PL212316B1 - Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek - Google Patents
Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionekInfo
- Publication number
- PL212316B1 PL212316B1 PL386473A PL38647399A PL212316B1 PL 212316 B1 PL212316 B1 PL 212316B1 PL 386473 A PL386473 A PL 386473A PL 38647399 A PL38647399 A PL 38647399A PL 212316 B1 PL212316 B1 PL 212316B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- attenuated
- interferon
- amino acid
- acid residues
- Prior art date
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 109
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 82
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 62
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 36
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 28
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 title claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title abstract description 22
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 title 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 389
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 261
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 261
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 261
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 202
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 108
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 22
- 230000010479 cellular ifn response Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 120
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 claims description 90
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims description 90
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 90
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 81
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 73
- 102000006381 STAT1 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 55
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 55
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 47
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 33
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 33
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 31
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 26
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 26
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 24
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 20
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 17
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 13
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 10
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 7
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 abstract description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 64
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 34
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 32
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 31
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 22
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 16
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 16
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 15
- 108010032038 Interferon Regulatory Factor-3 Proteins 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 13
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 13
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 13
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 12
- 101150094092 STAT1 gene Proteins 0.000 description 12
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 11
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 11
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 11
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 9
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 7
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 5
- 101710089751 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 5
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 5
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 5
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 238000012552 review Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 4
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000491226 Influenza A virus (A/WSN/1933(H1N1)) Species 0.000 description 3
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 3
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 3
- 230000034373 developmental growth involved in morphogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 108700032552 influenza virus INS1 Proteins 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- -1 poly-A Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 2
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 2
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 2
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 241000711897 Rinderpest morbillivirus Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 230000010472 type I IFN response Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000724653 Borna disease virus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241001440741 CHER virus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000712471 Dhori virus Species 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101001128393 Homo sapiens Interferon-induced GTP-binding protein Mx1 Proteins 0.000 description 1
- 101001082058 Homo sapiens Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 241000546112 Infectious salmon anemia virus Species 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007578 Interferon Regulatory Factor-3 Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010083736 Myxovirus Resistance Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006421 Myxovirus Resistance Proteins Human genes 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 240000001068 Thogoto virus Species 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 230000008144 egg development Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000048122 human MX1 Human genes 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- A61K39/17—Newcastle disease virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Przedmiotem niniejszego wynalazku są zastosowania preparatów szczepionek zawierających atenuowane wirusy grypy, zastosowania preparatów farmaceutycznych zawierających atenuowane wirusy grypy oraz sposoby wytwarzania szczepionek zawierających atenuowane wirusy grypy.
1. Wprowadzenie
Niniejszy wynalazek dotyczy, ogólnie, atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, mających zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi komorkowej na interferon (IFN) oraz zastosowania takich atenuowanych wirusów w szczepionce oraz preparatach farmaceutycznych. Wynalazek dotyczy także wykorzystania i zastosowania układów z niedoborem IFN do selekcji, identyfikacji i namnażania takich atenuowanych wirusów.
Zgodnie z wynalazkiem opisano atenuowane wirusy grupy posiadające modyfikacje w genie NS1, które zmniejszają lub eliminują zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania odpowiedzi komórkowej wobec IFN. Zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz wykazują zmniejszoną patogenność, a zatem są odpowiednie do stosowania w żywych szczepionkach wirusowych oraz preparatach farmaceutycznych.
2. Tło wynalazku
2.1 Wirus grypy
Rodziny wirusów zawierających osłonkowany RNA o pojedynczej nici genomu o ujemnej polarnosci (antysensownego) klasyfikuje się w grupach mających genomy niesegmentowane (Paramyxoviridae, Rhabdovindae, Filoviridae i Borna Disease Virus) lub mających genomy segmentowane (Othomyxoviridae, Bunyaviridae i Arenaviridae).
Rodzina Orthomyxoviridae, opisywana szczegółowo poniżej i używana w niniejszych przykładach, obejmuje wirusy grypy, wirusy typu A, B i C, jak również wirusy Thogoto i Dhori oraz wirusa zakaźnej anemii łososi.
Wiriony grypy składają się z wewnętrznego rdzenia rybonukleoproteinowego (nukleokapsyd w postaci helisy), zawierającego genom o pojedynczej nici RNA, oraz zewnętrznej osłonki lipoproteinowej powleczonej wewnątrz białkiem matriksowym (M1).
Segmentowany genom wirusa grypy A składa się z ośmiu cząsteczek (siedem dla grypy C), o liniowej ujemnej polarności, RNA o pojedynczych niciach, które kodują dziesięć polipeptydów, włączając: białka polimerazy RNA zależne od RNA (PB2, PB1 i PA) oraz nukleoproteinę (NP), która tworzy nukleokapsyd; białka błony matriksowej (M1, M2); dwie glikoproteiny powierzchniowe, które wystają z osłonki zawierającej lipid: hemaglutyninę (HA) i jądrowe białko eksportowe (NEP).
Transkrypcja i replikacja genomu ma miejsce w jądrze, a montowanie zachodzi poprzez składanie na błonie plazmatycznej.
Wirusy mogą ponownie mieszać geny w czasie mieszanych infekcji.
Wirus grypy adsorbuje się poprzez HA do sialilooligosacharydów w glikoproteinach i glikolipidach błony komórkowej.
Po endocytozie wirionu zachodzą zmiany konformacyjne w cząsteczce HA wewnątrz endosomu komórkowego, które ułatwiają fuzję błonową, stymulując w ten sposób pozbawienie osłonki.
Nukleokapsyd migruje do jadra, gdzie mRNA wirusa ulega transkrypcji.
Wirusowy mRNA ulega transkrypcji przez unikalny mechanizm, w którym endonukleazy wirusowe odcinają czapeczkowany koniec 5' z heterologicznych mRNA komórki, które następnie służą jako startery do transkrypcji matryc RNA wirusa przez transkryptazę wirusową.
Terminacja transkryptu zachodzi w miejscach 15 do 22 zasad od końców ich matryc, gdzie sekwencje oligo(U) działają jako sygnały do dodawania śladów poii(A).
Z ośmiu tak wytworzonych wirusowych cząsteczek RNA, sześć jest informacjami monocistronowymi, które ulegają translacji bezpośrednio do białek, reprezentujących HA, NA, NP i białka polimerazy wirusowej, PB2, PB1 i PA.
Inne dwa transkrypty przechodzą splicmg, po czym każdy daje dwa mRNA, które ulegają translacji w różnych ramkach odczytu, wytwarzając M1, M2, NS1 i NEP
Innymi słowy, osiem segmentów wirusowego RNA koduje dziesięć białek: dziewięć strukturalnych i jedno niestrukturalne. Omówienie genów wirusa grypy i ich produktów białkowych pokazano w tabeli I poniżej.
PL 212 316 B1
T a b e l a 1
Segmenty RNA genomu wirusa grypy i produkty kodowaniaa
Segment | Długosćb (nukleotydy) | Kodowany polipeptydc | Długośćd (aminokwasy) | Cząsteczki na wirion | Komentarz |
1 | 2341 | PB2 | 759 | 30-60 | Składnik transkryptazy RNA; wiazanie czapeczkowanego RNA komórki gospodarza |
2 | 2341 | PB1 | 757 | 30-60 | Składnik transkryptazy RNA; inicjacja transkrypcji |
3 | 2233 | PA | 716 | 30-60 | Składnik transkryptazy RNA |
4 | 1778 | HA | 566 | 500 | Hemaglutynina; trimer; glikoproteina osłonki; pośredniczy w przyłączaniu do komórek |
5 | 1565 | NP | 498 | 1000 | Nukleoproteina; zwiazana z RNA; strukturalny składnik transkryptazy RNA |
6 | 1413 | NA | 454 | 100 | Neuraminidaza tetramer; glikoproteina osłonki |
7 | 1027 | M1 | 252 | 3000 | Białko matrycowe, powleka wnętrze osłonki |
M2 | 96 | ? | Strukturalne białko w błonie plazma- tycznej; złożony mRNA | ||
8 | 890 | NS1 | 230 | Białko niestrukturalne; funkcja nieznana | |
NEP | 121 | ? | Jądrowe białko eksportowe; złożony mRNA |
a Zaadaptowane z R.A. Lamb i P.W. Choppin (1983) Annual Review of Biochemistry, tom 52, 467-506 b Dla szczepu A/PR/8/34 c Określone w próbach biochemicznych i genetycznych d Określone w analizie sekwencji nukleotydowej i sekwencjonowaniu białka
Genom wirusa grypy A zawiera osiem segmentów RNA o pojedynczej nici o ujemnej polarności, kodujących jedno białko niestrukturalne i dziewięć strukturalnych. Białko niestrukturalne NS1 jest powszechne w komórkach zakażonych wirusem grypy, lecz nie zostało wykryte w wirionach. NS1 jest fosfoproteiną znajdującą się w jądrze wcześnie podczas zakażenia, a także w cytoplazmie w czasie późniejszym cyklu wirusowego (King i inni 1975, Virology 64: 378). Badania z mutantami grypy wrażliwymi na temperaturę (ts) z uszkodzeniami w genie NS, sugerowały, że białko NS1 jest regulatorem transkrypcyjnym i posttranskrypcyjnym mechanizmów, dzięki którym wirus jest zdolny do hamowania ekspresji genu komórki gospodarza i stymulacji syntezy białek wirusowych. Tak jak wiele innych białek, które regulują procesy posttranslacyjne, białko NS1 oddziałuje ze specyficznymi sekwencjami i strukturami RNA. Donoszono, że białko NS1 wiąże się z różnymi rodzajami RNA, łącznie z vRNA, poli-A, U6snRNA, regionem 5' nie podlegającym translacji, jak mRNA wirusa oraz dsRNA (Qiu i inni, 1995, RNA 1: 304; Qiu i inni 1994, J.Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen. Virol. 73: 3325-9. Ekspresja białka NS1 z cDNA w transfekowanych komórkach powiązano z kilkoma skutkami: inhibicją transportu jądrowo-cytoplazmatycznego mRNA, inhibicją splicingu pre-mRNA, inhibicją poliadenylacji mRNA gospodarza i stymulacją translacji wirusowego mRNA (Fortes i mm, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami i inni, 1994, J. Virol. 68: 20 1432; de la Luna i inni 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu i inni, Genes Dev. 8: 1617; Park i inni, 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff i inni, 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen i inni, 1994, EMBO J. 18: 2273-83).
2.2 Wirusy atenuowane
Inaktywowane szczepionki wirusowe otrzymuje się przez „zabicie” patogenu wirusowego, np. przez traktowanie wysoką temperaturą albo formaliną tak, że nie jest on zdolny do replikacji. Inaktywowane szczepionki mają ograniczone wykorzystanie, ponieważ nie zapewniają długotrwałej odpor4
PL 212 316 B1 ności, a zatem zapewniają ograniczone zabezpieczenie. Alternatywnym podejściem do wytwarzania szczepionek wirusowych, jest stosowanie atenuowanych żywych szczepionek wirusowych. Atenuowane wirusy są zdolne do replikacji, lecz nie są patogenne, a zatem zapewniają dłużej trwającą odporność i większe zabezpieczenie. Jednakże konwencjonalne metody wytwarzania atenuowanych wirusów obejmują przypadkową izolację szeregu mutantów gospodarza, z których wiele jest wrażliwych na temperaturę, np. wirusa pasażuje się przez nienaturalnego gospodarza i selekcjonuje wirusy potomne, które są immunogenne, lecz jeszcze niepatogenne.
Konwencjonalnym substratem do izolacji i hodowli wirusów grypy do szczepionek są jaja kurze z zarodkami. Wirusy grypy zwykle rosną w ciągu 2-4 dni w temperaturze 37°C w jajach 10-11 dniowych. Mimo, że większość pierwotnych izolatów ludzkich wirusów grypy A i B rośnie lepiej w worku owodniowym zarodków, po 2 do 4 pasażach wirusy dostosowują się do wzrostu w komórkach jamy omoczniowej, która jest dostępna z zewnątrz jaja (Murphy, B. R. i R. G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses, strona 1397-1445. W Fields Virology. Lippicott-Raven P. A).
Technologia rekombinacji DNA i techniki inżynierii genetycznej teoretycznie pozwalają na lepsze podejście do wytwarzania atenuowanego wirusa, ponieważ w genomie wirusa można celowo dokonać specyficznych mutacji. Jednakże zmiany genetyczne wymagane do atenuacji wirusów nie są ani znane, ani przewidywalne. Ogólnie, próby stosowania technologii rekombinacji DNA do opracowania szczepionek wirusowych dotyczą w większości produkcji szczepionek podjednostkowych, które zawierają tylko podjednostki białka patogenu, związane z odpowiedzią immunologiczną, poddane ekspresji w rekombinowanych wektorach wirusowych, takich jak wirus krowianki lub bakulowirus. Ostatnio, wykorzystano techniki rekombinacji DNA w próbie wytworzenia mutantów delecyjnych herpeswirusa lub poliowirusów, które naśladują atenuowane wirusy występujące w naturze lub znane szeregi mutantów gospodarzy. Do 1990 wirusy o ujemnej nici RNA nie były wcale podatne na manipulacje miejscowo-specyficzne, a więc nie mogły być genetycznie modyfikowane.
Atenuowane żywe wirusy grypy wytwarzane dotąd mogły nie być zdolne do supresji odpowiedzi interferonowej u gospodarza, w którym replikują. Zatem, mimo, że wirusy te są zalecane, ponieważ są one immunogenne i niepatogenne, trudno je namnożyć w konwencjonalnych substratach do celów wytwarzania szczepionek. Ponadto, atenuowane wirusy mogą posiadać cechy wirulencji, które są łagodne i nie pozwalają gospodarzowi na wytworzenie odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do obrony przed późniejszymi prowokacjami.
3. Omówienie wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA, mające zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki oraz zastosowania takich wirusów w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. Zmutowane wirusy z zaburzoną aktywnością antagonistyczną wobec IFN są atenuowane, czyli są zakaźne, mogą replikować in vivo zapewniając subkliniczny poziom infekcji i nie są patogenne. Zatem, są one idealnymi kandydatami dla żywych szczepionek wirusowych. Ponadto, atenuowane wirusy mogą indukować silną odpowiedź INF, która ma inne konsekwencje biologiczne in vivo, powodując zabezpieczenie przed późniejszymi chorobami zakaźnymi i/lub indukując odpowiedź przeciwnowotworową. Zatem, atenuowane wirusy można stosować farmaceutycznie do profilaktyki lub leczenia innych chorób zakaźnych, nowotworów u osób o wysokim ryzyku i/lub chorób leczonych IFN.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację, oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
Korzystniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus
PL 212 316 B1 syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu. Korzystnie w powyższych zastosowaniach chorobą zakaźną jest grypa.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzystnie, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Korzystnie, miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Korzystnie, chorobę zakaźną stanowi grypa.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
Korzystniej, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1. Korzystnie w tych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Korzystnie, w tych zastosowaniach chorobą zakaźną jest grypa.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza
PL 212 316 B1 z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzytsniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Korzystnie, chorobę zakaźną stanowi grypa.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
Korzystniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w tych zastosowaniach układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Korzystnie, w tych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza liczbę 1 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzystniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Korzystnie, miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania szczepionki, polegający na tym, że obejmuje (a) namnażanie w jajach z zarodkiem w wieku poniżej 10 dni genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego, przy czym wirusa namnaża się do wystarczających ilości oraz w warunkach wolnych od zakażenia tak, że wirus potomny jest odpowiedni do preparowania w szczepionkę.
PL 212 316 B1
Korzystnie, jajo z zarodkiem jest wieku sześciu do dziewięciu dni.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania szczepionki, polegający na tym, że obejmuje
a) namnażanie w linii komórkowej z niedoborem interferonu genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego.
Korzystnie, linią komórkową z niedoborem interferonu nie są komórki Vero.
Korzystnie, linią komórkową z niedoborem interferonu są komórki Vero.
Korzystnie, w powyższych sposobach mutacja w genie NS1 skutkuje delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza 1.
Korzystnie, w powyższych sposobach atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzystnie, w powyższych sposobach atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Wirusy o ujemnej nici RNA, stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują wirusy zarówno segmentowane jak i niesegmentowane; zalecane postacie realizacji obejmują, lecz bez ograniczenia, wirusa grypy, wirusa syncytialnego płuc (RSV), wirusa choroby Newcastle (NDV), wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (VSV) oraz wirusa paragrypy (PIV). Wirusy stosowane w wynalazku można selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję wobec mutagenów, powtórzone pasaże i/lub pasaże w gospodarzach niedozwolonych); reasortantów (w przypadku segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych (np. przy użyciu technik „genetyki odwrotnej” mających pożądany fenotyp, czyli zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki. Zmutowane lub genetycznie zmodyfikowane wirusy można selekcjonować na podstawie różnicowania wzrostu w układach z niedoborem IFN względem układów kompetentnych pod względem IFN. Przykładowo, można selekcjonować wirusy, które rosną w układzie z niedoborem IFN, lecz nie rosną w układzie kompetentnym pod względem IFN (lub które rosną gorzej w układzie kompetentnym pod względem IFN).
