CN101365480B - 经由β-丙内酯处理的残留细胞DNA水平降低的细胞衍生病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗或预防病毒感染的疫苗产品。本发明还提供减少与细胞培养物疫苗制备有关的污染物的方法。用DNA烷基化剂，例如β-丙内酯(BPL)处理使残留的功能细胞培养物DNA降解，从而提供了含有免疫原性蛋白并且基本上不含残留的功能细胞培养物DNA的疫苗，所述蛋白衍生自用细胞培养物繁殖的病毒。

Description

经由β-丙内酯处理的残留细胞DNA水平降低的细胞衍生病毒疫苗

本文引用的所有文件和在线信息通过引用方式全文纳入。

技术领域

本发明提供杂质减少的改良细胞培养产物和方法。具体地说，本发明提供一种改良方法以使会与细胞培养物产生的产物维持结合的任何残留功能细胞培养物DNA降解。按照本发明，用DNA烷基化剂，例如β-丙内酯(BPL)处理以使残留的功能细胞培养物DNA降解。可采用该方法处理包括疫苗和重组蛋白在内的各种细胞培养产物。

背景技术

商业生产病毒疫苗通常需要大量病毒作为抗原来源。可以在细胞培养系统中培养和复制种子病毒(seed virus)以获得疫苗生产所用的商业数量的病毒。适用于病毒复制的细胞培养系统包括哺乳动物细胞、鸟类细胞或昆虫细胞，但对于病毒疫苗特别优选哺乳动物细胞培养系统，从而确保病毒抗原蛋白质能正确糖基化和折叠。出于相似的原因，重组蛋白质表达也同样优选哺乳动物细胞培养系统。

如果未修饰细胞培养物的天然状态，其复制能力有限，因而对产生商业疫苗或重组蛋白质所需数量的材料而言行不通且无效。因此，出于生产目的，优选将细胞修饰成“连续”或“无限增殖”的细胞系，从而增加它们能分裂的次数。许多这种修饰所用的机制类似于致癌细胞所涉及的那些机制。因此，关注的是应该除去在这些系统中产生的疫苗或重组蛋白产物的最终制剂中细胞培养过程的任何残留物质，例如宿主细胞DNA。

除去残留宿主细胞DNA的标准方法是采用DNA酶处理。欧洲专利0870508和美国专利5948410披露了这种类型的常规方法，其涉及两步处理，首先用DNA酶(例如，Benzonase)，然后用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。

目前降低该风险的努力集中在减少残留宿主细胞DNA的总浓度。本发明的目的是通过消除任何残留宿主细胞DNA的功能而进一步降低风险。

发明概述

本发明提供杂质减少的改良细胞培养产物和方法。具体地说，本发明提供一种改良方法以使能与细胞培养物产生的产物维持结合的任何残留功能细胞培养物DNA降解。按照本发明，用DNA烷基化剂，例如β-丙内酯(BPL)处理以使残留的功能细胞培养物DNA降解。可采用该方法处理包括疫苗和重组蛋白在内的各种细胞培养产物。

本发明包括一种疫苗，其包含衍生自用细胞培养物增殖的病毒的免疫原性蛋白，其中所述疫苗基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。此外，本发明涉及在细胞培养物中表达的重组蛋白，最终重组蛋白制剂基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。

可用烷基化剂处理来消除任何残留宿主细胞DNA的功能，所述烷基化剂能将要转移入人受者染色体中，或者为受者DNA复制机制所识别的DNA切割成足够小的部分，因而其不能编码功能蛋白。降解的残留细胞培养物DNA的长度优选短于500个碱基对。降解的残留细胞培养物DNA的长度更优选短于200个碱基对。

发明详述

本发明提供杂质减少的改良细胞培养产物和方法。具体地说，本发明提供一种改良方法以使与细胞培养物产生的产物维持结合的任何残留功能细胞培养物DNA降解。按照本发明，用DNA烷基化剂，例如β-丙内酯(BPL)处理以使残留的功能细胞培养物DNA降解。可采用该方法处理包括疫苗和重组蛋白在内的各种细胞培养产物。

本发明包括一种疫苗，其包含衍生自用细胞培养物增殖的病毒的免疫原性蛋白，其中所述疫苗基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。此外，本发明涉及在细胞培养物中表达的重组蛋白，最终重组蛋白制剂基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。

可用烷基化剂处理来消除任何残留宿主细胞DNA的功能，所述烷基化剂能将要转移入人受者染色体中，或者为受者DNA复制机制所识别的DNA切割成足够小的部分，因而其不能编码功能蛋白。降解的(无功能的)残留细胞培养物DNA的长度优选短于1000个碱基对(例如，短于1000、800、700、600、500、400、300、200、150、100、75或50个碱基对)。降解的残留细胞培养物DNA的长度优选短于500个碱基对。降解的残留细胞培养物DNA的长度更优选短于200个碱基对。

本文所用的“功能DNA”或“功能RNA”表示能翻译成功能蛋白质或转移入哺乳动物染色体中的核苷酸序列。通常，能翻译成功能蛋白质的核苷酸序列需要启动子区域、起始密码子、终止密码子和功能蛋白质的内部编码序列。如果DNA发生损伤，例如加入烷基化剂所致，许多这些区域发生改变或遭破坏，从而不再进行翻译或只进行到形成所需蛋白的寡肽亚基。

“降解的残留功能细胞培养物DNA”指不能翻译成功能蛋白质或转移入哺乳动物染色体的功能DNA。“降解的残留功能DNA”的长度优选短于1000个碱基对，更优选短于500个碱基对，甚至更优选短于200个碱基对，最优选短于100个碱基对。可通过包括凝胶电泳在内的标准技术测定降解的残留功能DNA的长度。

本发明提供基本上不含残留的功能细胞培养物DNA的疫苗组合物和重组蛋白制剂。本文所用的“基本上不含残留的功能细胞培养物DNA”指某种组合物或制剂，其中每0.5ml检测到短于200个碱基对的残留DNA片段少于10ng。可通过包括毛细管电泳与核酸扩增技术在内的标准技术检测任何残留细胞培养物DNA的大小。

本发明使用烷基化剂，例如BLP提供了减少凝聚作用和污染物的额外益处。凝聚物减少的疫苗制剂的免疫原性也增强。疫苗的免疫原性依赖于针对特定病毒表位的特异性。如果蛋白质的表面与有害的分子结合或为之掩盖或因凝聚作用而掩藏在大分子中，则表位可能不易识别，因而在疫苗中的效率较低。此外，凝聚物减少的疫苗制剂可具有其它加工益处。纯化过程依赖于分离所需蛋白质，例如流感疫苗中的血凝素和神经氨酸酶。如果蛋白质因存在凝聚物或交联作用而在结构上得到修饰，它可能不能被识别，因此不能用柱层析、过滤或离心除去。

烷基化剂

本发明所用的烷基化剂包括将烷基引入化合物的物质。烷基化剂优选单烷基化剂(monoalkylating agent)，例如BPL。BPL是在许多疫苗的制备中广泛用于灭活病毒的单烷基化剂。BPL与包括核酸在内的各种生物分子反应，其中BPL通过烷化和脱嘌呤作用来修饰结构。BPL通常如以下结构所示：

在体外，BPL通常在有利于亲核反应的条件下(例如，高温、高BPL浓度和质子惰性的极性溶剂)与高浓度的亲核物质反应，从而形成功能化的丙酸，例如7-(2-羧乙基)鸟嘌呤或1-(2-羧乙基)脱氧腺苷(方案1)。Boutwell等，纽约科学协会年报(Annals New York Academy of Sciences)，751-764；Perrin等Biologicals，23(1995)207-211；Chen等Carcinogenesis，2(2)(1981)73-80。

方案1(Chen等)：

BPL 脱氧腺苷 1-(2-羧乙基)脱氧腺苷

DNA碱基的这种结合或烷基化通过包括碱基配对取代，特别是脱嘌呤、缺失与核苷交联在内的许多机制诱导诱变。BPL的高度诱变性和反应性对应于快速杀伤病毒，随后将DNA降解成非致癌性副产物。

用少于1％(例如，少于1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.2％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、0.01％或0.005％)的BPL处理来降解任何残留的功能细胞培养物DNA。优选用0.1％-0.01％BPL处理来降解残留的功能细胞培养物DNA。

优选向缓冲溶液中加入烷基化剂，溶液的pH宜维持在5-10之间。溶液的pH更优选维持在6-9之间。溶液的pH甚至更优选维持在7-8之间。

一些方法加入多次烷基化剂。例如，可先进行第一次BPL处理，再进行第二次BPL处理。在第一次和第二次处理之间可以有除去烷基化剂的步骤，但对于第二次处理，加入烷基化剂时无需除去第一次处理剩余的任何烷基化剂。

烷基化剂还优选用作疫苗所用病毒的灭活剂。本发明的烷基化剂优于能使蛋白质与包括宿主细胞DNA在内的其它物质交联的常规灭活剂，例如甲醛。这种交联导致凝聚物(例如，蛋白质-蛋白质聚集体、核苷酸组合体和蛋白质-核苷酸组合体)的形成。因为烷基化剂，例如BPL的病毒灭活不依赖于这种交联机制，所以利用这种烷基化剂灭活病毒尽可能减少了疫苗产品中凝聚物和其它杂质的形成。这种凝聚物可包括与其它蛋白质离子结合或共价结合的蛋白质，与其它核苷酸离子性结合或共价结合的蛋白质，和/或与与其它核苷酸离子性结合或共价结合的核苷酸。

本文所用的“凝聚”或“凝聚物”表明单个单位或颗粒结合在一起的物质或整体，从而产生较大的团体或颗粒。一般可通过定量检测可能的凝聚步骤前后或破坏凝聚物方法(例如，洗涤剂处理)应用前后的所需组分，通过凝胶电泳(例如，Laemmli系统，层析，溶液浊度，或沉淀研究和本领域熟知的其它方法来测定凝聚。

用烷基化剂，特别是BPL处理可涉及不同温度的阶段。例如，第一阶段可处于低温(例如，2-8℃，如约4℃)，第二阶段可处于较高的温度，一般至少比第一阶段高10℃(例如，25-50℃之间，如约37℃)。如果灭活和DNA降解均利用烷基化剂，则该两-阶段方法特别有用。在一典型的方案中，病毒灭活发生在温度较低的阶段，而DNA降解发生在温度较高的阶段。如下文所详述的，升高温度也有助于除去热敏感性的烷基化剂。

免疫原性蛋白质

适用于本发明的免疫原性蛋白质可衍生自疫苗靶标的任何病毒。可将免疫原性蛋白质配制成灭活(或杀伤)病毒，减毒病毒，裂解病毒制剂(split virusformulation)，纯化的亚单位制剂，从某病毒分离、纯化或衍生的病毒蛋白质，和病毒样颗粒(VLP)。

本发明的免疫原性蛋白质是病毒抗原，这些抗原优选包含在病毒生命周期的至少一个阶段暴露于其表面的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物中是保守的。病毒抗原包括衍生自一种或多种以下所列病毒的抗原以及下文鉴定的具体抗原实例。病毒可以是无包膜的，或者优选有包膜的。病毒优选RNA病毒，更优选ssRNA病毒。它们可具有有义基因组，或优选具有反义基因组。它们的基因组可以非节段的，或者优选节段的。

正粘病毒：病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙型流感(病毒)。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白质，包括：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白质(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。优选的抗原包括HA和NA。

流感抗原可衍生自流行病爆发间的(年度)流感毒株。或者，流感抗原可以衍生自可能导致流行病爆发的毒株(即，与目前的流行毒株相比，具有新血凝素的流感毒株，或者在禽类对象中致病并可能平行转移至人群的流感毒株，或对人致病的流感毒株)。取决于具体的季节和疫苗所包含的抗原性质，流感抗原可以衍生自以下一种或多种血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。

本发明的流感抗原可以衍生自禽流感毒株，特别是高致病性禽流感毒株(HPAI)。Alexander，Avian Dis(2003)47(3增刊)：976-81。

流感病毒抗原的进一步细节见下文。

副黏病毒科病毒：病毒抗原建议衍生自副黏病毒科病毒，例如肺病毒(RSV)、副黏病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。

肺病毒属：病毒抗原可衍生自肺病毒属，例如呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞体病毒、小鼠的肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。肺病毒属优选RSV。肺病毒抗原可以选自一种或多种以下蛋白质，包括：表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水性蛋白(SH)、基质蛋白M和M2、核衣壳蛋白N、P和L及非结构性蛋白NS1和NS2。优选的肺病毒抗原包括：F、G和M。参见，例如J Gen Virol.2004年11月；85(部分11)：3229。肺病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。

副黏病毒属：病毒抗原可衍生自副黏病毒属，例如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎(病毒)、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副黏病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副黏病毒属抗原可以选自一种或多种以下蛋白质：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)就基质蛋白(M)。优选的副黏病毒属蛋白包括：HN、F1和F2。副黏病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。可商业购得的腮腺炎疫苗包括：单价形式或与麻疹和风疹疫苗联用(MMR)的减毒活腮腺炎病毒。

麻疹病毒属：病毒抗原可以衍生自麻疹病毒属，例如麻疹(病毒)。麻疹病毒属抗原可选自一种或多种以下蛋白质：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。可商业购得的麻疹疫苗包括通常与腮腺炎和风疹联用的减毒的活麻疹病毒(MMR)。

微小RNA病毒：病毒抗原可衍生自微小RNA病毒，例如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。优选衍生自肠病毒，例如脊髓灰质炎病毒的抗原。

肠病毒：病毒抗原衍生自肠病毒，例如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22和24型柯萨奇A病毒、1-6型柯萨奇B病毒、1-9、11-27和29-34型艾柯病毒(ECHO病毒)、68-71(型)肠病毒。肠病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠病毒抗原优选一种或多种以下衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。可商业购得的脊髓灰质炎疫苗包括：灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。

嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，例如甲肝病毒(HAV)。可商业购得的HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。

披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，例如风疹病毒属、α病毒或动脉炎病毒。优选衍生自风疹病毒属，例如风疹病毒的抗原。披膜病毒抗原可选自：E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选自：E1、E2或E3。可商业购得的风疹疫苗包括通常与腮腺炎和麻疹疫苗联用的冷适应的活病毒(MMR)。

黄病毒属：病毒抗原可衍生自黄病毒属，例如蜱传脑炎(病毒)(TBE)、登革热(病毒)(1、2、3或4型)、黄热病(病毒)、日本脑炎(病毒)、西尼罗河脑炎(病毒)、圣路易斯脑炎(病毒)、俄罗斯春夏型脑炎(病毒)、波瓦桑脑炎(病毒)。黄病毒属抗原可选自：PrM、M、C、E、NS-1、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。黄病毒属抗原优选自：PrM、M和E。可商业购得的TBE疫苗包括灭活的病毒疫苗。

鼠疫病毒：病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，例如牛病毒性腹泻(病毒)(BVDV)、经典猪瘟(病毒)(CSFV)或边境病(病毒)(BDV)。

嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，例如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可选自：表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。可商业购得的HBV疫苗包括含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。

丙肝病毒：病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自以下一种或多种：E1，E2，E1/E2，NS345多蛋白，NS 345-核心多蛋白，核心和/或非结构区的肽(Houghton等，Hepatology(1991)14：381)。

杆状病毒：病毒抗原可衍生自杆状病毒，如莱萨病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒抗原可选自：糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。可商业购得的狂犬病病毒疫苗包含用人双倍体细胞或胎恒河猴肺细胞培养的杀伤病毒。

杯状病毒科：病毒抗原可衍生自杯状病毒科，如诺瓦克病毒和诺瓦克样病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒：病毒抗原可衍生自冠状病毒、SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(病毒)(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自：刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选衍生自SARS病毒。WO04/92360描述了SARS病毒抗原。

逆转录病毒：病毒抗原可衍生自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可衍生自：HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自：HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原可选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160、gp120和gp41)、pol、tat、nef、rev vpu、小蛋白(优选p55gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一种或多种毒株：HIV_IIIb、HIV_SF2、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4。

呼肠孤病毒：病毒抗原可衍生自呼肠孤病毒，如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自：结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3，或者非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。优选的呼肠孤病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒抗原可选自：VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)和VP7。

细小病毒：病毒抗原可衍生自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自：VP-1、VP-2、VP-3、NS-1和NS-2。细小病毒抗原优选衣壳蛋白VP-2。

δ-肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可以是衍生的HDV，特别是HDV的δ-抗原(参见例如，美国专利5378814)。

戊肝病毒(HEV)：病毒抗原可衍生自HEV。

庚肝病毒(HGV)：病毒抗原可衍生自HGV。

人疱疹病毒：病毒抗原可衍生自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人疱疹病毒6(HHV6)，人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自：立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可选自：糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)，或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自：核心、核衣壳、外被膜或包膜蛋白。可商业购得减毒的活VZV疫苗。EBV抗原可选自：早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或外被膜蛋白。

乳多空病毒：抗原可衍生自乳多空病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自：衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7，或其融合物。优选将HPV抗原制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。

《疫苗》(Vaccines)，第四版，(Plotkin和Orenstein编，2004)；《医学微生物》(Medical Microbiology)，第四版，(Murray等编，2002)；《病毒学》(Virology)，第三版，(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学》(FundamentalVirology)，第二版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)也描述了病毒抗原，本发明的组合物涵盖了这些抗原。

适用于本发明的免疫原性蛋白质可衍生自能导致呼吸道疾病的病毒。这种呼吸道抗原的例子包括衍生自呼吸道病毒，例如正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。特别优选衍生自流感病毒的免疫原性蛋白质。

本发明组合物可包含适用于儿科对象的一种或多种免疫原性蛋白质。儿科对象一般年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿科抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中多次给予。儿科抗原可衍生自靶向儿科群体的病毒和/或儿科群体易受感染的病毒。儿科病毒抗原包括衍生自以下一种或多种病毒的抗原：正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)。

本发明组合物可包含适用于老年人或免疫力受损个体的一种或多种免疫原性蛋白质。这些个体可能需要较频繁地接种较高剂量的或用佐剂配制的制剂，从而能增强他们对靶抗原的免疫应答。靶向用于老年人或免疫力受损个体中的抗原包括衍生自一种或多种以下病毒的抗原：正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。

病毒培养后，可对纯化的病毒颗粒，例如澄清的细胞培养液中存在的病毒颗粒，或对从这种澄清的细胞培养液中纯化的病毒颗粒使用烷基化剂。本发明方法可涉及通过澄清除去细胞材料，然后从澄清的细胞培养液中纯化病毒颗粒，例如采用层析。可对以此方式纯化的病毒颗粒使用烷基化剂，或在任选的超滤/渗滤步骤后使用烷基化剂。优选的方法不对感染的细胞培养液的澄清上清液使用烷基化剂，而对从这种澄清上清液纯化的病毒颗粒使用烷基化剂(参见Morgeaux等，(1993)Vaccine 11：82-90)。

优选在进行除去内毒素的步骤后使用烷基化剂。

方法步骤

可通过分离免疫原性蛋白质并使残留的功能宿主细胞DNA降解来制备本发明的疫苗组合物。类似地，可通过分离或纯化重组蛋白并使残留的功能宿主细胞DNA降解来制备重组蛋白制剂。这些步骤可以顺序或同时进行。通过加入烷基化剂，例如BPL实施残留功能细胞培养物DNA的降解步骤。

优选先除去烷基化剂和任何残留的副产物，再配制最终的疫苗或重组蛋白。疫苗组合物或重组蛋白制剂含有的游离丙酸和BPL优选低于0.1％(例如，低于0.1％、0.05％、0.025％、0.01％、0.005％、0.001％或0.01％)。最终的疫苗组合物或重组蛋白制剂优选含有不到0.01％的BPL。

可通过加热使BPL水解成无毒的β-羟基丙酸而将其方便地除去。水解所需的时间长度取决于BPL的总量和温度。温度越高，水解速度越快，但温度不应升得太高从而破坏活性蛋白成分。如下所述，加热至37℃，2-2.5小时适合于除去BPL。

DNA处理后，残留的DNA产物可留在最终的免疫原性或重组组合物中。然而，更优选将它们与所需组分，例如与病毒颗粒/蛋白质相分离。以此方式分离可部分或完全除去DNA降解产物，优选除去＞200bp的任何降解DNA。因此，本发明方法可包括将DNA与病毒颗粒相分离的步骤。该分离步骤可涉及，例如超滤、超离心(包括梯度超离心)、沉淀病毒核心和上清液分级、层析(例如，离子交换层析，如阴离子交换)、吸附等中的一种或多种。

因此，方法总体上涉及用烷基化剂处理来降低残留DNA的长度，然后纯化以除去残留DNA(包括除去降解的DNA)。

细胞培养

可从用细胞培养物增殖的病毒制备本发明疫苗。此外，本发明包括在细胞培养物中表达的重组蛋白制剂。病毒复制和重组蛋白表达优选哺乳动物细胞培养物。

本领域已知许多哺乳动物细胞系，包括源自以下的细胞系：人或非人灵长类(例如，猴)细胞(例如，通过引用全文纳入本文的WO01/38362、WO01/41814、WO02/40665、WO2004/056979和WO2005/080556中所述的PER.C6细胞，由ECACC以保藏号96022940保藏)、MRC-5(ATCCCCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、HEK细胞、HeLa细胞、胎恒河猴肺细胞(ATCC CL-160)、人胚胎肾细胞(293细胞，通常用剪切的腺病毒5型DNA转化)、Vero细胞(来自猴肾)、马、牛(例如，MDBK细胞)、绵羊、犬(例如，犬肾MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016，保藏号为DSM ACC 2219，如WO 97/37000和WO 97/37001所述)、猫和啮齿类动物(例如，仓鼠细胞，如BHK21-F，HKCC细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，可以获得各种发育阶段的细胞系，包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎。

合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，例如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38；等等。利用哺乳动物细胞系表示疫苗可以不含诸如鸡DNA，卵蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类粘蛋白)等物质，从而降低变应原性。

在某些实施方式中，细胞是固定的(例如，PER.C6细胞；ECACC96022940)。优选的实施方式利用哺乳动物细胞，这些细胞可选自和/或衍生自一种或多种以下的非限制性细胞类型：成纤维细胞(例如，表皮、肺)、内皮细胞(例如，主动脉细胞、冠状动脉细胞、肺细胞、血管细胞、表皮微血管细胞、脐带细胞)、肝细胞、角质化细胞、免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突细胞)、乳腺细胞(例如，上皮细胞)、平滑肌细胞(例如，血管细胞、主动脉细胞、冠状动脉细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、子宫颈细胞、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如，星形细胞)、前列腺细胞(例如，上皮细胞、平滑肌细胞)、肾细胞(例如，上皮细胞、肾小球系膜细胞、近端小管细胞)、骨骼细胞(例如，软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌肉细胞(例如，成肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、支气管细胞)、肝脏细胞、视网膜细胞或成视网膜细胞、肺细胞和基质细胞。

WO97/37000和WO97/37001描述了能在悬液和无血清的介质中生长，并可用于产生和复制病毒，特别是流感病毒的动物细胞和细胞系的制备。进一步的细节见WO03/023021和WO03/023025。

用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞；源自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾脏的Vero细胞；或源自人胚胎成视网膜细胞的PER.C6细胞。这些细胞系可广泛获自，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)、寇里尔细胞保藏中心(Coriell Cell Repositories)或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER.C6可以保藏号96022940获自ECACC。

培养流感病毒的最优选细胞系的MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34获自ATCC，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，WO97/37000披露了适用于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系(“MDCK 33016”，以DSM ACC 2219保藏)。类似地，EP-A-1260581(WO 01/64846)披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。WO2006/071563披露了非致瘤性MDCK细胞，包括“MDCK-S”(ATCCPTA-6500)、“MDCK-SF101”(ATCC PTA-6501)、“MDCK-SF102”(ATCCPTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。WO2005/113758披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括“MDCK.5F1”细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

WO97/37000、WO97/37001、WO03/023021和WO03/023025描述了对悬液和贴壁培养基中MDCK细胞培养物的操作。具体地说，WO 03/023021和WO 03/023025描述了MDCK悬浮细胞在无血清培养基、化学成分确定的培养基和无蛋白培养基中的实验室和商业规模细胞培养体积。各参考文献全文纳入本文。

作为替代哺乳动物来源，本发明所用的细胞系可源自禽来源，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡。禽细胞系可源自各种各种发育阶段，包括胚胎、雏禽和成年。这些细胞系优选源自胚胎细胞，例如胚胎成纤维细胞、生殖细胞或单个器官，包括神经元、大脑、视网膜、肾脏、肝脏、心脏、肌肉或胚外组织和保护该胚胎的膜。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞(WO01/85938和WO03/076601)和鸭视网膜细胞(WO2005/042728)。合适的禽胚胎干细胞包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074(WO2006/108846)。还可利用鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。这些禽细胞特别适合于培养流感病毒。

本领域技术人员知道昆虫细胞表达系统，例如杆状病毒重组表达系统，这些系统描述于，例如Summers和Smith，《德克萨斯农业实验站第1555号公告》(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555)(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式商业购自加利福尼亚州圣迭戈市的英杰公司(Invitrogen)等。杆状病毒表达载体所用的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，等等。

重组表达蛋白质还可在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌(Streptococcus spp.)等细菌宿主中进行。适合于重组表达蛋白质的酵母菌宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。

各种出版物充分描述了上述细胞类型的培养条件，或者可以商业购得培养基、添加剂和条件，例如新泽西州东鲁瑟福得市开姆布莱克斯生物产品公司(Cambrex Bioproducts，East Rutherford，NJ)的目录和其它文献。

在某些实施方式中，将本文所述方法所用的宿主细胞培养在无血清和/或无蛋白质的培养基中。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可任选包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。

已知的无血清培养基包括Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(拜维塔克公司(BioWhittaker))或EX-CELL(JRH生物科学公司(JRH Bioscience))。常规含血清培养基包括Eagle基本培养基(BME)或极限必需培养基(MEM)(Eagle，Science，130，432(1959))或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM或EDM)，一般使用最多10％的胎牛血清或类似的添加剂。极限必需培养基(MEM)(Eagle，Science，130，432(1959))或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM或EDM)可任选不使用任何含血清的添加剂。现有技术也熟知无蛋白质的培养基，例如PF-CHO(JHR生物科学公司(JHR Bioscience))，化学成分确定的培养基，例如ProCHO 4CDM(拜维塔克公司)或SMIF 7(吉比克/BRL生命技术公司(Gibco/BRL Life Technologies))和促有丝分裂肽，例如Primactone、Pepticase或HyPep^TM(均购自国际探索公司(Quest International))或乳清蛋白水解物(吉比克公司(Gibco)和其它生产商)。基于植物水解物的培养基添加剂的特别优点在于能排除病毒、支原体或未知感染因子的污染。

由于本发明所用细胞系的适用性，细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)可在很大范围内变动，可改进这些条件使之适应具体病毒生长条件或重组表达细节的要求。

可采用各种方法，例如悬液、贴壁培养或微载体来培养细胞。

病毒复制期间，可以在37℃以下(例如，30-36℃)培养细胞(WO97/37001)。

在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：给培养的细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。可给培养的细胞接种病毒(通过PFU或TCID₅₀检测)，细胞比例为1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40℃，优选28-37℃，在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。

可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，从而增加了收集的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约0.0001-10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数(“m.o.i.”)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。

本发明的疫苗组合物通常配制成亚病毒颗粒形式，例如病毒脂质包膜溶解或遭破坏的裂解病毒(split virus)形式，或一种或多种纯化的病毒蛋白形式。疫苗组合物可含有足够量的抗原从而能在患者中产生免疫应答。

本领域熟知裂解病毒，例如流感病毒的方法，例如参见WO02/28422、WO02/067983、WO02/074336、WO01/21151等。利用破裂浓度(disruptingconcentration)的裂解剂(splitting agent)使感染性(野生型或减毒的)或非感染性(例如，灭活的)的完整病毒破裂或破碎。裂解剂通常包括能打碎并溶解脂质膜的试剂，其通常具有相连的疏水性尾部和亲水性头部。最优选的裂解剂是溴化十六烷基三甲铵(CTAB)。裂解剂的其它细节见流感病毒章节。

破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(N，N-dialkyl-Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，Triton表面活性剂，如Triton X-100或Triton N 101)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。

病毒的各蛋白质的纯化方法是熟知的，包括，例如过滤、层析、离心步骤和中空纤维洗脱。一个实施方式通过离子交换树脂纯化蛋白质。

或者，疫苗可包含完整病毒，例如完整的减毒活病毒，或者优选完整的灭活病毒。本领域已知灭活或杀伤病毒的方法，从而破坏了它们感染哺乳动物细胞的能力。这些方法包括化学和物理方法。灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理：洗涤剂、甲醛、福尔马林、BPL或紫外光。灭活的其它化学方法包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(carboxyfullerene)(C60)或它们任何的组合处理。本领域知道灭活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基吖丙啶(acetyl ethyleneimine)或γ射线。优选用BPL灭活病毒。

药物组合物

本发明的组合物是药学上可接受的。它们通常包含除抗原以外的组分，例如，它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这种组分的充分讨论见《雷明顿：药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice ofPharmacy)(吉纳罗公司(Gennaro)，2000；第20版，ISBN：0683306472)。

组合物通常是水性形式。

组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，这些疫苗优选基本上不含(即，少于5μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞(Banzhoff(2000)Immunology Letters 71：91-96；WO02/097072)。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

优选包含生理盐，例如钠盐以控制张力。优选1-20mg/ml之间的氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodiumphosphate dehydrate)、氯化镁、氯化钙等。

组合物的重量克分子渗透浓度在200mOsm/kg-400mOsm/kg之间，优选240-360mOsm/kg之间，更优选处于290-310mOsm/kg范围内。

组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液(尤其是含有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸缓冲液。所含的缓冲液范围一般是5-20mM。

组合物的pH通常在5.0-8.1之间，更常见在6.0-8.0之间，例如6.5和7.5。因此，本发明方法可包含先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。

组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。组合物优选无谷蛋白。

本发明的组合物可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇酐酯表面活性剂(称为“吐温”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(Triton X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲铵(“CTAB”)，或脱氧胆酸钠。可以只存在痕量的洗涤剂。

组合物可包含一次免疫的物质，或可包含多次免疫的物质(即，“多剂量”试剂盒)。在多剂量配置中，包含防腐剂是有用的。除了在多剂量组合物中包含防腐剂以外，还可将组合物置于装有用于转移物质的无菌适配器的容器中。

一般给予的疫苗剂量体积是约0.5ml，虽然可将半剂量(即，约0.25ml)给予儿童。

组合物和试剂盒优选保存在2℃-8℃之间。不应冷冻它们。应避免有光直射它们。

治疗方法和疫苗的施用

本发明的组合物适合给予动物(特别是人)患者，本发明提供在患者体内产生免疫应答的方法，包括将本发明的组合物给予患者的步骤。

本发明还提供试剂盒，或者用作药物的本发明组合物。

本发明还提供衍生自病毒的免疫原性蛋白在制备药物中的应用，所述病毒用细胞培养物增殖，所述药物用于在患者体内产生免疫应答，而所述疫苗基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。

这些方法和应用所产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。本领域熟知评估病毒疫苗接种后的抗体应答、中和能力和保护作用的方法。例如，对于流感病毒，人类研究证明针对HA的抗体滴度与保护作用有关(血清样品血凝反应-抑制滴度约30-40时，对同源病毒感染的保护作用约为50％)[Potter和Oxford(1979)Br Med Bull 35：69-75]。

可以各种方法给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内、口服、真皮内、透皮、经皮等。

本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。患者可以是老年人(例如，≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)，年轻人(例如，≤5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，怀孕的妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，用于流感的奥塞米韦或扎那米韦化合物；参见下文)的患者，鸡蛋过敏的人和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些团体，还可应用于更广泛的人群中。

治疗可以是单剂量用药法或多剂量用药法。多剂量可以用于初次免疫接种程序表和/或加强免疫接种程序表中。在多剂量用药法中，可通过相同或不同的路径给予各种剂量，例如胃肠外致敏和粘膜加强，粘膜致敏和胃肠外加强，等等。给予多次剂量(通常是两剂量)在免疫原初患者中特别有用。多剂量通常可间隔至少一周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周，等等)给予。

可将本发明制备的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如，可在医疗保健专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与细菌疫苗基本上同时，例如白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、乙型流感嗜血杆菌疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)、肺炎球菌偶联物疫苗，等等。

类似地，可将本发明疫苗与有效抵御疫苗病毒的抗病毒化合物基本上同时(例如，可在医疗保健专家的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者。例如，如果疫苗是流感疫苗，则化合物可以是神经氨酸酶抑制剂(例如，奥塞米韦或扎那米韦)。这些抗病毒(化合物)包括：(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonicacid)，包括它们的酯(例如乙酯)和它们的盐(例如磷酸盐)。优选的有效抵御流感的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸、乙酯、磷酸酯(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU^TM)。

宿主细胞DNA

本领域普通技术人员能检测残留的宿主细胞DNA。本发明组合物中残留DNA的总量优选低于20ng/ml，例如≤10ng/ml、≤5ng/ml、≤1ng/ml、≤100pg/ml、≤10pg/ml，等等。如上所述，最好基本上所有的这种DNA均短于500碱基对。

用于检测DNA的试验通常是确认试验(“工业指南：生物分析方法确认”(Guidance for Industry：Bioanalytical Method Validation)，美国健康和人服务部食品药品管理中心兽药评估和研究(CDER)中心(CVM)(U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug AdministrationCenter for Drug Evaluation and Research(CDER)Center for VeterinaryMedicine(CVM)).2001年5月；Lundblad(2001)Biotechnology and AppliedBiochemistry 34：195-197)。可利用数学和可定量的术语描述确认试验的性能特征，已鉴定了其可能的误差来源。已总体上检验了该试验的诸如准确度、精密度、特异性等特征。一旦校验(例如，用宿主细胞DNA的已知标准量)及检验好某试验，可常规进行定量DNA检测。可采用三种主要的DNA定量技术：杂交方法，例如Sourthern印迹或槽印迹(Ji等(2002)Biotechniques.32：1162-7)；免疫测定方法，例如Threshold^TM系统(Briggs(1991)J Parenter SciTechnol.45：7-12；和定量PCR(Lahijani等(1998)Hum Gene Ther.9：1173-80)。技术人员熟知这些方法，虽然各方法的精确特征取决于所研究的宿主细胞，例如杂交探针的选择，扩增用引物和/或探针的选择，等等。分子装置公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是用于皮克水平总DNA的定量试验，其已用于监测生物药品中的污染DNA水平(Briggs(1991)同上)。典型的试验包括在生物素化的ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗-ssDNA抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。所有试验组分均装入购自生产商的完整的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中。各种商品化生产商提供检测残留宿主细胞DNA的定量PCR试验，例如AppTec^TM实验室服务公司(AppTec^TM Laboratory Services)、BioReliance^TM、亚瑟技术公司(AltheaTechnologies)，等等。检测人疫苗中宿主细胞DNA污染的化学发光杂交试验和总DNA Threshold^TM系统的比较见Lokteff等(2001)Biologicals.29：123-32。

还可用各种分析方法检测残留宿主细胞DNA的长度。如上所述，烷基化剂处理后，残留宿主细胞DNA的平均长度优选短于500个碱基对，或者甚至短于200个碱基对。

就犬细胞，特别是例如MDCK细胞而言，对基因组的分析显示13条编码序列长度＜500bp，3条序列＜200bp，1条序列＜100bp。因此，使DNA断裂至＜200bp基本上除去了所有编码序列，任何片段实际上极其不可能对应于该长度左右的3种基因之一(即：81bp的胰泌素；108bp的PYY和135bp的骨钙蛋白)。

佐剂

本发明组合物可包含佐剂，佐剂起到增强接受组合物的患者体内所引发的免疫应答(体液的和/或细胞的)的作用。佐剂与病毒疫苗的联用是熟知的，例如肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗中，等等。FLUAD^TM流感疫苗包含水包油乳剂佐剂。

本发明可用的佐剂包括但不限于：铝盐、免疫刺激性寡核苷酸、皂苷、脂质A类似物(例如，3dMPL)和水包油乳液。以下文献更详细地披露了这些和其它佐剂：Powell和Newman《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)，普莱纳姆出版社(Plenum Press)1995，ISBN 0-306-44867-X)和O′Hagan(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》(Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols)，，《分子医学方法丛书》(Methods in Molecular Medicine series)第42卷，ISBN：1-59259-083-7)。

可利用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但只是为了方便使用，而非精确描述所存在的实际化学化合物(例如，可参见Powell和Newman的第9章)。本发明可利用常规用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。优选吸附到这些盐上。

具有佐剂活性的免疫刺激性寡核苷酸是熟知的。它们可含有CpG基序(一种二核苷酸序列，含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶)，TpG基序，寡聚-dT序列，寡聚-dC序列，双链RNA，回文序列，多聚(dG)序列，等。免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸，可包含少于100个核苷酸。

皂苷(Powell和Newman的第22章)是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。皂树(Quillaiasaponaria Molina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。已利用HPLC和RP-HPLC纯化了皂苷组合物，已经鉴定了用这些技术专门纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540披露了QS21的制备方法。皂苷制剂还可含有固醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒，ISCOM一般还含有磷脂。

3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基4′-单磷酰基脂质A)是单磷酰基脂质A中还原端葡糖胺的3位被脱酰化的佐剂。3dMPL从明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体(heptoseless mutant)制备，其在化学上类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。3dMPL可采取酰化程度不同的相关分子混合物的形式(例如，具有长度可能不同的3、4、5或6条酰基链)。

具有佐剂活性的各种水包油乳剂是已知的。它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是生物可降解的(可代谢的)和生物相容的。乳剂中油滴的直径通常是亚微米的，用微流化仪实现这种小体积能提供稳定的乳剂。优选大小小于220nm的油滴，因为它们能进行过滤除菌。

本发明所用的具体水包油乳剂佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳剂。以体积计，该乳剂的组成可以是约5％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”，更详细的讨论见Powell和Newman的第10章及O′Hagan的第12章。MF59乳剂优选包含柠檬酸盐离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳剂。该乳剂可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1％)和/或卵磷脂。这些乳剂可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳剂。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2。可将吐温80溶解于PBS中获得2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳剂。得到的乳剂可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm 。

·角鲨烯、生育酚和Triton洗涤剂(例如，Triton X-100)的乳剂。该乳剂还可包含3d-MPL。该乳剂可包含磷酸缓冲液。

·含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、Triton洗涤剂(例如，TritonX-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳剂。该乳剂所包含的这三种组分的质量比约为75∶11∶10(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80，110μg/ml TritonX-100和100μg/ml α-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括这些组分与抗原的任何比例。该乳剂还可包含角鲨烯。该乳剂还可包含3d-MPL。水相可含有磷酸缓冲液。

流感疫苗

本发明特别适合于制备流感病毒疫苗。目前有各种形式的流感病毒疫苗可用，例如，参见Plotkin和Orenstein(《疫苗》，第4版，2004，ISBN：0-7216-9688-0)的第17和18章。它们通常以活病毒或灭活病毒为基础。灭活疫苗可以完整的病毒颗粒、“裂解”病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素)为基础。流感抗原还可以病毒体的形式存在(不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。还可使用从重组宿主(例如，在使用杆状病毒载体的昆虫细胞系中)纯化的抗原。

灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理：洗涤剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基吖丙啶或它们任何的组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如紫外光或γ射线。

可采用各种方法从含病毒的液体中收集病毒颗粒。例如，纯化方法可包括利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有洗涤剂以使病毒颗粒破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

用洗涤剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、Triton X-100、Triton N101、溴化十六烷基三甲铵，等等)处理纯化的病毒颗粒，包括“吐温-醚”裂解方法来产生亚病毒颗粒制品，从而获得了裂解病毒颗粒。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如WO02/28422、WO02/067983、WO02/074336、WO01/21151、WO02/097072、WO2005/113756等。通常利用破裂浓度的裂解剂使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、海克麦格、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三-N-丁酯、塞太弗伦、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，Triton表面活性剂，如Triton X-100或Triton N101)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解发生在最初的病毒颗粒纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解方法可包括使含病毒颗粒的物质澄清(以除去非病毒颗粒物质)，浓缩收集的病毒颗粒(例如，采用吸附法，如CaHPO₄吸附)，分离完整病毒颗粒与非病毒颗粒物质，在密度梯度离心步骤中利用裂解剂裂解病毒颗粒(例如，利用含有裂解剂，如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度(溶液))，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。

纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。

用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行间期，疫苗通常包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明还可利用流行毒株(即，对疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的HA，例如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三价疫苗为基础。然而，取决于季节和疫苗中抗原的性质，本发明可保护以抵御使免受以下一种或多种甲型流感病毒血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。

除了适用于免疫接种以抵御流行间期的毒株，本发明组合物还特别适用于免疫接种以抵御流行毒株。能导致流行病爆发的流感毒株的特征在于：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出现超过10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中见到的毒株(例如，通常只在鸟群中发现的H5、H6或H9)，从而使得人群对该毒株的血凝素而言在免疫学上是原初的；(b)其能水平转移至人群中；和(c)其对人具有致病性。对于免疫接种抵御流行性流感，优选具有H5血凝素类型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出现的流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝1、HA进化枝1’、HA进化枝2或HA进化枝3(世界卫生组织(World HealthOrganization)(2005)Emerging Infectious Diseases 11(10)：1515-21)，其中进化枝1和3特别相关。其抗原可有用地包含在组合物中的其它毒株是耐受抗病毒治疗(例如，耐受奥塞米韦和/或扎那米韦)的毒株，包括耐药性流行毒株。

本发明组合物可包含一种或多种(例如，1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。优选包含来自两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原的三价疫苗。

流感病毒可以是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得。因此，甲型流感病毒可包括A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是6个A/PR/8/34的区段，和疫苗毒株的HA和N区段，即6∶2重配株)。其还可包含来自A/WSN/33毒株的，或来自可用于产生疫苗制品所用重配毒株的任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。本发明通常保护抵御能人到人传播的毒株，因此毒株的基因组通常包含至少一个源自哺乳动物(例如，人)流感病毒的RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区段。

HA是目前灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平使疫苗剂量标准化，一般通过SRID检测。现有疫苗通常含有约15μg HA/毒株，虽然在例如儿童，或流行情况下，或在使用佐剂时可利用较低的剂量。与较高剂量(例如，3×或9×剂量)一样，已傻用了部分剂量，例如1/2(即，7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg，等等。具体的剂量包括，例如约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5/毒株，等等。

对于活疫苗，通过半数组织培养感染量(TCID₅₀)而不是HA含量来检测剂量，每种毒株的TCID₅₀一般在10⁶-10⁸之间(优选10^6.5-10^7.5)。

本发明所用的HA可以是病毒中发现的天然HA，或者可经修饰。例如，已知可修饰HA以除去致使病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，围绕HA1和HA2之间的切割位点的超碱性区域)。

处理含病毒颗粒的组合物以降解宿主细胞DNA后(例如，利用BPL)，优选分离降解产物和病毒颗粒，例如通过阴离子交换层析。

一旦纯化了特定毒株的流感病毒，可将其与其它毒株的病毒组合，例如用于制备上述三价疫苗。优选单独处理各毒株并混合诸单价病毒(bulk)从而得到最终的多价混合物，而不是混合诸病毒并降解多价混合物的DNA。

概述

术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。

与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。

术语“分离的”和“纯化的”表示至少50％纯，更优选60％纯(与大多数裂解疫苗一样)，更优选70％纯，或80％纯，或90％纯，或95％纯，或大于99％纯。

除非有专门表述，包括混合两种或多种组分的步骤的某方法不要求任何具体混合顺序。因此，可以任何顺序混合诸组分。如果有三种组分，则可先将两种组分彼此混合，再将该混合物与第三种组分混合，等等。

如果利用动物(特别是牛)材料培养细胞，这些材料应从不含可传染海绵样脑病(TSE)，特别是不含牛海绵样脑病(BSE)的来源获得。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。

如果将化合物作为组合物的一部分给予身体，或可用合适的药物前体替代该化合物。

如果将细胞物质用于重配或反向遗传学方法，优选批准用于人疫苗生产的细胞物质，例如欧洲药典概述章节5.2.3。

附图简述

图1和2显示了PCR扩增MDCK基因组中6个指定靶标的结果。一些样品按照指示稀释，最高达1∶10000，再进行PCR。

图3显示了PCR扩增MDCK基因组中SINE序列的结果。与图1和2一样，有时先稀释DNA再进行PCR。在下图中，数字是PCR中DNA的起始量(fg)。

图4显示了BPL处理对MDCK DNA大小的作用。在不同温度下，将基因组DNA与BPL培育不同时间。图5显示相似的结果。用SYBR金染色琼脂糖凝胶。

图6显示了残留DNA(上线)相对于具有所示大小的标记物(下线)的毛细管电泳。

本发明实施方式

按照WO97/37000、WO03/23025和WO04/92360的指导，将流感病毒(A/New Caledonian/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)、B/Jiangsu/10/2003、A/Wyoming/3/2003(H3N2))培养在悬浮培养的MDCK细胞中。使最终的培养基澄清以提供病毒颗粒，然后进行层析和超滤/渗滤。利用β-丙内酯(终浓度0.05％v/v；2-8℃培育16-20小时，然后在37℃培育2-2.5小时来水解)灭活得到的物质中的病毒颗粒。随后利用CTAB裂解病毒颗粒，各种其它加工步骤获得含有纯化的表面蛋白的最终单价病毒疫苗(monovalentbulk vaccine)。

表征MDCK DNA以评估其在制备过程以下三个阶段中的含量、大小和完整性：(A)超滤/渗滤步骤后；(B)β-丙内酯处理后；和(C)最终单价疫苗。采用毛细管电泳和核酸扩增来研究任何残留基因组DNA的大小、完整性和生物学活性。

测定大小

如上所述，通过毛细管电泳分析阶段(A)、(B)和(C)的残留宿主细胞DNA的大小。对五种不同的病毒培养物作了分析。

在这个3时间点取出500μl样品，56℃用10μl蛋白酶K处理16-22小时，然后按照生产商的使用说明书用DNA提取试剂盒(万科化学品公司(WakoChemicals))进行总DNA提取。在20℃恒温下，将DNA重悬在500μl超纯水中，用贝克曼公司的P/ACE MDQ分子表征系统(P/ACE MDQ MolecularCharacterization System)(Beckman Coulter)进行电泳。利用72-1353bp的11种分子尺寸标记物。该方法的核酸检出限(DL)是0.7pg/ml。

根据尺寸标记物和DNA条带的相对密度，测定了DNA片段的分布和尺寸，指定为＜200bp到＞1000bp的4种不同的尺寸类别。图6显示了阶段(C)样品的毛细管电泳。分析显示该样品中所有的可检测残留DNA基本上短于200bp。

下表显示了5种分析物的平均结果：

阶段

DNA量

＜200bp

200-500bp

500-1000bp

＞1000bp

A	47mg	25％	12％	6％	55％
						B	5mg	79％	18％	3％	4％
C	0.07mg	＞99％	＜DL	＜DL	＜DL

因此，BPL处理导致DNA含量降低约10倍，但还使分布从长序列向＜200bp的短片段变化。步骤(B)和(C)之间的进一步加工(包括层析和超滤步骤)将总DNA水平再降低约70倍，除去了所有≥200bp的可检测DNA。

DNA扩增

赘生细胞转化是常与修饰的原癌基因和/或修饰的肿瘤抑制基因有关的现象。通过PCR分析了BPL处理前后，即(A)和(B)时间点的几种这样的犬基因序列。此外，处理并检验了未感染的MDCK细胞的DNA。所检验的原癌基因是：H-ras和c-myc。所检验的肿瘤抑制基因是：p53；p21/waf-1；和PTEN。此外，通过PCR分析了复制型SINE序列。SINE高拷贝数有助于灵敏地检测。

所有样品均掺加了外部对照DNA(pUC19片段)来监测样品制备和PCR的质量。在所有实验中，均观察到掺加对照一致扩增，表明PCR混合物中残留的水解BPL和副产物对试验没有抑制作用，从而确保样品制备和PCR的质量足够。先将样品作10倍(连续)稀释再扩增，直至检测不到PCR产物，从而表明了DNA水平降低的对数。PCR试验的检出限是55pg。

通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。图1显示了未感染的MDCK细胞中获得的结果，图2显示了病毒培养期间获得的结果。分析的所有6种基因显示BPL处理前的扩增信号强，但与BPL接触后信号强度降低。在检验的所有生产批次中，与BPL接触后残留的MDCK基因组DNA降低至少两个对数值。

由于图2显示了进一步纯化前阶段(B)的结果，该结果超过了最终整体疫苗中存在的DNA。然而，在最终的单价疫苗中，由于利用SINE序列时的灵敏度，在阶段(C)也可能进行PCR。该项分析的结果如图3所示。(A)和(B)中的DNA扩增相对类似于SINE区域，表明BPL对较小DNA序列的活性较低。然而，即使对于这些小序列，所有分析样品的扩增信号亦有显著降低。比较样品收集点(B)和(C)之间的PCR信号强度反映了中间纯化步骤所致的残留DNA减少。

从基因分析外推并直接根据SINE分析，预计最终疫苗中每剂量的DNA总水平＜1ng，通常是每剂量＜100pg。

温度

病毒灭活期间的BPL处理有两个独立的步骤：(1)2-8℃向含病毒颗粒的混合物中加入BPL；然后(2)将温度升高至37℃以水解BPL。研究了两个BPL步骤对MDCK DNA灭活和断裂的作用。

2-8℃，用终浓度为0.05％(v/v)的BPL处理未感染的MDCK细胞的纯化基因组DNA 16小时，或者在37℃或50℃处理最多6.5小时。然后检测DNA的断裂，结果示于图4。这些实验显示了BPL针对细胞DNA的活性，但由于细胞DNA因凋亡已高度断裂，因此未感染的细胞在病毒生长后未反映MDCK的这种状态。

2-8℃，琼脂糖凝胶上未处理和处理DNA之间的差异可以忽略，提示在这些条件下基本上不可能发生BPL所致的DNA断裂。相反，在37℃和50℃，DNA被极大修饰，温度较高导致反应动力学加速。未处理细胞的DNA在琼脂糖凝胶上显示相对独特的条带，其具有降解产物的亮斑点(图5，第3道)。然而，37℃短时BPL培育后，MDCK DNA沿凝胶槽向下移动，条带信号强度降低(图5，第2道)。培育期较长导致大基因组DNA分子消失并提高了MDCK DNA的断裂程度。

在其它实验中，先在4℃将BPL与细胞培育16小时。在第一群中，将温度升高至37℃，2小时；在第二群中，先经离心过滤除去BPL，再升高温度。第一群中观察到的残留DNA水平很低(降低＞2log)。

因此，BPL处理期间观察到的DNA断裂看来主要发生在37℃的BPL水解步骤期间，而不是2-8℃的病毒灭活步骤期间。

应该知道，只是借助实施例描述了本发明，可以作出改进而仍属于本发明的范围和构思。

Claims (16)

1.一种制备亚病毒颗粒形式的流感病毒疫苗的方法，所述疫苗包含衍生自用细胞培养物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，所述方法包括：

(i)用烷基化剂处理，使残留的功能细胞培养物DNA降解，以灭活病毒；

(ii)利用破裂浓度的裂解剂使完整病毒破裂或破碎；和

(iii)分离该免疫原性蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烷基化剂是β-丙内酯。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用低于0.1%的β-丙内酯处理来降解所述细胞培养物DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疫苗显示凝聚水平降低。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)包括分离DNA与病毒颗粒。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养物选自下组：MDCK细胞、Vero细胞和PER.C.6细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解剂是非离子或离子性表面活性剂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中的裂解剂是溴化十六烷基三甲铵。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚病毒颗粒是裂解病毒。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚病毒颗粒是纯化的病毒蛋白形式。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫原性蛋白质是病毒抗原，选自血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白质、膜蛋白、一种或多种转录酶组分。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述免疫原性蛋白是血凝素。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述免疫原性蛋白是神经氨酸酶。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将免疫原性蛋白配制最终疫苗的步骤。

15.如权利要求1-14任一所述的方法，其特征在于，包括：

(i)用细胞培养物增殖病毒；

(ii)用烷基化剂处理，使残留的功能细胞培养物DNA降解，以灭活病毒；

(iii)利用破裂浓度的裂解剂使完整病毒破裂或破碎；

(iv)分离该免疫原性蛋白；和

(v)将免疫原性蛋白配制最终疫苗，所述疫苗是纯化的病毒蛋白形式。

16.如权利要求1-14任一所述的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在MDCK细胞悬浮液中增殖病毒；

(ii)使最终培养物澄清以提供病毒颗粒；

(iii)对步骤(ii)得到的病毒颗粒进行层析和超滤/渗滤；

(iv)利用β-丙内酯灭活病毒颗粒；

(v)利用CTAB裂解病毒颗粒；和

(vi)将裂解的病毒颗粒配制最终疫苗。