JP3384806B2 - Ｈｌａ−ｄｒ型別判定の実施を可能にするプローブ系および該プローブを用いる型別判定法 - Google Patents

Ｈｌａ−ｄｒ型別判定の実施を可能にするプローブ系および該プローブを用いる型別判定法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、個人のクラスII HLA遺伝子型を決定するた
めの方法に関し、特に多形性HLA−DR遺伝子の検出に関
係する。この方法は、特に、移植におけるHLA型別判
定、医療診断、法医学などに適用できる。
HLA（ヒトリンパ細胞抗原）系は、ヒトにおいて主要
組織適合複合体によりエンコードされる。それは、自己
と非自己を区別することによって、個人間の器官移植の
間の極めて本質的な制限をもたらす。更に、HLA因子
は、多数の病気に対する素因に関与する。HLA系の抗原
は従って、器官移植における提供者と被移植者の間の特
性（F.H.バッハ及びJ.J.ファン ロート、N.Engl.J.Me
d.、295、806〜13頁、1976）ならびに或る病気に対する
個人の素因を決定する型別判定法において用いられてき
た。
遺伝子的観点からHLA系は十分に特徴づけられ、そし
て第６染色体の短腕上の約２センチモーガン（cM）の間
隔内にある多かれ少なかれ多形性の一組の座よりなる。
この系中の三つの座（HLA−Ａ、−Ｂ及び−Ｃ）は、相
互複性的に（codominantly）表現される同種抗原のクラ
ス（クラスＩ）をコードする。事実いくつかの遺伝子を
含む他の領域（HLA−Ｄ）は、かなりの程度の多形性を
伴なって相互複性的に表現される同種抗原の第二のクラ
ス（クラスII）をコードする。特に補体カスケードの成
分C2、C4及び因子Bfを制御するいくつかの他の座はま
た、HLA系（クラスIII）に属する。器官移植の成功は、
被移植者と提供者の間のHLA同一性（クラスＩ及びII）
に大きく依存する。従って、HLA型別判定は、出来るだ
け正確でなければならない。この要求は主に、腎臓移植
（P.J.モリス及びA.ティン（1982）Immunol.Rev66、103
−G.オペルツ（1989）Transpl.Proc.21、609−E.L.ラガ
ーイ、P.H.ヘンネマン、M.ルイクロクら（1985）New En
gl.J.Med.321,701）および骨髄移植（P.G.ビーティ、R.
A.クリフト、E.M.ミケルソンら（1985）New Engl.J.Me
d.313,765−J.M.ホウ及びB.A.ブラドリー（1990）Briti
sh J.Hematol.76、１）に関係する。骨髄移植において
は、クラスII HLA抗原に関する完全な同一性は、移植の
成功、すなわち移植片の拒絶又は移植片対宿主の疾病の
進展を妨げるための決定的因子を表わす（P.G.ビーテ
ィ、J.ハンセン、G.M.ロングトンら（1991）Transplant
ation 51、443−R.C.アシュ、J.T.キャスパー、C.R.チ
タンバーら（1990）New Engl.J.Med.322、485−C.アナ
セッティ、D.アモス、P.G.ビーティら（1989）New Eng
l.J.Med.320,197）。
HLA−Ｄ領域の遺伝子の表現産生物の多形性は、細胞
の表面で表現されたHLA遺伝子産生物の同種抗血清での
分析に基づく血清学的手法により通常決定される（J.J.
ファン ロード及びA.ファン リューウェン（1963）J.
Clin.Invest.42、1382−J.J.ファン ロード、A.ファン
リューウェン、J.J.コニング、A.B.ファン ウド ア
ブラス（1975）Tissue Antigens 5、73）。正確性及び
再現性は、利用できる血清のバッチに依存する。しか
し、最良の条件下でさえ、極めて多数の存在する対立遺
伝子がこれらの血清学的手法により検出不能である。血
清学的分析の限界は主に、単一特異的な同種抗血清の不
存在、極めて密接に関連する特異性たとえばDR3とDRw13
の間の交叉反応性の不完全な区別、あるいは細胞たとえ
ば白血病細胞の表面におけるクラスII HLA分子の変更さ
れた表現に起因する。
分子生物学を用いて、従来予想されていたよりもはる
かに多数のHLA遺伝子、特に多くのより異なる対立遺伝
子が存在することが今は知られている。この多様性は今
は、種々の遺伝子及び対立遺伝子のDNA配列によって特
徴づけられる。HLA命名委員会の最近のレポートによる
と（HLA系の因子のためのWHO命名委員会（1990）Immuno
genetics 31、131−及びJ.G.ボドマー、S.G.E.マーシュ
ー、E.D.アルバート、W.F.ボドマー、B.デュポン、H.A.
アーリッヒ、B.マッパ、W.R.メイア、P.パラム、T.ササ
ズキ、G.M.T.シュロイダー、J.L.ストロミンガー、A.ス
ビガード及びP.I.テラサキ（1991）Tissue Antigens 3
7、97参照）、クラスII HLA多形性は、下記のように分
布される。DRB1座:47の対立遺伝子、DRB3座:4の対立遺
伝子、DRB4座:1の対立遺伝子、DRB5座:4の対立遺伝子、
DQB1座:17の対立遺伝子、DQA1座:13の対立遺伝子、DPB1
座:21の対立遺伝子、DPA1座:4の対立遺伝子。
これら対立遺伝子の多くは、血清学的分析を逃れ、DN
Aの点でのみ同定しうる。血清学的型別判定の限界は、D
R4血清学的特異性により例示されうる。これは今は、DN
A配列の点でのみ同定できる11のサブタイプ（DRB1＊040
1−0411）に細分される（J.G.ボドマー、S.G.E.マーシ
ュー、E.D.アルバート、W.F.ボドマー、B.デュポン、H.
A.アーリッヒ、B.マッハ、W.R.メイア、P.パラム、T.サ
サズキ、G.M.T.シュロイダー、J.L.ストロミンガー、A.
スビガード及びP.I.テラサキ（1991）Tissue Antigens
37、97参照） 同様にいくつかの同種抗血清によりDRw 13及びDRw 14
に細分されうるDRw 6特異性は10の対立遺伝子配列（DRB
1＊1301−1305及びDRB1＊1401−1405）を含み（上記の
J.G.ボドマーの文献参照）、これはまたDNA配列の点で
の遺伝子型分析によってのみ区別されうる。
遺伝子型分析は、クラスII HLA系の多様性を遺伝子の
点で直接に分析することを可能にする新しいアプローチ
である。遺伝子型分析は分子ハイブリッド化の原理に基
づいており、提案された最初のアプローチは、いわゆる
「RFLP」法であり、これは制限酵素を用いてDNAを切断
し、これら酵素により発生された特定のDNAフラグメン
トのサイズを分析することにある（C.T.ウェイク、E.O.
