CN105120893B - 流感病毒重配 - Google Patents

流感病毒重配 Download PDF

Info

Publication number
CN105120893B
CN105120893B CN201380071503.1A CN201380071503A CN105120893B CN 105120893 B CN105120893 B CN 105120893B CN 201380071503 A CN201380071503 A CN 201380071503A CN 105120893 B CN105120893 B CN 105120893B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
influenza
sections
vaccine
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380071503.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105120893A (zh
Inventor
P·梅森
P·R·道米策
H·特鲁赛姆
P·苏帕菲帕特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Synthetic Genomics Vaccines Inc
Original Assignee
Novartis AG
Synthetic Genomics Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG, Synthetic Genomics Vaccines Inc filed Critical Novartis AG
Publication of CN105120893A publication Critical patent/CN105120893A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105120893B publication Critical patent/CN105120893B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/16152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了用于生产重配甲型流感病毒的新的流感供体毒株。

Description

流感病毒重配
本申请部分是在生物医学高级研究和开发机构(BARDA)授予的基金号HHSO10020100061C的政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明属于甲型流感病毒重配领域。此外，其涉及制造用于保护抵御甲型流感病毒的疫苗。
背景技术
针对流感感染的最有效保护是抗流行株的疫苗接种，且尽快生成用于疫苗生产的流感病毒是重要的。
野生型流感病毒通常在鸡蛋和细胞培养物内生长达到低效价。为了获得生长更好的毒株用于疫苗生产，目前常见的做法是用快速生长的高产供体毒株重配流行疫苗株。这可以通过以下方法完成：用所述流行流感毒株(所述疫苗毒株)和所述高产供体毒株共同感染培养宿主，并选择含有来自所述疫苗毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)区段和来自所述供体毒株的其它病毒区段(即，编码PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1和NS2的那些)的重配病毒。另一个方法是通过反向遗传重配流感病毒(参见，例如参考文献1和2)。
参考文献3报道，含有来自A/Texas/1/77的PB1基因区段、来自A/New Caledonia/20/99的HA和NA区段、源自A/Puerto Rico/8/34的经修饰PA区段和来自A/Puerto Rico/8/34的其余病毒区段的重配流感病毒显示增加的细胞中生长。
目前，就重配流感病毒而言仅有有限数量的供体毒株用于疫苗生产，而最常用的毒株是A/Puerto Rico/8/34(A/PR/8/34)毒株。然而，包含A/PR/8/34主链区段的重配流感病毒常常不能充分良好生长以确保有效疫苗生产。因此，本领域需要提供进一步和改善的供体毒株用于流感病毒重配。
具体实施方式
发明人目前惊奇地发现，与包含来自相同供体毒株的全部主链区段的重配甲型流感病毒相比，包含来自两种或多种流感供体毒株的主链区段的流感病毒能在培养宿主(特别是细胞培养物)内更快生长。具体而言，发明人已发现，包含源自两种不同高产供体毒株的主链区段的流感病毒能用靶标疫苗相关HA/NA基因产出重配株的得率高于单独使用两种原始供体毒株中任一种所得重配株。
具有来自两种或多种流感供体毒株的主链区段的重配甲型流感病毒可包含来自不同甲型流感病毒的HA区段和PB1区段。在这些重配流感病毒中，PB1区段优选来自与疫苗毒株具有相同流感病毒HA亚型的供体病毒。例如，PB1区段和HA区段可以都来自具有H1亚型的流感病毒。重配甲型流感病毒还可包含来自具有不同流感病毒HA亚型的不同甲型流感病毒株的HA区段和PB1区段，其中PB1区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自具有H1或H5HA亚型的流感病毒。例如，PB1区段可来自H1病毒和/或HA区段可来自H3流感病毒。
本发明还提供了主链片段来自两种或多种流感供体毒株的重配甲型流感病毒，其中PB1区段来自A/California/07/09流感毒株。该区段可与SEQ ID NO:22的序列具有至少95％相同性或100％相同性。重配甲型流感病毒可具有H1HA亚型。应理解，本发明该方面所述的重配流感病毒将不包含来自A/California/07/09的HA和/或NA区段。
当所述重配甲型流感病毒包含来自两种或三种供体毒株的主链区段时，各供体毒株可提供多于一种的所述重配甲型流感病毒主链区段，但所述供体毒株中的一或两种也可仅提供单一主链区段。
当所述重配甲型流感病毒包含来自二、三、四或五种供体毒株的主链区段时，这些供体毒株中的一种或两种可提供多于一种的所述重配甲型流感病毒主链区段。通常，重配甲型流感病毒不可包含超过六种主链区段。因此，例如，若这些供体毒株之一提供五种病毒区段，则该重配甲型流感病毒仅能包含来自总共两种不同供体毒株的主链区段。
当重配甲型流感病毒包含来自A/Texas/1/77的PB1区段时，其优选不包含来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M区段。当重配甲型流感病毒包含来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M区段时，其优选不包含来自A/Texas/1/77的PB1区段。在一些实施方式中，本发明不涵盖具有来自A/Texas/1/77的PB1区段和来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP和M区段的重配甲型流感病毒。来自A/Texas/1/77的PB1区段可具有SEQ ID NO:27的序列且来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M区段可分别具有SEQ ID NO 28、29或30的序列。
与包含来自相同流感供体毒株的所有主链区段的重配流感毒株相比，本发明的甲型流感病毒可在相同时间内并在相同生长条件下在MDCK细胞和/或鸡蛋中生长至较高的病毒效价。
本发明还提供了一种重配甲型流感病毒，其包含来自供体毒株的至少一种主链病毒区段，该供体毒株是A/California/07/09流感毒株。当所述至少一种主链病毒区段是PA区段时，其序列可与SEQ ID NO:15的序列具有至少95％或至少99％相同性。当所述至少一种主链病毒区段是PB1区段时，其序列可与SEQ ID NO:16的序列具有至少95％或至少99％相同性。当所述至少一种主链病毒区段是PB2区段时，其序列可与SEQ ID NO:17的序列具有至少95％或至少99％相同性。当所述至少一种主链病毒区段是NP区段时，其序列可与SEQID NO:18的序列具有至少95％或至少99％相同性。当所述至少一种主链病毒区段是M区段时，其序列可与SEQ ID NO:19的序列具有至少95％或至少99％相同性。当所述至少一种主链病毒区段是NS区段时，其序列可与SEQ ID NO:20的序列具有至少95％或至少99％相同性。
至少一种主链区段可来源于A/California/07/09流感毒株，如先前段落中所述。优选的重配甲型流感病毒包含来自A/California/07/09流感毒株的PB1区段。发明人已表明，包含该主链区段的重配甲型流感病毒在培养宿主中生长良好。重配甲型流感病毒可包含来自不是A/California/07/09的流感病毒的所有其他主链区段。
重配甲型流感病毒可包含来自A/California/07/09的PB1区段和来自流感毒株PR8-X的所有其他主链区段。PR8-X的区段具有SEQ ID NO:1(PA)、SEQ ID NO:2(PB1)、SEQID NO:3(PB2)、SEQ ID NO:4(NP)、SEQ ID NO:5(M)、SEQ ID NO:6(NS)、SEQ ID NO:7(HA)或SEQ ID NO:8(NA)的序列。因此，本发明的流感病毒可包含选自下组的一种或多种基因组区段：与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％或99％相同性的PA区段、与SEQ ID NO:3的序列具有至少95％或99％相同性的PB2区段、与SEQ ID NO:5的序列具有至少95％或99％相同性的M区段、与SEQ ID NO:4的序列具有至少95％或99％相同性的NP区段，和/或SEQ ID NO:6的序列具有至少95％或99％相同性的NS区段。该重配甲型流感病毒还可包含具有SEQ ID NO:1和/或3-6的序列的一种或多种病毒区段。在优选的实施方式中，重配流感毒株包含本段落中提及的所有基因组区段。该实施方式是优选的，因为发明人发现这种重配甲型流感病毒在细胞培养物和含胚鸡蛋中生长地特别好。
通常，重配流感病毒会每种主链区段各仅包含一个。例如，当流感病毒包含来自A/California/07/09的PB1区段时，其不会同时包含来自另一甲型流感供体毒株的PB1区段。
所述主链病毒区段可就特定培养宿主中的培养进行优化。例如，当重配流感病毒在哺乳细胞中培养时，使至少一种病毒区段适应培养宿主中的最佳生长是有利的。例如，当表达宿主是犬细胞(如MDCK细胞系)时，该病毒区段可具有优化细胞中病毒生长的序列。因此，本发明的重配流感病毒可包含PB2基因组区段，该区段在使用成对比对算法与SEQ IDNO:3比对时在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸389的位置处具有赖氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸559的位置处具有天冬酰胺。根据本发明，还提供了重配流感病毒，其中PA基因组区段在使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸327的位置处具有赖氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸444的位置处具有天冬氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸675的位置处具有天冬氨酸。本发明的重配流感病毒还可具有NP基因组区段，该区段在使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸27的位置处具有苏氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸375的位置处具有天冬酰胺。变体流感毒株还可包含两个或多个这些突变。优选地，变体流感病毒含有同时具有前述两种氨基酸变化的变体PB2区段，和/或含有前述全部三种氨基酸变化的PA，和/或含有前述全部两种氨基酸变化的NP区段。该甲型流感病毒可能是H1毒株。