Tak wyselekcjonowany atenuowany wirus może być stosowany sam jako składnik aktywny w szczepionce lub preparatach farmaceutycznych. Alternatywnie, atenuowany wirus może być stosowany jako wektor lub „szkielet” szczepionek wytwarzanych rekombinacyjnie. Jak dotąd, technikę „genetyki odwrotnej” można stosować do budowania mutacji lub wprowadzania obcych epitopów do atenuowanego wirusa, który służyłby jako szczep „rodzicielski”. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów, lub alternatywnie, przeciw całkowicie innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym. Przykładowo, atenuowanego wirusa można zmodyfikować do ekspresji epitopów neutralizujących innych wstępnie wyselekcjonowanych szczepów. Alternatywnie, w atenuowanego mutanta można wbudować epitopy wirusów innych niż wirusy o ujemnej nici RNA (np. gp160, gp120 lub gp41 HIV). Alternatywnie, w wirusa można wbudować epitopy patogenów zakaźnych niewirusowych (np. pasożytów, bakterii, grzybów). W jeszcze innej opcji, można wytworzyć szczepionki nowotworowe, np. przez wbudowanie antygenów nowotworowych do atenuowanego szkieletu wirusowego.
W poszczególnej postaci realizacji, obejmującej wirusy RNA z genomami segmentowanymi, można stosować techniki reasortacji, do przeniesienia atenuowanego fenotypu z rodzicielskiego szczepu wirusa o segmentowanym RNA (naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) do różnych szczepów wirusowych (wirus dzikiego typu, naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany).
Wirusy atenuowane, które indukują silne odpowiedzi IFN u gospodarza, można także stosować w preparatach farmaceutycznych do profilaktyki lub leczenia innych infekcji wirusowych lub chorób możliwych do leczenia IFN, takich jak nowotwór. Pod tym względem, można zmieniać tropizm atenuowanego wirusa, aby nakierować wirus na pożądany narząd docelowy, tkankę lub komórki in vivo lub ex vivo. Stosując to podejście, odpowiedź IFN można indukować miejscowo, w docelowym miejscu, unikając w ten sposób lub minimalizując skutki uboczne układowego traktowania IFN. W tym celu można skonstruować atenuowanego wirusa do ekspresji liganda specyficznego pod względem receptora docelowego narządu, tkanki lub komórek.
PL 212 316 B1
Wynalazek opiera się, częściowo, na stwierdzeniu twórców wynalazku, że NS1 wirusa grypy dzikiego typu działa jak antagonista IFN w taki sposób, że NS1 hamuje odpowiedź za pośrednictwem IFN komórek gospodarza zakażonych wirusem. Stwierdzono, że mutanty wirusowe z niedoborem aktywności NS1 są silnymi induktorami odpowiedzi komórkowej IFN i przedstawiały atenuowany fenotyp in vivo; czyli zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz dają mniejsze skutki patogenne. Nie chcąc wiązać się jakąkolwiek teorią lub wytłumaczeniem jak działa wynalazek, cechy atenuacji wirusów tu opisanych są prawdopodobnie spowodowane ich zdolnością do indukcji silnej komórkowej odpowiedzi IFN oraz ich zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi IFN gospodarza. Jednakże dogodne cechy atenuowanych wirusów tu opisanych nie muszą być przypisywane jedynie wpływowi na komórkową odpowiedź IFN. W rzeczywistości, zmiany innych aktywności związanych z NS1 mogą nadawać żądany atenuowany fenotyp.
Wykazano, że zmutowany wirus grypy o zaburzonej aktywności antagonistycznej wobec IFN replikuje in vivo, wytwarzając miana, które są wystarczające do indukcji odpowiedzi immunologicznej i cytokinowej. Przykładowo, szczepienie atenuowanym wirusem grypy zmniejszało miano wirusa u zwierząt, które później sprowokowano wirusem grypy dzikiego typu. Atenuowane wirusy grypy przedstawiały także aktywność antywirusową i przeciwnowotworową. Wstępna infekcja (zakażenie) atenuowanym wirusem grypy hamowało replikacje innych szczepów wirusa grypy dzikiego typu i innych wirusów (takich jak wirus Sendai) nadkażonych w jajach z zarodkami. Szczepienie atenuowanym wirusem grypy u zwierząt, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe, zmniejszyło liczbę utworzonych ognisk. Ponieważ wirus grypy jak wiadomo indukuje odpowiedź CTL (cytotoksyczne limfocyty T), atenuowany wirus jest bardzo atrakcyjnym kandydatem do szczepionek nowotworowych.
Do szczepionek wirusowych zalecane są mutacje, które zmniejszają, lecz nie znoszą aktywności antagonistycznej IFN wirusa, takie wirusy można selekcjonować pod względem wzrostu zarówno w konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych substratach oraz pod względem wirulencji pośredniej. W szczególności, twórcy wynalazku pokazali, że mutant o skróconym C-terminalnie NS1 replikuje do wysokich mian w substratach z niedoborem IFN, takich jak 6 i 7-dniowe zarodki kurze, jak również w błonie omoczniowej 10-dniowych zarodków kurzych, substracie konwencjonalnym dla wirusa grypy, który nie pozwala na wzrost mutantów wirusa grypy, w których usunięto cały gen NS1 (przytaczanych tu także jako mutanty „znokautowane”). Jednakże, replikacja mutanta o skróconym końcu C NS1 jest mniejsza u 12-dniowych zarodków kurzych. Podejście to pozwala, pierwszy raz, na utworzenie i identyfikację żywych atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, w których zmieniono, lecz nie zniesiono aktywność antagonistyczną wobec IFN i które są zdolne do wzrostu w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek. Podejście to dostarcza także, po raz pierwszy, układ skutecznej selekcji identyfikacji wirusa grypy lub innych wirusów, które zawierają mutacje nadające zmienioną, lecz nie zniesioną aktywność antagonistyczną wobec interferonu. Układy z niedoborem IFN mogą być stosowane do namnażania atenuowanych wirusów, które nie mogą być hodowane w układach konwencjonalnych stosowanych aktualnie do wytwarzania szczepionek. Określenie „układy z niedoborem IFN” jakie się tu stosuje, odnosi się do układów, np. komórek, linii komórkowych i zwierząt, takich jak myszy, kurczęta, indyki, króliki, szczury itd., które nie wytwarzają IFN lub wytwarzają IFN na niskim poziomie, nie odpowiadających lub odpowiadających mniej skutecznie na IFN, i/lub mających braki w indukowanej przez IFN aktywności genów antywirusowych. W tym celu, twórcy wynalazku zidentyfikowali lub opracowali liczne układy z niedoborem IFN, które można stosować, w tym, lecz bez ograniczenia, młode zarodki kurze, linie komórkowe z niedoborem IFN (takie jak komórki VERO lub genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe takie jak nokauty STAT1). Alternatywnie, zarodki kurze lub linie komórkowe można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN (łącznie z lekami, przeciwciałami, antysensami, rybozymami, itd). Jeszcze inna postać realizacji obejmuje stosowanie jaj z niedoborem układu IFN, np. jaj wytworzonych przez ptaki ujemne pod względem STAT1, zwłaszcza drób, w tym, lecz bez ograniczenia, transgeniczne kurczęta, kaczki lub indyki.
4. Opis rysunków
Figura 1. Wirus delNS1 hamuje replikację wirusa grypy A dzikiego typu w jajach. Jaja kurze z zarodkami w wieku 10 dni zaszczepiono wskazanymi pfu wirusa delNS1. Osiem godzin później 3 jaja zakażono 103 pfu wirusa WSN. Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa WSN przez test łysinek w komórkach MDCK. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Figura 2. Indukcja odpowiedzi antywirusowej przez wirusa delNS1 w zarodkach kurzych. Jaja kurze z zarodkami w wieku 10 dni zaszczepiono PBS (nie traktowano) lub 2 x 104 pfu wirusa delNS1
PL 212 316 B1 3 (traktowane delNS1). Osiem godzin później jaja ponownie zakażono 103 pfu wirusa grypy A/WSN/33 (H1N1), wirusa grypy A/PR8/34 (H + N1, wirusa grypy A/X-31 (H3N2), wirusa grypy B/Lee/40 lub wirusa Sendai. Po dwóch dniach inkubacji zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa przez test hemaglutynacji. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Figura 3. Komórki CV1 transfekowano plazmidem, wykazującym ekspresję IRF-3 poddanego fuzji z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Pozwoliło to na określenie lokalizacji IRF-3 wewnątrz komórek, przez mikroskopię fluorescencyjną. W niektórych przypadkach, plazmid ekspresyjny NS1 kotransfekowano plazmidem ekspresyjnym IRF-3 we wskazanych stosunkach. 24 godziny po transfekcji komórki zakażano wirusem PR8 (WT) lub delNS1 przy wysokim moi, zgodnie ze wskazaniami. 10 godzin po zakażeniu komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym pod względem lokalizacji IRF-3-GFP. Zaznaczono odsetek komórek wykazujących wyłącznie lokalizację cytoplazmatyczną (CYT) oraz lokalizację zarówno cytoplazmatyczną jak i jądrową IRF-3 (Nuc + Cyt).
5. Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano wytwarzanie, selekcję i identyfikację atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizowania odpowiedzi komórkowej IFN, oraz zastosowania takich wirusów w preparatach szczepionek i farmaceutycznych.
Wirusy mogą mieć genomy segmentowane lub niesegmentowane i można je selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję na promieniowanie UV, mutageny i/lub pasaże); reasortantów (dla segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, wirusy zmutowane można wytworzyć przez naturalną zmienność, ekspozycję na promieniowanie UV, ekspozycję na mutageny chemiczne, przez pasażowanie w gospodarzach niedozwolonych, przez reasortację (czyli przez koinfekcję atenuowanego segmentowanego wirusa z innym szczepem posiadającym żądane antygeny) i/lub przez genetyczną modyfikację (np. przy użyciu „genetyki odwrotnej”). Wirusy selekcjonowane do zastosowania w wynalazku, mają defektywną aktywność antagonizującą IFN i są atenuowane; czyli są one zakaźne i mogą replikować in vivo, lecz wytwarzają tylko niskie miana, wywołując poziom subkliniczny infekcji, który nie jest patogenny. Takie atenuowane wirusy są idealnymi kandydatami do żywych szczepionek.
W zalecanej postaci realizacji, atenuowane wirusy selekcjonowane do zastosowania w wynalazku, powinny być zdolne do indukcji silnej odpowiedzi IFN u gospodarza, cechy, która przyczynia się do wytworzenia silnej odpowiedzi immunologicznej przy zastosowaniu jako szczepionki i która ma inne konsekwencje biologiczne, które czynią wirusy użytecznymi jako środki farmaceutyczne do profilaktyki i/lub leczenia innych infekcji wirusowych, lub tworzenia nowotworów u osób z wysokim ryzykiem, lub innych chorób, które leczy się IFN.
Wynalazek opiera się, częściowo, na licznych stwierdzeniach i obserwacjach dokonanych przez twórców wynalazku podczas pracy z mutantami wirusa grypy. Jednakże te zasady można analogicznie stosować i ekstrapolować w stosunku do innych segmentowanych i niesegmentowanych wirusów o ujemnej nici RNA, w tym, lecz bez ograniczenia, paramyksowirusy (wirus Sendai, wirus paragrypy, świnki, wirus choroby Newcastle), morbiliwirusy (wirus odry, wirus nosówki i wirus księgosuszu); pneumowirusy (wirus syncytialny dróg oddechowych i bydlęcy wirus dróg oddechowych); oraz rabdowirusy (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i wirus wścieklizny).
Po pierwsze, odpowiedź IFN jest istotna dla infekcji wirusowych in vivo. Twórcy wynalazku stwierdzili, że wzrost wirusa grypy dzikiego typu A/WSN/33 u myszy z niedoborem IFN (myszy STAT1-/-) spowodował infekcję wielonarządową; czyli infekcja wirusowa nie ograniczała się tylko do płuc, jak to się dzieje u myszy dzikiego typu, u których powstaje odpowiedź IFN (Garcia-Sastre i inni, 1998, J. Virol. 72: 8550, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Po drugie, zgłaszający ustalili, że NS1 wirusa grypy działa jako antagonista IFN. Twórcy wynalazku ustalili, że mutant wirusa grypy z delecją całego genu NS1 (czyli „nokaut” NS1) nie był zdolny do wzrostu do wysokich mian w komórkach gospodarza kompetentnych pod względem IFN i mógł się namnażać tylko w gospodarzach z niedoborem IFN. Wirus z wyłączonym (znokautowanym) genem NS1 wykazywał fenotyp atenuowany (czyli był on letalny u myszy STAT1-/- bez IFN, lecz nie był u myszy dzikiego typu) i stwierdzono, że jest on silnym induktorem odpowiedzi IFN w komórkach gospodarza (Garcia-Sastre i inni 1998, Virology, 252: 324-330, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Wstępne zakażenie zmutowanym wirusem z wyłączeniem NS1 zmniejszyło miana wirusów grypy dzikiego typu i innych (np. Sendai) nadkażonych w jajach kurzych z zarodkami. W innym doświadczeniu, zakażenie zmutowanym wirusem grypy z wyłączonym NS1, zmniejszyło tworzenie ognisk u zwierząt zaszczepionych ko10
PL 212 316 B1 mórkami nowotworowymi. Tak więc, wirus grypy z wyłączonym NS1 posiadał interesujące właściwości biologiczne. Jednakże, wirusy grypy znokautowane pod względem NS1 nie mogły się namnażać w konwencjonalnych układach do wytwarzania szczepionek. W celu przezwyciężenia tego problemu twórcy wynalazku opracowali układy z niedoborem IFN, które pozwalają na wytwarzanie rozsądnych ilości atenuowanego wirusa.
Oprócz tego, twórcy wynalazku opracowali mutanty delecyjne NS1, które nie mają delecji całego genu. Niespodziewanie, te mutanty NS1 okazały się obrazować „pośredni” fenotyp, wirus może rosnąć w konwencjonalnych gospodarzach stosowanych do namnażania wirusa grypy (choć wzrost jest lepszy w układach z niedoborem IFN, które dają wyższe miana). Najistotniejsze jest to, że mutanty delecyjne są atenuowane in vivo i indukują silną odpowiedź IFN. Szczepienie mutantami wirusa grypy ze skróconym NS1 powodowało niższe miana wirusa u zwierząt później prowokowanych wirusem dzikiego typu, i powodowało zabezpieczenie przed chorobą.
Substraty opracowane do izolacji, identyfikacji i hodowli wirusów do celów szczepionek. W szczególności, opisano substraty z niedoborem interferonu do skutecznego hodowania mutantów wirusa grypy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, substratem z niedoborem interferonu jest taki, który jest defektywny pod względem zdolności do wytwarzania lub odpowiedzi wobec interferonu. Taki substrat można stosować do hodowli dowolnej ilości wirusów, które mogą wymagać środowiska wzrostu nie zawierającego interferonu. Takie wirusy mogą obejmować, lecz bez ograniczenia, paramyksowirusy (wirus Sendai, wirus paragrypy, świnki, wirus choroby Newcastle), morbiliwirusy (wirus odry, wirus nosówki i wirus księgosuszu); pneumowirusy (wirus syncytialny dróg oddechowych i bydlęcy wirus dróg oddechowych); oraz rabdowirusy (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i wirus wścieklizny).
Wynalazek odnosi się do zastosowania atenuowanego wirusa tu opisanego w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych przeznaczonych dla ludzi i zwierząt. W szczególności, atenuowane wirusy można stosować jako szczepionki przeciw szerokiemu zakresowi wirusów lub innych patogenów zakaźnych (np. bakteriom, pasożytom, grzybom) lub antygenom specyficznym wobec nowotworów. W innej postaci realizacji, atenuowane wirusy, które hamują replikację wirusową i tworzenie nowotworu, można stosować do profilaktyki lub leczenia infekcji (patogenami wirusowymi lub niewirusowymi) lub tworzenia nowotworu lub leczenia chorób, dla których korzystne jest terapia IFN. Można stosować wiele metod wprowadzania żywych atenuowanych preparatów wirusowych do podmiotu ludzkiego lub zwierzęcego, aby indukować odporność lub odpowiednią odpowiedź cytokinową. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustna, przeskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. W zalecanej postaci realizacji, atenuowane wirusy tu opisane wynalazku opracowuje się w postaci do dostarczania donosowego.
