JPH06335380A - 核酸結合用担体、その調製方法および標的核酸の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 不溶性固体微粒子表面にハイブリッド形成性
塩基配列が固定化領域を介して固定化されており、該固
定化領域は第１級アミノ基を有するヌクレオチドを含有
するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、または第
１級アミノ基を有する化合物であり、固体微粒子とアミ
ド結合により固定化され、該ハイブリッド形成性塩基配
列はその末端において固定化領域と結合している核酸結
合用担体とその調製方法およびそれを用いた標的核酸の
検出方法。 【効果】 試料検体中の極く微量の標的核酸を短時間に
高い捕獲率で抽出、分離あるいは濃縮し、これを反復増
幅法の反応の鋳型として使用し、反復増幅法の反応によ
り検出することが可能な核酸結合用担体およびその調製
方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸結合用担体、その
調製方法およびそれを用いた標的核酸の検出方法に関す
る。更に詳しくは、標的核酸の特異的部位を選択的に結
合させることが可能な、特に核酸との間のハイブリッド
形成を利用した核酸の抽出、分離またその抽出、分離さ
れる標的核酸を増幅してから検出するのに適した核酸結
合用担体、その調製方法およびそれを用いた標的核酸の
検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】検査試料中の目的とする特定塩基配列を
有する核酸を抽出、分離或いは検出する手段として、核
酸のハイブリッド形成が利用されている。このハイブリ
ダイゼーション法における反応では、標識化された或い
は固体担体表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドま
たはポリヌクレオチド（すなわちプローブ）が、標的核
酸と塩基対を形成する。

【０００３】このハイブリダイゼーション法は、組み換
えＤＮＡ技術分野の研究者等によって開発された方法
で、一本鎖に変性されたＤＮＡまたはＲＮＡの核酸が適
当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖核酸と
塩基間の水素結合を介してハイブリッドを形成すること
を利用するものである。

【０００４】従来の核酸のハイブリッド形成分析は通
常、以下の方法で行なわれている。まず、検査試料中の
核酸を変性して一本鎖とした後、支持体であるニトロセ
ルロース製やナイロン製のメンブランフィルターに８０
℃で３時間程度焼き付け固定化する。次に、標識プロー
ブの非特異的吸着を抑えるためにプレハイブリダイゼー
ションを行なう。プレハイブリダイゼーションは通常３
７℃で３０分以上を要する。ここで、標識プローブと
は、トレーサーとして検出の目的となる、特定塩基配列
を含む一本鎖核酸からなり、容易に検出できる標識を付
したものである。プレハイブリダイゼーションの後、標
識プローブを、試料の核酸を固定したメンブランフィル
ターに添加し、ハイブリッド形成に適する溶液、例えば
クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ドデシル硫酸ナ
トリウム、サケ精子ＤＮＡおよびホルムアミドを含むト
リス塩酸塩緩衝液中で一晩インキュベーションを行な
う。次いで、標識プローブの非特異的な吸着を除去する
ために特定塩化合物の溶液中で２時間程度加温すること
によりフィルターの洗浄を実施する。この後、フィルタ
ーに固定化された一本鎖核酸とハイブリッドを形成して
いる標識プローブの標識をトレーサーとして検出するこ
とにより検査試料の核酸中の特定塩配列を検出する。

【０００５】このように、従来のフィルターを支持体と
した核酸のハイブリッド形成分析では、検査試料中の核
酸の固定、プレハイブリダイゼーション、標識プローブ
とのハイブリッド形成、洗浄、検出という一連の煩雑な
操作を必要とし、また時間がかかり、例えば臨床実験で
日常的に用いる分析手段としては適さないという問題を
有する。その上検出感度はピコモル程度であり感染症の
早期発見には適さないという欠点もあった。

【０００６】特に核酸の固定化における焼き付け、プレ
ハイブリダイゼーション、洗浄という操作は煩雑で、分
析に要する時間を長くする原因となっている［Lin et a
l.：Journal of Virology, Vol. 55, ５０９ページ（１
９８５）］。

【０００７】また、フィルター上でのハイブリッド形成
は、固相の一本鎖核酸と液相の標識プローブとの反応が
溶液中で不均一な状態で実施されるため、ハイブリッド
の形成速度が遅いという問題を有する。しかもハイブリ
ッド形成効率は極めて低く、通常、添加された標識プロ
ーブのうち計算上期待される値の数％がハイブリッド形
成に利用されるにすぎない。

【０００８】さらに、ＤＮＡを分離し、検出するために
固体微粒子を使用することが提案されている。例えば M
oyes および Stark は、ＳＶ４０ＤＮＡを、直径０.５
〜１.０μｍのジアゾ化ｍ−アミノベンジルオキシメチ
ルセルロース粒子に共有結合させて検出に使用すること
を教示しているが、この場合ハイブリッド形成に約２４
時間もの長時間を要している［Ｃｅｌｌ ５：３０１
（１９７５）］。

【０００９】また、一本鎖核酸をラテックス粒子表面に
固定して、ハイブリッド形成試験に使用することが提案
されている（特開昭６３−２７０００号公報）。しかし
この試験では、一本鎖核酸のラテックス粒子表面への固
定部位を選択することができない。そのためにハイブリ
ッド形成効率が極めて低いので、標的核酸の数が微量な
試料には適用できない。

【００１０】上記の核酸固定化法の欠点を解消するため
に種々の核酸固定化支持体およびその製造方法が提案さ
れている。その中に、核酸を構成するヌクレオチドの配
列部分を炭素原子数４〜２０の炭素鎖（炭素原子の一部
はＯ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子で置換されてもよく、
“腕”と称される）を介在させて間接的に核酸を固定化
した支持体が知られており、該核酸固定化支持体は、固
定部位となるヌクレオチド中の塩基の特定部位を予め活
性化させ、支持体に設けた“腕”となる反応性基と反応
させて共有結合を形成させることにより製造される（特
開昭６１−１３０３０５号公報）。また、ヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドを固定化した支持体に核酸を
酵素反応を利用して連結する方法が知られている（特開
昭６１−２４６２０１号公報）。

【００１１】しかし、前記特開昭６１−１３０３０５号
公報記載の方法は、支持体を活性化させた後、有機溶
媒、強アルカリまたは強酸で中間形成体を数回処理する
必要があり、反応収率は僅かに１１％に過ぎない。その
上この方法は反応時間も数時間から数日を要することが
あり、非常に煩雑で時間のかかる操作が必要である。ま
た、特開昭６１−２４６２０１号公報に記載の方法は、
固定化してあるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
の有効量を高めるためには核酸を一定の方向性をもって
連結する必要があるが、そのためには特開昭６１−１３
０３０５号公報の方法の場合と同様の著しく煩雑な操作
が必要である。また高価な酵素が大過剰に必要であると
考えられ、経済的に不利である。従って、上記の２つの
方法は、日常的に利用するには実用的でない。

【００１２】さらに、特開平１−１７１４９９号公報に
は、表面が非多孔質であって粒径０.０５〜５μｍの有
機高分子粒子の表面に、一本鎖のポリヌクレオチドが、
それに含まれている第１級アミノ基を有するヌクレオチ
ド２以上からなるヌクレオチド配列の部分において、ア
ミド結合により固定化されてなるハイブリッド形成用担
体およびその調製方法が記載されている。この公報に記
載された調製方法は固体粒子に核酸を簡便且つ効率よく
固定化でき、しかも得られた担体は核酸の高精度の検
出、分離、精製に適している。しかしこの公報に記載さ
れた方法は、ハイブリッド形成性ポリヌクレオチド中
に、第１級アミノ基と含有するヌクレオチドが含有され
ている場合には、その方法によって得られた担体は、検
出或いは抽出しようとする核酸が極く微量である検査試
料に適用する場合感度が充分でない場合がある。

【００１３】標的核酸の検出においてハイブリダイゼー
ション法の感度不足、操作の煩雑さを改良する方法とし
て、標的核酸またはその一部断片を増幅してから検出す
る方法が開発された。具体的には、例えばポリメラーゼ
チェーンリアクション法（以下“ＰＣＲ法”と略称する
ことがある）、リガーゼチェーンリアクション法（ＬＣ
Ｒ法）、サイクリングプローブリアクション法（ＣＰＲ
法）、分岐ＤＮＡプローブ法などが挙げられる。このう
ちＰＣＲ法については、例えば米国特許第４,６８３,１
９５号明細書、同第４,６８３,２０２号明細書および同
第４,８００,１５９号明細書に記載されている。これら
の反復増幅法を用いれば、原理的に標的核酸が一分子さ
えあれば検出することができる。しかし、これらの反復
増幅法の場合、各反応の各サイクルの終わりに合成され
たヌクレオチド鎖を分離するために、数秒〜数十秒の短
い時間内に、数十度の加熱処理を行ない、熱変性させる
必要がある。また、高価な耐熱性酵素、ＤＮＡ合成酵
素、リガーゼなどを使用するので、反応系の容積に自ら
限界があり、市販されているＰＣＲ法増幅器の反応容積
は数十〜数百μｌ程度である。この反応容積程度の検体
に標的核酸が少なくとも一分子以上存在しなければなら
ない。

【００１４】また、感染症または犯罪容疑者の同定など
の場合、入手できる検体の量が限られている場合があ
る。すなわち、感染初期の場合に、血液または他の試料
１０ｍｌにつき、僅か１個乃至数個の病原性微生物また
はウィルスの核酸のみが存在するに過ぎない場合がしば
しばある。そのような場合、１００μｌの検体を取って
も、病原性微生物またはウィルスの核酸の取れる確率は
僅か１％程度に過ぎない。従って、１０ｍｌ検査試料中
に存在する僅か１個の前記核酸を反復増幅法の鋳型とし
て確実に捕捉し得る試料調製法の確立が不可欠となる。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の目的
は、検査試料中の標的核酸が数分子程度しか存在しない
試料に対して、それ以外の夾雑物核酸、蛋白、脂質など
の細胞由来物質が大過剰、例えば数万倍乃至数百万倍存
在する試料であっても、標的核酸を適確で迅速に、且つ
高感度で抽出、分離或いは濃縮することが可能な核酸結
合用担体を提供し、大容積から反復増幅反応可能な容積
に濃縮された標的核酸を反復増幅法によって抽出する反
復増幅法の試料調製方法を提供することにある。

【００１６】さらに本発明の目的は、上記核酸結合用担
体を簡便に且つ効率よく調製することができる方法を提
供することにある。

【００１７】

【問題点を解決するための手段】本発明者らの研究によ
れば、前記本発明の目的の一つは、不溶性固体微粒子の
表面上にハイブリッド形成性塩基配列が固定化領域を介
して固定化されている核酸結合用担体であって、（ｉ）
核固体微粒子は、０.０１〜２０μｍの平均粒径を有
し、（ｉｉ）該固定化領域は、一端に第１級アミノ基を
有し他端にハイブリッド形成性塩基配列端部の官能基と
結合する官能基を有する化合物の残基であり、（ｉｉ
ｉ）該固体微粒子表面と該固定化領域とは、該固体微粒
子表面上に存在するカルボキシル基とアミド結合により
固定化されており、（ｉｖ）該ハイブリッド形成性塩基
配列は、その配列中に第１級アミノ基を有するヌクレオ
チドを含有しており、（ｖ）該ハイブリッド形成性塩基
配列は、その末端において該固定化領域と結合してお
り、且つ（ｖｉ）該固体微粒子表面上には、該固体微粒
子１個当り少なくとも１個の該ハイブリッド形成性塩基
配列が存在している、ことを特徴とする核酸結合用担体
によりに達成される。

【００１８】ここで、ハイブリッド形成性塩基配列端部
の官能基としては、水酸基、リン酸基またはアミノ基な
どを例示することができる。

【００１９】また本発明者らの研究によれば、前記本発
明の他の目的は、標的核酸を含有する検査試料と前記核
酸結合用担体とを接触させて該核酸結合用担体に前記標
的核酸を捕獲せしめることにより、前記標的核酸を濃縮
および／または精製し、次いで反復増幅法によって前記
標的核酸を増幅させた後、前記標的核酸を検出すること
を特徴とする検査試料中の標的核酸の検出方法により達
成される。

【００２０】本発明における担体における不溶性固体微
粒子（以下、単に「粒子」と称する）を形成する物質と
しては、有機高分子材料であることが望ましく、その高
分子の材料としては例えば、スチレン、クロルスチレ
ン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビ
ニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メ
タ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）
アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、
（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）
アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グ
リシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル
酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、
（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、
（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリ
ルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニ
ルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化
ビニルなどの芳香族ビニル化合物、α,β−不飽和カル
ボン酸のエステル類もしくはアミド類、α,β−不飽和
ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン
化合物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビ
ニル系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の
有機高分子材料を示すことができる。さらに他の高分子
材料としてアガロース、デキストラン、セルロース、カ
ルボキシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体やメチ
ル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなど
のタンパク質の架橋体を挙げることができる。

【００２１】これらの有機高分子材料からなる粒子は、
乳化重合、懸濁重合、溶液沈殿重合などによって製造す
ることができる。また、有機高分子材料溶液を非溶媒中
に分散し架橋したり、または溶媒を揮散させることなど
によって該粒子を得ることができるが、粒子の製造方法
はこれらに限定されるものではない。なお、この粒子に
は、必要に応じて充填剤、例えば磁性粉、超強磁性粉な
どを含有またはコーティングさせてもよい。

【００２２】本発明に用いられる粒子の表面は非多孔質
であることが望ましい。ここで、粒子の表面が「非多孔
質」であるとは、長径が０.０１μｍ以上である孔を粒
子の表面に有しないことを意味する。粒子の表面が非多
孔質でないと、即ち、長径で０.０１μｍ以上である孔
が粒子の表面に存在すると、後述の核酸検出法などで用
いられる標識プローブが粒子の内部に捕捉されるなどの
原因によりハイブリッド形成分析の感度や精度の向上が
望めない。なお、このように、粒子の表面は非多孔質で
あることが望ましいが、粒子の内部に独立気泡などが存
在してもよい。

【００２３】本発明に使用する粒子の平均粒径は、遠心
分離などの簡便な操作で粒子を回収するために０.０１
μｍ以上、好ましくは０.０５μｍ以上、特に好ましく
は０.１μｍ以上である。一方、粒子の単位沈降体積当
りの表面積を大きくし、且つハイブリッド形成に適当な
条件下で担体が均一に分散する状態を保つことによって
高いハイブリッド形成効率を達成するために、２０μｍ
以下、好ましくは１０μｍ以下、特に好ましくは５μｍ
以下である。

【００２４】さらに、本発明に用いる粒子は、水性媒体
中で使用するために、水不溶性でなければならない。

【００２５】本発明の核酸結合用担体は、前記したとお
り、粒子の表面上に、ハイブリッド形成性塩基配列が固
定化領域を介して結合しており、その粒子表面とその固
定化領域とは、粒子表面上に存在するカルボキシル基と
アミド結合により固定化されている。

【００２６】従って本発明における粒子は、その表面に
アミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する必
要がある。もし粒子がその表面にカルボキシル基を有し
ない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入する必
要がある。カルボキシル基は粒子表面積１ｎｍ2当り少
なくとも１個存在することが好ましく、より好ましくは
３個以上、さらに好ましくは５個以上である。

【００２７】このようなカルボキシル基を表面に有し、
前記方法に好適な高分子粒子としては、例えばイムテッ
クスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０
１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０３２、Ｇ０３０１、Ｇ０
２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１およびＬ
０１０２：並びにイムテックスＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−
Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３などの商品名（日本合成ゴム
（株））で市販されているものがあげられる。また、カ
ルボキシル基を有しない粒子の表面にカルボキシル基を
導入するには、従来より知られている種々の方法を利用
することができる。

【００２８】本発明の核酸結合用担体における固定化領
域としては、第１級アミノ基を有するヌクレオチドを少
なくとも１個含有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドの残基をあげることができる（以下、「固定化領
域Ｉ」と称する）。このヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド配列は、ヌクレオチドを１〜２０個、好ましく
は３〜１５個含有するものである。

【００２９】第１級アミノ基を有するヌクレオチドとし
ては、例えばデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシ
チジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）などを
挙げることができるが、粒子表面にあるカルボキシル基
との反応性が高い点でｄＡおよびｄＣが好ましい。第１
級アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、１種のヌク
レオチドで構成されていてもよいし、２種以上のヌクレ
オチドで構成されていてもよいが、ハイブリッド形成の
相手となる核酸中の特定塩基配列以外の塩基配列と偶然
に相補的な塩基配列を生じることを避けるために、１種
のヌクレオチド、特にｄＡまたはｄＣで構成されること
が好ましい。

【００３０】本発明の核酸結合用担体における固定化領
域としては、前述の第１級アミノ基を有するヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド以外のものとして、粒子表
面のカルボキシル基とアミド結合を形成するための第１
級アミノ基または第１級アミノ基形成基を有しており、
またハイブリッド形成性塩基配列端部の官能基と結合す
るための官能基を有している化合物の残基をあげること
ができる（以下、「固定化領域ＩＩ」と称する）。この
固定化領域は、第１級アミノ基と前記官能基は通常炭化
水素によって結ばれているのが望ましく、その炭化水素
は酸素、窒素、硫黄などのヘテロ原子が含まれていても
差し支えない。この炭化水素は一般に１〜１０個の炭素
原子、好ましくは２〜７個の炭素原子を含有しているの
が適当である。

【００３１】前記固定化領域ＩＩにおける、第１級アミ
ノ基または第１級アミノ基形成基とハイブリッド形成性
塩基配列端部の官能基と結合するための官能基を有して
いる化合物としては、例えばアプライドバイオシステム
社が下記構造を有するアミノリンク１（Aminolink−
１）およびアミノリンク２（Aminolink−２）として販
売している化合物が挙げられる。

