KR102604877B1 - 감염성 질환의 예방 및/또는 치료와 종양학적 질환의 치료를 위한 약독화된 인플루엔자 벡터 - Google Patents

감염성 질환의 예방 및/또는 치료와 종양학적 질환의 치료를 위한 약독화된 인플루엔자 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의약 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 감염성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 이에 기초한 인플루엔자 벡터, 및 이를 함유하는 약학적 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명은 종양학적 질환의 치료에 사용될 수 있는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 이를 기초로 하는 인플루엔자 벡터, 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

감염성 질환의 예방 및/또는 치료와 종양학적 질환의 치료를 위한 약독화된 인플루엔자 벡터
본 발명은 의약 및 바이러스학 분야에 관한 것으로, 특히 약독화된 키메라성 A 바이러스, 이에 기초한 약독화된 인플루엔자 벡터, 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 및 종양학적 질환의 치료에 사용되는 용도에 관한 것이다.
오늘날 바이러스 감염에 대항하고 그 확산을 제한하기 위한 가장 중요한 보호 조치는 예방 접종이다. 현대의 백신은 원칙적으로 표면 바이러스 항원에 대한 항체 형성을 유도한다. 백신 효과는 백신에 함유된 바이러스 균주의 항원 구조와 개체군에서 순환하는 균주 사이의 일치 정도에 직접적으로 의존적이다. 대다수 바이러스의 표면 단백질은 일정한 항원 변이(antigenic variation)(항원 소변이(drift))를 겪으며, 백신 균주 조성의 지속적인 갱신이 필요하다. 광범위한 작용의 면역 반응을 유도하는 고도의 면역원성 및 안전한 백신의 개발은 현재 효율적인 인플루엔자 예방에서 부딪히는 주요한 문제 중 하나이다.
모든 바이러스성 호흡기 질환 중 인플루엔자는 가장 심각한 병리학을 유발하고 개체군의 건강과 경제에 가장 큰 피해를 준다. 주기적으로 발생하는 신종 유행성 인플루엔자 균주에 대한 개체군의 면역 부족은 인플루엔자 감염을 특히 위험하게 한다. 스페인 독감은 1918년에 3천만 내지 5천만 명을 사망하게 한 것으로 알려져 있다. 현재 세계 보건기구(WHO) 데이터에 따르면 전 세계 성인 인구의 5 내지 10% 및 아동의 20 내지 30%를 포함한 전 세계 인구의 약 20%는 계절성 유행병 동안 인플루엔자에 걸린다(World Health Organization) URL : http://www.who.int/biologicals/vaccines/influenza/en/ (접속 날짜: 2016. 3. 28). 중증 질병 형태는 3-5백만 건이 기록되며, 25만 내지 50만 건은 치명적이다. 인플루엔자 및 기타 급성 호흡기 바이러스성 감염(ARVI)으로 인한 경제적 손실은 모든 감염성 질환으로 인한 전체 피해의 약 77%를 차지한다. 상당한 손실은 환자의 치료 및 재활의 직접 비용뿐 아니라 생산성 저하 및 기업 이익 감소로 인한 간접 손실과도 관련이 있다. 인플루엔자 및 급성 호흡기 바이러스 감염은 일시적 장애의 총 건수의 12-14%를 차지한다.
기존 백신은 약독화(생균, 낮은 병원성을 나타내는 전체 및 활성 바이러스 포함) 및 불활성화(바이러스 입자 단편 또는 전체 비활성 바이러스 포함) 유형 두 가지로 세분될 수 있다. 감염된 숙주에서 복제할 수 있는 살아있는 바이러스는 이러한 바이러스의 발현된 항원에 대해 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 이끌어낸다. 이 바이러스들은 체액성 및 세포성 면역 반응을 둘 다 효과적으로 유도하고, 사이토카인(cytokine-) 및 케모카인(chemokine-) 매개 면역 반응을 자극한다. 따라서, 약독화된 생 바이러스는 일반적으로 면역계의 체액성 부분만을 자극하는 불활성화 면역원 또는 면역원의 개별 서브유닛을 기반으로 하는 백신 조성물에 비해 특정한 이점을 갖는다.
다양한 감염성 질환에 대해 동물과 사람을 예방 접종하고자 하는 경우, 다른 계열의 바이러스들은 이종 게놈 서열을 발현하는 벡터로 사용될 수 있다. 벡터는 전통적인 사(killed) 백신이나 생백신을 생산할 수 없거나 효과가 질병 제어를 할 수 없는 경우에 사용할 수 있다. 기존의 항원 전달 시스템 중에서 바이러스 벡터는 다음과 같은 특성 때문에 특별한 위치를 차지한다: 바이러스 벡터는 세포와 상호 작용하고 세포 내로 침투하는 자연 기전이 있고, 세포의 세포질 또는 핵으로 이종 유전자 물질을 전달하고, 장기 지속적인 항원 발현을 제공할 수 있고, 바이러스 엔벨로프는 도입된 전이유전자(transgene)를 암호화하는 핵산을 보호한다.
모든 바이러스가 효과적인 약독화된 재조합 백신의 생산을 위한 벡터를 구축하는데 필요한 특성을 갖고 있는 것은 아니다. 현재, 바이러스 벡터 기반의 백신을 개발하기 위해 가장 널리 사용되는 바이러스는 폭스바이러스(Poxviridae)이다[J. Gen. Virol. 2005. V. 86. No. 11. P. 2925-2936], 뉴캐슬병 바이러스(NDV)[Virol. 2001. V. 75. No.23. P. 11868-11873] 및 아데노바이러스(Adenoviridae) [Biotechnology. 2007. V. 5, P. 38-44]. 바이러스 벡터로 사용되는 폭스바이러스 중에서 가장 널리 사용되는 바이러스는 단순성과 낮은 생산 원가, 뿐만 아니라 높은 패킹 능력(최대 25kbp)과 같은 장점을 지닌 우두 바이러스이다[J. Gen. Virol. 2005. V. 86. No. 11. P. 2925-2936]. 우두 바이러스계 벡터의 심각한 단점은 천연두에 대한 면역화의 결과로서 인간 개체군의 일부에 존재하는 상기 바이러스에 대한 기존의 면역성이다. 따라서, 카나리폭스(Canarypox) 및 가금류 폭스바이러스(Flowpox)와 같은 폭스바이러스를 기반으로 하는 벡터를 사용하는 것이 권장된다. 하지만, 카나리폭스 및 플로우폭스(Flowpox)는 우두 바이러스보다 표적 항원에 대하여 더 약한 면역 반응을 유도하고, 반복 투여 또는 보조제의 사용을 필요로 한다[Vaccine. 1991. V. 9. No. 5, P. 303-308]. NDV 백신 벡터의 유의적인 단점은 재조합 NDV의 투여 효과가 충분히 연구되지 않았으며 NDV 기반 백신이 사람에게 안전한 지 여부가 분명하지 않다. 또한, NDV는 낮은 패킹 능력과 몇 가지 표적 항원을 운반하는 벡터의 생성이 어렵다는 특징이 있다[Chem. Biodivers. 2010. V. 7. No. 3. P. 677-689]. 아데노바이러스는 또한 유전자 전달용 벡터로서의 용도를 제한하는 다수의 단점이 있다. 아데노바이러스 벡터의 주요 단점은 다음과 같다: (1) 많은 세포를 아데노바이러스 감염에 둔감하게 만드는 신체의 세포 표면에 바이러스 수용체의 불균일한 분포; (2) 알려진 아데노바이러스 벡터에 대한 개체군의 강력한 방어 면역의 존재; 및 (3) 인간 염색체에 아데노바이러스 DNA 게놈이 통합될 수 있다는 이론적 가능성(Stephen SL, Montini E, Sivanandam VG, Al-Dhalimy M, Kestler HA, Finegold M, Grompe M, Kochanek S. Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo. J Virol. 2010 Oct; 84 (19): 9987-94. doi: 10.1128/JVI.00751-10, Epub 2010 Aug 4).
인플루엔자 바이러스를 기반으로 하여 구축된 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 몇 가지 장점이 있는데, 그 이유는
- 인플루엔자 바이러스가 복제 주기에 DNA 단계가 없어서 인체 또는 동물 게놈에 삽입될 수 없고;
- 인플루엔자 바이러스는 사람의 기도 세포 감염시 그 항원에 대하여 전신성 및 점막성 B 세포 및 T 세포 반응을 유도하고;
- 여러 가지 다른 인플루엔자 바이러스 아형이 있고(이러한 다양한 아형에 대한 항체는 교차 반응성이 없으므로, 종종 다른 생벡터의 문제점인 숙주에 존재하는 바이러스 벡터에 대한 기존의 면역성을 피하는 것이 가능하다. 또한, 동일한 항원을 발현하는 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 의한 효과적인 부스터 면역화가 가능하다);
- 비내 투여용의 생 인플루엔자 백신이 여러 종류가 있고(LIVE allantoic INFLUENZA VACCINE ULTRAVAC® (RF) 및 Flumist® (USA)), 이의 생산에는 10일령의 닭 배아를 이용하는 산업 기술이 있다(Guideline on Influenza Vaccines - Quality Module, European Medicines Acency, 25 April 2014 [전자 자료] URL : http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2014/06/WC500167817.pdf (접속 날짜: 2015. 1. 11)).
인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A, B 및 C 바이러스 속을 포함하는 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에 속한다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 게놈은 구조적으로 유사하며 네거티브 극성인 8개의 RNA 게놈 분절들로 이루어진다: PB2, PB1, PA, HA, NA, NP, M 및 NS(Chou YY, Vafabakhsh R, Doganay S, Gao Q, Ha T, Palese P. One influenza virus particle packages eight unique viral RNAs as shown by FISH analysis. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Jun 5; 109(23): 9101-6. doi: 10.1073/pnas.1206069109. Epub 2012 April 30). 폴리머라제 복합체 PB2, PB1 및 PA는 각 게놈 단편에서 하나의 mRNA를 전사하고, 이는 동일한 이름의 단백질로 해독된다. 게놈 분절 M 및 NS의 메신저 RNA는 교대로 결찰되어 각각 M2 및 NEP 단백질을 암호화하는 mRNA를 형성할 수 있다. NS1과 PB1-F2(모든 균주에서 입수용이한 것은 아니다)를 제외한 모든 단백질은 바이러스 입자의 구조적 성분이다. 비구조 단백질 NS1은 감염된 세포의 세포질에 축적되어 인터페론 저해제로 작용한다 (Krug RM. Functions of the influenza A virus NS1 protein in antiviral defense. Curr Opin Virol. 2015 Jun; 12: 1-6. doi 10.1016/j.coviro.2015.01.007, Epub 2015 Jan 29. Review).
인플루엔자 바이러스 게놈의 분절형 구조는 재편성(reassortment) 과정의 결과인 새로운 다른 균주의 근원이다. 이는 인플루엔자 바이러스의 자연적 항원 다양성과 인플루엔자 유행병의 발생 메카니즘 중 하나이다.
인플루엔자 바이러스의 항원 성질은 비리온(virion) 표면에 돌기(spike)를 형성하는 표면 당단백질인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)에 의해 결정된다. HA 분자는 바이러스를 세포의 시알산 수용체에 결합시키고 바이러스 막과 세포 막을 융합시켜 세포의 세포질과 핵 내로 게놈을 침투시키는 메카니즘을 담당한다. 바이러스 복제 과정에서 HA는 세포 프로테아제에 의해 두 개의 서브유닛(HA1과 HA2)으로 절단되고(HA 활성화), 이는 이황화 결합에 의해 연결되어 있다(Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 1994, 371, 37-43). HA 분자는 HA1 서브유닛을 포함하는 구형(globular) 부분과 주로 HA2에 의해 형성되고 HA1 서브유닛에 의해 부분적으로 형성된 줄기(stem) 영역의 두 부분으로 구성된다. 구형 부분은 수용체 결합 부위와 5개의 항원 부위를 포함하며, 항체 형성의 주요 표적으로 작용한다. 세포 수용체에 대한 바이러스 결합을 차단하는 항체는 중화성이다. HA1 서브유닛은 높은 가변성을 특징으로 한다. 바이러스 막에 근접하여 위치한 HA 줄기는 높은 보존성이며 낮은 면역원성을 특징으로 한다. HA2 서브유닛의 주요 기능은 바이러스 막과 엔도솜(endosome) 막의 융합을 보장하는 것이다; 이 서브유닛은 고도로 보존적이다. 항원 특이성에 따르면 HA의 18가지 아형과 NA의 11가지 아형이 A형 인플루엔자 바이러스에서 현재까지 알려진 것이다. 아형 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 및 H18은 제1 그룹에 속하며 아형 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15는 제2 그룹에 속한다. 동시에, 인간 개체군에서 순환성인 인플루엔자 바이러스 A의 아형 H1, H2 및 H3과 인플루엔자 바이러스 B의 다른 항원 변이체만이 유행병 및 계절성 인플루엔자 전염병을 유발한다.
질병 후 또는 하나의 인플루엔자 A 바이러스 아형에 의한 백신 접종 후에 생성된 특이 면역은 다른 바이러스 아형에 의한 감염에 대해서는 보호가 불량하다. 임의의 인플루엔자 바이러스 A 아형에 대한 면역성은 인플루엔자 바이러스 B에 의한 감염에 대해 보호하지 못하며, 그 반대도 마찬가지이다. 즉, 인플루엔자 바이러스 B에 대한 면역화는 인플루엔자 바이러스 A에 대해서는 효과적이지 않다. 이와 관련하여, 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 알려진 모든 항원 변종에 대하여 효과적인 만능 인플루엔자 백신의 개발이 절실히 요구된다.
두 가지 메카니즘은 인플루엔자 바이러스의 매우 높은 가변성을 가능하게 하여 중화 항체를 회피하는 능력을 가능하게 한다: 1) 표면 당단백질의 항원 구조의 변화를 유도하는 점 돌연변이의 축적(항원 소변이) 및 2) 게놈 분절들의 재편성. 이들은 유행병을 일으킬 수 있는 바이러스의 신규 아형(항원 대변이(shift))의 출현을 초래한다.
기존의 인플루엔자 백신은 모두 노인 및 유아에게 효능이 낮다(Jefferson T, Rivetti A, Di Pietrantonj C, Demicheli V, Ferroni E. Vaccines for preventing influenza in healthy childern. Cochrane Database Syst Rev 2012; 8, CD004879; Osterholm MT , Kelley NS, Sommer A, Belongia EA. Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis 2011; 12, 36-44; Pfleiderer M, Trouvin JH, Brasseur D, Granstrom M, Shivji R, Mura M, Cavaleri M. Summary of knowledge gaps related to quality and efficacy of current influenza vaccines. Vaccine 2014; 32, 4586-91).
또한, 이 백신은 백신 바이러스가 유행병 균주와 동일한 항원 성질을 갖는 경우에만 순환성 바이러스에 대하여 보호할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 표면 항원(HA 및 NA)은 높은 가변성이 있어, 해마다 백신접종과 백신 조성의 갱신을 필요로 한다. WHO 권고안에 따라 개발된 계절성 백신은 유행성 바이러스 A/캘리포니아/7/2009(H1N1pdm09)가 발생한 2009년에 나타난 것처럼, 모든 순환성 균주와 기본적으로 다른 새로운 인플루엔자 유행성 바이러스 균주가 발생한 경우에는 효과가 없다는 것이 언급되어야 한다. 한가지 추가 예는 항원 소변이의 결과로서 이 바이러스 아형의 새로운 항원 변형체의 출현으로 인한 2014 계절성 백신의 H3N2 성분의 낮은 효율일 수 있다(Skowronski DM, Chambers C, Sabaiduc S, De Serres G, Dickinson JA, Winter AL, Drews SJ, Fonseca K, Charest H, Gubbay JB, Petric M, Krajden M, Kwindt TL, Martineau C, Eshaghi A, Bastien N, Li Y. Interim estimates of 2014/15 vaccine effectiveness against influenza A(H3N2) from Canada's Sentinel Physician Surveillance Network, January 2015. Euro Surveill 2015; 20). 지난 60년 동안 특정 이점과 단점을 지닌 많은 백신이 개발되었다; 그러나 기존의 백신은 지속적으로 발생하는 인플루엔자 바이러스에 교차 방어 면역을 유도할 수 없기 때문에 인플루엔자 이환율 제어 문제를 해결할 수 없다. 이와 관련하여 오래 지속되는 광범위한 교차 방어 면역을 제공하고 모든 알려진 아형의 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대하여 보호할 수 있는 효과적인 보편적 인플루엔자 백신의 개발이 절실히 필요하다.
알려진 모든 인플루엔자 백신, 즉 불활성화 백신(전체 비리온, 파편 또는 서브유닛) 또는 생백신(약독화, 저온-적응된)의 기능은 HA의 구형 부분에 대한 면역성을 발생시키는 것이다. 가변성 구형 부분과 달리, 인플루엔자 A(그룹 I과 II)와 B 바이러스의 HA 줄기 부분은 훨씬 더 보존적이다. HA의 이 부분에 대해 유도된 항체의 직접 및 간접 중화에는 여러 메카니즘이 알려져 있다. 직접 중화 메카니즘 중 하나는 융합 펩타이드 방출 및 세포 내로 바이러스 게놈을 전달하기 위한 후속적인 엔도솜 및 바이러스 막의 융합에 필요한 HA 입체형태 변화의 예방에 기여한다. 직접 중화의 두번째 메카니즘은 절단 부위 부근에 위치한 HA 부분과 상호 작용하는 항체에 의하여 HA가 HA1 및 HA2 서브유닛으로 절단되는 것을 방지하는데 기여한다. 항체 의존적 및 보체 의존적 세포독성은 간접 중화 메카니즘에 관여한다(Terajima M, Cruz J, Co MD, Lee JH, Kaur K, Wrammert J, Wilson PC, Ennis FA. Complement-dependent lysis of influenza a virus-infected cells by broadly cross-reactive human monoclonal antibodies. J Virol 2011; 85, 13463-7; Jegaskanda S, Weinfurter JT, Friedrich TC, Kent SJ. Antibody-dependent cellular cytotoxicity is associated with control of pandemic H1N1 influenza virus infected of macaques. J Virol 2013; 87, 5512-22).
