PL212316B1 - Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek - Google Patents

Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek

Info

Publication number
PL212316B1
PL212316B1 PL386473A PL38647399A PL212316B1 PL 212316 B1 PL212316 B1 PL 212316B1 PL 386473 A PL386473 A PL 386473A PL 38647399 A PL38647399 A PL 38647399A PL 212316 B1 PL212316 B1 PL 212316B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
attenuated
interferon
amino acid
acid residues
Prior art date
Application number
PL386473A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Palese
Adolfo Garcia-Sastre
Thomas Muster
Original Assignee
Sinai School Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL212316(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sinai School Medicine filed Critical Sinai School Medicine
Publication of PL212316B1 publication Critical patent/PL212316B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku są zastosowania preparatów szczepionek zawierających atenuowane wirusy grypy, zastosowania preparatów farmaceutycznych zawierających atenuowane wirusy grypy oraz sposoby wytwarzania szczepionek zawierających atenuowane wirusy grypy.
1. Wprowadzenie
Niniejszy wynalazek dotyczy, ogólnie, atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, mających zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi komorkowej na interferon (IFN) oraz zastosowania takich atenuowanych wirusów w szczepionce oraz preparatach farmaceutycznych. Wynalazek dotyczy także wykorzystania i zastosowania układów z niedoborem IFN do selekcji, identyfikacji i namnażania takich atenuowanych wirusów.
Zgodnie z wynalazkiem opisano atenuowane wirusy grupy posiadające modyfikacje w genie NS1, które zmniejszają lub eliminują zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania odpowiedzi komórkowej wobec IFN. Zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz wykazują zmniejszoną patogenność, a zatem są odpowiednie do stosowania w żywych szczepionkach wirusowych oraz preparatach farmaceutycznych.
2. Tło wynalazku
2.1 Wirus grypy
Rodziny wirusów zawierających osłonkowany RNA o pojedynczej nici genomu o ujemnej polarnosci (antysensownego) klasyfikuje się w grupach mających genomy niesegmentowane (Paramyxoviridae, Rhabdovindae, Filoviridae i Borna Disease Virus) lub mających genomy segmentowane (Othomyxoviridae, Bunyaviridae i Arenaviridae).
Rodzina Orthomyxoviridae, opisywana szczegółowo poniżej i używana w niniejszych przykładach, obejmuje wirusy grypy, wirusy typu A, B i C, jak również wirusy Thogoto i Dhori oraz wirusa zakaźnej anemii łososi.
Wiriony grypy składają się z wewnętrznego rdzenia rybonukleoproteinowego (nukleokapsyd w postaci helisy), zawierającego genom o pojedynczej nici RNA, oraz zewnętrznej osłonki lipoproteinowej powleczonej wewnątrz białkiem matriksowym (M1).
Segmentowany genom wirusa grypy A składa się z ośmiu cząsteczek (siedem dla grypy C), o liniowej ujemnej polarności, RNA o pojedynczych niciach, które kodują dziesięć polipeptydów, włączając: białka polimerazy RNA zależne od RNA (PB2, PB1 i PA) oraz nukleoproteinę (NP), która tworzy nukleokapsyd; białka błony matriksowej (M1, M2); dwie glikoproteiny powierzchniowe, które wystają z osłonki zawierającej lipid: hemaglutyninę (HA) i jądrowe białko eksportowe (NEP).
Transkrypcja i replikacja genomu ma miejsce w jądrze, a montowanie zachodzi poprzez składanie na błonie plazmatycznej.
Wirusy mogą ponownie mieszać geny w czasie mieszanych infekcji.
Wirus grypy adsorbuje się poprzez HA do sialilooligosacharydów w glikoproteinach i glikolipidach błony komórkowej.
Po endocytozie wirionu zachodzą zmiany konformacyjne w cząsteczce HA wewnątrz endosomu komórkowego, które ułatwiają fuzję błonową, stymulując w ten sposób pozbawienie osłonki.
Nukleokapsyd migruje do jadra, gdzie mRNA wirusa ulega transkrypcji.
Wirusowy mRNA ulega transkrypcji przez unikalny mechanizm, w którym endonukleazy wirusowe odcinają czapeczkowany koniec 5' z heterologicznych mRNA komórki, które następnie służą jako startery do transkrypcji matryc RNA wirusa przez transkryptazę wirusową.
Terminacja transkryptu zachodzi w miejscach 15 do 22 zasad od końców ich matryc, gdzie sekwencje oligo(U) działają jako sygnały do dodawania śladów poii(A).
Z ośmiu tak wytworzonych wirusowych cząsteczek RNA, sześć jest informacjami monocistronowymi, które ulegają translacji bezpośrednio do białek, reprezentujących HA, NA, NP i białka polimerazy wirusowej, PB2, PB1 i PA.
Inne dwa transkrypty przechodzą splicmg, po czym każdy daje dwa mRNA, które ulegają translacji w różnych ramkach odczytu, wytwarzając M1, M2, NS1 i NEP
Innymi słowy, osiem segmentów wirusowego RNA koduje dziesięć białek: dziewięć strukturalnych i jedno niestrukturalne. Omówienie genów wirusa grypy i ich produktów białkowych pokazano w tabeli I poniżej.
PL 212 316 B1
T a b e l a 1
Segmenty RNA genomu wirusa grypy i produkty kodowaniaa
Segment Długosćb (nukleotydy) Kodowany polipeptydc Długośćd (aminokwasy) Cząsteczki na wirion Komentarz
1 2341 PB2 759 30-60 Składnik transkryptazy RNA; wiazanie czapeczkowanego RNA komórki gospodarza
2 2341 PB1 757 30-60 Składnik transkryptazy RNA; inicjacja transkrypcji
3 2233 PA 716 30-60 Składnik transkryptazy RNA
4 1778 HA 566 500 Hemaglutynina; trimer; glikoproteina osłonki; pośredniczy w przyłączaniu do komórek
5 1565 NP 498 1000 Nukleoproteina; zwiazana z RNA; strukturalny składnik transkryptazy RNA
6 1413 NA 454 100 Neuraminidaza tetramer; glikoproteina osłonki
7 1027 M1 252 3000 Białko matrycowe, powleka wnętrze osłonki
M2 96 ? Strukturalne białko w błonie plazma- tycznej; złożony mRNA
8 890 NS1 230 Białko niestrukturalne; funkcja nieznana
NEP 121 ? Jądrowe białko eksportowe; złożony mRNA
a Zaadaptowane z R.A. Lamb i P.W. Choppin (1983) Annual Review of Biochemistry, tom 52, 467-506 b Dla szczepu A/PR/8/34 c Określone w próbach biochemicznych i genetycznych d Określone w analizie sekwencji nukleotydowej i sekwencjonowaniu białka
Genom wirusa grypy A zawiera osiem segmentów RNA o pojedynczej nici o ujemnej polarności, kodujących jedno białko niestrukturalne i dziewięć strukturalnych. Białko niestrukturalne NS1 jest powszechne w komórkach zakażonych wirusem grypy, lecz nie zostało wykryte w wirionach. NS1 jest fosfoproteiną znajdującą się w jądrze wcześnie podczas zakażenia, a także w cytoplazmie w czasie późniejszym cyklu wirusowego (King i inni 1975, Virology 64: 378). Badania z mutantami grypy wrażliwymi na temperaturę (ts) z uszkodzeniami w genie NS, sugerowały, że białko NS1 jest regulatorem transkrypcyjnym i posttranskrypcyjnym mechanizmów, dzięki którym wirus jest zdolny do hamowania ekspresji genu komórki gospodarza i stymulacji syntezy białek wirusowych. Tak jak wiele innych białek, które regulują procesy posttranslacyjne, białko NS1 oddziałuje ze specyficznymi sekwencjami i strukturami RNA. Donoszono, że białko NS1 wiąże się z różnymi rodzajami RNA, łącznie z vRNA, poli-A, U6snRNA, regionem 5' nie podlegającym translacji, jak mRNA wirusa oraz dsRNA (Qiu i inni, 1995, RNA 1: 304; Qiu i inni 1994, J.Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen. Virol. 73: 3325-9. Ekspresja białka NS1 z cDNA w transfekowanych komórkach powiązano z kilkoma skutkami: inhibicją transportu jądrowo-cytoplazmatycznego mRNA, inhibicją splicingu pre-mRNA, inhibicją poliadenylacji mRNA gospodarza i stymulacją translacji wirusowego mRNA (Fortes i mm, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami i inni, 1994, J. Virol. 68: 20 1432; de la Luna i inni 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu i inni, Genes Dev. 8: 1617; Park i inni, 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff i inni, 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen i inni, 1994, EMBO J. 18: 2273-83).
2.2 Wirusy atenuowane
Inaktywowane szczepionki wirusowe otrzymuje się przez „zabicie” patogenu wirusowego, np. przez traktowanie wysoką temperaturą albo formaliną tak, że nie jest on zdolny do replikacji. Inaktywowane szczepionki mają ograniczone wykorzystanie, ponieważ nie zapewniają długotrwałej odpor4
PL 212 316 B1 ności, a zatem zapewniają ograniczone zabezpieczenie. Alternatywnym podejściem do wytwarzania szczepionek wirusowych, jest stosowanie atenuowanych żywych szczepionek wirusowych. Atenuowane wirusy są zdolne do replikacji, lecz nie są patogenne, a zatem zapewniają dłużej trwającą odporność i większe zabezpieczenie. Jednakże konwencjonalne metody wytwarzania atenuowanych wirusów obejmują przypadkową izolację szeregu mutantów gospodarza, z których wiele jest wrażliwych na temperaturę, np. wirusa pasażuje się przez nienaturalnego gospodarza i selekcjonuje wirusy potomne, które są immunogenne, lecz jeszcze niepatogenne.
Konwencjonalnym substratem do izolacji i hodowli wirusów grypy do szczepionek są jaja kurze z zarodkami. Wirusy grypy zwykle rosną w ciągu 2-4 dni w temperaturze 37°C w jajach 10-11 dniowych. Mimo, że większość pierwotnych izolatów ludzkich wirusów grypy A i B rośnie lepiej w worku owodniowym zarodków, po 2 do 4 pasażach wirusy dostosowują się do wzrostu w komórkach jamy omoczniowej, która jest dostępna z zewnątrz jaja (Murphy, B. R. i R. G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses, strona 1397-1445. W Fields Virology. Lippicott-Raven P. A).
Technologia rekombinacji DNA i techniki inżynierii genetycznej teoretycznie pozwalają na lepsze podejście do wytwarzania atenuowanego wirusa, ponieważ w genomie wirusa można celowo dokonać specyficznych mutacji. Jednakże zmiany genetyczne wymagane do atenuacji wirusów nie są ani znane, ani przewidywalne. Ogólnie, próby stosowania technologii rekombinacji DNA do opracowania szczepionek wirusowych dotyczą w większości produkcji szczepionek podjednostkowych, które zawierają tylko podjednostki białka patogenu, związane z odpowiedzią immunologiczną, poddane ekspresji w rekombinowanych wektorach wirusowych, takich jak wirus krowianki lub bakulowirus. Ostatnio, wykorzystano techniki rekombinacji DNA w próbie wytworzenia mutantów delecyjnych herpeswirusa lub poliowirusów, które naśladują atenuowane wirusy występujące w naturze lub znane szeregi mutantów gospodarzy. Do 1990 wirusy o ujemnej nici RNA nie były wcale podatne na manipulacje miejscowo-specyficzne, a więc nie mogły być genetycznie modyfikowane.
Atenuowane żywe wirusy grypy wytwarzane dotąd mogły nie być zdolne do supresji odpowiedzi interferonowej u gospodarza, w którym replikują. Zatem, mimo, że wirusy te są zalecane, ponieważ są one immunogenne i niepatogenne, trudno je namnożyć w konwencjonalnych substratach do celów wytwarzania szczepionek. Ponadto, atenuowane wirusy mogą posiadać cechy wirulencji, które są łagodne i nie pozwalają gospodarzowi na wytworzenie odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do obrony przed późniejszymi prowokacjami.
3. Omówienie wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA, mające zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki oraz zastosowania takich wirusów w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. Zmutowane wirusy z zaburzoną aktywnością antagonistyczną wobec IFN są atenuowane, czyli są zakaźne, mogą replikować in vivo zapewniając subkliniczny poziom infekcji i nie są patogenne. Zatem, są one idealnymi kandydatami dla żywych szczepionek wirusowych. Ponadto, atenuowane wirusy mogą indukować silną odpowiedź INF, która ma inne konsekwencje biologiczne in vivo, powodując zabezpieczenie przed późniejszymi chorobami zakaźnymi i/lub indukując odpowiedź przeciwnowotworową. Zatem, atenuowane wirusy można stosować farmaceutycznie do profilaktyki lub leczenia innych chorób zakaźnych, nowotworów u osób o wysokim ryzyku i/lub chorób leczonych IFN.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację, oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
Korzystniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus
PL 212 316 B1 syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu. Korzystnie w powyższych zastosowaniach chorobą zakaźną jest grypa.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzystnie, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Korzystnie, miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Korzystnie, chorobę zakaźną stanowi grypa.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
Korzystniej, w tym zastosowaniu atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1. Korzystnie w tych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Korzystnie, w tych zastosowaniach chorobą zakaźną jest grypa.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza
PL 212 316 B1 z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzytsniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Korzystnie, w powyższych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Korzystnie, chorobę zakaźną stanowi grypa.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
Korzystniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, w tych zastosowaniach układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Korzystnie, w tych zastosowaniach miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza liczbę 1 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie, atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzystniej, atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Korzystnie, miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania szczepionki, polegający na tym, że obejmuje (a) namnażanie w jajach z zarodkiem w wieku poniżej 10 dni genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego, przy czym wirusa namnaża się do wystarczających ilości oraz w warunkach wolnych od zakażenia tak, że wirus potomny jest odpowiedni do preparowania w szczepionkę.
PL 212 316 B1
Korzystnie, jajo z zarodkiem jest wieku sześciu do dziewięciu dni.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania szczepionki, polegający na tym, że obejmuje
a) namnażanie w linii komórkowej z niedoborem interferonu genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego.
Korzystnie, linią komórkową z niedoborem interferonu nie są komórki Vero.
Korzystnie, linią komórkową z niedoborem interferonu są komórki Vero.
Korzystnie, w powyższych sposobach mutacja w genie NS1 skutkuje delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza 1.
Korzystnie, w powyższych sposobach atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
Korzystnie, w powyższych sposobach atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
Wirusy o ujemnej nici RNA, stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują wirusy zarówno segmentowane jak i niesegmentowane; zalecane postacie realizacji obejmują, lecz bez ograniczenia, wirusa grypy, wirusa syncytialnego płuc (RSV), wirusa choroby Newcastle (NDV), wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (VSV) oraz wirusa paragrypy (PIV). Wirusy stosowane w wynalazku można selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję wobec mutagenów, powtórzone pasaże i/lub pasaże w gospodarzach niedozwolonych); reasortantów (w przypadku segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych (np. przy użyciu technik „genetyki odwrotnej” mających pożądany fenotyp, czyli zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki. Zmutowane lub genetycznie zmodyfikowane wirusy można selekcjonować na podstawie różnicowania wzrostu w układach z niedoborem IFN względem układów kompetentnych pod względem IFN. Przykładowo, można selekcjonować wirusy, które rosną w układzie z niedoborem IFN, lecz nie rosną w układzie kompetentnym pod względem IFN (lub które rosną gorzej w układzie kompetentnym pod względem IFN).
