KR20200086315A - 백신 보조제로서 gm3 강글리오시드의 합성 변이체를 포함하는 나노입자 - Google Patents

백신 보조제로서 gm3 강글리오시드의 합성 변이체를 포함하는 나노입자 Download PDF

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베린다 산체즈 라미레즈
아우드리 페르난데즈 고메즈
그레첸 베가도 베즈
씨얼쓰 메사 페르디로
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블란카 이델미스 토론 머규아
미구엘 안토니오 로페즈 로페즈
제수스 알투로 준코 바란코
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센트로 데 인뮤놀러지아 모레큘러
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Abstract

본 발명은 다양한 GM3 강글리오시드의 합성 변이체에 의해 형성된 나노-입자화된 보조제의 제조 방법에 관한 것이다. 합성 GM3의 세라미드 내 지방산의 미세구조에 따라서, 상기 보조제는 특화된 방법으로 항원에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 특이적으로 자극할 수 있다. 특히, 본 발명은 GM3 강글리오시드의 완전 합성 변이체를 포함하는 용액 내에서 나이세리아 메닌지티디스의 외막 복합체(OMC)의 소수성 단백질 분산을 통해 형성되는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 및 전술한 나노입자를 포함하는 면역원성 백신 조성물을 제공한다.

Description

백신 보조제로서 GM3 강글리오시드의 합성 변이체를 포함하는 나노입자
본 발명은 면역-나노공학 및 면역 항암치료 특히 암이나 발암 바이러스에 의한 만성 감염에 걸린 대상체를 위한 치료용 백신에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 이들 환자에서 세포성 또는 체액성 면역 작동자를 특이적으로 자극하는 데에 특화된 나노입자 보조제에 관한 것이며, 이에 상응하는 백신 조성물을 제공한다.
치료용 암 백신은 임상시험에서 성공적인 결과를 거두지 못한 후 수십년간 환자를 위한 효과적이고 낮은 독성의 치료제 역할을 하는 데에 실패했다. 최근의 면역관문 억제 항체(Ab)의 임상적 성공은 암 백신을 포함하는 면역-종양학에 대한 상업적, 과학적 흥미를 자극하고 있다. 이들 치료용 백신의 실패는 잘못된 항원의 선택, 상대적으로 비효율적인 비이클/보조제의 사용 및 이러한 백신을 종양 미세환경에 의해 발생하는 부정적인 효과(Branca MA et al (2016) Nat Biotech 34 (10): 1019-24)를 바로잡는 역할을 하는 다른 면역조절제와의 조합 없이 단독 투여(monotherapy)한 점 등이 원인일 수 있다.
전통적으로, 암 백신은 자가-조합 종양 항원으로 분류되는 제형 단백질 내에서 사용되었는데, 이들은 종양세포에서 이상 발현되고 정상 조직에서도 존재한다. 이들 백신의 임상에서의 효율성을 뒷받침하는 확실한 증거가 없는 것은 이들 대부분의 항원에 대해 친화력이 높은 수용체를 가지는 T 세포가 소멸함으로써 발생하는 중심관용(central tolerance) 과정 때문일 수 있다 (Tran E. et al (2017) Nat Immunol 18 (3): 255-62). 따라서, 이러한 항원 타입에 기반한 백신의 성공 여부는 초기에는 상대적으로 약하지만 이후 종양이 천연의 신규 항원으로 작용하면서 증가하는 작동자 T 세포의 특이적 반응을 강화시킬 수 있는 특화된 신규 보조제의 사용에 달려있다. 이를 통해 악성 병변을 제거할 수 있는 세포 독성 T 림프구(CTL)의 강력한 다중특이적, 맞춤형 작용을 이끌어낼 수 있다.
최근 종양 신생 항원(neo-antigen)이 알려지면서, 성공적인 암 백신을 위한 항원의 선정과 관련하여 관점의 변화가 일어나고 있다. 이들 신생항원을 얻는 수월한 방법은 각 종양 돌연변이의 맞춤형 검출에 의한 것이다. 이러한 형태의 항원의 보다 제한적인 공급원은 바이러스 종양 단백질 서열이다. 이들 돌연변이된 펩타이드가 면역 체계에 새로운 물질(이들은 정상 조직에는 존재하지 않음)이 때문에 보다 면역원성이 높다는 장점이 있으나, 이들 신생항원을 이용하여 설계된 백신의 성공여부는 역시 CTL 반응을 극대화할 수 있는 신규한 보조제의 능력과, 성공적인 성숙 및 종양 미세환경 (TME)의 면역억제 효과의 회피의 측면에서 항원제시세포(APC)가 항원을 제시할 수 있도록 하는 항원의 최적의 이용도에 좌우된다. 다른 한편, 실제로는 진정한 신생-에피토프를 동정하는 것은 비효율적인 과정이다. 서열분석 연구를 통해 각각의 종양에서의 수천개의 체세포 돌연변이를 동정하였으며 생물정보공학(bioinformatics) 프로그램을 통해 특정 MHC에 결합할 수 있는 수백개의 변이된 펩타이드를 예측하였으나, 방대한 양의 이들 신생-에피토프는 질량 분광학 조사 결과 실제 종양에서 발견되지 않았다. 심지어 이중 몇몇 만이 CTL 반응을 자극할 수 있었다. 이는 신생-에피토프를 예측하고 확인하는 현재의 방법이 임상 현장에서의 개인 맞춤형 면역치료가 가능할 정로도 일상적으로 사용되기는 어렵다는 점을 보여준다(Editorial, (2017) Nat Biotech 35 (2): 97).
모든 형태의 백신에서 적절한 보조제(adjuvant)의 선정은 원하는 효과 달성을 위한 중요한 요소이다. 치료용 암 백신의 주 목적은 B 림프구, T 세포 및 선천 면역의 매개자의 활성화와 증식을 촉진하여 자극된 체액성 및 세포성 면역 작동자가 종양세포를 인식하고 사멸시키도록 함으로써 환자의 생존률과 삶의 질을 높이는 데에 있다. 이러한 목적을 달성하기 위한 이상적인 보조제는 먼저 APC의 항원 이용도를 최적화해야 한다. 다음으로, 이들 APC를 효율적으로 자극함으로써 필요한 공-자극 신호를 발생시키고 특정 사이토카인과 케모카인을 분비하도록 해야 한다. 세번째로, 면역억제 효과가 중화될 수 있도록 TME를 조정할 수 있어야한다. 근래, 이러한 모든 특징을 갖춘 보조제는 개발되지 못했다.
Khong H 등(Khong H. et al (2016) J. Immunother. Cancer 4: 56)에 따르면, 암 백신용의 유망한 보조제로 마이크로 및 나노입자가 있는데, 이은 백신접종을 강화시키는 몇몇 유리한 특징을 가진다. 이들 입자의 제작은 입자 크기 및 전체 전하를 조절함으로써 특정 APC를 효율적으로 타겟팅하기 위해 항원과 함께 작용하도록 설계될 수 있다. 500-2000 nm 범위 직경의 백신 입자는 주입 부위에서 APC에 의해 잘 포집되어 림프절(LN)로 이동하는 반면, 20-200 nm 입자는 수동적으로 LN으로 흘러들어가 부근의 APC에 의해 포집된다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 마이크로 및 나노입자는 리포좀, 프로테오리포좀, 합성 폴리머 및 천연 폴리머이다. 이들 각 나노입자의 이점 및 한계는 당업계에 알려져있다.
본 발명에 특히 적합한 예는 Xu F. 등(Xu F. et al (2016) ACS Nano Vol. 10: 1189-1200)에 의해 기술된 GM3 강글리오시드를 포함하는 합성 나노입자 보조제이다. 이 보조제는 40 내지 80 nm 직경의 금 나노입자를 GM3 강글리오시드가 삽입된 지질막으로 코팅함으로써 만들어진다. 이런 방법으로, 당지질-수용체 특이적 상호작용, 특히 시알릴-락토오스와 활성화된 수지상세포(DC)에서 과발현되는, LN에서 CD4 + T 세포와의 시냄스의 주역인 Siglec1(CD169)의 상호작용이 이루어질 수 있다. GM3로 코팅된 이들 나노입자가 오금 림프절의 CD169+ DC에 선택적으로 인 비보 누적되기는 하나, 종양 모델에서 기준 항원을 이용한 접종 실험을 통해 이들이 유용한 보조제로 사용될 수 있다는 근거는 없다. 한편, 이러한 원리는 40 내지 80nm 직경의 나노입자에서만 적용된다.
Molina 등은 미국특허등록 제7,776,346호에서 나이세리아 메닌지티디스 박테리아의 외막 단백질 복합체(OMPC)를 면역원성이 낮은 항원과 소수성 접합을 시켜 형성되는 매우 작은 크기의 프로테오리포좀(VSSP)과 강글리오시드 GM3을 이용하는 효율적인 면역원 제작방법을 기술하는데, 이것이 본 발명의 방법과 가장 유사한 기술적 해결방안으로 생각된다. 또한, 이들 VSSP를 수득하는 방법은 Rodriguez 등의 미국특허등록 제6,149,921호에도 자세히 기재되어 있는데, 이들 프로테오리포좀을 얻기 위해 사용되는 GM3 강글리오시드는 생물학적 기원, 주로 단클론 항체의 산업적 생산 결과 얻어지는 하이브리도마를 통해 수득되어야 한다는 점을 강조하고 있다. Est
Figure pct00001
vez 등(Est
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vez et al (2000) Vaccine Vol. 18: 90-197)은 이들 VSSP가 개 적혈구에서 얻어진 GM3를 이용하여 생산될 수 있음을 개시한다. Lee H 등 (Lee H et al (2011) Int J Mass Spectr Vol 305: 138-150)에 의해 설명된 바와 같이, 자연계에서 얻어진 GM3 강글리오시드는 올리고당의 구조는 동일하나 세라미드는 지방산 조성물의 구조가 다양한, 상이한 분자 종의 혼합물로 구성된다는 사실은 당업계에 잘 알려져 있다. 약학 조성물을 제조하기 위해 동물이나 종양 기원의 물질을 사용하는 데 있어서의 불편함은 별론으로 하고, 생물학적 기원의 GM3를 사용할 경우 재생 가능한 필수적 특성을 가지는 VSSP를 수득하기 어렵게한다.
본 발명에서 기술하기 이전에는, 어떠한 종래의 기술적 해결책이나 과학적 문헌에서도 화학적으로 정의된 구조를 가지는 상이한 완전 합성 GM3를 이용하여 생산된 VSSP 변이체를 개시한 바는 없다. 이들 합성 변이체는 또한 제조 과정에서 사용된 GM3 강글리오시드의 분자적 미세구조에 따라 치료용 백신용으로 특화된 보조제로서 기능하는 놀라운 특성을 가지며, 이러한 특화로 인해 본 발명의 신규 보조제는 생물학적 기원의 GM3를 이용하여 생산된 VSS에 비해 유리한 특성을 가진다. 따라서 본 발명의 신규성은 완전 합성 GM3 강글리오시드를 함유하는 새로운 VSSP 나노-입자화된 보조제로서, 기본적으로 항원에 대한 강력한 항체 반응을 유도하기 위한 스테아르산, GM3 (18: 0), 또는 특이적 CTL 작동자 반응의 유도에 특히 효과적인 올레산, GM3 (18:1)를 함유하는 세라미드를 가지는 GM3의 구조를 가지나 이에 제한되지는 않는 보조제를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 GM3 강글리오시드의 완전 합성 변이체와 박테리아 N. 메닌지티디스 외막 복합체의 소수성 단백질 간의 결합을 통해 형성되는 나노입자를 포함하는 보조제에 관한 것으로, 상기 조성물은 기본적으로 GM3 강글리오시드의 세라미드인 스테아르산 또는 올레산을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 전술한 나노-입자화된 보조제를 포함하고, 선택적으로 알럼(alum) 또는 오일 보조제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 또 다른 보조제를 추가적으로 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 백신 조성물에 관한 것이다. 특히, 이들 백신 조성물에서 항원은 성장인자 수용체의 세포외 도메인 또는 그 일부이며 그 예로는 HER1, HER2 또는 HER3 단독 또는 이들의 조합; 또는 GnRH 호르몬과 관련된 펩타이드인 PyrGnRHm1-TT가 있다. 상기 백신 조성물은 암 또는 종양유발 바이러스의 만성 감염을 치료하기 위한 의약의 생산에 사용될 수 있다
특정 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 나노-입자화된 보조제를 포함하는 백신 조성물을 단독 또는 조합하여 환자의 특정 체액성 또는 세포성 면역 반응을 자극하기 위한 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 2주 1회의 빈도로 최소 5회의 유도 용량을 투여 후 최소 6개월간 매월 유지 용량을 피하(SC), 피내, 근육내, 림프절내, 종양내 투여하거나 또는 점액막 상에 직접 적용하여 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 동시에, 시간차를 두고 혹은 택일적으로 투여될 수 있다.
백신 조성물
본 발명에서 사용된 백신 조성물은 GM3 강글리오시드의 완전 합성 변이체 용액 내에서 N. 메닌지티디스의 OMPC 유래 소수성 단백질의 분산에 의해 형성된 나노-입자화된 보조제와 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 항원의 결합을 통해 형성된다. 특히 이들 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 성장인자 수용체의 전체 세포외 도메인 또는 그 일부일 수 있으며 또한 GnRH와 같은 종양 진행의 특정 단계와 관련된 호르몬일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 VSSP의 하나에 포함된, GM3 강글리오시드의 세라미드에 존재하는 지방산의 형태는 백신의 목적에 따라 다를 수 있다; 항체 반응을 촉진시키기 위한 목적이라면 스테아르산(GM3 18:0)이 사용될 것이며, CTL 반응을 촉진시키기 위한 목적일 경우 올레산(GM3 18: 1)이 사용될 것이다. 적절하게 두가지 백신 제형을 조합하여 접종함으로써 동일한 항원에 대해 숙주 내에서 항체 및 CTL의 이중 반응을 유도할 수도 있다. GM3(18: 0)를 함유하는 VSSP와 GM3(18: 1)를 함유하는 VSSP가 단독 혹은 알럼 또는 오일 제형과 같은 다른 보조제와 조합되어 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
GM3 (18:0)를 가지는 VSSP를 보조제로 이용하는 본 발명의 백신 조성물은 천연 유래 강글리오시드를 함유하는 나노입자를 보조제로 하는 백신 제형과 비교하여 체액성 반응 유도, 종양 세포주의 혈청 내 인식, 종양 세포에서 수용체 활성화의 혈청 내 억제 측면에서 뿐 아니라 이들 세포의 생존률 감소 측면에서 보다 우수하다.
GM3 (18:1)를 가지는 VSSP를 보조제로 이용하는 본 발명의 백신 조성물은 천연 유래 강글리오시드를 함유하는 나노입자를 보조제로 하는 백신 제형과 비교하여 보다 강력한 CTL 반응을 유도한다.
치료적 적용 및 치료 방법
본 발명은 성장인자 수용체 패밀리에 대한 항체 또는 CTL 반응을 유도하는 데에 특화된 백신 조성물을 제공하며, 이는 항체 반응 및 특정 CTL반응 모두 효과적이지만 단일 백신 제형 및 단일 투여 계획에 최적화되기 어렵다고 알려졌기 때문에, 면역-종양치료에서 중요한 항원성 시스템을 위한 유용한 해결책이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 진행의 특정 단계와 관련된 호르몬에 대한 높은 역가의 중화항체를 생성하는 데에 특화된 백신 제형을 제공하는 데에 있으며, 예를 들어 GnRH 호르몬이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적은 특히 암 또는 종양유발 바이러스의 만성 감염을 겪는 면역 저하된 환자에서 항체 또는 CTL의 특이적인 강력한 반응을 형성할 수 있는 치료용 백신 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 백신 조성물은 SC, 피내, 근육내, 림프절내, 종양내 경로로 또는 점액막에 직접 적용하여 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물로 치료될 수 있는 암종은 상피 유래 암이다. 보다 구체적으로, 이들 암의 예는 폐암(소세포 및 비소세포형), 간세포암, 위암, 췌장암, 두경부암, 교아종, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 직장암, 전립선암, 침샘선암, 신장암, 외음부 및 갑상선 종양, 항문선암 및 음경선암을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물 내 포함된 성장인자 수용체의 세포외 도메인 또는 그 일부의 인간에게 적용되는 용량은 200μg에서 1mg 사이이며, 바람직하게는 400μg에서 900μg 범위 내이다. 본 발명의 백신 조성물 내 포함된 GnRH 펩타이드의 용량은 500μg에서 3mg 사이이며, 바람직하게는 1 mg에서 2.5 mg 범위 내이다. VSSP는 100μg에서 1mg 사이의 범위, 바람직하게는 200μg 내지 600μg(OMPC 함량에 따라)로 투여된다.
상기 조성물은 2주 1회의 빈도로 최소 총 5회의 유도 용량을 투여 후 최소 6개월간 매월 유지 용량으로 대상체에 투여된다. 원하는 효과가 동일한 항원에 대한 항체 및 CTL의 이중 반응일 경우, 접종은 두 가지 백신 조성물을 동시에, 시간차를 두고 혹은 택일적으로 투여함으로써 이루어질 수 있다.
나노-입자화된 보조제 VSSP GM3 (18: 0)의 수득
먼저, N. 메닌지티디스의 OMPC를 반응기에서 디옥시콜산나트륨(10-40 mM)과 황산 도데실 나트륨(1-10 mM)의 혼합물을 함유하는 Tris-HCL 완충액에서 분산시키고 1 내지 36시간 동안 저어주었다. 다음으로, 합성 강글리오시드(GM3 18: 0)를 첨가된 OMPC 질량의 0.1 내지 3배 질량으로 첨가하고 추가적으로 저어주었다. 이어서, 한외여과 및 투석을 통해 계면활성제를 제거하였다. 한외여과된 잔여물 용액을 OMPC가 0.1 내지 1mg/ml가 되도록 농축하여 0.2μm 포어 크기의 캡슐로 여과함으로써 살균하였다.
나노-입자화된 보조제 VSSP GM3 (18:1)의 수득
먼저, N. 메닌지티디스의 OMPC를 반응기에서 디옥시콜산나트륨(10-40 mM)과 황산 도데실 나트륨(1-10 mM)의 혼합물을 함유하는 Tris-HCL 완충액에서 분산시키고 1 내지 36시간 동안 저어주었다. 다음으로, 합성 강글리오시드(GM3 18: 1)를 첨가된 OMPC 질량의 0.1 내지 3배 질량으로 첨가하고 추가적으로 저어주었다. 이어서, 한외여과 및 투석을 통해 계면활성제를 제거하였다. 한외여과된 잔여물 용액을 OMPC가 0.1 내지 1mg/ml가 되도록 농축하여 0.2μm 포어 크기의 캡슐로 여과함으로써 살균하였다.
VSSP GM3(18:0)를 보조제로 포함하는 HER1, HER1 + HER2 및 HER3 백신 조성물의 제조
HER1 또는 HER1+HER2 또는 HER3를 성장인자 수용체로서 포함하고 VSSP GM3(18: 0)를 보조제로서 포함하는, 특이적인 강력한 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 바람직한 백신 조성물은 다음과 같이 제조되었다: 용액 내 또는 동결건조된 HER1 또는 HER1+HER2 또는 HER3 항원의 각각의 바이알 및 4 내지 20℃에서 미리 보관된 VSSP GM3 18:0 용액을 환자의 병상 옆에서 주사 전 10-30 분간 개별적으로 혼합하여 항원과 VSSP GM3 (18: 0)(OMPC 함량에 따라)의 최종 질량비가 300μg 내지 2 mg 범위가 되도록 하였다.
VSSP GM3 (18:1)를 보조제로 포함하는 HER1, HER1 + HER2 및 HER3 백신 조성물의 제조
HER1 또는 HER1+HER2 또는 HER3를 성장인자 수용체로서 포함하고 VSSP GM3(18: 1)를 보조제로서 포함하는, 특이적인 강력한 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 바람직한 백신 조성물은 다음과 같이 제조되었다: 용액 내 또는 동결건조된 HER1 또는 HER1+HER2 또는 HER3 항원의 각각의 바이알 및 4 내지 20℃에서 미리 보관된 VSSP GM3 18:1 용액을 환자의 병상 옆에서 주사 전 10-30 분간 개별적으로 혼합하여 항원과 VSSP GM3 (18: 1)(OMPC 함량에 따라)의 최종 질량비가 300μg 내지 2 mg 범위가 되도록 하였다.
VSSP GM3(18:0)를 보조제로 포함하는 GnRHm1-TT 펩타이드 백신 조성물의 제조
생합성 과정에서 천연 GnRH(EHWSYGLRPG) 서열의 6번째 아미노산인 L-글리신을 L-프롤린으로 치환하여(EHWSYPLRPG) GnRHm1-TT 펩타이드를 제조하였다. 제작을 완료하기 위해 파상풍 독소의 QYIKANSKFIGITEL 에피토프(Junco JA et al (2007) Vaccine 25: 8460-68)를 합성 과정 중에 고상 방법(solid phase method)(Hougten et al., (1986) Biotechniques 4: 522-6)에 따라 첨가하였다. 이에 본 발명의 목적을 위해 제조된 펩타이드는 PyrGnRHm1-TT로 명명한다.
PyrGnRHm1-TT 및 보조제로서 VSSP GM3 (18:0)를 포함하는, 특이적인 강력한 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 바람직한 백신 조성물은 다음과 같이 제조되었다: 용액 내 또는 동결건조된 PyrGnRHm1-TT 항원의 각각의 바이알 및 4 내지 20℃에서 미리 보관된 VSSP 18:0 용액을 환자의 병상 옆에서 주사 전 10-30 분간 개별적으로 혼합하여 항원과 VSSP GM3 18:0(OMPC 함량에 따라)의 최종 질량비가 600μg 내지 4 mg 범위가 되도록 하였다.
도 1은 MCA203 종양을 가지는 마우스에 각각 상이한 GM3 분자종을 포함하는 VSSP 나노입자를 처리한 뒤 유세포 분석으로 비장에서의 CD11b+GR1+ 세포 축적을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 OVA/VSSP GM3 (18:1), OVA/VSSP GM3 (18:0) 및 OVA/VSSP GM3 (천연 유래)로 접종한 마우스에서 유도된 인 비보 항원-특이적 CTL 반응을 유세포분석으로 측정한 결과를 보여준다.
도 3은 상이한 GM3 분자종을 함유하는 VSSP 나노입자를 보조제로 이용한 OVA 백신을 처리한 EG7 모델에서의 항-종양 효과를 나타내는 그림이다. 그래프는 실험 20일째에 각 그룹에서의 종양 부피 및 그 평균값을 나타낸다. 점선은 종양이 진행 중이지 않은 경우의 값을 의미한다. 우측은 각 그룹에서 종양이 진행되지 않은 동물의 빈도를 나타낸다.
도 4는 VSSP GM3 (18:0) 보조제를 포함하는 HER3 백신에 의해 유도된 IgG 역가를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다.
도 5a는 VSSP GM3(18:0) 보조제를 포함하는 HER1+HER2 이가 백신으로 유도된 HER1 및 HER2에 대한 항체 역가와 VSSP GM3 (천연 유래)를 보조제로 사용한 경우의 항체 역가를 ELISA 분석을 통해 비교한 결과이다.
도 5b는 GM3 VSSP(18: 0) 보조제를 포함하는 HER1+HER2 이가 백신으로 유도된 DEC-HER2 서브도메인에 대한 항체 역가와 VSSP GM3(천연 유래)를 보조제로 사용한 경우의 항체 역가를 ELISA 분석을 통해 비교한 결과이다.
도 6은 유세포 분석을 통해 GM3 VSSP(18: 0) 보조제를 사용한 HER1 + HER2 이가 백신에 의해 유도된 항체에 의해 종양 세포주인 HER1+/HER2+가 인식되는 정도를 VSSP GM3 (천연 유래) 보조제를 사용한 경우와 비교한 결과를 보여준다.
도 7은 GM3 VSSP (18: 0)를 보조제로 포함하는 이가 HER1+ HER2 백신에 의해 유도된 항체가 H125 HER1+/HER2+ 종양 세포주의 생존률에 미치는 영향을 VSSP GM3 (천연 유래)를 보조제로 사용한 경우와 비교한 결과를 MTT 측색분석을 통해 보여주는 그림이다.
도 8은 유세포 분석을 통해 GM3 VSSP (18:0) 보조제를 사용한 HER1 백신에 의해 유도된 항체에 의해 종양 세포주인 MDA-MB468(HER1+)가 인식되는 정도를 VSSP GM3 (천연 유래) 보조제를 사용한 경우와 비교한 결과를 보여준다.
도 9는 웨스턴 블롯을 통해 VSSP GM3 (18: 0) 또는 VSSP GM3 (천연 유래) 보조제를 사용한 HER1 백신 조성물로 유도된 항체에 의해 HER1 활성화가 억제된 정도를 비교한 결과를 보여준다.
도 10은 VSSP GM3 (18:0)의 존재 또는 부재 하에서 PyrGnRHm1-TT 펩타이드를 접종할 경우 코펜하겐 랫트 전립선의 무게에 미치는 영향을 보여준다.
도 11은 듀닝 R3327-H 종양 세포주를 이식한 코펜하겐 랫트에서의 종양 성장률을 평가한 결과를 보여주는 그리이다.
실시예
실시예 1. MCA203 종양을 가지는 마우스에 VSSP GM3 (18:1)를 투여하면 비장에서 CD11b + GR1 + 세포의 수가 증가하지 않는다.
4개 그룹의 암컷 C57BL/6 마우스(그룹 당 3마리)에 0일 째에 SC로 MCA203 세포 1 x 106 개를 주입하였다. 이후, 11, 12 및 18일 째에, VSSP GM3(천연 유래), VSSP GM3(18:1) 및 VSSP GM3(18:0)(200μg OMPC)를 3개 그룹 마우스에 SC로 주사하고, 4번째 그룹의 마우스는 비처리 대조군으로서 인산 완충액을 투여하였다. 22일 째에, 동물들을 희생시키고 적출된 각 비장에서 유세포분석을 통해 CD11b+Gr1+세포 수를 측정하였다. VSSP GM3(18:1)를 처리한 동물(도 1)은 완충액 투여 종양 마우스와 비교할 때 이들 조절 세포의 양이 유사하였다. 다른 한편 CD11b+Gr1+ 세포는 VSSP GM3(천연 유래) 및 VSSP GM3(18:0)를 주사한 동물의 비장에서 유의하게 증가하였다(같은 글자 sp>0.05, 다른 글자 sp<0.05, ANOVA 및 Tukey 검정).
실시예 2. OVA/VSSP GM3(18:1)를 이용한 백신접종은 OVA/VSSP GM3(천연 유래)에 비하여 3배 더 T CD8+ 세포 특이적인 세포 독성을 유도한다.
VSSP GM3 (천연 유래) 나노입자, VSSP GM3(18:1) 및 VSSP GM3(18:0)를 각각 보조제로 사용한 3가지 상이한 제형의 OVA 항원으로 면역화한 암컷 C57BL/6 마우스(그룹 당 3마리)에서 인 비보 CTL 항원-특이적 반응을 비교하였다. 백신을 SC로 0, 1 및 7일째에 투여하였다(200μg OMPC). 동시에 CFSE(37℃에서 5분 동안)로 상이하게 표지된 동물로부터 비장세포를 수득하였다. SIINFEKL 펩타이드와 함께 배양한 뒤(1μM, 90분 동안 37℃, 5% CO2 하에서) 높게 표지된 세포(5μM)를 표적 세포로 사용하였고, 펩타이드 로딩 없이 낮게 표지된 세포(0.33μM)는 대조군으로 사용되었다. 마지막 접종 후, 세척을 통해 유리 펩타이드를 제거하고 양 타입의 비장세포를 동일한 비율로 혼합하여 백신접종한 동물에 주사하였다. 16시간 뒤 접종 마우스의 서혜 림프절을 제거하고 2개의 형광 강도를 유세포분석으로 측정하였다. 용해 백분율은 다음의 식으로 계산하였다: 100 - [(CFSEhigh/CFSElow) x 100]. OVA/VSSP GM3(18:1) 백신(도 2)은 60%의 특이적 용해를 유도하였으며, 이는 OVA/VSSP GM3(천연 유래) 및 OVA/VSSP GM3(18:0) 백신을 통해 얻은 값보다 3배 더 높은 값이다.
실시예 3. 치료용 항암 백신에서 GM3 (18:1)를 보조제로서 함유하는 VSSP 나노입자의 사용은 천연유래 GM3를 포함하는 나노입자에 비해 항종양 효과를 향상시킨다.
세 그룹의 암컷 C57BL/6 마우스(그룹 당 10마리)에 SC로 0일 째에 3 x 105의 EG.7 종양세포(신생 항원으로 OVA를 발현하도록 유전적으로 변형된 EL4 흉선종 변이체)를 접종하였다. 이어서, 4, 5 및 11일 째에 상이한 OVA 백신 제형을 이용하여 3회의 연속적 면역화를 SC 경로로 수행하였다: 첫 번째(200μg/dose)는 VSSP GM3 (천연 유래)를 보조제로 사용하고 두 번째(200 μg/dose)는 VSSP GM3 (18:1)를 보조제로 사용하였다. 세 번째 그룹의 마우스에 동일한 일정으로 인산 완충액을 주입하고 대조군으로 사용하였다. 종양 접종 후 7일 뒤에, 종양 부피(TV)를 주 2회 측정하였다. 종양이 괴사하거나 또는 종양 크기가 직경 17mm를 초과했을 때 동물들을 희생시켰다. 실험 20일째에(도 3) OVA/VSSP GM3 (천연 유래) 제형 대비 OVA/VSSP GM3 (18: 1) 치료용 백신의 우수성이 관찰되었다(TV 평균값: VSSP GM3 (18:1) 560 mm3; 천연 유래 740mm3; 대조군 1640mm3)(p=0.037 ANOVA 및 Tukey 검정). 보다 중요한 것은, EG7가 공격적인 종양모델임에도 OVA/VSSP GM3 (18:1) 조성물을 처리한 그룹에서 동물의 50%가 종양이 진행되지 않았다는 점이다(대조군에서는 100%의 동물에서 종양 진행이 관찰되었다). OVA/ VSSP GM3(천연 유래)를 접종한 동물에서는 20%만이 무진행을 보였다(p = 0.012, 카이제곱 검정).
실시예 4. HER3/VSSP GM3 백신 조성물(18:0)에 의한 높은 역가의 HER3 특이적 항체의 유도.
BALB/c 마우스(n=5)에 SC로 200μg HER3 ECD와 200μg GM3 VSSP (18:0)를 혼합한 백신 조성물을 접종하였다. 면역화는 0, 14, 28 및 42일 째에 수행하였다. 35일 째(1차 추출) 및 56일 째(2차 추출) 혈액을 추출하여 혈청을 얻었으며 HER3 ECD에 대한 특이적 항체 Abs 역가를 ELISA로 측정하였다. 플레이트를 10μg/mL HER3 ECD로 코팅하고 37℃에서 배양하였다. 블로킹 후, 혈청 희석액(1/100, 1/1000, 1/5000, 1/10000)을 첨가하였다. 반응은 항-뮤린 IgG 항체/퍼옥시다제 컨쥬게이트(Sigma) 및 상응하는 기질을 이용하여 시각화하였다.
면역화된 마우스는 특이적 IgG를 1/5000에 이르는 역가로 생성하였다(도 4). 이러한 결과를 통해 GM3 VSSP(18:0)가 자가 종양 항원과 같이 면역원성이 낮은 항원에 대한 체액성 면역 반응을 효율적으로 활성화시킴을 알 수 있었다.
실시예 5. VSSP GM3(18:0) 또는 VSSP GM3(천연 유래)를 보조제로 포함하는 이가 HER1 + HER2 백신에 의한 특이적 IgG 유도의 비교
BALB/c 마우스(n=5)에 100μg HER3 ECD 및 100μg HER2 ECD와 200μg VSSP GM3(천연 유래)(그룹 1) 또는 200μg VSSP GM3(18:0)(그룹 2)를 혼합한 백신 조성물을 접종하였다. 면역화는 SC 경로로 0, 14 및 28일 째에 수행하였다. 35일 째에 혈액을 추출하였으며 HER1 및 HER2 ECD에 대한 특이적 항체 Abs 역가를 ELISA로 측정하였다. 이를 위해 플레이트를 5μg/mL HER1 ECD 또는 5μg/mL HER2 ECD로 코팅하고 37℃에서 배양하였다. 블로킹 후, 혈청 희석액(1/100, 1/1000, 1/10 000, 1/50 000, 1/100 000)을 첨가하였다. 반응은 항-뮤린 IgG 항체/알칼린 포스페이트 컨쥬게이트 및 상응하는 기질을 이용하여 시각화하였다. 면역전 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다.
모든 면역화된 마우스는 특이적 IgG를 생성하였다. HER1 ECD에 특이적인 항체의 역가는 GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 사용한 그룹 2에서 VSSP GM3(천연 유래)를 보조제로 사용한 그룹 1에 비해 더 높았다(도 5a). 한편, 그룹 1 및 2에서 HER2 ECD 특이적 항체의 측면에서 유도된 항체 역가가 유의한 차이가 없을지라도, GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 사용하는 그룹 2에서 역가가 증가하는 경향성을 보였다. HER2 ECD 인식에 있어서의 경향성이 관찰되었으므로, 면역 혈청에서 분리된, 정제된 다클론 항체(PcAb)를 이용하여 HER2 ECD 서브도메인(섬유성 파아지 상에서 발현되는 서브도메인 I, Ⅱ, Ⅲ 및 IV)에 대한 적정을 수행하였다. 이를 위해, ELISA 플레이트를 10μg/mL PcAb로 코팅하고 37℃에서 배양하였다. 이후 HER2의 상이한 서브도메인을 발현하는 파아지 샘플을 첨가하고 퍼옥시다제가 접합된 항-파아지 항체(GE-Healthcare)를 이용하여 측색(colorimetric) 신호를 검출하였다. GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 사용한 백신을 접종한 동물에서 생성된 PcAb는 VSSP GM3(천연 유래)를 사용한 동물에서 정제된 항체에 비해 HER2 ECD 서브도메인 I, Ⅲ 및 IV에 대한 반응성이 더 높았다(도 5b).
실시예 6. VSSP GM3 (18:0)를 보조제로 사용한 HER1+HER2 이가 백신에 의해 유도된 항체는 VSSP GM3 (천연 유래)를 보조제로 사용한 백신의 경우에 비해 HER1+/HER2 + 종양 세포주를 더 잘 인식한다.
BALB/c 마우스(n=5)에 SC로 100μg HER1 ECD와 100μg HER2 ECD를 혼합하고 200μg VSSP GM3(18:0)를 보조제로 사용한 백신 조성물을 접종하였다. 면역화는 0, 14 및 28일 째에 수행하였으며, 35일 째의 혈청을 이용하여 HER1 및 HER2를 발현하는 종양 세포주(A431 상피성 외음부암(ATCC-CRL 1555), H125 비소세포 폐암(ATCC-CRC 5801) 및 SKBR3 유방암 (ATCC-HTB 30))에 대한 인식 정도를 유세포분석으로 평가하였다. 측정을 위해 각 세포주의 105 개 세포를 인산 완충 식염수 내 2% 우아혈청으로 블로킹하고 이어서 각 처리 그룹에서 수득한 1/200의 혈청 혼합물 희석액과 함께 배양하였다. 종양 세포에서 특이적인 항체와 HER1 및 HER2 수용체 간의 결합을 항-뮤린 IgG Ab/FITC(Sigma) 컨쥬게이트를 이용하여 유세포분석기에서 최소 5000개 세포를 수득함으로써 시각화하였다. 면역전 혈청의 혼합물을 각 그룹의 음성 대조군으로 사용하였다. VSSP GM3(18:0)를 보조제로 포함하는 백신 조성물에 의해 유도된 혈청은 실험된 종양 세포주를 높은 강도로 인식하였다(도 6).
실시예 7. GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 포함하는 이가 HER1 + HER2 백신은 VSSP GM3(천연 유래)를 사용하는 백신에 비해 H125 종양 세포주의 생존성에 더 큰 영향력을 발휘하는 항체를 유도한다.
100μg HER1 ECD와 100μg HER2 ECD 및 보조제로서 1/20로 희석된 GM3 VSSP(18:0) 또는 VSSP GM3(천연 유래)를 포함하는 이가 백신을 매 15일마다 3회 접종한 BALB/c 마우스에서 수득한 혈청 혼합물과 함께 H125 세포(105)를 72시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 면역전 혈청 혼합물을 동일한 희석 비율로 사용하고, 양성 대조군으로 10μM AG1478 티로신 키나아제 억제제를 사용하였다. 세포 생존률에 면역 혈청이 미치는 영향을 MTT 측색분석을 통해 측정하였으며, 흡광도 측정은 540 nm 및 630 nm에서 수행하였다. 세포 생존률은 다음의 식으로 계산하였다:
Cell viability (%) =
Figure pct00003
GM3 VSSP(18:0) 보조제를 포함하는 백신에 의해 유도된 혈청은 VSSP GM3(천연 유래)를 사용하는 백신과 비교하여 세포 생존성을 유의하게 감소시켰다(도 7).
실시예 8. GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 사용하는 HER1 백신은 VSSP GM3(천연 유래)를 사용하는 경우에 비하여 HER1 + 종양 세포주에 대한 반응성이 보다 높은 항체를 유도한다.
C57BL/6 마우스(n=5)에 200μg HER1 ECD를 포함하면서 400μg VSSP GM3(천연 유래) 또는 400μg GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 이용하는 백신을 SC로 접종하였다. 0, 14, 28 및 42일 째에 면역화를 수행하였으며, 56일째에 실험동물을 채혈하여 유세포 분석을 통해 HER1 발현 MDA-MB468 유방암 세포주(ATCC-HTB 132)에 대한 혈청 반응성을 평가하였다. 기본적으로, 105 세포를 인산 완충 식염수 내 2% 우아혈청으로 블로킹하고 이어서 각 처리 그룹에서 수득한 1/100의 혈청 혼합물 희석액과 함께 배양하였다. 종양 세포에서 특이적인 항체와 HER1 수용체 간의 결합을 항-뮤린 IgG Ab/FITC(Sigma) 컨쥬게이트를 이용하여 유세포분석기에서 최소 5000개 세포를 수득함으로써 시각화하였다. 면역전 혈청의 혼합물을 각 그룹의 음성 대조군으로 사용하였다. VSSP GM3(18:0)를 보조제로 포함하는 백신 조성물에 의해 유도된 혈청은 VSSPGM3 (천연 유래)를 사용한 경우에 비해 종양 세포와 강하게 반응하였다(도 8).
실시예 9. VSSP GM3 (18:0)를 보조제로 가지는 HER1 백신은 VSSPGM3 (천연 유래)를 보조제로 사용하는 경우에 비해 HER1 활성화 억제능이 강화된 항원을 유도한다.
4개 그룹의 C57BL/6 마우스(n=5)에 다음 중 하나의 백신 조성물을 SC로 접종하였다:
그룹 1: VSSP GM3(천연 유래) 200μg을 보조제로 포함하는 HER1-ECD 200μg.
그룹 2: GM3 VSSP(18:0) 200μg을 보조제로 포함하는 HER1-ECD 200μg.
그룹 3: VSSP GM3(천연 유래) 400μg을 보조제로 포함하는 HER1-ECD 200μg
그룹 4: VSSP(18:0) 400μg를 보조제로 포함하는 HER1-ECD 200μg.
면역화는 0, 14, 28, 42일 째에 수행하였으며 56일째의 혈청을 사용하여 생성된 항체의 HER1 인산화 억제능을 EGF 하에서 평가하였다. 요약하면, H292 폐암세포(CRL 1848)를 1/100 희석된 혈청 혼합물과 함께 2시간 동안 배양하고, 세포를 100ng/mL EGF로 10분간 자극하여 HER1 활성화를 유도하였다. 혈청이 HER1의 인산화에 미치는 영향을 인산화된 HER1 및 β-액틴 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. EGF를 처리한 세포를 HER1 활성화에 대한 대조군으로 사용하였다. 1/100로 희석된 면역전(pre-immune) 혈청을 HER1 억제에 대한 음성 대조군으로 사용하였고, 10μM의 AG1478 티로신 키나아제 억제제를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터 정규화를 위해 실험 사진을 이용하여 밀도측정 분석을 수행하였다. GM3 VSSP(18:0) 보조제를 사용한 백신으로 면역화된 동물의 혈청은 VSSP GM3 (천연 유래)를 사용한 백신을 접종한 경우에 비해 인산화의 측면에서 200μg 및 400μg 용량 모두에서 보다 강력하게 HER1 수용체 활성화를 억제하였다(도 9). 이러한 결과는 유도된 체액성 면역 반응의 질적 측면에서 GM3 VSSP(18:0)를 보조제로 함유하는 백신의 우수성을 보여주는 것이다.
실시예 10. 코펜하겐 랫트의 전립선에 대한 PyrGnRHm1-TT/VSSP GM3(18: 0) 백신 제형의 효과
8-12주령의 수컷 코펜하겐 랫트를 사용하였으며, 실험 동물을 그룹 당 10마리로 구성된 3 그룹으로 나누었다.
그룹 1: 플라시보 (Montanide ISA 51 VG/ VSSP GM3(18:0) 주사
그룹 2: PyrGnRHm1-TT/ Montanide ISA 51 VG로 접종
그룹 3: PyrGnRHm1-TT / Montanide ISA 51 VG / VSSP GM3 (18:0)로 접종
면역원 제조를 위해, PyrGnRHm1-TT 펩타이드를 증류수 및 VSSP 나노입자에서 분산시켜 250μL 내에 750μg 펩타이드 및 120μg VSSP의 최종 농도가 되도록 하였다. 이후 이 혼합물을 Montanide ISA 51 VG를 이용하여 50:50 (v/v)로 제형화하였다. 랫트에 2주 1회 빈도로 4회 접종을 하였다.
Montanide ISA 51 VG에서 유화된 PyrGnRHm1-TT 펩타이드로 접종할 경우 플라시보로 접종한 경우에 비해 전립선 크기가 유의하게 감소하였다(p <0.05). 그러나, 이러한 차이는 PyrGnRHm1-TT 펩타이드가 VSSP GM3 (18:0) 존재 하에서 유화되었을 때 더 컸다(p <0.01)(도 10).
실시예 11. R3327-H 듀닝(Dunning) 모델에서 PyrGnRHm1-TT 펩타이드를 이용한 항종양 반응의 유도
성체 코펜하겐 랫트의 우측 뒷다리 말단부에 SC로 듀닝 R3327-H 뮤린 종양 모델의 (2 x 2 x 2 mm) 종양 절편을 이식하였다. 실험 동물은 처리 내용에 따라 4개 그룹으로 나누었다:
그룹 1: 플라시보: Montanide ISA 51 VG / VSSP GM3 (18:0)
그룹 2: 거세
그룹 3: PyrGnRHm1-TT 펩타이드 / Montanide ISA 51 VG로 접종
그룹 4: PyrGnRHm1-TT 펩타이드/Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3 (18:0)로 접종
종양 직경이 약 10 mm에 달했을 때 백신 접종을 개시하였으며, 총 7회의 백신을 매 15일마다 투여하였다.
플라시보 그룹(그룹 1)에서 종양의 현저한 성장이 관찰되었음에 반해(도 11), 거세한 그룹 및 면역화한 그룹(그룹 2, 3 및 4)에서는 종양 성장이 유의하게 억제되었다(p<0.01). 이러한 효과는 VSSP GM3(18:0)로 유화된 PyrGnRHm1-TT 펩타이드를 접종한 랫트에서 보다 두드러졌다(p = 0.005).

Claims (15)

  1. GM3 강글리오시드의 완전 합성 변이체와 나이세리아 메닌지티디스 박테리아의 외막 복합체의 소수성 단백질을 결합시켜 형성된 나노입자를 포함하는 보조제(adjuvant).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 GM3 강글리오시드의 세라미드 내 지방산은 스테아르산 (18:0)인 것을 특징으로 하는 보조제.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 GM3 강글리오시드의 세라미드 내 지방산은 올레산 (18:1)인 것을 특징으로 하는 보조제.
  4. 나노-입자화된 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 보조제 및 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 항원으로 포함하는 백신 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 알럼(알럼) 및 오일 보조제를 포함하는 군으로부터 선택되는 또 다른 보조제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 4 항 내지 제 5 항에 있어서, 상기 항원은 성장인자 수용체의 세포외 도메인 또는 그 일부분인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항에 있어서, 상기 성장인자 수용체는 HER1, HER2, HER3 단독 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제 4 항 내지 제 6 항에 있어서, 상기 항원은 PyrGnRHm1-TT 펩타이드인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 암 치료용 의약을 생산하기 위한 제 1 항 내지 제 4 항의 백신 조성물.
  10. 종양유발 바이러스에 의한 만성 감염 치료용 의약을 생산하기 위한 제 1 항 내지 제 4 항의 백신 조성물.
  11. 항원-특이적 체액성 면역 반응을 자극하기 위한 제 2 항의 보조제의 용도.
  12. 항원-특이적 세포성 면역 반응을 자극하기 위한 제 3 항의 보조제의 용도.
  13. 환자에서의 항원-특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 최적화시키기 위한 제 2 항 및 제 3 항의 보조제의 조합의 용도.
  14. 제 1 항 내지 제 4 항의 백신 조성물을 매 15일마다 최소 5회의 유도 용량과 뒤이은 매달 유지 용량으로 최소 6개월 동안 피하, 피내, 근육내, 림프절내, 종양내 주사하거나 또는 점액막에 직접 적용하여 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 치료 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 동시에, 시간차를 두고 혹은 택일적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU24534B1 (es) 2017-11-06 2021-07-02 Ct Inmunologia Molecular Adyuvantes nano-particulados que contienen variantes sintéticas del gangliósido gm3
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Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6149921A (en) * 1993-12-29 2000-11-21 Centro De Inmunologia Molecular Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment
IS4518A (is) * 1997-07-09 1999-01-10 Lyfjathroun Hf, The Icelandic Bio Pharmaceutical Group Nýtt lyfjaform fyrir bóluefni
PE20020572A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-31 Centro Inmunologia Molecular Preparaciones para potenciar la inmunogenicidad de antigenos poco inmunogenicos
CU23257A1 (es) * 2003-02-27 2008-01-24 Centro Inmunologia Molecular COMPOSICIONES VACUNALES A BASE DE GANGLIOSIDOS PARA LA ADMINISTRACION SUBCUTáNEA
US7776346B2 (en) 2003-05-22 2010-08-17 Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. Personal product compositions comprising structured benefit agent premix or delivery vehicle
CU23739A1 (es) * 2008-09-30 2011-12-28 Ct Ingenieria Genetica Biotech Composición farmacéutica utilizando combinaciones de variantes de la hormona liberadora de las gonadotropinas (gnrh) como inmunógeno
US8343498B2 (en) * 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
CU24299B1 (es) * 2013-08-02 2017-12-08 Centro De Inmunología Molecular Composiciones vacunales bivalentes basadas en los receptores de tipo 1 y 2 del factor de crecimiento epidérmico
CU24534B1 (es) 2017-11-06 2021-07-02 Ct Inmunologia Molecular Adyuvantes nano-particulados que contienen variantes sintéticas del gangliósido gm3

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