백신 접종은 실제적으로 HA 줄기 영역에 대한 항체를 유도하지 않지만 자연 감염 후에는 이러한 항체들이 소량 검출될 수 있다(Moody MA, Zhang R, Walter EB, Woods CW, Ginsburg GS, McClain MT, Denny TN, Chen X, Munshaw S, Marshall DJ, Whitesides JF, Drinker MS, Amos JD, Gurley TC, Eudailey JA, Foulger A, DeRosa KR, Park R, Meyerhoff RR, Yu JS, Kozink DM, Barefoot BE, Ramsburg EA, Khurana S, Golding H, Vandergrift NA, Alam SM, Tomaras GD, Kepler TB, Kelsoe G, Liao HX, Haynes BF. H3N2 인플루엔자 감염은 인플루엔자 백신 접종보다 더 큰 교차 반응성을 유인하고 더 적은 클론 확장성 항-헤마글루티닌 항체를 유인해 낸다. PLoS ONE 2011; 6, e25797).
만능 백신의 생성에 대한 현재 개발 중인 시도들의 대부분은 인플루엔자 바이러스 단백질의 보존적 영역을 표적으로 한다. 보존적 단백질 PB2, PB1, PA, NP 및 M1에 대해 지향성인 항체들은 중화 활성을 갖지 않지만 항체 의존적 세포독성(ADCC)에 의한 바이러스 제거에 중요한 역할을 할 수 있었다.
만능 백신을 생성하는 몇 가지 예는 HA2 서브유닛을 기반으로 한다. KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 및 프로인트 보강제에 접합된 융합 펩타이드(1 내지 38 아미노산 잔기) 또는 엑토도메인 HA2(23 내지 185 아미노산 잔기)를 나타내는 펩타이드에 의한 마우스의 3중 면역화는 치사 용량의 이종 바이러스 균주로 공격받았을 때 동물 사망률을 감소시키는 교차 반응 면역성을 유도했다(Stanekova Z, Kiraly J, Stropkovska A, Mikuskova T, Mucha V, Kostolansky F, Vareckova E. Heterosubtypic protective immunity against influenza A virus induced by fusion peptide of the hemagglutinin in comparison to ectodomain of M2 protein. Acta Virol 2011; 55, 61-7). 키메라 HA 작제물을 이용한 백신 접종의 경우에 보다 효과적인 보호가 발달되었다. 크레이머 등(Krammer et al.)은 동일한 바이러스의 HA 줄기 영역과 함께 상이한 아형의 바이러스로부터 HA 구형 부분을 함유하는 키메라 단백질로 면역화된 마우스에서 헤테로아형 체액 면역이 유도됨을 보여 주었다(Krammer F, Palese P, Steel J. Advances in universal influenza virus vaccine design and antibody mediated therapies based on conserved regions of the hemagglutinin. Curr Top Microbiol Immunol 2014; 386, 301-21; Krammer F, Hai R, Yondola M, Tan GS, Leyva-Grado VH, Ryder AB, Miller MS, Rose JK, Palese P, Garcia-Sastre A, Albrecht RA. Assessment of influenza virus hemagglutinin stalk-based immunity in ferrets. J Virol 2014; 88, 3432-42). DNA를 이용한 동물 전기침투, 및 보강제 폴리(I:C)가 보충된 단백질 작제물에 의한 이중 근육내 및 비내 면역화를 포함하는 복합 면역화 방식은 이 시도의 단점이다.
H1N1 바이러스의 HA 줄기 영역의 아미노산 서열을 기반으로 하는 유전자조작에 의해 생성된 안정화된 구조(미니-HA)의 사용은 만능 인플루엔자 백신 생성의 다른 시도의 하나로서 작용한다. 광범위한 중화 활성을 가진 항체들에 대해 최고의 친화성을 가진 구조들만이 대규모 라이브러리 중에서 선택되었다. 이러한 구조들에 의한 마우스의 면역화는 또한 H5N1 아형의 고 병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 의한 공격을 받았을 때 동물을 사망으로부터 보호했다(Impagliazzo A, Milder F, Kuipers H, Wagner MV, Zhu X, Hoffman RM, van Meersbergen R, Huizingh J, Wanningen P, Verspuij J, de Man M, Ding Z, Apetri A, Kukrer B, Sneekes-Vriese E, Tomkiewicz D, Laursen NS, Lee PS, Zakrzewska A, Dekking L, Tolboom J, Tettero L, van Meerten S, Yu W, Koudstalal W, Goudsmit J, Ward AB, Meijberg W, Wilson IA, Radosevic K. 광범위한 보호 면역원으로서 안정한 삼량체성 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기(A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen). Science 2015; 349, 1301-6). 사망으로부터 마우스의 완전한 보호는 Novavax에 의해 생산된 Matrix-M 보강제로 보충된 정제된 미니-HA 단백질 30㎍에 의한 이중 근육내 면역화에 의해 달성되었다.
다른 유망한 만능 인플루엔자 백신 개발 방향은 HA의 면역원성을 현저히 향상시키는 자기 조립성(self-assembling) 나노입자의 설계를 기반으로 하는 것이다(Kanekiyo M, Wei CJ, Yassine HM, McTamney PM, Boyington JC, Whittle JR, Rao SS, Kong WP, Wang L, Nabel GJ. 자기-조립성 인플루엔자 나노입자 백신은 광범위 중화성 H1N1 항체를 유인해낸다(Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies). Nature 2013; 499, 102-6). 동물은 새로운 보강제 SAS(Sigma Adjuvant System)가 보충된 나노입자로 근육내로 2회 또는 3회 면역화되었다. 나노입자에 의한 면역화 후 중화 항체의 부족에도 불구하고, 마우스 뿐만 아니라 페레트(ferret)는 고 병원성 H5N1 조류 바이러스에 의해 감염되었을 때 사망으로부터 완전히 보호되는 것으로 판명되었다.
생 백신의 생성을 위한 현대 기술 중 하나는 하나의 바이러스의 항원을 다른 바이러스가 발현할 수 있게 하는 백신 벡터의 구축을 기반으로 한다. 인플루엔자 항원의 발현 벡터로는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 바큘로바이러스 또는 폭스바이러스와 같은 여러 DNA 함유 바이러스가 사용된다(Dudek T, Knipe DM, 백신 및 백신 벡터로서의 복제-결손성 바이러스(Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors). Virology 2006; 344, 230-9; He F, Madhan S, Kwang J. 인플루엔자 백신용 전달 매개체로서 바큘로바이러스 벡터(Baculovirus vector as a delivery vehicle for influenza vaccines). Expert Rev Vaccines 2009; 8, 455-67; Draper SJ, Cottingham MG, Gilbert SC. 항체 유도를 위한 폭스바이러스 벡터화된 백신의 활용 - 발전 및 전망(Utilizing poxviral vectored vaccines for antibody induction-progress and prospects). Vaccine 2013; 31, 4223-30. Price GE, Soboleski MR, Lo CY, Misplon JA, Pappas C, Houser KV, TumpeyTM, Epstein SL. 독성 H1N1 및 H5N1 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 마우스 및 페레트를 보호하는 보존적 항원에 대한 면역성에 초점을 맞춘 백신접종(Vaccination focusing immunity on conserved antigens protects mice and ferrets against virulent H1N1 and H5N1 influenza A Viruses). Vaccine 2009; 27, 6512-21). 즉, 아데노바이러스 벡터를 이용한 실험은 인플루엔자 A 바이러스 보존적 단백질 NP 및 M2의 서열을 함유하는 플라스미드(50㎍)에 의한 삼중 면역화와 그 다음 동일한 단백질들을 발현하는 2종의 아데노바이러스 벡터에 의한 비내 감염이 바이러스 A/FM/1/47(H1N1) 또는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 아형에 의해 감염된 마우스 및 페레트를 사망 및 체중 감소로부터 완벽하게 보호한다는 것을 보여주었다.
따라서, 인플루엔자 바이러스의 보존적 영역에 대한 면역 반응을 표적으로 하는 모든 논의된 시도들은 인플루엔자 A 바이러스의 다른 변형체들에 의한 감염으로부터 보호할 백신의 생성 가능성을 입증한다. 하지만, 이 목표를 달성하기 위해 다른 성질의 면역학적 보강제를 사용하여 동물을 수회 백신 접종하는 복잡한 방식이 사용되었다. 또한, 만능 인플루엔자 백신의 공지된 실험 제제 중에서 인플루엔자 B 바이러스에 대한 보호를 제공하는 것은 없었다. 여기에 추가되어야 하는 것은, 상기 실험 제제들이 필요로 하는 최종 산물의 허용될 수 없는 높은 비용과 관련된 다성분 백신의 생산을 위한 복잡한 기술 과정들이다.
비강 세포에서 항원의 발현은 전신 및 국소 점막 B 세포 및 T 세포 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 동물의 기도 세포에서 이종 게놈 서열을 전달 및 발현하기 위한 벡터로서 인플루엔자 바이러스를 사용하기 위한 수많은 시도들이 이루어졌다. 인플루엔자 A 또는 B 바이러스의 8개 게놈 단편들 중에서, 오로지 NS 게놈 단편만이 최종 비리온의 구조를 파괴함이 없이 NS1 비구조 단백질의 판독 프레임에 800개 초과의 뉴클레오타이드의 게놈 삽입을 안정하게 유지할 수 있었다(Kittel C, Sereinig S, Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Wolkerstorfer A, Katinger H, Egorov A. NS1 판독 프레임으로부터 GFP를 발현하는 인플루엔자 바이러스의 수색(Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame). Virology 2004 Jun 20; 324(1): 67-73. PubMed PMID: 15183054). 또한, 모든 인플루엔자 바이러스 단백질 중에서 보통 230 내지 237개의 아미노산 잔기를 함유하는 NS1 단백질만은 세포 배양물, 닭 배아 또는 동물의 기도에서 바이러스의 증식 활성에 유의적인 영향을 미침이 없이 카르복시 말단에서 50%까지 절삭될 수 있다(Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T. Vero 세포에서 효과적으로 증식하는 NS1 단백질에 긴 결실을 가진 형질감염 인플루엔자 A 바이러스(Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells). J Virol. 1998 Aug; 72 (8): 6437-41, PubMed PMID : 9658085; PubMed Central PMCID : PMC109801). 이러한 NS1 단백질 절삭은 바이러스의 형태 및 기본적인 기능을 방해함이 없이 이종 게놈 서열의 긴 삽입물이 도입될 공간을 제공하여, 유전자적으로 안정한 벡터를 구성할 수 있게 한다. 이와 관련하여, NS1 단백질의 80 내지 126 아미노산 잔기의 절삭된 판독 프레임을 암호화하는 인플루엔자 A 바이러스에 기초한 인플루엔자 바이러스 벡터가 생산되었고, 상기 절삭된 판독 프레임은 다양한 박테리아 및 바이러스 병원체의 항원 서열의 삽입에 의해, 예컨대 결핵균, 소 브루셀라균 또는 인간 면역결핍 바이러스의 단백질 서열에 의해 연장될 수 있었다[Tabynov K, Sansyzbay A, Kydyrbayev Z, Yespembetov B, Ryskeldinova S, Zinina N, Assanzhanova N, Sultankulova K, Sandybayev N, Khairullin B, Kuznetsova I, Ferko B, Egorov A. 소 브루셀라 감염에 대한 백신으로서 브루셀라 OMP16 또는 L7/L12 단백질을 발현하는 인플루엔자 바이러스 벡터. Virol J. 2014 Apr 10; 11: 69. doi: 10.1186/1743-422X-69. PubMed PMID: 24716528, PubMed Central PMCID: PMC3997475; Sereinig S, Stukova M, Zabolotnyh N, Ferko B, Kittel C, Romanova J, Vinogradova T, Katinger H, Kiselev O, Egorov A. 결핵균 ESAT-6 단백질을 발현하는 인플루엔자 바이러스 NS 벡터들은 CD4+ Th1 면역 반응을 유도하고 결핵균 공격에 대하여 동물을 보호한다. Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug; 13(8): 898-904. PubMed PMID: 16893990; PubMed Central PMCID: PMC1539114; Ferko B, Stasakova J, Sereinig S, Romanova J, Katinger D, Niebler B, Katinger H, Egorov A. 과다약독화된 재조합 인플루엔자 A 바이러스 비구조-단백질 암호화 벡터는 사람의 면역결핍 바이러스 1형 Nef-특이적 전신 및 점막 면역 반응을 마우스에서 유도한다. J Virol. 2001 Oct; 75 (19) : 8899-908. PubMed PMID : 11533153; PubMed Central PMCID : PMC114458]. 124개 아미노산 잔기로 절삭된 NS1 단백질을 운반하는 작제물(이하, NS1-124 벡터)은 닭 배아에서의 증식 및 동물에서의 면역원성을 위한 매개변수들에 의해 최적인 것으로 나타났다(Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Kittel C, Sereinig S, Katinger H, Egorov A. 변경된 NS1 유전자를 가진 복제-결손형 인플루엔자 A 바이러스의 면역원성 및 보호 효능. J Virol 2004 Dec; 78 (23): 13037-45 PubMed PMID : 15542655; PubMed Central PMCID: PMC524997).
더 많이 절삭된 NS1 단백질을 가진 작제물은 10일된 닭 배아를 비롯한 인터페론-적격 세포(MDCK 세포, A549)에서 증식하는 능력이 감소되었고, 인터페론-결손성 Vero 세포에서만 생산하기에 적합했다. 반면, 124-126 아미노산 잔기로 구성된 NS1 단백질을 가진 벡터는 약독화가 변동적이어서 동물에서의 안전성이 충분하지 못했다. 예를 들어, 특정 위치에서 ESAT-6 미코박테리아 단백질을 운반하는 바이러스 벡터의 증식 수준은 마우스 폐에서 병원성 인플루엔자 바이러스(폐 조직 1g 당 바이러스 입자가 104 이상)의 증식 수준에 가까운 값에 도달할 수 있었다. 더욱이 5.0 log/마우스 초과의 감염 용량에서 NS1-124 벡터는 감염된 마우스의 폐 조직에서의 바이러스의 현저한 증식 및 가시적인 폐 병리의 형성을 유발할 수 있었다(Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanov J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T. NS1 단백질에 긴 결실을 가진 형질감염성 인플루엔자 A 바이러스는 Vero 세포에서 효율적으로 증식한다. J Virol 1998 Aug; 72(8): 6437-41. PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801; Stukova MA, Sereinig S, Zabolotnyh NV, Ferko B, Kittel C, Romanova J, Vinogradova TI, Katinger H, Kiselev OI, Egorov A. 결핵균 ESAT-6 단백질을 발현하는 인플루엔자 벡터의 백신 가능성. Tuberculosis(Edinb). 2006 May-July; 86(3-4): 236-46, PubMed PMID: 16677861). 따라서 124개 아미노산 잔기로 절삭된 NS1 판독 프레임을 가진 인플루엔자 벡터는 바이러스의 온도 민감성(39℃에서 저하된 증식력) 및 동물의 하부 기도에서 바이러스의 활성 복제의 결여가 필수 조건인 인플루엔자 생백신용으로 개발된 안전성 매개변수에 대응하는 것이 아니기 때문에 인체 백신접종용으로 사용될 수 없다[Maassab HF, Bryant ML, 인간을 위한 약독화된 저온-적응된 인플루엔자 바이러스 생백신의 개발. Rev Med Virol. 1999 Oct-Dec; 9(4): 237-44. Review. PubMed PMID: 10578119; Gendon IuZ. [Live cold-adapted influenza vaccine: state-of-the-art]. Vopr Virusol. 2011 Jan-Feb; 56(1): 4-17. Review. Russian. PubMed PMID: 21427948; Aldksandrova GI, Gushchina MI, Klimov AI, Iotove VV. [Genetic basis for construction of the life influenza type A vaccine using temperature-sensitive mutants]. Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1990 Mar; (3): 3-8. Review. Russian. PubMed PMID: 2194119; Kendal AP. 러시아에서 개발된 저온 적응된 생 약독화된 인플루엔자 백신: 다른 나라들에서도 인플루엔자 제어를 위한 요구들을 충족시킬 수 있을까? Eur J Epidemiol. 1997 Jul; 13(5): 591-609. Review. PubMed PMID: 9258574).
인가된 생 인플루엔자 백신(LIVE allantoic INFLUENZA VACCINE ULTRAVAC® (RF) 또는 Flumist® (USA))과 달리, 공지된 인플루엔자 벡터 NS1-124 및 이들에 가까운 작제물들은 표현형적 온도 민감성 마커(ts 표현형)를 보유하지 않았고, 전장의 NS1 단백질을 가진 야생형 바이러스의 증식 수준에 가까운 수준을 마우스 폐에서 나타냈다.
