JP2001522588A - 特異的ヌクレオチド配列を検出するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は核酸配列を検出するための方法および組成物を含む。より具体的には、本発明は、異なる核酸標的保護および回収方法を使用した特異的遺伝子配列の検出のための方法および組成物を含む。さらに、本発明は核酸開裂のための新規な方法を含む。本明細書で開示したものは、配列特異的ではないカッタープローブを使用する核酸配列の検出法、三重らせん形成の使用、ヘアピン構造に関与する三重らせん形成、およびシグナル増幅法である。本発明は、異なる核酸標的保護および回収方法を使用した特異的遺伝子配列の検出のための方法および組成物を含む。さらに、本発明は核酸開裂のための新規な方法を含む。本明細書で開示したものは、配列特異的ではないカッタープローブを使用する核酸配列の検出法、三重らせん形成の使用、ヘアピン構造に関与する三重らせん形成、およびシグナル増幅法である。

Description

【発明の詳細な説明】

＜関連出願の相互参照＞ 本出願は、１９９７年１１月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／０６５, ３７８、１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／０７５,８１２ 、および１９９８年３月５日出願の米国仮特許出願番号６０／０７６,８７２の 優先権を主張する。 ＜技術分野＞ 本発明は核酸配列を検出するための方法および組成物を含む。より具体的には
、本発明は、異なる核酸標的保護および回復戦略を使用した特異的遺伝子配列の
検出のための方法および組成物を含む。さらに、本発明は核酸開裂のための新規
な方法を含む。 ＜発明の背景＞ 分子生物学的技術により、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の決定、同定または検出の
ための多くの正確で迅速な試験が提供されてきた。残念なことに、これらの試験
のほとんどは、試験に関与する１または数個の段階を、ＤＮＡのＰＣＲ増幅に依
存する。ＰＣＲを用いた標的核酸の増幅は、所望の標的核酸配列以外の核酸配列
の増幅をもたらし得る。

【０００１】 多くの標的およびシグナル増幅法が文献に記載されてきたが、高い特異性、簡
易性、およびスピードの組合せられたものを提供すると信じられるものはない。
近年、核酸検出技術が、２１世紀の診断技術の開発のために研究中である。核酸
配列を基本とした増幅（NASBA Organon Teknika）、鎖−置換増幅（Becton Dick
inson）、転写を基本とした増幅システム（TAS）、転写を仲介した増幅（Genpro
be）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR、F.Hoffmann la Roche）およびインサイツＰ
ＣＲの標的増幅法などの、多くの異なる増幅を基本とする技術が開発されてきた
。

【０００２】 他の増幅を基本とした技術は、シグナル（プローブ）増幅法、例えばリガーゼ
連鎖反応（LCR/Abbott）、ｑ−ベータバクテリオファージレプリカーゼ（Genetr
ak systems）、サイクリングプローブ技術（ID Biomedical of Vancouer）、ｂ −ＤＮＡ（Chiron）、インサイツハイブリダイゼーション、リガーゼハイブリダ
イゼーション、および転写シークエンシングを用いたゲノム増幅（GAWTS）など を含む。

【０００３】 上記の技術は全て、不満足な態様を有する。標的増幅法は、単位複製配列およ
び他の形のサンプル汚染並びに特異性に関連した問題に難点がある。かかる問題
は、その技術基礎の限界に存し、適切な実験（キット）設計がないことに一致し
、その結果、特異性および感度は高くない。さらに、これらの技術は特異的ＲＮ
Ａ標的を直接スクリーニングする能力に欠けており、これにより、これらの技術
が、ＲＮＡウイルス性、癌、および他の感染性疾患診断および治療管理の向上を
支持することが厳しく制限される。

【０００４】 さらに、特殊な標的におけるマイクログラム量以上の核酸をスクリーニングで
きないことにより、さらに、これらの方法の特異性および感度は減少する。実際
、感染性疾患診断における１つの真実は、検出の必要が感染時間経過の初期であ
ればあるほど、解析に必要な宿主ＤＮＡ（ミリグラム量）のサンプルは多い。

【０００５】 シグナル増幅技術は同様に、固有な問題を有する。標的を定量できないことと
併せて、標的から単一コロニーまで全体的に認識できないことによる、非特異的
な高いバックグラウンドシグナルおよび不適切な感度レベルにより、診断の進展
の機会はほとんどない。

【０００６】 単一遺伝子コピー検出における現在最も感度の高いアッセイである生物発光の
みが、最低数１０万の保護標的を検出できる。必要なのは、単一の遺伝子を検出
するための標的検出の感度を増加させる方法である。

【０００７】 現在利用可能な核酸増幅法でも、小サンプル中に存在する比較的少量の標的核
酸分子（マイクログラム量のＤＮＡ）を検出できるが、より短時間でより少ない
バックグラウンド妨害で標的核酸分子を検出する能力もまた必要とされる。ＰＣ
Ｒおよび他の増幅技術に固有な問題は、回収方法の間のサンプル汚染およびＤＮ
Ａ種を汚染し偽陽性結果を与える単位複製配列（増幅ＤＮＡ）の存在を含む。関
連性の高い配列により仲介される非特異的標的増幅およびプライマーダイマーの
生成の問題がある。また特異性を良好に調節できない結果、偽陽性反応が生じ、
感度を良好に調節できない結果、偽陰性反応が生じる。ＰＣＲ結果はしばしば、
ＤＮＡ−サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティングおよびプローブハイブリ
ダイゼーション、またはインサイツハイブリダイゼーションなどの他の技術によ
り確証および確認しなければならない。さらに、ＰＣＲおよび増幅技術は、最大
１マイクログラムの範囲の、非常に少量の開始サンプルＤＮＡを用いてのみ使用
できる。これにより、大量の全／非特異的核酸におけるコピー数の少ない核酸標
的の検出に、並びに初期感染時間経過診断にＰＣＲ技術を使用できない。

【０００８】 直接的ＲＮＡ解析を提供する技術は、ノーザンブロットおよびリボヌクレアー
ゼ保護アッセイを含む。ノザンブロットは最初にＲＮＡ分子を変性させ、線形で
折り畳まれていないことを確かめる。次いで、ＲＮＡをゲル電気泳動にかけ、膜
に移行し、標識プローブとハイブリダイズさせ、可視化法にかける。この方法は
定性および定量の両方である。この長い時間と高い費用のかかる方法は、その設
計における全ての不利な面のためにＲＮＡ診断においてほとんどまたは全く適当
ではなく、これはＤＮＡ診断でのサザンブロットの使用の問題と類似している。
これらは、時間の消費、高い費用／材料および労働、比較的少ない標的の検出に
おける感度の欠失、および単一の標的コピーまで感知できないこと、従って後期
の伝染性時間経過アッセイを含む。

【０００９】 リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ambion）は、プローブのＲＮＡ分子への結合
、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して非特異的ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ領域を除去、
電気泳動ゲル上での解析を含む。この方法は定性のみであり、アッセイにおいて
可視化に必要なＲＮＡの量のために、診断技術には感度が足りない。

【００１０】 ＲＮＡ診断に可能性のある現在利用可能な唯一のプロセスである、逆転写−Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、間接的ＲＮＡ解析のみ達成できる。ＲＮＡをＤＮＡコ
ピー（ｃＤＮＡ）に変換し、定量的ＰＣＲを実施する。ＲＴ−ＰＣＲは高価であ
り、特異性および感度が低く、再現可能な結果を得るために全段階を極度に標準
化する必要があり、極めて手間を要する。また、ＲＴ−ＰＣＲは初期の伝染性時
間経過核酸診断に使用できない。

【００１１】 従って、特異的核酸配列を検出できる方法および組成物が必要である。特に必
要なのは、所望レベルの特異性を使用して核酸配列の単離が可能となる柔軟性を
与える方法および組成物である。また、核酸増幅技術を使用しないが、任意の量
、特に大量のサンプル核酸から、特異的標的配列の単離が可能であり、所望の特
異性のレベルに応じて、数レベルの特異性で単離を行える柔軟性を有する方法も
必要である。特に必要なのは、ＲＮＡ（核酸標的配列の源としてｍＲＮＡを含む
がこれに限定されない）を使用して標的配列を検出できる方法および組成物であ
る。 ＜本発明の要約＞ 様々な細胞および／または組織源から単離した標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列の、検出並びに定性および定量の両方の解析の
ための方法および組成物を記載する。方法は、安価であり、複数のレベルの特異
性に特異的であり、感度が高く、広範囲の量の核酸をアッセイでき、再現可能な
結果を生じ、最小限の手間が必要とされる。本発明の方法および組成物は、診断
および治療に、例えば、ウイルスなどの微生物および他の微生物およびヒト、動
物および植物の病原体の検出；ヒト、動物および植物における感染性疾患、癌お
よび転移の診断、血液製剤のアッセイ、および腫瘍の早期検出、法医学、親子鑑
定、組織または器官の移植および遺伝子疾患決定などの領域において使用する遺
伝子解析に使用できる。これらのアッセイはまた、食物、土壌、水、血液製剤お
よび空気品質試験の汚染検出に使用できる。

【００１２】 本発明の２つの実施形態は、制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）およ
び標的保護アッセイ（ＴＰＡ）を含む。本発明はまた、核酸の部位特異的切断の
ための新規な技術を含み、これはハロゲン化ヌクレオチド誘導体、好ましくはピ
リミジンまたはプリン類似体などの反応性基を有するカッタープローブ（ＣＰ）
を用いて核酸を切断することを含む。ＲＦＴＡは、特殊なプローブを使用した核
酸の選択的な制限開裂および検出を含む。ＴＰＡは、特殊プローブを用いた標的
配列の保護および検出を含む。 [カッタープローブ（ＣＰ）およびカッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）] カッタープローブは、核酸を切断するための新規な方法および組成物を含み、
核酸の開裂を必要とする任意の公知のアッセイに使用できる。好ましい方法は、
切断する標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含み、これには
、ハロゲン化ヌクレオチド誘導体などの反応性基が、標的の開裂部位に並置する
位置のプローブに組込まれている。例えば、置換ブロモウリジン（ＢＵ）が、チ
ミジンの代わりにプローブに組込まれると、相補的アデニンが標的核酸（反対の
鎖）の開裂部位となる。カッタープローブは特異的部位でＤＮＡまたはＲＮＡを
開裂するだけである。いくつかのチミジンがＢＵで置換されている場合、他の３
つの塩基と共にカッタープローブに存在する他のチミジン塩基は、配置および塩
基カッタープローブによる切断の特異性の基礎になる。カッタープローブは、標
的鎖に逆平衡な配列を有する。これらの新規なカッタープローブは、標的核酸の
存在を検出するためにカッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）において、または核
酸の開裂が所望である任意の他のアッセイにおいて使用できる。カッタープロー
ブの他の使用は、標的核酸の特異的部分の破壊および既知の点突然変異の検出を
含む。ＣＰの反応性基であるＢＵは、適当な形の特異的エネルギー、光エネルギ
ーまたは化学試薬により活性化され、標的配列が開裂する。

【００１３】 ＣＰは、本発明の新規なアッセイに使用し得る。さらに、標的配列が一旦、カ
ッタープローブと結合すれば、標的／プローブ複合体は、特異的ヌクレアーゼ分
解に耐性となり、ＴＰＡにおいてＰＮＡＳ、保護標的核酸構造（protected targ
et nucleic acid structure）（ＰＮＡＳ）およびＲＦＴＡにおいて部分的二本 鎖標的プローブ複合体（ＰＤＴＰ）を形成する。

【００１４】 カッタープローブは、１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／
０７５,８１２、１９９８年５月５日出願の６０／０７６,８７２に開示され、そ
の両方をそれぞれの全体を本明細書に取り込む。 [制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）] 制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）は、１９９７年１１月１２日出願
の米国仮特許出願番号６０／０６５,３７８、および１９９８年２月２４日出願 の６０／０７５,８１２に開示され、その両方についてそれぞれの全体を本明細 書に取り込む。

【００１５】 一般に、ＲＦＴＡは、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ標的の検出に使
用し得る。好ましくは、ＲＦＴＡ法および組成物は、少なくとも１つの一次プロ
ーブおよび少なくとも１つの第二プローブを含む。プローブは好ましくは一本鎖
である。一次プローブは少なくとも２つの部分を有し得る。一次プローブの少な
くとも１つの部分は、標的に相補的であり、一次プローブの少なくとも１つの他
の部分は第二プローブに相補的である。第二プローブは標的に相補的ではなく、
第二プローブに相補的な一次プローブの部分にのみ相補的である。追加の部分を
プローブに添加してもよい。

【００１６】 ＤＮＡおよびＲＮＡの両方へ適用される本発明のＲＦＴＡ法は、電気泳動分離
後に標的核酸を移行した後に膜ハイブリダイゼーションを利用する従来のＤＮＡ
またはＲＮＡブロッティング法に優る利点がいくつかある。ＲＦＴＡは、膜ハイ
ブリダイゼーションよりもかなり迅速で実施が簡便であり、技術的熟練および電
気または真空移行システム、ＵＶ架橋剤または真空オーブン、およびハイブリダ
イゼーションオーブンおよび水浴などの特殊装置の必要が少ない。ＲＦＴＡはま
た、膜ハイブリダイゼーションで利用した比較的大量で、比例的に遅いハイブリ
ダイゼーション速度を有するハイブリダイゼーションとは対照的に、はるかに少
ないプローブが、電気泳動前に少量でハイブリダイゼーションに利用される点で
、標準的ＲＦＬＰ解析よりも実施がかなり安価である。ＲＦＴＡには追加の特殊
電気泳動システムは全く必要でなく、利用可能な検出システムは全て、膜に作用
させる固定または乾燥ゲル上でより良好とはいわないまでも同等に作用する。さ
らに、ＲＦＴＡは膜ハイブリダイゼーションよりもより感度が高くあり得る。な
ぜなら、核酸転写または膜架橋が必要でなく、これは両方共、傷害または不十分
な転写による特異的シグナルの欠失をもたらし得るからである。ＲＦＴＡはＤＮ
Ａ増幅を利用しないので、ＲＦＴＡはＰＣＲを基本とした試験でしばしば見られ
る高い割合の非特異的シグナルの傾向がない。最後に、ＲＦＴＡは、数個のプロ
ーブを単一のサンプルを用いて同時に任意の電気泳動ゲル上で試験できる点で多
重性の利点を有し、数個のゲルの泳動および／または続く再プローブのためにす
でにハイブリダイズした膜を剥離するなどの（この両方共費用と時間のかかる方
法である）、複製単離段階を実施する必要がなくなる。

【００１７】 本発明の好ましいＲＦＴＡ法の１つの例は、以下の段階を使用する：１）標的
核酸を有するサンプル核酸の分離および精製；２）サンプル核酸の開裂による標
的核酸の切出し；３）二本鎖核酸サンプルの一本鎖への変性；４）所望の標的配
列の少なくとも一部に相補的な、少なくとも１つの標識された標的特異的一次プ
ローブと精製核酸サンプルの結合。プローブの標的核酸への自発的ハイブリダイ
ゼーションの可能な条件下で、プローブを過剰のモル量で加える。５）標的核酸
−プローブ複合体の単離；および６）標的核酸−プローブ複合体の検出。 [標的保護アッセイ（ＴＰＡ）] ＴＰＡ実施形態を含む方法および組成物は、二本鎖ヘアピンＤＮＡプローブと
一緒に一本鎖ＲＮＡの検出に用いることができる。ＴＰＡ実施形態の方法および
組成物は、分子生物学技術で一般的に使用されている成分および方法と一緒に使
用できる。さらに、ＴＰＡ実施形態は、ＣＰなどの新規核酸開裂技術と一緒に使
用できる。

【００１８】 中心で折り畳まれ二本鎖ＤＮＡ構造を形成するポリプリンまたはポリピリミジ
ンに富む配列を、好ましくは有する長さが可変の二本鎖ヘアピンＤＮＡプローブ
のインビトロ構成の好ましい、ＴＰＡ、ＲＮＡ−ＴＰＡの実施形態。 [ｍＲＮＡ ＴＰＡにおけるＴＦＯヘアピン捕獲プローブ] ｍＲＮＡにおいてポリピリミジンに富む領域を同定しなければならない。これ
は三重らせん形成のピリミジン・プリン・ピリミジンモチーフに要求されるため
必要である。二本鎖ＤＮＡヘアピン捕獲プローブは２つの部分を有することを特
徴とする：３'末端はポリプリンに富む領域であり、５'末端はポリピリミジンに
富む領域であり、両方の領域がヘアピンループを形成した伸縮により中間で接続
される。ヘアピン捕獲プローブはそれ自体が折り返され、ヘアピンを形成する。
また、３'末端は、３'末端に近いが３'末端ではない生化学的フック（ジゴキシ ゲニンまたはＤＩＧ）と複合体を形成する。 １．当業者に公知の任意の方法によるｍＲＮＡの単離および工程１の二本鎖ＤＮ
Ａヘアピンプローブによる特異的ｍＲＮＡ分子の結合。プローブ／標的配列は、
現段階で保護核酸配列（ＰＮＡＳ）である。独特なＲＮＡ標的部位は、ｍＲＮＡ
の３'ポリＡと５'ｍＲＮＡ末端（５'末端に近い）の間に位置する。これは第一 レベルの特異性である。 ２．標的ｍＲＮＡ分子の存在により三重らせんＰＮＡＳにならない任意の二本鎖
ＤＮＡプローブ分子を分解する、ＥxoIIIなどのヌクレアーゼの添加などによる 、二本鎖構造の除去。 ３．次いで、ＰＮＡＳを単離する。好ましい方法として、ＰＮＡＳは、当業者に
公知の方法を使用して固体基質に付着させる。かかる方法は、生化学的フックま
たは特異的結合対、例えばＤＩＧ（ジゴキシゲニン）およびビオチンおよび抗Ｄ
ＩＧの使用によりプローブ／標的複合体を磁気ビーズおよびストレプトアビジン
覆膜磁気ビーズに付着させることを含むがこれに限定されない。標的の長さは、
可変であり得、好ましくは８から２５ヌクレオチド塩基の間の範囲からキロベー
ス長さのセグメントである。 ４．標的の存在は、３'アデニンｍＲＮＡ分子にハイブリダイズする、好ましく は約２５ヌクレオチドの、リポータープローブ分子、好ましくはポリ（ｄｔ）オ
リゴにより同定する。各レポータープローブ分子は、リポータープローブ分子に
会合した、少なくとも１つのメンバーの結合基を有する。

【００１９】 コピー数の少ないＲＮＡ標的の存在を正確に決定する能力は、治療適用の助け
となり、間接的な方法による標的とする一本鎖ＤＮＡの存在の決定を可能にする
。

【００２０】 ＣＰ、ＲＦＴＡおよびＴＰＡの実施形態を含む、本発明の組成物は、本明細書
で教示する方法を実践するに必要な組成物を含む。例えば、ＲＦＴＡの方法に使
用する組成物は、標的配列に相補的な１つ以上のヌクレオチド部分および二次プ
ローブ配列に相補的な１つ以上のヌクレオチド部分を有する一次プローブ、およ
び標識二次プローブを含み得る。ヌクレアーゼおよび緩衝液と共に、選択した一
次および二次プローブを含む組成物またはキットが、本発明に含まれる。個々の
分子、プローブおよび成分はまた個々に提供できるものと理解されるべきである
。

【００２１】 従って、本発明の目的は、好ましくは様々なレベルの特異性で、ヒト、植物お
よび動物において特異的遺伝子配列を検出するための方法および組成物を提供す
ることである。

【００２２】 さらに別の本発明の目的は、カッタープローブを含む特異的な核酸開裂のため
の新規な方法および組成物を提供することである。 さらに別の本発明の目的は、一次および二次プローブを含む、特別に設計され
たプローブを含むＤＮＡ配列を検出するための方法および組成物を提供すること
である。

【００２３】 本発明の目的は、一次および二次プローブを含む、特別に設計されたプローブ
を含むＲＮＡ配列を検出するための方法および組成物を提供することである。 別の本発明の目的は、三重らせん構造の形成を含む核酸配列を検出するための
方法および組成物を提供することである。

【００２４】 さらに別の本発明の目的は、様々なレベルの特異性で、ヒト、植物および動物
において、特異的な遺伝子配列を検出するための方法および組成物を提供するこ
とである。

【００２５】 さらに別の本発明の目的は、ヒト、植物および動物における微生物または病原
体の同定の決定のために核酸配列を検出するための方法および組成物を提供する
ことである。

【００２６】 別の本発明の目的は、親子または種同定などの遺伝子関係の決定のために、ま
たは器官または組織のドナー可能性を決定するのために、核酸配列を検出するた
めの方法および組成物を提供することである。

【００２７】 別の本発明の目的は、法医学決定に使用するために、または血液供給を保護す
るために、核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。 さらに別の本発明の目的は、ヒト、植物および動物における遺伝子疾患の解析
のために、核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。

【００２８】 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の開示した実施例お
よび添付の請求の範囲の詳細な記載の参照後に明らかとなるであろう。 ＜詳細な説明＞ 本発明は、標的を含むと推定されるサンプルにおける標的核酸配列の検出のた
めの方法および組成物を含む。この方法および組成物は、ＲＮＡおよびＤＮＡ配
列の両方の直接的検出に必要な組成物および方法を含む。この方法および組成物
は、核酸量、好ましくはナノグラムからミリグラム量の範囲の核酸で、標的配列
を検出できる。アッセイの特異性を向上させる段階が、実施する順番に記載され
、これを特異性レベルと呼ぶ。本発明の方法および組成物は、診断および治療に
、例えば、ウイルスなどの微生物および他の微生物およびヒト、動物および植物
の病原体の検出；ヒト、動物および植物における感染性疾患の診断、血液製剤の
アッセイ、および腫瘍の早期検出、法医学、親子鑑定、組織または器官の移植お
よび遺伝子疾患決定などの領域において使用する遺伝子解析に使用できる。これ
らのアッセイはまた、食物、土壌、水、血液製剤および空気品質試験の汚染検出
に使用できる。

【００２９】 特異性は現在、ＤＮＡ診断において発達中の概念である。本明細書に使用した
ように、特異性レベルは、予期される最終結果を可視化するために起こらなけれ
ばならない単一事象として認識される。核酸診断において、これらの事象は以下
を含み得る： 特異的核酸制限反応； 特異的核酸プローブハイブリダイゼーション反応； ＰＮＡＳの固定基質への特異的結合；または シグナル可視化反応。

【００３０】 ＤＮＡ診断技術を再指向し向上する目標に向けて、追加の特異性レベルが前に
追加される。追加の特異性レベルは、プローブハイブリダイゼーションの結果と
した、標的のサイズを再度調節することにより標的のサイズを効率的に増加する
ことを含む。かかるレベルは、ゲルフォーマットを使用して、ＲＦＴＡの好まし
い実施形態に見られる。標的核酸のＣＰ部位特異的非酵素的開裂を含む本発明の
方法および組成物は、アッセイに２つのレベルの特異性を提供する利点がある。

【００３１】 本出願は、１９９７年１１月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／０６５, ３７８、１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／０７５,８１２ 、および１９９８年３月５日出願の米国仮特許出願番号６０／０７６,８７２の 優先権を主張し、これら全てについてその全体を本明細書に取り込む。

【００３２】 本発明は、公知の分子生物学的技術である方法および組成物を使用する。本発
明は、ヌクレアーゼ、プローブ、ハイブリダイゼーションスキーム、捕獲溶出法
、種々のサイズ検出法または検出付き溶出の組合せに関する。例えば、本明細書
に使用した核酸の単離は、当業者に公知の任意の技術により実施できる。単離お
よび精製法は、公知のSambrookらによる、Molecular Cloning；A Laboratory Ma
nual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1989)（これ は本明細書に引用により取り込む）の実験マニュアルに見られる。

【００３３】 他の公知の技術は、核酸の標識付けおよび検出のためのかかる標識の可視化を
含む。かかる標識は、レポーター分子と呼ばれ、標識を含むプローブのいくつか
はレポータープローブと呼ばれる。使用した標識は、現在入手可能な種類のいず
れかであってもよく、直接的な、例えば放射活性、または蛍光分子；間接的な、
例えばビオチン／アビジンまたはジドキシゲニン；酵素、例えば熱量測定および
／または蛍光基質と結合したアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ；
生物発光分子、または１つ以上のシステムの組合せであり得る。これらの例は、
唯一の検出法として限定するものではない。核酸またはプローブの任意の標識法
を本発明に使用できる。検出法は、標識システムに依存し、これは各個々の試験
の設計において選択する。

【００３４】 例えば、標識核酸は、蛍光を使用し得、核酸上に複数のＦＩＴＣ分子（フルオ
レセインイソシアネート）、または当業者に公知の任意の他の蛍光分子を配置す
ることにより達成できる。さらに、化学発光、生物発光、または化学蛍光（全て
酵素仲介）、放射活性または当業者に公知の他の標識は、シグナル増幅が検出の
特異性を増加するために必要とされる場合に使用し得る。ゲル可視化は、オート
ラジオグラフィー可視化のための放射活性、または化学蛍光または当業者に公知
のその他を利用し得る。ある方法は、走行後にゲルを、ＡＴＴＯＰＨＯＳＡＥ溶
液（Boehringer Mannheim）に配置することを必要とする。核酸上の標識である アルカリホスファターゼは、ＡＴＴＯＰＨＯＳＡＥと反応して蛍光を発生する。
特異的配列を直接的に検出する別の方法は、エクオリン生物発光（SeaLite Scie
nces,Inc.）を用いるものである。本発明は、１００ものシグナル増幅分子を、 当業者に公知の単一の標的にのせる能力を主張する技術に関する。

【００３５】 さらに、標的配列は、アッセイからの標的の単離により決定し得る。２つの公
知の技術が、サイズ分離技術または捕獲分子への結合による標的の取り出しを含
む。これらの２つの技術は、それぞれ、本明細書でゲルフォーマットおよび試験
管（テストチューブ）フォーマットと呼ぶ。

【００３６】 ゲルフォーマットは、サイズ分離による単離を含み、試験管フォーマットの捕
獲法のような、生化学的フックおよび固体基質を使用しない。代わりに、標的／
プローブ複合体を、任意の実行可能な方法で、標的／プローブ複合体をサイズ分
類することにより単離する。好ましい方法は、ゲル電気泳動であるが、他のサイ
ズ分類技術、例えばクロマトグラフィーまたは分画遠心分離も本発明において考
慮する。

【００３７】 一般に、標的／プローブ複合体は、これに限定するものではないが、通常、ポ
リアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動、またはキャピラリーゲル電気
泳動により、ハイブリダイズしていないプローブからサイズ分離する。特異的標
的／プローブ分子は、特異的核酸プローブ上に配置した標的により同定する。

【００３８】 標的／プローブ複合体の期待されるフラグメントサイズ、従ってゲル上でそれ
が移動する位置を計算できる。計算の記載は、Sambrook らなどの多くの標準的 な文献に見られる。一定時間後の既知サイズのフラグメントの期待される移動距
離は、ゲルの型およびゲルの走行に使用した電流量を考慮することにより計算で
きる。この移動は、所望の標識部分の遅延係数（Ｒｆ）を反映する。Ｒｆは、、
添加点から、所望の複合体のゲル上での移動点までの距離を、ゲルにより遅延さ
れない小分子の移動（通常ダイ前端）で割ったものとして定義される。別の言葉
でいえば、プローブ／標的複合体のＲｆは、ダイ前端の移動距離で、プローブ／
標的複合体の移動距離を割ったものと定義される。ダイ前端は同一条件下で同様
に移動する事実から、Ｒｆは一般に定数であるので、複合体のＲｆは標的／プロ
ーブ複合体の移動距離に比例する。

【００３９】 独特（決定的）なゲル位置への移動により、プローブ／標識複合体のサイズだ
けではなく、標識の存在のために、１つの追加の特異性レベルが追加される。標
識プローブを有する標的配列は、類似のサイズであり、ゲル上の同位置で走行す
る、他の非標識、非標的核酸配列により検出が妨害されることなく、特異的サイ
ズで検出できる。標識／プローブ複合体は、当分野で公知の方法によりゲルで可
視化する。

【００４０】 試験管フォーマットは、ＤＩＧまたはビオチン／ストレプトアビジン、酵素／
基質、または抗体／抗原などの特異的結合対を使用する。これらの結合対もまた
、生化学的フックと呼ばれる。結合対の一方は、他のプローブまたは標的配列に
結合する通常捕獲プローブと呼ばれるプローブ、またはプローブの一部に結合す
る。他方の結合対のメンバーは、固体支持体表面、または捕獲分子を溶液から分
離するために使用できる表面、例えば磁気ビーズに付着する。固体支持体は、プ
ラスチックプレート、シリコン化プレート、およびプラスチックビーズを含むが
これに限定されず、それらから標的をさらに解析するために開裂または溶出でき
る。これにより単一のアッセイで１つ以上の標的の解析が可能となる。

【００４１】 本発明の２つの好ましい実施形態は、制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴ
Ａ）および標的保護アッセイ（ＴＰＡ）を含む。さらに、本発明において、各実
施形態は、ハロゲン化ヌクレオチドなどの反応性基を有するカッタープローブ（
ＣＰ）を用いて核酸を開裂する新規な方法および組成物と共に使用し得ると考え
られる。ＣＰの方法および組成物はまた、核酸の開裂を所望する任意のアッセイ
で使用できる。 [核酸配列を切断するためのＣＰの方法および組成物] 本明細書に使用したように、ＣＰは、活性化時にフリーラジカルを形成する反
応性基を有する核酸プローブを意味する。好ましくは、反応性基は、ハロゲン置
換ヌクレオチド誘導体、好ましくは臭素または塩素、最も好ましくはハロゲン置
換ピリミジン誘導体であるが、任意のヌクレオチドをハロゲン置換し得る。しか
し、機能的等価分子、すなわち、高い効率で核酸鎖の糖−リン酸骨格を開裂する
後エネルギーを付与する２つのフリーラジカルの産生により特徴づけられるもの
は、用語ＣＰに含まれると考える。本発明はまた、複数鎖の複合体において、ヌ
クレオチドのリン酸糖骨格を開裂するに十分なフリーラジカルを生成する分子を
含む。用語ＢＵ（ブロモウラシル）は、理解し易くするために本明細書において
使用し、プローブ分子において使用できる化合物として限定するものではない。
用語ＢＵまたはＣＰにより考えられる他の可能な反応性基は、クロロウラシル、
ブロモシトシンおよびクロロシトシンを含み、これは活性化時にフリーラジカル
を生成することが知られている。

【００４２】 かかるプローブの使用例は、エネルギー付与５'ブロモウラシル（ＢＵ）含有 プローブを付与することを含む。ウラシルフリーラジカルが形成され、高頻度で
、ＢＵに並置する核酸鎖を制限するであろう。

【００４３】 臭素フリーラジカルは、低頻度で反対の核酸鎖を制限する。これらの方法にお
いて、キレート形成ダイ（intercalating dye）の添加により、ブロモウラシル 活性化が引き起こされ、臭素フリーラジカルが生成し、高頻度で反対の鎖を開裂
する。

【００４４】 本発明の方法および組成物は、カッタープローブを用いた標的核酸の開裂を含
む。標的核酸は、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であり得る。好ましくは
、ＣＰは一本鎖であるが、他の形または会合構造も本発明に考慮する。新規なカ
ッタープローブを、カッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）において使用して、標
的核酸の存在を検出できる。カッタープローブの他の使用は、標的核酸の特異的
部分の破壊および既知の点変異の検出を含む。

【００４５】 核酸標的の制限は、以前、これは、制限エンドヌクレアーゼを用いて達成され
、使用した酵素に特異的な配列でおよび制限部位がゲノムに存在する場所でのみ
核酸を切断する。このように核酸を制限することは、制限配列が、常に、保存さ
れた核酸標的領域の所望の位置にに見られないため限られる。さらに、多くの制
限酵素が、例えば開裂用に塩基のメチル化を要求するなど、独特な要求を有する
。本発明の方法にはかかる拘束がない。

【００４６】 本発明は、反応性基を含むように変化した、新規ヌクレオチドの使用を含み、
これは活性化時に、例えば、特異的エネルギーまたは化学試薬が作用することに
より、核酸鎖に特異的な破壊が引き起こされる。本発明は、二本鎖破壊を引き起
こせる任意のＵＶエネルギーまたは他の周波数の使用に関する。さらに、本発明
は、核酸配列に組込めるか、または複合体を形成でき、光または他の刺激の曝露
時に核酸の一方または両方の鎖に破壊を引き起こせる、任意の光反応性化合物（
臭素および塩素を含むがこれに限定されない）の使用を考える。

【００４７】 ＣＰの方法および組成物は、切断する標的配列に相補的なプローブ配列を使用
する。カッタープローブにおいて、反応性基、例えばハロゲン化ヌクレオチド誘
導体を、標的の開裂部位に並置する位置のプローブに組込まれている。例えば、
ブロモウリジンが、チミジンの代わりにＣＰに組込まれると、相補的アデニンが
標的で開裂する。カッタープローブは所望の部位でＤＮＡまたはＲＮＡを開裂す
るだけである。いくつかのチミジンがＢＵで置換されている場合、プローブ分子
の相補配列は、標的上の配置の特異性およびカッタープローブによる特異的部位
開裂の基礎を形成する。