Tak wyselekcjonowany atenuowany wirus może być stosowany sam jako składnik aktywny w szczepionce lub preparatach farmaceutycznych. Alternatywnie, atenuowany wirus może być stosowany jako wektor lub „szkielet” szczepionek wytwarzanych rekombinacyjnie. Jak dotąd, technikę „genetyki odwrotnej” można stosować do budowania mutacji lub wprowadzania obcych epitopów do atenuowanego wirusa, który służyłby jako szczep „rodzicielski”. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów, lub alternatywnie, przeciw całkowicie innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym. Przykładowo, atenuowanego wirusa można zmodyfikować do ekspresji epitopów neutralizujących innych wstępnie wyselekcjonowanych szczepów. Alternatywnie, w atenuowanego mutanta można wbudować epitopy wirusów innych niż wirusy o ujemnej nici RNA (np. gp160, gp120 lub gp41 HIV). Alternatywnie, w wirusa można wbudować epitopy patogenów zakaźnych niewirusowych (np. pasożytów, bakterii, grzybów). W jeszcze innej opcji, można wytworzyć szczepionki nowotworowe, np. przez wbudowanie antygenów nowotworowych do atenuowanego szkieletu wirusowego.
W poszczególnej postaci realizacji, obejmującej wirusy RNA z genomami segmentowanymi, można stosować techniki reasortacji, do przeniesienia atenuowanego fenotypu z rodzicielskiego szczepu wirusa o segmentowanym RNA (naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) do różnych szczepów wirusowych (wirus dzikiego typu, naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany).
Wirusy atenuowane, które indukują silne odpowiedzi IFN u gospodarza, można także stosować w preparatach farmaceutycznych do profilaktyki lub leczenia innych infekcji wirusowych lub chorób możliwych do leczenia IFN, takich jak nowotwór. Pod tym względem, można zmieniać tropizm atenuowanego wirusa, aby nakierować wirus na pożądany narząd docelowy, tkankę lub komórki in vivo lub ex vivo. Stosując to podejście, odpowiedź IFN można indukować miejscowo, w docelowym miejscu, unikając w ten sposób lub minimalizując skutki uboczne układowego traktowania IFN. W tym celu można skonstruować atenuowanego wirusa do ekspresji liganda specyficznego pod względem receptora docelowego narządu, tkanki lub komórek.
PL 212 316 B1
Wynalazek opiera się, częściowo, na stwierdzeniu twórców wynalazku, że NS1 wirusa grypy dzikiego typu działa jak antagonista IFN w taki sposób, że NS1 hamuje odpowiedź za pośrednictwem IFN komórek gospodarza zakażonych wirusem. Stwierdzono, że mutanty wirusowe z niedoborem aktywności NS1 są silnymi induktorami odpowiedzi komórkowej IFN i przedstawiały atenuowany fenotyp in vivo; czyli zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz dają mniejsze skutki patogenne. Nie chcąc wiązać się jakąkolwiek teorią lub wytłumaczeniem jak działa wynalazek, cechy atenuacji wirusów tu opisanych są prawdopodobnie spowodowane ich zdolnością do indukcji silnej komórkowej odpowiedzi IFN oraz ich zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi IFN gospodarza. Jednakże dogodne cechy atenuowanych wirusów tu opisanych nie muszą być przypisywane jedynie wpływowi na komórkową odpowiedź IFN. W rzeczywistości, zmiany innych aktywności związanych z NS1 mogą nadawać żądany atenuowany fenotyp.
Wykazano, że zmutowany wirus grypy o zaburzonej aktywności antagonistycznej wobec IFN replikuje in vivo, wytwarzając miana, które są wystarczające do indukcji odpowiedzi immunologicznej i cytokinowej. Przykładowo, szczepienie atenuowanym wirusem grypy zmniejszało miano wirusa u zwierząt, które później sprowokowano wirusem grypy dzikiego typu. Atenuowane wirusy grypy przedstawiały także aktywność antywirusową i przeciwnowotworową. Wstępna infekcja (zakażenie) atenuowanym wirusem grypy hamowało replikacje innych szczepów wirusa grypy dzikiego typu i innych wirusów (takich jak wirus Sendai) nadkażonych w jajach z zarodkami. Szczepienie atenuowanym wirusem grypy u zwierząt, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe, zmniejszyło liczbę utworzonych ognisk. Ponieważ wirus grypy jak wiadomo indukuje odpowiedź CTL (cytotoksyczne limfocyty T), atenuowany wirus jest bardzo atrakcyjnym kandydatem do szczepionek nowotworowych.
Do szczepionek wirusowych zalecane są mutacje, które zmniejszają, lecz nie znoszą aktywności antagonistycznej IFN wirusa, takie wirusy można selekcjonować pod względem wzrostu zarówno w konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych substratach oraz pod względem wirulencji pośredniej. W szczególności, twórcy wynalazku pokazali, że mutant o skróconym C-terminalnie NS1 replikuje do wysokich mian w substratach z niedoborem IFN, takich jak 6 i 7-dniowe zarodki kurze, jak również w błonie omoczniowej 10-dniowych zarodków kurzych, substracie konwencjonalnym dla wirusa grypy, który nie pozwala na wzrost mutantów wirusa grypy, w których usunięto cały gen NS1 (przytaczanych tu także jako mutanty „znokautowane”). Jednakże, replikacja mutanta o skróconym końcu C NS1 jest mniejsza u 12-dniowych zarodków kurzych. Podejście to pozwala, pierwszy raz, na utworzenie i identyfikację żywych atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, w których zmieniono, lecz nie zniesiono aktywność antagonistyczną wobec IFN i które są zdolne do wzrostu w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek. Podejście to dostarcza także, po raz pierwszy, układ skutecznej selekcji identyfikacji wirusa grypy lub innych wirusów, które zawierają mutacje nadające zmienioną, lecz nie zniesioną aktywność antagonistyczną wobec interferonu. Układy z niedoborem IFN mogą być stosowane do namnażania atenuowanych wirusów, które nie mogą być hodowane w układach konwencjonalnych stosowanych aktualnie do wytwarzania szczepionek. Określenie „układy z niedoborem IFN” jakie się tu stosuje, odnosi się do układów, np. komórek, linii komórkowych i zwierząt, takich jak myszy, kurczęta, indyki, króliki, szczury itd., które nie wytwarzają IFN lub wytwarzają IFN na niskim poziomie, nie odpowiadających lub odpowiadających mniej skutecznie na IFN, i/lub mających braki w indukowanej przez IFN aktywności genów antywirusowych. W tym celu, twórcy wynalazku zidentyfikowali lub opracowali liczne układy z niedoborem IFN, które można stosować, w tym, lecz bez ograniczenia, młode zarodki kurze, linie komórkowe z niedoborem IFN (takie jak komórki VERO lub genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe takie jak nokauty STAT1). Alternatywnie, zarodki kurze lub linie komórkowe można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN (łącznie z lekami, przeciwciałami, antysensami, rybozymami, itd). Jeszcze inna postać realizacji obejmuje stosowanie jaj z niedoborem układu IFN, np. jaj wytworzonych przez ptaki ujemne pod względem STAT1, zwłaszcza drób, w tym, lecz bez ograniczenia, transgeniczne kurczęta, kaczki lub indyki.
4. Opis rysunków
Figura 1. Wirus delNS1 hamuje replikację wirusa grypy A dzikiego typu w jajach. Jaja kurze z zarodkami w wieku 10 dni zaszczepiono wskazanymi pfu wirusa delNS1. Osiem godzin później 3 jaja zakażono 103 pfu wirusa WSN. Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa WSN przez test łysinek w komórkach MDCK. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Figura 2. Indukcja odpowiedzi antywirusowej przez wirusa delNS1 w zarodkach kurzych. Jaja kurze z zarodkami w wieku 10 dni zaszczepiono PBS (nie traktowano) lub 2 x 104 pfu wirusa delNS1
PL 212 316 B1 3 (traktowane delNS1). Osiem godzin później jaja ponownie zakażono 103 pfu wirusa grypy A/WSN/33 (H1N1), wirusa grypy A/PR8/34 (H + N1, wirusa grypy A/X-31 (H3N2), wirusa grypy B/Lee/40 lub wirusa Sendai. Po dwóch dniach inkubacji zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa przez test hemaglutynacji. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Figura 3. Komórki CV1 transfekowano plazmidem, wykazującym ekspresję IRF-3 poddanego fuzji z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Pozwoliło to na określenie lokalizacji IRF-3 wewnątrz komórek, przez mikroskopię fluorescencyjną. W niektórych przypadkach, plazmid ekspresyjny NS1 kotransfekowano plazmidem ekspresyjnym IRF-3 we wskazanych stosunkach. 24 godziny po transfekcji komórki zakażano wirusem PR8 (WT) lub delNS1 przy wysokim moi, zgodnie ze wskazaniami. 10 godzin po zakażeniu komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym pod względem lokalizacji IRF-3-GFP. Zaznaczono odsetek komórek wykazujących wyłącznie lokalizację cytoplazmatyczną (CYT) oraz lokalizację zarówno cytoplazmatyczną jak i jądrową IRF-3 (Nuc + Cyt).
5. Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano wytwarzanie, selekcję i identyfikację atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizowania odpowiedzi komórkowej IFN, oraz zastosowania takich wirusów w preparatach szczepionek i farmaceutycznych.
Wirusy mogą mieć genomy segmentowane lub niesegmentowane i można je selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję na promieniowanie UV, mutageny i/lub pasaże); reasortantów (dla segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, wirusy zmutowane można wytworzyć przez naturalną zmienność, ekspozycję na promieniowanie UV, ekspozycję na mutageny chemiczne, przez pasażowanie w gospodarzach niedozwolonych, przez reasortację (czyli przez koinfekcję atenuowanego segmentowanego wirusa z innym szczepem posiadającym żądane antygeny) i/lub przez genetyczną modyfikację (np. przy użyciu „genetyki odwrotnej”). Wirusy selekcjonowane do zastosowania w wynalazku, mają defektywną aktywność antagonizującą IFN i są atenuowane; czyli są one zakaźne i mogą replikować in vivo, lecz wytwarzają tylko niskie miana, wywołując poziom subkliniczny infekcji, który nie jest patogenny. Takie atenuowane wirusy są idealnymi kandydatami do żywych szczepionek.
W zalecanej postaci realizacji, atenuowane wirusy selekcjonowane do zastosowania w wynalazku, powinny być zdolne do indukcji silnej odpowiedzi IFN u gospodarza, cechy, która przyczynia się do wytworzenia silnej odpowiedzi immunologicznej przy zastosowaniu jako szczepionki i która ma inne konsekwencje biologiczne, które czynią wirusy użytecznymi jako środki farmaceutyczne do profilaktyki i/lub leczenia innych infekcji wirusowych, lub tworzenia nowotworów u osób z wysokim ryzykiem, lub innych chorób, które leczy się IFN.
Wynalazek opiera się, częściowo, na licznych stwierdzeniach i obserwacjach dokonanych przez twórców wynalazku podczas pracy z mutantami wirusa grypy. Jednakże te zasady można analogicznie stosować i ekstrapolować w stosunku do innych segmentowanych i niesegmentowanych wirusów o ujemnej nici RNA, w tym, lecz bez ograniczenia, paramyksowirusy (wirus Sendai, wirus paragrypy, świnki, wirus choroby Newcastle), morbiliwirusy (wirus odry, wirus nosówki i wirus księgosuszu); pneumowirusy (wirus syncytialny dróg oddechowych i bydlęcy wirus dróg oddechowych); oraz rabdowirusy (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i wirus wścieklizny).
Po pierwsze, odpowiedź IFN jest istotna dla infekcji wirusowych in vivo. Twórcy wynalazku stwierdzili, że wzrost wirusa grypy dzikiego typu A/WSN/33 u myszy z niedoborem IFN (myszy STAT1-/-) spowodował infekcję wielonarządową; czyli infekcja wirusowa nie ograniczała się tylko do płuc, jak to się dzieje u myszy dzikiego typu, u których powstaje odpowiedź IFN (Garcia-Sastre i inni, 1998, J. Virol. 72: 8550, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Po drugie, zgłaszający ustalili, że NS1 wirusa grypy działa jako antagonista IFN. Twórcy wynalazku ustalili, że mutant wirusa grypy z delecją całego genu NS1 (czyli „nokaut” NS1) nie był zdolny do wzrostu do wysokich mian w komórkach gospodarza kompetentnych pod względem IFN i mógł się namnażać tylko w gospodarzach z niedoborem IFN. Wirus z wyłączonym (znokautowanym) genem NS1 wykazywał fenotyp atenuowany (czyli był on letalny u myszy STAT1-/- bez IFN, lecz nie był u myszy dzikiego typu) i stwierdzono, że jest on silnym induktorem odpowiedzi IFN w komórkach gospodarza (Garcia-Sastre i inni 1998, Virology, 252: 324-330, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Wstępne zakażenie zmutowanym wirusem z wyłączeniem NS1 zmniejszyło miana wirusów grypy dzikiego typu i innych (np. Sendai) nadkażonych w jajach kurzych z zarodkami. W innym doświadczeniu, zakażenie zmutowanym wirusem grypy z wyłączonym NS1, zmniejszyło tworzenie ognisk u zwierząt zaszczepionych ko10
PL 212 316 B1 mórkami nowotworowymi. Tak więc, wirus grypy z wyłączonym NS1 posiadał interesujące właściwości biologiczne. Jednakże, wirusy grypy znokautowane pod względem NS1 nie mogły się namnażać w konwencjonalnych układach do wytwarzania szczepionek. W celu przezwyciężenia tego problemu twórcy wynalazku opracowali układy z niedoborem IFN, które pozwalają na wytwarzanie rozsądnych ilości atenuowanego wirusa.
Oprócz tego, twórcy wynalazku opracowali mutanty delecyjne NS1, które nie mają delecji całego genu. Niespodziewanie, te mutanty NS1 okazały się obrazować „pośredni” fenotyp, wirus może rosnąć w konwencjonalnych gospodarzach stosowanych do namnażania wirusa grypy (choć wzrost jest lepszy w układach z niedoborem IFN, które dają wyższe miana). Najistotniejsze jest to, że mutanty delecyjne są atenuowane in vivo i indukują silną odpowiedź IFN. Szczepienie mutantami wirusa grypy ze skróconym NS1 powodowało niższe miana wirusa u zwierząt później prowokowanych wirusem dzikiego typu, i powodowało zabezpieczenie przed chorobą.
Substraty opracowane do izolacji, identyfikacji i hodowli wirusów do celów szczepionek. W szczególności, opisano substraty z niedoborem interferonu do skutecznego hodowania mutantów wirusa grypy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, substratem z niedoborem interferonu jest taki, który jest defektywny pod względem zdolności do wytwarzania lub odpowiedzi wobec interferonu. Taki substrat można stosować do hodowli dowolnej ilości wirusów, które mogą wymagać środowiska wzrostu nie zawierającego interferonu. Takie wirusy mogą obejmować, lecz bez ograniczenia, paramyksowirusy (wirus Sendai, wirus paragrypy, świnki, wirus choroby Newcastle), morbiliwirusy (wirus odry, wirus nosówki i wirus księgosuszu); pneumowirusy (wirus syncytialny dróg oddechowych i bydlęcy wirus dróg oddechowych); oraz rabdowirusy (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i wirus wścieklizny).
Wynalazek odnosi się do zastosowania atenuowanego wirusa tu opisanego w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych przeznaczonych dla ludzi i zwierząt. W szczególności, atenuowane wirusy można stosować jako szczepionki przeciw szerokiemu zakresowi wirusów lub innych patogenów zakaźnych (np. bakteriom, pasożytom, grzybom) lub antygenom specyficznym wobec nowotworów. W innej postaci realizacji, atenuowane wirusy, które hamują replikację wirusową i tworzenie nowotworu, można stosować do profilaktyki lub leczenia infekcji (patogenami wirusowymi lub niewirusowymi) lub tworzenia nowotworu lub leczenia chorób, dla których korzystne jest terapia IFN. Można stosować wiele metod wprowadzania żywych atenuowanych preparatów wirusowych do podmiotu ludzkiego lub zwierzęcego, aby indukować odporność lub odpowiednią odpowiedź cytokinową. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustna, przeskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. W zalecanej postaci realizacji, atenuowane wirusy tu opisane wynalazku opracowuje się w postaci do dostarczania donosowego.
5.1. Wytwarzanie mutantów o zmienionej aktywności antagonistycznej IFN
Zgodnie z przedstawionym opisem można wyselekcjonować i zastosować dowolnego zmutowanego wirusa, który posiada zmniejszoną aktywność antagonistyczną dla IFN. W jednej postaci realizacji można wyselekcjonować mutanty występujące naturalnie lub odmiany, albo mutanty spontaniczne, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi wobec IFN. W innej postaci realizacji zmutowane wirusy można wytworzyć przez ekspozycję wirusa na mutageny, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub mutageny chemiczne, lub przez wielokrotne pasażowanie i/lub pasaż w niedozwolonym gospodarzu. Skrining w różnicującym układzie wzrostowym można stosować do selekcji tych mutantów, które mają zaburzoną funkcję antagonistyczną wobec IFN. Dla wirusów o genomie segmentowanym, fenotyp atenuowany można przenieść do innego szczepu, mającego pożądany antygen, przez reasortację (czyli koinfekcję atenuowanego wirusa i żądanego szczepu oraz selekcję reasortantów wykazujących oba fenotypy).
Mutacje można wbudować do wirusa o ujemnej nici RNA, takiego jak wirus grypy, RSV, NDV, VSV i PIV, stosując podejścia „genetyki odwrotnej”. W ten sposób mutacje naturalne lub inne, które nadają fenotyp atenuowany, można wbudować w szczepy do szczepionek. Przykładowo, można wbudować delecje, insercje lub substytucje regionu kodującego odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN (tak jak NS1 grypy). Bierze się także pod uwagę delecje, substytucje lub insercje regionu niekodującego genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. W tym celu można wbudować mutacje w sygnały odpowiedzialne za transkrypcję, replikację, poliadenylację i/lub upakowanie genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. Przykładowo, w wirusie grypy takie modyfikacje mogą obejmować, lecz bez ograniczenia: substytucję regionów nie kodujących genu wirusa grypy B (Muster i inni 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177), wymiany par
PL 212 316 B1 zasad w regionach niekodujących genu wirusa grypy (Fodor i inni, 1998, J. Virol. 72: 6283), mutacje w regionie promotorowym genu wirusa grypy (Piccone i inni, 1993, Virus Res. 28:99; Li i inni 1992, J. Virol. 66: 4331), substytucje i delecje w całej rozciągłości reszt urydynowych przy końcu 5' genu wirusa grypy, wpływające na poliadenylację (Luo i inni, 1991, J. Virol. 65:2861; Li i inni J. Virol. 1994, 68 (2): 1245-9). Takie mutacje, np. w stosunku do promotora, mogą obniżać ekspresję genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. Mutacje w genach wirusowych, które mogą regulować ekspresję genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN, wchodzą w zakres wirusów, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem.
Zgodnie z wynalazkiem brano także pod uwagę mutacje w stosunku do segmentu genowego NS1, które niekoniecznie wynikają ze zmiany aktywności antagonistycznej wobec IFN lub fenotypu indukującego IFN, lecz raczej wywołują zmiany funkcji wirusowych i fenotyp atentowany, np. zmianę inhibicji eksportu jądrowego mRNA zawierającego poli(A), zmianę inhibicji splicingu pre-mRNA, zmianę inhibicji aktywacji PKR przez sekwestrację dsRNA, zmianę wpływu na translację RNA wirusa i zmianę inhibicji poliadenylacji mRNA gospodarza (np. patrz Krug w Textbook of Influenza, Nicholson i inni, wydawca, 1998, 82-92 i odniesienia tam cytowane).
Technika genetyki odwrotnej obejmuje wytwarzanie syntetycznych rekombinowanych wirusów RNA, które zawierają regiony niekodujące ujemnej nici RNA wirusa, które są zasadnicze dla rozpoznania przez polimerazy wirusowe i dla sygnałów upakowania koniecznych do wytworzenia dojrzałego wirionu. Rekombinowane RNA syntetyzuje się z rekombinowanej matrycy DNA i odtwarza in vitro z kompleksem oczyszczonej polimerazy wirusowej, tworząc rekombinowane rybonukleoproteiny (RNP), które można stosować do transfekcji komórek. Skuteczniejszą transfekcję uzyskuje się jeśli białka polimerazy wirusowej są obecne podczas transkrypcji syntetycznego RNA albo in vitro albo in vivo. Syntetyczne rekombinowane RNP można odtworzyć do zakaźnych cząstek wirusowych. Powyższe techniki opisano w patencie US nr 5 166 057 wydanym 25 listopada 1992; patencie US nr 5 854 037 wydanym 29 grudnia 1998; w europejskiej publikacji patentowej EP 0702085 A1, opublikowanej 20 lutego 1996; w zgłoszeniu patentowym US nr 09/152 845; w międzynarodowej publikacji patentowej PCT WO 97/12032 opublikowanej 3 kwietnia 1997; WO 96/34625 opublikowanej 7 listopada 1996; w europejskiej publikacji patentowej EP-A780475; WO 99/02625 opublikowanej 21 stycznia 1999; WO 98/53078 opublikowanej 26 listopada 1998; WO 98/02530 opublikowanej 22 stycznia 1998; WO 99/15672 opublikowanej 1 kwietnia 1999; WO 98/13501 opublikowanej 2 kwietnia 1998; WO 97/06270 opublikowanej 20 lutego 1997; oraz EPO 780 47SA1 opublikowanej 25 czerwca 1997, z których każdą załącza się tu w całości jako odniesienie.
Atenuowane wirusy wytworzone z użyciem genetyki odwrotnej można stosować w preparatach szczepionek i farmaceutycznych tu opisywanych. Techniki genetyki odwrotnej można także stosować do wprowadzania dodatkowych mutacji w innych genach wirusowych istotnych dla wytwarzania szczepionki, to jest do atenuowanego wirusa można wbudować epitopy użytecznych odmian szczepów do szczepionek. Alternatywnie, do atenuowanego szczepu można wbudować całkiem obce epitopy, włączając antygeny pochodzące od innych patogenów wirusowych lub niewirusowych. Przykładowo, do atenuowanego szczepu można wbudować antygeny niespokrewnionych wirusów, takich jak HIV (gp160, gp120, gp41), antygeny pasożytów (np. malarii), antygeny bakteryjne lub grzybowe albo antygeny nowotworowe. Alternatywnie, do chimerowych atenuowanych wirusów tu opisanych można wbudować epitopy, które zmieniają tropizm wirusa in vivo.
W alternatywnej postaci realizacji do skonstruowania atenuowanych wirusów posiadających pożądane epitopy w wirusach o segmentowanym RNA można użyć połączenie techniki genetyki odwrotnej i reasortacji. Przykładowo, atenuowany wirus (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę genetyki odwrotnej) oraz szczep niosący pożądany epitop szczepionki (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę genetyki odwrotnej), można koinfekować w gospodarzu, który pozwala na reasortację segmentowanych genomów.
Następnie, można wyselekcjonować formy z reasortowanym genomem, które posiadają zarówno fenotyp atentowany, jak i pożądany epitop.
Zmutowany może być również wirus DNA (np. krowianki, adenowirus, bakulowirus) lub wirus o dodatniej nici RNA (np. wirus polio). W takich przypadkach, można stosować techniki rekombinacji DNA, które są dobrze znane w dziedzinie (np. patrz patent US nr 4 769 330 Paoletti'ego, patent US nr 4 215 051 Smitha, które załącza się tu w całości jako odniesienie).
Zgodnie z wynalazkiem można skonstruować dowolnego wirusa, w tym, lecz bez ograniczenia, rodziny przedstawione tabeli 2 poniżej.
PL 212 316 B1
T a b e l a 2
Rodziny wirusów ludzkich i zwierzęcych
Cechy wirusa Rodzina wirusa
dsDNA z osłonką Poxviridae Irididoviridae Herpesviridae
Bez osłonki Adenoviridae Papovaviridae Hepadnaviridae
ssDNA bez osłonki Parvoviridae Reaoviridae
dsRNA bez osłonki Birnaviridae
ssRNA z osłonką genom o dodatniej polarności (sensowny brak etapu DNA w replikacji Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Wirus zapalenia wątroby typu C
Etap DNA w replikacji Retroviridae
Genom o ujemnej polarności (antysen- sowny) genom niesegmentowany Paramyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae
Genom segmentowany Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae
Bez osłonki Picornaviridae Caliciyiridae
Stosowane skróty: ds = podwójna nić; ss = pojedyncza nić; z osłonką = posiadający zewnętrzną podwójną warstwę lipidową pochodzącą z błony komórkowej gospodarza; genom sensowny = dla wirusów RNA, genomy, które składają się z sekwencji nukleotydowej podlegającej bezpośredniej translacji na rybosomach = dla wirusów DNA, genomy, które składając się z sekwencji nukleotydowych, które są takie same jak mRNA; genom antysensowny = genomy, które składają się z sekwencji nukleotydowej komplementarnej do nici sensownej.
Zgodnie z wynalazkiem opisano genetycznie zmodyfikowane wirusy grypy zawierające delecje i/lub skrócenia produktu genowego NS1. Szczególnie zalecane są mutanty NS1 wirusa grypy A i B. W jednym podejściu można zachować części regionu aminoterminalnego produktu genowego NS1, ale usunąć region C-terminalny produktu genowego NS1. Specyficzne pożądane mutacje można skonstruować poprzez insercję kwasu nukleinowego, delecję, lub mutację w odpowiednim kodonie. W szczególności, skrócone białka NS1 mają od 1-60 aminokwasów, 1-70 aminokwasów, 1-80 aminokwasów, 1-90 aminokwasów (aminokwas N-terminalny oznacza 1), a korzystnie 90 aminokwasów; od 1-100 aminokwasów; a zwłaszcza 99 aminokwasów; od 1-110 aminokwasów; od 1-120 aminokwasów; lub od 1-130 aminokwasów, a zwłaszcza 124 aminokwasy produktu dzikiego typu genu NS1.
Zgodnie z wynalazkiem brano także pod uwagę dowolnego genetycznie zmodyfikowanego wirusa grypy, w którym produkt genowy NS1 został zmodyfikowany przez skrócenie lub modyfikację białka NS1, które zmutowanym wirusom nadają następujące fenotypy: zdolność wirusów do wzrostu do wysokich mian w substratach niekonwencjonalnych, takich jak jaja kurze z 6-7 dniowymi zarodkami, lub zdolność wirusów do indukcji odpowiedzi interferonowej gospodarza. Dla wirusów grypy A, obejmują one, lecz bez ograniczenia, wirusy ze skróceniami NS1.
Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie naturalnie występujących zmutowanych wirusów grypy A lub B, mających fenotyp atenuowany, jak również szczepów wirusa grypy skonstruowanych tak, aby zawierały takie mutacje odpowiedzialne za fenotyp atenuowany. W przypadku wirusów grypy A obejmują one lecz bez ograniczenia: wirusy mające NS1 o 124 aminokwasach (Norton i inni, 1987, Virology 156: 204-213, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Dla wirusów grypy B obejmują one, lecz bez ograniczenia: wirusy posiadające mutację skrócenia NS1, zawierające 110 aminokwaPL 212 316 B1 sów pochodzących z końca N (B/201) (Norton i inni, 1987, Virology 156: 204-213, które załącza się tu w całości jako odniesienie) oraz wirusy mające mutację skrócenia NS1, obejmujące 89 aminokwasów pochodzących z końca C (B/AWBY-234) (Tobita i inni 1990 Virology 174: 314-19, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie naturalnie występujących mutantów analogicznych do NS1/38, NS1/80, NS1/124, (Egorov i inni, 1998, J. Virol. 72 (8): 6437-41) jak również naturalnie występujących mutantów, A/Turkey/ORE/71, B/201 lub B/AWBY-234.
Atenuowany wirus grypy można dodatkowo modyfikować tak, aby wykazywał ekspresję antygenów innych szczepów do szczepienia (np. przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji). Alternatywnie, atenuowany wirus grypy można skonstruować przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji z genetycznie zmodyfikowanymi wirusami tak, aby wykazywał ekspresję całkowicie obcych epitopów, np. antygenów innych patogenów zakaźnych, antygenów nowotworowych lub antygenów kierunkujących. Ponieważ segment RNA NS jest najkrótszy wśród ośmiu RNA wirusowych, możliwe jest, że RNA NS będzie tolerować dłuższe insercje sekwencji heterologicznych niż inne geny wirusowe. Ponadto, segment RNA NS kieruje syntezą dużych ilości białka w zakażonych komórkach, sugerując, że byłby to idealny segment do insercji obcych antygenów. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, każdy z ośmiu segmentów wirusów grypy można stosować do insercji sekwencji heterologicznych. Przykładowo, jeśli pożądana jest prezentacja antygenu powierzchniowego, można użyć segmenty kodujące białka strukturalne np. HA lub NA.
5.2 Układ selekcji w oparciu o restrykcję gospodarza
Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby selekcji wirusów, które posiadają pożądany fenotyp, czyli wirusów, które posiadają niską lub brak aktywności antagonistycznej wobec IFN, otrzymanych z naturalnych odmian, odmian spontanicznych (czyli odmian, które ewoluują podczas namnażania wirusa), mutagenizowanych naturalnych odmian, reasortantów i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Takie wirusy można najlepiej przesiewać w testach wzrostu różnicującego, które porównują wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN.
Wybiera się wirusy, które wykazują lepszy wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN; dogodnie wybiera się wirusy, które rosną do mian o co najmniej jeden logarytm wyższych w układach z niedoborem IFN w porównaniu z układem kompetentnym pod względem IFN.
