JPH0889294A - 核酸診断用粒子の調製方法および該核酸診断用粒子を用いた 検査試料中の標的核酸の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 核酸診断用粒子の調製方法および該核酸診断
用粒子を用いた検査試料中の標的核酸の診断方法を提供
する。 【構成】 不溶性固体微粒子の表面上にハイブリッド形
成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されている核
酸診断用粒子の調製方法であって、 （ａ）第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチドが
５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同一種
のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハイブ
リッド形成性塩基配列とから構成される全長１０〜１５
０塩基数の一本鎖オリゴヌクレオチドを準備し、 （ｂ）前記（ａ）の一本鎖オリゴヌクレオチドを表面上
にカルボキシル基を有している不溶性固体微粒子とを接
触させ、かくして該固体微粒子と該固体化領域を固定化
する、 ことを特徴とする核酸診断用粒子の調製方法および標的
核酸の診断方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸診断用粒子の調製
方法およびそれを用いた標的核酸の診断方法に関する。
更に詳しくは、標的核酸の特異的部位を選択的に結合さ
せることが可能な、特に核酸との間のハイブリッド形成
を利用した核酸の抽出、分離またその抽出、分離される
標的核酸を増幅してから診断するのに適した核酸診断用
粒子の調製方法およびそれを用いた標的核酸の診断方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】検査試料中の目的とする特定塩基配列を
有する核酸を抽出、分離或いは検出する手段として、核
酸のハイブリッド形成が利用されている。このハイブリ
ダイゼーション法における反応では、標識化された或い
は固体担体表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドま
たはポリヌクレオチド（すなわちプローブ）が、標的核
酸と塩基対を形成する。

【０００３】このハイブリダイゼーション法は、組み換
えＤＮＡ技術分野の研究者等によって開発された方法
で、一本鎖に変性されたＤＮＡまたはＲＮＡの核酸が適
当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖核酸と
塩基間の水素結合を介してハイブリッドを形成すること
を利用するものである。

【０００４】一方、ＤＮＡを分離し、検出するために固
体微粒子を使用することが提案されている。例えば Moy
es および Stark は、ＳＶ４０ＤＮＡを、直径０.５〜
１.０μｍのジアゾ化ｍ−アミノベンジルオキシメチル
セルロース粒子に共有結合させて検出に使用することを
教示しているが、この場合ハイブリッド形成に約２４時
間もの長時間を要している［Ｃｅｌｌ ５：３０１（１
９７５）］。

【０００５】また、一本鎖核酸をラテックス粒子表面に
固定して、ハイブリッド形成試験に使用することが提案
されている（特開昭６３−２７０００号公報）。しかし
この試験では、一本鎖核酸のラテックス粒子表面への固
定部位を選択することができない。そのためにハイブリ
ッド形成効率が極めて低いので、標的核酸の数が微量な
試料には適用できない。

【０００６】上記の核酸固定化法の欠点を解消するため
に種々の核酸固定化支持体およびその製造方法が提案さ
れている。その中に、核酸を構成するヌクレオチドの配
列部分を炭素原子数４〜２０の炭素鎖（炭素原子の一部
はＯ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子で置換されてもよく、
“腕”と称される）を介在させて間接的に核酸を固定化
した支持体が知られており、該核酸固定化支持体は、固
定部位となるヌクレオチド中の塩基の特定部位を予め活
性化させ、支持体に設けた“腕”となる反応性基と反応
させて共有結合を形成させることにより製造される（特
開昭６１−１３０３０５号公報）。また、ヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドを固定化した支持体に核酸を
酵素反応を利用して連結する方法が知られている（特開
昭６１−２４６２０１号公報）。

【０００７】しかし、前記特開昭６１−１３０３０５号
公報記載の方法は、支持体を活性化させた後、有機溶
媒、強アルカリまたは強酸で中間形成体を数回処理する
必要があり、反応収率は僅かに１１％に過ぎない。その
上、この方法は反応時間も数時間から数日を要すること
があり、非常に煩雑で時間のかかる操作が必要である。
また、特開昭６１−２４６２０１号公報に記載の方法
は、固定化してあるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドの有効量を高めるためには核酸を一定の方向性をも
って連結する必要があるが、そのためには特開昭６１−
１３０３０５号公報の方法の場合と同様の著しく煩雑な
操作が必要である。また高価な酵素が大過剰に必要であ
ると考えられ、経済的に不利である。従って、上記の２
つの方法は、日常的に利用するには実用的でない。

【０００８】さらに、固定化するプローブＤＮＡの相補
鎖を予め作成し、これをプローブＤＮＡにアニールさせ
て固定化する方法も提案されているが、この方法を実施
する場合、相補鎖ＤＮＡの合成並びにアニールした後の
ＤＮＡの精製に煩雑な操作を必要とする。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の目的
は、一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の部位を極めて簡
便な方法で、特定の固体微粒子表面に固定し、このＤＮ
Ａ固定化粒子を使用して、検査試料中数分子程度の極め
て僅かの量の標的核酸を含むに過ぎない検査試料から標
的核酸を迅速かつ効率的に抽出し、例えば核酸増幅法を
使用して診断することが可能な核酸診断用粒子の調製方
法を提供することにある。

【００１０】本発明の他の目的は、前記調製方法によっ
て得られた核酸診断用粒子を使用して、検査試料中の微
量の標的核酸を簡便な手段でかつ的確に検出し診断する
方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らの研究によれ
ば、前記本発明の目的の１つは、不溶性固体微粒子の表
面上のハイブリッド形成性塩基配列が固定化領域を介し
て固定化されている核酸診断用粒子の調製方法であっ
て、（ａ）第１級アミノ基を有する同一種のヌクレオチ
ドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域配列と、同
一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未満であるハ
イブリッド形成性塩基配列とから構成される全長１０〜
１５０塩基数の一本鎖オリゴヌクレオチドを準備し、
（ｂ）前記（ａ）の一本鎖オリゴヌクレオチドを表面上
にカルボキシル基を有している不溶性固体微粒子とを接
触させ、かくして該固体微粒子と該固体化領域を固定化
する、ことを特徴とする核酸診断用粒子の調製方法によ
って達成される。

【００１２】また本発明者の研究によれば、本発明の他
の目的は前記調製方法によって得られた核酸診断用粒子
とを接触させて該標的核酸診断用粒子に前記標的核酸を
捕獲せしめることにより前記標的核酸を濃縮および／ま
たは精製し、次いで反復増幅法によって前記標的核酸を
増幅させた後、前記標的核酸を検出することを特徴とす
る検査試料中の標的核酸の診断方法によって達成され
る。

【００１３】以下本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明における粒子における不溶性固体微粒子（以
下、単に「微粒子」と称する）を形成する物質として
は、有機高分子材料であることが望ましく、その高分子
の材料としては例えば、スチレン、クロルスチレン、ク
ロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベ
ンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アク
リル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル
酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）
アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル
酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジ
ル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エス
テル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、（メ
タ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メ
タ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルア
ミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピ
リジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニ
ルなどの芳香族ビニル化合物、α,β−不飽和カルボン
酸のエステル類もしくはアミド類、α,β−不飽和ニト
リル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合
物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビニル
系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の有機
高分子材料を示すことができる。さらに他の高分子材料
としてアガロース、デキストラン、セルロース、カルボ
キシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体やメチル化
アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなどのタ
ンパク質の架橋体を挙げることができる。

【００１４】本発明における微粒子の比重は、好ましく
は１.０１〜２ｇ／ｃｍ³であり、より好ましくは１.２
〜１.７ｇ／ｃｍ³である。微粒子の比重が１.０１ｇ／
ｃｍ³未満の場合、微粒子を分離するために、高速遠心
が必要となり、また長時間を要する傾向がある。一方比
重が２ｇ／ｃｍ³を超えると、標的核酸との反応の途中
で微粒子が沈降しハイブリダイゼーションが効率よく進
行し難くなる。

【００１５】比重が１.０１ｇ／ｃｍ³以上の微粒子は、
前記高分子材料に、さらにハロゲン原子を分子中に含有
するモノマーを加えて、重合することにより得ることが
できる。このハロゲン原子を分子中に含有するモノマー
の具体例としては、例えばモノフルオロフェニル（メ
タ）アクリレート、モノクロロフェニル（メタ）アクリ
レート、トリクロロフェニル（メタ）アクリレート、ペ
ンタクロロフェニル（メタ）アクリレート、モノブロモ
フェニル（メタ）アクリレート、トリブロモフェニル
（メタ）アクリレート、モノイオドフェニル（メタ）ア
クリレート、ペンタブロモフェニル（メタ）アクリレー
ト、２−（トリブロモフェノキシ）エチル（メタ）アク
リレート、２−（トリブロモフェノキシエトキシ）エチ
ル（メタ）アクリレート、２−（ペンタクロロフェノキ
シ）プロピル（メタ）アクリレートおよび１−（トリブ
ロモフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピル（メタ）ア
クリレートを挙げることができる。

【００１６】これらのうち、特に好ましいものは、ペン
タクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニル
メタクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルアクリ
レート、２,４,６−トリブロモフェニルメタクリレー
ト、α−クロロフェニルアクリレートおよびα−クロロ
フェニルメタクリレートである。

【００１７】これらハロゲン原子を分子中に含有するモ
ノマーは、通常常温で水溶性の固体である。従ってこれ
らは前記した高分子材料のモノマーと一緒に水性媒体中
に微分散させてエマルジョンとし、次いで乳化重合、懸
濁重合、シード重合、溶液沈澱重合などを行うことによ
り、目的とする微粒子を得ることができる。

【００１８】全モノマー中のハロゲン原子を分子中に含
有するモノマーの割合は、所望の微粒子の種類、比重な
どに応じて適宜選択することができるが、重合反応の効
率を考慮すると、一般的には、３０〜７０重量％の範囲
が適当である。

【００１９】本発明に用いられる微粒子の表面は非多孔
質であることが望ましい。ここで、微粒子の表面が「非
多孔質」であることは、長径が０.０１μｍ以上である
孔を微粒子の表面に有しないことを意味する。微粒子の
表面が非多孔質でないと、即ち、長径で０.０１μｍ以
上である孔が微粒子の表面に存在すると、後述の核酸検
出法などで用いられる標識プローブが微粒子の内部に捕
捉されるなどの原因によりハイブリッド形成分析の感度
や精度の向上が望めない。なお、このように、微粒子の
表面は非多孔質であることが望ましいが、微粒子の内部
に独立気泡などが存在してもよい。

【００２０】本発明に使用する微粒子の平均粒子径は、
遠心分離などの簡便な操作で微粒子を回収するために好
ましくは０.１μｍ以上、より好ましくは０.５μｍ以上
である。一方、微粒子の単位沈降体積当りの表面積を大
きくし、且つハイブリッド形成に適当な条件下で均一に
分散する状態を保つことによって高いハイブリッド形成
効率を達成するために、好ましくは１５μｍ以下、より
好ましくは５μｍ以下である。さらに、本発明に用いる
微粒子は、水性媒体中で使用するために、水不溶性でな
ければならない。

【００２１】本発明の核酸診断用粒子は、前記したとお
り、微粒子の表面上に、第１級アミノ基を有する同一種
のヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領
域を介して結合しており、その微粒子表面とその固定化
領域とは、微粒子表面上に存在するカルボキシル基とア
ミド結合により固定化されている。

【００２２】従って本発明における微粒子は、その表面
にアミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する
必要がある。もし微粒子がその表面にカルボキシル基を
有しない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入す
る必要がある。カルボキシル基は微粒子表面積１ｎｍ²
当り少なくとも１個存在することが好ましく、より好ま
しくは３個以上、さらに好ましくは５個以上である。

【００２３】このようなカルボキシル基を表面に有し、
前記方法に好適な微粒子としては、例えばイムテックス
ＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０１０
１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０２、Ｇ０３０１、Ｇ０２０
１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１、Ｌ０１０
２、ＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３、Ｈ１
００９、Ｈ１００３、Ｈ２００１、Ｈ０９０３などの商
品名［日本合成ゴム（株）］で市販されているものが挙
げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する微粒子
は、酸素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの
耐熱性を有するものである。また、カルボキシル基を有
しない微粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、
従来より知られている種々の方法を利用することができ
る。

【００２４】次に本発明に使用する一本鎖オリゴヌクレ
オチドについて説明する。本発明に用いられる、一本鎖
オリゴヌクレオチドは第１級アミノ基を有する同一種の
ヌクレオチドが５〜３０塩基数連続してなる固定化領域
配列と、同一種のヌクレオチドの連続配列が５塩基数未
満であるハイブリッド形成性塩基配列とから構成され
る。

【００２５】塩基配列中のアミノ基と微粒子表面のカル
ボキシル基とのアミド結合は、水溶性カルボジイミドの
存在下で実施した場合、塩基配列の配置によって反応性
や結合位置が大きく異なるが、本発明によって前記一本
鎖オリゴヌクレオチドを使用すれば、その一本鎖オリゴ
ヌクレオチドの特定の部位を高効率かつ特異的に微粒子
に固定化することができる。従って本発明の調製方法
は、従来の固定化方法に比べて簡単な操作で高い選択率
で核酸診断用粒子を得ることが可能となる。

【００２６】本発明において使用する一本鎖オリゴヌク
レオチドは全長が１０〜１５０塩基数、好ましくは２０
〜１００塩基数のものである。このオリゴヌクレオチド
の塩基数が１０塩基数未満であると、プローブとして短
かすぎ、標的核酸とのハイブリダイゼーションが充分に
行なわれなくなる。一方オリゴヌクレオチドの塩基数が
１５０塩基数を超えるとプローブとして、それ以上長く
なることにより利点は少なくなり、逆に一本鎖オリゴヌ
クレオチド調製の効率が低下する。

【００２７】本発明における固定化領域の配列の長さ
は、５〜３０塩基数であり、好ましくは７〜１５塩基数
であって、同一種の第１級アミノ基より形成されてい
る。固定化領域の長さが５塩基数未満の場合、微粒子表
面へ固定化される効率が低下し、一方３０塩基数を超え
ると、微粒子表面のカルボキシル基との結合反応におい
て不必要に長くなり一本鎖オリゴヌクレオチドの調製の
効率が低下する。

【００２８】前記固定化領域配列は、一本鎖オリゴヌク
レオチド中の任意の位置に存在していてもよいが、標的
核酸とのハイブリダイゼーション反応を効率よく行なわ
せしめるためには、固定化領域配列は一本鎖オリゴヌク
レオチドの末端部位に存在させておくことが好ましい。
一方、一本鎖オリゴヌクレオチド中に複数のプローブＤ
ＮＡを含有する場合には、プローブＤＮＡとプローブＤ
ＮＡの間に、すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチドの末
端部位以外の部位に固定化領域配列を存在させることも
できる。

【００２９】本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドにおけ
るハイブリッド形成性塩基配列は、同一種塩基からなる
連続配列が５塩基数未満であることが必要である。同一
種塩基の連続した配列が５塩基数以上となると、その連
続した配列中の第１級アミノ基と、微粒子表面のカルボ
キシル基の反応性が高くなり、固定化領域配列を高い選
択率で固定化できなくなる恐れがある。

【００３０】本発明における第１級アミノ基を有するヌ
クレオチドとしては、デオキシアデニル酸（ｄＡ）、デ
オキシシチジル酸（ｄＣ）およびデオキシグアニル酸
（ｄＧ）を挙げることができるが、微粒子表面における
カルボキシル基との反応性が高い点でデオキシアデニル
酸（ｄＡ）およびデオキシシチジル酸（ｄＣ）が好まし
い。

【００３１】本発明において、表面にカルボキシル基を
有する微粒子と前記一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触
させる固定化反応は、例えば適当な大きさの反応容器に
該微粒子と該一本鎖オリゴヌクレオチドとを仕込んだ
後、脱水縮合剤を添加して行なう。

【００３２】ここで脱水縮合剤としては、例えば１−エ
チル−３−（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノ）プロピルカルボ
ジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム
−３'−スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−
エトキシ−１,２−ジヒドロキノリンなどの水溶性の脱
水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、油溶性の
脱水縮合剤も使用することができる。これらの脱水縮合
剤は、使用する微粒子が表面に有するカルボキシル基１
グラム当量に対して、通常、１〜２０モル、好ましくは
２〜１０モル使用する。

【００３３】微粒子の使用量は、一本鎖オリゴヌクレオ
チド１ミリモル当たり、通常、０.５〜５００ｇ、好ま
しくは５〜５０ｇである。上記反応は、通常ｐＨ３〜１
１程度の水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃におい
て、５分ないし一夜行えばよい。

【００３４】次に本発明により調製された核酸診断用粒
子を利用し検査試料中の標的核酸を診断する方法につい
て説明する。

【００３５】本発明により得られた核酸診断用粒子を使
用して、試料中の標的核酸を迅速に捕獲するためのハイ
ブリッド形成反応は、それ自体知られている通常の溶液
ハイブリッド形成反応条件をそのまま適用して実施する
ことができる。

【００３６】ハイブリッド形成に適当な緩衝液として
は、例えば０.５Ｍ塩化ナトリウムまたたは１０ｍＭの
トリス塩酸塩緩衝液に０.５（ｗ／ｖ）％となる量のド
デシル硫酸ナトリウム、５０（ｖ／ｖ）％となる量のホ
ルムアミドおよび１０（ｗ／ｖ）％となる量のサケ精子
ＤＮＡを混合した水溶液などが挙げられるが、この組成
に限定されるものではない。

【００３７】前記したように本発明により得られた核酸
診断用粒子は、特に標的核酸を極く微量含有し、試料検
体は、血液、だ液、汗或いは尿の如き、夾雑物核酸、蛋
白質、脂質などが、標的核酸に比べて大過剰に存在して
いる試料からの標的核酸の抽出、分離、濃縮または検出
に極めて適している。例えば血液検体中の極く微量のウ
イルス細菌などの核酸を迅速且つ的確に、抽出、分離、
濃縮または検出するのに有効である。その場合のハイブ
リッド形成反応の緩衝液としては、例えば０.５Ｍ塩化
ナトリウム水溶液が挙げられる。

【００３８】ハイブリッド形成反応の温度は０〜８０
℃、好ましくは１５〜７０℃の範囲であり、時間は０〜
１５分で充分である。

【００３９】本発明により得れた核酸診断用粒子の使用
により捕獲した標的核酸は、反復増幅法により増幅させ
てから検出することができる。ここで、反復増幅法とし
てはポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ
法）、リガーゼチェーンリアクション法（ＬＣＲ法）、
サイクリングプローブリアクション法（ＣＰＲ法）、分
岐ＤＮＡプローブ法などを例示することができるが、特
に好ましくはＰＣＲ法である。なお前記標的核酸の増幅
は標的核酸を微粒子から分離して反復増幅法により増幅
してもよく、また分離しないで微粒子に保持された状態
で反復増幅法により増幅させてもよい。かくして本発明
の核酸診断用粒子は、反復増幅法に利用することにより
一層優れた効果が発現される。この点について以下ＰＣ
Ｒ法を挙げ詳細に説明する。

【００４０】一般に検査試料の容量は、その種類によっ
て、数百μｌから数十リットルの範囲にある。例えば感
染症検査においても、全血サンプルの採血量は数ｍｌか
ら数百ｍｌまでその対象となりうる。これに対し、本発
明の核酸診断用粒子を用いて濃縮される目的核酸を含有
する試料の容量は、適用する核酸増幅方法の種類によっ
て数μｌ〜数百μｌの間で調整することができる。ＰＣ
Ｒ検出法の場合、通常数μｌ〜数十μｌの範囲である。

【００４１】検査試料中の標的核酸の検出において、本
発明の核酸診断用粒子を用いることは、大容量の検査試
料中に僅かしか存在しない目的核酸でも漏れなく結合さ
せ濃縮することおよび増幅反応に無用な他の核酸、蛋白
質などの生体物質を増幅系から除去することで検出バッ
クグランドを落とし検出感度を高めるという２つの利点
が達成できる。

【００４２】本発明の核酸診断用粒子は、標的核酸数が
非常に少ないときに特に有効である。具体的には、採取
される所定量の検査試料中に、標的核酸が数分子程度し
か存在しない場合、通常行なわれるプローブ標識検出法
は感度が不足しているため使用できない。また、所定量
の検体中の一部を取り、ＰＣＲ法により増幅して検出す
るにも、その一部の検体に標的核酸が存在しないことが
あり、結果的にＰＣＲ法による増幅を行なっても検出で
きず、時には陰性となり、時には陽性となるような不確
実な検出になってしまう。

【００４３】本発明の核酸診断用粒子を用いて上記標的
核酸の濃縮および／または精製を行なってから、ＰＣＲ
法による鋳型として使用すれば、例えば１リットルの検
体中に数個の分子の標的核酸が存在するに過ぎない場合
に、本発明の核酸診断用粒子を用いて数個の分子の標的
核酸を１０μリットルに濃縮すれば、約１０⁵倍のＰＣ
Ｒ法による感度アップが達成できる。この場合、他の検
体成分との分離、標的核酸の濃縮あるいは精製は具体的
にはハイブリッド形成反応によって、標的核酸がプロー
ブＤＮＡと結合することによって核酸診断用微粒子に固
定化したものを遠心分離などの手段によって行なうこと
ができる。

【００４４】本発明の核酸診断用粒子を用いて、標的核
酸の濃縮および／または精製を行ない、次いで、熱また
はアルカリ変性によって標的核酸を核酸診断用粒子から
分離してからＰＣＲ法により増幅してもよいし、核酸診
断用粒子から分離せずに該粒子と共にＰＣＲ法により増
幅してもよい。この場合、プライマー位置はハイブリッ
ド形成性塩基配列と同じ位置またはより増幅される断片
の内側に選定して行なうことはＰＣＲ法の反応の効率か
ら好ましい。

【００４５】本発明の核酸診断用粒子を用いて標的核酸
の濃縮および／または精製を行なう過程の中で、検体中
他の成分との分離、特にＰＣＲ法の反応を阻害するイン
ヒビターなどの分離も当然行なわれることになるので、
標的核酸の濃縮過程には、有害物質の除去も達成できる
ことになる。

【００４６】

【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説
明する、但し、本発明は実施例に限定されるものではな
い。

【００４７】実施例 （１）プローブＤＮＡの調製 エイズウイルス ＨＩＶ−１の遺伝子を標的核酸とし
て、下記の塩基配列を合成した。 プローブＤＮＡ Ａ（＋） ５'ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧ ＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＣ ３' プローブＤＮＡ Ａ（＋）はＤＮＡ合成装置（パーキン
エルマ ３９１型）を用いてβ−シアノエチルホスホア
ミダイド法により合成した。合成したポリヌクレオチド
の固相からの切り出しおよび採取は、該装置のためのマ
ニュアルに従って行なった。合成したプローブＤＮＡの
精製はＯＰＣカラムを用いて行なった（同メーカーマニ
ュアルに従って行なった）。また、プローブＤＮＡ Ａ
（＋）と同様な方法で、以下のプローブＤＮＡ Ａ
（＋）検定用ＤＮＡを合成、精製した。 配列名 Ａ（−）11 ５' ＴＧＧＡＣＡＴＡＡ ３' Ａ（−）19 ５' ＣＣＡＧＣＡＴＴＣ ３' Ａ（−）28 ５' ＡＴＡＧＣＣＣＴＡ ３' Ａ（−）37 ５' ＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴ ３' Ａ（−）1 ５' ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ３' Ａ（−） ５' ＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＣＡ ＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡ ＡＧＡＡＴＧＴ ３'

【００４８】（２）³²Ｐによる標識 （１）で調製したプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用のＤ
ＮＡ、Ａ（−）11、Ａ（−）19、Ａ（−）28、Ａ（−）
37、Ａ（−）1およびＡ（−）をそれぞれ次のように
［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで標識した。各精製されたＤＮＡ溶
液を１μｌ（ポリヌクレオチド２ｎｍｏｌｅ含有）、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム
社製）１μｌ（酵素活性にして８Ｕ）、γ−³²Ｐアデノ
シン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣｉ）、１
０倍濃度の５'−リン酸化用緩衝液５μｌおよび滅菌水
３９μｌを、２ｍｌエッペンドルフ遠心管に入れ、混合
し、３７℃で３０分間インキュベートした。

【００４９】次に、反応液からＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼをフェノール抽出法（"Molecular Cloning", Col
d Spring Harbor Laboratories，1982, p. 458 参照）
によって除去した後、反応液をＴＮＥ緩衝液で膨潤させ
たセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム
（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。

【００５０】なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リ
ン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。 組成：０.５Ｍ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７.６ ０.１Ｍ 塩化マグネシウム ５０ｍＭ ジチオスレイトール １ｍＭ スペルミジン １ｍＭ エチレンジアミン四酢酸 ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各
画分の放射線量をチェレンコフーカウント法によって測
定して素通り画分を判別し集めた。この結果、 ³²Ｐによ
って標識した２種のポリヌクレオチドについてのＴＮＥ
緩衝溶液２００μｌが得られた。これらは、１μｌ当り
約４００,０００ｃｐｍのカウントの放射線量を有する
溶液であった。

【００５１】（３）プローブＤＮＡ Ａ（＋）の微粒
子への固定化 平均粒子径１.０μｍ、表面積１ｎｍ²当り５個のカルボ
キシル基を有する表面がカルボキシル変性され、比重が
１.３ｇ／ｃｍ³のポリスチレン系粒子Ｈ１００３（日本
合成ゴム（株）製）の１０（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ
塩酸懸濁液を１０００μｌ、（１）で調製したプローブ
ＤＮＡ Ａ（＋）を１ｎｍｏｌｅ、１−エチル−３−
（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド
の０.５（ｗ／ｖ）％０.０００１Ｎ塩酸溶液を５００μ
ｌをそれぞれエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設
定した恒温槽中で一晩混合することにより、プローブＤ
ＮＡＡ（＋）を前記粒子にアミド結合させた。その後、
３,０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、プローブＤＮＡ
固定化粒子を沈殿として回収した。次に、結合用緩衝液
（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ
塩化ナトリウム、０.１（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナ
トリウムおよび１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸よりな
る緩衝液）を１ｍｌ添加し、プローブＤＮＡ固定化粒子
を再分散させた後、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離
し、プローブＤＮＡ固定化粒子を回収した。この操作を
３回繰り返してプローブＤＮＡ固定化粒子を洗浄し、最
終的にＴＮＥ緩衝液で１０００μｌに再分散した。（以
下、「固定化粒子分散液」という。）

【００５２】（４）固定化部位の確認 固定化粒子分散液１００μｌ（１００ｐｍｏｌｅのプロ
ーブＤＮＡ Ａ（＋）を含有）をそれぞそれＮｏ.１か
らＮｏ.６までの６本のエペンドルフチューブに入れ
た。（２）で標識したプローブＤＮＡ Ａ（＋）検定用
配列Ａ（−）11、Ａ（−）19、Ａ（−）28、Ａ（−）3
7、Ａ（−）1およびＡ（−）をそれぞれＮｏ.１からＮ
ｏ.６のチューブ順に１０μｌ（チェレンコフカウント
は約４,０００,０００ｃｐｍ、１００ｐｍｏｌｅ相当）
を入れてから、滅菌蒸留水で全体の容量を１８０μｌと
なるように調整した。次にそれぞれのチューブのチュレ
ンコフカウントを測ってそれらの値をそれぞれのチュー
ブのカウント１とした。

【００５３】上記のように調製した６本のエペンドルフ
チューブを８０℃のウォーターバスに入れ、１０分間加
熱後、直ちに氷水に入れ、５分間静置後に、５Ｍ塩化ナ
トリウム２０μｌを加えて、４０℃のウォーターバスで
５分間加温し、ハイブリット形成体を調製した。次に、
３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、未反応の標的核
酸を含む上清を除去し、沈殿分を結合用緩衝液で２回遠
心洗浄し、最終的にＴＮＥ緩衝液で１８０μｌに再分散
し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれ
ぞれのチューブのカウント２とした。

【００５４】次に、上記試料を遠心分離して、沈殿分を
滅菌蒸留水で１８０μｌに再分散し、８０℃のウォータ
ーバスに１０分間静置後、直ちに氷水により冷却した。
５分後３,０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄し、上清を除
去した後、沈殿分を滅菌蒸留水で１８０μｌに再分散
し、チュレンコフカウントを測った。それらの値をそれ
ぞれチューブのカウント３とした。

【００５５】標的核酸の捕獲率（［捕獲核酸量］／［標
的核酸量］×１００％）および捕獲した核酸の分離率
（［分離核酸量］／［捕獲核酸量］×１００％）を表１
にまとめた。

【００５６】

【表１】

【００５７】前記表１の結果からプローブＤＮＡ Ａ
（＋）配列の５'末端の（ｄＣ）₁₀部分が特異的に微粒
子に固定化できたことが理解される。

【００５８】（５）細胞抽出液でのＨＩＶ ＤＮＡの分
離およびＰＣＲによる検出 Ｈｅｌａ細胞の抽出液（蛋白質２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮＡ
ＲＮＡ ５０μｇ／ｍｌおよび脂質、糖その他１０μｇ
／ｍｌの混合液）２０ｍｌにＨＩＶ−ＤＮＡ全長鎖ゲノ
ムＤＮＡ（ＮＹ１０株より培養）をそれぞれ０、３、
５、１０、２５分子ずつ５本のチューブに添加した。各
チューブから、それぞれ１０μｌを取り、Nested ＰＣ
Ｒで検出した。続いて固定化粒子分散液２μｌおよび５
Ｍ ＮａＣｌ１.０ｍｌをＮｏ.１〜５のチューブに加
え、十分攪拌してから、４５℃の水温槽で３０分間静置
した後に、３,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、粒子
を回収した。回収した粒子にＰＣＲ反応液５０μｌを加
えて、再分散し、その再分散液５０μｌを全部ＰＣＲ反
応用チューブに移し、ＰＣＲ反応による増幅を行なっ
た。ＰＣＲ法の反応液の組成は、 １０ｘ リアクションバッファ（タカラ製） １０μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ｍＭ）（タカラ製） ２０μｌ プライマー ＳＫ１４５Ａ（２０ｍＭ） ２μｌ プライマー ＳＫ４５１Ａ（２０ｍＭ） ２μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.５unit／ｍｌ）（タカラ製）５μｌ 滅菌蒸留水 １１μｌ ミネラールオイル（シグマ社製） １drop である。

【００５９】またＰＣＲ反応による増幅は、PERKIN ELM
ER ＣＥＴＵＳ社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２
０００を用いて、次のプログラムで増幅反応を行なっ
た。 ９４℃ １分 ５５℃ １.５分 ７２℃ ３分 ３０サイクル ７２℃ ７分 プライマーＳＫ１４５Ａの配列は ５' ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ ３' プライマーＳＫ４５１Ａの配列は ５' ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ ３' であって、市販のものを使用した。

【００６０】上記ＰＣＲ法による増幅反応の生成物の１
０倍希釈液を５μｌ取り、同様なプログラムで Nested
ＰＣＲ法の反応を行なった。その時のＰＣＲ法の反応液
の組成は、プライマー ＳＫ１４５Ａの代わりにＳＫ１
４５（タカラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１
（タカラ製）を使用した以外は同様に行なった。Nested
ＰＣＲ法の反応増幅産物を２％のアガロースゲル（Aga
rose １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液
（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭ
ｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムブロマイ
ド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。そ
の結果を表２にまとめて示した。

【００６１】尚、本実験におけるＨＩＶ ＤＮＡの分子
数は２６０ｎｍでの吸光度から濃度を算出し、さらに原
液を１０倍ずつ順次希釈し、１分子レベルまでNested
ＰＣＲ検出できることを確認したものを使用した。

【００６２】

【表２】

【００６３】

【発明の効果】本発明によれば、一本鎖オリゴヌクレオ
チドの特定の部位を極めて簡便な方法で、特定の不溶性
固体微粒子表面に固定し、このＤＮＡ固定化粒子を使用
して、検査試料中数分子程度の極めて僅かの量の標的核
酸を含むに過ぎない検査試料から標的核酸を迅速かつ効
率的に抽出し、例えば核酸増幅法を使用して診断するこ
とが可能な核酸診断用粒子の調製方法が提供され、また
それを使用した標的核酸の診断方法が提供される。

【００６４】本発明により調製された核酸診断用粒子は
一般の病院、血液センター等に備え付けられている血球
分離用遠心機で容易に分離することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性固体微粒子の表面上にハイブリッ
   ド形成性塩基配列が固定化領域を介して固定化されてい
   る核酸診断用粒子の調製方法であって、（ａ）第１級ア
   ミノ基を有する同一種のヌクレオチドが５〜３０塩基数
   連続してなる固定化領域配列と、同一種のヌクレオチド
   の連続配列が５塩基数未満であるハイブリッド形成性塩
   基配列とから構成される全長１０〜１５０塩基数の一本
   鎖オリゴヌクレオチドを準備し、（ｂ）前記（ａ）の一
   本鎖オリゴヌクレオチドを表面上にカルボキシル基を有
   している不溶性固体微粒子とを接触させ、かくして該固
   体微粒子と該固体化領域を固定化する、ことを特徴とす
   る核酸診断用粒子の調製方法。
2. 【請求項２】 標的核酸を含有する検査試料と請求項１
   記載の方法により調製された核酸診断用粒子とを接触さ
   せて該標的核酸診断用粒子に前記標的核酸を捕獲せしめ
   ることにより前記標的核酸を濃縮および／または精製
   し、次いで反復増幅法によって前記標的核酸を増幅させ
   た後、前記標的核酸を検出することを特徴とする検査試
   料中の標的核酸の診断方法。