CN114929722A - 使用与固体表面结合的亲和配体分离和离析核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过将靶标大分子(诸如DNA(双链或单链)、RNA(双链或单链)、信使RNA或其它低核苷酸或寡核苷酸)与结合于表面的亲和配体结合，从样品中离析和分离靶标大分子的方法。所述方法可用于色谱法或任何其他分离科学。
Description
相关应用的交叉引用
本申请要求于2019年11月25日提交的美国临时专利申请号62/939,934的优先权。前述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及使用结合到表面的特定选择的亲和配体从进料流或通常从样品中分离、离析和去除靶标大分子(诸如DNA和RNA)的方法。
背景技术
色谱法(正如通常使用的)是一种分离样品混合物中各种成分的技术。在液相色谱系统中，依次将样品和洗脱液注入色谱分离柱。分离柱含有可与待分离样品的各种组分相互作用的填料或基质介质或材料。分离介质的组成取决于被引导通过其中的流体，以实现所需的分离。当样品和洗脱液通过分离介质时，由于不同的相互作用，样品的各种组分以不同的速率通过分离介质。这些组分在出口或分离介质的流出物中分离出来。
本领域已知各种类型的垂直和水平流分离柱。随着高效液相色谱的需要，开发了水平流型色谱柱。这种水平或径向流柱在例如美国专利号4,627,918和4,676,898中有描述。在水平或径向流型柱中，样品和洗脱流体通过分配器引入分离介质或基质的外周或周壁或表面，流体水平或径向向内通过分离介质到达中心或收集口，然后以不同的时间和不同的速率从柱中洗脱。
后来，开发了直接处理粗进料的色谱柱和方法，以分离生物活性物质，包括细胞/发酵收获物、组织提取物和血浆/血液。将大珠层析介质装入标准低压色谱柱中，用大孔筛(60-180μm孔)代替端板筛。大孔防止色谱柱堵塞。由于颗粒大小较大，细胞物质在颗粒间腔中的珠之间流动，而可溶性产物被珠上的官能团捕获。
传统上，来自细胞培养/发酵收获的生物制品的下游处理需要两个主要操作：回收和纯化。回收涉及通过离心和/或微滤去除细胞和其他颗粒物质，以及初始的减容步骤，通常为超滤。由于常规色谱介质会被细胞碎片迅速污染，因此必须为纯化操作准备无颗粒进料。
在(治疗性)生物制品(诸如单克隆抗体)的某些纯化过程中，通过活细胞系统(哺乳动物、细菌、苔藓、藻类、植物等)产生样品/产物，并且产物或者由细胞分泌到进料流中，或者细胞被破碎以将产物释放到周围的液体中。然而，在所有这些生产系统中，产物不是作为单一组分纯产物提供的，而是作为所需产物和“污染物”的非常复杂的混合物，其中包括宿主细胞蛋白质(HCP)和基因组DNA以及RNA。
在纯化过程中，必须将纯化产物中的HCP和DNA/RNA去除至低于监管机构(诸如FDA)设定的限值水平。这种纯化常常通过阴离子离子交换法实现。在过滤和纯化含有蛋白质的样品期间，可能难以在不使目的蛋白质退变的情况下将蛋白质与其他细胞组分和宿主蛋白质分离，并且难以离析靶标蛋白质。一种常见的方法是通过沉淀；然而，这可能导致蛋白质的变性或退变，这可能导致蛋白质功能的丧失。蛋白质的重折叠通常会导致活性丧失。快速蛋白质液相色谱(FPLC)是蛋白质纯化中常用的方法。在不必使用高压或侵蚀性pH缓冲液使蛋白质变性的情况下，可仅使用缓冲液与离析目的蛋白之间的特异性相互作用来纯化蛋白质。
仍然需要一种从进料流中去除和离析双链和单链DNA和RNA的系统。
发明内容
公开了从样品中分离靶标大分子的方法，包括以下步骤：选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；将偶联的表面亲和配体放置于容器中；将含有靶标大分子的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中靶标大分子与亲和配体结合；以及将结合靶标大分子的偶联的表面亲和配体与从中去除了了靶标大分子的样品分离。任选地，所述方法包括收集基本上不含靶标大分子的洗脱液和/或从偶联的表面亲和配体洗脱和回收靶标大分子。
靶标大分子可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、病毒、含有低核苷酸(oligonucleotide)或寡核苷酸(oligonucleoside)的蛋白质、含有低核苷酸或寡核苷的脂质、其它低核苷酸或寡核苷酸、其任意片段或其任意组合。在某些实施方案中，所述亲和配体不结合样品中的蛋白质和/或为亚甲基蓝、Hoechst染料、苯并噻唑-喹啉的花菁(cyanine)或苯并噁唑-喹啉的花菁。所述表面可以是包括官能化基团的固体表面，例如珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材(monolith)或色谱中用作树脂的任何其它材料。容器可以是色谱柱、碗、圆柱体、锥形器皿或桶。
还公开了从含有DNA和其它核酸的样品中离析和去除DNA的方法，以及从含有RNA和其它核酸的样品中离析和去除RNA的方法。这些方法包括以下步骤：选择将会与靶标DNA或RNA结合的亲和配体；将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；将偶联的表面亲和配体放置于容器中；将所述样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中靶标DNA或RNA与所述亲和配体结合；以及从去除了DNA或RNA的样品中分离与靶标DNA或RNA结合的偶联表面亲和配体。
附图说明
图1A和图1B是显示在两种浓度的MCMB珠状琼脂糖凝胶(30μg MCMB/mL凝胶和65μgMCMB/mL凝胶，MCMB＝单羧基亚甲蓝)中未处理和“超滤”的DNA(大小<50bp)，在两种浓度的MCMB珠状琼脂糖凝胶中结合的DNA百分比的对比条形图。图1A显示了与凝胶结合的DNA占加入的总DNA的％，图1B显示了凝胶结合DNA的能力(以μg DNA/mL凝胶计)。黑色＝MCMB-琼脂糖；灰色＝对照(凝胶上不存在MCMB)；
图2A和2B是显示使用不同大小的DNA时凝胶结合DNA的能力的图：图2A＝与凝胶结合的DNA占加入的总DNA的％，图2B＝凝胶结合DNA的能力(以μg DNA/mL凝胶计)。白色＝天然琼脂糖珠w/o氨基；黑色＝氨基官能化琼脂糖珠；灰色＝DNA，浓度<50bp或<2000bp；
图3A-3D是显示不同浓度(各50μL)的DNA通过1mL填充有天然琼脂糖珠的FPLC柱时在260nm处的峰强度和电导率的图。这些图显示了四种不同DNA浓度下的结果：图3A＝3.3mg/mL，图3B＝1.5mg/mL，图3C＝0.33mg/mL，图3D＝0.15mg/mL；
图4是显示将DNA(2.5mg/mL TRIS，各50μL)加载到1mL填充有氨基琼脂糖珠或天然未改性的琼脂糖珠的FPLC柱上的结果(强度和电导率)的图；
图5是显示将DNA(2.5mg/mL TRIS，各50μL)加载到1mL填充有MCMB琼脂糖珠的FPLC柱上的结果(强度和电导率)的图；
图6是显示在旋转柱中ds DNA与偶联的琼脂糖亲和配体树脂结合的条形图，其中100μL凝胶上加载有～11-13μg ds DNA的溶液；
图7是显示在旋转柱中ds DNA与偶联的琼脂糖-YO-C3树脂结合的条形图，其中100μL凝胶上加载有～12μg ds DNA的溶液；
图8是显示在旋转柱中ds DNA与偶联的琼脂糖-TO-C3树脂结合的条形图，其中100μL凝胶上加载有～12μg ds DNA的溶液；
图9是显示在旋转柱中ds DNA与偶联的琼脂糖-TO-C6树脂结合的条形图，其中100μL凝胶上加载有～12μg ds DNA的溶液；
图10是显示在旋转柱中ds DNA与偶联的琼脂糖-单-Hoechst-C3树脂结合的条形图，其中的100μL凝胶上加载有～18μg ds DNA的溶液；
图11是显示在旋转柱中ds DNA与偶联的琼脂糖-L-Hoechst-C3树脂结合的条形图，其中100μL凝胶上加载有～12μg ds DNA的溶液；
图12是显示在旋转柱中每批加载缓冲液中的ds DNA与100μL凝胶上的13.6μg dsDNA结合的条形图；
图13是显示在旋转柱中每批加载缓冲液中的ss DNA与100L凝胶上的22.1μg ssDNA在结合的条形图；
图14是显示白蛋白与各种树脂结合能力的条形图。
具体实施方式
本文公开了从生物进料流，例如未澄清(即未过滤)的细胞培养物中捕获和去除靶标大分子的方法。在一个实施方案中，可以是大沟结合剂、小沟结合剂或嵌入配体(一起称为“亲和配体”)的特殊捕获配体可以(例如共价)结合到固体表面，并用于从复杂混合物(诸如细胞培养物进料流)中不可逆或可逆地捕获靶标大分子，诸如DNA、RNA和含低核苷酸的脂质和蛋白质。所述方法用于分离科学，包括但不限于色谱、过滤、蒸馏和蒸发。色谱法包括任何已知的色谱法，包括但不限于径向流色谱法、轴向色谱法、间歇色谱法、吸附色谱法、膨胀床色谱法、模拟移动床色谱法、逆流色谱法、高压和高效液相色谱法。过滤包括本领域中任何已知的过滤方法，包括但不限于膜过滤、中空纤维过滤和切向流/错流过滤。
本文公开了使用亲和配体(与靶标分子表现出确定的相互作用的分子)过滤、分离、离析、去除和/或纯化核酸的方法。所述方法包含以下步骤：(a)选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放入容器中；(d)将含有靶标大分子的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中靶标大分子与容器中的亲和配体结合；和(e)将结合靶标大分子的偶联表面亲和配体与从中去除了靶标大分子的样品分离。任选地，所述方法还包括(f)收集洗脱液，即从中去除了靶标大分子的样品。
亲和配体可以不可逆地固定和粘附到表面，以使其可以与靶标大分子相互作用和结合。靶标大分子可以是核酸或其片段。核酸可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、病毒、含有低核苷酸或寡核苷酸的蛋白质、含有低核苷酸或寡核苷酸的脂质、其它低核苷酸或寡核苷酸、其任意片段或其任意组合。靶标大分子可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、其任意片段或其任意组合。
亲和配体可以是小沟结合剂、大沟结合剂或嵌入配体。对每个过滤和/或纯化过程中使用的亲和配体进行单独选择，以降低或消除与靶标大分子以外的分子的交叉反应性(不需要的结合)。亲和配体可以是已知为小沟结合剂、大沟结合剂或嵌入配体的任何分子，并且还可以是已知为小沟结合剂、大沟结合剂或嵌入配体的任何分子，还可以观察到所述分子对靶标大分子具有进一步的选择性。
在一个实施方案中，可以选择结合大链DNA并且与蛋白质具有最小至没有明显相互作用的亲和配体。可以选择亲和配体，其结合双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、其任意片段或其任意组合，并且与其他低核苷酸具有最小至没有明显的相互作用。
所述表面可以是固体表面，其任选地被官能化以包括例如离子交换基团或疏水相互作用基团。表面可具有官能化基团，诸如以环氧基、羧基、醛基、卤化物或氨基为末端的间隔基。间隔基是指连接到固体表面的原子链，优选一至三十个或一至二十个原子。间隔基可以含有酯、羧基或碳链(例如烷基)。间隔基可含有聚乙二醇部分，诸如(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-10。间隔基可以是C1-20烷氨基、C1-12烷氨基或C2-12烷基氨基。反应后，间隔基将位于固体表面和亲和配体之间并连接固体表面和亲和配体。
固体表面可以是珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材或在色谱中用作树脂的任意其它材料，如上所述，其任选地被官能化。珠可以是琼脂糖珠或氨基琼脂糖珠。膜可以是醛膜，诸如由
醛A4片材制成的膜。整体材可以是环氧树脂或乙二胺(EDA)-AEX/活性炭。
当采用的方法是批处理色谱法时，表面可以是膜。当采用的方法是轴向或径向流色谱法时，表面可以是珠。
当含有靶标大分子的样品或进料流与亲和配体接触时，亲和配体与表面结合并捕获靶标大分子。亲和配体可以通过本领域已知的任何方式结合到表面。实例包括但不限于通过使用N-羟基琥珀酰亚胺活化的羧酸形成酰胺键、与醛/希夫碱反应、与环氧基团反应、点击化学和迈克尔(Michael)加成形成键。