替代或补充地，该重配流感病毒可包含PB1区段，其在使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸200的位置处具有异亮氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸338的位置处具有天冬酰胺，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸529的位置处具有异亮氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ IDNO:2的氨基酸591的位置处具有异亮氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸687的位置处具有组氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸754的位置处具有赖氨酸。
优选的成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[4]，使用默认参数(如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[5]。
本发明提供一种制备本发明重配甲型流感病毒的方法。这些方法包括以下步骤：(i)将一种或多种表达构建体引入培养宿主，所述表达构建体编码产生甲型流感病毒所需的病毒区段，其中，主链病毒片段来自两种或多种流感毒株；以及(ii)培养所述培养宿主以产生重配病毒，和可选地(iii)纯化步骤(ii)中获得的病毒。在这些方法中，HA和PB1区段可来自具有相同流感HA亚型的不同流感毒株，或者HA和PB1区段可来自具有不同HA亚型的不同流感毒株，前提是PB1区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自具有H1或H5HA亚型的流感病毒。PB1主链病毒区段可以来自A/California/07/09。一种或多种表达构建体还可编码一种或多种来自PR8-X的PB2、PA、NP、M或NS区段或者与SEQ ID NO:9和/或11-14具有至少90％或100％相同性的区段。当PB1区段来自A/California/07/09时，表达构建体可不编码来自A/California/07/09的HA和/或NA区段。
至少一种表达构建体可包含与SEQ ID NO:22的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的序列。
在一些实施方式中，所述至少一种表达构建体不编码来自A/Texas/1/77流感毒株的PB1区段。
这些方法还包括以下步骤：(iv)用步骤(ii)或步骤(iii)中获得的病毒感染培养宿主；(v)培养来自步骤(iv)的培养宿主以生成进一步的病毒；和可选地(vi)纯化步骤(v)中获得的病毒。
本发明还提供一种用于产生流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用本发明的重配病毒感染培养宿主；(b)培养来自步骤(a)的宿主以产生所述病毒；和可选地(c)纯化步骤(b)中获得的病毒。
本发明还提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：(d)通过上述实施方式中任何一种的方法制备病毒和(e)从所述病毒制备疫苗。
本发明提供一种表达系统，所述表达系统包括一种或多种含有编码甲型流感病毒区段的vRNA的表达构建体，其中，所述表达构建体编码来自具有相同流感HA亚型的两种不同流感毒株的HA和PB1区段或编码来自具有不同流感病毒HA亚型的两种不同流感毒株的HA和PB1区段，该PB1区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或该HA区段不是来自具有H1或H5HA亚型的流感病毒。
本发明还提供一种表达系统，所述表达系统包括一种或多种含有编码甲型流感病毒区段的vRNA的表达构建体，其中，一个或多个所述表达构建体编码A/California/07/09的PB1区段。所述表达构建体还可包含编码一种或多种来自PR8-X的PB2、NP、NS、M和/或PA区段的vRNA。因此，所述表达构建体可包含一种或多种与SEQ ID NO:9和/或11-14具有至少90％相同性、至少95％相同性、至少99％相同性或100％相同性的核苷酸序列。优选地，所述表达构建体编码来自PR8-X的全部PB2、NP、NS、M和PA区段。
本发明还提供一种包含本发明表达系统的宿主细胞。这些宿主细胞能由所述表达系统中的表达构建体表达甲型流感病毒。
还提供可用于本发明表达系统的表达构建体。例如，本发明提供一种表达构建体，所述表达构建体在同一构建体上编码本发明所述的重配流感毒株的主链区段。
供体毒株
流感供体毒株是通常提供重配流感病毒中主链区段的毒株，尽管其有时还提供病毒的NA区段。然而，重配流感病毒中的HA和NA区段通常来自疫苗毒株，其是提供HA区段的流感毒株。
发明人出乎意料地发现，与包含的HA和PB1区段来自具有不同HA亚型的病毒的重配流感病毒相比，包含的HA区段和PB1区段来自具有相同HA亚型的不同甲型流感毒株的重配甲型流感病毒在培养宿主中的生长要快得多。这些重配流感病毒优选具有来自至少两种供体毒株的主链区段。
与具有不同HA亚型的流感病毒的PB1区段相比，具有相同HA亚型的流感病毒的PB1区段之间通常具有较高水平的相同性。例如，使用H1毒株A/California/07/09的PB1区段进行的Blast搜索显示仅具有H1HA亚型的流感毒株在PB1区段中具有高度相同性。同样地，使用H3毒株A/Wisconsin/67/2005的PB1区段进行的Blast搜索显示仅具有H3HA亚型的流感毒株对于该病毒的PB1区段具有高度相同性。
发明人还发现，具有来自至少两种供体毒株的主链区段且包含来自A/California/07/09的PB1区段的重配甲型流感病毒在培养宿主中生长特别好。这些重配流感病毒优选具有来自至少两种不同供体毒株的主链区段。该重配流感病毒可包含来自A/California/07/09的PB1区段和具有H1亚型的流感病毒的HA区段。
包含A/California/07/09毒株的1、2、3、4、5、6或7种区段的流感毒株也可用作供体毒株。
本发明可用所含病毒区段与SEQ ID NO 9-14或21-26的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同性的供体毒株来实施。例如，由于遗传密码的简并性，具有不同序列的若干核酸编码相同多肽是可能的。因此，本发明可用编码与序列SEQ ID NO 1-8或15-20相同的多肽的病毒区段实施。例如，SEQ ID NO:31和32的核苷酸序列仅有73％相同性，但它们编码相同的病毒蛋白。
本发明还可以使用编码与SEQ ID NO 9-22所编码多肽序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同性的多肽的病毒区段来实施。
病毒传代过程中能出现的自发性突变也可产生DNA和氨基酸序列内的变异。这类变体流感毒株也可用于本发明。
重配病毒
本发明提供包含来自两种或多种流感供体毒株的主链区段的重配流感病毒。这些重配流感病毒可包含来自不同甲型流感毒株的HA区段和PB1区段，前提是该HA区段和PB1区段来自具有相同流感病毒HA亚型的流感病毒。它们还可包含来自具有不同流感病毒HA亚型的不同甲型流感病毒的HA区段和PB1区段，前提是PB1区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自具有H1或H5HA亚型的流感病毒。
还提供了具有来自两种或多种不同供体毒株的主链区段(包括来自A/California/07/09的PB1区段)的重配流感病毒。
PB1和PB2区段可来自相同的供体毒株。
流感病毒是分区段负链RNA病毒。甲型和乙型流感病毒具有八种区段(NP、M、NS、PA、PB1、HA和NA)，而丙型流感病毒具有7种。本发明的重配病毒包含来自两种或多种供体毒株的主链区段，或来自A/California/07/09的至少一种(即，一种、两种、三种、四种、五种或六种)主链病毒区段。主链病毒区段是不编码HA或NA的那些。因此，主链区段通常编码流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1和NS2多肽。这些病毒还可含有不编码功能性NS蛋白的NS区段，如参考文献6中所述。所述重配病毒通常不包含来自所述供体毒株的HA和NA的编码区段，尽管也考虑包含来自本发明供体毒株的HA或NA但不同时包含二者的重配病毒。
当所述重配病毒是包含来自单一供体毒株的主链区段的重配株时，所述重配病毒包含的供体毒株与疫苗毒株的区段比通常是1:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1。通常具有的大部分区段来自供体毒株，特别是6:2的比率。当所述重配病毒包含来自两种供体毒株的主链区段时，所述重配病毒通常以1:1:6、1:2:5、1:3:4、1:4:3、1:5:2、1:6:1、2:1:5、2:2:4、2:3:3、2:4:2、2:5:1、3:1:2、3:2:1、4:1:3、4:2:2、4:3:1、5:1:2、5:2:1或6:1:1的比例包含来自第一供体毒株、第二供体毒株和疫苗毒株的区段。
优选地，所述重配病毒不包含供体毒株的HA区段，因为HA区段编码所述流感病毒的主要疫苗抗原，从而应该来自所述疫苗毒株。因此，本发明的重配病毒优选至少具有来自所述疫苗毒株的HA区段，并且通常具有来自所述疫苗毒株的HA和NA区段。
本发明还包括包含来自多于一种疫苗毒株的病毒区段的重配株，前提是所述重配株包含本发明所述的主链。例如，所述重配流感病毒可包含来自一种供体毒株的HA区段和来自一种不同供体毒株的NA区段。
与重配病毒中一些病毒区段的来源野生型疫苗毒株相比，本发明的重配病毒能在相同生长条件和相同时间(例如12小时、24小时、48小时或72小时)下生长到更高效价。可通过本领域技术人员已知的标准方法测定病毒效价。在相同时间框与相同条件下，本发明的重配病毒能达到的病毒效价比野生型疫苗毒株的病毒效价高出至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％或至少1000％。
本发明适合重配流行性和大流行间期(季节性)流感疫苗毒株。所述重配流感毒株可包括甲型流感病毒HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。其可含有甲型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。当用于本发明重配流感病毒中的疫苗毒株是季节性流感毒株时，所述疫苗毒株可具有H1或H3亚型。在本发明的一个方面中，所述疫苗毒株是H1N1或H3N2毒株。所述重配疫苗毒株还可含有乙型流感毒株的HA区段。
本发明中使用的疫苗毒株还可以是流行性或潜在流行性毒株。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是：(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即在人群体中十年以上未见的血凝素(如H2)，或者从未在人群体中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于人群体未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群体中横向传播；和(c)它对人有致病性。优选具有H5血凝素型的疫苗毒株，其中，所述重配病毒在用于针对流行性流感(例如H5N1毒株)免疫的疫苗中使用。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它新出现的潜在大流行株。本发明特别适于生产用于疫苗的重配病毒以保护抵御可能或已经从非人动物群体传播到人类的潜在大流行毒株，如猪源H1N1流感毒株。
本发明的重配毒株可包含来自A/California/4/09毒株的HA区段和/或NA区段。
可被用作疫苗毒株的毒株包括对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[7]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[8]。
包含不编码功能性NS蛋白的NS区段的重配病毒也在本发明的范围内。参考文献6描述了NS1敲除突变。这些NS1突变病毒株尤其适于制备活减毒流感疫苗。
本发明方法中所用的“第二流感毒株”不同于所用的供体毒株。
反向遗传学
本发明特别适合于通过反向遗传学技术生产本发明的重配流感病毒株。在这些技术中，使用表达系统在培养宿主中生产病毒。
在一个方面，该表达系统可编码来自具有相同HA亚型的不同流感毒株的HA和PB1区段。其还可编码来自具有不同流感病毒HA亚型的不同甲型流感病毒的HA区段和PB1区段，前提是PB1区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自具有H1或H5HA亚型的流感病毒。该表达载体可编码来自A/California/07/09的PB1区段。在这些实施方式中，该系统可编码来自另一种流感供体毒株(如PR8-X)的区段NP、M、NS、PA和/或PB2中的至少一种。
可用12种质粒来实施甲型和乙型流感病毒的反向遗传学，这些质粒表达起动复制与转录所需的4种蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)以及所有八种病毒基因组区段。然而为减少所需的构建体数量，多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)可包含在单一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感vRNA片段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子包含在另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或8种流感mRNA转录物的序列)上[9]。也可将一种或多种流感vRNA区段纳入pol I启动子的控制下并将一种或多种流感蛋白编码区纳入同一质粒的另一启动子控制下，特别是pol II启动子。优选使用双向质粒实现这点。
参考文献9方法的优选方面涉及：(a)单一表达构建体上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)单一表达构建体上的所有8种vRNA编码区段。特别优选在一种表达构建体上包括神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)区段并在另一表达构建体上包括六种其他病毒区段，因为新出现的流感病毒株通常在所述NA和/或HA区段具有突变。因此，在独立的表达构建体上具有HA和/或NA区段的优势是仅需替换包含HA和NA序列的载体。因此，在本发明的一个方面中，所述疫苗毒株的NA和/或HA区段可包含在一个表达构建体上，而来自一种或多种本发明供体毒株的HA和/或NA区段以外的vRNA编码区段包含在不同的表达构建体上。因此，本发明提供包含编码本发明供体毒株中主链病毒区段的一种、两种、三种、四种、五种或六种vRNA的表达构建体。该表达构建体可包含生成功能性HA和/或NA蛋白的HA和/或NA病毒区段。
已知的反向遗传系统涉及用pol I启动子、细菌RNA聚合酶启动子、噬菌体聚合酶启动子等表达编码所需病毒RNA(vRNA)分子的DNA分子。由于流感病毒需要病毒聚合酶存在以起始生命周期，系统还可提供这些蛋白，例如，所述系统还包括编码病毒聚合酶蛋白的DNA分子从而表达两种类型DNA引起完全感染性病毒的装配。还可以蛋白形式提供所述病毒聚合酶。
反向遗传学用于流感vRNA表达时，本领域技术人员清楚所述序列元件彼此的精确间隔对于所述聚合酶启动复制是重要的。因此编码所述病毒RNA的DNA分子在所述pol I启动子和所述终止序列之间的正确定位很重要，但该定位在反向遗传学系统操作人员的能力范围内。
为了生产重组病毒，细胞必须表达组装病毒粒子所需病毒基因组的所有区段，克隆到本发明表达构建体内的DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白，但也可使用辅助病毒以提供一些RNA和蛋白，但优选不使用辅助病毒的系统。由于所述流感病毒是分区段病毒，本发明的方法中所述病毒基因组通常使用多于一种表达构建体来表达。然而，还考虑在单一表达构建体上组合所述病毒基因组的一种或多种区段或甚至所有区段。
一些实施方式中，也可包括导致所述宿主细胞内表达辅助蛋白的表达构建体。例如，作为反向遗传学系统一部分表达非病毒丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有优势。
表达构建体
用于本发明的表达系统的表达构建体可以是单向或双向表达构建体。所述方法中使用多于一种转基因时(不论在相同或不同表达构建体上)，可以使用单向和/或双向表达。
由于流感病毒的传染性需要蛋白质，通常优选使用双向表达构建体，因为这能减少所述宿主细胞需要的表达构建体总数。因此，本发明的方法可利用至少一种双向表达构建体，其中基因或cDNA位于上游pol II启动子和下游非内源pol I启动子之间。从所述polII启动子转录所述基因或cDNA产生可翻译为蛋白质的加帽正义病毒mRNA，而从所述非内源pol I启动子转录产生负义vRNA。所述双向表达构建体可以是双向表达载体。
双向表达构建体含有从同一构建体中的不同方向(即5'到3'和3'到5')驱动表达的至少两种启动子。所述两种启动子可以可操作地连接同一双链DNA的不同链。优选所述启动子之一是pol I启动子且至少一种其他启动子为pol II启动子。这是有利的，因为所述pol I启动子可用于表达非加帽的vRNA而所述pol II启动子可用于转录随后翻译为蛋白质的mRNA，因此能从同一构建体同时表达RNA和蛋白质。当表达系统中使用多于一种表达构建体时，所述启动子可以是内源性和非内源性启动子的混合物。
所述表达构建体中使用的pol I和pol II启动子对于与宿主细胞来源具有相同分类学目的生物而言可以是内源的。或者，所述启动子可来源于具有不同于宿主细胞的分类学目的生物体。术语“目”指常规分类学分级，示例的目有灵长目、啮齿目、食肉目、有袋目、鲸目等。人和黑猩猩在同一分类学目中(灵长目)，但人和狗在不同的目中(灵长目与食肉目)。例如，可以使用人pol I启动子在犬细胞(如MDCK细胞)中表达病毒区段[10]。
所述表达构建体通常包括RNA转录终止序列。所述终止序列可为内源终止序列或对所述宿主细胞非内源的终止序列。本领域技术人员清楚合适的终止序列且其包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列和核酶。此外，所述表达构建体可包括用于mRNA的一种或多种聚腺苷酸化信号，尤其在表达受pol II启动子控制的基因的末端处。
表达系统可包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种表达构建体。
表达构建体可为载体，如质粒或其他游离构建体。此类载体通常包含至少一个细菌和/或真核的复制起点。此外，所述载体可包含能在原核和/或真核细胞中筛选的选择标记。此类选择标记的示例为赋予抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素或卡那霉素。所述载体还可包含一个或多个多克隆位点以促进DNA序列克隆。
或者，表达构建体可为线性表达构建体。这类线性表达构建体通常不含任何扩增和/或选择序列。但是，包含所述扩增和/或选择序列的线性构建体也在本发明的范围内。参考文献11描述了线性表达构建体，其描述各病毒区段的独立线性表达构建体。也可能在相同线性表达构建体上包含多于一种，例如两种、三种、四种、五种或六种病毒区段。例如，参考文献12中描述了这类系统。
表达构建体可用本领域已知方法产生。例如，参考文献13中描述了此类方法。所述表达构建体为线性表达构建体时，可在引入所述宿主细胞前利用单个限制性酶位点使之线性化。或者，可用至少两种限制性酶位点从载体中切下所述表达构建体。此外，也可通过用核酸扩增技术(如用PCR)扩增获得线性表达构建体。
用于本发明的系统的表达构建体可以是非病毒表达构建体。这表示所述构建体可在真核细胞中驱动其内所编码病毒RNA区段的表达，但其不包括所述构建体在细菌中增殖所需的组分。因此所述构建体不含细菌复制起点(ori)，且通常不含细菌选择标记(如抗生素抗性标记)。通过引用纳入本文的参考文献14描述了该表达构建体。
所述表达构建体可通过化学合成制备。所述表达构建体可完全或部分通过化学合成制备。通过引用纳入本文的参考文献14中描述了用于通过化学合成制备表达构建体的合适方法。
可利用本领域技术人员已知的任何技术将本发明的表达构建体引入宿主细胞。例如，可通过使用电穿孔、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀、脂质体、微注射、微粒轰击将本发明的表达构建体引入宿主细胞。
细胞
本发明所用的培养宿主可以是能产生感兴趣病毒的任何真核细胞。本发明通常使用细胞系，尽管例如原代细胞可用作替代。所述细胞通常是哺乳动物或鸟类。合适的哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人类和猴)以及犬细胞。可以使用多种细胞类型，如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的示例是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞包括例如，非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系[15-17]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系中。
其他合适的细胞包括但不限于：CHO；293T；BHK；MRC 5；PER.C6[18]；FRhL2；WI-38；等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[19]、Coriell细胞库[20]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81.2、CRL1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。
本发明使用的细胞优选源自马达二氏(Madin Darby)犬肾的MDCK细胞[21-23]。原始MDCK细胞可作为CCL 34获自ATCC。优选地，使用MDCK细胞的衍生物。这些衍生物如参考文献21所述，其公开了适合悬浮培养的MDCK细胞('MDCK 33016'或‘33016-PF’，保藏为DSMACC 2219，也可参见参考文献21)。此外，参考文献24公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞('B-702'，保藏为FERM BP-7449)。在一些实施方式中，所用MDCK细胞系可为致瘤性的。也考虑使用非致瘤性MDCK细胞。例如，参考文献25公开了非致瘤性MDCK细胞，包括'MDCK-S'(ATCC PTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。参考文献26公开了对感染有高度易感性的MDCK细胞，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL 12042)。
可使用多于一种细胞类型的混合物来实施本发明的方法。但本发明的方法优选用单一细胞类型如用单克隆细胞实施。本发明方法所用细胞优选来自单一细胞系。此外，同一细胞系可用于重配所述病毒和所述病毒的任何后续繁殖。
所述细胞优选在无血清情况下培养以避免常见污染源。本领域技术人员已知用于真核细胞培养的各种无血清培养基(如伊可夫氏(Iscove's)培养基、超CHO培养基(BW公司(BioWhittaker))、EX-CELL(JRH生物科学公司(JRH Biosciences)))。此外，可用无蛋白培养基(如PF-CHO(JRH生物科学公司))。另外，用于复制的细胞也可在常规含血清培养基(如含0.5％-10％胎牛血清的MEM或DMEM培养基)中培养。
所述细胞可贴壁培养或悬浮培养。
常规重配
传统上，通过用供体毒株和疫苗毒株共同感染培养宿主(通常是鸡蛋)来重配流感病毒。通过添加对所述供体毒株HA和/或NA蛋白特异的抗体来选择重配病毒，从而选择包含所述疫苗毒株的HA和/或NA蛋白的重配病毒。经过该处理的数次传代，可以选择包含所述疫苗毒株HA和/或NA区段的快速生长重配病毒。
本发明适于这些方法中的应用。相较于供体毒株，具有不同HA和/或NA亚型的疫苗毒株更易使用，因为这有利于重配病毒的选择。然而，也可能使用具有相同HA和/或NA亚型的疫苗毒株作为供体毒株，而这在本发明的一些方面中优选。在这种情况下，对所述供体毒株的HA和/或NA蛋白具有优先特异性的抗体应该是可获得的。
病毒制备
在一个实施方式中，本发明提供一种生产流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用本发明的重配病毒感染培养宿主；(b)培养来自步骤(a)的宿主以生产所述病毒；和可选地(c)纯化步骤(b)中生产的病毒。
所述培养宿主可以是细胞或含胚鸡蛋。本发明此方面中用细胞作培养宿主时，已知细胞培养条件(如温度、细胞密度、pH值等)根据所用细胞系和病毒在较宽的范围内变化且可根据应用需求调整。因此下述信息仅代表指南。
如上所述，细胞优选在无血清或无蛋白的培养基中培养。
所述细胞的繁殖可按照本领域技术人员已知的方法进行。例如，所述细胞可在使用常规支持方法如离心或过滤的灌注系统中培养。而且，所述细胞可按照本发明于感染前在分批进料系统中繁殖。在本发明的内容中，培养系统指分批进料系统，其中所述细胞初始培养于分批系统中且通过浓缩营养物的受控进料来补偿培养基中营养物(或部分营养物)的消耗。在感染前的细胞繁殖期间将培养基的pH值调节为pH 6.6-pH 7.8，特别是pH 7.2-pH 7.3是有利的。细胞培养优选在30-40℃的温度进行。在培养受感染细胞(步骤b)时，所述细胞优选在30℃-36℃或32℃–34℃或33℃的温度下培养。这是特别优选的，因为已显示在该温度范围内孵育受感染细胞能生产配入疫苗时功效改善的病毒[27]。
感染前培养中的氧分压优选调节为25％-95％且特别为35％-60％的值。本发明内容中的氧分压值基于空气饱和度。在分批系统中细胞浓度优选约8-25x105细胞/mL时或在灌注系统中优选约5-20x106细胞/mL时进行细胞感染。所述细胞可用10-8至10，优选0.0001-0.5的病毒剂量(MOI值，“感染复数”，相当于感染时每细胞的病毒单位数量)感染。
可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。可采用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可由此适合悬浮培养。
本发明所述方法还包括收获和分离病毒或其产生的蛋白。分离病毒或蛋白期间，通过标准方法如分离、过滤或超滤从所述培养基中分离所述细胞。之后按照本领域技术人员充分知晓的方法如梯度离心、过滤、沉淀、色谱等浓缩所述病毒或所述蛋白，然后纯化。根据本发明，还优选在纯化期间或之后进行病毒灭活。可在所述纯化过程中任何点通过例如β-丙内酯或甲醛进行病毒灭活。
所述培养宿主可以是鸡蛋。目前培养流感病毒用于疫苗的标准方法采用含胚SPF鸡蛋，从鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。也可通过鸡蛋对病毒进行传代并随后在细胞培养物中繁殖，反之亦然。
疫苗
本发明使用根据所述方法生产的病毒来生产疫苗。
疫苗(特别是流感病毒)通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于完整病毒颗粒、‘裂解’病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。抗原也可以病毒体形式呈递。本发明可用于制造任意这些类型的疫苗。
采用灭活病毒时，所述疫苗可包含完整病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(对于流感，包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。
可通过各种方法从含病毒液体(如尿囊液或细胞培养物上清)中收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。抗原可通过渗滤纯化，可选在稀释后。
用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通(Triton)X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制品，包括‘吐温-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法为本领域熟知，例如参见参考文献28-33等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解所述病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、6-O-(N-庚甲酰)-甲基-α-D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞弗伦(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂(Lipofectin)、脂质体转染试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间进行(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒颗粒的材料(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，分离完整病毒颗粒与非病毒颗粒材料，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。裂解的流感疫苗的示例有BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品。
纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备这些纯化形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品是流感亚基疫苗。
另一种形式的灭活抗原是病毒体[34](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。其可通过使用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。一种用于制备病毒体的替代性方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。
本发明的方法还可用于生产活疫苗。此类疫苗通常通过从含病毒颗粒的液体中纯化病毒颗粒来制备。例如，所述液体可通过离心澄清并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献35的第17和18章)。活病毒疫苗包括医学免疫公司(MedImmune)的FLUMISTTM产品(三价活病毒疫苗)。
所述病毒可被减毒。所述病毒可为温度敏感型。所述病毒可为冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。
HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8以及较高剂量(如3x或9x剂量[36,37])已有应用。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，每株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等。
对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID50)而非HA含量来衡量剂量，且TCID50一般为每株106至108(优选为106.5-107.5)。
本发明所用的流感株可以具有野生型病毒中的天然HA，或修饰的HA。例如，已知修饰HA以去除使病毒在禽类物种中具有高致病性的决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))。采用反向遗传学促进这类修饰。
除了适于针对大流行间期株系的免疫，本发明组合物特别用于免疫抵御大流行或潜在大流行株系。本发明适用于免疫人以及非人动物。
其抗原可有用地包含在所述组合物中的其它株系是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[38]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行株系[39]。
本发明的组合物可包含来自一种或多种(如1、2、3、4或更多)流感病毒株的抗原，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒，前提是至少一种流感病毒是本发明的重配流感病毒。也考虑其中至少两种、至少三种或所有抗原来自本发明重配流感病毒的组合物。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，并在收获病毒和制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。三价疫苗是典型的，其包含来自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株的抗原。也可用四价疫苗[40]，其包含来自2种甲型流感病毒毒株和2种乙型流感病毒毒株、或者3种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原。
药物组合物
如本发明所述制备的疫苗组合物是药学上可接受的。它们通常还包含抗原外的其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献41。
疫苗组合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可为干燥形式，如可注射固体或贴片上的干燥或聚合制品的形式。
疫苗组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[32,42]。更优选无汞的疫苗。可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物[32]。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为了控制张力，优选包含生理性盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是1-20mg/ml。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
疫苗组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[43]，但优选将渗透压保持在此范围内。
疫苗组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂时)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。
疫苗组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整批料疫苗pH的步骤。
所述疫苗组合物优选无菌。所述疫苗组合物优选无热原，如小于1EU/剂量(内毒素单位，标准量度)，优选小于0.1EU/剂量。所述疫苗组合物优选不含谷蛋白。
本发明的疫苗组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为'吐温')、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵('CTAB')或脱氧胆酸钠，特别用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中可包含各自的含量小于1mg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
疫苗组合物可含有供一次免疫的物质，或者可含有供多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，该组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。
流感疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。
组合物和药盒优选储存于2℃-8℃。其不应冷冻。理想情况下应避直射光保存。
宿主细胞DNA
由细胞系分离和/或培养病毒时，标准实践是使最终疫苗中残留的细胞系DNA含量最小化，以尽可能减少该DNA的潜在致癌活性。
因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有每剂量低于10ng(优选低于1ng，更优选低于100pg)的残留宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。
任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。
在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如色谱法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来提高对残留宿主细胞DNA的去除。参考文献44和45公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理，这一步可以在病毒生长过程中使用，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理，这一步可以在病毒颗粒破坏过程中使用。也可利用烷化剂如β-丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒[46]。
佐剂
本发明组合物宜包含佐剂，其作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。优选的佐剂包含水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
该乳剂也可包含诸如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其是本文特别优选的。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。另一种优选的油是α-生育酚(参见下文)。
可以使用油的混合物。
表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是有用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂含量(重量百分比)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。
所述疫苗含裂解病毒时，优选在水相中含有游离的表面活性剂。这是有利的，因为游离表面活性剂可在所述抗原上产生‘裂解效果’，因此破坏否则可能存在的任何未裂解病毒颗粒和/或病毒颗粒聚集体。这可改善裂解病毒疫苗的安全性[47]。
优选的乳液的平均液滴大小为小于1μm，例如小于等于750nm、小于等于500nm、小于等于400nm、小于等于300nm、小于等于250nm、小于等于220nm、小于等于200nm或更小。可通过某些技术(如微流化)方便地获得这些液滴尺寸。
本发明所用的具体水包油乳剂佐剂包括但不限于：
·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[48-50]，参考文献51的第10章和参考文献52的第12章更详细地描述了该佐剂。.MF59乳剂优选包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·包含角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。该乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。这些乳剂可含有(以体积计)2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，且角鲨烯:生育酚的重量比优选小于等于1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳剂。角鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。因此这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。可通过以下方法制备一种这样的乳液(“AS03”)：将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。所得乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。所述乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[53]，例如，以上述比例。
·角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸盐缓冲液。
·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(例如，750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲液。
·角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“PluronicTML121”)的乳液。该乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与苏氨酰基-MDP一起用于“SAF-I”佐剂中[54](0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)。也可不与Thr-MDP一起使用，例如在“AF”佐剂中[55](5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
·含有角鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。所述乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)小于200nm[56]。该乳剂也可含有一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。所述乳液可包含TLR4激动剂[57]。可将这类乳液冻干。
·角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[58]。含佐剂化疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％角鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳剂。如参考文献59所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献60所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[61]。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[62]。
·包含矿物油、非离子亲脂水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[62]。
在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此所述组合物以液体含佐剂形式包装。该抗原通常采用水性形式，从而最终通过混合两种液体来制备疫苗。待混合的两种液体的体积比可变(例如5:1-1:5)，但一般是约1:1。在上述具体乳液说明中给出组分浓度时，这些浓度通常用于非稀释组合物，因此所述浓度在混合抗原溶液后会降低。
疫苗组合物的包装
适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷器等。这些容器应无菌。
组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。摇瓶优选在加入组合物之前已灭菌。为了避免胶乳敏感患者的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。所述药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量(‘多剂量’药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如鲁尔(Luer)锁)，从而预填装注射器可插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中复溶冻干物质)，并可以将药瓶的内容物移回注射器中。从药瓶移出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子移除后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶，可装有允许无菌取出其内含物的瓶帽。
将某一组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器中的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时意外脱出。注射器可以具有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选地装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名“Tip-Lok”TM销售的注射器。
容器可标注显示半剂量体积，例如以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可有显示0.25ml体积的标记。
在使用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警示，例如准备好肾上腺素溶液以防疫苗接种后发生过敏反应等。
治疗方法和疫苗的给药
本发明提供了一种根据本发明生产的疫苗。这些疫苗组合物适合给予人类或非人动物对象如猪或鸟类，且本发明提供了在对象中产生免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予所述对象的步骤。本发明还提供用作药物的本发明组合物，并提供本发明组合物在生产在对象中产生免疫应答的药物中的应用。
这些方法和应用产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(血凝反应-抑制效价约30-40的血清样品对同源病毒感染给出约50％的保护作用)[63]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。
可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[64-66]、口服[67]皮内[68,69]、经皮、透皮[70]等。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，人类对象可以小于1岁、1～5岁、5～15岁、15～55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选对象是老年人(例如大于等于50岁、大于等于60岁，优选大于等于65岁)、年轻人(如小于等于5岁)、住院对象、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病对象、免疫缺陷对象、在接受该疫苗7天前接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的对象、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而该疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。对于大流行毒株，优选给予所有年龄组。
本发明优选组合物满足1、2或3个CPMP功效标准。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)大于等于70％血清保护；(2)大于等于40％血清转化；和/或(3)GMT增加大于等于2.5倍。在老年人(大于60岁)中，这些标准是：(1)大于等于60％血清保护；(2)大于等于30％血清转化；和/或(3)GMT增加大于等于2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。
可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种抵御新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一医学咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等基本同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本同时给药。
相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一医学咨询或就诊期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2,6-脱水-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒物是(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸，乙酯和磷酸盐(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU)TM)。
概述
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将组合与第三种组分混合等。
本方法的各步骤可在相同或不同时间、相同或不同地理位置如国家以及由相同或不同人或实体进行。
将动物(且特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的条件下培养细胞。
将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物或可由合适的前药替代。
两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献71的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献72中教导了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
两个核酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同碱基的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献71的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对程序是GCG Gap(威斯康星州的遗传计算机组(Genetics Computer Group)，套件版本10.1)，优选使用以下默认参数：开放缺口＝3；延伸缺口＝1。
附图说明
图1比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的蔗糖梯度纯化的病毒的HA含量(由凝集素捕获ELISA测定)，所述重配株含有PR8-X或#21主链以及来自(A)大流行样(pandemic-like)H1毒株(毒株1)或者(B)第二大流行样毒株(毒株2)的HA和NA区段。在图1A和1B中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μg/ml。
图2比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的未纯化病毒的HA含量(由凝集素捕获ELISA测定)，所述重配株含有PR8-X或#21主链以及来自(A)大流行前(pre-pandemic)H1毒株(毒株1)和(B)第二大流行前毒株(毒株2)的HA和NA区段的。在图2A和2B中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μg/ml。
图3比较从使用反向遗传源产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的蔗糖纯化的病毒的HA产量(由HPLC测定)，所述重配株含有PR8-X或#21主链以及来自H3毒株(毒株1)的HA和NA区段。白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μg/ml。
图4比较从使用参考疫苗毒株或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的含胚鸡蛋在感染后60小时所收获病毒的病毒效价(由病灶形成试验(FFA)测定；图4A)和HA效价(由凝集素捕获ELISA测定；图4B)，所述重配病毒使用PR8-X或#21主链和来自大流行样H1毒株(毒株2)的HA和NA区段制备。在图4A中，单个点表示来自单个鸡蛋的数据。线表示单个数据点的平均值。y轴表示感染单位/ml。在图4B中，白色柱表示参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示汇集的鸡蛋样品的HA产量，单位为μg/ml。
图5比较从使用参考疫苗毒株或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的MDCK细胞在感染后60小时所收获病毒的病毒效价(由FFA测定；图5A)和HA效价(由凝集素捕获ELISA测定；图5B)，所述重配病毒使用#21或#21C主链和来自大流行样H1毒株(毒株2)的HA和NA区段制备。在两个图中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示使用#21主链制备的重配病毒，且格纹柱表示使用修饰的#21主链(#21C)制备的重配病毒，所述修饰的#21主链在构成主链的PR8-X PB2区段中含有两个犬适应性突变(R389K、T559N)。图5A和5B中的y轴分别显示感染单位/ml和HA产量(单位为μg/ml)。
图6比较从使用反向遗传产生的6:2重配病毒感染的MDCK细胞在感染后60小时所收获病毒的病毒效价(由FFA测定)，所述重配病毒使用PR8-X、#21或#21C主链和来自不同的大流行样H1毒株(毒株1)的HA和NA区段制备。白色柱表示PR8-X主链，斑点柱表示#21主链，且格纹柱表示在构成主链的PR8-X PB2区段中含有两个犬适应性突变(R389K、T559N)的#21C主链。y轴表示感染单位/ml。
图7比较从使用参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的含胚鸡蛋在感染后60小时所收获病毒的HA效价(由血红细胞血凝试验测定)，所述重配病毒含有PR8-X或#21C主链和来自大流行样H1毒株(毒株1)的HA和NA区段。单个点代表来自单个鸡蛋的数据。线表示单个数据点的平均值。y轴表示HA单位。
图8比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞在感染后不同时间点所收获病毒的感染效价(由FFA测定)，所述重配株使用PR8-X主链或含有犬适应性聚合酶突变的修饰的PR8-X主链和来自大流行样H1毒株(毒株1)的HA和NA区段制备。在图8A中，带有三角形标记的虚线表示PR8-X主链且带有方形标记的实线表示在PR8-X PA区段中含有三个犬适应性突变(E327K、N444D和N675D)的经修饰PR8-X主链“PR8-X(cPA)”。在图8B中，带有三角形标记的虚线表示PR8-X主链且带有空心圆形标记的实线表示在PR8-X NP区段中含有两个犬适应性突变(A27T、E375N)的经修饰PR8-X主链“PR8-X(cNP)”。在两个图中，x轴都表示感染后小时数且y轴都表示感染单位/ml。
图9比较从使用参考疫苗毒株或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的MDCK细胞在感染后不同时间点所收获病毒的感染效价(由FFA测定；图9A)和HA效价(由血红细胞血凝试验测定；图9B)，所述重配病毒使用PR8-X主链或含有犬适应性突变的修饰的PR8-X主链和来自H3毒株(毒株2)的HA和NA区段制备。在图9A中，带有x标记的虚线表示参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，带有三角形标记的虚线表示PR8-X主链，带有方形标记的实线表示在PR8-X PA区段中含有三个犬适应性突变(E327K、N444D和N675D)的经修饰PR8-X主链“PR8-X(cPA)”，且带有空心圆形标记的实线表示在PR8-X NP区段中含有两个犬适应性突变(A27T、E375N)的经修饰PR8-X主链“PR8-X(cNP)”。y轴表示感染单位/ml且x轴表示感染后小时数。在图9B中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示PR8-X(cPA)主链，且格纹柱表示PR8-X(cNP)主链。y轴表示来自感染后60小时时间点的HA单位。
图10比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的蔗糖梯度纯化的病毒的HA含量(由凝集素捕获ELISA测定)，所述重配株含有具有PR8-X或#21主链和来自(A)H3(毒株2)或者(B)第二H3毒株(毒株3)或者(C)第三H3毒株(毒株4)的HA和NA区段。在图10A和10B中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μg/ml。
具体实施方式
新供体毒株的开发
为提供高生长供体毒株，发明人发现，与含有来自PR8-X的所有主链区段的重配流感病毒相比，包含A/California/07/09的PB1区段和来自PR8-X的所有其他主链区段的重配流感病毒显示改进的生长特征。该流感主链称作#21。
病灶形成试验(FFA)
对于FFA实验，将未感染的MDCK细胞以1.8×104细胞/孔的密度加入96孔板的100μL DMEM(含10％FCS)中。第二天，吸出培养基，然后用50μL体积中的病毒(病毒稀释在DMEM+1％FCS中)感染细胞。将细胞在37℃孵育到下一天。
在感染后若干时间点，吸出培养基并用PBS清洗细胞一次。向每孔加入50μl冰冷的50％/50％丙酮-甲醇然后在-20℃孵育30分钟。吸出丙酮混合物并用PBST(PBS+0.1％吐温)清洗细胞一次。每孔加入50μl溶于PBS的2％BSA然后室温(RT)孵育30分钟。将50μl 1:6000稀释的抗NP加入封闭缓冲液然后室温孵育1小时。吸弃抗体溶液并用PBST清洗细胞三次。二抗(山羊抗小鼠)以1:2000稀释度在50μl封闭缓冲液中添加，并将板室温下孵育1小时。吸出抗体溶液并用PBST清洗细胞三次。每孔加入50μl KPL True Blue并孵育10分钟。通过吸弃True-Blue停止反应并用dH2O清洗一次。吸弃水并晾干细胞。
包含PR8-X或#21主链的重配病毒的生长特性
为了测试#21毒株作为供体毒株用于病毒重配的合适性，通过反向遗传学生产含有来自多种流感毒株(包括动物传染病性、季节性和大流行样毒株)的HA和NA蛋白和来自PR8-X或#21主链的其它病毒区段的重配流感病毒。测定这些重配病毒的HA含量、HA产量和病毒效价。作为对照，使用了不含有任何来自PR8-X或A/California/07/09的主链区段的参考疫苗毒株。在含胚鸡蛋或MDCK细胞轴培养这些病毒。
结果显示，在鸡蛋和细胞培养物中，与对照病毒和含有所有来自PR8-X的主链区段的病毒相比，含有#21主链的重配病毒稳定地生成更高的病毒效价和HA产量。该差异是由于PB1区段，因为这是#21重配株和PR8-X重配株之间仅有的差别(参见图1-4)。
包含PR8-X或犬适应性PR8-X主链的重配病毒的生长特性
为测试犬适应性突变对于PR8-X生长特性的影响，发明人将突变导入PR8-X的PA区段(E327K、N444D和N675D)或NP区段(A27T、E375N)。这些主链分别称作PR8-X(cPA)和PR8-X(cNP)。生产重配流感病毒，其含有PR8-X(cPA)和PR8-X(cNP)主链与大流行样H1流感毒株(毒株1)或H3流感毒株(毒株2)的HA和NA区段。作为对照，使用了不含有任何来自PR8-X的主链区段的参考疫苗毒株。在MDCK细胞中培养重配流感病毒。
结果显示，与含有未修饰的PR8-X主链区段的重配流感病毒相比，含有犬适应性主链区段的重配流感病毒稳定地生成更高的病毒效价(参见图8和9)。
含有PR8-X、#21或#21C主链的重配病毒的生长特性
为测试主链区段中犬适应性突变是否能改进#21主链的生长特性，发明人通过将突变导入PR8-X PB2区段(R389K、T559N)来修饰#21主链。该主链称作#21C。通过反向遗传学生产重配流感病毒，其含有来自两种不同大流行样H1流感毒株(毒株1和2)的HA和NA蛋白以及来自PR8-X、#21主链或#21C主链的其他病毒区段。作为对照，使用了不含有任何来自PR8-X或A/California/07/09的主链区段的参考疫苗毒株。在MDCK细胞中培养这些病毒。测定这些重配病毒的病毒产量。对于含有来自大流行样H1毒株(毒株1)的HA和NA区段和PR8-X或#21C主链的重配流感病毒，还测定了HA效价。
结果显示，与仅含有PR8-X主链区段或#21主链的重配流感病毒相比，含有#21C主链的重配流感病毒稳定地生成更高的病毒效价(参见图5、6和7)。与PR8-X重配株相比，包含#21C主链的重配流感病毒还显示更高的HA效价。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
参考文献
[1]WO2007/002008
[2]WO2007/124327
[3]WO2010/070098
[4]Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48,443-453.
[5]Rice等(2000)Trends Genet 16:276-277.
[6]US-6468544.
[7]Herlocher等(2004)J Infect Dis 190(9):1627-30.
[8]Le等(2005)Nature 437(7062):1108.
[9]Neumann等(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9
[10]WO2010/133964
[11]WO2009/000891
[12]美国临时申请号61/273,151
[13]Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第2版，1989，冷泉港出版社，冷泉港，纽约
[14]WO2011/012999
[15]Kistner等(1998)Vaccine 16:960-8.
[16]Kistner等(1999)DevBiol Stand 98:101-110.
[17]Bruhl等(2000)Vaccine 19:1149-58.
[18]Pau等(2001)Vaccine 19:2716-21.
[19]http://www.atcc.org/
[20]http://locus.umdnj.edu/
[21]WO97/37000.
[22]Brands等(1999)DevBiol Stand 98:93-100.
[23]Halperin等(2002)Vaccine 20:1240-7.
[24]EP-A-1260581(WO01/64846)
[25]WO2006/071563
[26]WO2005/113758
[27]WO97/37001
[28]WO02/28422.
[29]WO02/067983.
[30]WO02/074336.
[31]WO01/21151.
[32]WO02/097072.
[33]WO2005/113756.
[34]Huckriede等(2003)Methods Enzymol 373:74-91.
[35]Vaccines(《疫苗》)(Plotkins和Orenstein编)，第4版，2004，ISBN:0-7216-9688-0
[36]Treanor等(1996)J Infect Dis 173:1467-70.
[37]Keitel等(1996)Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.
[38]Herlocher等(2004)J Infect Dis 190(9):1627-30.
[39]Le等(2005)Nature 437(7062):1108.
[40]WO2008/068631.
[41]Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药剂学科学和实践》)，第20版，ISBN:0683306472.
[42]Banzhoff(2000)Immunology Letters 71:91-96.
[43]Nony等(2001)Vaccine 27:3645-51.
[44]EP-B-0870508.
[45]US 5948410.
[46]WO2007/052163.
[47]WO2007/052061
[48]WO90/14837.
[49]Podda和Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2:197-203.
[50]Podda(2001)Vaccine 19:2673-2680.
[51]Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚基和佐剂方法》)(Powell和Newman编)，普莱南出版社(Plenum Press)1995(ISBN0-306-44867-X).
[52]Vaccine Adjuvants:Preparation Methods and Research Protocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)(分子医学方法丛书第42卷)ISBN:1-59259-083-7.O’Hagan编.
[53]WO2008/043774.
[54]Allison和Byars(1992)Res Immunol 143:519-25.
[55]Hariharan等(1995)Cancer Res 55:3486-9.
[56]US-2007/014805.
[57]US-2007/0191314.
[58]Suli等(2004)Vaccine22(25-26):3464-9.
[59]WO95/11700.
[60]美国专利6,080,725.
[61]WO2005/097181.
[62]WO2006/113373.
[63]Potter和Oxford(1979)Br Med Bull 35:69–75.
[64]Greenbaum等(2004)Vaccine 22:2566-77.
[65]Zurbriggen等(2003)Expert Rev Vaccines 2:295-304.
[66]Piascik(2003)J Am Pharm Assoc(Wash DC).43:728-30.
[67]Mann等(2004)Vaccine 22:2425-9.
[68]Halperin等(1979)Am J Public Health 69:1247-50.
[69]Herbert等(1979)J Infect Dis 140:234-8.
[70]Chen等(2003)Vaccine 21:2830-6.
[71]Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编，1987)增刊30.
[72]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489.

Claims (29)

1.一种重配甲型流感病毒，其包含来自两种供体毒株的主链区段，其中，PB1区段来自A/California/07/09流感毒株，其他主链区段皆来自PR8-X流感毒株，其中，所述PB1区段的序列是SEQ ID NO:16，PA区段的序列是SEQ ID NO:1，PB2区段的序列是SEQ ID NO:3，NP的序列是SEQ ID NO:4，M区段的序列是SEQ ID NO:5，NS区段的序列是SEQ ID NO:6。
2.如权利要求1所述的重配甲型流感病毒，所述重配甲型流感病毒的HA区段来自H1流感毒株。
3.一种制备如权利要求1所述重配甲型流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)向培养宿主中导入一种或多种表达构建体，所述表达构建体编码甲型流感病毒生产所需的病毒区段，所述表达构建体编码来自两种供体毒株的主链区段且PB1主链病毒区段来自A/California/07/09，并且，其他主链区段皆来自PR8-X流感毒株；以及
(ii)培养所述培养宿主以生产如权利要求1所述的重配甲型流感病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述一种或多种表达构建体包含SEQ ID NO:22的序列。
5.如权利要求3或4所述的方法，所述表达构建体还包含SEQ ID NO:9和/或11-14中的一种或多种序列。
6.如权利要求5所述的方法，所述表达构建体包含SEQ ID NO:9和11-14的序列。
7.如权利要求3所述的方法，所述重配甲型流感病毒的HA区段来自H1流感病毒。
8.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括(iii)纯化步骤(ii)中所得重配甲型流感病毒的步骤。
9.一种生产流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用如权利要求1所述的重配甲型流感病毒感染培养宿主；(b)培养来自步骤(a)的所述宿主以生产所述病毒；和可选地(c)纯化步骤(b)中获得的所述病毒。
10.一种制备疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过权利要求9所述的方法制备病毒以及(b)从所述病毒制备疫苗。
11.如权利要求9或10所述的方法，所述培养宿主是含胚鸡蛋。
12.如权利要求9或10所述的方法，所述培养宿主是哺乳动物细胞。
13.如权利要求12所述的方法，所述细胞是MDCK、Vero或PerC6细胞。
14.如权利要求13所述的方法，所述细胞贴壁生长。
15.如权利要求13所述的方法，所述细胞悬浮生长。
16.如权利要求15所述的方法，所述MDCK细胞为细胞系MDCK 33016，保藏号为DSMACC2219。
17.如权利要求10所述的方法，其中，步骤(b)涉及灭活所述病毒。
18.如权利要求10所述的方法，所述疫苗是完整病毒颗粒疫苗。
19.如权利要求10所述的方法，所述疫苗是裂解病毒颗粒疫苗。
20.如权利要求10所述的方法，所述疫苗是表面抗原疫苗。
21.如权利要求10所述的方法，所述疫苗是病毒体疫苗。
22.如权利要求10所述的方法，所述疫苗含有每剂量少于10ng的残留宿主细胞DNA。
23.一种表达系统，其包含多种含有如权利要求1所述重配甲型流感病毒的vRNA编码区段的表达构建体，所述表达构建体编码来自两种流感供体毒株的主链病毒区段，其中PB1区段来自A/California/07/09，且序列为SEQ ID NO:16，所述表达构建体还含有编码PR8-X中PB2、NP、NS、M和PA区段的vRNA，其中PA区段的序列是SEQ ID NO:1，PB2区段的序列是SEQ IDNO:3，NP的序列是SEQ ID NO:4，M区段的序列是SEQ ID NO:5，NS区段的序列是SEQ ID NO:6。
24.如权利要求23所述的表达系统，其中，至少一种表达构建体包含SEQ ID NO:22的序列。
25.如权利要求23或24所述的表达系统，所述表达构建体还包含SEQ ID NO:9和/或11-14的一种或多种序列。
26.如权利要求25所述的表达系统，所述表达构建体包含SEQ ID NO:9和11-14的序列。
27.一种宿主细胞，其包含权利要求23所述的表达系统。
28.如权利要求27所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
29.如权利要求28所述的宿主细胞，所述宿主细胞是MDCK、Vero或PerC6细胞。
CN201380071503.1A 2012-12-03 2013-12-02 流感病毒重配 Active CN105120893B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261732809P 2012-12-03 2012-12-03
US61/732,809 2012-12-03
PCT/EP2013/075294 WO2014086732A2 (en) 2012-12-03 2013-12-02 Influenza virus reassortment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105120893A CN105120893A (zh) 2015-12-02
CN105120893B true CN105120893B (zh) 2018-11-13

Family

ID=49713076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380071503.1A Active CN105120893B (zh) 2012-12-03 2013-12-02 流感病毒重配

Country Status (11)

Country Link
US (3) US9708585B2 (zh)
EP (1) EP2925356A2 (zh)
JP (1) JP6421128B2 (zh)
KR (1) KR20150110494A (zh)
CN (1) CN105120893B (zh)
AU (2) AU2013354219A1 (zh)
BR (1) BR112015012380A2 (zh)
CA (1) CA2893429A1 (zh)
HK (1) HK1214959A1 (zh)
MX (1) MX2015006927A (zh)
WO (1) WO2014086732A2 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013354219A1 (en) * 2012-12-03 2015-07-02 Novartis Ag Reassortant influenza a viren
US10323231B2 (en) * 2015-04-24 2019-06-18 University Of Rochester Attenuated influenza vaccines and uses thereof
US11013795B2 (en) 2015-06-26 2021-05-25 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
GB201602535D0 (en) * 2016-02-12 2016-03-30 Univ Edinburgh Improved flu vaccine yield
JP6826203B2 (ja) * 2017-08-28 2021-02-03 一般財団法人阪大微生物病研究会 リアソータントインフルエンザウイルスの段階的作出方法
WO2020051766A1 (zh) * 2018-09-11 2020-03-19 上海市公共卫生临床中心 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
KR101954904B1 (ko) 2018-10-15 2019-03-06 남종규 복층의 태양광 설치 구조
CN111647610B (zh) * 2020-06-02 2021-09-03 扬州大学 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101472941A (zh) * 2006-03-31 2009-07-01 沃弗-威斯康星校友研究基金会 用于疫苗的高滴度重组流感病毒
WO2010077986A2 (en) * 2008-12-16 2010-07-08 Baxter International Inc. Production of viral vaccine
WO2011145081A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-24 Novartis Ag Influenza virus reassortment method

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
AU5543294A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
DE19612967A1 (de) 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
DE19612966B4 (de) 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
TW570803B (en) 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
US6080725A (en) 1997-05-20 2000-06-27 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulating and vaccine compositions employing saponin analog adjuvants and uses thereof
DK1098961T3 (da) 1998-06-12 2008-05-26 Andrej Y Dr Egorov Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon
PL355287A1 (en) 1999-09-24 2004-04-05 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Intranasal influenza virus vaccine
DE60142506D1 (de) 2000-03-03 2010-08-19 Chemo Sero Therapeut Res Inst In serumfreier kultur verwendbare zelle, kultursuspension und verfahren zur virusproduktion als impfstoff unter verwendung der zelle
GB0024089D0 (en) 2000-10-02 2000-11-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
EP1361889A1 (en) 2001-02-23 2003-11-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel vaccine
PT1361890E (pt) 2001-02-23 2011-06-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Formulações vacinais de influenza para distribuição intradérmica
MY134424A (en) 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
KR20070008625A (ko) 2004-04-05 2007-01-17 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 미세유체화된 수중유 유화액 및 백신 조성물
WO2005113756A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method
CN101094915A (zh) 2004-05-20 2007-12-26 益得生物医学公司 生产流感疫苗的方法
EP1831353B1 (en) 2004-12-23 2012-02-29 MedImmune, LLC Non-tumorigenic mdck cell line for propagating viruses
US7691368B2 (en) 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
KR20080025171A (ko) 2005-06-21 2008-03-19 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드 이종성 프로테아제를 발현시키기 위한 방법 및 조성물
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
NZ567817A (en) 2005-11-01 2012-01-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Cell-derived viral vaccines with low levels of residual cell DNA by beta-propiolactone treatment
EA014028B1 (ru) 2005-11-04 2010-08-30 Новартис Вэксинс Энд Диагностикс Срл Эмульсии, содержащие свободное поверхностно-активное вещество в водной фазе в качестве адъюванта сплит вакцин против гриппа
FR2896162B1 (fr) 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
DK2016194T3 (en) 2006-04-19 2015-06-15 Medimmune Llc METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSION OF VIRAL NEGATIVE SENSE RNA IN DOG CELLS
CN101522218B (zh) 2006-10-12 2012-09-26 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含水包油乳液佐剂的疫苗
NZ577405A (en) 2006-12-06 2012-08-31 Novartis Ag Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
US8778847B2 (en) * 2007-06-13 2014-07-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunogenic peptides of influenza virus
EP2045323A1 (en) 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2233152A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
SI2401384T1 (sl) 2009-05-21 2013-01-31 Novartis Ag Reverzna genetika z uporabo neendogenih pol i promotorjev
JP5745511B2 (ja) * 2009-06-25 2015-07-08 メディミューン，エルエルシー ブタインフルエンザヘマグルチニン変異体
CA2769673A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Novartis Ag Reverse genetics systems
FR2962739B1 (fr) * 2010-07-13 2014-01-31 Univ Claude Bernard Lyon Souches virales modifiees et procede pour ameliorer la production de semences vaccinales de virus influenza
AU2013354219A1 (en) * 2012-12-03 2015-07-02 Novartis Ag Reassortant influenza a viren

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101472941A (zh) * 2006-03-31 2009-07-01 沃弗-威斯康星校友研究基金会 用于疫苗的高滴度重组流感病毒
WO2010077986A2 (en) * 2008-12-16 2010-07-08 Baxter International Inc. Production of viral vaccine
WO2011145081A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-24 Novartis Ag Influenza virus reassortment method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gene Constellation of Influenza A Virus Reassortants with High Growth Phenotype Prepared as Seed Candidates for Vaccine Production;Andrew A. Fulvini等;《PlOS ONE》;20110613;第6卷(第6期);e20823 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9708585B2 (en) 2017-07-18
CN105120893A (zh) 2015-12-02
AU2018232956A1 (en) 2018-10-11
JP6421128B2 (ja) 2018-11-07
HK1214959A1 (zh) 2016-08-12
BR112015012380A2 (pt) 2017-09-12
US20170326227A1 (en) 2017-11-16
AU2018232956B2 (en) 2020-10-01
US20150315548A1 (en) 2015-11-05
JP2016501020A (ja) 2016-01-18
US20200155666A1 (en) 2020-05-21
WO2014086732A3 (en) 2014-07-24
AU2013354219A1 (en) 2015-07-02
US10500266B2 (en) 2019-12-10
CA2893429A1 (en) 2014-06-12
WO2014086732A2 (en) 2014-06-12
WO2014086732A8 (en) 2018-12-06
EP2925356A2 (en) 2015-10-07
MX2015006927A (es) 2016-02-05
KR20150110494A (ko) 2015-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103608453B (zh) 流感病毒重配
CN105120893B (zh) 流感病毒重配
US10329537B2 (en) Influenza virus reassortment
ES2694805T3 (es) Fabricación de vacunas contra virus de la gripe sin usar huevos
CN105338999B (zh) 乙型流感病毒重配
CN103025350A (zh) 流感病毒的重配方法
CN102548577A (zh) 用于抵抗流感的佐剂疫苗
CN105727281A (zh) 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗
KR20120083480A (ko) 바이러스 구제를 위한 개선된 역유전학 방법
CN105142667A (zh) 流感病毒重配
AU2014203051B2 (en) Influenza Virus Reassortment
JP2023502650A (ja) 遺伝子再集合インフルエンザウイルスを産生するための方法
DE202013005100U1 (de) Influenza Virus Reassortierung

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant