JP2644215B2

JP2644215B2 - 核酸配列、特に遺伝障害測定法

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Publication number: JP2644215B2
Application number: JP60505273A
Authority: JP
Inventors: トーブ、フロイド
Original assignee: DAIJIIN DAIAGUNOOSUTEITSUKUSU Inc
Current assignee: DAIJIIN DAIAGUNOOSUTEITSUKUSU Inc
Priority date: 1984-11-23
Filing date: 1985-10-28
Publication date: 1997-08-25
Anticipated expiration: 2012-08-25
Also published as: US4820630A; CA1258029A; WO1986003227A1; EP0203143B1; EP0203143A1; JPS63501051A; NO862918D0; NO862918L; AU591471B2; AU5195786A; DE3578190D1; IL77078A; IL77078A0

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の技術的背景〕本発明の態様は、米国特許庁に保存を請求しているデ
イスクロージャー・ドクメント（寄託書）第129717号
（1984年８月２日付提出;1984年８月６日付記録）およ
び同第130094号（1984年８月14日付提出;1984年８月14
日付記録）に開示しており、これを引用して本明細書に
含ませる。

従来、遺伝病は、いったん疾病が出現したうえで臨床
所見にもとづいて診断されてきた。さらに一段と正確な
診断を確定し、もしくはそのような診断を提供するた
め、またはより早期に診断できるため、多くの酵素およ
び蛋白質試験がつぎつぎに開発された。しかし不幸に
し、多くの疾患ではいまだそのような試験を利用するこ
とができなかった。

最近、個体のDNA（どの細胞にも存在している）を分
析して、遺伝病の原因となり得る異常遺伝子の存在をつ
きとめることができるようになった。これらの遺伝病に
は、ハンチングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、地中
海貧血、鎌状赤血球貧血等がある。異常遺伝子を発見す
るには「サザーン・ブロッティング法」（SB）〔E.M.S.
サザーン、モレキュラー・バイオロジー・98巻、503頁
（1975年）〕を用い、制限部位の多形性（RSPs）を解析
する方法によって行なわれる。この試験方法は時間がか
かり、高価である。しかし、この試験方法は胎児診断が
可能であり、したがってこの試験の介入により、重度障
害児出産を防止できるのできわめて重要である。

カンおよびドジーは鎌状赤血球貧血の胎児診断に、羊
水細胞から得られたDNAの「サザン・ブロッティング
法」を利用する新しい方法を報告した〔ザ・ランセット
（1978年10月28日号）、910頁〕。正常なDNAをHpaI酵素
で消化すると、β−グロビンの遺伝子は7.6Kbの断片に
含まれている。変異DNAの場合には、遺伝子は7.0Kb（ヘ
モグロビン−Ａ）または13.0Kb（ヘモグロビン−Ｓ）の
鎖長の断片内に見いだされた。この方法によって検出さ
れる多形性のHpaI部位はβ−グロビン遺伝子そのものの
なかにあるのではなく、隣接している配列内に配置され
ていた。即ち、「この解析方法は間接的なものであり、
羊水窄刺前、危険性を有する両親間に丁度リンクした多
形性が保有されていることを証明できた場合にのみ適し
ている」〔ベンズ、アメリカン・ジャーナル・オブ・ペ
デイアトリック・ヘマトロジー／オンコロジー、６巻
（1984年、春季号）。〕（これは家族的研究の結果、明
らかにされた）。

鎌状赤血球貧血は、β−グロビン遺伝子のなかで、グ
ルタミン酸のコドン（CAG）がバリンを暗号化している
コドン（GTG）へ変換するただ１個のヌクレオチド塩基
変異によって起こることが知られている。ニーンハイス
〔ニュー・イングラング・ジャーナル・オブ・メジシ
ン、299巻、195頁（1978年）〕は、この点突然変異によ
って生じたり、または消失したりする認識部位を持って
いる制限酵素による直接解析法を提案した。曽野候補に
挙げられたMnlIは、短い断片（60〜80bp）を生成した
が、これは当時のブロッティング技術によっては解明で
きなかった。

ウイルソンら〔米国特許第4395486号（1983年）〕
は、CTNAGを認識するDdelのような酵素を使用した制限
酵素測定法によって鎌状赤血球貧血を直接診断できるこ
とを発見した。Ｂ−グロビン遺伝子断片は、放射性同位
元素で標識（放射能標識）した該遺伝子の５′末端と相
補的なプローブにより同定した。正常ヘモグロビンを有
する個体は175bpおよび201bpのバンドを示し、一方、貧
血のある個体では376bpの単一なバンドを示した。DdeI
で生じた短い断片群は、不幸にして検出できなかった
が、ブロッティング技術に精密な技術的修正を加えるこ
とによって、はじめて識別することができた。

ウイルソンらの記載に示されたように、新規酵素MstI
が通常技術が使用できるようになった〔プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ、79巻、3628号（1982年６月）〕。正常断片の鎖長は
1.14bpであるが、一方、鎖状赤血球貧血の個体では1.34
Kbの断片を生じる。

ゲル電気泳動によって、これらの断片をその大きさに
より分離する。非グロビン性DNAに由来するその他の断
片も多数存在しているから、グロビン断片群を求めるに
は特殊な手段（「サザーン・ブロッティング法」）を用
いなければならない〔サザーン、プロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ、76
巻、3683〜3687頁（1979年）〕。ゲル電気泳動後、DNA
をフィルター保持体（例えばニトロセルロース）へ移し
換え、ついでこのフィルターを、グロビン配列と特異的
に結合する放射性プローブと反応させる。このプローブ
をグロビン配列に密着させ、ついでこれを洗滌し、オー
トラジオグラフィーを行なうことによって、患者が1.34
Kbもしくは1.14Kbの鎖長の断片、またはその両者を有し
ているかどうか判定することができる。電気泳動、移し
換え、フィルター・ハイブリッド形成、洗滌、およびオ
ートラジオグラフィーから成るこの一連のプロセスは、
高価で時間がかかり、しかも、ある大きさの断片では非
常にむずかしい場合がある。

