DE102010018462A1

DE102010018462A1 - Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza

Info

Publication number: DE102010018462A1
Application number: DE102010018462A
Authority: DE
Inventors: Philip Dormitzer; Klaus STÖHR
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2011-04-07
Also published as: USH2284H1; WO2010125461A1; BE1019643A3; CN102548577A; USH2283H1; FR2949344A1; CA2763816A1; KR20120027276A; EP2424565A1; JP2012525370A

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Influenza-Impfstoffen. Die Verfahren verwenden einen H1N1-Influenza A-Virus-Stamm mit einem Hämagglutinin, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist. Der Impfstoff kann mit einem Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion versehen sein.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung von Impfstoffen zum Schutz gegen eine Infektion mit Influenzavirus, und insbesondere gegen den oder die im April 2009 aufgetretenen Stamm/Stämme der Schweinegrippe.
STAND DER TECHNIK
Im April 2009 wurde in zahlreichen Ländern, einschließlich den USA und Mexiko, ein Ausbruch der Schweinegrippe beim Menschen bestätigt, und dieser verbreitete sich anschließend schnell über den Globus. Im Juni 2009 wurde von der WHO eine Pandemie ausgerufen. Die Erkrankung wurde durch ein neu identifiziertes Schweine-Influenzavirus A/California/04/2009 A(H1N1) verursacht. Dieser Schweinegrippe-Stamm scheint keine immunologische Kreuzreaktivität mit gegenwärtig bekannten humanen Influenza-Impfstämmen aufzuweisen, einschließlich der A(H1N1)-Antigene in den aktuellen saisonalen Humanimpfstoffen. Für das Virus wurden verschiedene Bezeichnungen verwendet, wie beispielsweise ”Schweine-Influenza”, ”neue, vom Schwein ausgehende H1N1-Influenza”, ”Mensch-Schwein-Influenza”, ”neue Influenza A(H1N1)” und ”Influenza A(H1N1)v”.
Es ist erforderlich, Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereitzustellen, um die weitere Mensch-zu-Mensch-Übertragung dieser Schweinegrippe und ihrer Varianten zu verhindern.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Influenza-Impfstoffen bereit. Die Verfahren verwenden einen H1N1-Influenzavirus-Stamm mit einem Hämagglutinin, das stärker mit SEQ ID NO:1 verwandt ist als mit SEQ ID NO:3. Der Impfstoff kann mit einem Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion versehen werden. Das Hämagglutinin ruft eine Immunantwort in einem Empfänger hervor, und das Adjuvans verstärkt die heterovariante Reichweite dieser Antwort, sodass ein Schutz gegen den homologen Stamm und auch gegen Varianten desselben, wie beispielsweise gegen Drift-Stämme, die natürlich entstehen können, bereitgestellt werden kann. Die Erfindung ist nützlich für die Herstellung der Impfstoffprodukte FOCETRIA^TM und CELTURA^TM gewesen.
Antigen-Bestandteile
Die Erfindung verwendet Hämagglutinin von Influenza-A-Virus als Impfstoff-Antigen. Das Antigen wird ausgehend von Influenza-Virionen hergestellt.
Verschiedene Formen von Influenzavirus-Impfstoffen sind gegenwärtig erhältlich (siehe z. B. Kapitel 17 & 18 von Literaturstelle 1). Das Antigen in Impfstoffen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, liegt in Form eines inaktivierten Virus vor. Chemische Mittel für die Inaktivierung eines Virus umfassen die Behandlung mit einer wirksamen Menge eines oder mehrerer der folgenden Mittel: Detergentien, Formaldehyd, Formalin, β-Propiolakton oder UV-Licht. Zusätzliche chemische Mittel für die Inaktivierung umfassen die Behandlung mit Methylenblau, Psoralen, Carboxyfulleren (C60) oder mit einer Kombination von beliebigen derselben. Andere Verfahren für eine Virus-Inaktivierung sind im Stand der Technik bekannt, wie beispielsweise binäres Ethylamin, Acetylethylenimin oder Gamma-Bestrahlung.
Der Impfstoff kann das gesamte Virion, ein Split-Virion oder gereinigte Oberflächen-Antigene umfassen (einschließlich Hämagglutinin und üblicherweise auch Neuraminidase). Ein Split-Virion und gereinigte Oberflächen-Antigene (d. h. Subvirion Impfstoffe) sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich.
Virionen können ausgehend von Virus-enthaltenen Flüssigkeiten durch verschiedene Verfahren geerntet werden. Beispielsweise kann ein Aufreinigungsprozess eine Zonenzentrifugation unter Verwendung einer Lösung mit linearem Saccharose-Gradienten umfassen, die ein Detergenz enthält, um die Virionen aufzuschließen. Die Antigene können anschließend durch Diafiltration gereinigt werden (nach optionaler Verdünnung).
Split-Virionen werden erhalten, indem man Virionen mit Detergenz behandelt (z. B. mit Ethylether, Polysorbat 80, Desoxycholat, tri-N-Butylphosphat, Triton X-100, Triton N101, Cetyltrimethylammoniumbromid, Tergitol NP9, usw.), um Subvirion-Zubereitungen herzustellen, einschließlich des ”Tween-Ether”-Spaltverfahrens. Verfahren für das Spalten (Splitting) von Influenza-Viren sind im Stand der Technik hinreichend bekannt (siehe z. B. Literaturstelle 2–7, usw.). Das Spalten des Virus wird üblicherweise durchgeführt, indem man infektiöses oder nicht-infektiöses Gesamtvirus aufschließt oder fragmentiert, wobei eine den Aufschluss bewirkende Konzentration eines Spaltmittels verwendet wird. Der Aufschluss führt zu einer vollständigen oder partiellen Solubilisierung der Virusproteine, was die Integrität des Virus verändert. Bevorzugte Mittel für die Spaltung sind nicht-ionische und ionische (z. B. kationische) Tenside, z. B. Alkyglykoside, Alkylthioglykoside, Acyl-Zucker, Sulfobetaine, Betaine, Polyoxyethylenalkylether, N,N-Dialkylglucamide, Hecameg, Alkylphenoxypolyethoxyethanole, quartäre Ammonium-Verbindungen, Sarcosyl, CTABs (Cetyltrimethylammoniumbromide), tri-N-Butylphosphat, Cetavlon, Myristyltrimethylammonium-Salze, Lipofectin, Lipofectamin und DOT-MA, die Octyl- oder Nonylphenoxypolyoxyethanole (z. B. die Triton-Tenside, wie beispielsweise Triton X-100 oder Triton N101), Polyoxyethylen-Sorbitanester (die Tween-Tenside), Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenester, usw. Ein nützliches Verfahren für die Spaltung verwendet die aufeinanderfolgenden Wirkungen von Natriumdesoxycholat und Formaldehyd, und die Spaltung kann während der anfänglichen Aufreinigung der Virionen erfolgen (z. B. in einer Lösung mit einem Saccharose-Dichtegradienten). Somit kann ein Verfahren für die Spaltung das Aufklären des Virion-enthaltenen Materials umfassen (um nicht-Virion-Material zu entfernen), die Konzentrierung der geernteten Virionen (z. B. unter Verwendung einer Adsorptions-Methode, wie beispielsweise CaHPO₄-Adsorption), die Trennung der vollständigen Virionen von nicht-Virion-Material, die Spaltung der Virionen unter Verwendung eines Mittels für die Spaltung in einem Zentrifugationsschritt mit Dichtegradienten (z. B. unter Verwendung eines Saccharose-Gradienten, der ein Mittel für die Spaltung enthält, wie beispielsweise Natriumdesoxycholat) und die anschließende Filtration (z. B. Ultrafiltration), um das unerwünschte Material zu entfernen. Split-Virionen können in nützlicher Weise in Natriumphosphatgepufferter, isotonischer Natriumchloridlösung resuspendiert werden. Die Produkte BEGRIVAC^TM, FLUARIX^TM, FLUZONE^TM und FLUSHIELD^TM sind Split-Impfstoffe.
Impfstoffe mit gereinigten Oberflächen-Antigenen umfassen die Influenza-Oberflächenantigene Hämagglutinin und üblicherweise auch Neuraminidase. Verfahren zur Herstellung dieser Proteine in gereinigter Form sind hinreichend im Stand der Technik bekannt. Die Produkte FLUVIRIN^TM, AGRIPPAL^TM und INFLUVAC^TM sind Subunit-Impfstoffe.
Influenza-Antigene können auch in Form von Virosomen [8] (Nukleinsäure-freie, virusähnliche Liposomen-Partikel) präsentiert werden, wie beispielsweise in den Produkten INFLEXAL V^TM und INVAVAC^TM, wobei es jedoch bevorzugt ist, keine Virosomen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Somit liegt in einer Ausführungsform das Influenza-Antigen nicht in Form eines Virosoms vor.
Das Hämagglutinin-Antigen in dem Impfstoff kann von jedem geeigneten Stamm sein. In einigen Ausführungsformen ist das Hämagglutinin ein solches, das bei Verabreichung an ein menschliches Subjekt in einer Form ohne Adjuvans Anti-Hämagglutinin-Antikörper hervorrufen kann, die mit A/California/04/2009-Hämagglutinin (SEQ ID NO:1) kreuzreagieren; in diesen Ausführungsformen kann ein Adjuvans die Immunantwort verstärken, sodass ein menschliches Subjekt ein breiteres Spektrum von Antikörpern erzeugt, was zu einem Schutz gegen Drift-Stämme von A/California/04/2009 führen kann. In anderen Ausführungsformen stammt das Hämagglutinin von A/California/04/2009 (SEQ ID NO:1). In anderen Ausführungsformen umfasst das Hämagglutinin eine HA1-Aminosäuresequenz, die mindestens i% Sequenzidentität mit SEQ ID NO:2 aufweist, wobei i 85 oder mehr ist, z. B. 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder mehr (z. B. 100).
H1N1-Stämme mit geeigneten HA-Antigenen umfassen A/California/04/2009 selbst, A/California/7/2009, A/Texas/5/2009, A/England/195/2009 und A/New York/18/2009.
Das Hämagglutinin ist stärker mit SEQ ID NO:1 (A/California/04/2009) verwandt als mit SEQ ID NO:3 (A/Chile/1/1983). Ein Hämagglutinin, das stärker mit SEQ ID NO:1 verwandt ist als mit SEQ ID NO:3 (d. h. welches einen höheren Grad an Sequenzidentität mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 aufweist, wobei der gleiche Algorithmus und die gleichen Parameter verwendet werden), wird nachfolgend als ein ”H1*” Hämagglutinin bezeichnet. Die SEQ ID NO:1 und 3 sind zu 80,4% identisch.
Nützliche H1-Hämagglutinin-Sequenzen vollständiger Länge zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:6, sowie auch solche, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens i% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:2 aufweisen, wie es oben diskutiert ist, oder die mindestens i% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:7 aufweisen. Idealerweise umfasst das Hämagglutinin keine hyperbasischen Regionen im Bereich der HA1/HA2-Spaltungsstelle. Bevorzugte Hämagglutinine weisen eine Bindungspräferenz für Oligosaccharide mit einem terminalen Sia(α2,6)Gal-Disaccharid im Vergleich zu Oligosacchariden mit einem terminalen Sia(α2,3)Gal-Disaccharid auf (siehe nachstehend).
SEQ ID NO:6 (die SEQ ID NO:7 umfasst) ist ein nützliches H1*-Hämagglutinin. Es unterscheidet sich von SEQ ID NO:1 an den Resten 214, 226 und 240 (d. h. 99,47% Identität).
Neben dem H1-Hämagglutinin (wie beispielsweise dem H1*-Hämagglutinin) können die erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen ein oder mehrere Antigene von einem oder von mehreren (z. B. von 1, 2, 3, 4 oder mehreren) zusätzlichen Influenzavirus-Stämmen umfassen, einschließlich von Influenza A-Virus und/oder Influenza B-Virus. Somit kann eine Zusammensetzung Antigen mit Eigenschaften von einem oder von mehreren Stämmen einer normalen saisonalen Grippe plus mindestens einem H1*-Hämagglutinin umfassen, z. B. ein 4-valenter Impfstoff mit zwei H1-Stämmen (einer ein H1*-Hämagglutinin, einer kein H1*-Hämagglutinin), ein H3N2-Stamm und ein Influenza B-Stamm, oder ein 5-valenter Impfstoff mit zwei H1-Stämmen (einer ein H1*-Hämagglutinin, einer kein H1*-Hämagglutinin), ein H3N2-Stamm und zwei Influenza B-Virus-Stämme (ein dem B/Victoria/2/87 ähnlicher Stamm und ein dem B/Yamagata/16/88 ähnlicher Stamm). Wenn ein Impfstoff mehr als einen Influenza-Stamm umfasst, dann werden die verschiedenen Stämme üblicherweise getrennt voneinander angezüchtet und vermischt, nachdem die Viren geerntet und die Antigene hergestellt wurden. Somit kann ein erfindungsgemäßes Verfahren den Schritt des Mischens von Antigenen von mehr als einem Influenza-Stamm umfassen.
Das Influenza-Virus kann resistent gegen eine antivirale Therapie sein (z. B. resistent gegen Oseltamivir [9] und/oder Zanamivir).
In einigen Ausführungsformen werden erfindungsgemäß verwendete Stämme somit Hämagglutinin mit einer Bindungspräferenz für Oligosaccharide mit einem terminalen Sia(α2,6)Gal-Disaccharid gegenüber Oligosacchariden mit einem terminalen Sia(α2,3)Gal-Disaccharid aufweisen. Um zu bestimmen, ob ein Virus eine Bindungspräferenz für Oligosaccharide mit einem terminalen Sia(α2,6)Gal-Disaccharid gegenüber Oligosacchariden mit einem terminalen Sia(α2,3)Gal-Disaccharid aufweist, können verschiedene Assays verwendet werden; siehe z. B. Literaturstellen 10–13. Abhängig von der Art des Assays kann er direkt mit dem Virus selbst durchgeführt werden oder er kann indirekt mit Hämagglutinin durchgeführt werden, welches aus dem Virus aufgereinigt wurde.
In einigen Ausführungsformen weist das H1-Hämagglutinin Glykosylierungsmuster auf, die sich von den Glykosylierungsmustern, welche in Viren aus Eiern beobachtet werden, unterscheiden. Somit kann das HA (und andere Glykoproteine) Glykoformen enthalten, die in Hühnereiern nicht beobachtet werden. Nützliches HA umfasst Glykoformen aus Hunden.
Neben Hämagglutinin-Antigen umfassen erfindungsgemäß hergestellte Impfstoffe üblicherweise auch ein Neuraminidase-Protein; der Impfstoff wird z. B. virale Neuraminidase umfassen. Die Erfindung kann gegen ein oder mehrere der NA-Subtypen N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 oder N9 von Influenza A-Virus schützen, wobei sie üblicherweise gegen N1 (z. B. ein H1N1-Virus) oder N2 (z. B. ein H1N2-Virus) schützen wird. Impfstoffe mit vollständigen Virionen, Split-Virion-Impfstoffe und Subunit-Impfstoffe umfassen alle sowohl Hämagglutinin als auch Neuraminidase. Wenn ein Impfstoff Neuraminidase-Antigen umfasst, dann kann die Neuraminidase mindestens j% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:4 aufweisen, wobei j 75 oder mehr ist, z. B. 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder mehr (z. B. 100). Zahlreiche solcher Sequenzen sind verfügbar. In einigen Ausführungsformen ist die Neuraminidase stärker mit SEQ ID NO:4 verwandt als mit SEQ ID NO:5. SEQ ID NO:4 und 5 sind zu 82% identisch.
Impfstoffe können ferner ein Matrix-Protein umfassen, wie beispielsweise M1 und/oder M2 (oder ein Fragment davon) und/oder ein Nukleoprotein. Ein Schweinemodell hat gezeigt, dass die Zugabe von M2 zu Schweine-Influenzavirus-Impfstoff aus inaktiviertem H1N1 (mit einer Öl-in-Wasser-Emulsion als Adjuvans) die Wirksamkeit des Impfstoffs verstärken kann [14].
Das Influenza-Virus kann ein Reassortanten-Stamm sein, und dieser kann durch reverse genetische Verfahren erhalten worden sein. Reverse genetische Verfahren [z. B. 15–19] ermöglichen die Herstellung von Influenzaviren mit gewünschten genomischen Segmenten in vitro unter Verwendung von Plasmiden oder Plasmid-freien Systemen. Üblicherweise umfasst das Verfahren die Expression (a) von DNA-Molekülen, die für die gewünschten viralen RNA-Moleküle kodieren, z. B. ausgehend von polI-Promotoren oder von Bakteriophagen-Polymerase-Promotoren, und (b) von DNA-Molekülen, die für virale Proteine kodieren, z. B. ausgehend von polII-Promotoren, sodass die Expression beider Arten von DNA in einer Zelle zum Zusammenbau eines vollständigen intakten, infektiösen Virions führt. Die DNA stellt vorzugsweise alle viralen RNAs und Proteine bereit, wobei es jedoch auch möglich ist, ein Helfer-Virus zu benutzen, um einen Teil der RNA und der Proteine bereitzustellen.
Ein Influenza A-Virus, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ein oder mehrere RNA-Segmente von einem A/PR/8/34-Virus umfassen (üblicherweise 6 Segmente von A/PR/8/34, wobei die Segmente HA und N von einem Impfstamm sind, d. h. eine 6:2 Reassortante), insbesondere, wenn Viren in Eiern gezüchtet werden. Üblicherweise schützt ein Impfstoff gegen einen Stamm, der in der Lage ist, von Mensch zu Mensch übertragen zu werden, und somit wird das Genom dieses Stamms üblicherweise mindestens ein RNA-Segment umfassen, das in einem Influenza-Virus eines Säugetiers (z. B. eines Menschen) entstanden ist.
Die als Quelle für die Antigene verwendeten Viren können entweder in Eiern oder in Zellkultur gezüchtet werden. Das gegenwärtige Standardverfahren für die Anzüchtung von Influenzaviren verwendet spezifisch Pathogen-freie (SPF), embryonierte Hühnereier, wobei das Virus von den Ei-Inhaltsstoffen (Allantois-Flüssigkeit) gereinigt wird. Es sind jedoch kürzlich Viren in tierischer Zellkultur gezüchtet worden, und aufgrund der Geschwindigkeit und der Patientenallergien ist dieses Verfahren der Anzüchtung bevorzugt. Wenn das Anzüchten von Viren auf Basis von Eiern angewendet wird, dann können ein oder mehrere Aminosäuren gemeinsam mit dem Virus in die Allantois-Flüssigkeit des Eis eingebracht werden [7].
Wenn eine Zellkultur verwendet wird, dann wird das Substrat des viralen Wachstums üblicherweise eine Zelllinie sein, die von einem Säugetier abgeleitet ist. Geeignete Ursprungszellen von Säugetieren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Hamster, Rinder, Primaten (einschließlich Menschen und Affen), und Hunde-Zellen. Bevorzugte Säugetierzelllinien für das Anzüchten von Influenzaviren umfassen: MDCK-Zellen [20–23], die von Madin Darby-Hundenieren abgeleitet sind; Verozellen [24– 26], die von der Niere der afrikanischen grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops) abgeleitet sind; oder PER.C6-Zellen [27], die von humanen embryonischen Retinoblasten abgeleitet sind. Diese Zellen sind verbreitet verfügbar, z. B. von der American Type Cell Culture (ATCC)-Sammlung, von den Coriell Cell Repositories oder von der Europäischen Sammlung von Zellkulturen (ECACC). Beispielsweise liefert die ATCC zahlreiche unterschiedliche Verozellen unter den Katalognummern CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 und CRL-1587, und es liefert MDCK-Zellen unter der Katalognummer CCL-34. PER.C6 ist von der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 96022940 erhältlich.
Die am stärksten bevorzugten Zelllinien für das Anzüchten von Influenzaviren sind MDCK-Zellen. Die ursprüngliche MDCK-Zelllinie ist von der ATCC als CCL-34 erhältlich, wobei jedoch Derivate dieser Zelllinie ebenfalls verwendet werden können. Beispielsweise offenbart Literaturstelle 20 eine MDCK-Zelllinie, die hinsichtlich eines Wachstums in Suspensionskultur adaptiert wurde (MDCK ”33016”, hinterlegt als DSM ACC 2219). In ähnlicher Weise offenbart Literaturstelle 28 eine von MDCK abgeleitete Zelllinie, die in Suspension in Serumfreier Kultur wächst (”B-702”, hinterlegt als FERM BP-7449). Literaturstelle 29 offenbart nicht-tumorigene MDCK-Zellen, einschließlich ”MDCK-S” (ATCC PTA-6500), ”MDCK-SF101” (ATCC PTA-6501), ”MDCK-SF102” (ATCC PTA-6502) und ”MDCK-SF103” (PTA-6503). Literaturstelle 30 offenbart MDCK-Zelllinien mit hoher Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion, einschließlich ”MDCK.5F1”-Zellen (ATCC CRL-12042). Jede dieser MDCK-Zelllinien kann verwendet werden.
Wenn Virus in einer Säugetier-Zelllinie angezüchtet wurde, dann wird die Zusammensetzung in vorteilhafter Weise frei von Proteinen aus Eiern (z. B. Ovalbumin und Ovomucoid) und von Hühner-DNA sein, was die Allergenität verringert.
Wenn das Virus in einer Zelllinie angezüchtet wurde, dann wird die Kultur für das Anzüchten und auch das virale Inokulum, welches für den Start der Kultur verwendet wurde, vorzugsweise frei von Herpes-Simplex-Virus, respiratorischem Syncytialvirus, Parainfluenzavirus 3, SARS Koronavirus, Adenovirus, Rhinovirus, Reovirus, Polyomaviren, Birnaviren, Circoviren und/oder Parvoviren [31] sein (d. h. es wird daraufhin getestet worden sein und es wird hinsichtlich einer Kontamination dieser Viren ein negatives Ergebnis vorliegen). Das Fehlen von Herpes-Simplex-Viren ist besonders bevorzugt.
Für das Wachstum in einer Zelllinie, wie beispielsweise MDCK-Zellen, kann das Virus in den Zellen in Suspension [20, 32, 33] oder in adhärenter Kultur angezüchtet werden. Eine geeignete MDCK-Zelllinie für die Suspensionskultur ist MDCK 33016 (hinterlegt als DSM ACC 2219). Als eine Alternative kann eine Kultur mit Mikroträgern verwendet werden.
Zelllinien, die die Replikation von Influenza-Virus unterstützen, werden vorzugsweise in Serum-freien Kulturmedien und/oder in Protein-freien Medien angezüchtet. Ein Medium, das im Kontext der vorliegenden Erfindung als Serum-freies Medium bezeichnet wird, weist keine Additive von Serum menschlichen oder tierischen Ursprungs auf. Als Protein-frei werden Kulturen verstanden, in denen die Vermehrung der Zellen unter Ausschluss von Proteinen, Wachstumsfaktoren, anderen Proteinzusätzen und Nicht-Serum-Proteinen erfolgt, wobei jedoch wahlweise Proteine wie Trypsin oder andere Proteasen, die für das virale Wachstum notwendig sein können, enthalten sein können. Die Zellen, die in solchen Kulturen wachsen, enthalten natürlicherweise selbst Proteine.
Zelllinien, die die Replikation von Influenza-Viren unterstützen, werden vorzugsweise während der viralen Replikation unterhalb von 37°C [34] angezüchtet, z. B. bei 30–36°C, bei 31– 35°C oder bei 33 ± 1°C.
Das Verfahren zur Vermehrung von Virus in kultivierten Zellen umfasst üblicherweise Schritte, bei denen man die kultivierten Zellen mit dem zu kultivierenden Stamm inokuliert, die infizierten Zellen für einen gewünschten Zeitraum zum Zwecke der Virusvermehrung kultiviert, wie beispielsweise durch Virus-Titer oder Antigen-Expression bestimmt wird (z. B. zwischen 24 und 168 Stunden nach der Inokulation) und das vermehrte Virus erntet. Die kultivierten Zellen werden bei einem Verhältnis von Virus (gemessen durch PFU oder TCID₅₀) zu Zellen von 1:500 bis 1:1, vorzugsweise 1:100 bis 1:5, stärker bevorzugt 1:50 bis 1:10, inokuliert. Das Virus wird einer Suspension von Zellen zugegeben, oder es wird einem Monolager der Zellen zugegeben, und das Virus wird für mindestens 60 Minuten, üblicherweise jedoch für weniger als 300 Minuten, vorzugsweise für zwischen 90 und 240 Minuten, bei 25°C bis 40°C, vorzugsweise bei 28°C bis 37°C, an die Zellen adsorbiert. Die infizierte Zellkultur (z. B. Monolayer) kann entweder durch Einfrieren und Auftauen oder auf enzymatische Weise entfernt werden, um den Virusgehalt der geernteten Kulturüberstände zu erhöhen. Die geernteten Flüssigkeiten werden dann entweder inaktiviert oder im gefrorenen Zustand gelagert. Kultivierte Zellen können bei einer Multiplizität der Infektion (multiplicity of infektion, ”m. o. i.”) von etwa 0,0001 bis 10, vorzugsweise 0,002 bis 5, stärker bevorzugt 0,001 bis 2, infiziert werden. Noch stärker bevorzugt ist es, dass Zellen bei einer m. o. i. von etwa 0,01 infiziert werden. Infizierte Zellen können 30–60 Stunden nach der Infektion geerntet werden. Vorzugsweise werden die Zellen 34–48 Stunden nach der Infektion geerntet. Stärker bevorzugt ist es, dass die Zellen 38–40 Stunden nach der Infektion geerntet werden. Proteasen (üblicherweise Trypsin) werden üblicherweise während der Zellkultur zugegeben, um die Freisetzung der Viren zu ermöglichen, und die Proteasen können zu jeder geeigneten Phase während der Kultivierung zugesetzt werden.
Hämagglutinin (HA) ist das hauptsächlich verwendete Immunogen in inaktivierten Influenza-Impfstoffen, und die Impfstoff-Dosen werden durch Bezugnahme auf HA-Mengen standardisiert, welche üblicherweise durch einen Single-Radial-Immundiffusions (SRID)-Assay gemessen werden. Derzeit verwendete Impfstoffe enthalten etwa 15 μg HA pro Stamm, obwohl geringere Dosen ebenfalls verwendet werden, z. B. für Kinder oder in Notfallsituationen. Fraktionen von Dosen, wie beispielsweise 1/2 (d. h. 7,5 μg HA pro Stamm), 1/4 (d. h. 3,75 μg HA pro Stamm) und 1/8 sind verwendet worden [35, 36] sowie auch höhere Dosen (3× oder 9× Dosen [37, 38]). Somit können die Impfstoffe zwischen 0,1 und 150 μg HA pro Influenza-Stamm umfassen, vorzugsweise zwischen 0,1 und 50 μg, z. B. 0,1–20 μg, 0,1–15 μg, 0,1–10 μg, 0,1–7,5 μg, 0,5–5 μg, 3,75–15 μg, usw. Besondere Dosen umfassen etwa 45, etwa 30, etwa 15, etwa 10, etwa 7,5, etwa 5, etwa 3,8, etwa 3,75, etwa 1,9, etwa 1,5, usw. μg pro Stamm.
Das HA, welches im Rahmen der Erfindung verwendet wird, kann ein natürliches HA sein, wie es in einem Virus gefunden wird, oder es kann modifiziert sein.
Wenn Virus in einer Zelllinie angezüchtet wurde, dann ist es Standardpraxis, die Menge der Rest-DNA aus der Zelllinie in dem fertigen Impfstoff zu minimieren, um die onkogene Aktivität der DNA zu minimieren. Somit enthält die Zusammensetzung vorzugsweise weniger als 10 ng (vorzugsweise weniger als 1 ng, und stärker bevorzugt weniger als 100 pg) Rest-DNA der Wirtszelle pro Dosis, obwohl Spurenmengen von DNA der Wirtszelle vorhanden sein können. Im Allgemeinen ist die DNA der Wirtszelle, die man ausschließen möchte, eine DNA, die länger ist als 100 Basenpaare.
Kontaminierende DNA kann während der Impfstoff-Herstellung unter Verwendung von Standardverfahren für die Aufreinigung entfernt werden, z. B. durch Chromatographie, usw. Die Entfernung von Rest-DNA der Wirtszelle kann durch Nuklease-Behandlung verstärkt werden, z. B. durch Verwendung einer DNAse. Ein praktisches Verfahren zur Verringerung der Kontamination durch DNA der Wirtszelle wird in den Literaturstellen 39 und 40 offenbart, wobei dieses eine zweistufige Behandlung umfasst, bei der zunächst eine DNAse (z. B. Benzonase) verwendet wird, wobei die Verwendung während des viralen Wachstums stattfinden kann, und anschließend ein kationisches Detergens verwendet wird (z. B. CTAB), das während des Aufschlusses der Virionen verwendet werden kann. Die Behandlung mit einem alkylierenden Mittel, wie beispielsweise β-Propiolakton, kann ebenfalls verwendet werden, um DNA der Wirtszelle zu entfernen, und es kann in vorteilhafter Weise auch verwendet werden, um Virionen zu inaktivieren [41], wobei die Verwendung von Formaldehyd vermieden wird.
Öl-in-Wasser-Emulsions-Adjuvantien
Zusammensetzungen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfassen (oder mit diesem verwendet werden), wobei dieses so wirken kann, dass die Immunantworten (humoral und/oder zellulär), welche in einem Patienten ausgelöst werden, der die Zusammensetzung enthält, verstärkt werden.
Zahlreiche geeignete Emulsionen sind bekannt, und sie enthalten üblicherweise mindestens ein Öl und mindestens ein Tensid, wobei das Öl/die Öle und das Tensid/die Tenside biodegradierbar (metabolisierbar) und biokompatibel sind. Die Öltröpfchen in der Emulsion sind üblicherweise kleiner als 5 μm im Durchmesser, und die Emulsion umfasst in vorteilhafter Weise Öltröpfchen mit einem Durchmesser im Submikronbereich, wobei diese geringen Größen mit einem Mikrofluidizer erreicht werden, sodass stabile Emulsionen bereitgestellt werden. Tröpfchen mit einer Größe von weniger als 220 nm sind bevorzugt, da diese einer Sterilfiltration unterzogen werden können.
Spezifische Öl-in-Wasser-Emulsions-Adjuvantien, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf):

• Eine Submikron-Emulsion aus Squalen, Tween 80 und Span 85. Die Zusammensetzung der Emulsion nach Volumen kann etwa 5% Squalen, etwa 0,5% Polysorbat 80 und etwa 0,5% Span 85 betragen. Im Bezug auf das Gewicht werden diese Verhältnisse zu 4,3% Squalen, 0,5% Polysorbat 80 und 0,48% Span 85. Dieses Adjuvans ist als ”MF59” [42–44] bekannt, und wird genauer im Kapitel 10 von Literaturstelle 45 und in Kapitel 12 von Literaturstelle 46 beschrieben. Die MF59-Emulsion umfasst in vorteilhafter Weise Citrat-Ionen, z. B. 10 mM Natriumcitratpuffer.
• Eine Emulsion, die Squalen, ein α-Tocopherol und Polysorbat 80 umfasst. Diese Emulsionen können von 2–10% Squalen, von 2–10% Tocopherol und von 0,3–3% Tween 80 enthalten, und das Gewichtsverhältnis von Squalen:Tocopherol beträgt vorzugsweise ≤ 1 (z. B. 0,9), und dies stellt eine stabilere Emulsion bereit. Squalen und Tween 80 können in einem Volumenverhältnis von etwa 5:2 oder in einem Gewichtsverhältnis von etwa 11:5 vorhanden sein. Eine solche Emulsion kann hergestellt werden, indem man Tween 80 in PBS löst, um eine 2%ige Lösung bereitzustellen, und anschließend 90 ml dieser Lösung mit einer Mischung aus (5 g von DL-α-Tocopherol und 5 ml Squalen) mischt und die Mischung anschließend in einem Mikrofluidizer behandelt. Die resultierende Emulsion kann Submikron-Öltröpfchen aufweisen, z. B. mit einem durchschnittlichen Durchmesser von zwischen 100 und 250 nm, vorzugsweise etwa 180 nm.
• Eine Emulsion, die Squalen, ein wässriges Lösungsmittel, ein hydrophiles, nicht-ionisches Polyoxyethylenalkylether-Tensid (z. B. Polyoxyethylen (12)-Cetostearylether) und ein hydrophobes nicht-ionisches Tensid (z. B. einen Sorbitanester oder einen Mannitester, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat oder ”Span 80”) umfasst. Die Emulsion ist vorzugsweise thermoreversibel und/oder weist mindestens 90% der Öltröpfchen (nach Volumen) mit einer Größe von weniger als 200 nm auf [47]. Die Emulsion kann darüber hinaus ein oder mehrere der folgenden Dinge umfassen: Alditol (z. B. Mannitol); ein kryoprotektives Mittel (z. B. einen Zucker, wie beispielsweise Dodecylmaltosid und/oder Saccharose); und/oder ein Alkylpolyglykosid. Solche Emulsionen können lyophilisiert werden. Die Emulsion kann Squalen:Polyoxyethylencetostearylether:Sorbitanoleat:Mannitol in einem Massenverhältnis von 330: 63:49:61 enthalten.

Antigene und Adjuvantien in der Zusammensetzung werden üblicherweise zum Zeitpunkt der Verabreichung an einen Patienten miteinander vermischt vorliegen. Die Emulsionen können während der Herstellung mit dem Antigen vermischt werden oder unmittelbar zum Zeitpunkt der Verabreichung. Somit können das Adjuvans und das Antigen getrennt voneinander in einem verpackten oder vertriebenen Impfstoff gehalten werden, fertig für die endgültige Formulierung zum Zeitpunkt der Verwendung. Das Antigen wird im Allgemeinen in wässriger Form vorliegen, sodass der Impfstoff letztendlich durch Mischen von zwei Flüssigkeiten hergestellt wird. Das Volumenverhältnis der zwei Flüssigkeiten kann für das Mischen variieren (z. B. zwischen 5:1 und 1:5), wobei es jedoch üblicherweise 1:1 beträgt.
Wenn eine Zusammensetzung ein Tocopherol enthält, kann jedes der α-, β-, γ-, δ-, ε- oder ξ-Tocopherole verwendet werden, wobei jedoch α-Tocopherole bevorzugt sind. Ein bevorzugtes α-Tocopherol ist DL-α-Tocopherol, und das bevorzugte Salz dieses Tocopherols ist das Succinat.
Wie oben erläutert sind Öl-in-Wasser-Emulsionen, die Squalen enthalten, besonders bevorzugt. In einigen Ausführungsformen kann die Squalen-Konzentration in einer Impfstoff-Dosis im Bereich von 5–15 mg liegen (d. h. eine Konzentration von 10–30 mg/ml, wenn man ein Dosisvolumen von 0,5 ml annimmt). Es ist jedoch möglich, die Konzentration von Squalen zu verringern [48,49], z. B. indem man < 5mg pro Dosis einbringt, oder sogar < 1,1 mg pro Dosis. Beispielsweise kann eine humane Dosis 9,75 mg Squalen pro Dosis enthalten (wie im Produkt FLUAD^TM: 9,75 mg Squalen, 1,175 mg Polysorbat 80, 1,175 mg Sorbitantrioleat in einem Dosisvolumen von 0,5 ml), oder es kann eine Teilmenge davon umfassen, z. B. 3/4, 2/3, 1/2, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 oder 1/10. Beispielsweise kann eine Zusammensetzung 7,31 mg Squalen pro Dosis enthalten (und somit jeweils 0,588 mg Polysorbat 80 und Sorbitantrioleat), 4,875 mg Squalen/Dosis (und somit jeweils 0,588 mg Polysorbat 80 und Sorbitantrioleat), 3,25 mg Squalen/Dosis, 2,438 mg/Dosis, 1,95 mg/Dosis, 0,975 mg/Dosis, usw. Jede dieser fraktionellen Verdünnungen von MF59 in FLUAD^TM-Stärke kann im Rahmen der Erfindung verwendet werden.
Wie oben erwähnt kann die Mischung von Antigen und Emulsion unmittelbar zum Zeitpunkt der Verabreichung erfolgen. Somit kann die Erfindung verwendet werden, um Kits herzustellen, die die Antigen- und Adjuvans-Bestandteile fertig für die Vermischung miteinander enthalten, und diese werden bis zum Zeitpunkt der Verwendung getrennt voneinander gehalten.
Pharmazeutische Zusammensetzung
Zusammensetzungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind pharmazeutisch akzeptabel. Sie umfassen normalerweise zusätzlich zu den Antigenen weitere Bestandteile; z. B. umfassen sie üblicherweise einen oder mehrere pharmazeutische Träger und/oder Hilfsstoffe. Eine ausführliche Diskussion dieser Bestandteile ist in Literaturstelle 50 verfügbar.
Die Zusammensetzungen werden üblicherweise in wässriger Form vorliegen.
Die Zusammensetzung kann Konservierungsstoffe wie Thiomersal (z. B. 10 μg/ml) oder 2-Phenoxyethanol umfassen. Es ist jedoch bevorzugt, dass der Impfstoff im Wesentlichen frei von (d. h. weniger als 5 μg/ml) Quecksilbermaterial ist, z. B. frei von Thiomersal [51]. Impfstoffe, die kein Quecksilber enthalten sind am stärksten bevorzugt. Impfstoffe, die frei von Konservierungsmittel sind, sind besonders bevorzugt.
Um die Tonizität zu kontrollieren, ist es besonders bevorzugt, ein physiologisches Salz zuzusetzen, wie beispielsweise ein Natriumsalz. Natriumchlorid (NaCl) ist bevorzugt, wobei dieses bei zwischen 1 und 20 mg/ml vorhanden sein kann. Andere Salze, die vorhanden sein können, umfassen Kaliumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Dinatriumphosphatdihydrat, Magnesiumchlorid, Kalziumchlorid, usw.
Die Zusammensetzungen werden üblicherweise eine Osmolarität von zwischen 200 mOsm/kg und 400 mOsm/kg aufweisen, vorzugsweise zwischen 240–360 mOsm/kg, am stärksten bevorzugt ist es, dass sie in einen Bereich von 290–310 mOsm/kg fallen.
Die Zusammensetzungen können einen oder mehrere Puffer umfassen. Typische Puffer umfassen: einen Phosphat-Puffer; einen Tris-Puffer, einen Borat-Puffer, einen Succinat-Puffer, einen Histidin-Puffer oder einen Citrat-Puffer. Puffer werden üblicherweise in einem Bereich von 5–20 mM eingebracht. Die Puffer können in der wässrigen Phase einer Emulsion vorliegen.
Der pH-Wert der Zusammensetzung wird üblicherweise zwischen 5,0 und 8,1 betragen, stärker bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0, z. B. 6,5 und 7,5, oder zwischen 7,0 und 7,8. Ein Verfahren der Erfindung wird daher einen Schritt umfassen, bei dem der pH-Wert des Bulk-Impfstoffs vor der Verpackung eingestellt wird.
Die Zusammensetzung ist vorzugsweise steril. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise Gluten-frei.
Bevorzugte Impfstoffe haben einen geringen Gehalt an Endotoxin, z. B. weniger als 1 IU/ml, und vorzugsweise < 0,5 IU/ml.
Der Impfstoff ist vorzugsweise frei von Antibiotika (z. B. Neomycin, Kanamycin, Polymyxin B).
Die Zusammensetzung kann Material für eine einzelne Immunisierung enthalten oder sie kann Material für mehrere Immunisierungen enthalten, d. h. eine ”Mehr-Dosen-”Zusammensetzung. Mehr-Dosen-Anordnungen umfassen üblicherweise ein Konservierungsmittel im Impfstoff.
Influenza-Impfstoffe werden üblicherweise in einem Dosisvolumen von etwa 0,5 ml verabreicht, obwohl eine halbe Dosis (d. h. etwa 0,25 ml) an Kinder verabreicht werden kann, und Dosierungseinheiten werden demgemäß ausgewählt werden, z. B. eine Dosierungseinheit, die eine Dosis von 0,5 ml für die Verabreichung an einen Patienten ergibt.
Verpackung der Zusammensetzungen oder Kit-Bestandteile
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können einen Schritt umfassen, bei dem der Impfstoff in einen Behälter eingebracht wird, insbesondere in einen Behälter für den Vertrieb zur Verwendung an Ärzte.
Geeignete Behälter für die Impfstoffe umfassen Fläschchen und Einwegspritzen, die steril sein sollten.
Wenn eine Zusammensetzung/ein Bestandteil in einem Fläschchen vorliegt, dann ist das Fläschchen vorzugsweise aus Glas oder Kunststoffmaterial hergestellt. Das Fläschchen wird vorzugsweise sterilisiert, bevor die Zusammensetzung eingebracht wird. Das Fläschchen kann eine einzelne Dosis des Impfstoffs umfassen, oder es kann mehr als eine Dosis umfassen (ein ”Mehr-Dosen”-Fläschchen), z. B. 10 Dosen. Bevorzugte Fläschchen sind aus farblosem Glas hergestellt.
Ein Fläschchen kann einen Deckel aufweisen (z. B. ein Luer Lock), der so ausgestaltet ist, dass eine vorgefüllte Spritze in den Deckel eingebracht werden kann, der Inhalt der Spritze in das Fläschchen überführt werden kann, und der Inhalt des Fläschchens dann zurück in die Spritze aufgezogen werden kann.
Impfstoff-Produkte und Kits, die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden können
Die Erfindung kann zur Herstellung verschiedener Impfstoffe verwendet werden.
Ein Impfstoff, der unter Verwendung der Erfindung hergestellt werden kann, umfasst: (i) ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und (ii) ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Diese Zusammensetzung ist ein monovalenter Impfstoff mit inaktiviertem Oberflächen-Antigen. Die inaktivierten Viren können in Eiern oder in Zellkultur gezüchtet sein (z. B. in MDCK-Zellen). Der Impfstoff kann in einer Spritze bereitgestellt werden, die eine Dosierungseinheit von 0,5 ml enthält, wobei jede Dosierungseinheit etwa 7,5 μg des H1-Hämagglutinins enthält. Die Spritze kann aus Glas bestehen, mit einem Kolbenstopper aus Bromobutylgummi. Das Adjuvans umfasst Squalen, Polysorbat 80 und Sorbitantrioleat, z. B. etwa 9,75 mg Squalen, etwa 1,18 mg Polysorbat 80 und etwa 1,18 mg Sorbitantrioleat pro 7,5 μg HA. Die Zusammensetzung kann einen Citratpuffer umfassen. Die Zusammensetzung ist idealerweise frei von Quecksilber, obwohl eine geringe Dosis Thiomersal manchmal enthalten sein kann. In einigen Ausführungsformen weist ein Impfstoff mit Adjuvans 3,75 μg HA auf, insbesondere wenn ein Dosisvolumen von 0,25 ml verwendet wird.
Ein weiterer Impfstoff, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, umfasst: (i) ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und (ii) ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Diese Zusammensetzung ist ein monovalenter Impfstoff mit inaktiviertem Oberflächen-Antigen. Die inaktivierten Viren können in Eiern angezüchtet sein. Der Impfstoff kann in einem Fläschchen bereitgestellt sein, das mehrere Dosierungseinheiten von 0,5 ml enthält, z. B. ein Fläschchen mit 10 Dosen, das Thiomersal enthält, wobei jede Dosierungseinheit etwa 7,5 μg oder 15 μg oder 30 μg des H1-Hämagglutinins umfasst. Das Adjuvans umfasst Squalen, Polysorbat 80 und Sorbitantrioleat, z. B. etwa 9,75 mg Squalen, etwa 1,18 mg Polysorbat 80 und etwa 1,18 mg Sorbitantrioleat pro 7,5 μg HA. Die Zusammensetzung kann einen Citratpuffer umfassen.
Ein weiterer Impfstoff, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, umfasst: (i) ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und (ii) ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Diese Zusammensetzung ist ein monovalenter Impfstoff mit inaktiviertem Oberflächen-Antigen. Die inaktivierten Viren können in MDCK-Zellen angezüchtet sein. Der Impfstoff wird in einer Dosierungseinheit bereitgestellt, die 3,75 μg des H1-Hämagglutinins enthält. Das Adjuvans umfasst Squalen, Polysorbat 80 und Sorbitantrioleat (z. B. etwa 4,875 mg Squalen, etwa 0,59 mg Polysorbat 80 und etwa 0,59 mg Sorbitantrioleat). Die Zusammensetzung kann einen Citratpuffer umfassen. Eine Dosierungseinheit kann ein Volumen von 0,25 ml aufweisen. Der Impfstoff kann als Packung von 10 × 0,25 ml-Dosen vertrieben werden.
Ein weiterer Impfstoff, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, umfasst: (i) ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und (ii) ein Adjuvans, das sowohl Aluminiumphosphat als auch Aluminiumhydroxid umfasst. In einer nützlichen Ausführungsform ist die Zusammensetzung ein monovalenter Impfstoff mit inaktivierten vollständigen Virionen. Die inaktivierten Viren können in Eiern gezüchtet worden sein. Der Impfstoff kann in einer Spritze bereitgestellt werden, die eine Dosierungseinheit von 0,5 ml enthält, wobei jede Dosierungseinheit etwa 15 μg des H1-Hämagglutinins umfasst. Das Adjuvans kann in einem Volumen von 0,5 ml etwa 0,5 mg Al⁺⁺⁺ enthalten, z. B. 0,45 mg Aluminiumphosphat und 0,05 mg Aluminiumhydroxid (hydriert). Die Zusammensetzung kann 50 mg Thiomersal umfassen.
Ein weiterer Impfstoff, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, umfasst (i) ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und (ii) ein Aluminiumphosphat-Adjuvans. In einer nützlichen Ausführungsform ist diese Zusammensetzung ein monovalenter Impfstoff mit inaktivierten vollständigen Virionen (z. B. durch eine Inaktivierung mit Formaldehyd erhalten). Die inaktivierten Viren können in Eiern angezüchtet worden sein. Der Impfstoff kann in einer Ampulle bereitgestellt werden, die eine Dosierungseinheit von 0,5 ml enthält, wobei jede Dosierungseinheit etwa 6 μg des H1-Hämagglutinins enthält (z. B. von einem Reassortanten-Stamm, wie beispielsweise X-179A). Das Hämagglutinin kann an das Aluminiumphosphat-Adjuvans adsorbiert sein, wobei dieses in Form eines Gels vorliegen kann. Die Zusammensetzung kann Thiomersal umfassen.
Ein weiterer Impfstoff, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, ist ein Impfstoff ohne Adjuvans, der ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1 umfasst, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist (z. B. von einem A/California/7/2009-Stamm). Diese Zusammensetzung ist ein monovalenter Impfstoff mit inaktivierten vollständigen Virionen, wobei die inaktivierten Viren in Verozellen gezüchtet wurden. Der Impfstoff kann in einem Fläschchen bereitgestellt werden, das mehrere Dosen umfasst, z. B. 10 × Dosierungseinheiten von 0,5 ml, wobei jede Dosierungseinheit etwa 7,5 μg H1-Hämagglutinin (d. h. 75 μg pro Mehrdosen-Fläschchen) enthält. Die Zusammensetzung kann Trometamol, Natriumchlorid und Polysorbat 80 enthalten.
Ein weiterer Impfstoff, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, ist ein Impfstoff ohne Adjuvans, der ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1 umfasst, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist (z. B. von einem A/California/7/2009-Stamm, wie beispielsweise X-179A). Die Zusammensetzung ist ein monovalenter, inaktivierter Impfstoff mit Split-Virion, wobei die inaktivierten Viren in Eiern gezüchtet wurden. Der Impfstoff kann in einem Fläschchen bereitgestellt werden, das mehrere Dosen umfasst (z. B. 10 × Dosierungseinheiten von 0,5 ml mit einem Thiomersal-Konservierungsmittel, das mit 45 μg pro 0,5 ml Dosierungseinheit vorhanden sein kann), oder in Spritzen (eine Dosis pro Spritze). Jede Dosis des Impfstoffs kann 7,5, 15 oder 30 μg des H1-Hämagglutinins aufweisen. Der Impfstoff kann einen Phosphatpuffer umfassen.
Die Erfindung kann ferner bei der Herstellung eines Kits verwendet werden, das Folgendes umfasst: (i) einen ersten Kit-Bestandteil, der ein Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1 umfasst, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und das unter Verwendung der Erfindung hergestellt wurde, und (ii) einen zweiten Kit-Bestandteil, der ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst. Die zwei Kit-Bestandteile können zum Zeitpunkt der Verwendung miteinander vermischt werden, sodass ein monovalenter Impfstoff entsteht. Der erste Kit-Bestandteil ist ein monovalenter, inaktivierter Split-Virion-Impfstoff. Die inaktivierten Viren können in Eiern angezüchtet worden sein. Das Kit kann als Zusammenstellung mit zwei Fläschchen bereitgestellt werden, wobei jedes Fläschchen ein gleiches Volumen Flüssigkeit für die Mischung in einem Volumenverhältnis von 1:1 enthält, z. B. um 2,5 ml Antigen mit 2,5 ml Adjuvans zu vermischen. Eine Dosierungseinheit von 0,5 ml des monovalenten Impfstoffs mit Adjuvans kann etwa 7,5 μg, 3,75 μg oder etwa 1,9 μg des H1-Hämagglutinins umfassen. Das Adjuvans umfasst Squalen, DL-α-Tocopherol und Polysorbat 80, z. B. in einer Dosierungseinheit von 0,5 ml: etwa 10,7 mg Squalen, etwa 11,9 mg Tocopherol und etwa 4,9 mg Polysorbat 80 (oder eine Teilmenge davon, z. B. 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 oder 1/10 dieser Mengen von Squalen, Tocopherol und Polysorbat 80). Somit können die Adjuvans-Bestandteile in einem Massenverhältnis (Squalen:Tocopherol:Polysorbat 80) von 2,20:2,44:1 vorhanden sein. Die Adjuvans-Bestandteile können in einer Menge von 2,85 μg Squalen, 3,16 μg Tocopherol und 1,30 μg Polysorbat 80 pro μg H1-Hämagglutinin vorhanden sein. Der Impfstoff kann ein Thiomersal-Konservierungsmittel enthalten, z. B. mit etwa 10 μg/ml, d. h. etwa 5 μg in einer Dosis von 0,5 ml. Der Antigen-Bestandteil und der Adjuvans-Bestandteil können beide einen Phosphatpuffer enthalten. Der Antigen-Bestandteil kann Polysorbat 80, Octoxynol 10, Kaliumchlorid und/oder Magnesiumchlorid enthalten. Ein Kit kann 50 Fläschchen Antigen (2,5 ml Suspension in jeder) und 50 Fläschchen Adjuvans (2,5 ml Emulsion in jeder) enthalten. Die Antigen-Fläschchen können in einer einzelnen Packung vorliegen; die Adjuvans-Fläschchen können in zwei Packungen vorliegen.
Ein anderes Kit, das hergestellt werden kann, umfasst (i) einen ersten Kit-Bestandteil, der Hämagglutinin von Influenza A-Virus des Subtyps H1 ohne Adjuvans umfasst, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und das unter Verwendung der Erfindung hergestellt wurde, und (ii) einen zweiten Kit-Bestandteil, der ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst. Die zwei Kit-Bestandteile können zum Zeitpunkt der Verwendung miteinander vermischt werden, sodass ein monovalenter Impfstoff entsteht. In einer nützlichen Ausführungsform ist der erste Kit-Bestandteil ein monovalentes, inaktiviertes Split-Virion. Die inaktivierten Viren können in Eiern gezüchtet worden sein. Das Kit kann als Zusammenstellung mit zwei Fläschchen bereitgestellt werden (z. B. Bor-Silikatglas, wahlweise mit Chlorbutyl-Stopfen), wobei das erste Fläschchen eine Volumeneinheit des Antigens und das zweite Fläschchen 3× diese Volumeneinheit Emulsion enthält, z. B. für eine Mischung, die 4× die Volumeneinheit an fertigem Impfstoff ergibt. Auf diese Weise können 1,5 ml des Antigens mit 4,5 ml Emulsion kombiniert werden, um 6 ml Impfstoff bereitzustellen. Eine Einheitsdosis von 0,5 ml des monovalenten Impfstoffs mit Adjuvans kann etwa 3,8 μg des H1-Hämagglutinins umfassen. Das Adjuvans umfasst Squalen, Sorbitanoleat, Polyoxyethylencetostearylether und Mannitol, z. B. in einer Dosiseinheit von 0,5 ml: etwa 12,4 mg Squalen, etwa 1,9 mg Sorbitanoleat, etwa 2,4 mg Polyoxyethylencetostearylether und etwa 2,3 mg Mannitol (oder einen Bruchteil davon, z. B. 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 oder 1/10). Somit können die Adjuvans-Bestandteile in einem Massenverhältnis (Squalen:Sorbitanoleat:Polyoxyethylencetostearylether:Mannitol) von 124:19:24:23 vorhanden sein. Der Impfstoff kann ein Thiomersal-Konservierungsmittel umfassen, z. B. mit etwa 11,3 μg pro 0,5 ml, oder mit etwa 3 μg Thiomersal pro μg Hämagglutinin. Der Antigen-Bestandteil und der Adjuvans-Bestandteil können beide einen Phosphatpuffer umfassen.
Impfstoffe, die in diesem Abschnitt genannt wurden, können in nützlicher Weise ein Hämagglutinin enthalten, das SEQ ID NO:7 umfasst.
Bevorzugte Impfstoffe erfüllen 1, 2 oder 3 der CPMP-Kriterien hinsichtlich der Wirksamkeit. In Erwachsenen (18–60 Jahre) sind diese Kriterien (1) ≥ 70% Seroprotektion; (2) ≥ 40% Serokonversion; und/oder (3) ein GMT-Anstieg um das ≥ 2,5-fache. In älteren Menschen (> 60 Jahre) sind diese Kriterien: (1) ≥ 60% Seroprotektion; (2) ≥ 30% Serokonversion; und/oder (3) ein GMT-Anstieg um das ≥ 2-fache. Diese Kriterien basieren auf Open-Label-Studien mit mindestens 50 Patienten. Die Kriterien gelten für jeden Stamm in einem Impfstoff.
Reassortanten-Viren
Wie oben angemerkt kann die Erfindung einen Reassortanten-Influenzavirus-Stamm verwenden. In einer solchen Reassortante (a) kodiert das virale Hämagglutinin-Gen für ein Hämagglutinin, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist, und (b) stammt mindestens ein weiteres virales Gen von dem A/PR/8/34-Influenzavirus-Stamm (A/Puerto Rico/8/34). Somit kann das Virus mindestens eines der Segmente NP, M, NS, PA, PB1 und/oder PB2 von A/PR/8/34 umfassen.
In einer weiteren Reassortante (a) kodiert das virale Hämagglutinin-Gen für ein Hämagglutinin-Protein, das mindestens k% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 aufweist, wobei k 85 oder mehr ist, z. B. 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder mehr (z. B. 100), und (b) stammt mindestens ein weiteres virales Gen von dem Influenzavirus-Stamm A/PR/8/34 (A/Puerto Rico/8/34). Somit kann das Virus mindestens eines der Segmente NP, M, NS, PA, PB1 und/oder PB2 von A/PR/8/34 umfassen.
In diesen Viren kann das Gen für die virale Neuraminidase für ein Neuraminidase-Protein kodieren, das mindestens j% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:4 aufweist, wobei j 75 oder mehr ist, z. B. 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder mehr (z. B. 100). In diesen Ausführungsformen ist die Neuraminidase stärker mit SEQ ID NO:4 als mit SEQ ID NO:5 verwandt.
Die acht Segmente des Genoms von Influenza A-Virus umfassen (i) die PA-Untereinheit der viralen Polymerase (ii) die PB1-Untereinheit der viralen Polymerase, (iii) die PB2-Untereinheit der viralen Polymerase (iv) das virale Nukleoprotein (v) der viralen Matrix-Proteine (vi) die viralen Proteine NS1 und NS2 (vii) Hämagglutinin und (viii) Neuraminidase. Bevorzugte Reassortanten sind 6:2 Reassortanten, d. h. sie enthalten 6 Segmente von einem Stamm (z. B. von A/PR/8/34), jedoch die Segmente HA und NA von einem anderen Stamm (wie oben durch Bezugnahme auf SEQ ID NOs:1 und 4 definiert). In anderen Ausführungsformen gibt es eine 7:1 Reassortante mit einem wie oben definiertem HA. In anderen Ausführungsformen umfasst das Virus Gene von drei verschiedenen Ursprüngen, wobei jedoch mindestens ein Segment (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6) von A/PR/8/34 stammt.
Virale Segmente von dem A/PR/8/34 und deren Sequenzen sind verbreitet verfügbar.
Diese Viren sind insbesondere nützlich für die Herstellung von Impfstoffen, und sie können in praktischer Weise durch reverse genetische Verfahren hergestellt werden. Impfstoffe, die ein oder mehrere virale Gene von A/PR/8/34 umfassen, können verwendet werden, um inaktivierte Influenza-Impfstoffe herzustellen.
Die Reassortanten-Viren können in MDCK-Zellen wachsen, und die Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung eines Impfstoffs bereit, bei dem man: (i) eine Zellkultur mit einem wie oben beschriebenen Virus infiziert; (ii) die Zellkultur von Schritt (i) kultiviert, um weiteres Virus zu erzeugen; (iii) das in Schritt (ii) erhaltene Virus aufreinigt; und (iv) das in Schritt (iii) aufgereinigte Virus weiterverarbeitet, um einen Impfstoff herzustellen. Der Impfstoff kann ein Bulk-Impfstoff sein. Er kann verwendet werden, um ein monovalentes fertiges Impfstoffprodukt herzustellen, oder er kann als Bestandteil verwendet werden, um ein multivalentes fertiges Impfstoffprodukt herzustellen. Die Zellkultur aus Schritt (i) ist vorzugsweise eine MDCK-Zellkultur, wobei jedoch andere Zellen (idealerweise Säugetierzellen, wie beispielsweise PER.C6-Zellen) als Alternative verwendet werden können.
Die Erfindung stellt ferner ein verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, bei dem man: (i) ein Reassortanten-Influenzavirus durch reverse genetische Verfahren herstellt, z. B. mit einem viralen Hämagglutinin-Gen, das für ein Hämagglutinin kodiert, welches stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist; (ii) den Reassortanten-Stamm verwendet, um einen Impfstoff herzustellen. Schritt (ii) kann folgendes umfassen: Kultivierung eines Virus (z. B. in Eiern oder in Zellkultur); und Herstellung von Impfstoff aus dem kultivierten Virus. Das kultivierte Virus kann inaktiviert werden, und anschließend kann das inaktivierte Virus verwendet werden, um den Impfstoff herzustellen (z. B. nach Spaltung oder nach Antigen-Aufreinigung).
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, bei dem man ein wie oben definiertes Reassortanten-Influenzavirus verwendet, dass unter Verwendung von reversen genetischen Verfahren hergestellt wurde.
Allgemeines
Das Wort ”umfassen” schließt ”einschließen” sowie auch ”bestehen aus” ein; z. B. kann eine Zusammensetzung, die X ”umfasst” ausschließlich aus X bestehen, oder sie kann neben X etwas Zusätzliches umfassen, z. B. X + Y.
Der Begriff ”im Wesentlichen” schließt ”vollständig” nicht aus; eine Zusammensetzung, die ”im Wesentlichen frei” von Y ist, kann vollständig frei von Y sein. Sofern notwendig, kann der Begriff ”im Wesentlichen” bei der Definition der Erfindung ausgelassen werden.
Der Begriff ”etwa” in Bezug auf einen numerischen Wert X ist optional und bedeutet beispielsweise x ± 10%.
Sofern nicht anderweitig angegeben, erfordert ein Verfahren, dass einen Schritt umfasst, bei dem zwei oder mehrere Bestandteile miteinander vermischt werden, keine spezifische Reihenfolge des Vermischens. Somit können die Bestandteile in beliebiger Reihenfolge miteinander vermischt werden. Wenn es drei Bestandteile gibt, dann können zwei Bestandteile miteinander kombiniert werden, und dann kann die Kombination mit dem dritten Bestandteil kombiniert werden, usw.
Wenn tierische (und insbesondere bovine) Materialien bei der Zellkultur verwendet werden, dann sollten diese von Quellen erhalten werden, die frei von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (transmissible spongiform encephalopathies, TSEs) sind, und insbesondere frei von boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE). Insgesamt ist es bevorzugt, die Kulturzellen in vollkommener Abwesenheit von Materialien zu kultivieren, die von Tieren stammen.
Wenn ein Zellsubstrat für ein Reassortment-Verfahren oder ein reverses genetisches Verfahren verwendet wird, dann ist dieses vorzugsweise ein solches, das für die Verwendung bei der Herstellung von Humanimpfstoffen zugelassen wurde, z. B. wie in Ph Eur, allgemeines Kapitel 5.2.3.
Die Identität zwischen Polypeptid-Sequenzen wird vorzugsweise durch den Smith-Waterman-Homologie-Suchalgorithmus bestimmt, wie er in dem Programm MPSRCH (Oxford Molecular) implementiert ist, wobei eine affine Lückensuche mit den Parametern gap open penalty = 12 und gap extension penalty = 1 verwendet wird.
ARTEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG Die Produkte Focetria^TM und Celtura^TM
Es wurden entweder spezifisch Pathogen-freie (SPF)-Eier (für Focetria^TM) oder eine Suspensionskultur von MDCK-Zellen (für Celtura^TM) mit einem H1N1-Reassortanten-Stamm von Influenza A-Virus infiziert, wobei dieser ein Hämagglutinin aufweist, das stärker mit SEQ ID NO:1 als mit SEQ ID NO:3 verwandt ist. Die Viren wurden unter Verwendung bekannter Verfahren gezüchtet, dann geerntet und inaktiviert, und monovalente Oberflächen-Antigen-Impfstoffe wurden ausgehend von den gereinigten Viren hergestellt. Die gereinigten Antigene wurden verdünnt und anschließend mit einer Öl-in-Wasser-Emulsion kombiniert, die Squalen-Tröpfchen im Submikronbereich enthielten (MF59^TM), sodass ein Bulk-Impfstoff für das Produkt Focetria^TM (mit 7,5 μg Hämagglutinin pro 0,5 ml Dosierungseinheit) und für das Produkt Celtura^TM (3,75 μg Hämagglutinin pro 0,25 ml Dosierungseinheit) bereitgestellt wurde. Die Produkte werden in Spritzen gefüllt. Die Produkte werden somit in vorgefüllten Spritzen für die Injektion vertrieben, z. B. eine Injektion an den Deltamuskel oder den anterolateralen Oberschenkel. Diese beiden Produkte sind sicher und wirksam und wurden für die Verwendung beim Menschen in verschiedenen Gebieten zugelassen.
Weitere Produkte
Wie in Literaturstelle 52 berichtet, wurde ausgehend von einem Stamm A/California/7/2009 H1N1sw in embryonierten Hühnereiern ein monovalenter Split-Impfstoff ohne Adjuvans hergestellt, wobei dieselben Standardverfahren verwendet wurden, die auch bei der Herstellung des saisonalen, trivalenten, inaktivierten Impfstoffs von CSL verwendet werden [53]. Zwei unterschiedliche Impfstoffe wurden hergestellt: einer mit 15 μg HA-Dosis (0,25 ml Volumen) und ein weiterer mit einer 30 μg HA-Dosis (0,5 ml Volumen).
Literaturstelle 54 stellt Details für die Herstellung eines monovalenten Impfstoffs mit inaktivierten, vollständigen Virionen und mit einem Aluminiumphosphat-Adjuvans bereit, der 6 μg HA pro Dosis umfasst.
Es wird verständlich sein, dass die Erfindung lediglich beispielhaft beschrieben wurde und Modifikationen durchgeführt werden können, während man sich weiterhin im Bereich und im Rahmen der Idee der vorliegenden Erfindung bewegt.
Literaturstellen

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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffs, wobei der Impfstoff ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst, bei dem man Impfstoff-Antigen von einem Influenza-Virus herstellt, das ein Hämagglutinin aufweist, welches eine HA1-Aminosäuresequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:2 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, wobei der Impfstoff ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst, bei dem man: (i) ein Reassortanten-Influenzavirus durch Verwendung reverser genetischer Verfahren herstellt, und wobei das Virus ein Hämagglutinin aufweist, welches eine HA1-Aminosäuresequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:2 umfasst; und (ii) den Reassortanten-Stamm verwendet, um einen Impfstoff durch Kultivierung eines Virus in Eiern oder in Zellkultur herzustellen, und Impfstoff aus dem kultivierten Virus herstellt.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, bei dem man ein Reassortanten-Influenzavirus verwendet, das unter Verwendung reverser genetischer Verfahren hergestellt wurde, wobei das Reassortanten-Virus ein Hämagglutinin aufweist, welches eine HA1-Aminosäuresequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:2 umfasst; und wobei der Impfstoff ein Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Impfstoff aus inaktivierten Influenza-Virionen hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Impfstoff ein vollständiges Virion, ein Split-Virion oder gereinigte Oberflächen-Antigene umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hämagglutinin SEQ ID NO:7 umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virus eine Neuraminidase aufweist, die stärker mit SEQ ID NO:4 als mit SEQ ID NO:5 verwandt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virus ein oder mehrere RNA-Segmente von einem A/PR/8/34-Virus umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virus in Eiern gezüchtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das Virus in einer Zellkultur gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Virus in MDCK-Zellkultur oder in Vero-Zellkultur gezüchtet wird.