JP3800615B2 - 核酸診断用粒子の調製方法および該核酸診断用粒子を用いた検査試料中の標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸診断用粒子の調製方法およびそれを用いた標的核酸の検出方法に関する。更に詳しくは、標的核酸の特異的部位を選択的に結合させることが可能な、特に核酸との間のハイブリッド形成を利用した核酸の抽出、分離またその抽出、分離される標的核酸を増幅してから診断するのに適した核酸診断用粒子の調製方法およびそれを用いた標的核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
検査試料中の目的とする特定塩基配列を有する核酸を抽出、分離或いは検出する手段として、核酸のハイブリッド形成が利用されている。このハイブリダイゼーション法における反応では、標識化された或いは固体担体表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（すなわちプローブ）が、標的核酸と塩基対を形成する。
【０００３】
このハイブリダイゼーション法は、組み換えＤＮＡ技術分野の研究者等によって開発された方法で、一本鎖に変性されたＤＮＡまたはＲＮＡの核酸が適当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖核酸と塩基間の水素結合を介してハイブリッドを形成することを利用するものである。
【０００４】
一方、ＤＮＡを分離し、検出するために固体微粒子を使用することが提案されている。例えば Moyes および Stark は、ＳＶ４０ＤＮＡを、直径０.５〜１.０μｍのジアゾ化ｍ−アミノベンジルオキシメチルセルロース粒子に共有結合させて検出に使用することを教示しているが、この場合ハイブリッド形成に約２４時間もの長時間を要している［Ｃｅｌｌ ５：３０１（１９７５）］。
【０００５】
また、一本鎖核酸をラテックス粒子表面に固定して、ハイブリッド形成試験に使用することが提案されている（特開昭６３−２７０００号公報）。しかしこの試験では、一本鎖核酸のラテックス粒子表面への固定部位を選択することができない。そのためにハイブリッド形成効率が極めて低いので、標的核酸の数が微量な試料には適用できない。
【０００６】
上記の核酸固定化法の欠点を解消するために種々の核酸固定化支持体およびその製造方法が提案されている。その中に、核酸を構成するヌクレオチドの配列部分を炭素原子数４〜２０の炭素鎖（炭素原子の一部はＯ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子で置換されてもよく、“腕”と称される）を介在させて間接的に核酸を固定化した支持体が知られており、該核酸固定化支持体は、固定部位となるヌクレオチド中の塩基の特定部位を予め活性化させ、支持体に設けた“腕”となる反応性基と反応させて共有結合を形成させることにより製造される（特開昭６１−１３０３０５号公報）。また、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを固定化した支持体に核酸を酵素反応を利用して連結する方法が知られている（特開昭６１−２４６２０１号公報）。
【０００７】
しかし、前記特開昭６１−１３０３０５号公報記載の方法は、支持体を活性化させた後、有機溶媒、強アルカリまたは強酸で中間形成体を数回処理する必要があり、反応収率は僅かに１１％に過ぎない。その上、この方法は反応時間も数時間から数日を要することがあり、非常に煩雑で時間のかかる操作が必要である。また、特開昭６１−２４６２０１号公報に記載の方法は、固定化してあるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの有効量を高めるためには核酸を一定の方向性をもって連結する必要があるが、そのためには特開昭６１−１３０３０５号公報の方法の場合と同様の著しく煩雑な操作が必要である。また高価な酵素が大過剰に必要であると考えられ、経済的に不利である。従って、上記の２つの方法は、日常的に利用するには実用的でない。
【０００８】
さらに、固定化するプローブＤＮＡの相補鎖を予め作成し、これをプローブＤＮＡにアニールさせて固定化する方法も提案されているが、この方法を実施する場合、相補鎖ＤＮＡの合成並びにアニールした後のＤＮＡの精製に煩雑な操作を必要とする。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を極めて簡便な方法で、特定の固体微粒子表面に固定し、このＤＮＡ固定化粒子を使用して、検査試料中数分子程度の極めて僅かの量の標的核酸を含むに過ぎない検査試料から標的核酸を迅速かつ効率的に抽出し、例えば核酸増幅法を使用して診断することが可能な核酸診断用粒子の調製方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記調製方法によって得られた核酸診断用粒子を使用して、検査試料中の微量の標的核酸を簡便な手段でかつ的確に検出する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的の１つは、不溶性固体微粒子の表面上のハイブリッド形成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されている核酸診断用粒子の調製方法であって、
（ａ）第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハイブリッド形成性塩基配列とから構成される全長１０〜１５０塩基数の一本鎖オリゴヌクレオチドを準備し、
（ｂ）前記（ａ）の一本鎖オリゴヌクレオチドを表面上にカルボキシル基を有している不溶性固体微粒子とを接触させ、かくして該固体微粒子と該固体化領域を固定化する、
ことを特徴とする核酸診断用粒子の調製方法によって達成される。
【００１２】
また本発明者の研究によれば、本発明の他の目的は前記調製方法によって得られた核酸診断用粒子とを接触させて該標的核酸診断用粒子に前記標的核酸を捕獲せしめることにより前記標的核酸を濃縮および／または精製し、次いで反復増幅法によって前記標的核酸を増幅させた後、前記標的核酸を検出することを特徴とする検査試料中の標的核酸の検出方法によって達成される。
【００１３】
以下本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明における粒子における不溶性固体微粒子（以下、単に「微粒子」と称する）を形成する物質としては、有機高分子材料であることが望ましく、その高分子の材料としては例えば、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニルなどの芳香族ビニル化合物、α,β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミド類、α,β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビニル系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の有機高分子材料を示すことができる。さらに他の高分子材料としてアガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体を挙げることができる。
【００１４】
本発明における微粒子の比重は、好ましくは１.０１〜２ｇ／ｃｍ3であり、より好ましくは１.２〜１.７ｇ／ｃｍ3である。微粒子の比重が１.０１ｇ／ｃｍ3未満の場合、微粒子を分離するために、高速遠心が必要となり、また長時間を要する傾向がある。一方比重が２ｇ／ｃｍ3を超えると、標的核酸との反応の途中で微粒子が沈降しハイブリダイゼーションが効率よく進行し難くなる。
【００１５】
比重が１.０１ｇ／ｃｍ3以上の微粒子は、前記高分子材料に、さらにハロゲン原子を分子中に含有するモノマーを加えて、重合することにより得ることができる。このハロゲン原子を分子中に含有するモノマーの具体例としては、例えばモノフルオロフェニル（メタ）アクリレート、モノクロロフェニル（メタ）アクリレート、トリクロロフェニル（メタ）アクリレート、ペンタクロロフェニル（メタ）アクリレート、モノブロモフェニル（メタ）アクリレート、トリブロモフェニル（メタ）アクリレート、モノイオドフェニル（メタ）アクリレート、ペンタブロモフェニル（メタ）アクリレート、２−（トリブロモフェノキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（トリブロモフェノキシエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（ペンタクロロフェノキシ）プロピル（メタ）アクリレートおよび１−（トリブロモフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートを挙げることができる。