上述した鎌状赤血球貧血の診断技術では、すべて、該
疾患によって制限部位（制限酵素分解部位）を生成する
か、もしくは分解することを要する。

もう１つの解決策として、ゲノムDNA内のただ１個の
塩基変更（点突然変異）で制限部位が変化しないような
場合でも、該変異の検出をなし得る方法がある。「好適
なハイブリッド形成条件下では、完全な塩基対を作って
いるオリゴヌクレオチド−DNA2本鎖だけが生成するはず
であり、不適正塩基対を１個含んでいる２本鎖は安定で
はないはずである」〔コナーら、プロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ、80
巻、278頁（1983年１月）〕。この方法では、作用領域
において正常個体（または罹患個体）のDNAと相補的な
オリゴヌクレオチドを合成し、放射性同位元素で標識
し、緊縮（ストリンジェント）条件下にハイブリッド形
成を行なう。オートラジオグラフィーによって２本鎖を
精査する。この方法に関して、オーキンは「グロビンDN
A断片、または全DNAのブロット・ハイブリッド形成にお
ける他の幾つかのシングル・コピー配列を検出するため
には、合成プローブの放射能を高めなければならない。
われわれ自身の経験に照らして、これが方法論のなかで
最も厄介な部分である」と述べている〔ブラッド、63
巻、249頁（1984年２月）〕。

このように、緊縮条件下のハイブリッド形成は制限地
図作成技術より一層多方面に応用できるが、放射性プロ
ーブ、ゲル電気泳動、サザーン・ブロッティング、フィ
ルター・ハイブリッド形成、洗滌およびオートラジオグ
ラフィー等、問題の多い必要条件を含んでいる。本発明
の目的は、これらの必要条件における問題点を排除する
ことにある。

プローブを放射能で標識する代わりに、ビオチンで標
識し、ビオチンのアビジンに対する親和性または抗ビオ
チン抗体に対するその結合性によって（あるいは、さら
にペルオキシダーゼのようなリポーター酵素と連結させ
て）該標識を検出する方法が公知である〔レンツ、EMBO
ジャーナル、２巻、817頁（1983年）〕。然しながら、
この技術では、結合相手の配列次第で変わってくる処理
に影響されて、異なった様相を呈する相互作用を利用し
た標識（相互作用標識）を用いることについて教示して
いない。

ファルコウ（米国特許第4358935号）は、不均一系測
定法によって病原体のDNAまたはRNAを測定する感染症の
診断方法を記載している。測定用試薬は標識RNAまたは
標識DNAプローブである。この特許の記述によれば、
「大抵の場合」プローブは放射能標識で標識される。免
疫測定における公知の標識を使用し得ることを一般的に
言及しているが、但し、特定の非放射能標識の優位性を
示す表現はなく、また相互作用標識に関しても論じられ
ていない。さらに、別々に標識された近接プローブの使
用に関する記述もない。

テーバー（ヨーロッパ特許出願第114668号）は、各プ
ローブがサルモネラ菌の１個の染色体の異なった領域に
ハイブリッドを形成するDNAプローブの１群を開示し
た。これらのプローブは放射能標識が好ましいが、ビオ
チンで標識することも可能である。アビジンに蛍光団、
電子高密度化合物、抗体、または１対になった触媒−基
質のうちの何れか一方を結合せしめ、これにビオチン標
識プローブを反応させる。数個のプローブを好ましく同
時使用し、発生する信号強度を相加的に強めるが、多重
標識同志の相互作用、およびそれに伴なう染色体との相
互作用については全く示されていない。テーバーによっ
て示されている相互作用を持たない多重標識と比較し、
本発明の相互作用標識は、試料DNAの精密構造に対して
感度が一層高い。

ペーターソン（WO83/03260号）は、ヒトのMHC対立遺
伝子の多形性を測定する方法を開示しているが、この方
法はウイルソンの方法と同様に、制限酵素分解断片をそ
の大きさにより弁別するものである。この方法では放射
能標識の別法として、酵素、酵素基質、補因子、補酵素
および発光物質のような標識を認めているが、相互作用
標識に関しては言及していない。

エールリッヒ（ヨーロッパ特許出願第84796号）およ
びマツチ（ヨーロッパ特許出願第103960号）は、何れも
制限部位の多形性に基づいたHLA（ヒト・リンパ球抗原
系）の診断分類を提供している。ウイルソンの場合は、
DNAを制限酵素分解し、ハイブリッド形成を行なう前に
予め分別する。マツチの場合は、ハイブリッド形成プロ
ーブの放射能標識の代替物を示しているが、相互作用標
識に関しては言及していない。

ウルマン（米国特許第3996345号）は、１対の蛍光剤
−消光剤を利用する免疫測定システムを教示している。
その１実施態様において、ポリエピトープ性リガンドの
第１受容体に蛍光剤を結合させ、第２受容体に消光剤を
結合させている。

マギオ（米国特許第4233402号）は、被検物質の１抗
体に反応体標識を結合し、また被検物質の１抗体に信号
発成標識を結合させた酵素免疫測定法の使用を開示し
た。この方法では、反応体標識が先ず前駆体化合物に作
用して信号媒体を生じ、次いでこの信号媒体が直接的ま
たは間接的に信号発成標識に作用して信号を生じる。マ
ギオの教示によれば、一方の標識は被検物質に、もう一
方の標識は受容体に結合させなければならないという。
したがって彼の教示は、相互作用標識を施した２個のプ
ローブまたは２重に相互作用標識を施したプローブの使
用にはそぐわないものである。結局、マギオの場合は、
単に配列内の差異が作動して標識間の相互作用に影響を
与える１手段を示唆したにとどまり、正常なDNA配列と
突然変異配列とを識別するのに相互作用標識を利用でき
ることを示唆したのではない。

そのほか免疫測定法に関して興味ある特許としては、
リトマン（米国特許第4275149号）、リトマン（米国特
許第4299916号）、ザック（米国特許第4208479号）、お
よびハリス（米国特許第4463090号）が挙げられる。最
後に挙げたハリスの米国特許第4463090号は、免疫測定
における信号をカスケード増幅することに関するもので
ある。

これらの免疫測定法は、痕跡量の有機化合物の測定に
用いられるものであって、微細構造を解明するためのも
のではない。もし、試料DNAへハイブリッド形成したDNA
プローブを含有しているリガンドー受容体複合体を検出
するのに、前述した各測定法を適用したとしても、それ
らの測定法では障害の効果的な検出はできないであろ
う。緊縮ハイブリッド形成条件を採用しておらず、標識
間で２本鎖を切断していないから、発生する信号が存在
するか否かは、障害の有無に依存しない。一般的に、核
酸配列内の微細な差異を検出するには、これらの免疫測
定技術に特殊な工夫を加える必要があり、本発明はこの
点に関するものである。

ファリナ（米国特許第4378428号）は、一方の標識が
リボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドであり、またもう一
方の標識がリボヌクレアーゼＡのＳ−蛋白質であること
から成る均一系免疫測定法を提供している。このＳ−ペ
プチドおよびＳ−蛋白質は、リボヌクレアーゼＡを細菌
性プロテアーゼであるズブチシリンで消化することによ
って得られる。この発明者の測定法の場合は、ハイブリ
ッド形成法であって免疫測定法ではなく、また被検物質
核酸を消化するのであって、使用される標識の前駆体蛋
白質を消化するのではない。

ギボンズ（米国特許第4287300号と）は、荷電された
標識が、その電場によって第２標識の信号発信活性を調
節する均一系免疫測定法を提供した。

ザック（米国特許第4435504号）は、生産物／基質−
形式から或る別の均一系免疫測定法を開示している。

キャンベル（米国特許第4478817号）は、化学発光ま
たは生物発光標識を利用した免疫測定法において、核酸
が抗原として検出できることを教示している。この方法
では、核酸は抗体に結合されるのであって、本発明に示
すように相補的な核酸に結合されるのではない。

ヘラー（ヨーロッパ特許出願第70685号）は、ハイブ
リッド形成法によって「遅発性ウィルス感染」疾患を識
別する測定法を提供した。この方法では、標識ss−ポリ
ヌクレオチドの実質上近傍領域である100オングストー
ムより少ない至近部位に、化学発光触媒を有する第１−
ss−ポリヌクレオチド試薬と吸収体／発射体部分を有す
る第2ss−ポリヌクレオチド試薬との２つの試薬をハイ
ブリッド形成させる。この２つの試薬は起源ポリヌクレ
オチドを切断することによって得ることができる。

このヘラーの方法において、２つの試薬の物理的近接
と、それ故に生じるその相互作用能は、標的ポリペプチ
ドに存在する障害によって左右されない。しかもヘラー
は、区分消化または緊縮ハイブリッド形成によって相互
作用を調整できることには気付かなかった。

そのうえヘラーは、遺伝異常の診断、より詳細には鎌
状赤血球貧血の診断にその方法を利用することは教示し
ていない。またヘラーは、単一プローブに２個の相互作
用標識を付着結合させること、あるいは一方の相互作用
標識を標的ポリヌクレオチドに、他の一方をプローブに
付着結合させることも教示していない。また、最初の酵
素反応の生産物が別の酵素反応の基質となるようなスカ
ベンジャー手段または酵素標識、特に２個の酵素標識の
利用について教示していない。ヘラーは自分の方法を、
対象患者のDNAに含まれる１遺伝子のコピー数の測定に
利用すること、あるいは最初の対象と次の対象との間の
家族関係の判定に利用することを教示していない。最後
に、彼は２つの標識をへだてている距離について厳重な
制約を設定している。

ヘラー（ヨーロッパ特許出願第70687号）は、固定化
した試料ポリヌクレオチドを、発光標識したポリヌクレ
オチド試薬とハイブリッド形成させる不均一系ハイブリ
ッド形成測定法を記載している。

マルコム（WO84/03520号）は、ポリ−デオキシアデニ
ンまたはポリ−デオキシチミジン尾部を有するポリヌク
レオチド・プローブを作成すれば、この尾部には酵素標
識を付着結合できることを教示した。しかし、ホモポリ
マー尾部と標識との間に抗体リンカーを使用することは
示していない。

ラバニ（ヨーロッパ特許出願第97373号）は、遺伝異
常に随伴する配列と相補的な標識ポリヌクレオチドを作
成し、これと患者のDNAでハイブリッド形成することに
よって遺伝異常が診断できることを教示した。しかし、
相互作用標識の利用に関しては言及していない。

本明細書においては、鎌状赤血球貧血の胎児診断に焦
点を絞って専ら議論して来たが、本発明の方法は、障害
座位および正常配列または障害付近の突然変異配列の何
れかが知られているが、もしくは分離可能であるその他
の多くの遺伝異常に対して、同等に適用できる。

〔発明の要約〕

本発明の診断方法においては、採取した試料細胞から
DNAを単離し、純化、変性して、これをハイブリッド化
する。試料DNAおよび／またはプローブDNAに標識を付け
る。この際、少なくとも２つの標識を利用し、これらの
標識は相互に物理的に近接した位置にあるとき、協同し
て検出可能な信号を発生し得るものを選ぶ。これらの標
識は、試料DNAが関心の対象となる配列、もしくは対象
となる障害を含んでいるかによって、物理的近接の維持
が影響をうけるような位置で、試料DNAまたはプローブD
NAと結合する。

これらの配列は蛋白質を暗号化していてもよく、DNA
発現を調節するものであってもよく、あるいはそれ以外
の対象であってもよい。障害は、生物学的な意味を持つ
単一もしくは多重の挿入、欠失、または置換（即ち、突
然変異）である。

本発明のもう１つの用途、細胞内において、多剤耐性
遺伝子のようなある特定の配列を増幅してDNAを測定で
きることである。例えばロビンソンらは、ある種の多剤
耐性腫瘍細胞株で1.1Kbの断片が強く増幅されることを
報告している〔ネーチャー（1984年６月）、609〜626、
628頁〕。本発明方法によって生成された信号レベル
は、増幅度の指標となる。この方法に簡単な修飾を加え
ると、遺伝子そのものの代わりに、その遺伝子から転写
されたmRNAが測定される。このことは、当の遺伝子の発
現度の指標となる。また、多剤耐性以外にも細胞性また
はウィルス性の腫瘍遺伝子およびその他の腫瘍マーカー
も検出できる。もう１つの用途は、正常な場合、染色体
上に既知のコピー数だけ存在する配列を測定することに
よって、染色体の異常数を測定することである。これ
は、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ダウ
ン症候群および、そのほか染色体異常に随伴し起こる各
種疾患の診断に価値あるものであろう。

なお、そのほかマーカー遺伝子を測定することによっ
て、２人の対象者の家族関係を決定付けることに利用で
きよう。この場合は、数個のマーカーの存在について測
定することが望ましい。

（試料DNAの供給源）試料DNAは、ウイルソンら〔米国特許第4395486号（19
83年）〕およびその他の教示にように、羊水中に存在し
ている細胞、または末梢血流中に存在するリンパ球から
単離する。特殊な状況下では、その他の都合によいDNA
供給源があってよく、本発明においては、如何なる特殊
な供給源または試料DNAの単離方法であってもこれを制
限することを意図するものではない。

（プローブDNAの供給源）プローブは、既知内容または既知配列を有するDNAの
化学合成、mRNAからの逆転写、または制限酵素分解およ
び単離等を含む通常技術により作成できる。本発明で
は、特定のプローブ作成方法に限定することを意図する
ものではない。

作成したプローブは、障害に最も近い領域と相補的な
配列を有するものである。「最も近い」の語は、「隣接
する」または「包含している」の何れかを意味し、また
は所望によりその双方を意味する。最後に、作成したプ
ローブは、所望により遺伝子のコーディング鎖またはア
ンチコーディング鎖と相補的であることができる。

（標識の代表例）標識の例としては、酵素、酵素基質、プロ酵素、プロ
酵素活性化体（補因子および補酵素を含む）、種々の極
性または非極性またはその他の化学物質またはポリマー
のような微環境を変化させる試薬、蛍光標識、生物発光
標識、その他、互いに信号を増強し、変化し、または消
滅させる任意の標識等が挙げられるが、これに限定され
るものではない。ある状況下にあっては、相互に作用す
る２つ以上の標識を使用するのが好ましい。（例えば、
酵素カスケードまたは酵素連鎖を使用することができ
る）。また場合によっては、２つ以上のプローブを使用
するのが好ましいこともある。プローブ上の標識密度お
よびそれらの位置はさまざまに変えることができる。

（信号の代表例）信号の例としては、下記のものが挙げられるが、これ
だけに限定されるものではない。

A.発光性（蛍光性をも含む）生産物の生成。

B.他の標識によって生じるある標識の発光性の変化（振
幅、偏光、その他の諸特性等）。

C.化学発光。

D.光吸収性（着色性）生産物。

E.pH変化。

F.NMR変化。

G.広く標識またはその他の成分によって電磁放射線の吸
収または発射に生じる変化。

H.重量分析、容量分析または電気化学分析上の変化。

I.広く沈澱または凝集。

本明細書に使用される「信号（シグナル）」の語は、
存在している信号の中断を含めた広い意味に用いられ
る。

「信号」の語は、あるパラメーターの絶対的な値でな
く、検出可能なパラメーターの変化率の意味に用いるこ
とがある。

信号は、個々に独立して、または自動的または半自動
的にモニターすることができる。

現在は、酵素標識が好ましく用いられる。

（プローブの標識化）さまざまな技術によって、標識を直接的または間接的
にプローブへ付けることができる。標識は、多くの異な
った結合形式で、プローブへ共有結合的に結合するか、
または保持される。使用標識の正確な形式次第によっ
て、標識は相互作用を容易にするため、プローブの末端
またはプローブの至るところへ配置されるか、または種
々の大きさおよび構成を持つリンカーへ付けられる。付
着形式の１例として、ホモポリマーDNA鎖に特異性を有
する抗体を標識とし、ホモポリマー尾部を有するプロー
ブを使用する方法が挙げられる。このようにすると、標
識は、抗原−抗体結合により抗体リンカーを介してプロ
ーブへ付けられる。

標識を特異的にプローブへ付着した後、ハイブリッド
形成を行なう。この場合、プローブは、ビオチンまたは
水銀のような小標識（タグ）をもっているから、特異性
のある標識（ラベル）は小標識（タグ）との親和性に基
づき、いつ如何なる時点でも（たとえハイブリッド形成
後のような時点でさえ）選択的にこれと結合する。（本
システムの優位性は、ハイブリッド形成反応の立体障害
を最小化している点である）。さらに、（１）標識が付
着している部位であり、（２）空間または立体高価によ
り相互作用を促進するため、または（３）標識を相互に
接近させるために、プローブ末端へ追加塩基またはその
他の部分構造を付加する。例えば、２個のプローブに相
補的な塩基の短い配列を付着させると、該プローブがゲ
ノムDNAと結合した後、プローブ同志の相互作用を促進
することができる。言うまでもなく、標識に付着してい
る該配列の引力は、試料核酸が存在しない場合の、固い
場合に要する引力より低く保たれている。

DNAを標識する好ましい技術は、レンツおよびクルツ
により記載されている〔ニュークレイック・アシッド・
リサーチ、11巻、3345頁（1984年）〕。DNAプローブに
酵素を結合させる架橋用試薬としてポリエチレンイミン
を使用することが記載されている。

標識を付着するDNA配列（プローブ）の大きさおよび
組成は、解析すべき配列の特殊性によってきまる。

〔実施態様の説明〕

本発明方法の第１の実施態様では、対象となる部位の
５′領域に相補的な第１標識プローブと、対象部位の
３′領域に相補的な第２標識プローブを利用する。もし
その部位がある酵素の認識／制限部位から成っているの
であれば、その酵素で試料DNAを消化し、その制限酵素
分解断片を標識プローブへハイブリッド化することによ
って、２つの標識は分離され、したがって標識間の相互
作用が妨害されて信号を発生する。

相互作用標識として多数の組合せが可能である。好ま
しい組合わせの１つは、第１標識をグルコース・オキシ
ダーゼ酵素として、第２標識を西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼ酵素とするものであって、グルコース・オキシダ
ーゼはブドウ糖基質に作用して過酸化水素を発生し、一
方、ペルオキシダーゼは過酸化水素のルミノールとの化
学発光反応を触媒する。もう１つの好ましい組合わせ
は、一方の標識がヘキソキーゼで、他方がグルコース−
６−燐酸デヒドロゲナーゼである〔リトマン、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー、106巻、223〜229頁（198
0年）〕。多数の有用な酵素標識および酵素反応が、リ
トマンの米国特許第4275149号（1981年）の第IV表〜第V
III表に教示されている。

必ずしも２個の酵素標識を使用する必要はない。１個
の標識を例示すれば、アミノブチルエチル−イソルミノ
ール（ABEI）、およびフルオレスセインが挙げられる。
ABEIは、フルオレスセインとの相互作用によってスペク
トルのシフトを示す化学発光物質である〔ペーテルおよ
びキャンベル、クリニカル・ケミストリー、29巻、1604
〜1603頁（1983年）〕。

さらにもう１つの組合わせとして、DNAプローブにβ
−ガラクトシダーゼおよび巨大分子のＯ−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシド（に荷電したガラクトシダーゼ
の基質）を標識し、これを試料DNA（に荷電してあ
る）と電気的誘引力によって結合させる。基質と酵素と
の間の相互作用は、光散乱の増加率をモニターすること
によって検出させる〔ギボンズら、クリニカル・ケミス
トリー、29巻1602〜1608頁（1983年）〕。

本発明の特に優れている点は、連結し合っていないDN
A断片にそれぞれ付着している標識間の相互作用を阻止
するため、「スカベンジャー」酵素を使用することであ
る。例えば、ペルオキシダーゼ系において遊離の過酸化
水素を破壊するためにカタラーゼ酵素を使用できる。ヘ
キソキナーゼ系では、ホスホフルクトキナーゼをスカベ
ンジャーとして使用できる。そのほか、信号発生系の遊
離成分の限界拡散法、あるいはそのような成分によって
発信される信号を消去する方法等が使用できる。

この方法のもう１つの優れた点は、２つまたはそれ以
上の酵素から成る「カスケード」を信号発生系に使用で
きることである。信号発生を最高に達せしめるそのよう
な多重酵素カスケードは、ハリスによって酵素免疫測定
法に用いられている（米国特許第4463090号）。

本発明の第２実施態様は、関心の対象となる領域と相
補的である２重標識プローブをただ１つだけ使用するこ
とである。制限酵素が突然変異部位に作用すると、第１
標識および第２標識の付着点は、それぞれ分割された断
片上に残るため、遠く離れてしまう。

本発明の第３実施態様では、単一標識プローブを使用
するが、同時に相互作用標識を試料DNAに付ける。

本発明の第４実施態様では、ただ１個の標識をプロー
ブまたは試料DNAに付ける。この標識は、ハイブリッド
形成によって変化する信号を発生する。例えば、蛍光標
識プローブの蛍光偏光は、プローブを試料DNAにハイブ
リッド化すると変化を生じる。

本発明の第５実施態様は、相互作用標識を利用して、
認識／制限部位を、生成もしくは破壊しない点突然変異
を測定することである。正常DNA配列と相補的なオリゴ
ヌクレオチドに一方の標識を付け、もを一方の標識は試
料DNAに付けるか、または試料DNAの近接領域と相補的な
別のポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに付
ける。コナーら〔プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ザ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ、80歳、278頁（1983
年）〕が教示したように、好適な条件下でハイブリッド
形成を行なうと、正常配列ではハイブリッド化するが、
変異配列ではハイブリッドを形成しない。したがって、
標識は配列が完全に適合した場合だけ、有効に相互作用
を示す。

合成プローブの正確な大きさおよび構成は、分析され
る配列の特殊性、および標識のため、標識（ラベル）ま
たは小標識（タグ）を付けることによってハイブリッド
の構成および安定性に与えるかもしれない変化等を含む
多数の因子により左右される。

オーキン〔ブラッド、63巻、249頁（1984年２月）〕
が教示したように、ハイブリッド形成条件は、突然変異
遺伝子および正常遺伝子をクローンすることによって確
立することができ、これを全ゲノムの消化生産物に拡大
すればよい。言うまでもなく、正常配列ではなく、変異
配列を相補的であるプローブを利用することも可能であ
る。この場合には、信号は遺伝異常を指示することにな
る。

本発明の第６実施態様は、１本鎖DNAを選択的に攻撃
するS1ヌクレアーゼやマングビーン・ヌクレアーゼのよ
うな酵素を利用することである〔これらの酵素に関して
は、マニアティス、モレキュラー・クローニング（1982
年）、140〜141頁に簡単な記載がある〕。もしプローブ
が試料DNAの領域と好ましく相同であるなら、それは２
本鎖であるから、何れの箇所も攻撃をうけない。然し、
突然変異（欠失、挿入または置換）によって完全な結合
が妨げられた場合は、相同でない領域は攻撃をうけ、切
断される。この場合、攻撃が予想される箇所を２重標識
したプローブ（５′および３′をそれぞれ相互作用標
識）を使用する。酵素攻撃が有効であれば標識がそれぞ
れ分割された断片上に残るように工夫される限り、別法
として、一方の標識をプローブに、他の一方の標識を試
料DNAに付けることもでき、あるいは双方の標識を試料D
NAに付けることもできる。

上記の説明は、試料DNAおよびDNAプローブの利用を例
示して論じたが、本発明の方法は、試料RNAの測定およ
びRNAプローブの利用にも容易に適合できる。

本発明の方法は、遺伝異常に随伴するDNA障害の検出
にきわめて有用なものであるが、前に決定した配列の持
続または変更の検出にも容易に適合でき、したがって
「遺伝子」の語は広く解釈されるべきである。この方法
はヒト遺伝子に限定されるものではなく、天然または合
成にかかわりなく、例えば診断の目的で、ヒト、動物、
植物、微生物またはウィルス起源の核酸配列測定に適用
できる。試料核酸は支持手段に取り付けることができ
る。

本発明の幾つかの実施態様を記載したが、上記の教示
から多くの組合わせ、修飾、変更が可能であることは理
解されよう。したがって、本発明が前記た特定実施態様
だけに限定されるものでないことを理解すべきである。

以下、実験に係る実施例を示して、この測定方法を具
体的に説明する。

実施例１均一系溶液ハイブリッド形成法による核酸の測定レンツの指定した濃度および量［ニュークレイック・
アシッド・リサーチズ、12巻、3435頁］を用い、レンツ
の技術により、ポリヌクレオチド［ポリイノシン、ポリ
シチジン、ポリウリジン（ポリＩ、Ｃ、Ｕ）］とペルオ
キシダーゼ（Ｐ）またはグルコース・オキシダーゼ
（Ｇ）のコンジュゲート複合体を作成した。RNAと酵素
の複合体をS300ゲル濾過法によってサイズにより分離
し、これによってRNAと結合しなかった大量の酵素から
複合体を分離した。特に、このゲル濾過によって、遊離
ペルオキシダーゼおよびグルコース・オキシダーゼを複
合体から分離した。

この方法によって、複合体ポリＩ−ペルオキシダーゼ
（複合体PIP）、ポリＣ−グルコース・オキシダーゼ
（複合体PCG）およびポリＵ−グルコース・オキシダー
ゼ（複合体PUG）が生成した。さらにグルコースとペル
オキシダーゼを、１本の試験管内でポリＵに同時にコン
ジュゲート結合させ、単一予備調製複合体（複合体PUP
G）を作成した。ポリＩをポリＣへ特異的にハイブリッ
ド化する試験のため、下記の各成分を試験管内でそれぞ
れ混合した。

45分間、ハイブリッド形成後［37℃、0.1モルNa＋（p
H6.5）非特異的付着を避けるため0.6mg/mlポリＡ（ポリ
アデニン）を添加］、結合形および遊離プローブを分離
することなく、またそのほか何らの操作も加えずに、酵
素発現試薬［オルトフェニレンジアミン（OPD）1mg/m
l、酢酸ナトリウム50mM（pH5.1）、４％グルコース］を
加えた。反応を起こすためには、グルコース・オキシダ
ーゼは（グルコースから）H₂O₂を合成しなければならな
い。それによって、ペルオキシダーゼはH₂O₂を利用し、
OPD基質に変化を生じることができる。

相互作用複合体を予備調製した試験管Ｃでは15〜60分
で発色した。ハイブリッド形成により、グルコースとペ
ルオキシダーゼが近接して相互作用を行なう試験管Ａで
も同程度の発色を示した。試験管Ｂも、最初、若干発色
した。然しその発色の程度は、試験管Ａおよび試験管Ｃ
より弱かった。酵素発現を一晩中続けると、試験管Ｃで
は、ペルオキシダーゼとグルコース・オキシダーゼの相
互作用を示す結晶が生成した。結晶は試験管Ａでも生成
した。然し、試験管Ｂでは結晶らしいものは何ら認めら
れなかった。対照とした複合酵素を含んでいない反応で
も、結晶は生成しなかった。透過光または反射光によっ
て結晶は茶色となり、偏光内では橙赤色の複屈折を示し
た。

発明者の知る限り、これは、結合形核酸から遊離形を
分離する面倒な方法を採らずに、溶液（または任意の）
ハイブリッド形成を遂行し、分析できた最初の実験であ
る。またこれは、非放射能標識プローブでハイブリッド
形成を直接モニターできた最初の実験である。さらに、
結晶および色の差異を発現することによって、新規で、
しかもはなはだ有用な測定法を提供し得たものである
（次に挙げる実験に示したように、基質条件は目的生産
物の形態によって変わる）。

実施例２核酸ハイブリッド形成による均一系測定法におけるスカ
ベンジャーとして、カタラーゼの使用実施例１の成績を確認し、さらに拡大するため、ま
た、ＧおよびＰを含有する非ハイブリッド形成核酸をＢ
で混合するとき（上記）に見られるバックグラウンドを
減少させるため、同様の実験を、但し、発現混合物にカ
タラーゼを加えて計画した。カタラーゼを加えることに
よって、グルコース・オキシダーゼとペルオキダーゼが
近接していない場合には、グルコース・オキジダーゼか
らペルオキシダーゼヘH₂O₂が拡散するのをできだけ少な
くするはずである。遊離形カタラーゼをスカベンジャー
として発色試薬のなかに加えた。カタラーゼは、混合物
内に自由に拡散するH₂O₂を破壊することができる。発色
試薬は、グルコース基質をさらに追加した以外は実施例
１と同じである。発色混合液はグルコースを４％から25
％に増量して基質の供給を充分に、結晶生産物よりも、
むしろ水溶性の着色物を好ましく生成するようにした。
Ａ、Ｂ、Ｃの各酵素複合体パネル毎にカタラーゼ7.5、1
5および30単位/mlの異なった３段階の濃度で試験した。
パネルＡの試験管には、ペルオキシダーゼ標識ポリＩ
（PIP）50μｌと、これと相互作用をするグルコース・
オキシダーゼ標識の相補的ポリヌクレオチドＣ（PCG）5
0μｌが含まれている。パネルＢの試験管には、PIP複合
体50μｌと、これと相補的でないPUG複合体50μmlが含
まれている。パネルＣの試験管には、ポリＵ、酵素標識
Ｇおよび酵素標識Ｐから成る予備調製複合体（PUPG）50
μｌが含まれている。ハイブリッド形成条件は、30℃、
0.1モルNaCl（pH6.5）で0.6mg/mlのポリＡを加えて行な
った。

30分後の発色で、パネルＣの予備調製複合体（陽性対
照）は、すべてのカタラーゼ濃度で、濃い発色反応を示
した。試験管Ｂのハイブリッドを形成しないヌクレオチ
ドによる発色量は、すべてのカタラーゼ濃度でうすく、
カタラーゼによる阻害を示していた。予想したように、
パネルＡのハイブリッド化複合体では中間的なカタラー
ゼによる阻害を示した。各カタラーゼ濃度で、パネルＡ
はパネルＢより濃く、ポリヌクレオチドのハイブリッド
化によって、ＧとＰとの相互作用のための過酸化水素の
拡散距離が減少したことを示していた。

カタラーゼ濃度は、現在10単位/mlが選ばれている
が、15単位/mlで最良の成績を達成した。

このように相互作用標識システムは、着色性生産物
（または結晶性生産物）を生成することによる迅速簡単
な方法で、液相ハイブリッド形成のモニターに使用する
ことができる。また、スカベンジャー酵素の存在によっ
て、酵素間相互作用の観察がさらに容易になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トーブ、フロイドアメリカ合衆国メリ−ランド 20850、ロックビル、ウエスト・モンゴメリー・アベニュー 538番 (56)参考文献特開昭60−201256（ＪＰ，Ａ) 欧州公開70685（ＥＰ，Ａ１)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子配列中の特定の核酸領域を検出する
にあたり、（ａ）当該遺伝子配列を含んでいる試料核酸
を単離し、（ｂ）当該試料核酸を制限酵素に爆露し、
（ｃ）当該試料核酸を物理的近接にあるとき相互作用に
よって信号を発生し得る少なくとも２つの標識された核
酸プローブと組み合わせ、（ｄ）その信号の検出を行う
ことを特徴とする方法。
【請求項２】核酸領域が特定部位にある制限酵素の認識
部位を形成または破壊する障害を有している、請求の範
囲第１項記載の方法。
【請求項３】試料核酸と核酸プローブを両者間に完全な
相同を必要とするような緊縮条件下でハイブリッド化さ
せる、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】少なくとも１つの核酸プローブが特定部位
に近い正常な領域と完全に相同である、請求の範囲第２
項記載の方法。
【請求項５】少なくとも１つの核酸プローブが障害に近
い領域と完全に相同である、請求の範囲第２項記載の方
法。
【請求項６】信号を定量化する、請求の範囲第２項記載
の方法。
【請求項７】第１標識がプロ酵素に作用して活性形を生
成するプロ酵素活性化剤であり、生成した活性形が第２
標識と一層強力に相互作用して信号を発生する、請求の
範囲第２項記載の方法。
【請求項８】第１標識が基質に作用して化学種を発生す
る酵素であり、この化学種が第２標識と相互作用して信
号を発生する、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項９】標識が（ａ）グルコース・オキシダーゼ／
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼおよび（ｂ）ヘキソキナ
ーゼ／グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼから成る
群から選ばれたものである、請求の範囲第８項記載の方
法。
【請求項１０】少なくとも１つの核酸プローブが化学種
に作動して第２標識との相互作用を減少させるスカベン
ジャー手段をさらに含んでいる、請求の範囲第８項記載
の方法。
【請求項１１】スカベンジャー手段がそれぞれ（ａ）カ
タラーゼおよび（ｂ）ホスホフラクトキナーゼから成る
群から選ばれたものである、請求の範囲第10項記載の方
法。
【請求項１２】第１標識が化学発光物質であり、第２標
識がこれと相互作用する蛍光団である、請求の範囲第２
項記載の方法。
【請求項１３】第１標識がアミノブチルエチル−イソル
ミノールであり、第２標識がフルオレスセインである、
請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項１４】第１標識が基質であり、第２標識がその
基質に作用して信号を発生する酵素である、請求の範囲
第２項記載の方法。
【請求項１５】第１標識が巨大分子β−ガラクシドであ
り、第２標識がβ−ガラクトシダーゼである、請求の範
囲第14項記載の方法。
【請求項１６】核酸プローブが少なくとも３段階の連続
反応を含んでいる、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項１７】遺伝子配列がヒトβ−グロビン遺伝子で
あり、障害が６番目のコドン位置におけるバリンを暗号
化しているコドンの存在である、請求の範囲第２項記載
の方法。
【請求項１８】試料核酸内の同一領域の数が信号レベル
から決定される、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項１９】細胞DNAの正常補体内に一定コピー数で
存在している遺伝子を同定することおよび対象のDNA中
にある当該遺伝子のコピー数を測定することを含む染色
体異常を特徴とする疾病を診断するにあたり、対象のDN
A中にある当該遺伝子のコピー数の測定のために使用さ
れる、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２０】疾病がクラインフェター症候群、ターナ
ー症候群およびダウン症候群から成る群から選択された
ものである、請求の範囲第19項記載の方法。
【請求項２１】制限酵素の認識部位を形成または破壊す
る遺伝子配列中の既知障害によって特徴付けられる遺伝
子異常の患者を診断するにあたり、（ａ）当該患者から
細胞を採取し、（ｂ）当該細胞から当該遺伝子配列を含
む試料核酸を単離し、（ｃ）当該試料核酸を当該制限酵
素に暴露し、（ｄ）当該試料核酸を物理的近接にあると
き相互作用によって信号を発生し得る複数の標識核酸プ
ローブとハイブリッド化させ、その場合、当該試料核酸
を当該制限酵素に暴露した後の当該核酸プローブの相互
作用が当該制限酵素の認識部位の不存在に依存するもの
であり、当該試料核酸の当該制限酵素による開裂は当該
核酸プローブの相互作用を妨害し、かつ信号の発生を妨
害するものであり、（ｅ）当該核酸プローブの相互作用
によって発生した信号を検出することにより正常遺伝子
を異常遺伝子から区別する、請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項２２】核酸プローブがリンカー手段により標識
を結合されているものである、請求の範囲第21項記載の
方法。
【請求項２３】リンカー手段がポリエチレンイミンを含
むものである、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項２４】細胞が胎児起源であって、胎児を診断す
るために行われる、請求の範囲第21項記載の方法。
【請求項２５】信号を定量化する、請求の範囲第21項記
載の方法。
【請求項２６】（ａ）試料核酸中における核酸領域の第
１亜区（subregion）と相補的な第１核酸プローブおよ
び第２亜区と相補的な第２核酸プローブを調製し（ただ
し、それら両亜区は隣接しており、かつ重複していな
い。）、（ｂ）当該第１核酸プローブと第２核酸プロー
ブをそれぞれ第１酵素標識と第２酵素標識で標識し、そ
れら標識はそれらの間の化学種の拡散により信号を発生
し、かつその信号はそれら標識が物理的近接にあるとき
より強いものであり、（ｃ）当該試料核酸を制限酵素に
暴露し、当該制限酵素による開裂が上記第１標識と第２
標識の物理的近接を妨げるものであり、（ｄ）上記プロ
ーブを当該試料核酸へハイブリッド化させることによっ
てそれら標識を物理的近接に置くと共にこれを維持し、
（ｅ）その信号をモニターする、請求の範囲第１項記載
の方法。
【請求項２７】化学種がハイドロジェンペルオキシダー
ゼである、請求の範囲第26項記載の方法。
【請求項２８】試料核酸が細胞またはウイルスから得ら
れるものであり、核酸領域が特定環境下で機能または生
育する当該細胞またはウイルスの能力に機能的に関連し
ているものである、請求の範囲第26項記載の方法。
【請求項２９】標識が核酸プローブの領域に特異的に結
合する抗体リンカーによって核酸プローブに結合してい
る、請求の範囲第26項記載の方法。
【請求項３０】その領域がモノポリマー尾部である、請
求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３１】試料核酸が支持手段に結合されている、
請求の範囲第26項記載の方法。
【請求項３２】第１対象と第２対象の試料核酸について
少なくとも１つの特定の核酸領域の存在を測定すること
により、両対象の間の家族関係を決定するにあたり、
（ａ）核酸領域の第１亜区と相補的な第１核酸プローブ
および第２亜区と相補的な第２核酸プローブを調製し
（だだし、それら両亜区は隣接しており、かつ重複して
いない。）、（ｂ）当該第１核酸プローブと第２核酸プ
ローブをそれぞれ第１標識と第２標識で標識し、それら
標識はそれらの間の相互作用によって信号を発生し、か
つその信号はそれら標識が物理的近接にあるときより強
いものであり、物理的近接が制限酵素により特定の核酸
領域において当該試料核酸の開裂により妨げられるもの
であり、（ｃ）当該試料核酸を当該制限酵素に暴露し、
（ｄ）当該プローブを当該試料核酸にハイブリッド化さ
せ、それによって当該試料核酸が当該核酸領域において
当該制限酵素により開裂されないならば、それら標識は
相互に物理的近接に置かれ、かつ維持され、（ｅ）その
信号を測定し、（ｆ）その信号の大きさから両対象の間
の家族関係を決定する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３３】（ａ）障害を有する遺伝子配列を含む試
料核酸を調製し、（ｂ）第１標識を有する第１核酸プロ
ーブと第２標識を有する第２核酸プローブを調製し、当
該プローブの一方は当該障害の上流領域に、他方は当該
障害の下流領域にハイブリッド化することができるもの
であり、それら領域は何れも当該障害の存在部位と近接
するがこれと重ならないものであり、当該第１標識は基
質に作用して化学種を発生せしめ、次いでこれが当該第
２標識の付近へ拡散し、当該第２標識と相互作用して信
号を発生し得るような酵素であり、コレラ標識、化学種
および基質が信号発生系を形成しているのものであり、
（ｃ）当該試料核酸を制限酵素に暴露し、（ｄ）当該プ
ローブを当該試料核酸とハイブリッド化させ、（ｅ）当
該第１標識のための基質を提供して信号発生系を刺激
し、それによって当該化学種が拡散して相互作用により
信号を発生する距離が当該障害に依存しており、（ｆ）
その信号を観察する、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項３４】DNA障害により特徴付けられる遺伝子疾
病診断用試験キットであって、当該障害の上流領域と相
補的であり、かつ第１標識を有する第１核酸プローブ
と、当該障害の下流領域と相補的であり、かつ第２標識
を有する第２核酸プローブとを含んでおり、それら標識
は相互作用により信号を発生することができるものであ
り、その信号はそれらプローブがそれぞれ相補的な上記
領域にハイブリッド化することによってそれら標識が物
理的に近接にしたとき一層強まるものであり、その物理
的近接は制限酵素による障害の開裂により妨げられるも
のであることを特徴とする、試験キット。
【請求項３５】第１標識がグルコース・オキシダーゼで
あり、第２標識が西洋ワサビ・ペルオキシダーゼであ
る、請求の範囲第34項記載の試験キット。
【請求項３６】さらにカタラーゼを含有している、請求
の範囲第34項記載の試験キット。
【請求項３７】制限酵素の認識部位がβ−グロビン遺伝
子の６番目のコドンにおいて鎌状赤血球貧血障害により
形成または破壊されている、請求の範囲第34項記載の試
験キット。
【請求項３８】遺伝子疾病が鎌型赤血球貧血であり、プ
ローブが他の領域と有意義なハイブリッド形成を行うの
を回避するに十分な数のコドン６の３′および５′塩基
にわたってコドン６の近傍において正常または変異ヒト
β−グロビン遺伝子に対して相補的であり、上記プロー
ブは物理的に近接すると相互作用して信号を発生する標
識で標識されている、請求の範囲第34項記載のキット。
【請求項３９】物理的に近接していない標識による信号
の発生を妨害するスカベンジャー手段をさらに含んでい
る、請求の範囲第38項記載の試験キット。
【請求項４０】標識がリンカー手段によってプローブに
結合されている、請求の範囲第34項記載の試験用キッ
ト。