Alternatywnie, wirusy można przesiewać przy użyciu układów testowych IFN, np. układów testowych opartych na transkrypcji, w których ekspresja genu reporterowego jest kontrolowana przez promotor odpowiadający na IFN. W celu identyfikacji wirusów, które skutecznie indukują odpowiedź wobec IFN, lecz które są niezdolne do antagonizacji odpowiedzi IFN można mierzyć ekspresję genu reporterowego w komórkach zakażonych względem niezakażonych. Jednak w zalecanej postaci realizacji, stosuje się testy wzrostu różnicującego do selekcji wirusów, mających żądany fenotyp, ponieważ stosowany układ gospodarza (kompetentny pod względem IFN względem układu z niedoborem IFN) stosuje odpowiednią presję selekcyjną.
Przykładowo, wzrost wirusa (mierzony przez miano) można porównać w różnych komórkach, liniach komórkowych lub zwierzęcych układach modelowych, które wykazują ekspresję IFN oraz składników odpowiedzi IFN. W tym celu, można porównać wzrost wirusa w liniach komórkowych, jak linie VERO (które wykazują niedobór IFN) względem komórek MDCK (które są kompetentne pod względem IFN). Alternatywnie, można otrzymać i ustalić linie komórkowe z niedoborem IFN od zwierząt hodowanych lub genetycznie zmodyfikowanych tak, aby wykazywały niedobór w układnie IFN (np. zmutowane myszy STAT1-/-). Można mierzyć wzrost wirusa w takich liniach komórkowych, w porównaniu z komórkami kompetentnymi pod względem IFN, otrzymanymi np. od zwierząt dzikiego typu (np. myszy dzikiego typu). W jeszcze innej postaci realizacji można skonstruować linie komórkowe, które są kompetentne pod względem IFN i wiadomo, że podtrzymują wzrost wirusa dzikiego typu tak, aby wykazywały niedobór IFN (np. przez nokaut STAT1, IRF3, PKR itd). Można stosować techniki, które są dobrze znane w dziedzinie namnażania wirusów w liniach komórkowych (patrz np. przykłady działania poniżej). Można porównać wzrost wirusa w standardowej kompetentnej pod względem IFN linii komórkowej względem genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej z niedoborem IFN.
Można także stosować układy zwierzęce. Przykładowo, dla grypy można porównać wzrost w jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN, np. około 6 do 8-dniowych, ze wzrostem w jajach kurzych z zarodkami kompetentnymi pod względem IFN, np. około 10 do 12-dniowych.
W tym celu można stosować techniki dobrze znane w dziedzinie do zakażania i namnażania w jajach (np. patrz przykłady działania poniżej). Alternatywnie, można porównać wzrost u myszy
PL 212 316 B1 z niedoborem IFN STAT1-/-, z myszami dzikiego typu kompetentnymi pod względem IFN. W jeszcze innej realizacji można porównać wzrost w zarodkach kurzych z niedoborem IFN wytworzonych przez np. transgeniczny drób STAT1-/-, ze wzrostem w jajach kompetentnych pod względem IFN wytworzonych przez drób dzikiego typu.
Jednak do celów skriningu można stosować układy krótkotrwałe z niedoborem IFN, zamiast układów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, układ gospodarza można traktować związkami, które hamują wytwarzanie IFN i/lub składników odpowiedzi IFN (np. leki, przeciwciała przeciwko IFN, przeciwciała przeciwko receptorowi IFN, inhibitory PKR, cząsteczki antysensowne i rybozymy, itd). Wzrost wirusa można porównać w nietraktowanych kontrolach kompetentnych pod względem IFN względem układów traktowanych z niedoborem IFN. Przykładowo, starsze jaja kompetentne pod względem IFN można wstępnie traktować takimi lekami przed zakażeniem przesiewanym wirusem. Wzrost porównuje się ze wzrostem uzyskanym w nietraktowanych jajach kontrolnych w tym samym wieku.
Sposoby skriningu tu opisane zapewniają prosty i łatwy przesiew w celu identyfikacji zmutowanych wirusów o zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez niezdolność zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku odpowiadającym na IFN, w porównaniu ze zdolnością zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku z niedoborem IFN. Sposoby skriningu tu opisane można także stosować do identyfikacji zmutowanych wirusów o zmienionej, lecz nie zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez pomiar zdolności zmutowanego wirusa do wzrostu zarówno w odpowiadających na IFN, np. 10-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach MDCK jak i środowiskach z niedoborem IFN, np. 6 do 7-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach VERO. Przykładowo, wirusy grypy wykazujące o co najmniej jeden logarytm niższe miana w 10-dniowych zarodkach w stosunku do 6-7-dniowych zarodków, będą uważane za posiadające zakłóconą zdolność do hamowania odpowiedzi wobec IFN. W innym przykładzie, wirusy grypy wykazujące o co najmniej jeden logarytm niższe miano u 12-dniowych zarodków (które wykazują niską odpowiedź wobec IFN) w stosunku do 10-dniowych zarodków (które wykazują średnią odpowiedź wobec IFN) uznaje się za częściowo zakłóconą pod względem zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN i uznaje się za atrakcyjnych kandydatów do szczepionki.
Sposoby selekcji tu opisane obejmują także identyfikację tych zmutowanych wirusów, które indukują odpowiedzi wobec IFN. Zgodnie ze sposobami selekcji tu opisanymi indukcję odpowiedzi wobec IFN można mierzyć przez testowanie poziomu ekspresji IFN lub ekspresji genów docelowych lub genów reporterowych indukowanych przez IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem lub aktywacji transaktywatorów związanych z ekspresją IFN i/lub odpowiedzią IFN.
Indukcję odpowiedzi IFN można określać przez pomiar stanu fosforylacji składników szlaku IFN po zakażeniu testowanym zmutowanym wirusem, np. IRF-3, który jest ufosforylowany w odpowiedzi na podwójną nić RNA. W odpowiedzi na IFN typu I, następuje szybka fosforylacja tyrozyny kinazy Jaki i kinazy TyK2, podjednostek receptora IFN, STAT1 i STAT2. Tak więc, w celu określenia czy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN, komórki, takie jak komórki 293, zakaża się testowanym zmutowanym wirusem i po infekcji komórki poddaje się lizie. Składniki szlaku IFN, takie jak kinaza Jaki lub kinaza TyK2, poddaje się immunoprecypitacji z lizatów zakażonych komórek, przy użyciu specyficznych surowic poliklonalnych lub przeciwciał i określa stan fosforylacji tyrozyny kinazy, przez testy odcisku immunologicznego z użyciem przeciwciała antyfosfotyrozynowego (np. patrz Krishnan i inni 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305). Stan zwiększonej fosforylacji jakiegokolwiek składnika szlaku IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem będzie wskazywać na indukcję odpowiedzi IFN przez zmutowanego wirusa.
Układy selekcyjne tu opisane obejmują pomiar zdolności do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcji indukowanej w odpowiedzi na infekcje wirusową, np. IRF3, STAT1, STAT2, itd. W szczególności, STAT1 i STAT2 są ufosforylowane i translokowane z cytoplazmy do jądra, w odpowiedzi na IFN typu I. Zdolność do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcji można mierzyć technikami znanymi fachowcom, np. testami EMSA (ang. electromobility shift assay), barwienia komórek, itd.
Indukcję odpowiedzi IFN można określić przez pomiar aktywacji transkrypcji zależnej od IFN po zakażeniu testowym zmutowanym wirusem. Ekspresję genów, o których wiadomo, że są indukowane przez IFN, np. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylanosyntetazy, głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I, itd., można analizować technikami znanymi fachowcom (np. northern blot, western blot,
PCR itd.).
PL 212 316 B1
Alternatywnie, testowane komórki, takie jak ludzkie komórki zarodkowe nerek lub ludzkie komórki mięsaka kościotwórczego, modyfikuje się tak, aby wykazywały krótkotrwałą lub konstytutywną ekspresję genów reporterowych, takich jak gen reporterowy lucyferazy lub gen reporterowy transferazy chloramfenikolowej (CAT) pod kontrolą elementu odpowiedzi stymulowanej IFN, takiego jak promotor stymulowany IFN genu ISG-54K (Bluyssen i inni 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395-402). Komórki zakaża się testowym zmutowanym wirusem i poziom ekspresji genu reporterowego porównuje z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi wirusem dzikiego typu. Zwiększenie poziomu ekspresji genu reporterowego po zakażeniu testowym wirusem będzie wskazywać, że testowy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN.
Układy selekcyjne tu opisane obejmują pomiar indukcji IFN przez określenie, czy ekstrakt z komórek lub jaj zakażonych testowym zmutowanym wirusem jest zdolny do nadawania aktywności zabezpieczającej przeciw infekcji wirusowej. Konkretniej, grupy 10-dniowych jaj z zarodkami zakaża się testowym zmutowanym wirusem lub wirusem dzikiego typu. Około 15 do 20 godzin po zakażeniu, zbiera się płyn omoczniowy i testuje pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przed infekcją VSV w komórkach hodowli tkankowej, takiej jak komórki CEF.
5.3 Namnażanie wirusa w substratach wzrostowych z niedoborem interferonu
Do hodowli i izolacji naturalnie występujących lub zmodyfikowanych zmutowanych wirusów posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną IFN można stosować także sposoby i substraty z niedoborem IFN. Substraty z niedoborem IFN, które można stosować do podtrzymywania wzrostu atenuowanych zmutowanych wirusów, obejmują, lecz bez ograniczenia, naturalnie występujące komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja z zarodkami, które wykazują niedobór IFN, np. komórki Vero, młode jaja z zarodkami; rekombinowane komórki lub linie komórkowe, które są tak zmodyfikowane, aby wykazywały niedobór IFN, np. linie komórkowe z niedoborem IFN pochodzące z myszy z wyłączonym STAT1 lub innych podobnie zmodyfikowanych zwierząt transgenicznych; jaja z zarodkami otrzymane od ptaków z niedoborem IFN, zwłaszcza drobiu (np. kur, kaczek, indyków), łącznie ze stadem, które jest tak hodowane, aby wykazywało niedobór IFN lub ptaków transgenicznych (np. nokautów STAT1). Alternatywnie, układ komórek gospodarza, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można genetycznie zmodyfikować tak, aby wykazywały ekspresję transgenów, kodujących inhibitory układu IFN, np. dominujące mutanty ujemne, takie jak STAT1 bez domeny wiążącej DNA, antysensowny RNA, rybozymy, inhibitory wytwarzania IFN, inhibitory sygnału IFN i/lub inhibitory genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Należy pamiętać, że zwierzęta, które są hodowane lub genetycznie zmodyfikowane tak, aby wykazywały niedobór IFN, będą wykazywać nieco obniżoną odporność immunologiczną, i powinny być utrzymywane w kontrolowanym środowisku pozbawionym chorób. Tak więc, należy przedsięwziąć odpowiednie środki (włączając stosowanie antybiotyków w diecie), aby ograniczyć ryzyko ekspozycji na czynniki zakaźne zwierząt transgenicznych z niedoborem IFN, takich jak stada kur hodowlanych, kaczek indyków, itd. Alternatywnie, układ gospodarza, np. komórki, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta, można traktować związkiem, który hamuje wytwarzanie IFN i/lub szlak IFN, np. lekami, przeciwciałami, cząsteczkami antysensownymi, cząsteczkami rybozymowymi ukierunkowanymi na gen STAT1 i/lub genami antywirusowymi indukowanymi przez IFN.
Niedojrzałe jaja kurze z zarodkami obejmują jaja, które naturalnie są w wieku poniżej dziesięciu dni, dogodnie sześć do dziewięciu dni; oraz jaja, które sztucznie naśladują niedojrzałe jaja w wieku poniżej dziesięciu dni, w wyniku zmian warunków wzrostu, np. zmian temperatury inkubacji, co powoduje opóźniony rozwój jaj tak, że układ IFN jaja nie jest w pełni rozwinięty w porównaniu z jajami 10- do 12-dniowymi.
5.3.1 Naturalne substraty z niedoborem IFN
Naturalnie występujące i zmodyfikowane zmutowane wirusy tu opisane mogą być namnażane w niekonwencjonalnych substratach, takich jak niedojrzałe jaja z zarodkami, które jeszcze nie wykształciły układu IFN. Niedojrzałych jaj z zarodkami nie stosuje się zazwyczaj do hodowli wirusów, z powodu ich delikatności i mniejszej objętości omoczni. Niniejszy wynalazek obejmuje hodowlę zmutowanych wirusów w zarodkach mniej niż 10-dniowych; korzystnie hodowlę zmutowanego wirusa w 8-dniowych zarodkach i najkorzystniej w 6- do 8-dniowych zarodkach.
Niniejszy wynalazek obejmuje także sposoby hodowli i izolacji zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w komórkach i liniach komórkowych, które naturalnie nie posiadają szlaku IFN lub wykazują niedobór szlaku IFN lub niedobory w szlaku IFN, np. niski poziom ekspresji IFN w porównaniu z komórkami dzikiego typu. W szczególnie zalecanej postaci
PL 212 316 B1 wynalazku, niniejszy wynalazek odnosi się do sposobów hodowli zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w komórkach Vero.
5.3.2 Genetycznie zmodyfikowane substraty z niedoborem IFN
Niniejszy wynalazek odnosi się do sposobów hodowli i izolowania zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w genetycznie zmodyfikowanym substracie z niedoborem IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje transgeniczne ptactwo, u którego zmutowano gen zasadniczy dla układu IFN, np. STAT1, które będą składać jaja z niedoborem IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje dodatkowo transgeniczne ptactwo, które wykazuje ekspresję dominujących ujemnych czynników transkrypcyjnych, np. braku domeny wiążącej DNA STAT1, rybozymów, antysensownego RNA, inhibitorów wytwarzania IFN, inhibitorów sygnalizacji IFN i inhibitorów genów antywirusowych indukowanych w odpowiedzi na IFN. Korzyść ze stosowania jaj od transgenicznego ptactwa z niedoborem IFN jest taka, że do hodowli wirusa można stosować konwencjonalne 10-dniowe jaja, które są stabilniejsze i mają większą objętość z powodu większego rozmiaru. W jeszcze innej postaci realizacji można skonstruować linie komórkowe tak, aby wykazywały niedobór IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje linie komórkowe, w których mutuje się geny zasadnicze do syntezy IFN, szlaku IFN i/lub genu (genów) antywirusowego indukowanego przez IFN, np. STAT1.
Substraty z niedoborem testosteronu obejmują rekombinowane linie komórkowe lub zwierzęta, w szczególności ptaki, w których jeden lub więcej genów zasadniczych dla szlaku IFN, np. receptor interferonowy STAT1, itd., został przerwany, czyli jest „nokautowany”; zwierzęciem rekombinowanym może być dowolne zwierzę i obejmuje to ptaka, np. kurczaka, indyka, kurę, kaczkę, itd. (patrz np. Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry i inni 1993, Trasgenic Res. 2: 125; Stern, C. D. 1996, Curr. Top Microbiol. Immunol. 212: 195-206; oraz Shuman, 1991, Experimentia 47: 897 w celu przeglądu dotyczącego wytwarzania ptaków transgenicznych, załączone tu w całości jako odniesienie). Taką linię komórkową lub zwierzę można wytworzyć każdą metodą znaną w dziedzinie do przerywania genu na chromosomie komórki lub zwierzęcia. Takie techniki obejmują, lecz bez ograniczenia, mikroiniekcję do przedjądrzy (Hoppe i Wagner, 1989, opis patentowy nr 4 873 191); przenoszenie genu za pośrednictwem retrowirusa do linii zarodkowych (Van der Putten i inni, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152); celowanie genowe w zarodkowych komórkach macierzystych (Thompson i inni, 1989, Cell 56: 313); elektroporację zarodków (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803); oraz przenoszenie genu za pośrednictwem nasienia (Lavitrano i inni, 1989, Cell 57: 717); itd. Dla przeglądu takich technik - patrz Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171, który załącza się tu w całości jako odniesienie.