【００１６】
これらのうち、特に好ましいものは、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルアクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルメタクリレート、α−クロロフェニルアクリレートおよびα−クロロフェニルメタクリレートである。
【００１７】
これらハロゲン原子を分子中に含有するモノマーは、通常常温で水溶性の固体である。従ってこれらは前記した高分子材料のモノマーと一緒に水性媒体中に微分散させてエマルジョンとし、次いで乳化重合、懸濁重合、シード重合、溶液沈澱重合などを行うことにより、目的とする微粒子を得ることができる。
【００１８】
全モノマー中のハロゲン原子を分子中に含有するモノマーの割合は、所望の微粒子の種類、比重などに応じて適宜選択することができるが、重合反応の効率を考慮すると、一般的には、３０〜７０重量％の範囲が適当である。
【００１９】
本発明に用いられる微粒子の表面は非多孔質であることが望ましい。ここで、微粒子の表面が「非多孔質」であることは、長径が０.０１μｍ以上である孔を微粒子の表面に有しないことを意味する。微粒子の表面が非多孔質でないと、即ち、長径で０.０１μｍ以上である孔が微粒子の表面に存在すると、後述の核酸検出法などで用いられる標識プローブが微粒子の内部に捕捉されるなどの原因によりハイブリッド形成分析の感度や精度の向上が望めない。なお、このように、微粒子の表面は非多孔質であることが望ましいが、微粒子の内部に独立気泡などが存在してもよい。
【００２０】
本発明に使用する微粒子の平均粒子径は、遠心分離などの簡便な操作で微粒子を回収するために好ましくは０.１μｍ以上、より好ましくは０.５μｍ以上である。一方、微粒子の単位沈降体積当りの表面積を大きくし、且つハイブリッド形成に適当な条件下で均一に分散する状態を保つことによって高いハイブリッド形成効率を達成するために、好ましくは１５μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下である。
さらに、本発明に用いる微粒子は、水性媒体中で使用するために、水不溶性でなければならない。
【００２１】
本発明の核酸診断用粒子は、前記したとおり、微粒子の表面上に、第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域を介して結合しており、その微粒子表面とその固定化領域とは、微粒子表面上に存在するカルボキシル基とアミド結合により固定化されている。
【００２２】
従って本発明における微粒子は、その表面にアミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する必要がある。もし微粒子がその表面にカルボキシル基を有しない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入する必要がある。カルボキシル基は微粒子表面積１ｎｍ2当り少なくとも１個存在することが好ましく、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは５個以上である。
【００２３】
このようなカルボキシル基を表面に有し、前記方法に好適な微粒子としては、例えばイムテックスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０２、Ｇ０３０１、Ｇ０２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１、Ｌ０１０２、ＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３、Ｈ１００９、Ｈ１００３、Ｈ２００１、Ｈ０９０３などの商品名［日本合成ゴム（株）］で市販されているものが挙げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する微粒子は、酸素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの耐熱性を有するものである。また、カルボキシル基を有しない微粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、従来より知られている種々の方法を利用することができる。
【００２４】
次に本発明に使用する一本鎖オリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明に用いられる、一本鎖オリゴヌクレオチドは第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハイブリッド形成性塩基配列とから構成される。
【００２５】
塩基配列中のアミノ基と微粒子表面のカルボキシル基とのアミド結合は、水溶性カルボジイミドの存在下で実施した場合、塩基配列の配置によって反応性や結合位置が大きく異なるが、本発明によって前記一本鎖オリゴヌクレオチドを使用すれば、その一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を高効率かつ特異的に微粒子に固定化することができる。従って本発明の調製方法は、従来の固定化方法に比べて簡単な操作で高い選択率で核酸診断用粒子を得ることが可能となる。
【００２６】
本発明において使用する一本鎖オリゴヌクレオチドは全長が１０〜１５０塩基数、好ましくは２０〜１００塩基数のものである。このオリゴヌクレオチドの塩基数が１０塩基数未満であると、プローブとして短かすぎ、標的核酸とのハイブリダイゼーションが充分に行なわれなくなる。一方オリゴヌクレオチドの塩基数が１５０塩基数を超えるとプローブとして、それ以上長くなることにより利点は少なくなり、逆に一本鎖オリゴヌクレオチド調製の効率が低下する。
【００２７】
本発明における固定化領域の配列の長さは、５〜３０塩基数であり、好ましくは７〜１５塩基数であって、同一種の第１級アミノ基より形成されている。固定化領域の長さが５塩基数未満の場合、微粒子表面へ固定化される効率が低下し、一方３０塩基数を超えると、微粒子表面のカルボキシル基との結合反応において不必要に長くなり一本鎖オリゴヌクレオチドの調製の効率が低下する。
【００２８】
前記固定化領域配列は、一本鎖オリゴヌクレオチド中の任意の位置に存在していてもよいが、標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を効率よく行なわせしめるためには、固定化領域配列は一本鎖オリゴヌクレオチドの末端部位に存在させておくことが好ましい。一方、一本鎖オリゴヌクレオチド中に複数のプローブＤＮＡを含有する場合には、プローブＤＮＡとプローブＤＮＡの間に、すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチドの末端部位以外の部位に固定化領域配列を存在させることもできる。
【００２９】
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドにおけるハイブリッド形成性塩基配列は、同一種塩基からなる連続配列が５塩基数未満であることが必要である。同一種塩基の連続した配列が５塩基数以上となると、その連続した配列中の第１級アミノ基と、微粒子表面のカルボキシル基の反応性が高くなり、固定化領域配列を高い選択率で固定化できなくなる恐れがある。
【００３０】
本発明における第１級アミノ基を有するヌクレオチドとしては、デオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）およびデオキシグアニル酸（ｄＧ）を挙げることができるが、微粒子表面におけるカルボキシル基との反応性が高い点でデオキシアデニル酸（ｄＡ）およびデオキシシチジル酸（ｄＣ）が好ましい。
【００３１】
本発明において、表面にカルボキシル基を有する微粒子と前記一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触させる固定化反応は、例えば適当な大きさの反応容器に該微粒子と該一本鎖オリゴヌクレオチドとを仕込んだ後、脱水縮合剤を添加して行なう。
【００３２】
ここで脱水縮合剤としては、例えば１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３'−スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジヒドロキノリンなどの水溶性の脱水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、油溶性の脱水縮合剤も使用することができる。これらの脱水縮合剤は、使用する微粒子が表面に有するカルボキシル基１グラム当量に対して、通常、１〜２０モル、好ましくは２〜１０モル使用する。
【００３３】
微粒子の使用量は、一本鎖オリゴヌクレオチド１ミリモル当たり、通常、０.５〜５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇである。上記反応は、通常ｐＨ３〜１１程度の水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃において、５分ないし一夜行えばよい。
【００３４】
次に本発明により調製された核酸診断用粒子を利用し検査試料中の標的核酸を検出する方法について説明する。
【００３５】
本発明により得られた核酸診断用粒子を使用して、試料中の標的核酸を迅速に捕獲するためのハイブリッド形成反応は、それ自体知られている通常の溶液ハイブリッド形成反応条件をそのまま適用して実施することができる。
【００３６】
ハイブリッド形成に適当な緩衝液としては、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウムまたたは１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液に０.５（ｗ／ｖ）％となる量のドデシル硫酸ナトリウム、５０（ｖ／ｖ）％となる量のホルムアミドおよび１０（ｗ／ｖ）％となる量のサケ精子ＤＮＡを混合した水溶液などが挙げられるが、この組成に限定されるものではない。
【００３７】
前記したように本発明により得られた核酸診断用粒子は、特に標的核酸を極く微量含有し、試料検体は、血液、だ液、汗或いは尿の如き、夾雑物核酸、蛋白質、脂質などが、標的核酸に比べて大過剰に存在している試料からの標的核酸の抽出、分離、濃縮または検出に極めて適している。例えば血液検体中の極く微量のウイルス細菌などの核酸を迅速且つ的確に、抽出、分離、濃縮または検出するのに有効である。その場合のハイブリッド形成反応の緩衝液としては、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液が挙げられる。
【００３８】
ハイブリッド形成反応の温度は０〜８０℃、好ましくは１５〜７０℃の範囲であり、時間は０〜１５分で充分である。
【００３９】
本発明により得れた核酸診断用粒子の使用により捕獲した標的核酸は、反復増幅法により増幅させてから検出することができる。ここで、反復増幅法としてはポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）、リガーゼチェーンリアクション法（ＬＣＲ法）、サイクリングプローブリアクション法（ＣＰＲ法）、分岐ＤＮＡプローブ法などを例示することができるが、特に好ましくはＰＣＲ法である。なお前記標的核酸の増幅は標的核酸を微粒子から分離して反復増幅法により増幅してもよく、また分離しないで微粒子に保持された状態で反復増幅法により増幅させてもよい。かくして本発明の核酸診断用粒子は、反復増幅法に利用することにより一層優れた効果が発現される。この点について以下ＰＣＲ法を挙げ詳細に説明する。
【００４０】
一般に検査試料の容量は、その種類によって、数百μｌから数十リットルの範囲にある。例えば感染症検査においても、全血サンプルの採血量は数ｍｌから数百ｍｌまでその対象となりうる。これに対し、本発明の核酸診断用粒子を用いて濃縮される目的核酸を含有する試料の容量は、適用する核酸増幅方法の種類によって数μｌ〜数百μｌの間で調整することができる。ＰＣＲ検出法の場合、通常数μｌ〜数十μｌの範囲である。
【００４１】
検査試料中の標的核酸の検出において、本発明の核酸診断用粒子を用いることは、大容量の検査試料中に僅かしか存在しない目的核酸でも漏れなく結合させ濃縮することおよび増幅反応に無用な他の核酸、蛋白質などの生体物質を増幅系から除去することで検出バックグランドを落とし検出感度を高めるという２つの利点が達成できる。
【００４２】
本発明の核酸診断用粒子は、標的核酸数が非常に少ないときに特に有効である。具体的には、採取される所定量の検査試料中に、標的核酸が数分子程度しか存在しない場合、通常行なわれるプローブ標識検出法は感度が不足しているため使用できない。また、所定量の検体中の一部を取り、ＰＣＲ法により増幅して検出するにも、その一部の検体に標的核酸が存在しないことがあり、結果的にＰＣＲ法による増幅を行なっても検出できず、時には陰性となり、時には陽性となるような不確実な検出になってしまう。
【００４３】
本発明の核酸診断用粒子を用いて上記標的核酸の濃縮および／または精製を行なってから、ＰＣＲ法による鋳型として使用すれば、例えば１リットルの検体中に数個の分子の標的核酸が存在するに過ぎない場合に、本発明の核酸診断用粒子を用いて数個の分子の標的核酸を１０μリットルに濃縮すれば、約１０5倍のＰＣＲ法による感度アップが達成できる。
この場合、他の検体成分との分離、標的核酸の濃縮あるいは精製は具体的にはハイブリッド形成反応によって、標的核酸がプローブＤＮＡと結合することによって核酸診断用微粒子に固定化したものを遠心分離などの手段によって行なうことができる。
【００４４】
本発明の核酸診断用粒子を用いて、標的核酸の濃縮および／または精製を行ない、次いで、熱またはアルカリ変性によって標的核酸を核酸診断用粒子から分離してからＰＣＲ法により増幅してもよいし、核酸診断用粒子から分離せずに該粒子と共にＰＣＲ法により増幅してもよい。この場合、プライマー位置はハイブリッド形成性塩基配列と同じ位置またはより増幅される断片の内側に選定して行なうことはＰＣＲ法の反応の効率から好ましい。
【００４５】
本発明の核酸診断用粒子を用いて標的核酸の濃縮および／または精製を行なう過程の中で、検体中他の成分との分離、特にＰＣＲ法の反応を阻害するインヒビターなどの分離も当然行なわれることになるので、標的核酸の濃縮過程には、有害物質の除去も達成できることになる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する、但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例
（１）プローブＤＮＡの調製
エイズウイルス ＨＩＶ−１の遺伝子を標的核酸として、下記の塩基配列を合成した。
プローブＤＮＡ Ａ（＋）
５'ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＣ ３'
プローブＤＮＡ Ａ（＋）はＤＮＡ合成装置（パーキンエルマ ３９１型）を用いてβ−シアノエチルホスホアミダイド法により合成した。合成したポリヌクレオチドの固相からの切り出しおよび採取は、該装置のためのマニュアルに従って行なった。合成したプローブＤＮＡの精製はＯＰＣカラムを用いて行なった（同メーカーマニュアルに従って行なった）。
また、プローブＤＮＡ Ａ（＋）と同様な方法で、以下のプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用ＤＮＡを合成、精製した。
【００４８】
（２）32Ｐによる標識
（１）で調製したプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用のＤＮＡ、Ａ（−）11、Ａ（−）19、Ａ（−）28、Ａ（−）37、Ａ（−）1およびＡ（−）をそれぞれ次のように［γ−32Ｐ］ＡＴＰで標識した。
各精製されたＤＮＡ溶液を１μｌ（ポリヌクレオチド２ｎｍｏｌｅ含有）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ（酵素活性にして８Ｕ）、γ−32Ｐアデノシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣｉ）、１０倍濃度の５'−リン酸化用緩衝液５μｌおよび滅菌水３９μｌを、２ｍｌエッペンドルフ遠心管に入れ、混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４９】
次に、反応液からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratories，1982, p. 458 参照）によって除去した後、反応液をＴＮＥ緩衝液で膨潤させたセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。
【００５０】
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。
ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各画分の放射線量をチェレンコフーカウント法によって測定して素通り画分を判別し集めた。この結果、32Ｐによって標識した２種のポリヌクレオチドについてのＴＮＥ緩衝溶液２００μｌが得られた。これらは、１μｌ当り約４００,０００ｃｐｍのカウントの放射線量を有する溶液であった。
【００５１】
（３）プローブＤＮＡ Ａ（＋）の微粒子への固定化
平均粒子径１.０μｍ、表面積１ｎｍ2当り５個のカルボキシル基を有する表面がカルボキシル変性され、比重が１.３ｇ／ｃｍ3のポリスチレン系粒子Ｈ１００３（日本合成ゴム（株）製）の１０（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ塩酸懸濁液を１０００μｌ、（１）で調製したプローブＤＮＡ Ａ（＋）を１ｎｍｏｌｅ、１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０.５（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ塩酸溶液を５００μｌをそれぞれエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより、プローブＤＮＡＡ（＋）を前記粒子にアミド結合させた。その後、３,０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、プローブＤＮＡ固定化粒子を沈殿として回収した。次に、結合用緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、０.１（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸よりなる緩衝液）を１ｍｌ添加し、プローブＤＮＡ固定化粒子を再分散させた後、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、プローブＤＮＡ固定化粒子を回収した。この操作を３回繰り返してプローブＤＮＡ固定化粒子を洗浄し、最終的にＴＮＥ緩衝液で１０００μｌに再分散した。（以下、「固定化粒子分散液」という。）
【００５２】
（４）固定化部位の確認
固定化粒子分散液１００μｌ（１００ｐｍｏｌｅのプローブＤＮＡ Ａ（＋）を含有）をそれぞそれＮｏ.１からＮｏ.６までの６本のエペンドルフチューブに入れた。
（２）で標識したプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用配列Ａ（−）11、Ａ（−）19、Ａ（−）28、Ａ（−）37、Ａ（−）1およびＡ（−）をそれぞれＮｏ.１からＮｏ.６のチューブ順に１０μｌ（チェレンコフカウントは約４,０００,０００ｃｐｍ、１００ｐｍｏｌｅ相当）を入れてから、滅菌蒸留水で全体の容量を１８０μｌとなるように調整した。次にそれぞれのチューブのチュレンコフカウントを測ってそれらの値をそれぞれのチューブのカウント１とした。
【００５３】
上記のように調製した６本のエペンドルフチューブを８０℃のウォーターバスに入れ、１０分間加熱後、直ちに氷水に入れ、５分間静置後に、５Ｍ塩化ナトリウム２０μｌを加えて、４０℃のウォーターバスで５分間加温し、ハイブリット形成体を調製した。次に、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、未反応の標的核酸を含む上清を除去し、沈殿分を結合用緩衝液で２回遠心洗浄し、最終的にＴＮＥ緩衝液で１８０μｌに再分散し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれぞれのチューブのカウント２とした。
【００５４】
次に、上記試料を遠心分離して、沈殿分を滅菌蒸留水で１８０μｌに再分散し、８０℃のウォーターバスに１０分間静置後、直ちに氷水により冷却した。５分後３,０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄し、上清を除去した後、沈殿分を滅菌蒸留水で１８０μｌに再分散し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれぞれチューブのカウント３とした。
【００５５】
標的核酸の捕獲率（［捕獲核酸量］／［標的核酸量］×１００％）および捕獲した核酸の分離率（［分離核酸量］／［捕獲核酸量］×１００％）を表１にまとめた。
【００５６】
【表１】
【００５７】
前記表１の結果からプローブＤＮＡ Ａ（＋）配列の５'末端の（ｄＣ）10部分が特異的に微粒子に固定化できたことが理解される。
【００５８】
（５）細胞抽出液でのＨＩＶ ＤＮＡの分離およびＰＣＲによる検出
Ｈｅｌａ細胞の抽出液（蛋白質２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮＡ ＲＮＡ ５０μｇ／ｍｌおよび脂質、糖その他１０μｇ／ｍｌの混合液）２０ｍｌにＨＩＶ−ＤＮＡ全長鎖ゲノムＤＮＡ（ＮＹ１０株より培養）をそれぞれ０、３、５、１０、２５分子ずつ５本のチューブに添加した。各チューブから、それぞれ１０μｌを取り、Nested ＰＣＲで検出した。続いて固定化粒子分散液２μｌおよび５Ｍ ＮａＣｌ １.０ｍｌをＮｏ.１〜５のチューブに加え、十分攪拌してから、４５℃の水温槽で３０分間静置した後に、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子にＰＣＲ反応液５０μｌを加えて、再分散し、その再分散液５０μｌを全部ＰＣＲ反応用チューブに移し、ＰＣＲ反応による増幅を行なった。ＰＣＲ法の反応液の組成は、
１０ｘ リアクションバッファ（タカラ製） １０μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ｍＭ）（タカラ製） ２０μｌ
プライマー ＳＫ１４５Ａ（２０ｍＭ） ２μｌ
プライマー ＳＫ４５１Ａ（２０ｍＭ） ２μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.５unit／ｍｌ）（タカラ製）５μｌ
滅菌蒸留水 １１μｌ
ミネラールオイル（シグマ社製） １drop
である。
【００５９】
またＰＣＲ反応による増幅は、PERKIN ELMER ＣＥＴＵＳ社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２０００を用いて、次のプログラムで増幅反応を行なった。
９４℃ １分
５５℃ １.５分
７２℃ ３分
３０サイクル
７２℃ ７分
プライマーＳＫ１４５Ａの配列は
５' ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ ３'
プライマーＳＫ４５１Ａの配列は
５' ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ ３'
であって、市販のものを使用した。
【００６０】
上記ＰＣＲ法による増幅反応の生成物の１０倍希釈液を５μｌ取り、同様なプログラムで Nested ＰＣＲ法の反応を行なった。その時のＰＣＲ法の反応液の組成は、プライマー ＳＫ１４５Ａの代わりにＳＫ１４５（タカラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１（タカラ製）を使用した以外は同様に行なった。
Nested ＰＣＲ法の反応増幅産物を２％のアガロースゲル（Agarose １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムブロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。その結果を表２にまとめて示した。
【００６１】
尚、本実験におけるＨＩＶ ＤＮＡの分子数は２６０ｎｍでの吸光度から濃度を算出し、さらに原液を１０倍ずつ順次希釈し、１分子レベルまでNested ＰＣＲ検出できることを確認したものを使用した。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を極めて簡便な方法で、特定の不溶性固体微粒子表面に固定し、このＤＮＡ固定化粒子を使用して、検査試料中数分子程度の極めて僅かの量の標的核酸を含むに過ぎない検査試料から標的核酸を迅速かつ効率的に抽出し、例えば核酸増幅法を使用して診断することが可能な核酸診断用粒子の調製方法が提供され、またそれを使用した標的核酸の検出方法が提供される。
【００６４】
本発明により調製された核酸診断用粒子は一般の病院、血液センター等に備え付けられている血球分離用遠心機で容易に分離することができる。
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸診断用粒子の調製方法およびそれを用いた標的核酸の検出方法に関する。更に詳しくは、標的核酸の特異的部位を選択的に結合させることが可能な、特に核酸との間のハイブリッド形成を利用した核酸の抽出、分離またその抽出、分離される標的核酸を増幅してから診断するのに適した核酸診断用粒子の調製方法およびそれを用いた標的核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
検査試料中の目的とする特定塩基配列を有する核酸を抽出、分離或いは検出する手段として、核酸のハイブリッド形成が利用されている。このハイブリダイゼーション法における反応では、標識化された或いは固体担体表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（すなわちプローブ）が、標的核酸と塩基対を形成する。
【０００３】
このハイブリダイゼーション法は、組み換えＤＮＡ技術分野の研究者等によって開発された方法で、一本鎖に変性されたＤＮＡまたはＲＮＡの核酸が適当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖核酸と塩基間の水素結合を介してハイブリッドを形成することを利用するものである。
【０００４】
一方、ＤＮＡを分離し、検出するために固体微粒子を使用することが提案されている。例えば Moyes および Stark は、ＳＶ４０ＤＮＡを、直径０.５〜１.０μｍのジアゾ化ｍ−アミノベンジルオキシメチルセルロース粒子に共有結合させて検出に使用することを教示しているが、この場合ハイブリッド形成に約２４時間もの長時間を要している［Ｃｅｌｌ ５：３０１（１９７５）］。
【０００５】
また、一本鎖核酸をラテックス粒子表面に固定して、ハイブリッド形成試験に使用することが提案されている（特開昭６３−２７０００号公報）。しかしこの試験では、一本鎖核酸のラテックス粒子表面への固定部位を選択することができない。そのためにハイブリッド形成効率が極めて低いので、標的核酸の数が微量な試料には適用できない。
【０００６】
上記の核酸固定化法の欠点を解消するために種々の核酸固定化支持体およびその製造方法が提案されている。その中に、核酸を構成するヌクレオチドの配列部分を炭素原子数４〜２０の炭素鎖（炭素原子の一部はＯ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子で置換されてもよく、“腕”と称される）を介在させて間接的に核酸を固定化した支持体が知られており、該核酸固定化支持体は、固定部位となるヌクレオチド中の塩基の特定部位を予め活性化させ、支持体に設けた“腕”となる反応性基と反応させて共有結合を形成させることにより製造される（特開昭６１−１３０３０５号公報）。また、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを固定化した支持体に核酸を酵素反応を利用して連結する方法が知られている（特開昭６１−２４６２０１号公報）。
【０００７】
しかし、前記特開昭６１−１３０３０５号公報記載の方法は、支持体を活性化させた後、有機溶媒、強アルカリまたは強酸で中間形成体を数回処理する必要があり、反応収率は僅かに１１％に過ぎない。その上、この方法は反応時間も数時間から数日を要することがあり、非常に煩雑で時間のかかる操作が必要である。また、特開昭６１−２４６２０１号公報に記載の方法は、固定化してあるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの有効量を高めるためには核酸を一定の方向性をもって連結する必要があるが、そのためには特開昭６１−１３０３０５号公報の方法の場合と同様の著しく煩雑な操作が必要である。また高価な酵素が大過剰に必要であると考えられ、経済的に不利である。従って、上記の２つの方法は、日常的に利用するには実用的でない。
【０００８】
さらに、固定化するプローブＤＮＡの相補鎖を予め作成し、これをプローブＤＮＡにアニールさせて固定化する方法も提案されているが、この方法を実施する場合、相補鎖ＤＮＡの合成並びにアニールした後のＤＮＡの精製に煩雑な操作を必要とする。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を極めて簡便な方法で、特定の固体微粒子表面に固定し、このＤＮＡ固定化粒子を使用して、検査試料中数分子程度の極めて僅かの量の標的核酸を含むに過ぎない検査試料から標的核酸を迅速かつ効率的に抽出し、例えば核酸増幅法を使用して診断することが可能な核酸診断用粒子の調製方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記調製方法によって得られた核酸診断用粒子を使用して、検査試料中の微量の標的核酸を簡便な手段でかつ的確に検出する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的の１つは、不溶性固体微粒子の表面上のハイブリッド形成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されている核酸診断用粒子の調製方法であって、
（ａ）第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハイブリッド形成性塩基配列とから構成される全長１０〜１５０塩基数の一本鎖オリゴヌクレオチドを準備し、
（ｂ）前記（ａ）の一本鎖オリゴヌクレオチドを表面上にカルボキシル基を有している不溶性固体微粒子とを接触させ、かくして該固体微粒子と該固体化領域を固定化する、
ことを特徴とする核酸診断用粒子の調製方法によって達成される。
【００１２】
また本発明者の研究によれば、本発明の他の目的は前記調製方法によって得られた核酸診断用粒子とを接触させて該標的核酸診断用粒子に前記標的核酸を捕獲せしめることにより前記標的核酸を濃縮および／または精製し、次いで反復増幅法によって前記標的核酸を増幅させた後、前記標的核酸を検出することを特徴とする検査試料中の標的核酸の検出方法によって達成される。
【００１３】
以下本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明における粒子における不溶性固体微粒子（以下、単に「微粒子」と称する）を形成する物質としては、有機高分子材料であることが望ましく、その高分子の材料としては例えば、スチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニルなどの芳香族ビニル化合物、α,β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミド類、α,β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビニル系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の有機高分子材料を示すことができる。さらに他の高分子材料としてアガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体を挙げることができる。
【００１４】
本発明における微粒子の比重は、好ましくは１.０１〜２ｇ／ｃｍ3であり、より好ましくは１.２〜１.７ｇ／ｃｍ3である。微粒子の比重が１.０１ｇ／ｃｍ3未満の場合、微粒子を分離するために、高速遠心が必要となり、また長時間を要する傾向がある。一方比重が２ｇ／ｃｍ3を超えると、標的核酸との反応の途中で微粒子が沈降しハイブリダイゼーションが効率よく進行し難くなる。
【００１５】
比重が１.０１ｇ／ｃｍ3以上の微粒子は、前記高分子材料に、さらにハロゲン原子を分子中に含有するモノマーを加えて、重合することにより得ることができる。このハロゲン原子を分子中に含有するモノマーの具体例としては、例えばモノフルオロフェニル（メタ）アクリレート、モノクロロフェニル（メタ）アクリレート、トリクロロフェニル（メタ）アクリレート、ペンタクロロフェニル（メタ）アクリレート、モノブロモフェニル（メタ）アクリレート、トリブロモフェニル（メタ）アクリレート、モノイオドフェニル（メタ）アクリレート、ペンタブロモフェニル（メタ）アクリレート、２−（トリブロモフェノキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（トリブロモフェノキシエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（ペンタクロロフェノキシ）プロピル（メタ）アクリレートおよび１−（トリブロモフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートを挙げることができる。
【００１６】
これらのうち、特に好ましいものは、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルアクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルメタクリレート、α−クロロフェニルアクリレートおよびα−クロロフェニルメタクリレートである。
【００１７】
これらハロゲン原子を分子中に含有するモノマーは、通常常温で水溶性の固体である。従ってこれらは前記した高分子材料のモノマーと一緒に水性媒体中に微分散させてエマルジョンとし、次いで乳化重合、懸濁重合、シード重合、溶液沈澱重合などを行うことにより、目的とする微粒子を得ることができる。
【００１８】
全モノマー中のハロゲン原子を分子中に含有するモノマーの割合は、所望の微粒子の種類、比重などに応じて適宜選択することができるが、重合反応の効率を考慮すると、一般的には、３０〜７０重量％の範囲が適当である。
【００１９】
本発明に用いられる微粒子の表面は非多孔質であることが望ましい。ここで、微粒子の表面が「非多孔質」であることは、長径が０.０１μｍ以上である孔を微粒子の表面に有しないことを意味する。微粒子の表面が非多孔質でないと、即ち、長径で０.０１μｍ以上である孔が微粒子の表面に存在すると、後述の核酸検出法などで用いられる標識プローブが微粒子の内部に捕捉されるなどの原因によりハイブリッド形成分析の感度や精度の向上が望めない。なお、このように、微粒子の表面は非多孔質であることが望ましいが、微粒子の内部に独立気泡などが存在してもよい。
【００２０】
本発明に使用する微粒子の平均粒子径は、遠心分離などの簡便な操作で微粒子を回収するために好ましくは０.１μｍ以上、より好ましくは０.５μｍ以上である。一方、微粒子の単位沈降体積当りの表面積を大きくし、且つハイブリッド形成に適当な条件下で均一に分散する状態を保つことによって高いハイブリッド形成効率を達成するために、好ましくは１５μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下である。
さらに、本発明に用いる微粒子は、水性媒体中で使用するために、水不溶性でなければならない。
【００２１】
本発明の核酸診断用粒子は、前記したとおり、微粒子の表面上に、第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域を介して結合しており、その微粒子表面とその固定化領域とは、微粒子表面上に存在するカルボキシル基とアミド結合により固定化されている。
【００２２】
従って本発明における微粒子は、その表面にアミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する必要がある。もし微粒子がその表面にカルボキシル基を有しない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入する必要がある。カルボキシル基は微粒子表面積１ｎｍ2当り少なくとも１個存在することが好ましく、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは５個以上である。
【００２３】
このようなカルボキシル基を表面に有し、前記方法に好適な微粒子としては、例えばイムテックスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０２、Ｇ０３０１、Ｇ０２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１、Ｌ０１０２、ＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３、Ｈ１００９、Ｈ１００３、Ｈ２００１、Ｈ０９０３などの商品名［日本合成ゴム（株）］で市販されているものが挙げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する微粒子は、酸素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの耐熱性を有するものである。また、カルボキシル基を有しない微粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、従来より知られている種々の方法を利用することができる。
【００２４】
次に本発明に使用する一本鎖オリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明に用いられる、一本鎖オリゴヌクレオチドは第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハイブリッド形成性塩基配列とから構成される。
【００２５】
塩基配列中のアミノ基と微粒子表面のカルボキシル基とのアミド結合は、水溶性カルボジイミドの存在下で実施した場合、塩基配列の配置によって反応性や結合位置が大きく異なるが、本発明によって前記一本鎖オリゴヌクレオチドを使用すれば、その一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を高効率かつ特異的に微粒子に固定化することができる。従って本発明の調製方法は、従来の固定化方法に比べて簡単な操作で高い選択率で核酸診断用粒子を得ることが可能となる。
【００２６】
本発明において使用する一本鎖オリゴヌクレオチドは全長が１０〜１５０塩基数、好ましくは２０〜１００塩基数のものである。このオリゴヌクレオチドの塩基数が１０塩基数未満であると、プローブとして短かすぎ、標的核酸とのハイブリダイゼーションが充分に行なわれなくなる。一方オリゴヌクレオチドの塩基数が１５０塩基数を超えるとプローブとして、それ以上長くなることにより利点は少なくなり、逆に一本鎖オリゴヌクレオチド調製の効率が低下する。
【００２７】
本発明における固定化領域の配列の長さは、５〜３０塩基数であり、好ましくは７〜１５塩基数であって、同一種の第１級アミノ基より形成されている。固定化領域の長さが５塩基数未満の場合、微粒子表面へ固定化される効率が低下し、一方３０塩基数を超えると、微粒子表面のカルボキシル基との結合反応において不必要に長くなり一本鎖オリゴヌクレオチドの調製の効率が低下する。
【００２８】
前記固定化領域配列は、一本鎖オリゴヌクレオチド中の任意の位置に存在していてもよいが、標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を効率よく行なわせしめるためには、固定化領域配列は一本鎖オリゴヌクレオチドの末端部位に存在させておくことが好ましい。一方、一本鎖オリゴヌクレオチド中に複数のプローブＤＮＡを含有する場合には、プローブＤＮＡとプローブＤＮＡの間に、すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチドの末端部位以外の部位に固定化領域配列を存在させることもできる。
【００２９】
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドにおけるハイブリッド形成性塩基配列は、同一種塩基からなる連続配列が５塩基数未満であることが必要である。同一種塩基の連続した配列が５塩基数以上となると、その連続した配列中の第１級アミノ基と、微粒子表面のカルボキシル基の反応性が高くなり、固定化領域配列を高い選択率で固定化できなくなる恐れがある。
【００３０】
本発明における第１級アミノ基を有するヌクレオチドとしては、デオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）およびデオキシグアニル酸（ｄＧ）を挙げることができるが、微粒子表面におけるカルボキシル基との反応性が高い点でデオキシアデニル酸（ｄＡ）およびデオキシシチジル酸（ｄＣ）が好ましい。
【００３１】
本発明において、表面にカルボキシル基を有する微粒子と前記一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触させる固定化反応は、例えば適当な大きさの反応容器に該微粒子と該一本鎖オリゴヌクレオチドとを仕込んだ後、脱水縮合剤を添加して行なう。
【００３２】
ここで脱水縮合剤としては、例えば１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３'−スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジヒドロキノリンなどの水溶性の脱水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、油溶性の脱水縮合剤も使用することができる。これらの脱水縮合剤は、使用する微粒子が表面に有するカルボキシル基１グラム当量に対して、通常、１〜２０モル、好ましくは２〜１０モル使用する。
【００３３】
微粒子の使用量は、一本鎖オリゴヌクレオチド１ミリモル当たり、通常、０.５〜５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇである。上記反応は、通常ｐＨ３〜１１程度の水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃において、５分ないし一夜行えばよい。
【００３４】
次に本発明により調製された核酸診断用粒子を利用し検査試料中の標的核酸を検出する方法について説明する。
【００３５】
本発明により得られた核酸診断用粒子を使用して、試料中の標的核酸を迅速に捕獲するためのハイブリッド形成反応は、それ自体知られている通常の溶液ハイブリッド形成反応条件をそのまま適用して実施することができる。
【００３６】
ハイブリッド形成に適当な緩衝液としては、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウムまたたは１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液に０.５（ｗ／ｖ）％となる量のドデシル硫酸ナトリウム、５０（ｖ／ｖ）％となる量のホルムアミドおよび１０（ｗ／ｖ）％となる量のサケ精子ＤＮＡを混合した水溶液などが挙げられるが、この組成に限定されるものではない。
【００３７】
前記したように本発明により得られた核酸診断用粒子は、特に標的核酸を極く微量含有し、試料検体は、血液、だ液、汗或いは尿の如き、夾雑物核酸、蛋白質、脂質などが、標的核酸に比べて大過剰に存在している試料からの標的核酸の抽出、分離、濃縮または検出に極めて適している。例えば血液検体中の極く微量のウイルス細菌などの核酸を迅速且つ的確に、抽出、分離、濃縮または検出するのに有効である。その場合のハイブリッド形成反応の緩衝液としては、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液が挙げられる。
【００３８】
ハイブリッド形成反応の温度は０〜８０℃、好ましくは１５〜７０℃の範囲であり、時間は０〜１５分で充分である。
【００３９】
本発明により得れた核酸診断用粒子の使用により捕獲した標的核酸は、反復増幅法により増幅させてから検出することができる。ここで、反復増幅法としてはポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）、リガーゼチェーンリアクション法（ＬＣＲ法）、サイクリングプローブリアクション法（ＣＰＲ法）、分岐ＤＮＡプローブ法などを例示することができるが、特に好ましくはＰＣＲ法である。なお前記標的核酸の増幅は標的核酸を微粒子から分離して反復増幅法により増幅してもよく、また分離しないで微粒子に保持された状態で反復増幅法により増幅させてもよい。かくして本発明の核酸診断用粒子は、反復増幅法に利用することにより一層優れた効果が発現される。この点について以下ＰＣＲ法を挙げ詳細に説明する。
【００４０】
一般に検査試料の容量は、その種類によって、数百μｌから数十リットルの範囲にある。例えば感染症検査においても、全血サンプルの採血量は数ｍｌから数百ｍｌまでその対象となりうる。これに対し、本発明の核酸診断用粒子を用いて濃縮される目的核酸を含有する試料の容量は、適用する核酸増幅方法の種類によって数μｌ〜数百μｌの間で調整することができる。ＰＣＲ検出法の場合、通常数μｌ〜数十μｌの範囲である。
【００４１】
検査試料中の標的核酸の検出において、本発明の核酸診断用粒子を用いることは、大容量の検査試料中に僅かしか存在しない目的核酸でも漏れなく結合させ濃縮することおよび増幅反応に無用な他の核酸、蛋白質などの生体物質を増幅系から除去することで検出バックグランドを落とし検出感度を高めるという２つの利点が達成できる。
【００４２】
本発明の核酸診断用粒子は、標的核酸数が非常に少ないときに特に有効である。具体的には、採取される所定量の検査試料中に、標的核酸が数分子程度しか存在しない場合、通常行なわれるプローブ標識検出法は感度が不足しているため使用できない。また、所定量の検体中の一部を取り、ＰＣＲ法により増幅して検出するにも、その一部の検体に標的核酸が存在しないことがあり、結果的にＰＣＲ法による増幅を行なっても検出できず、時には陰性となり、時には陽性となるような不確実な検出になってしまう。
【００４３】
本発明の核酸診断用粒子を用いて上記標的核酸の濃縮および／または精製を行なってから、ＰＣＲ法による鋳型として使用すれば、例えば１リットルの検体中に数個の分子の標的核酸が存在するに過ぎない場合に、本発明の核酸診断用粒子を用いて数個の分子の標的核酸を１０μリットルに濃縮すれば、約１０5倍のＰＣＲ法による感度アップが達成できる。
この場合、他の検体成分との分離、標的核酸の濃縮あるいは精製は具体的にはハイブリッド形成反応によって、標的核酸がプローブＤＮＡと結合することによって核酸診断用微粒子に固定化したものを遠心分離などの手段によって行なうことができる。
【００４４】
本発明の核酸診断用粒子を用いて、標的核酸の濃縮および／または精製を行ない、次いで、熱またはアルカリ変性によって標的核酸を核酸診断用粒子から分離してからＰＣＲ法により増幅してもよいし、核酸診断用粒子から分離せずに該粒子と共にＰＣＲ法により増幅してもよい。この場合、プライマー位置はハイブリッド形成性塩基配列と同じ位置またはより増幅される断片の内側に選定して行なうことはＰＣＲ法の反応の効率から好ましい。
【００４５】
本発明の核酸診断用粒子を用いて標的核酸の濃縮および／または精製を行なう過程の中で、検体中他の成分との分離、特にＰＣＲ法の反応を阻害するインヒビターなどの分離も当然行なわれることになるので、標的核酸の濃縮過程には、有害物質の除去も達成できることになる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する、但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例
（１）プローブＤＮＡの調製
エイズウイルス ＨＩＶ−１の遺伝子を標的核酸として、下記の塩基配列を合成した。
プローブＤＮＡ Ａ（＋）
５'ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＣ ３'
プローブＤＮＡ Ａ（＋）はＤＮＡ合成装置（パーキンエルマ ３９１型）を用いてβ−シアノエチルホスホアミダイド法により合成した。合成したポリヌクレオチドの固相からの切り出しおよび採取は、該装置のためのマニュアルに従って行なった。合成したプローブＤＮＡの精製はＯＰＣカラムを用いて行なった（同メーカーマニュアルに従って行なった）。
また、プローブＤＮＡ Ａ（＋）と同様な方法で、以下のプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用ＤＮＡを合成、精製した。
（２）32Ｐによる標識
（１）で調製したプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用のＤＮＡ、Ａ（−）11、Ａ（−）19、Ａ（−）28、Ａ（−）37、Ａ（−）1およびＡ（−）をそれぞれ次のように［γ−32Ｐ］ＡＴＰで標識した。
各精製されたＤＮＡ溶液を１μｌ（ポリヌクレオチド２ｎｍｏｌｅ含有）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ（酵素活性にして８Ｕ）、γ−32Ｐアデノシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣｉ）、１０倍濃度の５'−リン酸化用緩衝液５μｌおよび滅菌水３９μｌを、２ｍｌエッペンドルフ遠心管に入れ、混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４９】
次に、反応液からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratories，1982, p. 458 参照）によって除去した後、反応液をＴＮＥ緩衝液で膨潤させたセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。
【００５０】
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。
【００５１】
（３）プローブＤＮＡ Ａ（＋）の微粒子への固定化
平均粒子径１.０μｍ、表面積１ｎｍ2当り５個のカルボキシル基を有する表面がカルボキシル変性され、比重が１.３ｇ／ｃｍ3のポリスチレン系粒子Ｈ１００３（日本合成ゴム（株）製）の１０（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ塩酸懸濁液を１０００μｌ、（１）で調製したプローブＤＮＡ Ａ（＋）を１ｎｍｏｌｅ、１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０.５（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ塩酸溶液を５００μｌをそれぞれエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより、プローブＤＮＡＡ（＋）を前記粒子にアミド結合させた。その後、３,０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、プローブＤＮＡ固定化粒子を沈殿として回収した。次に、結合用緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、０.１（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸よりなる緩衝液）を１ｍｌ添加し、プローブＤＮＡ固定化粒子を再分散させた後、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、プローブＤＮＡ固定化粒子を回収した。この操作を３回繰り返してプローブＤＮＡ固定化粒子を洗浄し、最終的にＴＮＥ緩衝液で１０００μｌに再分散した。（以下、「固定化粒子分散液」という。）
【００５２】
（４）固定化部位の確認
固定化粒子分散液１００μｌ（１００ｐｍｏｌｅのプローブＤＮＡ Ａ（＋）を含有）をそれぞそれＮｏ.１からＮｏ.６までの６本のエペンドルフチューブに入れた。
（２）で標識したプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用配列Ａ（−）11、Ａ（−）19、Ａ（−）28、Ａ（−）37、Ａ（−）1およびＡ（−）をそれぞれＮｏ.１からＮｏ.６のチューブ順に１０μｌ（チェレンコフカウントは約４,０００,０００ｃｐｍ、１００ｐｍｏｌｅ相当）を入れてから、滅菌蒸留水で全体の容量を１８０μｌとなるように調整した。次にそれぞれのチューブのチュレンコフカウントを測ってそれらの値をそれぞれのチューブのカウント１とした。
【００５３】
上記のように調製した６本のエペンドルフチューブを８０℃のウォーターバスに入れ、１０分間加熱後、直ちに氷水に入れ、５分間静置後に、５Ｍ塩化ナトリウム２０μｌを加えて、４０℃のウォーターバスで５分間加温し、ハイブリット形成体を調製した。次に、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、未反応の標的核酸を含む上清を除去し、沈殿分を結合用緩衝液で２回遠心洗浄し、最終的にＴＮＥ緩衝液で１８０μｌに再分散し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれぞれのチューブのカウント２とした。
【００５４】
次に、上記試料を遠心分離して、沈殿分を滅菌蒸留水で１８０μｌに再分散し、８０℃のウォーターバスに１０分間静置後、直ちに氷水により冷却した。５分後３,０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄し、上清を除去した後、沈殿分を滅菌蒸留水で１８０μｌに再分散し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれぞれチューブのカウント３とした。
【００５５】
標的核酸の捕獲率（［捕獲核酸量］／［標的核酸量］×１００％）および捕獲した核酸の分離率（［分離核酸量］／［捕獲核酸量］×１００％）を表１にまとめた。
【００５６】
【表１】
前記表１の結果からプローブＤＮＡ Ａ（＋）配列の５'末端の（ｄＣ）10部分が特異的に微粒子に固定化できたことが理解される。
【００５８】
（５）細胞抽出液でのＨＩＶ ＤＮＡの分離およびＰＣＲによる検出
Ｈｅｌａ細胞の抽出液（蛋白質２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮＡ ＲＮＡ ５０μｇ／ｍｌおよび脂質、糖その他１０μｇ／ｍｌの混合液）２０ｍｌにＨＩＶ−ＤＮＡ全長鎖ゲノムＤＮＡ（ＮＹ１０株より培養）をそれぞれ０、３、５、１０、２５分子ずつ５本のチューブに添加した。各チューブから、それぞれ１０μｌを取り、Nested ＰＣＲで検出した。続いて固定化粒子分散液２μｌおよび５Ｍ ＮａＣｌ １.０ｍｌをＮｏ.１〜５のチューブに加え、十分攪拌してから、４５℃の水温槽で３０分間静置した後に、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子にＰＣＲ反応液５０μｌを加えて、再分散し、その再分散液５０μｌを全部ＰＣＲ反応用チューブに移し、ＰＣＲ反応による増幅を行なった。ＰＣＲ法の反応液の組成は、
１０ｘ リアクションバッファ（タカラ製） １０μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ｍＭ）（タカラ製） ２０μｌ
プライマー ＳＫ１４５Ａ（２０ｍＭ） ２μｌ
プライマー ＳＫ４５１Ａ（２０ｍＭ） ２μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.５unit／ｍｌ）（タカラ製）５μｌ
滅菌蒸留水 １１μｌ
ミネラールオイル（シグマ社製） １drop
である。
【００５９】
またＰＣＲ反応による増幅は、PERKIN ELMER ＣＥＴＵＳ社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２０００を用いて、次のプログラムで増幅反応を行なった。
９４℃ １分
５５℃ １.５分
７２℃ ３分
３０サイクル
７２℃ ７分
プライマーＳＫ１４５Ａの配列は
５' ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ ３'
プライマーＳＫ４５１Ａの配列は
５' ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ ３'
であって、市販のものを使用した。
【００６０】
上記ＰＣＲ法による増幅反応の生成物の１０倍希釈液を５μｌ取り、同様なプログラムで Nested ＰＣＲ法の反応を行なった。その時のＰＣＲ法の反応液の組成は、プライマー ＳＫ１４５Ａの代わりにＳＫ１４５（タカラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１（タカラ製）を使用した以外は同様に行なった。
Nested ＰＣＲ法の反応増幅産物を２％のアガロースゲル（Agarose １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムブロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。その結果を表２にまとめて示した。
【００６１】
尚、本実験におけるＨＩＶ ＤＮＡの分子数は２６０ｎｍでの吸光度から濃度を算出し、さらに原液を１０倍ずつ順次希釈し、１分子レベルまでNested ＰＣＲ検出できることを確認したものを使用した。
【００６２】
【表２】
【発明の効果】
本発明によれば、一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を極めて簡便な方法で、特定の不溶性固体微粒子表面に固定し、このＤＮＡ固定化粒子を使用して、検査試料中数分子程度の極めて僅かの量の標的核酸を含むに過ぎない検査試料から標的核酸を迅速かつ効率的に抽出し、例えば核酸増幅法を使用して診断することが可能な核酸診断用粒子の調製方法が提供され、またそれを使用した標的核酸の検出方法が提供される。
【００６４】
本発明により調製された核酸診断用粒子は一般の病院、血液センター等に備え付けられている血球分離用遠心機で容易に分離することができる。
Claims (2)
- 不溶性固体微粒子の表面上にハイブリッド形成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されている核酸診断用粒子の調製方法であって、
（ａ）第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハイブリッド形成性塩基配列とから構成される全長１０〜１５０塩基数の一本鎖オリゴヌクレオチドを準備し、
（ｂ）前記（ａ）の一本鎖オリゴヌクレオチドを表面上にカルボキシル基を有している不溶性固体微粒子とを接触させ、かくして該固体微粒子と該固体化領域を固定化する、
ことを特徴とする核酸診断用粒子の調製方法。 - 標的核酸を含有する検査試料と請求項１記載の方法により調製された核酸診断用粒子とを接触させて該標的核酸診断用粒子に前記標的核酸を捕獲せしめることにより前記標的核酸を濃縮および／または精製し、次いで反復増幅法によって前記標的核酸を増幅させた後、前記標的核酸を検出することを特徴とする検査試料中の標的核酸の検出方法。
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