1950년 내지 60년대에는 인플루엔자 감염으로부터 회복 후 암이 경감되는 개별적 증례에 대한 의사의 관찰을 기반으로 하는 종양용해제로서 인플루엔자 바이러스를 사용하는 시도가 이루어졌다(Lindenmann J, Klein PA. Viral oncolysis: increased immunogenicity of host cell antigen associated with influenza virus. J Exp Med. 1967 Jul 1; 126(1): 93-108).
90년대 후반에 인플루엔자 바이러스에 대한 유전공학 기술이 개발된 이래로, 변형된 NS1 단백질을 가진 종양용해성 인플루엔자 벡터를 생산할 수 있는 가능성이 생겼다. NS1 단백질의 절삭은 NS1 단백질이 길항제인 선천성 면역계의 자극으로 인해 종양내로 재조합 바이러스의 도입 시, 종양용해 효과의 증진을 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Sturlan S, Stremitzer S, Bauman S, Sachet M, Wolschek M, Ruthsatz T, Egorov A, Bergmann M. 대장암 세포에서 프로테아제의 내인성 발현은 인플루엔자 A 바이러스 매개 종양용해를 촉진한다. Cancer Biol Ther. 2010 Sep 15; 10(6): 592-9; Ogbomo H, Michaelis M, Geiler J, van Rikxoort M, Muster T, Egorov A, Doerr HW, Cinatl J Jr. 종양용해성 인플루엔자 A 바이러스로 감염된 종양 세포는 저항성 종양 세포를 용해시키는 자연 킬러 세포를 자극한다. Med Microbiol Immunol. 2010 May; 199(2): 93-101. doi: 10.1007/s00430-009-0139-0. Epub 2009 Dec 15. PubMed PMID: 20012989; Efferson CL, Tsuda N, Kawano K, Nistal-Villan E, Sellappan S, Yu D, Murray JL, Garcia-Sastre A, Ioannides CG. 절삭된 NS1 단백질을 발현하는 재조합 인플루엔자 바이러스로 감염된 전립선 종양 세포는 미감염된 종양 세포를 인지하는 세포용해성 CD8+ 세포를 활성화시킨다. J Virol. 2006 Jan; 80(1); 383-94).
또한, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질의 길이에 대한 유전공학 조작의 가능성은 인터루킨-15와 같은 면역강화제(immunopotentiating agent)의 발현이 존재함으로서 효과가 증강된 벡터의 개발을 가능하게 했다(van Rikxoort M, Michaelis M, Wolschek M, Muster T, Egorov A, Seipelt J, Doerr HW, Cinatl J Jr. NS 판독 프레임으로부터 인터루킨-15를 발현하는 신규 인플루엔자 A 바이러스의 종양용해 효과. PLoS One. 2012; 7(5): e36506).
이러한 작업들은 유감스럽게도 인플루엔자 백신 제제의 생산에 최적의 기질인 닭 배아에서 대규모 생산을 위해 필수적인 전이유전자의 유전자 안정성을 보유하지 않는 몇몇 세포 배양물에서 제한된 증식을 할 수 있는 인플루엔자 바이러스를 이용했다.
따라서, 동물 유기체에서 바이러스의 활성 증식의 결여를 특징으로 하고 온도 민감성 표현형을 갖고, 감염성 질환의 예방 및/또는 치료뿐만 아니라 종양학적 질환의 치료에 사용될 수 있는, 새로운 효과적인 바이러스 벡터, 특히 약독화된 인플루엔자 벡터에 대한 필요성은 여전히 남아 있다.
본 발명은 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대하여 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스로서, NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임과 상기 약독화된 인플루엔자 A 바이러스의 아형과 다른 인플루엔자 A 아형에서 유래하는 Nep 유전자 이종 서열을 포함하는 키메라성 NS 단편을 함유하는, 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 상기 절삭된 판독 프레임이 80 내지 130개의 아미노산 잔기로 이루어지는 NS1 단백질을 암호화하고, 더욱 바람직하게는 상기 절삭된 판독 프레임이 124개의 아미노산 잔기로 이루어지는 NS1 단백질을 암호화하는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 상기 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임이 H1N1 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되고, Nep 유전자 이종 서열이 H2N2 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되는 것인, 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 약독화된 인플루엔자 A 바이러스는 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임과 Nep 유전자 이종 서열을 포함하는 키메라성 NS 단편을 함유하고, 상기 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임은 H1N1 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되고, Nep 유전자 이종 서열은 H2N2 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되며, 상기 절삭된 판독 프레임은 124개 아미노산 잔기로 이루어진 NS1 단백질을 암호화한다.
또한, 본 발명은 박테리아, 바이러스 및 원생동물에서 유래되는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서, 이 벡터는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스이고, 여기서 NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임은 박테리아, 바이러스 및 원생동물 유래의 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 전이유전자의 서열이 삽입되어 연장되는, 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 인간면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스(Trichomonas), 파동편모충(Trypanosoma), 리슈만편모충, 클라미디아, 브루셀라증 원인인자, 또는 이의 조합의 단백질들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 병원성 박테리아, 바이러스 또는 원생동물 유래의 단백질 또는 이의 단편을 발현하고, 이 단백질 또는 이의 단편이 10 내지 400개의 아미노산으로 이루어지는 것인 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 삽입이 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 단백질 영역을 암호화하고, 바람직하게는 HA 단백질 영역이 인플루엔자 A 바이러스의 1 내지 185 아미노산(aa), 인플루엔자 B 바이러스의 1 내지 186 aa, 인플루엔자 A 바이러스의 23 내지 185 aa 또는 인플루엔자 A 바이러스의 65 내지 222 aa으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HA2 서브유닛 영역인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 삽입이 1 내지 21 aa의 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 HA2 서브유닛 영역의 서열 및 243 내지 251 aa의 인플루엔자 A 바이러스 NP 단백질 영역의 서열을 암호화하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터이다.
본 발명의 다른 양태는 삽입이 결핵균의 단백질 ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 또는 10.4 또는 이의 단편을 암호화하고, 특히 바이러스 게놈 서열이 추가로 NS1-124 및 ESAT6을 암호화하는 서열 사이에 자기-절단성 2A 펩타이드를 암호화하는 서열을 함유하는, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 벡터가 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임과 Nep 유전자 이종 서열을 포함하는 키메라성 NS 단편을 함유하는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스이고, 상기 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임이 H1N1 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되고, Nep 유전자 이종 서열이 H2N2 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되며, 상기 절삭된 판독 프레임이 124 아미노산 잔기로 이루어진 NS1 단백질을 암호화하고, NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임이 인플루엔자 B HA2 단백질의 1 내지 21aa 및 인플루엔자 A NP 단백질의 243 내지 251aa를 암호화하는 서열의 삽입에 의해 연장되는, 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 종양용해 활성을 가진 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서, 이 벡터가 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스이고 NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임은 박테리아, 바이러스 또는 원생동물 유래의 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 전이유전자의 서열이 삽입되어 연장되어 있는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 삽입이 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 인간면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 파동편모충, 리슈만편모충, 클라미디아, 또는 이의 조합 유래의 단백질들 또는 이의 단편들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는, 종양용해 활성을 가진 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터이다.
본 발명의 다른 양태는 단백질 또는 이의 단편이 10 내지 400개의 아미노산으로 이루어지는 것인 종양용해 활성을 가진 약독화된 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태는 삽입이 결핵균의 단백질 ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 또는 10.4, 또는 이의 단편을 암호화하고, 특히 NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임이 결핵균 단백질 ESAT-6을 암호화하는 서열의 삽입에 의해 연장되고, 더욱 바람직하게는 NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임이 자기-절단성 2A 펩타이드를 암호화하는 서열 및 결핵균 단백질 ESAT-6을 암호화하는 서열의 삽입에 의해 연장되는, 종양용해 활성을 가진 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터이다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 A 및 B 바이러스들에 대하여 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서,
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 PB2 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 PB2 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 PB1 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 PB1 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 PA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 PA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 NP 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 NP 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 M 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 M 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/California/7/09-유사(H1N1pdm) 바이러스에서 유래되는 HA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 HA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/California/7/09-유사(H1N1pdm) 바이러스에서 유래되는 NA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 NA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열; 및
절삭형이고 124개 아미노산 잔기로 이루어진 NS1 단백질을 암호화하는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1)에서 유래되는 NS1 단백질 판독 프레임, 및 인플루엔자 A/Singapore/1/57-유사(H2N2) 바이러스에서 유래되는 Nep 유전자 서열을 포함하는 NS 단백질 키메라성 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 또는
상기 NS 키메라성 유전자의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
상기 NS1 단백질 절삭형 판독 프레임은 인플루엔자 B 바이러스 HA2 서브유닛 영역의 융합 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질(NP)의 보존적 B-세포 에피토프를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입에 의해 연장되는, 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 피검자의 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 인플루엔자 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 6.5 내지 10.5 log EID50/ml의 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 및 0 내지 1.5wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 완충 용액을 함유한다.
본 발명의 바람직한 양태는 완충 용액이 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하고, 바람직하게는 1가 염이 염화나트륨이고, 탄수화물 성분이 수크로오스, 트레할로오스 또는 락토오스이고, 단백질 성분이 인간 재조합 알부민, 카시톤(casitone), 락트알부민 가수분해물 또는 젤라틴이고, 아미노산 성분이 아르기닌, 글리신 또는 글루탐산나트륨이고, 이미다졸 함유 화합물이 L-카르노신 또는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5-일)에틸]프로판디아미드인 약학적 조성물이다.
본 발명의 다른 양태는 감염성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물로서, 상기 감염성 질환이 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순 바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충, 리슈만편모충, 클라미디아, 또는 브루셀라증 원인인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발되는, 약학적 조성물이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 피검자는 포유동물 또는 조류이고, 특히 피검자는 인간 피검자이다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 감염성 질환에 대한 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터와 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 인플루엔자에 대한 백신을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 백신은 6.5 내지 10.5 log EID50/ml의 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 및 0 내지 1.5wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 완충 용액을 함유한다.
본 발명의 다른 양태는 완충 용액이 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 백신이다. 바람직한 양태에 따르면, 상기 완충 용액 중의 1가 염은 염화나트륨이고, 탄수화물 성분은 수크로오스, 트레할로오스 또는 락토오스이고, 단백질 성분은 인간 재조합 알부민, 카시톤, 락트알부민 가수분해물 또는 젤라틴이며, 아미노산 성분은 아르기닌, 글리신 또는 글루탐산나트륨이고, 이미다졸 함유 화합물은 L-카르노신 또는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5일)에틸]프로판디아미드이다.
본 발명의 한 양태는 감염성 질환에 대한 백신이고, 이때 감염성 질환은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충, 리슈만편모충 또는 브루셀라증 원인인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발된다.
또한, 본 발명은 피검자의 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해, 특히 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충, 리슈만편모충 또는 브루셀라증 원인인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발된 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 피검자는 포유동물 또는 조류이고; 특히 피검자는 인간 피검자이다.
또한, 본 발명은 피검자의 인플루엔자 예방에 사용되는, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 감염성 질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 피검자에게 유효량의 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 피검자의 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충, 리슈만편모충 또는 브루셀라증 원인인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 피검자는 포유동물 또는 조류이고; 특히 피검자는 인간 피검자이다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 약독화된 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하여, 피검자의 종양학적 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 양태는 8.5 내지 10.5 log EID50/ml의 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 벡터 및 0 내지 1.5wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분, 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 완충 용액을 함유하는 약학적 조성물이고, 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 완충 용액은 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유한다.
본 발명의 다른 양태는 완충 용액에서 1가 염이 염화나트륨이고, 탄수화물 성분이 전분이며, 단백질 성분이 인간 알부민이고, 아미노산 성분이 아르기닌이고, 이미다졸 함유 화합물이 L-카르노신 또는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5일)에틸]프로판디아미드인 약학적 조성물이다.
또한, 본 발명은 피검자의 종양학적 질환, 특히 결장직장암, 식도분문암, 췌장암, 담관세포암, 신경아교종, 교모세포종 및 흑색종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환을 치료하는데 사용되는 본 발명에 따른 약독화된 바이러스 벡터, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 피검자는 인간 피검자이다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 피검자의 종양학적 질환을 치료하는 방법, 바람직하게는 결장직장암, 식도분문암, 췌장암, 담관세포암, 신경아교종, 교모세포종 및 흑색종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 종양학적 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 상기 투여는 종양내 투여, 수술에 의한 종양 제거 후 형성된 공동에 투여 또는 정맥내 투여이다.
본 발명의 기술적 결과는 인간 및 동물에서 고도의 안전성이 있는 키메라성 NS 게놈 단편을 함유하는 인플루엔자 바이러스 및 이에 대응하는 인플루엔자 벡터, 특히 동물 유기체에서 활성 바이러스 증식의 결여를 특징으로 하고 온도 민감성 표현형을 갖고 있고 감염성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 벡터를 생산하는 것이다. 본 발명의 다른 기술적 결과는 보강제 없이 점막 투여 시에 만능 인플루엔자 백신의 성질을 보유하는, 키메라성 NS 게놈 단편을 함유하는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 것이다. 또한, 이러한 기술적 결과는 10일령의 닭 배아에서 생산된 인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 벡터의 증식을 허용하는 높은 가능성이다. 다른 기술적 결과는 만능 인플루엔자 백신의 성질을 가진 인플루엔자 벡터를 생산하는 것이다. 또한, 기술적 결과는 종양용해 활성이 있는 인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 벡터를 생산하는 것이다. 또 다른 기술적 결과는 보강제의 미사용으로 인한, 인플루엔자 백신의 생산에 필요한 비용을 감소시키는 것이다.
도 1은 약독화된 인플루엔자 벡터의 설계 원리를 도시한 것이다. 도 1 (A)는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 NS 게놈 단편의 개략도이다. 도 1 (B)는 NS1 판독 프레임이 절삭되고 이종 서열이 삽입되어 연장될 수 있는 유전자 변형된 키메라성 NS 게놈 단편의 개략도이다. Nep 단백질을 암호화하는 서열은 다른 인플루엔자 A 바이러스 아형에서 유래되는 이종 서열로 대체된다.
도 2는 야생형 바이러스의 NS 게놈 단편 및 2종의 키메라성 유전자 작제물의 예들의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다. 도 2 (A)는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 NS 단편을 도시한 것이다. 도 2 (B)는 NS1 단백질의 판독 프레임이 절삭되고 Nep 서열(진하게 표시됨)이 A/Singapore/1/57(H2N2) 바이러스에서 유래되는 인플루엔자 A 바이러스의 키메라성 NS 단편을 도시한 것이다. 도 2 (C)는 NS1 단백질의 판독 프레임이 절삭되고 Nep 서열(진하게 표시됨)이 A/Leningrad/134/47/57(H2N2) 바이러스에서 유래되는 인플루엔자 A 바이러스의 키메라성 NS 단편을 도시한 것이다.
도 3은 바이러스 A/Leningrad/134/47/57(H2N2) 바이러스 유래의 이종 Nep를 함유하는 NS1 키메라성 인플루엔자 벡터의 판독 프레임에서 해독된 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 4는 이종의 Nep 유전자를 가진 바이러스의 병원성 및 ts-표현형을 입증하는 데이터를 도시한 것이다. 도 4 (A)는 Vero 세포에서 34℃의 최적 온도 및 39℃의 승온에서 나타나는 바이러스의 증식 데이터를 도시한 것이다. 도 4 (B)는 감염 2일 후에 마우스 폐에서 나타나는 바이러스의 증식 데이터를 도시한 것이다.
도 5는 이종 병원성 인플루엔자 균주에 의한 대조 감염에서 NS1 판독 프레임으로부터 HA2 서브유닛 영역을 발현하는 벡터에 의한 마우스의 단일 면역화 후 보호 효과를 입증하는 그래프이다. 도 5 (A)는 A/Mississippi/85/1(H3N2) 바이러스에 의한 대조 감염에서의 사망률을 도시한 것이고, 도 5 (B)는 B/Lee/40 바이러스에 의한 대조 감염 하의 사망률을 도시한 것이다.
도 6은 뒷발에 1x106 B16 세포를 도입시켜 마우스에 유도된 흑색종에 미치는 재조합 인플루엔자 바이러스의 종양용해 효과에 대한 데이터이다. 치료는 종양 이식 후 5일째에 바이러스를 종양내 투여하여 수행했다. 도 6 (A)는 종양 이식 후 20일째 및 종양용해 벡터로 4회 치료한 후 평균 발 크기를 도시한 것이고; 도 6 (B)는 종양용해 벡터로 4회 치료 후 마우스의 생존율을 도시한 것이다.
도 7은 약독화된 인플루엔자 벡터의 구조를 도시한 것이다. 여기에는 바이러스 게놈의 8개 단편 및 각각의 특성이 제시되어 있다.
게놈 단편 PB2, PB1, PA, Np 및 M은 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되고; 표면 HA 및 NA 당단백질 유전자는 A/California/7/09-유사 (H1N1pdm) 바이러스에서 유래되며; NS 게놈 단편은 2가지 단백질, 1) 124 아미노산 잔기로 절삭되고 인플루엔자 B HA2 단백질의 N-말단 영역의 서열의 삽입 및 인플루엔자 A NP 단백질의 보존적 B-세포 에피토프의 삽입에 의해 연장된 NS1 단백질; 및 2) 이종 인플루엔자 A 균주, H2N2 A/Singapore/1/57 유사 혈청학적 아형에서 유래되는 서열을 가진 Nep 단백질을 암호화하는 키메라성 구조를 갖고 있는 것으로 표시되어 있다.