5.1. Wytwarzanie mutantów o zmienionej aktywności antagonistycznej IFN
Zgodnie z przedstawionym opisem można wyselekcjonować i zastosować dowolnego zmutowanego wirusa, który posiada zmniejszoną aktywność antagonistyczną dla IFN. W jednej postaci realizacji można wyselekcjonować mutanty występujące naturalnie lub odmiany, albo mutanty spontaniczne, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi wobec IFN. W innej postaci realizacji zmutowane wirusy można wytworzyć przez ekspozycję wirusa na mutageny, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub mutageny chemiczne, lub przez wielokrotne pasażowanie i/lub pasaż w niedozwolonym gospodarzu. Skrining w różnicującym układzie wzrostowym można stosować do selekcji tych mutantów, które mają zaburzoną funkcję antagonistyczną wobec IFN. Dla wirusów o genomie segmentowanym, fenotyp atenuowany można przenieść do innego szczepu, mającego pożądany antygen, przez reasortację (czyli koinfekcję atenuowanego wirusa i żądanego szczepu oraz selekcję reasortantów wykazujących oba fenotypy).
Mutacje można wbudować do wirusa o ujemnej nici RNA, takiego jak wirus grypy, RSV, NDV, VSV i PIV, stosując podejścia „genetyki odwrotnej”. W ten sposób mutacje naturalne lub inne, które nadają fenotyp atenuowany, można wbudować w szczepy do szczepionek. Przykładowo, można wbudować delecje, insercje lub substytucje regionu kodującego odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN (tak jak NS1 grypy). Bierze się także pod uwagę delecje, substytucje lub insercje regionu niekodującego genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. W tym celu można wbudować mutacje w sygnały odpowiedzialne za transkrypcję, replikację, poliadenylację i/lub upakowanie genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. Przykładowo, w wirusie grypy takie modyfikacje mogą obejmować, lecz bez ograniczenia: substytucję regionów nie kodujących genu wirusa grypy B (Muster i inni 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177), wymiany par
PL 212 316 B1 zasad w regionach niekodujących genu wirusa grypy (Fodor i inni, 1998, J. Virol. 72: 6283), mutacje w regionie promotorowym genu wirusa grypy (Piccone i inni, 1993, Virus Res. 28:99; Li i inni 1992, J. Virol. 66: 4331), substytucje i delecje w całej rozciągłości reszt urydynowych przy końcu 5' genu wirusa grypy, wpływające na poliadenylację (Luo i inni, 1991, J. Virol. 65:2861; Li i inni J. Virol. 1994, 68 (2): 1245-9). Takie mutacje, np. w stosunku do promotora, mogą obniżać ekspresję genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. Mutacje w genach wirusowych, które mogą regulować ekspresję genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN, wchodzą w zakres wirusów, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem.
Zgodnie z wynalazkiem brano także pod uwagę mutacje w stosunku do segmentu genowego NS1, które niekoniecznie wynikają ze zmiany aktywności antagonistycznej wobec IFN lub fenotypu indukującego IFN, lecz raczej wywołują zmiany funkcji wirusowych i fenotyp atentowany, np. zmianę inhibicji eksportu jądrowego mRNA zawierającego poli(A), zmianę inhibicji splicingu pre-mRNA, zmianę inhibicji aktywacji PKR przez sekwestrację dsRNA, zmianę wpływu na translację RNA wirusa i zmianę inhibicji poliadenylacji mRNA gospodarza (np. patrz Krug w Textbook of Influenza, Nicholson i inni, wydawca, 1998, 82-92 i odniesienia tam cytowane).
Technika genetyki odwrotnej obejmuje wytwarzanie syntetycznych rekombinowanych wirusów RNA, które zawierają regiony niekodujące ujemnej nici RNA wirusa, które są zasadnicze dla rozpoznania przez polimerazy wirusowe i dla sygnałów upakowania koniecznych do wytworzenia dojrzałego wirionu. Rekombinowane RNA syntetyzuje się z rekombinowanej matrycy DNA i odtwarza in vitro z kompleksem oczyszczonej polimerazy wirusowej, tworząc rekombinowane rybonukleoproteiny (RNP), które można stosować do transfekcji komórek. Skuteczniejszą transfekcję uzyskuje się jeśli białka polimerazy wirusowej są obecne podczas transkrypcji syntetycznego RNA albo in vitro albo in vivo. Syntetyczne rekombinowane RNP można odtworzyć do zakaźnych cząstek wirusowych. Powyższe techniki opisano w patencie US nr 5 166 057 wydanym 25 listopada 1992; patencie US nr 5 854 037 wydanym 29 grudnia 1998; w europejskiej publikacji patentowej EP 0702085 A1, opublikowanej 20 lutego 1996; w zgłoszeniu patentowym US nr 09/152 845; w międzynarodowej publikacji patentowej PCT WO 97/12032 opublikowanej 3 kwietnia 1997; WO 96/34625 opublikowanej 7 listopada 1996; w europejskiej publikacji patentowej EP-A780475; WO 99/02625 opublikowanej 21 stycznia 1999; WO 98/53078 opublikowanej 26 listopada 1998; WO 98/02530 opublikowanej 22 stycznia 1998; WO 99/15672 opublikowanej 1 kwietnia 1999; WO 98/13501 opublikowanej 2 kwietnia 1998; WO 97/06270 opublikowanej 20 lutego 1997; oraz EPO 780 47SA1 opublikowanej 25 czerwca 1997, z których każdą załącza się tu w całości jako odniesienie.
Atenuowane wirusy wytworzone z użyciem genetyki odwrotnej można stosować w preparatach szczepionek i farmaceutycznych tu opisywanych. Techniki genetyki odwrotnej można także stosować do wprowadzania dodatkowych mutacji w innych genach wirusowych istotnych dla wytwarzania szczepionki, to jest do atenuowanego wirusa można wbudować epitopy użytecznych odmian szczepów do szczepionek. Alternatywnie, do atenuowanego szczepu można wbudować całkiem obce epitopy, włączając antygeny pochodzące od innych patogenów wirusowych lub niewirusowych. Przykładowo, do atenuowanego szczepu można wbudować antygeny niespokrewnionych wirusów, takich jak HIV (gp160, gp120, gp41), antygeny pasożytów (np. malarii), antygeny bakteryjne lub grzybowe albo antygeny nowotworowe. Alternatywnie, do chimerowych atenuowanych wirusów tu opisanych można wbudować epitopy, które zmieniają tropizm wirusa in vivo.
W alternatywnej postaci realizacji do skonstruowania atenuowanych wirusów posiadających pożądane epitopy w wirusach o segmentowanym RNA można użyć połączenie techniki genetyki odwrotnej i reasortacji. Przykładowo, atenuowany wirus (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę genetyki odwrotnej) oraz szczep niosący pożądany epitop szczepionki (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę genetyki odwrotnej), można koinfekować w gospodarzu, który pozwala na reasortację segmentowanych genomów.
Następnie, można wyselekcjonować formy z reasortowanym genomem, które posiadają zarówno fenotyp atentowany, jak i pożądany epitop.
Zmutowany może być również wirus DNA (np. krowianki, adenowirus, bakulowirus) lub wirus o dodatniej nici RNA (np. wirus polio). W takich przypadkach, można stosować techniki rekombinacji DNA, które są dobrze znane w dziedzinie (np. patrz patent US nr 4 769 330 Paoletti'ego, patent US nr 4 215 051 Smitha, które załącza się tu w całości jako odniesienie).
Zgodnie z wynalazkiem można skonstruować dowolnego wirusa, w tym, lecz bez ograniczenia, rodziny przedstawione tabeli 2 poniżej.
PL 212 316 B1
T a b e l a 2
Rodziny wirusów ludzkich i zwierzęcych
Cechy wirusa | Rodzina wirusa |
dsDNA z osłonką | Poxviridae Irididoviridae Herpesviridae |
Bez osłonki | Adenoviridae Papovaviridae Hepadnaviridae |
ssDNA bez osłonki | Parvoviridae Reaoviridae |
dsRNA bez osłonki | Birnaviridae |
ssRNA z osłonką genom o dodatniej polarności (sensowny brak etapu DNA w replikacji | Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Wirus zapalenia wątroby typu C |
Etap DNA w replikacji | Retroviridae |
Genom o ujemnej polarności (antysen- sowny) genom niesegmentowany | Paramyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae |
Genom segmentowany | Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae |
Bez osłonki | Picornaviridae Caliciyiridae |
Stosowane skróty: ds = podwójna nić; ss = pojedyncza nić; z osłonką = posiadający zewnętrzną podwójną warstwę lipidową pochodzącą z błony komórkowej gospodarza; genom sensowny = dla wirusów RNA, genomy, które składają się z sekwencji nukleotydowej podlegającej bezpośredniej translacji na rybosomach = dla wirusów DNA, genomy, które składając się z sekwencji nukleotydowych, które są takie same jak mRNA; genom antysensowny = genomy, które składają się z sekwencji nukleotydowej komplementarnej do nici sensownej.
Zgodnie z wynalazkiem opisano genetycznie zmodyfikowane wirusy grypy zawierające delecje i/lub skrócenia produktu genowego NS1. Szczególnie zalecane są mutanty NS1 wirusa grypy A i B. W jednym podejściu można zachować części regionu aminoterminalnego produktu genowego NS1, ale usunąć region C-terminalny produktu genowego NS1. Specyficzne pożądane mutacje można skonstruować poprzez insercję kwasu nukleinowego, delecję, lub mutację w odpowiednim kodonie. W szczególności, skrócone białka NS1 mają od 1-60 aminokwasów, 1-70 aminokwasów, 1-80 aminokwasów, 1-90 aminokwasów (aminokwas N-terminalny oznacza 1), a korzystnie 90 aminokwasów; od 1-100 aminokwasów; a zwłaszcza 99 aminokwasów; od 1-110 aminokwasów; od 1-120 aminokwasów; lub od 1-130 aminokwasów, a zwłaszcza 124 aminokwasy produktu dzikiego typu genu NS1.
Zgodnie z wynalazkiem brano także pod uwagę dowolnego genetycznie zmodyfikowanego wirusa grypy, w którym produkt genowy NS1 został zmodyfikowany przez skrócenie lub modyfikację białka NS1, które zmutowanym wirusom nadają następujące fenotypy: zdolność wirusów do wzrostu do wysokich mian w substratach niekonwencjonalnych, takich jak jaja kurze z 6-7 dniowymi zarodkami, lub zdolność wirusów do indukcji odpowiedzi interferonowej gospodarza. Dla wirusów grypy A, obejmują one, lecz bez ograniczenia, wirusy ze skróceniami NS1.
Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie naturalnie występujących zmutowanych wirusów grypy A lub B, mających fenotyp atenuowany, jak również szczepów wirusa grypy skonstruowanych tak, aby zawierały takie mutacje odpowiedzialne za fenotyp atenuowany. W przypadku wirusów grypy A obejmują one lecz bez ograniczenia: wirusy mające NS1 o 124 aminokwasach (Norton i inni, 1987, Virology 156: 204-213, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Dla wirusów grypy B obejmują one, lecz bez ograniczenia: wirusy posiadające mutację skrócenia NS1, zawierające 110 aminokwaPL 212 316 B1 sów pochodzących z końca N (B/201) (Norton i inni, 1987, Virology 156: 204-213, które załącza się tu w całości jako odniesienie) oraz wirusy mające mutację skrócenia NS1, obejmujące 89 aminokwasów pochodzących z końca C (B/AWBY-234) (Tobita i inni 1990 Virology 174: 314-19, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie naturalnie występujących mutantów analogicznych do NS1/38, NS1/80, NS1/124, (Egorov i inni, 1998, J. Virol. 72 (8): 6437-41) jak również naturalnie występujących mutantów, A/Turkey/ORE/71, B/201 lub B/AWBY-234.
Atenuowany wirus grypy można dodatkowo modyfikować tak, aby wykazywał ekspresję antygenów innych szczepów do szczepienia (np. przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji). Alternatywnie, atenuowany wirus grypy można skonstruować przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji z genetycznie zmodyfikowanymi wirusami tak, aby wykazywał ekspresję całkowicie obcych epitopów, np. antygenów innych patogenów zakaźnych, antygenów nowotworowych lub antygenów kierunkujących. Ponieważ segment RNA NS jest najkrótszy wśród ośmiu RNA wirusowych, możliwe jest, że RNA NS będzie tolerować dłuższe insercje sekwencji heterologicznych niż inne geny wirusowe. Ponadto, segment RNA NS kieruje syntezą dużych ilości białka w zakażonych komórkach, sugerując, że byłby to idealny segment do insercji obcych antygenów. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, każdy z ośmiu segmentów wirusów grypy można stosować do insercji sekwencji heterologicznych. Przykładowo, jeśli pożądana jest prezentacja antygenu powierzchniowego, można użyć segmenty kodujące białka strukturalne np. HA lub NA.
5.2 Układ selekcji w oparciu o restrykcję gospodarza
Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby selekcji wirusów, które posiadają pożądany fenotyp, czyli wirusów, które posiadają niską lub brak aktywności antagonistycznej wobec IFN, otrzymanych z naturalnych odmian, odmian spontanicznych (czyli odmian, które ewoluują podczas namnażania wirusa), mutagenizowanych naturalnych odmian, reasortantów i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Takie wirusy można najlepiej przesiewać w testach wzrostu różnicującego, które porównują wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN.
Wybiera się wirusy, które wykazują lepszy wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN; dogodnie wybiera się wirusy, które rosną do mian o co najmniej jeden logarytm wyższych w układach z niedoborem IFN w porównaniu z układem kompetentnym pod względem IFN.
Alternatywnie, wirusy można przesiewać przy użyciu układów testowych IFN, np. układów testowych opartych na transkrypcji, w których ekspresja genu reporterowego jest kontrolowana przez promotor odpowiadający na IFN. W celu identyfikacji wirusów, które skutecznie indukują odpowiedź wobec IFN, lecz które są niezdolne do antagonizacji odpowiedzi IFN można mierzyć ekspresję genu reporterowego w komórkach zakażonych względem niezakażonych. Jednak w zalecanej postaci realizacji, stosuje się testy wzrostu różnicującego do selekcji wirusów, mających żądany fenotyp, ponieważ stosowany układ gospodarza (kompetentny pod względem IFN względem układu z niedoborem IFN) stosuje odpowiednią presję selekcyjną.
Przykładowo, wzrost wirusa (mierzony przez miano) można porównać w różnych komórkach, liniach komórkowych lub zwierzęcych układach modelowych, które wykazują ekspresję IFN oraz składników odpowiedzi IFN. W tym celu, można porównać wzrost wirusa w liniach komórkowych, jak linie VERO (które wykazują niedobór IFN) względem komórek MDCK (które są kompetentne pod względem IFN). Alternatywnie, można otrzymać i ustalić linie komórkowe z niedoborem IFN od zwierząt hodowanych lub genetycznie zmodyfikowanych tak, aby wykazywały niedobór w układnie IFN (np. zmutowane myszy STAT1-/-). Można mierzyć wzrost wirusa w takich liniach komórkowych, w porównaniu z komórkami kompetentnymi pod względem IFN, otrzymanymi np. od zwierząt dzikiego typu (np. myszy dzikiego typu). W jeszcze innej postaci realizacji można skonstruować linie komórkowe, które są kompetentne pod względem IFN i wiadomo, że podtrzymują wzrost wirusa dzikiego typu tak, aby wykazywały niedobór IFN (np. przez nokaut STAT1, IRF3, PKR itd). Można stosować techniki, które są dobrze znane w dziedzinie namnażania wirusów w liniach komórkowych (patrz np. przykłady działania poniżej). Można porównać wzrost wirusa w standardowej kompetentnej pod względem IFN linii komórkowej względem genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej z niedoborem IFN.
Można także stosować układy zwierzęce. Przykładowo, dla grypy można porównać wzrost w jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN, np. około 6 do 8-dniowych, ze wzrostem w jajach kurzych z zarodkami kompetentnymi pod względem IFN, np. około 10 do 12-dniowych.
W tym celu można stosować techniki dobrze znane w dziedzinie do zakażania i namnażania w jajach (np. patrz przykłady działania poniżej). Alternatywnie, można porównać wzrost u myszy
PL 212 316 B1 z niedoborem IFN STAT1-/-, z myszami dzikiego typu kompetentnymi pod względem IFN. W jeszcze innej realizacji można porównać wzrost w zarodkach kurzych z niedoborem IFN wytworzonych przez np. transgeniczny drób STAT1-/-, ze wzrostem w jajach kompetentnych pod względem IFN wytworzonych przez drób dzikiego typu.