W szczególności, zwierzę z wyłączonym STAT1, można wytworzyć przez pobudzenie rekombinacji homologicznej między genem STAT1 w jego chromosomie i egzogennym genem STAT1, który unieczynniono biologicznie (np. przez insercje sekwencji heterologicznej, np. genu oporności na antybiotyk). Metody rekombinacji homologicznej do przerywania genów w genomie myszy opisano np. u Capecchi (1989, Science, 244: 1288) i Mansour i inni (1988, Nature 336: 348).
W skrócie, całość lub część klonu genomowego STAT1 izoluje się z genomowego DNA z tego samego gatunku, jak znokautowana komórka lub zwierzę. Klon genomowy STAT1 można izolować dowolną metodą znaną w dziedzinie do izolacji klonów genomowych (np. przez sondowanie biblioteki genomowej sondą pochodzącą z sekwencji STAT1, taką jak sekwencje dostarczone do wglądu przez Meraz i innych 1996, Cell 84: 431; Durbin i innych 1996, Cell 84: 443 i odniesienia tam cytowane). Po wyizolowaniu klonu genomowego, całość lub część klonu wprowadza się do rekombinowanego wektora. W pewnych przypadkach część klonu wprowadzanego do wektora zawiera co najmniej część egzonu genu STAT1, czyli zawiera sekwencję kodującą białko STAT1. Następnie do egzonu genu STAT1 wprowadza się sekwencję niehomologiczną do sekwencji STAT1, zwłaszcza dodatni marker selekcyjny, taki jak gen kodujący oporność na antybiotyk. Marker selekcyjny jest dogodnie operacyjnie związany z promotorem, dogodniej promotorem konstytutywnym. Sekwencję nie homologiczną wprowadza się gdziekolwiek w sekwencji kodującej STAT1, co będzie przerywać aktywność STAT1, np. w pozycji, w której mutacje punktowe lub inne mutacje inaktywują, jak przedstawiono, działanie białka STAT1. Przykładowo, lecz bez ograniczenia, sekwencję nie homologiczną można wprowadzić do sekwencji kodującej część białka STAT1, zawierającą całość lub część domeny kinazy (np. sekwencji kodującej co najmniej 50, 100, 150, 200 lub 250 aminokwasów domeny kinazy).
Dodatnim markerem selekcyjnym jest dogodnie gen oporności na neomycynę (gen neo) lub gen oporności na higromycynę (gen hygro). Promotorem może być dowolny promotor znany w dziedzinie; np. promotorem może być promotor kinazy fosfoglicerynianowej (PGK) (Adra i inni, 1987, Gene 60:
PL 212 316 B1
65-74), promotor PolII (Soriano i inni, 1991 Cell 64: 693-701) lub promotor MCI, który jest promotorem syntetycznym przeznaczonym do ekspresji w zarodkowych komórkach macierzystych (Thomas i Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512). Zastosowanie markera selekcyjnego, takiego jak gen oporności na antybiotyk, pozwala na selekcję komórek, do których wprowadzono wektor celujący (np. ekspresja produktu genu neo nadaje oporność na G418, a ekspresja produktu genu hygro nadaje oporność na higromycynę).
W zalecanej postaci realizacji ujemny marker selekcyjny dla etapu selekcji przeciwnej do homologicznej rekombinacji wektora, w przeciwieństwie do nie homologicznej, wprowadza się na zewnątrz insertu klonu genomowego STAT1. Przykładowo, takim ujemnym markerem selekcyjnym jest gen kinazy tymidynowej HSV (HSV-tk), którego ekspresja uwrażliwia komórki na gancyklowir. Ujemny marker selekcyjny znajduje się dogodnie pod kontrolą promotora, takiego jak, lecz bez ograniczenia, promotor PGK, promotor PolII lub promotor MCI.
Gdy nastąpi rekombinacja homologiczna, części wektora, które są homologiczne do genu STAT1, jak również nie homologiczny insert wewnątrz sekwencji genu STAT1, wprowadza się do genu STAT1 w chromosomie, a pozostałość wektora traci się. Tak więc, ze względu na to, że ujemny marker selekcyjny znajduje się na zewnątrz regionu homologii z genem STAT1, komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna (lub ich potomstwo), nie będą zawierać ujemnego markera selekcyjnego. Przykładowo, jeśli ujemnym markerem selekcyjnym jest gen HSV-tk, komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna nie będą wykazywały ekspresji kinazy tymidynowej i przeżyją ekspozycję na gancyklowir. Procedura ta pozwala na selekcję komórek, w których zaszła rekombinacja homologiczna w porównaniu z rekombinacją nie homologiczną, w której prawdopodobnie ujemny marker selekcyjny jest także wprowadzony do genomu razem z sekwencjami STAT1 i dodatnim markerem selekcyjnym. Tak więc, komórki, w których zaszła rekombinacja nie homologiczną będą najprawdopodobniej wykazywać ekspresję kinazy tymidynowej i będą wrażliwe na gancyklowir.
Po wytworzeniu wektora celującego, linearyzuje się go z użyciem enzymu restrykcyjnego, dla którego istnieje unikalne miejsce w wektorze celującym i linearyzowany wektor wprowadza się do zarodkowych komórek macierzystych (ES) (Gossler i inni 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069) dowolną metodą znaną w dziedzinie, np. przez elektroporację. Jeśli wektor celujący zawiera dodatni marker selekcyjny oraz ujemny marker selekcji przeciwnej, komórki ES, w których zaszła rekombinacja homologiczna można wyselekcjonować przez inkubację w pożywkach selekcyjnych. Przykładowo, jeśli markery selekcyjne są genem oporności neo i genem HSV-tk, komórki są poddawane ekspozycji na G418 (np. około 300 μg/ml) i gancyklowir (np. około 2 μΜ).
W celu potwierdzenia, że przerwane sekwencje STAT1 rekombinowały homologicznie do genu STAT1 w genomie komórek ES, można stosować każdą technikę znaną w dziedzinie do genotypowania, przykładowo, lecz bez ograniczenia, analizę Southern blot lub łańcuchową reakcję polimerazy. Ze względu na to, że mapa restrykcyjna klonu genomowego STAT1 jest znana i znane są sekwencje kodujące sekwencję STAT1 (patrz Meraz i inni 1996, Cell 84: 431; Durbin i inni 1996, Cell 84: 443-450, wszystkie cytowane tam odniesienia), można określić wielkość poszczególnych fragmentów restrykcyjnych lub produktów powielania PCR wytworzonych z DNA zarówno od przerwanych, jak i nieprzerwanych alleli. Tak więc, testując pod kątem fragmentu restrykcyjnego lub produktu PCR, którego wielkość różni się w przypadku przerwanego genu STAT1 i nieprzerwanego, można określić czy zaszła rekombinacja homologiczna przerywająca gen STAT1.
Następnie, komórki ES z przerwanym lokusem STAT1, można wprowadzić do blastocyst przez mikroiniekcję, a potem blastocysty można wszczepić do macic myszy będących w ciąży rzekomej, stosując rutynowe techniki. Zwierzę, które rozwinie się z wszczepionej blastocysty, jest chimerowe pod względem przerwanego allelu. Chimerowe samce można krzyżować z samicami i taką krzyżówkę można tak zaplanować, aby transmisja linii zarodkowej allelu łączyła się z transmisją pewnej barwy powlekającej. Transmisję linii zarodkowej allelu można potwierdzić poprzez Southern blotting lub analizę PCR, jak opisano powyżej, genomowego DNA wyizolowanego z próbek tkanek.
5.3.3 Krótkotrwałe substraty z niedoborem IFN
Komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja, można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN. Związki, które hamują syntezę IFN, albo aktywność, albo ekspresję składników układu IFN, można stosować do wstępnego traktowania IFN gospodarza, np. związki, które hamują syntezę IFN, aktywność IFN, receptor IFN, inne cele w szlaku przenoszenia sygnału IFN lub które hamują aktywność genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Przykładami związków, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem są, lecz bez ograniczenia, cząsteczki kwasu nukleinowe18
PL 212 316 B1 go, przeciwciała, peptydy, antagoniści receptora IFN, inhibitory szlaku STAT1, inhibitory PKR, itd. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują cząsteczki antysensowne, rybozymy i cząsteczki o potrójnej helisie, które celują w geny, kodujące zasadnicze składniki układu IFN, np. STAT1. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują także nukleotydy kodujące dominujące mutanty ujemne składników układu IFN; np. przed infekcją mutantem wirusowym, komórki można transfekować DNA, kodującym skrócony mutant receptora IFN niekompetentny pod względem sygnału.
Dominujące mutanty ujemne, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem do hamowania szlaku IFN obejmują wersje z niedoborem kinazy Jak1, TyK2 lub czynniki transkrypcyjne bez domen wiążących DNA STAT1 oraz STAT2 (patrz np. Krishman i inni 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305).
5.4 Preparaty szczepionki
Zgodnie z wynalazkiem opisano preparaty szczepionek zawierające atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA, mające zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi IFN oraz odpowiedni nośnik. Wirus stosowany w preparacie szczepionki można wybrać spośród naturalnie występujących mutantów lub odmian, wirusów mutagenizowanych lub genetycznie zmodyfikowanych. Szczepy atenuowane wirusów o segmentowanym RNA można także wytworzyć przez techniki reasortacji lub stosując połączenie technik podejścia genetyki odwrotnej i reasortacji. Naturalnie występujące odmiany obejmują wirusy wyizolowane z natury, jak również odmiany spontanicznie występujące, wytworzone podczas namnażania wirusa, posiadające zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi komórkowej IFN. Atenuowany wirus można stosować sam jako składnik aktywny w preparacie szczepionki. Alternatywnie, atenuowany wirus można stosować jako wektor lub „szkielet” szczepionek wytworzonych w sposób rekombinowany. W tym celu można stosować techniki rekombinacji, takie jak odwrotna genetyka (lub dla wirusów segmentowanych, połączenia genetyki odwrotnej i technik reasortacji), aby skonstruować mutacje lub wprowadzić obce antygeny do atenuowanego wirusa stosowanego w preparacie szczepionki. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów lub alternatywnie, przeciw całkiem innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym.
W rzeczywistości, do wirusów tu opisanych można wbudować dowolną sekwencję genu heterologicznego do stosowania w szczepionkach. Dogodnie epitopy, które indukują zabezpieczającą odpowiedź immunologiczną wobec dowolnego z różnych patogenów, lub antygeny, które wiążą przeciwciała neutralizujące, mogą podlegać ekspresji przez wirusy lub ich część. Przykładowo, heterologiczne sekwencje genowe, które można, wbudować w wirusy tu opisane do zastosowania w szczepionkach obejmują, lecz bez ograniczenia, epitopy ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), taki jak gp120; antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg); glikoproteiny wirusa opryszczki (np. gD, gE); VP1 poliowirusa, determinanty antygenowe patogenów nie wirusowych, takich jak bakterie i pasożyty. W innej postaci realizacji może zachodzić ekspresja całości lub części genów immunoglobulin. Przykładowo, w wirusach tu opisanych można wbudować regiony zmienne immunoglobulin antyidiotypowych, które naśladują takie epitopy. W jeszcze innej postaci realizacji może zachodzić ekspresja antygenów związanych z nowotworem.
Można opracowywać albo żywe rekombinowane szczepionki wirusowe, albo inaktywowane rekombinowane szczepionki wirusowe. Żywe szczepionki mogą być zalecane, ponieważ namnożenie w gospodarzu prowadzi do przedłużenia bodźca podobnego rodzaju i natężenie bodźca występującego przy naturalnych infekcjach, a zatem nadaje zasadniczą, długotrwałą odporność. Wytwarzanie takich żywych rekombinowanych preparatów szczepionek wirusowych można osiągnąć przez użycie konwencjonalnych metod obejmujących namnożenie wirusa w hodowli komórkowej lub omoczni zarodków kurzych, a następnie oczyszczenie.
Preparaty szczepionki mogą zawierać genetycznie zmodyfikowane wirusy o ujemnej nici RNA, które mają mutacje w genie NS1 lub analogicznym, w tym bez ograniczenia, mutanty grypy o skróconym NS1 opisane w poniższych przykładach. Można je także opracowywać przy użyciu naturalnych odmian grypy A, tak jak naturalna odmiana grypy A A/turkey/Ore/71 lub B/201 i B/AWBY-234, które są naturalnymi odmianami grypy B.
Po opracowaniu postaci żywej szczepionki wirusowej należy stosować zakres wynoszący około
104 pfu do około 5 x 106 pfu na dawkę.
Do wprowadzania preparatu szczepionki opisanego powyżej można stosować wiele metod, obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórna, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Zalecane jest wprowadzanie preparatu szczepionki wiPL 212 316 B1 rusowej poprzez naturalną drogę zakażenia patogenem, dla którego przeznaczona jest szczepionka, lub poprzez naturalną drogę zakażenia rodzicielskiego wirusa atenuowanego. Przy stosowaniu preparatu żywej szczepionki wirusowej zalecane jest wprowadzanie preparatu poprzez naturalną drogę infekcji wirusem grypy. Dogodnie można wykorzystać zdolność wirusa grypy do indukcji energicznej komórkowej odpowiedzi wydzielniczej i odpornościowej. Przykładowo, zakażenie dróg oddechowych wirusami grypy może indukować silną wydzielniczą odpowiedź immunologiczną, np. w układzie moczopłciowym, przy współistniejącym zabezpieczeniu przed specyficznymi czynnikami powodującymi chorobę. Szczepionkę tu opisaną zawierającą 104-5 x 106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podać jednorazowo. Alternatywnie, szczepionkę tu opisaną zawierającą 104-5 x 106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podawać dwukrotnie lub trzykrotnie z przerwą od 2 do 6 miesięcy, tak często jak potrzeba, zwierzęciu, w szczególności ssakowi, a zwłaszcza człowiekowi.
5.5 Kompozycje farmaceutyczne
Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje farmaceutyczne zawierające zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, do zastosowania jako środki antywirusowe lub środki antynowotworowe, lub jako środki przeciw chorobom wrażliwym na IFN. Kompozycje farmaceutyczne mogą być stosowane profilaktycznie antywirusowo i można je podawać osobnikom, którzy są zagrożeni zakażeniem lub którzy będą poddani ekspozycji na wirusa. Przykładowo, w przypadku dziecka wracającego do domu ze szkoły, w której kontaktowało się ono z kilkoma kolegami zakażonymi grypą, rodzice mogliby podać antywirusową kompozycję farmaceutyczną sobie, dziecku i innym członkom rodziny, w celu zapobiegnięcia infekcji wirusowej i późniejszej chorobie. Leczeni mogą być także ludzie podróżujący do części świata, gdzie powszechne są pewne choroby zakaźne (np. wirus zapalenia wątroby typu A, malaria, itd.). Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne można stosować do leczenia nowotworów lub profilaktyki tworzenia nowotworu, np. u pacjentów, którzy mają raka lub u których istnieje wysokie ryzyko rozwinięcia nowotworu lub raka. Przykładowo, pacjenci z rakiem mogą być leczenie w celu zapobiegania dalszemu tworzeniu się nowotworu. Alternatywnie, leczone mogą być podmioty, które są poddane lub mogą być poddane ekspozycji na substancje rakotwórcze; leczone mogą być osobniki związane z oczyszczaniem środowiska, które mogą się stykać z zanieczyszczeniami (np. azbestem). Alternatywnie, osobniki, które mają być poddane ekspozycji na promieniowanie można leczyć przed ekspozycją i po niej (np. pacjenci poddawani ekspozycji na wysokie dawki promieniowania lub którzy muszą brać leki rakotwórcze).
