NO882593L - Forbedret nykleinsyrehybridiseringsteknikk og kit til dette. - Google Patents
Forbedret nykleinsyrehybridiseringsteknikk og kit til dette.Info
- Publication number
- NO882593L NO882593L NO88882593A NO882593A NO882593L NO 882593 L NO882593 L NO 882593L NO 88882593 A NO88882593 A NO 88882593A NO 882593 A NO882593 A NO 882593A NO 882593 L NO882593 L NO 882593L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- probe
- probes
- polynucleotide
- binding
- solid support
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 136
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title description 83
- 239000002253 acid Substances 0.000 title description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 422
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 225
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 224
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 224
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 106
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 98
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 74
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 73
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 66
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 62
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 48
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 32
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 32
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 31
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 22
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 21
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 21
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 12
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 12
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 12
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 12
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 12
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 6
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 6
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 6
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 6
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 5
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 20
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 claims 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 53
- 239000002585 base Substances 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 13
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 4
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- BVQVLAIMHVDZEL-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-1,2-propanedione Chemical compound CC(=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 BVQVLAIMHVDZEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical compound CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- JQRLYSGCPHSLJI-UHFFFAOYSA-N [Fe].N1C(C=C2N=C(C=C3NC(=C4)C=C3)C=C2)=CC=C1C=C1C=CC4=N1 Chemical class [Fe].N1C(C=C2N=C(C=C3NC(=C4)C=C3)C=C2)=CC=C1C=C1C=CC4=N1 JQRLYSGCPHSLJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N decanal Chemical compound CCCCCCCCCC=O KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101000723939 Mus musculus Transcription factor HIVEP3 Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000000859 Sickle cell trait Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 159000000006 cesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 229910052701 rubidium Inorganic materials 0.000 description 1
- IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N rubidium atom Chemical compound [Rb] IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en nukleinsyrehybridiser-ingsfremgangsmåte, og et diagnostisk kit for bruk med fremgangsmåten .
Alle artiklene og referansene identifisert i denne spesifika-sjonen er inkorporert heri ved referanse.
I tradisjonell mikrobiell diagnostikk blir tilstedeværelse av en mikrobe i en prøve bestemt ved isolering av mikroben. Etter anrikningskultiveringer, blir mikroben bestemt enten på basis av de biokjemiske egenskapene eller de immunologiske egenskapene. Begge fremgangsmåtene for identifikasjon krever at mikroben i prøven har evnen til å formere seg. Slik identifikasjon kan være besværlig og veldig tidkrevende.
Med utvikling av genetisk forskning, er det blitt oppdaget at mikrober, selv de som ikke lenger lever, kan bli bestemt ved de spesifikke nukleinsyrene som de inneholder. Nukleinsyren kan være deoksyribonukleinsyre (DNA), som vanligvis er dobbelt-trådet, eller ribonukleinsyre (RNA), som vanligvis er enkelt-trådet. Organismer så som bakterier, sopp, virus, gjær osv. kan alle bli bestemt på denne måte. Generelt innbefatter identifikasjonsfremgangsmåten kunstig indusert lyse, hvorved celleveggen til organismen blir ødelagt og utskiller nukleinsyre som dermed kan bli bestemt.
Den hydrogenbundede strukturen til dobbel helixen til et nukleinsyremolekyl (f.eks. DNA) kan bli ødelagt ved oppvarm-ing og/eller behandling med alkali. Da det ikke er noen kovalente bindinger som knytter partnertrådene sammen, separeres de to polynukleotidkjedene til et dupleks nukleinsyremolekyl fullstendig når alle hydrogenbindingene er brutt. Denne fremgangsmåten for trådseparasjon kalles denaturering. En meget nyttig egenskap til denaturerte nukleinsyrer er at reaksjonen under hensiktsmessige betingelser kan bli rever-sert, . slik at to separerte komplementære tråder fra samme kilde igjen kan gå sammen til en dobbel helix.
Dette betegnes renaturering. Renaturering innbefatter reaksjonen til to komplementære nukleotidsekvenser som ble separert ved denaturering. Denne teknikken kan også bli utvidet til å innbefatte at hvilke som helst komplementære nukleotidsekvenser smelter sammen med hverandre for å danne en duplex-struktur. Dette blir referert til som hybridisering når nukleotidsekvenser fra forskjellige nukleinsyrebe-standdeler er involvert; f.eks. reaksjonen mellom enkelt-trådet DNA og RNA, eller mellom to enkelttrådede DNAer fra forskjellige kilder.
Nukleinsyrehybridisering er en velkjent fremgangsmåte for identifisering av spesifikke nukleinsyrer. Denne evnen som to enkelt-trådede nukleinsyrepreparater har til å hybridisere danner basis for nukleinsyreanalyse. Prinsippet på slike analyser er å utsette to enkelt-trådede nukleinsyrepreparater for hverandre, og deretter å måle mengden av dobbelttrå-det materiale som er blitt dannet.
Hybridiseringsanalyser innbefatter vanligvis bruken av polynukleotidhybridiseringsprober. En probe innbefatter generelt et enkelt-trådet fragment av en nukleinsyre, eller et dobbbelt-trådet fragment som er denaturert. Den erkarakterisert vedå ha en spesifikk nukleotidsekvens som er komplementær til en korresponderende nukleotidsekvens på en målnukleinsyre (nukleinsyren som skal bestemmes). Proben og målpolynukleotiden (enkelt-trådet), danner duplex-molekyler når de blir bragt sammen ved baseparring av de komplementære sekvensene. Proben blir generelt fremstilt i renset reagens-form, og et lett detekterbart merke kan bli inkorporert inn i den molekylære strukturen til proben. Tilstedeværelse av målnukleotiden kan derved bli bekreftet ved dannelsen av duplex hybride molekyler som bærer merket.
Polynukleotidhybridiseringsprober tilveiebringer billig, effektiv og rask fremgangsmåte for detektering, lokalisering, og isolering av "mål "-nukleotidsekvensene. Klausner et"'al.,' "Biotechnology", august 1984: 471-478, tilveiebringer interessant bakgrunn på polynukleotid-hybridiseringsprober, innbefattet en diskusjon for preparering og anvendelse. Kjente fremgangsmåter for preparering av polynukleotid-hybridiseringsprober og for anvendelse av slike probert er godt dokumentert i litteraturen. Se f.eks. Southern, J.Moi. Biol. 98: 503-517 (1975); Falkow et al., US-patent 4.385.535; Leary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 80: 4045-4049 (1938); Langer-Safer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 79:4381-4385
(1982); og Langer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 78:6633-6637
(1981). Som beskrevet ved disse andre referanser, innbefatter slike kjente fremgangsmåter for preparering av prober, kloning av en proberegion inn i et dobbelt-trådet DNA-plasmid. Plasmidet som bærer proberegionen er merket, vanligvis ved enzymatiske polymeriseringsteknikker. Slike teknikker innbefatter, f.eks. nick-translasjon (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113:237 (1977)); gap-fylling (Bourguignon et al., J. Virol. 20:290 (1976)); og terminal tilsetting, hvor teknik-kene blir utført i nærvær av modifiserte nukleotidtrifos-fater. Probenukleinsyren kan også bli merket kjemisk med haptener eller biotin (Tchen et al., P.N.A.S. 81:3466 (1984), Forster et al., Nucl. Acids Res. 13:745 (1985), Viscidi et al., J. Clin. Microbiol. 23:311 (1986).
Det er to prinsipielle måter å utføre hybridiseringsanalyser: oppløsnings (eller væskehybridisering og fast bærehybridisering. I oppløsningshybridisering, blir enkelt-trådet nukleinsyrepreparater blandet sammen i oppløsning. Når det gjelder større mengder materiale, kan reaksjonen bli fulgt ved forandring i optisk tetthet. Når mindre mengder materiale er innbefattet, kan proben bære et lett detekterbart merke, så som et radioaktivt merke. Enkelt-trådene som ikke har reagert, blir separert fra dobbelt-trådene, og dobbelt-trådet nukleinsyre kan bli bestemt ved detektering av tilstedeværelse av merket i det dobbelt-trådede materialet. Hydroksyapatitt (HA) er blitt benyttet som en standard fremgangsmåte for separering av hybridisert probe fra ikke-hybridisert probe i oppløsning. Under riktige betingelser kan HA selektivt binde hybridisert DNA-probe, men den binder ikke ikke-hybridisert probe. Andre fremgangsmåter er pgså tilgjengelige for separering av hybridisert probe fra ikke-hybridisert probe. En slik fremgangsmåte innbefatter bruk av et spesifikt enzym, f.eks. S^nuklease, for å selektivt degradere ikke-hybridisert probe til mindre fragmenter. Dobbelt-trådede molekyler blir ikke påvirket av enzymet. Den degraderte proben kan deretter bli separert ved bruk av velkjent størrelse separeringsteknikker, så som presipiter-ing med polyetylenglykol, kromatografi, elektroforese og ultrasentrifugering osv. Britten et al., Methods in Enzymology, XXIX, s. 363, Eds., Grossman & Moldave, Academic Press, New York, 1974.
Oppløsningshybridisering har fordelene som er innbefattet i hastighet og .reaksjonseffektivitet. Men den har også alvorlige ulemper. Separering av hybridisert ikke-hybridisert probe er generelt arbeidskrevende, tidkrevende, kan ikke utføres ved automatisering og kan på andre måter være begrensende. Størrelseseparerings-teknikkene beskrevet ovenfor, er for eksempel relativt uspesifikke, ueffektive og viser dårlig reproduserbarhet. Selv om HA separasjonsfremgangsmåten er mere spesifikk, er den bare vanligvis nyttig hvis mål-polynukleotidet er tilstede i et stort overskudd i forhold til proben, eller hvis målet er RNA, eller begge. Effektiv separering kan være y.anskelig med urensede prøver, f. eks. plante- og dyrevevhomogenater, blod, avføring, nese- og urinrørsslim osv.
Ved fast bærehybridisering blir en av enkelt-trådet nukleinsyre-preparatene immobilisert ved å være festet til en fast bærer. Flerfoldige fremgangsmåter eksisterer for kobling av en av. de terminale endene til et polynukleotid til en gitt støtte-matrise. Se, f.eks. Weissback, A. og Poonian, M., Methods in Enzymology, Vol. XXXIV, Part B, 463-475, 1974. Avledede former av polymikleotider, f.eks. en som hærer et terminalt aminoheksylnukleotid, kan lett festes til forskjellige matriser. Mosbach, K. , et al., Methods in Enzymology, Vol. XLIV, 859-886, 1976. 01igoribonukleotider kan bli immo-biliserte på boronatderivater av forskjellige matriser. Schott, H., et al., Biochemistry, 12, 932, 1973.
Som et eksempel adsorberer nitrocellulose enkelt-trådet DNA, men ikke RNA. Videre adsorpsjon av DNA på nitrocellulosen kan bli forhindret ved velkjente behandlinger. Så hvis et annet denaturert DNA- eller RNA-preparat blir tilsatt, vil den bli festet til den faste bærer bare hvis den har evnen til å baseparre med DNAet som opprinnelig var adsorbert. Vanligvis er nukleinsyrepreparatet som ikke opprinnelig er bundet til den faste bærer merket. Etter hybridiseringsreaksjonen er fullført, blir den faste bæreren separert fra reaksjonsblandingen, og hybrid!seringsgraden kan bli bestemt ved måling av merket som er festet til den faste bæreren.
En forbedring av fast bærehybridisering er sandwich-hybridisering, så som diskutert i Ranki, US-patent 4.486.539. Prøven blir utsatt for betingelser som gjør mål-polynukleotidet (nukleinsyren som skal bestemmes) enkel-trådet. Prøven blir deretter blandet med to rensede nukleinsyrereagenser. Det første nukleinsyrereagenset innbefatter et enkelttrådet nukleinsyrefragment, som har en nukleotidsekvens på minst 10 baser, og som er festet til en fast bærer. Det andre nukleinsyrereagenset innbefatter et enkelt-trådet nukleinsyrefragment , som har en nukleotidsekvens på minst 10 baser, og som er merket med en radioisotop. Nukleinsyrereagenset har evnen til å danne hybridmolekyler ved komplementær baseparring med mål-polynukleotidet. De to nukleinsyrereagensene . har ikke evnen til å hybridisere med hverandre. Den faste bæreren blir derved vasket for å fjerne merket som ikke er inkorpurert i hybride molekyler. Tilstedeværelse av måle-nukleinsyre blir deretter bestemt ved måling av merket på den vaskede, faste bæreren. Sandwich-hybridisering tilveiebringer også forbedret spesifisitet i forhold til fremgangsmåter som benytter et enkelt nukleinsyrereagens, fordi den innbefatter to spesifikke hybridiseringsprosesser.
En fordel med fastbærerhybridisering er hvor lett det hybride molekylet som er dannet fra målentikleinsyren og proben(e) kan bli separert fra reaksjonsblandingen. Tidligere typer fastbærerhybridiseringsteknikker, inbefattende sandwich-hybridiseringsfremgangsmåten til Ranki diskutert ovenfor, har alvorlige ulemper. Kinetikken medfører mye saktere reaksjonshastigheter i fastbærerhybridisering enn i oppløsningshybridisering, da ikke alle hybridiseringskom-ponentene kan diffundere. En reaksjon som kan ta, minutter i oppløsning kan ta timer og dager, for å bli fullført når en fast bærer er involvert. Hybridiseringseffektiviteten er altså mye lavere, siden noen nukleinsyrer ikke er tilgjengelige for baseparring. Mye preparat er også nødvendig. Vanligvis er det nødvendig med flere timer for å preparere prøven for hybridisering, og en til to timer er nødvendig for vasking. Relativt store mengder av prober er også nødvendig.
Det er derved ønskelig å ha en fremgangsmåte for analysering av nukleinsyrer som kombinerer fordelene ved både oppløs-ningshybridisering og fast bærehybridisering.
Diagnose av genetisk sykdom, ifølge teknikkens stand, innbefatter generelt tidkrevende og arbeidskrevende teknikker. I en akseptert diagnostisk fremgangsmåte for bestemmelse av genetisk sykdom, er fremgangsmåten kjent som restriksjons-fragmentlengde polymorfi sering (RFLP). RFLP-teknologien benytter generelt et omfattende separeringssteg basert på størrelsen av de genetiske stikkene som blir laget etter behandling av prøve-DNA med et restriksjonsenzym. Det spesialiserte tilfellet sigdcelleanemi presenterer den lettest forståelige variasjonen av RFLP-teknologi. F.eks., The New England Journal of Medicine, juli, 1.982: s. 30-32 og s. 32-36, inneholder to artikler som illustrerer hvordan den nåværende prenatale testen for sigdcelleanemi blir utført. Generelt blir testprøve-DNA behandlet med et restriksjonshen-syn (Mst II) som tilveiebringer to stykker med forskjellig størrelse av globingenet for det normale og sigdallel^ne. Stykkene blir separert ved størrelse, f.eks. en agarose elek-troforesegel. Stykkene blir deretter gjort enkelt-trådede, overført til et filterpapirark, og de nøyaktige stykkene blir bestemt i mengden av stykker med lik størrelse ved en hybri-diseringsprobe. Både gelelektroforese og overføringsstegene i testen krever bruk av trenet personell, og er tidkrevende.
Det er derved nødvendig med en forenklet fremgangsmåte for diagnostisering av tilstedeværelse av genmutasjoner på grunn av genetiske sykdommer.
Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller kravene ovenfor. Den dekker spesifikt en fremgangsmåte for detektering, enten kvalitativt ell.er kvantitativt, av en enkel-trådet målnuk-leotid i en væskeprøve. Fremgangsmåten innbefatter følgende steg: a) kombinering av prøven med minst to forskjellige prober, som er en første probe og en andre probe, for å danne en reaksjonsblanding, hvor hver probe består av et enkelt-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens som er komplementær til en del av mål-polynukleotidet, hvor probene sammen danner hybride molekyler ved komplementær baseparring med mål-polynukleotidet, ingen av probene er festet til en fast bærer, og probene hybridiserer ikke med hverandre, og den andre proben har et detekterbart merke;
b) deretter kontakting av reaksjonsblandingen med en fast bærer som binder den første proben men ikke den andre
proben, og ikke målnukleotidet; og
c) deretter bestemming om noe av merket er bundet til den faste bæreren.
Enkel-trådet målpolynukleotid kan bli dannet ved denaturering av en dobbelt-trådet polynukleotid. De to probene binder fortrinnsvis forskjellige deler av målpolynukleotidet som skal bli bestemt, slik at de to probene ikke konkurrerer med hverandre. De to forskjellige delene er fortrinnsvis^ ved siden av hverandre eller nær hverandre.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for mikrobiell diagnostikk. Den er også egnet for genetisk sykdomdiagnose som for sigdcelleanemi, og for kreftdiagnostikk, blant andre anvendelser. Med hensyn på det siste inkorporerer fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse et atskillelsesteg, slik som ved bruk av et restr iks j ons-enzym, sammen med en sandwich-hybridiseringsfremgangsmåte. For eksempel kan fremgangsmåten bli benyttet for å detektere et målpolynukleotid i en prøve som også kan inneholde et standard polynukleotid, hvor nukleotidsekvensen til de to polynukleotidene er vesentlig lik hverandre, og standardpolynukleotidet. er en del A og en del B, og målpolynukleotidet har en del A' og en del B', og hvor standard og måle-polynukleotidene har minst ett nukleotid som er forskjellige og som er beliggende mellom delene A og B på standardpolynukleotidet og mellom delene A' og B' på mål-polynukleotidet, hvor fremgangsmåten innbefatter følgende steg: a) adskilling av både standard og målpolynukleotidene som er tilstede til enkelt-trådede segmenter, slik at ingen av segmentene til standard polynukleotid inneholder begge delene A og B, mens minst ett av segmentene til målpolynukleotidet inneholder begge delene A' og B';
b) kombinering av behandlet prøve fra (a) med minst to prober, værende en første probe og en andre probe, for å
danne en reaksjonsblanding, hver probe innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid, probene kan ikke hybridisere med hverandre, den første proben baseparres komplementært med del A, og med del A', den andre proben baseparret komplementært med del B, og med del B', de to probene danner sammen hybride molekyler med komplementær baseparring med det enkelt-trådede
segmentet til mål-polynukleotidet som inneholder delene A' og B' ; og c) påfølgende bestemmelse av tilstedeværelse av hybride molekyler som inneholder begge probene.
Ingen av probene er festet til en fast bærer, og den andre proben har et detekterbart merke, hvor stegene for bestemming av tilstedeværelse av hybride molekyler som inneholder begge probene Innbefatter videre følgende steg: a) kontakting av reaksjonsblandingen med en fast bærer som binder den første proben men ikke den andre proben, og ikke segmenter som bare inneholder del B eller bare del B' ; og b) påfølgende bestemmelse av om noe av merket er bundet til den faste bæreren.
TEGNINGER
Disse andre trekk, aspekter og fordeler ifølge foreliggende oppfinnelse, vil bli bedre forstått med referanse til følgende beskrivelse, vedlagte krav og vedlagte tegninger: Fig. 1 er en skjematisk representasjon av stegene til analysefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 er en skjematisk representasjon av en sigdcel-leanalyse som benytter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 og fig. 4 er plot av det relativt signale ved merkedeteksjon vs. mål-DNA-konsentrasjon. Fig. 5 er et plot av bindingskaraktertrekkene til en avidincellulosefastbærer og en biotinmerket probe.
BESKRIVELSE
En fremgangsmåte og et kit som innbefatter trekkene Ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for å detektere tilstedeværelse av polynukleotid (så som DNA eller RNA) inneholdende organismer, så som virus, bakterier, sopp, gjær og andre mikroorganismer og andre infeksiøse midler. Frem-gangs og kitet kan bli benyttet, for eksempel ved mathygiene-undersøkelser, medisinsk diagnostisk anvendelse og hvilken som helst mikrobiell diagnostikk. Egnede prøver Innbefattende dyr og plantevevhomogenater, blod, serum, avføring, nese- og urinrørsslim, vann, støv, jord osv. Faste prøver blir først moset eller homogenisert i et væskemedium for å fremstille en testprøve. Fremgangsmåten er også egnet for diagnostisering av genetisk sykdom når normale gener er blitt muterte. Fremgangsmåten er også egnet for kreftdiagnostikk.
I fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, blir en prøve inneholdende celler som man antar inneholder polynukleotider som skal bli detektert (mål-polynukleotidet) for-behandlet, om nødvendig, for å frigjøre målpolynukleotidet fra cellene til organismen inn i oppløsning, eller å gjøre celleveggen permeabel for reagensene som blir benyttet for detektering av målpolynukleotidet. Målpolynukleotidet er vanligvis et DNA eller et RNA, eller derivater eller fragmenter derav.
Hybridisering foregår mellom enkelt-trådede polynukleotlder. Hvis målnukleotidet dermed er dobbelt-trådet, blir testprø-ven utsatt for betingelser som kan denaturere målnukleotidet som er tilstede, f.eks. varme, eller varme pluss høyt pH, så som 100°C I 5 min, eller behandling, med 0,5 molar NaOH i 5 min, ved 20-40°C. Betingelser for denaturering av polynukleotlder er velkjente.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, som' il-lustrert i fig. 1, innbefatter et oppløsnings-sandwich-hybridiseringssteg og et høstingssteg. Oppløsnings-saridwich- hybridiseringssteget innbefatter at testprøve blir kombinert med minst to forskjellige spesifikke nukleotide hybridiseringsprober for å danne en reaksjonsblanding. For eksempel kan to prober bli benyttet, værende en førsteprobe, en bindingsprobe, en andreprobe og en identifikasjonsprobe. Hver probe innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens som er komplementær til en del av det den enkelttrådede målpolynukleotidet. Hver probe har dermed evnen til komplementær baseparring med den korresponderende nukleotidsekvensen på målpolynukleotidet. De to probene binder fortrinnsvis forskjellige deler av målpolynukleotidet, slik at de to probene ikke konkurrerer med hverandre; delene er fortrinnsvis nær hverandre, (ikke mer enn omtrent 300 nukleotider fra hverandre), det er mere foretrukket at delene er rett ved siden av hverandre (ikke mer enn 10 nukleotider fra hverandre). Probene kan ikke hybridisere med hverandre. I reaksjonsblandingen hybridiserer de to probene og enkelt-trådet målpolynukleotid sammen for å danne kom-plekse dobbelt-trådede hybridmolekyler. For å sikre rask og effektiv hybridisering, er ingen av probene festet til en fast bærer. Den andre proben, identifikasjonsproben, er viderekarakterisert vedå ha et lett detekterbart merke. Fremgangsmåten betegner sandwich-hybridisering fordi mål-polynukleotidet blir "sandwiched" mellom de to probene i det resulterende hybridmolekylet.
Probene kan være i separate reagenser. Fordi probene ikke hybridiserer med hverandre, er det også mulig å ha alle probene i et enkelt reagens.
Rekkefølgen av kombinering av probene med testprøven er generelt ikke.viktig. Probene kan bli satt til testprøven i seriatum (en etter en annen), alle samtididg, eller i hvilken som helst annen kombinasjon.
Reaksjonsblandingen blir holdt ved betingelser som medfører hybridisering. Betingelsene avhenger av, og er generelt kjente for, de spesielle polynukleotidbestanddelene som er involvert. Hybridiseringen blir i all vesentlig grad utført til fullending. For de fleste polynukleotidene tar dette mer enn omtrent en time. For eksempel ved en saltkonsentrasjon på omtrent 0,15 molar, en temperatur på 65 °C og en plas-midprobekonsentrasjon på 1,0 jjg/ml, er tiden det tar for å nå 1/2 fullending mindre enn 20 minutter.
I høstingssteget blir reaksjonsblandingen satt i kontakt med en fast bærer som har evnen til å binde den første proben (bindingsprobe), men ikke den andre probe (identifikasjonsprobe), og ikke målpolynukleotidet. Betegnelse "binde" og "binding" heri refererer seg til sterk binding via spesifikke funksjonelle grupper, i kontrast til lavt nivå av uspesifikk binding. De hybride molekylene som blir dannet ved binding av mål-polynukleotidet til de to probene, blir dermed bundet til den faste bæreren via bindingsproben.
Den andre proben blir valgt, slik at det er liten uspesifikk binding av selve andreproben på den faste bærer. Tilstedeværelse av målpolynukleotid i testprøven blir dermed bekreftet ved bestemmelse av om noe av merket e_r bundet på den faste bæreren. Kvantitativ bestemmelse av mengden av mål-polynukleotidet i testprøven er også mulig ved å måle den virkelige mengden av merket som er bundet til den faste bæreren.
Det er ihvertfall to hovedfremgangsmåter for bestemming om noe av merket er bundet til den faste bæreren, både måling av distribusjonen av andreprobe i de faste faser av væskefasen til reaksjonsblandingen etter høstingssteget. I første fremgangsmåte blir overskuddet identifikasjonsprobe som ikke er inkorporert i de hybride molekylene fjernet ved konvensjonel-le fremgangsmåter så som vasking, fordamping, dekantering osv. Mengden av - merket bundet til den faste bæreren- blir deretter målt. Tilstedeværelse av merket på den faste bæreren indikerer nærvær av målpolynukleotid i prøven. I- den- andre fremgangsmåten kan den faste bæreren bli separert fra væskefasen til reaksjonsblandingen, eller den kan forbli blandet med væskefasen. Mengden av ubundet andreprobe i oppløsning i væskefasen blir målt og blir sammenlignet med total mengde av andre prober tilsatt til reaksjonsblandingen. En forskjell i de to mengdene indikerer at noe av den andre proben er bundet til den faste bæreren, som igjen indikerer tilstedeværelse av målpolynukleotid i prøven.
Fortrinnsvis innbefatter den første proben (bindingsproben) en første bindingsgruppe og den faste bæreren innbefatter en andre bindingsgruppe, hvor de to bindingsgruppene binder seg raskt til hverandre ved dannelse av sterke bindinger. De to bindingsgrupper sammen danner et bindingspar. En av bindingsgruppene til bindingsparret er festet til basematerialet til den faste bæreren, og den andre bindingsgruppen er deler av den første proben. Blndingsparet kan f.eks. være hvilket som helst av følgende par: avidinbiotin, haptenantistoffer, antistofferantigener, karbohydraterlektiner, riboflavin-riboflavinbindingsprotein, metallion-metallionbindingsstof-fer, enzymsubstrat, boronat-cis-dioler, staph A-proteiner-antistoffer, enzymerinhibitorer osv. Bindingsparene innbefatter også par av derivatene til de ovenfor nevnte bestanddelene. Kriteriene for valg av bestemte bindingspar innbefatter (1) hastigheten hvorpå bindingsgruppene til paret reagerer med å binde seg til hverandre, (2) styrken på bindingen mellom bindingsgruppene til paret, (3) minimal interferens av bindingsgruppen på den første proben med oppløsnings-sandwich-hybridiseringssteget, (4) lettheten hvorpå bindingsgruppene kan.bli festet til matrisematerialet til den faste bærer, og bli benyttet for å danne den første proben.
Matrisematerialet til den faste bæreren kan være et materiale selektert fra f.eks. agarose, cellulose, glass,, latex, polyakrylamid, polykarbonat, polyamid (f.eks. nylon-)/ polyetylen, polypro.pylen, polystyren, silisiumok&ydgel, " silisium og derivater derav. Denne listen er på ingen måte fullstendig. Hvilket som helst fast stoff hvorpå ett av bindingsgruppene til bindingsparet kan bli festet, er egnet.
Den faste bæreren kan være I forskjellige former. For eksempel kan den være i form av mikropartikler med partlk-kelstørrelser mindre enn 100 mp (f.eks. mikrokrystallinsk cellulose), makropartikler med partikkelstørrelse på 0,1 til 2,0 mm, ark, rør, pipettespisser, plater, filtre og kuler osv.
Fremgangsmåter for festing av den andre bindingsgruppen til den faste bæreren er velkjent. Fremgangsmåter for forandring av polynukleotidandelen av den første proben til å inneholde den første bindingsgruppen, er også velkjente. (Tchen et al., P.N.A.S. 81:3466 (1084), Forster et al., Nucl. Acids Res. 13:745 (1985), VIscidi et al.,. J. Clin. Microbiol. 23:311 (1986 ). Biotechnology, august 1983:471-478, J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975); Falkow et al., US-PS 4.385.535; Leary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 80:4045-4049 (1983); Langer-Safer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 79:4381-4385 (1982 ); and Langer et al., Proe. Nati. Acad-. Sei. 79:6633-6637 (1981), Rigby et al., J. Mol. Biol. 113:237 1977), Bourguignon et al"., J. Virol. 20:290 (1976 ).
Den andre proben (identifikasjonsproben) inneholder et lett detekterbart merke. Forskjellige fremgangsmåter for merking av spesifikke polynukleotidprober er kjente. Et hvilket som helst merke som har evnen til lett å bli detektert og som ikke interfererer med oppløsningshybridiseringssteget, kan bli benyttet. Egnede merker innbefatter radioisotoper, lysmerker, enzymer, enzymkofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lektiner', metallchelatorer osv. og deres derivater. Deteksjon kan være direkte, som med radioisotoper, eller indirekte, som med et hapten etterfulgt av et enzym-merket antistoff.
Radioisotope, så som<32>p,<125>I, osv., kan bli benyttet for å merke proben. De radioaktive merkene kan bli detektert ved bruk av velkjente fremgangsmåter, så som gammatelling eller scintillasjonstelling. Men bruk av radioaktivisotope merker kan være dyrt og farlig. Deteksjon av radioaktivitet krever vanligvis dyrt utstyr. Spesielt trenet personell og sikker-hetsforanstaltingen er nødvendig for håndtering av radioaktivt materiale. Radioaktive isotoper har begrenset halveringstid; og dermed har den merkede polynukleotidproben vanligvis en relativ kort brukstid (vanligvis i noen uker).
Av de ovenfor nevnte grunner, ble andre merkingssystemer utviklet, så som lysmerker og enzymvirkningsbaserte merker. Som diskutert i Heller, et al., EP-PS 82303701.5, kan lysmerker innbefatte kjemisk luminescent, bioluminescent, fluorescent eller fosforscent, og kan under riktige betingelser tilveiebringe sensitiviteter som er sammenlignbare med det til radioisotopene. Lysmerket kan bli festet til et hvilket som helst punkt på de enkelttrådede polynukleotidseg-mentene til proben; men terminale posisjoner er kjent å være mere ønskelige.
Noen eksempler på lysmerker er som følger; (1) kjemisk luminescent: peroksydase og funksjonaliserte jernporfyrin-derivativer, (2) bioluminescent: bakteriell luciferase, ildflueluciferase, flavinmononukleotid (FMN), adenosin trifosfat (ATP), redusert nikotinamidadenindinukleotid (NADH), redusert nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH), og forskjellige langkjedede aldehyder (decylaldehyd osv. );
(3) fluoriserende: fluoriserende nukleotider så som adenosin-nukleotider, etenocytidinnukleotider, etc, eller funksjonaliserte nukleotider (aminoheksanadenosinnukleotidér, mur-kurinukleotider, osv.) som først kan bli merket med kovale-sens, og deretter kovalent bli festet til enkelt-trådet polynukleotidsegmentet til proben; (4) fosforeschentV 2-diketoner så som 2,3 butadion, 1-[karboksyfenyl]-1,2-pentadion og 1-fenyl-l, 2-propandion. Fremgangsmåter -"-f or å feste lysmerket til proben er godt dokumentert innnenfor fagområdet. Merket blir målt ved å eksitere merket og deretter måle lysresponsen med fotodeteksjonsanordninger. Fluorescent- eller fosforescentmerker kan bli eksitert ved bestråling med lys med hensiktsmessig bølgelengde. Kjemilu-minescent eller bioluminescentmerker kan bli eksitert kjemisk ved bruk av fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet.
Identifikasjonsproben kan også bli merket med et enzym. Hybridiseringsproduktet blir detektert ved virkningen av enzymet på et substrat for enzymet. For eksempel, kan et enzym som har evnen til å virke på et kromogent substrat bli valgt. Omdanningsforholdet til substratet kan bli beregnet ved optisk analyse. Forholdet blir deretter korrolert med tilstedeværelse eller fravær av målpolynukleotidet. Det er velkjent at avidin og biotin kan bli benyttet for å binde et enzym til en spesifikk nukleinsyreprobe. Eksempler på egnede enzymer innbefatter f.eks. beta-galaktosidase, alkalisk fosfatase, pepperrotperoksydase, og luciferase.
En av hovedfordelene med de lysmerkede og enzymvirkende baserte merker, er at deres kvalitative deteksjon kan bli visualisert uten- at det er nødvendig med dyrt deteksjons-utstyr. Kvantitative bestemmelser av slike merker kan også bli gjort ved bruk av fotometrisk utstyr.
Det er foretrukket at de første og andre probene hver er komplementære til vesentlig innbyrdes eksklusive deler av målpolynukleotidet. Med andre ord, så bør de første og andre probene ikke konkurrere for den samme basesekvensen i den grad at sandwich-hybridisering blir forhindret.
Probene kan bli tilveiebragt fra hensiktsmessig restriksjons-endonukleasebehandlede polynukleqtider fra organismen som er av interesse, eller fra dobbelt-trådede polynukleotider ved enzymatiske fremgangsmåter så som Exo III-spalting-eller RNA- polymerasetranskripsjon. I disse tilfellene er probene RNA eller DNA-fragmenter. I andre tilfeller hvor basesekvensen av en unik del er kjent, kan probene bli syntetisert ved organisk syntetiske teknikker (Stawinski, J. et al. , Nuc. Acids Res. 4, 353, 1977; Gough, G. R. et al., Nuc. Acids Res. 6, 1557, 1979; Gough, G. R. et al., Nuc. Acids Res. 7, 1955, 1979; Narang, S. A., Methods in Enzymology, Vol 65, Part I, 610-620, 1980). Det er også mulig å fremstille oligodeok-syribonukleotider med definert sekvens ved bruk av polynukleotid-fosforlase (E. Coll) under riktig betingelser (Gillam, S., og Smith, M., Methods in Enzymology, Vol. 65, Part I, s. 687-701, 1980). Det er også mulig å fremstille store mengder av proben ved kloning; f.eks. ved rekombinering av den bestemte sekvensen inn i et plasmid eller M13 bakteriofagvek-tor, og deretter kloning av den rekombinante bestanddel ved bruk av standard fremgangsmåte. Kloningsfremgangsmåten er foretrukket.
Størrelsen på probene kan være fra 10 nukleotider til 100.000 nukleotider i lengde. Under 10 nukleotider er hybridiserings-systemet ikke stabilt og vil begynne å denaturere over 20°C. En komplementær polynukleotidsekvens på 12 er omtrent den minimale lengden som er nødvendig for hensiktsmessig bind-ingsspesifisitet. Den generelt benyttede minimumsverdien er omtrent 15. Over 100.000 nukleotider blir hybridisering (renaturering) en mye saktere og ufullstendig prosess, se Molecular Genetics, Stent, G. S. og R. Calender, s. 213-219, 1971. Det er ikke nødvendig at hele proben er komplementær til målpolynukleotidet. på en base'ved baseskala. Fortrinnsvis bør probene være fra omtrent 15 til omtrent 50.000 nukleotider lang, fortrinnsvis fra omtrent 15 til omtrent 10.000 nukleotider lang. Antallet komplementære (baseparring) nukleotider på proben er fortrinnsvis mellom omtrent 200 til omtrent 5.000. De komplementære nukleotidene er fortrinnsvis ved siden av hverandre, spesielt når antallet komplementære nukleotider er lavt (under 200). Men en-til-en komplementering av alle baseparringsnukleotider på mål og proben er ikke nødvendig. Mindre prober (15-100) kan fremstilles ved auto-matiserte organisk syntetiske teknikker. Prober med størrelse fra 100-10.000 nukleotider kan bli tilveiebragt fra hensiktsmessig enzymatiske fremgangsmåter, eller ved rekombinant DNA-fremgangsmåter.
Merking av mindre polynukleotidsegmenter med relativt bulkete merkingsandeler (f.eks. kjemisk luminescens-merker) kan i noen tilfeller interferere med hybridiseringsprosessen. Det er derfor viktig å velge viktige merker. Noen av kriteriene for velging av merker er: hvor lett det er å inkorporere merket i polynukleotidet uten inhibering av hybridisering, lettheten og sensitiviteten til deteksjon av merket, lav uspesifikk binding av den merkede proben til den faste bærer, og høy stabilitet.
Riktige hybridiseringsbetingelser i oppløsnings-hybridiser-ingssteget blir bestemt av naturen til den første bindingsgruppen på den.første proben (bindingsproben) , og av merket festet til den andre proben (identifikasjonsproben), stør-relsen på de to probene, [G] + [C] (guanin pluss cytosin) innholdet i probene og de komplementære nukleotidsekvensene på målnukleotidet og hvordan testprøven er preparert. Merket kan påvirke temperaturen og saltkonsentrasjonen som blir benyttet for å utføre hybridiseringsreaksjonen. For eksempel kan kjemisk luminescenskatalysatorer bli sensitive til temperaturer og saltkonsentrasjoner som absorberer/emitter bestanddelene kan tolerere. Størrelsen på probene påvirker temperaturen og tiden .til hybridiseringsreaksjonen. Hvis man antar lignende salt og reagenskonsentrasjoner, krever hybridiseringer som innbefatter reagenspolynukletidsekvenser i området på 10.000 til 100.000 nukleotider fra 40 til 80 minutter for å oppstå ved 67"C, mens hybridiseringer som Innbefatter 14 til 100 nukleotider krever fra 5 til 30 minutter ved 25°C. Sekvenser med høyt [G] + [C] innhold vil hybridisere ved høyere temperaturer enn polynukleotid-sekvenser med et lavt [G] + [C] innhold. Betingelsene som blir benyttet for å preparere testprøven og å opprettholde målpolynukleotidet 1 enkelt-trådet form kan påvirke temperaturen, tiden og saltkonsentrasjonen som blir benyttet i hybridiseringsreaksjonen. Betingelsene for preparering er at testprøven er påvirket av polynukleotidlengden som er nød-vvendig og [G] + [C] innholdet. Generelt, desto lengre sekvens eller høyere [G] + [C] innhold, desto høyere temperatur og/eller lavere saltkonsentrasjon er nødvendig for denaturering. Konsentrasjonen av probe eller målpolynukleotid i blandingen bestemmer også tiden som er nødvendig for at hybridisering oppstår. Desto høyere probe eller mål-konsentrasjonen er, desto kortere hybridiseringsinkubasjonstid er nødvendig. Hybridiseringsgraden ble også påvirket av type salt som er tilstede i inkubasjonsblandingen, konsentrasjonen av saltet, og inkubasjonstemperaturen. Natriumklorid, natriumfosfat og natriumcitrat er de saltene som vanligvis blir benyttet for hybridisering og saltkonsentrasjonen som blir benyttet kan være så høy som 1,5 - 2M. Saltene nevnt ovenfor gir sammenlignbare polynukleotidhybrIdiseringshastigheter når de blir benyttet ved de samme konsentrasjonene og temperatur-ene, som de sammenlignbare kalsium, litium, rubidium og cesiumsaltene gjør. Britten et al. (1974) (Methods in Enzymology, Volume XXIX, del E., ed. Grossman og Moldave; Academic Press, New York, side 364) og Wetmur og Davidson
(1968) (J. Molecular Biology, Vol. 31, side 349) presenterer data som illustrerer de vanlige hybridiseringshastighetene som oppnås med saltene som vanligvis benyttes. Hybridiseringshastighetene til DNA med RNA varierer noe fra hybridiseringshastighetene til DNA som hybridiserer med DNA. Størrelsen på variasjonen er sjeldent over ti ganger, og varierer av-hengig av for eksempel om et overskudd av DNA eller RNA blir benyttet. Se Galau et al. (1977) (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol 74, #6, s. 2306).
Det er foretrukne generelle betingelser som ikke er optimale, men hvor hybridisering skjer for nesten alle probene og mål-kombinasjoner til 100 nukleotider eller mere. Disse betingel sene er omtrent 0,075 molar natriumklorid, 0,025 molar natrlumfosfat (pH 6,5), 65°C, og polynukleotidkonsentrasjoner på 0,001 til 1,0 pg/ml. Det finnes også kjente fremgangsmåter for å oppnå lignende betingelser ved lave temperaturer, f.eks. ved tilsetting av et denatureringsmiddel så ^ som formamid i reaksjonen (Casey et al., Nucl. Acids Res. 4: 1539
(1977)). Tilsetting av andre reagenser i hybridiseringsreaksjonen kan også øke reaksjonshastigheten, for eksempel dektransulfat (wahl et al., P.N.A.S. 76:3683 (1979), polyetylenglykol (Amasino, Anal, Biochem. 152:304 (1986)) og fenol (Kohne et al., Biochhemistry 16:5329 (1977)).
Et kit som egner seg for å detektere et enkelt-trådet målpolynukleotid i en testprøve ved analysefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan innbefatte et væs-kepolynukleotidreagens eller reagenser innbefattende minst to forskjellige prober, værende en førsteprobe, en bindingsprobe, en andre probe og en identifikasjonsprobe. Hver probe Innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid som inneholder "en nukleotidsekvens komplementær til en del av målpolynukleotidet. Ingen av probene blir festet til en fast bærer. Probene kan ikke hybridisere med hverandre. Den andre proben har et detekterbart merke. Kitet innbefatter også en fast bærer som har evnen til å binde den første proben, men ikke den andre proben og ikke målpolynukleotidet. De andre karak-tertrekkene til probene og til den faste bæreren er generelt som beskrevet ovenfor i beskrivelsen til fremgangsmåten Ifølge foreliggende oppfinnelse. Kitet kan også videre innbefatte måter for kvalitative og/eller kvantitativ bestemmelse av merket. Det kan være mer enn en probe i hvert polynukleotidreagens. Da probene ikke hybridiserer med hverandre, kan de med fordel bli slått sammen i et enkelt reagens.
Det er også foretrukket at ett eller flere av følgende komponenter er innbefattet som deler av kitet: (a) detergen-sen som kan løse opp de forskjelllige bestanddelene så som natriumdodecylsulfat, eller natriumlaurylsarkosinat; (b) protease, så som proteinase K og pronase; (c) reagenser for å lette denaturering av målpolynukleotidet, innbefattende salter og oppløsningsmidler; (d) reagenser som blir benyttet til detektering av merket på den andre proben. Komponentene til (a), (b), (c) og probereagenset kan også bli kombinert til et enkelt reagens eller et antall reagenser, ifølge hva som er nødvendig.
Fremgangsmåten nevnt ovenfor og kitet kan bli omdannet for bruk for testing av en serie av målnukleotider. Et separat sett av prober er tilveiebragt for hvert målpolynukleotid, hvor hvert sett er spesifikt for det bestemte målpolynukleotidet. Hvert sett med prober innbefatter minst to forskjellige prober, bærende bindings- og identifikasjonsprobene (første og andre prober), som erkarakterisertovenfor. Den faste bæreren som blir benyttet har en bindingsgruppe som har evnen til å binde bindingsgruppene på hver av bindingsprobene som er spesifikke for majoriteten av målpolynukleotider, men ingen av identifikasjonsprobene, og ingen av målpolynukleotidene. Derfor kan en enkelt universal fast bærer bli benyttet med alle de forskjellige bindingsprobene. I kitet er fortrinnsvis hvert sett av prober holdt i et separat væskereagens.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten og kitet kan også bli tilpasset for testing av flere målpolynukleotider i en testprøve. Et separat sett av prober blir tilveiebragt for hvert målpolynukleotid, hvor hvert sett er spesifikt for det korresponderende polynukleotid. Ingen av probene har evnen til å hybridisere med hverandre. Hvert sett av prober består av minst to forskjellige prober, som er en første probe (en bindingsprobe ) og en andre probe (en identifikasjonsprobe), hvor probene er somkarakteriserttidligere. Alle første-probene bærer en identisk bindingsgruppe, slik at alle førsteprobene kan bli høstet på den samme faste bæreren. Den faste bæreren binder ingen av identifikasjonsprobene og ingen av målpolynukleotidene. De andre probene inneholder forskjellige merker, hvor hvert merke svarer til et bestemt målpolynukleotid. Etter høstingssteget, gir deteksjon av de respektive merkene på den faste bæreren informasjon om tilstedeværelse og/eller kvantiteter av det korresponderende målpolynukleotidet i prøven. I kitet blir fortrinnsvis alle probene oppbevart i et enkelt væskereagens.
Fordelene med analysefremgangsmåten og kitet ifølge foreliggende oppfinnelse er mange. Fremgangsmåten tilveiebringer reaksjonshastighet og reaksjonseffektivitet svarende til oppløsningshybridisering, og letthet ved separasjon av hybridiseringsproduktene fra testprøven svarende til fast bærehybridisering. Analysefremgangsmåten er veldig spesifikk, siden den trenger komplementering av minst to prober med målpolynukleotidet. Oppløsnings-sandwich-hybridi seringssteget kan generelt bli fullført på mindre enn en time, og høstings-steget tar ikke noe lenger tid enn omtrent 5 minutter (optimalt mindre enn omtrent 0,5 min.). Dermed tilveiebringes vesentlig tidsbesparring.
Kit Ifølge foreliggende oppfinnelse er enkelt å bruke. Brukeren trenger bare å oppbevare et enkelt, fast bærer-reagens, som kan bli benyttet for analysering av alle målpolynukleotidene. Bare ett væskereagens er nødvendig for hvert målpolynukleotid. Et tredje reagens for detektering av merket kan i noen tilfeller være nødvendig.
En annen betraktelig fordel med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er at det ikke er nødvendig med noen omfattende preparering av testprøven. Tidligere oppløsnings-hybridiseringsfremgangsmåter detekterer mål^nukleinsyrer som er blitt renset bort fra andre cellekomponenter. Nukleinsyrene i cellene eller virusene er vanligvis i tette komplekser med andre cellekomponenter, vanligvis protein, og i denne formen er de ikke tilgjengelige for hybridisering. Bare å ødelegge cellen eller viruset for å frigjøre innholdet medfører ikke nødvendigvis at polynukleotidene er tilgjengelige for hybridisering. Polynukleotidene forblir i kompleks med andre celle- eller viruskom-ponenter, selv om de blir frigjort fra cellen, og kan til og med bli omfattende nedbrutt av nukleaser som også kan^bli frigjort. En probe som ble tilsatt til en slik blanding kan i tillegg danne kompleks med "klebrig" celle eller virale komponenter og blir dermed utilgjengelig for hybridisering, eller så kan proben bli nedbrutt av virkningen av nuklease. En mengde fremgangsmåter eksisterer for rensing av polynukleotider. Disse fremgangsmåtene er alle tidkrevende - en som tar en time blir ansett å være veldig rask - og krever multiple manipuleringer. Det ble uventet oppdaget at analyseteknikkene ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet med urene prøver, og dermed unngå nødvendigheten av omstendelige og tidkrevende rensingsteg. Analysen kan lett automatiseres hvilket igjen vil forenkle forbrukerens arbeid. Analyseresul-tatene kan enten være kvalitative eller kvantitative.
Et annet aspekt ifølge fremgangsmåten og testkitet til foreliggende oppfinnelse er rettet mot genetisk sykdomsdiag-nose og kreftdiagnose.
Genetisk sykdom er et resultat av mutasjoner i et polynuk-leotids nukleotidsekvens. Slik mutasjon er også en faktor i utvikling av kreft. Som en konsekvens eller slik genetisk sykdom eller kreft, kan en prøve som er tatt fra pasienten, og som inneholder et normalt polynuklotid (standard polynukleotid), kan også inneholde et unormalt polynukleotid (målpolynukleotid) som er en variant av det normale polynukleotidet. Prøven kan også inneholde bare det unormale polynukleotid. De normale og unormale polynukleotidene har vanligvis vesentlig identiske nukleotide sekvenser, med unntagelse av mutasjonsstedene på mot-polynukleotidene. De normale og unormale polynukleotidene reagerer dermed forskjellig på visse reagenser.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt for å detektere slike forskjeller mellom de normale og unormale polynukleotidene. Fremgangsmåten kombinerer et adskillingssteg med en oppløsnings-sandwich-hybridiserings-f remgangsmåte. Ådskillelsessteget innbefatter et segmen_ter-ingssteg, og kan også innbefatte et denatureringssteg hvis målpolynukleotidet er dobbelt-trådet. Rekkefølgen av disse to stegene er ikke av betydning.
Restriksjonsreagenser, f.eks. restriksjonsenzymer, er kjente. Et restriksjonsenzym kan, under egnede betingelser, bli benyttet i et segmenteringssteg til å spalte et polynukleotid ved veldig spesifikke seter på nukleotid-ryggraden. Standard og målpolynukleotidene er nesten like. Standard polynukleotidet har en del A og en del B. Målpolynukleotidet har en del A' og en del B'. De to polynukleotidene er forskjellig i minst ett nukleotid som er beliggende mellom poly-nukleot idenes respektive deler av A og B, og A' og B'. Restriksjonsreagenset blir valgt slik at det spalter standardpolynukleotidet i segmenter som ikke inneholder begge delene A og B; restriksjonsreagensene spalter mål-polynukleotidet i segmenter hvor minst ett inneholder begge delene A' og B' . Vanligvis, hvor målpolynukleotidet er en genetisk variant av standard polynukleotidet, er delene A og A', og delene B og B', identiske.
Mål og standard-nukleotidene som er tilstede, eller deres segmenter (fra segmentsteget), blir denaturert, dvs. gjort enkelt-trådet, hvis nødvendig, enten før eller etter seg-menteringssteget. Den behandlede prøven inneholder dermed enkelt-trådede versjoner av mål og/eller standard-polynukleotider som er tilstede, klar for hybridisering. Den behandlede prøven blir deretter kombinert med minst.to prober for å danne en reaksjonsdanning. De to probene er en første probe og en andre probe. Hver probe innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid. Probene hybridiserer ikke med hverandre. Den første proben baseparrer komplementært med. del A på standardpolynukleotidet, og med del A' på målpolynukleotidet. Den andre proben baseparrer komplementært med del B på standardpolynukleotidet, og med del B' på målpolynukleotidet. De to probene danner sammen hybridmolekyler ved baseparring med enkelt-trådet segment(er) til målpolynukleotidet, som inneholder begge delene A' og B'. Med hensyn på standardpolynukleotidet, fordi del A og del B er på separate segmenter etter sekventering, vil ingen hybridmolekyler som inkorporerer både den første og den andre proben dannes. Probene er festet til separate segmenter. Hybride molekyler som både har de første og andre probene, vil bare bli dannet hvis unormale (mål)polynukleotider er tilstede i prøven.
Tilstedeværelse i reaksjonsblandingen av hybride molekyler som har begge probene inkorporert, ville indikere tilstedeværelse av målpolynukleotid i prøven. Bestemmelse av hybride molekyler som er dannet ved denne sandwich-hybridiseringsfremgangsmåten kan bli utført ved bruk av tidligere kjente fremgangsmåter..For eksempel kan et system som ligner det som er beskrevet i Ranki, US-patent 4.486.539, hvori en av probene allerede er immobilisert på en fast bærer, bli be-nytte. Ikke alle probene trenger å være i oppløsning. Andre fremgangsmåter er også kjent. Alternativt kan oppløsnings-sandwich-hybridisering, etterfulgt av et høstingssteg som tidligere diskutert, også bli benyttet. I det siste tilfellet er videre begrensninger på fremgangsmåten til denne oppfinnelsen som er beskrevet ovenfor at: ingen av probene blir festet til en fast bærer, og den andre proben har et detekterbart merke. Reaksjonsblandingen blir satt i kontakt med en fast bærer som binder den første proben, men ikke den andre proben, og ingen av segmentene inneholder bare del B eller bare del B'. En påfølgende bestemmelse blir utført for å se om noe av merket er bundet på den faste bæreren som tidligere diskutert.
Følgende fremgangsmåte er for eksempel egnet for sigdcelle-analyser. En testprøve som antas å inneholde de muterte gene-
DNA-trådene (f.eks. i sigdallelene) blir behandlet med et restriksjonsenzym, f.eks. Mst II. Slike enzymer er blitt benyttet ved genkartlegging, for å detektere strukturelle gendelesjoner i DNA-trådene. Direkte identifikasjon av mutante gener i DNA, f.eks. hemiglobinopatier sonu er forårsaket av punktmutasjon i DNAet, var også mulig i kraft av spesifisiteten i slike restriksjonsenzymer. En enkel nukleotidforandring i enzymets spaltningssete kan raskt bli detektert hvis det hensiktsmessige enzymet blir benyttet. Det er kjent at restriksjonsenzymet Mst II spalter DNA i gjennomsnitt for å danne fragmenter på 1,1 og 1,3 kb fra p™ og 3^ gener, respektivt. Mst II spalter en sekvens (CCTNAGG) som er et delstykke av Ddel-setene (CTNAG). DNAet fra sigdcel-legenet har en nukleotidvarlasjon i Mst II-setet. Den muterte DNA-tråden vil ikke bli spaltet med setet ved Mst II enzymet. Den restriksjonsenzymbehandlede testprøve ble deretter utsatt for betingelser som gjør at polynukleotidene blir enkelt-trådede. En enkel målpolynukleotid enkelt prøvehybridiseringsanalysefremgangsmåte som nylig er beskrevet for detektering av nærvær av et målpolynukleotid ble deretter utført, med tilleggsbegrensningene at de første og andre probene binder seter på DNA-tråden som er på motsatt side av Mst II-setet inbefattet i mutasjonen. Den eneste måten hvorpå et kompleks hybridmolekyl, innbefattende mål-polynukleotidet og begge probene, vil bli dannet, er hvis genet er mutert - f.eks. en sigdcelle. Det normale genet blir spaltet mellom bindingssetene for de to probene. Sigdcel-leanalysen er skjematisk representert i fig. 2. Denne fremgangsmåten eliminerer .tidligere analysesteg som innbefatter gelelektroforese og overføring til fast fase (filterpapir). Forenklingen er helt vesentlig. Denne analysefremgangsmåten kan i like stor grad bli benyttet for diagnostikk av andre genetiske sykdommer hvori genmutasjoner er inbefattet.
Det kreftdiagnostiske aspektet ville tatt form som en kvantitativ analyse for nivåer av messenger RNA fra et onokogen, selvom analyser som ligner på sigdcelleeksempelet også ville være nyttig.
EKSEMPLER
Eksempel 1
Dette eksempel korrelerer det høstede signalet til mål-D NA-konsentrasjonen.
I dette eksempel er målpolynukleotidet mpB1017; probe 1 er pHBC6 som har biotin som den første bindingsgruppe; probe 2 er M13 10W merket med<32>p; den faste bæreren er avidin-cellulose, som binder biotin på den første proben.
FORKORTELSER. SSC er 0,15 molar natriumklorid og 0,015 molar natriumsitrat,. SSC blir benyttet ved forskjellige kon-sentrasjoner, "10X SSC" vil f.eks. være, 1,5 molar natriumklorid, og 0,15 molar natriumsitrat. EDTA er etylendiamin-tetraacetat, SDS er natriumdodecylsulfat, DNA er deok-syribopolynukleotid, BSA er bovin serumalbumin, tris:HCL er tris-hydroksymetylaminmetan justert til hensiktsmessig pH med saltsyre.
MATERIALER OG METODER. Plasmid-DNAer ble tilveiebragt ved voksing av transformert E. coli, stamme LE392, etterfulgt av lysis av cellene med lysozym, SDS og NaOH. DNA ble videre renset ved sentrifugering i CsCl i nærvær av etidiumbromid, se Mauiatis, T. , Fritsch, E. F., og Sambrook, J. , 1982. Molecular kloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, Replicative form (RF) DNA fra M13 bakteriofag, stamme 10w ble tilveiebragt på en lignende måte ved dyrking av infektert E. coli-stamme 71.18. Enkelt-trådet virus - DNA fra M13-klon mpB1017 ble tilveiebragt fra virus i vekstmediet til infektert E. coli 71.18 ved presipitasjon med polyetylenglykol, sentrifugering i CsCl og ekstrahering av det rensede viruset med SDS, fenol og kloroform. Laksesperm-DNA ble tilveiebragt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO (USA).
Dobbelt-trådede DNAer ble merket ved nicktranslasjon (Rigby, et al., J. Mol. Biol., 113:237, 1977) essensielt som beskrevet av Leary et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei. [USA] 80:4045, 1983. Plasmid pHBC6 inneholder 5.400 basepar av det humane P-globingenet, klonet i plasmid pBR322 (Fukumaki et al., Cell 28:585, 1982). M13-klon mpB1017 inneholder 1310 baser av det humane globingenet, homologt til 1310 baser fra plasmid pHBC6. M13-stamme 10w inneholder 7.500 baser av bakteriofage gener, homologt til det samme antall baser i klon mpB1017. Regionene i mpB1017 DNA som er homologe til pHBC6 og M13 10w er ikke overlappende.
Den faste fasen for høsting av oppløsning-sandwich-produkt ble fremstilt ved aktivering av mikrokrystallinsk cellulose med N,N'-karbonyldiimidazol, etterfulgt av kobling til proteinavidin, ved bruk av fremgangsmåter som ligner de som er beskrevet av Paul et al., J. Org. Chem. 27:2094, 1962. Koblingsforholdet var 1 gram aktivert cellulose til 1 mg avidin. En l:l-masse av den fremstilte faste fasen av avidin:cellulose inneholder omtrent 1 mg cellulose i 6, ml buffer.
Oppløsningshybridiseringer ble utført i en final oppløsning inneholdende 5X SSC, 0,02$ (w/v) av hver av polyvinyl-pyrolidon-40, ficoll-400, og BSA, og likeledes 25 mM NaP04buffer, pH 6,5, og 250 pg/ml sonikert laksesperm-DNA. Alle DNAene (probe 1, probe 2, mål, og bærerlaksespermer) ble denaturert ved 100°C i 3 til 5 minutter før hybridiseringsreaksjonen ble begynt.
Andre detaljer fra eksempelanalysen er gitt nedenfor.
FREMGANGSMÅTE. Følgende analyse ble utført for å undersøke gjennomførbarheten av analysen ifølge foreliggende éppfin- neise, og for å bestemme området av mål-DNA-konsentrasjon hvori analysen er effektiv. Plasmid pHBC6 ble merket med liganden biotin ved nick-translasjon med biotin-ll-de-oksyuridintrifosfat (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA). Dette utgjør probe 1 i analysen. Replikativ form DNA fra bakteriofag M13 10w ble merket med en radioaktiv indikator,<32>p, ved nickeltranslasjon med cx-32P-deoksytidintrifosfat (Amersham, Chicago, IL, USA). Dette utgjør probe 2 i analysen. Probe en inneholdt omtrent b% biotinnukleotider, og probe 2 hadde spesifikke radioak-tiviteter på 0,7 til 7 X 10<7>cpm/pg. Mål-DNAet var M13 mpB1017, og prøver inneholdende varierende mengder av mål-DNA fra 20 picogram til 1,0 mikrogram ble analysert. Alle analysene inneholdt 100 ng probe 1 (biotin) og 50 ng probe 2 (<32>P). Probe- og prøve-DNAene ble blandet sammen i en oppløsning bestående av 10 mM tris:CCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, varmedenaturert og justert til oppløsningshybridiseringsbe-tingelsene gitt i fremgangsmåten ovenfor og inkubert i et totalt volum på 0,2 ml overnatt ved 68°C. Denne inkuba-sjonstiden er uvanlig lang, og ble bare benyttet for at det var hensiktsmessig og for å forsikre at reaksjonen ble fullført. Kontrollanalyser inneholdt probe 1 eller probe 2 og 20 ng-mål, eller probe 1 & 2 uten mål. Separasjon av produkt-sandwich fra uhybridiserte prober ble tilveiebragt ved tilsetting av 0,2 ml av 1:1 masse av avidin: cellulose til reaksjonene, inkubering ved 22°C i 30 min., og filtrering av cellulose på et 13 mm glassfiberfilter. En vask av reaksjons-karet med 0,1 ml tris:HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, ble også filtrert på det samme filteret som den primære reaksjonen. Den filtrerte faste fasen ble videre vasket 2 ganger med 2X SSC og 0, 1% SDS, og 2 ganger med 0.2X SSC og 0, 1% SDS, og 2 ganger med 0,1X SSC og 0, 1% SDS. De siste to vaskene ble utført ved 50° C, alle an-dre ved romtemperatur. Alle vaskene var med 0,5 ml oppløsning. Disse vaskene ble- justert fra de som blir benyttet for Southern blot hybridiseringsanalysef av Leary et al., P.N.A.S. 80:4045 (1983)). Mengden probe 2 (<32>P) bundet til den faste fasen ble bestemt ved væskescintilla- sjonstelling, med 'harpikset i 0,5 ml oppløsning I en minibeholder og 4,5 ml Beckman Ready SoIv^mMP scintilla-sjonsfluid. Alle vaskevannene hlé også samlet og tellet på lignende måte.
RESULTATER. Resultater fra en kjøring er gitt i tabell I hvor mengden av probe 2 bundet er direkte relatert til mengden av måle-DNa i analysen. Dataene representerer gjennomsnittet av duplikate prøver.
Data fra flere kjøringer demonstrerte at analysen, som den ble utført i dette eksemplet, har en topp 1 høstet signal (probe 2) ved omtrent 30 ng av mål-DNA. Ved mengde over dette nivået reduseres det høstede signalet på en logaritmisk måte. Under 30 ng mål-DNA, er analysen begrenset av b.ak-grunnsbinding av probe 2. til den faste fasen og den spesifikke radioaktiviteten til proben, men øker eksponénsielt fra omtrent 0,5 ng til 10" ng av mål-DNA.' Den ikke-lineære beskaffenheten av signalet som en funksjon av målmengden er grafisk tegnet i fig. 3. Fig. 4 er en utvidet versjon av fig. 3 rundt toppsignalet. Det ikke-lineære forholdet kan være en funksjon av nicktranslasjonsreakskjonen som blir benyttet for å merke probene, siden prober som er merket på denne måten er kjent for å vise elementer av kooperativ binding (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem. 138:267, 1984).
EKSEMPEL 2
Dette eksemplet demonstrerer bindingskaraktertrekkene til en avidincellulosefastbærer og en biotinmerket probe.
Kinetikken og spesifisiteten til høsting av en biotinmerket probe ved binding av det ut av en hybridiseringsbuffer på avidin-cellulose ble undersøkt ved bruk av DNAer merket med både biotin-ll-dUTP og<3>H-dATP eller bare merket med<3>H-dATP (kontroll). DNAet var plasmid pHBC6 merket med nick-translasjon (Rigby et al., J. Md. Biol., 113:237 (1977)).
Avidincellulose (0,05 ml pakket volum) suspendert i 0,2 ml lOmM Tris:HCl plus 1,0 mM EDTA (pH 7,5) ble satt til hver av 30 mikrosentrifugerør, en blanding (0,2 ml) inneholdende 100 nanogram av biotin-merket eller kontroll-DNA, 50 mikrogram bærer laksesperm-DNA, 20 mikrogram gjær-RNA, 0,02$ (w/v) hver av bovinserumalbumin, fikoll og polyvinylkryolidon i 0,075 M natriumsitrat, 0,75 M natriumklorid og 0,025 M natriumfosfat (pH 6,5) ble satt til hensiktsmessige rør. Rørene inneholdende den faste fasen og hybridiseringsblanding ble inkubert i romtemperatur på en risteplattform i tider som varierte fra 1 min. til 300 min. Etter inkuberingen ble den faste fasen samlet ved filtrering på et teflonmembranfilter. Fraksjon av DNA bundet ble bestemt ved å trekkes fra radioaktiviteten i filtratet og vasket fra den totale radioaktiviteten . som er satt til hver prøve. Resultatet er presentert i fig. 5. I løpet av 30 min. ble omtrent 92$ av biotin-merket DNA bundet til avidincellulose, mens et gjennomsnitt på mindre enn 2% av kontroll-DNAet var bundet til den faste bæreren. Binding er rask, effektiv og spesifikk for biotinmerket på proben.
Behovet for avidinkomponenten til den faste fasen for binding til biotinmerket DNA ble undersøkt ved bruk av de-_ samme'
DNA er som ovenfor, med forskjellige forbehandlinger av den faste bæreren. Fri biotin bør konkurrere med biotin-DNA for avidinsetene på den faste fasen og forbehandling av den faste fasen med 20 ganger den halve kapasiteten til fritt biotin reduserte biotin-DNA-binding med 50$. En videre forbehandling med 10 ganger mere fritt biotin reduserte biotin-DNA-binding med 30$ til. Forbehandling av den faste fase med pronase, 1%
(w/v) natriumdodecylsulfat og 0, 1% (v/v) e-merkaptoetanol reduserte også biotin-DNA-binding med 50%, og videre behandling av dette spaltede harpikset med fritt biotin opphevet biotin-DNA-binding. En litt annen fremgangsmåte indikerte også at den hovedsakelige biotin-DNA-binding til den faste bæreren ikke bare var biotinavhengig, men også avidinavhengig. En kontrollfastbærer ble fremstilt ved behandling av cellulose på samme måte som det som ble benyttet for kobling til avidin, med unntagelse av at avidin ble utelatt fra reaksjonen og erstattet med TrisrHCl. Dette kontrollharpikset bandt 5 til b% av kontroll-DNA-probe og 15 til 16£ av biotinmerket DNA-probe under de betingelsene som ble benyttet ovenfor for de kinetiske studiene. Majoriteten av biotin-merket probebinding (mere enn 85%) til den faste bæreren er forårsaket av interaksjon med ..den spesifikke ligand avidin.
EKSEMPEL 3
Dette eksempel demonstrerer konstruksjonen av M13-vektorer inneholdende MstII-fragmenter med sigdcellemutasjon.
For å analysere den viktigste genetiske formen av sigdcel-leanemi ved bruk av analysefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er veldig spesifikke M13-konstruksjoner nødven-dige. DNA-fragmentene fra begge sidene av Mstil-restriksjons-setet som identifiserer -den 6. kodonfeilen i en sigdcelle-enhet ble satt inn M13-fag. De to fragmentene som blir benyttet for dette, ble avledet ,fra plasmid pHBC6 (Fukumaki et al., Cell 28; 585 (1982)) og renset ved akrylamid gelelektroforese. Omtrent 10 jjg av 200 basepar Sau 1 (-Mst II isoschizomer) beliggende rett nedstrøms for det diagnostiske Mst II-setet ble behandlet med Klenow DNA-polymerase i nærvær av 250 pM dXTPer for å "fylle-inn" Mst II-setet. Dette "blunt"-DNA-fragmentet ble deretter satt Inn i Hc II-setet til pUC 18. Analyse av 24 pUC 18-B-200 isolater indikerte nærværet av det 200 baseinnskuddet i 2 isolater, pUC 18-B-200-6 og pUC 18-B-200-9. Etter CsCl-preparering, ble omtrent 200 jig pUC 18-B-200-9 spaltet med Eco RI og Hd III før rensing ved gelelektorforese. Dette Eco RI, Hd III-endede 200 baseparfragmentet ble deretter satt inn i en M13 mp 18 for å tilveiebringe enkelt-trådet DNA. Flere konstruksjoner ble gjort ved bruk av dette 200 basef ragmentet for å tillate enkel produksjon av store mengder spesifikke RNA-sekvenser. Dette fragmentet ble satt inn i transkripsjonsvektor pT7-l og pT7-2 (United States Biochemical Corporation, P.O. Box 22406, Cleveland, Ohio, 44122). Disse konstruksjonene tillater in vitro-syntese av merket RNA for bruk som en probe i sigdcel-leanalyse Ifølge foreliggende oppfinnelse. De andre rekombinante vektorene som er nødvendig for analysen av sigd-celleegenskapen benytter det 800 basepar Mst II Hpa 1-fragmentet som er lokalisert ved oppstrøms for det diagnostiske Mst II-restriksjonssete. Dette fragmentet ble klonet på en lignende måte igjen ved bruk av Klenow DNA-polymerase for å "runde av" de 5' overhengende endene som finnes ved Mst II-enden. Dette 800 basepar-fragmentet ble satt inn i fire vektorer for å tilveiebringe enkelt-trådet RNA og DNA. Disse er:
Selvom foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet i detalj med hensyn på visse versjoner derav, er også andre versjoner mulig. Rammen av vedlagte krav bør ikke nødvendigvis være begrensende til beskrivelsen av versjonene som er innbefattet heri .
Claims (80)
1.
Analysefremgangsmåte for detektering av en enkelt-trådet målpolynukleotid i en væskeprøve,karakterisert vedat fremgangsmåten innbefatter følgende steg: a) kombinering av prøven med minst to forskjellige prober, bærende en første probe og en andre probe, for dannelsen av en reaksjonsblanding, hvor hver probe innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid som Inneholder en nukleotidsekvens komplementær til en del av målpolynukleotidet, hvor probene sammen danner hybride molekyler ved komplementær baseparring med målpolynukleotidet, ingen av probene er festet til en fast bærer, og probene hybridiserer ikke med hverandre, og den andre proben har et detekterbart merke; b) deretter kontakting av reaksjonsblandingen med en fast bærer som binder den første proben men ikke den andre proben og ikke målpolynukleotidet; og c) deretter bestemming om noe av merket er bundet til den faste bærer.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den første proben er et RNA- eller DNA-fragment.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den andre proben er et RNA- eller DNA-fragment.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den faste bæreren blir dannet av et stoff selektert fra gruppen bestående av agarose, cellulose, glass, lateks, polyakrylamid, polyamid, polykarbonat, polyetylen, polypropylen, polystyren, silisiumoksydgel , silisiumoksyd og derivater derav.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den faste bæreren er i en form selektert fra gruppen bestående av mikropartikulater, makropartikulater, ark, kuler, rør, pipettespisser, plater og filtere.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at merket blir valgt fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemisk luminiserende forbindelser, bioluminiserende forbindelser, fluoriserende forbindelser, fosforiserende forbindelser, enzymer, enzymkofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lektiner, metallchelatorer og derivater derav.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den første proben har en førstebindingsgruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, hvor de "to bindingsgruppene har evnen til binding til hverandre, og de to bindingsgruppene utgjør et bindingspar.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisertved at bindingsparet blir selektert fra gruppen bestående av avidinbiotin, haptenantistoffer, antistofferantigener, karbohydratlektiner, riboflavin-riboflavinbindende protein, metallion-metallionbindende stoffer, enzymsubstrater, boronater-cis-dioler, staff A-proteinantistoffer, enzyminhibitorer og derivater derav.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at bindingsparet er biotinavidin, hvor fast bærer er avidincellulose.
10.
Fremgangsmåte Ifølge krav 1,karakterisertved at hver probe har en lengde på mellom 15 til omtrent 50.000 nukleotider, de første og andre probene hver er komplementære til forskjellige deler av målpolynukleotidet, og den korteste avstand mellom delene ikke er mer enn omtrent 300 nukleotider.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at delene som er komplementære til probene er rett ved siden av liggende.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at den første proben er et RNA- eller DNA-f ragment, og den andre proben er et RNA- eller DNA-fragment; den faste bæreren blir fremstilt av et stoff selektert fra gruppen bestående av aggarose, cellulose, glass, lateks, polyakrylamid, polyamid, polykarbonat, polyetylen, polypropylen, polystyren, silisiumoksydgel, silisiumoksyd og derivater derav; den faste bæreren er en form selektert fra gruppen bestående av mikropartikulater, makropartikulater, ark, kuler, rør, pipettespisser, plater og filtre; merket blir selektert fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemisk lumineserende forbindelser, bioluminiserende forbindelser, fluoriserende forbindelser, fosforerende forbindelser, enzymer, enzymkofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lektiner, metallchelatorer og derivater derav; den første proben har en førstebindings-gruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, de to bindingsgruppene har evnen til å bindes til hverandre; de to bindingsgruppene utgjør et bindingspar, bindingsparet blir selektert fra gruppen bestående av avidinbiotin, haptenantistoffer, antistoffantigener, karbohydratlektiner, riboflavin-riboflavinbindende protein, metallionemetallbindende stoffer, enzymsubstrater, boronater-cis-dioler, staph A proteinantistoffer, enzyminhibitorer og derivater derav.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at deteksjonen av målpolynukleotidet er kvalitativt.
14 .
Fremgangsmåte iføgle krav 1,karakterisertved at tilstedeværelse av merket bundet til den faste bæreren blir bestemt kvantitativt, slik at deteksjonen av målpolynukleotidet er kvantitativt.
15.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at probene blir kombinert med prøven i serie (seriatum).
16. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at prøven blir kombinert med alle probene samtidig.
17.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det enkelt-trådede målpolynukleotidet blir dannet ved denaturering av en dobbelt-trådet polynukleotid.
18.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at stegene for bestemming om noe merke er bundet på den faste bæreren videre innbefatter følgende steg: a) separering av den andre proben som ikke er inkorporert i de hybride molekylene fra den faste bærer; og b) deretter detektering av tilstedeværelsen av fravær av merket på den faste bæreren, hvor tilstedeværelse indikerer tilstedeværelse av målpolynukleotid i prøven.
19.
Fremgangsmåte Ifølge krav 1,karakterisertved at steget for bestemming om noe av merket er bundet på den faste bæreren videre innbefatter følgende steg: a) måling av mengden av ubundet andreprobe i oppløsning; og b) sammenligning av dette med den totale mengden av andreprobe som blir satt til reaksjonsblandingen for bestemming av tilstedeværelse eller fravær av målpolynukleotid i prøven.
20.
Analysefremgangsmåte for detektering av pluraliteten til enkelt-trådede målpolynukleotider i en pluralitet av væskeprøver , for hvert målpolynukleotid,karakterisert vedat fremgangsmåten innbefatter følgende steg: a) kombinering av minst en del av en væskeprøve som man antar inneholder målnukleinsyré med minst to forskjellige prober, værende en første probe og en andre probe, for å danne en reaksjonsblanding, hver probe består av et enkelt-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens komplementær til en del av målpolynukleotidet, den første proben og andreproben danner sammen hybride molekyler ved komplementær baseparring med målpolynukleotidet, ingen av probene er festet til en fast bærer, probene hybrediserer Ikke med hverandre, og den andre proben har et detekterbart merke; b) deretter ..kontakting av reaksjonsblandingen med en fast bærer som binder den første proben med den andre proben og ingen av målpolynukleotidene; og c) deretter bestemming om noen av merkene er bundet til den faste bæreren; hvori den faste bæreren binder hver av de første probene spesifikt for pluraliteten til målpolynukleotidene.
21.
Fremgangsmåte lføgle krav 20,karakterisertved at hver av de første probene har en første-bindingsgruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, hvor den andre bindingsgruppen har evnen til binding av hver ay de første bindingsgruppene på de første probene spesifikke for pluraliteten til mål-nukleotider.
22.
Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisertved at hver probe har en lengde som er mellom omtrent 15 til omtrent 50.000 nukleotider, for hvert probepar som er spesifikt for målpolynukleotid, de første og andre probene er komplementære til forskjellige deler av det respektive målpolynukleotidet, er den korteste avstanden mellom delene ikke på mer omtrent 300 nukleotider.
23.
Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisertved at delene er rett ved siden av liggende.
24.
Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisertved at minst en av de enkelt-trådede målpolynukleotidene blir dannet ved denaturering av en dobbelt-trådet polynukleotid.
25.
Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisertved at minst noen av probene blir kombinert med prøven ved forskjellige tidspunkter.
26.
Analysefremgangsmåte for detektering av en pluralitet av enkelt-trådede målpolynukleotider i en væskeprøve,karakterisert vedat fremgangsmåten Innbefatter følgende steg: a) kombinering av prøven med en pluralitet av forskjellige prober for å danne en reaksjonsblanding, mens to av probene er spesifikke for hver av målpolynukleotidene, værende en førsteprobe og en andreprobe, den første proben og andre proben består begge av en enkelt-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens komplementær til en del av det respektive målpolynukleotidet, den første proben og andre proben danner sammen hybride molekyler ved komplementær baseparring med målpolynukleotidet, den andre proben har et detekterbart merke; hvori ingen av pluralitetene av probene er festet til en fast bærer, pluraliteten av probene hybridiserer ikke med hverandre, og hver av de andre probene spesifikk for pluraliteten av målpolynukleotidene har et annet merke; b) deretter kontakting av reaksjonsblandingen med en fast bærer som binder de første probene men ikke de andre probene og ingen av målpolynukleotidene; og c) deretter bestemming om noen av hver av de forskjellige merkene er bundet til den faste bæreren.
27.
Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisertved at hver probe har en lengde på mellom omtrent 15 til omtrent 50.000 nukleotider, den første probe og andre probe som er spesifikk for hvert målpolynukleotid hver er komplementær til forskjellige deler av det respektive målpolynukleotidet, hvor den korteste avstanden mellom delene ikke er mere enn 300 nukleotider fra hverandre.
28.
Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisertved at delene er rett ved siden av liggende.
29. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisertved. at minst ett av enkelt-trådede målpolynukleotidene blir dannet ved denaturering av en dobbelt-trådet polynukleotid.
30.
Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisertved at minst noe av pluraliteten til probene blir kombinert med prøven ved forskjellige tidspunkter.
31.
Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisertved at alle probene samtidig blir kombinert med prøvene.
32.
Kit for deteksjon av en enkelt-trådet målpolynukleotid i en prøve,karakterisert vedat kitet innbefatter: a) polynukleotidreagens ' inneholdende minst to forskjellige prober, værende en første probe og en andre probe, hver probe innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens komplementær til en del av målpolynukletidet, probene sammen danner hybride molekyler med komplementær baseparring med målpolynukleotidet, ingen av probene blir festet til en fast bærer, brobene kan ikke hybridisere med hverandre, den andre proben har et detekterbart merke; og b) en fast bærer som binder den første proben, men ikke den andre proben og ikke målpolynukleotidet.
33.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat den første proben er et RNA- eller DNA-fragment.
34.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat den andre proben er et RNA- eller DNA-fragment.
35.
Kit ifølge et krav 32,karakterisert vedat den faste bæreren blir dannet av et stoff selektert fra gruppen bestående av agarose, cellulose, glass, lateks, nylon, polyakryiamid, polykarbonat, polyetylen, polypropylen, polystyren, silisiumoksydgel, silisiumoksyd og derivater derav.
36.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat den faste bæreren er i en form selektert fra gruppen bestående av mikropartikulater, makropartikulater, ark, kuler, rør, pipettespisser, plater og filtere.
37.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat merket blir selektert fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemisk luminiserende forbindelser, bioluminiserende forbindelser, fluoriserende forbindelser, fosforiserende forbindelser, enzymer, enzymkofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lektiner, metallchelatorer og derivater derav.
38.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat den første proben har en førstebindingsgruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, de to bindingsgruppene har evnen til å bindes til hverandre, og de to bindingsgruppene utgjør et bindingspar.
39.
Kit ifølge krav 38,karakterisert vedat bindingsparene blir selektert fra gruppen bestående av avidinbiotin , haptenantistoffer , antistoffantigener , karbohydratlektiner , riboflavin-riboflavinbindende protein, metallioner-metallionbindende stoffer, enzymsubstrater, boronater-cis-dioler, staph A proteinantistoffer enzyminhibitorer og derivater derav.
40.
Kit ifølge krav 39,karakterisert vedat bindingsparet er biotinavidin, og hvor den faste bærer er avidincellulose.
41.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat hver probe har en lengde på mellom 15 til omtrent 50.000 nukleotider, de første og andre probene er komplementære til forskjellige deler av målpolynukleotidet, og hvor den korteste avstanden mellom delene ikke er på mer enn 300 nukleotider .
42 .
Kit ifølge krav 41,karakterisert vedat delene som er komplementære til probene er rett ved siden "av liggende.
43.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat den videre innbefatter måte for kvalitativ detektering av merket.
44.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat den videre innbefatter måter for kvantitativ detektering av merket.
45.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat minst en av polynukleotidreagensene inneholder mer enn en probe.
46.
Kit ifølge krav 32,karakterisert vedat alle probene er i et enkelt reagens.
47.
Kit for deteksjon av en pluralitet av enkelt-trådede målpolynukleotider,karakterisert vedat kitet innbefatter, for hvert målpolynukleotid, polynukleotidreagenser inneholdende minst to forskjellige prober, værende en første probe og en andre probe, hver probe består av en enkelt-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens komplementær til en del av målpolynukleotidet, den første proben og andre proben danner sammen hybride molekyler ved komplementær baseparring med målpolynukleotider, og hvor ingen av probene blir festet til en fast bærer, og probene hybridiserer ikke med hverandre, og den andre proben har et detekterbart merke;
kitet innbefatter videre en fast bærer som har evnen til å binde hver av de første probene, men ingen av de andre probene, og ingen av målpolynukleotidene.
48.
Kit ifølge krav 47,karakterisert vedat hver av de første"probene har en første bindingsgruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, hvor den andre bindingsgruppen har evnen til å binde hver av de første bindingsgruppene på de første probene.
49.
Kit ifølge krav 47,karakterisert vedat hver andre probe spesifikk for hvert målpolynukleotid innbefatter et forskjellig merke.
50.
Kit ifølge krav 49,karakterisert vedat det videre innbefatter måter for detektering av merkene på de andre probene.
51.
Kitt ifølge krav 48,karakterisert vedat hver probe innbefatter en enkel-trådet polynukleotid som har en lengde på 15 til omtrent 50.000 nukleotider, for hvert probepar spesifikt for et målpolynukleotid, hvor hver av de første og andre probene er komplementære til en annen del av målpolynukleotidet, og den korteste avstanden mellom delene ikke er mer enn omtrent 300 nukleotider.
52.
Kit ifølge krav 51,karakterisert vedat probene er komplementære til rett ved siden av liggende deler på målnukleotidet.
53.
Kit ifølge krav 47,karakterisert vedat minst ett av polynukleotidreagensen inneholder mer enn én probe.
54.
Kit ifølge krav 47,karakterisertvedat alle probene som er komplementære til hver-av målpolynukleotidene er innbefattet i et enkelt reagens, og antallet polynukleotidreagenser i kitet er derfor lik antallet målpolynukleotider.
55.
Kit for deteksjon av en pluralitet av målpolynukleotider i en prøve,karakterisert vedat kitet innbefatter: a) polynukleotidreagens innbefattende, for hver av målpolynukleotidene, minst to forskjellige prober, værende en første probe og en andre probe, hver probe bestående av en enkel-trådet polynukleotid som inneholder en nukleotidsekvens komplementær til en del av målpolynukleotidet, den første proben og andre proben danner sammen hybride molekyler ved komplementær baseparring med målpolynukleotidet, ingen av probene blir festet til en fast bærer, den første proben og andre proben kan ikke hybridisere med hverandre, den andre proben har et detekterbart merke; og
hvori alle probene for pluraliteten av målpolynukleotidene ikke har evnen til å hybridisere med hverandre, og hvori hver av de andre probene er spesifikke for pluraliteten av målpolynukleotidene har et annet detekterbart merke; og b) en fast bærer som binder de første probene, men ingen av de andre probene, og ingen av målpolynukleotidene.
56.
Kit ifølge krav 55,karakterisert vedat det videre innbefatter måter for detektering for forskjellige merker på de andre probene.
57.
Kit ifølge krav 56,karakterisert vedat hver probe innbefatter et enkelt-trådet polynukleotid som har en lengde på omtrent 15 til omtrent 50.000 nukleotider, for hvert probepar spesifikt for hver målpolynukleotid, er de første og andre probene hver komplementære til en forskjellig del av målnukleotidet, hvor den korte avstanden mellom delene ikke er på mer enn 300 nukleotider.
58.
Fremgangsmåte ifølge krav 57,karakterisertved at de første og andre probene er kompelentære til rett ved siden av liggende deler på målnukleotidet.
59.
Kit ifølge krav 55,karakterisert vedat minst ett av polynukleotldreagensene inneholder mer enn én probe.
60.
Kit ifølge krav 55,karakterisert vedat alle probene er innbefattet i et enkelt reagens.
61.
Analysefremgangsmåte for detektering av et målpolynukleotid i en prøve som også kan inneholde et standard polynukleotid, hvor nukleotidsekvensene til de to polynukleotidene er vesentlig lik hverandre, standardpolynukleotidet har en del A og en del B, målpolynukleotidet har en del A' og en del B', standard og målpolynukleotidene er forskjellige i minst en nukleotid som er beliggende mellom delene A og B på stan-dardnukleotidet og mellom delene A' og B' på målpolynukleotidet,karakterisert vedat fremgangsmåten innbefatter følgende steg: a) adskillelse av både standard og målpolynukleotidene som er tilstede til enkelt-trådede segmenter, slik at ingen av segmentene til standardpolynukleotidet inneholder begge delene A og B, mens minst ett av segmentene til målpolynukleotidet inneholder begge delene av A' og B'; b) kombinering av den behandlede prøven fra steg (a) med minst to prober, værende en første pr_pbe og en andre probe, for å danne en reaksjonsblanding, hver probe består.av et enkelt-trådet -polynukleotid, probene har ikke evnen til å hybridisere med hverandre, den første proben baseparret komplementært med del A, og med del A', den andre proben baseparret komplementært med del B, og med del B', og hvor de to probene sammen danner hybride molekyler ved komplementær baseparring med det enkelt-trådede segmentet til målpolynukleotidet som inneholder begge delene A' og B'; og c) deretter bestemming av tilstedeværelse av hybride molekyler som inneholder begge probene.
62. Fremgangsmåte ifølge krav 61,karakterisertved at adskillelsessteget innbefatter behandling med et restriksjonsenzym.
63.
Fremgangsmåte ifølge krav 62,karakterisertved at mål- og standardpolynukleotidene er dobbelt-trådede, og adskillelsessteget også innbefatter denaturering av mål- og standardpolynukleotidene som er tilstede.
64.
Fremgangsmåte ifølge krav 61,karakterisertved at del A er identisk til del A' og del B er identisk til del B'.
65.
Fremgangsmåte ifølge krav 61,karakterisertved at den korteste avstanden mellom del A og del B på standard polynukleotidet, og korteste avstand mellom delen A og B på målpolynukleotidet, ikke er på mer enn omtrent 300 nukleotider.
66.
Fremgangsmåte ifølge krav 65,karakterisertved at den korteste avstanden mellom del A og del B på standardpolynukleotidet, og korteste avstand mellom del A' og B' på målpolynukleotidet, ikke er på mer enn omtrent .10 nukleotider.
67.
Fremgangsmåte ifølge krav 61,karakterisertved at målpolynukleotidet er en genetisk variant av standardpolynukleotidet, hvor målnukleotidet er et resultat av genmutasjon som indikerer, en genetisk sykdom.
68.
Fremgangsmåte ifølge krav 67,karakterisertved at den genetiske sykdommen er sigdcel-leanemi .
69.
Fremgangsmåte ifølge krav 61,karakterisertved at ingen av probene er festet til en fast bærer, den andre proben har et detekterbart merke, og stegene for bestemming av tilstedeværelse av hybride molekyler inneholdende begge probene som videre innbefatter følgende steg: a) kontakting av reaksjonsblandingen med en fast bærer som binder den første proben, men ikke den andre proben, og ikke segmenter inneholdende bare del B eller del B' ; og b) deretter bestemming om noe av merket er bundet til den faste bæreren.
70.
Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisertved at den faste bæreren blir dannet av et stoff selektert fra gruppen bestående av agarose, cellulose, glass, lateks, polyakrylamid, polyamid, polykarbonat, polyetylen, polypropylen, polystyren, silisiumoksydgel, silisiumoksyd og derivater derav.
71.
Fremgangsmåte ifølge krav 69, karakteriser,! ved at den faste bæreren er i en form selektert fra gruppen "bestående av mikropartikulater, makropartikulater, ark, kuler, rør, pipettespisser, plater og filtre.
72.
Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisertved at merket blir selektert fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemisk luminiserende.forbindelser, bioluminiserende forbindelse, fluoriserende forbindelse, fosforiserende forbindelse, enzymer, enzymkofaktorer, haptenér, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lektiner, metallchelatorer og derivater derav..
73.
Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisertved at den første proben har en første bindingsgruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, hvor de to bindingsgruppene har evnen til å bli bundet til hverandre, og hvor de to bindingsgruppene utgjør et bindingspar.
74 .
Fremgangsmåte ifølge krav 73,karakterisertved at bindingsparet er selektert fra gruppen bestående av avidinbiotin, haptenantistoffer, antistoffantigener, karbohydratlektiner, riboflavin-riboflavinbindende protein, metallioner-metallionbindende substanser, enzymsubstrater, boronat-cis-dioler , staph A proteinantistoffer, enzymerinhibitorer og derivater derav.
75 .
Fremgangsmåte ifølge krav 74,karakterisertved at bindingsparet er biotinavidin, og hvor den faste bæreren er avidincellulose.
76.
Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisertved at hver probe har en lengde på mellom omtrent 15 til omtrent 50.000 nukleotider, hvor de første og andre probene hver er komplementære til forskjellige deler på.målpolynukleotidet, og hvor den korteste avstanden mellom delene ikke er på mer enn omtrent 300 nukleotider.
77.
Fremgangsmåte ifølge krav 76,karakterisertved at delene som er komplementære til probene er rett ved siden av liggende.
78. Fremgangsmåte ifølge krav 76,karakterisertved at den første proben er et RNA- eller DNA-fragment," og den andre proben er et ENA- eller DNA-fragment; den faste bæreren er dannet av et stoff selektert fra gruppen bestående av agarose, cellulose, glass, lateks, polyakrylamid, polyamid, polykarbonat, polyetylen, polypropylen, polystyren, silislumoksydgel, silisiumoksyd og derivater derav; den faste bæreren er i en form selektert fra gruppen bestående av mikropartikulater, makropartikulater, ark, kuler, rør, pipettespisser, plater og filter; merket blir selektert fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemisk luminiserende forbindelser, bioluminiserende forbindelser, fluoriserende forbindelser, fosforiserende forbindelser, enzymer, enzymkofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lektiner, metallshelatorer og derivater derav; den første probe har en første bindingsgruppe og den faste bæreren har en andre bindingsgruppe, de to bindingsgruppene har evnen til å bindes til hverandre; de to bindingsgruppene utgjør et bindingspar, bindingsparet blir selektert fra gruppen bestående av avidinbiotin, haptenantistoffer, antistoffantigener, karbohydratlektiner, riboflavin-riboflavinbindende protein, metallioner-metallionbindende stoffer, enzymsubstrater, borat-cis-dioler, staph A proteinantistoffer, enzyminhibitorer og derivater derav.
79.
Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisertv ed at stegene for bestemming om noe av merket er bundet på den faste bæreren videre innbefatter følgende steg: a) separering av den andre proben som ikke er inkorporert i de hybride molekyler fra den faste bærer; og b) deretter detektering av tilstedeværelse eller fravær av merket på den faste bæreren,, hvor tilstedeværelse indikerer tilstedeværelse av målpolynukleotidet i prøven.
80.
Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisertved at stegene for bestemming om noe av merket er bundet på den faste bæreren videre innbefatter følgende steg: a) måling av mengden av ubundet andreprobe i oppløsning; og b) sammenligning av dette med total mengde av andreprobe som er satt til reaksjonsblandingen for å bestemme tilstedeværelse eller fravær av målpolynukleotidet i prøven.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US91920186A | 1986-10-14 | 1986-10-14 | |
PCT/US1987/002548 WO1988002785A2 (en) | 1986-10-14 | 1987-10-06 | Improved nucleic acid hybridization technique and kit therefor |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO882593D0 NO882593D0 (no) | 1988-06-13 |
NO882593L true NO882593L (no) | 1988-06-13 |
Family
ID=25441695
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO88882593A NO882593L (no) | 1986-10-14 | 1988-06-13 | Forbedret nykleinsyrehybridiseringsteknikk og kit til dette. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01501339A (no) |
AU (1) | AU8103687A (no) |
CA (1) | CA1309932C (no) |
DK (1) | DK324088D0 (no) |
FI (1) | FI882800A0 (no) |
NO (1) | NO882593L (no) |
WO (1) | WO1988002785A2 (no) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU593151B2 (en) * | 1986-11-12 | 1990-02-01 | Molecular Diagnostics, Inc. | Method for the detection of nucleic acid hybrids |
DE3888653T2 (de) * | 1987-12-21 | 1994-07-07 | Applied Biosystems | Verfahren und Testsatz zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz. |
US5354657A (en) * | 1988-01-12 | 1994-10-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the highly specific detection of nucleic acids in solid |
WO1989011548A1 (en) * | 1988-05-20 | 1989-11-30 | Cetus Corporation | Immobilized sequence-specific probes |
GB2225112A (en) * | 1988-11-22 | 1990-05-23 | Ici Plc | Hybridisation probes |
ATE418620T1 (de) | 2000-03-31 | 2009-01-15 | Sanko Junyaku Kk | Sonde zur herstellung einer polymersonde, verfahren zur herstellung einer polymersonde sowie verwendung derselben |
DK1658302T3 (da) | 2003-07-25 | 2010-11-22 | Idenix Pharmaceuticals Inc | Purinnukleosidanaloge til behandling af sygdomme forårsaget af Flavirividae, herunder hepatitis C |
WO2005071401A2 (en) * | 2004-01-15 | 2005-08-04 | Chiron Corporation | Homogeneous multiplex assay for nucleic acid targets |
WO2013021687A1 (ja) | 2011-08-11 | 2013-02-14 | オリンパス株式会社 | 標的粒子の検出方法 |
EP2752655A4 (en) | 2011-08-30 | 2015-06-17 | Olympus Corp | PROCEDURE FOR DETECTING TARGET PARTICLES |
WO2013125124A1 (ja) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | オリンパス株式会社 | 標的粒子の検出方法 |
JP6095645B2 (ja) * | 2012-03-21 | 2017-03-15 | オリンパス株式会社 | 標的核酸分子の検出方法 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2057685B (en) * | 1979-03-19 | 1983-12-21 | Int Diagnostic Tech | Double tagged immunoassay |
US4487830A (en) * | 1982-05-14 | 1984-12-11 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for autoantibodies |
CA1222680A (en) * | 1983-07-05 | 1987-06-09 | Nanibhushan Dattagupta | Testing dna samples for particular nucleotide sequences |
NO843838L (no) * | 1983-09-26 | 1985-03-27 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Fremgangsmaate for detektering av nukleinsyre |
CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
US4820630A (en) * | 1984-11-23 | 1989-04-11 | Digene Diagnostics, Incorporated | Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels |
GB8432118D0 (en) * | 1984-12-19 | 1985-01-30 | Malcolm A D B | Sandwich hybridisation technique |
CA1272443A (en) * | 1985-02-22 | 1990-08-07 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
GB8508431D0 (en) * | 1985-04-01 | 1985-05-09 | English Clays Lovering Pochin | Paper coating apparatus |
GB8509367D0 (en) * | 1985-04-12 | 1985-05-15 | Amersham Int Plc | Nucleic acid hybridisation |
IL79112A (en) * | 1985-06-13 | 1992-01-15 | Abbott Lab | Method for the isolation of a nucleic acid sequence and kit for performing a hybridization assay |
EP0238332A2 (en) * | 1986-03-19 | 1987-09-23 | Cetus Corporation | Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples |
GB8607101D0 (en) * | 1986-03-21 | 1986-04-30 | Serono Diagnostics Ltd | Immunoassay |
-
1987
- 1987-10-06 WO PCT/US1987/002548 patent/WO1988002785A2/en not_active Application Discontinuation
- 1987-10-06 AU AU81036/87A patent/AU8103687A/en not_active Abandoned
- 1987-10-06 JP JP62506425A patent/JPH01501339A/ja active Pending
- 1987-10-07 CA CA000548798A patent/CA1309932C/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-06-13 FI FI882800A patent/FI882800A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-06-13 NO NO88882593A patent/NO882593L/no unknown
- 1988-06-14 DK DK324088A patent/DK324088D0/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO882593D0 (no) | 1988-06-13 |
AU8103687A (en) | 1988-05-06 |
JPH01501339A (ja) | 1989-05-11 |
WO1988002785A3 (en) | 1988-07-14 |
CA1309932C (en) | 1992-11-10 |
DK324088D0 (da) | 1988-06-14 |
FI882800A (fi) | 1988-06-13 |
WO1988002785A2 (en) | 1988-04-21 |
FI882800A0 (fi) | 1988-06-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5869252A (en) | Method of multiplex ligase chain reaction | |
WO2020056924A1 (zh) | 核酸检测方法 | |
US5688643A (en) | Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid differentiation | |
US6100099A (en) | Test strip having a diagonal array of capture spots | |
JP2644215B2 (ja) | 核酸配列、特に遺伝障害測定法 | |
AU656514B2 (en) | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein | |
AU753273B2 (en) | Mismatch detection techniques | |
AU711836B2 (en) | Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support | |
EP0336454B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay | |
US20030203358A1 (en) | Exogenous nucleic acid detection | |
AU2002311761B2 (en) | Mutation detection using MutS and RecA | |
AU3942993A (en) | Method of multiplex ligase chain reaction | |
NO882593L (no) | Forbedret nykleinsyrehybridiseringsteknikk og kit til dette. | |
US6468751B1 (en) | Method and apparatus for performing amplification of nucleic acid on supports | |
JPH0743376B2 (ja) | 核酸配列の検定方法及び分子遺伝子プローブ | |
JP3384806B2 (ja) | Hla−dr型別判定の実施を可能にするプローブ系および該プローブを用いる型別判定法 | |
US6027879A (en) | Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe | |
JP2012161319A (ja) | β2アドレナリン多型の検出 | |
French et al. | Detection of the factor V Leiden mutation by a modified photo-cross-linking oligonucleotide hybridization assay | |
WO2021201206A1 (ja) | マイコバクテロイデス・アブセッサス・コンプレックスに属する抗酸菌のerm(41)遺伝子の一塩基変異を判別する方法、その方法に用いるプライマーセット及びプローブ | |
JP2792757B2 (ja) | 核酸の検出法 | |
WO2023170151A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence in a single reaction vessel | |
WO2024062126A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence | |
WO2023170144A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence | |
Tu et al. | Characterization of alkaline phosphatase labeled UidA (Gus) probe and its application in testing of transgenic tritordeum |