ロング及びB.マッハ（1982）Nature 300、372−J.ビー
メ、M.アンダーソン、G.アンダーソン、E.ミラー、P.A.
ペターソン及びL.ラスク（1985）J.Immunol.135、2149
−J.L.ビドウェル、E.A.ビドウェル、D.A.サベージ、D.
ミドルトン、P.T.クロウダ及びB.A.ブラトレィ（1988）
Transplantation 45、640参照）。
RFLP分析は、血清学により検出できない対立遺伝子的
差異のいくつかのみを認識することを可能にし、この方
法はまだ制限がある。実際、異なる配列を持つ一つの対
立遺伝子は、異なるヌクレオチドが分析に用いられた制
限酵素の認識部位にある場合にのみ同定可能である。従
って、多数のクラスII HLA対立遺伝子がこの分析により
認識されないであろう。また、RFLP分析は、コード配列
における変更をまれにしか検出せず、変更の正確な性質
について情報を与えない。最後に、この方法は、いくつ
かの制限酵素により消化されるべき比較的多量の核酸の
使用、電気泳動及びフィルターへの移動を含むので、長
たらしく、冗長である。
RFLP法の限界を例示するために、DR1、DR4、DRw 8、D
Rw 11又はDRw 13特異性のサブタイプがRFLPにより検出
できないことが述べられる。
クラスII HLAの遺伝子型分析の新しい方法が提案さ
れ、これは、「オリゴヌクレオチドによる型別判定」と
呼ばれる方法である。クラスII HLA遺伝子、及び特に、
はるかに最も多形性であるDRβ遺伝子のDNA配列の知識
の結果、遺伝子の配列中の所与の場所に特異的なオリゴ
ヌクレオチドが、ハイブリッド化による多形性の分析の
ためのトレーサーとして用いられうる。これらオリゴヌ
クレオチドは、出来るだけ最も情報を与えるよう、及び
配列におけるそれらの差に基づいて異なる対立遺伝子の
同定を可能にするように選ばれる。実際に、配列におけ
る何らかの差異、単一のヌクレオチドさえも検出されう
る。
オリゴヌクレオチドによる型別判定の該手法は、アン
ゲリニら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.83、4489〜44
93頁（1986）に記載されるようにDNAに、及びRNAに等し
く適用されうる（C.ウクラ、J.J.ファン ロード、J.ゴ
ルスキ及びB.マッハ（1987）J.Clin.Invest、80、1155
参照）。
この新しいアプローチは、水素結合を介して相補的配
列と相互作用し、それによって公知の対合の法則すなわ
ちDNAにおけるＡ−Ｔ、Ｇ−ＣおよびRNAにおけるＡ−
Ｕ、Ｇ−Ｃに従って安定なハイブリッドを形成する可能
性がある核酸の特徴的性質を用いる分子ハイブリッド化
の原理に基づく。すなわち、既知の対立遺伝子のDNA又
はRNA配列に対応する合成オリゴヌクレオチドがプロー
ブとして、試料中の該プローブの配列に相補的な配列を
含む標的核酸配列を同定するために用いられうる。標的
とプローブの間で形成されたハイブリッドのラベリング
は、試料中の標的の検出及び定量化を可能にする。この
ラベリングは、任意の公知のラベルたとえば酵素的、化
学的又は放射性ラベルにより行われる。これら原理に基
づいて、クラスII HLAのためのオリゴヌクレオチドによ
る型別判定の最初の適用は、いわゆるサザーン法を用い
てアンゲリニらにより上記の文献中に示され、それによ
ると標的DNAがナイロン膜上に沈着され、検出はラベル
されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われる。
該方法は次に、通常の血清学により同定できないクラス
II HLA対立遺伝子の検出に適用された（J.M.チェルシ
ー、J.ゴルスキ、M.ジャネット及びB.マッハ（1988）Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA85、198−J.M.チェルシー、J.ゴ
ルスキ、H.ベツェル、A.C.フレイデル、L.ゲプアーラ
ー、M.ジャネット及びB.マッハ（1989）Human Immunol.
24、１参照）。クラスII HLA型別判定への別の直接的適
用は、PCT特許出願WO89/11547号に記載されるものであ
り、いわゆるドットブロット法を用いる。これら手法の
変更は、いわゆる逆ドットブロット法により示され、こ
れはヌクレオチドプローブを紙、ニトロセルロース又は
両者の混合の膜に結合し、ハイブリッド化の検出をラベ
ルされた標的により行うことにある。この手法は、HLA
−DQA型別判定及び地中海β−タラセミアの突然変異の
検出に適用された（R.K.サイキら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、Vol.86、6230〜6234頁（1989））。
上述したように、及び上記刊行物ならびに特許明細書
に説明されているように、細胞型別判定は、ゲノムにお
ける点突然変異の検出を必要とし、単一ヌクレオチドに
関する以外相同な配列を検出し、区別するのに十分に敏
感であるプローブの開発を含む。また、良好な感度を保
持しながら大きな特異性をテストに与える短いプロー
ブ、一般に30未満のヌクレオチドのプローブを用いるこ
とが必要であることが見い出された。短いオリゴヌクレ
オチドの使用は、広いスペクトルの選択性を利用可能に
することを可能とする。
固体支持体へのプローブの結合を含むテストが用いら
れる場合、そのような固体支持体に30未満のヌクレオチ
ドの短いプローブを固定化することに結びつく問題が残
されている。R.K.サイキらは上記刊行物中で、15〜20の
塩基より成るプローブの３′未満に400の塩基のポリ（d
T）尾をカップリングし、そして紫外線光に曝露してナ
イロン中に存在する第一アミンにチミン塩基を共有結合
的に結合することによってナイロンフィルターに上記尾
を介してプローブを固定化することより成る方法を提案
した。
しかし、この方法は、完全に満足なものではない。な
ぜなら、それは特異性の問題を示すからである。事実、
プローブのチミン塩基もまた、UV照射下で支持体と反応
でき、それによりハイブリッド化の効率の減少をもたら
す。
また、産業化の理由から、大きな特異性及び良好な感
度を有し、しかしまた実施が簡単であり、迅速に実行さ
れ、安価であり、自動化でき、かつ個人の型別判定のた
めに用いうるところの型別判定法を開発することが望ま
しい。
今、個人のHLA−DR遺伝子型を決定するための新規方
法が見い出され、これは、単一ヌクレオチドに関する以
外相同である配列を検出しかつ区別することを可能にし
ながら、上記欠点を克服する。
本発明法は、最小数のプローブで型別判定を可能にす
るように選ばれた一組のヌクレオチドプローブを用いて
行われる。このプローブの組は、特に、単一の温度、特
に37℃で行うことを可能にする利点を持つ（但し、下記
の実験の部から判るように他の温度で実施することも可
能である）。そのような一組のプローブはまた、本発明
の一部を成す。
下記で定義される本発明のプローブの組は、サザーン
形式の手法において（標準的トレーサー剤でラベルされ
た）検出プローブの形で、あるいは好ましくは固体支持
体上に固定化された（サンドイッチ又は逆ドットブロッ
ト法）捕捉プローブの形で、直接にまたはリガンドを介
して受身結合（吸着）によりたとえば疎水性リガンドに
より（たとえばヨーロッパ特許出願第0,405,913号参
照）、あるいは、ここでもまた直接に作られうるあるい
は支持体に共有結合的に結合しうるリガンドを介して作
られうる少なくとも一つの共有結合の設立により（たと
えばPCT特許出願WO88/01,302号参照）用いられうる。プ
ローブの固定化は、公知法を用いて、又は後述の他の方
法を用いて行われうる。
本発明のプローブ（ヌクレオチドプローブ）は、主に
ヌクレオチド配列の形で記述されるであろう。所与の温
度で点突然変異を検出することを意図されるプローブの
場合においてさえ、ハイブリッド化複合体の安定性に多
かれ少なかれ好都合な溶液、緩衝液の使用によって特
に、種々の長さ（ヌクレオチドの数）のプローブの使用
をもくろむことがある程度可能であることが、当業者に
は明らかである。従って、本発明のプローブは、最大で
あると一般に考えられる（特に、もし比較的低い温度た
とえば37℃での実施が望まれるなら）配列により定義さ
れ、かつ更に、該温度でなお使用可能でありかつ点突然
変異にさえ感受性であるであろう最小の配列の表示を伴
なう。
夫々の特定のヌクレオチドプローブが、その対応する
相補性プローブを有し、それは当然、捕捉又は検出プロ
ーブとして同じ役割を演じうることが当業者には明らか
である。従って、本発明は、後述されるであろう配列に
相補性の配列を持つプローブを包含する。
また、一組のプローブにおいて一般に、ある特定の特
異性Ｘを認識する一つのプローブを、二つのプローブの
系（その一つが特異性Ｘ及びＹを認識し、他方が特異性
Ｘ及びＺを認識する）で置き代えうることが当業者には
明らかである。この場合、XYプローブ及びXZプローブの
両者による陽の応答は、特異性Ｘの存在を推論するこを
と可能にする。従って、本発明は、後述するように、一
又は二以上のプローブが二つのプローブまたはいくつか
のプローブの均等な系により置き代えられたプローブ系
を包含する。当然に、そのような組合せ系は、２より多
い多数の特異性に適用されうる。
本発明は、HLA DRタイプを決定するためにオリゴヌ
クレオチドでの型別判定法において用いられうるヌクレ
オチドプローブに関し、該プローブは下記のものから選
択される： −TGGCAGCTTAAGTTT −CCTAAGAGGGAGTG −GCGAGTGTGGAACCT −AAGACAGGCGGGC. 直上の４つの配列は、夫々、引用番号101,102,103お
よび104で呼ばれる。
プローブ101は、DRB1＊01タイプを同定することを可
能にする。
プローブ102は、DRB1＊02タイプを同定することを可
能にする。
プローブ103は、DRB4＊01タイプを同定することを可
能にし、プローブ104は、DRB1＊1305タイプを同定する
ために有用である。
本発明はまた、プローブ101〜104から選択された少な
くとも１つのプローブを含む１セットのヌクレオチドプ
ローブまたはHLAタイプキットに関する。
本発明はまた、下記より選択される少なくとも１つの
プローブを更に含む、そのような１セットのヌクレオチ
ドプローブに関する： −GTGGACAACTACTG −GATACTTCTATCACCAA −GCCTGATGAGGAGTAC −TGGCAGGGTAAGTATAAG −GGGCCCTGGTGGACA −TGCGGTATCTGCACA −GGAGGAGGTTAAGTT −CTGGAAGACGAGCG −TGGAAGACAAGCGG −TGCGGAGCACTGGA −AACCAGGAGGAGAACGTG −ACTCTACGGGTGAGTG −GACACCTATTGCAGAC 下線部分は、最小配列に対応する。
直上の13の配列は、夫々、引用番号105〜117で呼ばれ
る。
好ましい実施態様において、プローブ111は、３′未
満の下線を付されていない２つのＴを含む完全な形で用
いられる。その特異性は、プローブ45のそれと同じであ
る。
プローブ115は好ましくは、下線を付された配列プラ
ス５′未満の下線を付されていない２つのＡの形で用い
られる。その特異性は、プローブ28のそれと同じであ
る。
プローブ105〜110、112〜114、116および117は好まし
くは、下記の実験の部において引用番号43、９、10、1
4、17、44、46、48、47、24および27を付されているそ
れらのプローブの形で用いられる。
特に本発明は、上記で定義した１セットのプローブで
あって、それが更に下記のプローブ（下記部分は最適配
列に対応する）の少なくとも１つを含む事実を特徴とす
る１セットのプローブに関する： −GAGGAGGACTTGCGCT −TACGGGGCTGTGGAG −GGAGCTGCGTAAGT −TTCCTGGAGAGACAC −GGGAGAGATACTTCC. 直上の５つの配列は、夫々、引用番号118〜122で呼ば
れる。これら配列は、特に、配列番号42、42a,52,37お
よび55を持つそれらプローブの形で用いられる。
上記の特定のプローブは、特に、捕捉プローブまたは
検出プローブとして用いられる。それらは好ましくは、
固体支持体上に固定化されたまたは固定化されうる捕捉
プローブの形で用いられる。
本発明の主体はまた、オリゴヌクレオチドでの型別判
定の標準的手法に従い個人のHLA−DRβ型別判定を行う
方法において、上記のプローブの組のプローブの少なく
とも一部が、遂次的に又は同時的に捕捉又は検出プロー
ブとして用いられることを特徴とする方法である。
自動化された方法において、該プローブの組が用いら
れるであろう。他の場合には、それらを次々と用い、集
められた情報が型別判定のために十分である時に方法を
止めることができることが明白である。
従って、本発明の方法は、下記の工程を本質的に含
む： −個人のHLA−DR遺伝子の多形性領域を含む標的核酸の
試料を、上記定義したプローブの組の少なくとも一部
と、選択された特定の手法に従い接触させる、 −標的が該プローブの配列と十分に相補性である配列を
含む場合にのみ、各プローブとのハイブリッド化が起る
ように予め決めた条件下で公知法に従いインキュベート
する、そして −用いられた各プローブとのハイブリッド化またはハイ
ブリッド化の不存在を標準的検出手法に従い決定する。
集められた情報は次に、用いられたプローブ及びリス
トされたHLA−DRタイプ及び／又は関連するサブタイプ
の知識を考慮に入れて、予め設定した型別判定計画に従
い型別を決定するために用いられる。この仕事は、型別
判定計画、すなわち、実際には観察された陽応答（ハイ
ブリッド化）に従い直接にタイプ及び／又はサブタイプ
を与える表の使用により単純化される。本発明のプロー
ブの組のために、そのような表は下記の実験の部で与え
られる（表６を見よ）。
本発明は特に、上記プローブが捕捉プローブとして用
いられ、方法が下記の工程を含む事により区別されうる
ところの上記方法に関する： （ａ） 各捕捉プローブを固体支持体上に固定化する、 （ｂ） 各固定化捕捉プローブを、少なくとも一つの標
的核酸フラグメントを含む流体媒体と、プローブの配列
と相補性の配列が標的中に存在するならばハイブリッド
化を許す予め決めた条件下で接触させる、そして （ｃ） 形成されるハイブリッドの存在を検出する。
当然に、本発明のプローブは、RNA標的フラグメント
及びDNA標的フラグメントの両者を検出しうる。また、
上記プローブとは別に、総ての適当なプローブ、特に実
施例５で後述するプローブの一つを検出プローブとして
用いることが明らかに可能である。
捕捉プローブが非常に短い、すなわち20のヌクレオチ
ドより小さい、特に17のヌクレオチドより小さい場合、
固体支持体へのプローブの結合を改善できる手段を用い
ることが必要になる。ならば、支持体へのプローブの結
合は、固定支持体への結合を容易にするリガンドとプロ
ーブの共有結合的カップリングから生じる誘導体の形で
行われる。リガンド（これは疎水性部分を含みうる）は
特に、少なくとも一つの極性官能基たとえばアミノ基を
含むリガンドである。該官能基は、共有結合の設立によ
り固体支持体にプローブを結合すべく働きうる。極性官
能基が支持体と反応しない場合、それは、たとえ支持体
が疎水性であるとしても、支持体への吸着により結合を
改善する。
リガンドはたとえば、夫々下記式Ｉ及びIIにより示さ
れる蛋白質及び化合物から選ばれる： ここでＺは、２〜12個の炭素原子を有し、非置換の又
はヒドロキシル及び／又はアミノ基から選ばれた一以上
の基により置換された、直鎖又は分枝したアルキルまた
はアルケニル残基を示し、M+は特にアルカリ金属または
アンモニウムイオンを示す。
このリガンドは好ましくは、捕捉プローブのヌクレオ
チド配列の５′未満に結合される。
ここで、ｎは１〜４で変わりうる整数であり、好まし
くはｎ＝１又は４である。
このリガンドは好ましくは、捕捉プローブのヌクレオ
チド配列の３′末端に結合される。
リガンドが蛋白質である場合、たとえばアルブミン、
好ましくはウシ血清アルブミンが選ばれ、これは捕捉プ
ローブのヌクレオチド配列の５′または３′末端に結合
されうる。
本発明の支持体は、受身吸着又は共有結合によって、
本発明に従いヌクレオチド配列又は誘導体を固定化でき
る任意の支持体であることができる。支持体は、通常用
いられる任意の物質、たとえばニトロセルロース、ナイ
ロン、紙又は好ましくは疎水性物質たとえばスチレンポ
リマーまたは少なくとも10重量％のスチレン単位を含
む、スチレンに基づくコポリマーにより作られうる。
本発明に従う固定支持体は、限定されないが、微小滴
定プレート、シート、管、コーン、くぼみ等の形である
ことができる。
本発明の方法に従い、核酸を含む試料は、そのHLA−D
R遺伝子型が決定されるべき個人から得られる。本発明
の文脈において、HLA−DR核酸を含む任意のタイプの組
織を用いうる。すなわち、化学的、酵素的又は同様の手
段による個人試料中に存在する核酸の開裂の後に得られ
る核酸（DNA又はRNA）フラグメントを用いることができ
る。
しかし、標的DNA又はRNAの増幅の前工程を入れると、
本発明のオリゴヌクレオチドでの型別判定のための方法
を容易にできる。配列特異的なオリゴヌクレオチドのハ
イブリッド化によるHLA多形性の分析の原理は同じまま
であるが、選択的増幅工程は標的の配列の富化を可能に
し、それによって手法を単純化する（R.K.サイキ、T.L.
ブガワン、G.T.ホーン、K.B.ムリス及びH.A.アーリッヒ
（1986）Nature 324、163−J.M.チェルシー、M.ジャネ
ット及びB.マッハ（1990）Eur.J.Immunol.20,237）。
増幅は、DNAまたはRNAから得ることができる。試料中
のHLA−DR標的の配列の増幅が、プローブへの核酸のハ
イブリッド化により標的の配列を検出することを可能に
すべく十分な増幅を達成できる任意の公知法により実施
されうることは、当業者に明らかである。
一般に、試料中の核酸はDNAであり、特にゲノムDNAで
あろう。しかし、本発明はまた他の核酸たとえばメッセ
ンジャーRNA又はクローン化DNAを用いても実施でき、個
人試料中の核酸は一重鎖又は二重鎖形であってもよい。
もちろん、核酸が二重鎖形である場合、一重鎖核酸を得
るために変性工程を行う必要がある。
本発明で用いられるプローブは、適当な条件下でその
相補性配列に特異的に結合しうる配列特異的オリゴヌク
レオチド（SSO）である。もし特定のプローブが対立遺
伝子を一義的に同定するために用いらるうるなら、プロ
ーブはASOすなわち対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドと呼ばれる。単一のプローブが単独で、種々のDRβ対
立遺伝子間の異なる性質の故にDRβ特異的対立遺伝子を
同定できないことがありうる。
本発明の方法に従い、対立遺伝子の同定は、一組のプ
ローブの結合のモデルから演繹され、ここで一組のプロ
ーブの個々のプローブはHLA−DR遺伝子の異なる部分に
特異的である。既知の対立遺伝子のDNA配列に対応する
多数のプローブの選択の結果として、本発明のオリゴヌ
クレオチドによる型別判定法の特異性は、DRB1、DRB3及
びDRB5座の総ての対立遺伝子を同定することを可能にす
る。もちろん、本発明の方法は、他の極端に多形性の
座、たとえばDQB1及びDPB1の対立遺伝子を同定するため
に用いうる。対立遺伝子的差異は本質的に、HLA分子の
初めのドメインをコードするエキソン（aa5−94）中に
局在するので、プローブはこの領域中に局在する特定の
配列に相補性であるように選択される。新しい対立遺伝
子が発見されるかも知れない場合には、それはクラスII
HLA配列の登録に直ちにリストされ、これは、情報を与
えるトレーサーのコレクションを更新し、従って方法論
を何らかの新しい対立遺伝子の検出に適合させることを
可能にする。
完全なクラスII HLA型別判定を合理化するために、初
めに、主なHLA−DR特異性すなわちHLA−DR1−DRw 18を
限られた数のプローブで認識しうる包括的なDR型別判定
の第一工程を導入することが提案されている。この工程
は、多数の臨床適用のために十分である（B.マッハ及び
J.M.チェルシー（1991）Human Immunol.30、278参
照）。
この第一工程の結果に基づいて、DQB1多形性を検出
し、そしてもし必要ならDPB1対立遺伝子を特徴づけるた
めに、第二段階でDRβミクロ多形性を作るのに必要な特
異的なプローブを選択することができる。
オリゴヌクレオチドによる型別判定の手法によるHLA
−DR1−DRw 18の分析は、DR血清学に代って常用のDR型
別判定のための組織適合性テストにおいて、特に、腎臓
移植の待機リストに乗っている患者のDR型別判定、可能
性ある腎臓提供者の型別判定、骨髄移植が意図される白
血病患者ならびにその家族又は非血縁の可能性ある提供
者のDR型別判定、骨髄提供ボランティアの登録の編集の
ための大規模なDR型別判定を行うために、たとえばイン
スリン依存性糖尿病の場合に疾病とHLA系の間の関係を
調べるために、予防的医薬での利用のために、あるいは
父親及び他の法医学的特定のためのテストのために用い
ることができる。
本明細書で用いられる言葉のいくつかの定義を下記に
示す。
「遺伝子型」は、個人の遺伝子型の特徴のセット
（組）を言い、遺伝子の表現産生物とくに蛋白質の分析
から明らかになる個人の特徴である「表現型」の対語で
ある。
「対立遺伝子」は、核酸配列における相異を示す同じ
遺伝子の異なる選択形である。これら相異は、DNA、RNA
及び蛋白質において現われる。
「多形性」は、同じ遺伝子に関し異なる対立遺伝子の
存在により個体群中に導入される多様性を特徴づける。
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、プラ
イマー、プローブ及び検出されるべき核酸フラグメント
などを指す。オリゴヌクレオチドは、任意の公知の適当
な方法で調製されうる。
「ヌクレオチドプローブ」は、天然のDNA又はRNAフラ
グメントまたは天然あるいは合成のオリゴヌクレオチ
ド、又は合成のDNA又はRNAフラグメントを表わし、未修
飾であるか、あるいは一以上の修飾塩基たとえばイノシ
ン（文字Ｉで示される）、５−メチルデオキシシチジ
ン、５−（ジメチルアミノ）−デオキシウリジン、テオ
キシウリジン、2,6−ジアミノプリン、５−ブロモデオ
キシウリジンまたはハイブリッド化を許す任意の他の修
飾塩基を含む。
また、本明細書において捕捉プローブの配列がアンダ
ーラインを付されている場合には、これは本発明に従う
型別判定のための最適配列を表わす。当然に、これら最
適配列は、少なくとも一つの塩基により３′及び／又は
５′末端て延長されうる。この場合、任意的に追加され
うるいくつかの塩基は、たとえば下記の文から判るよう
に、カッコ内に示される。最後に、使用される配列の長
さを、実施条件（たとえばハイブリッド化及び洗滌の温
度、ハイブリッド化及び又は洗滌緩衝液の性質）及び型
別判定計画に従って変更することは、当業者にとって可
能である。
本発明のより良い理解は、本発明の方法の好ましい実
施態様を示す非限定的な実施例に言及して書かれた以下
の詳細な説明を読むことによって得られるであろう。
実施例１ 本発明で用いられ、ここで例として示されるリガンド
は、下記の表１に示すように市販入手可能な化合物であ
りうる。
オリゴヌクレオチドへのホスホルアミダイトリガンド
のカップリングは、下記の一般的プロトコールに従って
行われる。
アプライド バイオシステムズ社の自動装置381Aで、
該製造者のプロトコールに従うホスホルアミダイト化学
を用いてオリゴヌクレオチドが合成される。0.2Mの濃度
で無水アセトニトリルに溶解されたホスホルアミダイト
リガンドが合成装置の位置Ｘに置かれ、リガンドの付加
は、オリゴヌクレオチドの合成が完了した時に自動合成
の標準プロトコールに従いオリゴヌクレオチドの５′末
端で起る。
リガンドがジメトキシトリチル保護基を有する場合、
たとえば化合物ｄの場合には、合成の最後にトリクロル
酢酸でトリチル基を脱保護する追加的工程を行うことが
必要である。
33％NH4OH中で55℃での一夜の脱保護及び続く−20℃
でエタノール中での析出の後に、オリゴヌクレオチドは
真空乾燥され、1mlの水に溶解される。
化合物ｂ及びｃの場合、モノメトキシトリチル基の開
裂の追加的工程が、脱保護の後に製造者（夫々、クロン
テク及びグレンリサーチ）のプロトコールに従って行わ
れる。
化合物ｅ及びｆの場合、自動合成は、標準プロトコー
ルに従いリガンドをグラフトされたシリカから始まる。
リガンドとオリゴヌクレオチドとのカップリングは、後
者の３′末端を介して起る。
総ての場合に、５′又は３′末端で修飾されたオリゴ
ヌクレオチドが、ブラウンリー RP18カラム（10mm×25
cm）上で逆相高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）により
精製される。
条件：流速、4.6ml/分 勾配、30分間の経過中に緩衝液Ｂの10％〜35
％。
３分間の経過中に緩衝液ｂの35％〜100％。
緩衝液Ａ及びＢの特徴は下記の通りである。
緩衝液A:0.1モル濃度トリエチルアンモニウム アセ
テート（TEAA）、pH 7.00 緩衝液B:50％緩衝液Ａ＋50％CH3CN。
実施例２ ウシ血清アルブミン（BSA）へのオリゴヌクレオチド
のカップリング。
アミノリンクの２アームを有し、表１で記号ａを付さ
れたオリゴヌクレオチドが実施例１記載のように合成さ
れる:3×10-8モルのオリゴヌクレオチドが真空乾燥さ
れ、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液pH 9.3の25μに溶解
される。DMF中に30mg/mlのDITC（1,4−フェニレンジイ
ソチオシアネート、Fluka 78480）を含む溶液500μを
加える。水3mlを加える前に、この混合物を室温で1.5時
間撹拌する。溶液をブタノール（３×3ml）で抽出後
に、残った水性相（500μ）を真空乾燥し、次にホウ
酸塩緩衝液（0.1M、pH 9.3）400μ中のBSA（Pierce 3
0444）の１×10-7モル（6.6mg）で溶解する。室温で一
夜撹拌後に、接合体をNaCl勾配（表１）を有するAX300
カラム（BOWNLEE 4.6×100mm）でHPLCを用いてイオン交
換により精製する。接合体ピークは水（２×１リット
ル）に対して透析され、真空下で濃縮され、1mlの水で
溶解され、−20℃で貯蔵される。
クロマトグラフ条件： 勾配:25分間の経過中に15％Ｂ′〜56％Ｂ′。
２分間の経過中に56％Ｂ′〜100％Ｂ′。
緩衝液Ａ′及びＢ′の特徴は下記の通りである。
緩衝液Ａ′:20mMリン酸ナトリウム、pH 7.00;20％CH3
CN。
緩衝液Ｂ′：緩衝液Ａ′＋1M NaCl又は2M NaCl。
実施例３ 表２は、選択された一致配列（DR CONSと呼ぶ）に相
対的な突然変異されたアミノ酸の位置を定義する目的を
もってDRβ遺伝子の種々の対立遺伝子についてのアミノ
酸配置を示す。これら突然変異は、DNAにおける不顕で
はない突然変異、すなわちアミノ酸における変化を起す
であろう突然変異に対応する。実際に、アミノ酸は、塩
基の三連符によりDNA中でエンコードされていると知ら
れている。第三位置での突然変異は一般に、アミノ酸に
おける変化をもたらないであろう。対照的に、第二塩基
における変化は、極めてしばしばアミノ酸における変化
を起す。最後に、第一塩基での突然変異は常に、アミノ
酸の修飾をもたらすであろう。
種々の対立遺伝子の型別判定の場合に、非不顕突然変
異に対応するDNA上の突然変異が従って、最もしばしば
用いられる。しかし、不顕タイプの突然変異を、たとえ
ば２つの極めて密接に関係する対立遺伝子を区別する目
的で検出することが可能である。
表３は、今日まで既知の及び刊行物に発表された総て
の対立遺伝子に関しDRβ遺伝子のヌクレオチドの配置
を、表２におけると同じ一致配列に相対的に示す。
組織適合性についての第５回会議（オランダ、ライデ
ン、1991）で提案された表記法が、種々の対立遺伝子を
指名するために用いられる。表２中のカッコ内の指名
は、従来の表記を示す。
実施例４ 上記の二つのプロトコールを用いて、実施例１に記載
されかつ表４にまとめて示したリガンドを有するか、又
は実施例２に記載されかつ表５にまとめて示したBSAに
カップリングされたオリゴヌクレオチドが合成された。
＊ Ｘは、表１で先に用いた命名法に従うリガンドを
示す。
＊＊ Trは、実施例１で記載した条件（BROWNLEE RP
18カラム（4.6mm×25cm）、流速1ml/分）下でのHPLCに
おけるオリゴヌクレオチドの保持時間（分単位）を示
す。
＊＊＊ 配列33、34、及び34aにおける文字Ｉは、イ
ノシンを示す。
＊ Trは、実施例２に記載した条件下でのHPLCにおけ
る、BSAにカップリングされたオリゴヌクレオチドの保
持時間（分単位）を示す。
（1M）は、緩衝液Ｂが1M NaClを含むことを意味す
る。
（2M）は、緩衝液Ｂが2M NaClを含むことを意味す
る。
＊＊ オリゴヌクレオチドは、アプライド バイオシ
ステムズ社のプロコールに従い260nmにおける吸光度を
測定し、UV分光法によりピコモル単位で定量される。BS
Aは、ブラトフォードの方法（ブラドフォード M.M.、A
nal.Biochem.,72,248（1976））に従ってピコモル単位
でアッセイされる。オリゴ/BSA比は、これら２つの値の
比である。
この実施例において、リガンドなしで、又はリガンド
を用いて、あるいはたとえばBSAへカップリングして合
成されることができる捕捉オリゴヌクレオチドが定義さ
れた。合成されるオリゴヌクレオチドの配列の選択は、
実施例３の表３に記載される種々の対立遺伝子のDNA配
列の配置（アラインメント）を考慮する。選択され、た
とえば捕捉プローブとして用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、表６に記載のように型別判定計画を立てることを
可能にする。他の型別判定計画が別のオリゴヌクレオチ
ドを用いて規定されうることが当業者には全く明らかで
ある。
表６において、カッコ内の指名は、DRB5対立遺伝子の
サブタイプのために、組織適合についての会議（1991）
の以前に用いられた命名法を示す。
記号＋は、表６中の問題の系統のサブタイプが対応す
る欄中のプローブとハイブリッド化を与えることを意味
する。
表６を用いて、種々のプローブで得られた結果（ハイ
ブリッド化またはハイブリッド化の欠如）を簡便に解釈
できる。たとえば、プローブ43、14、28及び37との陽の
応答を与える標的は、タイプ DRB1＊0301/DRB1＊07に
相当する。
実施例5:検出プローブの調製 実施例２に従い、活性化され真空乾燥されたオリゴヌ
クレオチドが、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液pH 9.3の20
0μ中のホースラデッシュ パーオキシダーゼ（ベー
リンガー マンハイム 413470）の1.25×10-7モル（5m
g）に溶解される。
精製プロトコールは同じである：接合体は、50mM Tr
is−HCl緩衝液pH 7.0、40％グリセロール中で−20℃で
貯蔵される。
表７は、HLA−DR検出のために用いられた種々の接合
体をまとめて示す。
＊ Trは、実施例２記載の条件下でのHPLCにおける、
ホースラディッシュ パーオキシダーゼ（HRP）にカッ
プリングされたオリゴヌクレオチドの保持時間（分単
位）を示す。（2M）は、緩衝液Ｂが2M NaClを含むこと
を意味する。
＊＊ オリゴヌクレオチドは、アプライド バイオシ
ステムズのプロトコールに従って260nmで吸光度を測定
するUV分光学によってピコモル単位で定量される。ホー
スラディッシュ パーオキシダーゼ（HRP）は、アトル
M.A.,J.Biol.Chem.、31、14954（1987）に従いUVで40
2nmでピコモル単位でアッセイされる。オリゴ/HRP比は
この２つの値の比である。
＊＊＊ 配列D2中の文字Ｉはイノシンを示す。配列D1
において（GT）は、この位置で二つの塩基ＧとＴの等モ
ル混合物があることを示す。
実施例6:遺伝子物質の調製 全血からの核酸の抽出は、下記のプロトコールに従い
アプライド バイオシステムズの装置で行われる:2〜6m
lの全血をTE緩衝液（10mM Tris−HCl、pH8.00、1mM E
DTA）（6mlのために十分な量の）中に溶解し、30ml抽出
ロートに入れる。蛋白質分解酵素Ｋの溶液（20mM Tris
−HCl、pH 8.5中の840単位）を加える。全体を撹拌下に
55℃で１時間インキュベートする。存在する過剰の蛋白
質を、フェノール／クロロホルム混合物での２回の同時
的抽出（8.5ml）により除去する。全体を60℃で20分間
撹拌する。有機相の除去後に、更にフェノール抽出を行
う。過剰のフェノールを、クロロホルム（9.5ml）によ
る37℃で10分間の抽出により除去する。水性相中のDNA
含量は、3M酢酸ナトリウムpH 5.5の0.5ml及びイソプロ
パノール13.5mlを加えることにより析出され、次にフィ
ルター上で回収される。次にDNAは、1mlの蒸留水中に取
り上げられ、その後、260nmで分光光学によりアッセイ
される。
実施例7:DNAの増幅 酵素的増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手法
（ムリスとファローナ、Meth.in Enzymol.vol.155、335
〜350頁）により下記のプロトコールに従って行われ
る： 下記の緩衝液の合計100μ中の精製された又はされ
ないDNAの0.1〜２μｇを、エッペンドルフ型管に入れ
る： − 10倍濃度のPCR緩衝液（500mM KCl、100mM Tris−
HCl、pH 8.3（20℃）、15mM MgCl2、0.1％ゼラチン）
の10μ、 − 0.5μＭ dNTP（dATP、dCTD、dGTP、TTP）の２μ
、 − 25ピコモルに対応する各プライマーの２μ、 − Taq ポリメラーゼ（パーキン エルマー セタ
ス）の1.5単位、 − 蒸留水（100μとするのに十分な量）、 − パラフィン油の50μ。
該管をサーモサイクラー（パーキン エルマー セタ
ス）中に置き、その中で下記の35回の温度サイクルが行
われる。
− 95℃での変性の0.5分間、 − 55℃でのハイブリッド化の0.5分間、 − 72℃での延長化の0.5分間。
用いたプライマーは、下記の配列を持つ。
プライマー１＝５′−CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG
−３′ プライマー２＝５′−TCGCCGCTGCACTGTGAAG−３′ 実施例８ ３×PBS（0.45M NaCl、0.15M リン酸ナトリウム、p
H 7.0）中の0.15μＭの濃度の所与のDR特異性の捕捉オ
リゴヌクレオチドの溶液100μを、ポリスチレン微小
滴定プレート（Nunc 439454）のくぼみ中に置く。充填
されたくぼみの数は、型別判定のために必要な数に等し
い。
総ての場合に、増幅工程及び検出工程の有効性をチェ
ックするために、正の対照が加えられなければならな
い。正の対照として用いられる捕捉プローブは、今日知
られる総ての対立遺伝子上に存在し、下記の配列を持
つ。
５′−GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT−３′ プレートは、PBS/Tween（0.15M NaCl、0.05M リン
酸ナトリウム、pH 7.0;0.5％ Tween 20（Merck 82218
4））の300μで３回洗われる。実施例７で記載される
ような増幅生成物（100μ）が、2N NaOHの２μに
より室温で撹拌下で５分間変性される。10μの2N酢
酸、そして次にｎ×50μ（ｎは型別判定のために必要
な捕捉プローブの数である）に等しい体積のPEG緩衝液
（0.1M リン酸ナトリウム、pH 7.0、0.5M NaCl、0.65
％ Tween 20、0.14mg/ml サケ精子DNA（Sigma Ｄ 9
156）、２％ PEG 4000（Merck 807490））が順次、上
記溶液に加えられる。この溶液50μを各くぼみに配
り、次にPEG緩衝液中の15nMの濃度の検出プローブ（オ
リゴヌクレオチド・パーオキシダーゼ接合体）の50μ
を配る。プレートを37℃で１時間インキュベートし、PB
S/Tweenの３×300μで洗う。濃度4mg/mlでOPD緩衝液
（0.05M クエン酸、0.1M Na2HPO4、pH4.93）中のOPD
培質（オルトフェニレンジアミン、ケンブリッジ メデ
ィカル バイオテクノロジー参照456）の100μに、使
用直前に1/1000希釈の30体積のH2O2を加えたものを、く
ぼみごとに加える。20分間の反応後に、酵素活性を1N
H2SO4の100μでブロックし、そして492nmでAxia マ
イクロリーダー（ビオ メリウ）を用いて読みを行う。
実施例９ 実施例６に記載された方法に従って作られた６つのDN
Aが、実施例７記載の方法に従って増幅される。
型別判定プロトコールは、下記の捕捉プローブを含
む： ５′ａ−GATACTTCTATCACC3′＝５′末端にリガンドを
有する特異性DR3のオリゴヌクレオチド（参照番号545） ５′GATACTTCTATCACC3′＝同じ配列であるが、リガン
ドを有さないオリゴヌクレオチド（参照番号545nu） ５′ａ−TGGACAACTACTG3′＝５′末端にリガンドを有
する特異性DR4のオリゴヌクレオチド（参照番号546） ５′TGGACAACTACTG3′＝同じ配列であるが、リガンド
を有さないオリゴヌクレオチド（参照番号546nu） 型別判定プロトコールは、実施例８記載の一般的プロ
トコールに従う。
プローブD1及びD2（表７）が、50％/50％混合物で検
出プローブとして用いられる。
結果を下記の表８に示す。
リガンドのない２つの捕捉プローブは、DNAの特異性
を区別せず、一方、リガンドａを有する同じ配列はDNA
のDR2及びDR4特異性を同定できる。
実施例10 実施例６記載の方法に従って作られた24のDNAが、実
施例７記載の方法に従って増幅される。
型別判定プロトコールは、実施例８記載の一般的プロ
トコールに従う。
プローブD1及びD2（表７）が50％/50％混合物で検出
プローブとして用いられる。
型別判定プロトコールは、下記の表９にまとめた捕捉
プローブを含む。
記述した方法は、テストされた24のDNAを曖昧でなく
型別判定することを可能にする。
実施例11 本発明で記述されるHLA−DR型別判定のための好まし
いハイブリッド化温度は、37℃である。しかし、このハ
イブリッド化温度を変えることができる。
下記の実施例は、ハイブリッド化温度が37℃から45℃
に変えられた他は、実施例10と同じである。型別判定
は、11のDNAについて行われる。
用いられた捕捉プローブを、下記の表11に示す。
型別判定の結果を下記の表12に示す。
実施例12 実施例８で記載したようにHLA−DR型別判定のために
用いられた好ましいハイブリッド化緩衝液（PEG緩衝液
と呼ばれる）は、下記の組成を持つ:0.1M リン酸ナト
リウム、pH 7.0、0.5M NaCl、0.65％ Tween 20、0.14
mg/mlサケ精子DNA（Sigma Ｄ 9156）、２％PEG 4000
（Merck 807490）。
ホルムアミドを含む（最終10％）同じ緩衝液が用いら
れた。ホルムアミドは、ハイブリッド化温度を下げるこ
とができると知られている。
もしハイブリッド化がホルムアミドの存在下でなお37
℃で行われるなら、従って検出の特異性は増大されるは
ずである。
型別判定は、実施例10で用いられた24のDNAについて
行われる。
用いられた捕捉プローブ及び得られた値を下記の表13
に示す。
好ましいハイブリッド化温度は37℃であり、好ましい
ハイブリッド化緩衝液はPEG緩衝液である。しかし、実
施例11と12の結果が示すように、ハイブリッド化温度と
ハイブリッド化緩衝液の両者を変えることが可能である
ことが判る。
上述の記載から明らかなように、本発明の方法は、下
記の実際的利点を結合する。総ての対立遺伝子の区別の
可能性を伴なう最適な特異性、 血清学的分析に比べて実施の単純さと低減されたコス
ト、 増幅後約90分間で結果が得られる迅速な実施、12時間
未満の合計期間に等しい（これは腎臓提供者にとって重
要である）、 個人の型別判定との両立性（これは緊急の型別判定及
び小さな実験室での使用にとって重要である）、 光学密度の測定及び適当な場合には単純なコンピュー
タ化システムを用いる結果の処理により定量化できる信
号、及び自動化システムへの適合性。
実施例13 上記と同様の方法で、引用番号101、102、103、104、
115および111を付されたそれらオリゴヌクレオチドに対
応する捕捉プローブが調製された。
これらプローブは、捕捉プローブとして用いられると
き、本明細書で示したようにそれらの特異性を同定す
る。
また、下記の検出プローブと共に本発明の捕捉プロー
ブを用いることができる： −GCGGTGACGGAGCTGG −GAACAGCCAGAAGGAC.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マンドランド，ベルナルド，ファビアン フランス国 69100，ビリュルバン，リ ュ デ ラ ドウア 21 (72)発明者 ティエルシー，ジャン−マリエ スイス国 1224，シェン−ブジェリス, アブニュ ガスパリン ６ (56)参考文献 特表 平６−505625（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−500734（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記 −TGGCAGCTTAAGTTT −CCTAAGAGGGAGTG −GCGAGTGTGGAACCT −AAGACAGGCGGGC. またはその相補的配列から選ばれるヌクレオチドプロー
    ブ。
  2. 【請求項２】下記 −TGGCAGCTTAAGTTT −CCTAAGAGGGAGTG −GCGAGTGTGGAACCT −AAGACAGGCGGGC. またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプ
    ローブを含む、HLADR型別判定を行うことを可能にする
    オリゴヌクレオチドプローブのセット。
  3. 【請求項３】下記 −TGGACAACTACT −GATACTTCTATCACC −CCTGATGAGGAGTA −GGCAGGGTAAGTATAAG −GGCCCTGGTGGA −GCGGTATCTGCACA −GGAGGAGGTTAAGTT −TGGAAGACGAGC −GGAAGACAAGCG −GCGGAGCACTGG −AACCAGGAGGAGAACGT −CTCTACGGGTGAGT −ACACCTATTGCAGA またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプ
    ローブを更に含む、請求項２のプローブのセット。
  4. 【請求項４】下記 −AGGAGGACTTGCGC −ACGGGGCTGTGGA −GAGCTGCGTAAG −TTCCTGGAGAGACAC −GGAGAGATACTTC. またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプ
    ローブを更に含む、請求項２または３のプローブのセッ
    ト。
  5. 【請求項５】下記のプローブ −AACCAGIAGGAGAACGT またはその相補的配列を更に含む、請求項２〜４のいず
    れか１つに記載のプローブのセット。
  6. 【請求項６】下記プローブ −GCGGTGACGGAGCTGG −GAACAGCCAGAAGGAC −CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC またはその相補的配列を更に含む、請求項２〜５のいず
    れか１つに記載のプローブのセット。
  7. 【請求項７】オリゴヌクレオチドでの型別判定の標準的
    手法に従って、個人からの試料から出発して個人のHLA
    −DR型別を判定する方法において、請求項２〜６のいず
    れか１つに記載されるプローブの少なくとも１つのセッ
    トを、捕捉プローブまたは検出プローブとして用いるこ
    とを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】プローブが請求項２〜５のいずれか１つに
    記載のものから選ばれる、請求項７の方法。
  9. 【請求項９】プローブが捕捉プローブとして用いられる
    請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】方法が、 −各捕捉プローブを固体支持体上に固定化する、 −各固定化捕捉プローブを、少なくとも一つの核酸フラ
    グメント標的を含む液体媒体と、プローブの配列と相補
    性の配列が標的中に存在するならばハイブリッド化を許
    す予め決めた条件下で接触させる、そして −形成されるハイブリッドの存在を検出する より成る工程を含む請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】各固定化捕捉プローブを、核酸標的の少
    なくとも１つのフラグメントを含む液体媒体と接触させ
    る工程が、37℃で行われる請求項10の方法。
  12. 【請求項１２】ヌクレオチドプローブが、捕捉プローブ
    と固体支持体との結合を容易にするリガンドと共有的に
    結合されていることを特徴とする、請求項１記載のヌク
    レオチドプローブを含む捕捉プローブ。
  13. 【請求項１３】ヌクレオチドプローブが、捕捉プローブ
    と固体支持体との結合を容易にするリガンドと共有的に
    結合されていることを特徴とする、請求項２〜５のいず
    れか１項記載のヌクレオチドプローブのセットを含む捕
    捉プローブのセット。
  14. 【請求項１４】オリゴヌクレオチドでの型別判定の標準
    的手法に従って、個人からの試料から出発して個人のHL
    A−DR型別を判定する方法において、請求項12記載の捕
    捉プローブまたは請求項13記載の捕捉プローブのセット
    を使用することを特徴とする方法。
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