结合的亲和配体可以在一次使用(即一次使用的产品)后重复使用或处理。出于调控目的，一次性、一次性使用的产品可能更可取，这样就不会存在每次使用后清洁后是否残留任何残留污染物的问题。此外，清洁将非常昂贵，并且在技术上可能很困难。
这样，亲和配体选择性地结合靶标大分子，从而提供基本上不含靶标大分子的洗脱液。将靶标大分子与样品的其余部分离析，如有必要，任选地用于回收和进一步实验和/或处理。亲和配体可以选择性地结合靶标大分子，而不结合蛋白质。例如，DNA的固定和分离可以通过使用偶联的表面亲和配体作为嵌入分子进行，例如，与改性亚甲基蓝或改性Hoechst染料偶联的氨基-琼脂糖珠。孵育后，DNA与亲和配体结合，并可以与样品分离。
从亲和配体中回收DNA可能基于固相(诸如二氧化硅或玻璃)之间的离子相互作用。结合缓冲液通常具有较高的离子强度，其pKa值等于或低于表面硅烷醇基的pKa值，可使DNA结合同时洗涤杂质。然后，通常使用低离子强度缓冲液洗脱DNA。缺点是用于从合成柱固相去除DNA的裂解缓冲液的pH值较高；高pH值可能会溶解二氧化硅，二氧化硅最终会成为DNA中的杂质。
在从进料流中耗尽或去除一些或全部靶标大分子之后，洗脱剂可以含有小于约5重量％的靶标大分子、小于约2重量％的靶标大分子、小于约1重量％的靶标大分子、小于约0.5重量％的靶标大分子、小于约0.2重量％的靶标大分子、小于约0.1重量％的靶标大分子，小于约0.05重量％的靶标大分子，小于约0.01重量％的靶标大分子，小于约0.005重量％的靶标大分子，或小于约0.001重量％的靶标大分子。
以另一种方式解释，亲和配体可以结合样品中至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、或至少约85重量％的靶标大分子。亲和配体可以结合样品中约50重量％至约99重量％的靶标大分子、样品中约60重量％至约98重量％的靶标大分子或样品中约70％至约98％重量的靶标大分子。
亲和配体可以表现出与靶标大分子的小沟结合或大沟结合。小沟结合的特征是通过范德华相互作用、氢键和静电相互作用与富含AT序列的窄小沟选择性结合。Reddy,etal.,“Recent developments in sequence selective minor groove DNA effectors,”Curr.Med.Chem.,8(2001),pp.475-508。大沟结合的特征是螺旋配体与主链以及氢键的静电相互作用。Eckel,R.,et al,“Identification of Binding Mechanisms in SingleMolecule–DNA Complexes,”Biophys.J.,2003 Sep,85(3):1968–1973。
亲和配体可表现出与靶标大分子的嵌入。嵌入是分子(或离子)可逆地插入材料中。在一个实施方案中，当靶标大分子是DNA时，亲和配体通过嵌入与DNA相互作用，使得适当大小和化学性质的配体将自己置于DNA碱基对之间。这些亲和配体大多是多环、芳香和平面的。亲和配体可以是染料。根据靶标大分子和所选固体表面选择亲和配体。亲和配体不是序列特异性的。在某些实施方案中，亲和配体不带电荷，并且任选不与进料流中的任何蛋白质结合。如果它带电荷，配体可能会不加选择地与蛋白质或其他物质结合。在一个实施方案中，当靶标大分子是DNA时，亲和配体可以是选择性结合DNA且任选不结合蛋白质的改性亚甲基蓝、改性Hoechst染料、改性噻唑橙或改性噁唑黄。
亲和配体可以被改性为能够结合任何固体表面(即珠、膜、颗粒、网、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体料或其它固相)，并且可以结合一种或多种靶标大分子，以便从样品、反应或进料流中离析、分开、去除、富集或纯化靶标大分子。当表面是珠时，可以使用已知用于色谱中也能够结合亲和配体的任何珠。珠可以是官能化的玻璃或琼脂糖，例如，结合改性亚甲基蓝、改性Hoechst染料或苯并噻唑-喹啉或改性的苯并噁唑-喹啉的花菁，例如改性噻唑橙、改性噁唑黄。珠可以是玻璃或琼脂糖，其具有例如与改性亲和配体上的烷-氨基结合的醛基、羧基或环氧基。当表面为膜时，膜可与改性亚甲基蓝、改性Hoechst染料或苯并噻唑-喹啉或苯并噁唑-喹啉改性的花菁结合，诸如改性噻唑橙、改性噁唑黄。
为了改性亲和配体：首先分析或鉴定接头或间隔基的最佳附着点(例如，其不会干扰配体识别靶标大分子的位点)；第二，开发一种合成策略，利用本领域已知的标准合成技术引入适当长度的连接基团，以防止配体上不需要的和不受控的基团，并确保连接基团的一端具有适当的官能团以化学结合固体表面。
亲和配体可以是任何已被改性以化学结合到官能化表面的嵌入剂、小沟结合剂或大沟结合剂。亲和配体可选自吖啶类、聚咪唑类、吲哚类、吡咯类、菲啶类、苯并噻唑-喹啉类或苯并噁唑-喹啉类的花菁、吩噁嗪类、吩噻嗪类、蒽醌类、呋喃香豆素类、其任何变体或能够结合到表面并捕获靶标大分子的任何其它配体。
根据本公开内容可用的吖啶类结构包括但不限于GelGreen(10,10’-(6,22-二氧代-11,14,17-三噁-7,21-二氮杂庚烷-1,27-二基)双(3,6-双(二甲氨基)吖啶-10-鎓)碘化物(10,10’-(6,22-dioxo-11,14,17-trioxa-7,21-diazaheptacosane-1,27-diyl)bis(3,6-bis(dimethylamino)acridin-10-ium)iodide))、吖啶橙(N,N,N’,N’-四甲基吖啶-3,6-二胺(N,N,N’,N’-Tetramethylacridine-3,6-diamine))及其衍生物、安吖啶(也称为同义词：m-AMSA、吖啶基茴香胺(acridinyl anisidide))和吖啶黄(3,6-二氨基-10-甲基吖啶-10-氯化鎓(3,6-Diamino-10-methylacridin-10-ium chloride)及其衍生物，包括普罗黄素(proflavine)(也称为原黄素(proflavin)和二氨基吖啶；吖啶-3,6-二胺)。
根据本公开内容可用的聚咪唑类、吲哚类和吡咯类包括但不限于“Hoechst”染料(即Hoechst 33258、Hoechst 33342(也称为双苯甲酰胺)和Hoechst 34580)(https://en.wikipedia.org/wiki/Hoechst_stain)，已知可嵌入DNA/RNA、DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能与DNA中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的区域强烈结合的荧光染色剂)、莱西托品(Lexitropsins)、奈替罗辛(Netropsins)(也称为刚果素(congocidine)或西那诺霉素(sinanomycin)的聚酰胺)和偏端霉素(Distamycin)(是一种聚酰胺-抗生素，起小沟结合剂的作用，也称为疱疹素(Herperetin)、司他霉素(Stallimycin))。
莱西托品是半合成DNA-结合配体系列的成员。其可以结合在DNA的小沟中。莱西托品与DNA以化学计量学1:1和2:1形成复合物。莱西托品可以具有但不限于以下结构：
根据本公开内容可用的菲啶类结构包括但不限于菲啶及其衍生物，例如溴化乙锭、碘化丙锭、叠氮碘化丙锭和GelRed(5,5'-(6,22-二氧代-11,14,17-三噁-7,21-二氮杂庚烷-1,27-二基)双(3,8-二氨基-6-苯基菲啶-5-鎓)碘化物(5,5'-(6,22-dioxo-11,14,17-trioxa-7,21-diazaheptacosane-1,27-diyl)bis(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium)iodide))。
根据本公开内容可用的苯并噻唑-喹啉和苯并噁唑-喹啉的花菁的结构包括但不限于“Sybr Green”系列染料(包括但不限于Sybr Green I(N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺(N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine))、Sybr Green II、SybrGold和Sybr Safe((Z)-4-((3-甲基苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-丙基喹啉-1-鎓-4-甲基苯磺酸盐((Z)-4-((3-Methylbenzo[d]thiazol-2(3H)-ylidene)methyl)-1-propylquinolin-1-ium4-methylbenzenesulfonate))、TOTOTM系列染料及其衍生物、YOYOTM系列染料及其衍生物、YO-PROTM系列染料及其衍生物、TO-PROTM系列染料及其衍生物、POPOTM系列染料及其衍生物、BOBOTM系列染料及其衍生物、LOLOTM系列染料及其衍生物、JOJOTM系列染料及其衍生物(参见ThermoFisher Scientific,Molecular probes Handbook,A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Chapter 8,Nucleic AcidDetection and Analysis,11th Ed(2010)，网址：https://www.google.com/url？sa＝t&rct＝j&q＝&esrc＝s&source＝web&cd＝3&ved＝2ahUKEwiL5NP478fdAhVqh4sKHffbCFkQFjACegQICBAC&url＝http％3A％2F％2Fwww.thermofisher.com％2Fcontent％2Fdam％2FLifeTech％2Fglobal％2Ftechnical-reference-library％2FMolecular％2520Probes％2520Handbook％2Fchapter-pdfs％2FCh-8-Nucleic-Acid-Detection-Analysis.pdf&usg＝AOvVaw2Ufpb7SkFbbWTbbzAwdgtm)、噻唑橙(Thiazole Orange)及其衍生物、噁唑黄(Oxazole Yellow)及其衍生物、Pico Green及其衍生物
根据本公开内容可用的吩噁嗪类包括但不限于7-氨基放线菌素D(7-AminoactinomycinD)、放线菌素D及其衍生物。
根据本公开内容可用的吩噻嗪类包括但不限于亚甲基蓝(也称为甲基亚硫酰氯(methylthioninium chloride))及其衍生物，包括但不限于二羧基亚乙基蓝NHS酯(Dicarboxymethylene Blue NHS ester)(DCMB-SE)和单羧基亚甲基蓝(Monocarboxymethylene Blue)(MCMB)。
MCMB
DCMB-SE
根据本公开内容可用的蒽醌类结构包括但不限于蒽环霉素(anthracyclines)及其衍生物、柔红霉素(Daunorubicin)(也称为道诺霉素(daunomycin))和阿霉素(Doxorubicin)。
米托蒽醌(Mitoxantrone)、洛索蒽醌(Losoxantrone)(蒽醌蒽吡啶唑类抗肿瘤剂和米托蒽醌类似物)、匹克生琼(Pixantrone)、吡柔比星(Pirarubicin)及其其它蒽醌类似物(例如蒽醌-2-脒基羧酸NHS酯(anthraquinone-2-amidopentyl carboxylic acid NHSester)。
根据本公开内容可用的呋喃香豆素类结构包括但不限于补骨脂素(psoralen)、当归素(angelicin)、佛手素(bergamottin)((E)-4-[(3,7-二甲基-2,6-辛二烯基)氧基]-7H-呋喃[3,2-g][1]苯并吡喃-7-酮((E)-4-[(3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl)oxy]-7H-furo[3,2-g][1]benzopyran-7-one))及其衍生物，以及阿米凯林(amikhelline)(C18H21NO5)及其衍生物。
根据本公开内容可用的其它亲和配体包括但不限于甲基绿(C27H35Cl2N3)，尽管其与DNA和椭圆玫瑰树碱(ellipticine)(5,11-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑(5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole))具有很大程度的离子相互作用。