【００４８】 好ましい実施形態はブロモウリジンを使用する。ＢＵを有するＣＰの活性は、
ブロモウラシル置換ＤＮＡの光感受性に基づく。ＢＵ置換ＤＮＡは、短波長ＵＶ
２５４ｎｍから長波長ＵＶ３１３ｎｍおよびさらには３１３ｎｍ以上の高強度の
可視光領域およびＸ線およびγ放射を含む範囲の光により開裂できる。特定の理
論と関連づける意図はないが、上記の型のエネルギーはハロゲン化ピリミジン（
ＢＵ）を２つのフリーラジカル（臭素フリーラジカルおよびウラシリルフリーラ
ジカル）に変換すると考えられる。ウラシリルラジカルは、ＢＵが取込まれた鎖
上の糖リン酸骨格および上流および下流の２つの隣接する塩基を破壊し、並びに
、臭素フリーラジカルは、標的鎖の糖リン酸骨格を破壊する。ブロモウリジン塩
基での二本鎖破壊効果は、２５４ｎｍで顕著である。しかし、インビボでは、チ
ミンダイマーは補助反応を形成する傾向がある。本発明のインビボ法において、
チミンダイマーを所望でない場合、好ましい実施形態は、３１３ｎｍのＵＶ光波
長を使用する。インビトロシステムにおいて、チミンダイマーが適用に全く損傷
を与えない場合、約２５４ｎｍのＵＶ曝露が好ましい。

【００４９】 塩基カッタープローブを使用する利点は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子上の所望の
部位で、標的を制限することである。これにより、標的を含むことが疑われるサ
ンプル核酸の、標的の正確なサイズでの切断が可能となり、標的の端を決定でき
る。かかる切断により、５'または３'突出のない平滑末端標的が得られる。

【００５０】 ＣＰの方法および組成物の実施形態は、図１に示す。ＤＮＡまたはＲＮＡの一
本鎖標的（５０）は、少なくとも１つの一本鎖カッタープローブ（５４、５６）
とのハイブリダイゼーションにより開裂する。ＢＵは、プローブ（５４、５６）
のチミンを置換し、これは標的における開裂されるアデニンに並置する。活性化
時に、ＢＵは標的（５０）のアデニンと相互作用する。ＢＵ含有プローブ（５４
、５６）が標的核酸鎖（５０）上の特異的領域にハイブリダイズした後、標的／
カッタープローブ複合体を、ＵＶ光に曝露する。光曝露により、プローブ（５４
、５６）上のＢＵ挿入部位、および反対の標的核酸鎖（５０）上の並置部位の両
方で鎖破壊が生じる。

【００５１】 プローブのＢＵ分子は、互いに隣に位置しているか、または任意の位置でプロ
ーブ中に分散して得る。この技術を使用して、選択的に任意の部位で核酸を切断
できる。切断は、特異的配列でのみ切断する制限エンドヌクレアーゼにより認識
される部位に限定されない。この新規な方法を用いて、非酵素的であるが、配列
特異的な核酸切断が、標的の両端において可能である。別に、ＣＰは標的に相補
的でもよく、ＣＰの活性化により二本鎖標的／プローブ複合体が切出される。本
発明は１つまたは２つのＢＵ部位の使用に限定されず、完全切断は、２つ以上の
隣接するＢＵ分子を含み得る。 [核酸のＫｂ長セグメントの制限および保護] 本発明の別の実施形態において、図２に示されるように、標的核酸配列（５０
）を含むことが疑われる二本鎖ＤＮＡサンプル（６４）を、ＣＰ（５４、５６）
と使用できる。サンプル配列（６４）は変性、次いでＣＰ（５４、５６）とのハ
イブリダイゼーションにより分離する。ＣＰの活性化により、制限部位１および
制限部位２での全標的の制限が生じる。Ｄ段階において、ＣＰは標的の一方の側
上にあり、切出し一本鎖標的を生じる。 [一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ標的でのＣＰの好ましい実施形態] カッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）は自動化および小型化が可能であり、高
い特異性および高い感度を有する結果を提供する。なぜなら、最低３の特異性レ
ベルがこのフォーマットで可能であるからである。この技術は、広範囲の量の核
酸を処理でき、しかも非常に高い感度を保証する。さらに、所望であれば、ＣＰ
Ａにより創製された標的／プローブ複合体を、ＰＣＲ、前記した他の増幅技術、
およびＤＮＡ−チップアレイなどの他のＤＮＡ解析技術と共に使用できる。

【００５２】 好ましいＣＰＡ３段階法は以下である： １）サンプル一本鎖核酸を単離し； ２）カッタープローブとハイブリダイズし、制限し、プローブ／標的複合体を
形成し； ３）標的を単離および検出する。

【００５３】 標的の単離は、任意の公知の技術により、好ましくは試験管フォーマットまた
はサイズ分離により達成され得る。 標的／プローブ複合体の単離のための試験管フォーマットを使用するＣＰＡは
、図３に示し、ＲＮＡまたはＤＮＡに使用できる。１つ以上の配列特異的ＣＰを
任意のアッセイで使用できる。図３のＡにおいて、試験するサンプル核酸（６４
）を、単離および精製する。図３に示した例において、サンプルはＤＮＡ（６４
）である。サンプルは、ＲＮＡでもよく、これは通常一本鎖である。

【００５４】 図３、段階Ｂにおいて、ＣＰオリゴ（５４、５６）を、設計し、標的配列およ
び所望の開裂部位（群）に基づいて製造した。ＣＰ−アンカー（５６）は、任意
の位置で複合体を形成した生化学的フックを有する。ＣＰ−リポーター（５４）
は、任意の位置で複合体を形成したリポーター分子を有し、標的／プローブ複合
体可視化を助ける。

【００５５】 段階Ｃにおいて、標的を含むと推定されるサンプル核酸を、それが二本鎖であ
る場合、変性させる。 段階Ｄにおいて、以下の成分をハイブリダイゼーションの可能な条件下で混合
する：変性サンプル核酸；カッタープローブ対；およびＣＰアンカー／標的複合
体の結合のための固定基質、例えば抗ＤＩＧ（８８）で覆膜した磁気ビーズ（７
２）。ＣＰリポーター（５４）上の標識は、アステリスクで示す。約３１３ｎｍ
でのインビトロでのＵＶ照射は標的（５０）を制限する。

【００５６】 図３の段階Ｅは、複合体の固体基質（７２）へのアンカリングを示す。一旦結
合すると、制限された標的／プローブ複合体は、高分子量ゲノムＤＮＡ、一本鎖
ＤＮＡ（変性）またはＲＮＡ標的から容易に分離する。例えば、アンカー捕獲分
子（８８）を介して付着した標的／プローブ複合体を有する磁気ビーズ（８）を
、十分に洗浄した。２つのプローブ（５４、５６）を有する標的（５０）はＰＮ
ＡＳ（９０）である。

【００５７】 段階Ｆにおいて、ＣＰ−リポーター（５４）からのシグナルを増幅する。 好ましい実施形態において、各アッセイは、カッタープローブアンカー対（Ｃ
Ｐ−アンカー対、ＣＰ１）と呼ばれる２つのカッタープローブ、および、カッタ
ープローブリポーター対（ＣＰ−リポーター対、ＣＰ２）と呼ばれる２つのリポ
ータープローブを使用する。

【００５８】 カッタープローブアンカー対は、標的配列の一部のみに結合できることを特徴
とする。図３に示したＤＮＡアンカープローブ（５６）は５'末端にブロモウラ シル塩基およびプローブの他の塩基と複合体を形成しているジゴキシゲニン（Ｄ
ＩＧ）またはアンカー分子を有する。アンカー捕獲分子（８８）は抗ＤＩＧであ
る。

【００５９】 カッタープローブリポーター対（５４）は、ＣＰ−アンカー対が結合できない
配列である、一本鎖ＤＮＡ標的の残りの一部に結合できることを特徴とする。 どちらかのＣＰ対が、相補的一本鎖ＤＮＡ標的または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ標的の変性鎖またはＲＮＡ標的に結合する。

【００６０】 示した特異的成分を例えば使用し、本発明はかかる特定の例には限定されない
と理解する。上記のプローブは、長さが可変である。また、図１Ｂおよび１Ｃに
示すように、追加の特異性レベルがＣＰＡアッセイにおいて必要である場合、よ
り多くのカッタープローブ（５８、６０、６２）を追加でき、各プローブは追加
の特異性レベルに寄与している。

【００６１】 ＣＰＡは、その中に構築された複数の特異性レベルを有し、以下を含む： １．ＢＵＣＰ−アンカー対（ＢＵＣＰ１）（５６）の結合 ２．ＢＵＣＰ−リポーター対（ＢＵＣＰ２）（５４）の結合 ３．標的／プローブ複合体の捕獲（標的−制限および保護される）：ＤＩＧ／
抗ＤＩＧ磁気ビーズ相互作用。

【００６２】 さらに、ＢＵＣＰ−アンカープローブ（５６）およびＢＵＣＰ−リポータープ
ローブ（５４）は非相補的であり、標的配列（５０）それ自体は、これらのプロ
ーブの両方に連結する核酸セグメントであるという事実は、低バックグラウンド
の高特異的アッセイを提供する。

【００６３】 一本鎖標的ＤＮＡ（変性一本鎖ＤＮＡ）またはＲＮＡ標的の検出感度は、現段
階の二本鎖標的／プローブ複合体および他の一本鎖ＤＮＡ／ゲノムＤＮＡを、Ｓ
１またはヤエナリ・ヌクレアーゼなどの酵素、または一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖
ＲＮＡを３'−５'の方向に分解する、類似の機能をもつ任意の他の酵素での処理
により向上できる。一旦、プローブが標的に結合すれば、標的／プローブ複合体
は保護核酸構造（ＰＮＡＳ）となり、これらの酵素による分解に対して耐性とな
る。このヌクレアーゼ処理は任意であるが、その使用は本発明に考慮され、必要
時にアッセイの感度を増加させ、実施するアッセイに依存する。 [サイズ分離を使用したＣＰＡ] ゲルアッセイフォーマットのこの好ましい実施形態は、図３の段階Ｆでの試験
管フォーマットと異なる。ゲルアッセイフォーマットは、以下のレベルの特異性
で形成される。 １．ＣＰ−１、アンカー分子、ＤＩＧ等の結合は必要ないが、プローブ（５６）
は標的（５０）を保護および制限する。 ２．ＣＰ−２、リポーター分子の結合は必要ないが、プローブ（５４）は標的（
５０）を保護および制限する。 ３．ゲルの泳動、制限標的（５０）は予測可能な距離Ｒｆに移動する。または上
記で議論した任意のサイズ分離技術を使用する。追加の特異性レベルが必要であ
れば、２つのＣＰを、縦にハイブリダイズして標的を保護および制限する３つの
プローブに断片化することにより導入できる。図１はこのプローブ断片化（５８
、６０、６２）を示す。 [三重らせんが形成されるＣＰＡの実施形態−ＴＦＯ（図４）] この実施形態において、標的配列（５０）は二本鎖であり、プローブ（６８）
は一本鎖である。プローブ（６８）が標的配列にハイブリダイズした場合、プロ
ーブ（６８）は三重らせん構造を形成する。かかるプローブは三重らせん形成オ
リゴヌクレオチド（ＴＦＯ）と呼ばれ、特異的二本鎖遺伝子セグメントの切出し
に使用できる。プローブは、（非共有結合的に）二本鎖標的のいずれかの鎖と会
合できる。この実施形態はインビボおよびインビトロで遺伝子の切出しに使用で
きる。

【００６４】 特異的二本鎖遺伝子セグメント（二本鎖ＤＮＡ）の切出しは、遺伝子療法およ
び生物工学の分野の出現により幅広い関心を集めている。これらの方法における
ＤＮＡの非酵素的制限は、ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ制限の使用以上に、新規
かつ有益である。エンドヌクレアーゼ制限は、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）
による４−８の塩基の制限／認識部位を必要とし、これは配列を切断したい場所
に位置していないかもしれない。ブレオマイシン、ＥＤＴＡおよびその他などの
大きな電気的に陰性の分子が、核酸に付着し、ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドへの付着により特異的な微量塩基カッターを生
成する方法を提供するために使用し、ブレオマイシンまたはＥＤＴＡが一本鎖Ｄ
ＮＡに近接していることからＤＮＡ鎖の切断が生じる。

【００６５】 電気的陰性形のＤＮＡ切断に関する問題は、遺伝子セグメントを切出すために
、二本鎖ＤＮＡを変性、切断、および再生する必要性および高度に電気的に陰性
な切断分子の調節不可能な反応性から、複数である。これらの分子は、特異的部
位へのプローブハイブリダイゼーションの前に、それ自体および非特異的ＤＮＡ
部位と反応し得る。

【００６６】 例えば、インビボおよびインビトロでの遺伝子切出しのための、本発明の新規
な方法および組成物は、ＣＰの形である、ＴＦＯの使用により達成される。イン
ビトロで、独特な二本鎖ＤＮＡセグメントに特異的なＴＦＯを、数倍過剰に加え
てＤＮＡとハイブリダイズさせる。ＴＦＯは、ヘリックスの大きな溝に存在し、
ここでフッグステイン結合（弱い水素型結合）により結合している。本発明の１
つの実施形態において、ＴＦＯはＢＵ−ＴＦＯと呼ばれるＢＵで置換された２つ
の末端チミン塩基を有するオリゴヌクレオチドである。

【００６７】 ＢＵ−ＴＦＯ保護標的／プローブ複合体の、約３１３ｎｍのＵＶ、または臭素
原子を励起しフリーラジカルを生成する任意の波長での処理は、短い二本鎖切出
しのためにＴＦＯの両端で二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。

【００６８】 図４Ｂで示した第二の実施形態において、大きい二本鎖ＤＮＡセグメントは２
つのＢＵ−ＴＦＯの使用により切出すことができる。ＤＮＡの大きな部分のフラ
ンキング領域を、ＣＰまたはＴＦＯにハイブリダイズさせる場合、全ＤＮＡ区分
は核酸分解から保護される。

【００６９】 ＢＵ−ＴＦＯカッタープローブのインビボへの適用には、変更された塩基から
なるＢＵ−ＴＦＯを用いて細胞をトランスフェクションすることが必要であり、
細胞膜結合ＤＮＡヌクレアーゼにより認識されない。インビボで２つの形のＢＵ
−ＴＦＯが染色体部位に結合した後、より透過型のエネルギー、例えばＢＵ増感
効果にも関与することが示された低用量のＸ線で放射を行う。

【００７０】 これらの制限法およびカッタープローブ組成物はまた、インビボおよびインビ
トロにおける遺伝子破壊にも使用され、ＴＦＯの結合形は遺伝子切出しプロセス
における結合と類似している。この実施形態は図５に示す。多くのおよび近い空
間配置をとる反応性基、例えばＢＵが、ＴＦＯを通じて存在し、照射後、目的物
でない核酸配列が消去され、通常細胞破壊がもたらされる。

【００７１】 本発明の別の実施形態は、ＢＵ置換分子を用いて、細胞性ｍＲＮＡまたは他の
ＲＮＡを標的化することである。これにより、ＢＵ−カッタープローブは、部位
選択的開裂のために特異的ＲＮＡ分子に結合する。臭素および他のフリーラジカ
ルの生成により、ｍＲＮＡ翻訳機能が破壊され、細胞は生存し続けるが、破壊さ
れた特異的ｍＲＮＡ集合は存在しない。ＢＵ−ＣＰは、ＢＵ−ＣＰプローブを用
いると、ＲＮＡが削除され、一方、アンチセンスＤＮＡを用いると、ＲＮＡは依
然として存在し、ＤＮＡにほとんど結合しないという点から、アンチセンスＤＮ
Ａよりも利点がある。結合条件は変化し得、ＲＮＡは依然として、翻訳または他
の機能に関しては存在する。 [ＴＦＯを用いた点突然変異の検出] カッタープローブの組成物および方法の別の実施形態は、文書化された点変異
の検出である。点突然変異を検出するためにＣＰを使用する例を表１に示す。こ
の方法の１つの実施形態は、標的配列を得るために、点変異を含むと推定される
サンプルＤＮＡの変性および制限を含む。この制限は、任意の公知の制限法、ま
たはより好ましくは、２つのＣＰを使用して達成され、点変異部位を含むと推定
されるＤＮＡの小セグメントを単離する。第三ＣＰを使用して標的配列をハイブ
リダイズする。表１に示されるように、点変異が存在する場合、第三ＣＰの照射
により、標的配列およびＣＰ複合体に開裂が引き起こされる。点変異が全く存在
しない場合、開裂は全く生じない。次いで、サンプルをゲル上で走行させ、可視
化して、複合体が開裂したかを決定する。点変異の有無を可視化する１つの方法
は、標識配列に結合するＣＰを標識することである。

【００７２】

【表１】 [制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）] 本発明の制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）は、直接的にＲＮＡまた
はＤＮＡ標的を検出する。標的は一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＦＴＡ法は
、少なくとも１つの一次プローブおよび少なくとも１つの二次プローブを使用す
る。全プローブは一本鎖である。一次プローブは少なくとも２つの区分を有する
。一次プローブの少なくとも１つの区分は標的に相補的であり、一次プローブの
少なくとも１つの区分は第二プローブに相補的である。二次プローブは標的に相
補的ではなく、二次プローブに相補的であるように設計された第一プローブの区
分にのみ相補的である。追加の区分を一次プローブに追加してもよい。追加の区
分は標的または第二プローブのいずれかに相補的であり得る。

【００７３】 一旦プローブ／標的複合体が形成されると、サイズ分離または生化学的フック
によりおよび、試験管フォーマットの固体支持体への結合により単離できる。両
方の単離法を上記する。

【００７４】 ＴＰＡおよびＲＦＴＡなどの技術は、ミリグラム量の核酸から、ナノグラム、
ピコグラムおよびさらに少量の標的（フェムトモルまで）を解析できる。本発明
の実施形態はまた、非常に小さいサンプルにおけるコピー数の少ない核酸または
他の標的を同定する。大量の核酸を処理する能力は、現在のマイクログラムの解
析技術からの急進的な逸脱であり、従ってＤＮＡ技術は非常に向上する。 [ＤＮＡ ＲＦＴＡ適用] ＲＦＴＡは、感染性物質の同定のためのＤＮＡ配列の簡単な検出から、組織適
合性抗原の遺伝子型、ウイルス株型、または遺伝子疾患試験などの細かいＤＮＡ
配列解析が所望である、より複雑な適用までの様々なＤＮＡ診断適用に使用でき
る。細かいＤＮＡ配列差異は、配列特異的プローブ自体を使用して、または最初
の消化段階で使用した制限エンドヌクレアーゼの選択において、またはその両方
の組合せで決定でき、後者の方法ではハイブリダイズした制限フラグメントのサ
イズが変化する。ＲＦＴＡはまた、可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）の差異、
並びに制限フラグメント多形（ＲＦＬＰ）法のこの修飾を使用してサンプル間で
の小タンデム反復（ＳＴＲ）マーカーを決定するために使用できる。ＲＦＬＰ法
は現在、ハイブリダイゼーション用膜を使用して、法医学および親子鑑定を実施
、並びに骨髄移植の成功も評価する。下記の開示は、ＤＮＡ用の方法および組成
物の適用を指向するものであるが、ＲＮＡもまた考えられ、ＲＮＡ適用の修飾は
下記に示す。

【００７５】 ＤＮＡ ＲＦＴＡ実施形態の例は、図６および７に示す。図６は、段階Ａ−Ｇ を示す：段階Ａ、サンプルＤＮＡの単離および精製；段階Ｂ、サンプルＤＮＡか
らの標的配列５０の放出、段階Ｃ、二本鎖核酸サンプル配列の変性；段階Ｄ、標
識一次プローブ７４を用いた標的配列５０のハイブリダイゼーション；段階Ｅ、
二次プローブ７６を用いたハイブリダイゼーション；段階Ｆ、別の二次プローブ
７８を用いたハイブリダイゼーション；および段階Ｇ、サイズ分離による単離。
次いで、得られた構造を、好ましくはゲル電気泳動を使用して、解析ゲルに適用
し、標識バンドのＲｆを決定する。

【００７６】 標的／プローブ複合体をゲル電気泳動により単離する場合、ＲＦＴＡに記載し
た特異性レベルは：１）５'標識切出し機構、２）３'標識切出し機構（最初の標
識切出し機構と異なる場合、追加の特異性レベル）；３）標識を有する一次プロ
ーブ（７４）；４）二次プローブ（７６）；５）二次プローブ（７８）；および
６）予測可能な移動（複合体のＲｆ）である。追加のプローブは、断片化でき、
特異的配列に追加して特異性レベルをさらに増加できる。 [ＤＮＡ ＲＦＴＡの段階および考察は図６に記載：] 段階Ａ：サンプルＤＮＡ源：ＤＮＡの単離および精製 本発明の制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）は、サンプルに存在する
標的ＤＮＡ配列を検出する。方法は、標的を含むことが疑われる源からのＤＮＡ
サンプルの精製を使用する。源は、細胞、組織、細胞小器官、血清、水および他
の液体を含むが、これに限定されない。宿主またはサンプルＤＮＡは、高分子量
ゲノムＤＮＡの形であり得る。精製は、当業者に公知の多くの方法のいずれか１
つであり得るか、またはかかる目的のために意図された増幅ＤＮＡを使用し得る
。 段階Ｂ：ＤＮＡ ＲＦＴＡの標的核酸の切出し 次いで、精製サンプルを開裂して、標的核酸配列（サンプル中に存在する場合
）を切出す。標的核酸の切出しは、ＲＦＴＡ法の第一の特異性レベルである。

【００７７】 切出しは、いくつかの異なる方法のいずれか１つで達成できる。１つの方法は
、１つ以上の配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる消化を含み、その制限部
位は標的核酸の境界をなすことが知られている。追加の特異性レベルは、最初の
制限エンドヌクレアーゼとは異なる部位で標的を切出す第二エンドヌクレアーゼ
の使用により添加できる。

【００７８】 他の型のヌクレアーゼ、例えば非特異的エンドヌクレアーゼも使用し得る。例
えば、核酸はリボザイム、リボヌクレアーゼを使用する方法、または他の方法を
使用して開裂し、核酸を開裂できる。１つ以上のエンドヌクレアーゼまたは他の
型のヌクレアーゼの選択は、標的配列および実施する個々の試験設計に依存する
。

【００７９】 他の方法を、ＤＮＡのヌクレアーゼ切断の代わりに利用可能である。本発明の
新規な試みは、任意の部位でＤＮＡおよびＲＮＡを選択的に切断するための前記
したカッタープローブ（ＣＰ）である。切断は、特異的配列でのみ切断するエン
ドヌクレアーゼにより認識される部位に限定されない。 段階Ｃ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける変性 一旦サンプル核酸が標的核酸の切出しを受けると、全サンプルＤＮＡを、熱、
イオンまたは塩条件、水酸化物、またはｐＨ条件などの公知の方法を使用して、
個々の相補鎖に変性する。 段階Ｄ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける一次プローブのハイブリダイゼーション 図６に示すように、変性後、サンプルＤＮＡをハイブリダイゼーションの可能
な条件下でプローブと結合させる。好ましい実施形態において、３つのプローブ
、一次プローブおよび２つの二次プローブを、ＲＦＴＡ法で使用する。一次プロ
ーブは、標的に排他的に結合するように特別に設計されているので、標的がサン
プルに存在する場合にのみ、一次プローブは結合する。本発明は標的およびプロ
ーブサイズは可変であると考える。

【００８０】 ａ）一次プローブの設計 一次プローブ（７４）の設計の考察は、一方のサンプル鎖（ワトソンまたはクリ
ック鎖として知られ、図ではＷまたはＣと略す）または両方のサンプル鎖を、本
発明において標的鎖（５０）として使用し得る。両方の鎖の使用により、シグナ
ルは２倍増幅する。後者の実施形態は、特定の標的核酸鎖（５０）に特異的な鎖
特異的一次プローブ（７４）の使用を必要とする。

【００８１】 一次プローブ（７４）は、１つ以上の部分を有し得る。好ましい実施形態にお
いて、一次プローブは３つの部分を有する。第一部分（８０）は、配列相同性ま
たは他の手段により、二次プローブ（７６）（標識していてもしていなくてもよ
い）に結合できる。一次プローブ（７４）のこの第一部分（８０）は、配列相同
性または他の手段により、標的核酸配列（５０）に結合できず、最初の二次プロ
ーブ（７４）に結合する。一般に一次プローブ（７４）の中間付近にある第二部
分（８２）は、配列相同性または他の手段により、標的配列（５０）に結合でき
る。この実施形態において、一次プローブ（７４）の第三部分（８４）は、配列
相同性または他の手段により、別の二次プローブ（７８）（標識していてもして
いなくてもよい）に結合できる。二次プローブは標的配列に結合できない。

【００８２】 あるフォーマットにおいて、一次プローブ（７４）の第一（８０）および第三
（８４）部分の一方または両方は、付着した、標識などのリポーター分子を有す
る。リポーターはシグナル増幅を向上させるために伸長または短縮し得る。

【００８３】 １つ以上の配列同定が所望である解析において、異なる標的領域への結合のた
めに異なる配列を有する複数の一次プローブを、同時に、反応混合物に使用する
（多重）。これらのプローブは、互いに相補的ではない。使用したプローブの数
は、当業者には公知である、捕獲−検出、分離および検出の可能な方法により制
限される。

【００８４】 一次プローブは、ＲＦＴＡ法において、第三の特異性レベルである。 ｂ）標識プローブ プローブは、放射活性、蛍光、または当業者に公知の任意の他の検出法を使用し
て検出分子を用いて標識し得る。１つの実施形態において、一次プローブを、そ
の全長に沿って、どれだけ多くの異なる部分が一次プローブを含むかにかかわら
ず、標識する。

【００８５】 ｃ）一次プローブのハイブリダイゼーション 一次プローブ（７４）を、自発的反応を確かにするために、モル過剰量で変性サ
ンプルＤＮＡを配置させる。次いで、一本鎖サンプルＤＮＡおよびプローブをハ
イブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、遅延冷却、イオン調整、または
ｐＨ中和などの公知の方法により行い得る。これはアッセイの第三の特異性レベ
ルである。 段階Ｅ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける最初の第二プローブのハイブリダイゼーショ ン 図６、段階Ｅで示すように、次いで、最初の第二プローブを一次プローブにハ
イブリダイズさせる。第二プローブ（７６）は、標的を知らせるために使用し、
従って、標識され、これはリポータープローブである。二次プローブは、オリゴ
ヌクレオチド（一本鎖ＤＮＡ）配列、通常、しかし限定的ではないが、１０−２
５ｍｅｒプローブからなる。ゲルフォーマットにおいて、二次プローブを十分に
標識し得る。各二次プローブは、ＲＦＴＡ法に別のレベルの特異性を追加する。
好ましい実施形態において、２つの二次プローブを使用し、それぞれ、第四およ
び第五の特異性レベルである。

【００８６】 二次プローブ（７６）および一次プローブは同時に加えることができ、モル過
剰量で変性サンプルＤＮＡとハイブリダイズさせる。別に、二次プローブは、一
次プローブがハイブリダイズした後に、加え得る。ハイブリダイゼーションは公
知の方法により行い得る。これはアッセイの第四の特異性レベルである。 段階Ｆ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける別の二次プローブのハイブリダイゼーション 図６に示すように、別の二次プローブ（７８）を使用する場合、次いでそれを
標識し、一次プローブにハイブリダイズさせる。標識の型は、選択した検出法に
より決定する。全ての一次および二次プローブ（７６、７８）を、同時に、累積
的な特異性レベルでハイブリダイズし得る。２番目の二次プローブの追加は５の
特異性レベルである。 段階Ｇ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける単離および検出 標的（５０）がサンプル中に存在する場合、付着した二次プローブまたはプロ
ーブ群を有する一次プローブと標的配列の得られた複合体は、二本鎖構造である
（図６の段階Ｆに示す）。次いで、複合体をサンプルＤＮＡの残りから単離し、
検出する。単離の２つの実施形態（ａ）図６に示すサイズ分離および（ｂ）図７
に示す捕獲プローブが示される。ゲル電気泳動後、期待したゲル位置（Ｒｆ）で
の標識バンドの検出により、６つの特異性レベルを有する核酸標的の存在が示さ
れる。

【００８７】 ある場合、標的は、一次プローブおよび二次プローブ濃度よりも少ない数で存
在し得る。この場合、一次プローブおよび二次プローブは、標的に結合すること
なく、共にハイブリダイズし得、ゲル上に偽陽性を与える。標的にハイブリダイ
ズしていないプローブを識別するために、一次プローブの第二部分（標的に相補
的な区分）に配列特異性を有するカッタープローブ、例えばＢＵ塩基カッターを
、一次および二次プローブのハイブリダイゼーション後に、標的／プローブ複合
体にハイブリダイズさせ得る。その後、ハイブリダイズしたサンプル複合体をＵ
Ｖ（約３１３ｎｍ）で処理すると、プローブ／標的複合体が２つの小複合体に開
裂する。２つの小複合体は、サイズ分類ゲル上でのそのＲｆの算定により、標的
を含まないプローブ複合体から、容易に識別される。

【００８８】 一次プローブの結合が非特異的である場合、次いで、標識バンドは、計算した
標的／プローブ複合体（通常小バンドを与える）のＲｆとは別のサイズ位置に現
れるか、またはゲルまたは膜上に観察されるＤＮＡバンドは全く標識を有さない
。それ故、一次プローブの僅かな非特異的結合は、ＲＦＴＡ試験において診断解
釈の結果を混乱させない。

【００８９】 標的／プローブ複合体の３'末端は、３'末端を除去および標的および二次プロ
ーブ配列をギャップがその間に存在しないように設計することにより３'末端の 遊離デオキシリボースヒドロキシル基（すなわち、別のヌクレオチドに結合して
いないヒドロキシル）にキャップをすることによりヌクレアーゼ耐性となり得る
。同様に、５'末端でのキャップは、遊離５'ヒドロキシルまたはホスフェートの
除去により達成される。ヌクレアーゼ耐性（ＲＦＴＡでは不必要であるが）は、
特異的適用のためのアッセイの感度の増加の助けとなり得る。

【００９０】 ＲＦＴＡ発明の別の実施形態（ここで標的／プローブ複合体はサイズ分離によ
り単離される）は、図７に示す。プローブ／標的複合体は、一方または両方の核
酸鎖に結合することが示されたことに注意されたい。本発明は、標的配列の検出
のためのシグナル増幅を提供するための、かかるプローブのセットの使用に関す
る。

【００９１】 図８−Ｉは、ＲＦＴＡの実施形態を示し、ここでは３つの異なるプローブを使
用する。長いプローブ、一次プローブ（７４）は、結合していない一本鎖領域を
両端（７４）に残しながら、標的配列（５０）の少なくとも一部に結合する。二
次プローブ（７６）および（７８）が結合し、複合体を形成し、次いでゲル電気
泳動により単離するのは一次プローブのこれらの末端である。複合体に結合して
ない末端があり、所望であればエキソヌクレアーゼで処理し得る。１つ以上のプ
ローブを、標識し得る。いずれかの鎖、ワトソンまたはクリックを、対応する結
合能を有するプローブの使用と共に、標的配列として使用し得る。この図は５つ
の特異性レベルを提供する。

【００９２】 図８−ＩＩは、その末端の両方でヘアピンループを形成するプローブ（７４）
を使用し、ヘアピンの内部に標的配列（５０）と結合している、別の実施形態を
示す。このプローブ／標的複合体はエキソヌクレアーゼ消化に耐性である。この
プローブ／標的複合体の形成後、エキソヌクレアーゼをサンプルに加え得、全て
の結合していない標的およびプローブ、および存在する任意の他の核酸は消化除
去する。ヘアピンプローブは前記した方法で標識し得る。この図は４つの特異性
レベルを提供する。

【００９３】 図８−IIIは、２つの一次プローブ（７４）および（８６）（各々、一方の末 端上では１つのヘアピンループを形成でき、他方の末端は標的配列（５０）の一
部と結合できる）を使用する好ましい実施形態を示す。好ましい実施形態におい
て、プローブ（７４、８６）は、２つのプローブ（７４、８６）の末端の間にヌ
クレアーゼ消化が可能となる有意なギャップがないように設計されている。ヘア
ピンループは、任意のサイズであり得、末端が同鎖の内部配列に結合している構
造である、ヘアピンの効果を有する任意の型を形成し得る。かかる構造は、ヘア
ピン、クローバー葉、分枝構造および当業者に公知のその他を含む。２つの異な
るプローブの使用（各々、標的配列の異なる部分に結合でき、各々ヘアピンルー
プを形成する）により、標的／プローブ複合体はエキソヌクレアーゼ消化に耐性
になる。それ故、任意の結合していないまたは不完全に結合したプローブ（７４
、８６）または標的（５０）は、エキソヌクレアーゼ処理により消化される。

【００９４】 図８−IIIの実施形態において、２つのプローブ（７４、８６）は、互いに結 合せず、標的（５０）が２つのプローブ（７４、８６）に接続した場合にのみゲ
ルにおいて可視化され、従って大きくバックグラウンドシグナルは大きく減少す
る。さらに、目的でない複合体は、予期したＲｆに移動せず、従って、所望の標
的から識別可能となる。従って、所望の標的を含まない複合体は、期待したＲｆ
でゲル上にバンドを生成しない。 [捕獲プローブ／試験−チューブフォーマットおよび検出] 本発明により考えらる別の方法は、サイズ分離の代わりにプローブ／標的複合
体を単離するための、チューブアッセイおよび捕獲プローブの使用である（図７
）。

【００９５】 以下は、１５ヌクレオチドの標的配列が、同核酸から標的／プローブ複合体の
単離のための捕獲プローブの使用を（変化できる）ための、ＲＦＴＡ法の好まし
い実施形態の例である。標的配列を有することが疑われるサンプルを、３つのプ
ローブとハイブリダイズさせる。これらのプローブの２つは、プローブ／標的複
合体を単離するためにサイズ分離を使用したＲＦＴＡ法で前記したプローブから
修飾する。 [プローブ図：] １）試験管（テストチューブ）フォーマットの１つの実施形態において、一次
プローブは、約５５ヌクレオチド塩基を有し得、ここで約１５ヌクレオチド塩基
の部分が標的配列と相補的である。かかる部分は一次プローブの中心または付近
に、別の約１５ヌクレオチド塩基の部分は、二次プローブに結合するために一方
の末端上に、三番目の約２５ヌクレオチドの塩基の部分は、別の二次プローブに
結合するために他方の末端上に配置し得る。

【００９６】 ２）最初の二次プローブは、少なくとも１５ヌクレオチド塩基であり、標的配
列と相補的ではないが、一次プローブの部分に相補的である。 ３）二番目の二次プローブは、少なくとも２５ヌクレオチド塩基であり、最初
の二次プローブと結合せず、標的配列と相補的ではなく、一次プローブの末端と
相補的である。

【００９７】 ゲル適用による前記したプローブ／標的複合体の単離において、二次プローブ
は標識する必要がなく；一次プローブのみ標識する必要がある。しかし、これら
の試験管またはチューブを基本とした適用において、唯１つの二次プローブを当
分野で公知の任意の標識で標識する。

【００９８】 ＲＦＴＡの試験管フォーマットは、１つの二次プローブを捕獲プローブとして
使用し（ＤＩＧまたは当分野で公知の任意の他の生化学的「フック」に複合体を
形成させる（コンジュゲート））、標的／一次プローブ複合体を固体支持体に付
着させる。

【００９９】 図７は、この方法の好ましい実施形態を示す：サンプルＤＮＡの単離、および
長サンプルＤＮＡ鎖からの標的配列の制限ヌクレアーゼ放出。標的配列、１を変
性し、一次プローブ、プローブ２とハイブリダイズする。二次プローブ、４、捕
獲プローブ、はそれに付着した捕獲分子を有する。図７において、捕獲分枝はジ
ゴキシゲニン（ＤＩＧ）、３であると示されている。しかし、これは類似の機能
を有する任意の他の分子でもよい。磁気ビーズ、５、をＤＩＧに対する抗体と共
に、試験−チューブに加え、標的／プローブ複合体を捕獲する。図７の段階Ｇは
、３番目のプローブ、リポータープローブ６、好ましくは標識されたものを、上
記標的／プローブ複合体に加える実施形態を示す。かかる標識プローブを結合す
るとにより、全構造が、試験−チューブ容器内において容易に検出（可視化）で
きる。捕獲およびリポータープローブ、両方共二次プローブ、を任意の順番で加
えることができる。

【０１００】 標識およびプローブサイズは可変であり、リポータープローブは最適のシグナ
ルを発生するために伸長または短縮し得る。二次リポータープローブは、試験管
アッセイで標識された唯一のものであり、当業者に公知の任意の方法を使用して
標識できるが；しかし、別の標識も必要な場合には使用し得る。試験管適用にお
いて、リポータープローブシグナルは検出に重要である。例えば、試験フォーマ
ットにおいて、リポーターシグナルは、標的が捕獲ないしリポータープローブの
ギャップをつなぐために存在する場合、固体基質に付着するのみである。

【０１０１】 図９は、チューブ適用および標的プローブ複合体（ＰＤＴＰ−部分二本鎖標的
／プローブ複合体）の変動を示す。 チューブを基本としたアッセイは、予備処理手段として、例えば、ミリグラム
量からマイクログラム量までの核酸からの全標的を濃縮するために、ＤＮＡチッ
プ、ＰＣＲ、および他の核酸またはシグナル増幅技術のために使用できる。シグ
ナル増幅は当分野で公知の任意の方法であり得る。

【０１０２】 標的／一次プローブ／捕獲プローブ／リポータープローブ複合体の存在は、全
プローブを共に付着させるための標的配列の存在に直接的に依存している。標的
配列がなければ、実質的に非特異的シグナル（バックグラウンド）は全くない。

【０１０３】 ＲＦＴＡ試験管アッセイフォーマットで使用するための標的／プローブ（ＰＤ
ＴＰ）構築物のいくつかの他の実施形態を図９に示す。核酸の一方または両方の
鎖、ワトソンまたはクリック鎖の使用が、これらの図式で考えられる。ヘアピン
構造は図９に例としてのみ示し、形成された構造の型に限定するものではない。

【０１０４】 図９−Ｉは、一次プローブ２に結合した標的配列１を示し、これは捕獲プロー
ブ４に直接付着した捕獲分子３を有する。標識リポータープローブ５は、構造の
検出のために加える。この実施形態は、末端がヒンジ／ループ領域の付加または
他の方法によりキャップされていない場合、５の特異性レベルを有し、エキソヌ
クレアーゼ耐性ではない。

【０１０５】 図９−ＩＩは、二次プローブがヘアピンまたは他の類似の構造を形成する実施
形態を示す。標的配列１は一次プローブ２と結合する。リポータープローブ５は
、当業者に公知の方法を使用して標識する。捕獲分子３が付着した捕獲プローブ
４はまた、標的／プローブ構造に結合する。この実施形態は５の特異性レベルを
有し、エキソヌクレアーゼ耐性である。

【０１０６】 図９−IIIは、ヘアピンループを形成する２つのプローブ、捕獲一次プローブ ２およびリポータープローブ４の使用を示す。各プローブの一部は、標的配列１
に結合している。一次プローブ２は、それに付着した捕獲分子３を有し、標的／
プローブ複合体の捕獲を提供する。この実施形態は４の特異性レベルを有し、エ
キソヌクレアーゼ消化に耐性である。

【０１０７】 図９−ＩＶは、ヘアピンループを形成するリポータープローブ４の使用を示す
。標的配列１は、一次プローブ２に結合する。一次プローブ２はまた、リポータ
ープローブ４に結合し、これはヘアピン構造を形成する。一次プローブ２はまた
、付着した捕獲分子３を有する捕獲プローブ５に結合する。この実施形態は５の
特異性のレベルを有し、末端がキャップされていない場合、エキソヌクレアーゼ
消化に一部のみ耐性である。

【０１０８】 ＲＦＴＡのこの実施形態により、シグナルが標的配列の非存在下でも生成可能
となり得る。この場合、リポーターおよび捕獲領域をはずすには注意をしなけれ
ばならない。これは多くの方法により達成できる： ｉ）ハイブリダイゼーション段階、後一次および二次ハイブリダイゼーションを
加える。この時点で、標的領域の一部に相同的で一次プローブに相補的なカッタ
ープローブを、プローブ複合体にハイブリダイズし；このハイブリダイゼーショ
ン後のＵＶ処理（約３１３ｎｍ）により、（標的領域の非存在下）捕獲およびリ
ポータープローブを分離する。 ii）一次プローブを２つのプローブ（各々、標的の異なる領域に結合）に断片化
できる。 iii）標的のヌクレアーゼ耐性を使用するリポーターおよび捕獲領域をはずす任 意の他の方法により、標的／プローブ複合体は安定化する。

【０１０９】 図９−Ｖは、標的配列１に結合した一次プローブ２の使用を示す。リポーター
プローブ５および捕獲分子３を有する捕獲プローブ４は、一次プローブ２に結合
する。この実施形態は５の特異性レベルを有し、キャップ法を使用しない場合、
エキソヌクレアーゼにより消化できる。

【０１１０】 追加の特異性レベルは、複数の標識をプローブに加えることにより、または１
つ以上のリポータープローブを創製することにより達成できる。表２はチューブ
を基本としたアッセイにおいて複数のプローブを特徴づける。

【０１１１】 追加のプローブは、断片化でき、特別な順序で加えてさらに特異性レベルを増
加できる。例えば、標的／プローブ構築物の別の実施形態は、３から２にプロー
ブの数を減少させるためのヘアピンループの使用を含む。

【０１１２】 配列をヌクレアーゼに耐性にすることは、必要ではないが、バックグラウンド
の減少または特定のアッセイ状況での感度の増加のために使用し得る。プローブ
ないし標的配列にギャップが全く形成されないようにプローブを設計することに
より、保護標的配列、または保護標的核酸配列（ＰＮＡＳ）はExoIIIなどのヌク
レアーゼに対して耐性となる。さらに、３'プローブ末端は、ヌクレアーゼから 保護するために、当業者に公知の方法で、キャップ、またはデヒドロキシル化ま
たは修飾する必要がある。他の公知の修飾法は、ＤＩＧ、ビオチン、アビジン、
またはヒドロキシラーゼ反応の存在を含むがこれに限定されない。かかる修飾は
任意の上記構築物を用いて使用できる。

【０１１３】 伸長ヘアピンリポータープローブの使用により、より多くのリポーター分子の
付加が可能となり、標的の可視化を増強する。 [ＲＮＡ検出修飾] ＲＮＡ標的配列の検出のために、上記のＤＮＡ方法および組成物と類似した方
法および組成物を、ＲＮＡ配列を修飾して使用できる。

【０１１４】 ＤＮＡサンプルでは、最初の段階は、当業者に公知の様々な方法のいずれかに
よる、サンプルＲＮＡの精製である。最も単純な形において、特異的ＲＮＡ配列
の検出および特徴づけが、特異的標識核酸プローブのハイブリダイゼーションを
使用し、次いでサイズ分離および前章で記載した特異的標的の検出により達成さ
れる。

【０１１５】 一般に、多くのＲＮＡ標的配列が、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの別々なサイ
ズのＲＮＡ分子として見られるので、サンプルＲＮＡからの標的切出しは必要で
はない。しかし、必要な場合、標的ＲＮＡは本発明において切出すことができる
。例えば、ｍＲＮＡ分子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、正しいサイズ
の相補プローブに結合させ、一本鎖領域を除去するために一本鎖ヌクレアーゼを
使用することにより、標的配列の単離のための所望のサイズに切断できる。他の
酵素やＲＮＡ操作の公知の方法は、リボザイムやＣＰカッタープローブのいうよ
うなＲＮＡ分子の大きさにするため、用いることができる。

【０１１６】 特異的ＲＮＡ標的配列の検出は、遺伝子発現解析、ＲＮＡウイルス（例えばＨ
ＣＶ、Ｃ型肝炎ウイルス）、活性対潜在ウイルス感染（すなわちＣＭＶ、サイト
メガロウイルス）の区別などの適用に有用である。本発明はまた、これらの適用
に定量的であるように設計され得る。

【０１１７】 ＲＮＡ適用におけるＲＦＴＡの可転性を増加させるために、逆転写段階を最初
に実施し、一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡを生成し得る。これにより、ＤＮＡ適用
で記載したものと全く同じように、ＲＦＴＡと結合させた制限フラグメント解析
の使用が可能となる。この型の解析は、ＲＮＡウイルス遺伝子型（ＨＣＶ）、並
びにある感染性物質における高い変異率の結果として発達し得る薬剤耐性または
免疫回避準種（例えばＨＩＶおよびＨＣＶ）の検出に適用可能である。追加の配
列特異性レベルは、ｃＤＮＡを、比較的非特異的プライマーではなく配列特異的
プライマー、例えばランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを用いて合
成することにより、ＲＦＴＡに加え得、一定のサイズの逆転写物が生じ、これを
ＲＦＴＡ解析にかけ得る。これらの２つの特異性レベル、配列特異的ＲＦＴＡと
結合した配列特異的ｃＤＮＡ合成は、偽陽性シグナルの可能性を減少させ、従っ
て試験の全体の特異性を上昇させる。 [ＲＦＴＡはＲＮＡ標的の解析指向] ほとんどのＲＮＡ標的、例えばｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびそ
の他は、ゲルおよび試験−チューブフォーマットの両方においてＲＦＴＡにより
直接指向され得る。それ故、その後の検出のためにＲＮＡをｃＤＮＡに変換する
ために、逆転写反応を実施する必要がない。

【０１１８】 本ＲＮＡ ＲＦＴＡ発明の好ましい実施形態は、図１１（ｍＲＮＡ ＲＦＴＡゲ
ルアッセイ）に示す。また、サイズ分離は、プローブ上の捕獲分子または他の適
当な分子を使用して、試験チューブ法により達成できると考えられる。さらに、
ＤＮＡ ＲＦＴＡで示したヘアピン構造は、適当な場合、使用できる。 段階Ｉ：ｍＲＮＡを単離する 段階II：ｍＲＮＡ（ポリピリミジン）上の標的部位を選択し、一次プローブを設
計する 段階III：ｍＲＮＡ標的への一次プローブのハイブリダイゼーション 段階ＩＶ：エキソリボヌクレアーゼでの処理（Ｓ１およびヤエナリヌクレアーゼ
） 段階Ｖ：標的プローブ複合体の生成（ＰＤＴＰ複合体） 段階ＶＩ：三重体のポリＡ３'末端にハイブリダイズする二次リポータープロー ブポリｄＴ（ビオチニル化）を加えることによりシグナル増幅を開始 段階VII：アビジン−酵素複合体を、コンジュゲートビオチン分子を有する複合 体に添加 段階VIII：予測されるＲｆへの電気泳動 段階ＩＸ：色素産生基質溶液中へのゲルの配置 このアッセイは４つの特異性レベルを提供する。

【０１１９】 ＢＵカッタープローブを使用するｍＲＮＡ ＲＦＴＡゲルを基本としたアッセ イの実施形態は、以下の段階を含む： 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離 段階II：ＢＵカッタープローブとのハイブリダイズ 段階III：ＵＶ光を照射して制限を完了 段階ＩＶ：一次プローブとハイブリダイズ 段階Ｖ：二次リポータープローブとハイブリダイズ 段階ＶＩ：予測されるＲｆまでゲル上で複合体を走行 これは４つの特異性レベルを有する。

【０１２０】 この方法の例は図１１に示す。単離した全ｍＲＮＡ（そのいくつかは標的配列
を含む）はサンプル中に存在する。ＢＵカッター部位を含むプローブ２は標的配
列１に結合する。標的はＵＶ光を用いて切断する。標的配列の一本鎖部分に結合
する標識プローブ３を加える。

【０１２１】 追加の実施形態において、標識プローブ３に結合する三番目のプローブを加え
る。プローブ／標的（ＰＤＴＰ）の全体の二本鎖構造を、特異的Ｒｆまでゲル上
を走行させる。

【０１２２】 ここでは一次プローブのフラグメントを示す、塩基カッタープローブ２を用い
た標的のハイブリダイゼーションによるＲＮＡの切断は、前記したように全ての
場合で必要なわけではない。

【０１２３】 塩基カッタープローブを使用しない場合、標的は、ＲＮＡ標的にハイブリダイ
ズする２つの領域および標的にハイブリダイズしない５'末端または３'末端をも
つ第三区分を有する、一次プローブ３を用いてハイブリダイズし得る。このプロ
ーブの全長を前記で議論したように標識する。ＲＮＡ実施形態における１つの変
動は、完全に標識されているかまたは標識されていない、塩基カッタープローブ
２として作用する、２番目の一次プローブを加えることにより、特異性が増加す
ることであり、最初の一次プローブにタンデムで近接して結合する。

【０１２４】 ＲＮＡ標的にハイブリダイズする核酸プローブの一部を断片化できる。従って
、生成した各追加のプローブ片について、別の特異性レベルを加える。断片化プ
ローブは、本明細書に記載の全ＲＦＴＡフォーマットを通じて議論したように、
容易に塩基カッタープローブ分子で置換されるオリゴヌクレオチドであり得る。

【０１２５】 一次プローブ４の第三区分と結合する非標識二次プローブとハイブリダイズさ
せる。 Ｓ１ヌクレアーゼ処理または当業者に公知の任意のものは、塩基カッタープロ
ーブが存在する方法において任意の段階であり、カッタープローブが存在しなけ
れば必要である。非ハイブリダイズｍＲＮＡの除去により、期待される標的／プ
ローブ複合体について予期されるＲｆ値が生じる。一本鎖ＲＮＡが除去されない
場合、尾／標的／プローブ複合体の絶対Ｒｆ値は僅かに修飾されて、異なる、し
かし予期可能なＲｆ値となる。最終複合体のサイズは、重要ではない。標的検出
能は、複合体のＲｆ移動度の予測性および再現性に依拠する。

【０１２６】 非ハイブリダイズ一本鎖ＲＮＡ尾を開裂するために、本発明により考えられる
他の可能な実施形態は、ＥＤＴＡ分子またはブレオマイシンを一本鎖ＲＮＡ尾に
隣接するプローブの末端にコンジュゲートすることを含む。ＲＮＡと共に、当業
者に公知の任意の他の類似の分子を有するプローブのハイブリダイゼーションに
より、標的ＲＮＡは開裂され、一本鎖ＲＮＡ尾は除去される。

【０１２７】 非ハイブリダイズ一本鎖ＲＮＡ尾を開裂するための別の試みは、ｍＲＮＡ尾に
隣接するプローブを１つ以上のチミン塩基で終らせることである。これらがＢＵ
で置換される場合、ハイブリダイズした複合体をＵＶ、好ましくは長波長、約３
１３ｎｍに曝露すると、ｍＲＮＡ尾が非酵素的に切出される。前記したＣＰの他
の実施形態もまた使用し得る。

【０１２８】 標的／プローブ複合体をポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上で走行さ
せる場合、二本鎖標的／プローブ複合体を可視化し、Ｒｆを、核酸サイズ基準の
Ｒｆとの比較により計算する。標的／プローブ複合体における期待されたＲｆ値
を得ることにより、４つの特異性のレベルで、所望のＲＮＡ標的がサンプル中に
存在することが確認される。

【０１２９】 ＲＦＴＡ／ＲＮＡゲルアッセイ：特異性レベル（４） １．一次プローブの結合 ２．バックグラウンドシグナルを減少させることによる、感度／特異性を増加さ
せるためのエキソヌクレアーゼ処理（非特異的ＲＮＡは破壊される） ３．二次プローブの結合 ４．標的／プローブ（Ｒｆ、遅延係数）のゲル中の固定点までの移動 エキソヌクレアーゼ処理の省略により、特異性のレベルが３に変化する。しか
し、塩基カッタープローブをエキソリボヌクレアーゼで置換すると、２レベル特
異性レベルが増加し、全部で５の特異性レベルとなる。 [ＲＮＡ標的のＲＦＴＡ直接解析：試験−チューブフォーマット] 標的複合体はまた、捕獲分子のプローブへの付着に関与するゲルフォーマット
により検出し得る。 [ＤＮＡおよびＲＮＡ検出における本発明の利点] ＤＮＡ ＲＦＴＡの利点： 複数の特異的レベル 捕獲およびリポータープローブは、それ自体接続されておらず、共通の標的に
のみ接続している。

【０１３０】 ＰＣＲはＤＮＡプローブ上で実施できる。 ＤＮＡ−チップ技術は標的／プローブ複合体も検出できる。 （ｗ）または（ｃ）のいずれかの鎖が、独立してまたは共に検出され得る。

【０１３１】 ＲＮＡ ＲＦＴＡの利点： 複数の特異性レベル 捕獲およびリポータープローブは、それ自体接続されておらず（互いに直接的
に結合していない）、共通の標的にのみ接続している。

【０１３２】 約２００−２５０ｍｅｒの５'ポリＡ領域は、シグナル増幅に使用できる（ポ リｄＴ標識プローブを使用）。 ＲＮＡは、逆転写（ＲＴ）段階を受けて、直接解析できる。

【０１３３】 ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の適用における、ＲＦＴＡ実施形態を含む、本発明
は、電気泳動分離後に標的核酸を移行した後に膜ハイブリダイゼーションを利用
する従来のＤＮＡまたはＲＮＡブロッティング法に優る利点がいくつかある。Ｒ
ＦＴＡは、膜ハイブリダイゼーションよりもかなり速く実施がより簡便であり、
技術的熟練および電気または真空移行システム、ＵＶ架橋剤または真空オーブン
、およびハイブリダイゼーションオーブンおよび水浴槽などの特殊装置の必要が
少ない。ＲＦＴＡはまた、膜ハイブリダイゼーションで利用した比較的大量で、
比例的に遅いハイブリダイゼーション動態を有するハイブリダイゼーションとは
対照的に、はるかに少ないプローブが、電気泳動前に少量でハイブリダイゼーシ
ョンに利用される点で、標準的ＲＦＬＰ解析よりも実施がかなり安価である。

【０１３４】 ＲＦＴＡには追加の特殊電気泳動システムは全く必要でなく、利用可能な検出
システムは全て、ゲルを走行させて解析するインサイツまたは天然ゲル上で、ま
たは、膜に作用させる固定または乾燥ゲル上でより良好とはいわないまでも同等
に作用する。さらに、ＲＦＴＡは膜ハイブリダイゼーションよりもより感度が高
くあり得る。なぜなら、核酸移行または膜架橋が必要でなく、これは両方共、傷
害または不十分な移行による特異的シグナルの欠失をもたらし得るからである。
ＲＦＴＡはＤＮＡ増幅を利用しないので、ＲＦＴＡはＰＣＲを基本とした試験で
しばしば見られる高い割合の非特異的シグナルの傾向がない。最後に、ＲＦＴＡ
は、いくつかのプローブを、一度に複製サンプル上で、またはいくつかのプロー
ブを同サンプル中で任意の電気泳動レーンまたはゲル上で利用できる利点を有し
、複製ゲルを走行させる必要および／またはすでにハイブリダイズした膜をその
後の再プローブ用に剥離する必要（この両方共費用が高く時間を消費する方法で
ある）がなくなる。

【０１３５】 以前のＤＮＡ解析、特に診断の領域における主要な問題は、全ての診断技術が
、１回の試験でミリグラム量の核酸を処理できないことであった。これは、感染
時間経過の早期に、少量の標的の存在を診断するために、全ＤＮＡ解析法に必要
である。この高い感度は、以前の技術では利用できなかった。本発明の方法は、
増幅（ＰＣＲ等）または非増幅を基本とするもの、さらにはチップを基本とする
ものであれ、全ＤＮＡ解析および診断技術に使用できる。

【０１３６】 ｍＲＮＡ ＲＦＴＡ試験−チューブアッセイの実施形態を提示する。 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階ＩＩ：ｍＲＮＡ（ポリピリミジン）上の標的部位を選択し、一次プローブを
設計する。 段階III：一次プローブのｍＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーション。 段階ＩＶ：二次捕獲プローブとのハイブリダイズ。 段階Ｖ：エキソリボヌクレアーゼ（ＳＩおよびヤエナリヌクレアーゼ）での処理
。 段階ＶＩ：得られたＰＤＴＰ複合体の生成。 段階VII：二次リポータービオチニル化増幅プローブの添加。 段階VIII：コンジュゲート添加。 段階ＩＸ：固体基質にＰＤＴＰを結合。 段階Ｘ：固体基質にＰＤＴＰを結合。 段階Ｘ：洗浄。 段階ＸＩ：発色性基質を加え、色発生を調査。

【０１３７】 これは４つの特異性レベルを有する。 ｍＲＮＡ ＲＦＴＡ、チューブを基本としたフォーマットの別の実施形態。 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階ＩＩ：ｍＲＮＡ標的の選択および一次プローブ（ＢＵＣＰ）の設計。 段階III：ＢＵＣＰをｍＲＮＡ標的領域（ＢＵＣＰ−１、捕獲）とハイブリダイ ズ。 段階ＩＶ：一次プローブとハイブリダイズ。 段階Ｖ：ＰＤＴＰ複合体を捕獲。 段階ＶＩ：洗浄。 段階VII：二次リポータープローブとのハイブリダイズおよび標識の存在を決定 。

【０１３８】 これは３の特異性レベルを有する。 本発明の方法および組成物の使用は、単一のチューブで解析できる核酸サンプ
ルのサイズに制限がなく、また大量の非特異的な汚染もないという事実により、
ＤＮＡチップおよびＰＣＲ技術を高い感度および特異性で機能させる。

【０１３９】 以前から既知のＤＮＡ解析技術の多くの方法は、感度を上げるために、十分量
の核酸を試験できない。本発明の方法は、ゲノムまたは他の大量のＤＮＡ（ミリ
グラム量の非特異的核酸からサンプルに存在する標的に富むμｇ量まで）を予備
処理でき、よって、以前から既知のＤＮＡ解析技術は、選択した標的核酸配列の
存在を特異的および正確に決定できる。 標的保護アッセイ（ＴＰＡ） 核酸標的配列検出のための本発明の別の実施形態は、標的保護アッセイ（ＴＰ
Ａ）と呼ばれる。ＴＰＡは、１９９６年１０月２６日出願の米国特許出願番号０
８／７３９,０６９、現在米国特許および１９９８年２月２４日出願の米国仮特 許出願番号６０／０７５,８１２および１９９８年３月５日出願の６０／０７６,
８７２に開示され、その各々についてその全体を本明細書に取り込む。

【０１４０】 ＴＰＡ技術は、単一のＤＮＡ（遺伝子）コピーを検出すいるに十分な感度の、
特異的ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の直接解析の方法である。ＴＰＡ発明はまた、二
本鎖および一本鎖両方のＤＮＡを検出する。 ｍＲＮＡ／ＴＰＡ 本発明の方法および組成物は、広範囲の量のＲＮＡを処理できる能力を有し、
これは、前記で議論し以前から存在する技術により達成できる適用の開発のため
に必要な感度を付与する。これにより、ＴＰＡプロセスは初期の感染時間経過診
断技術としての使用が可能となる。感染時間経過の初期でＲＮＡ標的を検出する
重要性は、ＲＮＡウイルスの複製、腫瘍発達および感染性疾患進行は、全て、宿
主におけるタンパク質合成、しかしより重要には、特異的ｍＲＮＡ種の産生を必
要とするという事実に基づく。

【０１４１】 本発明により考えられる１つの実施形態は、間接的単一遺伝子コピー検出に関
する。各活性化遺伝子について、数万のｍＲＮＡ分子が産生される。単一の遺伝
子を活性化する場合、２０,０００の特異的ｍＲＮＡ標的が、細胞および組織に 存在し、同定が可能である。

【０１４２】 本発明の好ましい実施形態は、以下の段階を含む。最初に、ＲＮＡ上の配列特
異的領域を選択する。第二に、標的配列を有すると疑われるＲＮＡサンプルを、
当業者に公知の任意の方法で単離すると、変性および線形ＲＮＡが獲得される。
サンプルＲＮＡは生存可能な源から、またはかかる目的のための増幅ＤＮＡを使
用して精製する。サンプル核酸からの標的の切出しは、ｍＲＮＡはすでに推定的
にサイズ分類されているという事実から必要ではない。

【０１４３】 第三の段階において、特異的一本鎖ＲＮＡ標的を、二本鎖ＤＮＡ構造とのハイ
ブリダイゼーションで保護し、保護標的核酸構造（ＰＮＡＳ）と呼ばれる部分的
三重らせん分子を形成する。三重らせん形成の実施形態は図１２に示す。この実
施形態において、リポータープローブはＤＮＡであり、二本鎖ＤＮＡ捕獲分子長
は可変であり；生化学的フックは、この目的において当業者に公知の任意の分子
、例えばＤＩＧである。このＤＮＡ捕獲分子は、図１２の二本鎖構造をとして機
能する二本鎖分子を形成するヘアピン構造であり得る。 ｍＲＮＡ ＴＰＡにおけるＴＦＯヘアピン捕獲プローブ ポリピリミジンに富むｍＲＮＡ中の領域を同定しなければならない。これは、
三重体形成にピリミジン−プリン−ピリミジンモチーフが要求されるため必要で
ある。二本鎖ＤＮＡヘアピン捕獲プローブは２つの区分を有することを特徴とす
る： ・３'末端は可変長のポリプリンに富む領域である ・５'末端は可変長のポリピリミジンに富む領域である ・ 両領域はヘアピンループを形成する６塩基の伸縮により中間で結合している 。

【０１４４】 従って、ヘアピン捕獲プローブは、それ自体が折り畳まれてヘアピンを形成す
るＤＮＡ分子である。また、３'末端は、３'末端に近接するが３'末端ではない 、生化学的フックとコンジュゲートする。標的は、ＲＮＡ鎖配向をもつ二本鎖Ｄ
ＮＡヘアピンプローブにハイブリダイズする。

【０１４５】 本発明の追加の実施形態は、ポリｄＴ標識プローブの捕獲ｍＲＮＡ分子への添
加を含む。これは指示シグナルを増強する。図１３は、かかる実施形態を示す。
ｍＲＮＡサンプルに示される任意の反復配列、例えばポリＡ区分は、この新規な
シグナル増幅に使用できることが本発明により考えられる。 ｍＲＮＡ ＴＰＡゲルを基本としたアッセイは以下の段階を含む： 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階ＩＩ：標的領域の選択およびＤＮＡ捕獲プローブの設計。 段階III：ｍＲＮＡ標的および二本鎖ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション 。 段階ＩＶ：アッセイ特異性を増加させるために、任意の非ｍＲＮＡ複合体形成二
本鎖ＤＮＡプローブを破壊するエキソヌクレアーゼ処理。 段階Ｖ：固体支持体へのＰＮＡＳの付着。 段階VI：洗浄。 段階VII：ＰＮＡＳをポリｄＴリポータープローブ（ビオチニル化２５ｍｅｒ分 子）とのハイブリダイズによるシグナル増幅。 段階VIII：洗浄。 段階ＩＸ：アビジン−酵素コンジュゲートを、コンジュゲートポリｄＴ増幅プロ
ーブ上でビオチン分子に結合している標的溶液に添加。 段階Ｘ：洗浄。 段階ＸＩ：ＰＮＡＳ構造完全性を傷害することなく、ＰＮＡＳを磁気ビーズから
解離。 段階XII：予測されるＲｆまで電気泳動ゲル上で可溶性ＰＮＡＳを走行。 段階XIII：ゲルを発色性基質溶液に配置し、発色するまでインキュベート。

【０１４６】 これは５の特異性レベルを有する。 この実施形態は、限定的なものではなく、他の等価体または類似の変例も使用
できる。標的領域サイズおよびプローブ長は、短いものから長いものまでサイズ
が変化し、アッセイが呈する標的およびフォーマットの型にのみ依存する。ハイ
ブリダイゼーションは、異なって設計されたプローブを用いて前記したＲＦＴＡ
法と同じ方法で達成される。ここで使用するＤＮＡプローブは二本鎖構造を形成
するヘアピンまたは任意の他の構造であり得る。ヘアピン構造は好ましい実施形
態である。

【０１４７】 ＰＮＡＳの形成は、本発明の方法および組成物の第一の特異性レベルである。
この特異性レベルは、ＤＮＡ二本鎖保護分子のポリプリンまたはポリピリミジン
に富む領域で働く必要がなるために低く、非特異的ＲＮＡ種は二本鎖ＤＮＡ保護
分子に結合し得る。この問題を回避する１つの方法は、ポリに富む領域の２つの
塩基ではなく４つの正常な塩基に及び変化する標的保護分子（二本鎖ＤＮＡ）の
使用を可能とするｒｅｃＡタンパク質の添加である。

【０１４８】 上記の好ましい実施形態の例は、１８ヌクレオチド塩基長配列を有する標的配
列を有し、ｍＲＮＡ ＴＰＡゲルアッセイである。 ｍＲＮＡ ＴＰＡゲルを基本としたアッセイの実施形態は図１４に提示する。

【０１４９】 ｍＲＮＡ ＴＰＡ試験チューブまたは捕獲アッセイの実施形態は図１５に示す 。 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階ＩＩ：標的部位の選択および捕獲プローブの設計。 段階III：標的およびプローブのハイブリダイゼーション。 段階ＩＶ：標的により保護されていない任意の二本鎖ＤＮＡ捕獲プローブを除去
するためのExoIII処理。 段階Ｖ：固体支持体へのＰＮＡＳの付着。 段階ＶＩ：洗浄。 段階VII：リポータープローブ（ポリｄＴ、ビオチニル化および２５ｍｅｒ）と のハイブリダイズ。 段階VIII：洗浄。 段階ＩＸ：アビジン−酵素コンジュゲートの添加。 段階Ｘ：洗浄。 段階ＸＩ：ＰＮＡＳ構造を解離することなく磁気ビーズからのＰＮＡＳ解離。 段階XII：特異的Ｒｆへのゲル電気泳動。 段階XIII：ゲルを発色性基質に配置し、ゲル上のバンドを可視化（Ｒｆを計算） このアッセイは、６の特異性レベルを有する。ここで使用したＤＮＡプローブ
は、二本鎖構造を形成するヘアピンまたは任意の他の構造であり得る。ヘアピン
構造が好ましい実施形態である。

【０１５０】 ＴＰＡ法のＲＮＡ／ＴＰＡ ＰＮＡＳ（標的／プローブ複合体）は、単離並び に両方の試験−チューブおよびゲルアッセイフォーマットにおいて検出できる。
ＴＦＯをハイブリダイゼーションしてＰＮＡＳを形成した後、続く段階は検出法
により決定する。

【０１５１】 ＲＮＡ／ＴＰＡ試験−チューブ適用は、非常に高い特異性を与える。なぜなら
、アッセイは少なくとも５の特異性レベルにより仲介されるからである。アッセ
イにより大量のＲＮＡの解析が可能となる。

【０１５２】 ExoIII処理が、捕獲プローブによりハイブリダイズする非特異的ＤＮＡを削除
するために必要である。 ＤＮＡヘアピン構造を使用したｍＲＮＡ ＴＰＡチューブを基本としたアッセ イの例を記載する。 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階ＩＩ：標的部位の選択およびエアピン捕獲プローブの設計。 段階III：標的およびヘアピンプローブのハイブリダイゼーション。 段階ＩＶ：標的により保護されていない任意の二本鎖ＤＮＡヘアピン捕獲プロー
ブを除去するためのエキソヌクレアーゼIII処理。 段階Ｖ：固体支持体へのＰＮＡＳの付着。 段階ＶＩ：洗浄。 段階VII：リポータープローブ（ポリｄＴ、ビオチニル化および２５ｍｅｒ）と のハイブリダイゼーション。 段階VIII：洗浄。 段階ＩＸ：アビジン−酵素コンジュゲートの添加。 段階Ｘ：洗浄。 段階ＸＩ：発色のための発色性基質の添加。

【０１５３】 これは５の特異性レベルを有する。 ｍＲＮＡ ＣＰＡゲルフォーマットアッセイの実施形態。 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階II：２つのＢＵカッタープローブのハイブリダイズおよび標的の制限。 段階III：固定基質へのＰＮＡＳのアンカー。 段階ＩＶ：ゲルの走行およびバンドシグナル可視化によるＲｆの決定。

【０１５４】 このアッセイは３の特異性のレベルを有する。 図１８は、ｍＲＮＡ ＣＰＡ試験−チューブフォーマットアッセイを提示する 。 段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離。 段階II：ＢＵカッタープローブのハイブリダイズおよび標的の制限。 段階III：固定基質へのＰＮＡＳのアンカー。 段階ＩＶ：洗浄。 段階Ｖ：シグナル増幅によるＰＮＡＳ検出。

【０１５５】 三重らせん形成で使用できる別の実施形態は、三重らせんロックである。ある
条件下で、二本鎖ＤＮＡセグメントのＥＸＯIII（エキソヌクレアーゼ）への曝 露により、３'→５'の方向にＷおよびＣ鎖上でＤＮＡは分解し得る。三重体形成
オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のＤＮＡ二本鎖への結合により、三重体は短時間
でのＥＸＯIIIによる分解から保護される。

【０１５６】 三重らせんの安定化を達成するために、三重らせんロックの実施形態を図１６
に示す。図１６は、ヘアピン構造であり、ｍＲＮＡに大きな溝が作成されるよう
に設計した、ＤＮＡ捕獲プローブと三重体を形成しているｍＲＮＡ分子を示す。
このヘアピンはまた、３'ＤＮＡ二本鎖末端上に、ＥＸＯIII攻撃の部位がない。

【０１５７】 また、ＥＸＯIII分解に対して、残りの３'プローブ末端のみを保護する必要が
ある。これは、一連の塩基（７）（ここではポリｄＴを使用する）により閉じた
末端上で接続した、互いに折り畳まれているポリプリン（３'末端）およびポリ ピリミジン（５'末端）に富む鎖である、ヘアピンＤＮＡ捕獲プローブを有する ことを特徴とする、三重体ロックの発明により達成された。

【０１５８】 存在するｍＲＮＡに通常の水素結合を介してハイブリダイズする１２−１５塩
基のＤＮＡにより、３つの捕獲プローブの３'末端を伸長することにより、ＤＮ Ａ−ＲＮＡハイブリッド生成によりExoIII分解に耐性な３'プローブ末端が創製 される。平滑末端および３'曝露末端にExoIIIが要求されることにより、プロー ブの３'末端の保護の目標が達成可能となる（一本鎖ｍＲＮＡ３'末端は、ExoIII
が分解できない突出を創製し、同時に３'プローブ末端（１５塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ およびＧ）多い伸縮）は、３'−５'分解に特異的に耐性な末端を送り出すｍＲＮ
Ａと水素結合を形成する）。 [ＲＮＡ／ＴＰＡの利点] ＲＮＡ／ＴＰＡの使用の主要な利点は、本発明の方法および組成物の使用によ
り、単一の遺伝子コピー検出と同じ感度の高さで、全てのシグナル増幅技術並び
にチップ上ＤＮＡおよびＰＣＲが標的検出を達成できるようになることである。
これは、保護、濃縮、および患者の標本のミリグラム量の核酸から、１マイクロ
グラムの核酸（すなわち元のサンプルに全標的も含む）への減少を提供する。こ
れは図に提示する。

【０１５９】 ＨＩＶ療法におけるウイルス負荷問題は、以前は成功裡に取り組まれなかった
。現在、ＰＣＲは、終点（ＡＺＴ＋カクテル療法では、ＨＩＶウイルスの個々の
全徴候が除去される）を同定することを試み、非検出レベルまでウイルス負荷の
損失を測定し、ＰＣＲに固有の限界、ＲＴ−ＰＣＲの性能の低さおよび組合せて
使用したＲＴ（逆転写）およびＰＣＲプロセスの両方で生じる複雑さのために、
ほとんどまたは全く成功していない。

【０１６０】 本発明の方法および組成物は、ＨＩＶ処置法期間を通じてｍＲＮＡレベルを追
随させることにより、ウイルス負荷診断に使用される。例えば、プロテアーゼ阻
害剤療法は、ＰＣＲが、療法を停止する必要のある時点（ウイルス負荷が減少す
る時点）を決定することが困難であるという問題がある。ＰＣＲは、その感度お
よび特異性に影響を及ぼす固有の欠点を有し、その最も重要なことは、非常に過
剰のゲノムＤＮＡにおいてコピー数の低い標的（ＤＮＡ）の同定を妨げ、直接Ｒ
ＮＡ標的を解析する能力が全体的に欠失していることである。本発明は、単一遺
伝子またはＲＮＡ標的コピーまで直接解析することにより、非常に過剰のＤＮＡ
／ＲＮＡにおける少量の標的を同定して、かかる問題を解決する。従って、ＴＰ
Ａがウイルス負荷の解析について送達できるパラメーターは、以下の核酸形の数
の監視を含む： １．単一遺伝子コピーに感度があるＨＩＶウイルスの二本鎖ＲＮＡ ２．ＨＩＶプロウイルス（組込み形）の二本鎖ＤＮＡ−単一遺伝子コピーに感度
がある ３．ウイルスタンパク質に特異的なｍＲＮＡ−単一遺伝子コピーと考えられる１
０,０００−２０,０００ｍＲＮＡ分子に感度がある 現在、生物発光を介したシグナル増幅は、間接的なｍＲＮＡ解析の評価により
、単一遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡ標的に感度がある。生物発光および他のシグナ
ル増幅技術が向上するので、ｍＲＮＡ標的は、直接、単一のメッセンジャーコピ
ーレベルで、大量の非特異的核酸中で評価され得る。

【０１６１】 本発明の別の使用は、直接的ｍＲＮＡ解析である。直接的ｍＲＮＡ解析の特定
の使用は、核酸を基本とした癌転移アッセイである。単一の腫瘍細胞を有するリ
ンパ節はそれ自体、腫瘍細胞表面マーカー、レセプタータンパク質に特異的なｍ
ＲＮＡ標的を最小で１０,０００−２０,０００提示し、これは、全リンパ節の全
ＲＮＡの単離（ミリグラム量）および１回の解析で検出できる。

【０１６２】 本発明の別の使用は、Ｃ型肝炎ＲＮＡおよびｍＲＮＡの直接的同定である。こ
の直接的検出により、感染性ウイルスの早期検出が可能となり、血液および血漿
の世界的供給の安全性を確保することが容易になる。

【０１６３】 本発明の別の使用は、多くの治療様相を、処理する異常性に特異的なｍＲＮＡ
標的解析により監視できることである。ホルモン異常（低または高状態）の診断
は、類似ｍＲＮＡ解析により監視できる。成長因子療法もまた、遺伝子調節問題
の場合と同様、直接的ｍＲＮＡ検査により監視できる。最後に、無数のヒト医学
適用と共に、同等なまたはさらにより印象的な農学および獣医学適用の一覧があ
る。

【０１６４】 本発明の組成物は、本明細書に教示した方法を実践するために必要な成分を有
する組成物を含む。例えば、組成物は、特異的標的配列に相補的なヌクレオチド
区分を有する一次プローブおよび１つ以上の二次プローブ配列、および標識二次
プローブを含む。ヌクレアーゼ、リボザイムおよび緩衝液と共に選択した一次お
よび二次プローブを含む組成物またはキットは、本発明に含まれる。個々の分子
、プローブおよび成分もまた個々にまたは組合せて提供され得ると理解される。

【０１６５】 本発明は、包含された実施例により説明され、これはいかなる場合にもその範
囲を限定するものではない。対照的に、手段は、様々な他の実施形態、修飾、お
よびその等価体を含み得ることは明らかに理解され、本明細書を読んだ後、当業
者に、本発明の精神および／または後の包含される請求の範囲の範囲から逸脱す
ることなく示唆され得る。 [実施例] ＜実施例１＞ 三重らせん形成ＤＮＡ ＴＰＡにより仲介されるＰＮＡＳと共に二本鎖ＤＮＡ 標的配列を使用した標的保護アッセイの一般フォーマット ＤＮＡの単離 以下のプロトコールは、大量の全血から迅速にＤＮＡを単離する代表的な方法
である：静脈穿刺チューブに収集した１５０ｍｌの血液（ヘパリン、ＡＣＤまた
はＥＤＴＡ）を共にプールし、５００ｍｌの遠心ボトル中、１５０ｍｌのイソト
ンＩＩ（Coulter Diagnostics）で希釈した。３０ｍｌの１０％トライトンＸ− １００を加え、３秒間激しく混合した。細胞核を最大速度（１２,０００×ｇ） で５分間ペレット化した。上清を除去した後、ペレットを１０ｍｌのＰＫ混合物
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡ、０.５％Ｔｗｅｅｎ２
０、０.５％ＮＰ−４０、および２.５ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ）に再懸濁し、
５５℃で１５分間、９５℃で１０分間インキュベートし（プロテアーゼＫを不活
性化する）、次いで室温までゆっくりと冷却する。次いで、サンプルを遠心チュ
ーブに移し、１２,０００×ｇで１０分間回転させる。上清を回収し、ＤＮＡを 、０.２容量の１０Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量のエタノールを加えてペレ ット化する。沈殿したＤＮＡを５,０００×ｇで１０分間ペレット化し、２回７ ０％エタノールで洗浄し、次いで０.５ｍｌ滅菌水に再懸濁する。緩和な超音波 またはせん断がペレットを完全に溶かすために必要であり得る。約１ｍｇの全ゲ
ノムＤＮＡが、１５０ｍｌの全血（約１億５千万の核の細胞）から回収される。
ＲＮＡ調製技術もまた適用できる。 [三重らせん形成により仲介されるＰＮＡＳの形成] 水中の０.５ｍｌのＤＮＡサンプルに、５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液（０.２
５Ｍトリス−アセテート、ｐＨ７.０、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
２、５０ｍＭ−メルカプトエタノール、０.１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および４０ ｍＭスペルミン−ＨＣｌ）を、次いで、１０ｎｍｏｌの特異的ＴＦＯを加える。
安定なＰＮＡＳの形成に十分な時間および温度で、例えば３７℃で１０分間、次
の段階の前にインキュベートする。 [酵素的消化] ５００単位の各制限酵素（ほとんどの場合５０μｌ）および４,０００単位のE
xoIII（４０μｌの１００,０００μ／ｍｌストック）を加える。反応物を３７℃
でさらに５０分間インキュベートし、次いで、生化学的または生物物理学的方法
により酵素を不活性化する。現時点でサンプルは方法の次の段階の準備がされて
いる。 [捕獲システム] 消化ＤＮＡ混合物に、１０ｎｍｏｌのＤＩＧ標識捕獲プローブおよび０.５ｍ ｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液（５.０Ｍ ＮａＣｌ、０.５ ＮａＯ Ａｃ、ｐＨ４.５）を加える。混合物を最適のハイブリダイゼーション温度で、 安定なハイブリダイゼーション複合体が形成されるために十分な時間、例えば１
時間インキュベートし、次いで、１００μｌの抗ＤＩＧ覆膜磁気ビーズを加え、
洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁する。さらに１時間インキュベ
ートした後、磁気粒子濃縮器を使用してビーズを単離し、８回０.５ｍｌハイブ リダイゼーション緩衝液で洗浄する。現時点でサンプルはＤＮＡ三重らせんＴＰ
Ａ法の最終段階の準備がされている。

【０１６６】 ＦＩＴＣ標識リポータープローブを使用し、蛍光異方性を使用して検出する。
ハイブリダイゼーション緩衝液中１０ｎｍｏｌのリポータープローブを含む１. ０ｍＬ溶液の初期異方性を測定した後、洗浄した磁気ビーズに加える。混合物を
１時間５０℃で穏やかに振りながらインキュベートし、全内容物（ビーズを含む
）をアボットＴＤＭサンプルバイアルに移す。次いで、異方性を、解析するため
に初期の値と比較して再測定する。結合した画分は、ｆｂ＝（ｒｏｂｓ−ｒｉｎ
）/（ｒｂ−ｒｉｎ）で示すことができ、ここでｆｂは結合した画分であり、ｒ ｉｎは初期異方性であり、ｒｏｂｓはハイブリダイゼーション後に観察された異
方性であり、ｒｂは全結合である（過剰の結合剤で、低濃度のプローブを滴定す
ることにより決定）。 ＜実施例２ ＨＩＶ＞ ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、ＡＩＤＳの２つの病因物質の１
つである。現在、抗ＨＩＶ抗体の存在を検出する血清学的アッセイを使用して、
血液および血液製剤をスクリーニングする。一般に信頼性があるが、これらの試
験は、時折、交差反応性抗体のために偽陽性結果を、または感染が測定可能な免
疫応答を発現する前の初期段階にある場合、偽陰性結果を生じる。ＴＰＡなどの
別の方法が特に有用であり得るのは後者の場合である。なぜなら、大量のサンプ
ルＤＮＡが、単一のアッセイチューブで処理および試験され得るからである。感
受性細胞系との共培養を使用したウイルスの直接的アッセイは存在しないが、こ
の方法は手間がかかり、完了に数日間を要する。以下の例は、低いレベルの感染
ＣＤ４陽性細胞をもつ最近感染した個体の最も悪い症例の多くのの血液の引用を
記載する。 １．実施例１で上記した１５０ｍｌの全血（１億５千万の白血球）ＤＮＡの抽出
。０.５ｍｌの水に精製したＤＮＡを再懸濁。 ２．５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液および１０ｎｍｏｌＴＦＯを添加。 ＨＩＶ−１ ＴＦＯ： ５'−ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＣＣ Ｔ−３' ３．１０分間３７℃でインキュベート。 ４．５００単位のＳａｕ３Ａおよび４,０００単位のExoIIIを添加。 ５．５０分間３７℃で、次いで２０分間６０℃でインキュベート。 ６．０.５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液および１０ｎｍｏｌのＤ
ＩＧ標識捕獲プローブを添加。 ＨＩＶ−１捕獲プローブ： ５'−ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＴＴ ＴＧＴ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＴ−ＤＩＧ−３' ７．５０℃で１時間インキュベート。 ８．１００μｌの洗浄ＤＩＧ覆膜磁気ビーズを添加。 ９．５０℃で１時間振りながらインキュベート。 １０．チューブを磁気濃縮器に配置し、液体を除去。 １１．０.５ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液で８回洗浄。 １２．蛍光異方性で以前に測定した１０ｎｍｏｌのリポータープローブを含む１
.０ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液にビーズを再懸濁： ＨＩＶ−１リポータープローブ： ５'−ＧＡＡ ＴＡＧ ＴＡＧ ＡＣＡ ＴＡＡ ＴＡＧ ＴＡ−ＦＩＴＣ−３' １３．５０℃で１時間インキュベート。 １４．異方性を再測定し、上記の式により結合プローブ（ｆｂ）の画分を解析。

【０１６７】 別に、段階１３の後、ビーズを磁気粒子濃縮器で再精製し、ハイブリダイゼー
ション緩衝液で８回洗浄し、直接的蛍光測定（励起＝４９０ｎｍ、発光＝５２０
ｎｍ）のために蛍光計に配置し、またはビーズを蛍光顕微鏡上で観察するために
スライド上に配置できる。 ＜実施例３＞ [ＢＵＣＰを用いた一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージＤＮＡの切断] 糸状バクテリオファージの複製は、宿主細菌を含む大腸菌繊毛と協調して生じ
、感染細胞は溶解しないが、上清に放出された、１世代１細胞あたり数百のウイ
ルス粒子を産生する。感染細菌の培養物におけるバクテリオファージの力価はミ
リメーターあたり１０¹²ｐｆｕに到達できる。細胞外感染鎖は、Ｍ１３（＋）鎖
、一本鎖環状ＤＮＡ分子（約７.２ｋｂ長）である。

【０１６８】 ＢＵカッタープローブＤＮＡ制限を実証するために使用したシステムは、ＢＵ
カッタープローブが環状Ｍ１３ｍｐｌ８バクテリオファージ上の特異的配列にハ
イブリダイズする能力を利用する。以下は塩基数が２５００から２５２５の配列
である

【０１６９】

【化１】 ２．栄養ブイヨンで生育した大腸菌の後期ドッグ(late dog culture)培養物を
、１２,０００ｇで１０分間遠心し、得られた上清をチューブにデカントし、こ れにクロロホルムを２滴加え、バクテリオファージストックを滅菌する。

【０１７０】 様々な濃度のＭ１３ＤＮＡを、次に、制限するＭ１３分子の数に対して１０倍
過剰のカッタープローブのインキュベートにより以前に提示されたＢＵカッター
プローブ配列とハイブリダイズさせ、よって完全なハイブリダイゼーションを確
実にする（プローブＭ１３相互作用のＴｍは、塩基含量調査により４４℃である
と計算される）。ハイブリダイゼーション温度は１Ｍの塩ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液中３７℃付近である。

【０１７１】 高ストリンジェンシー洗浄液を、３７℃で低塩濃度で加え、非特異的領域に結
合するＢＵＣＰプローブを除去する。 次いで、プローブの付着した環状ＤＮＡを、ぺトリ皿中で、長波長ＵＶ（３１
３ｎｍ）で、線量率１４.６Ｗｍ^-2で照射する。しかし、照射前に、ヘキストダ イ３３２５８番を、標的の臭素フリーラジカルによる高頻度の切断を確かにする
ために加えなければならない（Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージの反対の鎖の
糖−リン酸骨格）。

【０１７２】 バクテリオファージＤＮＡの制限は、アガロース（１％）ゲル電気泳動により
可視化され、これはＭ１３ＤＮＡ鎖と同様にプローブ鎖に誘導された破壊が示さ
れる。ＢＵカッタープローブは少なくとも１つの類似の蛍光分子をＢＵ分子の両
方の側に有する。Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージＤＮＡは、最初のとは異な
る波長で蛍光を発する別の蛍光ダイを有し、これはゲル解析時に環状（制限され
ていない標的）および線形（標的制限）のＲｆが確認される。

【０１７３】 これらの蛍光ダイは、実験的バックグラウンドを最小限にするために赤外スペ
クトルの近くである。分子動態蛍光解析器におけるゲルの解析によりプロファイ
ルが得られる。

【０１７４】 標的が制限されていない場合、Ｍ１３は、特異的Ｒｆでゲル中に移動している
ＤＮＡの環状無傷片のままである。標的の制限は、ゲルＲｆを別の位置にシフト
させ、これは切断および線形バクテリオファージの生成の証明となる。反応条件
は、（２）カッタープローブ開裂を提示する他の小バンドの変性ゲルを使用して
検査することにより質を調節できる（実験条件が合っていない場合、無傷カッタ
ープローブバンドが観察される）。 ＜実施例４＞ [独特な標的／プローブ複合体（ＰＤＴＰ）と一本鎖ＤＮＡ標的配列を使用した ＤＮＡ ＲＦＴＡの一般フォーマット] 選択した標的は、Bacillus Anthracisの毒素産生遺伝子のセンス鎖（ｗ）配列
である。ＤＮＡサンプル中の標的の存在は、細菌および感染の存在を示す。 [血清標本における細菌標的の単離] １．大量の血清サンプル５０−１００ｍｌを、１２,０００×ｇで４℃で遠心す る。 ２．ペレットを、５６７μｌのＴＥ緩衝液中で繰り返しピペッティングすること
により再懸濁する。３０μｌの１０％ＳＤＳおよび３μｌの２０ｍｇ/ｍｌプロ テインキナーゼＫを加え、混合し、１時間３７℃でインキュベートする。 ３．１００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、激しく混合する。８０μｌのＣＴＡＢ/
ＮａＣｌ溶液を加え、混合し、１０分間６５℃でインキュベートする。 ４．等容量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、混合し、４−５分間
微量遠心する。上清を新しいチューブに移す。上清の取り出しが困難である場合
、爪楊枝で最初に界面を取り出す。 ５．等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え、混合し
、５分間微量遠心する。上清を新しいチューブに移す。

【０１７５】 ある細菌株では、クロロホルム抽出後に形成された界面は上清を用意に取り出
せるほど密ではない。このような場合、ほとんどの界面は、上清を取り出す前に
滅菌爪楊枝で取り出し得る。次いで残りのＣＴＡＢ沈殿物はフェノール−クロロ
ホルム抽出で取り出す。 ６．０.６容量のイソプロパノールを加え、ＤＮＡが沈殿するまで穏やかに混合 する。沈殿物をシールドパスツールピペットで１ｍｌの７０％エタノールに移し
洗浄する。

【０１７６】 別に、沈殿物を簡潔に微量遠心し、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄する。 ７．５分間微量遠心にかけ、上清を廃棄し、凍結乾燥器で簡潔に乾燥させる。 [ＤＮＡ ＲＦＴＡ] Bacillus Anthracisの毒素遺伝子の同定 一旦ＤＮＡを単離すれば、１または２つの制限エンドヌクレアーゼが、選択し
た標的領域（可変長）に隣接する部位を有する箇所で制限しなければならない。 [酵素消化] 各制限酵素５００単位（ほとんどの場合５０μｌ）を加える。反応物を３７℃
でさらに５０分間インキュベートし、次いで生化学的または生物物理学的方法に
より酵素を不活性化する。現時点でサンプルは方法の次の段階に準備されている
。

【０１７７】 以下はＲＦＴＡを含む全プローブおよび構造の配列である。 塩基５８１−６６０ B.Anthracis毒素産生遺伝子

【０１７８】

【化２】 一旦ＤＮＡを制限すれば、一本鎖ＤＮＡ標的を放出するためにＤＮＡを変性し
なければならない。 [ＤＮＡの変性] 制限後、ＤＮＡを、最小１分間（９４℃で）９４℃まで加熱することにより、
またはアルカリ処理（０.４Ｎ ＮａＯＨと２５ｍＭ ＥＤＴＡ）により変性しな ければならない。

【０１７９】 次に、一次プローブを標的配列の一部とハイブリダイズさせる。ハイブリダイ
ゼーション条件が類似である場合、捕獲プローブは同時に混合物（１０ｎｍｏｌ
のＤＩＧ標識プローブ）に加えてもよく、標的領域の他の部分に結合する。ハイ
ブリダイゼーション温度は通常、二本鎖核酸の融解温度以下の２０℃である。通
常のハイブリダイゼーション条件は、１０倍少ない各プローブ、５０℃で２０−
６０分間のインキュベート、および中性ＯＨで高塩（５×５５ＰＥ）の緩衝液を
必要とする。 [捕獲システム] ＤＮＡ混合物に、１０ｎｍｏｌのＤｉｇ標識捕獲プローブおよび０.５ｍｌの ２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液（５.０Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ ＮａＯＡ ｃ、ｐＨ４.５）を加える。混合物を最適のハイブリダイゼーション温度で、安 定なハイブリダイゼーション複合体の形成に十分な時間、例えば１時間インキュ
ベートし、次いで１００μｌの抗Ｄｉｇ覆膜磁気ビーズを加え、洗浄し、ハイブ
リダイゼーション緩衝液に再懸濁する。さらに１時間インキュベートした後、磁
気粒子濃縮器を使用してビーズを単離し、０.５ｍｌのハイブリダイゼーション 緩衝液（１×ＳＳＰＥ）（鉱物ストリンジェント用に低塩）で８回洗浄する。洗
浄後の磁気ビーズは、各塩基上でビオチンで置換したリポータープローブのハイ
ブリダイゼーションに準備されている。リポータープローブ（２５ｍｅｒ）を、
５０℃で５×ＳＳＰＥ中、２０−６０分間インキュベートし、ストリンジェント
洗浄を導入して、４５℃で１×ＳＳＰＥ緩衝液を用いて洗浄することにより非結
合プローブを除去する。磁気ビーズを含む全チューブ洗浄は、ビーズ／標的損失
を防ぐために磁気チューブホールダーで実施する。

【０１８０】 次の段階は、アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体の添加による
シグナル発生の開始である。複合体を１０倍過剰に、標的捕獲ビーズを含むチュ
ーブに加える。ビーズは同様に洗浄して非結合複合体を除去し、発色性基質テト
ラメチルベンジジンを加え、ペルオキシダーゼとの接触時に可溶性色を出す。

【０１８１】 色の強度は存在する標的の数に比例する。 本明細書に記載した全特許および刊行物の開示は、本発明が関連する従来技術
をより完全に記載するために、その全体を引用によりここに援用する。

【０１８２】 本プロセスは、ある実施形態について特別に詳細に記載したが、かかる詳細な
記載は、それらが添付の請求の範囲に含まれることを除きおよびその程度まで、
本発明の範囲を限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、一本鎖核酸の切断に使用したカッタープローブの一つの実施形態であ
る。

【図２】 図２は、標的核酸をサンプルから切出すために使用したカッタープローブの一
つの実施形態である。

【図３】 図３は、サンプルから切出した標的核酸を回収するためにアッセイで使用した
カッタープローブの一つの実施形態である。

【図４】 図４は、二本鎖標的の切断に使用した一本鎖カッタープローブ（三重らせん形
成オリゴヌクレオチド、ＴＦＯ）の一つの実施形態である。

【図５】 図５は、二本鎖遺伝子標的を破壊するために使用した、一本鎖カッタープロー
ブ（ＴＦＯ）の一つの実施形態である。

【図６】 図６は、標的／プローブ複合体をサイズ分離により単離する、制限フラグメン
ト標的アッセイ（ＲＦＴＡ）の一つの実施形態である。

【図７】 図７は、標的／プローブ複合体をテストチューブフォーマットにより単離する
、ＲＦＴＡの一つの実施形態である。

【図８】 図８は、サイズ分離による標的／プローブの単離で使用するための、ＲＦＴＡ
一次プローブの別の実施形態である。図８IIおよび８IIIは、ヘアピンループを 有する一次プローブである。

【図９】 図９は、テストチューブフォーマットによる標的／プローブの単離で使用する
ための、ＲＦＴＡ一次プローブの別の実施形態である。図９II、９IIIおよび９I
Vはヘアピンループを有する一次プローブである。

【図１０】 図１０は、カッタープローブを特徴とする、ゲルベースの単離のためのＲＮＡ
／ＲＦＴＡアッセイの一つの実施形態である。

【図１１】 図１１は、ＲＦＴＡ／ＲＮＡの適用の一つの実施形態である。

【図１２】 図１２は、ＴＰＡ／ＲＮＡ捕獲アッセイの一つの実施形態である。

【図１３】 図１３は、ＲＮＡ／ＴＰＡチューブアッセイのためのシグナル増幅の一つの実
施形態である。

【図１４】 図１４は、ＴＰＡ／ＲＮＡの一つの実施形態である。

【図１５】 図１５ＡおよびＢは、シグナル増幅を有するＴＰＡ／ＲＮＡの一つの実施形態
である。

【図１６】 図１６は、三重らせんロックの一つの実施形態である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０７６，８７２ (32)優先日 平成10年３月５日(1998．3．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプル中の標的核酸配列を切断する方法であって、 標的核酸配列に反応性基を有する相補的なカッタープローブを提供する工程、 前記カッタープローブおよび前記標的核酸配列を、ハイブリダイゼーションお
   よび標的／プローブ複合体の形成が可能な条件下で結合させる工程、および、 前記反応性基を活性化させて、前記標的／プローブ複合体を前記カッタープロ
   ーブの反応性基の位置および前記標的核酸配列の相補的位置で切断する工程、 を含む切断方法。
2. 【請求項２】 前記反応性基はハロゲン化ヌクレオチドである、請求項１の
   方法。
3. 【請求項３】 前記反応性基はプリンまたはピリミジン類似体である、請求
   項２の方法。
4. 【請求項４】 前記反応性基はブロモウラシルであり、前記活性化法は光照
   射である、請求項３の方法。
5. 【請求項５】 前記カッタープローブはさらに捕獲分子を含む、請求項１の
   方法。
6. 【請求項６】 標的核酸配列と結合した反応性基を有するカッタープローブ
   を含む、サンプル中の標的核酸配列を検出するための組成物。
7. 【請求項７】 更にリポーター分子を含む、請求項６の組成物。
8. 【請求項８】 標的核酸配列を検出する方法であって、 ａ）標的核酸配列を含むと推定されるサンプルから単離された非標識核酸配列を
   得る工程、 ｂ）前記標的核酸配列を切出す工程、 ｃ）前記サンプルおよび切出された標的核酸配列を変性させる工程、 ｄ）その一部が前記標的核酸配列に特異的に結合する標的保護分子を、工程ａ）
   の前記非標識核酸配列と、保護標的核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成するために十分
   なハイブリダイズ条件下で接触させる工程、 ｅ）二本鎖標的保護分子の非結合部分に結合させるために少なくとも１つの二次
   プローブを接触させる工程、および、 ｆ）ＰＮＡＳを検出する工程、を含む検出方法。
9. 【請求項９】 前記標的核酸配列は一本鎖である、請求項８の方法。
10. 【請求項１０】 前記標的は二本鎖である、請求項８の方法。
11. 【請求項１１】 前記標的保護分子および二次プローブは一本鎖である、請
    求項８の方法。
12. 【請求項１２】 リポーター分子を有する標的保護分子または二次プローブ
    を更に含む、請求項８の方法。
13. 【請求項１３】 標的核酸配列と結合した標的保護分子および二次プローブ
    を含む、サンプル中の標的核酸配列を検出するための組成物。
14. 【請求項１４】 更にリポーター分子を含む、請求項１３の組成物。
15. 【請求項１５】 標的核酸配列を検出する方法であって、 ａ）標的核酸配列を含むと推定されるサンプルから単離された非標識核酸配列を
    得る工程、 ｂ）前記標的核酸配列を切出す工程、 ｃ）その一部が前記標的核酸配列に特異的に結合する標的保護分子を、工程ａ）
    の前記非標識核酸配列と、保護標的核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成するために十分
    なハイブリダイズ条件下で接触させる工程、 ｄ）前記標的保護分子の非結合部分に結合させるために少なくとも１つの二次プ
    ローブを接触させる工程、 ｅ）ＰＮＡＳを検出する工程、を含む検出方法。
16. 【請求項１６】 前記標的核酸配列は一本鎖である、請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 前記標的保護分子は二本鎖である、請求項１５の方法。
18. 【請求項１８】 前記標的保護分子はヘアピン構造を形成する、請求項１５
    の方法。
19. 【請求項１９】 前記ＰＮＡＳは三重らせんである、請求項１５の方法。
20. 【請求項２０】 リポーター分子を有する二本鎖標識保護分子または二次プ
    ローブをさらに含む、請求項１５の方法。
21. 【請求項２１】 ExoIIIは二次プローブが結合された後に二本鎖分子を消化
    する、請求項１５の方法。
22. 【請求項２２】 標的核酸配列と結合した、二本鎖標的保護分子および二次
    プローブを含む、サンプル中の標的核酸配列を検出するための組成物。
23. 【請求項２３】 リポーター分子をさらに含む、請求項２３の組成物。