도 8은 백신 벡터의 게놈 단편들, A/PR/8/34(H1N1) 바이러스 유래의 PB2, PB1, PA, NP 및 M; A/California/7/09 유사(H1N1pdm) 바이러스 유래의 HA 및 NA; 및 키메라성 NS(NS1 판독 프레임에서 삽입은 진하게 표시된 것이다)의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.
도 9는 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스의 다양한 변형체들에 대하여 마우스의 비내 투여 후 백신 벡터가 나타내는 보호 성질을 반영하는 결과를 도시한 것이다. 다이아그램들은 대조동물과 비교하여, 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스의 표시된 혈청형들로 대조 감염 후 백신접종된 마우스의 사망률(%)을 도시한 것이다. 백신은 1회(1x) 또는 2회(2x) 투여했다.
도 10은 페레트의 비내 면역화 후 백신 벡터의 보호 성질을 입증하는 데이터를 도시한 것이다. 다이아그램 A는 백신접종된 동물 및 대조 동물에 A/St.Petersburg/224/2015(H3N2) 바이러스로 대조 감염 후 온도 변동의 평균 값의 동역학을 도시한 것이다. 다이아그램 B는 감염 후 2일, 4일 및 6일째 페레트 비측 세척물로부터 대조 바이러스의 접종 결과를 도시한 것이다. 역가는 MDCK 세포에 대한 적정 후 50% 세포변성 용량/ml로 나타낸, 비측 세척물의 바이러스 평균 농도로 표현된다. 백신은 1회(1x) 또는 2회(2x) 투여했다.
본 발명은 감염성 질환의 치료 및/또는 예방뿐만 아니라 종양학적 질환의 치료에 사용될 수 있고 유전자조작 방법에 의해 생산된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대하여 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스로서, NS1 절삭형 판독 프레임 및 상기 약독화된 인플루엔자 A 바이러스의 아형과 다른 인플루엔자 A 아형 유래의 Nep 유전자의 이종 서열을 포함하는 키메라성 NS 단편을 함유하는, 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다. 즉, 절삭형 NS1 단백질을 암호화하는 서열의 인플루엔자 A 바이러스 아형은 Nep 단백질 서열이 유래된 바이러스 아형과 다르다. 구체적으로, 본 발명의 한 양태는 상기 NS1 절삭형 판독 프레임이 인플루엔자 H1N1 아형에서 유래되고, Nep 유전자의 이종 서열이 H2 내지 H18 아형의 인간 또는 동물의 인플루엔자 아형에서 유래되는, 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
상기 절삭형 판독 프레임은 80 내지 130개의 아미노산 잔기를 함유하는 NS1 단백질을 암호화하고, 더욱 바람직하게는 상기 절삭형 판독 프레임은 124개 아미노산 잔기를 함유하는 NS1 단백질을 암호화한다.
본 발명은 특히 인플루엔자 벡터, 구체적으로 벡터 NS1-124의 불충분한 약독화의 문제(온도 민감성의 부재 및 마우스 폐에서 높은 증식 수준)가 인플루엔자 바이러스의 NS 게놈 단편의 두 번째 결찰된 단백질 산물, 즉 Nep 단백질(NS2)의 변형에 의해 해결될 수 있다는 본 발명자들이 발견한 사실에 기초를 두고 있다. 인플루엔자 A 바이러스, 특히 A/PR/8/34(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 Nep 게놈 서열은 이종 인플루엔자 균주, 예컨대 A/Singapore/1/57(H2N2) 또는 A/Leningrad/134/47/57(H2N2) 바이러스에서 유래되는 Nep 서열로 대체되면, 온도 민감성 표현형 및 인플루엔자 A 바이러스, 특히 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 약독화가 출현하게 된다. 이러한 현상을 기반으로 하여, A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 절삭형 판독 프레임 NS1-124와 함께 H2N2 혈청학적 아형 유래의 Nep 단백질 판독 프레임을 암호화하는 인플루엔자 바이러스의 키메라성 NS 단편을 작제했다. 키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 A/PR/8/34 바이러스를 기반으로 하는 재편성 인플루엔자 바이러스는 표면 항원 H1N1, H5N1 또는 H1N1pdm의 기원에 상관없이 39℃ 및 마우스 폐에서 활성 증식을 제공할 수 없지만(약독화 표현형), 10일령의 닭 배아에서는 높은 역가의 증식을 제공했다.
또한, 본 발명은 박테리아, 바이러스 및 원생동물 유래의 항원 또는 이의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항원 또는 이의 단편을 발현하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것으로, 이때 이 벡터는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스이고, NS1 단백질 유전자의 절삭형 판독 프레임은 박테리아, 바이러스 및 원생동물 유래의 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 전이유전자 서열의 삽입에 의해 연장된다. 일반적으로, 약독화된 바이러스는 동물 및 인간에게 병원성 또는 비병원성인 임의의 박테리아, 바이러스 또는 원생동물 유래의 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 돌연변유전자 내로 삽입될 수 있고, 특히 상기 단백질은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 소 브루셀라균, 헤르페스 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 파동편모충, 리슈만편모충, 클라미디아, 브루셀라증 원인인자 또는 이의 조합에서 유래되는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 특히, 삽입 서열은 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 단편, 결핵균 단백질 ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 또는 10.4 또는 이의 단편들을 암호화할 수 있다. 본 발명에 따른 약독화된 벡터의 게놈 서열은 추가로 NS1-124 및 ESAT6을 암호화하는 서열들 사이에 자기 절단성 2A 펩타이드를 암호화하는 서열을 함유할 수 있다.
삽입 서열에 의해 암호화된 항원 또는 이의 단편은 이 항원 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 "수용"하는 게놈 단편의 능력에 의해서만 한정되는 임의의 크기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 항원의 크기는 10 내지 400 아미노산이다. 예를 들어, 삽입은 인플루엔자 A 바이러스의 1 내지 185 아미노산, 인플루엔자 B 바이러스의 1 내지 186 아미노산, 인플루엔자 A 바이러스의 23 내지 185 아미노산 또는 인플루엔자 A 바이러스의 65 내지 222 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HA2 서브유닛 영역을 나타내는 HA 단백질 단편을 암호화할 수 있다. 아미노산의 번호매김은 전이유전자의 기원인 인플루엔자 바이러스의 HA2 서브유닛 영역에 있는 아미노산의 위치에 따라 제공된다.
본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 다른 구체적인 양태는 삽입이 1 내지 21 아미노산의 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 HA2 서브유닛 영역의 서열 및 243 내지 251 아미노산의 인플루엔자 A 바이러스 NP 단백질 영역의 서열을 암호화하는 벡터이다. 이 벡터 변형체는 그 안에 짧은 삽입에도 불구하고, 놀랍게도 마우스에 단일 면역화 후 인플루엔자 A 바이러스의 이종 항원 아형 및 인플루엔자 B 바이러스에 대하여 최대 보호 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌고, 즉 만능 인플루엔자 백신의 성질을 나타낸다.
본 발명자들은 예컨대 아미노산 위치 124 다음 NS1 판독 프레임에 이종 항원 서열의 삽입이 본 발명에 따라 생산된 키메라성 바이러스의 약독화 표현형에 유의적인 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했다. 즉, 생 인플루엔자 백신의 필요 조건에 따라 필요한 생산 특징 및 명백한 약독화 표현형 및 유전자형 마커를 보유하는 다양한 인플루엔자 벡터를 수득했다. 삽입의 본질에 상관없이, 이 바이러스들은 실험용 동물에 대한 무해성 및 약독화의 명백한 표현형 마커의 유사성, 즉 ts 표현형의 존재를 나타냈다. 약독화의 유전자 마커의 유사성은 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임의 존재 및 다른 인플루엔자 A 아형에서 유래되는 Nep 유전자의 이종 서열의 존재에 의해 결정되었다. 삽입에 따라, 최종 벡터는 만능 인플루엔자 백신, 결핵에 대한 백신 등의 성질을 나타냈다.
특히, 본 발명은 인플루엔자 A 및 B 바이러스를 비롯하여 공지된 모든 균주들에 의해 유발되는 인플루엔자를 예방하는데 사용될 수 있는, 유전자조작 방법에 의해 수득되는 인플루엔자 A 바이러스 백신 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임과 H2N2 인플루엔자 A 바이러스 아형 유래의 Nep 유전자 이종 서열을 포함하는 키메라성 NS 단편을 함유하여, 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대하여 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다. 따라서, 절삭된 NS1 단백질을 암호화하는 서열의 인플루엔자 A 바이러스 아형은 Nep 단백질을 암호화하는 서열이 유래되는 바이러스 아형과 다르다. 특히, 백신 벡터에서, NS1 절삭된 판독 프레임은 인플루엔자 H1N1 아형에서 유래하고, Nep 이종 서열은 H2N2 인플루엔자 아형에서 유래한다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 인플루엔자 A 및 B 바이러스들에 대하여 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 벡터로서,
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 PB2 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 PB2 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 PB1 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 PB1 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 PA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 PA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 NP 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 NP 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래되는 M 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 M 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/California/7/09-유사(H1N1pdm) 바이러스에서 유래되는 HA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 HA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열;
인플루엔자 A/California/7/09-유사(H1N1pdm) 바이러스에서 유래되는 NA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이 NA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열; 및
절삭형이고 124개 아미노산 잔기로 이루어진 NS1 단백질을 암호화하는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1)에서 유래되는 NS1 단백질 판독 프레임, 및 인플루엔자 A/Singapore/1/57-유사(H2N2) 바이러스에서 유래되는 Nep 유전자 서열을 포함하는 NS 단백질 키메라성 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 또는
상기 NS 키메라성 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 또는 그 이상(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%)의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
상기 NS1 단백질 절삭형 판독 프레임은 인플루엔자 B 바이러스 HA2 서브유닛 영역의 융합 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질(NP)의 보존적 B-세포 에피토프를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입에 의해 연장되는, 벡터에 관한 것이다.
이러한 절삭형 판독 프레임은 2개의 글리신, 인플루엔자 B 바이러스의 제2 헤마글루티닌 서브유닛 HA2의 N-말단 영역(23개 아미노산 잔기)의 삽입 및 인플루엔자 A 바이러스의 보존적 B-세포 에피토프 서열(7개 아미노산 잔기)의 삽입에 의해 연장되는 124개 아미노산 잔기를 가진 NS1 단백질을 암호화한다.
이 벡터의 표면 당단백질 유전자는 인플루엔자 A/California/7/09(H1N1pdm) 바이러스에서 유래된다. 내부 단백질 PB2, PB1, RA, NP 및 M의 유전자는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에서 유래된다. 따라서, 본 발명에 따른 인플루엔자 벡터는 다양한 인플루엔자 균주들의 게놈 서열들로 이루어진 복합 유전자 작제물이다: 즉 1) PB2, PB1, PA, NP 및 M을 암호화하는 유전자는 A/PR/8/34(H1N1)바이러스(PB2(진뱅크 수탁번호: AB671295), PB1(진뱅크 수탁번호: CY033583), PA(진뱅크 수탁번호: AF389117), NP(진뱅크 수탁번호: AF389119), M(진뱅크 수탁번호: AF389121))에서 유래되고, 2) HA 및 NA를 암호화하는 유전자는 A/California/7/09 유사 H1N1pdm 바이러스(HA(진뱅크: KM408964.1) 및 (NA 진뱅크: KM408965.1))에서 유래되고, 3) NS 유전자는 키메라성으로, 여기서 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 NS 단백질 판독 프레임은 124 아미노산 잔기로 절삭되고 인플루엔자 B 바이러스 HA2 서브유닛 영역의 융합 펩타이드를 암호화하는 서열 및 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질(NP)의 보존적 B-세포 에피토프를 암호화하는 서열의 삽입에 의해 연장되고, NEP 단백질 판독 프레임은 H2N2 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래된다.
본 발명은 특히 본 발명자들이 상기 구조를 가진 벡터로 보강제 없이 마우스 및 페레트의 비내 면역화 시, 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스뿐만 아니라 인플루엔자 A(H3N2) 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스에 의한 대조 감염에 대하여 동물을 보호한다는 것을 예상치 않게 발견한 사실을 기반으로 한다. 따라서, 이 백신 벡터는 만능 인플루엔자 백신의 성질을 나타낸다.
본 발명의 상황에서 "만능 백신"이란 용어는 인플루엔자 바이러스의 모든 공지된 변형체 및 미공지된 변형체에 대하여 보호할 수 있는 백신을 의미한다. 보통 "계절성 백신"은 백신 조성물에 포함된 바이러스와 유사한 바이러스에 대해서만 보호한다.
"점막 백신"이란 용어는 기도 및 소화관의 공동 내로 투여될 수 있고 입과 코의 점막에 적용될 수 있는, 즉 비내, 구강 또는 설하로 적용될 수 있는 백신을 의미한다.
키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 A/PR/8/34 바이러스를 기반으로 하는 인플루엔자 벡터는 39℃ 및 마우스 폐에서 활성 증식을 제공할 수 없었지만(약독화 표현형), 10일령의 닭 배아에서는 높은 역가로 증식했다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스를 함유하여 종양용해 활성이 있는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터에 관한 것으로, 이때 NS1 단백질 유전자의 절삭형 판독 프레임은 병원성 박테리아, 바이러스 및 원생동물 유래의 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 전이유전자 서열의 삽입에 의해 연장된다. 상기 항원은 동물에 병원성인 임의의 박테리아, 바이러스 또는 원생동물에서 유래될 수 있고, 특히 상기 항원은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 파동편모충, 리슈만편모충, 클라미디아 또는 이의 조합의 항원들로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 특히, 삽입된 전이유전자는 결핵균 단백질 ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 또는 10.4 또는 이의 단편들을 암호화할 수 있고; 또한, NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임은 결핵균 단백질 ESAT-6을 암호화하는 서열의 삽입에 의해 연장될 수 있다.
삽입 서열에 의해 암호화된 항원 또는 이의 단편은 이 항원 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 "수용"하는 NS 게놈 단편의 능력에 의해서만 한정되는 임의의 크기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 항원의 크기는 10 내지 400개의 아미노산이다.
본 발명자들은 예상치 않게도 키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 약독화된 인플루엔자 벡터가 병원성 항원, 특히 NS1 단백질 판독 프레임 유래의 박테리아 항원이 발현되기만 한다면, 이종 Nep 유전자의 혼입으로 인하여 증강된 종양용해 활성을 보유한다는 것을 발견했다. 예를 들어, 결핵균 단백질 Esat6을 암호화하는 바이러스 벡터는 삽입없이 절삭된 NS1 단백질을 가진 공지된 재조합 바이러스보다 더 높은 활성을 나타냈다. 어떠한 이론에 국한하려는 것은 아니지만, 포유동물에서 강한 항결핵 면역성은 결핵 단백질을 발현하는 바이러스에 감염된 종양의 면역 공격에 기여한다고 추정할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 피검자의 감염성 질환, 특히 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충 또는 리슈만편모충으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 다양한 병인의 종양 질환의 치료에 사용될 수 있고; 구체적으로 종양 질환은 결장직장 암, 식도분문암, 췌장암, 담관세포암, 신경아교종, 교모세포종 및 흑색종으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 백신으로서 조제될 수 있다.
본원에 사용된 "피검자" 또는 "동물"이란 용어는 병원성 박테리아, 바이러스 또는 원생동물에 의한 감염에 걸리기 쉬운 척추동물, 예컨대 조류(수금류, 닭 등) 및 대표적인 다양한 포유동물 종, 예컨대 개, 고양이, 늑대, 페레트, 설치류(쥐, 마우스 등), 말, 소, 양, 염소, 돼지 및 영장류를 의미한다. 본 발명의 한 양태에서, 피검자는 인간 피검자이다.
"유효량"이란 용어는 단일 용량으로 또는 치료 사이클의 일부로서 피검자에게 투여될 때 치료 및/또는 예방에 효과적인 치료적 결과를 가진 바이러스 또는 벡터의 양을 의미한다. 이 양은 환자의 건강 상태 및 신체 조건, 연령, 치료받는 피검자의 분류학적 그룹, 포뮬레이션, 주치의에 의한 의학적 상황의 평가 및 기타 중요한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 그 양은 비교적 넓은 범위 내에서 다양할 수 있고, 당업자는 표준 방법들을 통해 결정할 수 있다. 약학적 조성물은 6 내지 10.5 log EID50/ml, 더욱 특히 6.5 내지 10.5 log EID50/ml, 특히 6 내지 9.5 log EID50/ml, 더욱 특히 6.5 내지 8.5 log EID50/ml의 본 발명에 따른 키메라성 인플루엔자 A 바이러스 또는 본 발명에 따른 인플루엔자 벡터를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"란 용어는 당해 분야에 사용되는 임의의 담체, 특히 물, 생리학적 식염수, 완충 용액 등을 의미한다. 한 양태에 따르면, 약학적으로 허용가능한 담체는 0 내지 1.5 wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸-함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸 전분을 함유하는 완충 용액이고, 바람직하게는, 상기 완충 용액은 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸 전분을 함유하고, 가장 바람직하게는 1가 염은 염화나트륨이고, 탄수화물 성분은 수크로오스, 트레할로오스 또는 락토오스이며, 단백질 성분은 인간 알부민, 카시톤, 락트알부민 가수분해물 또는 젤라틴이고, 아미노산 성분은 아르기닌, 글리신 또는 글루탐산 나트륨이다.