Zastosowanie atenuowanych wirusów tu opisanych jako środków antyrakowych opiera się na stwierdzeniu twórców wynalazku, że atenuowany mutant wirusa grypy z delecją w genie antagonizującym IFN jest zdolny do zmniejszania tworzenia nowotworu u myszy. Właściwości przeciwnowotworowe tu opisane mogą być co najmniej częściowo związane ze zdolnością do wzrostu w komórkach nowotworowych i zabijania ich, o których wiadomo, że w wielu przypadkach mają niedobory w układzie IFN. Bez względu na mechanizm (mechanizmy) molekularny odpowiedzialny za właściwości przeciwnowotworowe, atenuowane wirusy według wynalazku można by stosować do leczenia lub profilaktyki powstawania nowotworów. Zmutowane wirusy o zmienionym fenotypie antagonistycznym wobec IFN mogą być wycelowane w konkretne narządy, tkanki i/lub komórki w organizmie, w celu indukcji miejscowego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Zaletą takiego podejścia jest to, że wirusy indukujące IFN tu opisane są ukierunkowane na konkretne miejsca, np. lokalizacji nowotworu, aby indukować IFN w sposób specyficzny dla miejsca, raczej w celu wywołania efektu terapeutycznego niż układowej indukcji IFN, która może mieć skutki toksyczne.
Zmutowane wirusy indukujące IFN tu opisane można skonstruować stosując metody tu opisane do ekspresji białek lub peptydów, które nakierowywałyby wirusy do poszczególnych miejsc. W zalecanej postaci realizacji wirusy indukujące IFN można ukierunkować na miejsca nowotworowe. W takiej postaci realizacji zmutowane wirusy można zmodyfikować do ekspresji miejsca łączenia antygenu z przeciwciałem, które rozpoznaje antygen specyficzny dla nowotworu, kierując w ten sposób wirus indukujący IFN do nowotworu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy nowotwór wykazuje ekspresję receptora hormonu, tak jak guzy sutka lub jajnika, które wykazują ekspresję receptorów estrogenowych, wirus indukujący IFN można zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego hormonu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy nowotwór wykazuje ekspresję receptora czynnika wzrostu, np. VEGF, EGF lub PDGF, wirus indukujący IFN, można zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego czynnika wzrostu lub jego części. Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, wirusy indukujące IFN można tak zmodyfikować, aby wykazywały ekspresję dowolnego doce20
PL 212 316 B1 lowego produktu genowego, włączając peptydy, białka, takie jak enzymy, hormony, czynniki wzrostu, antygeny lub przeciwciała, które będą ukierunkowywać wirusa na miejsce potrzebujące aktywności antywirusowej, antybakteryjnej, antydrobnoustrojowej lub antynowotworowej.
Sposoby wprowadzania obejmują, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Kompozycje farmaceutyczne tu opisane można podawać jakąkolwiek dogodną drogą, np. przez infuzję lub iniekcję w jednej dużej dawce, przez absorpcję przez nabłonek lub śluzówkę (np. śluzówkę jamy ustnej, odbytu i jelita, itd.) oraz można je podawać razem z innymi czynnikami biologicznie aktywnymi. Podawanie może być układowe lub miejscowe. Oprócz tego, w zalecanej postaci realizacji, może być pożądane wprowadzenie kompozycji farmaceutycznych tu opisanych do płuc, każdą odpowiednią drogą. Podawanie dopłucne można także zrealizować np. stosując inhalator lub nebulizator oraz preparat ze środkiem aerozolowym.
W specyficznej postaci realizacji może być pożądane podawanie kompozycji farmaceutycznych tu opisanych miejscowo do obszaru wymagającego leczenia; można to osiągnąć np., lecz bez ograniczenia, przez infuzję miejscową podczas operacji, nałożenie na powierzchnię, np. w połączeniu z opatrunkiem na ranę po operacji, przez iniekcję, za pomocą cewnika, za pomocą czopka lub za pomocą implantu, przy czym wymieniony implant jest materiałem porowatym, nie porowatym lub żelowym, włączając błony, takie jak błony lub włókna sialastyczne. W jednej postaci realizacji podawanie może następować przez bezpośrednią iniekcję w miejscu (lub poprzednim miejscu) guza złośliwego lub nowotworowego lub tkanki przednowotworowej.
W jeszcze innej postaci realizacji kompozycję farmaceutyczną można dostarczać w układzie kontrolowanego uwalniania. W jednej postaci realizacji można stosować pompę (patrz Langer jak wyżej; Sefton, 1987 CRC Crit, Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwalf i inni, 1980, Surgery 88: 507; Saudek i inni, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). W innej postaci realizacji można stosować materiały polimeryczne (patrz Medical Applications of Controlled Release Langer i Wise (wydawcy), CRC Press., Boca Raton, Floryda (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen i Ball (wydawcy), Wiley, Nowy Jork (1984); Ranger i Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; patrz także Levy i inni, 1985, Science, 228: 190; During i inni, 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard i inni, 1989, J. Neurosurg. 71: 105). W jeszcze innej postaci realizacji układ kontrolowanego uwalniania można umieścić w pobliżu miejsca docelowego kompozycji, czyli płuca, co wymaga podania jedynie części dawki układowej (patrz np. Goodson, 1984, w Medical Application of Controlled Release, jak wyżej, tom 2, strony 115-138). Inne układy kontrolowanego uwalniania omawia się w przeglądzie Langera (1990, Science, 249:1527- 1533).
Kompozycje farmaceutyczne tu opisane obejmują terapeutycznie skuteczną ilość atenuowanego wirusa oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W konkretnej postaci realizacji określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” oznacza zaakceptowany przez federalną lub rządową agencję prawodawczą, lub wymieniony w farmakopei amerykańskiej albo innej generalnie uznawanej farmakopei do stosowania u zwierząt, a szczególnie u ludzi. Określenie „nośnik” odnosi się do rozcieńczalnika, adiuwanta, zaróbki lub podłoża, z którym podaje się kompozycję farmaceutyczną.
Jako nośniki płynne można wykorzystać także roztwory soli i wodne roztwory dekstrozy i glicerolu, szczególnie do roztworów do iniekcji. Odpowiednimi zaróbkami farmaceutycznymi są skrobia, glukoza, laktoza, sacharoza, żelatyna, słód, ryż, mąka, kreda, żel krzemionkowy, stearynian sodowy, monostearynian glicerolu, talk, chlorek sodu, sproszkowane mleko odtłuszczone, glicerol, glikol propylenowy, woda, etanol i temu podobne. Kompozycje te mogą przybierać postać roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów do opóźnionego uwalniania i temu podobnych. Kompozycje te można opracowywać w postaci czopków. Preparaty doustne mogą obejmować standardowe nośniki, takie jak farmaceutycznej czystości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharozy, celuloza, węglan magnezu, itd. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych opisano w „Remington's Pharmaceutical Sciences” E. W. Martina. Takie kompozycje będą zawierały terapeutycznie skuteczną ilość środka terapeutycznego, dogodnie w postaci oczyszczonej, razem z odpowiednią ilością nośnika tak, aby zapewnić postać do odpowiedniego podawania pacjentowi. Preparat powinien pasować do sposobu podawania.
Ilość kompozycji farmaceutycznej tu opisanej, która będzie skuteczna w leczeniu poszczególnych schorzeń lub stanów, będzie zależeć od charakteru schorzenia lub stanu i można ją określić standardowymi technikami klinicznymi. Oprócz tego można ewentualnie wykorzystać testy in vitro, pomocne w identyfikacji optymalnych zakresów dawkowania. Dokładna dawka do wykorzystania
PL 212 316 B1 w preparacie, będzie zależeć także od drogi podawania i ciężkości choroby lub schorzenia i powinna być określona zgodnie z oceną lekarza oraz stanem każdego pacjenta. Jednakże odpowiednie zakresy dawkowania do podawania wynoszą generalnie około 104-5 x 106 pfu i można je podawać raz lub wiele razy, z przerwami tak częstymi, jak potrzeba. Kompozycje farmaceutyczne tu opisane zawierające 104-5 x 106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podawać donosowo, dotchawiczo, domięśniowo lub podskórnie. Skuteczne dawki można ekstrapolować z krzywych odpowiedzi na dawkę otrzymanych z układów testowych in vitro lub modelu zwierzęcego.
6. Przykład: wytwarzanie i charakteryzacja mutantów o skróconym NS1 wirusa grypy typu A
6.1 Materiały i metody
Wirus grypy A/PR/8/34 (PR8) namnożono w 10-dniowych jajach kurzych z zarodkami w temperaturze 37°C. Wirus grypy A 25A-1, wirus reasortant, zawierający segment NS od przystosowanego do zimna szczepu A/Leningrad/134/47/57 i pozostałych genach z wirusa PR8 (Egorov i inni 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205; Shaw i inni 1996, w Options of Control of Influenza III, wydawca Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) strony 433-436) hodowano w komórkach Vero w temperaturze 34°C. Wirus 25A-1 jest wrażliwy na temperaturę w komórkach ssaków i użyto go jako wirusa pomocniczego do odzyskania transfektanta wirusa NS1/99. Komórki Vero i komórki MDCK utrzymywane w minimalnej pożywce podstawowej (MEM), zawierającej 1 μg/ml trypsyny (Difco Laboratories, Detroid, Michigan) użyto do hodowli wirusa grypy. Komórki Vero użyto także do selekcji, oczyszczania łysinek i mianowania wirusa NS1/99. Komórki MDCK utrzymywano w DMEM (minimalna pożywka podstawowa Dulbecco), zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą inaktywowaną ciepłem. Komórki Vero hodowano w pożywce AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
W następujący sposób skonstruowano plazmid pT3NS1/99, zawierający C-terminalnie skróconą 99-aminokwasową postać NS1. Po pierwsze, pUC19-T3/NS PR8, zawierający kompletny gen NS z wirusa PR8 oflankowany przez promotor polimerazy RNA T3 oraz miejsce restrykcyjne BpuAI, powielono przez odwrotną PCR (Ochman i inni, 1998, Genetics 120: 621-623) stosując odpowiednie startery. Otrzymany cDNA zawierający w ten sposób skrócony gen NS1 poddano fosforylacji, traktowano polimerazą Klenowa, poddano samoligacji i namnożono w szczepie TG1 E. coli. Konstrukcję otrzymaną po oczyszczeniu nazwano pT3NS1/99 i zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Plazmidy ekspresyjne białek NP, PB1, PB2 i PA wirusa PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 i pHMG-PA) opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Wykonano pPOLI-NS-RB przez substytucję otwartej ramki odczytu CAT pPOLI-NS-RT (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192) wewnątrz produktu RT-PCR otrzymanego z regionu kodującego genu NS wirusa grypy A/WSN/33 (WSN). Plazmid ten wykazuje ekspresję specyficznych dla NS segmentów RNA wirusa WSN pod kontrolą skróconego ludzkiego promotora polimerazy I.
Wytworzenie wirusa NS1/99 przeprowadzono przez transfekcję rybonukleoproteiny (RNP) (Luythes i inni, 1989, Cell 59: 1107-1113). RNP utworzono przez transkrypcję polimerazy RNA T3 z pT3NS1/99 linearyzowanego BpuAI w obecności oczyszczonej nukleoproteiny i polimerazy wirusa grypy 25A-1 (Enami i inni, 1991, J. Virol. 65: 2711-2713). Kompleksy RNP transfekowano do komórek Vero, które wcześniej zakażono wirusem 25A-1. Transfekowane komórki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C i supernatant pasażowano dwukrotnie w komórkach Vero w temperaturze 40°C i oczyszczono łysinki trzykrotnie w komórkach Vero pokrytych nadlewką agarową w temperaturze 37°C. Wyizolowany wirus NS1/99 analizowano przez RT-PCR stosując specyficzne startery. Wirus transfekcyjny dzikiego typu transfekowano plazmidami pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA i pPOLI-NS-RB, jak opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Dwa dni po transfekcji, komórki zakażono 5 x 104 pfu wirusa delNS1 i inkubowano jeszcze dwa dni w temperaturze 37°C. Supernatant komórkowy pasażowano raz w komórkach MDCK i dwukrotnie w jajach kurzych z zarodkami. Wirusy transfekcyjne klonowano przez ograniczone rozcieńczania w jajach. Genomowy RNA z oczyszczonego wirusa transfekcyjnego NS1/99 analizowano przez elektroforezę w żelu poiiakrylamidowym, jak opisano poprzednio (Zheng i inni, 1996, Virology, 217: 242-251). Ekspresję skróconego białka NS1 przez wirus NS1/99 weryfikowano przez immunoprecypitację znakowanych zakażonych ekstraktów komórkowych, przy użyciu króliczych poliklonalnych surowic odpornościowych przeciwko NS1.
Jamę omoczniową jaja kurzego z zarodkami w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów PR8, NS1/99 lub delNS1 (z delecją całego genu NS1), inkubowano w temperaturze 37°C przez dwa dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA).
PL 212 316 B1
Grupy 5 myszy BALB/c (Taconic Farms) zaszczepiono donosowo 5 x 106 pfu lub 5 x 103 pfu wirusa dzikiego typu A/PR/8/34 (PR8) lub NS1/99. Szczepienie przeprowadzono w znieczuleniu przy użyciu 50 μΐ MEM, zawierającej odpowiednią ilość jednostek tworzących łysinkę odpowiedniego wirusa. Zwierzęta monitorowano cały dzień i uśmiercono po zakończeniu obserwacji. W następnym doświadczeniu wszystkie myszy, które przeżyły sprowokowano cztery tygodnie później dawką 100 LD50 wirusa PR8 dzikiego typu. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki i używania zwierząt laboratoryjnych.
