CN102836423A - 一种核酸分离方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸的分离方法,具体来讲是根据核酸分子在溶液中的电荷性质,使其在电场中得到选择性分离的方法;进一步的,本发明提供了用于该方法的分离装置、以及该方法及装置在核酸分离中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及一种核酸的分离方法、装置及其应用,进一步的,本发明涉及在疫苗制品中去除宿主细胞核酸残留及检测残留的宿主核酸含量的方法、装置及其应用。
背景技术
预防接种传统上是针对传染病综合性预防的重要措施之一,疫苗的免疫效果和安全性备受关注。目前包括重组(CHO细胞)乙肝疫苗和Vero细胞狂犬病疫苗在内的很多疫苗都是细胞培养疫苗,在疫苗的生产过程中不可避免地混入了宿主细胞核酸的污染。如果用混有宿主细胞核酸的蛋白疫苗免疫人体,将有可能产生不可预料的后果,可能造成受体基因的插入突变,导致抑癌基因失活后癌基因被激活等严重后果。
考虑到这些潜在的风险,国际以及各国的医疗卫生机构都对疫苗制品中DNA的残留制定了相关标准。1986年世界卫生组织规定,用细胞系生产的疫苗每支DNA的残留不能超过100pg,而在1997年美国药品食品卫生监督局规定在美国使用的细胞系疫苗DNA残留不能超过10pg,目前我国按照世卫组织的标准,规定每支疫苗的DNA残留不能超过100pg。这些严格的质量标准使得去除疫苗中的DNA成为生产过程中的一个关键的技术瓶颈。
制备病毒疫苗的传统工艺是采用超滤浓缩、分子筛层析纯化等手段进行纯化,缺陷是制备的疫苗中宿主DNA的残留量较高。为了克服这个缺陷,有的研究人员通过改变超滤浓缩的倍数和层析柱的连接方式,降低宿主DNA的残留量。去除宿主细胞DNA残留的另一种方法是采用DNA酶处理。欧洲专利0870508和美国专利5948410披露了这种类型的常规方法。其涉及两步处理,首先用DNA酶(例如,Benzonase)处理,然后用阳离子洗涤剂(例如,CTAB)处理。尽管这些措施在一定程度上改善了疫苗制品的品质,但纯化效率不高、技术稳定性较差,未能从根本上解决疫苗中的宿主DNA残留的问题。
为了严格控制疫苗生产及终产品中DNA的残留,在疫苗生产的整个过程中要对DNA含量的变化进行全程监控,以便了解每个环节在DNA去除方面的能力。这就需要建立敏感而稳定的检测技术,目前鉴定疫苗中DNA残留量的方法主要有三种:分子杂交法、基于DNA结合蛋白的方法,和实时荧光定量PCR法。
分子杂交法检测疫苗中的DNA残留,是基于不同标记的DNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的宿主细胞DNA之间的杂交,通过标记分子检测与宿主细胞形成杂交的探针的量,进而推测宿主细胞DNA的含量。通常可以用不同的标记物对DNA探针进行标记,包括标记酶、生物素、放射性同位素、地高辛等。由于地高辛标记核酸探针的高灵敏度和操作上的便利,目前被广泛使用,其检测灵敏度可达10pg以下。
基于DNA结合蛋白的检测方法是利用两种能与DNA非特异性结合的蛋白质,单链DNA结合蛋白和抗单链DNA抗体。检测的基本过程是,使生物素-DNA单链结合蛋白或尿素酶-抗ssDNA的单抗与被检测的宿主细胞DNA结合,利用亲合素将此复合物连接到生物素-硝酸纤维素膜,尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2导致pH值发生变化,根据pH值的变化推算被结合的DNA的含量。
荧光定量PCR是另一种广泛使用的DNA检测技术,利用PCR扩增原理,在加入一对扩增引物的同时加入一个特异性的荧光探针,产物的增加可以通过荧光信号指示,通过实时监控PCR体系中的荧光信号的变化,推测样本中初始模板的定量。定量PCR可实时检测产物量,通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线,然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度。
虽然这三种检测方法在实际工作中均得到了合理的应用,但不难看出这三种检测方法均是对疫苗样本中核酸成分的间接检测,在稳定性、灵敏性以及使用的方便程度上还存在可优化空间。尽管存在这种可能性,低浓度核酸的定量检测在技术上仍然是一个巨大的挑战,目前还没有成熟的能够通用的解决方案,尤其是对疫苗中的DNA残留这种无明显序列特征的样本的检测。
发明内容
本发明涉及以下按顺序编号的段落定义的主题:
1.一种核酸分离方法,其特征在于该方法包括以下步骤:1)获得一种电泳槽,该电泳槽包括至少两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集;2)将包含待分离核酸的溶液加入到电泳槽中,3)施加外加电场,使溶液中的核酸分子选择性地分布于一个被分隔的或被可操作性分隔的电泳区域,从而得到分离。
2.根据段落1所述的核酸分离方法,其特征在于用于固定分隔不同电泳区域的材料包括琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、带孔或微孔的固相支持物。
3.根据段落1所述的核酸分离方法,其特征在于用于可操作性分隔不同电泳区域的方式包括阀门、开关、可阻断性流道。
4.根据段落1-3任一项所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽还包括选择性核酸分离部件。
5.根据段落4所述的核酸分离方法,其特征在于所述选择性择性核酸分离部件包括DEAE纤维素膜、透析膜、半透膜或滤膜。
6.根据段落1所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集。
7.根据段落6所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括槽体、阳极、阴极和电泳区域;电泳区域由固定分隔或可操作性分隔隔开的两个区域组成,阳极和阴极分别位于这两个区域中。
8.根据段落6所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括槽体、阳极、阴极和电泳区域;电泳区域包括两个独立的区域,所述独立的区域经电泳通道连接,电泳通道中带有固定分隔或可操作性分隔;阳极和阴极分别位于这两个区域内。
9.根据段落1所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括三个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集;阳极和阴极分别位于两端的区域内。
10.段落6或9所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽还包括选择性核酸分离部件。
11.根据段落10所述的核酸分离方法,其特征在于所述选择性择性核酸分离部件包括DEAE纤维素膜、透析膜、半透膜或滤膜。
12.根据段落1所述的核酸分离方法,其特征在于该方法包括以下步骤:1)获得一种电泳槽,该电泳槽包括两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,分别为阳极区域和中间区域,阳极和阴极分别位于阳极区域和中间区域中;2)将核酸/蛋白溶液加入到电泳槽的中间区域中;3)施加外加电场,使溶液中的核酸成分选择性地分布于阳极区域中,从而使其与主要分布于中间区域中的蛋白成分分离;4)分别收集分布于阳极区域的核酸成分和分布于中间区域的蛋白成分。
13.根据段落1所述的核酸分离方法,其特征在于该方法包括以下步骤:1)获得一种电泳槽,该电泳槽包括两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,分别为阳极区域和中间区域,阳极和阴极分别位于阳极区域和中间区域中,阳极区域和中间区域之间还包括选择性核酸分离部件;2)将核酸/蛋白溶液加入到电泳槽的中间区域中;3)施加外加电场,使溶液中的核酸成分从中间区域向阳极区域泳动,在此过程中,被位于中间区域和阳极区域之间的能选择性核酸分离部件所捕获,从而使其与主要分布于中间区域中的蛋白成分分离;4)分别收集主要分布于中间区域的蛋白成分和被选择性核酸分离部件所捕获的核酸成分。
14.段落1所述的核酸分离方法在分离样本中核酸的应用。
15.根据段落14所述的应用,其特征在于用于分离核酸/蛋白混合物中的核酸和蛋白成分。
16.根据段落14所述的应用,其特征在于用于分离疫苗制品中的核酸和疫苗成分。
17.根据段落14所述的应用,其特征在于用于检测溶液中核酸成分的含量。
18.根据段落16所述的应用,其特征在于用于检测疫苗制品中核酸成分的含量。
19.一种蛋白制品,其特征在于用段落1所述的核酸分离方法去除蛋白制品中的核酸成分。
20.根据段落19所述的蛋白制品,其特征在于进一步包括使核酸降解的步骤。
21.根据段落19或20任一项所述的蛋白制品,其特征在于进一步包括将核酸/蛋白复合体解离的步骤。
22.根据段落19所述的蛋白制品,其特征在于所述蛋白制品为疫苗制品。
本发明要解决的技术问题是如何高效、简便、低成本地分离疫苗或其他蛋白溶液中的核酸及蛋白组分,并精确测定其含量。本发明最重要的技术改进是,利用核酸与蛋白分子在设定溶液条件下电荷性质的不同,通过施加外加电场,使其分别分布于被分隔或被可操作性被分隔的不同电泳区域,通过单独收集这些区域内的溶液,实现核酸与蛋白成分的分离。
一方面,本发明提供了一种核酸分离方法。利用核酸分子在溶液中不同于其他成分的电荷性质,本方面通过对溶液施加外加电场,使其中的核酸分子选择性地转移到一个被分隔的或被可操作性分隔的区域中,实现核酸分子与其他溶液成分的分离。
一方面,本发明提供了一种用于核酸分离的装置。该装置主要是一种电泳槽,包括至少两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集。在核酸分离过程中,可以将核酸分子加入到电泳槽的一个被分隔或被可操作性分隔的区域内(定义为:起始区域);通过施加电场,使其向另一个被分隔或被可操作性分隔的区域(定义为:收集区域)内转移,从而实现核酸分子与其他溶液成分的分离。
一方面,本发明提供了一种核酸浓缩方法。通过设置起始区域和收集区域之间不同的溶液体积比,实现核酸成分的浓缩。例如,将起始区域溶液的体积设置为100mL,将收集区域溶液的体积设置为10mL,在分离过程中,使100mL起始溶液中的核酸成分通过电泳,选择性的转移到10mL收集溶液中,这样收集区域中溶液的核酸浓度就是起始区域中溶液的核酸浓度的10倍,也就是说,实现了起始溶液中核酸的10被浓缩。应当理解,起始区域和收集区域溶液的体积比可以在很大的范围内按需要任意调整,实现溶液中核酸不同浓缩的比例,调整范围可以设置为例如1/2-1/1,000,000;同样应当理解,起始区域和收集区域溶液的实际体积可以按照需要在很大的范围内任意设置,实现不同体积溶液中核酸的浓缩,起始区域溶液的体积可以设置为例如50uL-1,000,000L。
另一方面,本发明进一步提供了一种核酸浓缩方法。通过在连接起始区域和收集区域的核酸转移通道上设置能选择性分离核酸的部件,使核酸在局部区域得到富集,达到分离、浓缩溶液中核酸成分的技术效果。应当理解,选择性核酸分离部件包括所有能够利用核酸成分的物理、化学、以及生物学性质,使核酸选择性地富集(包括阻滞、吸附、粘附)在核酸分离部件上。具体包括但不限于利用核酸分离部件的分子筛效应、核酸的电荷性质、分子大小、长短、亲和性实现核酸分离的各种方式;优选的,核酸分离部件包括DEAE纤维素膜、透析膜、半透膜或滤膜。
一方面,本发明提供了一种低浓度核酸样本中核酸成分含量的直接检测方法。通过利用本发明提供的核酸浓缩方法和装置,首先将较大体积的低浓度核酸样本中的核酸成分进行浓缩,使浓缩后的核酸含量适合核酸含量的直接检测技术,包括但不限于紫外分光光度法、核酸中糖或磷含量的检测、核酸水解成单核苷酸后的检测。相比与目前广泛使用的低浓度核酸的间接检测技术(分子杂交法、基于DNA结合蛋白的方法、实时荧光定量PCR法),本发明提供的直接检测方法具有更高的准确性和稳定性。
一方面,本发明提供了一种所述核酸分离方法在分离样本中核酸的应用。
另一方面,本发明提供了一种分离核酸/蛋白混合物中的核酸或蛋白成分的方法。
另一方面,本发明提供了一种分离疫苗制品中的核酸或蛋白成分的方法。
另一方面,本发明提供了一种检测样本中核酸成分的含量的方法。
另一方面,本发明提供了一种检测疫苗制品中核酸成分的含量的方法。
一方面,本发明提供了一种利用本发明提供的方法或装置制备的低核酸含量的蛋白制品。
另一方面,本发明提供了一种利用本发明提供的方法或装置制备的低核酸含量的疫苗。
另一方面,本发明提供了一种利用本发明提供的方法或装置制备的低核酸含量的疫苗,在疫苗制备过程中,还包含核酸降解步骤、以及使核酸与蛋白解离的步骤。
根据本发明,所提供的核酸分离过程还包括使核酸降解的步骤。应该理解,能够使核酸降解的任何方法均可应用于该过程中,包括但不限于用特异性或非特异性核酸降解酶处理核酸/蛋白样本使核酸成分降解,用DNA烷基化剂例如β-丙内酯(BLP)处理核酸/蛋白样本使残留的核酸成分降解成小片段,
根据本发明,所提供的核酸分离过程还包括使核酸/蛋白复合体解离的步骤。应该理解,能够使核酸/蛋白复合体解离的任何方法均可应用于该过程中,包括但不限于有限加热、SDS处理、超声处理等。
本发明的有益效果
本发明提供了一种使核酸/蛋白溶液中的核酸及蛋白组分分离的方法、装置及其应用。与现有技术相比,本发明提供的分离方法及装置一方面,能够更简便、高效、低成本地去除疫苗制品中宿主细胞DNA的残留,使蛋白疫苗得到纯化;另一方面,能够更简便、高效、低成本地分离疫苗中宿主细胞DNA的微量残留,使直接检测宿主细胞DNA的含量成为可能,提高了检测的灵敏度和稳定性。
附图说明
图1.一种分隔的两腔电泳槽示意图
图2.一种分隔的带选择性核酸分离部件的两腔电泳槽示意图
图3.一种分隔的三腔电泳槽示意图
图4.一种分隔的带选择性核酸分离部件的三腔电泳槽示意图
图5.一种分离的两腔电泳槽示意图
图6.一种分离的带选择性核酸分离部件的两腔电泳槽示意图
图7.一种分离的三腔电泳槽示意图
图8.一种分离的带选择性核酸分离部件的三腔电泳槽示意图
具体实施方式
等电点与溶质的电荷性质
两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变,当两性离子正负电荷数值相等时,溶液的pH值即其等电点。当外界溶液的pH大于两性离子的pl值,两性离子释放质子带负电。;反之,当外界溶液的pH小于两性离子的pl值,两性离子质子化带正电。在某一pH的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,所带净电荷为零,呈电中性,此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。
核酸的等电点比较低,DNA的等电点为4-4.5,RNA的等电点为2-2.5。中性氨基酸的羧基解离程度大于氨基,其pI偏酸,pI值略小于7.0;酸性氨基酸的羧基解离程度更大,pI明显小于7.0;碱性氨基酸的氨基解离程度明显大于羧基等,故其pI大于7.0
本发明所提供的核酸分离技术的关键点在于,利用溶液中核酸分子与其他溶质不同的电荷性质,使其选择性地分布于分隔的或可操作分隔的不同的区域内,实现核酸与其他溶质的分离。在本发明中,可以通过改变溶液的pH值,对不同溶质的电荷性质进行调整,从而实现最佳的分离效果。应当理解,为了适应核酸与不同溶质之间的分离,所述溶液的pH值可以在很大范围内进行调整,例如pH 1-13,优选的溶液pH范围为pH2-7,更优选的pH 4-7。
分离装置
本发明所提供的分离核酸用途的电泳槽包括槽体、阳极、阴极、阳极与阴极之间的电泳区域。其中,电泳区域被固定分隔或可操作性分隔分成至少两个区域,这些固定或临时性分隔在不影响大分子正常电泳行为的情况下,使各区域内的溶液及存在于其中的大分子样本可被单独收集,从而实现大分子物质的分离回收。
根据本发明,本发明所提供的电泳槽还可以包括选择性核酸分离部件。所述选择性核酸分离部件包括所有能够利用核酸成分的物理、化学、以及生物学性质,使核酸选择性地阻滞、吸附、粘附在核酸分离部件上。具体包括但不限于利用核酸分离部件的分子筛效应、核酸的电荷性质、分子大小、长短、亲和性实现核酸分离的各种方式;优选的,核酸分离部件包括DEAE纤维素膜、透析膜、半透膜或滤膜。
电泳槽槽体可由合适的材料制造,包括但不限于玻璃、有机玻璃、塑料、树脂、聚丙烯、丙烯酸树脂或类似材料。电泳槽槽体可以为合适的任何形状,包括但不限于方形、长方形、三角形、圆形、圆筒形、球形、锥形或不同形状的组合。被分隔的电泳区域按照与电极的关系,可以分为阳极区域、阴极区域和中间区域;各区域的体积可以在10uL或以上体积自由设置,以适应电泳槽的不同用途。
根据本发明,用于将电泳槽固定分隔成不同区域的材料可以选自琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、以及带孔或微孔的固相支持物;固相支持物包括但不限于有机玻璃、塑料、树脂、聚丙烯、丙烯酸树脂或类似材料。
根据本发明,用于将电泳槽可操作性分隔成不同区域的方式可以包括阀门、开关、可阻断性流道、或将不同的电泳区域拆卸分离。可阻断性流道是指连接不同电泳区域的流道可被物理方式阻断,从而实现可操作性分隔,具体的阻断方式包括但不限于用止血钳夹住、折叠流道实现分隔、插入阻挡物实现分隔。
免疫原性蛋白
适用于本发明的蛋白可衍生自疫苗靶标的任何病毒,可将免疫原性蛋白质配制成灭活病毒、减毒病毒、裂解病毒制剂、纯化的亚单位制剂、或从某种病毒分离纯化或衍生的病毒蛋白或病毒颗粒。
适用于本发明的蛋白可以是病毒抗原,这些抗原优选包括在病毒生命周期的至少一个阶段暴露于其表面的表位;优选的,病毒抗原在多种血清型或分离物中是保守的。
适用于本发明的蛋白包括衍生自一种或多种以下所列病毒的抗原。病毒可以是无包膜的,或者优选有包膜的。病毒优选RNA病毒,更优选ssRNA病毒。它们可具有正义基因组,或优选具有反义基因组。它们的基因组可以非节段的,或者优选节段的。
正粘病毒:病毒抗原可衍生自正粘病毒,例如甲型、乙型和丙型流感病毒。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白质,包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白质(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA);优选的,抗原包括HA和NA。
流感抗原可衍生自流行病爆发间的年度流感毒株。或者,流感抗原可以衍生自可能导致流行病爆发的毒株(即与目前的流行毒株相比,具有新血凝素的流感毒株,或者在禽类对象中致病并可能平行转移至人群的流感毒株,或对人致病的流感毒株)。取决于具体的季节和疫苗所包含的抗原性质,流感抗原可以衍生自以下一种或多种血凝素亚型:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。
本发明的流感抗原可以衍生自禽流感毒株,特别是高致病性禽流感毒株HPAI(Alexander,Avian Dis.2003 47:976-81)。
流感病毒抗原的进一步细节见下文。
副粘病毒科病毒:病毒抗原建议衍生自副乳病毒科病毒,例如肺病毒(RSV)、副乳病毒(PIV)和麻疹病毒。
肺病毒属:病毒抗原可衍生自肺病毒属,例如呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞体病毒、小鼠的肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。肺病毒属优选RSV。肺病毒抗原可以选自一种或多种以下蛋白质,包括:表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水性蛋白(SH)、基质蛋白M和M2、核衣壳蛋白N、P和L及非结构性蛋白NS1和NS2。优选的肺病毒抗原包括:F、G和M。参见,例如J Gen Viol.2004年11月;85(部分11):3229。肺病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如,嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。
副粘病毒属:病毒抗原可衍生自副乳病毒属,例如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎(病毒)、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒属抗原可以选自一种或多种以下蛋白质:血凝素一神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP),磷蛋白(P)、大蛋白(L)就基质蛋白(M)。优选的副粘病毒属蛋白包括:HN、F1和F2。副粘病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如,嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。可商业购得的腮腺炎疫苗包括:单价形式或与麻疹和风疹疫苗联用(MMR)的减毒活腮腺炎病毒。
麻疹病毒属:病毒抗原可以衍生自麻疹病毒属,例如麻疹(病毒)。麻疹病毒属抗原可选自一种或多种以下蛋白质:血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。可商业购得的麻疹疫苗包括通常与腮腺炎和风疹联用的减毒的活麻疹病毒(MMR)。
微小RNA病毒:病毒抗原可衍生自微小RNA病毒,例如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。优选衍生自肠病毒,例如脊髓灰质炎病毒的抗原。
肠病毒:病毒抗原衍生自肠病毒,例如1,2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22和24型柯萨奇A病毒、1-6型柯萨奇B病毒、1-9,11-27和29-34型艾柯病毒(ECHO病毒)、68-71(型)肠病毒。肠病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠病毒抗原优选一种或多种以下衣壳蛋白:VP1、VP2、VP3和VP4。可商业购得的脊髓灰质炎疫苗包括:灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。
嗜肝RNA病毒:病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒,例如甲肝病毒(HAV)。可商业购得的HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。
披膜病毒:病毒抗原可衍生自披膜病毒,例如风疹病毒属、α病毒或动脉炎病毒。优选衍生自风疹病毒属,例如风疹病毒的抗原。披膜病毒抗原可选自:E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选自:E1、E2或E3。可商业购得的风疹疫苗包括通常与腮腺炎和麻疹疫苗联用的冷适应的活病毒(MMR)。
黄病毒属:病毒抗原可衍生自黄病毒属,例如蟀传脑炎(病毒)(TBE)、登革热(病毒)(1,2,3或4型)、黄热病(病毒)、日本脑炎(病毒)、西尼罗河脑炎(病毒)、圣路易斯脑炎(病毒)、俄罗斯春夏型脑炎(病毒)、波瓦桑脑炎(病毒)。黄病毒属抗原可选自:PrM、M、C、E、NS-1、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NSS。黄病毒属抗原优选自:PrM、M和E。可商业购得的TBE疫苗包括灭活的病毒疫苗。
鼠疫病毒:病毒抗原可衍生自鼠疫病毒,例如牛病毒性腹泻(病毒)(BVDV)、经典猪瘟(病毒)(CSFV)或边境病(病毒)(BDV)。
嗜肝DNA病毒:病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒,例如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可选自:表面抗原(L,M和S)、核心抗原(HBc,HBe)。可商业购得的HBV疫苗包括含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。
丙肝病毒:病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自以下一种或多种:E1、E2、E1/E2、NS345多蛋白、NS 345一核心多蛋白、核心和/或非结构区的肤(Houghton等,Hepatology,1991,14:381)。
杆状病毒:病毒抗原可衍生自杆状病毒,如莱萨病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒抗原可选自:糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。可商业购得的狂犬病病毒疫苗包含用人双倍体细胞或胎恒河猴肺细胞培养的杀伤病毒。
杯状病毒科:病毒抗原可衍生自杯状病毒科,如诺瓦克病毒和诺瓦克样病毒,如夏威夷病毒和雪山病毒。
冠状病毒:病毒抗原可衍生自冠状病毒、SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(病毒)(IB V)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自:刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选衍生自SARS病毒。WO04/92360描述了SARS病毒抗原。
逆转录病毒:病毒抗原可衍生自逆转录病毒,如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可衍生自:HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自:HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpro HIV抗原可选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160.gp120和gp41)、pol、tat、nef、rev vpu、小蛋白(优选p55gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一种或多种毒株:HIVIIIb、HIVsF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-IUS4。
呼肠孤病毒:病毒抗原可衍生自呼肠孤病毒,如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蟀传热病毒(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自:结构蛋白λ1、λ2、λ3、μl、μ2、δ1、δ2或δ3,或者非结构蛋白δNS、μNS或δ1s。优选的呼肠孤病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒抗原可选自:VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VPS和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSPS。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VPS和VP8)和VP7。
细小病毒:病毒抗原可衍生自细小病毒,如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自:VP-1、VP-2、VP-3、NS-1和NS-2。细小病毒抗原优选衣壳蛋白VP-2。
δ-肝炎病毒(HDV):病毒抗原可以是衍生的HDV,特别是HDV的δ-抗原(参见例如,美国专利5378814)。
戊肝病毒(HEV):病毒抗原可衍生自HEV。
庚肝病毒(HGV):病毒抗原可衍生自HGV。
人疱疹病毒:病毒抗原可衍生自人疤疹病毒,如单纯疤疹病毒(HSV),水痘-带状疱疹病毒(V ZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHVB)。人疱疹病毒抗原可选自:立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可选自:糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(g B),或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自:核心、核衣壳、外被膜或包膜蛋白。可商业购得减毒的活VZV疫苗。EBV抗原可选自:早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或外被膜蛋白。
乳多空病毒:抗原可衍生自乳多空病毒,如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自:衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7,或其融合物。优选将HPV抗原制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。
《疫苗》(Vaccines),第四版,(Plotkin和Orenstein编,2004);《医学微生物》(MedicalMicrobiology),第四版,(Murray等编,2002);《病毒学》(V irology),第三版,(W.K.Joklik编,1988);《基础病毒学》(Fundam entalV irology),第二版,(B.N.Fields和D.M.Knipe编,1991)也描述了病毒抗原,本发明的蛋白制品涵盖了这些抗原。
本发明蛋白制品可包含适用于儿科对象的一种或多种免疫原性蛋白质。儿科对象一般年龄小于约3岁,或小于约2岁,或小于约1岁。儿科抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中多次给予。儿科抗原可衍生自靶向儿科群体的病毒和/或儿科群体易受感染的病毒。儿科病毒抗原包括衍生自以下一种或多种病毒的抗原:正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)。
本发明蛋白制品可包含适用于老年人或免疫力受损个体的一种或多种免疫原性蛋白质。这些个体可能需要较频繁地接种较高剂量的或用佐剂配制的制剂,从而能增强他们对靶抗原的免疫应答。靶向用于老年人或免疫力受损个体中的抗原包括衍生自一种或多种以下病毒的抗原:正粘病毒(流感)、肺病毒(Rsv)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。
病毒培养后,可对纯化的病毒颗粒,例如澄清的细胞培养液中存在的病毒颗粒,或对从这种澄清的细胞培养液中纯化的病毒颗粒使用烷基化剂。本发明方法可涉及通过澄清除去细胞材料,然后从澄清的细胞培养液中纯化病毒颗粒,例如采用层析。可对以此方式纯化的病毒颗粒使用烷基化剂,或在任选的超滤/渗滤步骤后使用烷基化剂。优选的方法不对感染的细胞培养液的澄清上清液使用烷基化剂,而对从这种澄清上清液纯化的病毒颗粒使用烷基化剂(参见Morgeaux等,Vaccine,1993,11:82-90)。
本发明蛋白制品包括通过工程菌株制备的重组蛋白。
疫苗生产细胞
可从用细胞培养物增殖的病毒制备本发明疫苗。此外,本发明包括在细胞培养物中表达的重组蛋白制剂。病毒复制和重组蛋白表达优选哺乳动物细胞培养物。
本领域已知许多哺乳动物细胞系,包括源自以下的细胞系:人或非人灵长类(例如,猴)细胞(例如,通过引用全文纳入本文的WO01/38362、WO01/41814、WO02/40665、WO2004/056979和WO2005/080556中所述的PER.C6细胞,由ECACC以保藏号96022940保藏)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、HEK细胞、HeLa细胞、胎恒河猴肺细胞(ATCC CL-160)、人胚胎肾细胞(293细胞,通常用剪切的腺病毒5型DNA转化)、Vero细胞(来自猴肾)、马、牛(例如,MDBK细胞)、绵羊、犬(例如,犬肾MDCK细胞,ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016,保藏号为DSMACC 2219,如WO 97/37000和WO 97/37001所述)、猫和啮齿类动物(例如,仓鼠细胞,如BHK21-F,HKCC细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞),可以获得各种发育阶段的细胞系,包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎。
合适的猴细胞是,例如非洲绿猴细胞,例如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是,例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此,合适的细胞系包括但不限于:MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC-5;PER.C6;WI-38;等等。利用哺乳动物细胞系表示疫苗可以不含诸如鸡DNA,卵蛋白质(例如,卵白蛋白和卵类粘蛋白)等物质。
在某些实施方式中,细胞是固定的(例如,PER.C6细胞;ECACC 96022940)。优选的实施方式利用哺乳动物细胞,这些细胞可选自和/或衍生自一种或多种以下的非限制性细胞类型:成纤维细胞(例如,表皮、肺)、内皮细胞(例如,主动脉细胞、冠状动脉细胞、肺细胞、血管细胞、表皮微血管细胞、脐带细胞)、肝细胞、角质化细胞、免疫细胞(例如,T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突细胞)、乳腺细胞(例如,上皮细胞)、平滑肌细胞(例如,血管细胞、主动脉细胞、冠状动脉细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、子宫颈细胞、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如,星形细胞)、前列腺细胞,上皮细胞、平滑肌细胞)、肾细胞(例如,上皮细胞、肾小球系膜细胞、近端小管细胞)、骨骼细胞(例如,软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌肉细胞(例如,成肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌L细胞、支气管细胞)、肝脏细胞、视网膜细胞或成视网膜细胞、肺细胞和基质细胞。
WO97137000和WO97/37001描述了能在悬液和无血清的介质中生长,并可用于产生和复制病毒,特别是流感病毒的动物细胞和细胞系的制备。进一步的细节见WO03/023021和WO03/023025。
用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括:源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞;源自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾脏的Vero细胞;或源自人胚胎成视网膜细胞的PER.C6细胞。这些细胞系可广泛获自,例如美国模式培养物保藏所(ATCC)、寇里尔细胞保藏中心(Coriell Cell Repositories)或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如,ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞,目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER.C6可以保藏号96022940获自ECACC。
培养流感病毒的最优选细胞系的MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34获自ATCC,但也可使用该细胞系的衍生物。例如,WO97/37000披露了适用于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系(″MDCK 33016″,以DSM ACC 2219保藏)。类似地,EP-A-1260581(WO 01/64846)披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系(″B-702″,以FERM BP-7449保藏)。WO2006/071563披露了非致瘤性MDCK细胞,包括“MDCK-S″(ATCC PTA-6500),“MDCK-SF101”(ATCC PTA-6501),“MDCK-SF 102”(ATCCPTA-6502)和“MDCK-SF103″(PTA-6503)。WO2005/113758披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系,包括“MDCK.SF1”细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。
WO97/37000、WO97/37001、WO03/023021和WO03/023025描述了对悬液和贴壁培养基中MDCK细胞培养物的操作。具体地说,WO 03/023021和WO 03/023025描述了MDCK悬浮细胞在无血清培养基、化学成分确定的培养基和无蛋白培养基中的实验室和商业规模细胞培养体积。各参考文献全文纳入本文。
作为替代哺乳动物来源,本发明所用的细胞系可源自禽来源,例如鸡、鸭、鹅、鹤鹑或野鸡。禽细胞系可源自各种发育阶段,包括胚胎、雏禽和成年。这些细胞系优选源自胚胎细胞,例如胚胎成纤维细胞、生殖细胞或单个器官,包括神经元、大脑、视网膜、肾脏、肝脏、心脏、肌肉或胚外组织和保护该胚胎的膜。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞(WO01/85938和WO03/076601)和鸭视网膜细胞(WO2005/042728)。合适的禽胚胎干细胞包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB 14和EB 14-074(WO2006/108846)。还可利用鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。这些禽细胞特别适合于培养流感病毒。
本领域技术人员知道昆虫细胞表达系统,例如杆状病毒重组表达系统,这些系统描述于,例如Summers和Smith《德克萨斯农业实验站第1555号公告》(Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin,1987,No.1555)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式商业购自加利福尼亚州圣迭戈市的英杰公司(Invitrogen)等。杆状病毒表达载体所用的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、首蓓银纹夜蛾(Autographs californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni),等等。
重组表达蛋白质还可在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillusstcbtilis)和链球菌(Streptococcus spp.)等细菌宿主中进行。适合于重组表达蛋白质的酵母菌宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
各种出版物充分描述了上述细胞类型的培养条件,或者可以商业购得培养基、添加剂和条件,例如新泽西州东鲁瑟福得市开姆布莱克斯生物产品公司(Cambrex Bioproducts,East Rutherford,NJ)的目录和其它文献。
在某些实施方式中,将本文所述方法所用的宿主细胞培养在无血清和/或无蛋白质的培养基中。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质,但可任选包含病毒生长所需的蛋白质,例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。
已知的无血清培养基包括Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(拜维塔克公司(BioWhittaker))或EX-CELL(JRH生物科学公司(JRH Bioscience))。常规含血清培养基包括Eagle基本培养基(BME)或极限必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM或EDM),一般使用最多10%的胎牛血清或类似的添加剂。极限必需培养基(MEM)(Eagle,Science,1959,130:432)或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM或EDM)可任选不使用任何含血清的添加剂。现有技术也熟知无蛋白质的培养基,例如PF-CHO(JHR生物科学公司,JHR Bioscience),化学成分确定的培养基,例如ProCHO 4CDM(拜维塔克公司)或SMIF 7(吉比克/BRL生命技术公司,Gibco/BRL LifeTechnologies)和促有丝分裂肽,例如Primactone,Pepticase或I-IyPepTM(均购自国际探索公司,Quest International)或乳清蛋白水解物(吉比克公司Gibco和其它生产商)。基于植物水解物的培养基添加剂的特别优点在于能排除病毒、支原体或未知感染因子的污染。
由于本发明所用细胞系的适用性,细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)可在很大范围内变动,可改进这些条件使之适应具体病毒生长条件或重组表达细节的要求。
宿主DNA残留量及检测
本领域普通技术人员能检测残留的宿主细胞DNA。本发明蛋白制品中残留DNA的总量优选低于20ng/ml,例如≤10ng/ml、≤5ng/ml、≤1ng/ml、≤100pg/ml、≤10pg/ml,等等。
用于检测DNA的试验通常是确认试验(“工业指南:生物分析方法确认”(Guidance forIndustry:Bioanalytical Method Validation),美国健康和人服务部食品药品管理中心兽药评估和研究(CDER)中心(C VM)(U.S.Department of Health and Human Services Food andDrug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Center for VeterinaryMedicine(CVM)).2001年5月;Lundblad(2001)Biotechnology and Applied Biochemistry34:195-197)。可利用数学和可定量的术语描述确认试验的性能特征,已鉴定了其可能的误差来源。已总体上检验了该试验的诸如准确度、精密度、特异性等特征。一旦校验(例如,用宿主细胞DNA的已知标准量)及检验好某试验,可常规进行定量DNA检测。可采用三种主要的DNA定量技术:杂交方法,例如Sourthern印迹或槽印迹(Ji等,Biotechniques,2002,32:1162-7);免疫测定方法,例如ThresholdTM系统(Bri ggs,J Parenter SciTechnol.1991,45:7-12)和定量PCR(Lahijani,Hum Gene Ther.1998,9:1173-80)。技术人员熟知这些方法,虽然各方法的精确特征取决于所研究的宿主细胞,例如杂交探针的选择,扩增用引物和/或探针的选择,等等。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。应当理解,列举这些实施例只是为了起说明作用,而并不是用来限制本发明的范围。除非特别说明,本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规实验条件进行,例如Sambrook等人在《分子克隆:实验室手册》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.电泳槽结构
1.一种分隔的两腔电泳槽
参见图1,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5和琼脂糖凝胶分隔7;电泳区域由被琼脂糖凝胶分隔7分隔的两个区域组成,分别为阳极区域4和中间区域5,阳极2和阴极3分别位于这两个区域中。
2.一种分隔的带选择性核酸分离部件的两腔电泳槽
参见图2,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、琼脂糖凝胶分隔7和选择性核酸分离部件10;电泳区域由被琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分隔7分隔的两个区域组成,分别为阳极区域4和中间区域5,阳极2和阴极3分别位于这两个区域中;选择性核酸分离部件10位于阳极区域和中间区域之间。
3.一种分隔的三腔电泳槽
参见图3,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、阴极区域6和琼脂糖凝胶分隔7;电泳区域由被琼脂糖凝胶分隔7分隔的三个区域组成,分别为阳极区域4、中间区域5和阴极区域6,阳极2和阴极3分别位于两端的阳极区域4和阴极区域6中。
4.一种分隔的带选择性核酸分离部件的三腔电泳槽
参见图4,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、阴极区域6、琼脂糖凝胶分隔7和选择性核酸分离部件10;电泳区域由被琼脂糖凝胶分隔7分隔的三个区域组成,分别为阳极区域4、中间区域5和阴极区域6,阳极2和阴极3分别位于两端的阳极区域4和阴极区域6中;选择性核酸分离部件10位于阳极区域和中间区域之间。
5.一种分离的两腔电泳槽示意图
参见图5,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、阀门8和连接通道9;电泳区域包括两个独立的区域,分别为阳极区域4和中间区域5,它们由电泳通道9连接,阳极2和阴极3分别位于阳极区域4和中间区域5中;电泳通道9带有阀门8。
6.一种分离的带选择性核酸分离部件的两腔电泳槽
参见图6,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、阀门8、连接通道9和选择性核酸分离部件10;电泳区域包括两个独立的区域,分别为阳极区域4和中间区域5,它们由电泳通道9连接,阳极2和阴极3分别位于阳极区域4和中间区域5中;电泳通道9带有阀门8;选择性核酸分离部件10位于阳极区域和中间区域之间。
7.一种分离的三腔电泳槽
参见图7,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、阴极区域6、阀门8和连接通道9;电泳区域包括三个独立的区域,分别为阳极区域4、中间区域5和阴极区域6,它们由电泳通道9连接,阳极2和阴极3分别位于阳极区域4和阴极区域6中;电泳通道9带有阀门8。
8.一种分离的带选择性核酸分离部件的三腔电泳槽
参见图8,该电泳槽包括槽体1、阳极2、阴极3、阳极区域4、中间区域5、阴极区域6、阀门8、连接通道9和选择性核酸分离部件10;电泳区域包括三个独立的区域,分别为阳极区域4、中间区域5和阴极区域6,它们由电泳通道9连接,阳极2和阴极3分别位于阳极区域4和阴极区域6中;电泳通道9带有阀门8;选择性核酸分离部件10位于阳极区域和中间区域之间。
实施例2.核酸浓缩
用图1所示的由琼脂糖凝胶分隔的两腔式电泳槽浓缩溶液中的核酸成分。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,琼脂糖胶条的宽度为1cm,顶面超过电泳缓冲液的液面高度0.5cm,在电泳槽的阳极区域和中间区域之间形成分隔。
1、取20ug纯化的pGL3(Promega)质粒,溶解于200mL 0.5×TBE,质粒终浓度为100ng/mL;
2、将200mL质粒溶液缓慢加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL0.5×TBE;
3、如图1所示连接电源电极,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
5、收集电泳槽阳极区域中的溶液,进行乙醇沉淀,用30uL去离子水溶解沉淀,检测质粒的纯度并进行定量,计算回收率;
6、A260/280为1.97,回收率为95%。
实验结果表明,本发明提供的核酸分离方法能够简便、高效、高质量地浓缩样本中的核酸分子。
实施例3.基于选择性核酸分离部件的核酸浓缩
用图2所示的由琼脂糖凝胶分隔的带选择性核酸分离部件的两腔式电泳槽浓缩溶液中的核酸成分。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,琼脂糖胶条的宽度为1cm,顶面超过电泳缓冲液的液面高度0.5cm,在电泳槽的阳极区域和中间区域之间形成分隔。选择性核酸分离部件为活化的DEAE纤维素膜,位于阳极区域和中间区域之间核酸转移通道中。
1、DEAE纤维素膜活化:切一块与电泳区域截面大小合适的DEAE纤维素膜(Schleicher& Schuell,NA-45),在10mmol/LEDTA(pH 8.0)条件下,室温浸泡5分钟;随后用0.5mol/L NaOH取代EDTA浸泡以活化DEAE纤维素膜,室温浸泡5分钟,然后用无菌水冲洗6次;
2、将活化的DEAE纤维素膜固定于电泳槽中,位于琼脂糖凝胶的阳极一侧;
3、取20ug纯化的pGL3(Promega)质粒,溶解于200mL 0.5×TBE,质粒终浓度为100ng/mL;
4、将200mL质粒溶液缓慢加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL0.5×TBE;
5、如图2所示连接电源电极,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
6、取出DEAE纤维素膜,室温下,用10mL DEAE低盐缓冲液(50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;1mol/LNaCl;10mmol/L EDTA,pH 8.0)漂洗一次;
7、将膜转移到合适的容器中,加足量的DEAE高盐缓冲液(50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;0.15mol/L NaCl;10mmol/L EDTA,pH 8.0)使膜完全被浸泡,于65℃条件下温育30分钟;
8、将步骤7中的DEAE高盐缓冲液转移到另一容器中,再加入足量的DEAE高盐缓冲液(50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;0.15mol/L NaCl;10mmol/L EDTA,pH 8.0)使膜完全被浸泡,于65℃条件下温育15分钟;
9、合并两份DEAE高盐缓冲液,用酚/氯仿抽提一次;将水相转入一离心管中;加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵,2倍体积4℃乙醇,室温放置10分钟;用微量离心机以最大转速离心10分钟;用70%乙醇小心洗涤沉淀后,室温静置,使乙醇挥发,将DNA重溶于30uL去离子水中,检测回收的质粒的纯度并进行定量,计算回收率;
6、核酸的回收率为93%。
实验结果表明,本发明提供的方法能够简便、高效、高质量地浓缩样本中的核酸分子。
实施例4.核酸与蛋白的分离
用图5所示的分离式的两腔电泳槽从核酸蛋白混合液中分离核酸及蛋白分子。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,连接阳极区域和中间区域的电泳通道中装有一个阀门。
1、核酸蛋白混合物:取10ug纯化的pGL3(Promega)质粒和10mg牛血清白蛋白(Sigma),溶解于200mL 0.5×TBE,质粒终浓度为50ng/mL,蛋白的终浓度为50ug/mL;
2、关闭电泳通道中的阀门,将200mL核酸蛋白溶液加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL 0.5×TBE;
3、如图5所示连接电源电极,打开阀门,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
5、收集电泳槽阳极区域中的溶液,用Bradford法分别测定阳极区域和中间区域溶液中的蛋白含量;对收集的阳极区域溶液进行乙醇沉淀,用15uL去离子水溶解沉淀并进行定量,计算回收率;
6、质粒DNA的回收率为97%;阳极区域蛋白浓度为2ug/mL,中间区域蛋白浓度为47ug/mL。
实验结果表明,本发明提供的分离式电泳槽能够简便、高效、高质量地从核酸蛋白混合物中分离核酸与蛋白分子。
实施例5.基于选择性核酸分离部件的核酸分离
用图2所示的由琼脂糖凝胶分隔的带选择性核酸分离部件的两腔式电泳槽浓缩溶液中的核酸成分。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,琼脂糖胶条的宽度为1cm,顶面超过电泳缓冲液的液面高度0.5cm,在电泳槽的阳极区域和中间区域之间形成分隔。选择性核酸分离部件为美国联合碳化物公司(Union Carbide)的透析膜,位于阳极区域和中间区域之间核酸转移通道中。
1、透析膜预处理:裁剪与电泳区域截面大小合适的透析膜,浸在蒸馏水中15分钟,使其软化;浸入10mM碳酸氢钠(sodium bicarbonate)中,加热至80℃,搅拌30分钟以上;换到10mM Na2·EDTA中浸泡30分钟,以新鲜的EDTA同样处理三次;再用80℃蒸馏水洗30分钟,然后换到20%酒精中,置于4℃冰箱中保存;
2、将经过预处理的透析膜固定于电泳槽中,位于琼脂糖凝胶的阳极一侧;
3、核酸蛋白混合物:取10ug纯化的pGL3(Promega)质粒和10mg牛血清白蛋白(Sigma),溶解于200mL 0.5×TBE,质粒终浓度为50ng/mL,蛋白的终浓度为50ug/mL;
4、将核酸/蛋白质粒溶液缓慢加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL 0.5×TBE;
5、如图2所示连接电源电极,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
6、小心取出透析膜,放入2mLTE缓冲液中,用吸管反复吹打透析膜,使附着于膜上的DNA脱落;
7、用Bradford法测定溶液中的蛋白含量;
8、将收集的DNA溶液用酚/氯仿抽提一次;将水相转入一离心管中;加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵,2倍体积4℃乙醇,室温放置10分钟;用微量离心机以最大转速离心10分钟;用70%乙醇小心洗涤沉淀后,室温静置,使乙醇挥发,将DNA重溶于30uL去离子水中,检测回收核酸的纯度并进行定量,计算回收率;
8、核酸回收率为96%,在DEAE纤维素膜洗涤液中未检测到蛋白。
实验结果表明,本发明提供的方法能够简便、高效、高质量地浓缩样本中的核酸分子。
实施例6.宿主细胞核酸残留的去除
用图1所示的由琼脂糖凝胶分隔的两腔式电泳槽去除疫苗粗提物中的宿主核酸成分。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,琼脂糖胶条的宽度为1cm,顶面超过电泳缓冲液的液面高度0.5cm,在电泳槽的阳极区域和中间区域之间形成分隔。
1、疫苗粗提物制备:按照WO97/37000、WO03/23025和WO04/92360的指导,将流感病毒(A/New Caledonian/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)、B/Jiangsu/10/2003、A/Wyoming/3/2003(H3N2))培养在悬浮培养的MDCK细胞中。使最终的培养基澄清以提供病毒颗粒,然后进行层析和超滤/渗滤。利用β-丙内酯(终浓度0.05%v/v;2-8℃孵育16-20小时,然后在37℃孵育2-2.5小时进行水解)灭活得到的物质中的病毒颗粒。随后用CTAB裂解病毒颗粒及其它加工步骤,获得含有纯化的表面蛋白的单价病毒疫苗的粗提物;
2、用罗氏应用科学部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)”检测疫苗粗提物中宿主核酸的浓度;
3、取180mL疫苗粗提物,加入20mL 5×TBE储存液,混匀后缓慢加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL 0.5×TBE;
4、如图1所示连接电源电极,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
5、用罗氏应用科学部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)”检测中间区域疫苗溶液中宿主核酸的浓度,计算纯化效率;
6、疫苗粗提物中宿主核酸的浓度为10.3ng/mL,去除后的宿主核酸残留浓度为21.2pg/mL,纯化效率为485倍。
实验结果表明,本发明提供的方法能够简便、高效地去除疫苗制品中的宿主细胞核酸残留。
实施例7.宿主细胞残留核酸去除
用图1所示的由琼脂糖凝胶分隔的两腔式电泳槽去除疫苗粗提物中的宿主核酸成分。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,琼脂糖胶条的宽度为1cm,顶面超过电泳缓冲液的液面高度0.5cm,在电泳槽的阳极区域和中间区域之间形成分隔。
1、疫苗粗提物制备:按照WO97/37000、WO03/23025和WO04/92360的指导,将流感病毒(A/New Caledonian/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)、B/Jiangsu/10/2003、A/Wyoming/3/2003(H3N2))培养在悬浮培养的MDCK细胞中。使最终的培养基澄清以提供病毒颗粒,然后进行层析和超滤/渗滤。利用β-丙内酯(终浓度0.05%v/v;2-8℃孵育16-20小时,然后在37℃孵育2-2.5小时进行水解)灭活得到的物质中的病毒颗粒。随后用CTAB裂解病毒颗粒及其它加工步骤,获得含有纯化的表面蛋白的单价病毒疫苗的粗提物;
2、用罗氏应用科学部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)”检测疫苗粗提物中宿主核酸的浓度;
3、取180mL疫苗粗提物,加入20mL 5×TBE储存液,混匀后室温静置40分钟;
4、用φ变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对疫苗溶液进行超声处理,在水浴保护下进行超声,保证疫苗溶液温度不超过26℃,设置功率为600W,工作时间2秒,间歇时间3秒,总工作时间20分钟(240次);
5、将经过超声处理的疫苗溶液缓慢加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL0.5×TBE;
6、如图1所示连接电源电极,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
5、用罗氏应用科学部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)”检测中间区域疫苗溶液中宿主核酸的浓度,计算去除后疫苗溶液中的核酸浓度;
6、疫苗粗提物中宿主核酸的浓度为10.3ng/mL,去除后的宿主核酸残留浓度为10.7pg/mL,纯化效率为962倍。
实验结果表明,本发明提供的方法能够简便、高效地去除疫苗制品中的宿主细胞核酸残留。
实施例8.基于选择性核酸分离部件的宿主细胞残留核酸定量
用图2所示的由琼脂糖凝胶分隔的带选择性核酸分离部件的两腔式电泳槽浓缩溶液中的核酸成分。该电泳槽阳极区域容积为20mL,中间区域容积为200mL,琼脂糖胶条的宽度为1cm,顶面超过电泳缓冲液的液面高度0.5cm,在电泳槽的阳极区域和中间区域之间形成分隔。选择性核酸分离部件为活化的DEAE纤维素膜,位于阳极区域和中间区域之间核酸转移通道中。
1、DEAE纤维素膜活化:切一块与电泳区域截面大小合适的DEAE纤维素膜(Schleicher& Schuell,NA-45),在10mmol/L EDTA(pH 8.0)条件下,室温浸泡5分钟;随后用0.5mol/L NaOH取代EDTA浸泡以活化DEAE纤维素膜,室温浸泡5分钟,然后用无菌水冲洗6次;
2、将活化的DEAE纤维素膜固定于电泳槽中,位于琼脂糖凝胶的阳极一侧;
3、取180mL制备的疫苗粗提物,加入20mL 5×TBE储存液,混匀;
4、将200mL疫苗溶液缓慢加入到电泳槽的中间区域中,在电泳槽的阳极区域中加入20mL0.5×TBE;
5、如图2所示连接电源电极,在40V恒压条件下电泳20分钟后,停止电泳;
6、取出DEAE纤维素膜,室温下,用10mL DEAE低盐缓冲液(50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;1mol/LNaCl;10mmol/L EDTA,pH 8.0)漂洗一次;
7、将膜转移到合适的容器中,加足量的DEAE高盐缓冲液(50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;0.15mol/L NaCl;10mmol/L EDTA,pH 8.0)使膜完全被浸泡,于65℃条件下温育30分钟;
8、将步骤7中的DEAE高盐缓冲液转移到另一容器中,再加入足量的DEAE高盐缓冲液(50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;0.15mol/L NaCl;10mmol/L EDTA,pH 8.0)使膜完全被浸泡,于65℃条件下温育15分钟;合并两份DEAE高盐缓冲液;
9、将收集的DEAE高盐溶液用酚/氯仿抽提一次;将水相转入一离心管中;加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵,2倍体积4℃乙醇,室温放置10分钟;用微量离心机以最大转速离心10分钟;用70%乙醇小心洗涤沉淀后,室温静置,使乙醇挥发,将DNA重溶于30uL去离子水中进行分光光度计定量,计算粗提物中核酸的含量;
10、计算得到疫苗粗提物中宿主核酸的含量为11.294ng/mL。
Claims (10)
1.一种核酸分离方法,其特征在于该方法包括以下步骤:1)获得一种电泳槽,该电泳槽包括至少两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集;2)将包含待分离核酸的溶液加入到电泳槽中,3)施加外加电场,使溶液中的核酸分子选择性地分布于一个被分隔的或被可操作性分隔的电泳区域,从而得到分离。
2.根据权利要求1所述的核酸分离方法,其特征在于用于固定分隔不同电泳区域的材料包括琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、带孔或微孔的固相支持物。
3.根据权利要求1所述的核酸分离方法,其特征在于用于可操作性分隔不同电泳区域的方式包括阀门、开关、可阻断性流道。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽还包括选择性核酸分离部件。
5.根据权利要求4所述的核酸分离方法,其特征在于所述选择性择性核酸分离部件包括DEAE纤维素膜、透析膜、半透膜或滤膜。
6.根据权利要求1所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括两个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集。
7.根据权利要求6所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括槽体、阳极、阴极和电泳区域;电泳区域由固定分隔或可操作性分隔隔开的两个区域组成,阳极和阴极分别位于这两个区域中。
8.根据权利要求6所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括槽体、阳极、阴极和电泳区域;电泳区域包括两个独立的区域,所述独立的区域经电泳通道连接,电泳通道中带有固定分隔或可操作性分隔;阳极和阴极分别位于这两个区域内。
9.根据权利要求1所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽包括三个固定分隔的或可操作性分隔的电泳区域,在不影响大分子正常电泳行为的情况下,这些分隔使不同电泳区域内的溶液能够被单独收集;阳极和阴极分别位于两端的区域内。
10.权利要求6或9所述的核酸分离方法,其特征在于所述电泳槽还包括选择性核酸分离部件。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN114929722A (zh) * | 2019-11-25 | 2022-08-19 | Emp生物技术股份有限公司 | 使用与固体表面结合的亲和配体分离和离析核酸 |
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2011
- 2011-06-20 CN CN 201110165142 patent/CN102836423A/zh active Pending
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PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20121226 |