【００３２】

【化１】

【００３３】上記アミノリンク１およびアミノリンク２
はハイブリッド形成性塩基配列と結合させると下記化合
物を形成し末端第１級アミノ基は粒子表面のカルボキシ
ル基と結合する。

【００３４】

【化２】

【００３５】次に、本発明の核酸結合用担体におけるハ
イブリッド形成性塩基配列について説明する。このハイ
ブリッド形成性塩基配列は、標的核酸の特定塩基配列と
実質的に相補的に配列する塩基配列を含んでいる。通常
試料中には標的核酸に比べて夾雑物核酸、蛋白質、脂質
などが大過剰、例えば数千倍乃至数百万倍含まれてい
る。このような試料から標的核酸を特異的に迅速且つ効
率よく、抽出、分離或いは検出するために、ハイブリッ
ド形成性塩基配列は、少なくとも５個、好ましくは少な
くとも１０個のヌクレオチドを含んでいることが望まし
い。一方ハイブリッド形成性塩基配列のヌクレオチド数
の上限は、特に制限されないが、通常１００個以下、好
ましくは８０個以下である。この上限は合成の経済性か
ら自ら制限される。

【００３６】上記ハイブリッド形成性塩基配列は、３’
末端或いは５’末端において固定化領域と結合してい
る。ハイブリッド形成性塩基配列は、その中間領域にお
いて固定化領域と結合することは、好ましいことではな
い。その理由は、粒子に対する固定化反応率が低下した
り、またハイブリッド形成性塩基配列の長さが長くな
り、そのための合成効率が低下するからである。

【００３７】前述したように、ハイブリッド形成性塩基
配列はその末端において固定化領域と結合していること
が好ましい。その場合、ハイブリッド形成性塩基配列の
５’末端において結合していることが一層好ましい。こ
のようにハイブリッド形成性塩基配列が５’末端で固定
化領域を介して粒子に固定化され、標的核酸の特定塩基
配列と相補的な塩基配列が３’末端側に存在すると、こ
の固定化された一本鎖プローブ核酸をプライマーとした
核酸合成酵素による核酸伸長反応が可能となり、粒子上
でのクローン化ＤＮＡの合成または標識ヌクレオチドの
取り込みに基づく特定塩基配列の検出へ適用できるので
好ましい。

【００３８】本発明における標的核酸とハイブリダイズ
するハイブリッド形成性塩基配列としては、高等動物、
高等植物、菌、黴、バクテリア、ウイルスなどに由来す
るＤＮＡ、ＲＮＡ、クローン化ＤＮＡ、プラスミドＤＮ
Ａなどの天然に存在する核酸、これらの断片、オリゴヌ
クレオチドおよび合成ポリヌクレオチドを例示すること
ができる。

【００３９】かくして本発明による核酸結合用担体は、
その粒子表面上に、粒子１個当り平均的に少なくとも１
個、好ましくは１０〜１,０００個のハイブリッド形成
性塩基配列が存在している。

【００４０】本発明の核酸結合用担体は、（ａ）ハイブ
リッド形成性塩基配列を有し、該塩基配列が第１級アミ
ノ基を有するヌクレオチドを含有しており、該第１級ア
ミノ基は、該塩基配列と実質的に相補的な塩基配列で二
本鎖状態にすることにより、またはアミノ基保護化合物
を反応させることにより保護され、且つハイブリッド形
成性塩基配列端部の官能基が、第１級アミノ基または第
１級アミノ基形成基と該ハイブリッド形成性塩基配列端
部の官能基と結合する官能基とを有する化合物と結合し
ている縮合化合物を準備し、（ｂ）前記（ａ）の縮合化
合物を０.０１〜２０μｍの平均粒径を有し、且つ表面
上にカルボキシル基を有している粒子と接触させて脱水
縮合させ、かくして該粒子と該固定化領域を固定化し、
次いで（ｃ）該ハイブリッド形成性塩基配列における相
補的な塩基配列または該ハイブリッド形成性塩基配列の
第１級アミノ基における保護化合物を離脱させる、こと
を特徴とする核酸結合用担体の調製方法により得ること
ができる。

【００４１】この調製方法において、前記固定化領域Ｉ
を有するものの場合は、下記調製方法−ＩａおよびＩｂ
により調製され、一方前記固定化領域ＩＩを有するもの
の場合は、下記調製方法−ＩＩにより調製される。以
下、これら調製方法について説明する。

【００４２】調製方法−Ｉａ：調製方法−Ｉａは、
（ａ）第１級アミノ基を有するヌクレオチドを少なくと
も１個含有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
よりなる固定化領域および相補的な塩基配列により二本
鎖化されたハイブリッド形成性塩基配列よりなる縮合化
合物であり、該ハイブリッド形成性塩基配列は第１級ア
ミノ基を有するヌクレオチドを含有しており且つその端
部において該固定化領域と結合している縮合化合物を準
備し、（ｂ）前記（ａ）の縮合化合物を、０.０１〜２
０μｍの平均粒径を有し、且つ表面上にカルボキシル基
を有している粒子と接触させて脱水縮合させ、かくして
該粒子と該固定化領域を固定化し、次いで（ｃ）該ハイ
ブリッド形成性塩基配列における相補的な塩基配列を離
脱させる、ことにより核酸結合用担体を調製する方法で
ある。

【００４３】かかる調製方法−Ｉａにおいて、固定化領
域および二本鎖化されたハイブリッド形成性塩基配列よ
りなる縮合化合物は、予め固定化領域と二本鎖化されて
いないハイブリッド形成性塩基配列との塩基配列を調製
し、次いでこれを相補的な配列を有するヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチドを用いて二本鎖化することによ
り得ることができる。

【００４４】この際、ハイブリッド形成性塩基配列を選
択的に二本鎖化するには、そのハイブリッド形成性塩基
配列と実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを用いてア
ニーリングさせることにより調製することができる。さ
らに残りの一本鎖を除去するために、ヒドロキシアパタ
イトーカラムを通すことによって、ハイブリッド形成性
塩基配列が完全に二本鎖化された固定化用ハイブリッド
形成性塩基配列を得ることができる。

【００４５】この場合、前記の調製方法に用いる一本鎖
の塩基配列を、例えばＤＮＡ合成装置を用いる化学合成
により製造する場合には、所要の第１級アミノ基を有す
るヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（固定化領
域）が分子中の所望の位置に形成されるようにプログラ
ムを組んで製造すればよい。また、ターミナルデオキシ
トランスフェラーゼを用いる付加反応により、ハイブリ
ッド形成性塩基配列の末端に第１級アミノ基を有するヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドを導入することも
できる。さらに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ハイブ
リッド形成性塩基配列と、第１級アミノ基を有するヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドとを連結することに
より第１級アミノ基を有する塩基配列を導入することも
できる。その他従来より知られている核酸のテーリング
反応および核酸同士の連結反応を利用することができる
［例えば “Molecular Cloning”、Cold Spring Harbor
Laboratories、１９８２参照］。

【００４６】前記の方法で得られた第１級アミノ基を有
するヌクレオチドまたはオリゴヌクレチド（固定化領
域）と二本鎖化されたハイブリッド形成性塩基配列とが
結合された縮合化合物を、粒子の表面に固定化するに
は、通常脱水縮合剤が使用される。

【００４７】その際、用いられる脱水縮合剤としては、
例えば１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）
プロピルカルボジイミドなどのカルボジイミド類、Ｎ−
エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホ
ネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,
２−ジヒドロキノリンなどの水溶性の脱水縮合剤が好ま
しいものとして挙げられるが、油溶性の脱水縮合剤も使
用することができる。これらの脱水縮合剤は、使用する
粒子が表面に有するカルボキシル基１グラム当量に対し
て、通常１〜２０モル、好ましくは２〜１０モル使用す
る。この反応は、例えば適当な大きさの反応容器に表面
にカルボキシル基を有する粒子と、第１級アミノ基を有
するヌクレオチドまたはオリゴヌクレチド（固定化領
域）と二本鎖化したハイブリッド形成性塩基配列とが結
合した縮合化合物を仕込んだ後、前記の脱水縮合剤を添
加することにより行なうことができる。粒子の使用量
は、第１級アミノ基を有するヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレチドと二本鎖化したハイブリッド形成性塩基配列
とが結合した縮合化合物１ミリモル当り、通常０.５〜
５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇである。反応は、通常
ｐＨ３〜１１程度の水性媒体中、４〜７０℃において、
５分ないし一夜行なえばよい。

【００４８】前記の方法により固定化領域における第１
級アミノ基と、粒子表面に存在するカルボキシル基とを
脱水縮合させてアミド結合を形成させることにより、粒
子表面に固定化領域を介して二本鎖化ハイブリッド形成
性塩基配列が固定化される。

