KR102092304B1 - 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물, 및 상기 면역보강제를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물은 폴리감마글루탐산 또는 알럼 단독 면역보강제에 비해 현저히 우수한 체내 면역 반응 유도 효과를 나타내므로, 항원과 함께 백신 조성물에 첨가되어 감염성 질환 또는 암에 대한 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.

Description

폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물{Composition for Adjuvant Comprising Poly-gamma-glutamic Acid and Alum}

본 발명은 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물, 및 상기 면역보강제를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.

면역보강제 (adjuvant)는 면역원성을 증가시키기 위해 백신에 첨가되는 물질로서, 항원량이 적을 때 항원에 대한 면역반응을 신속하고 강력하게, 그리고 장기간 유지시켜 주는 역할을 담당한다. 따라서 면역보강제 개발은 백신 개발과 함께 가속화되고 있으며, 면역관련 질환에 대한 범위가 넓어지면서 새로운 면역보강제로서의 개발이 유망한 분야이다.

폴리감마글루탐산 (poly-gamma-glutamic acid; γ-PGA)은 한국 전통 음식인 청국장에 존재하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 생체 고분자 물질로, 안전성, 수용성, 비독성 및 생분해성이 입증된 물질이다. 폴리감마글루탐산은 전염증성 사이토카인 분비 촉진 및 TLR4 (toll-like receptor 4)를 통한 항원 제시 세포 (antigen presenting cell; APC)의 활성화 등 선천성 면역 반응을 유도하고, Th1 면역 반응을 촉진하여 세포 독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphcyte; CTL) 활성과 같은 세포성 면역 반응을 유도하며 (문헌[T. Uto, T. Akagi, K. Yoshinaga, M. Toyama, M. Akashi, M. Baba, Biomaterials, 32 (2011) 5206-5212.] 등), 폴리감마글루탐산을 이용한 면역보강제의 사용이 공지된 바 있다 (대한민국 등록특허 제10-0517114호 등). 그러나, 폴리감마글루탐산만을 단독으로 면역보강제로 사용하였을 경우에는 항체 생성능이 부족하다는 문제가 있어, 항원 특이적 면역유도반응을 더욱 강화시킬 필요성이 제기되고 있다.

알럼 (alum) 면역보강제는 알루미늄 염의 입자 특성으로 인해, 백신 항원에 대한 데포 (depot)로 작용하여 국소 항원 농도를 증가시키고 APC 의 항원 흡수 능력을 증가시키며 항체 생산과 같은 체액성 면역 반응을 강화하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 알럼 면역보강제는 항체-의존적 세포성 세포독성 (antibody dependent cell cytotoxicity; ADCC)이나, CTL 등에 의한 세포성 면역 반응을 거의 유도하지 못하여, 백신 보호 효능을 충분히 달성하지 못하는 문제점이 있다.

본 발명자는 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 폴리감마글루탐산과 알럼의 이온결합으로 형성된 복합체를 면역보강제로 사용할 경우, 폴리감마글루탐산 또는 알럼을 단독으로 면역 보강제로 사용한 경우보다 체액성 면역 및 세포성 면역 유도 효과가 현저히 우수하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폴리감마글루탐신, 알럼 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물을 제공한다.

폴리감마글루탐산 (poly-γ-glutamic acid; γ-PGA)은 D-, L-글루탐산이 감마 결합을 통하여 연결된 점액성의 아미노산 고분자로서, 바실러스속 (Bacillus) 균주로부터 만들어지는 천연 아미노산 고분자 소재이다.

본 발명에서 폴리감마글루탐산은 대한민국 등록특허 제10-0517114호, 제10-0873179호 또는 대한민국 공개특허 제10-2009-0037688호에 기재된 방법에 따라 제조하거나, 바실러스 서브틸리스 청국장 균주를 발효시켜 제조하거나, 또는 시판되는 폴리감마글루탐산을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 폴리감마글루탐산의 분자량은 50 kDa 내지 15,000 kDa일 수 있다. 폴리감마글루탐산의 분자량이 50 kDa 미만인 경우 면역보강 기능이 낮아지는 문제점이 발생되고, 폴리감마글루탐산의 분자량이 15,000 kDa이상인 경우 점도가 증가되는 문제점이 발생될 수 있다. 본 발명에서 폴리감마글루탐산은 용도에 따라 필요한 경우 적절한 방법으로 절단하여 일정한 분자량으로 제조하여 사용하거나, 적절한 방법으로 분리하여 일정한 분자량별로 회수하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 폴리감마글루탐산의 분자량은 1,000 내지 3,000 kDa일 수 있고, 예컨대 약 2,000 kDa일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 알럼 (alum)은 명반 또는 백반으로도 불리는 알루미늄 기반의 면역보강제 (aluminum-based adjuvant)이다. 본 발명에서 알럼은 면역보강제로 사용하기에 적합한 임의의 알루미늄 염을 의미하며, 수산화알루미늄 (aluminum hydroxide), 인산화알루미늄 (aluminum phosphate), 알루미늄염산염 (aluminium hydrochloride), 황산알루미늄 (aluminum sulphate), 규산알루미늄 (aluminum silicate), 황산알루미늄칼륨 (aluminum potassium sulfate), 암모늄 명반 (ammonium alum), 칼륨 명반 (potassium alum), 또는 이의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시양태에서 알럼은 수산화알루미늄이다.

본 발명의 면역보강제 조성물에 사용되는 폴리감마글루탐산 및 알럼은 복합체 형태일 수 있다. 본 발명에서 폴리감마글루탐산 및 알럼 복합체는 폴리감마글루탐산과 알럼의 이온결합에 의해 생성되는 나노 입자 형태일 수 있다.

본 발명의 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물은 폴리감마글루탐산 및 알럼을 적절한 중량비로 혼합하여 제조할 수 있다. 본 발명의 면역보강제 조성물에서 폴리감마글루탐산 및 알럼의 중량비는 약 10:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5일 수 있고, 구체적으로 약 4:1, 3:1, 2:1, 또는 1:1일 수 있으며, 예컨대 약 1:1일 수 있다. 또한, 폴리감마글루탐산 및 알럼 복합체는 전체 면역보강제 조성물 중량의 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 20 중량%, 1 내지 10 중량% 범위로 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 면역보강제 조성물은 감염성 질환에 대한 예방 백신에 첨가되어 감염성 질환에 대응할 수 있는 방어 효과를 증진시킨다.

본 발명에서, 감염성 질환은 결핵, 말라리아, 열대열원충, 사일열원충, 삼일열원충, 로타바이러스, 콜레라, 디프테리아-파상풍, 백일해, 인플루엔자, 인간 유두종 바이러스, 홍역과 풍진, 유행성 이하선염, 수막염, 소아마비, 폐렴, 광견병, 파상풍 톡소이드, 황열병, 탄저병, 클로스트리디움 보툴리눔 독소, 페스트, 천연두, 수두, 바이러스성 출혈열, 에볼라 바이러스 감염증, 브루셀라증, 발진티푸스, 웨스트 나일 바이러스, 캘리포니아 뇌염, 일본 뇌염, B 형 간염, C 형 간염, 단순 포진 바이러스 (HSV) 감염증, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염증, 결핵, 광견병, 프리온, 중증 급성 호흡기 증후군, 임질, 매독을 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 임의의 감염성 질환일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 감염성 질환은 인플루엔자 바이러스 감염증이며, 보다 구체적으로는 H1N1 신종 인플루엔자 바이러스 감염증이다.

본 발명에 따른 면역보강제 조성물은 항원에 대한 체액성 면역 및 세포성 면역을 모두 현저히 강화시켜 감염성 질환에 대한 우수한 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼 복합체 면역보강제 조성물은 우수한 항원 함입률 (표 1)을 갖고, 체액성 면역 강화 효과 (도 2 내지 도 4) 뿐만 아니라 세포성 면역 강화 효과 (도 5 내지 도 8, 도 15)가 현저히 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 면역보강제 조성물은 TLR4에 의해 매개되는 (도 12 내지 도 14) 수지상 세포를 활성화시키고 (도 9 내지 도 11) 수지상 세포의 모집 및 이동 유도 (도 16 내지 도 17), 케모카인 분비 증가 및 호중구 및 단핵구 모집 유도 (도 18 내지 도 19) 효과가 뛰어나다. 상기 면역 강화 효과는 인플루엔자 백신 접종 동물 모델에서 구체적으로 확인되었으며 (표 2, 도 21 내지 도 24), 본 발명의 면역 보강제를 포함한 백신으로 면역화된 인플루엔자 감염 마우스는 폴리감마글루탐산 또는 알럼 단독의 면역보강제를 사용한 백신 접종 마우스에 비해 생존율이 크게 개선된다는 점이 확인되었다 (도 20).

본 발명은 폴리감마글루탐산, 알럼 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 백신 조성물에 포함되는 항원은 세포, 바이러스, 단백질, 펩티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 지질, 또는 이의 조합, 또는 당업계에 공지된 임의의 면역원성 물질일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서 항원은 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 예컨대, 헤마글루티닌일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 제제화될 경우 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 안정화제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 인간에게 투여되거나 인간을 제외한 동물에게 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 복막내 주사, 비강 투여, 구강 투여, 경피 투여 또는 경구 투여될 수 있으며, 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 증감될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물은 폴리감마글루탐산 또는 알럼 단독 면역보강제에 비해 현저히 우수한 체내 면역 반응 유도 효과를 나타내므로, 항원과 함께 백신 조성물에 첨가되어 감염성 질환에 대한 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.

도 1은 폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제의 제조 과정 및 물리화학적 특성을 나타낸다.
도 2는 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA (Ovalbumin)로 면역화된 마우스 혈청에서 OVA항원에 대한 항체 생성 증가 효과를 나타낸다.
도 3은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스 골수에서 형질 세포 증가 효과를 나타낸다.
도 4는 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스의 장기 면역 지속 효과를 나타낸다.
도 5는 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스 혈청의 NK 세포 활성 강화 효과를 나타낸다.
도 6은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스 항체의 B16mOVA 세포 결합 및 NK 세포 활성화 강화 효과를 나타낸다.
도 7은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스 항체의 B16mOVA 세포 용해 효과를 나타낸다.
도 8은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스 비장세포에서 OVA 항원 자극에 따른 세포 면역 효과 증진 효과를 나타낸다.
도 9는 폴리감마글루탐산/알럼으로 활성화된 수지상 세포의 공동자극 분자 및 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 II의 발현 유도 효과를 나타낸다.
도 10은 폴리감마글루탐산/알럼으로 활성화된 수지상 세포의 전염증 사이토카인 분비 증가 효과를 나타낸다.
도 11은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 활성화된 수지상 세포의 항원 분해 촉진 효과를 나타낸다.
도 12는 폴리감마글루탐산/알럼으로 활성화된 수지상 세포에서 전염증 사이토카인 (TNF-α 및 IL-6)의 분비에 관여하는 TLR4의 작용 효과를 나타낸다.
도 13은 폴리감마글루탐산/알럼으로 활성화된 수지상 세포에서 공동 자극 분자 (CD40, CD80, 및 CD86) 발현 유도에 관여하는 TLR4의 작용 효과를 나타낸다.
도 14는 폴리감마글루탐산/알럼으로 활성화된 수지상 세포의 IκBα의 인산화 유도에 관여하는 TLR4의 작용 효과를 나타낸다.
도 15는 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 자극된 수지상 세포는 OVA항원에 반응하는 T 세포의 IL-4 및 IFN-γ 분비 증가 효과를 나타낸다.
도 16은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스에서 주사 부위로의 수지상 세포의 모집 촉진 효과를 나타낸다.
도 17은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스에서 림프절로의 OVA항원을 함입하는 수지상 세포 이동 촉진 효과를 나타낸다.
도 18은 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스에서 주사 부위 및 림프절 내 단핵구 및 호중구 모집 촉진 효과를 나타낸다.
도 19는 폴리감마글루탐산/알럼과 실험항원인 OVA로 면역화된 마우스에서 주사 부위 및 림프절 내 케모카인 및 사이토카인 수치 증가 효과를 나타낸다.
도 20은 인플루엔자 백신과 폴리감마글루탐산/알럼으로 면역화된 마우스의 감염 방어 효과를 나타낸다.
도 21은 인플루엔자 백신과 폴리감마글루탐산/알럼으로 면역화된 마우스 항체는 인플루엔자 바이러스 감염 세포 결합 개선 효과를 나타낸다.
도 22는 인플루엔자 백신과 폴리감마글루탐산/알럼으로 면역화된 마우스 항체의 세포독성 강화 효과를 나타낸다.
도 23은 인플루엔자 백신과 폴리감마글루탐산/알럼으로 면역화된 마우스 혈청의 NK 세포 활성 증진 효과를 나타낸다.
도 24는 인플루엔자 백신과 폴리감마글루탐산/알럼으로 면역화된 마우스 T 세포의 인플루엔자 바이러스에 대한 T 세포 활성화 증진 효과를 나타낸다.
도 25는 폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제의 작용 모드를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 제공되었을 뿐, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 한정되지 않는다.

<실시예 1> 실험 재료 및 방법

1. 마우스 및 세포

6 내지 8 주령 암컷 C57BL/6 마우스는 오리엔트 바이오 (Orient Bio) (경기도)에서 구입하였다. 암컷 C3H/HeN 및 C3H/HeJ 마우스는 일본 SLC (Hamamatsu, Japan)에서 구입하였다. OT-I 및 OT-II 형질전환 마우스는 잭슨 랩스 (Jackson Labs) (Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. 모든 동물은 한국생명공학연구원 (KRIBB) 내 무특이 병원체 (specific pathogen-free) 시설에서 유지하였고, 동물 실험은 한국생명공학연구원의 동물실험윤리위원회 (Istitutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 승인을 받았다. 골수 유래 수지상 세포 (bone marrow-derived dendritic cell; BMDC)는 문헌[T.Y . Lee, Y.H . Kim, S.W . Yoon, J.C . Choi, J.M . Yang, C.J . Kim, J.T . Schiller , M.H . Sung, H. Poo , Cancer Immunol Immunother, 58 (2009) 1781-1794.]에 공지된 방법에 따라 제조하였다.

B16F10 세포 및 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)에서 구입하였다. BMDC를 10% 열-비활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신 (GibcoBR)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. BMDC를 제외한 모든 세포를 10% 열-비활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 유지하였다. B16mOVA 세포를 1 μg/ml 푸로마이신 디히드로클로라이드 (EMD Millipore)로 보충된 DMEM 완전 배지 내에서 유지하였다.

2. 물리화학적 특성 분석

2.1. 동적 광산란 (dynamic light scattering; DLS): 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼의 수력학적 (hydrodynamic) 지름 및 다분산 지수 (polydispersity index)를 입자 크기 분석기 (ELS-Z, 일본 Otsuka Inc.)를 사용하여 측정하였다. 제타-포텐셜 수치를 제타-사이저 (Zeta-sizer) (Nano ZS, Malvern Instrument Ltd., UK)로 측정하였다.

2.2. 주사 전자현미경 (SEM): 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼 (100 μg/ml, 1 ml)을 오토클레이브된 식염수 완충액에 분산시켰다. 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼의 형태를 전계 방출 SEM (FE-SEM, Quanta 250 FEG, FEI, USA)으로 측정하였다. 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼을 실리콘 웨이퍼 상에서 적가 및 건조하여 제조하였다. 그 다음, SEM 측정 전 60 초 동안 폴라론 SC7640 스푸터 코터 (Polaron SC7640 sputter coater)를 사용하여 금 코팅하였다.

2.3. 투과 전자현미경 (TEM): 폴리감마글루탐산/알럼의 TEM 이미지를 전계 방출 TEM (FE-TEM, JEOL Ltd., Japan)을 사용하여 얻었다. 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼 (100 μg/ml) 용액을 포름바 (formvar) 및 탄소 코팅된 구리 그리드 (TED PELLA, Inc., USA) 상에 적가 및 건조하였다.

2.4. 푸리에 변환 적외선 분광학 (Fourier-transform infrared spectroscopy; FT-IR): 폴리감마글루탐산, 알럼, 및 폴리감마글루탐산/알럼의 화학 구조 분석을 위해, FT-IR 분광기 (Alpha-T, Bruker Optics, UA)를 사용하여 푸리에 변환 적외선 분석을 수행하였다. 먼저, 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼 용액 (완충액 내 1 mg/ml)을 10,000×g로 5 분 동안 원심분리하고 증류수에 재분산시켰다. 그 다음, 상층액을 제거한 뒤 2 일 동안 진공 건조시켰다. 분말을 브롬화칼륨 (KBr)과 혼합하였다. FT-IR 신호를 4 cm^-1 스캔 해상도 (scan resolution)로 500 cm^-1 내지 4,000 cm^-1에서 스캐닝하였다.

3. OVA (ovalbumin) 항원 로딩양의 결정

폴리감마글루탐산/알럼 및 알럼 (각각 10 mg/ml)을 OVA (ovalbumin) 항원 (3 mg/ml; Sigma)과 함께 15×g 회전으로 4 ℃에서 밤새 혼합하여 항원-면역보강제 복합체를 형성하였다. 이를 12,000×g에서 15 분 동안 원심분리하고 식염수에 재현탁시켰다. 로딩되지 않은 OVA 양을 분석하기 위해 상층액을 수집하고 BCA 분석법으로 계산한 후, 처음 혼합한 OVA양과 비교하여 로딩된 OVA의 양을 계산하였다.

4. 면역화 및 바이러스 투여

동물 그룹은 그룹 당 마우스 5 마리 이상씩 무작위 분포시켰다. C57BL/6 마우스를 0, 14 및 28 일째 10 μg OVA 및 면역보강제로 근육 내 주사로 면역화하였다. 비장, 골수 세포 및 혈청을 마지막 면역화 이후 14 및 180 일째에 수집하였다. 별도 실험에서 마우스를 0 및 14 일 째에 400 μg/ml 폴리감마글루탐산, 400 μg/ml 알럼, 또는 800 μg/ml 폴리감마글루탐산/알럼이 존재하거나 부재한 상태에서 0.05 μg의 헤마글루티닌 (HA)을 함유하는 pH1N1 스플릿 (split) 백신 항원 (A/California/7/2009 NYMC X-179A H1N1; Mogam Biotechnology Research Institute)으로 근육내 주사로 면역화하였다. 혈청을 최초 백신화 후 14 및 28 일째에 수집하였다. 비장을 최초 백신화 후 28 일째에 수집하였다. 최종 백신화 후 2 주째에 마우스를 50 LD₅₀의 pH1N1 바이러스 (A/California/04/09)로 비강내 투여하였다. 체중 및 생존 여부를 바이러스 투여 후 14 일 동안 모니터링하였다. 20% 이상 체중이 감소된 마우스는 실험적 종말점 (end point)에 도달하였으므로 희생시켰다. 모든 바이러스 실험은 생물안전성 레벨 (biosafety level) 2+ (BSL+) 조건에서 수행하였다.

5. 효소면역측정법 (ELISA)

면역화된 마우스 혈청 내 항원 특이적 IgG, IgG1 및 IgG2 항체의 양을 결정하기 위해, ELISA 플레이트 (Nunc, Rochester, NY, USA)를 4 ℃에서 pH 9.5의 카보네이트 용액 내 100 μl의 1 μg/ml OVA 단백질 또는 0.5 μg/ml 인플루엔자 백신 항원으로 밤새 코팅하였다. 배양 상층액 내 사이토카인 수준을 제조사의 설명서에 따라 OptEIA 키트 (BD)를 사용하여 측정하였다.

6. 항체-의존적 NK 세포 활성 측정

면역화된 마우스 혈청에서 항체에 의해 매개되는 NK 세포 활성을 측정하기 위해, ELISA 플레이트를 PBS 내 1 μg/웰 OVA 단백질 또는 600 ng/웰 인플루엔자 HA 항원 {stalk domain}으로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 5회 세척 후, 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 면역화된 마우스의 열-비활성 혈청 (56 ℃에서 1 시간)과 함께 인큐베이션하였다. NK 세포를 NK 세포 아이솔레이션 (isolation) II 키트 (Milteny Biotec)를 사용하여 음성 선택으로 비면역화된 C57BL/6 마우스 비장세포로부터 단리하였다. 5 차례의 PBS 세척 후, NK 세포를 웰 당 1 × 10⁵ 세포로 첨가한 뒤 PE-컨쥬게이션 항-CD107a, 5 μg/ml 브레펠딘 (brefeldin) A 및 5 μg/ml 모넨신 (monensin) (BD)과 함께 37 ℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 사이토픽스/사이토펌 (Cytofix/Cytoperm) 키트 (BD)를 사용하여 세포를 고정 및 투과화시킨 후 APC-컨쥬게이션 항-IFN-γ (BD Bioscience)로 세포내 염색하였다.

7. 항체 의존적 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity ; ADCC) 분석법

OVA로 면역화된 마우스의 혈청을 사용하는 실험을 위해, B16mOVA 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 웰 당 8 × 10³ 개의 세포로 플레이팅하였다. B16F10 세포는 음성 대조군으로 사용하였다. 인플루엔자 백신으로 면역화된 마우스의 혈청을 사용하는 실험을 위해, MDCK 세포를 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 DMEM 내에서 A/California/04/09 바이러스 (MOI = 1)에 37 ℃에서 12 시간 동안 노출시킴으로써 감염시켰다. 바이러스에 감염된 MDCK 세포를 수집하여 96-웰 U-바닥 플레이트에 웰 당 8 × 10³ 세포로 플레이팅하였다. 그 다음, 표적 세포를 면역화된 마우스의 열-비활성화 혈청 (56 ℃, 1 시간) 및 상술한 비면역화 마우스의 비장세포로부터 선택된 NK 세포와 혼합하였다. 4 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포독성을 사이토톡스 96 비방사성 세포독성 어세이 (CytoTox 96 Non-radioactive cytotoxicity assay) (Promega)를 사용하여 배양 상층액 내 락테이트 탈수소화효소 (lactate dehydrogenase; LDH) 검출에 의해 평가하였다.

8. ELISPOT 분석법

마지막 면역화 후 14 내지 18 일째에 비장세포를 면역화된 마우스로부터 수득하였다. 세포를 5 μg/웰 OVA 펩티드 또는 500 TCID₅₀/웰의 UV-비활성화 A/California/04/09 바이러스와 함께 3 일 동안 인큐베이션하였다. IFN-γ 또는 IL-4 생산 세포의 빈도를 ELISPOT 키트 (BD)를 사용하여 결정하였다. 스팟 (spot)을 ELISPOT 플레이트 리더 (Cellular Technology Ltd., USA)로 계수하였다.

9. BMDC의 시험관 내 활성화 및 항원 처리

문헌[T.Y . Lee, Y.H . Kim, S.W . Yoon, J.C . Choi , J.M . Yang, C.J . Kim, J.T. Schiller , M.H . Sung, H. Poo , Cancer Immunol Immunother , 58 (2009) 1781-1794.]에 공지된 방법에 따라 C57BL/6, C3H/HeN 및 C3H/HeJ 마우스의 골수 세포로부터 미성숙 BMDC를 생성하였다. 그 후, 세포를 100 μg/ml 알럼, 100 μg/ml 폴리감마글루탐산, 200 μg/ml 폴리감마글루탐산/알럼 또는 0.1 μg/ml LPS로 24 시간 동안 자극하였다. OVA 항원 흡수 (uptake) 및 수지상 세포의 처리 능력을 측정하기 위해, 미성숙 BMDC를 단독으로, 또는 면역보강제와 함께 5 μg/ml DQ-OVA {단백질 절단에 의한 분해 시 밝은 녹색 형광을 나타내는 OVA의 자가-켄칭 (self-quenched)된 컨쥬게이트}로 37 ℃에서 5 시간 동안 처리하였다.

10. 면역화된 마우스의 조직으로부터 세포의 준비

배수 림프절 (draining lymph node; dLN)로의 DC 모집 정도를 측정하기 위해, C57BL/6 마우스를 800 μg/ml 폴리감마글루탐산/알럼의 존재 또는 부재 하에서 5 μg 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 647-컨쥬게이션 OVA로 근육내 주사로 면역화시켰다. 면역화 3, 6, 24 및 48 시간 후, 투여 마우스의 주사된 근육 및 장골 (iliac) dLN으로부터 세포를 얻었다.

11. 유세포 분석

모든 세포를 항-CD16/CD32 항체로 블로킹하고, 플루오레신-컨쥬게이션 mAb로 염색하였다. BMDC의 활성을 측정하기 위해, 자극된 세포를 마우스 CD40, CD80, CD86, MHC 클래스 II, 및 이소타입이 일치하는 대조용 마우스 항체 (MD)에 대한 PE-컨쥬게이션 mAb로 염색하였다. 주사 부위 및 dLN 내 DC의 비율을 측정하기 위해, 수집된 세포를 APC eFluor 780-컨쥬게이션 항-CD11c, 알렉사 플루오르 488-컨쥬게이션 항-MHC 클래스 II로 염색하였다. 플루오로크롬 (fluorochrome)-컨쥬게이션 항체로 개별 라벨링된 세포를 사용하여 형광 보정을 최적화하였다. 잔해 및 죽은 세포를 제거하도록 데이터는 세포 크기 및 형태에 기초하여 살아 있는 세포군에 대해 게이팅되었다. 세포를 FACSCalibur 및 FACSVerse 유세포 분석기 (BD) 상에서 수득하고 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star)를 사용하여 분석하였다.

12. 면역형광 컨포컬 현미경 관찰

C57BL/6 마우스를 800 μg 폴리감마글루탐산/알럼의 존재 또는 부재 하에 5 μg 알렉사-플루오르 647-컨쥬게이션 OVA로 근육내 주사로 면역화하였다. 면역화 6 시간 후, 마우스의 주사된 근육 및 장골 dLN을 수득하였다. 근육 및 dLN의 동결 절편을 4% 파라포름알데히드 (근육) 또는 아세톤 (dLN)으로 10 분 동안 고정시키고, 10% 열-비활성화 FBS로 1 시간 동안 블로킹한 다음, PE-컨쥬게이션 CD11c 및 알렉사-플루오르 488-컨쥬게이션 MHC 클래스 II (Biolegend)로 4 ℃에서 밤새 염색하였다. 세포핵을 DAPI (Molecular Probes)로 반대 염색하였다. 조직 절편을 자이스 (Zeiss) LSM 700 컨포컬 레이저 주사 현미경 (ZEN 2012 software, Carl Zeiss)로 관찰하였다.

13. 헤마글루티닌화 억제 (HI) 및 혈청 중성화 (SN) 분석법

문헌 [J. Yang, S.M . Shim, T.Q . Nguyen , E.H . Kim, K. Kim, Y.T . Lim , M.H . Sung, R. Webby , H. Poo , Sci Rep, 7 (2017) 44839.]에 공지된 방법에 따라 A/California/04/09 바이러스에 대한 혈청 HI 역가 (titer)를 측정하였다. 역가는 헤마글루티닌화가 방지되는 혈청의 최대 희석량의 역수로 표시하였다.

중성화 역가를 측정하기 위해, 면역화된 마우스 혈청을 분석 전 Receptor-destroying enzyme 용액과 함께 56 ℃에서 30 분 동안 열-비활성화한 후 PBS를 섞어 혈청을 10 배 희석하여 준비하였다. 분석 하루 전, 1.5 × 10⁴ 세포/100 μl의 MDCK를 96-웰 플랫 바텀 플레이트에 시딩하고 37 ℃, 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하였다. 분석 당일, 준비된 혈청을 2 배 계열 희석한 다음 (1:10 내지 1:2560), 200 TCID₅₀/40 μl (1:1, v/v)로 혼합하였다. 샘플을 37 ℃, 5% CO₂에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, MDCK 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 50 μl의 바이러스:혈청 혼합물을 37 ℃, 5% CO₂에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상층액을 제거하고 1% PS, 1× 비타민, 1 μl/ml 토실술포닐 페닐알라닐 클로로메틸 케톤 (TPCK)-처리된 트립신 및 0.2% 소 혈청 알부민을 함유하는 100 μl의 MEM 배지를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO₂에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 중성화 Ab 역가를 헤마글루티닌화가 방지되는 최고 혈청 희석량으로 측정하였다.

14. 폐에서 바이러스 역가 측정

마우스 바이러스 감염 후 3, 5 및 7 일째에 폐 샘플을 1 g의 폐/ml에서 0.2% BSA를 함유하는 MEM 배지에서 파쇄 (homogenize)하였다. 파쇄액을 4 ℃ 15,000×g에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한 뒤, 상층액을 분석을 위해 사용하였다. 분석 하루 전, 2 × 10⁴ 세포/100 μl의 MDCK를 96-웰 플랫 바텀 플레이트에 시딩하고 37 ℃, 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하였다. 분석 당일, 준비된 폐 상층액을 10 배 계열 희석한 다음 (1:10 내지 1:10¹²) PBS로 2 회 세척한 MDCK 세포에 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상층액을 제거하고 1% PS, 1× 비타민, 1 μl/ml 토실술포닐 페닐알라닐 클로로메틸 케톤 (TPCK)-처리된 트립신 및 0.2% 소 혈청 알부민을 함유하는 100 μl의 MEM 배지를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO₂에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 역가를 Reed-Muench 방법에 따라 계산하여 log₁₀ TCID₅₀/ml의 단위로 표시하였다.

15. 통계적 분석

데이터를 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하고, 적어도 3 회의 독립적 실험에 의해 표시하였다. 다수의 그룹 간 통계적 차이는 본페로니 교정 (Bonferroni's corection)으로 보정된 일원배치 (one-way) ANOVA 방법 (ANOVA/Bonferroni)을 사용하여 평가하였다. 두 그룹 간 생존율을 분석하기 위해 로그-랭크 (log-rank) 테스트를 사용하였다. 0.05 미만의 p 값 (P < 0.05)을 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 모든 분석은 그래프패드 (GraphPad) PRISM 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

<실시예 2> 폴리감마글루탐산/알럼 복합체의 제조 및 물리화학적 특성 분석

0.9% 식염수 완충액 내에서 폴리감마글루탐산 (바이오 리더스, 대전) 및 임젝트 알럼 (Imject alum) (Thermo Scientific, USA)을 결합하여 폴리감마글루탐산/알럼 복합체를 생성하였다. 간략히 설명하면, 폴리감마글루탐산 용액 (pH 6.8; 암모니아 용액으로 조정)에 1 mg/ml 임젝트 알럼 용액 (pH 6.5; HCl로 조정)을 70×g의 고정 속도로 교반하면서 적가하였다 (v:v = 1:1). 생성된 폴리감마글루탐산/알럼을 4 ℃에서 15,000×g로 30 분 동안 원심분리한 다음, 0.9% 식염수 완충액으로 재현탁시킨 뒤 사용 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

제조된 폴리감마글루탐산/알럼의 크기 및 형태를 SEM (도 1의 B) 및 TEM (도 1의 C)으로 관찰한 결과, 폴리감마글루탐산/알럼은 1 내지 2 마이크로미터의 비규칙적인 형태를 갖는 것으로 나타났다 (도 1의 B 및 C). 또한, 폴리감마글루탐산, 알럼, 및 폴리감마글루탐산/알럼 복합체의 화학 구조를 확인하기 위해 FT-IR 분석을 수행한 결과 (도 1의 D), 폴리감마글루탐산/알럼의 스펙트럼은 알럼 및 폴리감마글루탐산에 각각 대응하는 3446 cm^-1 및 1639 cm^-1의 특징적 피크를 모두 나타낸다는 점을 확인하였다. 따라서, 폴리감마글루탐산 및 알럼으로 구성된 복합체가 성공적으로 형성되었음을 확인하였다 (도 1의 D).

한편, 알럼 및 폴리감마글루탐산/알럼에 대해 동적 광산란 (DLS) 방법에 따라 수력학적 지름 및 다분산 지수를 측정하고, 폴리감마글루탐산/알럼을 모델 단백질 항원인 OVA와 혼합하여 로딩된 OVA의 양 (2.144 ± 0.082 mg/ml)을 BCA 분석법으로 측정함으로써 항원 함입능 (encapsulation efficacy)을 측정하였다. 그 결과가 하기 표 1에 나타난다.

샘플	입자 크기 (지름 nm ± SD)	다분산 지수 (PDI)	제타 포텐셜 (mV)	OVA-로딩 (mg/ml)
알럼	1066.2±32.01	0.31±0.03	-7.08±0.91	1.603±0.042
폴리감마글루탐산/알럼	1294.67±13.32	0.37±0.03	-28.10±1.49	2.144±0.082

특히, 폴리감마글루탐산/알럼에 로딩된 OVA의 양은 알럼 단독일 때와 비교하여 현저히 상승하여, 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산/알럼 복합체의 우수한 항원 함입률을 나타낸다.

< 실시예 3> OVA 면역화 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 체액성 면역 강화 효과

C57BL/6 마우스 (n = 5)에 10 μg OVA 단백질 단독으로 (OVA 그룹), 또는 400 μg 알럼 (알럼-OVA 그룹), 400 μg 폴리감마글루탐산 (폴리감마글루탐산-OVA 그룹), 또는 800 μg 폴리감마글루탐산/알럼 (폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹)으로 0, 14 및 28 일째에 근육내 주사하여 면역화하였다. 마지막 면역화 후 14 일째에 마우스로부터 혈청 및 비장세포를 수득하였다. 혈청 내 OVA 특이적 항체 (IgG, IgG1 및 IgG2b)의 수준을 ELISA를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼 그룹의 혈청 내 IgG, IgG1 및 IgG2b 수준 모두 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 2).

또한, 위 면역화된 마우스에서 골수 세포를 수집한 후, 세포 내에 CD38⁺CD138⁺CD220^- 세포 (항체를 생산하는 형질 세포)의 비율을 유세포 분석기로 측정하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹의 골수 세포 내 CD38⁺CD138⁺CD220^- 형질 세포의 비율이 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 3).

한편, 마지막 면역화 후 180 일째에 마우스에서 혈청 및 비장을 수집하여, 혈청 내 OVA 특이적 IgG 서브클래스 항체의 수준을 ELISA로 측정하고 (도 4의 A), 비장 세포군 내 형질 세포 (CD38⁺CD138⁺B220^-) 및 기억 B 세포 (CD27⁺B220⁺)의 비율을 유세포 분석기로 측정하였다 (도 4의 B). 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼 그룹의 OVA 특이적 IgG 서브클래스 항체, 형질 세포 및 기억 B 세포의 비율 모두 다른 그룹에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 4).

상기 결과는 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물이 단기 및 장기 체액성 면역을 증진하는 효과가 뛰어나, 효과적인 면역보강제로 사용될 수 있음을 보여준다.

< 실시예 4> OVA 면역화 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 세포성 면역 강화 효과

C57BL/6 마우스 (n = 5)에 10 μg OVA 단백질 단독으로, 또는 400 μg 알럼 (알럼-OVA 그룹), 400 μg 폴리감마글루탐산 (폴리감마글루탐산-OVA 그룹), 또는 800 μg 폴리감마글루탐산/알럼 (폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹)으로 0, 14 및 28 일째에 근육내 주사로 면역화하였다. 마지막 면역화 후 14 일째에 마우스로부터 혈청 및 비장세포를 수집하였다. OVA로 코팅된 플레이트를 열-비활성화 혈청 (56 ℃, 1 시간)으로 인큐베이션 및 세척한 다음, PE-컨쥬게이션 항-CD107a 항체, 모넨신 및 브레펠딘 A와 함께 비면역화된 마우스에서 유래한 NK 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정 및 투과화시킨 뒤 APC-컨쥬게이션 항-IFN-γ 항체로 염색하였다. 그 다음, 유세포 분석기를 사용하여 IFN-γ 및 CD107a 발현 세포의 비율을 측정함으로써 NK 세포의 활성을 평가하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹에서 항체에 의해 활성화된 NK 세포 (CD107a+IFN-γ⁺ 및 CD107a⁺ NK 세포군)는 다른 그룹에 비해 현저히 상승함을 확인하였다 (도 5 및 도 6의 B). 그 결과, B16mOVA 및 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹 혈청의 공배양에 따른 NK 세포의 활성은 다른 그룹에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 5 및 도 6의 B).

또한, 상기 마우스 혈청을 56 ℃에서 1 시간 동안 열-비활성화시킨 후, 혈청과 B16mOVA 세포를 얼음 위에서 1 시간 동안 인큐베이션하고 세척하였다. 그 다음, 얼음 위에서 세포를 알렉사 플루오르 488-컨쥬게이션 항-마우스 IgG로 1 시간 동안 염색하였다. 그 결과, 다른 그룹에 비해 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹에서 형광 세기는 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 6의 A). 이는 B16mOVA 세포에 결합된 항체 수치가 다른 그룹에 비해 현저히 높음을 의미한다.

한편, 상기 열-비활성화 혈청, B16mOVA 세포, 및 비면역화된 마우스의 NK 세포를 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 상층액에 대해 LDH 분석법을 수행하여 ADCC 매개 세포용해 (cytolytic) 활성을 측정하였다. 그 결과, NK 세포, B16mOVA 세포를 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹 혈청과 함께 인큐베이션할 경우 B16mOVA의 용해 정도는 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 7).

그 다음, 면역화된 마우스에서 수득한 비장세포를 5 μg/ml의 OVA_{323 -339} (MHC 클래스 II에 제시되는 펩티드 절편) 또는 OVA_{257 -264} 펩티드 (MHC 클래스 I에 제시되는 펩티드 절편)로 자극하고, IL-4 또는 IFN-γ 분비 SFU의 수를 ELISPOT 분석법으로 측정하였다 (도 8). 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹의 OVA_{323 -339} 펩티드 특이적 IL-4 분비 세포의 수는 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 8 좌측 그래프). 또한, OVA_{257 -264} 펩티드 또는 OVA_{323 -339} 펩티드 특이적 IFN-γ 분비 세포의 수 모두 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 8 중간 및 우측 그래프).

상기 결과는 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물이 ADCC와 같은 세포성 면역 반응을 현저히 개선하므로, 우수한 면역보강제로 사용될 수 있음을 보여준다.

< 실시예 5> 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 시험관 내 수지상 세포 (DC) 활성화 효과

항원 제시 세포인 수지상 세포 (Dentritic cell; DC)는 적응 면역을 개시하는 데 핵심적인 역할을 수행하므로, 마우스 골수 유래 수지상 세포 (bone marrow-derived dendritic cell; BMDC)를 사용하여 폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제의 수지상 세포의 활성화에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로, 미성숙 BMDC에 OVA 항원과 알럼, 폴리감마글루탐산, 또는 폴리감마글루탐산/알럼으로 24 시간 동안 자극하였다. 그 다음, 면역 항진에 관여하는 공동자극 분자 (CD40, CD80, CD86) 및 MHC 클래스 II의 수준을 유세포 분석을 통해 측정하고 (도 9), 배양 상층액에 대해 전염증 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-12)의 분비 수준을 ELISA로 측정하였다 (도 10).

그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼에 노출된 BMDC의 공동자극 분자 (CD40, CD80, CD86) 및 MHC 클래스 II의 평균 형광 세기 (mean fluorescence intensity; MFI)와 전염증 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-12) 분비 수준 모두 알럼 또는 폴리감마글루탐산에 노출된 BMDC에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 9 및 도 10).

한편, DC의 항원 분해 및 처리 능력을 조사하기 위해, 미성숙 BMDC를 PBS, 알럼, 폴리감마글루탐산, 또는 폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제와 함께 DQ-OVA (OVA 분해시 녹색 형광을 방출하는 자가-켄칭 다이)로 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 형광 세기를 유세포 분석기로 측정하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산알럼에 노출된 BMDC에서 DQ-OVA의 MFI (34 MFI)는 PBS (21 MFI), 알럼 (20 MFI) 또는 폴리감마글루탐산 (25 MFI)에 노출된 세포에 비해 현저히 더 증가하였음을 확인하였다 (도 11).

<실시예 6> TLR4 작용제로서의 폴리감마글루탐산-알럼 복합체 효과

폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제의 수지상 세포 활성 개선 효과에 TLR4 (toll-like receptor 4)가 매개하는지 알아보기 위해, 야생형 마우스와 TLR4-결핍 마우스에서 각각 BMDC의 활성 유도 효과를 측정하여 비교하였다.

구체적으로, 야생형 C3H/HeN 마우스 및 TLR4-결핍 C3H/HeJ 마우스의 골수 세포를 GM-CSF 및 IL-4와 함께 7일 동안 배양하여 미성숙 BMDC를 생성하였다. 그 다음, BMDC를 50, 100, 또는 200 μg/ml 폴리감마글루탐산/알럼, 또는 0.1 μg/ml LPS (양성 대조군)와 함께 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하여 자극하였다. 그 후, 배양 상층액 내 전염증 사이토카인 (TNF-α 및 IL-6)의 수준을 ELISA로 측정하고 (도 12), 공동자극 분자 (수지상 세포의 면역 항진에 관여함) CD40, CD80 및 CD86의 발현 수준을 유세포 분석기로 측정하였다 (도 13). 그 결과, TLR4 기능이 결여된 마우스에서 BMDC의 전염증 사이토카인 분비 및 공동자극 분자 발현 수준은 정상 마우스에 비해 현저히 억제되어 있음을 확인하였다 (도 12 및 도 13).

한편, BMDC를 무혈청 상태로 (serum-starved) 3 시간 동안 배양한 다음, 200 μg/ml의 폴리감마글루탐산/알럼으로 37 ℃에서 30 분 동안 자극하였다. 세포 용해물에 대해 인산화 IκBα을 웨스턴 블롯팅으로 측정하고, 이미지 제이 (ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 커브 아래의 이미지 세기 면적으로 밴드 강도를 정량화하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼에 노출된 야생형 BMDC에서는 IκBα의 인산화가 증가하였으나, TLR4-결핍 마우스의 BMDC에서는 IκBα의 인산화가 거의 유도되지 않았다는 점을 확인하였다 (도 14).

상기 결과는 폴리감마글루탐산/알럼의 수지상 세포 활성화가 TLR4 신호전달과 그의 하위 기전인 NF-κB의 신호전달에 의해 매개된다는 점을 보여준다.

< 실시예 7> 폴리감마글루탐산 - 알럼 복합체의 CD8 ⁺ T 세포 활성화를 통한 세포성 면역 증진 효과

폴리감마글루탐산/알럼에 의해 수지상 세포의 항원 제시 기능이 강화되면 T 세포 활성이 개선되는지 확인하기 위해, 미성숙 BMDC를 100 μg/ml OVA 단백질 단독으로, 또는 알럼, 폴리감마글루탐산, 또는 폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제와 함께 6 시간 동안 자극하고 세포를 세척하였다. 그 다음, OT-II CD4⁺ T 세포 (MHC 클래스 II에 의해 제시된 OVA_{323 -339} 펩티드를 인식함) 또는 OT-I CD8⁺ T (MHC 클래스 I에 의해 제시된 OVA_{257 -264} 펩티드를 인식함) 세포와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 배양 상층액에 대해 T 세포에서 생성되는 사이토카인 (IL-4 및 IFN-γ)의 수준을 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-OVA에 노출된 BMDC와 공배양한 OT-II CD4⁺ T 세포의 IL-4 및 IFN-γ의 수준은 폴리감마글루탐산-OVA 그룹보다 상승하였으며, 알럼-OVA 그룹과 유사한 수준으로 상향 조절되어 있음을 확인하였다 (도 15의 A). 나아가, 폴리감마글루탐산/알럼-OVA에 노출된 BMDC와 공배양한 CD8⁺ T 세포의 IL-2 및 IFN-γ의 수준은 알럼-OVA 그룹 또는 폴리감마글루탐산-OVA 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 15의 B).

상기 결과는 폴리감마글루탐산/알럼이 DC의 활성화 및 항원 처리를 효과적으로 유도함으로써 적응 면역 반응의 활성을 증진시킨다는 점을 보여준다.

< 실시예 8> OVA 면역화 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 수지상 세포 모집 및 이동 유도 효과

효과적인 백신을 위해서는 수지상 세포가 백신 주사 부위로 모집 (recruit)되고, 항원이 로딩된 수지상 세포가 배수 림프절 (draining lymph node; dLN)로 신속히 이동하여야 한다. 따라서, 폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제가 백신 접종시 DC의 모집 및 이동에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로, C57BL/6 마우스 (n = 3)의 전경골근 (tibialis anterior)에 5 μg의 알렉사 플루오르 647-컨쥬게이션 OVA (플루오르-OVA) 단독으로, 또는 800 μg의 폴리감마글루탐산/알럼과 함께 (폴리감마글루탐산/알럼-플루오르-OVA) 근육내 주사로 투여하였다. 그 다음, 주사 부위를 포함하는 근육 조직 및 dLN에서 주사 후 3, 6, 24 및 48 시간 째에 DC (CD11c⁺MHC-II⁺) 및 플루오르-OVA-로딩된 DC의 수를 유세포 분석기로 측정하였다 (도 16). 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-플루오르-OVA 그룹에서 주사 후 3, 6, 24, 및 48 시간 째에 근육 조직 및 dLN에서 DC (CD11c⁺MHC-II⁺)의 수가 플루오르-OVA 그룹에 비해 증가하였음을 확인하였다 (도 16).

한편, 플루오르-OVA 단독으로, 또는 폴리감마글루탐산/알럼과 함께 6 시간 동안 노출된 마우스 dLN의 동결 절편에 대해 면역형광 컨포컬 현미경 관찰하였다. 스케일 바는 근육에 대한 이미지에서는 50 μm, dLN에 대한 이미지에서는 500 μm를 나타낸다. 동결 절편에 대해 DAPI (파란색), 항-마우스 CD11c (붉은색) 및 항-마우스 MHC-II (녹색) 항체로 면역형광 염색을 수행하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-플루오르-OVA 그룹에서 조직 절편 내 OVA (보라색) 및 CD11c⁺ 세포 (붉은색)의 형광 세기가 플루오르-OVA 그룹에 비해 증가하였다 (도 17).

상기 결과는 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물이 주사 부위 및 림프절로의 세포 모집 및 이동 유도 효과가 현저히 우수하여, 효과적인 면역보강제로 사용될 수 있음을 보여준다.

< 실시예 9> OVA 면역화 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 호중구 및 단핵구 모집 유도 효과

상기 실시예 8의 면역화 마우스 주사 부위 근육 및 dLN에서 호중구 (SSC^highCD11b⁺Ly6G^high) 및 단핵구 (CD11c^-CD11b⁺Ly6C^high)의 수를 유세포 분석기로 측정하였다 (도 18). 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-플루오르-OVA 그룹에서 주사 후 3, 6, 24, 및 48 시간 째에 근육 조직 및 dLN에서 호중구 및 단핵구의 수가 플루오르-OVA 그룹에 비해 증가하였음을 확인하였다 (도 18의 A). 또한, 항원-로딩된 호중구 및 단핵구의 수치도 본 발명의 폴리감마글루탐산-알럼 복합체 사용 그룹에서 상승하였다 (도 18의 B).

< 실시예 10> OVA 면역화 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 케모카인 분비 유도 효과

상기 실시예 8의 면역화 마우스 dLN의 파쇄액 (homogenate)에서 케모카인 및 사이토카인의 수준을 레전드플렉스 (Legendplex) 면역분석 키트를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-OVA 그룹의 근육 조직 및 dLN 파쇄액 내 MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β의 수준은 OVA 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 19).

< 실시예 11> 인플루엔자 접종 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 백신 보호 효과

폴리감마글루탐산/알럼 면역보강제가 실제 시판되는 백신 항원의 보호 효능에 미치는 영향을 평가하기 위해, 판데믹 인플루엔자 H1N1 (pH1N1) 바이러스 (A/California/04/09)에 감염된 마우스 모델을 사용하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스 (n = 6)에 0.06 μg pH1N1 스플릿 (split) 백신 항원 (A/California/7/2009 NYMC X-179A H1N1) 단독으로 (백신 그룹), 또는 400 μg 폴리감마글루탐산 (폴리감마글루탐산-백신 그룹), 400 μg 알럼 (알럼-백신 그룹), 또는 800 μg 폴리감마글루탐산/알럼 (폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹)과 함께 0 일째 및 14 일째에 근육내 주사로 접종시켰다. 백신 항원 단독 (백신 그룹) 또는 PBS 단독 (PBS 그룹)으로 면역화된 마우스는 음성 대조군으로 사용하였다. 마지막 면역화 후 14 일째에 마우스에 50 LD₅₀의 pH1N1 바이러스 (A/California/04/09)를 비강내 (i.n.) 투여하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹을 제외한 다른 그룹에서는 감염된 마우스의 체중이 감염 후 급격히 감소하였다 (도 20의 A). 또한, PBS 그룹 및 백신 그룹에서는 감염 14 일째에 모든 마우스가 사망하였고 알럼-백신 그룹 및 폴리감마글루탐산-백신 그룹에서는 각각 16.7% 및 33.3%로 부분적인 보호가 이루어졌다. 그러나 놀랍게도, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹에서는 감염된 마우스의 체중 감소가 일어나지 않았을 뿐 아니라 바이러스 투여 14 일에 이르기까지 사망한 마우스가 전혀 관찰되지 않았다 (도 20).

상기 결과는 본 발명의 폴리감마글루탐산-알럼 복합체가 실제 인플루엔자 바이러스에 대한 감염 방어능을 우수하게 향상시킨다는 것을 보여준다.

< 실시예 12> 인플루엔자 접종 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 체액성 면역 강화 효과

실시예 11에 기재된 바이러스 감염 마우스에서 폐 바이러스 역가를 측정하거나 인플루엔자 백신과 면역보강제로 면역화된 마우스에서 수득한 혈청을 이용하여 항체 역가, HI 및 SN 역가를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 폐 바이러스 역가에 대해서는 바이러스 감염 후 3 일 및 7일째 (days post-infection; dpi)에 측정하여 log₁₀TCID₅₀/ml 단위로 표시하였고, 항체 역가에 대해서는 마지막 면역화 후 2 주째에 수집한 혈청에 대해 종말점 (endpoint) 역가를 평균±SD로 표시하였다. HI 및 SN 역가는 GMT±SEM으로 표시였으며, 음성 대조군의 역가를 1로 표시하였다.

샘플	폐 바이러스 역가		항체 역가 (×103)			HI 역가	SN 역가
	3 dpi	7 dpi	IgG	IgG1	IgG2b
PBS	7.3	5.5	0.4±0.3	0.1±0.1	0.1±0.1	1±0	1±0
백신	6.6	5.5	114±33	148±87	53±35	13±14	32±4
알럼-백신	6.6	5.0	243±49	1137±381	128±77	100±55	45±6
폴리감마글루탐산-백신	5.5	3.5	53±24	45±29	57±20	3±5	40±21
폴리감마글루탐산/알럼-백신	4.3	-	1501±280	1273±827	2553±1019	320±180	100±95

표 2에 나타나듯이, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹의 폐 파쇄액 내 바이러스 역가는 감염 3 일째에 다른 그룹에 비해 현저히 감소하였고, 감염 7 일째에는 바이러스 제거 (clearance)가 나타났음을 확인하였다 (표 2). 또한, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹의 혈청 내 인플루엔자 항원-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2b 역가는 다른 그룹보다 현저히 높았다. 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹의 혈청의 HI 역가 및 SN 역가는 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다.

< 실시예 13> 인플루엔자 접종 마우스에서 폴리감마글루탐산 / 알럼 면역보강제의 세포성 면역 강화 효과

C57BL/6 마우스 (n = 6)를 판데믹 인플루엔자 백신 단독으로 (백신 그룹), 또는 400 μg 알럼 (알럼-백신 그룹), 400 μg 폴리감마글루탐산 (폴리감마글루탐산-백신 그룹), 또는 800 μg 폴리감마글루탐산/알럼 (폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹)으로 0 및 14 일째에 근육내 주사로 면역화하고, 마지막 면역화 2 주 후에 마우스 혈청을 수득하였다. 인플루엔자 바이러스에 감염되거나 감염되지 않은 MDCK 세포에 대해 마우스 혈청 내 항체의 결합능을 유세포 분석기로 평가하였다 (도 21). 그 결과, 모든 그룹에서 감염된 MDCK 세포에 대한 항체 결합능이 상승하였으나, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹의 혈청 내 항체의 감염 MDCK 세포에 대한 결합능은 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 21).

또한, pH1N1 바이러스 감염 MDCK 세포를 열-비활성화 혈청 (60 분, 57 ℃)과 함께 인큐베이션하고, NK 세포와 함께 추가로 인큐베이션한 다음 MDCK 세포의 세포독성 (cytotoxicity)을 LDH 분석법으로 평가하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹의 혈청과 인큐베이션한 경우 바이러스 감염 세포의 용해 (즉, 세포 독성)가 다른 그룹에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 22).

한편, 96 웰-플랫 바텀 플레이트를 0.6 μg/ml HA 줄기 부위 (stalk region) 항원으로 코팅하고 세척한 다음, 면역화된 마우스의 열-비활성화 혈청 및 NK 세포와 함께 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, NK 세포 IFN-γ 및 CD107a의 발현을 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹의 혈청과 인큐베이션한 경우 IFN-γ⁺ 및 IFN-γ⁺CD107a⁺ NK 세포의 수 모두 다른 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 23). 상기 결과는 본 발명의 폴리감마글루탐산-알럼 복합체가 폴리감마글루탐산 또는 알럼 단독 면역보강제에 비해 항체 의존적 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity) 활성을 현저히 개선시킴을 보여준다.

또한, 상기 면역화 마우스에서 비장세포를 수득하여, 500 TCID₅₀ UV-비활성화 pH1N1 바이러스로 자극한 다음, 인플루엔자 바이러스 항원 특이적 IFN-γ 분비 SFU의 수를 ELISPOT 분석법으로 측정하고 (도 24의 A), 인플루엔자 바이러스 항원 특이적 IFN-γ⁺CD4⁺ T 세포 및 IFN-γ⁺CD8⁺ T 세포의 비율을 유세포 분석기로 측정하였다 (도 24의 B). 그 결과, 폴리감마글루탐산/알럼-백신 그룹에서 IFN-γ 분비 세포, 및 IFN-γ 분비 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 수 모두 다른 그룹에 비해 현저히 더 상승하였음을 확인하였다 (도 24). 상기 결과는 본 발명의 폴리감마글루탐산-알럼 복합체가 폴리감마글루탐산 또는 알럼 단독 면역보강제에 비해 T 세포 활성 증진 효과가 현저히 우수하다는 점을 보여준다.

상술한 실시예를 통해 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산 및 알럼을 포함하는 면역보강제 조성물은 백신용 항원과 함께 투여되어 감염 부위 모집 및 림프절로 선천성 면역 세포의 모집 및 이동, 전염증성 사이토카인 분비 및 항원 제시 기능을 현저히 증가시킬 뿐 아니라, 이를 통해 체액성 면역 및 세포성 면역 모두 폴리감마글루탐산 또는 알럼 단독 면역보강제에 비해 현저히 개선되었음을 확인하였다 (도 25). 따라서, 본 발명의 면역보강제 조성물은 치료 효과가 우수한 효과적인 백신 면역보강제로 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.

Claims (15)

1. 폴리감마글루탐산 및 알럼 (alum)을 포함하고,
   상기 폴리감마글루탐산 및 알럼은 폴리감마글루탐산-알럼 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는,
   세포성 면역 (cell-mediated immunity) 증진용 면역보강제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 폴리감마글루탐산의 분자량은 1,000 내지 3,000 kDa인 면역보강제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 폴리감마글루탐산:알럼의 중량비는 10:1 내지 1:10인 면역보강제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 알럼은 수산화알루미늄을 포함하는 것인 면역보강제 조성물.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 폴리감마글루탐산-알럼 복합체는 TLR4 (Toll-like receptor 4) 작용제인 면역보강제 조성물.
7. 삭제
8. 폴리감마글루탐산 및 알럼으로 형성된 폴리감마글루탐산-알럼 복합체; 및 항원;을 포함하는 백신 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 항원은 세포, 바이러스, 단백질, 펩티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물 및 지질로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 백신 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 백신 항원인 백신 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 인플루엔자 백신 항원은 헤마글루티닌인 백신 조성물.
12. 제8항에 있어서, 바이러스성 감염증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
13. 제12항에 있어서, 인플루엔자의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 인플루엔자는 H1N1 인플루엔자인 백신 조성물.
15. 제8항에 있어서, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 복막내 주사, 비강 투여, 구강 투여, 경피 투여 또는 경구 투여되는 백신 조성물.
    

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