KR20080025171A - 이종성 프로테아제를 발현시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

이종성 프로테아제를 발현시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연의 상태에서는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는 세포 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 세포 내에서 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포 내에서 인플루엔자 바이러스의 역가를 증가시키는 방법을 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 프로테아제를 제공한다.

Description

이종성 프로테아제를 발현시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSING A HETEROLOGOUS PROTEASE}
하나의 측면에서, 본 발명은 천연의 상태에서는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는 세포 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현시키는 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 이와 같은 세포 내에서 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 이와 같은 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포 내에서 생장한 인플루엔자 바이러스의 역가를 증가시키는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 유래하는 이종성 프로테아제를 제공한다.
인플루엔자로 인한 유행병은, 인플루엔자가 일으키는 질병으로 인한, 전 세계 인구의 유병률과 사망률을 급진적으로 증가시키는 것을 특징으로 한다. 이 전염병의 심각성과 중증도를 좌우하는 몇 가지 인자들로서는, 인간의 면역성 감소와 바이러스가 인간들 사이에서 전이될 수 있는 효율을 포함한다. 이 중 전이 효율은 일반적으로 바이러스 자체뿐만 아니라, 인구 밀도, 그리고 특정 지역을 여행을 통해 용이하게 왕래할 수 있음에 의해 영향을 받는다. 이 전염병을 일으키는 바이러스는, 최근 들어 갑자기 나타난 항원성 변이체로서, 대다수의 인간들이 이전에 감염된 적이 없어서 그에 대한 면역성이 아주 미약하거나 전무한 바이러스이다. 뿐만 아니라, 이 질병이 급속히 확산되기 위해서는 반드시 인간들간 전이가 효율적으로 이루어져 하는데, 이 동물 바이러스가 인간 군집에 인수 공통의 형태로 침투하는 경우, 이 바이러스는 인간의 체 내에서 복제하도록 적응하여야 하고, 또한 효율적으로 전이될 수 있어야 한다.
전염성 인플루엔자는 매우 급속히 확산되고 있으며, 그 파급 효과 또한 가공할 만하다. 20세기에 가장 심각했던 경우는 1918년의 일인데, 이때, 미국 시민들 중 500,000명 이상이 사망하였으며, 전 세계적으로는 2∼4천만 명이 사망에 이르게 되었다. 이와 같은 전염병은 잠복해 있다가 감염 후 수 주 내지 수 개월 후에 발병하게 된다. 전염성 인플루엔자의 비교적 급속한 발병과 확산은 전 세계를 뒤흔들 엄청난 재앙에 대처하는데 있어서 몇 가지 문제점을 제공하여, 응급 처치 관계자 및 보건 관계자에게 엄청난 부담이 되고 있다. 최근 발병한 전염병에 대한 신속한 확인과 조치가 이러한 문제점들을 해결하기 위한 해결책 중 필수적인 요소이며; 현재, 드물기는 하지만 인간에서도 질병을 일으키는 조류 인플루엔자 바이러스를 비롯하여 갑자기 발생한 인플루엔자 바이러스를 모니터하기 위한 몇 가지 프로그램이 전 세계적으로 시행되고 있다. 그 결과 얻어진 감시 데이터는 이 질병의 위협성을 확인하고, 그에 대한 효율적인 대처 방법을 지도하기 위해서 미리 정해놓은 전염병 경계 수준(pandemic alert level)과 함께 활용되고 있다.
백신화는 매년 인플루엔자가 유행함으로 인하여 유발되는 질병을 예방함에 있어서 가장 중요한 공중 보건 수단이다. 잠재적인 전염병을 동정하고 나서 발병 수준이 상당히 증가하기까지의 간격이 짧으면, 다수의 인간들을 보호하는데 충분한 백신을 생산함에 있어 상당히 불리하다. 이 전염병이 다음에 발병하기 전에, 백신 기술과 이에 필요한 기본적 시설을 갖추는 것이 유병률과 사망률을 상당 수준 줄이는데 큰 몫을 할 것이다. "전염병 백신"을 생산하는데 필요한 기간을 단축하면, 이 전염병에 효과적으로 대처하기 위한 연구 기간 또는 이를 위한 방법의 개발 기간 또한 단축될 것이다.
현재, 미국에서 시판중인 모든 인플루엔자 백신은 부화 달걀 내에서 증식되는 것이다. 인플루엔자 바이러스는 달걀에서 잘 자라긴 하지만, 백신의 생산은 달걀의 자생력에 좌우된다. 이 경우, 달걀은 조직적으로 공급되어야 하고, 백신 생산에 필요한 균주는 차기 인플루엔자 발병 시기가 도래하기 수 개월 전에 선택하여야 하므로, 이러한 연구의 융통성에도 제한이 따르기 때문에, 때로는 백신 생산이 지연되고 생산된 백신의 공급 물량도 모자라게 된다. 불행히도, 몇몇 인플루엔자 백신 균주 예를 들어, 2003년에서 2004년까지 유행했던 선조형 A/후지안(Fujian)/411/02 균주는 부화 달걀 내에서 복제되기 어려워서, 시간과 비용을 많이 투자하여 세포 배양에 의해 분리해야만 했다.
또한, 세포 배양액 중에서 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위한 시스템도 최근 들어 개발된바 있다[예를 들어, Furminger. Vaccine Production, Nicholson외 다수 (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten외 다수 (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151 참조]. 통상적으로, 이와 같은 방법은 적당한 무한 증식성 숙주 세포를 바이러스의 선택 균주로 감염시키는 단계를 포함한다. 달걀 내에서 백신을 생산하는 것과 관련된 다수의 난점을 없앤다고 해서, 인플루엔자 바이러스의 모든 병원성 균주가 잘 자라는 것은 아니며, 또한 확립된 조직 배양법에 따라서 생산될 수 있는 것도 아니다. 뿐만 아니라, 살아있는 약독화 백신의 생산에 적당하며, 원하는 특성 예를 들어, 약독성(attenuation), 온도 감수성 및 냉각 적응성(cold adaptation)을 가지는 다수의 균주가, 확립된 방법을 통하여 조직 배양액 중에서 성공적으로 생육되는 것은 아니다.
그러므로, 1) 세포 배양액으로부터 인플루엔자 백신을 생산하는데 필요한 설비 및 방법을 마련하는 것과, 2) 인플루엔자 바이러스의 정기적인 유행으로 인해 유발되는 질병을 예방하기 위하여 세포 배양액으로부터 효과적으로 백신을 생산하는 기술의 개발이 필요하다. 이와 같은 방법 및 기술은 발병이 임박한 전염병의 경우, 이 전염병 백신의 생산과 공급에도 신속하게 적용될 수 있다.
세포 배양계 인플루엔자 백신을 독점 생산함에 있어서 넘어야 할 다수의 장애물 중 하나는, 새로운 세포에 침투하여 복제하는, 새로 형성된 바이러스에 대한 헤마글루티닌(HA) 단백질을 단백 분해하여 절단해야 한다는 점이다. 동물 감염시, HA 단백질은 동물의 체내에 존재하는 트립신-유사 세린 프로테아제에 의하여 절단된다. 배양 중, 엔도펩티다제 활성은 종종 인플루엔자 바이러스를 안정하게 복제시 키기에는 불충분할 수 있다. 그러므로, 배양액 중 세포가 목적으로 하는 인플루엔자 바이러스로 감염되어 바이러스 수율이 증가하게 된 이후에, 종종 프로테아제 예를 들어, 트립신을 배양 배지에 첨가하기도 한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,698,433호를 참조하시오. 그러나, 외인성(exogenous) 프로테아제를 세포 배양 배지에 첨가하면, 이 배양 배지 중에 추가의 성분들도 첨가하여야 하고, 이렇게 되면 배양이 복잡해질 뿐만 아니라 배양 조건 조절에도 신경을 써야만 한다. 뿐만 아니라, 외인성 트립신의 투여량을 증가시키면, 세포 배양법을 통해 백신을 생산하는 비용도 증가하게 된다. 그러므로, 외인성 프로테아제를 첨가할 필요가 없이, 배양액 중 인플루엔자 바이러스를 생육시키기 위한 새로운 방법과 조성물이 필요하다. 뿐만 아니라, 그러한 방법과 조성물은 세포 내에서 활성인 프로테아제를 발현함에 따른 고유의 유해성이 없어야 한다. 이러한 필요성과 기타 요망 사항들은 본 발명에 의해서 충족된다.
본원에 언급된 참고 문헌 또는 논의는, 그러한 것들이 본 발명에 선행하는 기술임을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 될 것이다. 또한, 특허에 관한 언급은 그것의 유용성을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
개요
본 발명은 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하여, 이러한 핵산을 포함하지 않는 세포 내에서 통상적으로 발현되는 경우보다 높은 수준으로 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포(본원에서는 "본 발명의 세포"라고 칭함)를 제공한다. 임의의 구체예에서, 세포는 정상적으로는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는다. 임의의 구체예에서, 세포는 예를 들어, 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 배양시 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 낮은 수준 예를 들어, 특정의 생물 활성을 나타내는데 최적인 수준 또는 바람직한 수준보다 낮은 수준으로 발현한다. 임의의 측면에서, 본 발명은 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는데, 여기서, 이 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 다른 측면에서, 본 발명은 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는데, 여기서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 염색체 외에서 유지된다. 다른 측면에서, 본 발명은 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는데, 여기서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 이 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 구성적으로(항상)(constitutively) 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 유도적으로(inducibly) 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 분비한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포의 시토졸 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현한다.
임의의 구체예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 임의의 구체예에서, 세린 프로테아제는 S1 군 프로테아제이다. 임의의 구체예에서, 프로테아제는 트립신이다. 임의의 구체예에서, 세린 프로테아제는 박테리아의 서브틸리신(subtilisin)이다. 임의의 구체예에서, 프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 SPRT이다. 임의의 구체예에서, 프로테아제는 표 1에 나열한 프로테아제이다. 임의의 구체예에서, 프로테아제는 프로-프로테아제이다. 임의의 구체예에서, 프로-프로테아제는 트립시노겐이다. 임의의 구체예에서, 프로-프로테아제는 활성 프로테아제로서 가공된다.
임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 임의의 구체예에서, 유도성 프로모터는 인터페론 또는 인터페론에 의하여 유도되는 하류 신호 전달 분자에 의해 유도된다. 임의의 구체예에서, 유도성 프로모터는 테트라사이클린-조절 발현 시스템에 의해서 유도된다. 임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 구성적 활성 프로모터의 제어 하에 있다. 임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 분비시키는 분비 신호를 암호화하는 서열을 포함한다.
임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1ng∼약 50㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 1ng∼약 50㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 10ng∼약 50㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 100ng∼약 50㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 1∼약 50㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1ng∼약 5㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1∼약 100ng 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1∼약 10ng 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1∼약 1ng 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포의 배양액 중에서 생육한 바이러스의 역가를 증가시키기에 충분한 양만큼의 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 이 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 분자량은 효소의 프로-프로테아제 형태를 바탕으로 하여 계산한다. 임의의 구체예에서, 이 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 분자량은 프로테아제의 성숙한, 활성인 형태를 바탕으로 하여 계산한다.
임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1ng 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 1ng 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 10ng 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 100ng 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 1㎍ 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 10㎍ 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 20㎍ 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 30㎍ 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 40㎍ 이상 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 50㎍ 이상 발현한다.
임의의 구체예에서, 세포는 박테리아 세포이다. 임의의 구체예에서, 박테리아 세포는 이.콜라이(E.coli) 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 임의의 구체예에서, 포유 동물 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 개의 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, MDCK 세포는 비-발암성(non-tumorigenic)이다. 임의의 구체예에서, 포유동물 세포는 영장류 세포이다. 임의의 구체예에서, 영장류 세포는 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 또는 인간의 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 조류의 세포이다. 임의의 구체예에서, 조류 세포는 닭의 세포이다.
기타 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 세포를 바이러스로 감염시키는 단계, 이 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양액으로부터 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 세포를 바이러스 게놈을 포함하는 핵산으로 형질 감염시키는 단계, 이 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양액으로부터 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 바이러스 게놈은 인플루엔자 게놈이고, 이 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스에 해당한다. 몇몇 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스에 해당한다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 약독화된 인플루엔자 바이러스, 냉각 적응된 인플루엔자 바이러스, 온도 감수성 인플루엔자 바이러스 또는 이와 같은 바람직한 특성들을 임의로 조합하여 가지는 바이러스를 포함한다. 하나의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B/앤 아버(Ann Arbor)/1/66 균주 바이러스 예를 들어, B/앤 아버/1/66의 냉각 적응성, 온도 감수성, 약독화 균주이다. 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A/앤 아버/6/60 균주 바이러스 예를 들어, A/앤 아버/6/60의 냉각 적응성, 온도 감수성, 약독화 균주이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스를 회수하는 단계 및 면역원성 조성물 예를 들어, 백신의 제조시 바이러스를 사용하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 바이러스는 개체에 투여시 예를 들어, 개체에 비강 내 투여시 면역 반응을 유도할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 투여 이전에 불활성화되며, 기타 구체예에서, 살아있는 약독화 바이러스는 백신의 제조에 사용된다. 임의의 구체예에서, 재조합 및 재분류 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스는 본 발명의 방법에 따라서 제조된다. 하나의 구체예에서, 살아있거나, 불활성화되었거나, 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 바이러스로부터 유래하는 사멸한 바이러스를 포함하는 백신이 제조된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 바이러스는 세포 배양액 또는 달걀 내에서 기타 바이러스를 복제하는데 사용된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 바이러스로부터 유래하는 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 백신이 제공된다.
임의의 구체예에서, 세포는 프로-프로테아제를 발현하며, 본 발명의 방법은 또한 배양 배지에 외인성 프로테아제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최대 농도 약 0.1㎍/㎖로 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 트립신이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 네거티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 임의의 구체에에서, 바이러스는 이중 가닥 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 역전사 바이러스이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계, 이 세포를 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계 및 세포 배양액으로부터 이 플루엔자 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스를 복제하는 방법을 제공한다. 임의의 구체예에서, 이러한 조건은 외인적으로 첨가된 프로테아제 또는 프로-프로테아제 예를 들어, 트립신 또는 트립시노겐을 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 세포를 인플루엔자 게놈을 암호화하는 핵산으로 형질 감염시키는 단계, 이 세포를 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스를 복제하는 방법을 제공한다. 임의의 구체예에서, 이러한 조건은 외인적으로 첨가된 프로테아제 또는 프로-프로테아제 예를 들어, 트립신 또는 트립시노겐을 포함하지 않는다.
임의의 구체예에서, 세포는, 정상적으로는 세포에 의해서 발현되지 않는 프로-프로테아제 또는 효소 활성인 프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 포유동물의 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 조류 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 영장류 세포, 개의 세포, 햄스터의 세포, 마우스의 세포 또는 래트의 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 Vero 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 닭의 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 세포 배양액 중에서 인플루엔자 바이러스를 배양하여[여기서, 이 세포 배양액 중 세포는 i) 세포와 이종성이고 ii) 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 절단하는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현함], 세포 배양액 중에서 생육한 인플루엔자 바이러스의 역가를, 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는 세포 내에서 인플루엔자 바이러스를 배양함으로써 얻어지는 역가에 비하여 증가시키는 단계를 포함하는, 세포 배양액 중에서 생육한 인플루엔자 바이러스의 역가를 증가시키는 방법을 제공한다.
임의의 구체예에서, 세포는 이종성 프로테아제를 안정적으로 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 이종성 프로테아제를 구성적으로 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 이종성 프로테아제를 유도적으로 발현한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제는 트립신이다. 임의의 구체예에서, 세포는 이종성 프로-프로테아제를 구성적으로 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 이종성 프로-프로테아제를 유도적으로 발현한다. 임의의 구체예에서, 프로-프로테아제는 트립시노겐이다. 임의의 구체예에서, 프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 SPRT 프로테아제이다. 임의의 구체예에서, 프로-프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 프리프로-SPRT 프로테아제이다.
세포가 바이러스 복제를 허용하는 능력을 나타내는 방법으로서는, 감염된 세포 배양액으로부터 얻어지는 바이러스의 수율이 있다. 바이러스 수율은 당 업자에게 알려진 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 수율은 감염성 비리온을 측정하는 방법인, 중앙 조직 배양 감염 투여량(median tissue culture infectious dose; TCID50) 검정법에 따라서 시료 중에 존재하는 바이러스의 농도를 측정함으로써 정량될 수 있다. 상기 TCID50 수치는 종종 log10 TCID50/㎖로서 정의된다. 하나의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포는 인플루엔자 바이러스(예를 들어, ca/ts 균주)의 복제를 log10 TCID50/㎖ 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상으로 허용한다. 특정 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포는 인플루엔자 바이러스(예를 들어, ca/ts 균주)의 복제를 상업적으로 합리적인 역가(log10 TCID50/㎖ 107 이상)로 허용한다.
임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는, 이종성 프로테아제를 발현하지 않으며, 외인적으로 프로테아제 예를 들어, 트립신이 첨가되지 않은, 상응하는 세포의 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가에 비하여, log10 TCID50/㎖ 약 0.1 이상, 또는 약 0.2 이상, 또는 약 0.3 이상, 또는 약 0.4 이상, 또는 약 0.5 이상, 또는 약 0.6 이상, 또는 약 0.7 이상, 또는 약 0.8 이상, 또는 약 0.9 이상, 또는 약 1.0 이상, 또는 약 1.2 이상, 또는 약 1.4 이상, 또는 약 1.6 이상, 또는 약 1.8 이상, 또는 약 2.0 이상, 또는 약 2.2 이상, 또는 약 2.4 이상, 또는 약 2.6 이상, 또는 약 2.6 이상, 또는 약 2.8 이상, 또는 약 3.0 이상, 또는 약 3.2 이상, 또는 약 3.4 이상, 또는 약 3.6 이상, 또는 약 3.8 이상, 또는 약 4.0 이상, 또는 약 4.2 이상, 또는 약 4.4 이상, 또는 약 4.6 이상, 또는 약 4.8 이상, 또는 약 5.0까지 증가한다.
임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는, 이종성 프로테아제를 발현하지 않으며, 외인적으로 프로테아제 예를 들어, 트립신이 첨가되지 않은, 상응하는 세포의 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가에 비하여, 약 10% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 25% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 50% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 100% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 500% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 1000% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 5000% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 10,000% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 30,000% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 50,000% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 70,000% 이상까지 증가한다. 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가는 약 100,000% 이상까지 증가한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 세포가 배양되는 세포 배양 배지는 무-혈청이다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 세포가 배양되는 세포 배양 배지는 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청)을 함유한다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 세포가 배양되는 세포 배양 배지는 외인적으로 동물 단백질이 첨가되지 않는데, 이러한 배지를 종종 "무 동물 단백질(animal protein free)" 배지 또는 "AFP" 배지라고 부르기도 한다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 세포가 배양되는 세포 배양 배지는 외인성 프로테아제(예를 들어, 돼지의 트립신)를 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 프로테아제 또는 프로-프로테아제가 발현할 수 있는 조건 하에서는 일반적으로 세포 내 발현되지 않는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하여, 그 세포 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 생산하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 생산하는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 세포는 인플루엔자의 복제를 허용하는 세포이다.
임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 안정적으로 프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로-프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 안정적으로 프로-프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양 배지 중에 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 분비한다. 임의의 구체예에서, 세포는 세포 배양액 1㎖당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1ng∼약 50㎍ 발현한다. 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포의 배양액 중에서 생육한 바이러스의 역가를 증가시키기에 충분한 양만큼 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 유도적이다. 임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 구성적이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 세포 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하기에 효과적인 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는, (세포로부터 분비 또는 방출될 수 있거나 또는 될 수 없는) 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 도입하여, 정상적으로는 세포에 의해 발현되지 않는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 정상적으로는 세포에 의해 발현되지 않는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
당 업자에 의해 공지된 임의의 적당한 기술 및/또는 벡터는 세포에 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다. 임의의 구체예에서, 핵산은 세포에 플라스미드, 코스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지, 파지미드, 트랜스포존 또는 인공 염색체로서 도입된다. 임의의 구체예에서, 핵산은 세포에 레트로바이러스 벡터로서 도입된다. 임의의 구체예에서, 핵산은 세포 내에서 안정하게 유지된다. 기타 구체예에서, 핵산은 일시적으로 유지된다.
임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 선별 마커를 추가로 포함한다. 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 안정적으로 발현하는 세포들을 선별하기 위한 선별 마커를 이용하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 핵산이 도입된 세포에서 유용한 것으로 당 업자에게 공지된 임의의 선별 마커는 이와 같은 구체예에 사용될 수 있다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 임의의 구체예에서, 선별 마커는 세포에 결핍된 동화 경로를 보충해주는 유전자이다. 예를 들어, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 아미노산이 합성되지 않는 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 세포에 결핍된 기능을 보충하는 유전자를 포함할 수 있다. 이 세포를 아미노산을 포함하지 않는 배지 중에서 배양함으로써, 합성 유전자를 포함하는 핵산을 가지는 것을 선별할 수 있다. 당 업자에게 공지된 이와 같은 유전자 중 임의의 것은 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1과 약 90% 이상 동일한 분리된 핵산을 제공한다. 임의의 구체예에서, 분리된 핵산은 서열 번호 1을 포함하거나 또는 대안적으로 이 서열 번호 1로 이루어져 있다. 임의의 구체예에서, 분리된 핵산은 혼성화 조건 하에서 서열 번호 1을 암호화하는 핵산(또는 이의 상보성 서열)에 혼성화된다. 임의의 구체예에서, 이 혼성화 조건은 엄중한 혼성화 조건이다. 임의의 구체예에서, 혼성화 조건은 매우 엄중한 혼성화 조건이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 2인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 대안적으로 이 서열 번호 2인 아미노산 서열로 이루어져 있는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 2인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 대안적으로 이 서열 번호 2인 아미노산 서열로 이루어져 있는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터로 형질 감염된 세포를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 MDCK 세포 내에서의 ca A/베트남(Vietnam)/1203/2004 (H5N1)의 복제 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 상이한 레트로바이러스 벡터로 형질 감염된 세포 내에서 관찰되는 루시퍼라제 활성 양을 나타내는 표이다.
도 3은 MDCK 세포를 감염시키는데 사용되는 레트로바이러스 입자의 농도와 MDCK 세포 내에서 관찰되는 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 12개의 상이한 단일 MDCK 클론과 2개의 상이한 MDCK 클론 혼합물 내에서의 루시퍼라제 발현 결과를 나타내는 표이다.
도 5는 2개의 상이한 패키징 세포주(packaging cell line)에서 생산된 바이러스 입자로부터 유래하고, 3개의 상이한 벡터로 형질 감염된 MDCK 클론에 관한 정보를 요약한 표이다.
도 6a∼도6c는 상이한 MDCK 클론[패널 A = 대조군 클론; 패널 B = 암포(Ampho) 트립시노겐 클론; 패널 C = GP2 트립시노겐 클론]을 MDV-A 또는 A/NC 인플루엔자 균주로 감염시켜 얻어진 인플루엔자 바이러스 역가를 그래프로 나타낸 것이다. 다음과 같이 외인적으로 트립신을 첨가하였다: △ = 0.0㎍/㎖; ● = 제1일 경과시, 0.1㎍/㎖; □ = 1∼5일 경과시, 1.0㎍/㎖.
도 7a∼도 7b는 16개의 MDCK 클론들 중 12개에서 6xHis-표지화된 트립시노겐이 발현된다는 사실을 말해주는 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 15개의 상이한 MDCK 클론들에서 루시퍼라제가 유도적으로 발현된다는 사실을 나타내는 표이다.
도 9는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 세린 프로테아제를 암호화하는 sprT 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 나타내는 것이다.
도 10은 sprT 유전자에 의해 암호화되는, 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 세린 프로테아제의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타내는 것이다.
도 11은 트립시노겐을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3)을 나타내는 것이다.
도 12는 sprT 유전자를 클로닝하는데 사용되는 전방향(Forward) 및 역방향(Reverse) 프라이머를 나타내는 것이다(각각, 서열 번호 4 및 서열 번호 5).
도 13은 R3/7 클론에 형질 감염된 pT-Rex-DEST30/루시퍼라제 및 pT-Rex-DEST30/트립신 플라스미드의 구조 맵을 나타내는 것이다.
상세한 설명
정의
달리 정의하지 않는 한, 모든 과학 용어 및 기술 용어들은 그 용어들이 속하는 업계에서 일반적으로 사용되는 의미와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해해야 할 것이다. 본 발명에 사용되는 다음과 같은 용어에 관하여는 이하에 정의하였다.
"핵산", "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"이란 용어는, 단일 가닥 또는 이중 가닥인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체, 또는 이의 키메라 또는 유사체를 의미하는 것이다. 임의로, 본원에 사용된 상기 용어에는, 천연 생성 뉴클레오티드 유사체가 천연 생성 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산)와 유사한 방식으로 단일 가닥 핵산에 혼성화한다는 점에서, 천연 생성 뉴클레오티드의 본질적인 특성을 갖는 상기 유사체의 중합체를 포함하기도 한다. 특별히 한정하지 않는 한, 본 발명의 특정 핵산 서열로서는 명백히 표시된 서열 이외에도, 이의 상보성 서열을 포함한다.
"유전자"란 용어는, 넓은 의미로서 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 의미하는 것이다. 그러므로, 유전자는 암호화 서열 및/또는 이 암호화 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. "유전자"란 용어는, 특정의 게놈 서열에도 적용될 뿐만 아니라, 이 게놈 서열에 의해 암호화되는 cDNA 또는 mRNA에도 적용된다.
유전자는 또한 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인지 서열을 형성하는 비-발현형 핵산 분절을 포함한다. 비-발현형 조절 서열로서는 조절 단백질 예를 들어, 전사 인자가 결합하여, 이것과 인접하여 존재하거나 또는 근접하여 존재하는 서열을 전사시키는 "프로모터" 및 "인핸서"를 포함한다. "조직 특이적" 프로모터 또는 인핸서란, 특정 조직형(들) 또는 세포형(들)에 있어서 전사를 조절하는 서열을 의미한다.
"벡터"란 용어는, 플라스미드, 바이러스 벡터, 재조합 핵산 및 cDNA를 의미하는 것이다. 벡터는 또한 자발적으로 복제를 하지 않는, 나출 RNA 폴리뉴클레오티드, 나출 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내에 DNA와 RNA 둘다로 이루어져 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리-리신-컨쥬게이트화 DNA 또는 RNA, 펩티드-컨쥬게이트화 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이트화 DNA 등일 수도 있다. 가장 일반적으로, 본 발명의 벡터는 플라스미드이다.
"발현 벡터"란, 벡터 내에 통합된 핵산을 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터 예를 들어, 플라스미드를 의미하는 것이다. 통상적으로, 발현될 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서에 "작동 가능하도록 결합되어"있으며, 또한 프로모터 및/또는 인핸서에 의하여 전사 조절 작용이 제어된다.
"2 방향 발현 벡터(bi-directional expression vector)"는 통상적으로, 2개의 프로모터 간에 존재하는 핵산에 대하여 반대 방향으로 배향되어 있어서, 발현이 양쪽 방향으로 개시될 수 있고, 그 결과, 예를 들어, 플러스(+) 또는 센스 가닥 RNA와, 네거티브(-) 또는 안티센스 가닥 RNA를 둘 다 전사시키는, 2개의 대안적인 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 대안적으로, 상기 2 방향 발현 벡터는 앰비센스(ambisense) 벡터로서, 바이러스 mRNA 및 바이러스 게놈 RNA(cRNA)가 동일한 가닥으로부터 발현되는 벡터일 수 있다.
본 발명의 내용 중, "분리된"이란 용어는, 생물학적 물질 예를 들어, 핵산이나 단백질이, 천연의 상태에서 일반적으로 동반하거나 또는 상호 작용하는 성분으로부터 실질적으로 분리된 상태를 의미하는 것이다. 분리된 물질은 임의로는 천연 환경 예를 들어, 세포에서 특정 물질과 함께 발견되지 않는 물질을 포함한다. 예를 들어, 만일 어떤 물질이 천연 환경 예를 들어, 세포에 존재하면, 그 물질은 이와 같은 환경에서 발견되는 물질에는 원래 존재하지 않던, 세포 내 위치(예를 들어, 게놈 또는 유전 요소)에 존재하는 것이다. 예를 들어, 만일 천연 생성 핵산이 그 핵산이 원래 존재하지 않던 게놈 내 위치에 비-천연 생성 수단(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 또는 앰플리콘)에 의해 도입되면, 천연 생성 핵산(예를 들어, 암호화 서열, 프로모터 및 인핸서 등)은 분리된다. 이러한 핵산을 "이종" 핵산이라고도 부른다.
"재조합체"란 용어는, 특정 물질(예를 들어, 핵산 또는 단백질)이 인간의 개입에 의해 인공적으로 또는 합성에 의해서(비-천연적으로) 변형된 것을 의미하는 것이다. 변형은 특정 물질이 원래 있던 환경 또는 상태로 존재하거나, 또는 이로부터 분리되어 일어날 수 있다. 구체적으로, 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스에 관하여 언급할 때, 바이러스는 그것이 재조합 핵산이 발현됨에 따라서 생산될 때, 재조합체인 것이다.
"재분류체(reassortant)"란 용어는, 바이러스에 관하여 언급할 경우, 바이러스가 하나 이상의 모 바이러스 균주 또는 공급원으로부터 유래하는 유전 성분 및/또는 폴리펩티드 성분을 포함하는 경우를 의미하는 것이다. 예를 들어, 7:1 재분류체는 제1 모 바이러스로부터 유래하는 7개의 바이러스 게놈 분절(또는 유전자 분절)과, 제2 모 바이러스로부터 유래하는 하나의 상보성 바이러스 게놈 분절 예를 들어, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제를 암호화하는 하나의 상보성 바이러스 게놈 분절을 포함하는 것이다. 6:2 재분류체란, 가장 일반적으로 제1 모 바이러스로부터 유래하는 6개의 내부 유전자인 6개의 게놈 분절과, 상이한 모 바이러스로부터 유래하는 2개의 상보성 분절 예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함하는 것이다.
이종성 핵산 또는 분리된 핵산에 관하여 언급할 때, "도입된"이란 용어는, 핵산이 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA) 내에 통합되어, 자발적 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있을 경우(예를 들어, 형질 감염된 mRNA일 경우), 핵산이 진핵 생물 세포 또는 원핵 생물 세포로 통합됨을 의미하는 것이다. 상기 용어는 "감염", "형질 감염", "형질 전환" 및 "형질 도입"과 같은 방법에도 적용된다. 본 발명의 내용 중 다양한 방법들 예를 들어, 전기 천공법, 인산칼슘 침전법, 지질 매개 형질 감염법(리포팩션) 등이 핵산을 원핵 생물 세포에 도입하는데 사용될 수 있다.
"숙주 세포"란 용어는, 이종성 핵산 예를 들어, 벡터를 함유하고, 이 핵산의 복제 및/또는 발현, 그리고 임의로는 폴리펩티드 및/또는 벡터를 포함하는 하나 이상의 암호화된 생성물 및/또는 바이러스의 생산을 허용하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵 생물 세포 예를 들어, 이.콜라이 또는 진핵 생물 세포 예를 들어, 효모, 곤충, 양서류, 조류 또는 포유동물 세포 예를 들어, 인간 세포일 수 있다. 본 발명의 내용 중 대표적인 숙주 세포로서는 Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장) 세포, Per.C6 세포(인간 배아 망막 세포), BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, 발달 초기 병아리 신장(PCK) 세포, 매딘-다비(Madin-Darby) 개 신장(MDCK) 세포, 매딘-다비 소 신장(MDBK) 세포, 293 세포(예를 들어, 293T 세포), 및 COS 세포(예를 들어, COS1, C0S7 세포)를 포함한다. 숙주 세포란 용어는, 세포의 조합물 또는 혼합물 예를 들어, 상이한 세포 유형 또는 세포주(예를 들어, Vero와 CEK 세포)의 혼합 배양액을 포함하는 의미이다. 전기 천공된 SF Vero 세포의 공동 배양에 관하여는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 2004년 12월 22일자로 출원된 PCT/US04/42669에 개시되어 있다.
본원에서 "인공 조작된"이란 표현은, 바이러스, 바이러스 핵산 또는 바이러스에 의해 암호화된 생성물 예를 들어, 폴리펩티드 또는 백신이, 재조합 방법 예를 들어, 위치 배향 돌연 변이 유발법, PCR 돌연 변이 유발법 등에 의해 도입된 하나 이상의 돌연 변이를 포함하는 경우를 의미하는 것이다. 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연 변이 및/또는 아미노산 치환을 포함하는 바이러스(또는 바이러스 성분이나 생성물)에 관하여 언급할 때, "인공적으로 조작된"이란 표현은, 바이러스 게놈 또는 이 바이러스(또는 바이러스 성분이나 생성물)를 암호화하는 바이러스 게놈 또는 게놈 분절이, 비-재조합 방법(예를 들어, 25℃에서 점진적으로 계대 배양시키는 방법)에 의해 생산된 천연 생성 공급원 예를 들어, 천연 생성 바이러스 균주 또는 이전에 제조하여 둔 실험실용 균주 예를 들어, 야생형 또는 냉각 적응 A/앤 아버/6/60 또는 B/앤 아버/1/66 균주로부터 유래하지 않는 경우를 의미하는 것이다.
"서열 동일성%"란 용어는, 본원에서 "동일성%"라는 용어와 호환되어 사용되는 것으로서, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하였을 때, 2개 이상의 펩티드 서열 간 아미노산 서열 동일성 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 간 뉴클레오티드 서열 동일성 수준을 의미하는 것이다. 예를 들어, 본원에 있어서, 동일성%가 80%란 의미는, 소정의 알고리즘에 의해 측정된 서열 동일성%가 80%란 의미이며, 또한 소정의 서열이 상이한 길이를 가지는 다른 서열과 80% 이상 동일하다는 의미이다. 서열 동일성의 대표적인 수준으로서는 소정의 서열에 대하여 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상인 경우를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"서열 상동성%"란 용어는 본원에서 "상동성%"와 호환되어 사용되는 용어로서, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하였을 때, 2개 이상의 펩티드 서열 간 아미노산 서열 상동성 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 간 뉴클레오티드 서열 상동성 수준을 의미하는 것이다. 예를 들어, 본원에 있어서, 상동성%가 80%란 의미는, 소정의 알고리즘에 의해 측정된 서열 상동성%가 80%란 의미이며, 또한 소정의 서열의 상동체가 소정의 서열 길이에 대한 서열 상동성이 80% 이상이라는 의미이다. 서열 상동성의 대표적인 수준으로서는 소정의 서열에 대하여 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상인 경우를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
2개의 서열들 간 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 대표적인 컴퓨터 프로그램으로서는 BLAST 프로그램 군 예를 들어, BLASTN, BLASTX 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN(인터넷상 NCBI 웹사이트를 통하여 공중이 이용 가능함)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Altschul외 다수, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10(공개된 디폴트 세팅 즉 매개 변수(w = 4, t = 17)에 대한 구체적인 참고 문헌), 및 Altschul외 다수, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]을 참조하시오. 서열 검색은 통상적으로 GenBank 단백질 서열 및 기타 공중이 이용 가능한 데이터베이스 내 아미노산 서열에 대하여 소정의 아미노산 서열을 평가할 때 사용되는 BLASTP 프로그램을 이용하여 수행된다. 상기 BLASTX 프로그램은 모든 해독 틀 내에서 번역된 핵산 서열을 GenBank 단백질 서열 및 기타 공중이 이용 가능한 데이터베이스 내 아미노산 서열에 대하여 검색할 경우에 바람직하다. BLASTP 및 BLASTX는 디폴트 매개 변수[개방 갭 패널티 = 11.0, 연장 갭 패널티 = 1.0] 및 BLOSUM-62 매트릭스를 사용하여 실행된다[상기 문헌 참조].
2개 이상의 서열 간 "동일성%"를 측정하기 위하여 선택된 서열의 바람직한 정렬법은 예를 들어, 디폴트 매개 변수(예를 들어, 개방 갭 패널티 = 10.0 및 연장 갭 패널티 = 0.1)와 BLOSUM 30 유사도 매트릭스를 이용하는, CLUSTAL-W 프로그램(MacVector 6.5 버젼)으로써 수행된다.
"~에 특이적인 혼성화" 또는 "특이적 혼성화" 또는 "~에 선택적으로 혼성화하다"란, 특정 뉴클레오티드 서열이 복합 혼합체(예를 들어, 총 세포) DNA 또는 RNA에 존재하는 경우, 엄중한 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열에 핵산 분자가 우선적으로 결합, 이중체화, 또는 혼성화하는 경우를 의미하는 것이다.
"엄중한 조건"이란 용어는, 프로브가 그것의 표적 내부 서열에 우선적으로 혼성화하고, 기타 서열에는 낮은 정도로 혼성화하거나 거의 혼성화하지 않는 조건을 의미하는 것이다. 핵산 혼성화 실험 예를 들어, 서던 혼성화 및 노던 혼성화와 같은 실험에 관한 내용 중 "엄중한 혼성화" 및 "엄중한 혼성화 세척 조건"이란, 서열에 의존적이고, 상이한 환경 매개 변수에 따라서 달라지는 혼성화 또는 혼성화 세척 조건을 의미하는 것이다. 핵산의 혼성화에 관한 보다 자세한 지침에 관하여는 문헌[Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY; Sambrook외 다수, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd ed., NY; 및 Ausubel외 다수, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY]에서 살펴볼 수 있다.
일반적으로, 고도로 엄중한 혼성화 및 세척 조건은 소정의 이온 세기와 pH에서의 특정 서열에 대한 용융점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치되는 프로브에 혼성화되는 온도(소정의 이온 세기 및 pH에서의 온도)이다. 매우 엄중한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하도록 선택된다.
서던 또는 노던 블럿팅에 있어서, 약 100개 이상의 상보성 잔기를 가지는 상보성 핵산이 필터 상에 혼성화되는 엄중 혼성화 조건의 일례로서는, 42℃에서 1㎎의 헤파린과 50%의 포르말린을 처리하고, 밤새도록 혼성화시키는 경우가 있다. 매우 엄중한 세척 조건의 일례로서는, 약 15분 동안 72℃에서 0.15M의 NaCl을 처리하는 경우가 있다. 엄중한 세척 조건의 일례로서는 15분 동안 65℃에서 0.2×SSC로 세척하는 경우가 있다. SSC 완충액에 관한 설명은 문헌[Sambrook외 다수]을 참조하시오. 고도로 엄중한 세척에서는 우선, 낮은 엄중도 세척이 선행되어, 백그라운드 프로브 신호를 제거할 수 있다. 예를 들어, 약 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체에 있어서, 대표적인 중간 정도의 엄중도 세척은, 15분 동안 45℃에서 1×SSC를 첨가함으로써 행해진다. 예를 들어, 약 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체에 있어서, 대표적인 낮은 엄중도 세척은, 15분 동안 40℃에서 4∼6×의 SSC를 첨가함으로써 행해진다. 일반적으로, 신호 대 노이즈 비율은 구체적인 혼성화 검정법에 있어서의 관련 없는 프로브에서 관찰되는 비율에 비하여 2배(또는 그 이상)에 달하는데, 이는 곧, 특이적인 혼성화가 관찰된다는 의미이다.
본원에 있어서 "약"이란 용어는, 별도의 언급이 없는 한, 이 용어에 의하여 한정되는 수치의 10% 이상만큼 위 또는 아래에 해당하는 경우를 의미한다. 예를 들어, "약 5㎍/㎏"이란 용어는, 4.5∼5.5㎍/㎏의 범위를 의미하는 것이다. 다른 예로서, "약 1시간"이란, 48∼72분의 범위를 의미하는 것이다.
본원에 있어서 "안정적으로 통합된"이란 용어는, 핵산과 관련하여 사용되었을 때, 숙주 세포의 게놈 핵산과 재조합되어, 그 결과 세포 게놈의 일부를 형성하게 된 핵산을 의미하는 것이다. 안정적으로 통합된 핵산은 안정적으로 통합된 핵산이 세포 게놈의 일부로서 남아 있는지 여부를 입증하는 선별 마커를 포함할 수 있다. 안정적으로 통합된 핵산은 반드시 게놈 내 단일 위치에 통합된 채로 유지될 필요는 없으며; 핵산은 하나 이상의 위치에 통합되어, 게놈 내 특정 위치로부터 다른 위치로 이동할 수 있다.
이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포
표면에 전구체 헤마글루티닌 분자(HA0)를 함유하는 인플루엔자 바이러스는 세포와 융합되어 감염을 개시할 수 없다. HA0는 단백 분해되어 HA1과 HA2 서브유닛으로 분리되어야 활성 형태를 가질 수 있다. 표면에 성숙한 HA를 가지는 비리온은 숙주 세포와 적극적으로 융합되어 감염을 개시한다. 몇몇 생체 내 세포 유형 예를 들어, 기도 세포는 HA를 활성화하는 프로테아제를 함유하지만; 시험관 내에서 사용되는 다수의 세포 유형들 예를 들어, MDCK는 HA를 효율적으로 절단할 수 있는 활성 프로테아제를 함유하지 않는다. 이러한 세포에 있어서, 외인성 트립신은 세포에 악영향을 미치지 않으면서, HA가 절단되어 활성화되도록 만들어주는 농도로 배양액에 첨가된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,698,433호 및 동 제5,756,341호를 참조하시오.
돼지의 트립신은 HA를 효과적으로 활성화하여, 통상의 목적으로 몇몇 인플루엔자 연구자에 의해 사용되고 있다. 이하에 기술된 예에서는, 예를 들어, 돼지의 트립신 또는 트립시노겐을 발현하는 재조합 세포는 이 세포가 예를 들어, MDCK 세포 내에서 인플루엔자 바이러스 복제를 허용하는 능력에 대해 평가 및 선별된다.
그러므로, 임의의 구체예에서, 재조합 시스템 또는 세포 자체로부터 발현되는 활성 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 본 발명과 관련하여 고려된다. 재조합 세포주로부터 클로닝된 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현시키면, 동물 유래 생성물을 감소 또는 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 어느 상황에서 HA 분자를 가장 효과적으로 절단할 수 있는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 제공할 수 있다. 대안적으로, 정상적으로는 세포에 의해서 발현되지 않으며, 세포의 게놈 내에서 암호화되는 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 프로테아제 또는 프로-프로테아제 발현 조절에 변화를 줌으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 전사 및 번역시키는 프로모터 예를 들어, 유도성 프로모터는 예를 들어, 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현을 조절하는 세포의 게놈 내 일정 부위에서 일어나는 상동성 재조합에 의하여 도입될 수 있다. 선별된 세포 유형을 활성화하는 프로모터(및/또는 기타 조절 서열)을 선택함으로써, 프로테아제 또는 프로-프로테아제는, 정상적으로는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는 세포 내에서 발현될 수 있다.
인플루엔자를 배양하는데 유용하다고 당 업자에게 알려진 임의의 세포는 본 발명의 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 복제하는데 적당한 숙주 세포로서는 예를 들어, Vero 세포, Per.C6 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293 세포 및 COS 세포, 예를 들어, 293T 세포 및 COS7 세포를 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 세포주 중 2개 이상을 포함하는 공동 배양액 예를 들어, 293T 세포 또는 COS 세포 중 어느 하나와 MDCK 세포를 예를 들어, 1:1의 비율로 포함하는 공동 배양액을 사용하여, 복제 효율을 개선할 수도 있다. 이러한 구체예에서, 공동 배양된 세포들 중 어느 하나 또는 둘 다는 이종성 프로테아제를 발현할 수 있다.
세포에 의해 발현된 프로테아제
당 업자에게 HA0 인플루엔자 단백질을 절단하는데 유용하다고 공지된 임의의 프로테아제는 본 발명에 의한 세포에 의하여 발현될 수 있다.
몇몇 프로테아제는 재조합 시스템으로부터 생산되거나 또는 세포 예를 들어, MDCK 세포 자체로 조작되어 통합되는 능력에 대해 평가될 수 있다. 적당한 프로테아제 및 프로-프로테아제로서는, 트립신, 트립시노겐 및 SPRT를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 추가의 대표적인 프로테아제를 이하 표 1에 나열하였다. 뿐만 아니라, 프로테아제의 활성 단편은 또한 본 발명의 세포 및 방법에서 사용될 수 있다.
당업자는 특정 프로테아제가 본 발명의 세포 및 방법에 사용하기 적당한지 여부를 통상적으로 판단할 수 있다. 일반적으로, 이러한 검정법은 바이러스 단백질의 절단 여부를 평가하는 과정을 포함하는데, 여기서, 이와 같은 절단 과정은 바이러스의 생명 주기에 있어서 매우 중요한 단계이다. 절단은 예를 들어, 2개의 작은 단백질이 이보다 큰 단백질로부터 생산되는지 여부를 모니터링함으로써 직접적으로 평가될 수 있거나, 아니면, 프로테아제의 존재 하에서 생산되는 바이러스 역가를 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 배양용 세포 및/또는 이의 배양 방법에 적당한 프로테아제는 예를 들어, HA0 단백질의 절단 여부를 평가함에 의하거나, 또는 프로테아제를 포함하는 세포 배양액 중 바이러스 역가를 모니터링함으로써 동정될 수 있다.
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프로테아제를 암호화하는 벡터
세포 내에서 이종성 유전자를 발현하는데 적당한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현시킬 수 있다. 통상적으로, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 핵산 구조물은 종래의 분자 생물학적 기술을 이용하여 구성되며, 이렇게 구성된 구조물은 목적으로 하는 숙주 세포주에 도입된다. 원하는 구조물을 포함하는 세포를 동정한 다음, 이를 스크리닝하여, 이종성 단백질을 원하는 농도로 발현하는 세포를 동정한다. 이러한 각각의 단계들을 수행하는 방법은 다수 개 존재한다.
이러한 목적으로서 적당한 다수의 벡터 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 인공 염색체 및 에피좀 벡터를 공중이 이용할 수 있다. 구조물을 선별하여 이 벡터를 사용하는 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 벡터는 간단한 클로닝 및 돌연 변이 유발법에 사용될 수 있긴 하지만; 유전자 발현 벡터는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 적당한 세포에 도입시킬 때 사용되어야 한다. 벡터는 원하는 크기를 가지는, 즉, 통상적으로, 0.25∼40 킬로베이스(kb) 이상인 프로테아제 또는 프로-프로테아제 암호화 서열을 수용할 수 있는 것으로서 선별될 수 있다.
벡터는 통상적으로 다양한 기능 성분들 예를 들어, 클로닝(또는 "폴리링커") 위치, 복제 기원 및 하나 이상의 선별 마커 유전자를 함유한다. 뿐만 아니라, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현시키기 위해서, 벡터는 통상적으로 다음과 같은 요소 중 하나 이상을 가진다: 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결 및 신호 서열(상기 각각의 요소들은 클로닝 위치에 가까이 위치하여, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 결합되어 있음).
프로테아제 또는 프로-프로테아제 단백질의 발현은 당 업계에 공지된 임의의 프로모터 또는 인핸서 요소에 의해 제어될 수 있다. 사용될 수 있는 적당한 프로모터로서는 예를 들어, SV40 초기 프로모터 부위(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 루 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복부 내에 포함되어 있는 프로모터(Yamamoto외 다수, 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner외 다수, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster외 다수, 1982, Nature 296:39-42), 테트라사이클린(Tet) 프로모터(Gossen외 다수, 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551) 또는 CMV 프로모터(예를 들어, 인간 즉시-초기 CMV 프로모터(human immediate-early CMV promoter))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 프로테아제 또는 프로-프로테아제 발현을 일시적으로 제어하는 것이 바람직할 수도 있는데, 당 업자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 예를 들어, 조절 요소는 인터페론-반응성 유도 프로모터 또는 조절 요소일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Levy외 다수, 1988, Genes & Devel. 2:383-393, Reich외 다수, 1987, P.N.A.S. USA 84:6394-6398, 및 Pellegrini외 다수, 1989, Mol. Cell Biol. 9:4605-4612]을 참조하시오. 벡터는 이 벡터가 각각의 호르몬에 대한 수용체를 가지는 세포 내에서 발현되는데 사용되는 경우, 호르몬 유도성을 부여할 수 있는 호르몬 반응 요소 예를 들어, 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE) 및 에스트로겐 반응 요소(ERE)를 함유하기 때문에, 이 벡터는 또한 유도적일 수도 있다. 발현의 백그라운드 수준을 감소시키기 위해서, 곤충 호르몬의 일종인 엑디손에 반응성인 요소를 대신 사용할 수 있으며, 이때, 엑디손 수용체를 공동 발현시킬 수 있다.
벡터는 일반적으로 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있도록 만들어주는 핵산 서열을 함유한다. 그러나, 벡터가 숙주 세포의 게놈에 통합되는 경향이 있을 때 벡터는 자발적으로 복제할 필요는 없으며, 실제로 자발적으로 복제하지 않는 것이 바람직하다. 통상적으로, 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA를 독립적으로 복제시킬 수 있도록 만들어주며, 복제 기원 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 다수의 박테리아, 효모, 바이러스 및 포유동물 세포용인 서열은 널리 공지되어 있다.
플라스미드 pBR322로부터 유래하는 복제 기원은 대부분의 그램-음성 박테리아에 적당하며, 2 마이크론 플라스미드 기원은 효모에 사용하기 적당하고, 다양한 바이러스 기원(예를 들어, SV40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포 내 클로닝 벡터로서 유용하다. 일반적으로, 복제 기원은 포유동물 발현 벡터가 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포 예를 들어, COS 세포 내에서 사용되지 않는 한, 그 발현 벡터에는 필요하지 않다.
유리하게도, 벡터는 선별 유전자(선별 마커라고도 부름)를 함유할 수 있다. 이 유전자는 형질 전환된 숙주 세포가 선택 배양 배지 중에서 생존 또는 생육하는데 필요한 단백질을 암호화한다. 그러므로, 선별 유전자를 함유하는 벡터로 형질 전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지 중에서 생존하지 못할 것이다. 통상의 선별 유전자는 항생제 및 기타 독소 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하고, 영양 요구성 결핍증(auxotrophic deficiencies)을 보완하거나, 또는 성장 배지 중에 존재하지 않는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 암호화한다. 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 벡터는 포유동물 세포 내에 도입되는 것이 가장 일반적이므로, 포유동물 선별 마커 예를 들어, G418 내성 유전자를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
다수의 선별 시스템 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler외 다수, 1977, Cell 11 :223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy외 다수, 1980, Cell 22:817) 유전자를 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포 내에서 사용할 수 있다. 또한, 대사 길항 물질 내성을 이용하여, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[Wigler외 다수, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare외 다수, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin외 다수, 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre외 다수, 1984, Gene 30:147) 유전자에 대한 선별의 기초로 삼을 수 있다. 기타 항생제-내성 유전자 예를 들어, 암피실린, 클라포란(Claforan), 겐타마이신, G418, 하이그로마이신, 리팜피신, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 유전자도 선별 마커로서 사용될 수 있다.
발현 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인지되는 프로모터를 함유하며, 목적 암호화 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 이러한 프로모터는 유도적이거나 구성적일 수 있다. "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 전술한 성분들이 의도로 하는 방식으로 작동할 수 있는 관계를 유지하도록 병렬된 상태를 의미한다. 암호화 서열에 "작동 가능하도록 결합된" 제어 서열은 암호화 서열이 제어 서열과 양립할 수 있는 조건 하에 발현되는 방식으로 결찰되어 있는 것이다.
프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 벡터의 구성에는 종래의 결찰 기술을 사용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편은 절단 및 조작되어, 원하는 벡터를 형성하기 바람직한 형태로 재결찰된다. 원한다면, 구성된 벡터 내에 올바른 서열이 존재함을 확인하기 위한 분석을 공지의 방식으로 수행할 수 있다. 발현 벡터를 구성하고, 시험관 내 전사체를 제조하며, DNA를 숙주 세포에 도입하고, 발현 및 기능을 평가하기 위한 분석법을 수행하는데 적당한 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 시료 중 유전자 서열의 존재, 또는 이의 증폭 및/또는 발현 여부는 종래의 방법 예를 들어, 서던 또는 노던 분석법, 웨스턴 블럿팅, DNA, RNA 또는 단백질의 닷 블럿팅, 시험관 내 혼성화 방법, 핵산 또는 단백질 분자의 면역 세포 화학적 분석법 또는 서열 분석법에 의해 확인할 수 있다. 당 업자들은 이러한 방법들이 원하는 경우 어떻게 변형할 수 있는지 용이하게 파악할 수 있을 것이다.
아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 목적으로 하는 프로테아제 또는 프로-프로테아제 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체 예를 들어, 후기 프로모터 및 3원 리더 서열(tripartite leader sequence)에 결찰될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이후, 시험관 내 또는 생체 내 재조합법에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비 필수 부위(예를 들어, E1 또는 E3 부위) 내에 삽입되면, 감염된 숙주 내에서 생존할 수 있고, 이 숙주 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스가 생산될 것이다[예를 들어, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 참조]. 대안적으로, 프로모터 및 변형된 ABC 운반 폴리펩티드(ABC transporter polypeptide)를 암호화하는 핵산에 측접하는 하비(Harvey) 쥣과 동물 육종 바이러스(Ha-MSV) 장 말단 반복부(LTR)를 함유하는 레트로바이러스 발현 벡터를 사용할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 가능하거나(replication competent), 또는 복제 불가능(replication defective)하다. 복제 불가능한 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보충형 숙주 세포(complementing host cell) 내에서만 일어날 것이다.
인공 염색체는 또한 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터 내에 포함되어 이로부터 발현될 수 있는 DNA보다 큰 DNA 단편을 전달하는데 사용될 수도 있다. 크기 약 6kb∼10Mb인 인공 염색체는 구성되어, 치료용인 종래의 전달 방법(리포좀, 다가 양이온 아미노 중합체 또는 소포)을 통해 전달될 수 있다[예를 들어, Harrington, J. J.외 다수 (1997) Nat. Genet. 15:345-355 참조].
특이적 개시 신호는 또한 삽입된 프로테아제 또는 프로-프로테아제 암호화 서열을 효율적으로 번역하는데 필요할 수도 있다. 이러한 신호로서는 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. 뿐만 아니라, 개시 코돈은 원하는 암호화 서열의 해독 틀과 보조를 맞추어 전체 삽입물의 번역을 보장하여야 한다. 이와 같은 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 다수의 천연 및 합성 기원들로부터 유래하는 것일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 인핸서 요소, 전사 종결 인자 등을 포함시킴으로써 강화될 수 있다[예를 들어, Bittner외 다수, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544 참조].
임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 안정적으로 발현하는 세포를 제공한다. 이러한 세포주를 생산하기 위하여, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포를 적당한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결 인자, 폴리아데닐화 위치 등)에 의해 제어되는 DNA 및 선별 마커로 형질 전환하는 것이 바람직하다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 풍부 배지 중에서 1∼2일 동안 생육시킨 후, 선별 배지에 대해 스위칭(switching)시킬 수 있다. 재조합 플라스미드 내 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 또한 세포가 자신의 염색체에 플라스미드를 안정적으로 통합하여, 생육시 세포주로 클로닝될 수 있고, 클로닝된 세포주에서 증식할 수 있는 지점을 마련할 수 있다.
이종성 프로테아제를 발현하는 세포를 제조하는 방법
프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 벡터를 원하는 세포 내에 도입하기 위해 선택한 방법은 통상적으로 벡터와 세포에 의존적일 것이다.
형질 전환 방법 및 핵산을 숙주 세포에 도입하는 기타 방법(예를 들어, 컨쥬게이트화, 원형질체 형질 전환 또는 융합법, 형질 감염법, 전기 천공법, 리포좀 전달법, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅 펠릿화, 바이러스 감염법 및 원형질체 융합법)은 당 업계에 널리 공지된 다수의 방법에 의하여 이루어질 수 있다[예를 들어, Ausubel, 상동, 및 Sambrook외 다수, 상동, 참조]. 박테리아, 효모, 식물 또는 포유동물 세포는 발현 벡터 예를 들어, 플라스미드 및 코스미드 등으로 형질 전환 또는 형질 감염될 수 있으며, 이때, 상기 발현 벡터는 전술한 바와 같이, 목적으로 하는 핵산을 포함한다. 대안적으로, 세포는 목적 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터에 의하여 감염될 수 있다. 숙주 세포에 따라서, 사용된 벡터 및 형질 전환 방법, 폴리펩티드의 일시적 또는 안정적 발현은 구성적이거나 또는 유도적일 것이다. 당 업자는 전술한 바와 같이, 폴리펩티드를 일시적으로 발현시킬지 또는 안정적으로 발현시킬지 여부와, 단백질을 구성적으로 발현시킬지 또는 유도적으로 발현시킬지 여부를 결정할 수 있을 것이다.
포유동물 세포는 팩키징된 바이러스 벡터에 의해 직접 감염될 수 있거나, 또는 화학적 수단 또는 전기적 수단에 의해 형질 감염될 수도 있다. 화학적 형질 감염법에 있어서, DNA는 CaPO4와 함께 공동 침전될 수 있거나, 또는 리포좀 및 비 리포좀 지질계 제제를 사용하여 도입될 수 있다. 상업용 키트는 CaPO4 형질 감염에 유용하며[CalPhos™ Mammalian Transfection Kit, Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif., USA], 지질-매개 형질 감염은 시판중인 시약 예를 들어, 리포펙타민(LIPOFECTAMIN)® 2000, 리포펙타민™ 시약, 셀펙틴(CELLFECTIN)® 시약, 리포펙틴(LIPOFECTIN)® 시약(Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), DOTAP 리포좀 형질 감염 시약, 퓨젠(FuGENE) 6, 엑스트림진(X-tremeGENE) Q2, DOSPER, (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind. USA), 이펙텐(Effectene)™, 폴리펙트(PolyFect)®, 및 슈퍼펙트(Superfect)(Qiagen, Inc., Valencia, Calif., USA)를 사용하여 실시될 수 있다. 포유동물 세포를 전기 천공시키는 방법은 예를 들어, 문헌[Norton외 다수 (eds.), Gene Transfer Methods: Introducing DNA into Living Cells and Organisms, BioTechniques Books, Eaton Publishing Co. (2000)]에서 살펴볼 수 있다. 기타 형질 감염 기술로서는 입자 충격법 및 미세 주입법에 의한 형질 감염 기술을 포함한다[예를 들어, Cheng외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(10): 4455-9 (1993); Yang외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(24): 9568-72 (1990) 참조].
이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 배양
이종성 프로테아제를 발현하는 세포는 당 업자에게 공지된 임의의 적당한 배양 배지 중에서 배양될 수 있다. 통상적으로, 세포는, 습도 및 CO2 농도를 중성 완충 pH(예를 들어, pH 7.0∼7.2)를 유지하도록 적당하게 제어하면서, 표준적인 상업용 배양 배지 예를 들어, 혈청(예를 들어, 10% 소 태아 혈청)이 보충된 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium), 또는 무 혈청 배지 중에서 배양된다. 임의로, 배지는 박테리아 성장을 막는 항생제 예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등 및/또는 부가의 영양분 예를 들어, L-글루타민, 피루브산나트륨, 비-필수 아미노산, 바람직하게 성장을 촉진하기 위한 부가 보충 성분 예를 들어, 트립신, β-머캡토에탄올 등을 함유한다.
포유동물 세포를 배양액 중에 유지시키는 방법에 관하여는 자세히 보고된 바 있으며, 당 업자에게도 공지되어 있다. 일반적인 방법에 관하여는 예를 들어, 문헌[Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam]에 개시되어 있다. 인플루엔자 바이러스를 시험관 내에서 생산함에 있어서 특정의 목적을 가지는 조직 배양 방법에 관한 부연 설명은 예를 들어, 본원에 그 자체로서 인용되어 있는 문헌[Merten외 다수 (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation Cohen and Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines]에 개시되어 있다. 부가적으로, 본 발명에서 채택한 이러한 방법의 변법은 통상의 실험을 통해 용이하게 결정된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 세포는 이 세포가 부착되는 표면상에 부착되는 세포로서 배양된다. 조직 배양 세포가 성장할 수 있는 부착성 표면은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 부착성 표면으로서는, 표면 개질된 폴리스티렌 플라스틱, 단백질 코팅된 표면(예를 들어, 피브로넥틴 및/또는 콜라겐 코팅된 유리/플라스틱), 그리고 다양한 시판용 미세 담체(예를 들어, DEAE-덱스트란 미세 담체 비드 예를 들어, 도마셀(Dormacell)(Pfeifer & Langen); 슈퍼비드(Superbead)(Flow Laboratories); 스티렌 공중합체-3중-메틸아민 비드 예를 들어, 힐렉스(Hillex), 솔로힐(SoloHill)(Ann Arbor))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 세포는 담체에 부착되지 않는 현탁 세포로서 배양될 수 있다. 담체를 사용하지 않고 현탁액 중에서 세포를 성장시키는 방법은 당 업계에 공지되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제6,825,036호 및 동 제6,455,298호]. 대안적으로, 또는 임의적으로, 본 발명의 세포에 의하여 발현된 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 수준은 조절되어, 임의의 적응 과정 없이, 현탁액 중에서 세포를 생육할 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 세포는 적응 과정 없이, 현탁액 중에서 생육하기에 충분한 수준의 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현시킨다. 기타 구체예에서, 적응 과정 없이 현탁액으로서 생육한 본 발명의 세포는 바이러스 복제에 사용된다. 특정 구체예에서, 적응 과정 없이 현탁액으로서 생육한 본 발명의 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제용으로 사용된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현으로 인하여, 적응 과정 없이 현탁 세포로서 생육한다. 임의의 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 세린 프로테아제이다. 기타 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 트립신 또는 트립시노겐이다. 또 다른 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 포유동물의 트립신 또는 트립시노겐이다. 또 다른 구체예에서, 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 박테리아 트립신 또는 트립시노겐이다.
몇몇 구체예에서, 현탁액 중에서 생육하는 본 발명의 세포에 의해 발현된 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 수준은 세포 배양액 1㎖당 약 0.1ng∼약 50㎍이다. 기타 구체예에서, 현탁액 중에서 생육하는 본 발명의 세포에 의해 발현되는 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 수준은 세포 배양액 1㎖당 0.1ng 이상, 또는 0.5ng 이상, 또는 1.0ng 이상, 또는 5.0ng 이상, 또는 10ng 이상, 또는 20ng 이상, 또는 30ng 이상, 또는 40ng 이상, 또는 50ng 이상, 또는 60ng 이상, 또는 70ng 이상, 또는 80ng 이상, 또는 90ng 이상, 또는 1㎍ 이상, 또는 2㎍ 이상, 또는 5㎍ 이상, 또는 10㎍ 이상, 또는 20㎍ 이상, 또는 30㎍ 이상, 또는 40㎍ 이상, 또는 50㎍ 이상이다.
인플루엔자 바이러스를 생산하는 세포는 혈청-함유 배지 또는 무 혈청 배지 중에서 배양될 수 있다. 몇몇 경우, 정제된 바이러스를 제조하기 위하여, 숙주 세포를 무 혈청 조건 하에서 생육시키는 것이 바람직하다. 적당한 무 혈청 배지에 관하여는 미국 가 명세서 출원 제60/638,166호(2004년 12월 23일 출원), 미국 가 명세서 출원 제60/641,139호(2005년 1월 5일 출원) 및 미국 특허 출원 제11/304,589호(2005년 12월 16일 출원)(각각은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있다.
조직 배양에 혈청 또는 동물 추출물을 사용하면 불리할 수 있다는 점을 당 업자는 알고 있을 것이다[Lambert, KJ.외 다수, In: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R.E.외 다수, Eds., Academic Pres New York, pp. 85-122 (1985)]. 예를 들어, 상기와 같은 보충 성분의 화학적 조성은 매 회 다양할 수 있으며, 심지어는 단일 제조자에 의할 경우에도 다양할 수 있다. 뿐만 아니라, 동물 또는 인간 기원의 보충 성분은 우발적인 제제(예를 들어, 마이코플라스마, 바이러스 및 프리온)에 의해 오염될 수도 있다. 이와 같은 제제들은 오염된 보충 성분들이 세포 배양 배지 제조에 사용될 경우, 배양 세포의 상태를 심각하게 위협할 수 있다. 또한, 이러한 제제는 우발적인 제제에 의해 오염된 배양액 중에 생성된 물질이 세포 요법 및 기타 임상용으로서 사용될 때 건강에 위협을 가할 수 있다. 가장 우려되는 경우는, 동물에 있어서 해면상 뇌증을 일으키고, 인간에 있어서는 크루츠펠트-야곱병을 일으키는 프리온이 존재할 경우이다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 배양 배지는 완전히 무 혈청인 것이다. 유리하게, 배양 배지는 동물 생성물이 완전히 존재하지 않을 수 있다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 배양 배지는 동물 단백질이 존재하지 않는 것이다(APF). 임의의 구체예에서, 배양 배지에는 외인적으로 동물-유래 프로테아제가 첨가되지 않는다. 임의의 구체예에서, 배양 배지에는 동물 유래 생성물이 첨가되지 않는다. 특정 배지의 제조에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 출원 제11/304,589호(2005년 12월 16일 출원)에 개시되어 있다.
세포는 소규모 예를 들어, 25㎖ 미만의 배지, 배양 튜브 또는 플라스크 내, 또는 교반이 행하여지는 큰 플라스크, 로터가 장착된 병 또는 미세 담체 비드(예를 들어, DEAE-덱스트란 미세 담체 비드 예를 들어, 도마셀(Pfeifer & Langen); 슈퍼비드(Flow Laboratories); 스티렌 공중합체-3중-메틸아민 비드 예를 들어, 힐렉스, 솔로힐(Ann Arbor), 플라스크, 병 또는 반응기 배양액 중에서 배양될 수 있다. 미세 담체 비드는 작은 구(지름 100∼200㎛)로서, 세포 배양액의 일정 부피당 부착성 세포 성장에 큰 표면적을 제공한다. 예를 들어, 배지 1ℓ에는 성장 표면이 8000㎠ 이상인 2천만개 이상의 미세 담체 비드가 포함될 수 있다. 바이러스를 상업용으로서 생산함에 있어서(예를 들어, 백산 생산), 세포를 생물 반응기 또는 발효조 내에서 배양하는 것이 바람직할 수도 있다. 생물 반응기로서는 부피가 1ℓ도 안 되는 것으로부터 100ℓ가 넘는 것에 이르기까지 여러 가지가 있는데, 그 예로서는 사이토 3 생물 반응기(Cyto3 Bioreactor)(Osmonics, Minnetonka, MN); NBS 생물 반응기(New Brunswick Scientific, Edison, N. J.); 실험실용 및 상업용 규모의 생물 반응기(B. Braun Biotech International)(B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)가 있다.
임의의 구체예에서, 배양 부피에 상관없이, 배양액의 온도는 35℃ 이하로 유지시키는 것이 중요하며, 이로써, 어느 정도 냉각-적응된 재조합 및/또는 재분류 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 회수할 수 있게 된다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 세포는 온도 약 32∼35℃, 통상적으로는 온도 약 32∼약 34℃, 일반적으로는 약 33℃에서 배양된다.
통상적으로, 조절기 예를 들어, 자동 온도 조절 장치 또는 세포 배양 시스템의 온도를 감지 및 유지하는 기타 장치를 사용하여, 온도가 바이러스 복제 기간 동안 35℃를 넘지 않도록 만들 수 있다.
스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 SPRT 프로테아제
전술한 프로테아제 이외에도, 본 발명은 SPRT라고 불리는 신규의 박테리아 프로테아제를 제공한다. 이 프로테아제를 암호화하는 유전자는 이하 실시예에 기술된 바와 같이, 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 클로닝된다. SPRT 프로테아제는 전술한 바와 같이, 바이러스를 배양하는데 사용되는 세포 내에서 발현하는데 적당하다.
sprT 유전자의 뉴클레오티드 서열을 도 9(서열 번호 1)에 도시하였으며, SPRT 프로테아제의 아미노산 서열은 도 10(서열 번호 2)에 도시하였다. 상기 sprT 유전자를 암호화하는 천연의 핵산 이외에, 이 sprT 유전자의 핵산 서열에 상동성인 서열을 암호화하는 핵산도 본 발명에 따라서 고려된다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 본 발명은 도 9에 도시한 핵산 서열과 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 또는 약 50% 동일한 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 핵산을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 도 9의 핵산 서열에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 서열과 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 또는 약 50% 동일한 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 도 9에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 혼성화하는 핵산(또는 표 1의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)을 제공한다. 임의의 구체예에서, 상기 핵산은 소정의 혼성화 조건 하에서 도 9에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 혼성화된다. 임의의 구체예에서, 혼성화 조건은 엄중한 혼성화 조건(stringent hybridization condition)이다. 임의의 구체예에서, 혼성화 조건은 매우 엄중한 혼성화 조건(highly stringent hybridization condition)이다.
뿐만 아니라, 본 발명의 핵산은 또한 SPRT 프로테아제를 암호화하는 핵산의 유도체를 포함하기도 한다. 이러한 유도체는 당 업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 유도체는 위치-특이적 돌연 변이 유발법 예를 들어, 핵산을 이루는 1개, 2개, 3개, 5개 또는 10개 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의하여 생산될 수 있다. 대안적으로, 유도체는 랜덤한 돌연 변이 유발법에 의하여 제조될 수 있다. 핵산을 랜덤하게 돌연 변이시키는 하나의 방법은, 0.1mM MnCl2의 존재 및 밸런스를 맞추지 않은 뉴클레오티드 농도 하에서 PCR 반응을 통해 핵산을 증폭시키는 과정을 포함한다. 이러한 조건은 PCR 반응에 사용된 중합 효소의 통합 오류(misincorporation) 비율을 높이므로, 증폭된 핵산을 랜덤하게 돌연 변이시킨다.
임의의 구체예에서, SPRT 프로테아제의 유도체를 암호화하는 유도체 핵산은 본원에 기술된 야생형 효소에 비하여 그 특성이 개선된다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 유도체 핵산은 야생형 효소에 비하여 활성이 더 큰(예를 들어, 비 활성(specific activity)이 더 큰) 유도체 SPRT 프로테아제를 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 유도체 SPRT 프로테아제는 SPRT 프로테아제의 분비를 야생형 프로테아제에 비하여 증가시키는 유도체 분비 신호를 나타낼 수 있다. 몇몇 구체예에서, 유도체 SPRT 프로테아제는 넥ㅅ 프로테아제로부터 프리프로펩티드를 절단하는 정도가 야생형 프로테아제에 비하여 증가한다. 몇몇 구체예에서, 유도체 SPRT 프로테아제는 야생형 프로테아제가 최대 활성을 나타내는 pH와 상이한 pH에서 최대 활성을 나타낸다. 임의의 구체예에서, pH는 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 배양하는데 바람직한 pH이다.
다른 측면에서, 본 발명은 SPRT 폴리펩티드를 제공한다. 임의의 구체예에서, SPRT 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 10의 아미노산 서열과 약 99% 이상, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 60% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 50% 이상 동일하다. 다른 측면에서, 본 발명은 표 1의 아미노산 서열과 약 99% 이상, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 60%, 약 55% 이상, 또는 약 50% 이상 동일한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 SPRT 폴리펩티드 또는 프로테아제의 활성 단편을 제공한다. 임의의 구체예에서, 활성 단편은 프로테아제 활성을 보유하면서, 도 10(또는 표 1)의 아미노산 서열로부터 선택되는, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310 또는 320개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 당업자는 예를 들어, 이 단편을 발현시켜, 통상의 기술을 이용하여 프로테아제 활성에 대해 테스트함으로써 이러한 활성 단편을 통상적으로 동정할 수 있다.
그러므로, 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 2(또는 표 1)의 성숙한 폴리펩티드 또는 이의 상동성 서열을 이루는 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 인공 변이체에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 아미노산 변이로서는, 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 거의 영향을 미치지 않는 삽입이나 보존적 아미노산 치환과 같은 최소한의 특성 변이; 소규모의 결실(통상적으로 1∼약 30개의 아미노산 결실); 소규모의 아미노-말단 또는 카복시-말단 연장 부(예를 들어, 아미노-말단 메티오닌 잔기) 첨가; 소규모의 링커 펩티드(약 20∼25개 이하의 잔기로 이루어진 펩티드) 첨가; 또는 전체 전하량 또는 다른 기능을 변이시킴으로 인한 정제 방법을 촉진하는 소규모의 연장 부 예를 들어, 폴리-히스티딘 부위, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인의 첨가가 있다.
보존적 치환의 예로서는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소루신 및 발린), 방향성 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 소형 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)으로 이루어진 군에 포함되는 것이 있다. 일반적으로 비 활성을 변형시키지 않는 아미노산 치환에 관하여는 당 업계에 공지되어 있고, 이에 관하여는 예를 들어, 문헌[H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York]에 개시되어 있다. 가장 일반적으로 일어나는 변이로서는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly 간의 변이가 있다.
20개의 표준적인 아미노산 이외에, 비-표준적인 아미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린, 6-M-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 알파-메틸 세린)이 야생형 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 대해 치환될 수 있다. 제한된 수의 비-보존적 아미노산, 즉, 유전자 암호에 의하여 암호화되지 않는 아미노산과, 비 천연 아미노산은 아미노산 잔기에 대해 치환될 수 있다. "비 천연 아미노산(unnatural amino acid)"이란, 단백질 합성 후 변형되며/변형되거나 측쇄의 화학 구조가 표준적인 아미노산 측쇄의 화학 구조와 상이한 아미노산이다. 비 천연 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있으며, 시판되고도 있고, 그 예로서는 피페콜산, 티아졸리딘 카복실산, 디하이드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.
대안적으로, 아미노산 변이는 폴리펩티드의 물리 화학적 특성이 변성되는 변이이다. 예를 들어, 아미노산 변이는 폴리펩티드의 열 안정성을 개선시키고, 기질 특이성을 변성시키며, 최적 pH 등을 바꾸기도 한다.
모 폴리펩티드 내에 존재하는 필수 아미노산은 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 위치-배향 돌연 변이 유발법 또는 알라닌-주사 돌연 변이 유발법에 따라서 동정될 수 있다[Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085]. 알라닌-주사 돌연 변이 유발 기술에 있어서, 분자 내 잔기 마다 하나의 알라닌 돌연 변이가 도입되며, 그 결과로 생성된 돌연 변이 분자는 생물학적 활성(예를 들어, 리파제 활성)에 대해 테스트되어, 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 동정할 수 있다. 문헌[Hilton외 다수, 1996, J. Biol. Chem. 271 : 4699-4708]을 참조하시오. 효소 또는 기타 생물학적 상호 작용의 활성 위치는 또한 추정 밀착 위치 아미노산을 돌연 변이시키는 기술과 연계하여, 기술 예를 들어, 핵 자기 공명법, 결정 분석법, 전자 회절법 또는 광 친화성 표지화에 의하여 측정되는 바와 같이, 구조를 물리적으로 분석함으로써 측정될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[de Vos외 다수, 1992, Science 255: 306-312; Smith외 다수, 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver외 다수, 1992, FEBS Lett. 309: 59-64]을 참조하시오. 필수 아미노산의 동일성은 또한 본 발명에 의한 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드들을 사용하여 이들의 동일성을 분석한 결과로부터 추정될 수 있다.
단일 아미노산 치환 또는 다수의 아미노산 치환은 공지의 돌연 변이 유발법, 재조합법 및/또는 셔플링으로 실행된 이후, 관련 스크리닝 방법 예를 들어, 문헌[Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241 : 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625]에 개시된 방법을 실시함으로써 테스트될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 방법으로서는 오류-유발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어, Lowman외 다수, 1991, Biochem. 30: 10832-10837; 미국 특허 제5,223,409호; WO 92/06204) 및 부위-배향 돌연 변이 유발법(Derbyshire외 다수, 1986, Gene 46: 145; Ner외 다수, 1988, DNA 7: 127)을 포함한다.
돌연 변이 유발법/셔플링 방법은 고 처리량, 자동화 스크리닝 방법과 함께 실행되어, 클로닝 및 돌연 변이되어, 숙주 세포에 의하여 발현되는 폴리펩티드의 활성을 검출할 수 있다[Ness외 다수, 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896]. 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연 변이 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수되어, 당 업계의 표준적인 방법을 이용하여 신속하게 서열 결정될 수 있다. 이러한 방법을 통하여, 목적 폴리펩티드 내에 존재하는 각각의 아미노산 잔기의 중요도를 신속하게 파악할 수 있으며, 또한 이 방법은 미지의 구조를 가지는 폴리펩티드에도 사용될 수 있다.
발현 벡터
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 SPRT 프로테아제 또는 기타 프로테아제를 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다(표 1 참조). 일반적으로, 발현 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자이다. 발현 벡터는 적당한 프로모터, 복제 서열, 선별 마커 등을 포함시켜 진핵 생물 또는 원핵 생물 내에서 용이하게 기능을 발휘하도록 만들 수 있으며, 그 결과, 전사 및 mRNA의 번역을 안정적으로 진행시킬 수 있다. 발현 벡터를 포함하는 세포 내에서 발현 벡터를 구성하고 유전자를 발현시키는 기술은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수, 2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 및 Ausubel외 다수, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY]을 참조하시오.
발현 벡터 내에서 유용하게 사용되는 프로모터로서는 메탈로티오닌 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예를 들어, 인간의 즉시-초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터 및 인터페론-반응성 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
발현 벡터는 SPRT 프로테아제가 발현되는 세포와 융화될 수 있는 복제 신호 및 발현 신호를 함유하여야 하다. 적당한 발현 벡터로서는 바이러스 벡터 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스, 플라스미드 벡터, 코스미드 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바이러스 및 플라스미드 벡터는 발현 벡터를 포유동물 세포 내에 형질 감염시키는 수단으로서 바람직하다. 발현 벡터 pcDNA1(Invitrogen, San Diego, CA) 즉, 발현 제어 서열이 CMV 프로모터를 포함하고, 이 세포에 형질 감염되어 내부에서 발현되는 비율이 우수한 벡터를 예로 들 수 있다. 사용될 수 있는 발현 벡터의 추가 예는 이하 실시예에 제공되어 있다.
발현 벡터는 당 업자에게 공지된 임의의 방법에 의하여 세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 방법으로서는 예를 들어, 세포에 의하여 용액으로부터 분자를 직접 흡수하는 방법; 예를 들어, 리포좀 또는 면역리포좀을 이용하여 리포팩션을 통해 능동적으로 흡수하는 방법; 입자-매개 형질 감염법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,272,065호; Goeddel외 다수, eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression-A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook외 다수, 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; 및 Ausubel외 다수, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY]을 참조하시오.
발현 벡터는 또한 전달 구성물의 분리를 단순화하는 정제 부분(purification moiety)을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 폴리히스티딘 부분은 단백질의 아미노 말단부에 통합될 수 있다. 폴리히스티딘 부분은 니켈-킬레이트 크로마토그래피에 의하여, 하나의 단계로써 단백질을 편리하게 분리할 수 있도록 만들어 준다. 임의의 구체예에서, 정제 부분은 정제 후 전달 구성물의 나머지로부터 절단될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 부분은 전달 구성물의 기능성 도메인의 기능을 방해하지 않으므로, 절단해낼 필요는 없다.
핵산 및 단백질의 조작을 위한 부가의 방법
본 발명의 내용 중, 핵산, 예를 들어, 바이러스 핵산, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산 등은 널리 공지된 분자 생물학적 기술에 따라서 조작될 수 있다. 이러한 방법 예를 들어, 증폭법, 클로닝법, 돌연 변이 유발법, 형질 전환법 등에 대한 상세한 절차는 예를 들어, 문헌[Ausubel외 다수 Current Protocols in Molecular Biology (2006년 증보판) John Wiley & Sons, New York ("Ausubel"); Sambrook외 다수 Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001 ("Sambrook"), 및 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger")]에 개시되어 있다.
전술한 참고 문헌 이외에, 예를 들어, 본 발명의 cDNA 프로브를 증폭시키는데 유용한 시험관 내 증폭 기술 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-레플리카제 증폭법, 및 기타 RNA 중합 효소 매개 기술(예를 들어, NASBA)에 대한 절차는 문헌[Mullis외 다수 (1987) 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis외 다수 eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim and Levinson (1990) C&EN 36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81; Kwoh외 다수 (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173; Guatelli외 다수 (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomell외 다수 (1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren외 다수 (1988) Science 241:1077; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer외 다수 (1990) Gene 89:117, 및 Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563]에 개시되어 있다. 본 발명에 있어서, 핵산을 클로닝하는데 유용한 추가의 방법으로서는 미국 특허 제5,426,039호(Wallace외 다수)에 개시된 방법을 포함한다. PCR에 의하여 큰 핵산을 증폭시키는 개선된 방법에 관하여는 문헌[Cheng외 다수 (1994) Nature 369:684] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌에 요약되어 있다.
본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 다양한 고상 기술 예를 들어, 모노뉴클레오티드-계 및/또는 트리뉴클레오티드-계 포스포라미디트 커플링 화학 기술을 활용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 활성화된 단량체 및/또는 삼량체를 연속으로 첨가하여 폴리뉴클레오티드 가닥을 연장시킴으로써 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Caruthers, M.H.외 다수 (1992) Meth Enzvmol 211 :3]을 참조하시오.
원하는 서열을 합성하는 대신에, 본질적으로 다양한 공급원 예를 들어, 더 미들랜드 서티파이드 리에이전트 컴파니(The Midland Certified Reagent Company), 더 그레이트 아메리칸 진 컴파니(The Great American Gene Company), 익스프레스진 인코포레이션(ExpressGen, Inc.), 오페론 테크놀로지스 인코포레이션(Operon Technologies, Inc.) 및 기타 다수의 공급원으로부터 임의의 핵산을 주문하여 구입할 수 있다.
뿐만 아니라, 바이러스 폴리펩티드, 프로테아제 또는 프로-프로테아제 내에 존재하는 선택된 아미노산 잔기들의 치환은 예를 들어, 위치 배향 돌연 변이 유발법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 원하는 표현형 예를 들어, 약독화된 표현형, 냉각 적응성, 온도 감수성, 특정 프로테아제에 의한 절단 특성 등과 기능상 상관된 아미노산 치환이 일어난 바이러스 폴리펩티드는, 특정 돌연 변이를 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스 핵산 분절에 도입함으로써 생산될 수 있다. 위치 배향 돌연 변이 유발법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Ausubel, Sambrook, 및 Berger, 상동]에 개시되어 있다. 위치 배향 돌연 변이 유발법을 수행하는 다양한 키트가 시판중에 있으며, 그 예로서는 카멜레온 위치 배향 돌연 변이 유발 키트(Chameleon Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene, La Jolla)가 있으며, 또한 이는 제조자의 지침에 따라서 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 인플루엔자 A 또는 B 폴리펩티드를 각각 암호화하는 게놈 분절에 도입하거나, 또는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산에 도입하는데 사용될 수 있다.
인플루엔자를 배양함에 있어서 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 용도
세포 배양액 중 인플루엔자 바이러스를 복제하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있다["이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 배양" 섹션 참조(상동)]. 통상적으로, 이러한 방법은 적당한 숙주 세포를 선택된 바이러스 균주로 감염시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 재조합법은 바이러스 게놈을 숙주에 도입하는데 사용된다(예를 들어, "프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 숙주 세포 내 인플루엔자 게놈 벡터" 섹션(상동)의 플라스미드 회수 참조). 상기 자세히 기술한 바와 같이, 외인성 프로테아제는 통상적으로 HA0 단백질을 효율적으로 절단하는 프로테아제를 발현하지 않는 세포용인 세포 배양액 중에 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 생산하도록 배양 배지에 첨가된다[예를 들어, Appleyard외 다수, 1974, J.Gen Virol. 25:351-357; 미국 특허 제5,824,536호; 동 제4,500,513호; 및 특허 공보 WO 96/15232]. 본 발명의 목적 중 하나는 인플루엔자가 복제하도록 이종성 프로테아제를 발현하는 세포를 제공하는 것이며, 특정의 구체예에 있어서는, 세포 배양액 중 바이러스 역가를 증가시키기도록 인플루엔자 감염의 효율을 개선시키는 것이다.
그러므로, 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제 예를 들어, 돼지의 트립신은 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스가 복제될 세포 배양 배지에 첨가되지 않는다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제를 첨가하지 않고 이종성 프로테아제를 발현하는 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가는, 외인성 프로테아제를 첨가하였을 때 이종성 프로테아제를 발현하지 않는 세포 배양액으로부터 얻어지는 역가와 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 기타 구체예에서, 외인성 프로테아제가 존재하지 않을 경우 이종성 프로테아제를 발현하는 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가는, 외인성 프로테아제를 첨가하였을 때 이종성 프로테아제를 발현하지 않는 세포 배양액으로부터 얻어지는 역가 보다 크다. 또 다른 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포 배양액에서는 인플루엔자 바이러스가 상업적으로 합리적인 역가(Log TCID50/㎖ >107)를 나타낼 때까지 증식할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 외인성 프로테아제 예를 들어, 돼지 트립신 또는 SPRT 프로테아제는 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스가 복제될 본 발명의 세포를 포함하는 세포 배양액에 첨가될 수 있다. 이러한 구체예는 예를 들어, 프로테아제를 낮은 수준 예를 들어, 바이러스가 상업적으로 합리적인 역가로 증식하기에 불충분한 수준으로 발현시키는 본 발명의 세포 내에서 바이러스를 배양하는데 유용하다. 이러한 구체예는 또한 본 발명의 세포가 단백 분해 절단에 의해 활성화되는 프로-프로테아제를 발현하는 방법에 있어서 유용하다.
하나의 구체예에서, 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 배양 세포 내에서 생산하는 방법이 제공되는데, 이 경우, 외인성 프로테아제 예를 들어, 트립신은 세포 배양 배지에 첨가되지 않는다. 특정 구체예에서, 네거티브 가닥 RNA 바이러스를, 세포 군집 중 역가(Log10 TCID50/㎖) 약 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상까지 복제시키는 방법이 제공되며, 여기서, 이 세포 배양 배지에는 외인성 프로테아제는 첨가되지 않는다.
임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제가 존재하지 않을 경우, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다.
특정 구체예에서, 외인성 프로테아제가 존재하지 않을 경우, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가 Log10 TCID50/㎖는, 이종성 프로테아제를 발현하지 않으며, 외인성 프로테아제 예를 들어, 트립신이 첨가되지 않은 해당 세포의 배양액 중에서 생산되는 인플루엔자 바이러스의 역가에 비하여 큰데, 즉, 약 0.1 이상, 또는 약 0.2 이상, 또는 약 0.3 이상, 또는 약 0.4 이상, 또는 약 0.5 이상, 또는 약 0.6 이상, 또는 약 0.7 이상, 또는 약 0.8 이상, 또는 약 0.9 이상, 또는 약 1.0 이상, 또는 약 1.2 이상, 또는 약 1.4 이상, 또는 약 1.6 이상, 또는 약 1.8 이상, 또는 약 2.0 이상, 또는 약 2.2 이상, 또는 약 2.4 이상, 또는 약 2.6 이상, 또는 약 2.6 이상, 또는 약 2.8 이상, 또는 약 3.0 이상, 또는 약 3.2 이상, 또는 약 3.4 이상, 또는 약 3.6 이상, 또는 약 3.8 이상, 또는 약 4.0 이상, 또는 약 4.2 이상, 또는 약 4.4 이상, 또는 약 4.6 이상, 또는 약 4.8 이상, 또는 약 5.0 이상이다.
기타 구체예에서, 세포 배양 배지에 첨가되는 프로테아제보다 적은 양의 프로테아제가 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 배양 세포 중에서 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서, 최소량의 외인성 프로테아제 예를 들어, 트립신이 세포 배양 배지에 첨가된다. 특정의 구체예에서, 네거티브 가닥 RNA 바이러스를, 세포 군집 중 역가(Log10 TCID50/㎖) 약 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상까지 복제시키는 방법이 제공되며, 이때, 약 0.1ng/㎖∼약 100㎍/㎖의 외인성 프로테아제가 세포 배양 배지에 첨가된다.
다른 특정 구체예에서, 네거티브 가닥 RNA 바이러스를, 세포 군집 중 역가(Log10 TCID50/㎖) 약 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상까지 복제시키는 방법이 제공되며, 이때, 약 1∼약 5000 mU/㎖의 외인성 프로테아제가 세포 배양 배지에 첨가된다.
또 다른 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는, 외인성 프로테아제가 약 0.1ng/㎖∼약 100㎍/㎖ 첨가되었을 때, 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다. 특정 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는, 외인성 프로테아제가 약 0.1ng/㎖∼약 10㎍/㎖ 첨가되었을 때, 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다. 기타 특정 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는, 외인성 프로테아제가 약 0.1ng/㎖∼약 1.0㎍/㎖ 첨가되었을 때, 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다.
임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는, 외인성 프로테아제가 약 1∼약 5000mU/㎖ 첨가되었을 때, 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다. 특정 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는, 외인성 프로테아제가 약 1∼약 1000mU/㎖ 첨가되었을 때, 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다. 기타 특정 구체예에서, 이종성 프로테아제를 발현하는 세포의 세포 배양액으로부터 얻어지는 인플루엔자 바이러스의 역가(Log10 TCID50/㎖)는, 외인성 프로테아제가 약 1∼약 500mU/㎖ 첨가되었을 때, 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상이다.
임의의 구체예에서, 바이러스의 역가는 세포를 약 2∼약 10일, 또는 임의로 약 3∼약 7일 동안 항온 처리한 후에 얻어진다. 특정 구체예에서, 바이러스 역가는 세포를 2일, 또는 3일, 또는 4일, 또는 5일, 또는 6일, 또는 7일, 또는 8일, 또는 9일, 또는 10일, 또는 12일, 또는 14일 동안 항온 처리한 후에 얻어진다.
임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.1ng/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 세포 배양 배지에 최종 농도 약 0.1ng/㎖이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.5ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 5ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 10ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 50ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 100ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 250ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 500ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 750ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 5㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 10㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 25㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 50㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다.
임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.1ng/㎖∼약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1ng/㎖∼약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 10ng/㎖∼약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 100ng/㎖∼약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1∼약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 10∼약 100㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다.
임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.01ng/㎖∼약 10㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.01ng/㎖∼약 1㎍/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.01∼약 100ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.01∼약 10ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.01∼약 1ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 0.01∼약 0.1ng/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다.
임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1∼5000mU/㎖, 또는 5∼1000mU/㎖, 또는 100∼500mU/㎖가 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 5mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 10mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 25mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 50mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 100mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 250mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 500mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 최종 농도 약 1000mU/㎖ 미만이 되도록 세포 배양 배지에 첨가된다.
통상적으로 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 생산하는데 필요한 양보다 소량으로 프로테아제가 배양 배지에 첨가되는 구체예는 특히 세포 배양액이 프로-프로테아제를 발현하는 때에 유용하다. 외인성 프로테아제를 배양 배지에 첨가하면, 보호형 프로-펩티드를 절단해 내고, 이 프로-프로테아제를 활성 형태로 전환함으로써, 프로-프로테아제를 "프라이밍(priming)"할 수 있다. 이후, 활성화된 프로테아제는 추후 세포에 의하여 발현되는 프로-프로테아제를 절단하여, 이 새로이 생성된 프로-프로테아제를 활성 프로테아제로 전환할 수 있다. 그러므로, 이러한 구체예를 통하여 외인적으로 첨가된 프로테아제 예를 들어, 돼지의 트립신 사용을 상당히 줄일 수 있다.
그러므로, 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 세포 배양액에 1회 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 바이러스가 세포 배양액 중 세포를 감염시키는데 사용되는 시기에 또는 이와 비슷한 시기에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 바이러스가 세포 배양액 중 세포를 감염시키는데 사용되는 날과 동일한 날에 첨가된다. 기타 구체예에서, 외인성 프로테아제는 세포 배양액 중 세포를 감염시키는데 사용되는 바이러스를 첨가하기 전에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 벡터가 바이러스 생산을 위한 세포 배양액 중 세포에 도입되는 시기와 동일한 시기 또는 이와 비슷한 시기에 첨가된다. 임의의 구체예에서, 외인성 프로테아제는 벡터가 바이러스 생산을 위한 세포 배양액 중 세포에 도입되는 날과 동일한 날에 첨가된다. 다른 구체예에서, 외인성 프로테아제는 바이러스 생산을 위한 세포 배양액 중 세포에 도입되는 벡터를 첨가하기 전에 첨가된다.
대안적으로, 임의의 구체예에서, 세포는 프로테아제와 프로-프로테아제를 발현할 수 있다. 이러한 임의의 구체예에서, 프로테아제의 발현은 프로테아제를 일시적으로 발현시킬 수 있는 유도성 프로모터의 제어 하에 존재할 수 있다. 이러한 구체예는 프로테아제가 일시적으로 발현될 수 있도록 만듦으로써, 프로-프로테아제를 활성화시킬 수 있다. 이후, 활성화된 프로-프로테아제는 추후에 발현되는 프로-프로테아제를 계속해서 활성화할 수 있다. 대안적으로, 임의의 구체예에서, 세포는 2개 이상의 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현할 수 있다. 임의의 구체예에서, 2개 이상의 프로-프로테아제는 동일하거나 상이한 조절 시스템 하에서 예를 들어, 구성적 또는 유도적으로 발현될 수 있다. 유도적 발현에 관한 구체예에서, 선택된 유도성 시스템은 유도적으로 발현 가능한 프로테아제 또는 프로-프로테아제 각각에 대해 동일하거나 상이할 수 있다.
임의의 구체예에서, 세포 배양액 중 이종성 프로테아제의 발현을 일시적으로 제어하는 것이 유용하다. 예를 들어, 소정의 시간 예를 들어, 세포 배양액을 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 후 약 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 경과시에 프로테아제 발현을 유도하는 것이 유용할 수 있다. 기타 구체예에서, 프로테아제의 발현은 인플루엔자 바이러스로 세포 배양액을 감염시키기 이전에 유도된다. 또 다른 구체예에서, 프로테아제는 세포 배양액을 인플루엔자 바이러스로 감염시킴과 동시에 유도된다. 또 다른 구체예에서, 프로테아제는 바이러스 생산용 세포 배양액 중 세포에 도입되는 벡터를 첨가하기 이전, 첨가함과 동시 또는 첨가한 후에 유도된다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 이종성 프로테아제는 전술한 바와 같이, 유도성 프로모터의 제어 하에 존재할 수 있거나, 또는 유전자 조절 요소의 제어 하에 존재할 수 있다.
프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 숙주 세포 내 인플루엔자 게놈 벡터
세포 배양액을 살아있는 바이러스로 감염시키는 것을 바탕으로 하는 세포 배양계 방법 이외에, 완전히 감염성인 인플루엔자 바이러스는 재조합 DNA 기술 예를 들어, 플라스미드 회수법(plasmid rescue)을 이용하여 세포 배양액 중에서도 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Neumann외 다수 (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor외 다수 (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73:9679-9682; Hoffmann외 다수 (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113; WO 01/83794; Hoffmann and Webster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81 :2843-2847; Hoffmann외 다수 (2002), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416; 미국 특허 제6,649,372호 및 동 제6,951,754호; 미국 특허 공보 20050003349 및 20050037487; 본원에 참고용으로 인용됨]을 참조하시오.
임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 다수의 벡터를 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하는데, 여기서, 이 벡터들은 각각 인플루엔자 바이러스 게놈의 일부를 암호화한다. 이후, 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포는 바이러스를 성장시킬 수 있는 조건 하에서 배양되고, 이후 인플루엔자 바이러스는 회수된다. 몇몇 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 약독화 바이러스, 냉각 적응성 바이러스 및/또는 온도 감수성 바이러스이다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 벡터-유래 재조합 인플루엔자 바이러스는 약독화, 냉각 적응, 온도 감수성 바이러스일 수 있는데, 예를 들어, 살아있는 약독화 백신 예를 들어, 비강 내 백신 제형으로서 투여되기에 적당한 것이다. 예시적인 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 B/앤 아버/1/66 바이러스 게놈 예를 들어, ca B/앤 아버/1/66 바이러스 게놈의 전부 또는 일부가 통합된 다수의 벡터를 도입함으로써 생산된다.
몇몇 구체예에서, 하나의 인플루엔자 균주의 내부 게놈 분절 6개 이상을 암호화하는 cDNA와, 상이한 인플루엔자 균주의 게놈 분절(예를 들어, HA 및 NA vRNA 분절) 하나 이상을 암호화하는 cDNA를 포함하는 다수의 벡터는 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 도입되어, 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있다. 예를 들어, 약독화, 냉각 적응성 및/또는 온도 감수성 인플루엔자 A 또는 B 균주의 내부 게놈 분절("골격(backbone)") 중 6개 이상 예를 들어, B/앤 아버/1/66 의 ca, att, ts 균주는, 다른 바이러스 균주로부터 유래하는 면역원성 항원을 암호화하는 하나 이상의 분절과 함께, 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 도입될 수 있다. 통상적으로, 면역원성 표면 항원은 헤마글루티닌(HA) 및/또는 뉴라미니다제(NA) 항원 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 면역원성 표면 항원을 암호화하는 단일 분절이 도입되는 구체예에 있어서, 선택된 바이러스의 7개의 상보성 분절은 또한 숙주 세포로 도입된다.
몇몇 구체예에서, 하나의 인플루엔자 균주의 1∼7개의 내부 분절을 암호화하는 cDNA와, 상이한 인플루엔자 균주의 1∼7개의 게놈 분절(예를 들어, HA 및 NA vRNA 분절)을 암호화하는 cDNA를 포함하는 다수의 벡터는 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 도입되어, 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있다.
임의의 구체예에서, 인플루엔자 vRNA를 암호화하는 발현 벡터는 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 전기 천공법에 의하여 공동 형질 감염된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 리포좀 형질 감염 시약의 존재 하에서 세포로 형질 감염되거나 또는 인산칼슘 침전법에 의하여, 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 플라스미드이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 상기 바이러스의 각 게놈 RNA 분절 또는 상응하는 암호화 RNA를 발현하기 위한 개별 발현 벡터를 포함한다.
임의의 구체예에서, 각각의 인플루엔자 바이러스 vRNA를 암호화하는 다수의 플라스미드 벡터는 숙주 세포 군집에 도입된다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 8개의 플라스미드(각 플라스미드는 상이한 vRNA 분절을 암호화함)는 숙주 세포로 완전 인플루엔자 게놈을 도입시키는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 플라스미드 벡터는 또한 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화하기도 한다. 대안적으로, 소형 게놈 내부 서열이 통합되어 있는 다수의 플라스미드를 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 인플루엔자의 8개의 게놈 분절 각각에 상응하는 바이러스 게놈 RNA는 인플루엔자 바이러스의 조작 및 생산을 위한 재조합 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터 예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드, 파지 및 인공 염색체를 본 발명에서 사용할 수 있다. 통상적으로, 조작의 용이성을 위하여, 바이러스 게놈 분절은, 박테리아와 진핵 생물 세포 내에서 작용하는 하나 이상의 복제 기원과, 임의로는 플라스미드 서열이 통합되어 있는 세포를 스크리닝 또는 선별하는데 편리한 마커를 제공하는 플라스미드 벡터 내에 삽입된다. 이후, 이와 같은 벡터는 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 세포에 도입되어 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 세포에, 각 인플루엔자 게놈 RNA를 암호화하는 하나 이상의 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 RNA polI 프로모터를 포함하는 다수의 발현 벡터와, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드(PB2, PB1, PA, HA, NP, MA, M1, M2 및 NS2)를 암호화하는 바이러스 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를도입하는 단계; 및 이 세포로부터 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 분리 즉, 수집하는 단계를 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 vRNA 분절 또는 이와 상응하는 cRNA, 그리고 인플루엔자 바이러스 단백질 구체적으로, PB1, PB2, PA 및 NA를 발현하는 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 숙주 세포 내에서 감염성인 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 구체예에 따르면, 조력 바이러스(helper virus)는 상기 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하도록 포함될 수 있거나 또는 포함될 수 없다.
본 발명은 본 발명의 배양 세포 내에서 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 세포 게놈 vRNA를 발현하여 이 바이러스의 완전한 게놈 vRNA를 제공할 수 있고, 또한 이 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수도 있는 발현 벡터 세트를 상기 세포 군집에 도입하는 단계; (b) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼17개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼3개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 전기 천공법에 의해 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절과, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 제2의 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2의 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구체예에서, 조력 바이러스가 본 방법에 사용된다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용된 배양 세포는 개의 세포이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 배양 세포 중에서 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 재조합 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 상기 세포 내에서 게놈 vRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를 상기 세포 군집에 도입하여 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA를 제공하는 단계; (b) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 상기 세포에 도입하는 단계; 그리고 (c) 상기 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트, 제2 세트, 또는 제1 및 제2 세트 둘 다는 전기 천공법에 의하여 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 본 발명의 핵산을 포함한다. 하나의 구체예에서, 조력 바이러스가 본 방법에 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 배양 세포 내에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 재조합 바이러스 입자 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 상기 세포의 군집에, 이 세포 내에서 게놈 vRNA 분절을 발현할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를 도입하여, 이 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공하는 단계; (b) 상기 세포에, 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 도입하는 단계; 및 (c) 상기 세포를 배양하여 이 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 재조합 바이러스는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트, 제2 세트, 또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다는 전기 천공법에 의하여 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 인플루엔자 폴리펩티드 중 하나 이상 또는 전부의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구체예에서, 조력 바이러스가 본 방법에 사용된다.
본 발명은 추가로 본 발명의 배양 세포 내에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 재조합 바이러스 입자 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현하여 이 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공할 수 있고, 또한 이 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수도 있는 발현 벡터 세트를 상기 세포의 군집에 도입하는 단계; (b) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼17개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼3개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 전기 천공법에 의해 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절과, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 본 발명의 핵산을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구체예에서, 조력 바이러스가 본 방법에 사용된다.
플라스미드 발현 벡터는 삽입된 바이러스 게놈 분절의 전사를 양 방향 중 어느 한 방향으로 개시할 수 있는(즉, (+) 가닥 및 (-) 가닥 바이러스 RNA 분자를 생성할 수 있는) 2 방향성 발현 벡터일 수 있다. 2 방향성 전사를 수행하기 위하여, 바이러스 게놈 분절 각각을 2개 이상의 독립 프로모터를 가지는 벡터에 삽입할 수 있으며, 바이러스 게놈 RNA 복사체들은 제1 RNA 중합 효소 프로모터(예를 들어, RNA polI 프로모터)에 의해 하나의 가닥으로부터 전사되고, 바이러스 mRNA는 제2 RNA 중합 효소 프로모터(예를 들어, RNA PolII 프로모터, 또는 세포 내에서 RNA polII 에 의한 전사를 개시할 수 있는 기타 프로모터)로부터 합성된다. 그러므로, 2개의 프로모터는 바이러스 게놈 RNA 분절의 삽입에 적당한, 하나 이상의 클로닝 위치(즉, 제한 효소 인지 서열), 바람직하게는 독특한 클로닝 위치에 측접하고 있으면서, 반대 방향으로 정렬될 수 있다. 대안적으로, (+) 가닥 mRNA와 (-) 가닥 바이러스 RNA(cRNA)가 벡터의 동일한 가닥으로부터 전사되는 "앰비센스" 벡터가 사용될 수 있다.
각각의 발현된 vRNA 또는 cRNA의 올바른 3' 말단을 확보하기 위하여, 각각의 vRNA 또는 cRNA 발현 벡터는 리보자임 서열 또는 RNA 암호화 서열의 적당한 종결 인자 서열 하류를 통합할 수 있다. 이는 예를 들어, 간염 델타 바이러스 게놈 리보자임 서열 또는 이의 기능성 유도체, 또는 쥣과 동물의 rDNA 종결 인자 서열(Genbank 등록 번호 M12074)일 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, PolI 종결 인자를 사용할 수 있다[Neumann외 다수, 1994, Virology 202:477-479]. RNA 발현 벡터는 vRNA 발현 벡터와 동일한 방식으로 구성될 수 있다[Pleschka외 다수, 1996, J. Virol. 70:4188-4192; Hoffmann and Webster, 2000, J. Gen Virol. 81 :2843-2847; Hoffmann외 다수, 2002, Vaccine 20:3165-3170; Fodor외 다수, 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Neumann외 다수, 1999, P.N.A.S.USA 96:9345-9350; 및 Hoffmann외 다수, 2000, Virology 267:310-317; 미국 특허 제6,649,372호 및 동 제6,951,754호; 미국 특허 공보 20050003349 및 20050037487; 상기 각 문헌은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨].
기타 시스템에 있어서, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사된 바이러스 서열은 상이한 벡터로부터 전사될 수 있다. 이러한 구체예에서, polI 프로모터의 제어를 받는 바이러스 게놈 분절 각각을 암호화하는 벡터와, polII 프로모터의 제어를 받으며, 최소한의 PA, PB1, PB2 및 NP를 암호화하는 벡터를 사용할 수 있다.
어느 하나의 경우, polII 프로모터와 관련하여, 발현될 인플루엔자 바이러스 게놈 분절은 적당한 전사 제어 서열(프로모터)에 작동 가능하도록 결합하여 mRNA 합성을 유도할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 게놈 분절의 전사를 조절하기 위해서 발현 벡터에 사용하기 적당한 프로모터가 다수 존재한다. 임의의 구체예에서, 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus)(CMV) DNA 의존성 RNA 중합효소 II(PolII) 프로모터가 사용된다. 원한다면, 예를 들어, 조건부 발현을 조절하기 위해서, 특정 조건 하에서, 또는 특정 조직 또는 세포 내에서 RNA 전사를 유도하는 기타 프로모터를 대신 사용할 수 있다. 다수의 바이러스 및 포유동물 프로모터 예를 들어, 인간 프로모터를 사용할 수 있거나, 또는 이러한 프로모터는 특정 용도에 따라서 분리될 수 있다. 예를 들어, 동물 및 인간 바이러스의 게놈으로부터 얻어진 대안적인 프로모터로서는 아데노바이러스(adenovirus)(예를 들어, 아데노바이러스 2), 파필로마 바이러스(papilloma virus), B형 간염 바이러스 및 폴리오마 바이러스(polyoma virus)의 프로모터와, 다양한 레트로바이러스 프로모터를 포함한다. 포유동물 프로모터로서는 액틴 프로모터, 면역 글로불린 프로모터 및 열 충격 프로모터 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 조절 서열은 인간 아데노바이러스 2의 스플라이싱된 3원성 리더 서열에 결합되어 있는, 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터를 포함한다[Berg외 다수, Bio Techniques 14:972-978]. 뿐만 아니라, 박테리오파지 프로모터 예를 들어, T7 프로모터는 동계 RNA 중합 효소와 함께 사용될 수 있다.
바이러스 단백질, 구체적으로, RNP 복합체 형성용 바이러스 단백질을 발현하는데 사용되는 발현 벡터는 원하는 바이러스에 상동성인 바이러스 단백질을 발현하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 발현 벡터에 의한 바이러스 단백질의 발현은 당 업자에게 공지된 임의의 조절 서열에 의하여 조절될 수 있다. 조절 서열은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다.
단백질 발현 벡터 내에서 바이러스 단백질의 발현을 제어하는데 사용될 수 있는 프로모터의 다른 예로서는, SV40 초기 프로모터 부위(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 루 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복부에 포함된 프로모터(Yamoto외 다수, 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner외 다수, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster외 다수, 1982, Nature 296:39-42); 원핵 생물 발현 벡터용 프로모터 예를 들어, β-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff외 다수, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), 또는 tac 프로모터(DeBoer외 다수, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25; 및 "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94); 노팔린 합성 효소 프로모터 부위를 포함하는 식물 발현 벡터용 프로모터(Herrera-Estrella외 다수, Nature 303:209-213) 또는 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner외 다수, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), 및 광합성 효소인 리불로스 비스포스페이트 카복실라제의 프로모터(Herrera-Estrella외 다수, 1984, Nature 310:115-120); 효모 또는 기타 진균으로부터 유래하는 프로모터 요소 예를 들어, Gal4 프로모터, ADC(알콜 탈수소 효소) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스게닉 동물에서 사용되는, 다음과 같은 동물 전사 제어 부위: 췌장 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 부위(Swift외 다수, 1984, Cell 38:639-646; Omitz외 다수, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; McDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포 내에서 활성인 인슐린 유전자 제어 부위(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프 세포 내에서 활성인 면역 글로불린 유전자 제어 부위(Grosschedl외 다수, 1984, Cell 38:647-658; Adames외 다수, 1985, Nature 318:533-538; Alexander외 다수, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프 세포 및 비만 세포 내에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 제어 부위(Leder외 다수, 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 부위(Pinkert외 다수, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-태아 단백질 유전자 제어 부위(Krumlauf외 다수, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer외 다수, 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항 트립신 유전자 제어 부위(Kelsey외 다수, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 미엘린 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 부위(Mogram외 다수, 1985, Nature 315:338-340; Kollias외 다수, 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희돌기 세포(ligodendrocyte cell)에서 활성인 미엘린 구성 단백질 유전자 제어 부위(Readhead외 다수, 1987, Cell 48:703-712), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 부위(Sani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상 하부에서 활성인 성선 자극 방출 호르몬 유전자 제어 부위(Mason외 다수, 1986, Science 234:1372-1378)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 단백질 발현 벡터는 핵산 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 프로모터, 하나 이상의 복제 기원, 및 임의로는 하나 이상의 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 포함한다. 다른 구체예에서, 2 시스트론성 mRNA를 생산할 수 있는 단백질 발현 벡터는 2 시스트론성 mRNA 서열을 삽입함으로써 생산될 수 있다. 임의의 내부 리보좀 도입 위치(IRES) 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 IRES 요소로서는 포유동물 BiP IRES 및 C형 간염 바이러스 IRES를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자가 삽입된 발현 벡터는 예를 들어, 다음과 같은 3가지의 일반적인 접근 방법에 의하여 동정될 수 있다: (a) 핵산 혼성화; (b) "마커" 유전자 기능의 유무; 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 첫 번째 접근 방법에 있어서, 발현 벡터(들) 내에 삽입된 바이러스 유전자의 존재 여부는 삽입된 유전자(들)와 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 이용한 핵산 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 두 번째 접근 방법에 있어서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터(들) 내에 유전자(들)를 삽입함으로 인하여 유도되는 임의의 "마커" 유전자의 기능(예를 들어, 항생제 내성 또는 형질 전환 표현형)의 존부에 따라서 동정 및 선별될 수 있다. 세 번째 접근 방법에 있어서, 발현 벡터는 발현된 유전자 산물을 검정함으로써 동정될 수 있다. 이러한 검정법은 예를 들어, 시험관 내 검정 시스템에서의 바이러스 단백질의 물리적 특성 또는 기능상 특성 예를 들어, 항체와 바이러스 단백질의 결합 특성을 바탕으로 할 수 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 RNP 복합체의 형성에 필요한 바이러스 단백질을 암호화 및 발현한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 바이러스 입자를 형성하는데 필요한 바이러스 단백질을 암호화 및 발현한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 특정 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 바이러스 단백질 모두를 암호화 및 발현한다.
전사는 임의로는 인핸서 서열을 포함시킴으로써 강화될 수 있다. 인핸서는 통상적으로 그 길이가 짧으며(예를 들어, 10∼500 bp), 프로모터와 함께 전사를 증가시키는 역할을 하는 시스-작용성(cis-acting) DNA 요소이다. 다수의 인핸서 서열이 포유동물 유전자(헤모글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아 단백질 및 인슐린) 및 진핵 생물 세포 바이러스로부터 분리되었다. 인핸서는 스플라이싱되어 벡터 내 5' 또는 3' 위치에서 이종성 암호화 서열이 있는 위치까지 클로닝될 수 있지만, 통상적으로는 5' 위치에서 프로모터가 있는 위치까지 삽입된다. 통상적으로 프로모터, 원한다면 부가의 전사 강화 서열은 이종성 DNA가 도입될 숙주 세포 유형에서의 발현을 최적화하는 것으로 선택된다[Scharf외 다수(1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler외 다수(1990) Assembly of enhancers, promoters and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185:512-27]. 임의로, 앰플리콘은 또한 번역 개시에 필요한 리보좀 결합 위치 또는 내부 리보좀 도입 위치(IRES)를 함유할 수도 있다.
벡터는 또한 전사 종결 서열과 mRNA 안정화 서열 예를 들어, 폴리아데닐화 위치 또는 종결 인자 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 말단, 경우에 따라서는 3' 말단의 비번역 부위로부터 얻을 수 있다. 몇몇 구체예에서, SV40 폴리아데닐화 서열은 폴리아데닐화 신호를 제공한다.
또한, 전술한 바와 같이, 발현 벡터는 전술한 유전자들 이외에도, 임의로는 하나 이상의 선별 마커 유전자를 포함하므로, 형질 전환된 숙주 세포 선별을 위한 표현형적 특징을 제공하며, 마커 예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원 효소 또는 네오마이신 내성 유전자는 진핵 생물 세포 배양액에서 선별용으로서 적당하다.
전술한 바와 같이 적당한 DNA 서열 및 적당한 프로모터 또는 제어 서열을 함유하는 벡터는 숙주 세포를 형질 전환하여 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 박테리아 세포 내에서 복제될 수 있지만, 일반적으로는 이 벡터를 포유 동물 세포 예를 들어, Vero 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293 세포, COS 세포에 도입하여 발현시키는 것이 바람직할 것이다. 특정 구체예에서, MDCK 세포는 발현용으로서 사용된다.
본 발명의 발현 벡터는 하나 이상의 돌연 변이가 발생한 게놈 vRNA 또는 상응하는 cRNA를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 돌연 변이는 바이러스를 약독화시킬 수 있다. 예를 들어, vRNA 분절은 팬-핸들 이중체(pan-handle duplex) 프로모터 부위 내에 존재하는 약화 염기쌍 치환(attenuated base pair substitution), 구체적으로, 예를 들어, NA-특이적 vRNA의 이중체 부위 내 11∼12번 위치에서 일어나는 C→A로의 치환 및 G→U로의 치환과 같은 공지의 약화 염기쌍 치환을 가지는 인플루엔자 A 바이러스의 vRNA 분절일 수 있다[Fodor외 다수, 1998, J. Virol. 6923-6290]. 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는 본 발명의 방법을 사용함으로써, 신규의 약화 돌연 변이를 확인할 수 있다.
또한, 문헌[미국 특허 제6,951,754호, 동 제6,887,699호, 동 제6,649,372호, 동 제6,544,785호, 동 제6,001,634호, 동 제5,854,037호, 동 제5,824,536호, 동 제5,840,520호, 동 제5,820,871호, 동 제5,786,199호, 동 제5,166,057호 및 미국 특허 출원 공보 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814, 및 20020164770]에 개시된 바와 같은 발현 벡터 중 임의의 벡터도 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 게놈과 이종성인 서열을 발현시키는 키메라 바이러스를 생산하는데 사용될 수도 있다. vRNA 또는 상응하는 cRNA를 발현시키는 발현 벡터는 바이러스 단백질을 발현시키는 발현 벡터와 함께 숙주 세포 내에 도입되어, 신규의 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스 또는 키메라 바이러스를 생산할 수 있다. 이러한 바이러스에 조작되어 들어갈 수 있는 이종성 서열로서는 안티센스 핵산 및 리보자임과 같은 핵산을 포함한다. 대안적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 이종성 서열은 이러한 바이러스에 조작되어 들어갈 수 있다. 다음과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 이종성 서열은 이와 같은 바이러스에 조작되어 들어갈 수 있다: 1) 병원성의 특징을 이루는 항원; 2) 자가 면역성 질환의 특징을 이루는 항원; 3) 알레르기원인 항원; 및 4) 종양의 특징을 이루는 항원. 예를 들어, 본 발명의 키메라 바이러스 내에 조작되어 들어갈 수 있는 이종성 유전자 서열로서는 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV)의 에피토프 예를 들어, gp160; B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg); 헤르페스 바이러스의 당 단백질(예를 들어, gD, gE); 폴리오바이러스의 VP1; 및 비 바이러스성 병원체 예를 들어, (소수의 경우이긴 하지만) 박테리아 및 기생체의 항원 결정기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 방법은 감염성 바이러스 입자의 회수 효율을 개선시키기 위하여, 당 업자에게 공지된 방법의 측면들을 통합하여 수정될 수 있다. 예를 들어, 역 유전학 기술(reverse genetics technique)은, 네거티브 가닥 바이러스 RNA의 비-암호화 부위(바이러스 중합 효소에 의한 인지와 성숙한 비리온을 생산하는데 필요한 패키징 신호에 필수적인 부위)를 함유하는 합성 재조합 바이러스 RNA를 제조하는 단계를 포함한다. 재조합 RNA는 재조합 DNA 주형으로부터 합성되어, 정제된 바이러스 중합 효소 복합체와 함께 시험관 내에서 재구성되며, 그 결과 세포를 형질 감염시키는데 사용될 수 있는 재조합 리보 핵산 단백질(RNP)을 형성하게 된다. 만일, 바이러스 중합 효소 단백질이 시험관 내 또는 생체 내에서 합성 RNA가 전사될 때 존재하면, 형질 감염은 더욱 효율적으로 이루어진다. 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자 내부로 회수될 수 있다. 전술한 기술에 관하여는 문헌[미국 특허 제5,166,057호(1992년 11월 24일); 미국 특허 제5,854,037호(1998년 12월 29일); 미국 특허 제5,789,229호(1998년 8월 4일); 유럽 특허 공보 EP 0702085A1(1996년 2월 20일자 발행); 미국 특허 출원 제09/152,845호; 국제 특허 공보 PCR WO97/12032(1997년 4월 3일); WO 96/34625(1996년 11월 7일); 유럽 특허 공보 EP-A780475; WO 99/02657(1999년 1월 21일); WO 98/53078(1998년 11월 26일); WO 98/02530(1998년 1월 22일); WO 99/15672(1999년 4월 1일); WO 98/13501(1998년 4월 2일); WO 97/06720(1997년 2월 20일); 및 EPO 780 47SA1(1997년 1월 25일); 상기 각각의 문헌은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 개시되어 있다.
인플루엔자 게놈 분절을 포함하는 벡터는 이종성 핵산을 진핵 생물 세포에 도입시키기 위한 방법으로서 당 업계에 널리 공지된 방법 예를 들어, 인산 칼슘 공동 침전법, 전기 천공법, 미세 주입법, 리포팩션 및 폴리아민 형질 감염 시약을 사용하는 형질 감염법에 따라서, 본 발명의 숙주 세포에 도입(예를 들어, 형질 감염)될 수 있다. 예를 들어, 벡터 예를 들어, 플라스미드는 제조자의 지침에 따라서 폴리아민 형질 감염 시약인 트랜스IT-LT1(TransIT-LT1; Mirus)을 사용하여, 숙주 세포 예를 들어, COS 세포, 293T 세포, MDCK 세포, 또는 COS 또는 293T 세포와 MDCK 세포의 혼합물에 형질 감염될 수 있다. 숙주 세포 군집에 도입될 각각의 벡터 약 1㎍은 160㎕의 배지(예를 들어, 무 혈청 배지) 중에 희석된 트랜스IT-LT1 약 2㎕와 합하여져, 총 부피 200㎕가 될 수 있다. DNA:형질 감염 시약의 혼합물을 45분 동안 실온에서 항온 처리한 다음, 여기에 800㎕의 배지를 첨가한다. 이후, 형질 감염 혼합물을 숙주 세포에 첨가하고, 이 세포를 전술한 바와 같이 배양한다. 그러므로, 세포 배양액 중에서 재조합 또는 재분류 바이러스를 생산하기 위해서는, 8개의 게놈 분절(PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA 및 NA) 각각이 통합되어 있는 벡터를 약 20㎕의 트랜스IT-LT1과 혼합한 후, 이를 숙주 세포에 형질 감염시켜야 한다. 임의로, 형질 감염시키기 이전에 혈청-함유 배지는 무 혈청 배지 예를 들어, Opti-MEM I으로 교환하고, 이를 다시 4∼6일 동안 항온 처리한다.
대안적으로, 전기 천공법을 사용하여 인플루엔자 게놈 분절이 통합되어 있는 벡터를 본 발명의 숙주 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스가 통합되어 있는 플라스미드 벡터는, 다음과 같은 방법에 따라서 전기 천공법을 이용하여 바람직하게는 Vero 세포에 도입된다. 요약하면, 예를 들어, 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 개질 이글 배지(MEM) 중에서 생육한 5×106개의 Vero 세포를 0.4㎖의 OptiMEM 중에 재현탁하고, 이를 전기 천공 큐벳에 넣는다. 20㎍(총 부피 25㎕ 이하)의 DNA를 큐벳 내 세포에 첨가한 후, 이를 가볍게 두드려주어 조심스럽게 혼합한다. 제조자의 지침에 따라서 300 볼트, 950 마이크로패러드에서 시간 상수 28∼33msec로 전기 천공법을 실시한다[예를 들어, BioRad Gene Pulser II, Capacitance Extender Plus 연결]. 전기 천공법을 실시하고 나서 약 1∼2분 후 가볍게 두드려주어 세포를 다시 혼합하고, 이 큐벳에 0.7㎖의 MEM과 10% FBS를 직접 첨가한다. 이후, 세포를 표준 6-웰 조직 배양 접시[2㎖ MEM, 10% FBS 또는 OptiMEM 함유, 혈청은 함유하지 않음]의 2개의 웰에 옮겨 담는다. 이 큐벳을 세척하여 나머지 세포를 회수하고, 세척 현탁액을 2개의 웰에 나누어 담는다. 최종 부피는 약 3.5㎖가 되도록 한다. 이후, 세포를 바이러스가 생육할 수 있는 조건 예를 들어, 약 33℃의 온도(냉각 적응 균주)하에서 항온 처리한다.
세포 배양액으로부터 바이러스 회수
바이러스는 통상적으로 감염된(형질 감염된) 세포가 생육한 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 통상적으로, 미정제 배지는 인플루엔자 바이러스를 농축하기 전에는 투명하다. 일반적으로 사용되는 방법으로서는 여과법, 한외 여과법, 황산 바륨 상에의 흡착법 및 용리법, 그리고 원심 분리법을 포함한다. 예를 들어, 감염된 배양액으로부터 유래하는 미정제 배지는 처음에 예를 들어, 1000∼2000×g에서, 세포 파편 및 기타 큰 입자형 물질을 제거하는데 충분한 시간 예를 들어, 10∼30분 동안 원심 분리를 수행함으로써 투명해질 수 있다. 대안적으로, 배지를 0.8㎛의 아세트산셀룰로스 필터를 통과시켜 여과하면, 그 결과, 원 상태의 세포 및 기타 큰 입자형 물질이 제거된다. 임의로는, 투명한 배지 상청액을 원심 분리(예를 들어, 15,000×g, 약 3∼5 시간)하여 인플루엔자 바이러스를 펠릿으로 만들기도 한다. 적당한 완충액 예를 들어, STE(0.01M Tris-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 인산염 완충 염수(PBS, pH7.4) 중에 바이러스 펠릿을 재현탁시킨 후, 바이러스는 수크로스(60∼12%) 또는 타르타르산칼륨(50∼10%) 상에서 밀도 구배 원심 분리함으로써 농축된다. 연속적 또는 단계적 구배 예를 들어, 수크로스 구배 12∼60%(12%씩 4단계)인 경우가 적당하다. 구배물을 바이러스가 회수되었음을 입증하는 밴드로 농축되기에 충분한 속도 및 시간에서 원심 분리한다. 대안적으로, 그리고, 대부분의 거대 규모 상업용으로서, 바이러스는 연속적 방식으로 작동하는 대역별-원심 분리 로터(zonal-centrifuge rotor)를 사용하여 밀도 구배법을 통해 분배된다. 당 업자가 조직 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 제조할 수 있도록 안내하기에 충분한 부연 설명은 예를 들어, 문헌[Furminger. Vaccine Production, Nicholson외 다수 (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten외 다수 (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151, 및 미국 특허 제5,690,937호]에 개시되어 있다. 원한다면, 회수된 바이러스는 수크로스-인산염-글루타메이트(SPG)(안정화제)의 존재 하에서 -80℃의 온도에 보관될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 잠재적인 발암 유전자를 없애기 위한 제제 예를 들어, 벤조나제로 처리된 본 발명의 세포 내에서 복제된 바이러스(또는 이의 일부)를 포함하는 조성물을 제공한다. 그러므로, 무-발암 유전자 백신 조성물은 특히, 본 발명의 구체예에 포함된다.
기타 바이러스
전술한 바와 같은 인플루엔자 바이러스 이외에, 본 발명의 세포 및 방법은 또한 기타 바이러스를 배양하는데 사용될 수 있다. 임의의 구체예에서, 하나 이상의 바이러스 폴리펩티드는 바이러스의 생활 주기 중 특정 시점에서 숙주 세포 프로테아제에 의해 단백 분해 절단된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 방법을 이용하면 바이러스의 수율, 바이러스의 감염성을 증가시킬 것이며, 또한 당 업자에게 공지된 바이러스의 원하는 기타 생물학적 특성을 개선할 수도 있을 것이다.
그러므로, 임의의 구체예에서, 배양된 바이러스는 DNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 네거티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 이중 가닥 RNA 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 역전사 바이러스이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 코도비랄레스(Caudovirales), 모노네가비랄레스(Mononegavirales) 및 니도비랄레스(Nidovirales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 목에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 마이오비리대(Myoviridae), 시포비리대(Siphoviridae), 포도비리대(Podoviridae), 루디비리대(Rudiviridae), 텍티비리대(Tectiviridae), 코르티코비리대(Corticoviridae), 리포트릭스비리대(Lipothrixviridae), 플라스마비리대(Plasmaviridae), 푸셀로비리대(Fuselloviridae), 피코드나비리대(Phycodnaviridae), 구타비리대(Guttaviridae), 폭스비리대(Poxviridae), 코르도폭스비리내(Chordopoxvirinae), 엔토모폭스비리내(Entomopoxvirinae), 이리도비리대(Iridoviridae), 폴리드나비리대(Polydnaviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae), 알파헤르페스비리내(Alphaherpesvirinae), 베타헤르페스비리내(Betaherpesvirinae), 감마헤르페스비리내(Gammaherpesvirinae), 폴리오마비리대(Polyomaviridae), 파필로마비리대(Papillomaviridae), 아데노비리대(Adenoviridae), 아스코비리대(Ascoviridae), 바큘로비리대(Baculoviridae), 니마비리대(Nimaviridae) 및 아스파르비리대(Asfarviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 T4-유사 바이러스, P1-유사 바이러스, P2-유사 바이러스, Mu-유사 바이러스, SP01-유사 바이러스, ΦH-유사 바이러스, λ-유사 바이러스, T1-유사 바이러스, T5-유사 바이러스, c2-유사 바이러스, L5-유사 바이러스, ψM1-유사 바이러스, T7-유사 바이러스, φ29-유사 바이러스, P22-유사 바이러스, 루디바이러스(Rudivirus), 텍티바이러스(Tectivirus), 코르티코바이러스(Corticovirus), 알파리포트릭스바이러스(Alphalipothrixvirus), 베타리포트릭스바이러스(Betalipothrixvirus), 감마리포트릭스바이러스(Gammalipothrixvirus), 플라스마바이러스(Plasmavirus), 푸셀로바이러스(Fusellovirus), 클로로바이러스(Chlorovirus), 프라시노바이러스(Prasinovirus), 프림네시오바이러스(Prymnesiovirus), 파에오바이러스(Phaeovirus), 라피도바이러스(Raphidovirus), 코코리토바이러스(Coccolithovirus), 구타바이러스(Guttavirus), 오르소폭스바이러스(Orthopoxvirus), 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), 아비폭스바이러스(Avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(Capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus), 수이폭스바이러스(Suipoxvirus), 몰러시폭스바이러스(Molluscipoxvirus), 야타폭스바이러스(Yatapoxvirus), 알파엔토모폭스바이러스(Alphaentomopoxvirus), 베타엔토모폭스바이러스(Betaentomopoxvirus), 감마엔토모폭스바이러스(Gammaentomopoxvirus), 이리도바이러스(Iridovirus), 클로리리도바이러스(Chloriridovirus), 라나바이러스(Ranavirus), 림포시스티바이러스(Lymphocystivirus), 이크노바이러스(Ichnovirus), 브라코바이러스(Bracovirus), 익타루리바이러스(Ictalurivirus), 심플렉스바이러스(Simplexvirus), 바리셀로바이러스(Varicellovirus), 마르디바이러스(Mardivirus), 일토바이러스(Iltovirus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 뮤로메갈로바이러스(Muromegalovirus), 로제올로바이러스(Roseolovirus), 림포크립토바이러스(Lymphocryptovirus), 래디노바이러스(Rhadinovirus), 폴리오마바이러스(Polyomavirus), 파필로마바이러스(Papillomavirus), 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 아비아데노바이러스(Aviadenovirus), 아타데노바이러스(Atadenovirus), 시아데노바이러스(Siadenovirus), 아스코바이러스(Ascovirus), 미미바이러스(Mimivirus), 뉴클레오폴리헤드로바이러스(Nucleopolyhedrovirus), 그래뉼로바이러스(Granulovirus), 위스포바이러스(Whispovirus), 아스피바이러스(Asfivirus) 및 리지디오바이러스(Rhizidiovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 엔테로박테리아(Enterobacteria) 파지 T4, 엔테로박테리아 파지 P1, 엔테로박테리아 파지 P2, 엔테로박테리아 파지 Mu, 바실러스(Bacillus) 파지 SP01, 할로박테리아 바이러스(Halobacteria virus) ΦH, 엔테로박테리아 파지 λ, 엔테로박테리아 파지 T1, 엔테로박테리아 파지 T5, 락토코커스(Lactococcus) 파지 c2, 마이코박테리아 파지 L5, 메타노박테리아(Methanobacteria) ψM1, 엔테로박테리아 파지 T7, 바실러스 파지 φ29, 엔테로박테리아 파지 P22, 설포로버스(Sulfolobus) 바이러스 SIRV1, 엔테로박테리아 파지PRD1, 알테로모나스(Alteromonas) 파지 PM2, 서모프로테우스(Thermoproteus) 바이러스 1, 설포로버스 아일랜디쿠스(Sulfolobus islandicus) 사상 바이러스, 아시디아누스(Acidianus) 사상 바이러스 1, 아콜레플라스마(Acholeplasma) 파지 L2, 설포로버스 바이러스 SSV1, 파라메슘 버사리아 클로렐라(Paramecium bursaria Chlorella) 바이러스 1, 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla) 바이러스 SP'1, 크라이소크로뮬리나 브레비필룸(Chrysochromulina brevifilum) 바이러스 PW1, 엑토카르푸스 실리큘로시스(Ectocarpus siliculosis) 바이러스 1, 헤테로시그마 아카시워(Heterosigma akashiwo) 바이러스 01, 에밀리아나 헉슬리(Emiliania huxleyi) 바이러스 86, 설포로버스 네오지알란디쿠스(Sulfolobus neozealandicus) 수적형(droplet-shaped) 바이러스, 바시니아 바이러스, Orf 바이러스, 계두 바이러스(Fowlpox virus), 면양두 바이러스(Sheeppox virus), 점액종 바이러스(Myxoma virus), 돈두 바이러스(Swinepox virus), 몰러스큠 콘타지오슘(Molluscum contagiosum) 바이러스, 야바 원숭이 종양 바이러스(Yaba monkey tumor virus), 멜로론타 멜로론타 엔토모폭스바이러스(Melolontha melolontha entomopoxvirus), 암색타 무레이(Amsacta moorei) 엔토모폭스바이러스, 카이로노머스 루리두스(Chironomus luridus) 엔토모폭스바이러스, 무척추 동물 무지개 바이러스(Invertebrate iridescent virus) 6, 무척추 동물 무지개 바이러스 3, 개구리 바이러스(Frog virus) 3, 임파 낭종병 바이러스 1, 캄포레티스 소노렌시스 이크노바이러스(Campoletis sonorensis ichnovirus), 코테시아 멜라노셀라 브라코바이러스(Cotesia melanoscela bracovirus), 익타루리드(Ictalurid) 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 3, 갈리드(Gallid) 헤르페스바이러스 2, 갈리드 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 5, 뮤리드 헤르페스바이러스(Murid herpesvirus) 1, 인간 헤르페스바이러스 6, 인간 헤르페스바이러스 4, 사이미린(Saimiriine) 헤르페스바이러스 2, 원숭이 바이러스(Simian virus) 40, 솜 꼬리 토끼 파필로마바이러스(Cottontail rabbit papillomavirus), 인간 아데노바이러스(Human adenovirus) C, 가금류(Fowl) 아데노바이러스 A, 양(Ovine) 아데노바이러스 D, 칠면조 아데노바이러스 B, 스포도프테라 프루기페르다 아스코바이러스(Spodoptera frugiperda ascovirus), 아칸타모에바 폴리파가 미미바이러스(Acanthamoeba polyphaga mimivirus), 오토그래파 캘리포니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus), 시디아 포모넬라 그래뉼로바이러스(Cydia pomonella granulovirus), 흰 반점 증후군 바이러스(White spot syndrome virus) 1, 아프리카 돼지 콜레라 바이러스(African swine fever virus) 및 리지디오마이세스 바이러스(Rhizidiomyces virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 아이노비리대(Inoviridae), 마이크로비리대(Microviridae), 제미니비리대(Geminiviridae), 써코비리대(Circoviridae), 나노비리대(Nanoviridae), 파르보비리대(Parvoviridae), 파르보비리내(Parvovirinae), 및 덴소비리내(Densovirinae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 아이노바이러스(Inovirus), 플렉트로바이러스(Plectrovirus), 마이크로바이러스(Microvirus), 스피로마이크로바이러스(Spiromicrovirus), 비델로마이크로바이러스(Bdellomicrovirus), 클라미디아마이크로바이러스(Chlamydiamicrovirus), 마스트레바이러스(Mastrevirus), 커토바이러스(Curtovirus), 베고모바이러스(Begomovirus), 써코바이러스(Circovirus), 자이로바이러스(Gyrovirus), 나노바이러스(Nanovirus), 바부바이러스(Babuvirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 에리트로바이러스(Erythrovirus), 디펜도바이러스(Dependovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus) 및 브레비덴소바이러스(Brevidensovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 엔테로박테리아 파지 M13, 아콜레플라스마(Acholeplasma) 파지 MV-L51, 엔테로박테리아 파지 φX174, 스피로플라스마(Spiroplasma) 파지 4, 비델로비브리오(Bdellovibrio) 파지 MAC1, 클라미디아(Chlamydia) 파지 1, 옥수수 줄무늬 바이러스(Maize streak virus), 비트 컬리 톱 바이러스(Beet curly top virus), 콩 골든 모자이크 바이러스(Bean golden mosaic virus) - 푸에르토리코, 돼지 써코바이러스(Porcine circovirus), 닭 빈혈 바이러스(Chicken anaemia virus), 지하 토끼 풀 스턴트 바이러스(Subterranean clover stunt virus), 바나나 송이 상부 바이러스(Babana bunchy top virus), 마우스의 마이뉴트 바이러스(Minute virus), B19 바이러스, 아데노-관련 바이러스 2, 쥬노니아 코에니아(Junonia coenia) 덴소바이러스, 봄빅스 모리(Bombyx mori) 덴소바이러스, 및 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) 덴소바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 및 콜리모비리대(Caulimoviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군의 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 오르소헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus), 아비헤파드나바이러스(Avihepadnavirus), 배드나바이러스(Badnavirus), 콜리모바이러스(Caulimovirus), 퉁그로바이러스(Tungrovirus), 소이모바이러스(Soymovirus), 카베모바이러스(Cavemovirus) 및 페투바이러스(Petuvirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, B형 오리 간염 바이러스, 코멜리나 황색 반점 바이러스(Commelina yellow mottle virus), 꽃 양배추 모자이크 바이러스, 벼 퉁그로 간상 바이러스(Rice tungro bacilliform virus), 대두 퇴록 반점 바이러스(Soybean chlorotic mottle virus), 카사바 잎맥 모자이크 바이러스(Cassava vein mosaic virus) 및 페츄니아 잎맥 소멸 바이러스(Petunia vein clearing virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 슈도비리대(Pseudoviridae), 메타비리대(Metaviridae) 및 레트로비리대(Retroviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 슈도바이러스(Pseudovirus), 헤미바이러스(Hemivirus), 메타바이러스(Metavirus), 에란티바이러스(Errantivirus), 알파레트로바이러스(Alpharetrovius), 베타레트로바이러스(Betaretrovirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 엡실론레트로바이러스(Epsilonretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus) 및 스푸마바이러스(Spumavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) Ty1 바이러스, 드로소필라 멜라노개스터 코피아 바이러스(Drosophila melanogaster copia virus), 사카로마이세스 세레비지아에 Ty3 바이러스, 드로소필라 멜라노개스터 집시 바이러스(Drosophila melanogaster gypsy virus), 조류 백혈병 바이러스, 마우스 유방암 바이러스, 쥣과 동물 백혈병 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 왈리 진피 육종 바이러스(Walleye dermal sarcoma virus), 인간 면역 결핍증 바이러스 1, 및 침팬지 포미 바이러스(Chimpanzee foamy virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 시스토비리대(Cystoviridae), 레오비리대(Reoviridae), 버나비리대(Birnaviridae), 토티비리대(Totiviridae), 크라이소비리대(Chrysoviridae), 파르티티비리대(Partitiviridae) 및 하이포비리대(Hypoviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 시스토바이러스(Cystovirus), 오르토레오바이러스(Orthoreovirus), 오르비바이러스(Orbivirus), 로타바이러스(Rotavirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 아쿠아레오바이러스(Aquareovirus), 사이포바이러스(Cypovirus), 피지바이러스(Fijivirus), 피토레오바이러스(Phytoreovirus), 오라이자바이러스(Oryzavirus), 아쿠아버나바이러스(Aquabirnavirus), 아비버나바이러스(Avibirnavirus), 엔토모버나바이러스(Entomobirnavirus), 토티바이러스(Totivirus), 지알디아바이러스(Giardiavirus), 레이슈마니아바이러스(Leishmaniavirus), 크라이소바이러스(Chrysovirus), 파르티티바이러스(Partitivirus), 알파크립토바이러스(Alphacryptovirus), 베타크립토바이러스(Betacryptovirus), 하이포바이러스(Hypovirus) 및 바리코사바이러스(Varicosavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 슈도모나스 파지 ψ6, 포유동물 오르토레오바이러스(Mammalian orthoreovirus), 블루텅 바이러스(Bluetongue virus), 로타바이러스(Rotavirus) A, 콜로라도 진드기 열 바이러스(Colorado tick fever virus), 아쿠아레오바이러스(Aquareovirus) A, 사이포바이러스(Cypovirus) 1, 피지병 바이러스(Fiji disease virus), 벼 난쟁이 병 바이러스(Rice dwarf virus), 벼 주름 발육 저go 바이러스(Rice ragged stunt virus), 감염성 췌장 괴사 바이러스(Infectious pancreatic necrosis virus), 감염성 훼브리셔스 낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus), 드로소필라 X 바이러스, 사카로마이세스 세레비지아에 바이러스 L-A, 지알디아 람블리아 바이러스(Giardia lamblia virus), 레이슈마니아 RNA 바이러스 1-1, 페니실리움 크라이소제늄 바이러스(Penicillium chrysogenum virus), 앳킨소넬라 하이폭실론 바이러스(Atkinsonella hypoxylon virus), 화이트 클로버 크립틱 바이러스(White clover cryptic virus) 1, 화이트 클로버 크립틱 바이러스 2, 크리포넥트리아 하이포바이러스 1-EP713 및 상추 대형 잎맥 관련 바이러스(Lattuce big-vein associated virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스 RNA는 일정 목에 속하는 바이러스의 게놈 바이러스 RNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 이 바이러스는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 뉴모비리내(Pneumovirinae), 래비도비리대(Rhabdoviridae), 필로비리대(Filoviridae), 보르나비리대(Bornaviridae), 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae), 버니아비리대(Bunyaviridae) 및 아레나비리대(Arenaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 레스피로바이러스(Respirovirus), 모빌리바이러스(Morbillivirus), 루불라바이러스(Rubulavirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 애뷸라바이러스(Avulavirus), 뉴모바이러스(Pneumovirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 사이토래비도바이러스(Cytorhabdovirus), 뉴클레오래비도바이러스(Nucleorhabdovirus), 노비래비도바이러스(Novirhabdovirus), 마버그바이러스(Marburgvirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus), 보르나바이러스(Bornavirus), 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토바이러스(Thogotovirus), 아이사바이러스(Isavirus), 오르토버니아바이러스(Orthobunyavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), 토스포바이러스(Tospovirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 오피오바이러스(Ophiovirus), 테뉴이바이러스(Tenuivirus) 또는 델타바이러스(Deltavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 센다이 바이러스(Sendai virus), 홍역 바이러스, 수두 바이러스, 헨드라 바이러스(Hendra virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 인간 호흡기 세포 융합 바이러스(Human respiratory syncytial virus), 조류 뉴모바이러스(Avian pneumovirus), 소포성 구내염 인디아나 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스, 소 유행열 바이러스(Bovine ephemeral fever virus), 상추 괴사 황색병 바이러스(Lettuce necrotic yellows virus), 감자 황색 난쟁이병 바이러스(Potato yellow dwarf virus), 감염성 조혈기 괴사 바이러스(Infectious hematopoietic necrosis virus), 빅토리아 호수 마버그 바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 자이어 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus), 보르나병 바이러스(Borna disease virus), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 토고토 바이러스, 감염성 연어 빈혈 바이러스, 버니암웨라 바이러스(Bunyamwera virus), 한탄 바이러스, 더그비 바이러스(Dugbe virus), 리프트 계곡열 바이러스(Rift Valley fever virus), 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus), 감귤 소로시스 바이러스(Citrus psorosis virus), 벼 줄무늬 잎마름병 바이러스(Rice stripe virus) 및 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 기타 특정 구체예에서, 바이러스는 약독화 인플루엔자 바이러스, 냉각 적응성 인플루엔자 바이러스, 온도 감수성 인플루엔자 바이러스 또는 이와 같은 바람직한 특성들을 가지는 바이러스이다. 하나의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B/앤 아버/1/66 균주 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 B/앤 아버/1/66의 냉각 적응, 온도 감수성, 약독화 균주와 통합한다. 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A/앤 아버/6/60 균주 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A/앤 아버/6/60의 냉각 적응성, 온도 감수성, 약독화 균주와 통합한다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 레비비리대(Leviviridae), 디시스트로비리대(Dicistroviridae), 피코나비리대(Picornaviridae), 세퀴비리대(Sequiviridae), 코모비리대(Comoviridae), 포티비리대(Potyviridae), 칼리시비리대(Caliciviridae), 아스트로비리대(Astroviridae), 노다비리대(Nodaviridae), 테트라비리대(Tetraviridae), 톰버스비리대(Tombusviridae), 코로나비리대(Coronaviridae), 아테리비리대(Arteriviridae), 로니비리대(Roniviridae), 토가비리대(Togaviridae), 플래비비리대(Flaviviridae), 브로모비리대(Bromoviridae), 클로스테로비리대(Closteroviridae), 바르나비리대(Barnaviridae), 루테오비리대(Luteoviridae), 티모비리대(Tymoviridae) 및 플렉시비리대(Flexiviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 레비바이러스(Levivirus), 알로레비바이러스(Allolevivirus), 크리파바이러스(Cripavirus), 이플라바이러스(Iflavirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 리노바이러스(Rhinovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 카디오바이러스(Cardiovirus), 아프토바이러스(Aphthovirus), 파레코바이러스(Parechovirus), 세퀴바이러스(Sequivirus), 웨이커바이러스(Waikavirus), 코모바이러스(Comovirus), 파바바이러스(Fabavirus), 네포바이러스(Nepovirus), 포티바이러스(Potyvirus), 라이모바이러스(Rymovirus), 바이모바이러스(Bymovirus), 마클루라바이러스(Macluravirus), 이포모바이러스(Ipomovirus), 트리티모바이러스(Tritimovirus), 베시바이러스(Vesivirus), 라고바이러스(Lagovirus), 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 헤페바이러스(Hepevirus), 마마스트로바이러스(Mamastrovirus), 아바스트로바이러스(Avastrovirus), 알파노다바이러스(Alphanodavirus), 베타노다바이러스(Betanodavirus), 베타테트라바이러스(Betatetravirus), 오메가테트라바이러스(Omegatetravirus), 톰버스바이러스(Tombusvirus), 카르모바이러스(Carmovirus), 네크로바이러스(Necrovirus), 디아안토바이러스(Dianthovirus), 마클로모바이러스(Machlomovirus), 아베나바이러스(Avenavirus), 오레어스바이러스(Aureusvirus), 파니코바이러스(Panicovirus), 코로나바이러스(Coronavirus), 토로바이러스(Torovirus), 아테리바이러스(Arterivirus), 오카바이러스(Okavirus), 알파바이러스(Alphavirus), 루비바이러스(Rubivirus), 플래비바이러스(Flavivirus), 페스티바이러스(Pestivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus), 알파모바이러스(Alfamovirus), 일라르바이러스(Ilarvirus), 브로모바이러스(Bromovirus), 큐커모바이러스(Cucumovirus), 올레아바이러스(Oleavirus), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 크리니바이러스(Crinivirus), 암펠로바이러스(Ampelovirus), 바나바이러스(Barnavirus), 루테오바이러스(Luteovirus), 폴레로바이러스(Polerovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 포모바이러스(Pomovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 베니바이러스(Benyvirus), 아이다에오바이러스(Idaeovirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 움브라바이러스(Umbravirus), 타이모바이러스(Tymovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 마큘라바이러스(Maculavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 마나드리바이러스(Manadrivirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus) 및 아우어미아바이러스(Ourmiavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 엔테로박테리아 파지 MS2, 엔테로박테리아 파지 Qβ, 귀뚜라미 마비 바이러스(Cricket paralysis virus), 감염성 연화병 바이러스(Infectious flacherie virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 인간 리노바이러스(Human rhinovirus) A, A형 간염 바이러스, 뇌 심근염 바이러스, 구제역 병 바이러스(Foot-and-mouth disease virus), 인간 파레코 바이러스(Human parecho virus), 파스닙 황반 바이러스(Parsnip yellow fleck virus), 벼 퉁그로 구상 바이러스(Rice tungro spherical virus), 동부 모자이크 바이러스(Cowpea mosaic virus), 잠두 위조 바이러스(Broad bean wilt virus) 1, 담배 윤문병 바이러스(Tobacco ringspot virus), 감자 바이러스 Y, 라이그라스 모자이크 바이러스(Ryegrass mosaic virus), 보리 호위축병 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 마클루라 모자이크 바이러스(Maclura mosaic virus), 고구마 옅은 반점 바이러스(Sweet potato mild mottle virus), 밀 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus), 돼지 수포성 발진 바이러스(Swine vesicular exanthema virus), 토끼 출혈성 질환 바이러스(Rabbit hemorrhagic disease virus), 노워크 바이러스(Norwalk virus), 삿뽀로 바이러스(Sapporo virus), E형 간염 바이러스, 인간 아스트로바이러스(Human astrovirus), 칠면조 아스트로바이러스(Turkey astrovirus), 노다무라 바이러스(Nodamura virus), 가로무늬 잭 신경 괴사 바이러스(Stripped jack nervous necrosis virus), 누도렐리아 카펜시스 β 바이러스(Nudaurelia capensis β virus), 누도렐리아 카펜시스 ω 바이러스, 토마토 부시 발육 저해 바이러스(Tomato bushy stunt virus), 카네이션 반점 바이러스(Carnation mottle virus), 담배 괴사 바이러스 A(Tobacco necrosis virus A), 카네이션 윤문병 바이러스, 옥수수 퇴록 반점 바이러스(Maize chlorotic mottle virus), 귀리 퇴록 발육 저해 바이러스(Oat chlorotic stunt virus), 포소스 잠복 바이러스(Pothos latent virus), 패니큠 모자이크 바이러스(Panicum mosaic virus), 감염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus), 말 토로바이러스(Equine torovirus), 말 동맥염 바이러스(Equine arteritis virus), 길-관련 바이러스(Gill-associated virus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 루벨라 바이러스(Rubella virus), 황열 바이러스(Yellow fever virus), 바이러스성 소 설사 바이러스(Bovine viral diarrhea virus), C형 간염 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스(Alfalfa mosaic virus), 담배 줄무늬 바이러스(Tobacco streak virus), 브롬 모자이크 바이러스(Brome mosaic virus), 오이 모바이크 바이러스(Cucumber mosaic virus), 올리브 잠복 바이러스(Olive latent virus) 2, 비트 엘보우스 바이러스(Beet ellows virus), 상추 감염성 황색병 바이러스(Lettuce infectious yellows virus), 포도 잎 말림 관련 바이러스(Grapevine leafroll-associated virus) 3, 버섯 간상 바이러스(Mushroom bacilliform virus), 보리 황색 난쟁이병 바이러스(Barley yellow dwarf virus)-PAV, 감자 잎 말림 바이러스(Potato leafroll virus), 완두 가엽 모자이크 바이러스(Pea enation mosaic virus)-1, 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 보리 줄무늬 모자이크 바이러스(Barley stripe mosaic virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 감자 몹-탑 바이러스(Potato mop-top virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 비트 괴사 잎맥 황색병 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 라스베리 부시 난쟁이병 바이러스(Raspberry bushy dwarf virus), 남부 콩 모자이크 바이러스(Southern bean mosaic virus), 당근 반점 바이러스(Carrot mottle virus), 순무 황색 모자이크 바이러스(Turnip yellow mosaic virus), 옥수수 라야도 피노 바이러스(Maize rayado fino virus), 포도잎 반점 바이러스(Grapevine fleck virus), 샬롯 바이러스(Shallot virus) X, 인디안 감귤 윤문병 바이러스(Indian citrus ringspot virus), 카네이션 잠복 바이러스(Carnation latent virus), 사과 나무 만곡병 바이러스(Apple stem grooving virus), 사과 나무 고접병 바이러스(Apple stem pitting virus), 감자 바이러스 X, 사과 잎 퇴록 반점 바이러스(Apple chlorotic leaf spot virus), 포도 덩굴 바이러스 A 및 아우어미아 멜론 바이러스(Ourmia melon virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 나나비리대(Narnaviridae)의 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 나나바이러스(Narnavirus) 및 미토바이러스(Mitovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 일원이다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 사카로마이세스 세레비지아애(Saccharomyces cerevisiae) 20SRNA 나나바이러스 및 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) 미토바이러스-1 NB631로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 또는 하위 군에 속하는 일원이다.
특정 구체예
1. 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, 이 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산이 숙주 세포 게놈에 통합되어 있고, 이 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 정상적으로는 세포 내에서 발현되지 않는 숙주 세포.
2. 제1항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 프로테아제를 발현하는 것인 숙주 세포.
3. 제2항의 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제인 것인 숙주 세포.
4. 제3항의 구체예에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 S1 군 프로테아제인 것인 숙주 세포.
5. 제4항의 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 트립신인 것인 숙주 세포.
6. 제2항의 구체예에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 박테리아 서브틸리신인 것인 숙주 세포.
7. 제6항의 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 SPRT인 것인 숙주 세포.
8. 제2항의 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 표 1에 나열된 프로테아제인 것인 숙주 세포.
9. 제1항의 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 프로-프로테아제인 것인 숙주 세포.
10. 제9항의 구체예에 있어서, 상기 프로-프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 프리프로-SPRT 프로테아제 또는 트립시노겐인 것인 숙주 세포.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 숙주 세포.
12. 제11항의 구체예에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 인터페론에 의하여 유도되거나, 또는 이 인터페론에 의해 유도되는 하류 신호 전달 분자에 의해 유도되는 것인 숙주 세포.
13. 제11항의 구체예에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 테트라사이클린-조절 발현 시스템에 의하여 유도되는 것인 숙주 세포.
14. 제1항 내지 제10항의 구체예에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 구성적으로 활성을 나타내는 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 숙주 세포.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 핵산은 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 분비시키는 분비 신호를 포함하는 것인 숙주 세포.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것인 숙주 세포.
17. 제16항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 개의 세포인 것인 숙주 세포.
18. 제17항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 MDCK 세포인 것인 숙주 세포.
19. 제16항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 영장류의 세포인 것인 숙주 세포.
20. 제19항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 아프리카 녹색 원숭이 또는 인간의 세포인 것인 숙주 세포.
21. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 세포는 조류 세포인 것인 숙주 세포.
22. 제21항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 닭의 세포인 것인 숙주 세포.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 세포는 적응되지 않은 채 현탁액 중에서 생육하는 것인 숙주 세포.
24. 상기 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 의한 숙주 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계, 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 생산 방법.
25. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 의한 숙주 세포를 인플루엔자 게놈을 암호화하는 핵산으로 형질 감염시키는 단계, 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 이 세포를 배양하는 단계, 및 이 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 생산 방법.
26. 제24항 또는 제25항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 프로-프로테아제를 발현하고, 이 방법은 배양 배지에 외인성 프로테아제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 제26항의 구체예에 있어서, 상기 외인성 프로테아제는 최대 농도 약 0.1㎍/㎖로 첨가되는 것인 방법.
28. 제26항의 구체예에 있어서, 상기 외인성 프로테아제는 트립신인 것인 방법.
29. 숙주 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계, 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 이 세포를 배양하는 단계[여기서, 상기 조건은 외인적으로 첨가된 트립신을 포함하지 않음], 및 이 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 외인적으로 첨가된 트립신이 없이 인플루엔자 바이러스를 복제하는 방법.
30. 숙주 세포를 인플루엔자 게놈을 암호화하는 핵산으로 형질 감염시키는 단계, 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 이 세포를 배양하는 단계[여기서, 상기 조건은 외인적으로 첨가된 트립신을 포함하지 않음], 및 이 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 외인적으로 첨가된 트립신 없이 인플루엔자 바이러스를 복제하는 방법.
31. 제29항 또는 제30항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 정상적으로는 세포에 의해서 발현되지 않는, 효소 활성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 것인 방법.
32. 제29항 또는 제30항의 구체예에서, 상기 숙주 세포는 포유동물의 세포인 것인 방법.
33. 제29항 또는 제30항의 구체예에서, 상기 숙주 세포는 조류의 세포인 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 숙주 세포는 영장류의 세포, 개의 세포, 햄스터의 세포, 마우스의 세포 또는 래트의 세포인 것인 방법.
35. 제32항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 MDCK 세포인 것인 방법.
36. 제34항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 Vero 세포인 것인 방법.
37. 제33항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 닭의 세포인 것인 방법.
38. 세포 배양액 중에서 인플루엔자 바이러스를 배양하여[여기서, 이 세포 배양액 중 세포는 i) 세포와 이종성이고 ii) 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 절단하는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현함], 세포 배양액 중에서 생육한 인플루엔자 바이러스의 역가를, 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는 세포 내에서 인플루엔자 바이러스를 배양함으로써 얻어지는 역가에 비하여 증가시키는 단계를 포함하는, 세포 배양액 중에서 생육한 인플루엔자 바이러스의 역가를 증가시키는 방법.
39. 제38항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 구성적으로 발현하는 것인 방법.
40. 제38항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 유도적으로 발현하는 것인 방법.
41. 제38항, 제39항 및 제40항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 세포는 프로테아제를 발현하는 것인 방법.
42. 제38항, 제39항 및 제40항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 세포는 프로-프로테아제를 발현하는 것인 방법.
43. 제41항에 의한 구체예 있어서, 상기 프로테아제는 트립신인 것인 방법.
44. 제41항에 의한 구체예 있어서, 상기 프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 SPRT 프로테아제인 것인 방법.
45. 제42항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로-프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 트립시노겐 또는 프리프로-SPRT 프로테아제인 것인 방법.
46. 프로테아제 또는 프로-프로테아제가 발현되는 조건 하에서, 정상적으로는 세포 내에서 발현되지 않는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양함으로써, 세포 내에서 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 생산하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 복제를 허용할 수 있는 숙주 세포 내에서 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 생산하는 방법.
47. 제46항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 프로테아제를 안정하게 발현하는 것인 방법.
48. 제46항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 프로-프로테아제를 안정하게 발현하는 것인 방법.
49. 제46항, 제47항 및 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 세포 배양 배지 중에 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 분비하는 것인 방법.
50. 제46항, 제47항, 제48항 및 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 숙주 세포 배양액 1㎖당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1ng∼약 10㎍ 발현하는 것인 방법.
51. 제46항, 제47항, 제48항, 제49항 및 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 숙주 세포 배양액 중에서 생육한 바이러스 역가를 증가시키기에 충분한 양만큼의 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 것인 방법.
52. 제46항, 제47항, 제48항, 제49항, 제50항 및 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 유도적인 것인 방법.
53. 제46항, 제47항, 제48항, 제49항, 제50항 및 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 구성적인 것인 방법.
54. 서열 번호 1과 약 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
55. 제54항의 구체예에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 것인 핵산.
56. 서열 번호 2의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
57. 제56항의 구체예에 의한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
58. 제54항, 제55항 및 제57항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 의한 핵산을 포함하는 발현 벡터.
59. 제58항의 구체예에 의한 발현 벡터를 포함하는 분리된 세포
60. 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 정상적으로는 숙주 세포 내에서 발현되지 않음], 및 이 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 안정적으로 발현하는 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 안정적으로 발현하는 숙주 세포를 생산하는 방법.
61. 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 현탁액 중 부착성 숙주 세포를 생육하는 방법으로서, 여기서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제는, 정상적으로는 세포 내에서 발현되지 않는 방법.
62. 제60항 또는 제61항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 프로테아제를 안정적으로 발현하는 것인 방법.
63. 제60항 또는 제61항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 프로-프로테아제를 안정적으로 발현하는 것인 방법.
64. 제60항, 제61항, 제62항 및 제63항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 세포 배양 배지 중에 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 분비하는 것인 방법.
65. 제60항, 제61항, 제62항, 제63항 및 제64항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 숙주 세포 배양액 1㎖ 당 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 약 0.1ng∼약 50㎍ 발현하는 것인 방법.
66. 제60항, 제61항, 제62항, 제63항, 제64항 및 제65항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 숙주 세포의 배양액 중에서 생육한 바이러스의 역가를 증가시키기에 충분한 양만큼의 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 것인 방법.
67. 제60항, 제61항, 제62항, 제63항, 제64항, 제65항 및 제66항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 유도적인 것인 방법.
68. 제60항, 제61항, 제62항, 제63항, 제64항, 제65항 및 제66항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 구성적인 것인 방법.
69. 제60항, 제61항, 제62항, 제63항, 제64항, 제65항, 제66항, 제67항 및 제68항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포인 것인 방법.
70. 제60항, 제61항, 제62항, 제63항, 제64항, 제65항, 제66항, 제67항 및 제68항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 조류의 세포인 것인 방법.
71. 제69항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 영장류의 세포, 개의 세포, 햄스터의 세포, 마우스의 세포 또는 래트의 세포인 것인 방법.
72. 제71항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 MDCK 세포인 것인 방법.
73. 제71항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 Vero 세포인 것인 방법.
74. 제70항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 닭의 세포인 것인 방법.
75. 제60항의 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포인 것인 방법.
76. 제60항 내지 제62항 및 제64항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 트립신인 것인 방법.
77. 제60항 내지 제62항 및 제64항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 스트렙토마이세스 그리세우스로부터 유래하는 SPRT 프로테아제인 것인 방법.
78. 제60항, 제61항 및 제63항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 프로-프로테아제는 트립시노겐인 것인 방법.
이하의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: MDCK 세포 내에서의 인플루엔자 균주의 성장
본 실시예에서는 인플루엔자 배양용인 몇몇 세포주의 특징에 관하여 기술하고 있다. 몇몇 상이한 세포주 및 1차 세포를 사용하여, 이 세포들이 2개의 실험실 적응 인플루엔자 균주, A형 및 B형 예를 들어, MRC-5, WI-38, FRhL2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, Vero 및 MDCK로부터 유래하는 유전적 재분류체를 생산하는지 여부에 대해 평가하였다. 다수의 세포 유형들은 몇몇 냉각-적응된 인플루엔자 균주를 제한된 정도로만 생산하였지만, MDCK만은 A형 및 B형 바이러스를 고 역가로 일정하게 생산하였다. 상기 MDCK 세포는 또한 이 세포가 잠재적 전염병의 백신인 ca A/베트남/1203/2004의 복제를 허용하는 능력에 대해서도 테스트되었다. MDCK 세포는 소량의 ca A/베트남/1203/2004으로 감염시켰으며, 상청액 중 바이러스는 감염 후 여러 시점에서 정량되었다. 감염 후 48시간 경과시까지, ca A/베트남/1203/2004의 역가는 약 8 log10 TCID50/㎖에 도달하였으며, 이후 3∼4일 동안에도 이 상태를 일정하게 유지하였다. 도 1을 참조하시오.
실험시, ATCC로부터 입수한 MDCK 세포(수탁 번호; CCL-34)를 10% 소 태아 혈청 공급원을 함유하는 배지(미국산) 또는 적당한 무 혈청 배지(예를 들어, SFMV 100) 중에서 제한된 회차 수만큼 증식시켜, 초기의 특성 규명 연구용인 예비-마스터(pre-master) 세포 스톡을 만들었다. 적당한 무 혈청 배지에 관하여는 미국 가 명세서 출원 제60/638,166호(2004년 12월 23일 출원) 및 미국 가 명세서 출원 제60/641,139호(2005년 1월 5일 출원)에 개시되어 있다. 세포는 냉각-적응 백신 균주 및 활동성 균주의 복제를 허용하는 두 가지 유형의 세포 스톡과 두 가지 유형의 배지 모두에서 용이하게 생육할 수 있었다[이하, 표 2 및 도 1 참조].
Figure 112008004956534-PCT00017
[▲ 혈청의 부재 및 존재 하에서 생육한 MDCK에 있어서, 냉각-적응된 인플루엔자 균주의 복제력 비교]
실시예 2: MDCK 세포주의 발암성
2개의 예비-마스터 MDCK 세포 스톡[하나는 혈청을 함유하는 배지 중에서 생육되었고, 다른 하나는 무 혈청 배지 중에서 생육됨]의 발암 가능성을, 5회 계대 배양된 후, 백신을 생산하는데 사용될 것으로 예측되는 단계의 무 흉선(athymic) 누드 마우스 모델에서 평가하였다. 발암성을 평가하기 위하여, 107개의 세포를 10마리의 마우스로 이루어진 군에 피하 주사하였으며, 84일 경과시 동물들을 안락사시켜 관찰하였다. 무 혈청 배지 중에서 계대 배양된 세포를 접종한 10마리의 동물들 중 6마리에서 신생 물질이 형성되었음을 알 수 있었다. 이와는 대조적으로, 10% 소 태아 혈청이 보충된 배지 중에서 계대 배양된 세포를 접종한 동물 중 어느 것에서도 신생 물질 형성에 대한 증거는 찾아볼 수 없었으나; 접종 위치에 섬유 육종이 약간 형성되었음을 알 수 있었으며, 또한 혈청 중에서 계대 배양된 세포는 발암성을 나타내지는 않았다(표 3 참조).
2개의 상이한 배지 중에서 계대 배양된 MDCK 세포의 발암성 및 세포 핵학
혈청 불포함 10% 혈청
4회차 계대 배양 20회차 계대 배양 4회차 계대 배양 20회차 계대 배양
발암성 ND 신생 물질 형성됨 ND 신생 물질이 형성되지 않음. 다만, 주사 위치에 섬유 육종이 형성됨
TP50 * 평가치 (종양이 발생하지 않은 동물의 수/ 총 동물의 수 ND 약 107 (6/10) ND 평가 불가 (> 107) (0/10)
세포 핵학 (중간 염색체 번호; 평가) 78; 52∼82번 염색체 에 고루 분포됨 78; 52∼82번 염색체 에 고루 분포됨 78; 소수 세포의 경우에는, 70∼82번 염색체에 이상이 발생함 78; 소수 세포의 경우에는, 70∼82번 염색체에 이상이 발생함
TP50 * = 50%의 동물에서 종양을 유발하는데 필요한 세포 수 ND = 수행하지 않음
표 3에 나타낸 바와 같이, 각각의 배지 중에서 4회차 및 20회차 계대 배양한 2개의 예비 마스터 세포 스톡에 대해서 핵형 분석을 수행하였다. 10% FCS 중에서 계대 배양된 비-발암성 세포의 중간 유사 분열 중기 염색체의 번호는 78이었으며, 이 경우, 기타 염색체(70∼82번 염색체)의 세포 내 분포는 비교적 제한적이었다. 무 혈청 배지 중에서 계대 배양된 세포의 중간 유사 분열 중기 염색체의 번호도 78이었으나, 상당수의 세포는 이수성 염색체(52∼82번 유사 분열 중기 염색체)를 가지는 것으로 확인되었다. 두 경우에 있어서, 세포 핵학 특성은 계대 배양을 하더라도 바뀌지 않았다.
실시예 3: 무 혈청 배지 중에서 생육할 수 있도록 하기 위한 MDCK 세포의 적응
ATCC로부터 입수한 MDCK 세포를 감마 조사 FBS를 함유하는 배지 중에서 계대 배양하였다. 이후, 이 세포들을 세포 은행 생산을 허용하도록 선택된 무 혈청 배지 제제 중에서 제한된 횟수만큼 계대 배양한다. 무 혈청 배지에 관하여는 미국 가 명세서 출원 제60/638,166호 및 동 제60/641,139호에 개시되어 있다. 이와 같은 추가의 계대 배양은 37℃ 또는 33℃에서 수행될 수 있다. 이와 같이, 혈청이 아닌, 식물-유래 보충 성분을 함유하는 3개의 배지 중에서 수행되는 MDCK 세포의 계대 배양을 통하여, FCS 함유 배지 중에서 계대 배양된 MDCK 세포와 유사한 핵형을 가지는 세포를 얻을 수 있었다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 4: MDCK 세포의 클로닝
세포 생산이 독특한 유전적 질서에 의해 결정된다는 사실을 확인하기 위하여, 희석을 제한함으로써 세포를 생물학적으로 클로닝하였다. 클론을 다양한 표현형적 특성 예를 들어, 복제 시간 및 상대적 발암성, 그리고 바이러스 복제 능에 대해 스크리닝하였다. 추상적 실험에 대한 초기의 증거로서, FCS를 함유하는 배지 중에서 54개의 MDCK 클론들을 생산하였다. 이 클론들을 계대 배양하였는데, 이들 클론은 각각 소량의 ca A/뉴 칼레도니아(New Caledonia)/20/99로 감염시켰다. 감염 후 수 일 경과시, 상청액을 제거하고, 상청액 중 바이러스 양을 TCID50으로 측정하였다. 소수의 클론은 비교적 높은 역가의 바이러스를 생산하였으며, 클로닝되지 않은 모 세포는 이보다 높은 역가의 바이러스를 생산하였다. 우수한 생물학적 특성 및 생리적 특성을 갖는 클론을 사용하여, 이하에 기술된 바와 같은 마스터 세포 은행(Master Cell Bank; MCB)을 확립하였다.
실시예 5: 마스터 세포 은행의 테스트 및 특성 규명
우발적인 제제가 존재하지 않음을 확인하기 위해 MCB를 광범위하게 테스트하였다. 예를 들어, 있을 수 있는 바이러스 제제에 대해 몇몇 PCR 및/또는 항체-특이적 테스트를 1회 이상 실시하였다(이하, 표 4 참조).
MCB에 대한 테스트 방식
일반적 테스트
무균 상태
마이코플라스마 존부
시험관 내 우발적 제제(다수의 세포주) 존부
생체 내 우발적 제제 존부
PERT
공동 배양
세포 핵학적 특성 관찰
전자 현미경
발암성 원 상태 세포(TP50)
세포 DNA의 발암성
세포 용해물의 발암성
9CFR 당 소 바이러스
9CFR 당 돼지 바이러스
MCB에 대한 테스트 방식
PCR*/Ab 특이적 테스트
제1형 및 제2형 AAV
HCMV
EBV
HSV
B, C 및 E형 간염 바이러스
HHV 6, 7 및 8
HIV 1 및 2
HPV
HTLV I 및 II
폴리오마(BK 및 JC 바이러스)
써코바이러스(Circovirus)
개의 파르보바이러스
개의 심신 이상(distemper)
아데노바이러스
SV40
실시예 6: 세포 배양액-유래 인플루엔자 바이러스의 전 임상적 특성 규명
본 실시예는 세포 배양액과 달걀로부터 생산된 인플루엔자 균주의 특성 규명 및 이 시스템으로부터 생산된 바이러스들을 비교한 결과에 관하여 기술하고 있다. 일반적으로, 인플루엔자 바이러스는 인간의 백신으로서 사용하기 적당하며, 바이러스를 이러한 용도로서 적합하도록 만드는 생물학적 특성을 보유한다. 이 실시예에서, 인플루엔자 바이러스는 냉각-적응성(ca: 저온에서 효율적으로 증식하는 능력을 가짐), 온도 감수성(ts: 고온에서 시험관 내 제한적으로 복제함) 및 약독화(att: 패럿의 폐 조직 내에서 복제되는 것을 확인할 수 없음)된 것으로서, 본원에서는 ca ts att 균주라고 칭한다. 비교 항목으로는 다음과 같은 것들을 포함한다: 바이러스 생산물의 생화학적 평가, 항원성 평가 및 유전적 평가(서열 결정); 인간 세포 내에서 복제한 후 바이러스의 생물학적 특성 규명 및 생화학적 특성 규명; 허용 가능한 동물 모델에 있어서의 복제; 및 허용 가능한 동물 모델에서의 면역원성.
유전적, 생화학적 및 항원성 비교
A/H1N1, A/H5N1, A/H3N2 및 B 형 ca ts att 균주는 MDCK 세포 내에서 비교적 높은 역가로서 복제하였다. 뿐만 아니라, 이러한 MDCK 세포 내 ca ts att 균주를 계대 배양하였을 경우에도 게놈 서열은 바뀌지 않았다. 3개의 ca ts att 균주인 ca A/시드니(Sydney)/05/97, ca A/베이징(Beijing)/262/95 및 ca B/앤 아버/1/94를 MDCK 세포 중에서 1회 또는 2회 계대 배양하고, 6개의 내부 유전자 모두의 전체 암호화 부위를 서열 결정하여, 이를 출발 물질과 비교하였다. 뉴클레오티드 변이는 관찰되지 않았는데, 이는 곧, 이와 같은 기질을 통한 계대 배양이 상기 균주의 유전적 조성을 바꾸지 않았음을 입증하는 것이다. 배지 조성, 접종량(moi), 항온 처리 온도 및 수집 시간을 포함하는, 생산 과정을 모의할 것으로 기대되는 조건 하에서, MDCK 세포 내에서 생산된 상이한 백신 균주에 대해 추가의 서열 특성 규명 작업을 수행하였다. 예비 데이터를 바탕으로 하였을 때, MDCK-생산 바이러스의 게놈 서열에는 변이가 일어나지 않을 것이라고 예상된다.
게놈은 MDCK 세포 내에서 계대 배양된 이후에도 유전적으로 안정하기 때문에, 달걀 또는 MDCK 세포 내에서 생산된 백신 간의 생물학적 특징은 뚜렷한 차이를 보이지 않을 것으로 예상된다. 그러나, 세포 배양액으로부터 유래하는 1차 바이러스 생산물은 달걀에서 생산된 생산물에 비하여, 특히, 바이러스 단백질인 HA 및 NA의 번역 후 변형이나, 바이러스 막 지질 조성면에서 몇 가지 미미한 차이점을 보이는데; 이 두 가지 경우 모두 비리온의 전체적인 물리적 특성을 잠재적으로 바꿀 수 있었다. 세포 배양액 생산 백신 및 달걀 생산 백신의 항원성에 대한 예비적 전 임상 데이터를 통하여, 이러한 중요한 매개 변수에서는 거의 차이를 보이지 않음을 입증할 수 있었다. 몇몇 백신 균주의 달걀 스톡을 MDCK 세포로써 계대 배양시켜, 참조 항혈청을 이용하여 HAI 역가를 측정함으로써 이 두 가지 생산물의 항원성을 측정하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, HAI 역가는 모두 각각에 대해서 2배 이내의 범위에서 차이를 나타냈는데, 이는 곧, 세포 내에서의 백신의 복제는 달걀 유래 물질에 비하여 백신의 항원성을 바꾸지 않았음을 말해주는 것이다.
달걀 및 MDCK 세포 내에서 생산된 균주의 HAI 역가
HAI 역가
균주 달걀-유래 MDCK 유래
A/파나마(Panama)/20/99 256 256
A/우한(Wuhan)/359/95 1024 2048
A/와이오밍(Wyoming)/03/2003 512 1024
B/질린(Jilin)/20/2003 64 32
B/홍콩(Hong Kong)/330/01 64 64
B/지앙수(Jiangsu)/10/2003 128 128
실시예 7: 배양액 중 인간 상피 세포의 감염
임의의 구체예에서, 인간 기원의 세포 내에서 MDCK 및 달걀 생산 백신을 복제시킨 후 이것들의 생화학적, 생물학적 및 구조적 유사성을 평가하기 위하여, 백신들을 상대적으로 이배체인 인간 세포 예를 들어, 정상의 인간 기관지 상피 세포(NHBE) 중에서 1회 계대 배양할 수 있다. 이와 같은 계대 배양은 인간의 기도가 1회 감염되었을 때의 상황을 모의하여, 자손 바이러스 즉, 궁극적으로 효과적인 면역 반응을 유도해내는 바이러스의 비교를 가능하도록 만드는데 사용될 것이다. 이 물질들을 통하여 백신의 헤마글루티닌(결합 및 융합)과 뉴라미니다제의 활성에 대한 연구를 수행하였으며, 또한 기타 생화학적 및 구조적 연구 예를 들어, 전자 현미경 관찰, 전체 입자 비율에 대한 감염성 및 바이러스 게놈 균등물에 관한 연구도 수행하였다. 전반적으로, 이러한 연구는 유효하고 안전한 달걀 생산 백신과 세포-유래 백신을 비교하기 위한 것이다. 분석적 연구 결과를 이하 표 6에 요약하였다.
세포 및 달걀 생산 백신을 비교하기 위한 전 임상 연구
생체 내(페럿) 시험관 내*
약독화/복제 상 기도에서의 복제 정도 하 기도에서의 복제 동역학 바이러스 결합 헤마글루티닌 역가 상이한 시알산의 결합
면역원성 교차 반응성 동역학 물리적 특성 EM을 통한 형태 관찰 결과 감염성: 총 입자(게놈)
감염성 관찰 가능한 정도의 복제에 필요한 양 항체 반응에 필요한 양 융합 활성 최적 pH 최적 온도
게놈 서열
뉴라미니다제 활성
* = 1차적 생산물과 인간 세포 중에서 1회 계대 배양 후의 생산물 비교
실시예 8: 전 임상 동물 모델
페럿은 약독화 인플루엔자 백신과 구성 백신 균주의 약독화와 면역원성을 평가하는데 꾸준히 사용되고 있는 동물 모델이다. MCB로부터 생산된 세포-유래 인플루엔자 균주의 수행력(Performance)은 달걀에서 생산된 동일한 균주와 비교된다. 이 물질들을 제어된 연구 조건 하에서 상호 비교함으로써, 이 바이러스 생산물의 유사성(comparability)을 정확하게 확인할 수 있다.
2개의 백신이 페럿을 감염시키거나 또는 페럿의 체내에 "흡수"되는 능력을 평가하기 위하여, 이 동물을 가볍게 마취하고, 이것에 세포 생산 바이러스 제제 또는 달걀 생산 바이러스 제제를 비강 내 접종하였다. 접종 후 몇몇 시점에서 비강 세척 물질을 수집하고, 바이러스 양을 소수의 허용 가능한 방법 중 하나의 방법에 의해 평가하여, 동물의 상기도 내에서의 바이러스 복제 정도 및 동역학을 평가하였다. 바이러스를 일정 범위로 투여하여 실험을 수행하였으며, 이때, 이 실험에서는 다수의 균주와 상이한 3가 혼합물을 사용하여 달걀 생산 균주에 대한, 세포 배양액 생육 균주의 상대적 감염도를 일반화하였다. 인플루엔자 균주의 면역원성, 바이러스가 감염을 개시하는 능력과 유전적으로 연관된 특성을 평가하는데에도 동일한 연구를 수행하였다. 동물을 육종하고, 바이러스 접종 후 다양한 시점(주)에서 비강 내 세척액을 수집하였는데; 이때, 표본들은 감염에 대한 비강 내 IgA 반응 및 혈청 항체를 평가하는데 사용하였다. 이러한 데이터, 감염도, 혈청 중 항체 및 점막 항체 반응이 최고인 시점을 이용하여, 달걀 생산 백신에 대한 세포 생산 백신의 상대적 감염도를 비교 및 평가할 것이다. 세포 생산 및 달걀 생산 백신 균주는 유사한 감염성과 면역원성을 가질 가능성이 가장 클 것이라 예상된다. 만일 세포 유래 백신이 달걀 유래 생산물보다 감염성 또는 면역원성을 더욱 크게 나타낸다면, 그 투여량을 낮출 수 있는지 여부를 평가하는 추가의 연구도 수행하였다.
인간에 단일 단위 투여된 세포 배양액 유래 백신을 평가하기 위하여, 페럿 내에서 다수의 면역원성 및 복제 연구를 수행하였다. ca ts att 균주를 감염시켰을 때에는, 일반적으로 페럿 체내에서 강력하고 신속한 항체 반응을 유도한다. 뿐만 아니라, 각각의 ca ts att 균주는 통상적으로 테스트되며, 그 결과 비강 인두에서는 비교적 높은 역가로 복제하나, 이 동물의 폐 내에서는 감지못할 수준으로 복제하는, 약독화된(att) 표현형을 나타냄을 알 수 있다. 이와 같은 생물학적 특징을 바탕으로 한, 세포 배양액 성장의 영향력도 평가된다. 그러나, att 표현형은 이 균주의 유전자 조성의 완전한 일부이므로, 어떠한 차이점도 확인되지 않을 것이다. 이 균주의 성장 동역학과 교차 반응성은 이 동물에 인간 투여량만큼 1회 투여한 후 평가된다. 목적 혈청 항체는 유전적으로 같은 계통에 속하는 다수의 균주와 교차 반응하고; 세포-유래 백신은 동일한 성능을 가질 것이라 예상된다.
이와 같은 동등성 평가를 통하여, 1차 바이러스 생산물의 잠재적인 생화학적 및/또는 생리학적 차이점에 대해 상당한 정도로 관찰할 수 있었으며, 이를 통하여, 인간 세포 또는 동물 연구에서 처음 계대 배양한 바이러스에 의해 측정되며, ca ts att 균주 성능의 후성적인(epigenetic) 차이점에 따른 영향력을 입증할 수 있다. 현재, 서열 정보를 바탕으로 하여, MDCK 세포에서 생산되었을 때 ca ts att 균주의 면역원 성능에는 아무런 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
페럿은 인플루엔자에 대한 널리 입증된 동물 모델로서, 통상적으로 약독화 표현형과 ca ts att 균주의 면역원성을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 8∼10주령의 동물을 사용하여 약독화 여부에 대해 평가하며; 통상적으로, 연구는 테스트 군 또는 대조군 당 3∼5마리의 동물을 사용하도록 디자인된다. 면역원성에 관한 연구는 8주령∼6월령의 동물을 사용하여 수행되며, 일반적으로 테스트 군 또는 대조군 당 3∼5 마리의 동물을 사용한다. 이러한 숫자는, 군 사이에서 통계학적으로 유효하거나 관찰 상 중요한 비교 결과를 얻는데 충분한 정보를 제공한다. 대부분의 연구에 있어서, 인플루엔자-유사 징후가 관찰될 수 있긴 하지만, 그 가능성은 희박하다. 페럿은 식욕이나 체중 감소, 비강 내 또는 안구 방혈과 같은 징후를 나타내지 않으며; 인플루엔자-유사 질병에 관한 징후를 관찰하는 작업은 연구 과정 중 필요한 부분이므로, 개입 예를 들어, 진통제 투여는 이루어지지 않는다. 불편함에 대한 다른 징후 예를 들어, 피부가 헌다거나 체중 감소가 심하다거나 하는 현상들이 나타날 경우에는 연구에 참여한 수의사와 함께 논의한 후 동물에게 적절한 조치를 취하여야 할 것이다.
실시예 9: 마스터 바이러스 종자( Master Virus Seed ; MVS ) 개발
현재 인플루엔자 백신 균주는, 조류 세포에 야생형 바이러스와, A형 또는 B형 MDV를 공동 감염시켜, 원하던 6:2 유전자 배위를 가지는 자손을 분리 및 스크리닝함으로써 생산된다. 이러한 방법에는 조류 세포 배양액 및/또는 SPF 알을 통하여 바이러스를 수차례 계대 배양하는 과정이 필요하다. 최근 들어, 인플루엔자 바이러스 제제를 생산하는데 플라스미드 회수법이 도입되었다. 이 방법에 있어서, 광범위하게 테스트 및 특성 규명된 세포 은행으로부터 유래하는 Vero(아프리카 녹색 원숭이) 세포를 8개의 DNA 플라스미드(각 플라스미드는 8개의 인플루엔자 RNA 분절 중 하나의 cDNA 복사체를 함유함)로 전기 천공시킨다. 전기 천공 후 수일 경과시, 이 전기 천공된 세포의 상청액은 인플루엔자 바이러스를 함유한다. 이후 상청액을 SPF 알에 접종하여, 백신 균주를 증식시키고, 이를 생물학적으로 클로닝한다. 이 두 가지 방법을 통하여, SPF 알에 접종되어 MVS를 생산하는 백신 균주가 생산된다. 플라스미드 회수법은 몇 가지 이점 예를 들어, 야생형 분리주를 사용하는 경우보다 타이밍을 신뢰할 수 있고, 유전적으로 보다 정확한 유전자 분절을 얻을 수 있으며, 또한 우발적 제제에 의한 잠재적 오염 가능성이 감소한다는 이점을 가지며, 이들 두 가지 방법에 의해 생산된 각각의 MVS는 서로 구별이 불가능하며, 다량의 백신을 생산하는데 사용될 수 있다.
백신 균주의 최종 증폭 단계는 MDCK 세포 은행으로부터 유래하는 세포 내에서 수행된다. 이와 같은 최종 증폭 단계는 소규모의(< 20ℓ) MDCK 세포 배양액을 사용하여 이루어질 수 있다. 이 세포로부터 유래하는 상청액을 수집하고, 농축 및 특성 규명/테스트하여, MVS를 생산한다.
실시예 10: 이종성 프로-프로테아제를 발현하는 MDCK 세포에 감염된 감염성 바이러스의 단백 분해 활성
본 실시예는 돼지 트립시노겐을 구성적으로 발현하는 MDCK 세포주의 구성에 대해 기술하고 있다.
우선, 돼지의 트립시노겐을 암호화하는 유전자를 레트로바이러스 벡터 pLNHX(Clonetech Inc., Mountain View, CA)에 클로닝하였다. 이와 같이 한 다음, 트립시노겐을 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열 즉, 도 11(서열 번호 3)에 제시한 서열을 합성하여, 이를 셔틀 벡터에 클로닝하였다. 이후, 트립시노겐 유전자를 BglII로 셔틀 벡터로부터 절단해 내고, 이를 pLNHX 폴리링커의 BglII 위치에 클로닝하였다. 이와 같이 하여 생산된 벡터를 본원에서는 pTGEN이라 부른다.
그 다음, 이 pTGEN을 2개의 상이한 패키징 세포주인 Ampho 293과 GP2에 종래의 기술을 이용하여 형질 감염시켰다. 양성 대조군으로서 사용하기 위한 pTGEN(본원에서는 vTGEN이라 칭함), 또는 루시퍼라제 발현 벡터(본원에서는 vLLRN이라 칭함)를 함유하는 레트로바이러스를, 종래의 기술을 이용하여 패키징 세포를 용해시켜 감염 후 48시간 경과시에 분리하였다. MDCK 세포를 vLLRN(GP2 세포 내에서 생산된 vLLRN)으로 감염시켰더니, 1) MDCK 게놈에 루시퍼라제 유전자가 도입되어, 감염 후 48시간 경과시 MDCK 세포 내에서 루시퍼라제 활성을 검출할 수 있었으며(도 2); 2) 감염 후 48시간 경과시 MDCK 세포에 의하여 발현된 루시퍼라제의 양은 MDCK 세포를 감염시킬 때 사용된 vLLRN의 농도에 비례하였다(도 3). 그러므로, 양성 대조군을 통하여, pLNHX 시스템은 이종성 유전자로 MDCK 세포를 형질 감염시는데 사용될 수 있으며, 이러한 유전자는 MDCK 세포에 의해 발현된다는 사실이 입증되었다.
pTGEN으로 안정하게 형질 감염된 클론을 동정하기 위하여, 다음과 같은 방법을 사용하였다. vTGEN, vLLRN 또는 vLNHX(벡터 유일의 음성 대조군)으로 감염시킨 후 48시간 경과시, G418을 성장 배지에 첨가하여, 내성을 갖는 MDCK 클론을 선별하였다. 약 3주 경과 후, 각각의 MDCK 클론을 분리하고, 이를 동종 동계 배양액으로서 증폭시켰다.
안정하게 형질 전환된 MDCK 클론으로부터 루시퍼라제를 발현시킨 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 12개의 상이한 각 클론, 및 루시퍼라제를 높은 수준으로 발현하는 3개의 클론을 포함하는 2가지 상이한 혼합물을 이 방법에 의해 제조하였다. 12개의 각 클론은 1000개의 세포당 10∼300ng의 활성 루시퍼라제를 생산하였다. 그러므로, 이러한 데이터를 통하여, 안정하게 형질 전환된 MDCK 클론(트랜스 유전자를 높은 수준으로 발현하는 클론)은 pLNHX 벡터 시스템으로부터 얻을 수 있음을 입증할 수 있다.
형질 감염 실험으로부터 얻어진 각각의 클론 및 클론 혼합물에 관한 특성을 도 5에 요약하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 각각 트립시노겐을 발현하는 18개의 MDCK 클론은 Ampho 293 세포와 GP2 세포 내에서 생산된 레트로바이러스 입자로부터 분리되었다.
실시예 11: 배양액 중 트립시노겐을 발현하는 MDCK 세포 내에서의 인플루엔자 바이러스 감염 및 성장
본 실시예는 외인성 트립신의 존재 및 부재 하에서 트립시노겐을 발현하는 MDCK 세포 내에서 2개의 상이한 인플루엔자 균주의 감염 및 성장에 관하여 기술하고 있다.
트립시노겐을 발현하는 2개의 MDCK 클론(하나는 MDCK 세포를 Ampho 293 세포에서 생산된 입자로 형질 감염시켜 생산된 것이고, 다른 하나는 GP2 세포 내에서 생산된 입자로 형질 감염시켜 생산된 것임)이 바이러스 숙주로서 사용되는 능력을 다음과 같이 평가하였다. 0시 경과시, 적당한 클론으로부터 유래한 세포를 균주 ca A/앤 아버/6/60 MDV-A 또는 ca A/뉴 칼레도니아/20/90으로, 0.01배 감염 시켰다(즉, 100개의 세포당 1개의 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다). pLLRN 또는 pLNHX로 형질 감염된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 배양액 중 바이러스 역가를 감염 후 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간 경과시에 평가하였다.
감염 후 24시간 경과시, 실험 군 중 하나에는 외인성 돼지 트립신을 세포 배양액에 최종 농도 0.1㎍/㎖가 되도록 첨가하였다(●). 1일(감염 후 24시간)∼5일(감염 후 120시간) 경과시, 다른 실험 군에는 배양액 중 외인성 돼지 트립신의 농도가 1㎍/㎖가 되도록 유지시켰다. 실험의 마지막 군에는, 외인적으로 트립신을 첨가하지 않았다.
실험 결과를 도 6a∼도 6c에 나타내었다. 도 6a는 위 감염된(mock-infected) MDCK 세포를 MDV-A(좌측 상단) 또는 ca A/NC(우측 상단)와 함께 인플루엔자 감염시킨 결과와, 루시퍼라제-발현 MDCK 세포를 MDV-A(좌측 하단) 또는 ca A/NC(우측 하단)와 함께 인플루엔자 감염시킨 결과를 제시하고 있다. 예상했던 바와 같이, 외인성 트립신을 1일∼5일 경과시 1㎍/㎖ 첨가하였을 때(□), 전체적인 바이러스 수율은 실질적으로 모든 실험에 있어서 높았으며, 외인성 트립신을 첨가하지 않았을 때(△), 바이러스 수율은 가장 낮았다. 1일 경과시에, 외인성 트립신을 0.1㎍/㎖ 첨가하면, 바이러스 수율은 거의 증가하지 않았다(●).
도 6b∼도 6c는 2개의 상이한 트립시노겐-발현 MDCK 클론을 MDV-A(좌측 패널) 또는 ca A/NC(우측 패널)와 함께 인플루엔자 감염시켰을 때의 결과를 제시하는 것이다. 이 실험에 사용된 MDCK 클론(도 6b)은 Ampho 293 세포 내에서 생산된 바이러스 입자로 형질 감염시켜 생산되었던 반면에, 본 실험에 사용된 MDCK 클론(도 6c)은 GP2 세포 내에서 생산된 바이러스 입자로 형질 감염시킴으로써 생산되었다.
도 6b∼도 6c에 나타낸 바와 같이, 감염된 세포가 트립시노겐을 발현할 경우, 바이러스 역가는 상당히 증가하였다. 모든 경우에 있어서, 외인성 트립신이 없을 경우에 얻어진 바이러스 역가(△)는, 대조군에서 관찰되는 바이러스 역가보다는 컸지만, 1㎍/㎖의 트립신이 존재할 경우에 얻어진 바이러스 역가(□)에 비하여는 낮았다. 그러나, 몇몇 경우(예를 들어, 도 6b의 우측 상부 및 우측 하부; 도 6c의 좌측 상부 및 우측 하부), 1일 경과시 소량의 트립신(0.1㎍/㎖)을 첨가하면(●), 바이러스 역가는 외인성 트립신이 존재할 경우에 관찰되는 바이러스 역가와 거의 비슷하게 증가하였다. 어떠한 특정 이론이나 작용 기작에 한정되지 않았을 때, 외인성 트립신의 첨가는, 트립시노겐의 프로-펩티드를 절단하여, 이것의 활성 형태에 대한 프로효소를 활성화시키기에 충분하였다고 생각된다. 그러므로, 배양액을 소량의 펩티다제로 "프라이밍(priming)"시키면, 배양액 중 세포에 의해 생산되는 프로효소를 활성화시켜, 전체적인 바이러스 수율을 증가시킬 수 있다.
실시예 12: 태깅된 트립시노겐의 MDCK 세포 내에서의 발현
본 실시예는 MDCK 세포 내에서 6개의 히스티딘 잔기로 태깅된 트립시노겐의 생산 및 검출 방법에 관하여 기술하고 있다.
트립시노겐을 높은 수준으로 발현하는 클론을 동정하기 위하여, 6개의 His-표지화 트립시노겐 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 MDCK 세포에 형질 감염시켜 다른 클론 세트를 제조하였다. 간단히 말해서, 돼지 트립시노겐을 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열(도 11 참조)을 pDEST™ 26(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)에 클로닝하고, 결과로 생성된 벡터를 MDCK 세포에 형질 감염시켰다. 상기 pDEST™ 26 플라스미드는 폴리링커에 인접한 위치에 존재하는 6개의 His 태그를 암호화하므로, pDEST™ 으로부터 유래하는 인공 트립시노겐 유전자가 발현되면 6개의 His가 태깅된 돼지 트립시노겐이 생산된다. 이후, 형질 감염된 세포를 48시간 동안 배양한 다음, G418의 존재 하에서 이 세포를 약 3주 동안 배양하여 형질 전환체를 선별하였다. 이후, 16개의 G418 내성 클론을 분리하고, 이를 단일 클론으로서 증식시켰다.
16개의 클론에 의한 트립시노겐의 발현 여부는 웨스턴 블럿으로 평가하였다. 간단히 말해서, 각각의 클론을 1∼2일 동안 배양한 다음, 이 세포를 원심분리로 수집하고, 1×인산염 완충 염수로 세척한 다음, 세포를 1×단백질 용해 완충액(Promega Corp.; Madison, WI) 200㎕ 중에 세포를 용해시켜, 단백질을 세포로부터 분리하였다. 그 다음, 각 단백질 용해물 10㎕를 12%의 변성 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 웨스턴 블럿 분석법을 수행하였다. 6개의 His-표지화 트립시노겐을, 1:10,000으로 희석된 트립신에 특이적인 토끼 항-트립신 폴리클로날 항체(Chemicon AB823; Chemicon International; Temecula, CA)로 검출하였다. 염소 항-토끼 HRP 컨쥬게이트화 2차 항체(1:3,000 희석)를 첨가하고, 이를 2회 세척한 다음, 여기에 ECL과 기질(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Piscataway, NJ)을 첨가하여 단백질을 가시화하였다. 웨스턴 블럿의 결과를 도 7a및 도 7b에 제시하였다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, 16개의 G418 내성 MDCK 클론 중 12개는 검출할 수 있을 정도의 양만큼 6개의 His-표지화 트립시노겐을 생산하였다.
실시예 13: 유도성 프로모터의 제어 하, MDCK 세포 내에서의 트립신의 발현
본 실시예는 유도성 프로모터의 제어 하에서 트립신을 발현하는 MDCK 세포주의 구성에 관하여 기술하고 있다.
바이러스 감염 후 적당한 시기에 세포 배양액에 트립신을 제공하는 다른 방법을 테스트하기 위하여, 유도성 프로모터의 제어 하에서 트립신을 발현하는 MDCK 세포를 다음과 같이 제조하였다. 우선, MDCK 세포주를 pcDNA™ 6/TR(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)로 형질 감염시키고, 블라스티신의 존재 하에서 이 형질 감염체를 선별하였다. 이후, 항생제 내성 클론을 분리하고, 이를 단일의 클론으로부터 증식시켰다.
그 다음, 양성 대조군 벡터인 pDEST30Luc(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 각각의 클론 내에 통합된 벡터로부터 테트라사이클린(tet) 억제 인자 단백질이 발현되는지 여부를 테스트하였다. 본 실험의 목적은 충분한 tet 억제 인자 단백질을 발현하는 MDCK 클론이 독시사이클린(dox)의 부재 하에서 매우 낮은 수준으로 루시퍼라제를 발현하고, dox의 존재 하에서는 높은 수준으로 발현하는지 여부를 확인하기 위한 것이다. 이와 같이 하기 위해서, 스크리닝될 각 클론으로부터 유래하는 약 20,000개의 세포를 6-웰 미세 역가 평판의 각 웰에 넣었다. 종래의 기술을 이용하여 각 시료를 pDEST30Luc으로 일시 형질 감염시킨 다음, dox를 형질 감염 후 1일 경과시에 전체 웰 중 3개의 웰에 가하였다. 형질 감염후 2일 경과시 세포를 수집하고, 이것의 상청액 20㎕를 각각의 루시퍼라제 검정용으로서 사용하였다.
12개의 클론에 대해 수행한 루시퍼라제 검정 결과를 도 8에 제시하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 클론 3은 독시사이클린의 존재 및 부재 하에서 관찰되는 활성 간 차이가 가장 컸다. 일시적 루시퍼라제 검정법을 이용하여 36개의 MDCK-Trex 클론을 스크리닝하였다. 2개의 클론 즉, MDCK/R3 및 MDCK/R7을 선별하여 유도성 트립신 발현 MDCK 세포를 제조하였다[유도 배수: +DC/-DC = 13.1 및 14.0]. MDCK/R3 또는 R7을 pT-Rex-DEST30/루시퍼라제로 형질 감염시켰다(대조군)(도 13). 29개의 항생제 내성 클론 R3/Luc 및 R7/Luc를 분리하여, 이를 독시사이클린(DC)으로 유도시키거나 유도시키지 않는 루시퍼라제 검정법을 위해 증폭시켰다. 화학 물질로 인한 유도 이후, R3에 대해서는 70배 이하, 그리고 R7에 대해서는 56배 이하 차이가 있었다[+DC/-DC = 70 및 56]. 이와 같은 데이터를 통하여, R3/Luc 및 R7/Luc 클론은 루시퍼라제 유전자를 안정적으로 운반하고, 루시퍼라제 발현은 DC에 의해 유도 가능하다는 사실을 알 수 있다.
유도성 트립신 발현 MDCK 세포를 제조하기 위하여, MDCK/R3 또는 R7을 pT-Rex-DEST30/트립신으로 형질 감염시키고(도 13), 항생제 내성 클론은 MDCK 성장 배지 + 블라스티시딘/G418을 이용하여 2∼3주 동안 선별하였다. 트립신을 발현하는 70개의 클론을 분리하고, 이를 프로테아제 활성 검정용으로 증폭시켰다. 이러한 클론으로부터 유래하는 게놈 DNA를 분리하고, 트립신 유전자를 PCR에 의해 검출하였다. DNA 서열 분석법에 의해서는 DNA 뉴클레오시드 돌연 변이가 관찰되지 않았다.
그 다음, 독시사이클린의 존재 및 부재 하에서 관찰되는 활성 간 차이가 가장 큰 클론을 성장 곡선 연구법 예를 들어, 실시예 11에 기술된 바와 같은 연구법에 의해 평가하여, 유도적으로 트립시노겐을 발현하는 세포에서 배양된 인플루엔자 바이러스의 성장 및 역가에 대해 연구하였다. 약 15개의 클론은 DC 유도 작용으로 인하여 트립신을 높은 수준으로 발현하였고, DC가 존재하지 않을 경우에는 트립신을 낮은 수준으로 발현하였다. 예를 들어, 하나의 클론 R3/6U7은 DC가 존재하지 않을 때 트립신 발현 수준이 기본 수준인 약 10ng/㎖였는데, 이 수준은 3㎍/㎖의 DC로 유도될 경우에는 약 2.5㎍/㎖(약 250배 유도)까지 증가한다. 대부분의 인플루엔자 백신 균주를 발현하기 위해서, 트립신은 일반적으로 약 1.0㎍/㎖의 농도로 사용된다. 이 세포 내에서의 트립신 발현 수준은 유도적이며, 감기 백신 생산의 경우에는 DC 농도가 상이함에 따라서 조절되는 것이다.
다수의 유도성 트립신 발현 MDCK 클론에서는 인플루엔자 균주의 감염 및 복제가 허용되어, 백신 생산에 유용하였다. 모 MDCK 세포는 일반적으로 현탁액 중 10% 미만의 세포와 함께 부착성 세포로서 성장한다. 그러나, 유도성 트립신 MDCK 클론은 현탁액 세포 중에서 성장한 세포 중 약 30%와 마찬가지로 부착성이 떨어진다. 현탁액 중 대부분의 세포(> 90%)는 트리판 블루 염색 분석법에 의해 생존하고 있는 것으로 확인된다. 내인성 트립신 발현을 적응시킴으로써, 현탁액 중 세포 %는 증가할 수 있다. 감기 백신 생산용인 현탁 세포를 사용하면, 담체를 사용할 필요가 없어지므로 생산 비용을 중일 수 있다.
실시예 14: 스트렙토마이세스 그리세우스로부터의 박테리아 세린 프로테아제의 클로닝
본 실시예는 박테리아인 스트립토마이세스 그리세우스로부터 세린 프로테아제를 클로닝하는 방법에 관하여 기술하고 있다.
그러기 위해서, 프라이머 쌍(Spr T 전방향 및 역방향 프라이머)을 사용하여 게놈 DNA로부터 유래하는 SPRT 프로테아제의 암호화 서열을 증폭시켰다(종래 기술 사용). 이 프라이머 쌍의 뉴클레오티드 서열을 도 12에 나타내었다. 스트립토코커스 그리세우스 균주(ATCC에 수탁 번호 23915로서 기탁됨)를 게놈 DNA의 공급원으로서 사용하였다. 이후, 상기 sprT 유전자를 종래의 기술을 이용하여 pDEST™ 14에 클로닝하여, 이 sprT 유전자의 뉴클레오티드 서열을 종래의 기술을 이용하여 서열 결정하였다.
sprT 유전자의 뉴클레오티드 서열을 도 9에 나타내었다.
지금까지, 본 발명을 명확하게 이해하기 위하여 더욱 자세히 기술하였는데, 이때 상기 기술된 사항을 통하여, 본 발명에 다양한 형태의 변화가 가하여질 수 있을 뿐 아니라, 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않고서 더욱 미세한 범위까지 변화를 가할 수 있음을 당 업자는 알고 있을 것이다. 예를 들어, 전술한 모든 기술과 장치는 다양하게 병행 및 병용될 수 있다. 본 출원에 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌들은 그 자체로서, 모든 목적을 위하여, 상기 각각의 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 모든 목적을 위하여 참고 문헌으로서 인용되어 있다고 기술되어 있는 바와 동일한 정도로, 참고용으로서 인용되어 있다. 뿐만 아니라, 미국 가 명세서 출원 제60/793,522호(2006년 4월 19일 출원); 미국 특허 출원 제60/793,525호(2006년 4월 19일 출원); 미국 특허 출원 제60/702,006호(2005년 7월 22일 출원); 미국 특허 출원 제60/699,556호(2005년 7월 15일 출원); 미국 특허 출원 제60/699,555호(2005년 7월 15일 출원); 미국 특허 출원 제60/692,965호(2005년 6월 21일 출원); 및 미국 특허 출원 제60/692,978호(2005년 6월 21일 출원)도 그 자체로서 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Vaccines, Inc Duke, Gregory Kemble, George Young, James Mo, Chengjun Hazari, Nisha <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSING A HETEROLOGOUS PROTEASE <130> FL411PCT <150> 60/793,522 <151> 2006-04-19 <150> 60/699,555 <151> 2005-07-15 <150> 60/793,525 <151> 2006-04-19 <150> 60/702,006 <151> 2005-07-22 <150> 60/692,978 <151> 2005-06-21 <150> 60/699,556 <151> 2005-07-15 <150> 60/692,965 <151> 2005-06-21 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 983 <212> DNA <213> Streptomyces griseus <220> <221> misc_feature <222> (898)..(898) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (915)..(916) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 agatcacagt ttgtacaaaa aagcaggctg cgttaacgaa ttcgcccttc cccacgaaag 60 aaggcaatcc gtgaagcaac tcctgcgtgc cctccagaga tgttccgtcg tcgtcgccac 120 cgtcgccatc gccgtcgtcg gcctccagcc cgtcacggcg tcggcagccc ccaaccccgt 180 cgtcggcgga acccgcgccg cccagggcga gttccccttc atggtccggc tctccatggg 240 ctgcggcggc gcgctgtacg ccaaggacat cgtcctcacc gccgcccact gtgtgaacgg 300 atcgggcaac aacacctcga tcaccgccac cgccggcgtc gtcgacctcc agtcgtccag 360 cgcgatcaag gtccgctcca ccaaggtcct ccaggccccc ggctacaacg gcaccggcaa 420 ggactgggcg ctcatcaagc tcgcccagcc catcaaccag cccacgctga agatcgccac 480 caccaccgcg tacaaccagg gcacgttcac cgtcgccggc tggggcgcca accgcgaggg 540 cggcagccag cagcgctacc tgctcaaggc caacgtcccg ttcgtctccg acgccgcctg 600 ccgctccgcc tacggcaacg aactcgtggc caacgaggag atctgcgccg gataccccga 660 caccggtggc gtcgacacct gccagggtga ctccggcggc ccgatgttcc gcaaggacaa 720 cgccgacgag tggatccagg tcggcatcgt cagctggggc tacggctgcg cccggcccgg 780 ctacccgggt gtctacaccg aggtctcgac cttcgcttcc gccatcgcct cggccgcccg 840 cacgctctga cggcacgtac cggcacccat cgataaccca gctttcttgt acaagtgnga 900 tgatccggct gctannaagc ccgaaaggaa gctgagtggc tgctgcacgc tgagcatact 960 agcataccct tggggctcta acg 983 <210> 2 <211> 259 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <400> 2 Met Lys Gln Leu Leu Arg Ala Leu Gln Arg Cys Ser Val Val Val Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Ile Ala Val Val Gly Leu Gln Pro Val Thr Ala Ser Ala 20 25 30 Ala Pro Asn Pro Val Val Gly Gly Thr Arg Ala Ala Gln Gly Glu Phe 35 40 45 Pro Phe Met Val Arg Leu Ser Met Gly Cys Gly Gly Ala Leu Tyr Ala 50 55 60 Lys Asp Ile Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Asn Gly Ser Gly Asn 65 70 75 80 Asn Thr Ser Ile Thr Ala Thr Ala Gly Val Val Asp Leu Gln Ser Ser 85 90 95 Ser Ala Ile Lys Val Arg Ser Thr Lys Val Leu Gln Ala Pro Gly Tyr 100 105 110 Asn Gly Thr Gly Lys Asp Trp Ala Leu Ile Lys Leu Ala Gln Pro Ile 115 120 125 Asn Gln Pro Thr Leu Lys Ile Ala Thr Thr Thr Ala Tyr Asn Gln Gly 130 135 140 Thr Phe Thr Val Ala Gly Trp Gly Ala Asn Arg Glu Gly Gly Ser Gln 145 150 155 160 Gln Arg Tyr Leu Leu Lys Ala Asn Val Pro Phe Val Ser Asp Ala Ala 165 170 175 Cys Arg Ser Ala Tyr Gly Asn Glu Leu Val Ala Asn Glu Glu Ile Cys 180 185 190 Ala Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser 195 200 205 Gly Gly Pro Met Phe Arg Lys Asp Asn Ala Asp Glu Trp Ile Gln Val 210 215 220 Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Gly 225 230 235 240 Val Tyr Thr Glu Val Ser Thr Phe Ala Ser Ala Ile Ala Ser Ala Ala 245 250 255 Arg Thr Leu <210> 3 <211> 753 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 agatctatga aggctaaatt gctggtgctc ctgtatgctt ttgttgctgg attccctaca 60 gacgacgacg acaaaatcgt cggtggctat acttgtgccg ctaacagcat tccatatcaa 120 gtgagtctca atagtggttc tcacttctgc ggtggctcac tgatcaatag ccagtgggtc 180 gtgtccgcag cccattgtta caaaagccgg atccaggtgc ggcttggcga acataatatc 240 gacgttcttg agggcaacga gcagtttatc aacgctgcta agattatcac ccatcctaat 300 ttcaatggca acaccctgga taatgatatt atgctcatca aacttagcag ccctgccacc 360 ctcaatagtc gggttgcgac agtctccctg cctcgctcct gcgccgctgc cggtacggaa 420 tgtttgatct ccgggtgggg aaacacaaaa tcttctgggt cttcttatcc ttccctgctg 480 cagtgcctga aagccccagt gctgtctgat tcttcttgta agagttccta cccaggtcag 540 atcacgggca acatgatttg cgtcgggttt cttgagggcg gcaaggattc ttgtcagggt 600 gattccggag gacctgttgt ctgcaatggc cagttgcagg gaatcgtgag ttggggatac 660 ggttgcgccc agaagaacaa gcccggagtg tatacgaagg tatgcaacta tgttaactgg 720 atacagcaga ccatcgctgc caactgaaga tct 753 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primere <400> 4 ccccacgaaa gaaggcaatc cgtg 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 5 gggtgccggt acgtgccgtc ag 22

Claims (22)

  1. 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산은 상기 숙주 세포의 게놈으로 통합되고, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제는 상기 세포에서 정상적으로는 발현되지 않는 것인 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 프로테아제를 발현하는 것인 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로테아제가 세린 프로테아제인 숙주 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제가 프로-프로테아제인 숙주 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 숙주 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 발현은 구성적 활성(constitutively active) 프로모터의 제어 하에 있는 것인 숙주 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제의 분비 를 유도하는 분비 신호를 포함하는 것인 숙주 세포.
  8. 제1항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간의 세포, 영장류의 세포, 개의 세포, 햄스터의 세포, 마우스의 세포 또는 래트의 세포인 숙주 세포.
  10. 제1항에 있어서, 조류의 세포인 숙주 세포.
  11. 제1항에 있어서, 적응 과정 없이 현탁액 중에서 생육하는 것인 숙주 세포.
  12. 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법으로서,
    a) 제1항의 숙주 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키거나, 상기 숙주 세포를 인플루엔자 게놈을 암호화하는 핵산으로 형질 감염시킴으로써, 제1항의 숙주 세포에 인플루엔자 게놈을 도입하는 단계;
    b) 상기 세포를 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    c) 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 숙주 세포는 프로-프로테아제를 발현하고, 상기 방법은 외인성 프로테아제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 외인성 프로테아제는 최대 농도 약 0.1 ㎍/㎖로 첨가하는 것인 방법.
  15. 외인적으로 첨가된 프로테아제 없이 인플루엔자 바이러스를 복제하는 방법으로서,
    a) 제1항의 숙주 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키거나, 상기 숙주 세포를 인플루엔자 게놈을 암호화하는 핵산으로 형질 감염시킴으로써, 제1항의 숙주 세포에 인플루엔자 바이러스 게놈을 도입하는 단계;
    b) 인플루엔자 바이러스가 복제할 수 있는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계로서, 상기 조건은 외인적으로 첨가된 프로테아제를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    c) 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 세포 배양액 중에서 생육한 인플루엔자 바이러스의 역가를 증가시키는 방법으로서, 세포 배양액 중에서 상기 인플루엔자 바이러스를 배양하여[여기서, 상기 세포 배양액 중의 세포는, i) 상기 세포와 이종성이고 ii) 상기 인플루엔자 바이러 스의 헤마글루티닌을 절단하는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 안정적으로 발현함], 상기 세포 배양액 중에서 생육한 인플루엔자 바이러스의 역가를, 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하지 않는 세포에서 상기 인플루엔자 바이러스를 배양함으로써 얻은 역가에 비하여 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
  17. 인플루엔자 복제를 지지할 수 있는 숙주 세포에서 이종성 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 생산하는 방법으로서, 정상적으로는 상기 세포에서 발현되지 않는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를, 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제가 발현될 수 있는 조건 하에서 배양함으로써, 상기 세포에서 상기 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포는 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 숙주 세포의 배양액 중에서 생육한 바이러스의 역가를 증가시키기에 충분한 양의 프로테아제 또는 프로-프로테아제를 발현하는 것인 방법.
  19. 서열 번호 1을 포함하는 분리된 핵산.
  20. 서열 번호 2의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  21. 제19항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  22. 제21항의 발현 벡터를 포함하는 분리된 세포.
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