JP2021501792A - ワクチンアジュバントとしての、gm3ガングリオシドの合成バリアントを含有するナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
特定の実施形態では、本発明は、患者の抗原特異的液性または細胞性免疫応答の刺激における、本発明の目的のナノ粒子アジュバントを単独でまたは組合せで含むワクチン組成物の使用に関する。
さらに、そのような治療を必要とする対象に、本発明のワクチン組成物を、少なくとも合計5回の誘導用量の間は2週間に1回の頻度で、その後、毎月の維持用量を少なくとも6カ月にわたり、皮下(SC)、皮内、筋肉内、結節内、腫瘍内に、または粘膜への直接適用によって投与する治療方法も本発明の目的である。前記組成物は、同時に、時差的にまたは交互に投与することもできる。
本発明において使用されるワクチン組成物は、N.meningitidisのOMPC由来の疎水性タンパク質をGM3ガングリオシドの完全合成バリアントの溶液中に分散させることによって形成されたナノ粒子アジュバントを、抗原としてのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と会合させることによって形成される。特に、これらのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、増殖因子受容体の完全細胞外ドメインまたはその一部であり得、ある特定のステージにおける腫瘍増悪に関連するホルモン、例えば、これだけに限定されないがGnRHなどにも関連する。
GM3(18:1)を有するVSSPをアジュバントとして使用する本発明のワクチン組成物は、天然の供給源から得られたガングリオシドを含有するナノ粒子をアジュバントとするワクチン製剤と比較して、より強力なCTL応答を誘導する。
本発明は、増殖因子受容体のファミリーに対するAbまたはCTL応答の誘導に特化したワクチン組成物を提供し、これは、がん免疫療法におけるこの目的の抗原系のために特に有用な解法を構成するものであり、その理由は、Ab応答と特異的なCTL応答はどちらも有効であるが、単一のワクチン製剤中に、および単一の投与スキームを用いて最適化するのが難しいことが公知であるからである。
ある特定のステージにおける腫瘍増悪に関連するホルモン、具体的には、これだけに限定されないが、GnRHホルモンに対する高力価の中和Abの生成に特化したワクチン製剤を導入することも本発明の目的である。
本発明の別の目的は、特にがんまたは腫瘍形成ウイルスによる慢性ウイルス感染症に罹患している免疫無防備状態の患者においてAbまたはCTLの強力な特異的応答を生じさせることができる治療用ワクチン組成物を提供することである。
本発明のワクチン組成物は、患者に、SC経路、皮内経路、筋肉内経路、結節内経路、腫瘍内経路によって、または粘膜に直接適用することによって投与することができる。
本発明のワクチン組成物中の増殖因子受容体の細胞外ドメインまたはその一部のヒトに使用される用量の範囲は、200μg〜1mg、好ましくは400μg〜900μgの範囲内である。本発明のワクチン組成物中に使用されるGnRHペプチド用量の範囲は、(OMPC含有量に応じて)500μg〜3mg、好ましくは1mg〜2.5mgの範囲内である。VSSPは、100μg〜1mg、好ましくは200μg〜600μgの範囲で投与される。
前記組成物を、対象に、少なくとも合計5回の誘導用量の間は2週間に1回の頻度で投与し、その後、毎月の維持用量を少なくとも6カ月にわたり投与する。所望の効果が宿主において同じ抗原に対してAbとCTLの二重応答を誘導することである場合、免疫化は、両方のワクチン製剤を同時に、またはその代わりに時差で組み合わせることができる。
まず、N.meningitidisのOMPCを、反応器中、デオキシコール酸ナトリウム(10〜40mM)とドデシル硫酸ナトリウム(1〜10mM)の混合物を含有するTris−HCl緩衝液中に分散させ、1〜36時間にわたって撹拌する。次に、OMPCの添加質量の0.1〜3倍の質量の合成ガングリオシド(GM3 18:0)を添加し、撹拌を持続させる。その後、界面活性剤を限外濾過または透析によって除去する。限外濾過した残余溶液を濃縮して、OMPCの濃度を0.1〜1mg/mlである所望の投与量に調整し、孔径0.2μmの滅菌カプセル中で濾過することによって滅菌する。
ナノ粒子アジュバントVSSP GM3(18:1)を得ること
まず、N.meningitidisのOMPCを、反応器中、デオキシコール酸ナトリウム(10〜40mM)とドデシル硫酸ナトリウム(1〜10mM)の混合物を含有するTris−HCl緩衝液中に分散させ、1〜36時間にわたって撹拌する。次に、OMPCの添加質量の0.1〜3倍の質量の合成ガングリオシド(GM3 18:1)を添加し、撹拌を持続させる。その後、界面活性剤を限外濾過または透析によって除去する。限外濾過した残余溶液を濃縮して、OMPCの濃度を0.1〜1mg/mlである所望の投与量に調整し、孔径0.2μmの滅菌カプセル中で濾過することによって滅菌する。
強力な特異的液性免疫応答を誘導するための、HER1またはHER1+HER2またはHER3を増殖因子受容体として含有し、VSSP GM3(18:0)をアジュバントとして含有する本発明において好ましいワクチン組成物を以下の通り調製する:溶液中のまたはフリーズドライされたHER1またはHER1+HER2またはHER3抗原、および予め4〜20℃で保管しておいたVSSP GM3 18:0溶液の個々のバイアルの内容物を、抗原の質量とVSSP GM3(18:0)の質量(OMPC含有量に応じる)の最終的な割合が300μg〜2mgの範囲内に入るように、患者のベッドの隣で別々に10〜30分にわたって混合した後、注射する。
強力な特異的細胞性免疫応答を誘導するための、HER1またはHER1+HER2またはHER3を増殖因子受容体として含有し、VSSP GM3(18:1)をアジュバントとして含有する本発明の好ましいワクチン組成物を以下の通り調製する:溶液中のまたは凍結乾燥されたHER1、HER1+HER2またはHER3抗原、および4〜20℃の温度範囲で保管していたVSSP GM3(18:1)溶液の個々のバイアルの内容物を、抗原の質量とVSSP GM3(18:1)の質量(OMPC含有量に応じる)の最終的な割合が300μg〜2mgの範囲内に入るように、患者のベッドサイドの隣で別々に10〜30分にわたって混合した後、注射する。
GnRHm1−TTペプチドを、生合成プロセスにおいて、通常は天然のGnRH(EHWSYGLRPG)の配列が占めている第6位のアミノ酸L−グリシンをL−プロリンによって置換すること(EHWSYPLRPG)によって調製した。構築を完了させるために、破傷風トキソイドのQYIKANSKFIGITELエピトープ(Junco JA et al (2007) Vaccine 25: 8460-68)を合成のプロセス中に添加し、その後、固相法を行った(Hougten et al., (1986) Biotechniques 4: 522-6);本発明の目的のためにしたがって調製されたペプチドは、以下PyrGnRHm1−TTと称される。
MCA203腫瘍を有するマウスにおいてVSSP GM3(18:1)の投与により脾臓内のCD11b+GR1+細胞の数は増加しない。
4群の雌C57BL/6マウス(群当たり3匹の動物)に、MCA203の細胞1×106個を0日目にSC経路によって接種した。その後、11日目、12日目および18日目に、VSSP GM3(天然の供給源)、VSSP GM3(18:1)およびVSSP GM3(18:0)(OMPC 200μg)を3群のマウスにSC経路によって注射し、第4のマウス群は無処置の対照として残し、リン酸緩衝剤を投与した。22日目に、動物を屠殺し、抽出した脾臓をフローサイトメトリーによって個別に分析して、CD11b+Gr1+細胞の数を決定した。VSSP GM3(18:1)を用いて処置した動物(図1)では、緩衝剤のみを受けた腫瘍担持マウスと比較して、同様の数量のこれらの調節細胞が示された。他方では、VSSP GM3(天然の供給源)を注射した動物およびVSSP GM3(18:0)を注射した動物の脾臓ではCD11b+Gr1+細胞が有意に増加した(等しい文字p>0.05、異なる文字p<0.05、ANOVAおよびTukey検定)。
OVA/VSSP GM3(18:1)を用いたワクチン接種によりOVA/VSSP GM3(天然の供給源)およびOVA/VS3 GM3(18:0)と比較して3倍のCD8+T細胞の特異的細胞傷害性が誘導される。
in vivoにおけるCTL抗原特異的応答を、3つの異なるOVA抗原の製剤:アジュバントとしてVSSP GM3(天然の供給源)ナノ粒子を用いた製剤、VSSP GM3(18:1)を用いた他の製剤、およびVSSP GM3(18:0)を使用した第3の製剤を用いて免疫化した雌C57BL/6マウス(群当たり3匹の動物)において比較した。0日目、1日目および7日目にワクチンをSC投与した(OMPC 200μg)。並行して、CFSEを用いて示差的に標識された(37℃で5分間)ナイーブな動物から脾細胞を得た。高度に標識された細胞(5μM)をSIINFEKLペプチドとのインキュベーション(1μM、37℃および5%CO2で90分間)後に標的細胞として使用し、一方、ペプチド負荷を伴わない低度に標識された細胞(0.33μM)を対照として使用した。最後の免疫化後、洗浄を行って遊離のペプチドを除去し、両方の型の脾細胞を等しい割合で混合し、ワクチン接種した動物に注射した。16時間後に、ワクチン接種したマウスの鼠径リンパ節を取り出し、2つの蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。特異的溶解のパーセンテージを式:100−[(CFSE高/CFSE低)×100]に従って算出した。OVA/VSSP GM3(18:1)ワクチン(図2)では60%の特異的溶解が誘導され、これは、OVA/VSSP GM3(天然の供給源)ワクチンを用いて実現されたものおよびOVA/VSSP GM3(18:0)ワクチンを用いて実現されたもののほぼ3倍の値である。
アジュバントとしてGM3(18:1)を含有するVSSPのナノ粒子を治療用がんワクチンに使用することにより、天然の供給源から得られたGM3を含むナノ粒子と比較して治療用ワクチンの抗腫瘍効果が改善される。
3群の雌C57BL/6マウス(群当たり10匹の動物)に、EG.7腫瘍(ネオ抗原としてOVAを発現するように遺伝子改変されたEL4胸腺腫のバリアント)の細胞3×105個を0日目にSC接種した。その後、4日目、5日目および11日目に、2つの異なるOVAのワクチン製剤:第1の製剤(200μg/用量)はVSSP GM3(天然の供給源)をアジュバントとするものであり、第2の製剤はVSSP GM3(18:1)をアジュバントとするものである(200μg/用量)を用いてSC経路による免疫化を3回連続して実施した。マウスの第3群にはリン酸緩衝剤を同じスキームで注射し、実験の対照として使用した。腫瘍を接種した7日後から腫瘍体積(TV)を週に2回測定した。腫瘍が壊死を示したら、または腫瘍サイズが直径17mmを超えたら、動物を屠殺した。実験の20日目に(図3)、OVA/VSSP GM3(天然の供給源)製剤に対するOVA/VSSP GM3(18:1)治療用ワクチンの優位性が観察された(TV平均:VSSP GM3(18:1)560mm3;天然740mm3;対照1640mm3)(p=0.037、ANOVAおよびTukey検査)。より重要なことに、EG7は侵攻性モデルであるにもかかわらず、OVA/VSSP GM3(18:1)調製物を用いて処置した群では動物の50%で腫瘍増悪が示されないことが見いだされた(対照群では動物の100%で増悪が観察された)。OVA/VSSP GM3(天然の供給源)を用いてワクチン接種した動物では、20%のみが増悪を示した(p=0.012、カイ二乗検定)。
HER3/VSSP GM3ワクチン調製物(18:0)による高力価のHER3特異的Abの誘導。
BALB/cマウス(n=5)を、GM3 VSSP(18:0)200μgと混合したHER3 ECD、200μgを含有するワクチン調製物を用いてSCにより免疫化した。0日目、14日目、28日目および42日目に免疫化を行った。35日目(第1の抽出)および56日目(第2の抽出)に血液を抽出して血清を処理し、HER3 ECDに対する特異的なAbの力価をELISAによって決定した。プレートを、10μg/mLのHER3 ECDでコーティングし、37℃でインキュベートした。ブロッキング後、血清希釈物(1/100、1/1000、1/5000、1/10000)を添加した。反応を、抗マウスIgG Ab/ペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma)および対応する基質を使用して可視化した。
免疫化したマウスでは特異的IgGが生じ、力価は1/5000に至った(図4)。この結果から、自己腫瘍抗原などの非常に免疫原性が低い抗原に対する液性免疫応答を活性化するGM3 VSSP(18:0)の潜在性が実証される。
VSSP GM3(18:0)またはVSSP GM3(天然の供給源)のいずれかをアジュバントとする二価HER1+HER2ワクチンによる特異的IgGの誘導の比較。
BALB/cマウス(n=5)を、VSSP GM3(天然の供給源)200μg(群1)またはVSSP GM3(18:0)200μg(群2)をアジュバントとするHER1 ECD、100μgとHER2 ECD、100μgの混合物を含有するワクチン調製物を用いて免疫化した。0日目、14日目および28日目にSC経路によって免疫化を行った。血液の抽出および処理を35日目に行った。HER1 ECDおよびHER2 ECDに対する特異的なAbの力価をELISAによって決定した。このために、プレートを5μg/mLのHER1 ECDまたは5μg/mLのHER2 ECDでコーティングし、37℃でインキュベートした。ブロッキング後、血清希釈物を添加した(1/100、1/1000、1/10000、1/50000、1/100000)。反応を、抗マウスIgG Ab/アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび対応する基質を使用して可視化した。免疫前の血清を陰性対照として使用した。
VSSP GM3(18:0)をアジュバントとするHER1+HER2二価ワクチンを用いて誘導されたAbによる、VSSP GM3(天然の供給源)をアジュバントとして使用したワクチンと比較して高いHER1+/HER2+腫瘍細胞株の認識。
BALB/cマウス(n=5)を、VSSP GM3(天然の供給源)200μgをアジュバントとするまたはVSSP GM3(18:0)200μgをアジュバントとするHER1 ECD、100μgとHER2 ECD、100μgの混合物を含有するワクチン調製物を用いてSCにより免疫化した。0日目、14日目および28日目に免疫化を実施し、35日目に対応する血清を使用して、HER1およびHER2を発現する腫瘍細胞株(A431外陰部上皮癌(ATCC−CRL1555)、H125非小細胞肺癌(ATCC−CRC5801)およびSKBR3乳癌(ATCC−HTB30)の認識をフローサイトメトリーによって評価した。測定を実施するために、各細胞株由来の細胞105個をリン酸緩衝食塩水中2%ウシ胎仔血清でブロッキングし、その後、各処置群由来の血清の混合物の1/200希釈物と一緒にインキュベートした。特異的Abの腫瘍細胞におけるHER1およびHER2受容体への結合を抗マウスIgG Ab/FITC(Sigma)コンジュゲートを使用し、フローサイトメーターで少なくとも5000個の細胞を獲得することによって可視化した。評価した各群における免疫前の血清の混合物を陰性対照として使用した。VSSP GM3(18:0)をアジュバントとするワクチン調製物によって誘導された血清は評価された腫瘍細胞株をより高い強度で認識した(図6)。
GM3 VSSP(18:0)をアジュバントとする二価HER1+HER2ワクチンにより、VSSP GM3(天然起源)を使用した組成物と比較してH125腫瘍細胞株の生存率に対する影響が増大した抗体が誘導される
H125細胞(105個)を、GM3 VSSP(18:0)またはVSSP GM3(天然起源)をアジュバントとするHER1 ECD、100μgとHER2 ECD、100μgの混合物を1/20の希釈度で含有する二価ワクチン調製物を15日毎に3回投薬して免疫化したBALB/cマウスから得た血清の混合物と一緒に72時間インキュベートした。陰性対照として、免疫前の血清の混合物を同じ希釈で使用し、一方、陽性対照として、10μMのAG1478チロシンキナーゼ阻害剤を使用した。免疫血清の細胞生存率に対する影響の決定をMTT比色定量アッセイを使用して実施し、吸光度の読み取りを540nmおよび630nmで実施した。細胞生存率を式:
GM3 VSSP(18:0)をアジュバントとするワクチンによって誘導された血清により、VSSP GM3(天然起源)を使用した組成物と比較して細胞生存率が有意に低下した(図7)。
GM3 VSSP(18:0)をアジュバントとするHER1ワクチンにより、VSSP GM3(天然起源)を使用した調製物と比較してHER1+腫瘍細胞株に対する反応性がより高いAbが誘導される。
C57BL/6マウス(n=5)を、VSSP GM3(天然起源)400μgまたはGM3 VSSP(18:0)400μgをアジュバントとするHER1 ECD、200μgを含有するワクチン調製物を用いてSCにより免疫化した。0日目、14日目、28日目および42日目に免疫化を実施し、他方では、強力なHER1発現MDA−MB468乳癌細胞株(ATCC−HTB132)に対する血清反応性をフローサイトメトリーによって評価するために、56日目の動物から採血した。基本的に、105個の細胞をリン酸緩衝食塩水中2%ウシ胎仔血清でブロッキングし、その後、各処置群由来の血清の1/100の希釈度の混合物と一緒にインキュベートした。腫瘍細胞のHER1受容体への特異的Abの結合を抗マウスIgG Ab/FITC(Sigma)コンジュゲートを使用し、少なくとも5000個の細胞をフローサイトメーターで獲得することによって可視化した。陰性対照として、評価した各群の免疫前の血清の混合物を使用した。VSSP GM3(18:0)をアジュバントとするワクチンによって誘導された血清は、VSSP GM3(天然起源)を使用した組成物と比較して腫瘍細胞とより強く反応した(図8)。
VSSP GM3(18:0)をアジュバントとするHER1ワクチンにより、VSSP GM3(天然起源)を使用した組成物と比較してHER1の活性化を阻害する能力が増大したAbが誘導される。
4群のC57BL/6マウス(n=5)を、以下のワクチン調製物のうちの1つを用いてSCにより免疫化した:
群1:VSSP GM3(天然起源)200μgをアジュバントとするHER1−ECD、200μg
群2:GM3 VSSP(18:0)200μgをアジュバントとするHER1−ECD、200μg
群3:VSSP GM3(天然起源)400μgをアジュバントとするHER1−ECD、200μg
群4:GM3 VSSP(18:0)400μgをアジュバントとするHER1−ECD、200μg
PyrGnRHm1−TT/VSSP GM3(18:0)ワクチン製剤のコペンハーゲンラットの前立腺に対する影響。
8〜12週齢の雄コペンハーゲンラットを使用した。動物をそれぞれ動物10匹の3群に分けた。
群1:プラセボ(モンタニドISA 51 VG)/VSSP GM3(18:0)を注射した
群2:PyrGnRHm1−TT/モンタニドISA 51 VGを用いて免疫化した
群3:PyrGnRHm1−TT/モンタニドISA 51 VG/VSSP GM3(18:0)を用いて免疫化した
モンタニドISA 51 VG中に乳化させたPyrGnRHm1−TTペプチドを用いた免疫化により、プラセボを用いた免疫化と比較して前立腺のサイズの有意な減少が生じた(p<0.05)。しかし、この差は、ペプチドPyrGnRHm1−TTをVSSP GM3(18:0)の存在下で乳化した場合にはるかに大きかった(p<0.01)(図10)。
PyrGnRHm1−TTペプチドを使用したR3327−Hダニングモデルにおける抗腫瘍応答の誘導
成体コペンハーゲンラットの右後肢の遠位帯域にダニングR3327−Hマウス腫瘍モデルの(2×2×2mm)の腫瘍断片をSC移植した。動物を異なる処置を受ける4群に分けた:
群1:プラセボ:モンタニドISA 51 VG/VSSP GM3(18:0)
群2:去勢した
群3:PyrGnRHm1−TTペプチド/モンタニドISA 51 VGを用いて免疫化した
群4:PyrGnRHm1−TTペプチド/モンタニドISA 51 VG/VSSP GM3(18:0)を用いて免疫化した
Claims (15)
- GM3ガングリオシドの完全合成バリアントと、細菌Neisseria meningitidisの外膜複合体の疎水性タンパク質との会合によって形成されたナノ粒子を含むアジュバント。
- GM3ガングリオシドのセラミド中の脂肪酸が、ステアリン酸(18:0)である、請求項1に記載のアジュバント。
- GM3ガングリオシドのセラミド中の脂肪酸が、オレイン酸(18:1)である、請求項1に記載のアジュバント。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のナノ粒子アジュバントの1つ、および抗原としてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むワクチン組成物。
- アラム、および
油性アジュバント
を含む群から選択される別のアジュバントを含んでもよい、請求項4に記載のワクチン組成物。 - 抗原が、増殖因子受容体の細胞外ドメインまたはその一部である、請求項4〜5に記載のワクチン組成物。
- 増殖因子受容体が、HER1、HER2、HER3単独またはこれらの組合せである、請求項4〜6に記載のワクチン組成物。
- 抗原が、PyrGnRHm1−TTペプチドである、請求項4〜6に記載のワクチン組成物。
- がんを処置するための医薬を製造するための、請求項4〜8に記載のワクチン組成物。
- 腫瘍形成ウイルスによる慢性ウイルス感染症を治療するための医薬を製造するための、請求項4〜8に記載のワクチン組成物。
- 抗原特異的液性免疫応答を刺激するための、請求項2に記載のアジュバントの使用。
- 抗原特異的細胞性免疫応答を刺激するための、請求項3に記載のアジュバントの使用。
- 患者における抗原特異的液性免疫応答および細胞性免疫応答を最適化するための、請求項2および3に記載のアジュバントの組合せの使用。
- それを必要とする対象を治療するための方法であって、請求項4〜8に記載のワクチン組成物を、15日毎に少なくとも合計5回の誘導用量、その後、毎月の維持用量を少なくとも6カ月にわたり、SC経路、皮内経路、筋肉内経路、結節内経路、腫瘍内経路によって、または粘膜への直接適用によって投与することを含む、方法。
- 前記ワクチン組成物が、同時に、時差的にまたは交互に投与される、請求項14に記載の方法。
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