6.2 Wyniki: atenuacja wirusów grypy A przez delecje NS1
Twórcy wynalazku pokazali poprzednio, że wirus grypy A z delecją genu NS1 (wirus delNS1) jest zdolny do wzrostu do mian wynoszących około 107 pfu/ml w komórkach z niedoborem wytwarzania interferonu typu I (IFN), takich jak komórki Vero. Jednakże, wirus ten miał zaburzoną zdolność do replikacji i powodował chorobę u myszy (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252: 324). Dla kontrastu, wirus del NS1 był zdolny do wzrostu i zabijał myszy STAT1-/-. Wyniki te pokazały, że białko NS1 wirusa grypy A jest czynnikiem wirulencji związanym z inhibicją odpowiedzi antywirusowych u gospodarza, za pośrednictwem IFN typu I. Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu określenia, czy można wytworzyć wirusy grypy z cechami wirulencji pośredniej między wirusami typu dzikiego i delNS1 przez delecje części genu NS1 i czy niektóre z tych wirusów mogłyby posiadać optymalne cechy do stosowania jako żywe atenuowane szczepionki przeciw wirusom grypy, czyli stabilność i odpowiednią równowagę między atenuacją, immunogennością i wzrostem w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek, takich jak jaja kurze z zarodkami. W celu przetestowania tej hipotezy, wytworzono wirusa grypy A/PR/8/34 (PR8), w którym zmodyfikowano gen NS1 w celu pokierowania ekspresją skróconego białka NS1, zawierającego tylko 99 aminokwasów przy końcu aminowym, wspólnie z 230 aminokwasami białka NS1 dzikiego typu. Wirus ten (NS1-99) otrzymano przez transfekcję RNP sztucznie skonstruowanego genu NS przy użyciu wirusa pomocniczego 25A-1, jak opisano poprzednio (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252: 324). Analiza ekspresji NS1 w komórkach zakażonych wirusem ujawniła skrócony charakter białka NS1 wirusa NS1-99.
Analizowano zdolność wirusów delNS1, NS1-99 i PR8 dzikiego typu, do wzrostu w jajach kurzych z zarodkami w różnym wieku. Przesłanki dla tego doświadczenia pochodzą z faktu, że zdolność zarodków kurzych do syntetyzowania i odpowiedzi na IFN typu I w warunkach odpowiedniego bodźca, jest zależna od wieku. W rzeczywistości, zarówno możliwość indukowania IFN jak i odpowiedź, zaczyna się w wieku około 10 dni, a potem wyraźnie rośnie z wiekiem (Sekellick i inni 1990, In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 997; Sekellick i inni 1985, J. Interferon Res. 5: 657).
Zatem, stosowanie jaj w różnym wieku stanowi unikalny system do testowania zdolności róż3 nych wirusów do hamowania odpowiedzi IFN. Jaja w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów PR8, NS1-99 lub delNS1, inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA). Jak ukazano w tabeli 3, podczas gdy wirus dzikiego typu rósł do podobnych mian HA w jajach z zarodkami 6, 10 i 14-dniowymi, delNS1 replikował do wykrywalnego miana HA tylko w jajach 6-dniowych.
Dla kontrastu, wirus NS1-99 wykazywał zachowanie pośrednie między wirusami delNS1 i dzikiego typu, i był zdolny do wzrostu do mian HA podobnych do wirusa dzikiego typu w jajach 10-dniowych, lecz nie w jajach 14-dniowych.
T a b e l a 3
Replikacja wirusa w jajach kurzych z zarodkami
Wirus Miano hemaglutynacji1
Wiek jaj
6 dni 10 dni 14 dni
WT PR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 N. D.3 2,048 < 2
delNSI 64 < 2 < 2
1 Miana reprezentują najwyższe rozcieńczenie z aktywnością hemaglutynacji 2 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu 3 Nie określono
PL 212 316 B1
Cechy atenuacji wirusa NS1-99 określono następnie u myszy. Do tego celu, grupy 5 myszy 6 5 3
BALB/c zakażono donosowo 5 x 106 pfu, 1,5 x 105 pfu lub 1,5 x 103 pfu wirusa PR8 dzikiego typu lub NS1-99. Następnie, myszy monitorowano przez 3 tygodnie pod względem przeżycia. Wyniki podano w tabeli 4. Wirus NS1-99 miał LD50 co najmniej trzy logarytmy wyższe od wirusa dzikiego typu.
T a b e l a 4
Atenuacja wirusa NS1-99 u myszy
Wirus Myszy, które przeżyły
Dawka zakażająca (pfu)
5 x 106 1,5 x 105 1,5 x 103
WT PR81 1/5 1/5 1/5
NS1/99 3/5 5/5 5/5
1 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu
7. Przykład: Wytwarzanie i charakteryzacja mutantów wirusa grypy typu B o skróconym NS1
7.1. Materiały i metody
Szczegóły doświadczalne są podobne do tych z sekcji 6.1. Dwa zmutowane wirusy grypy B, B/610B5B/201 (B/201) oraz B/AWBY-234, o długości odpowiednio 127 aminokwasów i 90 aminokwasów (skrócone białka C-terminalne NS1) (Norton i inni, 1987 Virology 156: 204; Tobita i inni 1990 Virology 174: 314) otrzymano z doświadczeń koinfekcji w hodowli tkankowej, obejmującej wirusy B/Yamagata/1/7 3 (B/Yam) oraz A/Aichi/2/68, w obecności wirusa przeciwciała anty-A (H3N2). Wzrost zmutowanych wirusów grypy w jajach z zarodkami w różnym wieku, porównano z wirusem rodzicielskim B/Yam, który posiada dzikiego typu białko NS1 o 281 aminokwasach.
Jaja w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów B/Yam, B/201 lub B/AWBY-234, inkubowano w temperaturze 35°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test HA.
Dodatkowo określono cechy atenuacji wirusów B/201 i B/AWBY-234 u myszy. Grupy trzech myszy BALB/c zakażono donosowo 3 x 105 pfu dzikiego typu B/Yam lub zmutowanymi wirusami B/201 i B/AWBY/234 i określono zdolność tych wirusów do replikacji, przez pomiar mian wirusów w płucach w 3 dniu po infekcji, ponieważ dzikiego typu B/Yam nie indukuje widocznych oznak choroby u myszy.
7.2 Wyniki
T a b e l a 5
Replikacja wirusa grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami
Miano hemaglutynacji1
Wiek jaj
Wirus 6 dni 10 dni 14 dni
B/Yam 362 256 < 2
B/201 32 < 2 < 2
B/AWBY-234 8 < 2 < 2
Wyniki wzrostu wirusów zmutowanych i dzikiego typu grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami, ukazane w tabeli 5, pokazują, że jak w przypadku wirusów grypy A, karboksyterminalne skrócenie NS1 wirusa grypy B, jest odpowiedzialne za niższe wydajności replikacji w starszych jajach kurzych z zarodkami, ze skuteczną odpowiedzią IFN. Wskazuje to, że NS1 wirusa grypy B jest także związany z inhibicją odpowiedzi IFN u gospodarza oraz że delecje w genie NS1 wirusa grypy B powodują fenotyp atenuowany.
Wyniki z doświadczeń replikacji u myszy podano w tabeli 6. Miana wirusów B/201 i B/AWBY-234 były około o trzy logarytmy niższe niż miana B/Yam, wskazując, że skrócenie domeny karboksyterminalnej NS1 wirusa grypy B odpowiada za fenotyp atenuowany u myszy.
PL 212 316 B1
T a b e l a 6
Replikacja wirusa grypy typu B w płucach myszy
Wirus Miana w płucu w 3 dniu po infekcji (pfu/płuco)
B/Yam 2 x 104 1 x 104 3 x 104
B/201 30 < 10 60
B/AWBY-234 < 10 40 < 10
8. Zabezpieczenie przed infekcją wirusem grypy dzikiego typu u myszy immunizowanych wirusami grypy typu A i B z delecją w białkach NS1
W celu określenia, czy myszy immunizowane atenuowanymi wirusami grypy typu A i B, zawierającymi skrócone białka NS1, były zabezpieczone przed prowokacją odpowiednikami tych wirusów, ale dzikiego typu, przeprowadzono następujące doświadczenie. Myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusem A/NS1-9 9 i trzy tygodnie później zakażono je 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu. Immunizowane zwierzęta były zabezpieczone przed śmiercią, podczas gdy wszystkie kontrolne nietraktowane myszy padły po prowokacji (patrz tabela 7).
W drugim doświadczeniu myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusami grypy typu B
B/201 lub B/AWBY-234, wykazującymi ekspresję skróconego białka NS1. Trzy tygodnie później myszy 5 sprowokowano 3 x 105 pfu wirusa B/Yam/1/73 dzikiego typu. Ponieważ ten szczep wirusa grypy B nie indukuje objawów choroby u myszy, stopień zabezpieczenia określono przez pomiar mian wirusa w płucu w 3 dniu po prowokacji. Podczas gdy nietraktowane zwierzęta kontrolne miały miana około 104 pfu/płuco, nie wykryto wirusów w płucach zwierząt immunizowanych (patrz tabela 8). Stwierdzenia te sugerują, że wirusy grypy A jak również grypy B, zawierające zmodyfikowane geny SN1 były zdolne do indukcji odpowiedzi odpornościowej u myszy, które są w pełni zabezpieczone przed późniejszą prowokacją wirusem dzikiego typu.
T a b e l a 7
Przeżycie myszy immunizowanych wirusem grypy A/NS1-99 po prowokacji 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu
Dawka immunizująca wirusa Liczba myszy, które przeżyły/całość
5,0 x 106 3/3
1,5 x 105 4/4
PBS 0/5
T a b e l a 8
Miana w płucu u myszy immunizowanych 20 wirusami B/201 i B/AWBY-234 po prowokacji 3 x 105 pfu wirusa grypy B/Yamagata/73 dzikiego typu
Dawka immunizująca Liczba myszy, które przeżyły/całość
3 x 105 pfu B/201 < 101, < 101, < 101, < 101
3 x 105 pfu B/AWBY-234 < 101, < 101, < 101, < 101
PBS 2,5 x 104; 1 x 104; 1,7 x 104; 3,0 x 104; 5,0 x 104;
9. Przykład: indukcja interferonu typu I w jajach z zarodkami zakażonymi wirusem delNS1
Następnie, określono zdolność wirusa delNS1, wirusa grypy A bez genu NS1, do indukcji sekrecji IFN typu I w jajach z zarodkami kurzymi. Do tego celu, grupy dwóch 10-dniowych jaj z zarodka3 mi kurzymi zakażono 5 x 103 pfu wirusów delNS1 i dzikiego typu PR8. Osiemnaście godzin po inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i dializowano przeciwko kwasowemu pH przez noc, aby inaktywować zakaźne wirusy.
Po traktowaniu kwasowym pH, próbki dializowano przeciwko PBS i testowano pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przeciw infekcji VSV (około 200 pfu w komórkach CEF. Wyniki ukazane w tabeli 9 wskazują, że przy nieobecności NS1, wirusy grypy A są lepszymi induktorami IFN.
PL 212 316 B1
T a b e l a 9 Indukcja IFN w jajach
Wirus IFN (U/ml)
PR8 < 16 < 16
delNSI 400 400
Pusta < 16 < 16
10. Przykład: Aktywność antywirusowa wirusa delNS1
Eliminacja genu antagonizmu IFN NS1 z wirusa grypy A może powodować zdolność tego wirusa do indukcji wysokich poziomów IFN. Jeśli ma to miejsce w tym przypadku, wirus delNS1 będzie „zakłócał” replikację wirusów wrażliwych na IFN. Aby przetestować tę możliwość, twórcy wynalazku prześledzili zdolność wirusa delNS1 do inhibicji replikacji wirusa grypy A/WSN/33 (WSN), powszechnie stosowanego szczepu laboratoryjnego wirusa grypy, w jajach. Jak widać na fig. 1, traktowanie tylko 2 pfu wirusa delNS1 spowodowało redukcję ostatecznych mian wirusa WSN w płynie omoczniowym o jeden logarytm. Oprócz tego, traktowanie 2 x 104 pfu wirusa delNS1 spowodowało praktycznie kompletne ograniczenie replikacji WSN w jajach. Wirus delNS1 był także zdolny do zakłócania replikacji w jajach innych szczepów wirusa grypy typu A (H1N1 i H3N2), wirusa grypy typu B oraz innych wirusów, takich jak wirus Sendai (fig. 2).
Zachęceni tymi wynikami, twórcy wynalazku określili następnie zdolność wirusa delNS1 do zakłócania replikacji wirusa grypy dzikiego typu u myszy. Mimo, że traktowanie IFN typu I hodowli tkankowej zapobiega replikacji in vitro wirusa grypy typu A, traktowanie myszy IFN nie jest w stanie zahamować replikacji wirusów grypy (Haller 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25052). Jest to prawda dla większości wsobnych szczepów myszy, z wyjątkiem myszy A2G. Myszy A2G, jak również znaczny udział dzikich myszy (około 75%) zawierały co najmniej jeden nieuszkodzony allel Mx1, podczas gdy większość szczepów laboratoryjnych było Mx1-/- (Haller, 1986 Current Top Microbiol. Immunol. 127: 331-337). Białko Mx1, które jest homologiem ludzkiego białka MxA (Aebi 1989, Mol. Cell. Biol. 11: 5062) jest silnym inhibitorem replikacji wirusa grypy (Haller 1980, Nature, 283: 660). Białko to nie ulega konstytutywnej ekspresji, lecz jego ekspresja jest indukowana transkrypcyjnie przez IFN typu I. Tak więc, myszy A2G można użyć do testowania zdolności induktorów IFN do stymulacji odpowiedzi antywirusowej przeciwko wirusom grypy A (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 2 5052).
Twórcy wynalazku zakazili donosowo osiem 4-tygodniowych myszy A2G 5 x 106 pfu wysokopatogennego izolatu wirusowego A/PR/8/34 (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25052). Połowa myszy otrzymała donosowe leczenie 5 x 106 pfu delNS1 24 godziny przed zakażeniem PR8. Inne cztery myszy były traktowane PBS. Monitorowano zmiany masy ciała i przeżycie. Wyniki te pokazują, że traktowanie delNS1 umożliwiło zabezpieczenie myszy A2G przed śmiercią indukowaną wirusem grypy i utratą masy ciała. Takie samo traktowanie było nieskuteczne u myszy Mx1-/- wskazując, że w mechanizmie zabezpieczenia przed wirusem pośredniczył Mx1, czyli IFN.
11. Przykład: Właściwości przeciwnowotworowe wirusa delNS1 u myszy
Ponieważ IFN typu I i/lub induktory IFN typu I okazały się posiadać aktywność przeciwnowotworową (Belardelli i Gresser, 1996, Immunology Today 17: 369-372; Qin i inni, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14411-14416) jest prawdopodobne, że traktowanie nowotworów wirusem delNS1 mogłoby pośredniczyć w regresji nowotworu.
Alternatywnie, wirus delNS1 mógłby mieć właściwości onkolityczne, czyli mógłby być zdolny do specyficznego wzrostu i zabijania komórek nowotworowych, z których o wielu wiadomo, że posiadają niedobory układu IFN.
Aby przetestować aktywność przeciwnowotworową wirusa delNS1, przeprowadzono następujące doświadczenie, przy użyciu mysiej linii komórkowej mięsaka CT26.WT w mysim nowotworowym modelu przerzutowania do płuc (Restifo i inni, 1998 Virology 249: 89-97) 5 x 105 komórek CT26.WT wstrzyknięto dożylnie dwunastu 6-tygodniowym myszom BALB/c.
Połowę z tych myszy traktowano donosowo 106 pfu wirusa delNS1 co 24 godziny w dniach 1, 2 i 3 po zaszczepieniu. Dwanaście dni po wstrzyknięciu nowotworu, myszy uśmiercono i obliczono przerzuty płucne. Jak ukazano w tabeli 10, traktowanie delNS1 spowodowało istotną regresję przerzutów do płucnych u myszy.