Jednak do celów skriningu można stosować układy krótkotrwałe z niedoborem IFN, zamiast układów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, układ gospodarza można traktować związkami, które hamują wytwarzanie IFN i/lub składników odpowiedzi IFN (np. leki, przeciwciała przeciwko IFN, przeciwciała przeciwko receptorowi IFN, inhibitory PKR, cząsteczki antysensowne i rybozymy, itd). Wzrost wirusa można porównać w nietraktowanych kontrolach kompetentnych pod względem IFN względem układów traktowanych z niedoborem IFN. Przykładowo, starsze jaja kompetentne pod względem IFN można wstępnie traktować takimi lekami przed zakażeniem przesiewanym wirusem. Wzrost porównuje się ze wzrostem uzyskanym w nietraktowanych jajach kontrolnych w tym samym wieku.
Sposoby skriningu tu opisane zapewniają prosty i łatwy przesiew w celu identyfikacji zmutowanych wirusów o zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez niezdolność zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku odpowiadającym na IFN, w porównaniu ze zdolnością zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku z niedoborem IFN. Sposoby skriningu tu opisane można także stosować do identyfikacji zmutowanych wirusów o zmienionej, lecz nie zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez pomiar zdolności zmutowanego wirusa do wzrostu zarówno w odpowiadających na IFN, np. 10-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach MDCK jak i środowiskach z niedoborem IFN, np. 6 do 7-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach VERO. Przykładowo, wirusy grypy wykazujące o co najmniej jeden logarytm niższe miana w 10-dniowych zarodkach w stosunku do 6-7-dniowych zarodków, będą uważane za posiadające zakłóconą zdolność do hamowania odpowiedzi wobec IFN. W innym przykładzie, wirusy grypy wykazujące o co najmniej jeden logarytm niższe miano u 12-dniowych zarodków (które wykazują niską odpowiedź wobec IFN) w stosunku do 10-dniowych zarodków (które wykazują średnią odpowiedź wobec IFN) uznaje się za częściowo zakłóconą pod względem zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN i uznaje się za atrakcyjnych kandydatów do szczepionki.
Sposoby selekcji tu opisane obejmują także identyfikację tych zmutowanych wirusów, które indukują odpowiedzi wobec IFN. Zgodnie ze sposobami selekcji tu opisanymi indukcję odpowiedzi wobec IFN można mierzyć przez testowanie poziomu ekspresji IFN lub ekspresji genów docelowych lub genów reporterowych indukowanych przez IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem lub aktywacji transaktywatorów związanych z ekspresją IFN i/lub odpowiedzią IFN.
Indukcję odpowiedzi IFN można określać przez pomiar stanu fosforylacji składników szlaku IFN po zakażeniu testowanym zmutowanym wirusem, np. IRF-3, który jest ufosforylowany w odpowiedzi na podwójną nić RNA. W odpowiedzi na IFN typu I, następuje szybka fosforylacja tyrozyny kinazy Jaki i kinazy TyK2, podjednostek receptora IFN, STAT1 i STAT2. Tak więc, w celu określenia czy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN, komórki, takie jak komórki 293, zakaża się testowanym zmutowanym wirusem i po infekcji komórki poddaje się lizie. Składniki szlaku IFN, takie jak kinaza Jaki lub kinaza TyK2, poddaje się immunoprecypitacji z lizatów zakażonych komórek, przy użyciu specyficznych surowic poliklonalnych lub przeciwciał i określa stan fosforylacji tyrozyny kinazy, przez testy odcisku immunologicznego z użyciem przeciwciała antyfosfotyrozynowego (np. patrz Krishnan i inni 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305). Stan zwiększonej fosforylacji jakiegokolwiek składnika szlaku IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem będzie wskazywać na indukcję odpowiedzi IFN przez zmutowanego wirusa.
Układy selekcyjne tu opisane obejmują pomiar zdolności do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcji indukowanej w odpowiedzi na infekcje wirusową, np. IRF3, STAT1, STAT2, itd. W szczególności, STAT1 i STAT2 są ufosforylowane i translokowane z cytoplazmy do jądra, w odpowiedzi na IFN typu I. Zdolność do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcji można mierzyć technikami znanymi fachowcom, np. testami EMSA (ang. electromobility shift assay), barwienia komórek, itd.
Indukcję odpowiedzi IFN można określić przez pomiar aktywacji transkrypcji zależnej od IFN po zakażeniu testowym zmutowanym wirusem. Ekspresję genów, o których wiadomo, że są indukowane przez IFN, np. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylanosyntetazy, głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I, itd., można analizować technikami znanymi fachowcom (np. northern blot, western blot,
PCR itd.).
PL 212 316 B1
Alternatywnie, testowane komórki, takie jak ludzkie komórki zarodkowe nerek lub ludzkie komórki mięsaka kościotwórczego, modyfikuje się tak, aby wykazywały krótkotrwałą lub konstytutywną ekspresję genów reporterowych, takich jak gen reporterowy lucyferazy lub gen reporterowy transferazy chloramfenikolowej (CAT) pod kontrolą elementu odpowiedzi stymulowanej IFN, takiego jak promotor stymulowany IFN genu ISG-54K (Bluyssen i inni 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395-402). Komórki zakaża się testowym zmutowanym wirusem i poziom ekspresji genu reporterowego porównuje z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi wirusem dzikiego typu. Zwiększenie poziomu ekspresji genu reporterowego po zakażeniu testowym wirusem będzie wskazywać, że testowy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN.
Układy selekcyjne tu opisane obejmują pomiar indukcji IFN przez określenie, czy ekstrakt z komórek lub jaj zakażonych testowym zmutowanym wirusem jest zdolny do nadawania aktywności zabezpieczającej przeciw infekcji wirusowej. Konkretniej, grupy 10-dniowych jaj z zarodkami zakaża się testowym zmutowanym wirusem lub wirusem dzikiego typu. Około 15 do 20 godzin po zakażeniu, zbiera się płyn omoczniowy i testuje pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przed infekcją VSV w komórkach hodowli tkankowej, takiej jak komórki CEF.
5.3 Namnażanie wirusa w substratach wzrostowych z niedoborem interferonu
Do hodowli i izolacji naturalnie występujących lub zmodyfikowanych zmutowanych wirusów posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną IFN można stosować także sposoby i substraty z niedoborem IFN. Substraty z niedoborem IFN, które można stosować do podtrzymywania wzrostu atenuowanych zmutowanych wirusów, obejmują, lecz bez ograniczenia, naturalnie występujące komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja z zarodkami, które wykazują niedobór IFN, np. komórki Vero, młode jaja z zarodkami; rekombinowane komórki lub linie komórkowe, które są tak zmodyfikowane, aby wykazywały niedobór IFN, np. linie komórkowe z niedoborem IFN pochodzące z myszy z wyłączonym STAT1 lub innych podobnie zmodyfikowanych zwierząt transgenicznych; jaja z zarodkami otrzymane od ptaków z niedoborem IFN, zwłaszcza drobiu (np. kur, kaczek, indyków), łącznie ze stadem, które jest tak hodowane, aby wykazywało niedobór IFN lub ptaków transgenicznych (np. nokautów STAT1). Alternatywnie, układ komórek gospodarza, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można genetycznie zmodyfikować tak, aby wykazywały ekspresję transgenów, kodujących inhibitory układu IFN, np. dominujące mutanty ujemne, takie jak STAT1 bez domeny wiążącej DNA, antysensowny RNA, rybozymy, inhibitory wytwarzania IFN, inhibitory sygnału IFN i/lub inhibitory genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Należy pamiętać, że zwierzęta, które są hodowane lub genetycznie zmodyfikowane tak, aby wykazywały niedobór IFN, będą wykazywać nieco obniżoną odporność immunologiczną, i powinny być utrzymywane w kontrolowanym środowisku pozbawionym chorób. Tak więc, należy przedsięwziąć odpowiednie środki (włączając stosowanie antybiotyków w diecie), aby ograniczyć ryzyko ekspozycji na czynniki zakaźne zwierząt transgenicznych z niedoborem IFN, takich jak stada kur hodowlanych, kaczek indyków, itd. Alternatywnie, układ gospodarza, np. komórki, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta, można traktować związkiem, który hamuje wytwarzanie IFN i/lub szlak IFN, np. lekami, przeciwciałami, cząsteczkami antysensownymi, cząsteczkami rybozymowymi ukierunkowanymi na gen STAT1 i/lub genami antywirusowymi indukowanymi przez IFN.
Niedojrzałe jaja kurze z zarodkami obejmują jaja, które naturalnie są w wieku poniżej dziesięciu dni, dogodnie sześć do dziewięciu dni; oraz jaja, które sztucznie naśladują niedojrzałe jaja w wieku poniżej dziesięciu dni, w wyniku zmian warunków wzrostu, np. zmian temperatury inkubacji, co powoduje opóźniony rozwój jaj tak, że układ IFN jaja nie jest w pełni rozwinięty w porównaniu z jajami 10- do 12-dniowymi.
5.3.1 Naturalne substraty z niedoborem IFN
Naturalnie występujące i zmodyfikowane zmutowane wirusy tu opisane mogą być namnażane w niekonwencjonalnych substratach, takich jak niedojrzałe jaja z zarodkami, które jeszcze nie wykształciły układu IFN. Niedojrzałych jaj z zarodkami nie stosuje się zazwyczaj do hodowli wirusów, z powodu ich delikatności i mniejszej objętości omoczni. Niniejszy wynalazek obejmuje hodowlę zmutowanych wirusów w zarodkach mniej niż 10-dniowych; korzystnie hodowlę zmutowanego wirusa w 8-dniowych zarodkach i najkorzystniej w 6- do 8-dniowych zarodkach.
Niniejszy wynalazek obejmuje także sposoby hodowli i izolacji zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w komórkach i liniach komórkowych, które naturalnie nie posiadają szlaku IFN lub wykazują niedobór szlaku IFN lub niedobory w szlaku IFN, np. niski poziom ekspresji IFN w porównaniu z komórkami dzikiego typu. W szczególnie zalecanej postaci
PL 212 316 B1 wynalazku, niniejszy wynalazek odnosi się do sposobów hodowli zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w komórkach Vero.
5.3.2 Genetycznie zmodyfikowane substraty z niedoborem IFN
Niniejszy wynalazek odnosi się do sposobów hodowli i izolowania zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w genetycznie zmodyfikowanym substracie z niedoborem IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje transgeniczne ptactwo, u którego zmutowano gen zasadniczy dla układu IFN, np. STAT1, które będą składać jaja z niedoborem IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje dodatkowo transgeniczne ptactwo, które wykazuje ekspresję dominujących ujemnych czynników transkrypcyjnych, np. braku domeny wiążącej DNA STAT1, rybozymów, antysensownego RNA, inhibitorów wytwarzania IFN, inhibitorów sygnalizacji IFN i inhibitorów genów antywirusowych indukowanych w odpowiedzi na IFN. Korzyść ze stosowania jaj od transgenicznego ptactwa z niedoborem IFN jest taka, że do hodowli wirusa można stosować konwencjonalne 10-dniowe jaja, które są stabilniejsze i mają większą objętość z powodu większego rozmiaru. W jeszcze innej postaci realizacji można skonstruować linie komórkowe tak, aby wykazywały niedobór IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje linie komórkowe, w których mutuje się geny zasadnicze do syntezy IFN, szlaku IFN i/lub genu (genów) antywirusowego indukowanego przez IFN, np. STAT1.
Substraty z niedoborem testosteronu obejmują rekombinowane linie komórkowe lub zwierzęta, w szczególności ptaki, w których jeden lub więcej genów zasadniczych dla szlaku IFN, np. receptor interferonowy STAT1, itd., został przerwany, czyli jest „nokautowany”; zwierzęciem rekombinowanym może być dowolne zwierzę i obejmuje to ptaka, np. kurczaka, indyka, kurę, kaczkę, itd. (patrz np. Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry i inni 1993, Trasgenic Res. 2: 125; Stern, C. D. 1996, Curr. Top Microbiol. Immunol. 212: 195-206; oraz Shuman, 1991, Experimentia 47: 897 w celu przeglądu dotyczącego wytwarzania ptaków transgenicznych, załączone tu w całości jako odniesienie). Taką linię komórkową lub zwierzę można wytworzyć każdą metodą znaną w dziedzinie do przerywania genu na chromosomie komórki lub zwierzęcia. Takie techniki obejmują, lecz bez ograniczenia, mikroiniekcję do przedjądrzy (Hoppe i Wagner, 1989, opis patentowy nr 4 873 191); przenoszenie genu za pośrednictwem retrowirusa do linii zarodkowych (Van der Putten i inni, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152); celowanie genowe w zarodkowych komórkach macierzystych (Thompson i inni, 1989, Cell 56: 313); elektroporację zarodków (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803); oraz przenoszenie genu za pośrednictwem nasienia (Lavitrano i inni, 1989, Cell 57: 717); itd. Dla przeglądu takich technik - patrz Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171, który załącza się tu w całości jako odniesienie.
W szczególności, zwierzę z wyłączonym STAT1, można wytworzyć przez pobudzenie rekombinacji homologicznej między genem STAT1 w jego chromosomie i egzogennym genem STAT1, który unieczynniono biologicznie (np. przez insercje sekwencji heterologicznej, np. genu oporności na antybiotyk). Metody rekombinacji homologicznej do przerywania genów w genomie myszy opisano np. u Capecchi (1989, Science, 244: 1288) i Mansour i inni (1988, Nature 336: 348).
W skrócie, całość lub część klonu genomowego STAT1 izoluje się z genomowego DNA z tego samego gatunku, jak znokautowana komórka lub zwierzę. Klon genomowy STAT1 można izolować dowolną metodą znaną w dziedzinie do izolacji klonów genomowych (np. przez sondowanie biblioteki genomowej sondą pochodzącą z sekwencji STAT1, taką jak sekwencje dostarczone do wglądu przez Meraz i innych 1996, Cell 84: 431; Durbin i innych 1996, Cell 84: 443 i odniesienia tam cytowane). Po wyizolowaniu klonu genomowego, całość lub część klonu wprowadza się do rekombinowanego wektora. W pewnych przypadkach część klonu wprowadzanego do wektora zawiera co najmniej część egzonu genu STAT1, czyli zawiera sekwencję kodującą białko STAT1. Następnie do egzonu genu STAT1 wprowadza się sekwencję niehomologiczną do sekwencji STAT1, zwłaszcza dodatni marker selekcyjny, taki jak gen kodujący oporność na antybiotyk. Marker selekcyjny jest dogodnie operacyjnie związany z promotorem, dogodniej promotorem konstytutywnym. Sekwencję nie homologiczną wprowadza się gdziekolwiek w sekwencji kodującej STAT1, co będzie przerywać aktywność STAT1, np. w pozycji, w której mutacje punktowe lub inne mutacje inaktywują, jak przedstawiono, działanie białka STAT1. Przykładowo, lecz bez ograniczenia, sekwencję nie homologiczną można wprowadzić do sekwencji kodującej część białka STAT1, zawierającą całość lub część domeny kinazy (np. sekwencji kodującej co najmniej 50, 100, 150, 200 lub 250 aminokwasów domeny kinazy).
Dodatnim markerem selekcyjnym jest dogodnie gen oporności na neomycynę (gen neo) lub gen oporności na higromycynę (gen hygro). Promotorem może być dowolny promotor znany w dziedzinie; np. promotorem może być promotor kinazy fosfoglicerynianowej (PGK) (Adra i inni, 1987, Gene 60:
PL 212 316 B1
65-74), promotor PolII (Soriano i inni, 1991 Cell 64: 693-701) lub promotor MCI, który jest promotorem syntetycznym przeznaczonym do ekspresji w zarodkowych komórkach macierzystych (Thomas i Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512). Zastosowanie markera selekcyjnego, takiego jak gen oporności na antybiotyk, pozwala na selekcję komórek, do których wprowadzono wektor celujący (np. ekspresja produktu genu neo nadaje oporność na G418, a ekspresja produktu genu hygro nadaje oporność na higromycynę).
W zalecanej postaci realizacji ujemny marker selekcyjny dla etapu selekcji przeciwnej do homologicznej rekombinacji wektora, w przeciwieństwie do nie homologicznej, wprowadza się na zewnątrz insertu klonu genomowego STAT1. Przykładowo, takim ujemnym markerem selekcyjnym jest gen kinazy tymidynowej HSV (HSV-tk), którego ekspresja uwrażliwia komórki na gancyklowir. Ujemny marker selekcyjny znajduje się dogodnie pod kontrolą promotora, takiego jak, lecz bez ograniczenia, promotor PGK, promotor PolII lub promotor MCI.
Gdy nastąpi rekombinacja homologiczna, części wektora, które są homologiczne do genu STAT1, jak również nie homologiczny insert wewnątrz sekwencji genu STAT1, wprowadza się do genu STAT1 w chromosomie, a pozostałość wektora traci się. Tak więc, ze względu na to, że ujemny marker selekcyjny znajduje się na zewnątrz regionu homologii z genem STAT1, komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna (lub ich potomstwo), nie będą zawierać ujemnego markera selekcyjnego. Przykładowo, jeśli ujemnym markerem selekcyjnym jest gen HSV-tk, komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna nie będą wykazywały ekspresji kinazy tymidynowej i przeżyją ekspozycję na gancyklowir. Procedura ta pozwala na selekcję komórek, w których zaszła rekombinacja homologiczna w porównaniu z rekombinacją nie homologiczną, w której prawdopodobnie ujemny marker selekcyjny jest także wprowadzony do genomu razem z sekwencjami STAT1 i dodatnim markerem selekcyjnym. Tak więc, komórki, w których zaszła rekombinacja nie homologiczną będą najprawdopodobniej wykazywać ekspresję kinazy tymidynowej i będą wrażliwe na gancyklowir.
Po wytworzeniu wektora celującego, linearyzuje się go z użyciem enzymu restrykcyjnego, dla którego istnieje unikalne miejsce w wektorze celującym i linearyzowany wektor wprowadza się do zarodkowych komórek macierzystych (ES) (Gossler i inni 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069) dowolną metodą znaną w dziedzinie, np. przez elektroporację. Jeśli wektor celujący zawiera dodatni marker selekcyjny oraz ujemny marker selekcji przeciwnej, komórki ES, w których zaszła rekombinacja homologiczna można wyselekcjonować przez inkubację w pożywkach selekcyjnych. Przykładowo, jeśli markery selekcyjne są genem oporności neo i genem HSV-tk, komórki są poddawane ekspozycji na G418 (np. około 300 μg/ml) i gancyklowir (np. około 2 μΜ).
W celu potwierdzenia, że przerwane sekwencje STAT1 rekombinowały homologicznie do genu STAT1 w genomie komórek ES, można stosować każdą technikę znaną w dziedzinie do genotypowania, przykładowo, lecz bez ograniczenia, analizę Southern blot lub łańcuchową reakcję polimerazy. Ze względu na to, że mapa restrykcyjna klonu genomowego STAT1 jest znana i znane są sekwencje kodujące sekwencję STAT1 (patrz Meraz i inni 1996, Cell 84: 431; Durbin i inni 1996, Cell 84: 443-450, wszystkie cytowane tam odniesienia), można określić wielkość poszczególnych fragmentów restrykcyjnych lub produktów powielania PCR wytworzonych z DNA zarówno od przerwanych, jak i nieprzerwanych alleli. Tak więc, testując pod kątem fragmentu restrykcyjnego lub produktu PCR, którego wielkość różni się w przypadku przerwanego genu STAT1 i nieprzerwanego, można określić czy zaszła rekombinacja homologiczna przerywająca gen STAT1.
Następnie, komórki ES z przerwanym lokusem STAT1, można wprowadzić do blastocyst przez mikroiniekcję, a potem blastocysty można wszczepić do macic myszy będących w ciąży rzekomej, stosując rutynowe techniki. Zwierzę, które rozwinie się z wszczepionej blastocysty, jest chimerowe pod względem przerwanego allelu. Chimerowe samce można krzyżować z samicami i taką krzyżówkę można tak zaplanować, aby transmisja linii zarodkowej allelu łączyła się z transmisją pewnej barwy powlekającej. Transmisję linii zarodkowej allelu można potwierdzić poprzez Southern blotting lub analizę PCR, jak opisano powyżej, genomowego DNA wyizolowanego z próbek tkanek.
5.3.3 Krótkotrwałe substraty z niedoborem IFN
Komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja, można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN. Związki, które hamują syntezę IFN, albo aktywność, albo ekspresję składników układu IFN, można stosować do wstępnego traktowania IFN gospodarza, np. związki, które hamują syntezę IFN, aktywność IFN, receptor IFN, inne cele w szlaku przenoszenia sygnału IFN lub które hamują aktywność genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Przykładami związków, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem są, lecz bez ograniczenia, cząsteczki kwasu nukleinowe18
PL 212 316 B1 go, przeciwciała, peptydy, antagoniści receptora IFN, inhibitory szlaku STAT1, inhibitory PKR, itd. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują cząsteczki antysensowne, rybozymy i cząsteczki o potrójnej helisie, które celują w geny, kodujące zasadnicze składniki układu IFN, np. STAT1. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują także nukleotydy kodujące dominujące mutanty ujemne składników układu IFN; np. przed infekcją mutantem wirusowym, komórki można transfekować DNA, kodującym skrócony mutant receptora IFN niekompetentny pod względem sygnału.
Dominujące mutanty ujemne, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem do hamowania szlaku IFN obejmują wersje z niedoborem kinazy Jak1, TyK2 lub czynniki transkrypcyjne bez domen wiążących DNA STAT1 oraz STAT2 (patrz np. Krishman i inni 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305).
5.4 Preparaty szczepionki
Zgodnie z wynalazkiem opisano preparaty szczepionek zawierające atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA, mające zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi IFN oraz odpowiedni nośnik. Wirus stosowany w preparacie szczepionki można wybrać spośród naturalnie występujących mutantów lub odmian, wirusów mutagenizowanych lub genetycznie zmodyfikowanych. Szczepy atenuowane wirusów o segmentowanym RNA można także wytworzyć przez techniki reasortacji lub stosując połączenie technik podejścia genetyki odwrotnej i reasortacji. Naturalnie występujące odmiany obejmują wirusy wyizolowane z natury, jak również odmiany spontanicznie występujące, wytworzone podczas namnażania wirusa, posiadające zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi komórkowej IFN. Atenuowany wirus można stosować sam jako składnik aktywny w preparacie szczepionki. Alternatywnie, atenuowany wirus można stosować jako wektor lub „szkielet” szczepionek wytworzonych w sposób rekombinowany. W tym celu można stosować techniki rekombinacji, takie jak odwrotna genetyka (lub dla wirusów segmentowanych, połączenia genetyki odwrotnej i technik reasortacji), aby skonstruować mutacje lub wprowadzić obce antygeny do atenuowanego wirusa stosowanego w preparacie szczepionki. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów lub alternatywnie, przeciw całkiem innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym.
W rzeczywistości, do wirusów tu opisanych można wbudować dowolną sekwencję genu heterologicznego do stosowania w szczepionkach. Dogodnie epitopy, które indukują zabezpieczającą odpowiedź immunologiczną wobec dowolnego z różnych patogenów, lub antygeny, które wiążą przeciwciała neutralizujące, mogą podlegać ekspresji przez wirusy lub ich część. Przykładowo, heterologiczne sekwencje genowe, które można, wbudować w wirusy tu opisane do zastosowania w szczepionkach obejmują, lecz bez ograniczenia, epitopy ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), taki jak gp120; antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg); glikoproteiny wirusa opryszczki (np. gD, gE); VP1 poliowirusa, determinanty antygenowe patogenów nie wirusowych, takich jak bakterie i pasożyty. W innej postaci realizacji może zachodzić ekspresja całości lub części genów immunoglobulin. Przykładowo, w wirusach tu opisanych można wbudować regiony zmienne immunoglobulin antyidiotypowych, które naśladują takie epitopy. W jeszcze innej postaci realizacji może zachodzić ekspresja antygenów związanych z nowotworem.
Można opracowywać albo żywe rekombinowane szczepionki wirusowe, albo inaktywowane rekombinowane szczepionki wirusowe. Żywe szczepionki mogą być zalecane, ponieważ namnożenie w gospodarzu prowadzi do przedłużenia bodźca podobnego rodzaju i natężenie bodźca występującego przy naturalnych infekcjach, a zatem nadaje zasadniczą, długotrwałą odporność. Wytwarzanie takich żywych rekombinowanych preparatów szczepionek wirusowych można osiągnąć przez użycie konwencjonalnych metod obejmujących namnożenie wirusa w hodowli komórkowej lub omoczni zarodków kurzych, a następnie oczyszczenie.
Preparaty szczepionki mogą zawierać genetycznie zmodyfikowane wirusy o ujemnej nici RNA, które mają mutacje w genie NS1 lub analogicznym, w tym bez ograniczenia, mutanty grypy o skróconym NS1 opisane w poniższych przykładach. Można je także opracowywać przy użyciu naturalnych odmian grypy A, tak jak naturalna odmiana grypy A A/turkey/Ore/71 lub B/201 i B/AWBY-234, które są naturalnymi odmianami grypy B.
Po opracowaniu postaci żywej szczepionki wirusowej należy stosować zakres wynoszący około
104 pfu do około 5 x 106 pfu na dawkę.
Do wprowadzania preparatu szczepionki opisanego powyżej można stosować wiele metod, obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórna, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Zalecane jest wprowadzanie preparatu szczepionki wiPL 212 316 B1 rusowej poprzez naturalną drogę zakażenia patogenem, dla którego przeznaczona jest szczepionka, lub poprzez naturalną drogę zakażenia rodzicielskiego wirusa atenuowanego. Przy stosowaniu preparatu żywej szczepionki wirusowej zalecane jest wprowadzanie preparatu poprzez naturalną drogę infekcji wirusem grypy. Dogodnie można wykorzystać zdolność wirusa grypy do indukcji energicznej komórkowej odpowiedzi wydzielniczej i odpornościowej. Przykładowo, zakażenie dróg oddechowych wirusami grypy może indukować silną wydzielniczą odpowiedź immunologiczną, np. w układzie moczopłciowym, przy współistniejącym zabezpieczeniu przed specyficznymi czynnikami powodującymi chorobę. Szczepionkę tu opisaną zawierającą 104-5 x 106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podać jednorazowo. Alternatywnie, szczepionkę tu opisaną zawierającą 104-5 x 106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podawać dwukrotnie lub trzykrotnie z przerwą od 2 do 6 miesięcy, tak często jak potrzeba, zwierzęciu, w szczególności ssakowi, a zwłaszcza człowiekowi.
5.5 Kompozycje farmaceutyczne
Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje farmaceutyczne zawierające zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, do zastosowania jako środki antywirusowe lub środki antynowotworowe, lub jako środki przeciw chorobom wrażliwym na IFN. Kompozycje farmaceutyczne mogą być stosowane profilaktycznie antywirusowo i można je podawać osobnikom, którzy są zagrożeni zakażeniem lub którzy będą poddani ekspozycji na wirusa. Przykładowo, w przypadku dziecka wracającego do domu ze szkoły, w której kontaktowało się ono z kilkoma kolegami zakażonymi grypą, rodzice mogliby podać antywirusową kompozycję farmaceutyczną sobie, dziecku i innym członkom rodziny, w celu zapobiegnięcia infekcji wirusowej i późniejszej chorobie. Leczeni mogą być także ludzie podróżujący do części świata, gdzie powszechne są pewne choroby zakaźne (np. wirus zapalenia wątroby typu A, malaria, itd.). Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne można stosować do leczenia nowotworów lub profilaktyki tworzenia nowotworu, np. u pacjentów, którzy mają raka lub u których istnieje wysokie ryzyko rozwinięcia nowotworu lub raka. Przykładowo, pacjenci z rakiem mogą być leczenie w celu zapobiegania dalszemu tworzeniu się nowotworu. Alternatywnie, leczone mogą być podmioty, które są poddane lub mogą być poddane ekspozycji na substancje rakotwórcze; leczone mogą być osobniki związane z oczyszczaniem środowiska, które mogą się stykać z zanieczyszczeniami (np. azbestem). Alternatywnie, osobniki, które mają być poddane ekspozycji na promieniowanie można leczyć przed ekspozycją i po niej (np. pacjenci poddawani ekspozycji na wysokie dawki promieniowania lub którzy muszą brać leki rakotwórcze).
Zastosowanie atenuowanych wirusów tu opisanych jako środków antyrakowych opiera się na stwierdzeniu twórców wynalazku, że atenuowany mutant wirusa grypy z delecją w genie antagonizującym IFN jest zdolny do zmniejszania tworzenia nowotworu u myszy. Właściwości przeciwnowotworowe tu opisane mogą być co najmniej częściowo związane ze zdolnością do wzrostu w komórkach nowotworowych i zabijania ich, o których wiadomo, że w wielu przypadkach mają niedobory w układzie IFN. Bez względu na mechanizm (mechanizmy) molekularny odpowiedzialny za właściwości przeciwnowotworowe, atenuowane wirusy według wynalazku można by stosować do leczenia lub profilaktyki powstawania nowotworów. Zmutowane wirusy o zmienionym fenotypie antagonistycznym wobec IFN mogą być wycelowane w konkretne narządy, tkanki i/lub komórki w organizmie, w celu indukcji miejscowego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Zaletą takiego podejścia jest to, że wirusy indukujące IFN tu opisane są ukierunkowane na konkretne miejsca, np. lokalizacji nowotworu, aby indukować IFN w sposób specyficzny dla miejsca, raczej w celu wywołania efektu terapeutycznego niż układowej indukcji IFN, która może mieć skutki toksyczne.
Zmutowane wirusy indukujące IFN tu opisane można skonstruować stosując metody tu opisane do ekspresji białek lub peptydów, które nakierowywałyby wirusy do poszczególnych miejsc. W zalecanej postaci realizacji wirusy indukujące IFN można ukierunkować na miejsca nowotworowe. W takiej postaci realizacji zmutowane wirusy można zmodyfikować do ekspresji miejsca łączenia antygenu z przeciwciałem, które rozpoznaje antygen specyficzny dla nowotworu, kierując w ten sposób wirus indukujący IFN do nowotworu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy nowotwór wykazuje ekspresję receptora hormonu, tak jak guzy sutka lub jajnika, które wykazują ekspresję receptorów estrogenowych, wirus indukujący IFN można zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego hormonu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy nowotwór wykazuje ekspresję receptora czynnika wzrostu, np. VEGF, EGF lub PDGF, wirus indukujący IFN, można zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego czynnika wzrostu lub jego części. Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, wirusy indukujące IFN można tak zmodyfikować, aby wykazywały ekspresję dowolnego doce20
PL 212 316 B1 lowego produktu genowego, włączając peptydy, białka, takie jak enzymy, hormony, czynniki wzrostu, antygeny lub przeciwciała, które będą ukierunkowywać wirusa na miejsce potrzebujące aktywności antywirusowej, antybakteryjnej, antydrobnoustrojowej lub antynowotworowej.
Sposoby wprowadzania obejmują, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Kompozycje farmaceutyczne tu opisane można podawać jakąkolwiek dogodną drogą, np. przez infuzję lub iniekcję w jednej dużej dawce, przez absorpcję przez nabłonek lub śluzówkę (np. śluzówkę jamy ustnej, odbytu i jelita, itd.) oraz można je podawać razem z innymi czynnikami biologicznie aktywnymi. Podawanie może być układowe lub miejscowe. Oprócz tego, w zalecanej postaci realizacji, może być pożądane wprowadzenie kompozycji farmaceutycznych tu opisanych do płuc, każdą odpowiednią drogą. Podawanie dopłucne można także zrealizować np. stosując inhalator lub nebulizator oraz preparat ze środkiem aerozolowym.
W specyficznej postaci realizacji może być pożądane podawanie kompozycji farmaceutycznych tu opisanych miejscowo do obszaru wymagającego leczenia; można to osiągnąć np., lecz bez ograniczenia, przez infuzję miejscową podczas operacji, nałożenie na powierzchnię, np. w połączeniu z opatrunkiem na ranę po operacji, przez iniekcję, za pomocą cewnika, za pomocą czopka lub za pomocą implantu, przy czym wymieniony implant jest materiałem porowatym, nie porowatym lub żelowym, włączając błony, takie jak błony lub włókna sialastyczne. W jednej postaci realizacji podawanie może następować przez bezpośrednią iniekcję w miejscu (lub poprzednim miejscu) guza złośliwego lub nowotworowego lub tkanki przednowotworowej.
W jeszcze innej postaci realizacji kompozycję farmaceutyczną można dostarczać w układzie kontrolowanego uwalniania. W jednej postaci realizacji można stosować pompę (patrz Langer jak wyżej; Sefton, 1987 CRC Crit, Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwalf i inni, 1980, Surgery 88: 507; Saudek i inni, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). W innej postaci realizacji można stosować materiały polimeryczne (patrz Medical Applications of Controlled Release Langer i Wise (wydawcy), CRC Press., Boca Raton, Floryda (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen i Ball (wydawcy), Wiley, Nowy Jork (1984); Ranger i Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; patrz także Levy i inni, 1985, Science, 228: 190; During i inni, 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard i inni, 1989, J. Neurosurg. 71: 105). W jeszcze innej postaci realizacji układ kontrolowanego uwalniania można umieścić w pobliżu miejsca docelowego kompozycji, czyli płuca, co wymaga podania jedynie części dawki układowej (patrz np. Goodson, 1984, w Medical Application of Controlled Release, jak wyżej, tom 2, strony 115-138). Inne układy kontrolowanego uwalniania omawia się w przeglądzie Langera (1990, Science, 249:1527- 1533).
Kompozycje farmaceutyczne tu opisane obejmują terapeutycznie skuteczną ilość atenuowanego wirusa oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W konkretnej postaci realizacji określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” oznacza zaakceptowany przez federalną lub rządową agencję prawodawczą, lub wymieniony w farmakopei amerykańskiej albo innej generalnie uznawanej farmakopei do stosowania u zwierząt, a szczególnie u ludzi. Określenie „nośnik” odnosi się do rozcieńczalnika, adiuwanta, zaróbki lub podłoża, z którym podaje się kompozycję farmaceutyczną.
Jako nośniki płynne można wykorzystać także roztwory soli i wodne roztwory dekstrozy i glicerolu, szczególnie do roztworów do iniekcji. Odpowiednimi zaróbkami farmaceutycznymi są skrobia, glukoza, laktoza, sacharoza, żelatyna, słód, ryż, mąka, kreda, żel krzemionkowy, stearynian sodowy, monostearynian glicerolu, talk, chlorek sodu, sproszkowane mleko odtłuszczone, glicerol, glikol propylenowy, woda, etanol i temu podobne. Kompozycje te mogą przybierać postać roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów do opóźnionego uwalniania i temu podobnych. Kompozycje te można opracowywać w postaci czopków. Preparaty doustne mogą obejmować standardowe nośniki, takie jak farmaceutycznej czystości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharozy, celuloza, węglan magnezu, itd. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych opisano w „Remington's Pharmaceutical Sciences” E. W. Martina. Takie kompozycje będą zawierały terapeutycznie skuteczną ilość środka terapeutycznego, dogodnie w postaci oczyszczonej, razem z odpowiednią ilością nośnika tak, aby zapewnić postać do odpowiedniego podawania pacjentowi. Preparat powinien pasować do sposobu podawania.
Ilość kompozycji farmaceutycznej tu opisanej, która będzie skuteczna w leczeniu poszczególnych schorzeń lub stanów, będzie zależeć od charakteru schorzenia lub stanu i można ją określić standardowymi technikami klinicznymi. Oprócz tego można ewentualnie wykorzystać testy in vitro, pomocne w identyfikacji optymalnych zakresów dawkowania. Dokładna dawka do wykorzystania
PL 212 316 B1 w preparacie, będzie zależeć także od drogi podawania i ciężkości choroby lub schorzenia i powinna być określona zgodnie z oceną lekarza oraz stanem każdego pacjenta. Jednakże odpowiednie zakresy dawkowania do podawania wynoszą generalnie około 104-5 x 106 pfu i można je podawać raz lub wiele razy, z przerwami tak częstymi, jak potrzeba. Kompozycje farmaceutyczne tu opisane zawierające 104-5 x 106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podawać donosowo, dotchawiczo, domięśniowo lub podskórnie. Skuteczne dawki można ekstrapolować z krzywych odpowiedzi na dawkę otrzymanych z układów testowych in vitro lub modelu zwierzęcego.
6. Przykład: wytwarzanie i charakteryzacja mutantów o skróconym NS1 wirusa grypy typu A
6.1 Materiały i metody
Wirus grypy A/PR/8/34 (PR8) namnożono w 10-dniowych jajach kurzych z zarodkami w temperaturze 37°C. Wirus grypy A 25A-1, wirus reasortant, zawierający segment NS od przystosowanego do zimna szczepu A/Leningrad/134/47/57 i pozostałych genach z wirusa PR8 (Egorov i inni 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205; Shaw i inni 1996, w Options of Control of Influenza III, wydawca Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) strony 433-436) hodowano w komórkach Vero w temperaturze 34°C. Wirus 25A-1 jest wrażliwy na temperaturę w komórkach ssaków i użyto go jako wirusa pomocniczego do odzyskania transfektanta wirusa NS1/99. Komórki Vero i komórki MDCK utrzymywane w minimalnej pożywce podstawowej (MEM), zawierającej 1 μg/ml trypsyny (Difco Laboratories, Detroid, Michigan) użyto do hodowli wirusa grypy. Komórki Vero użyto także do selekcji, oczyszczania łysinek i mianowania wirusa NS1/99. Komórki MDCK utrzymywano w DMEM (minimalna pożywka podstawowa Dulbecco), zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą inaktywowaną ciepłem. Komórki Vero hodowano w pożywce AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
W następujący sposób skonstruowano plazmid pT3NS1/99, zawierający C-terminalnie skróconą 99-aminokwasową postać NS1. Po pierwsze, pUC19-T3/NS PR8, zawierający kompletny gen NS z wirusa PR8 oflankowany przez promotor polimerazy RNA T3 oraz miejsce restrykcyjne BpuAI, powielono przez odwrotną PCR (Ochman i inni, 1998, Genetics 120: 621-623) stosując odpowiednie startery. Otrzymany cDNA zawierający w ten sposób skrócony gen NS1 poddano fosforylacji, traktowano polimerazą Klenowa, poddano samoligacji i namnożono w szczepie TG1 E. coli. Konstrukcję otrzymaną po oczyszczeniu nazwano pT3NS1/99 i zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Plazmidy ekspresyjne białek NP, PB1, PB2 i PA wirusa PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 i pHMG-PA) opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Wykonano pPOLI-NS-RB przez substytucję otwartej ramki odczytu CAT pPOLI-NS-RT (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192) wewnątrz produktu RT-PCR otrzymanego z regionu kodującego genu NS wirusa grypy A/WSN/33 (WSN). Plazmid ten wykazuje ekspresję specyficznych dla NS segmentów RNA wirusa WSN pod kontrolą skróconego ludzkiego promotora polimerazy I.
Wytworzenie wirusa NS1/99 przeprowadzono przez transfekcję rybonukleoproteiny (RNP) (Luythes i inni, 1989, Cell 59: 1107-1113). RNP utworzono przez transkrypcję polimerazy RNA T3 z pT3NS1/99 linearyzowanego BpuAI w obecności oczyszczonej nukleoproteiny i polimerazy wirusa grypy 25A-1 (Enami i inni, 1991, J. Virol. 65: 2711-2713). Kompleksy RNP transfekowano do komórek Vero, które wcześniej zakażono wirusem 25A-1. Transfekowane komórki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C i supernatant pasażowano dwukrotnie w komórkach Vero w temperaturze 40°C i oczyszczono łysinki trzykrotnie w komórkach Vero pokrytych nadlewką agarową w temperaturze 37°C. Wyizolowany wirus NS1/99 analizowano przez RT-PCR stosując specyficzne startery. Wirus transfekcyjny dzikiego typu transfekowano plazmidami pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA i pPOLI-NS-RB, jak opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Dwa dni po transfekcji, komórki zakażono 5 x 104 pfu wirusa delNS1 i inkubowano jeszcze dwa dni w temperaturze 37°C. Supernatant komórkowy pasażowano raz w komórkach MDCK i dwukrotnie w jajach kurzych z zarodkami. Wirusy transfekcyjne klonowano przez ograniczone rozcieńczania w jajach. Genomowy RNA z oczyszczonego wirusa transfekcyjnego NS1/99 analizowano przez elektroforezę w żelu poiiakrylamidowym, jak opisano poprzednio (Zheng i inni, 1996, Virology, 217: 242-251). Ekspresję skróconego białka NS1 przez wirus NS1/99 weryfikowano przez immunoprecypitację znakowanych zakażonych ekstraktów komórkowych, przy użyciu króliczych poliklonalnych surowic odpornościowych przeciwko NS1.
Jamę omoczniową jaja kurzego z zarodkami w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów PR8, NS1/99 lub delNS1 (z delecją całego genu NS1), inkubowano w temperaturze 37°C przez dwa dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA).
PL 212 316 B1
Grupy 5 myszy BALB/c (Taconic Farms) zaszczepiono donosowo 5 x 106 pfu lub 5 x 103 pfu wirusa dzikiego typu A/PR/8/34 (PR8) lub NS1/99. Szczepienie przeprowadzono w znieczuleniu przy użyciu 50 μΐ MEM, zawierającej odpowiednią ilość jednostek tworzących łysinkę odpowiedniego wirusa. Zwierzęta monitorowano cały dzień i uśmiercono po zakończeniu obserwacji. W następnym doświadczeniu wszystkie myszy, które przeżyły sprowokowano cztery tygodnie później dawką 100 LD50 wirusa PR8 dzikiego typu. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki i używania zwierząt laboratoryjnych.
6.2 Wyniki: atenuacja wirusów grypy A przez delecje NS1
Twórcy wynalazku pokazali poprzednio, że wirus grypy A z delecją genu NS1 (wirus delNS1) jest zdolny do wzrostu do mian wynoszących około 107 pfu/ml w komórkach z niedoborem wytwarzania interferonu typu I (IFN), takich jak komórki Vero. Jednakże, wirus ten miał zaburzoną zdolność do replikacji i powodował chorobę u myszy (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252: 324). Dla kontrastu, wirus del NS1 był zdolny do wzrostu i zabijał myszy STAT1-/-. Wyniki te pokazały, że białko NS1 wirusa grypy A jest czynnikiem wirulencji związanym z inhibicją odpowiedzi antywirusowych u gospodarza, za pośrednictwem IFN typu I. Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu określenia, czy można wytworzyć wirusy grypy z cechami wirulencji pośredniej między wirusami typu dzikiego i delNS1 przez delecje części genu NS1 i czy niektóre z tych wirusów mogłyby posiadać optymalne cechy do stosowania jako żywe atenuowane szczepionki przeciw wirusom grypy, czyli stabilność i odpowiednią równowagę między atenuacją, immunogennością i wzrostem w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek, takich jak jaja kurze z zarodkami. W celu przetestowania tej hipotezy, wytworzono wirusa grypy A/PR/8/34 (PR8), w którym zmodyfikowano gen NS1 w celu pokierowania ekspresją skróconego białka NS1, zawierającego tylko 99 aminokwasów przy końcu aminowym, wspólnie z 230 aminokwasami białka NS1 dzikiego typu. Wirus ten (NS1-99) otrzymano przez transfekcję RNP sztucznie skonstruowanego genu NS przy użyciu wirusa pomocniczego 25A-1, jak opisano poprzednio (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252: 324). Analiza ekspresji NS1 w komórkach zakażonych wirusem ujawniła skrócony charakter białka NS1 wirusa NS1-99.
Analizowano zdolność wirusów delNS1, NS1-99 i PR8 dzikiego typu, do wzrostu w jajach kurzych z zarodkami w różnym wieku. Przesłanki dla tego doświadczenia pochodzą z faktu, że zdolność zarodków kurzych do syntetyzowania i odpowiedzi na IFN typu I w warunkach odpowiedniego bodźca, jest zależna od wieku. W rzeczywistości, zarówno możliwość indukowania IFN jak i odpowiedź, zaczyna się w wieku około 10 dni, a potem wyraźnie rośnie z wiekiem (Sekellick i inni 1990, In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 997; Sekellick i inni 1985, J. Interferon Res. 5: 657).
Zatem, stosowanie jaj w różnym wieku stanowi unikalny system do testowania zdolności róż3 nych wirusów do hamowania odpowiedzi IFN. Jaja w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów PR8, NS1-99 lub delNS1, inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA). Jak ukazano w tabeli 3, podczas gdy wirus dzikiego typu rósł do podobnych mian HA w jajach z zarodkami 6, 10 i 14-dniowymi, delNS1 replikował do wykrywalnego miana HA tylko w jajach 6-dniowych.
Dla kontrastu, wirus NS1-99 wykazywał zachowanie pośrednie między wirusami delNS1 i dzikiego typu, i był zdolny do wzrostu do mian HA podobnych do wirusa dzikiego typu w jajach 10-dniowych, lecz nie w jajach 14-dniowych.
T a b e l a 3
Replikacja wirusa w jajach kurzych z zarodkami
Wirus | Miano hemaglutynacji1 | ||
Wiek jaj | |||
6 dni | 10 dni | 14 dni | |
WT PR82 | 2,048 | 4,096 | 1,071 |
NS1/99 | N. D.3 | 2,048 | < 2 |
delNSI | 64 | < 2 | < 2 |
1 Miana reprezentują najwyższe rozcieńczenie z aktywnością hemaglutynacji 2 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu 3 Nie określono
PL 212 316 B1
Cechy atenuacji wirusa NS1-99 określono następnie u myszy. Do tego celu, grupy 5 myszy 6 5 3
BALB/c zakażono donosowo 5 x 106 pfu, 1,5 x 105 pfu lub 1,5 x 103 pfu wirusa PR8 dzikiego typu lub NS1-99. Następnie, myszy monitorowano przez 3 tygodnie pod względem przeżycia. Wyniki podano w tabeli 4. Wirus NS1-99 miał LD50 co najmniej trzy logarytmy wyższe od wirusa dzikiego typu.
T a b e l a 4
Atenuacja wirusa NS1-99 u myszy
Wirus | Myszy, które przeżyły | ||
Dawka zakażająca (pfu) | |||
5 x 106 | 1,5 x 105 | 1,5 x 103 | |
WT PR81 | 1/5 | 1/5 | 1/5 |
NS1/99 | 3/5 | 5/5 | 5/5 |
1 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu
7. Przykład: Wytwarzanie i charakteryzacja mutantów wirusa grypy typu B o skróconym NS1
7.1. Materiały i metody
Szczegóły doświadczalne są podobne do tych z sekcji 6.1. Dwa zmutowane wirusy grypy B, B/610B5B/201 (B/201) oraz B/AWBY-234, o długości odpowiednio 127 aminokwasów i 90 aminokwasów (skrócone białka C-terminalne NS1) (Norton i inni, 1987 Virology 156: 204; Tobita i inni 1990 Virology 174: 314) otrzymano z doświadczeń koinfekcji w hodowli tkankowej, obejmującej wirusy B/Yamagata/1/7 3 (B/Yam) oraz A/Aichi/2/68, w obecności wirusa przeciwciała anty-A (H3N2). Wzrost zmutowanych wirusów grypy w jajach z zarodkami w różnym wieku, porównano z wirusem rodzicielskim B/Yam, który posiada dzikiego typu białko NS1 o 281 aminokwasach.
Jaja w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów B/Yam, B/201 lub B/AWBY-234, inkubowano w temperaturze 35°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test HA.
Dodatkowo określono cechy atenuacji wirusów B/201 i B/AWBY-234 u myszy. Grupy trzech myszy BALB/c zakażono donosowo 3 x 105 pfu dzikiego typu B/Yam lub zmutowanymi wirusami B/201 i B/AWBY/234 i określono zdolność tych wirusów do replikacji, przez pomiar mian wirusów w płucach w 3 dniu po infekcji, ponieważ dzikiego typu B/Yam nie indukuje widocznych oznak choroby u myszy.
7.2 Wyniki
T a b e l a 5
Replikacja wirusa grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami
Miano hemaglutynacji1 | |||
Wiek jaj | |||
Wirus | 6 dni | 10 dni | 14 dni |
B/Yam | 362 | 256 | < 2 |
B/201 | 32 | < 2 | < 2 |
B/AWBY-234 | 8 | < 2 | < 2 |
Wyniki wzrostu wirusów zmutowanych i dzikiego typu grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami, ukazane w tabeli 5, pokazują, że jak w przypadku wirusów grypy A, karboksyterminalne skrócenie NS1 wirusa grypy B, jest odpowiedzialne za niższe wydajności replikacji w starszych jajach kurzych z zarodkami, ze skuteczną odpowiedzią IFN. Wskazuje to, że NS1 wirusa grypy B jest także związany z inhibicją odpowiedzi IFN u gospodarza oraz że delecje w genie NS1 wirusa grypy B powodują fenotyp atenuowany.
Wyniki z doświadczeń replikacji u myszy podano w tabeli 6. Miana wirusów B/201 i B/AWBY-234 były około o trzy logarytmy niższe niż miana B/Yam, wskazując, że skrócenie domeny karboksyterminalnej NS1 wirusa grypy B odpowiada za fenotyp atenuowany u myszy.
PL 212 316 B1
T a b e l a 6
Replikacja wirusa grypy typu B w płucach myszy
Wirus | Miana w płucu w 3 dniu po infekcji (pfu/płuco) | ||
B/Yam | 2 x 104 | 1 x 104 | 3 x 104 |
B/201 | 30 | < 10 | 60 |
B/AWBY-234 | < 10 | 40 | < 10 |
8. Zabezpieczenie przed infekcją wirusem grypy dzikiego typu u myszy immunizowanych wirusami grypy typu A i B z delecją w białkach NS1
W celu określenia, czy myszy immunizowane atenuowanymi wirusami grypy typu A i B, zawierającymi skrócone białka NS1, były zabezpieczone przed prowokacją odpowiednikami tych wirusów, ale dzikiego typu, przeprowadzono następujące doświadczenie. Myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusem A/NS1-9 9 i trzy tygodnie później zakażono je 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu. Immunizowane zwierzęta były zabezpieczone przed śmiercią, podczas gdy wszystkie kontrolne nietraktowane myszy padły po prowokacji (patrz tabela 7).
W drugim doświadczeniu myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusami grypy typu B
B/201 lub B/AWBY-234, wykazującymi ekspresję skróconego białka NS1. Trzy tygodnie później myszy 5 sprowokowano 3 x 105 pfu wirusa B/Yam/1/73 dzikiego typu. Ponieważ ten szczep wirusa grypy B nie indukuje objawów choroby u myszy, stopień zabezpieczenia określono przez pomiar mian wirusa w płucu w 3 dniu po prowokacji. Podczas gdy nietraktowane zwierzęta kontrolne miały miana około 104 pfu/płuco, nie wykryto wirusów w płucach zwierząt immunizowanych (patrz tabela 8). Stwierdzenia te sugerują, że wirusy grypy A jak również grypy B, zawierające zmodyfikowane geny SN1 były zdolne do indukcji odpowiedzi odpornościowej u myszy, które są w pełni zabezpieczone przed późniejszą prowokacją wirusem dzikiego typu.
T a b e l a 7
Przeżycie myszy immunizowanych wirusem grypy A/NS1-99 po prowokacji 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu
Dawka immunizująca wirusa | Liczba myszy, które przeżyły/całość |
5,0 x 106 | 3/3 |
1,5 x 105 | 4/4 |
PBS | 0/5 |
T a b e l a 8
Miana w płucu u myszy immunizowanych 20 wirusami B/201 i B/AWBY-234 po prowokacji 3 x 105 pfu wirusa grypy B/Yamagata/73 dzikiego typu
Dawka immunizująca | Liczba myszy, które przeżyły/całość |
3 x 105 pfu B/201 | < 101, < 101, < 101, < 101 |
3 x 105 pfu B/AWBY-234 | < 101, < 101, < 101, < 101 |
PBS | 2,5 x 104; 1 x 104; 1,7 x 104; 3,0 x 104; 5,0 x 104; |
9. Przykład: indukcja interferonu typu I w jajach z zarodkami zakażonymi wirusem delNS1
Następnie, określono zdolność wirusa delNS1, wirusa grypy A bez genu NS1, do indukcji sekrecji IFN typu I w jajach z zarodkami kurzymi. Do tego celu, grupy dwóch 10-dniowych jaj z zarodka3 mi kurzymi zakażono 5 x 103 pfu wirusów delNS1 i dzikiego typu PR8. Osiemnaście godzin po inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i dializowano przeciwko kwasowemu pH przez noc, aby inaktywować zakaźne wirusy.
Po traktowaniu kwasowym pH, próbki dializowano przeciwko PBS i testowano pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przeciw infekcji VSV (około 200 pfu w komórkach CEF. Wyniki ukazane w tabeli 9 wskazują, że przy nieobecności NS1, wirusy grypy A są lepszymi induktorami IFN.
PL 212 316 B1
T a b e l a 9 Indukcja IFN w jajach
Wirus | IFN | (U/ml) |
PR8 | < 16 | < 16 |
delNSI | 400 | 400 |
Pusta | < 16 | < 16 |
10. Przykład: Aktywność antywirusowa wirusa delNS1
Eliminacja genu antagonizmu IFN NS1 z wirusa grypy A może powodować zdolność tego wirusa do indukcji wysokich poziomów IFN. Jeśli ma to miejsce w tym przypadku, wirus delNS1 będzie „zakłócał” replikację wirusów wrażliwych na IFN. Aby przetestować tę możliwość, twórcy wynalazku prześledzili zdolność wirusa delNS1 do inhibicji replikacji wirusa grypy A/WSN/33 (WSN), powszechnie stosowanego szczepu laboratoryjnego wirusa grypy, w jajach. Jak widać na fig. 1, traktowanie tylko 2 pfu wirusa delNS1 spowodowało redukcję ostatecznych mian wirusa WSN w płynie omoczniowym o jeden logarytm. Oprócz tego, traktowanie 2 x 104 pfu wirusa delNS1 spowodowało praktycznie kompletne ograniczenie replikacji WSN w jajach. Wirus delNS1 był także zdolny do zakłócania replikacji w jajach innych szczepów wirusa grypy typu A (H1N1 i H3N2), wirusa grypy typu B oraz innych wirusów, takich jak wirus Sendai (fig. 2).
Zachęceni tymi wynikami, twórcy wynalazku określili następnie zdolność wirusa delNS1 do zakłócania replikacji wirusa grypy dzikiego typu u myszy. Mimo, że traktowanie IFN typu I hodowli tkankowej zapobiega replikacji in vitro wirusa grypy typu A, traktowanie myszy IFN nie jest w stanie zahamować replikacji wirusów grypy (Haller 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25052). Jest to prawda dla większości wsobnych szczepów myszy, z wyjątkiem myszy A2G. Myszy A2G, jak również znaczny udział dzikich myszy (około 75%) zawierały co najmniej jeden nieuszkodzony allel Mx1, podczas gdy większość szczepów laboratoryjnych było Mx1-/- (Haller, 1986 Current Top Microbiol. Immunol. 127: 331-337). Białko Mx1, które jest homologiem ludzkiego białka MxA (Aebi 1989, Mol. Cell. Biol. 11: 5062) jest silnym inhibitorem replikacji wirusa grypy (Haller 1980, Nature, 283: 660). Białko to nie ulega konstytutywnej ekspresji, lecz jego ekspresja jest indukowana transkrypcyjnie przez IFN typu I. Tak więc, myszy A2G można użyć do testowania zdolności induktorów IFN do stymulacji odpowiedzi antywirusowej przeciwko wirusom grypy A (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 2 5052).
Twórcy wynalazku zakazili donosowo osiem 4-tygodniowych myszy A2G 5 x 106 pfu wysokopatogennego izolatu wirusowego A/PR/8/34 (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25052). Połowa myszy otrzymała donosowe leczenie 5 x 106 pfu delNS1 24 godziny przed zakażeniem PR8. Inne cztery myszy były traktowane PBS. Monitorowano zmiany masy ciała i przeżycie. Wyniki te pokazują, że traktowanie delNS1 umożliwiło zabezpieczenie myszy A2G przed śmiercią indukowaną wirusem grypy i utratą masy ciała. Takie samo traktowanie było nieskuteczne u myszy Mx1-/- wskazując, że w mechanizmie zabezpieczenia przed wirusem pośredniczył Mx1, czyli IFN.
11. Przykład: Właściwości przeciwnowotworowe wirusa delNS1 u myszy
Ponieważ IFN typu I i/lub induktory IFN typu I okazały się posiadać aktywność przeciwnowotworową (Belardelli i Gresser, 1996, Immunology Today 17: 369-372; Qin i inni, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14411-14416) jest prawdopodobne, że traktowanie nowotworów wirusem delNS1 mogłoby pośredniczyć w regresji nowotworu.
Alternatywnie, wirus delNS1 mógłby mieć właściwości onkolityczne, czyli mógłby być zdolny do specyficznego wzrostu i zabijania komórek nowotworowych, z których o wielu wiadomo, że posiadają niedobory układu IFN.
Aby przetestować aktywność przeciwnowotworową wirusa delNS1, przeprowadzono następujące doświadczenie, przy użyciu mysiej linii komórkowej mięsaka CT26.WT w mysim nowotworowym modelu przerzutowania do płuc (Restifo i inni, 1998 Virology 249: 89-97) 5 x 105 komórek CT26.WT wstrzyknięto dożylnie dwunastu 6-tygodniowym myszom BALB/c.
Połowę z tych myszy traktowano donosowo 106 pfu wirusa delNS1 co 24 godziny w dniach 1, 2 i 3 po zaszczepieniu. Dwanaście dni po wstrzyknięciu nowotworu, myszy uśmiercono i obliczono przerzuty płucne. Jak ukazano w tabeli 10, traktowanie delNS1 spowodowało istotną regresję przerzutów do płucnych u myszy.
PL 212 316 B1
T a b e l a 10
Aktywność przeciwnowotworową wirusa delNS1 u myszy BALB/c, którym wstrzyknięto komórki nowotworu CT2 6.WT
Liczba przerzutów płucnych | ||
T raktowanych PBS | Traktowanych delNS1 | |
Mysz 1 | > 250 | 120 |
Mysz 2 | > 250 | 28 |
Mysz 3 | > 250 | 9 |
Mysz 4 | > 250 | 6 |
Mysz 5 | > 250 | 2 |
Mysz 6 | > 250 | 1 |
12. Przykład: Białko NS1 hamuje translokację IFR-3 podczas infekcji wirusem grypy
Wyniki tu opisane sugerują, że białko NS1 wirusa grypy jest odpowiedzialne za inhibicję odpowiedzi IFN typu I przeciwko wirusowi oraz że mutacje/delecje w tym białku powodują atenuację wirusów w związku ze wzmocnieniem odpowiedzi IFN typu I podczas infekcji. Wiadomo, że synteza IFN typu I podczas infekcji wirusowej może być stymulowana przez dwuniciowy RNA (dsRNA). IRF-3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który zazwyczaj znajduje się w formie nieaktywnej w cytoplazmie komórek ssaków. Dwuniciowy RNA indukuje fosforylację (aktywację) czynnika transkrypcyjnego IRF-3 powodując jego translokację do jądra, gdzie indukuje transkrypcję specyficznych genów, włączając geny kodujące IFN typu I (Weaver i inni, 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 1359). Aby określić czy NS1 grypy działa na IRF-3, monitorowano lokalizację IRF-3 w komórkach CV1 zakażonych dzikiego typu PR8 lub wirusem grypy A delNS1. Fig. 3 ukazuje, że translokacja IRF-3 jest minimalna w komórkach zakażonych PR8 (w ponad 10% komórek). Przeciwnie, około 90% komórek zakażonych delNS1 wykazywało lokalizację jądrową IRF-3.
Co zastanawiające, możliwa była częściowa inhibicja translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych delNS1, przez ekspresję NS1 z plazmidu w układzie trans. Wyniki pokazują, że NS1 wirusa grypy typu A jest zdolny do inhibicji translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych wirusem. Prawdopodobnie wirus grypy NS1 zapobiega aktywacji za pośrednictwem dsRNA IRF-3 przez sekwestrację dsRNA podczas infekcji wirusowej, powodując w ten sposób inhibicję syntezy IFN.
Niniejszy wynalazek nie powinien być ograniczony w zakresie przez opisane specyficzne postacie realizacji, które w zamierzeniu są pojedynczymi ilustracjami poszczególnych aspektów wynalazku i każda konstrukcja lub wirusy, które są funkcjonalnie równoważne, wchodzą w zakres tego wynalazku. Oczywiście, różne modyfikacje wynalazku oprócz tych ukazanych i tu opisanych, staną się widoczne dla fachowca z powyższego opisu i załączonych rysunków. Takie modyfikacje w zamierzeniu wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń.
Cytuje się tu różne odniesienia, których opisy wprowadza się tu jako odniesienie w całości.
Claims (53)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
- 3. Zastosowanie szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 4. Zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotypPL 212 316 B1 antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
- 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 8. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
- 10. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
- 11. Zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
- 13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 14. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 15. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że chorobę zakaźną stanowi grypa.
- 16. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
- 18. Zastosowanie według zastrz. 16 albo 17, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 19. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncy28PL 212 316 B1 tialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 20. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
- 21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
- 22. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 23. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 24. Zastosowanie według zastrz. 16 albo 17, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
- 25. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
- 26. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
- 28. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 29. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 30. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że chorobę zakaźną stanowi grypa.
- 31. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
- 33. Zastosowanie według zastrz. 31 albo 32, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 34. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.PL 212 316 B1
- 35. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
- 36. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
- 37. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 38. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 39. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza liczbę 1 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
- 40. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
- 41. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 42. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
- 43. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje (a) namnażanie w jajach z zarodkiem w wieku poniżej 10 dni genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego, przy czym wirusa namnaża się do wystarczających ilości oraz w warunkach wolnych od zakażenia tak, że wirus potomny jest odpowiedni do preparowania w szczepionkę.
- 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jajo z zarodkiem jest wieku sześciu do dziewięciu dni.
- 45. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje a) namnażanie w linii komórkowej z niedoborem interferonu genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego.
- 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że linią komórkową z niedoborem interferonu nie są komórki Vero.
- 47. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że linią komórkową z niedoborem interferonu są komórki Vero.
- 48. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że mutacja w genie NS1 skutkuje delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza 1.
- 49. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że mutacja w genie NS1 skutkuje delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowychPL 212 316 B11-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza 1.
- 50. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
- 51. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
- 52. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
- 53. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8910398P | 1998-06-12 | 1998-06-12 | |
US10883298P | 1998-11-18 | 1998-11-18 | |
US11768399P | 1999-01-29 | 1999-01-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL212316B1 true PL212316B1 (pl) | 2012-09-28 |
Family
ID=27376229
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL386473A PL212316B1 (pl) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek |
PL398576A PL219128B1 (pl) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów |
PL346212A PL200977B1 (pl) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL398576A PL219128B1 (pl) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów |
PL346212A PL200977B1 (pl) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (12) | US6573079B1 (pl) |
EP (4) | EP2316923B1 (pl) |
JP (7) | JP4837827B2 (pl) |
KR (2) | KR100637937B1 (pl) |
CN (1) | CN1312725A (pl) |
AT (1) | ATE351901T1 (pl) |
AU (2) | AU770619B2 (pl) |
BR (1) | BR9911163A (pl) |
CA (2) | CA2334895C (pl) |
CY (1) | CY1113689T1 (pl) |
CZ (2) | CZ306637B6 (pl) |
DE (1) | DE69934885T2 (pl) |
DK (4) | DK2316924T3 (pl) |
ES (4) | ES2653557T3 (pl) |
HU (1) | HUP0102441A3 (pl) |
IL (6) | IL140265A0 (pl) |
MX (2) | MXPA00012402A (pl) |
NO (1) | NO20006328L (pl) |
NZ (2) | NZ509054A (pl) |
PL (3) | PL212316B1 (pl) |
PT (1) | PT1085904E (pl) |
RU (1) | RU2236252C2 (pl) |
SK (3) | SK288200B6 (pl) |
WO (2) | WO1999064570A1 (pl) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7780962B2 (en) | 1997-10-09 | 2010-08-24 | Wellstat Biologics Corporation | Treatment of neoplasms with RNA viruses |
US20030044384A1 (en) | 1997-10-09 | 2003-03-06 | Pro-Virus, Inc. | Treatment of neoplasms with viruses |
US7470426B1 (en) | 1997-10-09 | 2008-12-30 | Wellstat Biologics Corporation | Treatment of neoplasms with viruses |
US6573079B1 (en) | 1998-06-12 | 2003-06-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
EP1390046A4 (en) * | 1999-04-15 | 2005-04-20 | Wellstat Biologics Corp | TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES |
US8147822B1 (en) | 1999-09-17 | 2012-04-03 | Wellstat Biologics Corporation | Oncolytic virus |
NZ517573A (en) | 1999-09-17 | 2004-02-27 | Pro Virus Inc | Sequences of the oncolytic virus strain vesicular stromatitis virus (VSV) |
EP1259629B1 (en) * | 2000-03-02 | 2005-07-20 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Recombinant influenza a viruses |
WO2001077394A1 (en) | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents |
DE10020505A1 (de) | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Conzelmann Karl Klaus | RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort |
AU2002223560B2 (en) * | 2000-09-25 | 2006-06-29 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Live influenza vaccine and method of manufacture |
MX348185B (es) | 2001-02-14 | 2017-06-02 | Anthrogenesis Corp | Placenta de mamíferos postparto, su uso y células madres placentales extraídas de ella. |
JP2005505505A (ja) | 2001-05-22 | 2005-02-24 | アクセス ビジネス グループ インターナショナル リミテッド ライアビリティ カンパニー | 液体成分を配合しかつ分取するための方法および装置 |
CN1549709A (zh) * | 2001-07-16 | 2004-11-24 | ����ɯ�ס����ڵ��ɿ� | 一类抗病毒化合物在制造用于治疗或预防在呼吸道中病毒感染的制剂中的应用 |
US7037707B2 (en) * | 2003-09-04 | 2006-05-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Method for generating influenza viruses and vaccines |
ES2694123T3 (es) * | 2004-06-01 | 2018-12-18 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos |
US8137676B2 (en) * | 2005-02-15 | 2012-03-20 | Mount Sinai School Of Medicine | Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof |
AT502275B8 (de) * | 2005-08-08 | 2007-08-15 | Greenhills Biotechnology Res D | Immunantwort-induzierende zusammensetzungen |
PT2251034T (pt) | 2005-12-02 | 2018-05-22 | Icahn School Med Mount Sinai | Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações |
EP1911836A1 (en) | 2006-10-12 | 2008-04-16 | AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH | Medium supplement for virus production |
US7860646B2 (en) * | 2007-04-16 | 2010-12-28 | The Boeing Company | Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments |
WO2008144067A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Board Of Regents, University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity |
EP2045323A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Linear expression constructs for production of influenza virus particles |
EP2048237A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-15 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences |
EP2072058A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Modified influenza virus |
US8108138B2 (en) * | 2008-10-02 | 2012-01-31 | The Boeing Company | Optimal vehicle router with energy management system |
EA024262B1 (ru) | 2008-11-25 | 2016-09-30 | Нанотерапьютикс Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА, СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH |
EP2233568A1 (en) | 2009-03-19 | 2010-09-29 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG | Novel method for generation of RNA virus |
US9884105B2 (en) * | 2008-12-16 | 2018-02-06 | Ology Bioservices, Inc. | Production of viral vaccine |
EP2233152A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-29 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | High growth reassortant influenza A virus |
US8935174B2 (en) * | 2009-01-16 | 2015-01-13 | The Boeing Company | Analyzing voyage efficiencies |
WO2010091262A1 (en) | 2009-02-05 | 2010-08-12 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof |
EP2413962A1 (en) | 2009-03-30 | 2012-02-08 | Mount Sinai School of Medicine | Influenza virus vaccines and uses thereof |
DE102010018462A1 (de) | 2009-04-27 | 2011-04-07 | Novartis Ag | Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza |
WO2010144797A2 (en) | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Vaccine Technologies, Incorporated | Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof |
CA2767207A1 (en) * | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Bioprocessing |
CN102648000A (zh) | 2009-07-22 | 2012-08-22 | 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 | 新的流感病毒 |
US9217157B2 (en) | 2009-07-27 | 2015-12-22 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Recombinant influenza viruses and uses thereof |
JP5845180B2 (ja) | 2009-07-30 | 2016-01-20 | モウント シナイ スクール オフ メディシネ | インフルエンザウイルス及びそれらの使用 |
CA2769673A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Novartis Ag | Reverse genetics systems |
EP2295543A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-16 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for the preparation of an influenza virus |
KR20130075732A (ko) | 2010-03-30 | 2013-07-05 | 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 | 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 |
US8597637B1 (en) | 2010-05-18 | 2013-12-03 | Weidong Zhang | Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus |
US20130183740A1 (en) * | 2010-06-02 | 2013-07-18 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Novel method for generation of rna virus |
US9044499B1 (en) | 2010-06-22 | 2015-06-02 | Weidong Zhang | NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment |
US8377901B2 (en) * | 2010-07-07 | 2013-02-19 | The University Of Manitoba | Target host factors for treating viral infection |
CN102021149B (zh) * | 2010-07-27 | 2013-04-24 | 张卫东 | 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用 |
CN102021148A (zh) * | 2010-07-27 | 2011-04-20 | 张卫东 | 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用 |
EP2758075B1 (en) | 2011-09-20 | 2023-05-03 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
US9157746B2 (en) | 2011-11-16 | 2015-10-13 | The Boeing Company | Vessel routing system |
AU2013362935B2 (en) | 2012-12-18 | 2018-10-04 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
CN103330723A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-10-02 | 艾克星(武汉)生物医药科技有限公司 | 基因工程呼吸道合胞病毒(△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途 |
US10947543B2 (en) | 2013-03-13 | 2021-03-16 | Yale University | Interferon production using short RNA duplexes |
WO2014159960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof |
BR112015021414B1 (pt) | 2013-03-14 | 2020-11-10 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | vírus da doença newcastle e seus usos |
WO2015127501A1 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Viralytics Limited | Combination method for treatment of cancer |
US10736956B2 (en) | 2015-01-23 | 2020-08-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccination regimens |
EP3261664A1 (en) | 2015-02-26 | 2018-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Bivalent swine influenza virus vaccine |
WO2017030997A1 (en) * | 2015-08-14 | 2017-02-23 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Respiratory syncytial virus having altered ns1 protein function and related materials and methods |
EA037571B1 (ru) * | 2015-11-06 | 2021-04-15 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" | Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний |
RU2628690C2 (ru) * | 2015-11-06 | 2017-08-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' | Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний |
RU2660562C2 (ru) * | 2016-03-30 | 2018-07-06 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" | Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе |
MX2018006373A (es) * | 2015-11-24 | 2018-11-09 | Commw Scient Ind Res Org | Produccion de virus en cultivos celulares. |
WO2017088017A1 (en) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of viruses in avian eggs |
WO2017218624A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof |
WO2018115308A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Blue Sky Vaccines Gmbh | Method for purifying virus |
CN111511907A (zh) | 2017-03-14 | 2020-08-07 | 加利福尼亚大学董事会 | 对病毒中免疫逃逸功能区域的全基因组鉴定 |
US11254733B2 (en) | 2017-04-07 | 2022-02-22 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof |
JOP20190256A1 (ar) | 2017-05-12 | 2019-10-28 | Icahn School Med Mount Sinai | فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها |
WO2019092084A1 (en) | 2017-11-08 | 2019-05-16 | Blue Sky Vaccines Gmbh | So3 chromatography for use in a method for virus purification |
CN113853215A (zh) | 2019-01-24 | 2021-12-28 | 蓝天免疫疗法有限责任公司 | 高生长流感病毒 |
US20230060867A1 (en) * | 2019-02-07 | 2023-03-02 | Duke University | Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same |
KR102370100B1 (ko) * | 2019-02-15 | 2022-03-07 | 아이디바이오 주식회사 | 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신 |
JP7222552B2 (ja) * | 2020-01-30 | 2023-02-15 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 豚デルタコロナウイルスの増殖方法 |
CN116888139A (zh) * | 2020-11-30 | 2023-10-13 | 蓝天免疫疗法有限责任公司 | 诱导高水平i型干扰素的新型复制缺陷型甲型流感病毒 |
WO2022125789A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Yale University | Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections |
EP4351623A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Gene combination as a broad spectrum antiviral |
CN115896035B (zh) * | 2022-12-22 | 2024-04-16 | 苏州沃美生物有限公司 | 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用 |
Family Cites Families (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4071618A (en) * | 1974-09-03 | 1978-01-31 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Process for preparing virus disease live vaccines |
US4215051A (en) | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
JPS57136528A (en) * | 1981-02-09 | 1982-08-23 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of viral vaccine |
US4873191A (en) | 1981-06-12 | 1989-10-10 | Ohio University | Genetic transformation of zygotes |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
JPS5939831A (ja) | 1982-08-27 | 1984-03-05 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン |
US4693981A (en) * | 1983-12-20 | 1987-09-15 | Advanced Genetics Research Institute | Preparation of inactivated viral vaccines |
US5106619A (en) * | 1983-12-20 | 1992-04-21 | Diamond Scientific Co. | Preparation of inactivated viral vaccines |
JPS60202827A (ja) * | 1984-03-28 | 1985-10-14 | Chibaken | 弱毒痘そうワクチン株 |
US5786199A (en) | 1989-08-28 | 1998-07-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
US5166057A (en) | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
US5854037A (en) | 1989-08-28 | 1998-12-29 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
US5840520A (en) | 1989-08-28 | 1998-11-24 | Aviron | Recombinant negative strand RNA virus expression systems |
US5766601A (en) * | 1990-08-08 | 1998-06-16 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
US6162432A (en) * | 1991-10-07 | 2000-12-19 | Biogen, Inc. | Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction |
EP0607332B1 (en) | 1991-10-07 | 1997-12-17 | Biogen, Inc. | Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the cd2/lfa-3 interaction |
DE570357T1 (de) | 1992-05-14 | 1994-07-28 | Polimun Scientific Immunbiologische Forschungsgesellschaft Mbh, Wien | Peptide, die Antikörper induzieren, die genetisch divergierende HIV-1 Isolationen neutralisieren. |
US7344722B1 (en) * | 1993-06-29 | 2008-03-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Cold-adapted influenza virus |
ATE257175T1 (de) | 1994-07-18 | 2004-01-15 | Conzelmann Karl Klaus Prof Dr | Rekombinantes infektiöses nicht-in-segmente- geteiltes, negativ-strange-rns-virus |
US6300090B1 (en) * | 1994-07-29 | 2001-10-09 | The Rockefeller University | Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells |
US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
US7153510B1 (en) | 1995-05-04 | 2006-12-26 | Yale University | Recombinant vesiculoviruses and their uses |
DE69510207T3 (de) | 1995-08-09 | 2007-02-15 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren |
US5840565A (en) | 1995-08-22 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture |
JPH11512609A (ja) | 1995-09-27 | 1999-11-02 | アメリカ合衆国 | クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性RSウイルス(respiratory syncytial virus)の生産 |
GB9605808D0 (en) * | 1996-03-20 | 1996-05-22 | Isis Innovation | CFTR gene regulator |
EP2112220A3 (en) | 1996-07-15 | 2010-01-06 | The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services | Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
AU4427897A (en) | 1996-09-27 | 1998-04-17 | American Cyanamid Company | 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales |
US6330090B1 (en) * | 1997-02-14 | 2001-12-11 | Photonetics | Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer |
EP0975809A4 (en) | 1997-03-05 | 2002-10-30 | Univ Washington | EXAMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AGENTS FOR SELECTIVE INHIBITION OF HCV REPLICATION |
US5891705A (en) * | 1997-04-08 | 1999-04-06 | Pentose Pharmaceuticals, Inc. | Method for inactivating a virus |
US6884414B1 (en) * | 1997-04-30 | 2005-04-26 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents |
AU7797798A (en) | 1997-05-23 | 1998-12-11 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
PT1012244E (pt) | 1997-07-11 | 2007-08-21 | Univ Yale | ''rabdovírus com revestimentos remanipulados'' |
CN1273603A (zh) | 1997-09-19 | 2000-11-15 | 美国氰胺公司 | 减毒的呼吸道合胞病毒 |
US6573079B1 (en) * | 1998-06-12 | 2003-06-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
DK1098961T3 (da) * | 1998-06-12 | 2008-05-26 | Andrej Y Dr Egorov | Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon |
US6146642A (en) * | 1998-09-14 | 2000-11-14 | Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
US6544785B1 (en) * | 1998-09-14 | 2003-04-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses |
AT407958B (de) * | 1999-02-11 | 2001-07-25 | Immuno Ag | Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation |
ATE353370T1 (de) | 1999-07-14 | 2007-02-15 | Sinai School Medicine | In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren |
EP1259629B1 (en) | 2000-03-02 | 2005-07-20 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Recombinant influenza a viruses |
WO2001077394A1 (en) | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents |
DE10020505A1 (de) | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Conzelmann Karl Klaus | RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort |
AU2002223560B2 (en) | 2000-09-25 | 2006-06-29 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Live influenza vaccine and method of manufacture |
AUPR343601A0 (en) * | 2001-02-28 | 2001-03-29 | Dickins, Philip | Trenching machine |
CA2505949A1 (en) * | 2002-11-13 | 2004-05-27 | Rutgers, The State University | Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1 |
ES2694123T3 (es) * | 2004-06-01 | 2018-12-18 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos |
US8137676B2 (en) | 2005-02-15 | 2012-03-20 | Mount Sinai School Of Medicine | Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof |
US20070116717A1 (en) * | 2005-08-01 | 2007-05-24 | Shneider Alexander M | Influenza vaccine compositions and methods |
AT502275B8 (de) * | 2005-08-08 | 2007-08-15 | Greenhills Biotechnology Res D | Immunantwort-induzierende zusammensetzungen |
PT2251034T (pt) | 2005-12-02 | 2018-05-22 | Icahn School Med Mount Sinai | Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações |
US7507411B2 (en) * | 2006-06-23 | 2009-03-24 | University Of Saskatchewan | Attenuated influenza NS1 variants |
-
1999
- 1999-06-11 US US09/332,286 patent/US6573079B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 EP EP10181977.9A patent/EP2316923B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 DK DK10181856.5T patent/DK2316924T3/en active
- 1999-06-11 AU AU44345/99A patent/AU770619B2/en not_active Expired
- 1999-06-11 SK SK1907-2000A patent/SK288200B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 DK DK99927443T patent/DK1086207T3/da active
- 1999-06-11 NZ NZ509054A patent/NZ509054A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 MX MXPA00012402A patent/MXPA00012402A/es active IP Right Grant
- 1999-06-11 ES ES10181977.9T patent/ES2653557T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 DK DK99927445.9T patent/DK1085904T3/da active
- 1999-06-11 IL IL14026599A patent/IL140265A0/xx active IP Right Grant
- 1999-06-11 JP JP2000553560A patent/JP4837827B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 PL PL386473A patent/PL212316B1/pl unknown
- 1999-06-11 EP EP99927443A patent/EP1086207B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 EP EP10181856.5A patent/EP2316924B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 WO PCT/US1999/013142 patent/WO1999064570A1/en active Application Filing
- 1999-06-11 EP EP99927445A patent/EP1085904B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 HU HU0102441A patent/HUP0102441A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1999-06-11 AT AT99927443T patent/ATE351901T1/de active
- 1999-06-11 ES ES10181856.5T patent/ES2650500T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 CZ CZ2011-316A patent/CZ306637B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 NZ NZ509055A patent/NZ509055A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 KR KR1020007014088A patent/KR100637937B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 SK SK50041-2015A patent/SK288544B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 IL IL14026499A patent/IL140264A0/xx active IP Right Grant
- 1999-06-11 DE DE69934885T patent/DE69934885T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 AU AU44343/99A patent/AU771110B2/en not_active Ceased
- 1999-06-11 CZ CZ20004635A patent/CZ302601B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 PL PL398576A patent/PL219128B1/pl unknown
- 1999-06-11 MX MXPA00012403A patent/MXPA00012403A/es active IP Right Grant
- 1999-06-11 ES ES99927445T patent/ES2400445T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 JP JP2000553136A patent/JP4531255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 PT PT99927445T patent/PT1085904E/pt unknown
- 1999-06-11 ES ES99927443T patent/ES2281177T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 CA CA2334895A patent/CA2334895C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 RU RU2001101426/15A patent/RU2236252C2/ru active IP Right Revival
- 1999-06-11 CA CA2334850A patent/CA2334850C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 BR BR9911163-2A patent/BR9911163A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 PL PL346212A patent/PL200977B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 US US09/332,288 patent/US6669943B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 WO PCT/US1999/013144 patent/WO1999064068A1/en active Application Filing
- 1999-06-11 CN CN99809582A patent/CN1312725A/zh active Pending
- 1999-06-11 KR KR1020067011483A patent/KR20060080249A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-06-11 DK DK10181977.9T patent/DK2316923T3/en active
- 1999-06-11 SK SK50021-2008A patent/SK288567B6/sk not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-11-28 US US09/724,419 patent/US6852522B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 IL IL140265A patent/IL140265A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-12-12 NO NO20006328A patent/NO20006328L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-12 IL IL140264A patent/IL140264A/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-11-14 US US10/713,732 patent/US7588768B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-20 US US10/945,718 patent/US7494808B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-12-24 IL IL188362A patent/IL188362A0/en not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-02-26 IL IL189766A patent/IL189766A0/en unknown
- 2008-04-22 US US12/148,798 patent/US8057803B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-02-02 US US12/364,243 patent/US9352033B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-02-23 US US12/391,172 patent/US20100233785A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-08 US US12/480,410 patent/US20100158942A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-16 JP JP2009285467A patent/JP5081220B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-02-12 JP JP2010029288A patent/JP2010142248A/ja active Pending
- 2010-09-29 JP JP2010218868A patent/JP2011050384A/ja active Pending
-
2011
- 2011-09-30 US US13/250,846 patent/US8765139B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-02-15 CY CY20131100144T patent/CY1113689T1/el unknown
- 2013-06-26 JP JP2013133432A patent/JP5810134B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2013-08-16 JP JP2013169102A patent/JP5829655B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-05-22 US US14/285,339 patent/US9387240B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-06-08 US US15/176,721 patent/US20160279227A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9387240B2 (en) | Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals |