KR20120083480A

KR20120083480A - 바이러스 구제를 위한 개선된 역유전학 방법

Info

Publication number: KR20120083480A
Application number: KR1020127012831A
Authority: KR
Inventors: 필립 도미처; 뵤른 카이너; 피라다 수파피팟; 마이클 프란티; 피터 메이슨; 제니퍼 우렌도르프; 미카일 마트로소비치
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2009-10-20
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2012-07-25
Also published as: CA2778332A1; US20150166966A1; HK1175200A1; ES2454815T3; EP2491117B1; JP2013507952A; JP2016104004A; EA023811B1; US20130034582A1; PL2491117T3; SI2491117T1; US8883481B2; NZ599479A; CN102741399A; AU2010309404A1; EA201270577A1; WO2011048560A1; EP2491117A1; JP5871806B2; AU2010309404B2

Abstract

역유전학에 의한 바이러스 구제를 위한 방법은 트랜스펙션 후 세포가 추가되는 것에서 제공된다.

Description

바이러스 구제를 위한 개선된 역유전학 방법 {IMPROVED REVERSE GENETICS METHODS FOR VIRUS RESCUE}

본 출원은 2009년 10월 20일 출원된 미국 가특허출원 제61/279,487호의 이익을 주장하며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 역 유전학 분야이다. 더 나아가서 다양한 바이러스를 방제하기 위한 백신의 제조와 관련된다.

역유전학은 세포 배양물에서 RNA 바이러스의 재조합 발현 및 조작을 허용한다. 그것은 바이러스학 및 백신 제조에 강력한 도구인데, 그것이 재조합 바이러스 (재교배 (reassortant)를 포함)의 신속한 생산 및/또는 그들의 돌연변이를 허용하기 때문이다. 방법은 바이러스 게놈을 암호화하는 하나 이상의 발현 구조물이 있는 숙주 세포의 트랜스펙션 및 세포로부터 바이러스의 분리를 포함한다.

역유전학에 의한 바이러스 구제의 한 가지 결점은 과정이 비효율적이고 종종 만족스럽지 못한 바이러스 수율을 가져온다. 그러므로 업계에서는 대체 가능하고 더 효율적인 역유전학 방법을 제공할 필요가 남아있다.

본 발명자들은 이제 놀랍게도 역유전학 방법의 낮은 효율은 역유전학 구조물 (들)로 세포를 트랜스펙션하고 이어서 트랜스펙션된 세포에 더 많은 세포를 추가함으로써 상당히 개선될 수 있다는 것을 발견했다. 본 발명자들은 관찰된 효율성의 증가는 트랜스펙션이 세포에 해롭다는 사실 때문이라고 추측한다. 따라서, 구제되는 어떤 바이러스도 병든 세포에서 증대되거나 또는 바이러스가 건강한 세포로 옮겨질 때까지 기다리는 것이 필요하다. 이것은 생육성 바이러스의 손실을 가져온다. 트랜스펙션된 숙주 세포에 세포의 추가는 구제된 바이러스가 바이러스 수율을 상당히 증가시키는 건강한 세포 물질상에서 로 증식하는 것을 허용한다.

한 구체예에서, 본 발명은 (i) 숙주 세포 배양물을 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구조물로 트랜스펙션 하는 단계; (ii) 단계 (i)의 트랜스펙션된 숙주 세포에 세포를 추가하여 세포의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (iii) 바이러스를 생산하기 위해 세포의 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는 바이러스의 제조 방법을 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 (i) 숙주 세포 배양물을 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구조물로 트랜스펙션 하는 단계; (ii) 단계 (i)의 트랜스펙션된 숙주 세포에 세포를 추가하여 세포의 혼합물을 제공하는 단계; (iii) 바이러스를 생산하기 위해 세포의 혼합물을 배양하는 단계; (iv) 단계 (iii)에서 얻은 바이러스를 정제 및 선택적으로 (v) 바이러스를 백신으로 제제하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 바이러스의 제조 방법을 제공한다.

도 1: 본 발명의 구체예의 도식적 표현; MDCK 33016 현탁 세포 (CDM에서 배양)는 6-웰 디쉬 A (혈청 없는 배지 또는 DMEM + 5% FBS); B: MDCK 33016을 동시에 트랜스펙션; C: 2번 씻은 후, 혈청 없는 DMEM으로 교환, +트립신, +/- 신선한, 감염되지 않은 MDCK 세포, D: RG 바이러스가 분주되었다.
도 2: MDCK 33016 세포에서 PR8-A/CA 백본을 사용한 인플루엔자 바이러스 구제의 효율성; y-축은 감염된 리터 (FFU/ml)를 보여준다; 오픈 박스는 PR8-A/CA 및 5% 혈청의 결과 및 hatched box는 PR8-A/CA 및 무 혈청의 결과를 보여준다; A는 신선한 감염되지 않은 세포가 추가되었음을 나타낸다; B는 신선하지 않고 감염되지 않은 세포가 추가되었음을 나타낸다.
도 3: MDCK 33016 세포에서 A/WSN/33 백본을 사용한 인플루엔자 바이러스 구제의 효율성; y-축은 감염된 리터 (FFU/ml)를 보여준다; 오픈 박스는 WSN 및 5% 혈청의 결과 및 hatched box는 WSN 및 무 혈청의 결과를 보여준다; A는 신선한 감염되지 않은 세포가 추가되었음을 나타낸다; B는 신선하지 않고 감염되지 않은 세포가 추가되었음을 나타낸다.
도 4: MDCK 33016 세포에서 PR8-WSN 백본을 사용한 인플루엔자 바이러스 구제의 효율성; y-축은 감염된 리터 (FFU/ml)를 보여준다; 오픈 박스는 PR8-WSN 및 5% 혈청의 결과 및 hatched box는 PR8-WSN 및 무 혈청의 결과를 보여준다; A는 신선한 감염되지 않은 세포가 추가되었음을 나타낸다; B는 신선하지 않고 감염되지 않은 세포가 추가되었음을 나타낸다.

역유전학

역유전학은 양성 가닥 RNA 바이러스 [참고문헌 1, 2], 음성 가닥 RNA 바이러스 [참고문헌 3, 4] 및 이중 가닥 RNA 바이러스 [참고문헌 5]를 포함하는 다양한 RNA 바이러스의 생산을 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 역유전학 방법을 사용하여 얻어진 재조합 바이러스 생산을 위한 방법을 제공한다.

알려진 역유전학 시스템은 pol I 프로모터, 박테리아 RNA 폴리머라제 프로모터, 박테리오파지 폴리머라제 프로모터, 등으로부터 요구되는 바이러스 RNA (vRNA) 분자를 암호화하는 DNA 분자 발현과 관련이 있다. 게다가, 바이러스가 전염성 바이러스를 형성하기 위해 어떤 단백질을 필요로 하는 경우, 예를 들어, 두 타입의 DNA의 발현이 완벽한 감염성 바이러스의 조립체로 이어지도록 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 시스템은 또한 이 단백질을 제공한다.

역유전학이 vRNA 발현을 위해 사용되는 경우, 서열 요소의 상호 정확한 일정한 간격은 폴리머라제가 복제를 개시하기 위해 결정적임은 당업자에게 명백하다. 그러므로 바이러스 RNA를 암호화하는 DNA 분자는 정확하게 pol I 프로모터 및 종결 서열 사이에 위치하는 것은 중요하지만, 이 위치는 역유전학 시스템분야의 당업자들에게는 잘 알려져 있다.

일반적으로, 역유전학은 그들의 라이프 사이클 중 게놈 RNA의 생산을 요구하는 것으로 알려진 어떤 바이러스의 발현에도 적합하다. 하기 설명된 바와 같이 이러한 바이러스는 양성 가닥 및 음성 가닥 RNA 바이러스를 포함하지만, 제한하는 것은 아니다. 바람직하게, 바이러스는 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 같은 오르토믹소바이러스이다. 본 발명의 방법은 세그먼트 바이러스뿐만 아니라 비-세그먼트화된 바이러스에도 적합하다.

바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 종종 바이러스 게놈을 포함하는 발현 구조물로 세포를 감염시키는 것으로 충분하다. 예를 들어, 폴리오바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드의 트랜스펙션 결과 전염성 폴리오바이러스를 회수할 수 있다 [참고문헌 1, 2]. 안티센스 바이러스 RNA는 보통 비전염성이고 라이프 사이클을 완전하게 하기 위해 RNA 폴리머라제를 요구하기 때문에, 음성 가닥 RNA 바이러스에 대한 역유전학은 더 많은 도전이 필요하다. 따라서, 바이러스 폴리머라제는 단백질로써 또는 제자리 (in situ) 단백질 발현을 위한 유전자로써 공급되어야 한다.

바이러스가 전염성을 위해 단백질을 요구하는 경우, 일반적으로 숙주 세포에 의해 요구되는 발현 구조물의 전체 수를 감소시키기 때문에, 2-방향성 발현 구조물을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법은 유전자 또는 cDNA가 업스트림 pol II 프로모터 및 다운스트림 비내인성 pol I 프로모터 사이에 위치하는 특징을 가진 적어도 하나의 2-방향성 발현 구조물을 활용할 수도 있다. pol II 프로모터로부터 유전자 또는 cDNA의 전사는 단백질로 번역될 수 있는 cap이 있는 양성 센스 바이러스 mRNA를 생산하지만, 비내인성 pol I 프로모터로부터 전사는 음성 센스 vRNA를 생산한다. 2-방향성 발현 구조물은 2-방향성 발현 벡터일 수도 있다.

재조합 바이러스를 생산하기 위해서, 세포는 비리온을 조립하는데 필수적인 바이러스 게놈의 모든 세그먼트를 발현해야 한다. 본 발명의 발현 구조물 내에 클로닝된 DNA는 바람직하게 모든 바이러스 RNA 및 단백질을 제공하지만, 헬퍼 바이러스를 사용하지 않는 시스템이 바람직하더라도, RNA 및 단백질의 일부를 제공하기 위해 헬퍼 바이러스를 사용하는 것 또한 가능하다. 바이러스가 비-세그먼트 바이러스인 경우, 하나 이상의 발현 구조물을 사용하여 비-세그먼트 바이러스의 바이러스 게놈을 발현하는 것은 또한 본 발명의 범위이지만, 상기 비-세그먼트 바이러스는 본 발명의 방법에서 단일 발현 구조물을 활용함으로써 얻을 수 있다. 바이러스가 세그먼트로 된 바이러스인 경우, 본 발명의 방법에서 바이러스 게놈은 보통 하나 이상의 발현 구조물을 사용하여 발현된다. 그러나, 단일 발현 구조물에 바이러스 게놈의 하나 또는 그 이상 또는 모든 세그먼트를 결합하는 것 또한 가능하다.

본 발명의 방법은 재교배 (reassortant) 바이러스 균주의 생산에 특히 적합하다. 본 기술은 바이러스 세그먼트의 결합을 일으키기 위해, 바이러스 세그먼트에서 암호화된 또는 암호화되지 않은 서열의 조작을 가능하게 하기 위해서, 돌연변이를 도입하기 위해서, 등 시험관 내에서 조작된 플라스미드를 사용할 수 있다. 재교배 바이러스 균주의 생산을 위한 발현 시스템의 사용은 전염병에 대응하기 위해 백신의 빠른 생산이 필요한 상황에서 특히 유리한 재교배 씨드 (seed) 바이러스를 얻기 위해 필요한 시간을 상당히 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 따라서, 본 발명의 이 양태의 방법은 적어도 두 가지 다른 야생형 균주로부터 또는 파생된 바이러스 유전자를 발현하는 하나 이상의 발현 구조물을 사용하는 것이 바람직하다.

숙주 세포에서 부수적 단백질의 발현으로 이어지는 발현 구조물 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 역유전학 시스템의 일부로서 비-바이러스성 세린 프로테아제 (예를 들어, 트립신)을 발현하는 것이 유리할 수 있다.

발현 구조물

본 발명에 사용하기 위한 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 발현 구조물은 바이러스 구제 (rescue)를 위해 업계에서 보통 사용되는 어느 발현 구조물도 될 수 있다.

사용된 발현 구조물은 1-방향성 또는 2-방향성 발현 구조물일 수도 있다. 숙주 세포가 하나 이상의 트랜스 유전자를 발현하는 경우 (같은 또는 다른 발현 구조물), 1-방향성 및/또는 2-방향성 발현을 사용하는 것이 가능하다.

2-방향성 발현 구조물은 같은 구조물로부터 다른 방향으로 발현하는 (즉 5'에서 3' 및 3'에서 5') 적어도 2개의 프로모터를 함유한다. 2개의 프로모터는 같은 이중 가닥 DNA의 다른 가닥에 사용가능하게 결합 될 수 있다. 바람직하게, 프로모터 중 하나는 pol I 프로모터이고 다른 프로모터 중 적어도 하나는 pol II 프로모터이다. 이것은 pol I 프로모터가 uncapped cRNA들을 발현하기 위해 사용될 수 있기 때문에 유용하지만, 다음에 단백질로 번역될 수 있는 mRNA를 전사하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 같은 구조물로부터 RNA 및 단백질의 동시 발현이 허용된다.

발현 구조물 (1-방향성 또는 2-방향성)은 전형적으로 각 전사 단위에 대한 RNA 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 종결 서열은 내인성 종결 서열 또는 숙주 세포에 비내인성 종결 서열일 수도 있다. 적합한 종결 서열은 당업자들에게 명백할 것이며, 제한은 아니나, RNA 폴리머라제 I 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 II 전사 종결 서열, 및 리보자임을 포함한다. 게다가, 발현 구조물은, 특히 pol II 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자의 단부에서, mRNA들에 대한 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 함유할 수도 있다.

발현 구조물에 사용된 pol I 및 pol II 프로모터는 발현 구조물이 발현되는 숙주 세포와 같은 분류학적 등급으로 유기체로부터 파생될 수 있다. 대신에, 프로모터는 숙주 세포와 다른 분류학적 등급으로 유기체로부터 파생될 수 있다. 용어 "등급"은 편의상 분류학적 등급을 나타내고, 등급의 예는 영장류, 쥐목, 육식동물, 유대목, 고래목 등이다. 사람 및 침팬지는 같은 분류학적 등급 (영장류)이지만, 사람 및 개는 다른 등급 (영장류 대 육식동물)이다. 본 발명의 방법에서, 숙주 세포는 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯, 적어도 일곱, 적어도 여덟, 적어도 아홉, 적어도 열, 적어도 열하나 또는 적어도 열둘의 발현 구조물로 트랜스펙션될 수도 있다.

발현 구조물은 플라스미드 또는 다른 에피솜 구조물 같은 벡터일 수도 있다. 이러한 벡터들은 전형적으로 적어도 하나의 박테리아 및/또는 진핵의 복제개시점을 포함할 것이다. 게다가, 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포에서 선택을 허용하는 선택적 마커를 포함할 수도 있다. 이러한 선택적 마커의 예는 암피실린 또는 카나마이신 같은 항생제에 저항성을 부여하는 유전자이다. 벡터는 DNA 서열의 클로닝을 가능하게 하는 하나 이상의 다양한 클로닝 부위를 포함할 수도 있다.

또는, 발현 구조물은 선형 발현 구조물일 수도 있다. 이러한 선형 발현 구조물은 전형적으로 증폭 및/또는 선택 서열을 함유하지 않을 것이다. 그러나, 증폭 및/또는 선택 서열을 포함하는 선형 구조물은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 인플루엔자 바이러스의 발현을 위한 선형 발현 구조물을 사용하는 방법의 예시는 참고문헌 6에 설명되어있다.

본 발명의 발현 구조물은 업계에서 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 참고문헌 7에서 설명되었다. 발현 구조물이 선형 발현 구조물일 경우, 단일 제한 효소 부위를 활용하는 숙주 세포 내로 도입하기 전 선형화가 가능하다. 대신에, 적어도 2개의 제한 효소 부위를 사용하는 벡터로부터 발현 구조물의 절개가 가능하다. 게다가, 핵산 증폭 기술 (예를 들어, PCR)을 사용하여 그것을 증폭함에 의해 선형 발현 구조물을 얻는 것 또한 가능하다.

발현 숙주가 MDCK 세포주 같은 개 세포인 경우, 단백질-암호화 영역은, 예를 들어, 야생형 개 유전자로부터 또는 개 바이러스로부터의 프로모터를 사용하여, 및/또는 사람 세포보다 개 세포에 더 적당한 코돈 사용을 가짐으로써 개 발현에 대해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 사람 유전자는 Phe에 대한 코돈으로서 UUC가 약간 선호되지만 (54%), 개 세포에서는 더 강하게 선호된다 (59%). 유사하게, 사람 세포의 Ile 코돈에 대해 주된 선호도가 없는 반면, 개 코돈의 53%는 Ile에 대한 AUC를 사용한다. 개 파르보바이러스 (ssDNA 바이러스)와 같은 개 바이러스는 또한 코돈 최적화를 위한 지침을 제공하며, 예를 들어, 개 파르보바이러스의 Phe 코돈의 95%는 UUU (대 개 게놈에서 41%)이고, Ile 코돈의 68%는 AUU (대 32%), Val 코돈의 46%는 GUU (대 14%), Pro 코돈의 72%는 CCA (대 25%), Tyr 코돈의 87%는 UAU이고 (대 40%), His 코돈의 87%는 CAU이고 (대 39%), Gln 코돈의 92%는 CAA이고 (대 25%), Glu 코돈의 81%는 GAA이고 (대 40%), Cys 코돈의 94%는 UGU이고 (대 42%), Ser 코돈의 단지 1%가 UCU이고 (대 24%), CCC는 Phe에 대해 결코 사용되지 않고, UAG는 정지 코돈으로서 결코 사용되지 않는다. 따라서 단백질-암호화 유전자는 성질이 개 세포에서 발현을 위해 이미 최적화된 유전자와 더 유사하게 만들어질 수 있고, 따라서 발현을 용이하게 한다.

트랜스펙션

"트랜스펙션"은 세포 내로 DNA의 도입을 나타낸다. 발현 구조물은 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법, DEAE-덱스트란, 인산 칼슘 침전, 리포솜, 미세주사, 또는 미립자 충격의 사용에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 역유전학은 보통 리포솜 방법을 사용하여 예를 들어, 트랜스펙션 시약인 Lipofectamine^TM을 사용하여 실행된다. 본 발명의 방법은 리포솜으로 트랜스펙션하는 것으로 제한되지 않지만, 다른 트랜스펙션 방법으로도 똑같이 잘 작용할 것이라 예상된다.

세포는 트랜스펙션 후 72시간까지 언제든지 트랜스펙션된 숙주 세포에 추가될 수 있다. 예를 들어, 세포는 트랜스펙션 직후, 트랜스펙션 후 5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간에 추가될 수도 있다. 일반적으로, 트랜스펙션 후 세포들이 추가되는 최대 시간은 트랜스펙션된 세포가 살 수 있는 최대 시간과 일치할 것이다.

시기 "트랜스펙션 후"는 배양물 내에 숙주 세포 내로 DNA가 도입될 때 한번 시작한다. DNA가 도입된 시간대는 예를 들어, 사용된 세포주, 트랜스펙션 방법 또는 트랜스펙션이 수행된 온도 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 시간은 표준 방법을 사용하는 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들면, 트랜스펙션이 다른 시간대에 멈춰진 것을 제외한 동일한 조건에서 세포가 역유전학 구조물로 트랜스펙션된 동시에 몇 실험이 행해질 수 있고, 만약 DNA가 숙주 세포로 도입되면, 적어도 하나의 바이러스가 형성될 것이다. 따라서 숙련자는 예를 들어, 표준 검정을 사용하여 플라크 형성 단위의 수를 결정함에 의해 바이러스의 존재에 대한 검정을 할 수 있다. 적어도 하나의 플라크 형성 단위 (PFU)가 발견된 후 첫 시간대는 DNA가 숙주 세포 내로 도입된 시간대이다.

대신에, 트랜스펙션된 세포에 세포가 추가된 후 시기는 트랜스펙션의 시작으로부터 결정될 수 있다. 트랜스펙션의 시작은 바이러스 분자 (들)을 암호화하는 발현 구조물 (들)이 숙주 세포의 배양물에 접촉하는 시간대이다. 따라서, 세포는 트랜스펙션된 세포에 트랜스펙션의 시작 후 96시간까지 예를 들어, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 또는 96시간까지 추가될 수 있다. "트랜스펙션 후" 시간대 및 "트랜스펙션 시작으로부터" 시간대는 상대적으로 다른 시작점으로 측정되는 반면, 세포가 감염된 세포에 추가될 때의 절대 시간은 같을 수 있다. 예를 들어, 만약 DNA가 배양물에서 숙주 세포 내로 도입되는데 1시간 걸리고 DNA가 도입된 후 30분 후에 세포가 추가되면, 트랜스펙션의 시작으로부터 90분 또는 트랜스펙션 후 30분에 세포가 추가되었을 것이다.

트랜스펙션 후 추가된 세포의 수는 일반적으로 트랜스펙션을 위해 숙주 세포로서 사용된 세포의 수 및 트랜스펙션에 사용된 세포 배양 용기의 크기에 또한 의존적으로 다양할 것이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 세포의 수는 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 추가된 세포의 수가 다른 것을 제외하고 동일한 조건으로 동시에 몇몇 실험이 수행될 수 있다. 가장 높은 바이러스 수율을 준 세포의 수는 이후의 실험에 사용될 수 있다. 예를 들어, Lipofectamine^TM으로 트랜스펙션 하기 위해 시작 배양물로서 약 6x10⁵ 세포가 사용될 때, 약 4x10⁵ 세포가 추가될 수 있다.

트랜스펙션 후 추가된 세포는 복제하기 위해 구제된 바이러스를 위한 물질을 제공한다. 따라서, 세포는 본 발명의 방법에 사용되기 전 어떤 시간 (예를 들면, 48시간) 내에 바이러스에 감염되지 않았거나 또는 바이러스 RNA를 암호화하는 발현 구조물로 트랜스펙션되지 않은 세포를 의미하는 감염되지 않은 세포일 수도 있다. 불멸하게 하기 위해 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스 같은 바이러스에 감염된 세포는 본 발명의 사용에 적합하다. 비슷하게, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 트랜스펙션된 세포는 본 발명의 방법으로 사용되기 전에 트랜스펙션은 짧게 (즉, 48시간 이내) 일어나지 않는다는 것을 제공한다.

구제된 바이러스가 감염성을 위해 프로테아제의 존재를 요구할 경우 세포를 트랜스펙션한 후 프로테아제를 함께 추가하는 것이 유리할 것이다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스는 감염을 위해 트립신 같은 세린 프로테아제의 활성을 요구한다. 따라서, 본 발명의 방법이 인플루엔자 바이러스를 구제하기 위해 사용될 때, 세린 프로테아제는 트랜스펙션 후 세포와 동시에 추가될 수 있다. 대신에, 트랜스펙션된 세포에 세포가 추가되기 전 또는 후에도 프로테아제가 추가될 수 있다.