PL 212 316 B1
T a b e l a 10
Aktywność przeciwnowotworową wirusa delNS1 u myszy BALB/c, którym wstrzyknięto komórki nowotworu CT2 6.WT
Liczba przerzutów płucnych
T raktowanych PBS Traktowanych delNS1
Mysz 1 > 250 120
Mysz 2 > 250 28
Mysz 3 > 250 9
Mysz 4 > 250 6
Mysz 5 > 250 2
Mysz 6 > 250 1
12. Przykład: Białko NS1 hamuje translokację IFR-3 podczas infekcji wirusem grypy
Wyniki tu opisane sugerują, że białko NS1 wirusa grypy jest odpowiedzialne za inhibicję odpowiedzi IFN typu I przeciwko wirusowi oraz że mutacje/delecje w tym białku powodują atenuację wirusów w związku ze wzmocnieniem odpowiedzi IFN typu I podczas infekcji. Wiadomo, że synteza IFN typu I podczas infekcji wirusowej może być stymulowana przez dwuniciowy RNA (dsRNA). IRF-3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który zazwyczaj znajduje się w formie nieaktywnej w cytoplazmie komórek ssaków. Dwuniciowy RNA indukuje fosforylację (aktywację) czynnika transkrypcyjnego IRF-3 powodując jego translokację do jądra, gdzie indukuje transkrypcję specyficznych genów, włączając geny kodujące IFN typu I (Weaver i inni, 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 1359). Aby określić czy NS1 grypy działa na IRF-3, monitorowano lokalizację IRF-3 w komórkach CV1 zakażonych dzikiego typu PR8 lub wirusem grypy A delNS1. Fig. 3 ukazuje, że translokacja IRF-3 jest minimalna w komórkach zakażonych PR8 (w ponad 10% komórek). Przeciwnie, około 90% komórek zakażonych delNS1 wykazywało lokalizację jądrową IRF-3.
Co zastanawiające, możliwa była częściowa inhibicja translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych delNS1, przez ekspresję NS1 z plazmidu w układzie trans. Wyniki pokazują, że NS1 wirusa grypy typu A jest zdolny do inhibicji translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych wirusem. Prawdopodobnie wirus grypy NS1 zapobiega aktywacji za pośrednictwem dsRNA IRF-3 przez sekwestrację dsRNA podczas infekcji wirusowej, powodując w ten sposób inhibicję syntezy IFN.
Niniejszy wynalazek nie powinien być ograniczony w zakresie przez opisane specyficzne postacie realizacji, które w zamierzeniu są pojedynczymi ilustracjami poszczególnych aspektów wynalazku i każda konstrukcja lub wirusy, które są funkcjonalnie równoważne, wchodzą w zakres tego wynalazku. Oczywiście, różne modyfikacje wynalazku oprócz tych ukazanych i tu opisanych, staną się widoczne dla fachowca z powyższego opisu i załączonych rysunków. Takie modyfikacje w zamierzeniu wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń.
Cytuje się tu różne odniesienia, których opisy wprowadza się tu jako odniesienie w całości.

Claims (53)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
  3. 3. Zastosowanie szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  4. 4. Zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp
    PL 212 316 B1 antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
  6. 6. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
  7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  8. 8. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
  11. 11. Zastosowanie preparatu szczepionki do profilaktyki choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat szczepionki zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
  13. 13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  14. 14. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  15. 15. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że chorobę zakaźną stanowi grypa.
  16. 16. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
  18. 18. Zastosowanie według zastrz. 16 albo 17, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  19. 19. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncy28
    PL 212 316 B1 tialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  20. 20. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
  21. 21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
  22. 22. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  23. 23. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  24. 24. Zastosowanie według zastrz. 16 albo 17, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
  25. 25. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest grypa.
  26. 26. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  27. 27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
  28. 28. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  29. 29. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  30. 30. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że chorobę zakaźną stanowi grypa.
  31. 31. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która (a) jest odpowiedzialna za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  32. 32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy.
  33. 33. Zastosowanie według zastrz. 31 albo 32, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  34. 34. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) atenuowanego wirusa o ujemnej nici RNA posiadającego fenotyp antagonistyczny wobec interferonu, który (a) jest odpowiedzialny za atenuację oraz (b) pozwala na wzrost atenuowanego wirusa do wyższych mian w układach gospodarza z niedoborem interferonu w porównaniu z układami gospodarzy kompetentnymi pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach i przy czym atenuowanym wirusem jest wirus syncytialny dróg oddechowych, wirus paragrypy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej lub wirus choroby Newcastle; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
    PL 212 316 B1
  35. 35. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
  36. 36. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentny pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
  37. 37. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  38. 38. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  39. 39. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia guzów nowotworowych lub raka u podmiotu, przy czym wspomniany preparat farmaceutyczny zawiera (1) genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza liczbę 1 i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do wyższego miana niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu po namnożeniu w takich samych warunkach; oraz (2) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  40. 40. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
  41. 41. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  42. 42. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza z niedoborem interferonu jest o co najmniej jeden logarytm wyższe niż miano atenuowanego wirusa namnożonego w układzie gospodarza kompetentnym pod względem interferonu.
  43. 43. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje (a) namnażanie w jajach z zarodkiem w wieku poniżej 10 dni genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego, przy czym wirusa namnaża się do wystarczających ilości oraz w warunkach wolnych od zakażenia tak, że wirus potomny jest odpowiedni do preparowania w szczepionkę.
  44. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jajo z zarodkiem jest wieku sześciu do dziewięciu dni.
  45. 45. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje a) namnażanie w linii komórkowej z niedoborem interferonu genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy posiadającego mutację w genie NS1, która zmniejsza lub eliminuje zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania komórkowej odpowiedzi interferonowej; oraz (b) zbieranie wirusa potomnego.
  46. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że linią komórkową z niedoborem interferonu nie są komórki Vero.
  47. 47. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że linią komórkową z niedoborem interferonu są komórki Vero.
  48. 48. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że mutacja w genie NS1 skutkuje delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza 1.
  49. 49. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że mutacja w genie NS1 skutkuje delecją wszystkich reszt aminokwasowych NS1 za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-110, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych
    PL 212 316 B1
    1-99, reszt aminokwasowych 1-90, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60 i przy czym N-końcowy aminokwas oznacza 1.
  50. 50. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
  51. 51. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus NS1/99.
  52. 52. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  53. 53. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że atenuowanym wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
PL386473A 1998-06-12 1999-06-11 Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek PL212316B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL212316B1 true PL212316B1 (pl) 2012-09-28

Family

ID=27376229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL398576A PL219128B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów
PL386473A PL212316B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
PL346212A PL200977B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL398576A PL219128B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL346212A PL200977B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6573079B1 (pl)
EP (4) EP2316923B1 (pl)
JP (7) JP4837827B2 (pl)
KR (2) KR100637937B1 (pl)
CN (1) CN1312725A (pl)
AT (1) ATE351901T1 (pl)
AU (2) AU771110B2 (pl)
BR (1) BR9911163A (pl)
CA (2) CA2334850C (pl)
CY (1) CY1113689T1 (pl)
CZ (2) CZ306637B6 (pl)
DE (1) DE69934885T2 (pl)
DK (4) DK1086207T3 (pl)
ES (4) ES2650500T3 (pl)
HU (1) HUP0102441A3 (pl)
IL (6) IL140264A0 (pl)
MX (2) MXPA00012403A (pl)
NO (1) NO20006328L (pl)
NZ (2) NZ509054A (pl)
PL (3) PL219128B1 (pl)
PT (1) PT1085904E (pl)
RU (1) RU2236252C2 (pl)
SK (3) SK288544B6 (pl)
WO (2) WO1999064570A1 (pl)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
DK1086207T3 (da) 1998-06-12 2007-05-29 Sinai School Medicine Hidtil ukendte fremgangsmåder og inteferon-deficiente substrater til opformering af vira
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES
CA2386920C (en) 1999-09-17 2012-01-24 Pro-Virus, Inc. Oncolytic virus
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
RU2280690C2 (ru) * 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) * 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
DK1358319T3 (da) 2000-09-25 2009-10-05 Polymun Scient Immunbio Forsch Levende influenzavaccine og fremgangsmåde til fremstilling heraf
KR101012952B1 (ko) 2001-02-14 2011-02-08 안트로제네시스 코포레이션 산후 포유류의 태반, 이의 용도 및 태반 줄기세포
WO2002094423A1 (en) 2001-05-22 2002-11-28 Access Business Group International Llc Method and apparatus for blending and dispensing liquid compositions
DK1406607T3 (da) 2001-07-16 2006-04-10 Greenhills Biotechnology Res D Anvendelse af en klasse antivirale forbindelser til at fremstille et stof til at behandle eller forhindre en virusinfektion i luftvejene
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
EP3332803B1 (en) * 2004-06-01 2021-09-08 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
NZ595736A (en) * 2005-12-02 2013-05-31 Sinai School Medicine Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
US9241998B2 (en) * 2007-05-21 2016-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic RSV activity
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
CA2744354C (en) 2008-11-25 2018-10-02 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Method for production of ph stable enveloped viruses
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
WO2010077986A2 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Baxter International Inc. Production of viral vaccine
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2010125461A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for protecting against influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
CA2767207A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing
ES2557315T3 (es) 2009-07-22 2016-01-25 Baxalta GmbH Nuevo virus de la gripe
US9217157B2 (en) 2009-07-27 2015-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant influenza viruses and uses thereof
WO2011014645A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza viruses and uses thereof
KR20120039047A (ko) 2009-07-31 2012-04-24 노파르티스 아게 역유전학 시스템
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US8597637B1 (en) * 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
CA2801268A1 (en) * 2010-06-02 2011-12-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Novel method for generation of rna virus
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
AU2012312529B2 (en) 2011-09-20 2018-01-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
WO2014099931A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
WO2014159990A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Yale University Interferon production using short rna duplexes
CN111218429A (zh) 2013-03-14 2020-06-02 西奈山伊坎医学院 新城疫病毒及其用途
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP3110443A4 (en) 2014-02-27 2017-11-15 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer
CA2974699A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
AU2016222962B2 (en) 2015-02-26 2020-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Bivalent swine influenza virus vaccine
US10947512B2 (en) 2015-08-14 2021-03-16 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered NS1 protein function and related materials and methods
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
JP7189017B2 (ja) 2015-11-24 2022-12-13 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 細胞培養におけるウイルスの生産
US10907133B2 (en) 2015-11-24 2021-02-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
BR112018075032A2 (pt) 2016-06-15 2019-03-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai proteínas de hemaglutinina do vírus influenza e seus uso
WO2018115308A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Blue Sky Vaccines Gmbh Method for purifying virus
US11944679B2 (en) 2017-03-14 2024-04-02 The Regents Of The University Of California Genome-wide identification of immune evasion functions in a virus
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
US11339377B2 (en) 2017-11-08 2022-05-24 Bluesky Immunotherapies Gmbh SO3 chromatography for use in a method for virus purification
US20220160863A1 (en) 2019-01-24 2022-05-26 Blue Sky Vaccines Gmbh High growth influenza virus
WO2020163768A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
US20240108713A1 (en) * 2020-11-30 2024-04-04 Bluesky Immunotherapies Gmbh Novel replication deficient influenza a virus inducing high levels of type i interferon
US20240035035A1 (en) * 2020-12-09 2024-02-01 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
EP4351623A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) * 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US5106619A (en) * 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5766601A (en) 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
JPH07502496A (ja) 1991-10-07 1995-03-16 バイオゲン　インコーポレイテッド Ｃｄ２／ｌｆａ−３相互作用の阻害剤を用いる抗原提示細胞による皮膚障害の予防または治療の方法
US6162432A (en) * 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
EP0570357B1 (en) 1992-05-14 1997-06-25 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Peptides that induce antibodies which neutralize genetically divergent HIV-1 isolates
US7344722B1 (en) 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
EP0702085B2 (en) 1994-07-18 2010-01-13 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Recombinant infectious non-segmented negative strand RNA virus
US6300090B1 (en) 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DK0780475T4 (da) 1995-08-09 2006-10-23 Schweiz Serum & Impfinst Fremgangsmåde til fremstilling af infektiöse negativ-streng RNA-virus
US5840565A (en) * 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
US6264957B1 (en) 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
KR100658491B1 (ko) 1996-07-15 2006-12-18 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클론닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스 백신의 생산
CN1232504A (zh) 1996-09-27 1999-10-20 美国氰胺公司 在单链负义病毒目病毒内引起减毒的3'基因组启动子区和聚合酶基因中的突变
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
CA2283379A1 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Michael G. Katze Novel screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis c virus replication
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
AU7797798A (en) 1997-05-23 1998-12-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
CA2295858C (en) 1997-07-11 2011-05-10 Yale University Rhabdoviruses with reengineered coats
EP1015594A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 American Cyanamid Company Attenuated respiratory syncytial viruses
DE69937999T2 (de) * 1998-06-12 2009-01-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Interferon induzierende genetisch veränderte attenuierte viren
DK1086207T3 (da) 1998-06-12 2007-05-29 Sinai School Medicine Hidtil ukendte fremgangsmåder og inteferon-deficiente substrater til opformering af vira
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
EP1194580B2 (en) 1999-07-14 2010-08-25 Mount Sinai School of Medicine of New York University In vitro reconstitution of segmented negative-strand rna viruses
RU2280690C2 (ru) 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
DK1358319T3 (da) 2000-09-25 2009-10-05 Polymun Scient Immunbio Forsch Levende influenzavaccine og fremgangsmåde til fremstilling heraf
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
CA2505949A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rutgers, The State University Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1
EP3332803B1 (en) 2004-06-01 2021-09-08 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
NZ595736A (en) * 2005-12-02 2013-05-31 Sinai School Medicine Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
US7507411B2 (en) 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Also Published As

Publication number Publication date
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
CN1312725A (zh) 2001-09-12
US9387240B2 (en) 2016-07-12
US6852522B1 (en) 2005-02-08
US6669943B1 (en) 2003-12-30
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
US8057803B2 (en) 2011-11-15
PL219128B1 (pl) 2015-03-31
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
IL140264A0 (en) 2002-02-10
SK288200B6 (sk) 2014-06-03
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
US9352033B2 (en) 2016-05-31
IL188362A0 (en) 2008-03-20
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
PT1085904E (pt) 2013-03-05
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
MXPA00012403A (es) 2003-05-15
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
BR9911163A (pt) 2002-01-15
AU4434399A (en) 1999-12-30
CZ306637B6 (cs) 2017-04-12
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
US7588768B2 (en) 2009-09-15
IL140265A0 (en) 2002-02-10
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
IL189766A0 (en) 2008-08-07
IL140264A (en) 2008-03-20
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
AU771110B2 (en) 2004-03-11
AU770619B2 (en) 2004-02-26
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
NZ509055A (en) 2004-02-27
NO20006328L (no) 2001-02-02
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
CA2334850C (en) 2013-11-26
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
CA2334895C (en) 2016-01-19
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
US6573079B1 (en) 2003-06-03
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
IL140265A (en) 2008-06-05
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
NZ509054A (en) 2004-01-30
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
US7494808B2 (en) 2009-02-24
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
PL200977B1 (pl) 2009-02-27
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
PL346212A1 (en) 2002-01-28
US8765139B2 (en) 2014-07-01
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
AU4434599A (en) 1999-12-30
PL398576A1 (pl) 2012-10-08
EP1086207A4 (en) 2003-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9387240B2 (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals