KR101211386B1 - 알루미늄 보조제에 즉석 흡착되는 인플루엔자 백신 - Google Patents

Abstract

항원보강형 인플루엔자 백신의 항원 및 보조제 성분이 제조시 혼합되지 않고, 사용시에 즉석에서 혼합되는 분리 성분으로 제공되며, 예를 들어 키트로서: (i) 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분; 및 (ii) 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분을 포함한다.

보조제, 분리 성분, 알루미늄 염.

Description

알루미늄 보조제에 즉석 흡착되는 인플루엔자 백신{INFLUENZA VACCINES EXTEMPORANEOUSLY ADSORBED TO ALUMINIUM ADJUVANTS}

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호용 항원보강형 백신의 분야에 관한 것이다.

수중유 에멀젼 보조제를 포함하는 Chiron Vaccines사 제품인 FLUAD™를 제외하고, 현재 일반적으로 사용되는 인플루엔자 백신은 항원미보강형이다. 이러한 백신은 참고자료 1의 17 및 18 장에 상세하게 설명되어 있다. 이들은 생 바이러스 또는 불활성 바이러스에 기초하며, 불활성화 백신은 전 바이러스, '분할' 바이러스 또는 정제된 표면 항원(적혈구응집소 및 뉴라미니다아제를 포함)에 기초할 수 있다.

보다 최근에는, 알루미늄 염 보조제의 포함은 인플루엔자 백신을 위하여 제안되어왔다(예컨대, 참고자료 2-5). 제조 중의 추가의 혼합 단계를 요구하여 전체 제조 속도 감소가 될 뿐만 아니라, 이러한 염을 포함하는 것은 다양한 문제와 관련되어 있다. 예를 들어, 이들의 불용해성에 의하여 흡착된 항원이 현탁액으로부터 침전되므로 충전 백신의 개별 복용량의 제조시 별도의 조치가 필요함을 의미한다. 이와 함께, 항원과 염의 결합은 최종 백신의 품질 조절을 어렵게 한다. 특히, 인플 루엔자 백신에 대한 일부 효능 검사는 미결합 항원에 요구되는 시험관 내 면역측정법에 기초한다. 즉, 보조제의 흡착에 의하여 이러한 시험이 불가능하도록 하기 때문이다.

본 발명의 목적은 추가된 및 개선된 항원보강형 인플루엔자 백신(유행기 및 유행기 사이에 사용되기 위함) 및 이들의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 항원보강형 인플루엔자 백신의 항원 및 보조제 성분은 제조 중에 혼합되지 않으며, 별도 성분으로서 사용시 즉석 혼합용으로 제공된다. 본 발명은 항원의 보조제 흡착은 실질적으로 동시에 발생하며, 예방접종 중 경험하는 조건 하에서 비가역성이기 때문에 효과적이다(본원의 실시예 참조). 따라서 본 발명은 제조 중 혼합을 수행함으로써 발생되는 다양한 문제를 회피할 수 있게 된다.

따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 제공한다: (i) 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분; 및 (ii) 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분. 성분 (i)은 알루미늄 염 보조제를 포함하지 않으며, 성분 (ii)는 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하지 않는다. 본 발명은 동시 별개 또는 순차적 사용을 위한 (i) 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분, 및 (ii) 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분을 제공한다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원 및 알루미늄 염 보조제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 조성물은 사용 시점에서 항원 및 보조제의 즉석 혼합에 의하여 제조된다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 제공한다: (i) 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분을 제조하는 단계; (ii) 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분을 제조하는 단계; 및 (iii) 항원과 보조제 성분을 키트 내에서 조합하는 단계. 방법에는 (iv) 환자에 투여하기 위하여 항원과 보조제 성분을 혼합하는 단계를 포함할 수 있으나, (iv) 단계는 일반적으로 제조자 보다는 의료 전문가에 의하여 사용시에 수행된다.

본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 인플루엔자 백신의 준비 및 투여 방법을 제공한다: (i) 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분 및 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분을 포함하는 키트의 성분을 혼합하는 단계; 및 (ii) 혼합된 성분을 환자에 투여하는 단계. 이 방법은 일반적으로 보조제 성분을 진탕시켜 모든 침전된 알루미늄 염을 분산시키는 단계; 항원 성분에 보조제 성분을 무균적으로 첨가하는 단계; 혼합된 성분을 전화 또는 서서히 진탕하는 단계; 혼합된 성분을 주사기로 회수하는 단계; 및 혼합된 성분을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 환자 투여는 일반적으로 혼합 후 24 시간 이하로 발생한다(예컨대, 18 시간 이하, 12 시간 이하, 6 시간 이하, 3 시간 이하, 2 시간 이하, 1 시간 이하, 30 분 이하, 20 분 이하, 10 분 이하, 5 분 이하, 2 분 이하, 1 분 이하, 등).

키트

본 발명의 키트는 두 성분을 포함한다: 하나는 항원이며 다른 하나는 보조제이다. 이러한 두 성분은 환자에 투여하기 위하여 준비되기까지 키트 내에서 별도로 보관되며, 성분들이 혼합되는 시점에서 항원이 보조제에 흡착된 백신이 된다.

두 성분은 따라서 키트 내에서 서로 물리적으로 분리되며, 이 분리는 다양한 방법에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 두 성분은 바이알 등의 두 개의 분리된 용기 내에 존재할 수 있다. 두 바이알의 성분은 예컨대 하나의 바이알 성분을 제거하여 바이알에 첨가하여 혼합될 수 있거나, 또는 양 바이알의 성분을 별도로 분리하여 이들을 제3의 용기에서 혼합할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시상태에서, 키트 성분 중의 하나는 주사기 내에, 다른 성분은 용기 예컨대 바이알에 존재할 수 있다. 사전-충전 주사기가 사용되어(예컨대, 바늘 포함) 혼합을 위하여 제2의 용기로 성분을 주입하게 되며, 그 뒤 혼합물은 주사기로 회수될 수도 있다. 주사기의 혼합 성분은 이후 환자에 투여될 수 있으며, 일반적으로 멸균 바늘을 사용한다. 사전-충전 주사기에 일 성분을 포장함으로써 환자 투여용 별도의 주사기가 필요하지 않게 된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 두 키트 성분은 동일 주사기 내에서 별도로 보유될 수 있다. 예컨대, 이중-격실 주사기이며, 예컨대 이들은 참고자료 6-13 등에 상세하게 설명되어 있다. 주사기를 작동시키는 경우(예컨대, 환자 투여시) 두 격실의 성분이 혼합된다. 이러한 배열은 사용시 별도의 혼합 단계를 회피하게 된다. 두 격실의 성분은 일반적으로 둘 다 수성 형태이다.

본 발명의 일 실시상태에서, 일 성분(일반적으로 보조제 성분보다는 항원 성분)은 건조 형태(예컨대, 동결건조형)이며, 다른 성분은 수성 형태이다. 두 성분은 건조 성분을 활성화시키기 위하여 혼합될 수 있으며, 환자 투여를 위하여 수성 조성물이 주어질 수 있다. 또 다른 바람직한 실시 상태에서, 두 성분 모두 건조 형태일 수 있다. 동결건조 성분은 일반적으로 주사기보다는 바이알 내에 위치된다. 건조 성분은 안정화제 예컨대 락토오스, 슈크로스 또는 만니톨, 및 이들의 혼합물 예컨대, 락토오스/슈크로스 혼합물, 슈크로스/만니톨 혼합물, 등을 포함할 수 있다.

바람직한 일 실시 상태에서는 사전-충전 주사기 내의 수성 보조제 성분 및 바이알 내의 동결건조 항원 성분을 사용한다.

두 성분이 수성인 경우, 이들은 다양한 부피비로 혼합될 수 있으며, 예컨대, 1:5 (수성 항원의 초과 부피) 및 5:1 (수성 보조제의 초과 부피) 이다. 1:2 및 2:1의 비율이 바람직하다. 예컨대, 약 1:1이다.

키트용으로 적합한 용기는 바이알 및 1회용 주사기를 포함한다. 이러한 용기는 멸균되어 있어야 한다.

성분이 바이알 내에 존재하는 경우, 바이알은 유리 또는 플라스틱 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바이알은 조성물이 첨가되기 전에 멸균되는 것이 바람직하다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 회피하기 위하여, 바이알은 무-라텍스 정지기(stopper)로 밀봉되는 것이 바람직하며, 모든 포장 물질 내에 라텍스가 부재하는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 투여용 백신을 포함할 수 있으며, 또는 일 투여량 이상('다중투여' 바이알) 예컨대, 10회 투여량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 제조된다.

인플루엔자 백신은 일반적으로 약 0.5 ㎖의 복용부피로 투여되며, 그 절반 투여량(즉, 약 0.25 ㎖)이 어린이에게 투여될 수 있다. 용기는 절반 투여량을 나타내는 표시를 하여 아동에게 절반 투여량을 전달하는 것을 촉진할 수 있으며, 예컨대, 0.5 ㎖ 복용량을 함유하는 주사기는 0.25 ㎖ 부피를 나타내는 표시를 보유할 수 있다.

바이알은 캡(cap)(예컨대, Luer lock)을 구비하여 사전-충전 주사기가 캡에 삽입되어 주사기의 함유물이 바이알로부터 배제될 수 있으며(예컨대, 내부의 동결건조 물질의 재배치), 바이알의 함유물이 주사기에서 제거될 수 있다. 바이알로부터 주사기 제거 후, 바늘이 부착되고, 조성물이 환자에 투여될 수 있다. 캡은 밀봉부 또는 덮개 내부에 위치하여, 밀봉부 또는 덮개가 캡이 접촉하기 전에 제거되어야 한다. 바이알은 이들의 함유물의 항균 제거를 허용하는 캡, 특히 다중투여 바이알용 캡을 구비할 수 있다.

성분이 주사기 내로 포장되는 경우, 주사기는 이에 부착된 바늘을 구비할 수 있다. 바늘이 부착된 경우, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위하여 주사기와 함께 제공될 수 있다. 이러한 바늘은 내장될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 일반적이다. 주사기는 기록 유지를 위하여 함유물의 생산 번호 및 사용 기간이 인쇄된, 접착식(peel-off) 라벨이 제공될 수 있다. 주사기의 플런저(plunger)는 호흡중 플런저가 사고로 제거되는 것을 예방하기 위하여 정지기가 구비된 것이 바람직하다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 구비할 수 있다. 1회용 주사기는 단일 투여용 백신을 함유할 수 있다. 주사기는 바늘이 부착 전에 팁을 밀봉하기 위하여 팁 캡(tip cap)을 구비하는 것이 일반적이며, 팁 캡은 부틸 고무로 제조되는 것이 바람직하다. 주사기 및 바늘이 별도로 포장되는 경우, 이 후 바늘을 부틸 고무 차단재로 막는 것이 바람직하다. 바람직한 주사기는 상표 "Tip-Lok"™로 판매되는 것이다.

유리 용기 (예컨대, 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 라임 유리보다는 규산염 유리로 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

키트는 백신의 상세 예컨대, 투여 설명서, 백신 내의 항원의 상세, 등을 포함하는 인쇄물을 포함(예컨대, 동일 포장 내에)할 수 있다. 설명서에는 경고문 예컨대, 예방접종 후의 과민성 반응의 경우 아드레날린 용액을 사용하라는 등의 경고문을 포함할 수 있다.

키트는 2℃ 및 8℃에서 저장되는 것이 바람직하다. 이는 동결되어서는 아니된다.

인플루엔자 바이러스 항원

키트 성분 중의 하나는 인플루엔자 바이러스 항원을 함유한다. 이러한 항원은 일반적으로 인플루엔자 비리온으로부터 제조되나, 대안적으로, 항원 예컨대 적혈구응집소가 재조합 숙주 내에서 발현될 수 있으며(예컨대, 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 사용한 곤충 세포주), 정제된 형태로 사용된다[14,15]. 그러나, 일반적으로 항원은 비리온에서 온 것이다.

항원은 생 바이러스의 형태를 취하거나 또는, 더 바람직하게는, 불활성 바이러스이다. 바이러스의 불활성화를 위한 화학적 수단에는 하나 이상의 다음의 약제의 유효량에 의한 처리를 포함할 수 있다: 세척제, 포름알데히드, 포르말린, β-프로피오락톤, 또는 UV 광. 불활성화를 위한 추가적인 화학적 수단은 메틸렌 블루, 솔라렌, 카복시플러렌 (C60) 또는 이들의 모든 조합의 처리를 포함한다. 바이러스 불활성화의 다른 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다, 예컨대 예를 들어 2성분 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 감마선 조사이다. INFLEXAL™ 제품은 전 비리온 불활성화 백신이다.

불활성 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전 바이러스, 분할 바이러스, 또는 정제된 표면 항원(적혈구응집소 및, 일반적으로, 뉴라미니다아제를 포함)을 포함할 수 있다.

비리온은 다양한 방법을 통하여 바이러스-함유 유체로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 방법은 비리온을 파괴하는 성분을 함유한 선형 슈크로스 성분 용액을 사용하는 구역원심분리가 관계될 수 있다. 그 다음 항원은 선택적인 희석 후에 정용여과에 의하여 정제될 수 있다.

분할 바이러스는 비리온을 세척제(예컨대, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 인산, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 테르기톨 NP9, 등)로 처리하여 획득하여 '트윈-에테르' 분할 방법에 포함하는 서브비리온 제조물을 생산할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 분할 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 참고자료 16-21, 등. 바이러스의 분할은 일반적으로 감염성 또는 비감염성인 전 바이러스의 분할제의 파괴 농도로 파괴 또는 절편화에 의하여 수행된다. 파괴에 의하여 바이러스 단백질의 전체 또는 일부 가용화가 되었으며, 바이러스의 통합성을 변화시켰다. 바람직한 분할제는 비이온성 및 이온성(예컨대, 양이온성) 계면활성제 예컨대, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카마이드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 인산염, 세타브론, 미리스틸트리메틸암모늄염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대, 트리톤 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르, 등이다. 유용한 하나의 분할 방법은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속 효과를 사용하며, 분할은 초기 비리온 분리정제시 발생할 수 있다(예컨대, 설탕 밀도 성분 용액 내에서). 따라서 분할 방법은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확된 비리온의 농도(예컨대, 흡착 방법, 예컨대 CaHPO₄ 흡착을 사용), 비-비리온 물질로부터 전 비리온의 분리, 밀도 성분 원심분리 단계에서 분할제를 사용하는 비리온 분할(분할제 예컨대, 나트륨 데옥시콜레이트를 함유한 설탕 성분을 사용), 및 원치않는 물질을 제거하기 위한 후속적인 여과(예컨대 초여과)가 관여될 수 있다. 분할 비리온은 나트륨 인산염-완충 등장성 염화 나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품은 분할 백신이다.

정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 적혈구응집소 및, 일반적으로, 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태의 이러한 단백질의 제조 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 서브유닛 백신이다.

인플루엔자 단백질 HA 및 NA는 천연 단백질의 절편을 포함하는 인플루엔자 항원으로 사용될 수 있다. 이들의 조합이 사용될 수 있다.

인플루엔자 항원은 바이로솜의 형태로 나타낼 수 있다[22].

인플루엔자 바이러스는 약독화될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도-민감성이 될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 저온-적응형일 수 있다. 이러한 3 가지 가능성은 생 바이러스에 특히 적용된다.

백신에 사용되는 인플루엔자 바이러스 균주는 계절별로 변화될 수 있다. 현재의 대유행기간 사이에서, 백신은 일반적으로 두 인플루엔자 A 균주(H1N1 및 H3N2) 및 하나의 인플루엔자 B 균주를 포함하며, 및 3가 백신이 일반적이다. 본 발명은 유행성 균주(즉, 백신 수용자 및 일반 인간 개체군이 면역학적으로 미경험인 균주)의 HA, 예컨대 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주(특히 인플루엔자 A 바이러스의 균주)를 사용할 수도 있으며, 유행성 균주용 인플루엔자 백신은 1가가 되거나 또는 유행성 균주에 의하여 보충된 정상 3가 백신에 기초할 수 있다. 그러나, 계절 및 백신에 포함된 항원의 특성에 따라, 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대하여 보호될 수 있다.

본 발명의 항원보강형 조성물은 유행성 균주에 대한 접종에 특히 유용하다. 유행성 발병을 유발할 수 있는 능력을 부여하는 인플루엔자 균주의 특성은: (a) 이는 현재-순환되는 인간 균주 내의 적혈구응집소에 비하여 신규의 적혈구응집소를 함유하며, 즉, 10년 이상 인간 개체군에게 명백하지 않거나(예컨대 H2), 또는 이전에 인간 개체군에서 발견되지 않은 것(예컨대 H5, H6 또는 H9, 일반적으로 조류 개체군에서만 발견)으로서, 인간 개체군이 균주의 적혈구응집소에 면역학적으로 미경험인 것; (b) 인간 개체군에 수평적으로 감염될 수 있는 것; 및 (c) 인간에 병원성인 것. H5 적혈구응집소 타입을 보유한 바이러스는 유행성 인플루엔자, 예컨대 H5N1 균주에 대한 면역접종에 바람직하다. 그 밖의 가능한 균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 기타 발생하는 잠재적인 유행성 균주를 포함한다. H5 서브타입 내에서, 바이러스는 HA 클레이드 1, HA 클레이드 1', HA 클레이드 2 또는 HA 클레이드 3 [23]에 해당될 수 있으며, 클레이드 1 및 3는 특히 관련되어 있다.

조성물 내에 유용하게 포함될 수 있는 항원의 그 밖의 균주는 저항성 유행성 균주를 포함하는 항바이러스 요법에 내성(예컨대 오셀타미비르[24] 및/또는 자나미비르에 내성)인 균주이다[25].

본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의(예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의) 인플루엔자 바이러스 균주의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 다른 균주는 일반적으로 분리하여 성장하며, 바이러스를 수확한 후에 혼합되고, 항원이 제조된다. 따라서 본 발명의 방법은 하나 이상의 인플루엔자 균주의 항원 혼합 단계를 포함할 수 있다. 1가 백신이 유용함에도(예컨대, 유행성 균주에 대하여), 3가 백신은 두 종의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원을 포함하는 것이 바람직하다.

인플루엔자 바이러스는 재배열 균주일 수 있으며, 역 유전학 기법에 의하여 획득할 수 있다. 역 유전학 기법[예컨대, 26-30]에 의하여 소망하는 게놈 부분을 함유한 인플루엔자 바이러스를 플라스미드를 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다. 일반적으로, 이는 (a) 예컨대, polI 프로모터로부터 소망하는 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자, 및 (b) 예컨대, polII 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자의 발현과 관련되어 있어, 세포 내에서 두 유형의 DNA의 발현에 의하여 완전 무손상 감염성 비리온의 조립을 유도한다. DNA는 바이러스 RNA 및 단백질 모두를 제공하는 것이 바람직하나, 또한 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하여 일부의 RNA 및 단백질을 제공하는 것도 가능하다. 각 바이러스 RNA를 생산하기 위한 별도의 플라스미드를 사용하는 플라스미드계 방법이 바람직하며[31-33], 이러한 방법은 바이러스 단백질의 전부 또는 일부(예컨대, PB1, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현하기 위하여 일부 방법에서 사용되는 12 플라스미드를 사용하는 것이다.

필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위하여, 최근의 연구[34]는 복수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트 (바이러스 RNA 합성용)를 동일한 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A vRNA 부분을 암호화하는 서열)상에서 결합하고, RNA 중합효소 II 프로모터를 보유한 복수의 단백질-암호화 영역을 다른 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A mRNA 전사체를 암호화하는 서열)상에서 결합한다. 참고자료 34의 방법의 바람직한 특징은: (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA-암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상의 모든 8 vRNA-암호화 부분이다. 일 플라스미드 상의 NA 및 HA 부분 및 다른 플라스미드 상의 6개의 다른 부분을 포함하는 것은 문제를 촉진시킬 수 있다.

바이러스 RNA 부분을 암호화하기 위한 polI 프로모터를 사용의 대안으로서, 박테리오파아지 중합효소 프로모터를 사용할 수 있다 [35]. 예를 들면, SP6, T3 또는 T7 중합효소의 프로모터는 편리하게 사용할 수 있다. polI 프로모터의 종-특이성 때문에, 박테리오파아지 중합효소 프로모터는 외인성 중합효소를 암호화하는 플라스미드로 전달감염되어야 함에도 많은 세포 유형(예컨대, MDCK)에 대하여 더욱 편리할 수 있다.

다른 기법으로서, 2중 polI 및 polII 프로모터를 사용하여 바이러스 RNA 및 단일 주형으로부터 발현가능한 mRNA를 동시에 암호화할 수 있다[36,37].

따라서, 바이러스(특히 인플루엔자 A 바이러스)는 A/PR/8/34 바이러스의 하나 이상의 RNA 부분(일반적으로 백신 균주의 HA 및 N 부분을 보유한 A/PR/8/34의 6 부분, 즉 6:2 재분류)을 포함할 수 있다. 특히, 바이러스가 난자에서 성장하는 경우, 이는 A/WSN/33 바이러스, 또는 백신 제조를 위하여 재분류 바이러스를 생산하기에 유용한 다른 바이러스 균주의 하나 이상의 RNA 부분을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 인간-대-인간 감염이 가능한 균주에 대하여 보호하며, 따라서 균주의 게놈은 일반적으로 포유류 (예컨대 인간) 인플루엔자 바이러스에서 유래한 최소한 하나의 RNA 부분을 포함하게 된다. 이는 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래한 NS 부분을 포함할 수도 있다.

항원의 공급원으로 사용된 바이러스는 SPF 난(egg) 또는 세포 배양물 상에서 성장할 수 있다. 현재 인플루엔자 바이러스 성장용 표준 방법은 계란 함유물(요막액)으로부터 정제된 바이러스를 보유한 수정 계란을 사용한다. 보다 근자에는, 그러나, 바이러스는 속도와 환자의 알러지의 이유로 동물 세포 배양물에서 성장되었으며, 이 성장 방법이 바람직하다. 난 기초 바이러스 성장이 사용되는 경우, 하나 이상의 아미노산이 바이러스와 함께 난 요막액으로 도입될 수 있다[18].

세포 기질은 일반적으로 포유류 세포주가 될 수 있다. 적합한 포유류 원 세포에는 햄스터, 가축류, 영장류(인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 세포 유형, 예컨대 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포, 폐 세포, 등이 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포는 BHK21 또는 HKCC로 명명된 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는 예컨대 아프리카 그린 원숭이 세포로서, 예컨대 신장 세포는 베로 세포주이다. 적합한 개 세포는 예컨대 신장 세포로서 MDCK 세포주이다. 따라서 적합한 세포주는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등. 포유류 세포의 용도는 예컨대 닭 DNA, 계란 단백질 (예컨대 난알부민 및 난점질) 등의 물질이 부재할 수 있는 것을 의미하며, 따라서 알러지 유발성을 감소시킨다.

인플루엔자 바이러스 성장용 바람직한 포유류 세포주는 다음을 포함한다: 메디안 더비 카닌 신장으로부터 유도된 MDCK 세포[38-41]; 아프리칸 그린 원숭이(세르코피테쿠스 아에티오프스(Cercopithecus aethiops)) 신장으로부터 유도된 베로 세포[42-44]; 또는 인간 배아성 망막모세포로부터 유도된 PER.C6 세포[45]. 이러한 세포주는 예컨대 아메리칸 타입 셀 컬쳐(ATCC) 콜렉션[46], 코리엘 셀 레포지토리(Coriell Cell Repositories)[47], 또는 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC) 등으로부터 광범위하게 활용가능하다. 예를 들어, ATCC는 다양한 다른 베로 세포를 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587에서 공급하며, 이는 MDCK 세포를 카탈로그 번호 CCL-34에서 공급한다. PER.C6는 ECACC로부터 수탁 번호 96022940로서 활용가능하다. 포유류 세포주의 덜 바람직한 대안으로서, 바이러스는 조류 세포주[예컨대, 참고자료 4850] 상에서 성장할 수 있으며, 오리로부터 유도된 세포(예컨대, 오리 망막) 또는 닭 예컨대, 닭 배아 섬유모세포(CEF), 등을 포함한다. 예로서는 조류 배아 줄기 세포[48, 51]를 포함하며, 닭 배아 줄기 세포, EB45, EB14, 및 EB14-074로부터 유도된 EBx 세포주를 포함한다[52].

인플루엔자 바이러스 성장에 가장 바람직한 세포주는 MDCK 세포주이다. 원 MDCK 세포주는 ATCC에서 CCL-34로서 이용가능하나, 이 세포주의 유도체를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 참고자료 38은 현탁액 배양시 성장에 적응된 MDCK 세포주를 개시하였다('MDCK 33016', 수탁 번호 DSM ACC 2219). 이와 유사하게, 참고자료 53은 현탁액의 무형청 배양시 성장하는 MDCK-유도성 세포주를 개시하였다('B-702', 수탁 번호 FERM BP-7449). 참고자료 54는 비-종양유발성 MDCK 세포로서, 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103'(PTA-6503)를 포함하는 세포를 개시하였다. 참고자료 55는 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL-12042)를 포함하는 감염에 대한 고 민감성 MDCK 세포주를 개시하였다. 모든 이러한 MDCK 세포주를 사용할 수 있다.

바이러스가 포유류 세포주에서 성장하는 경우, 키트 내의 항원 성분은 계란 단백질(예컨대, 난알부민 및 난점질) 및 닭 DNA가 부재하여, 알러지항원성을 감소시키는 것이 유리하다.

바이러스가 세포주 상에서 성장하는 경우, 성장용 배지, 및 배양 개시시 사용된 바이러스 접종물이 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스 3(parainfluenza virus 3), SARS 코로나바이러스(SARS coronavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 레오바이러스(reovirus), 폴리오마바이러스(polymavirus), 비르나바이러스(birnavirus), 시르코바이러스(circovirus), 및/또는 파르보바이러스(parvovirus)가 부재(즉, 시험되어, 오염에 음성인)한 것이 바람직하다[56]. 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)의 부재가 특히 바람직하다.

바이러스는 세포주 상에서 성장되는 경우, 숙주 세포 DNA가 소량으로 존재함에도, 항원 성분이 투여당 잔여 숙주 세포 DNA를 10 ng 이하 (바람직하게는 2 ng 이하, 더 바람직하게는 100 pg 이하)로 함유하는 것이 바람직하다. DNA 오염은 표준 정제 절차 예컨대, 크로마토그래피, 등을 사용하여 백신 제조 중에 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리 예컨대, DNase에 의하여 증진될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거의 편리한 방법은 참고자료 57 및 참고자료 58에 관련되어 있으며, 이들은 2 단계 처리에 관한 것으로서, 우선 바이러스 성장시 DNase(예컨대 벤조나아제)를 사용하고, 그 다음 비리온의 파괴시 양이온 세척제(예컨대 CTAB)를 사용한다. 알킬화제, 예컨대 β-프로피오락톤 처리는 숙주 세포 DNA를 제거하기 위하여 사용될 수 있으며, 비리온을 불활성화하기 위하여 사용하는 것이 유리하다[59].

15㎍의 적혈구응집소당 10 ng 이하(예컨대 이하, 1ng 이하, 100 pg 이하)의 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이 바람직하며, 2.25 ㎖ 부피당 10 ng 이하(예컨대 이하, 1 ng 이하, 100 pg 이하) 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이다. 50 ㎍의 적혈구응집소당 10 ng 이하(예컨대 1 ng 이하, 100 pg 이하)의 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이 바람직하며, 0.5 ㎖ 부피당 10 ng 이하(예컨대 이하, 1 ng 이하, 100 pg 이하)의 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이다.

모든 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500 bp 이하, 예컨대, 400 bp 이하, 300 bp 이하, 200 bp 이하, 100 bp 이하, 등인 것이 바람직하다.

세포주의 성장에 있어서, 예컨대 MDCK 세포의 경우, 바이러스는 현탁액 [38,60 61] 또는 유착 배양물의 세포에서 성장할 수 있다. 현탁액 배양을 위한 적합한 MDCK 세포주의 하나는 MDCK 33016(DSM ACC 2219로 기탁)이다. 대안으로서, 마이크로담체 배양물이 사용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장하는 것이 바람직하다. 배지는 본원에서 무혈청 배지라는 의미로 사용되며, 인간 또는 동물 기원의 혈청에 첨가제를 부가하지 않은 것이다. 무단백질은 세포를 조작하여 단백질, 성장 인자, 기타 단백질 첨가제 및 비혈청 단백질의 배제로 발생하며, 선택적으로 단백질 예컨대 바이러스 성장에 필수적인 트립신 또는 기타 단백질분해효소를 포함할 수 있는 배양을 의미한다. 이러한 배양액 내에서의 세포 성장에 의하여 자연적으로 자신들의 단백질을 보유하게 된다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 예를 들어 바이러스 복제시 37℃ 이하[62] (예컨대, 30-36℃, 또는 약 3O℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃)에서 성장하는 것이 바람직하다.

배양된 세포 내의 바이러스 증식 방법은 일반적으로 배양된 세포를 배양된 균주로 접종하는 단계, 예를 들어 바이러스 티터 또는 항원 발현에 의하여 측정하여 (예컨대 접종 후 24 내지 168 시간) 바이러스 증식을 위한 소망하는 시간 동안 감염된 세포를 수확하는 단계, 및 증식된 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 바이러스(PFU 또는 TCID₅₀로 측정)로, 세포비가 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 더 바람직하게는 1:50 내지 1:10이 되도록 접종할 수 있다. 바이러스 세포의 현탁액에 첨가되거나 또는 세포의 단일층에 도포될 수 있으며, 바이러스는 세포에 최소한 60 분간 흡수되나 일반적으로 300 분 이하, 바람직하게는 90 내지 240 분으로, 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃이다. 감염된 세포 배양물(예컨대 단일층)은 냉동-해동법 또는 수확된 배양 상청액의 바이러스 함량을 증가시키는 효소 반응 등에 의하여 제거될 수 있다. 수확된 유체를 불활성 또는 냉동 저장한다. 배양된 세포는 감염다중도("m.o.i.")가 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더 바람직하게는 0.001 내지 2로 감염될 수 있다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 m.o.i가 약 0.01로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60 시간 후 수확된다. 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간 후 수확된다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 감염 후 38 내지 40 시간 후 수확된다. 단백질분해효소(일반적으로 트립신)는 일반적으로 세포 배양 중에 첨가되어 바이러스 방출이 되도록 하며, 단백질분해효소는 배양 중 모든 적합한 단계에서 첨가될 수 있다.

적혈구응집소(HA)는 현재의 불활성 인플루엔자 백신 내의 주 면역원이며, 백신 투여량은 일반적으로 SRID에 의하여 측정된 HA 수준으로 표준화되었다. 현존하는 백신은 일반적으로 약 15㎍의 HA를 균주당 함유하나, 예컨대 아동용으로, 또는 유행성인 경우, 또는 보조제를 사용하는 경우에는 적은 투여량으로 사용될 수도 있다. 분할 투여량 예컨대 1/2 (즉, 7.5 ㎍ HA/ 균주), 1/4 및 1/8가 고복용량(예컨대 3x 또는 9x 투여량[63,64])으로 사용될 수 있다[4,5]. 따라서 백신은 0.1 내지 150 ㎍의 HA/인플루엔자 균주, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎍, 예컨대 0.1-20 ㎍, 0.1-15 ㎍, 0.1-10 ㎍, 0.1-7.5 ㎍, 0.5-5 ㎍, 등을 포함할 수 있다. 특정 투여량은 예컨대 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다. 본 발명에서 보조제가 백신에 존재하는 경우 이러한 낮은 투여량이 가장 유용하다.

생백신의 경우, 투여량은 HA 함량보다는 정중 조직 배양 감염성 투여량(TCID₅₀)에 의하여 측정되며, TCID₅₀가 균주당 10⁶ 내지 10⁸ (바람직하게는 10^6.5-10^7.5)인 것이 일반적이다.

본 발명에 사용되는 HA는 바이러스에서 발견되는 천연 HA일 수 있으며, 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, HA는 결정기(예컨대, HA1 및 HA2의 분할 부위 부근의 과염기성 영역)을 제거하여 바이러스가 조류 종에서 고병원성이 되도록 변형된다고 알려져 있으며, 이는 이러한 결정기가 난(egg) 내에서 성장된 바이러스를 예방할 수 있기 때문이다.

본 발명의 키트의 항원성분은 특히 분할 또는 표면 항원 백신에 대하여 세척제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('트윈'으로 알려짐), 옥트옥시놀(예컨대 옥트옥시놀-9 (트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 세척제는 단지 소량으로 존재하게 된다. 따라서, 백신은 1 ㎎/㎖ 이하의 옥트옥시놀-10, α-토코페릴 하이드로겐 석시네이트 및 폴리소르베이트 80를 각각 포함할 수 있다. 소량의 기타 잔여 성분은 항생제(예컨대, 네오마이신, 카나마이신, 폴리마이신 B)일 수 있다.

불활성화되었으나 비-전 세포 백신(예컨대, 분할 바이러스 백신 또는 정제된 표면 항원 백신)은 기질 단백질을 포함할 수 있으며, 이는 이 항원 내에 위치하는 추가적인 T 세포 에피토프로부터 이익을 얻기 때문이다. 따라서 적혈구응집소 및 뉴라미니다아제를 포함하는 비-전 세포 백신(특히 분할 백신)은 추가적으로 M1 및/또는 M2 기질 단백질을 포함할 수 있다. 기질 단백질이 존재하는 경우, 검출가능한 수준의 M2 기질 단백질, 또는 M1 단백질의 절편이 포함되는 것이 바람직하다. 핵단백질이 포함될 수도 있다.

보조제

인플루엔자 백신에 사용된 보조제는 키토산[65], 수중유 에멀젼 예컨대 MF59[66], 수중유중수 에멀젼[67], 알루미늄 염[2,5], CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 7909[68], 에셔리시아 콜리(E.coli) 열 불안정 독소[69,87] 및 이들의 독소제거 돌연변이[70-71], 모노포스포릴 지질 A [72] 및 이들의 3-O-데아실화 유도체[73], 백일해 독소 돌연변이[74], 무라밀 디펩타이드[75], 등을 포함한다.

본 발명에 의하면, 그러나, 보조제 성분은 알루미늄 염을 기초로 한다. 이러한 염에는 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄으로 알려진 보조제가 포함된다. 이러한 명칭은 통상적인 것이나, 편의를 위한 것일 뿐이며, 제공된 실제 화학적 화합물의 정확한 명세가 아니다[예컨대, 참고자료 76의 9장]. 본 발명은 일반적으로 보조제로 사용되는 모든 "수산화물" 또는 "인산염" 보조제를 사용할 수 있다.

"수산화 알루미늄"으로 알려진 보조제는 일반적으로 수산화 알루미늄(수산화 알루미늄) 염이며, 일반적으로 최소한 부분적으로 결정이다. 화학식 AlO(OH)로 나타내는 수산화 알루미늄은 알루미늄 화합물, 예컨대 수산화 알루미늄 Al(OH)₃ 과 적외선(IR) 스펙트럼조사에 의하여 구별되며, 특히 1070 cm^-1의 흡수 밴드 및 3090-3100 cm^-1에서의 강한 숄더(shoulder)의 존재에 의하여 구별된다[참고자료 76의 9장]. 수산화 알루미늄 보조제의 결정도는 작은 입자 크기에 기인하여 확장된 큰 선을 나타내는 불충분하게-결정화된 입자와 함께, 절반 높이에서의 회절 밴드의 폭(WHH)을 반영한다. 표면 영역은 WHH가 증가함에 따라 증가하며, WHH 값이 큰 보조제는 항원 흡착 능력이 크다는 것을 보여주었다. 섬유 형태학(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰)은 수산화 알루미늄 보조제에 일반적이다. 수산화 알루미늄 보조제의 pI(파이)는 일반적으로 약 11이며, 즉 보조제 자체가 생리학적 pH에서 양성 표면 전하를 보유하게 된다. 수산화 알루미늄 보조제에 대하여 pH 7.4에서 1.8 내지 2.6 ㎎ 단백질/㎎ Al⁺⁺⁺의 흡착능이 보고되었다.

"인산 알루미늄"으로 알려진 보조제 일반적으로 수산화인산 알루미늄 염이며, 때로는 소량의 황산염(즉 수산화인산 알루미늄 황산염)을 함유한다. 이들은 침전에 의하여 획득할 수 있으며, 침전시의 반응 조건 및 농도는 염 내의 인산염과 히드록실기의 치환도에 영향을 미친다. 수산화인산은 일반적으로 PO₄/Al 몰비가 0.3 내지 1.2이다. 수산화인산은 히드록실기의 존재에 의하여 AlPO₄와 구별될 수 있다. 예를 들어, 3164cm^-1에서의 IR 스펙트럼 밴드(예컨대, 200℃로 가열시)는 구조적 히드록실기의 존재를 나타낸다[참고자료 76의 9장].

인산 알루미늄 보조제 PO₄/A1³⁺ 몰비는 일반적으로 0.3 내지 1.2이며, 바람직하게는 0.8 내지 1.2, 더 바람직하게는 0.95±0.1이다. 인산 알루미늄은 일반적으로 무정형이며, 특히 수산화인산염에서 그러하다. 일반적인 보조제는 무정형 수산화인산 알루미늄으로서 PO₄/A1 몰비가 0.84 내지 0.92이며, 0.6 ㎎의 Al³⁺/㎖를 포함한다. 인산 알루미늄은 일반적으로 입자화된다(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰시 판-유사 형태). 일반적인 입자의 직경은 어떠한 항원 흡착 후 0.5 내지 20μm (예컨대, 약 5 내지 10μm)이다. 인산 알루미늄 보조제는 pH 7.4에서 0.7 내지 1.5 ㎎ 단백질/㎎ Al⁺⁺⁺의 흡착능을 나타낸다고 보고되었다.

인산 알루미늄의 0 전하점(PZC)은 인산염과 히드록실기의 치환도에 강하게 연관되어 있으며, 이 치환도는 침전에 의한 염 제조시 사용되는 반응물의 반응 조건 및 농도에 의존하여 달라질 수 있다. PZC는 용액 내의 유리 인산 이온의 농도 변화시키거나(인산 증가 = 산성 PZC 증가) 또는 완충제 예컨대 히스티딘 완충제를 첨가(PZC를 더욱 염기성화)함으로서 변화된다. 본 발명에 사용된 인산 알루미늄은 일반적으로 PZC가 4.0 내지 7.0, 더 바람직하게는 5.0 내지 6.5 예컨대, 약 5.7이다.

본 발명 조성물의 제조에 사용된 알루미늄 염의 현탁액은 완충제(예컨대, 인산 또는 히스티딘 또는 트리스 완충제)를 포함하나, 항상 요구되는 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게는 무균 및 무발열원이다. 현탁액은 유리 수성 인산 이온을 포함할 수 있으며 예컨대, 1.0 내지 2O mM, 바람직하게는 5 내지 15 mM, 및 더 바람직하게는 약 10 mM로 존재한다. 현탁액은 염화 나트륨을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시 상태에서, 보조제 성분은 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄의 혼합물을 포함한다[4]. 이 경우 인산 알루미늄이 수산화기보다 더 함유되며, 예컨대, 중량비로 최소한 2:1 예컨대, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 이상, 등이다.

환자 투여용 조성물 내의 Al⁺⁺⁺의 농도는 바람직하게는 10㎎/㎖ 이하, 예컨대, 5 ㎎/㎖ 이하, 4 ㎎/㎖ 이하, 3 ㎎/㎖ 이하, 2 ㎎/㎖ 이하, 1 ㎎/㎖, 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1 ㎎/㎖이다. 최대 0.85㎎/투여 이하가 바람직하다.

하나 이상의 알루미늄 염 보조제를 포함할 뿐만 아니라, 보조제 성분은 하나 이상의 추가의 보조제 또는 면역자극제를 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 성분은 3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A 보조제('3d-MPL'); 및/또는 수중유 에멀젼을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 3d-MPL은 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A 또는 3-O-데아실-4'-모노포스포릴 지질 A를 의미한다. 이 이름은 모노포스포릴 지질 A 내의 환원 말단 글루코사민의 3 위치가 데-아실화되었다는 것을 의미한다. 3dMPL는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)의 무헵토스(heptoseless) 돌연변이로부터 제조되었으며, 지질 A와 화학적으로 유사하나, 산-불안정성 포스포릴기 및 염기-불안정성 아실기가 결핍되어 있다. 이는 단핵구/대식세포 계통의 세포를 활성화하고, IL-1, IL-12, TNF-α 및 GM-CSF를 포함하는 수종의 사이토카인의 방출을 자극한다. 3d-MPL의 제조는 참고자료 77에 설명되어 있으며, 그 산물은 Corixa Corporation사의 상표 MPL™로 제조 판매된다. 더 자세한 사항은 참고자료 78 내지 81에서 찾을 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 다른 실시 상태에서, 칼슘 염이 알루미늄 염 대신 사용되었다. 이러한 실시 상태에서, 보조제 성분은 일반적으로 인산 칼슘 염을 포함한다.

약학적 조성물

키트의 항원 성분 및 보조제 성분은 둘 모두 이들의 혼합 산물로서 약학적으로 허용가능하다. 혼합 산물은 항원 및 보조제와 함께 성분을 포함할 수 있다. 이러한 것들은 항원 성분 및/또는 보조제 성분 및/또는 선택적 제3 성분으로부터 기원한 것일 수 있다.

따라서, 최종 혼합물은 일반적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 이러한 성분에 대한 철저한 논의는 참고자료 82에서 찾을 수 있다.

최종 조성물은 하나 이상의 보존제, 예컨대 티오메살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 바람직한 것은, 그러나, 백신에 실질적으로 수은성 물질이 부재(즉 5㎍/㎖ 이하), 예컨대 무-티오메살이어야 한다[17, 83]. 수은을 함유하지 않은 백신이 더 바람직하다. 무-보존제 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 조절하기 위하여 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다, 예컨대 등장성을 조절하기 위한 나트륨염이다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20 ㎎/㎖ 사이에 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 기타 염은 염화 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 디나트륨 인산염 디하이드레이트, 염화 마그네슘, 염화 칼슘, 등을 포함한다.

조성물이 시트르산 이온을 포함할 수 있다.

투여용 조성물은 일반적으로 삼투압이 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg이며, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있다. 삼투압은 예방접종에 의하여 야기된 통증에 대한 영향이 사전에 보고된바 없다[84], 그럼에도 이 범위의 삼투압을 유지하는 것이 바람직하다.

조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 일반적인 완충제는: 인산염 완충제; 트리스 완충제; 붕산염 완충제; 숙신산염 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트르산 완충제를 포한다. 완충제는 일반적으로 5-2O mM의 범위로 포함된다.

조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 일반적으로 6.0 및 8.0 예컨대 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8이다. 본 발명의 방법은 따라서 포장 전에 충전 백신의 pH를 조절하는 단계를 포함한다.

용기를 포함하는 개별 키트 성분은 바람직하게는 무균이다.

키트 성분은 바람직하게는 비-발열원성으로서, 예컨대 1 EU(내부독소 유닛, 표준 측정)/복용량 이하, 바람직하게는 0.1 EU/복용량 이하를 함유한다.

키트 성분은 바람직하게는 무 글루텐이다.

키트 성분은 단일 예방접종용 물질을 포함할 수도 있으며, 다중 예방접종용 물질을 포함할 수도 있다(즉 '다중복용' 키트). 따라서, 예를 들어, 10 회 투여분의 항원이 하나의 용기에 포함될 수 있으며, 10 회분의 보조제가 제2의 용기에 포함될 수도 있다. 두 성분은 시술시 혼합되어 하루 동안 일련의 환자에 대한 10 회 투여를 제공할 수 있다. 각 투여량은 투여용 새 주사기로 제거될 수 있다. 보존제의 함유는 다중복용 준비에 유용하다. 다중복용 조성물 내의 보존제 함유의 대안(또는 이와 함께)으로서, 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터를 보유한 용기에 함유될 수 있다.

치료 방법, 및 백신의 투여

혼합 후, 본 발명의 조성물은 인간 환자에 투여되기에 적합하며, 본 발명은 환자에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 의약으로서 사용되는 본 발명의 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명은 환자 내에서 면역 반응을 증진시키는 의약의 제조시 (i) 인플루엔자 바이러스 항원 및 (ii) 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분의 용도를 제공하며, 여기서, 의약은 별도 성분으로서 항원 및 보조제를 포함한다.

이러한 방법 및 용도에 의하여 증진된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함한다. 항체 반응의 사정, 능력의 중화 및 바이러스 예방접종 후 보호 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 인플루엔자 바이러스에 대하여, 예를 들면, 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 적혈구응집소에 대한 항체 티터는 보호와 연관되어 있다는 것을 보여주었다(약 30-40의 혈청 시료 적혈구응집-억제 티터는 동종 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호한다)[85]. 항체 반응은 일반적으로 적혈구응집소화 억제, 마이크로중성화, 단일 반경 면역확산(SRID), 및/또는 단일 반경 용혈(SRH)에 의하여 측정된다. 이러한 측정 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 예방접종 경로는 근육내 주입(예컨대 팔 또는 다리)에 의한 것이나, 다른 활용할 수 있는 경로에는 피하조직 주입, 비강내[86-88], 구강[89], 진피내[90,91], 경피성, 경피[92], 등을 포함한다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 성인 및 어린이 모두의 치료에 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6 세 이상의 소아 및 성인에 사용되도록 제안되고 있다. 따라서, 환자는 1 세 이하, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는 최소한 55 세일 수 있다. 환자는 고령(예컨대 50 세 이상, 60 세 이상, 및 바람직하게는 65 세 이상), 유아(예컨대 5 세 이하), 입원 환자, 요양중인 작업자, 군인 및 군사 요원, 임산부, 만성 환자, 면역결핍 환자, 백신 투여 전 7일 이내에 항바이러스 화합물 (예컨대 인플루엔자용 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 복용한 환자, 계란 알러지가 있는 사람 및 국외 여행중인 환자일 수 있다. 백신은 이러한 그룹에 단독으로 적합하지는 않다, 그러나, 일반적으로 집단적으로 사용될 수 있다. 유행성 균주에 있어서는, 모든 연령의 집단의 투여에 바람직하다.

본 발명에 의하여 생산되는 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 또는 예방접종 센터에 방문시에)에 환자에 투여될 수 있으며, 예컨대, 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 컨쥬게이트된 H. 인플루엔자 타입 b 백신, 불활성화 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 컨쥬게이트 백신 (예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 컨쥬게이트 백신, 등과 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 또는 수막구균 백신이 실질적으로 동시에 투여되는 것이 특히 노령의 환자에 유용하다.

이와 유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물과 실질적으로 동시(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 방문시에)에 투여될 수 있다. 특히, 항바이러스 화합물이 인플루엔자 바이러스(예컨대, 오셀타미비르)일 수 있다. 이러한 항바이러스는 뉴라미다아제 억제제, 예컨대, (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산 및, 이들의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 이들의 염(예컨대 인산염)을 포함한다. 인플루엔자에 대하여 효과적인 바람직한 항바이러스는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산, 에틸 에스테르, 인산염(1:1)이며, 이는 오셀타미비르 인산염(TAMIFLU™)으로 알려져 있다.

치료는 단일 투여 계획 또는 다중 투여 계획에 의할 수 있다. 다중 투여는 1차 예방접종 계획 및/또는 추가 예방접종 계획에 사용될 수 있다. 일 복용량 이상의 투여(일반적으로 2 복용량)은 특히 면역학적으로 미경험 환자에 유용하다. 예컨대, 인플루엔자 백신을 전에 투여받은 경험이 없는 사람, 또는 신규의 HA 서브타입에 대한 접종(유행성 발병)에 유용하다. 다중 투여는 일반적으로 최소한 1 주 간격(예컨대 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 6 주, 약 8 주, 약 10 주, 약 12 주, 약 16 주, 등.)으로 투여될 수 있다.

본원의 조성물 및 키트는 알루미늄-기초 보조제를 포함하며, 성분의 고정은 저장시 발생할 수 있다. 조성물은 환자 투여 전에 진탕해 주어야 한다. 진탕된 조성물은 불투명한 백색의 현탁액이다.

일반

용어 "포함하는(comprising)"은 "포함(including)" 및 "구성(consisting)"을 포괄하며 예컨대 X를 "포함하는" 조성물 배타적으로 X로 구성되거나 또는 추가적인 무엇인가를 포함할 수 있으며, 예컨대 X + Y 이다.

단어 "실질적으로(substantially)"는 "완전히(completely)"를 배제하지 않는다. 예컨대 Y가 "실질적으로 부재하는" 조성물은 Y가 완전히 부재할 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

용어 "약"은 수치 X에 관하여, 예를 들어, x+10%를 의미한다.

특별한 업급이 없다면, 이 이상의 성분이 혼합되는 단계를 포함하는 방법은 특이적 혼합 순서를 요하는 것이 아니다. 따라서 성분들은 어떠한 순서로 혼합될 수도 있다. 세 성분이 존재하는 경우, 두 성분이 서로 결합될 수 있고, 그 후 제3 성분 등과 결합하여 조합될 수 있다.

항원이 보조제에 "흡착된" 것으로 설명되는 경우, 최소한 50%의 항원이 흡착되는 것이 바람직하며, 예컨대, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상이다.

동물(및 특히 소) 물질이 세포 배양에 사용되는 경우, 감염성 해면상뇌증(TSE), 및 특히 소 해면상뇌증(BSE)이 없는 공급원으로부터 획득하여야한다. 전반적으로, 동물-유도성 물질이 전부 부재한 배양 세포가 바람직하다.

세포 기질이 재배열 또는 역 유전학 절차에 사용되는 경우, 인간 백신 생산에 승인된 것이 바람직하며, 예컨대 Ph Eur general chapter 5.2.3이다.

인플루엔자 바이러스 백신의 항원보강을 위한 알루미늄 염 사용에 관련된 전술한 문제점 때문에, 사용시까지 보조제 및 항원 성분이 분리되어 있으나, 항원 흡 착이 여전히 발생하는 백신이 제조되는지 여부를 검사하기로 결정하였다. 이 접근법의 가능성을 결정하기 위하여, 인플루엔자 바이러스에서 정제된 표면 항원을 수산화 알루미늄 현탁액과 혼합하였다. 혼합 후 즉시, 알루미늄 염은 벤치 원심분리기에 의하여 침전되었으며, 상청 내에 잔존하는 단백질의 양(즉, 미흡착된 단백질의 양)을 측정하였다.

현재의 인플루엔자 A 바이러스 균주

적혈구응집소는 인플루엔자 바이러스 A/New Caledonia(H1N1) 또는 A/Wyoming(H3N2)으로부터 정제되었으며, 희석하여 75 ㎍ HA/㎖가 되었다. 수산화 알루미늄 보조제는 4.25 ㎎/㎖ (약 1.5㎎ Al⁺⁺⁺/㎖)으로 준비된다. 1 ㎖의 보조제 현탁액을 15 ㎖ 팔콘 시험관 내의 4 ㎖의 항원 용액에 첨가하였으며, 혼합물을 전환하고, 실온에서 배양하였다. 시료를 0 시점과 5, 10, 20, 30, 60, 90 및 120 분에서 취하였다. 대조구는 항원 단독(1O mM PBS, pH 7.7) 또는 보조제 단독(1O mM PBS, pH 7.7)이었다. 분석을 위하여 시료를 즉시 4000 rpm으로 원심분리시켜 흡착된 물질을 침전시켰다. 단백질 함량은 BioRad™ 단백질 측정법 및 비-변성 SDS-PAGE로 측정하였다.

두 균주에 대한 흡착 연구 결과는 다음과 같으며, 100% 항원-단독 대조구의 단백질 함량으로 표준화되었다:

시료	상청 내의 A/New Caledonia 단백질	상청 내의 A/Wyoming
항원 대조구	100	100
보조제 대조구	0.0	0.3
0분	3.8	1.2
5분	1.7	0.7
10분	2.2	0.6
20분	2.2	0.6
30분	1.6	0.8
60분	1.4	0.5
90분	1.8	0.5
120분	1.9	0.5

따라서 고도 흡착이 매우 급속하게 일어났다. 다양한 시점에서의 차이는 의미가 없다. 결과를 확인하기 위하여, SYPRO 루비 염료 염색을 상청의 SDS-PAGE 분리에 사용하였다. 보조제 대조구, 0, 5, 10, 20 또는 30 분에서의 시료에서 단백질 밴드가 관찰되지 않았다. 따라서 존재하는 모든 단백질은 이 방법에 의한 검출 한계 이하이며, 이는 1-2 ng의 단백질 검출에 충분히 민감하다.

결과는 최소한 97%의 항원이 보조제에 급속하게 흡착되었다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 흡착은 필수적으로 동시에 발생하며, 이에 의하여 보조제에 선-흡착됨이 없이 항원보강형 인플루엔자 백신이 분포되게 한다. 따라서 보조제 백신이 더 급속하게 제조될 수 있으며, 이는 유행성 상황하에서 더욱 유용하다. 이러한 결과는 인플루엔자 A 바이러스의 두 종의 다른 균주에 의하여 달성될 수 있으며, 동일한 효과를 다른 균주 및 불용성 알루미늄 염을 기초로 한 다른 보조제에서도 얻을 수 있다고 충분히 기대된다.

유행성 인플루엔자 A 균주

정제된 표면 항원 제형인 A/Vietnam/1203/2004 x A/PR/8/34(H5N1) 인플루엔자 바이러스 2:6 재배열이 제조되었다. 적혈구응집소 함량은 SRID로 측정시 41 ㎍ HA/㎖로 측정되었다. 3O ㎖ A/H5N1를 초유리-15 원심분리 필터 기기를 사용하여 약 15 ㎖로 농축하였다. 원형 및 농축된 A/H5N1의 총 단백질 함량은 0-50 ㎍/㎖ 감마 글로블린 표준 곡선에 의한 Bio-Rad 단백질 측정법을 사용하여 측정하였다. 이 결과를 사용하여, HA와 총 단백질의 비율을 계산하였다. 이 값을 60㎍ HA/㎖의 A/H5N1 용액에 필요한 최종 부피를 계산하기 위하여 사용하였다.

0.7 ㎖의 2 ㎎/㎖ 수산화 알루미늄 보조제를 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 시험관 내의 0.7 ㎖의 60 ㎍ HA/㎖ MBP에 첨가하였다. 용액을 전화에 의하여 혼합하고, 실온(약 20℃)에서 배양하였다. 2벌의 시료를 5 분, 10 분, 30 분, 2 시간, 8 시간 및 24 시간에서 취하였다. 대조구는 0.7 ㎖의 60 ㎍ HA/㎖ MBP에 첨가된 0.7 ㎖의 10 mM PBS, pH 7.7 및 0.7 ㎖ 2 ㎎/㎖ 수산화 알루미늄에 첨가된 0.7 ㎖ 10 mM PBS, pH 7.7이었다. 시료를 13000 rpm으로 1 분간 실온에서 원심분리하여, 현탁된 수산화 알루미늄을 제거하고, 상청은 표지된 7 ㎖ 무균 조각(bijou) 내로 분리하였다. 결과를 BioRad™ 단백질 측정법 및 SYPRO 염료에 의한 비-변성 SDS-PAGE로 전술한 바와 같이 분석하였으며, 다음과 같다.

시료	상청내 단백질
항원 대조구	100
보조제 대조구	0.5
5분	3.7
10분	2.1
30분	0.2
2시간	0.3
8시간	1.1
24시간	2.4

A/H5N1 제형에 대한 결과를 동등한 A/New Caledonia 및 A/Wyoming 제조물을 사용하여 수행한 실험과 비교하였다. 매우 낮은 수준의 단백질이 수산화 알루미늄 펠렛에 결합되어 잔존하는 거의 모든 단백질을 확인하는 Bio-Rad 단백질 측정법을 사용한 모든 시료에 대한 상청에서 검출되었다. SDS-PAGE 분리 후 시료의 민감성 SYPRO 루비 염료 염색에 의하여 보조제 대조구 또는 모든 6 시점에서의 시료에서 단백질 밴드를 나타내지 않았다. 따라서 존재하는 모든 단백질은 이 방법에 의한 검출 한계 이하이다. 모든 시점에서의 단백질 농도 간의 의미있는 차이점은 존재하지 않았다. 수산화 알루미늄 대조구 및 각 시점의 시료들에 대한 모든 시료 흡착 및 후속 단백질 농도 평가는 5 내지 50 ㎍/㎖ 표준 곡선의 하한 이하였다.

따라서 데이터는 A/H5N1 단백질은 알루미늄 염 보조제에 동시에 흡착되며, 최소한 24 시간 동안 안정적으로 흡착되어 잔존하게 된다는 것을 알려준다.

인간 임상 데이터

참고자료 93에서 보고된 바와 같이, 무작위적 개방-표지 비-대조구 I기 시험의 300 명의 지원자가 수산화 알루미늄 보조제를 포함하거나 포함하지 않는 3 종의 서로 다른 투여량의 HA (7.5㎍, 15㎍ 또는 30㎍)를 포함하는 6종의 불활성화 1가 분할 인플루엔자 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) 백신 제형 중의 하나를 수여받았다. 개개인들은 두 종의 예방접종을 받고, 혈액 시료를 헤마글루틴화 억제 및 마이크로중성화에 의하여 분석하였다.

백신은 VAXIGRIP™ 유행기 사이 백신을 사용하여 인증된 방법으로 수정 계란에서 생산되었다[94]. 백신 균주는 NIBSC에 의하여 제조된 인플루엔자 A/Vietnam/1194/2004/NIBRG14(H5N1) 대조 균주이다. 이 균주는 고병원성 조류 균주 인플루엔자 A/Vietnam/1194/2004 변형 적혈구응집소 및 뉴라미니다아제 및 인플루엔자 A/PR/8/34 (H1N1)의 바이러스 단백질을 함유한다. 적혈구응집소는 분할 부위의 다염기성 아미노산 서열을 제거하도록 변형된다.

0.5 ㎖ 주사기(23 게이지, 1 인치 바늘)에 분할 백신을 보조제 없이 7-5 ㎍, 15 ㎍, 또는 30 ㎍의 적혈구응집소의 인산 완충제 식염수 용액의 수준으로 충전하였다. 항원미보강형 예방접종에 있어서, 이러한 주사기를 환자에 직접사용하였다. 항원보강형 예방접종에 있어서는, 그러나, 주사기의 함유물을 무균 바이알로 주입하며, 수산화 알루미늄 보조제를 함유한 주사기 함유물이었다. 이 혼합은 사용직전의 임상시 수행하였으며, 함유물 혼합 10초 후, 항원/보조제 현탁액을 균질화하기 위하여 서서히 교반하며 새 주사기로 주입(23 게이지, 1 인치 바늘)하고, 그 뒤 환자 근육내(삼각근)로 주입하였다. 주입 부피는 0.5 ㎖였으며, 항원보강형 30㎍ 제형 (1 ㎖ 부피)을 제외하였다. 백신의 최종 보조제 함량은 600 ㎍이었다. 항원 및 보조제에 대한 사전 연구에서 모든 3종의 항원 투여량에 대하여 유사한 흡착 계수를 보여주었다.

각 참여자는 21 일(0 및 21 일) 간격을 두고 두 종의 근육내 주사를 맞았다. 혈액시료를 0, 21 및 42일에 채취하였다.

모든 6종의 제형이 0 내지 42일 사이에 심각한 부작용, 격심한 주사부위 통증 및 38℃도 이상의 구강 온도를 보이는 열성 반응이 보고된바 없이 허용되었다.

모든 제형은 일회 투여 후에 일부 개체에서 검출가능한 반응을 지닌 면역 반응을 유발시켰다. 적혈구응집소 억제에 관하여, 각 그룹의 6% 내지 34%는 21일에서 32 이상의 티터를 보유하였으며, 그 비율은 42일차에는 28-67%였다. 중성화 항체 반응은 적혈구응집소 억제의 반응에 대한 유사한 패턴을 따랐다. 항원보강형 30㎍ 제형은 가장 큰 반응(2회의 예방접종 후, 67% 적혈구응집소-억제 혈청전환율)을 유도하였다. 특히, 항원보강형 30㎍ H5N1 백신에 의한 2회-투여 요법은 계절성 인플루엔자 백신의 허가에 필요한 유럽 규제 요건에 합치하는 면역 반응을 나타내었다.

본 발명을 실시예에 의하여 설명하였지만, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 범위에서 본 발명이 변형될 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

참고자료(이들의 내용은 참고자료로서 본원에 포함됨)

[1] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.

[2] US patent 6,372,223.

[3] WO 00/15251.

[4] WO 01/22992.

[5] Hehme et al. (2004) Virus Res. 103(l-2):163-71.

[6] WO 2005/089837.

[7] US patent 6,692,468.

[8] WO 00/07647.

[9] WO 99/17820.

[10] US patent 5,971,953.

[11] US patent 4,060,082.

[12] EP-A-0520618.

[13] WO 98/01174.

[14] WO 96/37624.

[15] WO 98/46262.

[16] WO 02/28422.

[17] WO 02/097072.

[18] WO 2005/113756.

[19] WO 02/067983.

[20] WO 02/074336.

[21] WO 01/21151.

[22] Huckriede et al. (2003) Methods Enzymol 373:74-91.

[23] World Health Organisation (2005) Emerging Infectious Diseases 11(10): 1515-21.

[24] Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190(9): 1627-30.

[25] Le et al. (2005) Nature 437(7062): 1108.

[26] Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170.

[27] Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200.

[28] Liu et al. (2003) Virology 314:580-590.

[29] Ozaki et al. (2004) J. Virol 78:1851-1857.

[30] Webby et al. (2004) Lancet 363:1099-1103.

[31] WO 00/60050.

[32] WO 01/04333.

[33] US patent 6649372.

[34] Neumann et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9.

[35] WO 2006/067211.

[36] WO 01/83794.

[37] Hoffmann et al. (2000) Virology 267(2):310-7.

[38] WO 97/37000.

[39] Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.

[40] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[41] Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50.

[42] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8.

[43] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110.

[44] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58.

[45] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[46] http://www.atcc.org/

[47] http://locus.umdnj.edu/

[48] WO 03/076601.

[49] WO 2005/042728.

[50] WO 03/043415.

[51] WO 01/85938.

[52] WO 2006/108846.

[53] EP-A-1260581 (WO 01/64846).

[54] WO 2006/071563.

[55] WO 2005/113758.

[56] WO 2006/027698.

[57] EP-B-0870508.

[58] US patent 5948410.

[59] International patent application entitled "CELL-DERIVED VIRUS VACCINES WITH LOW LEVELS OF RESIDUAL CELL DNA", filed 1st November 2006 claiming priority US-60/732786.

[60] WO 03/023021.

[61] WO 03/023025.

[62] WO 97/37001.

[63] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[64] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[65] US patent 6534065.

[66] Frey et al. (2003) Vaccine 21:4234-7.

[67] Bozkir & Hayta (2004) Drug Target 12:157-64.

[68] Cooper et al. (2004) Vaccine 22:3136-43.

[69] Guebre-Xabier et al. (2003) J Virol 77:5218-25.

[70] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-93.

[71] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-70.

[72] Baldridge et al. (2000) Vaccine 18:2416-25.

[73] WO 94/19013.

[74] EP-A-0721782.

[75] US patent 5292506.

[76] Vaccine Design: The Submit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[77] UK patent application GB-A-2220211.

[78] Myers et al. (1990) pages 145-156 of Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions.

[79] Ulrich (2000) Chapter 16 (pages 273-282) of Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X.

[80] Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-9.

[81] Baldrick et al. (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413.

[82] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[83] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[84] Nony et al. (2001) Vaccine 27:3645-51.

[85] Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.

[86] Greenbaum et al. (2004) Vaccine 22:2566-77.

[87] Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.

[88] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30.

[89] Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9.

[90] Halperin et al. (1979) Am J Public Health 69:1247-50.

[91] Herbert et al. (1979) J Infect Dis 140:234-8.

[92] Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6.

[93] Bresson et al. (2006) Lancet. DOI:10.1016/S0140-6736(06)68656-X.

[94] Lina et al. (2000) Biologicals 28:95-103.

Claims (22)

1. 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분, 및 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분을 포함하는 키트로서,

   상기 항원 성분 및 보조제 성분은 비혼합 상태로서 별도로 존재하고,

   상기 키트는 항원 성분 및 보조제 성분을 사용시점에 즉석 혼합하기 위한 키트.
2. 제1항에 있어서, 하나의 성분 또는 두 성분이 모두 바이알 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
3. 제1항에 있어서, 하나의 성분 또는 두 성분이 모두 주사기 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
4. 제1항에 있어서, 하나의 성분은 주사기 내에 존재하고, 다른 하나의 성분은 바이알 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
5. 제4항에 있어서, 항원 성분은 주사기 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원은 불활성 바이러스인 것을 특징으로 하는 키트.
7. 제6항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원은 전 바이러스, 분할 바이러스, 또는 정제된 표면 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
8. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원은 H1, H2, H3, H5, H7 또는 H9 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 키트.
9. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원은 난(egg)에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 키트.
10. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원은 세포 배양물에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 키트.
11. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원 성분은 난알부민, 난점질 및 닭 DNA가 부재한 것을 특징으로 하는 키트.
12. 제10항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원 성분은 10 ng 이하의 세포 배양물 숙주의 세포성 DNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
13. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원 성분은 성분 내의 바이러스 균주 당 0.1 내지 50 ㎍의 적혈구응집소를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
14. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 보조제 성분은 수산화 알루미늄 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
15. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 보조제 성분은 인산 알루미늄 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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17. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 것이며, 상기 면역원성 조성물은 상기 항원 성분 및 보조제 성분을 사용시점에 즉석 혼합함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 키트.
18. 인플루엔자 백신의 제조 방법으로서,

    (i) 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 항원 성분을 제조하는 단계;

    (ii) 알루미늄 염을 포함하는 보조제 성분을 제조하는 단계; 및

    (iii) 항원 성분과 보조제 성분을 비혼합 상태로 키트 내로 포함시키고, 상기 항원 성분 및 보조제 성분은 사용시점에 즉석 혼합하는 단계를 포함하는 제조 방법.
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21. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 의약의 용도로 사용하는 것을 특징으로 하는 키트.
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