세포

본 발명은 관심있는 바이러스를 발현할 수 있는 어떤 진핵 세포에서도 실행될 수 있다. 본 발명은, 예를 들어 1차 세포가 대안으로서 사용될 수도 있지만 전형적으로 세포주를 사용할 것이다. 세포는 전형적으로 포유동물일 것이다. 적합한 포유동물 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 햄스터, 소, 영장류 (사람 및 원숭이를 포함함) 및 개 세포를 포함한다. 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포 등과 같은 다양한 세포 타입이 사용될 수도 있다. 적합한 햄스터 세포의 예들은 BHK21 또는 HKCC라는 명칭을 갖는 세포주들이다. 적합한 원숭이 세포는, 예를 들어 아프리카 그린 원숭이 세포, Vero 세포주에서와 같은 신장세포이다 [참고문헌 8 내지 10]. 적당한 개 세포는, 예를 들어 CLDK 및 MDCK 세포주에서와 같은 신장세포이다.

추가의 적당한 세포는, 제한되는 것은 아니지만, CHO; 293T; MRC 5; PER.C6 [참고문헌 11]; FRhL2; WI-38 등을 포함한다. 적합한 세포는, 예를 들어 ATCC (American Type Cell Culture) 콜렉션으로부터 [참고문헌 12], Coriell Cell Repositories [참고문헌 13]로부터 또는 ECACC (European Collection of Cell Cultures)로부터 널리 사용가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에서 다양한 다른 Vero 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL 34 하에서 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁번호 96022940 하에서 ECACC로부터 사용가능하다. MDCK, Vero 및 Per.C6 세포는 보통 바이러스의 생산에 사용되고 그러므로 이 세포주들 각각은 본 발명의 방법에 사용하기 특히 적합하다.

본 발명에서 사용을 위한 바람직한 세포 (특히 성장하는 인플루엔자 바이러스에 대해)는 Madin Darby 개 신장으로부터 유래되는 MDCK 세포이다 [참고문헌 14 내지 16]. 원래의 MDCK 세포는 CCL 34로서 ATCC로부터 사용가능하다. 이 세포의 파생물 또는 다른 MDCK 세포의 파생물이 사용되는 것이 바람직하다. MDCK 파생물은, 예를 들어 현탁 배양물에서 성장을 위해 적합하게 된 MDCK 세포를 개시하는 참고문헌 14에서 설명되었다 (DSM ACC 2219로서 기탁된 'MDCK 33016' 또는 '33016-PF'; 참고문헌 15 참조). 게다가, 참고문헌 17은 무혈청 배양물 내 현탁액에서 성장하는 MDCK-유래 세포를 개시한다 (FERM BP-7449로서 기탁된 'B-702'). 사용된 MDCK 세포주는 종양형성성일 수도 있다. 비종양형성성 MDCK 세포를 사용하는 것 또한 구상 중이다. 예를 들면, 참고문헌 18은 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (ATCC PTA-6503)을 포함하는 비종양형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 19는 'MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL 12042)를 포함하는, 감염에 높은 민감성의 MDCK 세포를 개시한다.

트랜스펙션에 사용된 세포 및 트랜스펙션 후 추가된 세포는 같거나 또는 다른 세포 타입일 수도 있다. 예를 들어, 발현 구조물이 MDCK 세포 내로 트랜스펙션되고 추가된 세포가 Vero 세포 또는 그 반대일 수도 있다. 또 다른 예는 발현 구조물이 MDCK 세포의 한 균주 내로 트랜스펙션될 경우 추가된 세포는 다른 MDCK 균주인 방법일 수도 있다. 이 접근은 쉽게 트랜스펙션될 수 없는 세포주에서 구제된 바이러스가 잘 자라는 경우 유리하다. 이 양태에서, 바이러스는 더 쉽게 트랜스펙션되는 세포 내로 트랜스펙션 될 수 있지만 그 다음 바이러스 복제에 더 적합한 세포주로 증식된다. 그러나, 예를 들어, 일반적으로 경쟁적 배양물 선택에 대한 압력 또는 다른 세포 배양물의 조건을 피할 수 있는 유리함을 갖는 것처럼 트랜스펙션 및 그 다음 세포 추가 둘 다를 위한 숙주 세포로서 같은 세포주 (예를 들어, MDCK 3016 세포)를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 트랜스펙션 및/또는 트랜스펙션 후 추가를 위한 숙주세포로서 하나 이상의 세포 타입 혼합물을 사용하는 것 또한 가능하다.

바람직하게는, 세포는 통상적인 오염원을 피하기 위해 혈청의 부재하에서 배양된다. 진핵 세포 배양물을 위한 다양한 무혈청 배지가 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, Iscove's 배지, 울트라 CHO 배지 (BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)). 더 나아가서, 무단백질 배지가 사용될 수도 있다 (예를 들어, PF-CHO (JaaRH Biosciences)). 그렇지 않으면, 복제를 위한 세포는 또한 통상적인 혈청을 함유하는 배지 (예를 들어, 0.5% 내지 10% 소 태아 혈청이 있는 MEM 또는 DMEM)에서 배양될 수 있다.

숙주 세포 및 추가된 세포는 부착 배양 또는 현탁 배양으로 배양될 수도 있다. 예를 들어, 트랜스펙션에 사용된 세포는 부착 세포일 수 있고 트랜스펙션 후 추가된 세포 또한 부착세포일 수 있다. 트랜스펙션 후 추가된 세포가 부착세포일 때, 세포는 트랜스펙션 된 세포에 추가되기 전 성장하던 배양 용기로부터 제거될 필요가 있는 것은 명백할 것이다. 예를 들어, 트립신 같은 세린 프로테아제의 도움으로 성취될 수 있다. 트랜스펙션을 위한 숙주세포로서 현탁 세포 및 트랜스펙션 후 추가를 위해 부착 세포를 사용하는 것 및 그 반대 또한 가능하다.

본 발명의 방법은 업계에서 사용된 특이적 트랜스펙션 방법에 보통 사용되는 온도에서 보통 실행된다. 예를 들어, 리포솜이 트랜스펙션에 사용될 때, DNA/리포솜 복합체가 첫 번째 추가되면 트랜스팩션 반응은 처음에는 상온에서 배양되고, 그 다음 특정 기간 (예를 들어, 약 24시간)동안 약 37 ℃에서 배양될 수도 있다. 본 발명의 방법은 업계에 알려진 어떤 트랜스펙션 방법으로도 실행될 수 있고 그러므로 트랜스펙션이 수행되어야 하는 온도는 숙련자에게 알려져 있다. 대신에, 트랜스펙션 중 배양 온도가 다른 것을 제외한 동일한 조건에서 동시에 몇몇 트랜스펙션 실험을 수행함에 의해 적합한 배양 온도를 찾는 것 또한 가능하다. 구제된 바이러스의 수는 트랜스펙션의 효율을 나타내고 상기 설명한 바와 같이, 생산된 PFU의 수에 대한 검정에 의해 결정될 수 있다. 가장 큰 PFU 숫자를 얻은 온도는 트랜스펙션에 사용될 수 있다.

세포가 트랜스펙션된 세포에 추가되는 온도 및 결과로 얻은 세포 혼합물이 배양된 온도는 트랜스펙션 중 사용된 온도와 비교하여 같거나 또는 다를 수도 있다. 온도는 트랜스펙션 후 추가에 사용된 세포주에 의존할 수 있고 또한 본 발명의 방법을 사용하여 구제된 바이러스에 따라 다를 수 있다. 개개 세포주의 성장 또는 특정 바이러스의 구제에 적합한 온도는 업계에 알려져 있지만, 그러므로 숙련자는 쉽게 적합한 온도를 확인할 수 있다. 예를 들어, Vera, Per.C6 및 MDCK 세포주 같은 포유류 세포주는 보통 36 ℃ 내지 38 ℃, 또는 약 37 ℃에서 자란다. 이 온도는 또한 인플루엔자 같은 몇몇 바이러스가 약 33 ℃의 온도에서 구제될 수도 있지만 얻어진 바이러스의 더 나은 항원성을 낳을 수 있기 때문에 많은 바이러스의 구제에 선택된다 [참고문헌 20]. 적합한 온도는 또한 트랜스펙션 후 배양 온도가 다른 것을 제외한 동일한 조건에서 동시에 몇몇 트랜스펙션 실험을 수행함에 의해 확인될 수 있다. 가장 큰 PFU의 숫자를 얻은 온도는 트랜스펙션 후에 사용될 수 있다. 적합한 PFU 검정에 대한 방법은 트랜스펙션 중 사용될 수 있는 온도를 확인하는 검정에 관해 상기 설명되었다.

바이러스 제조

추가의 양태에 있어서, 본 발명은 백신 제조를 위해 (i) 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구조물로 숙주 세포의 배양물을 트랜스펙션; (ii) 세포의 혼합물을 제공하기 위해 (i)의 트랜스펙션된 숙주 세포에 세포를 추가; (iii) 바이러스를 생산하기 위해 세포의 혼합물을 배양하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 얻은 바이러스를 정제 및 선택적으로 (v) 바이러스를 백신으로 제제하는 단계를 포함하는 바이러스 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 이 양태에 있어서, 세포가 배양 숙주로서 사용된 경우, 알려진 세포 배양 조건 (예를 들어, 온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 세포주 및 바이러스에 대해 넓은 범위에서 가변적이고 본 출원의 요구에 맞춰질 수 있다. 그러므로 다음의 정보는 단지 가이드라인을 나타낸다.

상기 언급된 바와 같이, 세포는 바람직하게 무혈청 또는 무단백질 배지에서 배양된다.

세포의 증식은 당업자에게 알려진 방법에 따라 행해질 수 있다. 예를 들어 원심분리 또는 여과 같은 통상의 방법을 사용하여 관류 시스템 (perfusion system)에서 배양될 수 있다. 게다가, 세포는 감염 전 페드-배치 (fed-batch) 시스템에서 본 발명에 따라 증식될 수 있다. 본 발명에서, 배양 시스템은 세포가 처음에 배치 시스템에서 배양되고 배지의 영양소 결핍 (또는 영양소 일부)은 농축된 영양소의 조절된 피딩에 의해 보상된다. 감염 전 세포의 증식 중 배지의 pH 값을 pH 6.6 내지 7.8 사이 및 특히 pH 7.2 내지 7.3 사이로 조절하는 것이 유리할 수 있다. 세포의 배양은 바람직하게 30 내지 40 ℃의 온도에서 일어난다. 단계 (iii)에서, 세포는 바람직하게 30 내지 36 ℃ 또는 32 내지 34 ℃ 또는 약 33 ℃의 온도에서 배양된다. 이 온도 범위에서 감염된 세포는 백신으로 제제될 때 향상된 효과를 갖는 바이러스를 생산할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법에 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해 사용된 경우 이것은 특히 바람직하다 [참고문헌 20].

산소 분압은 감염 전 배양 중 25% 내지 95% 및 특히 35% 내지 60%의 값에서 바람직하게 적용될 수 있다. 본 발명에서 정해진 산소 분압 값은 공기의 포화도에 기초한다. 세포의 감염은 배치 시스템에서 바람직하게 약 8-25x10⁵ 세포수/mL 또는 관류 시스템에서 바람직하게 약 5-20x10⁶ 세포수/mL의 세포밀도에서 일어난다. 세포는 10^-8 내지 10, 바람직하게는 0.00001 내지 0.5의 바이러스의 투여량 (MOI 값, "감염의 증식 (multiplicity of infection)"은 감염의 시간에 세포당 바이러스 유닛의 숫자와 일치한다)으로 감염될 수 있다.

바이러스는 부착 배양 또는 현탁 배양의 세포에서 성장될 수도 있다. 미크로담체 배양이 사용될 수 있다. 미크로담체 배양은 부착 배양으로 여겨진다. 세포는 현탁 배양에서 또한 성장에 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 또한 바이러스 또는 그것들에 의해 생성되는 단백질의 수확 및 분리를 포함한다. 바이러스 또는 단백질의 분리 중, 세포는 분리, 여과 또는 한외여과 같은 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 분리된다. 이때, 바이러스 또는 단백질은 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피 등 및 그때 정제 같은 당업자에게 충분히 알려진 방법에 따라 농축된 후 정제된다. 본 발명에 따르면 정제 중 또는 후 바이러스는 비활성화되는 것 또한 바람직하다. 예를 들어, 바이러스 비활성화는 정제 과정 중 어떤 시점에서도 β-프로피올락톤 또는 포름알데히드에 의해 일어날 수 있다.

단계 (iii)에서 본 발명에 따라 분리된 바이러스는 난 (egg)에서 또한 성장될 수 있다. 백신을 위해 인플루엔자 바이러스 성장에 대한 현재의 표준 방법은 난 내용물 (요막액)로부터 정제된 바이러스와 함께, 암탉의 SPF 발육 계란을 사용한다. 계란을 통해 바이러스가 통과하고 그 다음 세포 배양물로 증식한다.

바이러스

본 발명의 방법은 세포에서 역유전학에 의해 발현될 수 있는 어떤 바이러스로도 수행될 수도 있다. 이러한 바이러스는 세그먼트로 된 또는 비-세그먼트 바이러스일 수 있다. 게다가, 바이러스는 양성 가닥 RNA 바이러스 또는 음성 가닥 RNA 바이러스일 수 있다. 바이러스는 또한 이중 가닥 바이러스일 수도 있다.

바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae), 뉴모비리나에 (Pneumovirinae), 라브도비리다에 (Rhabdoviridae), 필로비리다에 (Filoviridae), 보르나비리다에 (Bornaviridae), 오르소믹소비리다에 (Orthomyxoviridae), 분야비리다에 (Bunyaviridae), 또는 아레나비리다에 (Arenaviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과 (family)로부터 나온다. 추가로, 바이러스는 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus), 오르소믹소바이러스 (Orthomyxovirus), 레스피로바이러스 (Respirovirus), 모르빌리바이러스 (Morbillivirus), 루불라바이러스 (Rubulavirus), 헤니파바이러스 (Henipavirus), 아불라바이러스 (Avulavirus), 뉴모바이러스 (Pneumovirus), 메타뉴모바이러스 (Metapneumovirus), 베시클로바이러스 (Vesiculovirus), 리사바이러스 (Lyssavirus), 에페메로바이러스 (Ephemerovirus), 사이토르하브도바이러스 (Cytorhabdovirus), 뉴클레오하브도바이러스 (Nucleorhabdovirus), 노비르하브도바이러스 (Novirhabdovirus), 마르부르그바이러스 (Marburgvirus), 에볼라바이러스 (Ebolavirus), 보르나바이러스 (Bornavirus), 인플루엔자바이러스 A (Influenzavirus A), 인플루엔자바이러스 B (Influenzavirus B), 인플루엔자바이러스 C (Influenzavirus C), 토고토바이러스 (Thogotovirus), 이사바이러스 (Isavirus), 오르소분야바이러스 (Orthobunyavirus), 한타바이러스 (Hantavirus), 나이로바이러스 (Nairovirus), 프레보바이러스 (Phlebovirus), 토스포바이러스 (Tospovirus), 아레나바이러스 (Arenavirus), 오피오바이러스 (Ophiovirus), 테누이바이러스 (Tenuivirus), 또는 델타바이러스 (Deltavirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스이다. 특정 구체예에서, 음성 가닥 RNA 바이러스는 센다이 바이러스 (Sendai virus), 홍역 바이러스 (Measles virus), 멈프스 바이러스 (Mumps virus), 헨드라 바이러스 (Hendra virus), 뉴캐슬병바이러스 (Newcastle disease virus), 사람 호흡기세포융합바이러스 (Human respiratory syncytial virus), 조류 뉴모바이러스 (Avian pneumovirus), 수포성 구내염 인디아나 바이러스 (Vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스, 소 유행열 바이러스 (Bovine ephemeral fever virus), 레터스 네크로틱 옐로 바이러스 (Lettuce necrotic yellows virus), 감자 황고병 바이러스 (Potato yellow dwarf virus), 전염성 조혈 괴사 바이러스 (Infectious hematopoietic necrosis virus), 빅토리아호 마르부르그바이러스 (Lake Victoria marburgvirus), 자이르 에볼라 바이러스 (Zaire ebolavirus), 보르나병 바이러스 (Borna disease virus), 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus), 토고토 바이러스 (Thogoto virus), 전염성 연어 패혈 바이러스 (infectious salmon anemia virus), 부니암웨라바이러스 (Bunyamwera virus), 한탄 바이러스 (Hantaan virus), 두그베 바이러스 (Dugbe virus), 리프트 밸리열 바이러스 (Rift Valley fever virus), 토마토 반점 윌트 바이러스 (Tomato spotted wilt virus), 림프구성 맥락수막염바이러스 (Lymphocytic choriomeningitis virus), 시트러스 소로시스 바이러스 (Citrus psorosis virus), 벼줄무늬잎마름병바이러스 (Rice stripe virus) 및 델타 간염 바이러스 (Hepatitis delta virus)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다 (하기 참조).

바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 아르테리비리데 (Arteriviridae), 코로나비리다에 (Coronaviridae), 피코르나비리다에 (Picornaviridae) 및 로니비리다에 (Picornaviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과로부터 나온다. 추가로, 바이러스는 아테리바이러스 (Arterivirius), 코로나바이러스 (Coronavirus), 엔테로바이러스 (Enterovirus), 토로바이러스 (Torovirus), 오카바이러스 (Okavirus), 리노바이러스 (Rhinovirus), 헤파토바이러스 (Hepatovirus), 카르디오바이러스 (Cardiovirus), 아프토바이러스 (Aphthovirus), 파레코바이러스 (Parechovirus), 에르보바이러스 (Erbovirus), 코부바이러스 (Kobuvirus) 및 테스코바이러스 (Teschovirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스 일 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스, 폴리오바이러스, 사람 엔테로바이러스 A (HEV-A), 사람 엔테로바이러스 B (HEV-B), 사람 엔테로바이러스 C, 사람 엔테로바이러스 D, A형 간염 및 사람 리노바이러스 A 및 B로 구성되는 군으로부터 선택된다.

바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 비르나비리다에 (Birnaviridae), 시스토비리다에 (Cystoviridae), 히포비리다에 (Hypoviridae), 파르티티비리다에 (Partitiviridae), 레오비리다에 (Reoviridae) 및 토티비리다에 (Totiviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과로부터 나올 수 있다. 더욱이, 바이러스는 아쿠아비르나바이러스 (Aquabirnavirus), 아비비르나바이러스 (Avibirnavirus), 엔토모비르나바이러스 (Entomobirnavirus), 시스토바이러스 (Cystovirus), 파르티티바이러스 (Partitivirus), 알파크립토바이러스 (Alphacryptovirus), 베타크립토바이러스 (Betacryptovirus), 아쿠아레오바이러스 (Aquareovirus), 콜티바이러스 (Coltivirus), 시포바이러스 (Cypovirus), 피지바이러스 (Fijivirus), 이드노레오바이러스 (Idnoreovirus), 미코레오바이러스 (Mycoreovirus), 오르비바이러스 (Orbivirus), 오르소레오바이러스 (Orthoreovirus), 오리자바이러스 (Oryzavirus), 피토레오바이러스 (Phytoreovirus), 로타바이러스 (Rotavirus) 및 세아도르나바이러스 (Seadornavirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스 일 수 있다.

본 발명에 사용된 바람직한 바이러스는 로타바이러스이다. 이 바이러스의 역유전학은 현재 바이러스 구제의 낮은 효율 때문에 어렵고 그러므로 본 발명의 방법은 이 바이러스의 구제를 가능하게 할 수 있다.

본 발명은 빠른 돌연변이를 겪는 바이러스에 특히 적당하며 재조합 접근은 이후에 추가로 증식되어 적합한 백신을 얻을 수 있는 바이러스의 더 빠른 분리를 허용한다. 따라서, 바람직한 구체예에서 바이러스는 인플루엔자이다.

인플루엔자 바이러스

인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스는 이 바이러스에 대한 역유전학은 잘 특징지어져 있기 때문에 본 발명의 방법으로 사용에 특히 적합하다. 인플루엔자 바이러스는 세그먼트로 된 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 8개의 세그먼트를 갖지만, 인플루엔자 C는 7개를 갖는다. 바이러스는 복제 및 전사를 개시하기 위해 적어도 4개의 바이러스 단백질 (PB1 , PB2, PA 및 핵단백질)을 요구한다.

인플루엔자 A 및 B 바이러스의 역 유전학은 4개의 필수 단백질 및 모든 8개의 게놈 세그먼트를 발현하기 위해서 12개의 플라스미드로 실행될 수 있다. 그러나 구조물의 수를 감소시키기 위해서, 다수의 RNA 폴러미라제 I 전사 카세트 (바이러스 RNA 합성을 위한)는 하나의 플라스미드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8개의 인플루엔자 vRNA 세그먼트를 암호화하는 서열) 및 다른 플라스미드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 인플루엔자 전사체를 암호화하는 서열)에서 RNA 폴리머라제 II 프로모터와 다수의 단백질을 암호화하는 영역이 포함될 수 있다 [참고문헌 21]. pol I 프로모터의 통제 하에 하나 이상의 인플루엔자 vRNA 세그먼트를 포함하고 다른 프로모터, 특히 같은 플라스미드의 pol II 프로모터의 통제 하에 하나 이상의 인플루엔자 단백질 암호화 영역을 포함하는 것 또한 가능하다. 상기 설명된 바와 같이, 이것은 바람직하게 2-방향성 플라스미드에 의해 일어난다. 참고문헌 21 방법의 바람직한 양태는 다음을 포함한다: (a) 하나의 플라스미드에서 PB1, PB2 및 PA mRNA 암호화 영역; 및 (b) 하나의 플라스미드에서 모든 8개의 vRNA 암호화 세그먼트. 하나의 플라스미드에서 뉴라미니다제 (NA) 및 헤마클루티닌 (HA) 세그먼트 및 다른 플라스미드에서 6개의 다른 세그먼트를 포함하는 것은 최근에 생겨난 인플루엔자 바이러스 균주가 보통 NA 및/또는 HA 세그먼트에 돌연변이를 갖기 때문에 특히 바람직하다. 그러므로, 이 구체예에서는, 단지 HA 및 NA 서열을 포함하는 벡터는 대체될 필요가 있다.

인플루엔자 A 바이러스에 대한 바람직한 발현 시스템은 다수의 다른 야생형 균주로부터 유래된 게놈 세그먼트를 암호화한다. 시스템은 PR/8/34 균주 (A/Puerto Rico/8/34)로부터 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 세그먼트를 암호화할 수도 있지만, 보통 이것/이것들은 PR/8/34 HA 세그먼트를 포함하지 않을 것이고 보통 PR/8/34 NA 세그먼트를 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 PR/8/34로부터의 세그먼트 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나 (가능하게는 6개 모두)를 암호화할 수도 있다.

인플루엔자 A 바이러스에 대해 다른 유용한 발현 시스템은 AA/6/60 인플루엔자 바이러스 (A/Ann Arbor/6/60)로부터의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 세그먼트를 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 AA/6/60 HA 세그먼트를 포함하지 않을 것이고 보통 AA/6/60 NA 세그먼트를 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 AA/6/60로부터의 세그먼트 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나 (가능하게는 6개 모두)를 암호화할 수도 있다.

시스템은 예를 들어 A/캘리포니아/4/09 균주로부터 HA 세그먼트 및/또는 NA 세그먼트 같은 하나 이상의 게놈 세그먼트를 암호화할 수도 있다. 따라서, 예를 들어, HA 유전자 세그먼트는 SEQ ID NO: 2보다 SEQ ID NO: 1과 더 밀접하게 관련된 (즉, 같은 알고리즘 및 파라미터를 사용하여 SEQ ID NO: 2보다 SEQ ID NO: 1을 비교할 때, 더 높은 정도의 서열 동일성을 갖는다) H1 헤마글루티닌을 암호화할 수도 있다. SEQ ID NO: 1 및 2는 80% 동일하다. 비슷하게, NA 유전자는 SEQ ID NO: 4보다 SEQ ID NO: 3과 더 밀접하게 관련된 N1 뉴라미니다제를 암호화할 수도 있다. SEQ ID NO:3 및 4는 82% 동일하다.

인플루엔자 B 바이러스에 대한 발현 시스템은 다수의 다른 야생형 균주로부터 파생된 게놈 세그먼트를 암호화할 수도 있다. 시스템은 AA/1/66 인플루엔자 바이러스 (B/Ann Arbor/1/66)로부터의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 세그먼트를 암호화할 수도 있지만, 보통 이것/이것들은 AA/1/66 HA 세그먼트를 포함하지 않을 것이고 보통 AA/1/66 NA 세그먼트를 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 AA/1/66으로부터 세그먼트 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나를 암호화할 수도 있다.

A/PR/8/34, AA/6/60, AA/1/66, A/칠레/1/83 및 A/캘리포니아/04/09 균주들로부터 바이러스 세그먼트 및 서열은 널리 사용가능하다. 그것들의 서열은 공공 데이터베이스, 예를 들어, GI:89779337, GI89779334, GI:89779332, GI:89779320, GI:89779327, GL89779325, GI:89779322, GI89779329에서 사용가능하다.

인플루엔자 바이러스에 대한 역유전학 시스템은 숙주 세포에서 부수적인 단백질의 발현으로 이끄는 발현 구조물을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 비-바이러스성 세린 프로테아제 (예를 들어, 트립신)을 발현하는 것이 유리할 수 있다.

백신

하나의 양태에 있어서, 본 발명은 백신을 생산하기 위해서 본 발명의 방법에 따라 생산된 바이러스를 활용한다.

백신 (특히 인플루엔자 바이러스에 대해)은 일반적으로 생 바이러스 또는 비활성화 바이러스 중 하나에 기초한다. 비활성화 백신은 전체 비리온, '분할 (split)' 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기초할 수도 있다. 항원들은 또한 바이로좀 (virosomes)의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 이 타입의 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

비활성화 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전체 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원 (인플루엔자에 대해, 헤마그글루티닌을 포함하고, 보통 뉴라미니다아제를 또한 포함하는)을 포함할 수 있다. 바이러스를 비활성화하기 위한 화학적 수단은 하나 이상의 하기 시약의 유효량으로 처리를 포함한다: 세제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌 (C60), 바이너리 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이들의 조합. 바이러스 비활성화의 비-화학적 방법은, 예를 들어 UV 광 또는 감마 조사와 같이 당업계에 알려져 있다.

비리온은 바이러스-함유 유체, 예를 들어 요막액 (allantoic fluid) 또는 세포 배양물 상층액으로부터 여러 가지 방법에 의해 수확될 수 있다. 예를 들면, 정제 과정은 비리온을 붕괴하는 세정제를 포함하는 선형 수크로오스 구배 용액을 사용하는 띠원심분리를 수반할 수도 있다. 항원은 그 다음에 선택적 희석 후 투석여과에 의해 정제될 수도 있다.

분할 비리온은 세정제 (예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9, 등)로 정제된 비리온을 처리하여 서브비리온 제제를 생산함으로써 얻어지고, 'Tween-에테르' 분할 공정을 포함한다. 인플루엔자 바이러스의 스플리팅 방법은, 예를 들어 당업계에 잘 알려져 있다, 예를 들어 참고문헌 33-38 등 참조. 바이러스의 분할은 분할제의 붕괴 농도로 감염성이든 비-감염성이든 전체 바이러스를 붕괴 또는 단편화함으로써 수행된다. 붕괴는 바이러스 단백질의 전체 또는 부분적인 용해화를 초래하여 바이러스의 일체성을 변경시킨다. 바람직한 분할제는 비-이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들면, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 술포베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그 (Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB (세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 인산염, 세타블론, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton X-100 또는 Triton N101과 같은 Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 하나의 유용한 분할 과정은 데옥시콜산 나트륨 및 포름알데히드의 연속적인 효과를 사용하고, 분할은 초기 비리온 정제 동안 (예를 들어, 수크로오스 밀도 구배 용액에서) 일어날 수 있다. 따라서 분할 과정은 비리온-함유 물질의 정화 (비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확한 비리온의 농축 (예를 들어, CaHPO₄ 흡착과 같은 흡착 방법을 사용함), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할제를 사용하는 비리온의 분할 (예를 들어, 데옥시콜산 나트륨과 같은 분할제를 함유하는 수크로오스 구배를 사용함), 이어서 원치않는 물질을 제거하기 위한 여과 (예를 들어, 초미세여과)를 수반할 수 있다. 분할 비리온은 인산나트륨-완충된 등장 염화나트륨 용액에서 유용하게 재현탁될 수 있다. 분할 인플루엔자 백신의 예는 BEGRIVAC^TM, FLUARIX^TM, 및 FLUSHIELD^TM 제품이다.

본 발명의 방법은 또한 생 백신을 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 백신은 보통 비리온 함유액으로부터 비리온을 정제함에 의해 제조된다. 예를 들면, 액은 원심분리에 의해 투명하게 하고, 완충액 (예를 들어, 수크로스, 인산칼륨, 및 글루탐산 일나트륨을 함유함)으로 안정화시킬 수도 있다. 다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신은 현재 유효하다 (예를 들어, 참고문헌 28의 l7 & 18장 참조). 생 바이러스는 MedImmune의 FLUMISTTM 제품 (3가의 생 바이러스)를 포함한다.

정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 백신은 표면 항원 헤마그글루티닌, 및 전형적으로 또한 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태로 이들 단백질을 제조하기 위한 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 인플루엔자 서브유닛 백신이다.

다른 형태의 비활성화 항원은 바이로좀이다 [참고문헌 29] (무 핵산 바이러스 유사 리포좀 입자). 바이로좀은 세정제로 바이러스의 용해화와 이어서 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 당단백질을 함유하는 막의 복원에 의해 제조될 수 있다. 바이로좀을 제조하기 위한 또 다른 방법은 과량의 인지질에 바이러스 막 당단백질을 첨가하여 그것의 막에서 바이러스 단백질을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 수반한다.

바이러스는 약독화될 수 있다. 바이러스는 온도-민감성일 수 있다. 바이러스는 저온-적응될 수 있다. 이들 3가지 특징들은 항원으로서 생 바이러스를 사용할 때 특히 유용하다.

HA는 현재 비활성화 인플루엔자 백신에서 주요 면역원이고, 백신 투여용량은 SRID에 의해 전형적으로 측정되는 HA 수준을 기준으로 표준화되어 있다. 현존하는 백신은 전형적으로 균주 당 약 15㎍의 HA를 함유하나, 예를 들어, 어린이 또는 유행병 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때 더 낮은 용량이 사용될 수 있다. 더 높은 용량 (예를 들어 3x 또는 9x 용량 [참고문헌 30, 31])이 사용된 것과 같이, ¹/_{2 (}즉, 균주 당 7.5㎍ HA), ¹/₄ 및 ¹/₈ 과 같은 분할 용량이 사용되었다. 따라서 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150㎍, 바람직하게는 0.1 내지 50㎍, 예를 들어 0.1-20㎍, 0.1-15㎍, 0.1-1O㎍, 0.1-7.5㎍, 0.5-5㎍ 등의 HA를 포함할 수 있다. 특정 용량은 균주 당, 예를 들어, 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다.

생 백신에 대해, 투여용량은 HA 함량보다 오히려 중앙 조직 배양물 감염성 용량 (TCID₅₀)에 의해 측정되고, 균주 당 10⁶ 내지 10^{8 (}바람직하게는 10^6.5-10^7.5)의 TCID₅₀이 전형적이다.

본 발명에서 사용되는 인플루엔자 균주는 야생형 바이러스에서 발견되는 바와 같은 천연 HA 또는 변형된 HA를 가질 수 있다. 예를 들어, 조류 종에서 매우 병원성이 되는 바이러스를 야기하는 결정 요인 (예를 들어, HA1/HA2 절단 부위 주변의 과-염기성 영역)을 제거하기 위해 HA를 변형시키는 것은 알려져 있다. 역 유전학의 사용은 이러한 변형을 용이하게 한다.

백신에서 사용을 위한 인플루엔자 바이러스 균주는 계절에 따라 변화한다. 유행기간 사이에, 백신은 전형적으로 2가지의 인플루엔자 A 균주 (H1N1 및 H3N2) 및 한 가지의 인플루엔자 B 균주를 포함하며, 3가의 백신이 전형적이다. 본 발명은 또한 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주와 같은 유행의 바이러스 균주 (즉, 백신 수용자 및 일반적인 사람 집단이 면역학적으로 나이브 (naive)한 균주, 특히 인플루엔자 A 바이러스)를 사용할 수 있고, 유행의 균주에 대한 인플루엔자 백신은 1가일 수 있고 또는 유행 균주에 의해 보충되는 정상적인 3가의 백신을 기초로 할 수 있다. 그러나, 계절과 백신에 포함되는 항원의 성질에 의존하여, 본 발명은 하나 이상의 HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대해 예방할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대해서 예방할 수 있다.

게다가 유행기 사이의 균주에 대한 면역화에 적합할 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 유행성 또는 잠재적으로-유행성인 균주에 대한 면역화를 위해 특히 유용하다. 유행성의 발생을 야기하는 가능성을 제공하는 인플루엔자 균주의 특성은: (a) 현재-순환하는 사람 균주에서의 헤마그글루티닌과 비교하여 새로운 헤마글루티닌, 즉, 십년 이상 동안 사람 집단에서 드러나지 않았던 것 (예를 들어, H2) 또는 이전에 사람 집단에서 전혀 보이지 않았던 것 (예를 들어, 단지 새 집단에서만 일반적으로 발견된 H5, H6 또는 H9)을 함유하여, 사람 집단은 균주의 헤마그글루티닌에 면역학적으로 나이브하게 된다는 것이고; (b) 사람 집단에서 수평으로 전달될 수 있다는 것; (c) 사람에게 병원성이라는 것이다. H5 헤마그글루티닌 형을 가지는 바이러스는 H5N1 균주와 같은 유행성 인플루엔자에 대한 면역화를 위해 바람직하다. 다른 가능한 균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 몇몇 다른 출현하는 잠재적으로 유행성인 균주를 포함한다. 본 발명은 비-사람 동물 집단 내지 사람, 예를 들어, 돼지-기원 H1N1 인플루엔자 균주를 퍼뜨릴 수 있는 또는 퍼진 잠재적인 유행성 바이러스 균주에 대한 예방에 특히 적합하다. 본 발명은 따라서 비-사람 동물 뿐만 아니라 사람에게 백신 접종하기에 적합하다.

항원이 유용하게 조성물에 포함될 수 있는 다른 균주들은 저항성 유행성 균주 [참고문헌 33]를 포함하는 항바이러스 구제에 저항성인 (예를 들어, 오셀타미비르 (oseltamivir) [참고문헌 32] 및/또는 자나미비르 (zanamivir)에 저항성인) 균주들이다.

본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의 (예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 항원 (들)을 포함할 수 있다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 다른 균주들은 전형적으로 별개로 성장되고 바이러스가 수확되고 항원이 제조된 후 혼합되었다. 따라서 본 발명의 공정은 하나 이상의 인플루에자 균주로부터의 항원들을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 2가지의 인플루엔자 A 바이러스 균주와 한 가지의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터의 항원을 포함하는 3가의 백신이 전형적이다. 4가의 백신도 또한 유용하다. 2가지의 인플루엔자 A 바이러스 균주와 2가지의 인플루엔자 B 바이러스 균주, 또는 3가지 인플루엔자 A 바이러스 균주와 한 가지 인플루엔자 B 바이러스 균주를 포함하는 4가의 백신이 또한 유용하다 [참고문헌 34].

약제학적 조성물

본 발명에 따라서 제조되는 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능하다. 그것들은 보통 항원들에 더하여 성분을 포함하는데, 예를 들어, 그것들은 전형적으로 한 가지 이상의 약제학적 담체 (들) 및/또는 부형제 (들)을 포함한다. 하기 설명하는 바와 같이, 보조제가 또한 포함될 수도 있다. 이러한 성분들의 충분한 논의는 참고문헌 35에서 사용가능하다.

백신 조성물은 일반적으로 수성 형태일 것이다. 그러나, 일부 백신은 건조 형태, 예를 들어 주사 가능한 고체 또는 패치 상의 건조된 또는 중합화된 제제의 형태일 수 있다.

백신 조성물은 티메로살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 수은함유 물질이 실질적으로 없는 (즉, 5㎍/㎖ 미만), 예를 들어, 무-티메로살이어야 한다 [참고문헌 26, 36]. 수은을 함유하지 않는 백신이 더 바람직하다. α-토코페롤 숙시네이트는 수은 화합물에 대한 대안으로서 포함될 수 있다 [참고문헌 26]. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 조절하기 위해, 나트륨 염과 같은 생리적 염을 포함하는 것을 바람직하다. 1 내지 20mg/㎖로 존재할 수 있는 염화나트륨 (NaCl)이 바람직하다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산2나트륨 무수물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.

백신 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이고, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있을 것이다. 삼투압은 백신접종에 의해 야기되는 통증에 영향을 미치지 않는 것으로 이전에 보고되었지만 [참고문헌 37], 그럼에도 이 범위로 삼투압을 유지하는 것이 바람직하다.

백신 조성물은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 전형적인 완충액은 다음을 포함한다: 인산염 완충액; 트리스 완충액; 붕산염 완충액; 숙신산 완충액; 히스티딘 완충액 (특히 알루미늄 히드록시드 보조제와 함께); 또는 시트르산 완충액. 완충액은 전형적으로 5-20 mM 범위에 포함될 것이다.

백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 더 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 그러므로 본 발명의 과정은 포장 전에 대량의 백신의 pH를 조절하는 단계를 포함할 수도 있다.

백신 조성물은 바람직하게는 멸균이다. 백신 조성물은 예를 들어, 투여용량 당 <1 EU (엔도톡신 단위, 표준 측정), 및 바람직하게는 투여용량 당 <0.1 EU를 함유하는, 바람직하게는 비-발열성이다. 백신 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.

본 발명의 백신 조성물은, 특히 분할 또는 표면 항원 백신에 대해, 세제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 ('Tweens'로 알려짐), 옥톡시놀 (예컨대 옥토시놀-9 (Triton X-1OO) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 또는 데옥시콜산 나트륨을 포함할 수 있다. 세제는 단지 미량으로 존재할 수 있다. 따라서 백신은 각각 1mg/㎖ 미만의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 미량의 다른 잔여 성분들은 항생제일 수 있다 (예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).

백신 조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있고 또는 다수회 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다 (즉, '다수회 투여량' 키트). 보존제의 포함은 다수회 투여량 배치에서 바람직하다. 다수회 투여량 조성물에서 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서 (또는 더하여), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수도 있다.

인플루엔자 백신은 절반의 용량 (즉, 약 0.25 ㎖)이 어린이에게 투여될 수도 있지만, 전형적으로 약 0.5 ㎖의 용량 부피로 투여된다.

조성물 및 키트는 바람직하게 2 내지 8 ℃ 사이에서 보관된다. 그것들은 얼어서는 안 된다. 그것들은 이상적으로 직사광을 차단해야 한다.

숙주 세포 DNA

바이러스가 세포주에서 분리되고 및/또는 성장된 경우, DNA의 몇몇 종양 유발 활성을 최소화하기 위해 최종 백신의 잔여 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 실시이다.

따라서 본 발명에 따라서 제조되는 백신 조성물은 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있을지라도, 바람직하게는 용량 당 잔여 숙주 세포 DNA 10ng 미만 (바람직하게는 1 ng 미만, 및 더 바람직하게는 100 pg 미만)을 함유한다.

임의의 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이가 500 bp 미만, 예를 들어 400 bp 미만, 300 bp 미만, 200 bp 미만, 100 bp 미만 등인 것이 바람직하다.

DNA를 오염시키는 것은 표준 정제 과정, 예를 들어 크로마토그래피 등을 사용하여 백신 제조 동안 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 예를 들어, DNase를 사용함으로써 뉴클레아제 처리에 의해 향상될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 먼저 바이러스 성장 동안 사용될 수 있는 DNase (예를 들어, 벤조나제)를 사용하는 단계, 다음에 비리온 파괴 동안 사용될 수 있는 양이온성 세제 (예를 들어, CTAB)를 사용하는 단계의 2-단계 처리를 수반하는 참고문헌 38 및 39에서 개시되어 있다. β-프로피오락톤과 같은 알킬화제로 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 유리하게는 또한 비활성 비리온을 비활성화하기 위해 사용될 수 있다 [참고문헌 40].

보조제

본 발명의 조성물은 유리하게는 보조제를 포함하는데, 이것은 조성물을 받은 대상체에서 유발된 면역 반응 (체액성 및/또는 세포성)을 향상시키는 기능을 할 수 있다. 바람직한 보조제는 수중유 에멀젼을 포함한다. 여러가지 이러한 보조제는 공지이고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 오일 (들) 및 계면활성제 (들)은 생분해성 (대사가능) 및 생체적합성이다. 에멀젼 중의 오일 방울들은 일반적으로 직경이 5 ㎛ 미만이고 이상적으로는 미크론이하 직경을 가지며, 이들 작은 크기들은 안정한 에멀젼을 제공하기 위해 마이크로유동화기로 달성된다. 220 nm 미만의 크기를 갖는 방울들이 바람직한데 그것들이 여과멸균될 수 있기 때문이다.

에멀젼은 동물 (예, 물고기) 또는 야채 원료로부터의 오일들을 포함한다. 야채 오일의 원료는 견과류, 씨앗 및 곡물을 포함한다. 땅콩 오일, 콩 오일, 코코넛 오일 및 올리브 오일을 가장 흔히 사용하는데, 견과류 오일의 예가 된다. 호호바 (jojoba) 오일, 예를 들어 호호바 콩에서 얻어진 것도 사용될 수 있다. 씨앗 오일은 홍화씨 오일, 목화씨 오일, 해바라기씨 오일, 참깨씨 오일 등을 포함한다. 곡류에서, 옥수수 오일을 가장 손쉽게 사용하지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등의 다른 곡류의 오일 또한 사용될 수 있다. 글리세롤과 1,2-프로판디올의 6-10 탄소 지방산 에스테르는, 씨앗 오일에서 자연적으로 발생하지 않지만, 견과류 및 씨앗 오일 유래의 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수도 있다. 포유동물 젖의 지방과 오일이 대사되어, 본 발명에 사용될 수도 있다. 동물 원료로부터 순수한 오일을 얻기 위해 필요한 분리, 정제, 비누화 및 다른 수단은 당업계에 잘 알려져 있다. 대부분 물고기는 손쉽게 회수될 수도 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간 오일, 상어 간 오일 및 경랍 (spermaceti) 같은 고래 오일은 여기에 사용될 수도 있는 여러 가지 물고기 오일의 예가 된다. 다수의 분지형 오일은 5-탄소 이소프렌 단위로 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르페노이드이라고 부른다. 상어 간 오일은 여기에 특히 바람직한 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔이라고 알려진 분지형의, 불포화 테르페노이드를 함유한다. 스쿠알렌의 포화된 유사체인 스쿠알란은 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함한 물고기 오일은 상업적 원료로부터 쉽게 구할 수 있거나 업계에서 알려진 방법에 의해 얻어질 수도 있다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다 (하기 참조).

오일의 혼합물도 사용될 수 있다.

계면활성제는 그들의 'HLB' (친수/친유 밸란스)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게 적어도 15 및 더 바람직하게 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 다음을 포함하는 계면활성제와 함께 사용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (일반적으로 Tweens라고 불림), 특히 폴리소르베이트 20과 폴리소르베이트 80; DOWFAX^TM이라는 상표로 시판되는, 선형의 EO/PO 블록 코폴리머 같은, 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO) 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 코폴리머; 특히 옥톡시놀-9 (triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)와 함께, 반복되는 에톡시기 (옥시-1,2-에탄디일)의 수가 다양할 수 있는 옥톡시놀; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스파티딜콜린 같은 인지질 (레시틴); Tergitol^TM NP 시리즈 같은 노닐페놀 에톡실레이트; 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30) 같은, 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜 유래의 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제); 소르비탄 트리올리에이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트 같은 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPANs라고 알려짐). 비-이온성 활성계면제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (플리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트), Span 85 (소르비탄 트리올리에이트), 레시틴 및 triton X-100이다.

계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있는데, 예를 들면 Tween 80/Span 85 혼합물이다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 (Tween 80) 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (triton X-100) 같은 옥톡시놀의 조합 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합은 laureth 9 에 더하여 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

계면활성제의 바람직한 양은 (중량 %): 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페톡시 폴리옥시에탄올 (triton X-100 또는 triton 계열의 다른 세제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (laureth 9) 0.1 내지 20%, 바람직하게 0.1 내지 10%, 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다.

백신이 분할 바이러스를 포함하는 경우, 수층에 유리 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 이것은 유리 계면활성제가 항원에 "분할 효과"를 행할 수 있고, 그렇게 함으로써 그렇지 않으면 존재할 수도 있는 몇몇 분할되지 않은 비리온 및/또는 비리온 집합체를 방해한다. 이것은 분할 바이러스 백신의 안정성을 향상시킨다 [참고문헌 41].

바람직한 에멀젼은 1 ㎛ 미만, 예를 들어, 750 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 220 nm 이하, 200 nm 이하, 또는 더 작은 평균 방울 크기를 갖는다.

본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼 보조제는, 제한되는 것은 아니지만 다음을 포함한다:

● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 미크론이하 에멀젼. 에멀젼의 조성물은 약 5부피% 스쿠알렌, 약 0.5부피% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량조건에서, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85이다. 이 보조제는 참고문헌 45의 10장 및 참고문헌 46의 12장에서 더욱 상세하게 설명되는 'MF59'로서 알려져 있다 [참고문헌 42-44]. MF59 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온, 예를 들어, 1OmM 시트르산나트륨 완충액을 포함한다.

● 스쿠알렌, DL-α-토코페롤, 및 폴리소르베이트 80 (Tween 80)의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 그것은 또한 Span 85 (예를 들어, 1 %로) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 이것이 더욱 안정한 에멀젼을 제공하기 때문에 바람직하게는 ≤ 1이다. 스쿠알렌과 Tween 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 PBS 중에 Tween 80을 용해하여 2% 용액을 제공한 다음, 90㎖의 이 용액과 (5g의 DL-α-토코페롤과 5㎖ 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합함으로써 만들어질 수 있다. 결과된 에멀젼은 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경으로 미크론이하 오일 방울을 가질 수 있다. 에멀젼은 또한 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3d-MPL)를 포함할 수 있다. 다른 유용한 이 종류의 에멀젼은, 사람 투여 용량 당, 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다 [참고문헌 47].

● 스쿠알렌, 토코페롤 및 Triton 세제 (예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다 (하기 참조). 에멀젼은 인산염 완충액을 함유할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다 (하기 참조). 에멀젼은 인산 완충액을 함유할 수 있다.

● 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제 (예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤 (예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이들 3가지 성분을 약 75 : 11 : 10 (예를 들어, 750㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 11O㎍/㎖ Triton X-100 및 1OO㎍/㎖ α-토코페롤 숙시네이트)의 중량 비율로 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 몇몇 기여를 포함하여야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다 (하기 참조). 수층은 인산염 완충액을 함유할 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수, pH 7.4에서 제제화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 보조제에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다 [참고문헌 48] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 또한 "AF" 보조제에서와 같이, Thr-MDP 없이 사용될 수 있다 [참고문헌 49] (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유동화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고 및/또는 200 nm 미만의 크기를 갖는 적어도 90%의 오일 방울 (부피)을 갖는다 [참고문헌 50]. 에멀젼은 또한 하나 이상의 알디톨; 동결보호제 (예를 들어, 도데실말토사이드 및/또는 수크로스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수도 있다. 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수 있다 [참고문헌 51]. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼 [참고문헌 52]. 보조제 백신에서 이들 성분의 최종 농도 (중량)은 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105 (플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴/카프릭 트리글리세라이드)이다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고문헌 53에서 설명된 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디올리핀이다. 미크론이하 방울 크기가 유리하다.

● 대사되지 않는 오일 (경 미네랄 오일) 및 적어도 한 가지 이상의 계면활성제 (레시틴, Tween 80 또는 Span 80)로 이루어진 서브 미크론 수중유 에멀젼. QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성기 컨쥬게이트 (참고문헌 54에서 설명된 바와 같이, 글루쿠로닉산의 카복실기를 통해 데스아실사포닌에 알리파틱 아민 첨가에 의해 생성된 GPI-0100), 디메티이디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N,-비스 (2-히드록시에틸) 프로판디아민 같은 첨가제를 포함할 수도 있다.

● 사포닌 (예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀로서 회합되는 에멀젼 [참고문헌 55].

● 미네랄 오일, 비이온성 친유성 에톡실화 지방 알콜 및 비이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡실화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머) 를 포함하는 에멀젼 [참고문헌 56].

● 미네랄 오일, 비이온성 친수성 에톡실화 지방 알콜 및 비이온성 친유성 계면활성제 (예를 들어 에톡실화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머) 를 포함하는 에멀젼 [참고문헌 56].

몇몇 구체예에서, 에멀젼은 전달되는 즉시 항원과 혼합될 수 있고, 따라서 보조제 및 항원은 포장되거나 또는 유통된 백신에서 개별적으로 유지되어, 사용시 최종 제제을 준비할 수 있다. 다른 구체예에서, 에멀젼은 제조하는 동안 항원과 혼합되고, 따라서 조성물은 액체 보조 형태로 포장된다. 항원은 백신이 최족ㅇ적으로 두 액체의 혼합에 의해 제조되도록 일반적으로 수성 형태일 것이다. 섞기 위한 두 액체의 부피비는 다양하지만 (5:1 내지 1:5) 일반적으로 약 1:1이다. 특정 에멀젼의 상기 설명에 성분의 농도가 주어진 경우, 이 농도는 전형적으로 희석되지 않은 조성이고, 항원 용액과 섞은 후 농도는 감소할 것이다.

백신 조성물의 포장

본 발명 (또는 키트 성분)의 조성물에 적합한 용기는 바이알, 주사기 (예를 들어, 1회용 주사기), 나잘 스프레이 (nasal spray) 등을 포함한다. 이 용기들은 멸균되어야 한다.

조성물/성분이 바이알에 들어있는 경우, 바이알은 바람직하게 유리 또는 플라스틱 소재로 만들어진다. 바이알은 바람직하게 조성물이 추가되기 전에 멸균된다. 라텍스에 민감한 환자들에 대한 문제를 피하기 위해서, 바이알은 바람직하게 라텍스가 없는 마개로 밀봉되고, 모든 포장 소재에 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 백신 1회 투여량을 포함할 수도 있고, 또는 1회 투여량 이상 ("다수회 투여량" 바이알), 예를 들어, 10회 용량을 포함할 수도 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 만들어진다.

바이알은 미리 채워진 주사기가 캡 안으로 들어갈 수 있고, 주사기의 내용물이 바이알로 배출될 수 있고 (예를 들어, 동결건조된 물질을 복원하기 위해), 및 바이알의 내용물이 주사기로 다시 제거될 수 있는 것이 적용된 캡 (예를 들어, 루어 록)을 가질 수 있다. 바이알로부터 주사기를 제거한 후, 그때 바늘은 붙어있을 수 있고, 조성물은 환자에게 투여될 수 있다. 밀봉 또는 커버는 캡이 접근될 수 있기 전에 제거되어야 하는 것처럼 캡은 바람직하게 밀봉 또는 커버 내에 위치한다. 바이알은 내용물의 무균성 제거가 허용되는, 특히 다수회 투여량 바이알에서 캡을 가질 수도 있다.

성분이 주사기에 포장될 경우, 주사기는 그것과 부착된 바늘을 가질 수도 있다. 만약 바늘이 부착되지 않으면, 분리된 바늘은 조립 및 사용을 위한 주사기와 함께 제공될 수도 있다. 이러한 바늘은 끼워질 수도 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기는 기록 유지를 가능하게 하기 위해 롯트 번호, 인플루엔자 시즌 및 내용물의 유효 기간이 인쇄될 수도 있는 떼어낼 수 있는 표시와 함께 제공될 수도 있다. 흡입 중 돌발적인 플런저 제거로부터 플런저를 보호하기 위해 주사기의 플런저는 바람직하게 마개를 갖는다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수도 있다. 1회용 주사기는 백신 1회 투여량을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘 부착에 앞서 가장자리를 밀봉하기 위해 팁 캡을 갖고 팁 캡은 바람직하게 부틸 고무로 만들어져 있다. 만약 주사기 및 바늘이 개별 포장되면 그때 바늘은 바람직하게 부틸 고무 보호막에 끼워진다. 바람직한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"^TM하에 시판되는 것들이다.

용기는, 예를 들어 아이들에게 전달 가능하게 하기 위해서 절반 투여량 부피를 보이도록 표시할 수도 있다. 예를 들어, 0.5 ml 용량을 함유하는 주사기는 0.25 ml 부피를 보여주는 표시를 가질 수도 있다.

유리 용기 (예를 들어, 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 석회 유리보다 붕규산 유리로 만들어진 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

키트 또는 조성물은 예를 들면, 투여를 위한 안내서, 백신과 함께 항원의 세부사항, 등처럼 백신의 세부사항을 포함하는 설명서와 함께 포장될 수도 있다 (예를 들어, 같은 박스). 안내서는 또한 예를 들어 백신 접종 후 과민성 반응의 경우 아드레날린 용액의 쉽게 사용가능하도록 경고를 함유할 수도 있다.

구제 방법 및 백신 투여

본 발명은 본 방법에 따라서 제조된 백신을 제공한다. 이들 백신 조성물은 사람 또는 돼지 같은 비-사람 동물 피험자에게 투여에 적합하며, 본 발명은 본 발명의 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서 사용을 위한 본 발명의 조성물을 제공하고, 대상체에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 사용을 제공한다.

이들 방법 및 사용에 의해 상승되는 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 예방 항체 반응을 포함할 것이다. 항체 반응, 중화 능력 및 인플루엔자 바이러스 백신 접종 후 예방을 평가하는 방법은 업계에 잘 알려져 있다. 사람 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체의 적정 농도를 보여준 사람 연구는 예방 (약 30-40의 혈청 샘플 적혈구응집반응-억제 적정 농도는 상동 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 예방을 준다)과 연관이 있다 [참고문헌 57]. 항체 반응은 전형적으로 적혈구응집반응의 억제, 미세 중화, 단일 방사능 면역 확산 (single radial immunodiffusion, SRID), 및/또는 단일 방사능 용혈 (single radial hemolysis, SRH)에 의해 측정된다. 이 검정 기술들은 업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 바람직한 면역화 경로는 근육 내 주사에 의하지만 (예를 들어, 팔 또는 다리로), 다른 사용 가능한 경로는 피하 주사 또는 비강 내 [참고문헌 58-60], 구강 내 [참고문헌 61], 피부 내 [참고문헌 62, 63], 피부를 통한, 경피성 [참고문헌 64] 등이 있다.

본 발명에 따라서 제조된 백신은 어린이와 성인 둘 다를 구제하는데 사용될 수도 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6개월 나이부터 소아과 및 성인 면역에 사용에 대해 추천된다. 따라서 사람 대상체는 1살 미만, 1-5살, 5-15살, 15-55살, 또는 적어도 55살일 수도 있다. 백신을 받기 위해 바람직한 대상체는 연장자 (예를 들어 50살 이상, 60살 이상, 및 바람직하게 65살 이상), 연소자 (예를 들어, 5살 이하), 입원한 대상체, 의료계 종사자, 군대 인력, 임산부, 만성질환자, 면역결핍 대상체, 백신을 받기 전 7일 이내에 항바이러스 화합물 (예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나르니비르 화합물; 하기 참조)을 받은 대상체, 달걀 알레르기가 있는 사람 및 해외 여행중인 사람이다. 그러나 백신은 이 그룹에 단독으로는 적합하지 않고 한 집단에서 더 일반적으로 사용될 수도 있다. 유행성 균주에서, 모든 연령층에 투여가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 조성물은 효율에 대해 CPMP 기준의 1,2 또는 3을 만족한다. 성인 (18-60살)에서, 이 기준은: (1) 70% 이상 혈청 예방; (2) 40% 이상 혈청 전환; 및/또는 (3) GMT 2.5배 이상 증가이다. 연장자에서 (60살 초과), 이 기준은: (1) 60% 이상 혈청 예방; (2) 30% 이상 혈청 전환; 및/또는 (3) GMT 2배 이상 증가이다. 이 기준은 적어도 50명의 환자와 함께 한 공개연구에 기초한다.

처치는 단일 투여량 계획 또는 다수회 투여량 계획에 의할 수 있다. 다수회 투여량은 초기의 면역화 스케줄 및/또는 면역성 향상 스케줄로 사용될 수 있다. 다수회 투여량 계획에서 다양한 투여량은 예를 들어 비경구 프라임, 점막 신장, 점막 프라임 및 경구신장 등 같거나 또는 다른 루트에 의해 주어질 수도 있다. 1회 투여량 이상의 투여 (전형적으로 2회 용량)는 나이브 환자에게 예를 들어, 전에 인플루엔자 백신을 받아본 적이 없는 사람 또는 새로운 HA 서브타입 (유행성 발병)에 대한 백신 접종에 대해 특히 면역학적으로 유용하다. 다수회 투여량은 전형적으로 적어도 1주 간격 (예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.

본 발명에 의해 제조되는 백신은 예를 들어, 실질적으로 동시에 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 복합 에이치.인플루엔자 타입 b 백신, 비활성 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 뇌수막구균 백신 (4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 합포체 바이러스 백신, 폐렴 구균 백신, 등 다른 백신과 실질적으로 동시에 (예를 들어, 동일한 의학적 상담 동안 또는 의료 전문가 또는 백신접종 센터를 방문) 환자에게 투여될 수 있다. 폐렴 백신 및/또는 뇌수막구균 백신의 실질적으로 동시 투여는 연장자에서 특히 유용하다.

유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물 (예를 들어, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)과 실질적으로 동시에 (예를 들어 동일한 의료 상담 동안 또는 의료 전문가 방문) 환자에게 투여될 수 있다. 이 항바이러스 화합물은 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥산-1-카복실 산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안히드로-3,4,5-트리디옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에노닉 산, 그것의 에스테르 (예를 들어, 에틸 에스테르) 및 그것의 염 (예를 들어, 인산염) 같은 뉴라미니다제 억제제를 포함한다. 바람직한 항바이러스 화합물은 또한 오셀타미비르 인산염 (TAMIFLU^TM)으로 알려진 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥산-1-카복실 산, 에틸 에스테르, 인산염 (1:1)이다.

일반

용어 "포함하는"은 "구성하는"뿐만 아니라 "포함하는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 오로지 X만으로 이루질 수도 있고, 추가적인 몇몇 것 예를 들어x+ Y를 포함할 수도 있다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

수치 x와 관련된 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.

구체적으로 언급되지 않는다면, 2이상의 성분들을 혼합하는 단계는 혼합의 몇몇 특정 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3 가지 성분들이 있다면, 두 성분들은 서로 혼합될 수 있고, 조합은 제 3 성분 등과 혼합될 수 있다.

동물 (및 특히 소) 물질이 세포의 배양물에서 사용된다면, 그것은 전염성 해면상뇌증 (transmissible spongiform encephalopathies, TSEs), 및 특히 광우병 (BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전반적으로, 동물-유래 물질이 완전히 없는 세포를 배양하는 것이 바람직하다.

화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여된 경우, 그때 그 화합물은 대신에, 적합한 프로드러그 (prodrug)에 의해 대체될 수도 있다.

실시예

바이러스 구제

MDCK 33016 세포를 37 ℃ 온도에서 SDM 배지에서 현탁액에서 배양하였다. 트랜스펙션 하루 전 6x10⁵ 세포/웰을 CELL-BLIND^TM 6 웰 다쉬에서 5% FCS를 포함한 2ml DMEM에 분주하였다. 동시 실험에서 세포를 FCS 없는 상태로 분주하였다. 세포들을 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다.

다음날 분주 된 세포를 Lipofectamine^TM LTX Plus 트랜스펙션 시약으로 제조사의 프로토콜을 사용하여 트랜스펙션 하였다. 간단히 말해, 각 플라스미드 (PA, PB1, PB2, NP, NS, M, HA, NA 더하기 TMPRSS2) 1 ㎍을 혈청 없는 DMEM 500 ㎕에 희석하였다. Plus 시약 10 ㎕를 희석된 DNA에 직접 추가하였다. 혼합물을 5분 동안 상온에서 배양한 후 25 ㎕ 리포펙타민을 추가하였다. 그때 혼합물을 상온에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 트랜스펙션 시약:DNA 복합체를 한 방울씩 떨어뜨리는 방법으로 세포에 추가하였다. 그 다음 세포를 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다.

배양 후, 배지는 세포로부터 제거되고 1:2000 희석된 Trypzean^TM (1 mg/mlm 저장액)을 함유하는 혈청 없는 DMEM 배지에서 4x10⁵ MDCK 세포의 현탁액을 각 웰로 추가하였다. 동시 실험에서, 1:2000 희석된 Trypzean^TM (1 mg/ml 저장액) 단독으로, 즉, 세포의 추가 없이, 트랜스펙션 된 세포에 추가되었다. 세포를 37 ℃에서 48시간 동안 또는 세포가 용해된 후 Focus-Forming 검정을 사용하여 바이러스 적정농도가 결정될 때까지 배양하였다.

초점-성형 검정

감염되지 않은 MDCK 세포는 48웰 플레이트에 10% FCS의 DMEM 500 ㎕에 6.25x10⁴ 세포/웰의 밀도로 분주 되었다. 다음날 세포는 37 ℃에서 2시간 동안 100-150 ㎕ 부피의 바이러스에 감염되었다. 세포는 다양한 바이러스 희석 비율로 감염된다. 감염 두 시간 후, 배지는 제거되고 10% FCS가 들어있는 DMEM 500 ㎕이 각 웰에 추가되었다. 세포는 다음날까지 37 ℃에서 배양되었다.

감염 24시간 후, 배지는 제거되고 세포는 PBS로 한 번 씻었다. PBS에 녹인 얼음처럼 찬 80% 아세톤 500 ㎕가 각 웰에 추가된 후 4 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 아세톤 혼합물은 제거되고 세포를 PBST (PBS + 0.1% Tween)로 한번 씻었다. PBS에 녹인 2% BSA 500 ㎕를 각 웰에 추가하고 후 상온에서 (RT) 30분 동안 배양하였다. 블로킹 버퍼에 1:6000으로 희석된 항-NP 500 ㎕가 추가된 후 상온에서 2시간 동안 배양되었다. 항체 용액은 제거되고 세포는 PBST로 두 번 씻었다. 2차 항체 (고트 항 마우스)가 블로킹 버퍼 500 ㎕에 1:200으로 희석되어 추가되었고 플레이트는 상온에서 2시간 동안 배양되었다. 항체 용액은 제거되고 세포는 PBST로 세 번 씻었다. KPL True Blue 500 ㎕을 각 웰이 추가하고 10분 동안 배양하였다. 반응은 True-Blue를 빨아내고 dH₂O로 한 번 씻음에 의해 멈추었다. 물은 제거되고 세포는 마르게 놓아두었다.

결과

세 가지 다른 바이러스 백본으로 초점 성형 검정한 결과는 도 2-4에서 볼 수 있다. 결과는 감염 후 24시간 동안 세포 추가의 유무에 따른 바이러스 구제의 효율을 보여준다. 보이는 바와 같이, 세포가 추가되지 않은 실험과 비교해서 트랜스펙션 후 24시간 동안 세포를 추가한 경우의 실험의 모든 경우에서 바이러스 구제의 효율은 3배까지 증가했다. 효율의 증가는 모든 검사된 바이러스 백본, 및 혈청 함유 및 혈청 없는 조건 둘 다에서 볼 수 있다.

본 발명은 단지 예시적인 방법에 의해 기재되었으며, 본 발명의 범위 및 사상 이내에서 변형이 될 수 있다.

참고문헌

[1] Racaniello and Baltimore (1981) Science 214:916-919

[2] Kaplan et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:8424-8428

[3] Fodor et al. (1999) J. Virol 73 (11):9679-9682

[4] Hoffmann et al. (2002) Proc Nail Acad Sci USA 99:11411-11416

[5] Kobayashi et al. (2007) Cell Host Microbe 19;1 (2):147-57

[6] WO2009/000891.

[7] Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y

[8] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8.

[9] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110.

[10] Bruhl et al. (2000) Vaccine 1.9:1149-58.

[11] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[12] http://www.atcc.org/

[13] http://locus.umdnj.edu/

[14] WO97/37000.

[15] Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.

[16] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[17] EP-A- 1260581 (WO01/64846).

[18] WO2006/071563.

[19] WO2005/113758.

[20] WO97/37001.

[21] Neumann et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9.

[22] WO02/28422.

[23] WO02/067983.

[24] WO02/074336.

[25] WO01/21151.

[26] WO02/097072.

[27] WO2005/113756.

[28] Vaccines, (eds. Plotkins & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.

[29] Huckriede et al. (2003) Methods Eniymol 373:74-91.

[30] Treanor et al . (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[31] Keitel et al . (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[32] Herlocher et al . (2004) J Infect Dis 190 (9):1627-30.

[33] Le et al . (2005) Nature 437 (7062):1108.

[34] WO2008/068631.

[35] Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy . 20th edition, ISBN: 0683306472.

[36] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71 :91-96.

[37] Nony et al . (2001) Vaccine 27:3645-51.

[38J EP-B-0870508.

[39] US 5948410.

[40] WO2007/052163.

[41] WO2007/052061.

[42] WO90/14837.

[43] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[44] Podda (2001) Vaccine 19:2673-2680.

[45] Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[46] Vaccine Adjuvants : Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[47] WO2008/043774.

[48] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[49] Hariharan et al (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[50] US-2007/014805.

[51] US-2007/0191314.

[52] Suli et al. (2004) Vaccine 22 (25-26):3464-9.

[53] WO95/1 1700.

[54] US patent 6,080,725.

[56] WO2006113373.

[57] Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35:69-75.

[58] Greenbaum et al . (2004) Vaccine 22:2566-77.

[59] Zurbriggen et al . (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.

[60] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30.

[61] Mann et al . (2004) Vaccine 22:2425-9.

[62] Halperin et al. (1979) Am J. Public Health 69:1247-50.

[63] Herbert et al . (1979) J Infect Dis 140:234-8.

[64] Chen et al . (2003) Vaccine 21:2830-6.

<110> NOVARTIS AG <120> IMPROVED REVERSE GENETICS METHODS FOR VIRUS RESCUE <130> P055736WO <150> PCT/US 61/279,487 <151> 2009-10-20 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp 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<213> Influenza A virus <400> 4 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Thr 1 5 10 15 Ile Gly Ile Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile 20 25 30 Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile 35 40 45 Cys Asn Gln Arg Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn Gln 50 55 60 Thr Tyr Val Asn Ile Asn Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Lys Asp Thr 65 70 75 80 Thr Ser Val Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly 85 90 95 Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly 100 105 110 Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu 115 120 125 Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His 130 135 140 Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ser 145 150 155 160 Cys Pro Ile Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser 165 170 175 Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr 180 185 190 Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr 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Claims

(i) 숙주 세포 배양물을 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구조물로 트랜스펙션하는 단계; (ii) 단계 (i)의 트랜스펙션된 숙주 세포에 세포를 추가하여 세포의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (iii) 바이러스를 생산하기 위해 세포의 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
(i) 숙주 세포 배양물을 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구조물로 트랜스펙션하는 단계; (ii) 단계 (i)의 트랜스펙션된 숙주 세포에 세포를 추가하여 세포의 혼합물을 제공하는 단계; (iii) 바이러스를 생산하기 위해 세포의 혼합물을 배양하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 얻은 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 백신의 제조를 위한 바이러스의 제조 방법.
제 2항에 있어서, 단계 (iii)에서 정제된 바이러스를 백신으로 조제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 VERO, PER.C6 또는 MDCK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, MDCK 세포는 세포주 MDCK 33016 (DSM ACC2219)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 현탁 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 부착 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 세그먼트로 된 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 음성 가닥 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 이중 가닥 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 바이러스는 로타 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 또는 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 비-세그먼트화된 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.