亲和配体可以是上述吖啶类、聚咪唑类、吲哚类、吡咯类、菲啶类、苯并噻唑-喹啉类或苯并噁唑-喹啉类的花菁、吩噁嗪类、吩噻嗪类、蒽醌类、呋喃香豆素类中的任何一种，或能够结合到表面并捕获靶标大分子的其它配体。亲和配体可以是嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其组合，其已经通过a)将连接基团连接到已经存在于化合物或染料的官能团上，并且该连接基团然后结合到表面，或b)化学改变化合物或染料以包括连接基团，并且该连接基团然后结合到表面进行改性。连接基团可以是任何含有以环氧基、羧基、醛基、卤化物或氨基为末端的间隔基的反应性接头。间隔基是指与亲和配体连接的原子链，优选一至三十个或一至二十个原子。间隔基可以含有酯、羧基或碳链。间隔基可含有聚乙二醇部分，诸如(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n＝1-10。间隔基可以是C1-20烷氨基、C1-12烷氨基或C2-12烷氨基。卤化物可以是任何卤素，或其可以是F、Cl、Br或I。反应后，间隔基将位于表面和亲和配体之间并连接表面和亲和配体。连接基团可以是烷氨基，诸如C2-12烷氨基或C2-8烷氨基。
在一个实施方案中，亲和配体是亚甲基蓝、Hoechst染料、噻唑橙、Sybr Green或噁唑黄，其已被改性以包括能够将亲和配体结合(或束缚)到表面的连接基团。亲和配体可以是经改性的Hoechst染料，以包括连接基团，例如但不限于以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基。亲和配体可以是用烷基胺改性的Hoechst染料，诸如化合物左侧或右侧的C2-12烷基胺或C2-8烷基胺。亲和配体可以是经改性的噻唑橙，以包括连接基团，例如但不限于以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基。亲和配体可以是用烷基胺改性的噻唑橙，诸如C2-12烷基胺或C2-8烷基胺。亲和配体可以是经改性的噁唑黄，以包括连接基团，例如但不限于以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基。亲和配体可以是用烷基胺如C2-12烷基胺或C2-8烷基胺改性的噁唑黄。亲和配体可以是改性亚甲基蓝，诸如单羧基亚甲基蓝。为了生成单羧基亚甲基蓝，引入羧基并将其添加到亚甲基蓝的一侧，作为连接到表面的系链。
亲和配体可以是CDPI3TFP酯，如美国专利号8,980,855中第12栏所公开的，该专利的内容通过引用整体并入本文：
在该化合物中，四氟苄基是反应性羧基，例如，它会与珠上的氨基反应形成酰胺键。
亲和配体可以是改性Sybr Green I，诸如经改性以包括氨基的Sybr Green I。改性Sybr Green I的一种合成方法如下，部分公开于美国专利号5,658,751和美国专利公开号2010/0233710中，其内容通过引用整体并入本文：
在此，Sybr Green I已被改性，以包含将永久和共价键合到表面的氨基。例如，氨基将与含有环氧基或羧基的珠键合，所述珠已通过使用NHS酯剂活化，使羧基与氨基反应形成酰胺基。
根据本公开使用的C3-胺改性的TO(1)或YO(2)可以根据以下合成方案制备：
1-(3-氨丙基)-4-{[3-甲基-2,3-二氢-1,3-苯并噁唑-2-亚基]甲基}喹啉-1-氯化鎓(1-(3-aminopropyl)-4-{[3-methyl-2,3-dihydro-1,3-benzoxazol-2-ylidene]methyl}quinoline-1-iumchloride)(2)在本文中也可称为YO-C3。1-(3-氨丙基)-4-{[3-甲基-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]甲基}喹啉-1-氯化鎓(1-(3-aminopropyl)-4-{[3-methyl-2,3-dihydro-1,3-benzothiazol-2-ylidene]methyl}quinoline-1-iumchloride)(1)在本文中也可称为TO-C3。
亲和配体可以是改性Hoechst染料，其是Hoechst双苯酰亚胺染料系列的化合物，其中添加了能够将亲和配体(或在这种情况下的Hoechst染料)束缚到表面的连接基团。Hoechst染料可以是但不限于Hoechst 33258、Hoechst 33342或Hoechst 34580或单Hoechst染料(即含有一个苯并咪唑环，而不是通常的两个苯并咪唑环体系)。所述改性可以在分子的右侧、分子的左侧或两者兼有进行。Hoechst 33342可用C2胺基、C3胺基或C4胺基在羟基苯甲醛侧(左侧)进行改性。Hoechst 33342用C2胺基、C3胺基或C4胺基在哌嗪侧(右侧)进行改性。
改性Hoechst 33342的一种合成方法如下，部分公开于Wiederholt,K.,et al.,DNA-Tethered Hoechst Groove-Binding Agent:Duplex Stabilization andFluorescence Characteristics,J.Am.Chem.Soc.,1996,118,7055-7062：
在此，Hoechst 33342已被改性，以包括一个氨基(位于分子左侧)，该氨基将永久共价键合到表面。该化合物(10)，3-[4-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-(2,5'-双-1H-苯并咪唑-2-基]-苯氧基-乙胺(3-[4-(5-(4-methyl-1-piperazinyl)-(2,5'-bis-1H-benzimidazol-2-yl]-phenoxy-ethylamine)，在本文中也可称为L-Hoechst-C2。例如，氨基将与含有环氧基或羧基的珠键合，该珠已通过使用NHS酯试剂活化，使羧基与氨基反应形成酰胺基。
根据本公开使用的另一种改性Hoechst 33342是在羟基苯甲醛侧(左侧)的C3胺，例如通过以下合成方案制备：
该化合物(17)，3-[4-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-(2,5'-双-1H-苯并咪唑)-2-基]-苯氧基-丙胺(3-[4-(5-(4-methyl-1-piperazinyl)-(2,5'-bis-1H-benzimidazol)-2-yl]-phenoxy-propylamine)，在本文中也可称为L-Hoechst-C3。
根据本公开使用的另一种改性Hoechst 33342是在哌嗪侧(右侧)的C2胺，例如根据以下合成方案制备：
该化合物(12)，2'-(4-乙氧苯基)-6-(4-氨乙基-1-哌嗪基)-2,6'-双-1H-苯并咪唑(2'-(4-Ethoxyphenyl)-6-(4-aminoethyl-1-piperazinyl)-2,6'-bis-1H-benzimidazole)，在本文中也可称为R-Hoechst-C2。
经改性的单Hoechst或单咪唑Hoechst可用C2胺基、C2胺基或C4胺基在羟基苯甲醛侧(左侧)进行改性。根据本公开使用的改性单Hoechst是在羟基苯甲醛侧(左侧)的C3-胺，例如根据以下合成方案制备：
该化合物(7)，3-[4-(6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H-苯并咪唑-2-基]-苯氧基-丙胺(3-[4-(6-(4-methyl-1-piperazinyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-phenoxy-propylamine)，在本文中也可称为单Hoechst-C3。
当亚甲基蓝与珠结合时(例如单羧基亚甲基蓝与氨基琼脂糖珠结合)，由于亚甲基蓝带正电荷，因此可以预期它会与DNA以及蛋白质结合，诸如牛血清白蛋白(BSA)(一种球状蛋白质)。然而，据发现，亚甲基蓝在用于去除DNA的色谱分析中表现出色，令人惊讶，因为发现亚甲基蓝与DNA结合，但不与蛋白质结合。因此，可以从进料流中去除和离析DNA，而不需要也去除蛋白质。可从亚甲基蓝中洗脱DNA，并可任选地回收用于进一步检测和/或处理。
当偶联的表面亲和配体是与琼脂糖珠结合的改性亚甲基蓝时，样品中至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或约70％至约95％的靶标大分子可以与亲和配体结合。当靶标大分子是DNA时，改性亚甲基蓝可结合样品中约70％至约85％或约70％至约80％的DNA。
当偶联的表面亲和配体是与琼脂糖珠结合的改性Hoechst染料时，样品中至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、约70％至约99％、约80％至约99％、约85％至约98％的靶标大分子可与亲和配体结合。当靶标大分子是DNA时，改性Hoechst染料可结合样品中约70％至约99％、约80％至约99％、或约85％至约98％的DNA。当靶标大分子是DNA时，与珠或膜偶联的Mono-Hoechst-C2-6、L-Hoechst-C2-6或R-Hoechst-C2-6可结合样品中约70％至约99％、约80％至约99％、或约85％至约98％的DNA。当靶标大分子是DNA时，与珠偶联的Mono-Hoechst-C3、L-Hoechst-C3或R-Hoechst-C3可结合样品中约70％至约99％、约80％至约99％、或约85％至约98％的DNA。
当偶联的表面亲和配体是与琼脂糖珠结合的改性噻唑橙时，样品中至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、约60％至约99％、约70％至约99％、约70％至约95％的靶标大分子可与亲和配体结合。当靶标大分子是DNA时，改性噻唑橙可结合样品中约60％至约95％、约70％至约90％、或约75％至约85％的DNA。当靶标大分子是DNA时，与珠或膜偶联的TO-C2-8可结合样品中约60％至约95％、约70％至约90％、或约75％至约85％的DNA。当靶标大分子是DNA时，与珠偶联的TO-C3-6可结合样品中约60％至约95％、约70％至约90％、或约75％至约85％的DNA。
当偶联的表面亲和配体是与琼脂糖珠结合的改性噁唑黄时，样品中至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、约60％至约99％、约70％至约99％、约70％至约95％的靶标大分子可与亲和配体结合。当靶标大分子是DNA时，改性噁唑黄可结合样品中约60％至约98％、约70％至约95％、或约80％至约95％的DNA。当靶标大分子是DNA时，与珠或膜偶联的YO-C2-8可结合样品中约60％至约98％、约70％至约95％、或约80％至约95％的DNA。当靶标大分子是DNA时，与珠偶联的YO-C3可结合样品中约60％至约98％、约70％至约95％、约80％至约95％、或约85％至约95％的DNA。
当亲和配体与表面偶联时，可计算密度，即每体积固体表面的亲和配体数量(μg/mL)。密度越高，可用于结合靶标大分子的亲和配体越多。染料配体密度的范围可以是约5μg/mL至约50μg/mL，或约6μg/mL至约45μg/mL。
在制备偶联的表面亲和配体后，将其放置于容器中，用于选定的分离过程。根据本公开，可以使用由本领域中已知的任何材料(例如玻璃、塑料或金属)制成的任何容器，诸如柱、器皿、桶、碗、圆筒、圆锥形容器。容器只需要选择与正在实施的分离科学的过程一起工作。
在将偶联的表面-亲和配体放置于容器中之后，本公开的方法包括将样品(其中该样品含有靶标大分子和一种或多种核酸和其它污染物的任何其它组合)引入到容器中，使得样品和偶联的表面-亲和配体接触(例如混合或组合)，使得偶联的表面-亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中靶标大分子与亲和配体结合。当含有靶标大分子的样品或进料流与亲和配体一起孵育时，亲和配体结合到表面并捕获靶标大分子。样品和亲和配体必须孵育，即保持接触一段停留时间，这是靶标大分子发现并随后与亲和配体结合所需的时间量。当结合反应较慢时，停留时间较大；当靶标大分子与亲和配体的结合反应较快时，停留时间较低。如本领域中容易理解的，结合发生所需的时间基于偶联的结合动力学，并且对于每种偶联可能是不同的。停留时间可以是约0.1分钟至约180分钟、约0.1分钟至约120分钟或约0.1分钟至约90分钟。
在停留时间之后，结合靶标大分子的偶联表面亲和配体可以通过本领域已知的任何方式与从中去除了靶标大分子的样品分离。例如，当使用色谱法时，液体样品或洗脱液可以从柱中排出，其中留下固体。当使用批处理色谱法时，可将样品排出或从容器中取出固体。
在该分离之后，可以从偶联的表面-亲和配体上洗脱靶标大分子，并通过本领域已知的任何方式回收用于进一步研究和/或处理。这可以称为低核苷酸的亲和配体纯化(与去除污染物相反)。
分离和回收靶标大分子后，可以通过本领域已知的任何方法进行定量(即测定样品中靶标大分子的量)。
另一个实施方案是从含有靶标大分子和其它污染物、核酸、寡核苷酸或其组合的样品中分离和回收靶标大分子的方法。该方法包括以下步骤:(a)选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将含有靶标大分子的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中靶标大分子与容器中的亲和配体结合；和(e)将剩余样品与偶联靶标大分子(即固体)的偶联的表面亲和配体分离。
在该分离之后，可以从偶联的表面-亲和配体上洗脱靶标大分子，并通过本领域已知的任何方式回收用于进一步研究和/或处理。这可以称为低核苷酸的亲和配体纯化(与去除污染物相反)。
还公开了从含有DNA和其它核酸或低核苷酸的样品中离析和去除DNA的方法，包括以下步骤：(a)选择结合DNA的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将所述样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中DNA与亲和配体结合；和(e)将与DNA结合的偶联表面亲和配体与从中去除了了DNA的样品分离。所述DNA可以是单链或双链DNA。从样品中离析和去除DNA的方法还可包括以下步骤：从偶联的表面亲和配体中洗脱和回收DNA。
还公开了从含有RNA和其它核酸或低核苷酸的样品中离析和去除RNA的方法，包括以下步骤：(a)选择结合RNA的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将所述样品引入偶联的表面-亲和配体，并使偶联的表面-亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中RNA与亲和配体结合；和(e)将与RNA结合的偶联表面亲和配体与从中去除了所述RNA的样品分离。所述RNA可以是信使RNA。它可以是单链或双链RNA或信使RNA。从样品中离析和去除RNA的方法还可包括以下步骤：从偶联的表面亲和配体中洗脱和回收RNA。
另一个实施方案是通过选择优先结合双链DNA的亲和配体，从含有双链DNA和其它核酸的样品(例如含有单链和双链DNA的样品)中离析和去除双链DNA的方法。该方法包括以下步骤：(a)选择将会与双链DNA结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将含有双链DNA的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中双链DNA与容器中的亲和配体结合；和(e)通过本领域已知的任何方式从与双链DNA偶联的偶联表面亲和配体分离剩余的样品。
另一个实施方案是通过选择优先结合双链RNA的亲和配体，从含有双链RNA和其它核酸的样品(例如含有单链和双链RNA的样品)中离析和去除双链RNA的方法。该方法包括以下步骤：(a)选择将会与双链RNA结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将含有双链RNA的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中双链RNA与容器中的亲和配体结合；和(e)通过本领域已知的任何方式从与双链RNA偶联的偶联表面亲和配体分离剩余的样品。
另一个实施方案是通过选择优先结合单链DNA但不结合双链DNA的亲和配体，从含有单链DNA和其它核酸的样品(例如含有单链和双链DNA的样品)中离析和去除单链DNA的方法。该方法包括以下步骤：(a)选择将会与单链DNA结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将含有单链DNA的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中单链DNA与容器中的亲和配体结合；和(e)通过本领域已知的任何方式从与单链DNA偶联的偶联表面亲和配体分离剩余的样品。
另一个实施方案是通过选择优先结合单链RNA但不结合双链RNA的亲和配体，从含有单链RNA和其它核酸的样品(例如含有单链和双链RNA的样品)中离析和去除单链RNA的方法。该方法包括以下步骤：(a)选择将会与单链RNA结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将含有单链RNA的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中单链RNA与容器中的亲和配体结合；和(e)通过本领域已知的任何方式从与单链RNA偶联的偶联表面亲和配体分离剩余的样品。
另一个实施方案是通过选择优先结合信使RNA但不结合样品中其它核酸的亲和配体，从含有其它类型RNA(双链和/或单链)和/或DNA(双链和/或单链)和/或其它核酸的样品中分离和去除信使RNA(双链和/或单链)的方法。该方法包括以下步骤：(a)选择将会与信使RNA结合的亲和配体；(b)将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；(c)将偶联的表面亲和配体放置于容器中；(d)将含有信使RNA的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中信使RNA与容器中的亲和配体结合；和(e)通过本领域已知的任何方式从与信使RNA偶联的偶联表面亲和配体分离剩余的样品。
使用与这些实施方案(使用方法)相关的术语具有与上述相同的含义和定义。
通过下面的实施例更充分地显示本发明的特征和优点，这些实施例是为了举例说明的目的而提供的，而不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
合成了与亚甲基蓝偶联的琼脂糖珠，并用于径向流动色谱。当将含有DNA和蛋白质混合物的样品放置于色谱柱中并在流经色谱柱之前静置所需的停留时间时，与亚甲基蓝偶联的琼脂糖珠结合了样品中约80％的DNA。通过FPLC分析，少量材料(100μL)以及1mL树脂的放大试验均清楚地显示了结合相互作用。同时，阴性对照没有DNA非特异性结合。使用这种新设计的基质时，DNA的饱和水平仍有待确定。但是，当使用>310mg/mL的DNA浓度时，可能会出现DNA结合百分比水平下降的趋势。非常小的DNA片段也会导致DNA结合百分比下降。我们试图通过超滤排除最小的DNA片段(排除小于10kDa的片段)，于是检测到改善。
接下来，将与单羧基亚甲基蓝偶联的琼脂糖珠与1mg/mL的BSA溶液一起孵育，以确定嵌入染料是否与蛋白质相互作用。亚甲蓝琼脂糖或阴性对照均未检测到蛋白结合。
总之，合成了与亚甲基蓝偶联的琼脂糖树脂，其能够结合较大的DNA链，但不与蛋白质相互作用。
图1A和图1B显示了在两种浓度的MCMB珠状琼脂糖凝胶(30μg MCMB/mL凝胶和65μgMCMB/mL凝胶，MCMB＝单羧基亚甲基蓝)中未处理和“超滤”的DNA(大小<50bp)的对比图：图1A＝与凝胶结合的DNA占加入总DNA的％，图1B＝凝胶结合DNA的能力(以μg DNA/mL凝胶计)。黑色＝MCMB-琼脂糖；灰色＝对照(凝胶上不存在MCMB)。
图2A和B是使用不同大小的DNA对DNA结合和凝胶结合DNA的能力的对比图：图2A＝与凝胶结合的DNA占加入总DNA的％，图2B＝凝胶结合DNA的能力(以μg DNA/mL凝胶计)。白色＝天然琼脂糖珠w/o氨基；黑色＝氨基官能化琼脂糖珠；灰色＝DNA，浓度<50bp或<2000bp。给定浓度(64.8和69)为μg MCMB/mL凝胶。
图3A-3D显示了控制的结果：不同浓度(各50μL)的DNA通过1mL FPLC柱(填充天然琼脂糖珠)时260nm处的吸收和电导率。图表显示对于四种不同DNA浓度(3A＝3.3mg/mL，3B＝1.5mg/mL，3C＝0.33mg/mL，3D＝0.15mg/mL)没有发生结合，且与浓度无线性关系(参见左侧刻度上的峰高)。
图4是将DNA(2.5mg/mL TRIS，各50μL)加载到1mL FPLC柱上的图，该柱填充有氨基琼脂糖珠(浅蓝色)或天然琼脂糖珠(浅橙色，均为左手刻度，高斯曲线为260nm处的吸收)上面的“连续的”曲线为电导率(右手刻度)。
图5显示了将DNA(2.5mg/mL TRIS，各50μL)加载到1mL填充MCMB琼脂糖珠的FPLC柱上的结果。第一次加载(实心黑色)显示通过柱的DNA明显减少，第二次加载(虚线黑色)由于柱饱和而更高。
表1显示了与亚甲基蓝偶联的琼脂糖珠结合的DNA量。NK1＝氨基琼脂糖珠，具有30％的DNA结合(推测为离子相互作用)，NK2＝天然琼脂糖珠，基本上没有DNA结合。第一次加载时，样品中88％的DNA被结合，第二次加载时，50％被结合(推测是由于饱和)。
表1
表2显示了与亚甲基蓝偶联的琼脂糖珠结合的BSA蛋白质。NK1氨基-琼脂糖3.9％结合，NK2天然-琼脂糖5.5％结合，MCMB-琼脂糖基本上零BSA结合，MCMB-琼脂糖具有42微克先前结合的DNA 11％结合的BSA。BSA蛋白质与配体之间似乎没有相互作用，与阳离子氨基或阴离子DNA存在一些离子结合。5.5％BSA的天然琼脂糖结合被认为是由于与树脂的少量非特异性相互作用。
表2
实施例2：TO-I的合成
噻唑橙-丙基碘(Thiazolorange-propyliodide)(TO-I)的合成如下：
将1.84S-甲基-苯并噻唑-甲苯磺酸酯(S-methyl-Benzthioxazole-tosylate)(5.0mmol)与2.20mg碘化勒皮啶(Lepidine-iodide)(5.0mmol)混合，然后将混合物溶于10ml EtOH中。加入0.5ml Et3N，混合物颜色立即变成红色，变成深棕红色。将溶液在60℃下搅拌60min，然后在室温下放置12h。将所得的细沉淀进行真空过滤，并进行真空干燥。共获得1.95g纯产物→产率67％
UV(MeOH)：λmax 506nm
HPLC：色谱柱Nucleosil(Nucleosil)100，C18，5μm，MeCN/H2O(98:2)，Rt 18.8min
MALDI：m/z：459.8(C21H20IN2S+)
1H-NMR(DMSO-d6)：2.35(m,2H),3.33(s,3H),3.95(m,2H),4.55(m,2H),6.79(s,1H),7.20(d,1H),7.34(tr,1H),7.53(tr,1H),7.67(2d,2H),7.92(tr,1H),7.96(d,1H),7.90(tr,1H),8.02(d,1H),8.53(d,1H),8.71(d,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：2.3,32.5,33.9,54.4,88.2,107.7,112.9,117.6,122.7,123.8,124.0,124.4,125.8,126.6,128.0,133.1,136.8,140.2,144.1,148.2,159.9。
TO-I被结合到琼脂糖珠上，然后用于结合DNA。
实施例3：TO-C3和YO-C3的合成
噻唑橙通过引入反应性接头(例如含有氨基的接头)进行改性。在通过之前被认为是正确的工艺合成TO-C3的尝试失败之后，按以下合成了TO-C3：
TO-和YO-C3-胺(1)和(2)
N-Boc-1-(3-氨丙基)溴化勒皮啶(N-Boc-1-(3-aminoproyl)lepidium bromide)
(3)
将5.8g(24.5mmol)N-Boc-3-溴丙胺和2.3g(16.1mmol)勒皮啶在50-60℃下在无任何溶剂下均匀溶解16h。剩余的反应混合物用乙酸乙酯萃取数次，直至观察到固体沉淀。过滤该固体并进行真空干燥。分离出4.8g N-Boc-溴化勒皮啶(3)(产率78％)。
N-Boc-TO-C3-胺(9)
将400mg(1.09mmol)N-Boc-勒皮啶(3)和1.12g(3.05mmol)甲苯磺酸-苯并噻唑(benzothiazol-tosylat)(4)(Thompson,M.,“Synthesis,photophysical effects,andDNA targeting properties of oxazole yellow-peptide bioconjugates,”Bioconjugate Chem.2006,17,507-513)在室温(rt.)下溶于50ml CH2Cl2中。室温下滴加2.0ml(14mmol)Et3N。出现了深红色。60分钟后通过TLC检测反应结束。在真空(i.vac.)下去除溶剂，并将剩余的残留物通过sc-色谱法(CHCl3/MeOH(100/0→100/5))进行纯化。
Rf：0.7(CHCl3/MeOH/水溶液NH3：70/28/2)
MALDI：m/z：348,2(C21H21N3S+：M-CO2tBu)
离析出340mg的N-Boc保护的10(产率59％)。
1-(3-氨丙基)-4-{[3-甲基-23-二氢-13-苯并噻唑-2-亚基]甲基}喹啉-1-氯化鎓
(TO-C3)(1)
将400mg(0.76mmol)N-Boc保护的9溶于20ml无水(abs.)MeOH中。用HCl/MeOH将透明溶液酸化，并使之在室温下搅拌16h。在真空下去除溶剂。将剩余的残留物用乙酸乙酯萃取数次，过滤并在进行真空干燥。
离析出250mg TO-C3(1)(产率86％)。
Rf：0.45(CHCl3/MeOH/水溶液NH3：70/28/2)
UV(MeOH)：λmax 506nm
HPLC：色谱柱Nucleosil 100，C18，5μm，MeCN/H2O(98:2)，Rt 11.4min
MALDI：m/z：348,2(C21H22N3S+)
1H-NMR(dmso-d6)：2.14(五重峰,J＝7.2Hz,2H),2.87(tr,J＝7.1Hz,2H),4.03(s,3H),4.73(tr,J＝7.3Hz,2H),6.95(s,1H),7.39(d,J＝7.2Hz,1H),7.43(tr,J＝7.3Hz,1H),7.62(tr,J＝7.1Hz,1H),7.75(tr,J＝7.6Hz,1H),7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.99(tr,J＝8.2Hz,1H),8.06(d,J＝7.2Hz,1H),8.21(d,J＝8.7Hz,1H),8.74(d,J＝6.8Hz,1H),8.81(d,J＝8.1Hz,1H)。
13C-NMR(dmso-d6)：27.0,33.9,36.0,51.2,88.3,107.9,113.1,118.1,122.9,123.9,124.3,124.6,125.9,126.8,128.2,133.3,137.0,140.5,144.2,148.6,160.4。
1-(3-氨丙基)-4-{[3-甲基-2,3-二氢-1,3-苯并噁唑-2-亚基]甲基}喹啉-1-氯化
鎓(YO-C
3
)(2)
将400mg(0.76mmol)N-Boc保护的10溶于20ml无水MeOH中。用HCl/MeOH将透明溶液酸化，并使之在室温下搅拌16h。在真空下去除溶剂。将剩余的残留物用乙酸乙酯萃取数次，过滤并进行真空干燥。
离析出250mg TO-C3(2)(产率86％)。
Rf：0.45(CHCl3/MeOH/水溶液NH3：70/28/2)
UV(MeOH)：λmax 580nm
HPLC：色谱柱Nucleosil 100，C18，5μm，MeCN/H2O(98:2)，Rt 10.7min
MALDI：m/z：332,5(C21H22N3O+)
1H-NMR(dmso-d6)：(dmso-d6):2.18(五重峰,J＝7.3Hz,2H),2.91(sext,J＝6.0Hz,2H),3.87(s,3H),4.74(tr,J＝7.3Hz,2H),6.30(s,1H),7.39(tr,J＝7.8Hz,1H),7.48(tr,J＝7.6Hz,1H),7.64(d,J＝7.9Hz,1H),7.72(tr,J＝7.6Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.93(d,J＝7.2Hz,1H),7.97(tr,J＝7.2Hz,1H),8.18(d,J＝8.7Hz,1H),8.62(d,J＝7.2Hz,1H),8.78(d,J＝8.4Hz,1H)。
13C-NMR(dmso-d6)：26.8,30.5,35.9,50.9,74.2,109.1,110.7,110.9,117.9,123.4,124.3,125.9,126.2,126.5,131.3,133.3,137.1,143.4,146.1,150.0,161.5。
实施例4：现有技术的对比合成方案
在现有技术中，作者教导可以根据下面提出的合成方案制备TO-C3和YO-C3。关于噻唑橙胺1(TO-胺1)，一份报告收集了1H--NMR和13C-NMR光谱信号的化学位移，但未给出赋值(Pham,H.H.,et al.,“Bichromophoric dyes for wavelength shifting of dye-proteinfluoromodules,”Org.Biomol.Chem.2015,13,3699–3710)，而其他报告公布了该化合物的错误数据(Brenner,S.,et al.,“Fluorescent molecular motors,”PCT Int.Appl.2014,WO 2014051521,A1 20140403；Fei,X.,et al.,“Thiazole orange derivatives:synthesis,fluorescence properties,and labeling cancer cells,”Bioorg.Med.Chem.009,17,585-591；Fei,X.,et al.,“Solid-phase synthesis andmodification of thiazole orange and its derivatives and their spectralproperties,”J.Comb.Chem.2007,9,943-950)。已经进行实验，制备得到脒化合物7和8，而不是所需的TO-C3和YO-C3。在本实验中，甲苯磺酸S-甲基-苯并噻唑(4)是过量的，并在溴化勒皮啶的右侧和左侧发生反应。
1-(3{[-3-甲基-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]氨基}丙基)-4-{[3-甲基-2,3-
二氢-1,3-苯并噻唑-2-亚基]甲基}喹啉-1-溴化鎓(1-(3{[-3-methyl-2,3-dihydro-1,3-
benzothiazol-2-ylidene]amino}propyl)-4-{[3-methyl-2，3-dihydro-1，3-
benzothiazol-2-ylidene]methyl}quinoline-1-ium bromide)(TO-C3-脒)(7)
将1.26g(3.6mmol)甲苯磺酸S-甲基-苯并噻唑(4)(Zhang,T.H.；He,H.X；Du,J.L.；He,Z.J.Yao,S.Molecules,2018,23,2011-2024)和980mg(3.5mmol)勒皮啶溴化物(10)(Gromov,S,P.et al.,“Synthesis,Structure,and Properties of SupramolecularPhotoswitches Based on Ammonioalkyl Derivatives of Crown Ether Styryl Dyes,”J.Org.Chem.2014,79,11416-11430)悬浮在20ml CH2Cl2中。滴加2.0ml(14mmol)Et3N。将该深红色反应混合物再搅拌60分钟。通过TLC检测反应结束。用饱和NH4Cl和Na2CO3水溶液萃取反应混合物。分离有机相，干燥(Na2SO4)，过滤，并真空蒸发溶剂。通过结晶(乙醇)纯化剩余的残留物。离析出750mg TO-C3-脒7(产率43％)。
Rf：(CHCl3/MeOHNH3：85/15)
UV(MeOH)：λmax 506nm
HPLC：色谱柱Nucleosil 100，C18，5μm，MeCN/H2O(98:2)，Rt 13.8min
MALDI：m/z：495.4(C29H27N4S2 +)
1H-NMR(DMSO-d6)：2.24(五重峰,J＝5.9Hz,2H),3.16(s,3H),3.17(m,2H),4.00(s,3H),4.76(tr,J＝6.7Hz,2H),6.86(tr,J＝7.5Hz,1H),6.87(s,1H),6.99(d,J＝7.9Hz,1H),7.10(dtr,J＝1.0,7.3Hz,1H),7.23(d,J＝7.1Hz,1H),7.41(tr,J＝7.5Hz),7.46(d,J＝6,9Hz,1H),7.61(dtr,J＝7.3Hz,1H),7.74(tr,J＝7.5Hz,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.99(tr,J＝8.1Hz,1H),8.22(d,J＝8.7Hz,1H),8.31(s,1H),8.59(d,J＝7.2Hz,1H),8.77(d,J＝8.9Hz,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：29.6,33.7,50.7,53.1,79.2,88.0,107,7,109.0,112.9,118.3,120.6,121.2,122.3,122.8,123.9,124.3,124.4,125.7,126.3,126.7,128.1,133.1,137.2,140.4,140.6,144.6,148.5,154.7,159.9。
1-(3{[-3-甲基-2,3-二氢-1,3-苯并噁唑-2-亚基]氨基}丙基)-4-{[3-甲基-2,3-
二氢-1,3-苯并噁唑-2-亚基]甲基}喹啉-1-溴化鎓(YO-C3-脒)(8)
将1.35g(3.8mmol)甲苯磺酸S-甲基-苯并噁唑(5)(Gromov,S,P.et al.,“Synthesis,Structure,and Properties of Supramolecular Photoswitches Based onAmmonioalkyl Derivatives of Crown Ether Styryl Dyes,”J.Org.Chem.2014,79,pp.11416-11430)和980mg(3.5mmol)溴化勒皮啶(10)悬浮于20ml CH2Cl2中。滴加2.0ml(14mmol)Et3N。将该深红色反应混合物再搅拌60分钟。通过TLC检测反应结束。用饱和NH4Cl和Na2CO3水溶液萃取反应混合物。分离有机相，干燥(Na2SO4)，过滤，并真空蒸发溶剂。离析出750mg(产率36％)。
Rf：(CHCl3/MeOHNH3：85/15)
UV(MeOH)：λmax 580nm
HPLC：色谱柱Nucleosil 100，C18，5μm，MeCN/H2O(98:2)，Rt 10.7min
MALDI：m/z：331.2(C21H21N3O+)：M-(N-Me-苯并噁唑)
1H-NMR(dmso-d6)：2.13(五重峰,J＝6.0Hz,2H),3.13(s,3H),3.41(tr,J＝6.0Hz,2H)3.82(s,3H),4.70(tr,J＝6.0Hz,2H),6.82(m,J＝6.0Hz,1H),6.96(m,J＝6.0Hz,1H),7.00(p,J＝6.0Hz,1H),7.17(p,J＝6.0Hz,1H),7.33(tr,J＝6.0Hz,1H),7.43(tr,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝7.9Hz,1H),7.67(tr,J＝6.0Hz,1H),7.67(d,J＝6.0Hz,1H),7.73(d,J＝7.2Hz,1H),7.92(tr,J＝6.0Hz,1H),8.14(d,J＝8.7Hz,1H),8.33(s,1H),8.50(d,J＝7.2Hz,1H),8.71(d,J＝8.7Hz,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：28.3,29.6,30.5,42.2,52.4,73.6,79.2,107.4(br),108.6,110.5,110.7,118.0,120.3(br),123.3,123.6(br),125.8,126.3,126.0,126.3,131.1,132.0,133.1(br),137.2,143.8,143.8,145.9,149.7.3,161.2。
实施例5：3-[4-(6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H-苯并咪唑-2-基]-苯氧基-丙胺(3-[4-(6-(4-methyl-1-piperazinyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-phenoxy-propylamine)(单Hoechst-C3)的合成
N-Boc-(4-甲酰苯氧基)丙胺(N-Boc-(4-formylphenoxy)propylamine)(4)((Liu，Y.，et al.“A“Double-Locked”and enzyme-activated molecular probe for accuratebioimaging and hepatopathy differentiation,”Chemical Science 2019,10(47),10931-10936.)
将960mg(11.7mmol)4-羟醛2、2.52g(8mmol)K2CO3和2.36g(10.0mmol)N-Boc-3-溴丙胺1在3ml干燥DMF中加热16h。用100ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用饱和NaCl溶液萃取2-3次。分离有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并真空蒸发。离析出2.47g N-Boc保护的醛4(产率88％)。
Rf：～0.5(CHCl3/乙酸乙酯：88/12)
C15H21NO4(279.3)
MS-ESI：280(M+1)，265(M-CH3)，223(M-tBu)，
N-Boc-3-(4-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-苯氧基)丙基-1-胺 (N-Boc-3-(4-(6-(4-Methylpiperazin-1-yl)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-phenoxy) propyl-1-amine)(6)(Ranjan,N.,et al.,“Selective Inhibition of Escherichia coliRNA and DNA Topoisomerase I by Hoechst 33258Derived Mono-andBisbenzimidazoles,”J.Med.Chem.2017,60,4904-4922.)
将385g(2.0mmol)Na2S2O5溶于2ml H2O中，并将1.06g(3.8mmol)N-Boc保护的醛4溶于5ml EtOH中加入到该水溶液中。观察到黄灰色沉淀。向醛悬浮液中加入620mg(3mmol)哌嗪基二胺5的50ml EtOH溶液。将橙棕色混悬液在60℃加热1-2h。通过TLC检测反应完成。
Rf：～(CHCl3/MeOH/水溶液NH3：80/16/4)
UV：λmax 326nm，λmax 272nm。
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 11.8min
C26H35N5O3(465.6)
MS-MALDI：466.7(M+1)，443(M-43(NC2H5))
3-(4-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-苯氧基)丙基-1-胺(3-(4-
(6-(4-Methylpiperazin-1-yl)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-phenoxy)propyl-1-amine)
(7)
将930mg N-Boc保护的苯并咪唑6(2mmol)溶于10ml MeOH中。用HCL/MeOH将该溶液酸化。在室温下储存24小时后，通过TLC检测到完全脱保护。从反应混合物中结晶出单Hoechst-C3 7。过滤离析出400mg(产率55％)。
UV：λmax 326nm，λmax 272nm
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 3.1min
C21H27N5O(365.5)
MS-MALDI：366.1(M+1)，309(M-57(NC3H7))
1H-NMR(dmso-d6)：2.09(五重峰,J＝Hz,2H),2.30(s,3H),2.60(m,4H),2.95(tr,J＝Hz,2H),3.16(m,4H),4.15(tr,J＝Hz,2H),6.91(m,2H),7.07(d,J＝Hz,2H),7.42(m,J＝Hz,1H),8.11(d,J＝Hz,2H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：
实施例6：2'-(4-乙氧苯基)-6-(4-氨乙基-1-哌嗪基)-2,6'-双-1H-苯并咪唑(2'-(4-Ethoxyphenyl)-6-(4-aminoethyl-1-piperazinyl)-2,6'-bis-1H-benzimidazole)(R-Hoechst-C2)的合成
5-[4-(2-N-Boc-氨乙基)哌嗪基]-2-硝基苯胺(5-[4-(2-N-Boc-aminoethyl)
piperazinyl)]-2-nitroanilin)(8)
将2.0g(11.6mmol)5-氯-2-硝基苯胺、2.0g(14.4mmol)K2CO3和4.0g(17.5mmol)1-(2-N-Boc-氨乙基)哌嗪悬浮于2.0ml干燥DMF中。将该悬浮液在140-150℃下搅拌24小时。将冷却的反应混合物溶于100ml乙酸乙酯中，并用饱和NaCl溶液萃取3次。分离有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并真空蒸发。将剩余的残留物通过sc-色谱法(MeOH/CHCl3：1/9)纯化。离析出4.12g N-Boc保护的2-硝基苯胺8(产率97％)。
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 15.3min
C17H27N5O4(365.2)
MS-MALDI：366.1(M)，350.2(M-Me)，310(M-C4H8)
(N-Boc-氨乙基)-Hoechst 33342(11)
将3.0g(8.2mmol)N-Boc保护的2-硝基苯胺8溶于160ml乙醇中，并加入0.7g 10％Pd/C。将混合物在氢气气氛下搅拌5-6小时。通过TLC观察还原完全完成。过滤催化剂(硅藻土)后，立即使用N-Boc保护的二胺10溶液，无需进一步纯化。
同时将75ml含有3.2g(12mmol)Hoechst醛9(Nimesh,H.al.,“Synthesis andBiological Evaluation of Novel Bisbenzimidazoles as Escherichia coliTopoisomerase IA Inhibitors and Potential Antibacterial Agents,”J.Med.Chem.2014,57,5238-5257；Chandrika,N.T.et al.,“Synthesis andInvestigation of Novel Benzimidazole Derivatives as Antifungal Agents,”S.Bioorg.Med.Chem.2016,24,3680-3686)的乙醇溶液加入到3.0ml含有1.23g(6.5mmol)Na2S2O5的H2O溶液中。出现白色/灰色沉淀。
向该悬浮液中加入二胺10的粗还原混合物。将所得橙棕色悬浮液加热至70℃进行2h。DC对照表明N-保护的二胺10完全转化。加入硅藻土，并真空蒸发溶剂。通过sc-色谱法纯化固体残留物。
梯度乙酸乙酯/MeOH(100/0→80/20)。离析出4.76g N-Boc保护的Hoechst 11(产率100％)。
Rf：～0.5(乙酸乙酯/MeOH/水溶液NH3：70/28/2)
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 14.4min
C33H39N7O3(581.7)
MS-MALDI：582.1(M)，451.7(M-BocHN-CH2)
2'-(4-乙氧苯基)-6-(4-氨乙基-1-哌嗪基)-2,6'-双-1H-苯并咪唑(2'-(4-
Ethoxyphenyl)-6-(4-aminoethyl-1-piperazinyl)-2，6'-bis-1H-benzimidazole)(12)
将2.0N-Boc保护的Hoechst胺11(3.44mmol)溶于20ml EtOH中，并用HCl/MeOH酸化。室温下24小时后，过滤并干燥得到的沉淀。离析出1.91g Hoechst胺12·3HCl(94％)。
Rf：～0.5(乙酸乙酯/MeOH/水溶液NH3：40/50/10)硅胶
～0.5(CHCl3/MeOH/水溶液NH3：70/22/8)硅胶
～0.8(CHCl3/MeOH/水溶液NH3：70/22/8)Al2O3
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 11.8min
C28H31N7O(481.6)
MS-MALDI：482.7(M+1)，451.5(M-(N-CH2))
1H-NMR(DMSO-d6)：1.37(tr,J＝7.0Hz,3H),3,26(m,4H),3.38(q,J＝7.0Hz,1H),3.42(q,J＝7.0Hz,1H),3.48(tr,J＝7.0Hz,1H),3.66(d,J＝7.0Hz,1H),3.90(d,J＝7.0Hz,1H),3.92(m,1H),4.17(q,J＝7.0Hz,1H),7.21(d,J＝8.8Hz,2H),7.22(m,1H),7.36(ddd,J＝2.1,5.8,8.4Hz,1H),7.72(dd,3.5,5.5Hz,1H),7.97(d,J＝8.5Hz,1H),8.37(m,1H),8.38(d,J＝8.7Hz,2H),8.76(s,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：15.0,33.9,46.5,51.3,51.7,53.3,55.5,64.2,99.3,99.5,114.9,115.8,117.6,124.1,127.0,130.4,133.7,138.2,148.5,149.0,149.1,153.2,162.5。
实施例7：3-[4-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-(2,5'-双-1H-苯并咪唑-2-基]-苯氧基-丙胺(3-[4-(5-(4-methyl-1-piperazinyl)-(2,5'-bis-1H-benzimidazol-2-yl]-phenoxy-propylamine)(L-Hoechst-C3)的合成
N-甲氧基-N-甲基-3,4.二氨基苯甲酰胺(13)
2-(4-N-Boc-苯氧基-丙胺)-苯并咪唑-5-羧酸甲氧基-甲基酰胺(2-(4-N-Boc-
phenoxy-propylamine)-benzimidazole-5-carboxylic acid methoxy-methylamide)(14)
在氢气氛下，将2.6g的3.4-二硝基苯甲酸的Weinreb酰胺(Weinrebamide)(10.2mmol)还原，定量得到相应的N-甲氧基-N-甲基-3.4.二氨基苯甲酰胺13(10.2mmol)。在与N-Boc保护的醛4的反应中使用该还原溶液而不进行任何进一步纯化。
将100ml含4.2g N-Boc保护的醛4(15mmol)的EtOH溶液加入到3ml含1.54g(8.1mmol)Na2S2O5的H2O溶液中。观察到黄灰色沉淀。将所得悬浮液在室温下再搅拌15分钟。将过滤后的10.2mmol N-甲氧基-N-甲基-3.4.二氨基苯甲酰胺13的EtOH还原溶液加入到该悬浮液中，并将反应混合物在65℃下加热30分钟。通过TLC(乙酸乙酯)检测反应完成。通过真空去除溶剂。并将剩余的残留物用sc-色谱法通过梯度CHCl3/乙酸乙酯：100/0→0/100纯化。
离析出4.0g Weinreb酰胺14(两个反应步骤的产率为86％)
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 16.3min
C24H30N4O5(454.2)
MS-MALDI：455.8(M+1)，399(M-56(C4H8))
2-(4-N-Boc-苯氧基-丙胺)-苯并咪唑-5-甲醛(2-(4-N-Boc-phenoxy-
propylamine)-benzimidazole-5-carbaldehyde)(15)
将1.3g N-Boc Weinreb酰胺14(2.9mmol)悬浮于24ml四氢呋喃和8ml乙醚中。将该悬浮液冷却至-80℃，并加入320mg(9mmol)LiAlH4。将所得悬浮液加热至-30至-15℃。通过TLC(乙酸乙酯/己烷：9/1)观察还原结束。反应混合物依次用乙酸乙酯、MeOH和饱和NH4Cl水溶液处理。分离有机相，干燥(Na2SO4)，并真空蒸发溶剂。通过sc-色谱法离析出1.05g N-Boc-醛15。(产率92％)。在随后的氧化环化中使用该醛15而不进行任何进一步纯化。
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 16.3min
C22H25N3O4(395.5)
MS-MALDI：455.8(M+1)，399(M-56(C4H8))。
2-(4-N-Boc-苯氧基-丙胺)-双(苯并咪唑)6-(4-甲基哌嗪)(2-(4-N-Boc-
phenoxy-propylamine)-bis(benzimidazole)6-(4-methylpiperazin))(16)
在氢气氛下还原470mg哌嗪基硝基苯胺3(2.0mmol)，定量得到相应的哌嗪基二胺5。在与N-Boc保护的醛15的反应中使用该还原溶液而不进行任何进一步纯化。
将30ml含1.07g N-Boc保护的醛15(2.7mmol)的EtOH加入到2ml含385mg Na2S2O5(2.0mmol)的H2O溶液中。出现灰色沉淀。让悬浮液在室温下搅拌30分钟。向该悬浮液中加入哌嗪基二胺5的溶液，并将反应混合物在60℃加热2小时。DC-对照表明哌嗪基二胺5已完全转化。加入硅藻土，并真空蒸发溶剂。将固体残留物通过sc-色谱法纯化。梯度：CHCl3/MeOH(100/0→95/5)。
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt 14.3min
C33H39N7O3(581.3)
MS-MALDI：582.1(M+1)
1H-NMR(DMSO-d6)：1.38(s,9H),1.87(sept,J＝6.6Hz,2H),2.26(s,3H),2.54(m,3H),3.12(tr,J＝6.6Hz,2H),3.13(d,J＝6.2Hz,2H),3.31(s,3H),4.07(tr,J＝6.2Hz,2H),6.91(m,2H),7.11(d,J＝7.6Hz,2H),7.59(d,J＝8.3Hz,2H),7.71(d,J＝8.4Hz,2H),7.96(d,J＝8.1Hz,2H),8.02(d,J＝8.1Hz,2H),8.13(dd,J＝3.4,8.3Hz,2H)8.21(m,),8.33(m,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：28.2,29.1,36.9,45.6,49.9,54.8,65.5,77.5,108.8,111.3,114.8,116.1,118.6,120.3,121.0,122.3,124.3,128.2,135.3,136.0,144.2,145.0,147.6,152.7,155.6,160.2。
3-[4-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-(2,5'-双-1H-苯并咪唑-2-基]-苯氧基-丙胺(3- [4-(5-(4-methyl-1-piperazinyl)-(2，5'-bis-1H-benzimidazol-2-yl]-phenoxy- propylamine)(17)(Frau,S.,et al.,New J.Chem.1995,19,873-6)
将813mg N-Boc保护的Hoechst 16(1.4mmol)溶于5ml MeOH中。用HCl/MeOH将该溶液酸化。在室温下储存24小时后，通过TLC检测到完全脱保护。产物在反应混合物中结晶。过滤离析出400mg(产率60％)。
Rf：～0.5CHCl3/MeOH/H2ONH3：2/8/0.5
HPLC：色谱柱Luna 3μ，苯基-己基，MeCN/H2O(98:2)，Rt：14.3min
C28H31N7O(481.6)
MS-MALDI：481.7
1H-NMR(DMSO-d6)：2.09(五重峰,J＝6.4Hz,2H),2.83(d,J＝3.6Hz,3H),3.00(sext,J＝5.7Hz,2H),3.22(m,4H),3.53(m,J＝8.4Hz,2H),3.89(m,J＝9.4Hz,2H),4.23(tr,J＝6.1Hz,2H),7.21(d,J＝2.0Hz,1H),7.24(d,J＝9.1Hz,2H),7.35(dd,J＝2.1,9.0Hz,1H),7.72(d,J＝9.0Hz,1H),7.98(d,J＝8.5Hz,1H),8.38(d,J＝8.6Hz,1H),8.42(d,J＝8.7Hz,2H),8.77(s,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6)：26.9,36.1,41.9,46.2,52.0.65.2,98.9,113.8,114.2,114.4,115.2,115.3,117.2,117.9,118.7,123.7,126.2,129.9,133.2,147.9,148.7,152.7,161.7。
实施例8-用亲和配体将双链DNA结合偶联的琼脂糖珠
如上所述合成了YO-C3、TO-C3、TO-C6、MCMB、单Hoechst-C3、L-Hoechst-C3和R-Hoechst-C2，并将其偶联琼脂糖珠。通过表3所示的合成路线实现了官能化琼脂糖珠与亲和配体的偶联。
表3
然后根据以下程序测试每种偶联的琼脂糖亲和配体(称为树脂)与ds(双链)DNA的结合。将100μL树脂置于微型旋转柱中，并在缓冲液(0.05M TRIS，0.5M NaCl，pH 7.1)中平衡。在室温(RT)下加入200μL ds DNA溶液(英杰公司(Invitrogen)，产品(cat.)编号：15634-017，批号：1885913)以形成悬浮液。将悬浮液在RT条件下培养90min，每隔30min在涡流器上混合一次。90min后，离心除去上清液，收集液体，并用UV光度计在260nm处测量，以检测液体中不与树脂结合的DNA量。树脂用缓冲液洗涤一次。还测量了洗涤液。在大多数情况下，仅检测到少量DNA。
如果100％的DNA与树脂结合，则260nm处的吸收为0。相反，如果没有DNA与树脂结合，吸收将是100％。因此，可以根据液体的UV吸收来测量与树脂结合的DNA量。结果见表4和图6。图6是显示了在旋转柱中，在100μl凝胶上加载含有～11-13μg ds DNA的溶液时，dsDNA结合测试树脂的结果的条形图。
表4
表5提供了本实验中所用产品的化合物和来源的更多信息。
表5
如图7所示，YO-C3、TO-C3、TO-C6、MCMB、单Hoechst-C3、L-Hoechst-C3和R-Hoechst-C3成功分离并结合了样品外的ds DNA。PEI被作为阳性对照包括在内。它是一种带正电荷氨基的亚胺聚合物，与DNA具有天然的离子相互作用。模拟黄2、模拟橙1、模拟红2、模拟红3、模拟蓝1、模拟蓝1M、模拟蓝SA HL、模拟蓝SA HL、模拟蓝2A6XL和模拟蓝AP A6XL是非DNA嵌入剂的染料。它们被作为阴性对照染料包括在内。Zetarose模拟蓝染料1FF也被作为阴性对照包括在内，其恰巧比其他非嵌入染料对DNA的亲和力更高。6％的ds DNA未与改变的琼脂糖珠结合。这是非特异性结合的作用。因此，该数据显示嵌入小分子成功且选择性地结合了DNA。
实施例9-不同染料配体密度对结合DNA的影响
染料配体密度表示每体积固体珠的数量或量。预计密度越高，与偶联的表面亲和配体结合的DNA就越多。通过用表3中所示的不同密度的树脂进行如实施例8中所解释的过程来测试该理论。结果见表6-10，并绘制在图7-11中。图7、8、9、11显示了在旋转柱中，在100μl凝胶上加载含有～12μg ds DNA的溶液将ds DNA与测试树脂结合。图10显示了在旋转柱中，在100μl凝胶上加载～18μg ds DNA的溶液，将ds DNA与偶联的琼脂糖单Hoechst-C3树脂结合。在所有这些附图中，与树脂结合的ds DNA的量与结合到对照琼脂糖珠的量作对比。
表6
| 树脂 | DNA<sub>结合</sub>％ | m DNA<sub>结合</sub>[μg] |
| 琼脂糖 | 8％ | 0.8 |
| YO-C<sub>3</sub>(13) | 78％ | 9.2 |
| YO-C<sub>3</sub>(19) | 88％ | 10.4 |
| YO-C<sub>3</sub>(29) | 91％ | 10.8 |
LJ-P1605-014，017，12.0μg dsDNA
表7
| 树脂 | DNA<sub>结合</sub>％ | m DNA<sub>结合</sub>[μg] |
| 琼脂糖 | 8％ | 0.8 |
| TO-C<sub>3</sub>(7) | 64％ | 7.5 |
| TO-C<sub>3</sub>(13) | 59％ | 7.0 |
| TO-C<sub>3</sub>(19) | 60％ | 7.1 |
LJ-P1605-014，017，12.0μg dsDNA
表8
LJ-P1605-017，12.0μg dsDNA
表9
| 树脂 | DNA<sub>结合</sub>％ | m DNA<sub>结合</sub>[μg] |
| 琼脂糖 | 3％ | 0.6 |
| 单Hoechst-C<sub>3</sub>(12) | 80％ | 14.4 |
| 单Hoechst-C<sub>3</sub>(19) | 85％ | 15.4 |
| 单Hoechst-C<sub>3</sub>(26) | 87％ | 15.7 |
LJ-P1605-027，18.1μg dsDNA
表10
| 树脂 | DNA<sub>结合</sub>％ | m DNA<sub>结合</sub>[μg] |
| 琼脂糖 | 2％ | 0.2 |
| L-Hoechst-C<sub>3</sub>(12) | 92％ | 11.0 |
| L-Hoechst-C<sub>3</sub>(18) | 90％ | 10.8 |
| L-Hoechst-C<sub>3</sub>(41) | 92％ | 11.1 |
LJ-P1605-035，12.0μg dsDNA
实施例10–DNA回收
尝试使用各种不同溶剂从表3和表4中制备和显示的偶联的表面亲和配体中回收ds DNA。包括：1)4M NaCl，2)4M NaCl和95℃，3)pH 2.0(1M甘氨酸，pH 2.0)和4)pH 10.0(2MNa2CO3，pH 10)。
表11-15站示了使用不同的回收方法和溶剂从每种树脂中分离和回收的ds DNA的量(％)。
表11：4 NaCl的回收
表12：4 NaCl、95℃时的回收
表13：pH 2.0时的回收
表14：pH 10.0时的回收
实施例11–双链(ds)和单链(ss)DNA的结合
使用DNA(0.2mL～67ug/mL的ds DNA，0.2mL～166ug/mL的ss DNA)和100uL树脂进行结合试验。测试了许多非嵌入染料(模拟黄2、模拟橙1、模拟红2、模拟红3、模拟蓝1、模拟蓝1M、模拟蓝SA HL和模拟蓝AP A6XL)、未改变的琼脂糖珠和MCMB的结合。阳性对照组为MCMB。对于ds DNA，在旋转柱中，用含有13.6μg ds DNA的缓冲液在100μL凝胶上加载样品。对于ss DNA，在旋转柱中，用含有22.1μg ss DNA的缓冲液在100L凝胶上加载样品。数据如图12和13所示。如图所示，Astrea Biosciences的模拟树脂均未结合ss DNA，仅结合了可忽略不计的量的ds DNA，而MCMB成功结合了ss DNA和ds DNA。
所有非MCMB树脂的DNA结合量均为“阴性”，因此校准中可能存在错误。阴性结果在此报告中相当于“零”。通过减去待加载样品和待洗脱DNA中的DNA测量质量计算结合的DNA。该差值就是结合的DNA。所有测量均基于260nm处的吸光度，并使用比尔定律计算DNA质量。
实施例12-蛋白质的选择性非结合性
使用模型蛋白白蛋白进行DNA结合试验，以证明偶联的琼脂糖亲和配体具有选择性非结合性。使用PEI和Astrea Biosciences的模拟树脂作为阳性对照，因为已知它们可结合白蛋白。使用用0.2ml的1mg/mL白蛋白、0.1ml树脂、90min孵育时间、室温、50mM Tris/0.5M NaCl缓冲液实进行验。
图14是显示通过选定树脂结合白蛋白的实验结果图。与TO-C3、TO-C6和MCMB偶联的琼脂糖亲和配体未表现出白蛋白结合。YO-C3显示与0.4mg白蛋白/mL树脂的结合最小。阳性对照PEI结合了几乎所有存在的白蛋白(1.8mg白蛋白/mL树脂)。尚不清楚为什么模拟树脂不会产生与PEI类似的结合值。
该实验证明，用本公开的亲和配体，蛋白质的非结合是可能的。然而，适当的选择性将取决于样品中存在的蛋白质以及使用正确的亲和配体。
虽然已经描述了目前被认为是本发明的某些期望的实施方案，但是本领域的技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可以对其进行改变和修改，并且旨在包括落入本发明的真实范围内的所有这样的改变和修改。
Claims (44)
1.从样品中分离靶标大分子的方法，包括以下步骤：
a.选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；
b.将所述亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；
c.将所述偶联的表面亲和配体放置于容器中；
d.将含有所述靶标大分子的样品引入所述偶联的表面亲和配体，并使所述偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中所述靶标大分子与亲和配体结合；和
e.将结合靶标大分子的所述偶联的表面亲和配体与从中去除了靶标大分子的样品分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标大分子是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、病毒、含有低核苷酸或寡核苷酸的蛋白质、含有低核苷酸或寡核苷酸的脂质、其它低核苷酸或寡核苷酸、其任意片段或其任意组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标大分子是DNA、RNA、其任意片段或其任意组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标大分子是双链DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和配体是嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其任意组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述亲和配体是选自由吖啶类、聚咪唑类、吲哚类、吡咯类、菲啶类、苯并噻唑-喹啉或苯并噁唑-喹啉的花菁、吩噁嗪类、吩噻嗪类、蒽醌类和呋喃香豆素类组成的组的化合物，并且其中所述化合物已被改性以包括能够将亲和配体结合到所述表面的连接基团。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
f.收集基本上不含所述靶标大分子的洗脱液。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
f.从所述偶联的表面亲和配体中洗脱并回收所述靶标大分子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括：
i.选择将会与靶标大分子结合的嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其任意组合；和
ii.改性所述嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其组合以包括连接基团，从而产生能够结合到表面的亲和配体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和配体不结合样品中的任何蛋白质。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和配体是改性吩噻嗪、改性Hoechst染料、改性的苯并噻唑-喹啉的花菁或改性的苯并噁唑-喹啉的花菁。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和配体是已被改性以包括以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基的吩噻嗪、Hoechst染料、苯并噻唑-喹啉的花菁或苯并噁唑-喹啉的花菁。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述亲和配体是单羧基亚甲基蓝。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述亲和配体是改性Hoechst染料，所述Hoechst染料选自由Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580组成的组，并且所述亲和配体已被改性以包括以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基，其中所述间隔基含有1-30个原子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和配体是左侧烷基氨基改性的Hoechst染料。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和配体是右侧烷基氨基改性的Hoechst染料。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和配体是改性单-Hoechst染料。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和配体是已被改性以包括环氧基、羧基或以氨基或卤化物为末端的间隔基的改性的苯并噻唑-喹啉的花菁或改性的苯并噁唑-喹啉的花菁，并且其中所述间隔基包含1-30个原子。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面是固体表面。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述固体表面是珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材或色谱中用作树脂的任何其它材料。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述固体表面包括官能化基团。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述官能化基团包含环氧基、羧基、醛基或氨基。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述固体表面是氨基-琼脂糖珠。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述固体表面是醛膜。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于色谱法。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述容器是色谱柱、碗、圆柱体、锥形器皿或桶。
27.从含有DNA和其它核酸的样品中离析和去除DNA的方法，包括以下步骤：
a.选择将会结合DNA的亲和配体；
b.将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；
c.将偶联的表面亲和配体放置于容器中；
d.将样品引入所述偶联的表面亲和配体，并使所述偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中所述DNA与亲和配体结合；和
e.将与DNA结合的所述偶联的表面亲和配体与从中去除了所述DNA的样品分离。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述DNA是双链的。
29.根据权利要求27所述的方法，还包括以下步骤：
f.从偶联的表面亲和配体中洗脱和回收DNA。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述亲和配体是嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其任意组合。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述亲和配体是选自由吖啶类、聚咪唑类、吲哚类、吡咯类、菲啶类、苯并噻唑-喹啉类或苯并噁唑-喹啉类的花菁、吩噁嗪类、吩噻嗪类、蒽醌类、呋喃香豆素类组成的组的化合物，并且其中所述化合物已被改性以包括能够将所述亲和配体结合到所述表面的连接基团。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述亲和配体是已被改性以包括以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基的吩噻嗪、Hoechst染料、苯并噻唑-喹啉的花菁或苯并噁唑-喹啉的花菁。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述表面是固体表面。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述固体表面是珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材或色谱中用作树脂的任何其它材料。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述固体表面包括官能化基团。
36.从含有RNA和其他核酸的样品中离析和去除RNA的方法，包含以下步骤：
a.选择将会结合RNA的亲和配体；
b.将所述亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；
c.将所述偶联的表面亲和配体放置于容器中；
d.将样品引入所述偶联的表面亲和配体，并使所述偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中所述RNA与所述亲和配体结合；和
e.将与RNA结合的所述偶联表面亲和配体与从中去除了所述RNA的样品分离。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述RNA是双链的。
38.根据权利要求36所述的方法，还包括步骤：
f.从所述偶联的表面亲和配体洗脱和回收所述RNA。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述亲和配体是嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其任意组合。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述亲和配体是选自由吖啶类、聚咪唑类、吲哚类、吡咯类、菲啶类、苯并噻唑-喹啉类或苯并噁唑-喹啉类的花菁、吩噁嗪类、吩噻嗪类、蒽醌类、呋喃香豆素类组成的组的化合物，并且其中所述化合物已被改性以包括能够将所述亲和配体结合到所述表面的连接基团。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述亲和配体是吩噻嗪、Hoechst染料、苯并噻唑-喹啉的花菁或苯并噁唑-喹啉的花菁，所述花菁已被改性以包括以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述表面是固体表面。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述固体表面是珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材或色谱中用作树脂的任何其它材料。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述固体表面包括官能化基团。
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