이미다졸 함유 화합물은 L-카르노신 또는 하기 식으로 표시되는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5-일)에틸]-프로판디아미드이다:
인간 알부민은 재조합 알부민 또는 공여체 알부민일 수 있다.
또한, 본 발명은 피검자의 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해, 특히 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충 또는 리슈만편모충으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발된 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 예방에 사용되는, 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자 A 바이러스, 약독화된 인플루엔자 벡터 또는 약학적 조성물을 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 이 방법은 병원체 바이러스, 박테리아 또는 원생동물에 의해 유발된 감염성 질환, 특히 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충, 또는 리슈만편모충으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발된 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 것이다. 또한, 이 방법은 피검자의 종양 질환을 치료하기 위한 것이며, 특히 종양 질환은 결장직장 암, 식도분문암, 췌장암, 담관세포암, 신경아교종, 교모세포종 및 흑색종으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
피검자에 대한 투여는 임의의 표준 방법으로 이루어질 수 있고, 특히 근육내, 정맥내, 구강, 설하, 흡입 또는 비내 투여될 수 있다. 인플루엔자 벡터 또는 약학적 조성물은 피검자에게 1회, 2회 또는 3회 투여될 수 있고; 단일 투여가 바람직하다.
또한, 암 치료 시, 투여는 종양내 투여, 수술에 의한 종양 제거 후 형성된 공동으로의 투여, 또는 정맥내 투여일 수 있다.
본 발명은 이하 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아닌 양태들에 의해 예시된다.
실시예
실시예 1
변형된 NS 게놈 단편을 가진 인플루엔자 벡터의 생산
재조합 바이러스는 여러 단계로 조립했다. 제1 단계로, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(H1N1)의 전체 8개 게놈 단편들의 상보성 DNA(cDNA) 카피를 유전자은행의 데이터를 사용하여 합성했다: pHbank-PR8-HA(진뱅크 수탁번호: EF467821.1), pHW-PR8-NA(진뱅크 수탁번호: AF389120.1), pHW-PR8-PB2(진뱅크 수탁번호: AB671295), pHW-PR8-PB1(진뱅크 수탁번호: CY033583), pHW-PR8-PB1(진뱅크 수탁번호: CY033583), pHW-PR8-PA(진뱅크 수탁번호: AF389117), pHW-PR8-NP(진뱅크 수탁번호: AF389119), pHW-PR8-M(진뱅크 수탁번호: AF389121), pHW-PR8-NS(진뱅크 수탁번호: J02150.1)). 제2 단계로, 합성된 서열을 양방향 플라스미드 pHW2000계 벡터에 클로닝했다(Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG, A DNA from eight plasmids, Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(11): 6108-13). 이 플라스미드 벡터는 Pol I 및 Pol II 프로모터의 존재로 인해, 포유동물 세포에 형질감염 시에 바이러스 RNA 및 대응하는 메신저 RNA의 동시적인 세포내 전사를 제공했다.
변형 없이 PB1, PB2, PA, HA, NA, NP 및 M을 암호화하는 7개의 플라스미드 클론, 및 도 1에 제시된 원칙에 따라 변형을 가진 NS 게놈 단편의 변형체 세트를 생산했다.
도 1 (A)는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 NS 게놈 단편의 모식도이다. 네거티브 극성의 바이러스 RNA(vRNA)의 전장의 게놈 단편은 길이가 230 뉴클레오타이드(nt)였다. 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체에 의한 NS 단편의 전사는 2종의 메신저 RNA를 형성시킨다: 1. 230 아미노산 잔기(aa)를 가진 NS1 단백질을 암호화하는 NS1 단백질의 mRNA인 직접 전사체 및 2. 121aa을 가진 단백질을 암호화하는 Nep 단백질의 결찰된 mRNA. 도 1 (B)는 NS1 단백질의 판독 프레임이 398 nt 이하를 함유하고 3개의 정지 코돈에 의해 종결된 이종 서열의 삽입에 의해 연장될 수 있는, 유전자 변형된 키메라성 NS 게놈 단편의 모식도이다. Nep 단백질을 암호화하는 서열은 다른 인플루엔자 A 바이러스 아형 유래의 이종 서열로 대체된다. 변형의 결과로서, 키메라성 NS 게놈 단편은 NS1 판독 프레임에 삽입된 이종 서열의 길이에 따라 달라지는 길이를 보유한다.
암호화 영역 및 5'- 및 3'-말단 비-암호 영역을 포함하는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 뉴클레오타이드 서열(진뱅크 데이터베이스의 서열 번호 J02150)을 NS 게놈 단편의 키메라성 작제물을 개발하기 위한 기초로서 사용했다. 목적에 따라, NS 게놈 단편의 키메라성 작제물의 다양한 변형체를 작제했고, 이의 공통 특징은 다음과 같다: 1) A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 Nep 단백질을 암호화하는 서열 대신 H2N2 인플루엔자 바이러스 아형(균주: A/Singapore/1/57 및 A/Leningrad/134/47/57)에서 유래하는 서열로의 대체(도 2 (B) 및 2 (C)); 2) NS1-암호화 영역부터 최대 Nep 결찰 부위까지 30개의 뉴클레오타이드(위치 499-428 nt)로 이루어지는 서열의 결실; 3) 뉴클레오타이드 위치 399 다음에 3개의 연속 정지 코돈(TGATAATAA)의 카세트를 삽입함으로써 124 아미노산 잔기까지 NS1 단백질의 판독 프레임의 제한(도 2 (A) 및 (B)); 4) 뉴클레오타이드 위치 398 다음, 정지 코돈 카세트 바로 앞에서 NS1 판독 프레임에 삽입된 이종 유전자 서열의 존재 또는 부재.
도 2 (A)는 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 NS 단편의 서열(서열번호 1)을 도시한 것으로, B 및 C의 작제물을 생산하기 위해 결실되는 30 nt로 이루어지는 서열이 강조되고 밑줄쳐져 있다. 다른 인플루엔자 A 바이러스 아형의 이종 유사체로 대체될 Nep 유전자의 서열은 진하게 표시된 부분이다. 도 2 (B)는 NS1 단백질의 판독 프레임이 3개의 연속 정지 코돈(밑줄 표시됨)으로 이루어진 삽입에 의해 398 nt로 절삭되고, Nep 서열(진하게 표시됨)이 A/Singapore/1/57(H2N2) 바이러스로부터 차용된 인플루엔자 A 바이러스의 재조합 NS 단편의 서열(서열번호 2)을 도시한 것이다. 도 2 (C)는 NS1 단백질의 판독 프레임이 3개의 연속 정지 코돈(밑줄 표시됨)으로 이루어진 삽입에 의해 398 nt로 절삭되고, Nep 서열(진하게 표시됨)이 A/Leningrad/134/47/57(H2N2) 바이러스로부터 차용된 인플루엔자 A 바이러스의 재조합 NS 단편의 서열(서열번호 3)을 도시한 것이다.
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATG GATAAAAACATCATACTGAAAGCGAACTTC AGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGGTAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCATTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (서열번호 1)
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATG TGATAATAA AGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTAATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTAAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGTGAAACAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTAGGTCAAAAGTTCGAAGAAATAAGATGGCTGATTGAAGAAGTGAGACACAAATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACAGCTACTATTTGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (서열번호 2)
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATG TGATAATAA AGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTAATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTAAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTAGGTCAAAAGTTCGAAGAAATAAGATGGCTGATTGAAGAAGTGAGACACAAATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATACAAGCCTTACAGCTACTATTTGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (서열번호 3)
즉, 작제된 키메라성 NS 게놈 단편은 폴리머라제 인플루엔자 바이러스 복합체에 의해 전사되었을 때 2종의 메신저 RNA를 형성했다: 1) 124 아미노산 잔기로 절삭된 NS1 단백질의 형태로 해독되고 정지 코돈에 의해 제한되거나 다른 기원의 전이유전자 서열의 삽입에 의해 연장되고 그 해독은 정지 코돈 카세트에 의해 제한되는 NS1 mRNA; 2) 다른 항원성 아형의 인플루엔자 A 바이러스에서 유래되는 이종 Nep mRNA. 삽입이 있는 재조합 NS1 단백질의 해독 변형체는 이하 도 3과 표 1에 제시했다.
A/Leningrad/134/47/57(H2N2) 바이러스에서 유래하는 이종 Nep를 보유하는 재조합 바이러스의 NS1 판독 프레임에서 해독된 단백질의 아미노산 서열
명칭 아미노산 서열 설명
NS124/Nep-Len
 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM (SEQ ID NO:4) 이종 서열의 삽입 없이, 124 aa으로 절삭된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스
NS124-HA2(A)-185 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG-GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHH QNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQ(SEQ ID NO:5) 124 aa으로 절삭되고 인플루엔자 A 바이러스 HA2 서브유닛(진하게 표시됨)의 해독된 서열 1 내지 185 aa에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스
NS124-HA2(A)-65-222 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG- AVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDI WTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO:6) 124aa으로 절삭되고 인플루엔자 A 바이러스 HA2 서브유닛의 해독된 서열(진하게 표시됨) 65 내지 222aa에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스
NS124-HA2(A)-23-185 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG-GYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI TNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQ (SEQ ID NO:7) 124aa으로 절삭되고 인플루엔자 A 바이러스 HA2 서브유닛의 해독된 서열(진하게 표시됨) 23 내지 185aa에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스
NS124-HA2(B)-186 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG- GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYT SHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMNGLHDEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGDFSLPTFD (SEQ ID NO:8) 124aa으로 절삭되고 인플루엔자 B 바이러스 HA2 서브유닛의 해독된 서열(진하게 표시됨) 1 내지 186aa에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스
NS124-Fus(A)-NP MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG-GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGW-GG- RESRNPGNA (SEQ ID NO:9) 124aa으로 절삭되고 인플루엔자 A 바이러스 HA2 서브유닛의 해독된 서열(진하게 표시됨) 1 내지 186aa에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임, 및 인플루엔자 A 바이러스 NP 단백질의 보존적 B-세포 에피토프의 서열을 가진 바이러스. GG는 작제물 성분을 분리하는 글리신 삽입을 의미한다.
NS124-Fus(B)-NP MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG- GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGW -GG- RESRNPGNA (SEQ ID NO:10) 124aa으로 절삭되고 인플루엔자 B 바이러스 HA2 서브유닛의 해독된 서열(진하게 표시됨) 1 내지 21aa에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임, 및 인플루엔자 A 바이러스 NP 단백질의 보존적 B-세포 에피토프의 서열을 가진 바이러스. GG는 작제물 성분을 분리하는 글리신 삽입을 의미한다.
NS124-Esat6
 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG-MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA (SEQ ID NO:11) 124aa으로 절삭되고 결핵균 단백질 Esat6의 해독된 서열(진하게 표시됨)에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스
NS124-2A-Esat6 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-GG- NFDLLKLAGDVESNPGP -MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA (SEQ ID NO:12) 124aa으로 절삭되고 자기 절단성 2A 펩타이드의 헤독된 서열(피코나바이러스 유래)에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임, 및 결핵균 단백질 Esat6의 서열을 가진 바이러스
NS124-HSV-2ASY MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIM-AAA-NLLTTPKFT-AAA-RMLGDVMAV-AAA-NLLTTPKFT-AAA-RMLGDVMAV(SEQ ID NO:13) 124aa으로 절삭되고 헤르페스 단순바이러스(HSV) 1형 및 2형의 T 세포 에피토프의 해독된 서열(진하게 표시됨)에 의해 연장된 NS1 단백질의 판독 프레임을 가진 바이러스. 에피토프 삽입은 반복적으로 수행된다.
재조합 바이러스는 VERO 세포를 인플루엔자 바이러스의 게놈 미변형 단편들을 암호화하는 7개의 플라스미드 및 키메라성 NS 게놈 단편의 변형체들 중 하나로 플라스미드 DNA 전기침투 방법(Cell Line Nucleofector® Kit V(Lonza))의 사용 지침에 따라 형질감염시켜 조립했다. 형질감염 후, 세포는 Optipro 배지(Invitrogen)에서 헤마글루티닌 전구체를 HA1 및 HA2 서브유닛으로 해독후 절단하기 위한 1㎍/ml 트립신의 첨가 하에 34℃에서 96시간 동안 배양했다. Vero 세포로부터 바이러스 수확물을 사용하여 10일령의 닭 배아(SPF)를 감염시켰다. 배아는 34℃에서 48시간 동안 항온처리했고, 그 후 적혈구응집 반응에 양성 역가를 가진 요막액을 사용하여 닭 배아에서 2차 계대배양했다. 2차 계대배양의 요막액을 일정량 취하여 -80℃에 보관했다. 2차 계대배양물은 키메라성 NS 단편의 유전자 구조 및 RT-PCR 산물의 생산과 이의 서열분석에 의한 전이유전자의 존재를 통제하는데 사용했다. 또한, 2차 계대배양물은 재조합 바이러스 균주 및 벡터의 표현형 마커를 측정하고, 닭 배아에서 5차 계대배양 동안 전이유전자의 유전자 안정성을 측정하는데 사용했다.
실시예 2
이종 Nep -운반 재조합 바이러스의 약독화 및 온도 민감성 표현형의 측정
바이러스의 온도 민감성은 96웰 평판에서 최적 온도인 34℃ 및 승온인 39℃에서 Vero 세포에 미치는 바이러스의 감염 활성을 비교 적정하여 측정했다. 바이러스 역가는 96시간 항온배양 후에 평판 웰에서 세포변성 효과의 발생을 참작하여 리드-무엔흐(Reed-Muench)법으로 계수했다(Reed, LJ, Muench, H.(1938). "The A simple method of estimating fifty percent endpoints." The American Journal of Hygiene 27: 493-497). 도 4 (A)는 상기 온도에서의 바이러스 역가를 50% 조직 세포변성 용량(Log TCD50/ml)으로 표현했다. A/Singapore/1/57(H2N2) 또는 A/Leingrad/134/47/57(H2N2) 균주 유래의 이종 Nep를 운반하는 바이러스는 둘 다 놀랍게도 39℃에서 감염 역가가 34℃의 적정 온도에 비해, 4 log 넘게 유의적으로 감소한다는 것을 보여주었다. 대조 균주인 야생형 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스 및 절삭형 NS1 단백질과 동종 Nep 단백질을 가진 재조합 NS124/Nep PR8 바이러스는 고온에서 실질적으로 복제하여 온도 민감성을 나타내지 않았다. 즉, Nep의 대체는 바이러스에 ts 표현형을 출현시켰다.
더욱이, 약한 마취하의 마우스에 6 log/마우스 용량의 상기 바이러스에 의한 비내 감염 시, 바이러스-이종 Nep 유전자의 담체는 동종 Nep를 가진 NS124/Nep PR8 바이러스 및 야생형 바이러스에 비해 폐 조직에서 증식 능력이 저하되었다(p<0.002)(도 4 (B)). 폐에서의 바이러스 역가는 Vero 세포에서 청징화된 폐 파쇄액의 적정에 의해 동물을 감염시킨 후 2일째 평가했다. 폐 역가는 log TCD50/g 폐 조직으로 나타냈다. 즉, 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 균주에 키메라성 NS 게놈 단편의 도입은 바이러스를 약독화시켰고, 이는 동물의 하기도에서의 증식 능력의 저하로 명백하게 입증되었다.
실시예 3
키메라성 NS 게놈 단편 및 NS1 단백질의 판독 프레임에 다양한 삽입을 운반하는 벡터의 ts 표현형 및 약독화의 측정
다른 본성의 삽입을 암호화하는 광범위한 벡터 세트를 만들어, 키메라성 Nep 유전자를 함유하는 바이러스의 ts 표현형에 미치는 NS1 단백질의 판독 프레임에 삽입된 이종 서열의 효과를 측정했다. 도 3에 도시한 삽입을 가진 바이러스들을 조사했다. ts 표현형은 34℃ 및 39℃의 온도에서 10일령의 닭 배아(ChE)에서의 바이러스 감염 활성을 적정하여, 항온배양 후 48시간째 수집한 요막액의 적혈구응집 활성을 측정함으로써 조사했다. 역가는 리드 무엔흐 방법으로 계산하고 50% 배아 감염 용량의 log 값(log EID50/ml)으로 나타냈다. 표 2에 제시된 데이터에서 알 수 있듯이, 모든 벡터는 야생형 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스와 대조적으로 고온에서 유의적으로 감소된 증식 능력을 나타냈고, 삽입은 없지만 이종 Nep를 운반하는 원형 키메라성 균주에 대응하는 ts 표현형 마커를 나타냈다.
바이러스/벡터 NS 단편 조성* 각 온도에서 ChE에서의 수율(Log EID50/ml) ts 표현형***
NS1 길이 (aa) Nep 기원 균주** 34℃ 39℃
A/PR/8/34 230 A/PR/8/34 (H1N1) 9.8 9.5 무
NS124/Nep-Len 124 Len 8.8 2.8 유
NS124/Nep-Sing 124 Sing 8.8 3.3 유
NS124-HA2(A)-185 124 Len 8.3 2.8 유
NS124-HA2(A)-65-222 124 Len 8.5 3.0 유
NS124-HA2(A)-23-185 124 Len 8.3 3.5 유
NS124-HA2(?)- 186 124 Len 8.8 3.5 유
NS124-Fus(A)-NP 124 Len 8.0 2.8 유
NS124-Fus(B)-NP 124 Len 8.5 2.5 유
NS124-Esat6 124 Len 9.5 3.8 유
NS124-2A-Esat6 124 Len 9.8 4.0 유
NS124-HSV-2ASY 124 Len 8.0 2.5 유
설명: * 삽입 전에 천연 NS1 단백질 서열의 길이(아미노산 잔기); ** Nep 유전자 기원의 균주: A/PR/8/34 (H1N1) 또는 A/Singapore/1/57(H2N2), 또는 A/Leningrad/134/47/57 (H2N2); *** 34℃와 39℃에서 바이러스 증식의 차이가 2 log를 초과하면 ts-표현형은 양성으로 간주한다.
동물에 대한 벡터 균주의 약독화(att)에 미치는 삽입의 효과를 측정하기 위해, 마우스를 약한 마취하에 도 3에 도시된 바이러스 또는 벡터로 감염된 닭 배아의 바이러스 함유 요막액으로 공격했다. 요막액은 예비적으로 함유된 감염성 바이러스 역가의 수준을 특징으로 했다. 역가는 log EID50/ml으로 나타냈다. 마우스에 각 바이러스 샘플 0.05ml를 주입했다. 각 그룹의 마우스는 8마리였다. 바이러스의 치사 활성은 12일 동안 평가했다. 3.2 log EID50/ml의 역가를 가진 물질을 사용할 때 50% 치사 효과를 유발한 야생형 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스와 달리, 7.5 log 초과의 감염 용량에서 마우스에 50% 치사 활성을 나타내는 벡터들은 전혀 없었다. 즉, 키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 모든 벡터들은 삽입에 상관없이 마우스에 매우 약독성이었다(표 3).
바이러스의 마우스 치사 용량
바이러스/벡터 50% 치사 바이러스 용량 (LD50/ml) Att-표현형*
A/PR/8/34 3.2 무
NS124/Nep-Len > 7.5 유
NS124/Nep-Sing > 7.5 유
NS124-HA2(A)-185 > 7.5 유
NS124-HA2(A)-65-222 > 7.5 유
NS124-HA2(A)-23-185 > 7.5 유
NS124-HA2(?)-186 > 8.0 유
NS124-Fus(A)-NP > 8.0 유
NS124-Fus(B)-NP > 8.0 유
NS124-Esat6 > 7.5 유
NS124-2A-Esat6 > 7.5 유
NS124-HSV-2ASY > 7.5 유
* 약독화 표현형은 7.0 log EID50/마우스를 초과하는 보호 용량에서 치사 활성의 부재를 통해 측정했다.
실시예 4
마우스의 대조 감염에서 인플루엔자 A 및 B 바이러스들의 이종 균주들에 대한 보호 반응
인플루엔자 바이러스의 이종 항원 변형체들에 대한 보호 활성은 바이러스 A/Leningrad/134/47/57(H2N2)의 Nep 서열과 키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스 유래의 표면 항원을 가진 바이러스를 사용하여 측정했다. NS 판독 프레임에서 헤마글루티닌 HA2 서브유닛 영역을 암호화하는 다음과 같은 재조합 바이러스를 사용했다: 1) 185개 아미노산 잔기의 전장의 인플루엔자 A 바이러스 HA2 엑토도메인을 발현하는 벡터 NS124-HA2(A)-185(도 3, 서열번호 5), 2) 186개 아미노산 잔기의 전장의 인플루엔자 B 바이러스 HA2 엑토도메인을 발현하는 벡터 NS124-HA2(A)-185(도 3, 서열번호 8), 3) 인플루엔자 A 바이러스 NP 단백질 유래의 보존적 B-세포 에피토프의 서열과 함께 HA2의 N-말단 21 아미노산 잔기(융합 도메인)로 이루어지는 서열을 발현하는 벡터 NS124-Fus(A)-NP(도 3, 서열번호 9), 및 4) NS1 단백질의 해독을 124개 아미노산 잔기로 제한하는 NS 게놈 단편의 뉴클레오타이드 서열 위치 399에 정지 코돈 카세트를 보유하는 NS124/Nep-Len 바이러스(도 3, 서열번호 4). 대조 그룹은 유전자 변형이 없는 야생형 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스로 감염된 마우스, 또는 활성 성분 없이 인산염 완충 용액을 투입한 마우스를 포함했다. 약한 마취하에 6.5 log/마우스의 단일 바이러스 용량으로 마우스를 비내 면역화했다. 28일 후, 동물은 마우스-병원성 이종 인플루엔자 균주, A/Mississippi/85/1(H3N2) 또는 B/Lee/40으로 각각 3 내지 5 LD50에 해당하는 용량으로 대조 감염시켰다.
도 5 (A)에서 볼 수 있듯이, 바이러스(H3N2)에 의한 비-면역 마우스의 대조 감염은 80% 사망률을 초래했다. 동시에, 바이러스 제제로 면역화된 마우스는 이종 인플루엔자 A(H3N2) 바이러스 균주에 의한 감염에도 사망으로부터 완전하게 보호되었다. 또한, 야생형 바이러스에 의한 면역화도 역시 이종 균주에 의한 감염에 대하여 통계적으로 유의적인 수준의 보호를 초래했다. 대조 감염이 인플루엔자 B/Lee/40 바이러스에 의해 수행되었을 때, 인산염 완충 용액으로 면역화된 마우스뿐만 아니라 야생형 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에 의한 마우스의 면역화는 동물을 사망으로부터 보호하지 못했다(도 5 (B)). 놀랍게도, NS1 단백질의 판독 프레임에 삽입을 운반하는 재조합 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 보호를 나타내는 것으로 발견되었다. 벡터 NS124-Fus(A)-Np가 최대 보호 수준을 나타냈다. 따라서, 마우스의 단일 비내 면역화시, 키메라 NS 게놈 단편을 운반하는 벡터 균주는 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 모두의 이종 항원성 아형에 대하여 효과적인 만능 인플루엔자 백신의 성질을 나타냈다.
실시예 5
인플루엔자 B 바이러스 HA2 영역 및 H1N1pdm 바이러스 표면 당단백질의 서열을 암호화하는 변형된 NS 게놈 단편을 가진 인플루엔자 벡터의 생산
재조합 바이러스는 여러 단계들로 조립했다. 제1 단계로, 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 5개의 게놈 단편(PB2, PB1, PA, NP, M)(PB2(진뱅크 수탁번호: AB671295), PB1(진뱅크 수탁번호: CY033583), PA(진뱅크 수탁번호: AF389117), NP(진뱅크 수탁번호: AF389119), M(진뱅크 수탁번호: AF389121)) 및 A/California/7/09 유사 바이러스의 2개의 게놈 단편(HA, NA)(HA(진뱅크: KM408964.1) 및 NA(진뱅크: KM408965.1))의 상보성 DNA(cDNA) 카피들을 생산했고, H1N1 바이러스와 관련된 서열(NS1 유전자), H2N2 바이러스와 관련된 서열(Nep 유전자) 및 인플루엔자 B 바이러스 H2 영역 및 인플루엔자 A 바이러스 NP 영역 유래의 2개의 펩타이드의 서열들로 구성된 키메라성 NS 게놈 단편을 합성했다.
제2 단계로, 합성된 서열들을 양방향 플라스미드 pHW2000계 벡터에 클로닝했다(Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG, A DNA from eight plasmids, Proc Natl Acad Sci USA. 2000: 97(11): 6108-13). 이 플라스미드 벡터는 Pol I 및 Pol II 프로모터의 존재로 인해 포유동물 세포의 형질감염 시 바이러스 RNA 및 대응하는 메신저 RNA의 동시적인 세포내 전사를 제공한다. 도 7은 인플루엔자 바이러스의 유전자 다이아그램을 도시한 것이다. 도 8은 백신 벡터의 전체 8개 게놈 단편들의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.
게놈 PB2의 뉴클레오타이드 서열
1 agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg
61 tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc
121 aagaagtaca catcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg
181 gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat
241 gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta
301 tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat
361 ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc
421 cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcggagag ttgacataaa tcctggtcat
481 gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa
541 gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa
601 gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg
661 gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg
721 ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg
781 aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca
841 gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga
901 attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc
961 aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag
1021 agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca
1081 ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca
1141 gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa
1201 cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata
1261 aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg
1321 catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt
1381 gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc
1441 gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg
1501 gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagaatcc gggaccaacg aggaaatgta
1561 ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac
1621 tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa
1681 tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta
1741 tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa
1801 tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat
1861 accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg
1921 cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc
1981 aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat
2041 gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg
2101 aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat
2161 gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg
2221 gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc
2281 aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac
2341 t (SEQ ID NO:14)
게놈 PB1의 뉴클레오타이드 서열
1 atggatgtca atccgacctt acttttctta aaagtgccag cacaaaatgc tataagcaca
61 actttccctt atactggaga ccctccttac agccatggga caggaacagg atacaccatg
121 gatactgtca acaggacaca tcagtactca gaaaagggaa gatggacaac aaacaccgaa
181 actggagcac cgcaactcaa cccgattgat gggccactgc cagaagacaa tgaaccaagt
241 ggttatgccc aaacagattg tgtattggag gcgatggctt tccttgagga atcccatcct
301 ggtatttttg aaaactcgtg tattgaaacg atggaggttg ttcagcaaac acgagtagac
361 aagctgacac aaggccgaca gacctatgac tggactctaa atagaaacca acctgctgca
421 acagcattgg ccaacacaat agaagtgttc agatcaaatg gcctcacggc caatgagtct
481 ggaaggctca tagacttcct taaggatgta atggagtcaa tgaacaaaga agaaatgggg
541 atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata
601 acacagagaa caatgggtaa aaagaagcag agattgaaca aaaggagtta tctaattaga
661 gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca
721 attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg
781 agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca
841 aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc
901 accatcactg gagataacac caaatggaac gaaaatcaga atcctcggat gtttttggcc
961 atgatcacat atatgaccag aaatcagccc gaatggttca gaaatgttct aagtattgct
1021 ccaataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctgggaaaag ggtatatgtt tgagagcaag
1081 agtatgaaac ttagaactca aatacctgca gaaatgctag caagcatcga tttgaaatat
1141 ttcaatgatt caacaagaaa gaagattgaa aaaatccgac cgctcttaat agaggggact
1201 gcatcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaata tgttaagcac tgtattaggc
1261 gtctccatcc tgaatcttgg acaaaagaga tacaccaaga ctacttactg gtgggatggt
1321 cttcaatcct ctgacgattt tgctctgatt gtgaatgcac ccaatcatga agggattcaa
1381 gccggagtcg acaggtttta tcgaacctgt aagctacttg gaatcaatat gagcaagaaa
1441 aagtcttaca taaacagaac aggtacattt gaattcacaa gttttttcta tcgttatggg
1501 tttgttgcca atttcagcat ggagcttccc agttttgggg tgtctgggat caacgagtca
1561 gcggacatga gtattggagt tactgtcatc aaaaacaata tgataaacaa tgatcttggt
1621 ccagcaacag ctcaaatggc ccttcagttg ttcatcaaag attacaggta cacgtaccga
1681 tgccatagag gtgacacaca aatacaaacc cgaagatcat ttgaaataaa gaaactgtgg
1741 gagcaaaccc gttccaaagc tggactgctg gtctccgacg gaggcccaaa tttatacaac
1801 attagaaatc tccacattcc tgaagtctgc ctaaaatggg aattgatgga tgaggattac
1861 caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg
1921 aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt
1981 gcaacaacac actcctggat ccccaaaaga aatcgatcca tcttgaatac aagtcaaaga
2041 ggagtacttg aggatgaaca aatgtaccaa aggtgctgca atttatttga aaaattcttc
2101 cccagcagtt catacagaag accagtcggg atatccagta tggtggaggc tatggtttcc
2161 agagcccgaa ttgatgcacg gattgatttc gaatctggaa ggataaagaa agaagagttc
2221 actgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atagtgaatt
2281 tagcttgt (SEQ ID NO:15)
게놈 PA의 뉴클레오타이드 서열
1 agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg
61 attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca
121 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agattttcac
181 ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg
241 aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac
301 agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac
361 aaggagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg
421 gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg
481 gaagaaatgg ccacaaaggc agactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa
541 accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt
601 cagtccgaga gaggagaaga gacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aacaatgcgc
661 aagcttgccg accaaagtct cccgccgaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat
721 gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tgtctcaaat gtccaaagaa
781 gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa acaacaccac gaccacttag acttccgaat
841 gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt
901 gaggacccaa gtcatgaagg agagggaata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga
961 acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca
1021 aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag
1081 aaaattccaa agactaaaaa tatgaagaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag
1141 aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gactgtaaag atgtaggtga tttgaagcaa
1201 tatgatagtg atgaaccaga attgaggtcg ctagcaagtt ggattcagaa tgagtttaac
1261 aaggcatgcg aactgacaga ttcaagctgg atagagctcg atgagattgg agaagatgtg
1321 gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacatcaga ggtgtctcac
1381 tgcagagcca cagaatacat aatgaagggg gtgtacatca atactgcctt gcttaatgca
1441 tcttgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag
1501 gagggaaggc gaaagaccaa cttgtatggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg
1561 aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt
1621 gaaccacata aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct tataagaagt
1681 gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga gaacaaatgg aacctcaaaa
1741 attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc tccagtcact tcaacaaatt
1801 gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt
1861 gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga ggaaagttcc
1921 attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat tcaacagctt gtatgcatct
1981 ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt
2041 agggacaacc ttgaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag
2101 tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcttctt ggttcaactc cttccttaca
2161 catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta
2221 ccttgtttct act (SEQ ID NO:16)
게놈 NP의 뉴클레오타이드 서열
1 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact
61 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt
121 tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct
181 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg
241 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa
301 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc
361 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata
421 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga
481 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact
541 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat
601 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat
661 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga
721 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa
781 gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc
841 ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc
901 cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg
961 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt
1021 ttctact (SEQ ID NO:17)
게놈 M의 뉴클레오타이드 서열
1 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact
61 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt
121 tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct
181 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg
241 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa
301 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc
361 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata
421 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga
481 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact
541 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat
601 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat
661 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga
721 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa
781 gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc
841 ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc
901 cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg
961 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt
1021 ttctact (SEQ ID NO:18)
게놈 HA의 뉴클레오타이드 서열
1 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta
61 tgtataggtt atcatgcaaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat
121 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa
181 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga
241 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agttcatggt cctacattgt ggaaacatct
301 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatca attatgagga gctaagagag
361 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaaaac aagttcatgg
421 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcacgctgg agcaaaaagc
481 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagccaa
541 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctgt ggggcattca ccatccatct
601 actactgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggaca
661 tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcaa
721 gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa
781 gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcacaa tggaaagaaa tgctggatct
841 ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca gacacccgag
901 ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt
961 ccaaagtatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tgtcccgtct
1021 attcaatcta gaggcctatt cggggccatt gccggcttca ttgaaggggg gtggacaggg
1081 atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc
1141 gacctgaaga gcacacaaaa tgccattgac aagattacta acaaagtaaa ctctgttatt
1201 gaaaagatga atacacagtt cacagcagtg ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga
1261 atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc
1321 gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accatgattc aaatgtgaag
1381 aacttgtatg aaaaggtaag aaaccagtta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc
1441 tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact
1501 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaaaaaat agatggggta
1561 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca
1621 ttggtgctgg tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtctcta
1681 cagtgtagaa tatgtattta a (SEQ ID NO: 19)
게놈 NA의 뉴클레오타이드 서열
1 atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct gtatgacaat tggaatggct
61 aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga ttagccactc aattcaagtt
121 gggaatcaaa gtcagatcga aacatgcaat caaagcgtca ttacttatga aaacaacact
181 tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact ttgctgctgg gcagccagtg
241 gtttccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg ttagtggatg ggctatatac
301 agtaaagaca acagtgtaag agtcggttcc aagggggatg tgtttgtcat aagggaacca
361 ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct tgactcaagg ggccttgcta
421 aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc catatcgaac cttaatgagc
481 tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat ttgagtcagt cgcttggtca
541 gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg gaatttctgg cccagacagt
601 ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacggc ataataacag acactatcaa gagttggaga
661 aacgatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttacc
721 ataatgaccg atggaccaag tgatggacag gcctcataca agatcttcag aatagaaaag
781 ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc
841 tgttatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg ataactggca tggctcgaat
901 cgaccgtggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga taggatacat atgcagtggg
961 attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca gttgtggtcc agtatcgtct
1021 aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg gcaatggtgt ttggataggg
1081 agaactaaaa gcattagttc aagaaaaggt tttgagatga tttgggatcc aaatggatgg
1141 actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg taggaataaa tgagtggtca
1201 ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag ggctggattg tataagacct
1261 tgcttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagtggg
1321 agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt
1381 gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa (SEQ ID NO: 20)
키메라성 NS 단편 유전자의 뉴클레오타이드 서열(삽입은 진한 글자이다)
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGGAGGAGGTTTCTTCGGAGCTATTGCTGGTTTCTTGGAAGGAGGATGGGAAGGAATGATTGCAGGTTGGGGAGGAAGAGAGAGCCGGAACCCAGGGAATGCTTGATAATAAGCGGCCGCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTAATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTAAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTAGGTCAAAAGTTCGAAGAAATAAGATGGCTGATTGAAGAAGTGAGACACAAATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATACAAGCCTTACAGCTACTATTTGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (SEQ ID NO: 21)
재조합 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 게놈 미변형 단편들을 암호화하는 8개의 플라스미드 및 키메라성 NS 게놈 단편으로 플라스미드 DNA 전기침투법(Cell Line Nucleofector® Kit V(Lonza))의 사용 지침에 따라 VERO 세포를 형질감염시켜 조립했다. 형질감염 후, 세포는 1㎍/ml 트립신의 첨가하에 34℃에서 96시간 동안 Optipro 배지(Invitrogen)에서 항온배양하여 헤마글루티닌 전구체의 HA1 및 HA2 서브유닛으로의 해독후 절단을 보장했다. Vero 세포로부터의 바이러스 수확물을 사용하여 10일령의 닭 배아(SPF)를 감염시켰다. 배아는 34℃에서 48시간 동안 항온배양했고, 이후 적혈구응집 반응에서 양성 역가를 가진 요막액을 다음 계대배양을 위해 닭 배아에 사용했다. 7차 계대배양한 요막액을 접선유동여과(tangential flow filtration)로 정제하고 동결보관했다. 이 동결물을 등량의 증류수로 용해한 후 동물을 면역화시켰다.
실시예 6
마우스의 대조 감염에서 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 이종 균주에 대한 보 호 반응
인플루엔자 바이러스의 이종 항원 변형체에 대한 보호 활성은 마우스를 약한 마취하에 50㎕ 부피의 6.8 log EID50/마우스 용량의 인플루엔자 벡터로 1회 또는 3주 기간을 두고 2회 비내 면역화하여 측정했다. 마지막 면역화 후 21일째, 동물을 마우스-병원성 이종 인플루엔자 균주들, 즉 동종 A/California/7/09(H1N1pdm) 또는 이종 A/Aichi/2/68(H3N2), A/Mississippi/85/1(H3N2) 또는 인플루엔자 B/Lee/40 바이러스로 각각 3 내지 5 LD50에 해당하는 용량으로 대조 감염시켰다.
도 9 (A)에서 볼 수 있듯이, H1N1pdm 바이러스에 의한 비-면역 마우스의 대조 감염은 90%의 사망률을 초래했다. 하지만, 바이러스 제제로 1회 또는 2회 면역화된 마우스는 사실상 사망으로부터 보호되었다.
도 9 (B)에서 볼 수 있듯이, A/Aichi/2/68(H3N2) 바이러스에 의한 비-면역 마우스의 대조 감염은 100% 사망률을 초래했다. 하지만, 바이러스 제제로 1회 또는 2회 면역화된 마우스는 사실상 사망으로부터 보호되었다.
도 9 (C)에서 볼 수 있듯 이, A/Mississippi/85/1(H3N2) 바이러스에 의한 비-면역 마우스의 대조 감염은 100% 사망률을 초래했다. 하지만, 바이러스 제제로 2회 면역화된 마우스는 100% 보호되었다.
도 9 (D)에서 볼 수 있듯이, B/Lee/40 인플루엔자 바이러스에 의한 비-면역 마우스의 대조 감염은 100% 사망률을 초래했다. 하지만, 바이러스 제제로 2회 면역화된 마우스는 대조군과 매우 다른 60% 보호율을 나타냈다.
즉, 키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 인플루엔자 벡터는 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 모두의 이종 항원성 아형에 대하여 효과적인 만능 인플루엔자 백신의 성질을 나타냈다.
실시예 7
페레트의 대조 감염에서 이종 인플루엔자 A( H3N2 ) 균주에 대한 보호 반응
페레트는 인플루엔자 백신 및 약물의 효과를 연구하는데 있어서 WHO가 권장하는 최적의 모델이다. 인플루엔자 바이러스의 이종 항원 변형체에 대한 보호 활성은 페레트(그룹당 9마리)를 약한 마취하에 500㎕ 부피의 실시예 5에서 생산된 인플루엔자 벡터 7.5 log EID50/페레트 용량으로 1회 또는 3주 간격으로 2회 비내 투여하여 면역화시켜 측정했다. 마지막 면역화 후 21일째, 동물은 페레트-병원성 A/St.Petersburg/224/2015(H3N2) 바이러스로 대조 감염시켰다. 도 10 (A)에서 확인되듯이, 비-면역 동물의 대조 감염은 감염 2일 후 체온 상승을 초래했고, 이에 반해 백신접종된 동물은 온도 반응을 나타내지 않았다.
페레트의 기도에서 대조 바이러스의 증식에 미치는 백신접종의 효과는 2일, 4일 및 6일째 동물에서 취한 비측 세척물을 사용하여 MDCK 세포 배양물 중 50% 세포변성 용량의 적정을 통해 감염성 바이러스의 농도를 측정했다. 도 10 (B)에서 볼 수 있듯이, 비-면역 페레트의 대조 감염은 6일까지 역가의 큰 감소 없이 바이러스의 활성 증식을 초래했다. 페레트의 단일 면역화 시에는 항원공격 후 4일 및 6일째 바이러스 역가의 유의적인 감소가 관찰되었다. 이중 면역화 후에는 바이러스 역가의 100배가 넘는 유의적인 감소가 동물 감염 후 2일째에 이미 기록되었다.
즉, 심지어 인플루엔자 벡터에 의한 페레트의 단일 백신접종은 온도 반응 형태의 임상 징후로부터 동물의 보호를 초래했고, 기도로부터 대조 이종 균주의 가속화된 제거를 촉진시켰다. 반복 면역화는 바이러스 제거 과정을 가속시켰다.
실시예 8
미코박테리아 단백질 Esat6을 암호화하는 인플루엔자 벡터의 종양용해 효과
이종 Nep 유전자와 키메라성 NS 게놈 단편을 운반하는 약독화된 인플루엔자 벡터의 종양용해능은 우측 뒷발의 피하 공간에 106 B16 세포를 30㎕ 부피로 투여하여 유도된 마우스 흑색종을 바이러스들로 처리하여 측정했다. 각 그룹은 10마리였다. 치료는 종양 세포 투여후 5일째 수행했고, 종양 성장 구역에 직접 인산염 완충 용액 또는 바이러스 제제 30㎕를 주입하여 수행했다. 주입은 3일마다 4회 수행했고, 그 후 85일 동안 환부 발의 부피 증가율 및 동물의 생존율을 평가했다. 2000㎣에 달하는 종양을 가진 동물은 윤리적 이유 때문에 안락사시켰고, 사망으로 간주했다.
흑색종은 인플루엔자 NS124-2A-Esat6 바이러스의 절삭된 NS1 단백질의 C-말단 영역(도 3, 서열번호 12)으로부터 2A를 매개로 한 단백질 Esat-6의 해독후 절단을 제공하는 설계로 미코박테리아 항원 Esat6을 발현하는 벡터로 처리했다. 대조 치료제는 미코박테리아 단백질의 삽입이 없는 NS124/Nep-Len 바이러스였다.
도 6 (A)는 종양 세포의 투여 후 19일째 발 부피를 측정한 결과이다. 놀랍게도, 가장 작은 평균 발 부피는 단백질 Esat6을 발현하는 벡터로 치료를 받은 마우스에서 관찰되었다. 이 결과는 85일로 이루어지는 긴 관찰 기간 동안 마우스의 생존율과 상관성이 있는 것으로 발견되었다(도 6 (B)). NS124-2A-Esat6 그룹의 10마리 중 3마리는 종양 성장이 재발하는 것으로 관찰되었고, 다른 그룹의 동물들은 60일까지 사망했다. 즉, 수득된 데이터는 박테리아 항원을 암호화하는 종양용해 벡터의 장점을 입증한다.
실시예 10
비내 면역화를 위한 인플루엔자 바이러스계 백신의 포뮬레이션
이 백신은 실시예 1 또는 실시예 5에서 생산된 인플루엔자 벡터를 6.5 내지 8.5 log 50% 배아 감염 용량(EID50)/ml의 양으로 함유하고, 완충액 안정화 용액은 0.9wt% 염화물 용액, 0.5wt% L-카르노신, 2.5wt% 수크로오스, 1wt% 재조합 알부민, 1wt% L-아르기닌 및 3wt% 하이드록시에틸 전분 130/0.4(분자량은 130kDa이고, 몰 치환도는 0.4이다)를 함유한다.
실시예 11
비내 면역화를 위한 인플루엔자 바이러스계 백신의 포뮬레이션
이 백신은 실시예 1 또는 실시예 5에서 생산된 인플루엔자 벡터를 6.5 내지 8.5 log 50% 배아 감염 용량(EID50)/ml의 양으로 함유하고, 완충액 안정화 용액은 0.9wt% 염화물 용액, 0.1wt% L-카르노신, 2.5wt% 수크로오스, 1wt% 재조합 알부민, 1wt% L-아르기닌 및 3wt% 하이드록시에틸 전분 130/0.4(분자량은 130kDa이고, 몰 치환도는 0.4이다)를 함유한다.
실시예 12
종양용해 목적을 위한 인플루엔자 바이러스계 백신의 포뮬레이션
이 백신은 실시예 1 또는 실시예 5에서 생산된 인플루엔자 벡터를 6.5 내지 10.5 log 50% 배아 감염 용량(EID50)/ml의 양으로 함유하고, 완충액 안정화 용액은 1.35wt% 염화물 용액, 0.5wt% L-카르노신, 1wt% 재조합 알부민, 1wt% L-아르기닌 및 3wt% 하이드록시에틸 전분 130/0.4(분자량은 130kDa이고, 몰 치환도는 0.4이다)를 함유한다.
SEQUENCE LISTING <110> OBSCHESTVO S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTIYU <PHARMENTERPRISES> <120> ATTENUATED INFLUENZA VECTORS FOR THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES AND FOR THE TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES <130> 2420-301559RU/061 <140> <141> <150> 2015147703 <151> 06.11.2015 <150> 2016111907 <151> 30.03.2016 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 890 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> NS fragment of influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus <400> 1 agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60 attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120 tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180 tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240 aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300 acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360 caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgga taaaaacatc atactgaaag 420 cgaacttcag tgtgattttt gaccggctgg agactctaat attgctaagg gctttcaccg 480 aagagggagc aattgttggc gaaatttcac cattgccttc tcttccagga catactgctg 540 aggatgtcaa aaatgcagtt ggagtcctca tcggaggact tgaatggaat gataacacag 600 ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac 660 ctccactcac tccaaaacag aaacgagaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720 gaaataagat ggttgattga agaagtgaga cacaaactga aggtaacaga gaatagtttt 780 gagcaaataa catttatgca agccttacat ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840 actttctcat ttcagcttat ttaataataa aaaacaccct tgtttctact 890 <210> 2 <211> 869 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant NS fragment of influenza A virus with a truncated reading frame of an NS1 protein and a Nep sequence derived from ?Singapore/1/57 (H2N2) virus <400> 2 agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60 attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120 tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180 tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240 aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300 acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360 caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgtg ataataaagt gtgatttttg 420 accggctgga gactctaata ttgctaaggg ctttcaccga agagggagca attgttggcg 480 aaatttcacc attgccttct cttccaggac atactaatga ggatgtcaaa aatgcaattg 540 gggtcctcat cggaggactt gaatggaatg ataacacagt tcgagtctct aaaactctac 600 agagattcgc ttggtgaaac agtaatgaga atgggagacc tccactcact ccaaaacaga 660 aacggaaaat ggcgagaaca attaggtcaa aagttcgaag aaataagatg gctgattgaa 720 gaagtgagac acaaattgaa gataacagag aatagttttg agcaaataac atttatgcaa 780 gccttacagc tactatttga agtggaacaa gagataagaa ctttctcgtt tcagcttatt 840 taataataaa aaacaccctt gtttctact 869 <210> 3 <211> 869 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant NS fragment of influenza A virus with a truncated reading frame of an NS1 protei and a Nep sequence derived from ?Leningrad/134/47/57 (H2N2) virus <400> 3 agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60 attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120 tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180 tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240 aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300 acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360 caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgtg ataataaagt gtgatttttg 420 accggctgga gactctaata ttgctaaggg ctttcaccga agagggagca attgttggcg 480 aaatttcacc attgccttct cttccaggac atactaatga ggatgtcaaa aatgcaattg 540 gggtcctcat cggaggactt gaatggaatg ataacacagt tcgagtctct aaaactctac 600 agagattcgc ttggagaagc agtaatgaga atgggagacc tccactcact ccaaaacaga 660 aacggaaaat ggcgagaaca attaggtcaa aagttcgaag aaataagatg gctgattgaa 720 gaagtgagac acaaattgaa gataacagag aatagttttg agcaaataac atttatacaa 780 gccttacagc tactatttga agtggaacaa gagataagaa ctttctcgtt tcagcttatt 840 taataataaa aaacaccctt gtttctact 869 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein without insertion of a foreign sequence <400> 4 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met <210> 5 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of an influenza A virus HA2 subunit fragment <400> 5 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 125 130 135 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 140 145 150 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys 155 160 165 Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr 170 175 180 Val Ile Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu 185 190 195 Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val 200 205 210 Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 215 220 225 Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 230 235 240 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn 245 250 255 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys 260 265 270 Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr 275 280 285 Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp 290 295 300 Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln 305 310 <210> 6 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of an influenza A virus HA2 subunit fragment <400> 6 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 125 130 135 Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 140 145 150 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu 155 160 165 Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 170 175 180 Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile 185 190 195 Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys 200 205 210 Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser 215 220 225 Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu 230 235 240 Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 245 250 255 Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe 260 265 270 Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 275 280 <210> 7 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of an influenza A virus HA2 subunit fragment <400> 7 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly 125 130 135 Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn 140 145 150 Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu Lys Met Asn Ile 155 160 165 Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg 170 175 180 Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile 185 190 195 Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg 200 205 210 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 215 220 225 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 230 235 240 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 245 250 255 Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser 260 265 270 Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met 275 280 285 Gly Ile Tyr Gln <210> 8 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of an influenza B virus HA2 subunit fragment <400> 8 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 125 130 135 Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr 140 145 150 Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys 155 160 165 Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser 170 175 180 Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala 185 190 195 Met Asn Gly Leu His Asp Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val 200 205 210 Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala 215 220 225 Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His 230 235 240 Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser 245 250 255 Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys 260 265 270 Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala 275 280 285 Gly Asp Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp 290 <210> 9 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of an influenza A virus HA2 subunit fragment and a sequence of a B-cell epitope of influenza A virus NP protein <400> 9 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 125 130 135 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Gly Gly Arg 140 145 150 Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala 155 <210> 10 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of an influenza A virus HA2 subunit fragment and a sequence of a B-cell epitope of influenza A virus NP protein <400> 10 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 125 130 135 Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp Gly Gly Arg 140 145 150 Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala 155 <210> 11 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of mycobacterium tuberculosis protein Esat6 protein <400> 11 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala 125 130 135 Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser 140 145 150 Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu 155 160 165 Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val 170 175 180 Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu 185 190 195 Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala 200 205 210 Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 215 220 <210> 12 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by a sequence of self-cleaving 2A peptide and a sequence of mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 <400> 12 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Gly Gly Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 125 130 135 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn 140 145 150 Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val 155 160 165 Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr 170 175 180 Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln 185 190 195 Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn 200 205 210 Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala 215 220 225 Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 230 235 <210> 13 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Truncated NS1 protein elongated by sequences of T-cell epitopes of herpes simplex virus (HSV) types I and II <400> 13 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu 1 5 10 15 Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala 50 55 60 Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu 65 70 75 Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu 80 85 90 Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu 95 100 105 Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp 110 115 120 Gln Ala Ile Met Ala Ala Ala Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe 125 130 135 Thr Ala Ala Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ala Ala 140 145 150 Ala Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Ala Ala Ala Arg Met 155 160 165 Leu Gly Asp Val Met Ala Val 170 <210> 14 <211> 2341 <212> DNA <213> Influenza A virus/PR/8/34 (H1N1) <220> <223> Nucleotide sequence of PB2 genomic fragment <400> 14 agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg 60 tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc 120 aagaagtaca catcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg 180 gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat 240 gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta 300 tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat 360 ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc 420 cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcggagag ttgacataaa tcctggtcat 480 gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa 540 gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa 600 gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg 660 gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg 720 ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg 780 aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca 840 gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga 900 attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc 960 aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag 1020 agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca 1080 ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca 1140 gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa 1200 cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata 1260 aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg 1320 catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt 1380 gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc 1440 gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg 1500 gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagaatcc gggaccaacg aggaaatgta 1560 ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac 1620 tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa 1680 tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta 1740 tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa 1800 tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat 1860 accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920 cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc 1980 aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat 2040 gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg 2100 aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat 2160 gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg 2220 gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280 aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340 t 2341 <210> 15 <211> 2288 <212> DNA <213> Influenza A virus/PR/8/34 (H1N1) <220> <223> Nucleotide sequence of PB1 genomic fragment <400> 15 atggatgtca atccgacctt acttttctta aaagtgccag cacaaaatgc tataagcaca 60 actttccctt atactggaga ccctccttac agccatggga caggaacagg atacaccatg 120 gatactgtca acaggacaca tcagtactca gaaaagggaa gatggacaac aaacaccgaa 180 actggagcac cgcaactcaa cccgattgat gggccactgc cagaagacaa tgaaccaagt 240 ggttatgccc aaacagattg tgtattggag gcgatggctt tccttgagga atcccatcct 300 ggtatttttg aaaactcgtg tattgaaacg atggaggttg ttcagcaaac acgagtagac 360 aagctgacac aaggccgaca gacctatgac tggactctaa atagaaacca acctgctgca 420 acagcattgg ccaacacaat agaagtgttc agatcaaatg gcctcacggc caatgagtct 480 ggaaggctca tagacttcct taaggatgta atggagtcaa tgaacaaaga agaaatgggg 540 atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata 600 acacagagaa caatgggtaa aaagaagcag agattgaaca aaaggagtta tctaattaga 660 gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca 720 attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg 780 agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca 840 aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc 900 accatcactg gagataacac caaatggaac gaaaatcaga atcctcggat gtttttggcc 960 atgatcacat atatgaccag aaatcagccc gaatggttca gaaatgttct aagtattgct 1020 ccaataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctgggaaaag ggtatatgtt tgagagcaag 1080 agtatgaaac ttagaactca aatacctgca gaaatgctag caagcatcga tttgaaatat 1140 ttcaatgatt caacaagaaa gaagattgaa aaaatccgac cgctcttaat agaggggact 1200 gcatcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaata tgttaagcac tgtattaggc 1260 gtctccatcc tgaatcttgg acaaaagaga tacaccaaga ctacttactg gtgggatggt 1320 cttcaatcct ctgacgattt tgctctgatt gtgaatgcac ccaatcatga agggattcaa 1380 gccggagtcg acaggtttta tcgaacctgt aagctacttg gaatcaatat gagcaagaaa 1440 aagtcttaca taaacagaac aggtacattt gaattcacaa gttttttcta tcgttatggg 1500 tttgttgcca atttcagcat ggagcttccc agttttgggg tgtctgggat caacgagtca 1560 gcggacatga gtattggagt tactgtcatc aaaaacaata tgataaacaa tgatcttggt 1620 ccagcaacag ctcaaatggc ccttcagttg ttcatcaaag attacaggta cacgtaccga 1680 tgccatagag gtgacacaca aatacaaacc cgaagatcat ttgaaataaa gaaactgtgg 1740 gagcaaaccc gttccaaagc tggactgctg gtctccgacg gaggcccaaa tttatacaac 1800 attagaaatc tccacattcc tgaagtctgc ctaaaatggg aattgatgga tgaggattac 1860 caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg 1920 aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt 1980 gcaacaacac actcctggat ccccaaaaga aatcgatcca tcttgaatac aagtcaaaga 2040 ggagtacttg aggatgaaca aatgtaccaa aggtgctgca atttatttga aaaattcttc 2100 cccagcagtt catacagaag accagtcggg atatccagta tggtggaggc tatggtttcc 2160 agagcccgaa ttgatgcacg gattgatttc gaatctggaa ggataaagaa agaagagttc 2220 actgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atagtgaatt 2280 tagcttgt 2288 <210> 16 <211> 2233 <212> DNA <213> Influenza A virus/PR/8/34 (H1N1) <220> <223> Nucleotide sequence of PA genomic fragment <400> 16 agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg 60 attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca 120 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agattttcac 180 ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg 240 aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac 300 agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac 360 aaggagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg 420 gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg 480 gaagaaatgg ccacaaaggc agactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa 540 accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt 600 cagtccgaga gaggagaaga gacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aacaatgcgc 660 aagcttgccg accaaagtct cccgccgaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat 720 gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tgtctcaaat gtccaaagaa 780 gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa acaacaccac gaccacttag acttccgaat 840 gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt 900 gaggacccaa gtcatgaagg agagggaata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga 960 acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca 1020 aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag 1080 aaaattccaa agactaaaaa tatgaagaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag 1140 aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gactgtaaag atgtaggtga tttgaagcaa 1200 tatgatagtg atgaaccaga attgaggtcg ctagcaagtt ggattcagaa tgagtttaac 1260 aaggcatgcg aactgacaga ttcaagctgg atagagctcg atgagattgg agaagatgtg 1320 gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacatcaga ggtgtctcac 1380 tgcagagcca cagaatacat aatgaagggg gtgtacatca atactgcctt gcttaatgca 1440 tcttgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag 1500 gagggaaggc gaaagaccaa cttgtatggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg 1560 aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt 1620 gaaccacata aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct tataagaagt 1680 gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga gaacaaatgg aacctcaaaa 1740 attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc tccagtcact tcaacaaatt 1800 gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt 1860 gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga ggaaagttcc 1920 attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat tcaacagctt gtatgcatct 1980 ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt 2040 agggacaacc ttgaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100 tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcttctt ggttcaactc cttccttaca 2160 catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220 ccttgtttct act 2233 <210> 17 <211> 1027 <212> DNA <213> Influenza A virus/PR/8/34 (H1N1) <220> <223> Nucleotide sequence of NP genomic fragment <400> 17 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120 tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780 gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840 ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900 cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020 ttctact 1027 <210> 18 <211> 1027 <212> DNA <213> Influenza A virus/PR/8/34 (H1N1) <220> <223> Nucleotide sequence of M genomic fragment <400> 18 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120 tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780 gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840 ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900 cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020 ttctact 1027 <210> 19 <211> 1701 <212> DNA <213> Influenza A virus/California/09-like (H1N1pdm) <220> <223> Nucleotide sequence of HA genomic fragment <400> 19 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60 tgtataggtt atcatgcaaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agttcatggt cctacattgt ggaaacatct 300 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatca attatgagga gctaagagag 360 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaaaac aagttcatgg 420 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcacgctgg agcaaaaagc 480 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagccaa 540 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctgt ggggcattca ccatccatct 600 actactgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggaca 660 tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcaa 720 gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa 780 gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcacaa tggaaagaaa tgctggatct 840 ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca gacacccgag 900 ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt 960 ccaaagtatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tgtcccgtct 1020 attcaatcta gaggcctatt cggggccatt gccggcttca ttgaaggggg gtggacaggg 1080 atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc 1140 gacctgaaga gcacacaaaa tgccattgac aagattacta acaaagtaaa ctctgttatt 1200 gaaaagatga atacacagtt cacagcagtg ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga 1260 atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc 1320 gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accatgattc aaatgtgaag 1380 aacttgtatg aaaaggtaag aaaccagtta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc 1440 tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact 1500 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaaaaaat agatggggta 1560 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1620 ttggtgctgg tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtctcta 1680 cagtgtagaa tatgtattta a 1701 <210> 20 <211> 1410 <212> DNA <213> Influenza A virus/California/09-like (H1N1pdm) <220> <223> Nucleotide sequence of NA genomic fragment <400> 20 atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct gtatgacaat tggaatggct 60 aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga ttagccactc aattcaagtt 120 gggaatcaaa gtcagatcga aacatgcaat caaagcgtca ttacttatga aaacaacact 180 tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact ttgctgctgg gcagccagtg 240 gtttccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg ttagtggatg ggctatatac 300 agtaaagaca acagtgtaag agtcggttcc aagggggatg tgtttgtcat aagggaacca 360 ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct tgactcaagg ggccttgcta 420 aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc catatcgaac cttaatgagc 480 tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat ttgagtcagt cgcttggtca 540 gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg gaatttctgg cccagacagt 600 ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacggc ataataacag acactatcaa gagttggaga 660 aacgatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttacc 720 ataatgaccg atggaccaag tgatggacag gcctcataca agatcttcag aatagaaaag 780 ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc 840 tgttatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg ataactggca tggctcgaat 900 cgaccgtggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga taggatacat atgcagtggg 960 attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca gttgtggtcc agtatcgtct 1020 aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg gcaatggtgt ttggataggg 1080 agaactaaaa gcattagttc aagaaaaggt tttgagatga tttgggatcc aaatggatgg 1140 actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg taggaataaa tgagtggtca 1200 ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag ggctggattg tataagacct 1260 tgcttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagtggg 1320 agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1380 gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa 1410 <210> 21 <211> 979 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of a chimeric NS fragment gene <400> 21 agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60 attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120 tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180 tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240 aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300 acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360 caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatggg aggaggtttc ttcggagcta 420 ttgctggttt cttggaagga ggatgggaag gaatgattgc aggttgggga ggaagagaga 480 gccggaaccc agggaatgct tgataataag cggccgcagt gtgatttttg accggctgga 540 gactctaata ttgctaaggg ctttcaccga agagggagca attgttggcg aaatttcacc 600 attgccttct cttccaggac atactaatga ggatgtcaaa aatgcaattg gggtcctcat 660 cggaggactt gaatggaatg ataacacagt tcgagtctct aaaactctac agagattcgc 720 ttggagaagc agtaatgaga atgggagacc tccactcact ccaaaacaga aacggaaaat 780 ggcgagaaca attaggtcaa aagttcgaag aaataagatg gctgattgaa gaagtgagac 840 acaaattgaa gataacagag aatagttttg agcaaataac atttatacaa gccttacagc 900 tactatttga agtggaacaa gagataagaa ctttctcgtt tcagcttatt taataataaa 960 aaacaccctt gtttctact 979 1

Claims (54)

  1. 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대한 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스로서, NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임 및 Nep 유전자의 이종 서열을 포함하는 키메라(chimeric) NS 단편을 함유하는 것으로,
    상기 NS1 단백질의 절삭된 판독 프레임이 H1N1 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되고, Nep 유전자 이종 서열이 H2N2 인플루엔자 바이러스 아형에서 유래되며, 상기 절삭된 판독 프레임은 서열번호 4에 해당하는 124개 아미노산 잔기로 이루어진 NS1 단백질을 암호화하는 것인, 약독화된 인플루엔자 A 바이러스.
  2. 박테리아, 바이러스 및 원생동물에서 유래되는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서, 이 벡터는 제1항에 기재된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스이고, NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임은 박테리아, 바이러스 및 원생동물 유래의 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 전이유전자 서열의 삽입에 의해 더 길어지며, 상기 박테리아, 바이러스 및 원생동물에서 유래되는 단백질은 병원성인 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 파동편모충, 리슈만편모충, 클라미디아, 브루셀라증 원인 인자 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편이 10 내지 400개의 아미노산으로 이루어지는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  5. 제2항에 있어서, 전이유전자(transgene)가 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 단백질 영역을 암호화하는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, HA 단백질 영역이 인플루엔자 A 바이러스 유래의 1 내지 185 아미노산, 인플루엔자 B 바이러스 유래의 1 내지 186 아미노산, 인플루엔자 A 바이러스 유래의 23 내지 185 아미노산, 또는 인플루엔자 A 바이러스 유래의 65 내지 222 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HA2 서브유닛 영역인 것으로서, 여기서 아미노산의 번호는 전이유전자가 유래된 인플루엔자 바이러스의 HA2 서브유닛 영역에 있는 아미노산의 위치에 해당하는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  7. 제2항에 있어서, 전이유전자가 1 내지 21 아미노산의 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 HA2 서브유닛 영역의 서열 및 243 내지 251 아미노산의 인플루엔자 A 바이러스 NP 단백질 영역의 서열을 암호화하는 것으로서, 여기서 아미노산의 번호는 전이유전자가 유래된 인플루엔자 바이러스의 HA2 서브유닛 영역 및 NP 단백질 영역의 아미노산 위치에 해당하는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  8. 제2항에 있어서, 전이유전자가 결핵균의 단백질 ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 또는 Mtb10.4, 또는 이의 단편을 암호화하는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 바이러스 게놈 서열이 추가로 NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임 및 단백질 ESAT6을 암호화하는 전이유전자 사이에 자기-절단성 2A 펩타이드를 암호화하는 서열을 함유하는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  10. 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서, 이 벡터는 제1항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스이고, NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임은 인플루엔자 B HA2 단백질의 1 내지 21 aa 및 인플루엔자 A NP 단백질의 243 내지 251 aa를 암호화하는 서열의 삽입에 의해 더 길어지는 것으로서, 여기서 아미노산의 번호는 전이유전자가 유래된 인플루엔자 바이러스의 HA2 서브유닛 영역 및 NP 단백질 영역의 아미노산 위치에 해당하는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  11. 종양용해 활성이 있는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서, 이 벡터는 제1항에 기재된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스이고, NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임은 결핵균 단백질 ESAT-6 또는 이의 단편을 암호화하는 서열의 삽입에 의해 더 길어지는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편이 10 내지 400개의 아미노산으로 이루어지는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  13. 제11항에 있어서, NS1 단백질 유전자의 절삭된 판독 프레임이 자기-절단형 2A 펩타이드를 암호화하는 서열의 삽입에 의해 더 길어지는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  14. 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대하여 교차 보호 반응을 유도하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터로서,
    서열번호 14의 PB2 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 15의 PB1 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 16의 PA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 17의 NP 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 18의 M 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 19의 HA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 20의 NA 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열;
    124개 아미노산 잔기로 이루어진 NS1 단백질을 암호화하는, 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1)에서 유래되는 NS1 단백질 절삭된 판독 프레임, 및 인플루엔자 A/Singapore/1/57-유사(H2N2) 바이러스에서 유래되는 Nep 유전자 서열을 포함하는, 서열번호 21의 NS 단백질 키메라 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
    상기 NS1 단백질 절삭된 판독 프레임은 인플루엔자 B 서브유닛 HA2 영역의 융합 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질(NP)의 보존적 B-세포 에피토프를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입에 의해 더 길어지는 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, NS 단백질 키메라 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 21인 것인, 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터.
  16. 제2항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 감염성 질환 치료 및/또는 예방용 약학적 조성물로서, 상기 감염성 질환은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 결핵균, 헤르페스 단순 바이러스 I형 및 II형, 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, C형 간염 바이러스, 말라리아 기생충, 트리코모나스, 클라미디아, 파동편모충, 리슈만편모충, 또는 브루셀라증 원인 인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 감염성 병원체로 인한 것인, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것인, 인플루엔자 감염 및 관련 질환 예방용 약학적 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 6.5 내지 10.5 log EID50/ml의 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 및 0 내지 1.5wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 완충 용액을 함유하는, 인플루엔자 감염 및 관련 질환 예방용 약학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 완충 용액이 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 인플루엔자 감염 및 관련 질환 예방용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 1가 염이 염화나트륨이고, 탄수화물 성분이 수크로오스, 트레할로오스 또는 락토오스이고, 단백질 성분이 인간 알부민, 카시톤(casitone), 락트알부민 가수분해물 또는 젤라틴이고, 아미노산 성분이 아르기닌, 글리신 또는 글루탐산나트륨이고, 이미다졸 함유 화합물이 L-카르노신 또는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5-일)에틸]프로판디아미드인, 인플루엔자 감염 및 관련 질환 예방용 약학적 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 감염성 질환의 피검자가 포유동물 또는 조류인, 인플루엔자 감염 및 관련 질환 예방용 약학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 피검자가 인간 피검자인 것인, 인플루엔자 감염 및 관련 질환 예방용 약학적 조성물.
  23. 제2항에 기재된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 인플루엔자에 대한 백신.
  24. 제14항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 인플루엔자에 대한 백신.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 6.5 내지 10.5 log EID50/ml의 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터 및 0 내지 1.5wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 완충 용액을 함유하는 백신.
  26. 제23항에 있어서, 완충 용액이 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 백신.
  27. 제26항에 있어서, 1가 염은 염화나트륨이고, 탄수화물 성분은 수크로오스, 트레할로오스 또는 락토오스이고, 단백질 성분은 인간 알부민, 카시톤, 락트알부민 가수분해물 또는 젤라틴이며, 아미노산 성분은 아르기닌, 글리신 또는 글루탐산나트륨이고, 이미다졸 함유 화합물은 L-카르노신 또는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5일)에틸]프로판디아미드인 것인, 백신.
  28. 제2항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량을 인간을 제외한 피검자에 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 감염 및 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 인플루엔자 질환은 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 병원체에 의해 유발되는 것인, 인플루엔자 감염 및 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 피검자가 인간을 제외한 포유동물 또는 조류인 것인, 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  31. 제11항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 피검자의 종양학적 질환 치료용 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 8.5 내지 10.5 log EID50/ml의 약독화된 인플루엔자 A 바이러스 벡터, 및 0 내지 1.5wt%의 1가 염, 0 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 0 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0 내지 2wt%의 단백질 성분, 0 내지 2wt%의 아미노산 성분, 및 0 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 완충 용액을 함유하는 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 완충 용액이 0.5 내지 1.5wt%의 1가 염, 0.01 내지 5wt%의 이미다졸 함유 화합물, 1 내지 5wt%의 탄수화물 성분, 0.1 내지 2wt%의 단백질 성분, 0.01 내지 2wt%의 아미노산 성분 및 1 내지 10wt%의 하이드록시에틸화된 전분을 함유하는 약학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 1가 염이 염화나트륨이고, 탄수화물 성분이 전분이며, 단백질 성분이 인간 알부민이고, 아미노산 성분이 아르기닌이고, 이미다졸 함유 화합물이 L-카르노신 또는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-5일)에틸]프로판디아미드인 약학적 조성물.
  35. 제11항에 기재된 약독화된 인플루엔자 바이러스 벡터의 유효량을 인간을 제외한 피검자에 투여하는 단계를 포함하는, 종양학적 질환의 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 종양학적 질환은 결장직장암, 식도분문암, 췌장암, 담관세포암, 신경아교종, 교모세포종 및 흑색종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 종양학적 질환의 치료 방법.
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