【００４９】次にこのハイブリッド形成性塩基配列が固
定化された粒子を、そのハイブリッド形成性塩基配列に
結合した相補的な塩基配列を離脱させることによって、
本発明の核酸結合用担体が得られる。この際前記相補的
な塩基配列の離脱は、熱またはアルカリ変性により行な
うことができ、さらに遠心分離、濾過などの手段によっ
て相補的な塩基配列を除去すればよい。

【００５０】かくして本発明の調製方法−Ｉａによれ
ば、粒子表面上に、ハイブリッド形成性塩基配列がその
末端において固定化領域を介して固定化された核酸結合
用担体が得られる。この調製方法は、前述した方法に従
って、予め二本鎖化されたハイブリッド形成性塩基配列
とその末端に結合させた第１級アミノ基を有するヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド（固定化領域）を調製
し、次いでそれを粒子に固定化させるので、粒子表面上
に所望する数のハイブリッド形成性塩基配列を固定化す
ることができ、しかもハイブリッド形成性塩基配列は
５’末端或いは３’末端において固定化領域を介して粒
子と適確に固定化されており、ハイブリッド形成性塩基
配列の中間領域において粒子と固定化したものは実質的
に存在しない。

【００５１】従って調製方法−Ｉａは、ハイブリッド形
成性塩基配列が粒子表面上に、所望の数固定化すること
ができ、しかも５’末端（または３’末端）で固定化さ
れ、他方の３’末端（または５’末端）が自由な状態で
存在している。

【００５２】かかる本発明の核酸結合用担体は前記特徴
を有しているので、試料中の微量の標的核酸の抽出、分
離または検出のために極めて有用である。

【００５３】調製方法−Ｉｂ：調製方法−Ｉｂは、
（ａ）第１級アミノ基を有するヌクレオチドを少なくと
も１個含有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
よりなる固定化領域およびハイブリッド形成性塩基配列
よりなる縮合化合物であり、該ハイブリッド形成性塩基
配列は第１級アミノ基を有するヌクレオチドを含有して
おり、そして該ハイブリッド形成性塩基配列中に存在す
る第１級アミノ基は保護化合物により保護されており
（但し、二本鎖化されたハイブリッド形成性塩基配列を
除く）、且つ該ハイブリッド形成性塩基配列はその末端
において該固定化領域と結合している縮合化合物を準備
し、（ｂ）前記（ａ）の縮合化合物を、０.０１〜２０
μｍの平均粒径を有し、且つ表面上にカルボキシル基を
有している粒子と接触させて脱水縮合させ、かくして該
粒子と該固定化領域を固定化し、次いで（ｃ）該ハイブ
リッド形成性塩基配列中の第１級アミノ基における保護
化合物を離脱させる、ことにより核酸結合用担体を調製
する方法である。

【００５４】本発明の調製方法−ＩａおよびＩｂは、前
者が予め相補的な塩基配列により二本鎖化されたハイブ
リッド形成性塩基配列を含む縮合化合物を使用し、最終
的にその相補的な塩基配列を離脱する方法であるのに対
して、後者は第１級アミノ基が保護化合物で保護させた
ハイブリッド形成性塩基配列を含む縮合化合物を使用
し、最終的にその保護化合物を離脱する方法である点に
おいて相違している。

【００５５】この調製方法−Ｉｂにおいては、第１級ア
ミノ基を有するヌクレオチドを少なくとも１個含有する
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドよりなる固定化
領域およびハイブリッド形成性塩基配列よりなる縮合化
合物は、粒子表面のカルボキシル基と結合させるため
に、ハイブリッド形成性塩基配列の第１級アミノ基を化
学的に保護することが必要である。

【００５６】このハイブリッド形成性塩基配列における
第１級アミノ基の保護は、保護すべき第１級アミノ基が
脱水縮合剤に対して化学的に保護され（不活性化され）
且つ比較的簡単にその保護基が離脱される化合物が利用
される。具体的な保護化合物を示すと、ハイブリッド形
成性塩基配列におけるヌクレオチドがデオキシアデニル
酸（ｄＡ）のアミノ基に対しては、ベンゾイル基

【００５７】

【化３】

【００５８】またはジメチルホルムアミジン基

【００５９】

【化４】

【００６０】を有する化合物が例示され、デオキシシチ
ジル酸（ｄＣ）のアミノ基に対しては、ベンゾイル基ま
たはイソブチル基

【００６１】

【化５】

【００６２】を有する化合物が例示され、さらにデオキ
シグアニル酸（ｄＧ）のアミノ基に対してはジメチルホ
ルムアミジン基またはイソブチル基を有する化合物が例
示される。

【００６３】上記した保護化合物により保護されたヌク
レオチドの多くは、市販のＤＮＡ合成機における合成試
薬として市販されている。市販のＤＮＡ合成機を利用し
て、固定化領域のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ドおよびハイブリッド形成性塩基配列よりなる縮合化合
物を合成すると、固定化領域にアミノ基が保護されたハ
イブリッド形成性塩基配列が５’末端で結合している縮
合化合物が得られるので極めて有効である。

【００６４】従って、前記調製方法−Ｉｂは、市販のＤ
ＮＡの合成機を使用することにより、アミノ基が保護さ
れた縮合化合物を得ることができ、この縮合化合物はそ
のまま粒子の表面カルボキシル基との脱水縮合させるこ
とが可能である。

【００６５】この調製方法−Ｉｂにおける固定化領域の
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、第１級アミ
ノ基を有している限り、前述した調製方法−Ｉａのヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドと同様の配列である
ことができる。また調製方法−Ｉｂにおける縮合化合物
と粒子表面のカルボキシル基との脱水縮合は、前記調製
方法−Ｉａと同様の脱水縮合剤を使用し、同様の条件下
に実施することができる。

【００６６】調製方法−Ｉｂでは、縮合化合物を粒子に
固定化した後、ハイブリッド形成性塩基配列における保
護化合物を離脱させる。この保護化合物の離脱は、それ
自体知られた方法および条件下に実施される。例えばＤ
ＮＡの合成機により合成した塩基配列の保護化合物を離
脱するには、そのＤＮＡの合成機の指示書に従って行な
えばよい。

【００６７】調製方法−ＩＩ：調製方法−ＩＩは、
（ａ）第１級アミノ基または第１級アミノ基形成基を有
する化合物（但し、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドは除く）残基よりなる固定化領域およびハイブリッ
ド形成性塩基配列よりなる縮合化合物であり、該ハイブ
リッド形成性塩基配列は第１級アミノ基を有するヌクレ
オチドを含有しており、そして該ハイブリッド形成性塩
基配列中に存在する第１級アミノ基は保護化合物により
保護されており、且つ該ハイブリッド形成性塩基配列は
その末端において該固定化領域と結合している縮合化合
物を準備し、（ｂ）前記（ａ）の縮合化合物を、０.０
１〜２０μｍの平均粒径を有し、且つ表面上にカルボキ
シル基を有している粒子と接触させて脱水縮合させ、か
くして該粒子と該固定化領域を固定化し、次いで（ｃ）
該ハイブリッド形成性塩基配列中の第１級アミノ基にお
ける保護化合物を離脱させる、ことにより核酸結合用担
体を調製する方法である。

【００６８】この調製方法−ＩＩは、固定化領域が前記
調製方法−Ｉｂと相違している。すなわち、固定化領域
は、調製方法−Ｉｂにおいては第１級アミノ基を有する
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであるのに対し
て、調製方法−ＩＩにおいてはヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド以外の第１級アミノ基を有する化合物で
ある。

【００６９】この調製方法−ＩＩにおける固定化領域を
形成する化合物については前記固定化領域ＩＩにおいて
具体的に説明したとおりである。この調製方法−ＩＩに
おいて、固定化領域およびアミノ基で保護されたハイブ
リッド形成性塩基配列よりなる縮合化合物は、市販のＤ
ＮＡ合成機を使用することにより容易に得ることができ
る。すなわち、ＤＮＡ合成機に固定化領域となる第１級
アミノ基を有する化合物に、所望のハイブリッド形成性
塩基配列が末端（例えば５’末端）において結合するよ
うにプログラムを組み込み合成することにより、ハイブ
リッド形成性塩基配列のアミノ基が保護された縮合化合
物を容易に得ることができる。

【００７０】この調製方法−ＩＩにおいて、縮合化合物
の粒子表面への固定化は、前記調製方法−ＩａおよびＩ
ｂにおいて説明した脱水縮合剤を使用できまた同様の反
応条件で実施することができる。

【００７１】さらに縮合化合物を粒子表面に固定化した
後、ハイブリッド形成性塩基配列における保護化合物の
離脱は、前記調製方法−Ｉｂにおいて説明した方法およ
び条件で実施することができる。

【００７２】本発明の核酸結合用担体の利用：次に本発
明による核酸結合用担体の利用について説明する。

【００７３】本発明の核酸結合用担体を使用して、試料
中の標的核酸を迅速に捕獲するためのハイブリッド形成
反応は、それ自体知られている通常の溶液ハイブリッド
形成反応条件をそのまま適用して実施することができ
る。

【００７４】ハイブリッド形成に適当な緩衝液として
は、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウムまたは１０ｍＭのト
リス塩酸塩緩衝液に０.５（ｗ／ｖ）％となる量のドデ
シル硫酸ナトリウム、７５ｍＭとなる量のクエン酸ナト
リウム、７５０ｍＭとなる量の塩化ナトリウム、５０
（ｖ／ｖ）％となる量のホルムアミドおよび１０（ｗ／
ｖ）％となる量のサケ精子ＤＮＡを混合した水溶液など
が挙げられるが、この組成に限定されるものではない。

【００７５】前記したように本発明の核酸結合用担体
は、特に標的核酸を極く微量含有し、試料検体は、血
液、だ液、汗或いは尿の如き、夾雑物核酸、蛋白質、脂
質などが、標的核酸に比べて大過剰に存在している試料
からの標的核酸の抽出、分離、濃縮または検出に極めて
適している。例えば血液検体中の極く微量のウイルス細
菌などの核酸を迅速且つ適確に、抽出、分離、濃縮また
は検出するのに有効である。その場合のハイブリッド形
成反応の緩衝液としては、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液が挙げられる。

【００７６】ハイブリッド形成反応の温度は０〜８０
℃、好ましくは１５〜７０℃の範囲であり、時間は０〜
１５分で充分である。

【００７７】本発明の核酸結合用担体は、以下に説明す
るサンドイッチ法および競合法による標的核酸の抽出、
分離または検出に利用することができる。

【００７８】サンドイッチ法によると、まず、検査試料
から検出すべき核酸が有する塩基配列の中から、異なり
且つ重複しない２つの特定塩基配列を選択する。次い
で、それぞれの特定塩基配列に相補的な塩基配列を有す
る２種類の核酸のうち、一方を粒子に結合して本発明の
担体とし、他方を適当な標識でラベルして標識核酸プロ
ーブとする。これらの担体および標識核酸プローブを、
検査試料中の核酸とのハイブリッド形成に供すると、検
査試料中に輩出すべき特定の塩基配列を含む核酸が存在
すれば、担体の核酸と標識核酸プローブとが検査試料中
の該核酸を挟む形でハイブリッド形成により結合する。
次に、担体に対して結合した標識核酸プローブをトレー
サーとして検出することにより、特定の塩基配列を含む
核酸を検出することができる。

【００７９】また、競合法によると、まず、検査試料中
の検出すべき核酸の特定塩基配列に相補的な塩基配列を
含む一本鎖核酸を粒子に結合して本発明の担体とする。
一方、検査試料中の検出すべき核酸と実質的に同等な特
定塩基配列を含む核酸に標識を付し、プローブとする。
次に前記本発明の担体と検査試料とプローブを混合して
ハイブリッド形成反応に供すると、試料中に検出すべき
特定の塩基配列を有する核酸が存在すれば、該核酸は担
体に結合している一本鎖核酸とのハイブリッド形成をプ
ローブと競合する。試料中に検出すべき核酸が存在しな
い場合には、プローブのみが担体上の一本鎖核酸とハイ
ブリッドを形成する。試料中に存在する検出すべき核酸
の量に応じて担体上の一本鎖核酸とハイブリッドを形成
するプローブの量が減少するのでこのプローブを検出す
ることにより、特定の塩基配列を含む核酸を特異的に定
量することができる。

【００８０】上記核酸の検出に用いられるプローブと
は、直接の検出対象となる一本鎖核酸からなり、容易に
検出できる標識を付したものである。用いられる標識
は、酵素学的に活性な基、蛍光体、発色団、発光体、特
異的な結合が可能な配位子、重金属および放射性同位元
素のような、トレーサーとして容易に検出することがで
きる物質であり、このためにハイブリッド形成によって
担体上にトラップされた標識プローブは容易に検出する
ことができる。

【００８１】上記のサンドイッチ法および競合法は、バ
クテリア、ウィルスなどの病原体の検出、抗生物質や抗
ウィルス剤のスクリーニング、遺伝障害の診断およびガ
ン細胞の検出に利用することができる。

【００８２】前述した手段によっても、試料中の標的核
酸の検出ができない程に、核酸の含有量が極く微量な場
合、本発明の担体の使用により捕獲した標的核酸を反復
増幅法により、増幅させてから検出することができる。
ここで、反復増幅法としてはポリメラーゼチェーンリア
クション法（ＰＣＲ法）、リガーゼチェーンリアクショ
ン法（ＬＣＲ法）、サイクリングプローブリアクション
法（ＣＰＲ法）、分岐ＤＮＡプローブ法などを例示する
ことができるが、特に好ましくはＰＣＲ法である。なお
前記標的核酸の増幅は標的核酸を担体から分離して反復
増幅法により増幅してもよく、また分離しないで担体に
保持された状態で反復増幅法により増幅させてもよい。
かくして本発明の核酸結合用担体は、反復増幅法に利用
することにより一層優れた効果が発現される。この点に
ついて以下ＰＣＲ法を挙げ詳細に説明する。

【００８３】一般に検査試料の容量は、その種類によっ
て、数百μｌから数十リットルの範囲にある。例えば感
染症検査においても、全血サンプルの採血量は数ｍｌか
ら数百ｍｌまでその対象となりうる。これに対し、本発
明の核酸結合用担体を用いて濃縮される目的核酸を含有
する試料の容量は、適用する核酸増幅方法の種類によっ
て数μｌから数百μｌの間で調整することができる。Ｐ
ＣＲ検出法の場合、通常数μｌ乃至数十μｌの範囲であ
る。

【００８４】検査試料中の標的核酸の検出において、本
発明の核酸結合用担体を用いることは、大容量の検査試
料中に僅かしか存在しない目的核酸でも漏れなく結合さ
せ濃縮することおよび増幅反応に無用な他の核酸、蛋白
質などの生体物質を増幅系から除去することで検出バッ
クグランドを落とし検出感度を高めるという２つの利点
が達成できる。

【００８５】本発明の核酸結合用担体は、標的核酸数が
非常に少ないときに特に有効である。具体的には、採取
される所定量の検査試料中に、標的核酸が数分子程度し
か存在しない場合、通常行なわれるプローブ標識検出法
は感度が不足しているため使用できない。また、所定量
の検体中の一部を取り、ＰＣＲ法により増幅して検出す
るにも、その一部の検体に標的核酸が存在しないことが
あり、結果的にＰＣＲ法による増幅を行なっても検出で
きず、時には陰性となり、時には陽性となるような不確
実な検出になってしまう。

【００８６】本発明の核酸結合用担体を用いて上記標的
核酸の濃縮および／または精製を行なってから、ＰＣＲ
法による鋳型として使用すれば、例えば１リットルの検
体中に数個の分子の標的核酸が存在するに過ぎない場合
に、本発明の担体を用いて数個の分子の標的核酸を１０
μリットルに濃縮すれば、約１０⁵倍のＰＣＲ法による
感度アップが達成できる。この場合、他の検体成分との
分離、標的核酸の濃縮あるいは精製は具体的にはハイブ
リッド形成反応によって、標的核酸がプローブＤＮＡと
結合することによって担体粒子に固定化したものを遠心
分離、フィルター濾過或いは磁気力をかけるなどの手段
によって行なうことができる。

【００８７】本発明の核酸結合用担体を用いて、標的核
酸の濃縮および／または精製を行なってから、熱または
アルカリ変性によって標的核酸を担体から分離してから
ＰＣＲ法により増幅してもよいし、担体粒子から分離せ
ずに粒子と共にＰＣＲ法により増幅してもよい。この場
合、プライマー位置はハイブリッド形成性塩基配列と同
じ位置またはより増幅される断片の内側に選定して行な
うことはＰＣＲ法の反応の効率から好ましい。

【００８８】本発明の担体を用いて標的核酸の濃縮およ
び／または精製を行なう過程の中で、検体中他の成分と
の分離、特にＰＣＲ法の反応を阻害するインヒビターな
どの分離も当然行なわれることになるので、標的核酸の
濃縮過程には、有害物質の除去も達成できることにな
る。

【００８９】本発明の核酸結合用担体は、二本鎖状態の
ハイブリッド形成性塩基配列を結合し、次にその相補配
列を離脱させて一本鎖状態にする方法で調整されたもの
が好ましい。具体的には、前記調製方法Ｉａ、Ｉｂおよ
びＩＩによって調製することができる。このように調製
されたプローブ核酸固定化担体は、プローブ核酸の末端
部位のみが選択的に粒子に固定化されているので、ハイ
ブリダイゼーションの効率が非常に高い。特に検体の中
に標的核酸が僅か数分子程度しか存在しない試料におい
て、本発明の調製方法で得たプローブ核酸固定化担体の
使用がさらに効率が発揮できるので好ましい。

【００９０】

【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説
明する、但し、本発明は、実施例に限定されるものでは
ない。実施例において分離、抽出しようとする標的核酸
はＨＩＶ ＤＮＡの全長ＤＮＡをゲノムＤＮＡに導入し
たＮＹ１０株を増幅したものであって、少なくとも数十
万以上の塩基からなるものである。

【００９１】実施例 （１）ＨＩＶ プローブ核酸の調製 ＨＩＶ プローブ核酸として、下記の塩基配列を有する
２種のポリヌクレオチドを合成した。 Ａ（＋） ５’ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡ
ＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＣ
３’ Ｂ（−） ５’ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣ
ＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＴ
ＧＧ ３’

【００９２】ここで５’末端の（ｄＣ）₁₀は、固定化領
域であり、それ以外の配列はハイブリット形成性塩基配
列である。なお、＋、−はそれぞれＤＮＡの＋鎖、−鎖
を、５’、３’はそれぞれ５’末端、３’末端を表わ
す。上記プローブ核酸のハイブリット形成性塩基配列と
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（２種）も
同時に合成した。 Ａ（−） ３’ＡＡＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣ
ＡＴＣＣＣＧＡＴＡＴＧＴＡＡＧＡＡＴＧ ５’ Ｂ（＋） ３’ＡＴＧＴＡＧＴＣＣＧＧＴＡＴＡＧＴＧ
ＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＴＡＣＧＴＡＣＣ ５’

【００９３】これら４種のポリヌクレオチドをＤＮＡ合
成装置（アプライド バイオシステムズ社モデルＡＢＩ
３８１Ａ）を用いてβ−シアノエチルホスホアミダイト
法により合成した。合成したポリヌクレオチドの固相か
らの切り出しおよび採取は、該装置のためのマニュアル
に従って行なった。

【００９４】次いで、得られた各ポリヌクレオチドをそ
れぞれ２５０μｌのＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩
酸塩緩衝液、ｐＨ８、１００ｍＭ 塩化ナトリウムおよ
び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）に
溶解した後、ＴＮＥ緩衝液で膨潤させたファデックスＧ
−５０（ファルマシア社製）カラム（５ｍｌ）によるゲ
ル濾過に供した。ゲル濾過による溶出液を０.５ｍｌず
つ順次分取し、各画分の２６０ｎｍにおける吸光度を測
定し、素通り画分を判別し集めた。

【００９５】集めたポリヌクレオチドの溶液から、エタ
ノールで沈殿させることによりポリヌクレオチドを精製
した。次に、精製したポリヌクレオチドを５００μｌの
滅菌水に溶解した後、２６０ｎｍにおける吸光度を測定
してポリヌクレオチドを定量した。

【００９６】以上の結果、前記４種のポリヌクレオチド
それぞれ約１ｍｇが５００μｌの水溶液として得られ
た。以下は十鎖についてのみ説明するが、一鎖について
も同様な操作を行なったので説明を省略する。

【００９７】（２）プローブ核酸のハイブリット形成性
塩基配列の二本鎖化 （１）で得た合成ポリヌクレオチドＡ（＋）、Ａ（−）
をそれぞれ６ｎｍｏｌｅを取り、２ｍｌのエッペンドル
フチューブに入れ、１０倍アニーリング溶液（１００ｍ
Ｍ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、６０ｍＭ 塩化マグ
ネシウム,６０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０
０ｍＭ 塩化ナトリウム）を１０μｌ加え、滅菌蒸留水
で１００μｌに調整した。これを８０℃のウォーターバ
スに１０分間加温し、その後室温になるまで静置した
（所要時間３時間）。この反応によりＡ（＋）とＡ
（−）（以降Ａと略す）が、二本鎖を形成した。

【００９８】次に、未反応の一本鎖ポリヌクレオチドを
除くため、上記反応生成物を１０ｍｌのヒドロキシアパ
タイト（Bio Rad 社製ＡＧ５０１−Ｘ８＆ＭＳＺ５０
１）カラムに通した。その後、０.１５Ｍと０.５Ｍのリ
ン酸緩衝液で展開し、各画分の２６０ｎｍの吸光度を測
定し、未反応の残存一本鎖核酸と反応生成物の二本鎖核
酸を別々に分離し集めた。

【００９９】二本鎖核酸の回収率は９１％であって、回
収分の２.５容量分のエタノールを加え、−７０℃で、
２０分間静置後、１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離して沈殿物を回収し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス
塩酸塩緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０））に溶
かして、２６０ｎｍの吸光度により定量後、固定化反応
に供した。

【０１００】（３） ³²Ｐによる標識 （１）で得たポリヌクレオチドＡ（−）を次のようにし
て³²Ｐにより標識した。

【０１０１】（１）で得られたポリヌクレオチドＡ
（−）水溶液１μｌ（ポリヌクレオチド２ｎｍｏｌｅ含
有）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）１μｌ（酵素活性にして８Ｕ）、γ−³²
Ｐアデノシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣ
ｉ）、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液５μｌおよ
び滅菌水３９μｌを、２ｍｌエッペンドルフ遠心管に入
れ、混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。

【０１０２】次に、反応液からＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼをフェノール抽出法（"Molecular Cloning", Col
d Spring Harbor Laboratories，1982, p. 458 参照）
によって除去した後、反応液をＴＮＥ緩衝液で膨潤させ
たセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム
（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。

【０１０３】なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リ
ン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。 組成：０.５Ｍ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７.６ ０.１Ｍ 塩化マグネシウム ５０ｍＭ ジチオスレイトール １ｍＭ スペルミジン １ｍＭ エチレンジアミン四酢酸 ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各
画分の放射線量をチェレンコフーカウント法によって測
定して素通り画分を判別し集めた。この結果、 ³²Ｐによ
って標識した２種のポリヌクレオチドについてのＴＮＥ
緩衝溶液２００μｌが得られた。これらは、１μｌ当り
４００,０００ｃｐｍのカウントの放射線量を有する溶
液であった。

【０１０４】（４）表面がカルボキシ変性された粒子へ
の固定化 粒径１.０μｍ、表面積１ｎｍ²当り５個のカルボキシル
基を有する表面がカルボキシル変性されたポリスチレン
粒子イムテックスＬ０１０１（日本合成ゴム（株）製）
の１０（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ塩酸懸濁液を１００
０μｌ、（２）で調製したプローブ核酸Ａを１ｎｍｏｌ
ｅ、１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プ
ロピルカルボジイミドの０.５（ｗ／ｖ）％０.０００１
Ｎ塩酸溶液を５００μｌをそれぞれエッペンドルフ遠心
管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合するこ
とにより、二本鎖化されたハイブリッド形成性塩基配列
を一本鎖の固定化領域を介して粒子にアミド結合させ
た。その後、１０,０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、
ハイブリッド形成用担体を沈殿として回収した。沈殿分
を滅菌蒸留水で再分散し、８０℃のウォーターバス中１
０分間加温してから、直ちに、０℃の氷水に浸し、５分
間放置後、−２０℃に設定した遠心機で１０,０００ｒ
ｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した。この操作に
よりプローブ核酸Ａ（＋）の相補鎖Ａ（−）を粒子から
除去した。次に、結合用緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸
塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、０.
１（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸よりなる緩衝液）をハイブリッ
ド形成用担体に１ｍｌ添加し、ハイブリッド形成用担体
を再分散させた後、１０,０００ｒｐｍで３分間遠心分
離し、ハイブリッド形成用担体を回収した。この操作を
３回繰り返してハイブリッド形成用担体を洗浄し、最終
的に、ＴＥ緩衝液で１０００μｌに再分散した。

【０１０５】（５）有効固定化率の評価 （４）で調製したプローブ核酸Ａ（＋）を固定化した担
体１０（ｗ／ｖ）％を１００μｌ（１００ｐｍｏｌｅプ
ローブ核酸含有）を８本のエペンドルフチューブに入れ
た。標的核酸として（３）で標識したＡ（−）を１μｌ
（チェレンコフカウントは約４００,０００ｃｐｍ、１
０ｐｍｏｌｅ相当）および（１）で合成した未標識のＡ
（−）をそれぞれ１０、３０、５０、７０、９０、１１
０、１３０、１５０ｐｍｏｌｅとなるように、それぞれ
Ａ−１からＡ−８までの８本のエペンドルフチューブに
加えた。全体の容量を１８０μｌとなるように、滅菌蒸
留水を加えて、チュレンコフカウントを測って、それら
の値をそれぞれのチューブのカウント１とした。

【０１０６】上記のように調製した８本のエペンドルフ
チューブを８０℃のウォーターバスに入れ、１０分間加
熱後、直ちに氷水に入れ、５分間静置後に、５Ｍ塩化ナ
トリウム２０μｌを加えて、４０℃のウォーターバスで
５分間加温し、ハイブリット形成体を調製した。次に、
１０,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、未反応の標的
核酸を含む上清を除去し、沈殿分を結合用緩衝液で２回
遠心洗浄し、最終的にＴＮＥ緩衝液で１００μｌに再分
散し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそ
れぞれのチューブのカウント２とした。

【０１０７】次に、上記試料を遠心分離して、沈殿分を
滅菌蒸留水で１００μｌに再分散し、６５℃のウォータ
ーバスに１０分間静置後、直ちに氷水により冷却した。
５分後１０,０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄し、上清を
除去した後、沈殿分を滅菌蒸留水で１００μｌに再分散
し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれ
ぞれチューブのカウント３とした。

【０１０８】標的核酸の捕獲率（［捕獲核酸量］／［標
的核酸量］×１００％）および捕獲した核酸の分離率
（［分離核酸量］／［捕獲核酸量］×１００％）を表１
にまとめた。

【０１０９】

【表１】

【０１１０】表１の結果より、１００ｐｍｏｌｅのプロ
ーブ核酸を固定化した本発明の担体を用いると、標的核
酸の最大捕獲量は９５ｐｍｏｌｅであった。従って、

【０１１１】

【数１】

【０１１２】は９５％である。

【０１１３】また、チューブＮｏ.Ａ−５につき、ハイ
ブリダイゼーション時間と捕獲率について調べた。結果
を表２にまとめた。従って、本実施例の担体に必要なハ
イブリダイゼーション時間は２分以内である。

【０１１４】

【表２】

【０１１５】（６）夾雑物核酸、蛋白質および血液検体
存在下での標的核酸の抽出 （４）で調製したプローブ核酸Ａを固定化した担体を１
０μｌ（１０ｐｍｏｌｅ相当）エペンドルフチューブに
取り、（３）で調整した標識Ａ（−）の２０倍希釈液を
１μｌ（０.５ｐｍｏｌｅ相当、約６.６ｎｇ）を加え
て、チュレンコフカウントを測った。その値をカウント
１とした。次にこのチューブにアルカリ加熱した一本鎖
のＣａｒｆ ＤＮＡおよびＳａｌｍｏｎ ＤＮＡ（塩基
数１０〜１００,０００）およびＨｅｌａ細胞から採取
したヒトＤＮＡをそれぞれ４４μｇ、牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を３５０μｇを加え、さらに陰性血液検体２００μ
ｌを入れ全容量を蒸留水で９００μｌに調整した。この
試料を８０℃のウォーターバスに１０分間静置後、直ち
に氷水に入れて、５分後５Ｍ塩化ナトリウム１００μｌ
を加えてから４０℃のウォーターバスで３分間インキュ
ベートした。その後、１０,０００ｒｐｍで３分間遠心
洗浄し、沈殿分を結合用緩衝液、ＴＮＥ緩衝液でそれぞ
れ１回洗浄し、チュレンコフカウントを測った。その値
をカウント２とした。次に、遠心分離して、分散液を蒸
留水に置換えて、８０℃のウォーターバスで１０分間加
熱した後、直ちに氷冷した。続いて、遠心洗浄により、
上清を除去し、蒸留水で再分散し、チュレンコフカウン
トを測った。その値をカウント３とした。捕獲率および
分離率の結果を表３に示す。

【０１１６】

【表３】

【０１１７】（７）ＰＣＲ法による標的核酸の増幅 ＨＩＶ ＤＮＡ全長鎖をゲノムＤＮＡに導入して、増し
て得られたＮＹ１０株のＨＩＶ ＤＮＡを５０ｍｌの遠
心管に１０倍ずつ順次希釈した。それぞれの希釈液５０
ｍｌの中から１０μｌを取り、PERKIN ELMER ＣＥＴＵ
Ｓ社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２０００を用
いて、次のプログラムで増幅反応を行なった。 ９４℃ １分 ５５℃ １.５分 ７２℃ ３分 ３０サイクル ７２℃ ７分 ＰＣＲ法の反応液の組成は、 １０ｘ リアクションバッファ（タカラ製） ２.５μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ｍＭ）（タカラ製） ５.０μｌ プライマー ＳＫ１４５Ａ（２０ｍＭ） ０.５μｌ プライマー ＳＫ４５１Ａ（２０ｍＭ） ０.５μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.５unit/ml）（タカラ製） １.２５μｌ 減菌蒸留水 ５.２５μｌ ミネラールオイル（シグマ社製） １ drop である。

【０１１８】プライマーＳＫ１４５Ａの配列は ５’ ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ ３' プライマーＳＫ４５１Ａの配列は ５’ ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ ３' であって、これらをアプライドバイオシステム社製ＤＮ
Ａ合成器３８１Ａ型を用いて、メーカーマニュアルに従
って合成し、ＨＰＬＣ精製品を用いた。

【０１１９】上記ＰＣＲ法による増幅反応の生成物を５
μｌ取り、同様なプログラムで Nested ＰＣＲ法の反応
を行なった。その時のＰＣＲ法の反応液の組成は、プラ
イマー ＳＫ１４５Ａの代わりにＳＫ１４５（タカラ
製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１（タカラ製）
を使用した以外は同様に行なった。ＰＣＲ法および Nes
ted ＰＣＲ法の反応増幅産物を２％のアガロースゲル
（Agarose １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝
液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中で
Ｍｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムブロマ
イド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。
その結果を表４にまとめて示した。

【０１２０】

【表４】

【０１２１】（８）核酸結合用担体を用いた標的核酸の
濃縮およびＰＣＲ法による標的核酸の増幅 （４）と同様な方法で調製したプローブ核酸Ａ（＋）お
よびＢ（−）を固定化した担体の分散液をそれぞれ５μ
ｌ取り、前記（７）ＨＩＶ ＤＮＡを１０倍ずつ希釈し
た５０ｍｌ遠心管にそれぞれ加え、さらに５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液を３ｍｌ、２％ Triton １００溶液を２５０μ
ｌ、Ｈｅｌａ細胞から採取したヒトＤＮＡ溶液（５００
μｇ／ｍｌ）を５.５ｍｌ、Ｃａｌｆ ＤＮＡ溶液（５
００μｇ／ｍｌ）を５ｍｌおよび牛胎児血清を１５０μ
ｇそれぞれ加え、充分攪拌した後、７０℃にて３０分イ
ンキュベーションした。次いで、１５,０００ｒｐｍに
て５分間遠心し、上澄を捨て、沈澱分をＴＥ緩衝液／
０.１％ Triton溶液１０ｍｌで３回遠心洗浄し、最後
に、沈澱分を５０μｌの減菌蒸留水に分散した。次い
で、これらを１ｍｌの遠心管に２５μｌに分注し、９５
℃で５分間加熱した後、１０,０００ｒｐｍで遠心し、
上澄の１０μｌをＰＣＲ法の鋳型として使用した。残り
２５μｌの分散液の中から、１０μｌを取り、加熱、遠
心せずに粒子と共にＰＣＲ法の鋳型として前記（７）と
同様な条件でＰＣＲ法の反応を行なった。その後、上記
ＰＣＲ法による産物を５μｌずつ取り、前記（７）と同
様な条件でNested ＰＣＲ法の反応を行ない、アガロー
ス電気泳動で、増幅産物の有無を確認した。結果は表５
にまとめて示した。なお、コントロールとして、ＨＩＶ
ＤＮＡ希釈液の代わりに減菌蒸留水を使用した以外
は、全く上記と同様な操作を行なった。結果を表５に示
した。

【０１２２】

【表５】

【０１２３】実施例２ （１）プローブ核酸の調製および相補鎖の合成 実施例１の（１）と同様な方法で、プローブ核酸Ａ’
（＋）とＢ’（−）を合成した。但し、プローブ核酸
Ａ’（＋）とＢ’（−）は、それぞれＡ（＋）とＢ
（−）の固定化部位である５’末端（ｄＣ）₁₀の代わり
にアミノリンク２を使用した。

【０１２４】また、プローブ核酸Ａ’（＋）の合成にＡ
ＢＩ社製のＦＯＤ試薬を使用しても良いが、同じくＡＢ
Ｉ社製のβ−シアノエチルアミダイト（ＣＥＡ）試薬を
使用しても良い。ここでは、ＣＥＡを使用した。

【０１２５】プローブ核酸Ａ’（＋）の合成終了後、２
５％のアンモニア水で合成ヌクレオチドをカラムから切
り出した後、直ちに、２Ｎ塩酸でｐＨを中性に調整し、
減圧乾燥により乾燥させた。

【０１２６】次いで、実施例１の（１）と同様な方法
で、ゲル濾過、エタノール沈澱によって精製した。これ
らの操作によって５’末端に第１級アミノ基を有し、ヌ
クレオチド塩基のアミノ基がベンゾイル基またはイソブ
チル基を有する化合物で化学的に保護されたプローブ核
酸約１ｍｇが５００μｌの水溶液として得られた。

【０１２７】また、プローブ核酸Ａ’（＋）の相補鎖と
して、実施例１の（１）で調製したプローブ核酸Ａ
（−）および実施例１の（３）で標識したプローブ核酸
Ａ（−）をそのまま利用した。

【０１２８】（２）表面がカルボキシ変性された粒子へ
の固定化および固定化後の脱保護基 実施例１の（４）と同様な方法でプローブ核酸Ａ’
（＋）を粒子に固定した。この場合、５’末端に導入さ
れたアミノリンク２のアミノ基が粒子のカルボン酸とア
ミド結合を形成した。次いで、固定化担体の５（ｗ／
ｖ）％分散液２ｍｌを１０,０００ｒｐｍで２分間遠心
分離して、固定化担体を沈殿として回収した。この沈殿
に２５％のアンモニア水を２ｍｌ入れ、再分散させ、チ
ューブのふたを密封してから、５５℃の恒温槽に一夜放
置した。次に１０,０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、
沈殿を結合用緩衝液２ｍｌ添加し、ハイブット形成用担
体を再分散させた。同様な遠心洗浄操作を５回以上繰り
返して、離脱された保護化合物を分散液中に除去すると
ともに分散液のｐＨを８に合わせた。最終的に沈殿を１
ｍｌのＴＥ緩衝液に再分散し、１０（ｗ／ｖ）％の担体
分散液を得た。

【０１２９】（３）有効固定化率の評価 実施例１の（５）と同様な方法で、（２）で調整したプ
ローブ核酸Ａ’（＋）の固定化担体の有効固定化率を評
価した。結果を表６に示す。

【０１３０】

【表６】

【０１３１】表６の結果より、１００ｐｍｏｌｅのプロ
ーブヌクレオチドを固定化した粒子を用いると、標的核
酸の最大捕獲量は９６ｐｍｏｌｅであった。これによっ
て、有効固定化率は９６％である。

【０１３２】（４）夾雑物核酸、蛋白質および血液検体
存在下での標的核酸の抽出 実施例１の（６）と同様な方法で求めた夾雑物存在下で
のプローブ核酸Ａ’（＋）を固定化した担体の捕獲率お
よび分離率の結果を表７に示す。

【０１３３】（５）ＨＩＶ ＤＮＡの濃縮およびＰＣＲ
法、Nested ＰＣＲ法による検出 実施例１の（８）と同様な方法で、プローブ核酸Ａ’
（＋）およびＢ’（−）それぞれを固定化した担体を用
いてＨＩＶ ＤＮＡの濃縮およびＰＣＲ法、Nested Ｐ
ＣＲ法による増幅、検出を行なった。その結果は１００
０倍の容積濃縮に比例して、それぞれ１０００倍のＰＣ
Ｒ法および Nested ＰＣＲ法の検出効果を確認できた。

【０１３４】

【表７】

【０１３５】実施例３ （１）５’末端のアミノ基を固定化反応に利用するため
のヌクレオチド配列の調製 ＡＢＩ社のＤＮＡ合成機を用いて、プローブ核酸Ａ”
（＋）を合成した。Ａ”（＋）配列は実施例１の（１）
のＡ（＋）と全く同じである。但し、ここでは、５’末
端の固定化部位である１０個のデオキシシチジル酸（ｄ
Ｃ）にＡＢＩ社製のＦＯＤホスホアミダイト試薬を使用
し、これ以外の配列部分に、ＡＢＩ社製のβ−シアノエ
チルアミダイト試薬を使用した。プローブ核酸Ａ”
（＋）の合成終了後、２５％のアンモニア水で合成ヌク
レオチドをカラムから切り出し、容器を密封して５５℃
に設定した恒温槽の中に、１時間放置し、ＦＯＤ試薬の
アミノ基保護基を外した。次いで、２Ｎ塩酸でｐＨを中
性に調整し、減圧乾燥より、ＤＮＡを乾燥させた。次
に、メーカーのマニュアルに従って、精製し、固定化反
応に使用するプローブ核酸Ａ”（＋）約１ｍｇが５００
μｌの水溶液として得られた。

【０１３６】（２）カルボキシ変性された粒子への合成
ヌクレオチド配列Ａ”（＋）の固定化 実施例１の（４）と同様な方法で、プローブ核酸Ａ’
（＋）の代りに（１）で調整したプローブ核酸Ａ”
（＋）を使用し、固定化反応を行なった。固定化反応終
了後、遠心分離することにより、上澄を２５％のアンモ
ニア水で置換し、５５℃に設定された恒温槽に７時間放
置し、β−シアノエチルアミダイト試薬のアミノ基保護
基を外した。その後、実施例２の（２）と同じ方法で、
固定化担体を精製し、最終的に１０（ｗ／ｖ）％に分散
させた。

【０１３７】（３）有効固定化率および夾雑物存在下で
の捕獲率と分離率 実施例２の（３）と同様な方法で、（２）で調製した担
体の有効固定化率を調べた。その結果、有効固定化率は
９５％であった。また、実施例２の（４）と同様な条件
下で、（２）で調製した担体の捕獲率と分離率を求め
た。これらはそれぞれ９７、１００％であった。

【０１３８】（４）ＨＩＶ ＤＮＡの濃縮およびＰＣＲ
による検出 実施例１の（８）と同様な方法で、プローブ核酸Ａ”
（＋）およびＢ”（−）それぞれを固定化した粒子担体
を用いて、ＨＩＶ ＤＮＡの濃縮および精製を行なっ
た。次いで、同様な条件でＰＣＲ増幅を行ない、電気泳
動で確認した。１０００倍の容積濃縮率に対して、１０
００倍のＰＣＲ法による増幅効果を確認できた。

【０１３９】

【発明の効果】本発明の核酸結合用担体は、標的核酸の
特定の部位を選択的に且つ均質に効率良く粒子表面に固
定化したものである。本発明による核酸結合用担体は検
査試料中の標的核酸が数分子程度しか存在しない試料に
対して、それ以外の夾雑物核酸、蛋白質、脂質などの細
胞由来物質などが大過剰に存在している試料であっても
標的核酸を適確で迅速に且つ高感度で抽出、分離あるい
は濃縮することが可能であり、分離される標的核酸を反
復増幅法による増幅反応の鋳型として使用すると濃縮容
積に比例する反復増幅法の増幅感度の向上が認められ
た。さらに本発明によれば、上記核酸結合用担体を簡単
に且つ効率よく調製することができる方法が提供され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安田 健二 東京都中央区築地二丁目11番24号 日本合 成ゴム株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性固体微粒子の表面上にハイブリッ
   ド形成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されてい
   る核酸結合用担体であって、（ｉ）該固体微粒子は、
   ０.０１〜２０μｍの平均粒径を有し、（ｉｉ）該固定
   化領域は、一端に第１級アミノ基を有し他端にハイブリ
   ッド形成性塩基配列端部の官能基と結合する官能基を有
   する化合物の残基であり、（ｉｉｉ）該固体微粒子表面
   と該固定化領域とは、該固体微粒子表面上に存在するカ
   ルボキシル基とアミド結合により固定化されており、
   （ｉｖ）該ハイブリッド形成性塩基配列は、その配列中
   に第１級アミノ基を有するヌクレオチドを含有してお
   り、（ｖ）該ハイブリッド形成性塩基配列は、その末端
   において該固定化領域と結合しており、且つ（ｖｉ）該
   固体微粒子表面上には、該固体微粒子１個当り少なくと
   も１個の該ハイブリッド形成性塩基配列が存在してい
   る、ことを特徴とする核酸結合用担体。
2. 【請求項２】 不溶性固体微粒子の表面上にハイブリッ
   ド形成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されてい
   る核酸結合用担体の調製方法であって、（ａ）ハイブリ
   ッド形成性塩基配列を有し、該塩基配列が第１級アミノ
   基を有するヌクレオチドを含有しており、該第１級アミ
   ノ基は、該塩基配列と実質的に相補的な塩基配列で二本
   鎖状態にすることにより、またはアミノ基保護化合物を
   反応させることにより保護され、且つハイブリッド形成
   性塩基配列端部の官能基が、第１級アミノ基または第１
   級アミノ基形成基と該ハイブリッド形成性塩基配列端部
   の官能基と結合する官能基とを有する化合物と結合して
   いる縮合化合物を準備し、（ｂ）前記（ａ）の縮合化合
   物を０.０１〜２０μｍの平均粒径を有し、且つ表面上
   にカルボキシル基を有している不溶性固体微粒子と接触
   させて脱水縮合させ、かくして該固体微粒子と該固定化
   領域を固定化し、次いで（ｃ）該ハイブリッド形成性塩
   基配列における相補的な塩基配列または該ハイブリッド
   形成性塩基配列の第１級アミノ基における保護化合物を
   離脱させる、ことを特徴とする請求項１記載の核酸結合
   用担体の調製方法。
3. 【請求項３】 標的核酸を含有する検査試料と請求項１
   に記載の核酸結合用担体とを接触させて該核酸結合用担
   体に前記標的核酸を捕獲せしめることにより、前記標的
   核酸を濃縮および／または精製し、次いで反復増幅法に
   よって前記標的核酸を増幅させた後、前記標的核酸を検
   出することを特徴とする検査試料中の標的核酸の検出方
   法。