JPH09508268A

JPH09508268A - 核酸の配列決定

Info

Publication number: JPH09508268A
Application number: JP7519415A
Authority: JP
Inventors: シブソン，デイビッド，ロス
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-20
Publication date: 1997-08-26
Also published as: AU1459595A; EP0739422B1; WO1995020053A1; ES2146309T3; GB9401200D0; DK0739422T3; AU708678B2; DE69516116D1; DE69516116T2; US6348313B1; EP0739422A1; ATE191514T1

Abstract

(57)【要約】一度に所定の数の塩基を核酸の配列から逐次に除去すること（ここで所定の塩基除去の各工程から残った生成物は、該塩基に対し特異的でありかつオリゴヌクレオチド配列を含む標識されたアダプターにリゲートされる）、又はプライマーを配列決定される核酸にハイブリダイズし、そして該プライマーを一度に所定の数の塩基だけ逐次延長すること（ここで該加えられる塩基は配列決定される核酸中の塩基に相補的であり、該塩基付加工程の各々は、該塩基に対し特異的でありかつ該所定の塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む標識されたアダプターの使用により達成される）を含み；いずれの場合にも該標識されたアダプターの標識はその夫々の所定の塩基に対し特異的であるところの、核酸を配列決定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の配列決定本発明は、標識されたアダプター分子が用いられる一般的アプローチに基づく核酸配列決定のための新規技術に関する。本発明は、核酸の集団たとえばヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）において作られるような配列の集団の大規模分析を容易にする。もちろん、その利用性は、ＨＧＰなどに限定されない。核酸配列の慣用の分析は、従来、元の核酸試料を、サイズにおいて１又は２以上の塩基だけ異なる２以上の部分に塩基特異的にフラグメント化することに大きく依存していた。配列決定は、得られたフラグメントの分離及びこれらの分析により行われる。ＲＮＡの比較的少い処理量の配列分析において、塩基特異的フラグメント化は、塩基特異的活性を有するリボヌクレアーゼにより行われ、続いて生成物の薄層クロマトグラフ分離が行われる。より多い処理量の配列分析（特にＤＮＡの）は、塩基特異的化学切断により（マキサム，Ａ．Ｍ．及びギルバート，Ｗ．，Ｐro c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．74 ｐ560，１９７７）、又は適当な核酸ポリメラーゼにより触媒された合成を塩基特異的様式により停止させる（サンガー，Ｆ．，ニケルソン，Ｓ．及びコールソル，Ａ．Ｒ．，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．74ｐ5 463，（１９７７））ことにより、分析されるべきフラグメントを発生させる。得られたフラグメントの分離は、適当なポリマー様ポリアクリルアミドを含む超薄スラブ又はキャピラリーを通しての変性化ゲル電気泳動により達成される。これは、一塩基の分割において一つの適当に調製された試料当り約千のオーダーの塩基を分割でき、かつ同時に数十の試料を取扱える。検出（スミス，Ｌ．，Ｍ．及びヨウバン，Ｄ．，Ｃ．バイオテクノロジー７ｐ576−580（１９８９）（ヤング，Ｍ．，Ｍ．及びヨウバン，Ｄ．，Ｃ．バイオテクノロジー７ｐ576−5 80（１９８９））は、放射性、化学発光又は螢光標識化による、又は安定な同位体（ヒューマンゲノム１９９１−１９９２プログラムレポートｐ18及びｐ22 Ｕ．Ｓ．デパートメントオブエナージー１９９２）による直接的又は間接的であった。低減されたコストでより速い速度で配列決定を達成することに大きな興味が存在する。すると、生物のゲノム、特に単相ゲノム当り一般に3,000,000,000 より多い塩基のサイズを持つ高等真核生物のゲノムを完全に分析することが可能になる。更に、そのような分析に適する方法はまた、一集団中の多くの個体における高分割度関連分析を行うことを可能にする。これは、遺伝子に結びついた表現型、特に一般的に病気を同定するため、及びヒトにおける遺伝子の流れを追跡するために重要である。ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの一集団中の表現された配列を分析することがまた、可能になる。たとえば診断に関係する比較目的のために、多くの異なる個体からの同じ領域又は複数の領域を繰返し配列決定することがまた可能である。従って、配列分析の極めて多い処理量の方法が研究されている（望ましくは、現行の慣用の市販入手できる配列決定装置たとえば72の試料から１日で1000塩基以下を解読できるＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列決定システムで達成可能なよりも10倍以上多いもの）。走査トンネル電子顕微鏡は、個々の分子中の塩基を直接に可視化できる。また、レーザーは、個々の分子を分類するために使用でき、そして個々の分子は一度に一塩基ずつ一端からそれらを分解することにより分析されうる（ハーディング，Ｊ．Ｄ．及びケラー，Ｒ．Ａ．トレンズインバイオテック 10 ｐ55−58，１９９２）。しかし、全ゲノムを分析するために十分な、又は多数の個体からの多くの選択された配列を比較するために十分な速度で配列分析を行うことが望まれる時（たとえば、遺伝される特性の座を同定するために家族研究を用いる時）、更に問題がある。すなわち多くの試料を同時に分析する必要がある。これは、現在、ハイブリッド化による配列決定によりアプローチされている。ハイブリッド化による配列分析のために二つの方法がある。一つの方法（ダーマナック，Ｒ．，ら、ゲノミクス４ｐ114−128（１９８９）及びストレツォスカ，Ｚ．，らＰroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 88 ｐ10，089-10，093（１９９１）は、大きなアレイ上に別々に多くの試料（おそらく数10万個）を固定する。このアレイは次に、公知配列の多くの異なる標識されたオリゴヌクレオチドの各々によりプローブされる。プローブの各々にハイブリッド化した試料の同定は、プローブに相補的な配列を有するものを示す。すべての可能な配列をカバーする多数のプローブの使用は、試料の完全な配列をアセンブルすることを可能にする。しかし、この方法は、特異的ハイブリッド化を達成するために少くとも５つの塩基オリゴヌクレオチドを必要とすることにより制限され、このことは多数（４ⁿ、ここでｎはオリゴヌクレオチドの長さ）のプローブが、全ての可能な配列組合せをカバーするために必要となることを意味する。別の方法（フォダー，Ｓ．ら、Ｎature，３６４ｐ555−556（１９９３），カープコ，Ｋ．，Ｒ．ら、ＤＮＡＳequence１ｐ375−388（１９９１），サザーン，Ｅ．，Ｍ．，マスコズ，Ｕ．，及びエルダー，Ｊ．，Ｋ．Ｇenomics １３ｐ1008−1017（１９９２））は、数千の異なるオリゴヌクレオチド（異なる公知配列を持つ各々は、全体として全ての可能性をカバーする）を適当なアレイ上に固定化することを要する。その配列が分析されるべきところの標識された核酸試料によるアレイのプロービングは、試料と相同性を共有するオリゴヌクレオチドを同定する。このことは通常、オリゴヌクレオチドのインサイツ（in situ）での合成を通して達成され、それらのマスキング（たとえばリソグラフによる）は所定の時点に特定の塩基を加えることを要求しない。試料は、標識され、そしてアレイにハイブリッド化される。ハイブリッド化の位置は、試料と検出されたオリゴヌクレオチドとの間で配列相同が共有される場所を示す。従って、試料の配列は、検出されたオリゴヌクレオチドの配列から推論されうる。ハイブリッド化による配列決定のどちらかの方法においても、十分な長さのオリゴヌクレオチドを合成することは、実際に困難である。オリゴヌクレオチドが固定化され、そして試料でプローブされるとき、必然的に限られたサイズのアレイ上に短いオリゴヌクレオチドのみが実際上、合成されうる。あるいは、上述のように、試料のアレイをプローブするためにオリゴヌクレオチドが独立に合成されるとき、すべての配列可能性をカバーするために必要な数は、４ⁿであり、ここでｎは各オリゴヌクレオチドの長さである。すべての可能な配列を正確に検出するために必要な数を作りそして用いることは共に、量的に簡単ではない。たとえば、すべての可能な５量体を作るために必要な数は、1024 である。オリゴヌクレオチドの長さは、それらのハイブリッド化の忠実性を決定し、また全長がオリゴヌクレオチド配列成分からアセンブルされうる容易性を決定する。各場合において、より長いオリゴヌクレオチドが、より良い。ハイブリッド化の忠実性は、用いられるオリゴヌクレオチドが長くなる程、大きくなる。なぜならば、オリゴヌクレオチドが出来るだけ長いとき、より徹底した洗いを実施しうるからである。全長配列が、オーバーラップする配列成分からアセンブルされるとき、配列成分が長い程、有りうる可能な「解」は少くなる。オリゴヌクレオチドプローブが固定化されるところのハイブリッド化方法により配列決定することに伴う別の問題は、標的のサイズが増すとき、その標的内の所定の領域の割合が減少することである。このことは、信号対ノイズ比を小さくし、従って分析されうる標的サイズを制限する効果を持つ。ハイブリッド化の単独使用は、一般に配列分析の良い手段ではない。なぜならば、すべてのオリゴヌクレオチドが所定の条件範囲下で等しい効率又は特異性をもってハイブリッド化する訳ではないからである。従って、解釈上及び／又は実施上の困難性が伴う。固定化された試料のアレイ上でのインサイツの酵素的配列決定の可能性も報告された（ロゼンタール，Ａ．及びブレンナー，Ｓ．１９９３，ミーティングオンゲノムマッピングアンドシーケンシング第222ページ，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９３））。各塩基が異なるように標識され、所定の塩基で延長が停止されるように試料に加えられる。加えられる塩基の数とタイプは、各試料について記録される。テストされるべき次の塩基のために実行が繰返しされうるように、延長のブロックが除去される。各塩基をテストするサイクルは、各試料のための完全な配列を作る。この方法は、ホモポリマー状配列中のメンバーの数を決定することの困難さ、及び所定の試料内の異なる分子が、分析されるべき塩基の位置に関して互いに相外になるという困難性をこうむる。同時に多数の試料において一度に一以上塩基の塩基の順を逐次決定する方法は、もし利用できるなら、魅力的であろう。なぜならば、それは自動化されることができ、少数の試薬しか必要とせず、かつ数十のオーダーの塩基を決定することを可能にし、これは全長配列のアセンブリーを容易にするであろう。たとえば１７の塩基の各配列は（低い複雑性の特別の場合を成す繰返し要素を除き）、ヒトゲノムにおいてユニークである可能性が大きい。ヒトから１７以上の塩基のオーバーラップする配列を作ることは従って、ユニークヒト配列のアセンブリーを容易にする。そのようなプロセスが成功であるためには、試料のいずれかの中の分子がプロセスの間に相外（out of phase）になることを許すことなく一度に一以上のすべての試料上の塩基の順を決定することが必要である。これは、本発明により初めて達成される。本発明は、一以上の所定の塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む特定のアダプターの使用に基づく。本発明のいくつかの実施態様において、切断部位から離された（転移された：displaced）認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼがまた用いられる。しかし、全ての実施態様は、上記のアダプターの使用に依存する。すなわち本発明は、一度に所定の数の塩基を核酸の配列から逐次に除去すること（ここで所定の塩基除去の各工程から残った生成物は、該塩基に対し特異的でありかつオリゴヌクレオチド配列を含む標識されたアダプターにリゲートされる）、又はプライマーを配列決定される核酸にハイブリダイズし、そして該プライマーを一度に所定の数の塩基だけ逐次延長すること（ここで該加えられる塩基は配列決定される核酸中の塩基に相補的であり、該塩基付加工程の各々は、該塩基に対し特異的でありかつ該所定の塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む標識されたアダプターの使用により達成される）を含み；いずれの場合にも該標識されたアダプターの標識はその夫々の所定の塩基に対し特異的であるところの、核酸を配列決定する方法を提供する。所定の塩基除去実施態様は、二本鎖核酸に最も良く適合しており、この技術は本明細書で記載されるようにヌクレアーゼを用いることができる。もちろん、塩基特異的切断の任意の他の適当な方法を、もし望まれるなら、用いることができる。すなわち、本発明の別の局面は、下記工程を含む、二本鎖核酸の集団を配列決定する方法である。 (a) その認識部位がその切断部位から離されている（転移されている：displa ced）ところの核酸のための所定のヌクレアーゼ認識配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプターを該核酸にリゲートする、ここで該転位は、該リゲーションの結果として、得られたリゲーション生成物中に切断部位（これは、そこで切断すると、該核酸の一つの鎖から一又は複数の塩基の除去を結果する）を作るようなものである； (b) (a) からのリゲーション生成物を該ヌクレアーゼで切断して、不等の鎖長の二本鎖生成物を作る； (c) (b) からの該生成物を、延びる（extending）一本鎖を有する二本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプターの集団とのリゲーションに付す、ここでアダプターの該集団は、それらの延びる一本鎖内に、所定の数の塩基を構成する一又は複数の塩基の全ての可能な順列の少くとも一つの所定のサブセットを有する分子を含み、かつここで各順列は、夫々のユニークなかつ検出可能な標識を備えられており、該集団中の各アダプターは、その認識部位がその切断部位から転位されているヌクレアーゼのためのヌクレアーゼ認識配列を有し、該転位は、この工程(c) のリゲーションの結果として、そこで開裂すると(b) からの該生成物の一つの鎖からの一又は複数の塩基の除去を結果するを作るようなものである； (d) (c) からのリゲーション生成物を分離する； (e) (c) からの分離されたリゲーション生成物を(c) のヌクレアーゼで開裂して、(c) のヌクレアーゼの認識部位を有するフラグメントの集団を作る； (f) (d) において分離されたリゲーション生成物により有される標識を分析するか、又は(e) からのフラグメントにより有される標識を分析する；そして (g) 所望の配列を決定するのに必要な回数、工程(c)〜(f)を繰返す、但し、最後の繰返しは任意的に工程(e)を省略する。好ましくは、上記(c) において、すべての可能な塩基順列がユニークな標識を有する。しかし、標識される順列の割合により決定されるよりも大きい速度で分析を進めることが望まれない限り、順列のサブセットを標識することが十分である。たとえば、４塩基延長は、２５６の順列を有する。もし１６の「色」が標識として利用できるなら、延長中の４塩基の２における可能な塩基の順列のすべてが独立に標識されそして除去されうる。もちろん、情報に「値する塩基」のみが決定される。下記の記載から明らかなように、上記(c) で述べた「所定の数の塩基」とは、配列決定目的のためにモニターされる塩基である。そのような塩基の数は、一又は二以上でありうる。上記プロセスは、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ切断及び認識部位に言及して定義されたが、段階的塩基除去の同じ効果を達成する他の手段が、本発明により明示的に意図され、排除されない。明らかに、特定の制限エンドヌクレアーゼ（下記参照）の使用は便利であり、好ましいが、絶対的に必須という訳ではない。好ましくは、上記プロセスの前に、プロセスにおいて後に用いられるヌクレアーゼで核酸の集団を処理する。本発明の他の局面は、核酸の配列決定においてその切断部位から転位された認識部位を有するヌクレアーゼの使用、及びその切断部位から転位されたその認識部位を有する少くとも一つのヌクレアーゼ、及び又は二本鎖オリゴヌクレオチド（その中で鎖は、延びる鎖中に一以上の所定の塩基、及びその切断部位から転位されたその認識部位を有するヌクレアーゼのための認識部位を含む二本鎖部分を有する不等長である）の集団を含む核酸配列決定用キットである。好ましくは、１より多いヌクレアーゼのための一つの認識部位がある。なぜなら、塩基特異的除去のためにどのヌクレアーゼが用いられるかについて選択が行われうるからである。このことは、たとえば、配列決定される試料中の一つのヌクレアーゼのために一つの部位がすでに在り、しかし他方のヌクレアーゼのためにはない場合に、有利である。オリゴヌクレオチド又はアダプター中に１より多い認識部位を備えることが実際的であるが、但し、部位はオーバーラップしてはならない。あるいは、もし両方の認識部位の配列が、両方の認識部位が変えられることなしに部分的オーバーラップを収容するであろう様式で部分的に同じであるなら、複数の部位が働く。切断末端の同じ「タイプ」がまた、酵素により発生されなければならない。たとえば、３′オーバーハングを作るヌクレアーゼのための認識部位は、５′オーバーハングを作るヌクレアーゼのための認識部位の同時使用を排除する。本発明の所定の塩基付加実施態様は、少くとも幾分知られた配列を備えられた一本鎖核酸の配列決定に最良に適している。従って、本発明の他の局面は、少くとも幾分知られた配列を有する又は備えられた一本鎖核酸を配列決定する方法であって、下記の工程を含む。 (a) 該核酸中の決定されるべき未知の配列に極近接した該既知配列にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする； (b) 未知配列に極近接する該オリゴヌクレオチドの末端を、リゲートされるその末端に位置するところの所定の数の塩基の全ての可能な順列を含むオリゴヌクレオチド配列を有する標識されたアダプターの集団とのリゲーションに付す、ここで該集団のアダプターは、所望により同時に、予め選択された群で、又は一つづつ用いられる； (c) (b) でリゲートされた該集団から特定のアダプターを検出する； (d) 該一以上の所定の塩基を除き該特定のリゲートされたアダプターの全てを除去し、それにより、得た生成物の二本鎖領域を延長する；そして (e) 未知配列を決定するために必要な程度に工程 (b)〜(d) を繰返す、但し最終の繰返しは所望により工程(d) を省略する。本発明に従うすべてのプロセスは、標識されたアダプター分子（これは好ましくは一つのオリゴヌクレオチドにより全体的に構成され、しかしこれが必須ではない）の使用を要求するので、問題の標識の性質が本発明にとって重要でないことを留意するのが重要である。特異性を伴って特定のアダプター（リゲートされた状態にあっても、なくても）を検出する、従ってそれらが有する特定の所定の塩基を検出する任意のあたらきうる手段が、本発明の目的のために十分である。用いうる標識は当業者に知られているものを包含し、たとえば放射性同位体、安定な同位体、相同な又は類似の配列、染料、螢光化合物、酵素、ビオチン、炭水化物である。言葉「標識」は、配列決定プロセスにおいて不都合な妨害なしに何らかの手段により検出されうるものをカバーすると広く解釈されるべきである。本発明をここで、上述の実施態様の種々のカテゴリーに関して更に説明する。所定の塩基除去プロセスにより構成される本発明の局面にまず戻ると、このプロセスは、一端から所定の数の塩基だけ全ての試料を同時に選択的に減成し、そして減成の直前又は直後に各修飾された端における塩基を記録するために、或るカテゴリーの制限エンドヌクレアーゼを利用することに気付くであろう。プロセスのサイクル的繰返しは、試料端から数十塩基のオーダーの長い配列情報を発生する。本プロセスで用いうるヌクレアーゼは、その切断部位が二本鎖基質の二つの鎖を横切って対称的に間隔を置かれており、かつその特異性が切断部位に近接する塩基の性質により影響されないところの制限エンドヌクレアーゼを包含する。このタイプのタイプII制限エンドヌクレアーゼは全体として、特異性の広い範囲をカバーし、容易に入手でき、かつそれらの作用において高度に特異的かつ効率的である（レビュー：ロバーツ，Ｒ．Ｊ．Ｎucl．Ａcids res．１８，１９９０，ｐ2331−2365）。従って、所定の塩基除去プロセスは、分析されるべき試料の端に向かう塩基特異的切断を利用する。もちろん、分析される試料がヌクレアーゼ切断部位を内部的に持つ配列を含むことが可能である（そして、これが一般な場合でありうる。そのような試料は、用いられる塩基特異的切断が内部的にならびに所望の端で起きないように、予め用意されなければならない。これを達成する一つの手段は、得られたフラグメントがその後、そのような酵素により切断されないような適切なヌクレアーゼ（単数又は複数）で試料を予め処理することである。実際、すると配列分析は、得られたフラグメントの端に限られる。もし所望なら、選択されたヌクレアーゼが関与する予備切断の既知パターンが、プロセスで次に用いられるヌクレアーゼ酵素のみでなく、加えて他のヌクレアーゼをも用いて、本プロセスの実施の前に用いられうる。加えて、配列決定される核酸試料は、それらが個々の核酸の間の干渉なしに同時にプロセスにより処理されそして分析されうるように用意されることができる。これを達成する一つの手段は、別々の反応容器中に各核酸を有することである。しかし、本発明は、独立の固定化の使用により容器中の区別しうる核酸について、一つの反応容器中の多くの試料の好ましい同時的なプロセシングと分析に容易に適している。好ましくは、本発明のプロセスにおいて用いられるリゲーション反応は、ＤＮＡリガーゼ（該酵素はもちろん容易に入手でき、使用が容易である）により触媒される。所定の塩基付加方法の一般的枠組みは、添付の図１に示さえてる。図１に示す枠組みにおいて、例示のために、単一の制限エンドヌクレアーゼ、すなわちＢsa Ｉが用いられている。しかし、本発明の所定の塩基除去の局面は、単一の所定のヌクレアーゼの使用に限られない。所望なら、種々のヌクレアーゼの使用の所定のパターンを、配列決定操作の間の種々の段階で用いることができる。添付の図１に示した枠組みにおいて、分析されるフラグメントは、まずＢsaＩにより作られ、これはまた、末端の段階的塩基特異的分析のために用いられる。これは、段階的減成の結果として配列が「使い尽される」ような時まで分析の間に内部的に酵素が切断する可能性を避ける。大きな核酸において、平均してフラグメントは、それらがＢsa１認識部位を保持しているかどうか（及びどのように保持しているか）に依存して三つのタイプに分析されうる。一つのタイプは、その末端のいずれにもＢsa１認識配列を有さない。一つのタイプはその末端の一つにＢsa１認識配列を有する。一つのタイプは、その末端の両者にＢsa１認識配列を有する。平均してそれらは、夫々１：２：１の割合であろう。この場合、分析は、Ｂsa１認識配列を完全に欠くフラグメントに限られる。当業者が、要求されるフラグメントのために選択しうる多数の方策があり、それらの例は、下記の実施例中に見られる。加えて、当業者が、Ｂ sa１認識配列が起こるところの端からそのような配列の除去のために選択しうる方策がある。そのような方法の一つは、活性なＢsa１の存在下で、Ｂsa１切断ＤＮＡに、Ｂsa１認識配列を有するアダプター（その使用は配列決定される核酸試料から塩基の除去を結果するであろう）をリゲートすることである。アダプターがリゲートされると、後の各切断において二つの可能な結果がある。一つは、フラグメント中のＢsa１部位が用いられることであり、この場合にアダプターの部分が切断除去される。あるいは、アダプターのＢsa１部位が用いられ、その場合には塩基は試料から除去される。付加及び切断のサイクルが続いて起こるであろう。終局的に、偶然に試料のＢsa１部位が除去され、そして更に切断が試料から起きるであろう。適当なタイトレーションが、Ｂsa１により十分に消耗されしかしアダプターから消化により平均サイズにおいて過度に減少されていない集団を与えるために必要な処理のレベルを決定するであろう。これは事実、内部配列を配列決定プロセスに付す一般的方法である。他のそのような方法は知られている（たとえばマンガン²⁺の存在下でのＤＮＡse１での処理、Ｂａ１３１での処理又はランダムシェアリング（サムブロック，Ｊ．，フィッチュ，Ｅ．Ｇ．及びマニアチス，Ｔ．編（１９８９），「モレキュラークローニング」コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，ニューヨーク））。重要なことに、図１に示した枠組みにおいて、アダプター分子の二つの一般的タイプが用いられる。オリゴヌクレオチドそのままとして図１に示されているアダプター分子の第一のタイプは、ＢsaＩのための認識部位を含む塩基配列を含む。アダプター内のＢsaＩ認識部位の位置は、興味のブラント末端核酸配列とリゲートし、続いてＢ saＩで切断すると、選択された数の塩基が、分析される核酸の末端から除去され、従って相補的塩基を分析のために露出するようなものである。これは、認識部位と切断点の間の、アダプター内の塩基の数が、その認識部位から酵素ＢsaＩの最大切断距離よりも、配列決定される核酸から除去されるべき塩基の数（所定の数の塩基）だけ少ないことを必要とする。どのエンドヌクレアーゼが用いられるにせよ、それがブラント末端を切断しないで残すべきであることが、プロセスの連続するサイクル的性質のために極めて重要である。残るオーバーハングまたは延びる鎖は、作られる切断の性質に依存して３′又は５′でありうる。図１において、用いられるアダプター分子が、配列決定される核酸にリゲートされるべきオリゴヌクレオチド配列末端から４塩基の位置にある、ＢsaＩのための認識部位を有することが、第一段階から判る。ＢsaＩは、その認識部位から５塩基離れて切断して、４塩基５′オーバーハングを残すので、切断すると、従って一つの所定の塩基が配列決定される核酸から有効に除去される。もちろん、もし必要なら、１より多い塩基が除去され、アダプター分子の末端における塩基の数は、除去される必要がある追加的塩基の数（追加的な所定の塩基の数）だけ減少される。従って、ＢsaＩの場合には、最大５つの塩基が除去されうる。下記から判るように、後の検出工程はしかし、オーバーハングしている鎖中の塩基を分析するのみであり、従って、認識部位を超えて１未満の塩基を残さないことが適当である。後のサイクルにおいて分析のために露出されうる新しい塩基の数は、認識部位と切断部位の間の最短距離に等しい。Ｂsa１の場合には、これは１であり、しかし他の酵素の場合には１より大きく、たとえばＦok１ではそれは９である。図１において、検査される集団中の配列決定されるべき核酸（例示のために２つ）が独立に固相に固定化されて、固定化されていない端を配列分析にさらす。全体プロセス中の第１工程は、このように露出された端がアダプター分子にリゲートされ、残留アダプター分子を洗い落すことである。次にＢsaＩが加えられ、そしてこれは、リゲートされたアダプター及び所定の数の塩基（図に示されているように１つの塩基が除去される）の両者を有効に除去する。次に酵素及び切断されたアダプターが洗い落される。次の工程において、アダプター分子の異なる集団が用いられる。これらのアダプターは、上記した２つのタイプの第２のものである。これらアダプター分子は、オリゴヌクレオチド配列である分子のその部分に延長する鎖を有し、各アダプターの延長する鎖は既知の異なる塩基特異性を有する。所定の塩基特異性の順列のすべての可能な組合せを実際に報告できるアダプター分子の一集団が用いられる。更に、各アダプターは、各アダプター中の予め決定された特定の１又は複数の塩基に対して特異的である検出しうる標識、及び上記したようなヌクレアーゼ認識部位の両者を有する。好ましくは、アダプターの第２のタイプの全集団は、次に、プロセスの前の段階から得られた切断生成物に、その延長する鎖が切断生成物中の延長するオーバーハングに対して実際の相補性を示すところのアダプターのみがリゲートする条件下でリゲートされる。そのような条件は、たとえば（しかし必須ではない）、２０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、２４℃でｐＨ７．５、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのアデノシン三燐酸及び１ｍＭのジチオスレイトールを含む５０μｌの反応容積において、１ｐモルの切断生成物、２００ｐモルのアダプター、及び０．２５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを１６℃で４〜１６時間用いることでありうる。時間、温度及びイオン強度の条件は、リゲーション及び特異性の要求される速度を達成するため当業者により変えられうる。もちろん、あるいは、この段階における各アダプター分子は、検査される各核酸試料とリゲートされて、それがリゲートするか否かを決定することができる。しかし、用いられるアダプター分子の集団が、対応する特定の標識を有する異なる塩基特異性を夫々持つ分子を含むことが好ましい。このようにして、アダプター分子は同時にリゲートされることができ、そして、用いられなかった（リゲートしなかった）アダプターを洗い去った後に、実際にリゲートしたこれらアダプター分子は決定され、区別されることができる。図１で例示のために、最も上に示された核酸は、塩基Ｃ‐特異的アダプター分子にリゲートすることにより緑になり、一方、最も下に示された核酸は、塩基Ａ ‐特異的アダプター分子にリゲートすることにより赤になる。本質的に、分析のために２つの手近なオプションがある。第一のオプションにおいて、核酸配列と成功裡にリゲートした特定のアダプター分子の検出は、これら分子がリゲートしたままで実行されうる。これは、図１において分析オプション１として示されている。そのようなオプションは、多くの試料が同じ反応容器内で合成されるときに好ましく、そしてプロセスは敏感かつ低費用である。従って、核酸試料は夫々、一般に市販入手できる別々の１〜５μ直径のビーズに固定化されることができる。次に、百万以上のビーズが、像分析と結合された標準蛍光顕微鏡を用いて楽に分析されうる。反応体積は非常に小さく、従って反応試薬のコストが下がる。別の分析オプション、すなわち図１に示される分析オプション２は、標識されたアダプターを含むリゲーションの生成物が、制限酵素ＢsaＩの更なる作用に付されると、存在する。標識されたアダプター分子はＢsaＩのための認識部位も有するので、切断が再び可能である。前のように、認識部位は、そのようなアダプター分子のオリゴヌクレオチド部分中に、１以上の所定の塩基が分析される各核酸配列の末端から除去されて、延びる鎖を残すように、意図的に位置される。図１において、ＢsaＩは、各核酸からアダプター分子を末端塩基と共に除去する。プロセスのこの段階で除去される塩基の数は、プロセスの第一段階に関して上述したのとほとんど同じように、酵素認識配列の位置取りに明らかに依存する。いずれにしても、決定されるべき元の配列の固定化の結果として、全体プロセス中の第二のＢsaＩ切断の後に、特定のアダプターの集団が遊離され、これは分析オプション２においてそれらの特定の標識について分析されうる。このプロセスにより作られる標識の分析は、分析される核酸配列から導かれる塩基特異的情報を明らかに与える。分析オプション２において、所望ならアダプター分子は、ロボット的に制御されるサンプリング及びオフライン検出の使用により検出されうる。ロボット的液体取扱いは、分子生物学分野で普通になっている（ウーレン，Ｍ．，ら、トレンズインバイオテック１０ｐ52−55（１９９２））。図１から判るように、リゲーション及び分析の第一サイクルは、ここで完了である。従って、第一段階の後に、プロセスの各サイクルは、標識されたアダプターのリゲーションを含み、続いて(a) 特定の標識の検出及び続いて、核酸配列からアダプタープラス所定の数の末端塩基の除去、又は(b) 核酸からアダプタープラス１以上の所定の末端塩基の除去及び続く標識検出を含む。プロセスを続けるために、新しいサイクルがスタートされねばならない。従って、アダプター分子のリゲーションの新しいサイクルが、どの塩基が減成された核酸配列末端に今存在するかを決定する前に、上述のように行なわれる。図１の第二サイクルにおいて、最も上の核酸は、塩基Ｇ‐特定的なアダプターのリゲーションを経てシアン色になり、最も下の核酸は塩基Ｔ‐特異的アダプターのリゲーションを経て青色になる。所望の数の塩基が、検査される核酸の末端において分析されるまで、又は配列の全体が決定されるまで、次の一又は複数の塩基を露出するために本プロセスは、標識されたアダプターのリゲーション、洗い及びラベルの検出及びアダプターの除去のサイクルで繰返される。一番最後の段階において、最後の一又は複数の塩基が決定されるとき、最終の切断工程が省略されるか否かはもちろん、任意であり、プロセスの他の特に依存する。分析オプション１を用いると、最終の切断工程は必要ない。オリゴヌクレオチド配列を含むアダプター分子の構成が、直上で述べた配列決定プロセスにとって重要であることが理解されよう。実際、用いられうる異なるアダプター分子の数における唯一の制限は、プロセスの次に段階におけるアダプター特異性の決定のために利用できる、区別できるように異なる標識の数である。個々に特異的に標識される多数のアダプター分子の利用可能性は、１サイクル当り１度に１より多い塩基が分析されうる利点を有する。従って、たとえば、１度に２つの塩基の除去は、夫々異なるかつ区別しうる標識を有する１６の異なるアダプター分子の使用を必要とするであろう。１６の異なる標識が利用できる場合には、すべての有りうる生成物を同時に分析することが可能である。一般的に言って、必要とされるアダプター分子の数は４ⁿであり、ここでｎは１サイクル当り１核酸当り分析されるべき塩基の数である。各塩基を２度以上で続々と分析することも可能である。これは、１サイクル当り除去される塩基よりも多いアダプター分子を用いることにより達成されうる。たとえば、もし各サイクルの間に１６の異なる区別しうる標識をされたアダプターが用いられ、各アダプターは２つの異なる塩基のユニークな組合せを認識するなら、減成されそして配列決定される核酸の末端において所定の塩基が最初に露出されるサイクルにおいて、それは、標識されたアダプター中の相補的塩基の最５′末端における塩基の特異性の結果として検出される（図１を見よ）。しかし、１サイクル後に、同じ塩基が、アダプター分子中の末尾から２番目の塩基により検出されるであろう。上記プロセスで用いられる（第２のタイプの−上記参照）アダプター分子の正確な構成は、ヌクレアーゼ認識部位及び１以上の所定の塩基を提供するために適当な配列を持つオリゴヌクレオチド部分が明らかに含まれねばならないこと及びアダプターは所定の塩基特異的標識を有さなければならないことを除いて、重要でない。減成される核酸配列中の露出された塩基を検出するために用いられるアダプター分子中の塩基がアダプター中の延びる鎖の最末端にあることは必須でなく、それらが延びる鎖内に含まれることのみが必須である。そのような一又は複数の塩基の正確な位置は単に、全体プロセス中でいつそれらが読まれるであろうかを決める。最も好ましくは、本発明におけるアダプターは、切断生成物の末端に結合されうる短い二本鎖オリゴヌクレオチドである。それらは、それらの配列が予め決定されることができ、かつ高濃度が容易に作られるように、化学的に合成されたものであろう。それらはまた、それらをプロセスの間に容易に精製できるように化学的に変性されうる。理想的には、それらの５′末端は、ホスホリル化されていず、従って、減成された核酸フラグメントに結合されると、該フラグメントのアダプター化された末端はもはや更なるリゲーション反応に参加できない。アダプターが関与する不適当なリゲーションの危険は、かくして避けられる。逐次的な所定塩基除去により進む本発明のプロセスにおいて時々、制限エントヌクレアーゼ（一又は複数）のための新しい切断部位が、減成された核酸配列への標識されたアダプターのリゲーションにより作られる場合がありうる。これは、用いられたアダプターの範囲から１より多いタイプのアダプターが核酸にリゲートできる時に検出される（もし同じ塩基が、生じるところの各切断により露出されるのでなければ）。後者の場合、これは、配列が広がる（deverge）サイクルの間にプロセスによって終局的には検出されるであろう。新しい切断部位形成の上記可能性を除去するために、１以上の塩基に切断の方向に１以上の塩基を与えることができ、そしてプロセスにおいて元と類似の、しかし元から（切断の方向に）移転された追加の認識部位を作ることができる酵素認識部位の使用が避けられる。更に、認識部位と切断部位の間にあるアダプターの部分で、１以上の塩基を、それらが認識部位で起る順に、切断部位から離れている認識部位の側から置くことを避けることが望ましく、かくして、配列決定される核酸が、元の認識部位と類似の、しかし切断の方向に元から移転された新しい認識部位を作るのに必要な塩基を与える可能性を除く。他の類似の手段が有効でありうる。ここで本発明の所定塩基付加プロセスに移ると、上述のように、本発明は、決定されるべき未知の核酸配列に極近接する既知配列にアニールされるオリゴヌクレオチドプライマーに、一度に１以上の塩基が付加される実施態様を含む。これは一般に、図２に示され、そしてもちろん、一本鎖核酸に適する。そのようなアニーリング後に、この特定の実施態様における次の段階は、かくして作られた二重体を、オリゴヌクレオチド配列の末端に１以上の所定塩基を有するアダプターの集団とのリゲーションに付すことである。本発明の他の実施態様については、所定塩基の数と、特定の所定塩基を検出するために用いられる利用できる標識の数との間に相互関係がある。（核酸を配列決定するためのそのような塩基付加実施態様の核心において延長プロセスにとって重要な）アダプター分子のオリゴヌクレオチド末端は別として、これら特定のアダプター分子の構造の残部は理想的には、リゲーションを容易にするために非特異的であり、又はヌクレオチド配列である必要すらないが、但し、分子の実際の性質は本発明のプロセスを妨害しないようなものである必要がある。思い出されるように、プロセスの次の段階は、アダプターのリゲーションに続く特定のラベル（１又は複数）の検出である。これはもちろん、プライマーに付加された特定の塩基（１又は複数）を同定し、そして従って、配列決定される核酸鎖中の相補的塩基を同定する。このプロセスの１サイクルにおける最終工程は、プライマー／核酸二重体の二本鎖領域を延長した１以上の所定塩基を除いてアダプター分子のすべての除去である。理解されるように、サイクルの繰返しは、決定される一本鎖配列のための配列情報を発生する。アダプター分子の非特異的部分の除去が行なわれる各サイクルの段階において、これを行う手段は、それに応じて指名されたアダプター分子に関して酵素的又は化学的でありうる。たとえば、二重体に加えられる塩基（所定の塩基）とアダプターの非特異的部分の間のホスホチオネート結合（１又は複数）の位置決めを用いることができて（実施例３参照）、所定塩基以外のすべてをエキソヌクレアーゼが除去することを許す。本発明の実施態様は、数十万の試料を同時に処理することを可能にして、極めて高い処理量を可能にする。従って、適用は、たとえば高度に複雑な核酸試料から全ゲノムまでの分析、たとえば集団又は進化研究を行う時又は複雑な関連、特に病気に関連する特性を研究する時、微生物タイプを分類する、又は細胞又は組織の合計の比転写活性を決定する時の多くの異なる固体からの多くの異なる核酸の研究を含む。塩基の相違の小さなパーセンテージに基づく診断も容易になる。好ましくは配列決定される複数の核酸は、同時的にかつ独立に固定化される。好ましい方法は、ビーズまたはプレート形状、特にガラスビーズ又はプレート上の固定化されたオリゴヌクレオチドであるアダプターを用いることである。ガラスビーズは、最適サイズの選択を可能にする広い範囲の平均直径で入手できること、慣用の化学、特にオリゴヌクレオチド合成を標識を付着するために用いうること、反応された後に、それらは不活性にされうること、及びそれらの形は高度に不規則でありうること（像分析による容易かつ繰返しの同定を可能にする）という利点を持つ。プレートは、同様な化学的利点を有し、また試料の高密度がプレート上に配置されることができる（プレートはすると、走査装置での読みのための便利な形状である）という利点を提供する。個々のフラグメントを単一のタイプのビーズ上に固定化することを可能にするために、核酸フラグメントの大集団を十分な回数細分することは、一般に実際的でない。従って、各ビーズが唯一つのタイプのフラグメントを認識するように合成された、ビーズの混合集団を用意すべきである。各ビーズ上の十分な長さの異なるオリゴヌクレオチドの存在は、各ビーズがハイブリダイゼーションにより異なる配列を捕獲することを可能にする。捕獲された配列をオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合するために、もし必要なら、従来周知の方法を用いる。プレート又はシート形状の他の物質が、研究対象の試料を結合する又は共有的に付着するよう導き出される／適合されることができる。本発明の他の局面におけるように、所定塩基の付加の全プロセスにおけるリゲーションは、ＤＮＡリガーゼを用いて行いうる。所与のビーズ上に唯一つのタイプのオリゴヌクレオチドが見られるようにガラスビーズ上で多くの異なるオリゴヌクレオチドを同時に合成するために、サイクル的プロセスが用いられる。これは、要求される第一の塩基の夫々のための別々の合成をビーズ上で行うことにより達成される。これら合成の生成物は次に、一緒に混合され、次に４つの別々の合成反応（加えられる塩基の夫々のために１つ）へと分割される。このサイクルは、ビーズ上で変ることが要求されるだけ多くの位置のために繰り返される。所与のビーズは、その付着されたオリゴヌクレオチド内に塩基の一つの組合せを持つことができるだけである。なぜなら、それは、１合成サイクル当り１つのタイプの塩基付加にさらされただけであるからである。塩基の実際の順は、ビーズがさらされるところの実際の塩基付加により決定される。この一般的タイプのサイクルは、各ビーズが単一のペプチドを有するようにビーズ上で多くの異なるペプチドを同時に合成するために繰返された（ラン，Ｋ．，Ｓ．，らＮature 354 ｐ82-84（１９９１））。各ビーズ上のオリゴヌクレオチドが唯一つのユニークな核酸配列にハイブリダイズすることを保証するために、配列決定されるフラグメントのセットにおいて起ると予想されるよりもかなり多い順列の、ビーズ上の塩基が用いられる。従って、少数のビーズが、実際に配列を検出する。従って、実際目的には、１つの占領されたビーズ当り１つのタイプのフラグメントが存在するのみである。本発明のキットに関しては、そのようなキットはもちろん、適当な又は所望の他の物品、たとえばＤＮＡリガーゼ、又はオリゴヌクレオチド標識を有効に用いるために必要とされる化学薬品を含みうる。またキットはもちろん、指図書を含みうる。本発明はまた、所定塩基の付加プロセスに関係して上述したアダプター分子、及び本発明の所定塩基の除去プロセスでの使用のために上述したアダプターを包含しうる。以下で、特定の例示的物質に言及して本発明を更に説明する。実施例これら実施例で用いられるオリゴヌクレオチドの総ては、Ａ．Ｂ．Ｉ．３８０Ｂを用いて１μＭ規模で合成されるか、又は商業的に注文合成される（オズウェルエジンバーグ）。合成は、ビオチン又はアミノリンカーによる取りこみにより変性が実施されないなら、トリチルオン（Ｔrityl on）である。必要な場合、ビオチンが、合成の間にオリゴヌクレオチドの最後の（５′）位置で、ビオチンホスホルアミダイト（ＤＭＴ‐ビオチン‐Ｃ６‐ホスホルアミダイト，ケンブリッジリサーチバイオケミカルズインコーポレーテッド）により取込まれ、この場合、オリゴヌクレオチドはトリチルオフにされる。必要なら、蛍光プライマーは、合成の間にマルチ‐アミノ‐Ｃ６‐ホスホルアミダイト（ケンブリッジリサーチバイオケミカルズインコーポレーテッド）を用いて適当な位置にアミノインカーを取込むことにより作られる。これらはまた、トリチルオフにされる。実際の染料は、後にカップルされる。あるいは染料は、蛍光標識（Ａ．Ｂ．Ｉ．）を付加できる適当なホスホルアミダイトを用いて、合成の間に取込まれうる。必要なら、他の変性は、５′末端ホスホリル化又はホスホロチオエート結合の含入を包含する（ステック，Ｗ．Ｊ．，ゾン，Ｇ．，エガン，Ｗ．，及びステック，Ｂ．Ｊ．，Ａmer．Ｃhem．Ｓoc．ｐ6077−6079（１９８４），ステック，Ｗ．Ｊ．及びゾン，Ｇ．，Ｔetrahedron Ｌetters 25 ｐ5275-5278（１９８４），ステック，Ｗ．Ｊ．及びゾン，Ｇ．，Ｊ．Ｃhromatography 326 ｐ263-28 0（１９８５））。ホスホリル化は、５′ホスフェート‐オン（ケンブリッジリサーチバイオケミカルズインコーポレーテッド）の使用により合成の間に化学的であるか、又は酵素的である。酵素的ホスホリル化は、合成及び精製の後に行なわれる。こん跡のアンモニアの総てが除去されるように注意する。さもなくば、酵素的ホスホリル化が抑止される。稼働バッファーとして下記のバイオゲルスピンカラムの追加的使用（２４℃でｐＨ７．５のＴris ＨＣｌを除く）は、アンモニア除去を保証する一手段である。酵素的ホスホリル化は、１ｍＭアデノシン三燐酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール，１０ｍＭＴris‐ＨＣｌ（２４℃でｐＨ７．５）中の０．５μｇのオリゴヌクレオチド、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、２５μｌの反応系中で３６７℃で３０分間行われる。精製は、同体積のフェノール／クロロホルム１：１での２会の抽出及びバイオゲルｐ６ＤＳＧ樹脂スピンカラム（実施例１参照）に通すことによる。該カラムのためのバッファーは、ＴＥＡ：１００ｍＭトリエチルアミンアセテート（２５℃でｐＨ７）である。溶出液中のオリゴヌクレオチドは、アクアバック中で５０℃で２時間乾燥され、そして使用のために水に再溶解される。すべてのオリゴヌクレオチドは、水浴中で８〜１６時間、５５℃で脱保護される。２〜３滴の３Ｍトリエチルアミンアセテート（２５℃でｐＨ７．０）が初めに、トリチルオンオリゴヌクレオチドに加えられて、トリチル基を保護する。次いでオリゴヌクレオチドは、ロータリーエバポレーター中でトリチルオフまたはトリチルオンのために、夫々５０℃又は３５℃で乾燥されて、オリゴヌクレオチドを脱保護する。オリゴヌクレオチド（何らかの形の変性を有するものを除き）は、ＨＰＬＣ等級の水に再溶解される。染料標識されるべきアミノ結合されたオリゴヌクレオチドの各６０μｇを、ｐＨ９．０で０．５Ｍ重炭酸ナトリウバッファー８０μｌ中に再溶解する。６μｌの適当な染料エステル（ＦＡＭ‐ＮＨＳエステル、ＪＯＥ‐ＮＨＳエステル，ＪＡＭＲＡ‐ＮＨＳエステルまたはＲＯＸ‐ＮＨＳエステル、すべてＡ．Ｂ．Ｉ．）を、これらがその上で要求されるところのオリゴヌクレオチドに加え、暗中で環境条件で１夜インキュベーションする。染料が結合したオリゴヌクレオチドは、スピンカラムに通され（実施例１参照）、そして更にＨＰＬＣにより精製される。この場合のスピンカラムは、稼働バッファーとして１００ｍＭＴＥＡ（２５℃でｐＨ７．０）を用いる。ＨＰＬＣは、リバースフェーズＣ１８セミ‐プレップ（Ｒeverse Ｐhase Ｃ18 Ｓemi-prep）カラム５μ、２５ｃｍ×１ｃｍ（ベックマンウルトラスフェア）、バッファーＢ（７０％アセトニトリル）及びバッファーＡ（１００ｍＭトリエチルアミンアセテート，ｐＨ７．０）を用いて、４．７ｍｌ／分の流速で行われる。オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣに挿入された０．２２μＭフィルターを用いて濾過され、そして表１中の適当な勾配に従って精製される。最大のピーク（約９〜１１分の間に溶出）は、要求されたオリゴヌクレオチドを含む。溶出液は、ロータリーエバポレーター中で５０℃で乾燥され、そして２００μｌのＨＰＬＣ等級の水に再溶解される。今や、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドが、使用のために出来上った。トリチルオンオリゴヌクレオチドは、氷酢酸を８０％まで加えそして環境条件で２０分間インキュベートすることにより脱トリチル化される。脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドに同体積の無水エタノールを加え、次にロータリーエバポレーターにより５０℃で乾燥する。それらを、ＨＰＬＣ等級の水４００μｌに再溶解し、次に４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）及び１０００μｌの無水エタノールを加えることにより室温で３０分間沈殿させて、更に精製する。微小遠心管中で２０分間フルスピードでペレットを集め、３７℃で乾燥し、２００μｌの水に再溶解する。これは使用のために準備ができている。実施例１：固相捕獲を利用する、pBR322の1138塩基対をもつ、NdeI〜BsaI制限フラグメントの、塩基除去配列解析該プラスミドpBR322中には、位置3429に、該制限エンドヌクレアーゼBsaIに対する単一のサイト（部位）がある。サットクリッフェ(Sutcliffe)，J.G.,コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)Symp．Quant．Biol.，1978，pp．77 -90。BsaIによる認識および開裂（切断）は以下の通りである。従って、そのpBR322に及ぼす作用は、該認識サイト方向における5' ACCGの一本鎖伸長（延長）および逆方向における5' CGGT を残す。このことは、上記の配列決定法で説明した該原理を立証する機会を与える。Nd eIは、またpBR322を一旦位置2295においても開裂する。BsaI/NdeI による二重消化によってpBR322から生成されるこれら２種のフラグメントのうち、該BsaI認識サイトの欠如した該フラグメントの該BsaIにより生成された端部を、固相に固定化し、かつ該NdeI切断端部から配列決定工程により解析できる。 24℃におけるpH 7.9の制限バッファー：50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス(T ris)アセテート、10mMの酢酸マグネシウムおよび１mMのジチオスレイトールを含有する25μｌの反応体積中にて、55℃で１時間インキュベートすることにより、５単位のBsaIによって、使用したpBR322の各１μｇを完全に消化する。この反応系を37℃に冷却し、10単位のNdeIを添加し、更に１時間インキュベートすることによって、この二重消化を完了する。等体積の1:1 フェノール／クロロホルムで２回抽出し、次いでTE: Tris-HCl p H 7.5，1mM EDTA を含有する、バイオゲル(Biogel) P6 DSG 樹脂スピンカラムに通すことによって、該得られる混合物から、DNA を精製する。この未旋回カラムは高さ1.5 cmおよび半径0.4 cmなる寸法をもつ。旋回はローター半径145 mmをもつクリニカルセンチヒュージ(Clinical Centifuge)内で、2200 rpmにて2.5 分間実施する。該固相に接合すべき端部を、BsaIサイトの欠如したビオチン化オリゴヌクレオチドアダプターに連結（リゲート）する：これは、該BsaI認識サイトの欠如した該pBR322フラグメントのBsaI生成端部をアダプターする。同時に、該NdeI末端を、除去されて、レポーターアダプターにより解析可能な端部を残すのに適した立体配置で、BsaIサイトを含有する非ビオチン化アダプターに連結する：このアダプターも、該NdeIにより生成された端部が一緒に再連結されるのを阻止する。この連結反応は、上で精製されたフラグメントを使用して、塩化マグネシウムを10mMに、ジチオスレイトールを１mMに、アデノシン三燐酸を１mMに、塩化ナトリウムを50mMにおよびTris-HClを20mMに調節することにより生成した、24℃にて pH 7.5の連結バッファー50μｌ中で実施する。2.5 単位のT4DNA リガーゼ(Ligas e)および各200 ピコモルの上記アダプターを添加し、かつ該反応を16℃にて16時間実施した。この連結した材料を、等体積の1:1 フェノール／クロロホルムで抽出し、次いでこれを製造業者等の指示に従って、酢酸マグネシウムの少ない制限バッファーを含有する、セファクリルS-400 マイクロスピン(Sephacryl S-400 Microspin) カラムHR (ファルマーシア(Pharmacia))に通すことによって、該生成する混合物から精製する。この未旋回カラムは、高さ約1.5 cmおよび半径0.4 cmなる寸法をもつ。旋回はローター半径145 mmをもつクリニカルセンチヒュージ(Clinical Ce ntifuge)内で、1850 rpmにて２分間実施する。酢酸マグネシウムを10mMまで添加する。10単位のBsaIを添加し、55℃にて１時間インキュベーションを実施する。これにより該BsaIサイトをもつ該アダプターを、解析すべき該フラグメントから開裂し、5' CATA−本鎖伸長をもつフラグメントが残される。この解析すべきフラグメントを、次にストレプトアビジン(Streptavidin)被覆磁性ビーズ固体相(ダイナビーズ(Dynabeads) M-280 ストレプトアビジン(Strep tavidin)，ダイナール(Dynal))に結合することにより、固定化する。これらのビーズを穏やかに再懸濁し、20μｌの懸濁液を、0.5 mlの微量遠心管に取り出した。該懸濁液中のビーズを以下の如く洗浄する。先ず、該ビーズをマグネチックパーティクルコンセントレータ(Magnetic Particle Concentrator)(MPC-E，ダイナール(Dynal))内のチューブに入れて沈降させ、生成する上澄を注意して取り出す。該チューブを該マグネットから取り出し、該ビーズを40μｌの結合／洗浄バッファー（10mMのTris-HCl(25℃にてpH 7.5)、１mMのEDTAおよび2Mの塩化ナトリウム）中に穏やかに再懸濁させる。洗浄を更に２回繰り返す。最後の洗浄後に、20 μｌの結合／洗浄バッファーを使用して、該ビーズを再懸濁する。次いで、これらを上記の制限消化系に添加し、かつこの新たな懸濁液を28℃にて30分間維持し、時折穏やかに混合して、該ビオチンを該ビーズに結合させる。次いで、フラグメントを結合した該ビーズを、上記と同様に５回洗浄する。但し、最後の再懸濁は40μｌの連結バッファー（上記のもの）中で実施する。各20 0 ピコモルの上記レポーターアダプターおよび2.5 単位のT4DNA リガーゼを添加して、該固定化したフラグメントの該末端に対して特異性をもつものを、該フラグメントの末端に連結させる。これら４種のレポーターアダプターは、以下のフォーマットに従って、上記の如く別々に合成かつ精製される：ここで、Ｘは、各場合において異なる、４種の塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＴの一つであり、Dye(n)は染料FAM、JOE、TAMRA またはROX の１種であり、各染料は位置Ｘにおける該塩基の一つのみに対応している。該Ａ特異的レポーターアダプターは JOE によって標識され、該染料の蛍光は、中心バンド560 nmをもつフィルタを通して検出され、該Ｃ特異的レポーターは染料FAM によって標識され、該染料の蛍光は中心バンド531 nmをもっフィルタを通して検出され、該Ｇ特異的レポーターは染料TAMRA によって標識され、該染料の蛍光は中心バンド580 nmをもつフィルタを通して検出され、一方で該Ｔ特異的レポーターは染料ROX によって標識され、該染料の蛍光は中心バンド610 nmをもつフィルタを通して検出される。これらのレポーターアダプターは、等しい比率で混合され、次いで等モル量の該レポーターアダプター混合物と以下の相補オリゴヌクレオチドも一緒に混合される：連結を16℃にて６時間進行させ、かつ該ビーズを５回、上記の洗浄／結合バッファーを使用して洗浄することにより未連結物質を除去する（但し、最後の再懸濁は、40μｌの制限バッファー中で実施する）。 10単位のBsaIを添加し、時折穏やかに混合しつつ、55℃にて１時間インキュベーションを行って、該固定化フラグメントから該レポーターアダプターおよび塩基１個を除去する。該ビーズ上の該フラグメントを洗浄して、上記のようなレポーターアダプターへのもう一回の連結の準備を調える。但し、該第一の上澄中に見出されるレポーターアダプターは精製される。該レポーターアダプターの精製は、等体積のフェノール／クロロホルムで抽出し、次いで上記の如くバイオゲルスピンカラムに通すことにより実施するが、この際のスピンカラムバッファーは、トリエチルアミンアセテート100 mMを含み、 25℃でのpHは７である。遊離したレポーターを含むこの溶出液をアクアバック（ aquavac）中で50℃にて２時間乾燥し、このアダプターを、可視量のデキストランブルー(Dextran Blue)を含有する1:1 ホルムアミド／50mM EDTA 3.5 μｌ中に再溶解し、かつ解析するまで４℃にて保存する。該レポーターアダプターの連結、洗浄、BSaIによる開裂、開裂によって該上澄中に取り出された該レポーターアダプターの洗浄並びに精製からなる（全て上記したような）サイクルを、更に５回実施する。ホルムアミド中の該レポーターアダプター試料各々を、ABI モデル373A DNA配列決定装置を使用して解析する。これら試料を２分間に渡り90℃に加熱し、氷上に置き、次いでベーススプリンター(Base Sprinter) ゲル上に載せ、その製造業者等の指示に従って稼働させる。同一の処理にかけ、プールした試料の濃縮を実施し、あるいは必要に応じて希釈を行って、該DNA 配列決定装置を使用して、最適のシグナル強度を得る。上記のホルムアミド／EDTAの同一のアリコート中に再溶解することにより、試料をプールし、一方で最適のシグナル強度を得るために必要なら、希釈も、該ホルムアミド中で実施する。製造業者等の指示に従って、該製造業者の染料プライマー化学によって配列決定されたM13mp18 および未使用のレポーターアダプターをも、別々にかつ同時にコントロールとして解析する。該レポーターアダプターの全ては、34塩基配列に等価な速度で移動し、使用した異なる染料によって付与された移動度における識別を可能とする。しかしながら、これらが蛍光を発する波長は、所定のサイクル中に、どのレポーターアダプターが該固定化フラグメントに連結できたかに依存する。BsaIによって除去された該第一のレポーターは該610 nmのフィルタを介して検出され、該レポーター上のＴが、該固定化されたフラグメント上の対向するＡと連結することを示す。除去された該第二のレポーターは560 nmのフィルタを介して検出され、該レポーター上のＡが、該固定化されたフラグメント上の対向するＴと連結すること、およびBsaIが該第一のレポーターと共に該Ａを除去し、該Ａが前のレポーターによって、該固定化フラグメント上に検出されることを示す。残りのレポーターは、該配列決定された固定化フラグメントの末端において、除去される塩基に相補的な残りの塩基の順序Ｃ、Ｇ、Ｃ、Ｃに対応して、除去される順序で、それぞれ531 nm、580 nm、531 nmおよび531 nmのフィルタを通して検出される。従って、該フラグメントの端部における完全な配列は、該新開発のアダプターによって可能となった、該第一のBsaI開裂位置である該5'末端から３塩基で開始する、サットクリッフェ(Sutcliffe)(上記文献) によって予想されたような5'ATGCGGである。実施例２：pBR322の375塩基対をもつEcoRI 〜BamHI の制限フラグメントの塩基除去配列解析実施例１におけるように、該プラスミドpBR322中の制限エンドヌクレアーゼに対する固有のサイト（この場合には、それぞれ位置4363/0および375におけるEco RI およびBamHI に対する）を、上記の配列決定法（サットクリッフェ(Sutcliff e)，J.G.,コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor) Symp．Quant．Bio l.，1978，pp．77-90）に記載した原理を立証するために利用した。 24℃におけるpH 7.9の制限バッファー：50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス(T ris)アセテート、10mMの酢酸マグネシウムおよび１mMのジチオスレイトールを含有する25μｌの反応体積中にて、37℃で２時間インキュベートすることにより、各５単位のEcoRI およびBamHI によって、使用したpBR322の各１μｇを完全に消化する。等体積の1:1 フェノール／クロロホルムで抽出し、次いでゲル濾過条件に従って稼働される、セファクリル(Sephacryl)S-1000カラム(ファルマーシア(Pharmac ia))に通すことによって、該得られる混合物から、この375塩基対のフラグメントを精製する。このカラムの寸法は、半径0.4 cmおよび高さ５cmである。稼働バッファーは、TE：24℃にてpH 7.5のTris-HCl、１mMのEDTA＋50mMまでの塩化ナトリウムであり、その容量は＞５μｇである。100 μｌの画分を集め、各画分からの５μｌの試料を、アガロースゲル電気泳動法により、所定のフラグメントの存在につき分析する（サンブロック(Sambrook)，J.，フリッシュ(Fritsch)，E.F. およびマニアティス(Maniatis)，T.編(1989)，「モレキュラークローニング(Mol ecular Cloning)」，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，N.Y.刊行）。ピークを含む画分をプールし、存在する大きなフラグメントを避け、そして、1/10体積の3M酢酸ナトリウム溶液(pH 5.4)および2.5 体積の乾燥エタノールを添加することにより、室温にて30分間該DNA を沈殿させる。ペレットを、フルスピードで20分間、微量遠心機内で集め、70% エタノールで１回洗浄し、37℃にて乾燥する。次いで、このペレットを、TE中で0.5 μg/μｌなる濃度に使用するように、再溶解する。配列決定すべき該EcoRI 末端を、下記レポーターアダプターにより解析可能な端部を残すように除去されるために適した立体配置で、BsaIサイトを含有するアダプターに連結する：同時に該BamHI 末端を下記のBsaIサイトの欠如するアダプターに連結する：これらのアダプターも、EcoRI およびBamHI 生成末端が相互に再連結するのを阻害する。この連結反応は、上で精製されたフラグメントを使用し、該フラグメントを２ μｇ含有し、塩化マグネシウムを10mMまで、ジチオスレイトールを１mMまで、アデノシン三燐酸を１mMまで、塩化ナトリウムを50mMまで、および24℃にてpH 7.5 のTris-HClを20mMまで添加して、連結バッファーとした、体積50μｌの反応系中で実施する。0.25単位のT4 DNAリガーゼと、各２ピコモルの該アダプターを添加し、該反応を16℃にて16時間実施する。この連結したフラグメントを、等体積の1:1 フェノール／クロロホルムで抽出し、次いでこれを製造業者等の指示に従って、上記と同様であるがマグネシウムを含まない制限バッファーを含有する、セファクリルS-400 マイクロスピンカラムHR (ファルマーシア(Pharmacia))に通すことにより、得られる混合物から精製する。該未旋回カラムは、高さ約1.5 cmおよび半径0.4 cmなる寸法をもつ。旋回は145 mmなるローター半径をもつクリニカルセンチヒュージ内で1850 rpmにて２分間実施する。得られる溶出液に酢酸マグネシウムを10mMまで添加する。10単位のBsaIを添加し、55℃にて１時間インキュベートする。これにより、固定化すべき該フラグメントから該アダプターが開裂され、5'CAAA 一本鎖伸長をもつフラグメントが残される。等体積の1:1 フェノール／クロロホルム溶液で抽出し、次いで製造業者の指示に従って、これを上記と同様であるが連結バッファーを含有する、セファクリル S-400 マイクロスピンカラムHR (ファルマーシア(Pharmacia))に通すことによって、この新たに消化した材料を精製する。次いで、各200 ピコモルの該レポーターアダプターおよび0.25単位のT4 DNAリガーゼを添加し、該精製されたフラグメントの該BsaI切断末端に特異的なものを当該フラグメントの該末端と連結させる。これら４種のレポーターアダプターは、以下のフォーマットに従って、上記の如く別々に合成され、かつ精製される：ここで、Ｘは各場合において異なる、４種の塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＴの一つであり、Dye(n)は染料FAM 、JOE 、TAMRA またはROX の１種であり、各染料は位置Ｘにおける該塩基の一つのみに対応している。該Ａ特異的レポーターアダプターは JOE によって標識され、該染料の蛍光は、中心バンド560 nmをもつフィルタを通して検出され、該Ｃ特異的レポーターは染料FAM によって標識され、該染料の蛍光は中心バンド531 nmをもつフィルタを通して検出され、該Ｇ特異的レポーターは染料TAMRA によって標識され、該染料の蛍光は中心バンド580 nmをもつフィルタを通して検出され、一方で該Ｔ特異的レポーターは染料ROX によって標識され、該染料の蛍光は中心バンド610 nmをもつフィルタを通して検出される。これらのレポーターアダプターは、等しい比率で混合され、次いで等モル量の該レポーターアダプター混合物と以下の相補オリゴヌクレオチドも一緒に混合される：連結を16℃にて６時間進行させ、かつ等体積の1:1 フェノール／クロロホルムて抽出し、次いで製造業者の指示に従って、これを、上記と同様であるが制限バッファーを含有する、セファクリルS-400 マイクロスピンカラムHR (ファルマーシア(Pharmacla))に通すことによって、未連結物質を除去する。 10単位のBsaIを添加し、55℃にて１時間インキュベーションを行って、該固定化フラグメントから該レポーターアダプターおよび塩基１個を除去する。この消化したフラグメントを、等体積の1:1 フェノール／クロロホルムて抽出し、次いで製造業者の指示に従って、これを、上記と同様であるが24℃にてpH 7.0の100m Mトリエチルアミンアセテート(TEA) を含有する、セファクリルS-400 マイクロスピンカラムHR（ファルマーシア(Pharmacia))に通すことによって精製して、該レポーターアダプターへのもう一回の連結の準備を調える。該マイクロスピンカラムへの新たな50μｌのTEAアリコートの添加および上記のような各添加間の遠心処理を続け（更に１〜４回）、該フラグメントから開裂された該レポーターを溶出する。該レポーターおよび該フラグメントはアクアバック内で50℃にて２時間別々に乾燥される。該レポーターは、可視量のデキストランブルーを含有する、3.5 μｌの1:1 ホルムアミド／50mM EDTA 中に再溶解し、分析するまで４℃にて保存する。該フラグメントを50μｌの連結バッファーに溶解し、該レポーターアダプターの連結、精製、BsaIによる開裂、該フラグメントの精製、および開裂によって取り除かれた該レポーターアダプターの精製からなる（全て上記したような）サイクルを更に５回行う。ホルムアミド中の該レポーターアダプター試料各々を、ABI モデル373A DNA配列決定装置を使用して解析する。これら試料を２分間に渡り90℃に加熱し、氷上に置き、次いでベーススプリンター(Base Sprinter) ゲル上に載せ、その製造業者等の指示に従って稼働させる。同一の処理にかけ、プールした試料の濃縮を実施し、あるいは必要に応じて希釈を行って、該DNA 配列決定装置を使用して、最適のシグナル強度を得る。上記のホルムアミド／EDTAの同一のアリコート中に再溶解することにより、試料をプールし、一方希釈も、該ホルムアミド中で実施する。製造業者等の指示に従って、該製造業者の染料プライマー化学によって配列決定されたM13mp18 および未使用のレポーターアダプターをも、別々にかつ同時にコントロールとして解析する。該レポーターアダプターの全ては、34塩基配列に等価な割合で移動し、使用した異なる染料によって付与された移動度における識別を可能とする。しかしながら、これらが蛍光を発する波長は、所定のサイクル中に、どのレポーターアダプターが該固定化フラグメントに連結できたかに依存する。BsaIによって除去された該第一のレポーターは該610 nmのフィルタを介して検出され、該レポーター上のＴが、該固定化されたフラグメント上の対向するＡと連結することを示す。除去された該第二のレポーターは560 nmのフィルタを介して検出され、該レポーター上のＡが、該固定化されたフラグメント上の対向するＴと連結すること、およびBsaIが該第一のレポーターと共に該Ａを除去し、該Ａが前のレポーターによって、該固定化フラグメント上で検出されることを示す。残りのレポーターは、該配列決定された固定化フラグメントの末端において、除去される塩基に相補的な残りの塩基の順序Ａ、Ｇ、Ａ、Ｇに対応して、除去される順序で、それぞれ560n m、580 nm、560 nmおよび580 nmのフィルタを通して検出される。従って、該フラグメントの端部における全配列は、該新開発のアダプターによって可能となった、該第一のBsaI開裂位置である、該5'末端から２塩基で開始する、サットクリッフェ(Sutcliffe)（上記文献）によって予想された如き5'ATTCTCである。実施例３：M13mp18 の5'〜3'配列解析 M13 mp18は既知配列をもつ一本鎖DNA である（メッシング(Messing)，J.,メソッズインエンザイモロジー(Methods in Enzymology)，101（パートC）リコンビナントDNA (Recombinant DNA) pp．20-78 (1983)，ウー(Wu)，R.＆モルデーブ（ Moldave)，K.(編) ，アカデミックプレス，N.Y.）。従って、各配列決定サイクル中に塩基を付加する、レポーターアダプターを利用した、この配列決定法を立証するのに適した基質である。 M13 mp18−本鎖DNA を、下記の前進配列決定プライマーにアニーリングする。 M13 DNA 各１μｇを、アニーリングバッファー：10mMのTris-HCl(24 ℃にてpH 7.5) 、50mMの塩化ナトリウム20μｌ中の２ピコモルのプライマーに添加する。この反応系を95℃にて２分間加熱し、次いで55℃に30分間冷却する。このアニーリングした鋳型／プライマーを、該レポーターアダプターと連結する。各レポーターアダプターを別々に合成し、かつ精製する。最初の15個のオリゴヌクレオチドを、プレックスタッグズ(Plex Tags; ミリポア(Millipore))に従って標識する：ｎは所定の位置における全体で４個の塩基に相当し、またｓはホスホロチオエート結合に相当する。このアニーリング反応系を、24℃にてpH 7.5のTris-HClを20mMまで、塩化ナトリウムを50mMまで、ジチオスレイトールを１mMまで、塩化マグネシウムを10mMまでおよびアデノシン三燐酸を１mMまで添加することによって調節して、連結バッファーとする。これらのレポーターアダプターを等モル比で混合し、次いでこの混合物を該連結反応系に添加する。このレポーターアダプター混合物を、100:1 のモル比でM1 3mp18 DNA に添加する。 0.25単位のT4 DNAリガーゼを添加し、16℃にて６〜16時間に渡るインキュベーションを実施する。 M13 + 連結されたレポーターアダプターを、製造業者等の指示に従って、LacZ ベクターピュアリフィケーションキット(Vector Purification Kit)(ダイナール (Dynal))を利用して、該連結混合物から精製した。但し、この連結反応はファージ上澄というよりも、寧ろ開始点であり、100μｌのビーズ懸濁液（ダイナビーズ(Dynabeads) M-280 ストレプトアビジン，ダイナール）を、25ピコモルの特別に調製したオリゴヌクレオチドと共に使用し、該オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって３個の3'の殆どのヌクレオチドを結合して、エキソヌクレアーゼ耐性としたことを除き、市販のビーズ上のオリゴヌクレオチドと等価であり、４回の洗浄を実施し、かつ20μｌの溶出バッファーを使用した。100 ng のM13mp18 DNA に等価な溶出液を、試料として取り出し、どのレポーターアダプターか連結したかを決定する。該溶出液の残部を、レポーター添加を更に重ねるべく準備する。T4 DNAポリメラーゼを使用して、該TAG を除去し、結果として該レポーターの残部をエキソヌクレアーゼIII の作用に付すことができる。該溶出液を、24℃にてpH 7.5のTris -HClを20mMまで、塩化マグネシウムを10mMまで、ジチオスレイトールを１mMまでおよび塩化ナトリウムを50mMまで添加することによって調節して、Pol/Exo バッファーとする。この新規な混合物を４つの等価なアリコートに分割する。その各々に、３種の異なるデオキシリボヌクレオチドを各々0.1 mMまで添加する。これらのデオキシリボヌクレオチドは、各反応が異なる塩基を欠くように添加される。これは、一旦該TAG が除去された場合に、広範な重合が生ずるのを防止し、かつ完全に一つの型の塩基が該TAG と該特定の塩基との間の二本鎖領域中に見出される可能性をもカバーする。この反応を４つの異なる型に分割することにより、上記の状況が生じる場合には、該二本鎖領域の喪失は、該残りの溶出液の25% に対してのみ生ずるであろう。T4 DNAポリメラーゼ１単位を添加し、インキュベーションを37℃にて30分間実施する。上記のLacZベクターピュアリフィケーションキットを使用して（但し、試料は取り出さない）、該反応系からDNA を精製する。エキソヌクレアーゼIII を使用して、該M13 DNA の残部から、ホスホロチオエート結合までの該レポーターアダプターの残部を除去する。従って、２個の追加の塩基が該プライマー上に残される。該溶出液を、24℃にてpH 8.0のTris-HClを 50mMまで、塩化マグネシウムを５mMまでおよび2-メルカプトエタノールを10mMまで添加することによって調節して、エキソヌクレアーゼIIIバッファーとする。0 .1 単位のエキソヌクレアーゼIIIを添加し、37℃にて10分間のインキュベーションを行う。上記した該LacZベクターピュアリフィケーションキットを使用（但し、試料は取り出さない）して、該反応混合物からDNA を精製する。更に５回の、該レポーターへの連結、精製、存在するTAGの分析用の試料の採取、T4 DNAポリメラーゼによる処理、精製、エキソヌクレアーゼIIIによる処理および精製サイクルを実施し、該最終のサイクル中のサンプリングによって終了する。各サイクルにおいて存在する該レポーターを検査するために、８個の等しい部分に分割し、各々を８個のナイロン膜上に、膜当たり各試料１個となるように斑点として適用する。オリジナルのレポーターアダプター各々５ngをも、コントロールとして各膜上にそれぞれ斑点として適用する。これらの膜をハイブリッド化により精査し、洗浄し、最後にオートラジオグラフィーにより検出する。斑点形成を含む全ての方法は標準的な手順に従う（サンブロック(Sanbrook)，J.，フリッシュ(Fritsch)，E.F．およびマニアティス(Maniatis)，T.編(1989)，「モレキュラークローニング(Molecular Cloning)」，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，N.Y.刊行）。該レポーターアダプターの最後の3'の殆どの配列（プレックスタッグズ）に相補的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。各オリゴヌクレオチドを別々に合成し、γ³²Pアデノシン三燐酸でT4ポリヌクレオチドキナーゼによって標識する。該膜は以下のようにして精査する。タッグ07に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第一膜タッグ02に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第二膜タッグ09に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第三膜タッグ14に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第四膜タッグ12に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第五膜タッグ02に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第六膜これまで使用されなかったタッグに対して相補的なオリゴヌクレオチドで第七膜。各オリゴヌクレオチドの比活性は以前のプロービング(probings)におけると同様に維持され、従ってこの場合には全体として11倍多くのプローブが使用される。タッグ02、タッグ07、タッグ09、タッグ12およびタッグ14に対して相補的なオリゴヌクレオチドで第八膜。ここでも該個々のプローブの比活性は維持され、従って全体として５倍多くのプローブが使用される。タッグ07および該第一の試料の位置は、主として該第一の膜上で標識され、このことはCGに対応するレポーターアダプターが、該第一の連結の際に組み込まれたことを示している。タッグ02および第二並びに第六の試料の位置は、主として該第二の膜上で標識され、このことはACに対応するレポーターアダプターが、該第二および第六の連結の際に組み込まれたことを示している。更に、該プライマーの3'末端は、該第一のエキソヌクレアーゼ処理後には最早同一ではない。同様に、タッグ09および第三の試料、タッグ14および第四の試料、タッグ12および第五の試料、並びにタッグ02および第二並びに第六の試料の位置は、それぞれ該第三、第四、第五および第六膜上で標識される。このことは、GA、TC、GTおよびAC に対応するレポーターアダプターが、それぞれ該第三のサイクルから、各サイクル当たり１個宛て組み込まれたことを示している。このことは、また該配列が該プライマーの3'末端からの5' GCCAAGCTTGCA であること、および該TAG が組み込まれたサイクル中に、該エキソヌクレアーゼ処理後にも、各タッグの5'末端に２個の塩基が残されていることをも示唆している。最後の２つの膜はコントロールとして機能して、該試料およびTAG を検出するであろう該オリゴヌクレオチドのみがこれらに対して相補的であると予想されるものであることを立証する。上記説明から明らかな如く、本発明の概念に含まれるのは、無作為に選択し得る、固有のオリゴヌクレオチドが付着されたビーズが、配列決定の目的で核酸を順序付けるのに利用できるという着想である。不規則なビーズの使用は、かかるビーズ各々のもつ、個々の光学的特徴から利益を得ることを可能とする。核酸と特定の固有のビーズとの間に相関をもたしめる能力は、核酸のより形式的な配置の必要性を不要にする。本発明は、この概念およびその利用を包含する。勿論、該ビーズは容易に入手でき、また当業者には公知の標準的な化学的技術を、該ビーズとオリゴヌクレオチドとの結合に対して利用できる。実施例４本例との関連で、添付第3(a)図は、レポーターアダプターとの連結の第一のサイクル中に予め標識された、pBR322のBamH1〜EcoR1フラグメントおよびBamHI〜E ag1フラグメントの電気泳動図であり、かつ該TAMRA レポーターによる予想された特異的標識を示すものである。第3(b)図は、レポーターアダプターとの連結の第一のサイクル中に予め標識され、次にBsalにより切断された、pBR322のBamH1 〜EcoR1 フラグメントおよびBamH1 〜Eag1フラグメントの電気泳動図であり、該 TAMRA レポーターによる該特異的標識の、エンドヌクレアーゼによる予想された除去を示す。消化当たり45μｇのpBR332を、各々450 単位のEcoR1 およびEag1によって、25 ℃にてpH7.9 の100 mMNaCl(50mM のTris-HCl、10mMのMgCl₂、1mM のDTT含有）45 0 μｌ中で、37℃にて２時間に渡り、完全に切断した。該消化物２μｌをアガロースゲル電気泳動によって調べて、消化を確認した。生成したフラグメントを等体積の1:1 フェノール／クロロホルムで２度抽出し、次いで等体積のクロロホルムで抽出し、各場合に水性相を保持した。先ず30秒間攪乱することにより混合した層を、２分間の微量遠心分離を利用して分離した。 pH 5.3の3M酢酸ナトリウム1/10体積および新たな体積の2.5 倍の体積の100％エタノールを添加することにより、DNA を沈殿させた。-20 ℃にて30分間維持した後、該沈殿を15000 xgで15間の微量遠心分離によって回収した。上澄を捨て、得られたペレットを70% エタノール１mlで洗浄した。遠心処理を５分間繰り返し、得られた上澄を再度捨てた。短時間の微量遠心分離によって残留液体を遠心管の底部に集めた後に、ギルソン(Gilson)チップを用いて該液体を取り出した。何れの段階においても、該ペレットの取り出しを回避するように、注意した。該ペレットを37℃にて10分間乾燥し、次いで92μｌのTE: Tris-HCl 10mM(20℃におけるpH7.5)および１mMのEDTA中に再溶解した。その２μｌをアガロースゲル電気泳動によって調べて、回収物をチェックした。該ペレットを含有する該管全体の該 TEを攪拌して、あらゆる痕跡量部分も溶解するようにする必要がある。２組のオリゴヌクレオチド対を、EcoR1 およびEag1付着末端の大部分を遮断（ブロック）するために上記のように調製した：それぞれ該遮断オリゴヌクレオチド各々15ピコモルを、3.6 単位のT4 DNAリガーゼ、10 mMのTris-HCl(22 ℃におけるpH7.5)、50mMのBaCl、10mMのMgCl₂、１mMの DTT、１mMの ATPを含有する360 μｌの反応系中で、22℃にて1.5 時間、該切断物および精製したpBR322と連結した。該リガーゼを最後に添加し、かつ該反応系を65℃ に加熱し、次いで周囲温度にまで冷却して、添加前に該オリゴヌクレオチドをアニーリングした。該オリゴヌクレオチドを含まない、1/60の反応系をコントロールとして調製し、該主反応の1/60と並んでアガロースゲル電気泳動により解析し、該遮断オリゴヌクレオチドの不在下でコンカテマー化(concatamerisation) を生じ得ることを確認した。連結後、上記の如くフェノール／クロロホルムで２回抽出し、次いで4S-400マイクロスピンカラム（ファルマーシア）間に分割し、製造業者等の指示に従って、145 mmなるローター半径をもつクリニカル遠心機内で２分間、1850 rpmにて稼働した。得られた溶出液をプールし、939 塩基対のEcoR 1 〜Eag1のフラグメントを、240 単位のBamH1 により、37℃にて１時間、それぞれ50mMおよび10mMで添加されたNaClおよびMgCl₂ を含有する600 μｌの反応系で切断した。これは、異なるフラグメント上に２つのBamH1 付着末端を生成する効果をもち、該フラグメントの反対側の末端は最早連結には関与できなかった。該反応の1/30を、BamH1 を使用せずに、未切断コントロールとして設定し、かつ該消化の1/30と、アガロースゲル電気泳動によって比較して、375 および564 塩基対のバンドが、元の939 塩基対をもつフラグメントから生成されることを確認した。この主反応系をフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製し、かつ上記のように90μｌのTE中に再溶解したが、70% エタノールによる洗浄は省略した。この新たな溶液を水圧15-20 cmで稼働する、セファクリルS-1000（ファルマーシア）カラムに通すことにより、低分子材料、特にオリゴヌクレオチドを更に除去した。このカラムは、高さ５cmおよび直径１cmなる寸法を有していた。ピーク画分をアガロース電気泳動により決定し、プールし、該標識したレポーターアダプターに一夜連結させ、引き続き切断されるべきレポーターの連結の第一サイクルを開始した。該オリゴヌクレオチドが除去されていないと、該標識されたレポーターアダプターとの連結と競合するはずである。該レポーターアダプターは実施例１および２に記載のものであった。100 μｌ連結物中の、0.3 〜１ピコモルの消化されたpBR322対64〜320 ピコモルの該レポーターアダプターの各々の比は、蛍光ゲルリーダーによって測定されるように、該pBR322フラグメントの特異的な標識を与えたことが実験的に確認されていた。これは、多分あまりに低いアダプター濃度か、該pBR322のコンカテマー化を遮断できなかったことを反映しており、一方であまりに高いアダプター濃度は標識生成物の収率を低下した。これは、恐らく該アダプターが5'ホスフェートを有し、従って相互に連結して、その有効濃度を低下するためである。もう一つの戦略は、ホスホリル化されていないアダプターを使用して、この後者の効果を排除することである。かかるアダプターと該対象とするフラグメントとの連結の際に生ずるニックDNA が何等かの理由のために、この方法には許容されないならば、キナーゼ＋連結段階を利用して、該レポーターアダプターの除去後に該ニックを修復できた。 1875ピコモルの各レポーターアダプター、10mMのTris-HCl(22 ℃においてpH7. 5)、10mMのMgCl₂、50mMのNaCl、１mMのDTT、１mMの ATPおよび24単位のT4 DNAリガーゼを含有する体積2400μｌ中で、連結を16℃にて16時間実施した。該リガーゼは最後に添加し、かつその添加前に、該反応系を65℃にて５分間加熱し、次いで周囲温度まで冷却して、該オリゴヌクレオチドをアニーリングした。該S-1000 溶出液の1/10に相当する量を含有する他の等価な反応系からコントロールを設定した（リガーゼコントロール）。他の等価な反応系由来のコントロールも、該S- 1000溶出液の1/10に相当する量を含有するように設定した。これらにおいて、レポーターオリゴヌクレオチドの同一の最終濃度を使用したが、完全に該レポーターの一つのみで構成され、即ち所定のレポーターの元の濃度の４倍(4X)を使用し、他のレポーターの何れも使用しなかった。連結後、各反応系中のフラグメントを、上記のようにフェノール／クロロホルムで２度抽出し、かつエタノール沈殿させることにより（但し、70% エタノールによる洗浄は省略した）精製した。該コントロール反応系を、それぞれ100 μｌのTE中に再溶解し、該主反応は205 μｌのTE中で実施した。205 μｌのうちの５ μｌをアガロースゲル上で調べ、回収率をチェックした。該レポーターアダプターの大部分が、半径145 mmのローター中で1550 rpmにて２分間、製造業者等の指示に従って稼働する、サイズセップ(Sizesep) 400 スピンカラム(Spin Column; ファルマーシア）に通すことにより除去された。100 μｌを各カラムに適用した。従って、該主反応に対しては２本のカラムが必要であった。このカラムの寸法は、直径約0.8 cmおよび高さ３cmであった。カラムは、使用前に、重力の作用下で流動する、８mlのTE+50mmNaCl で平衡化した。該コントロール反応由来の溶出液の半分および該主反応由来のプールした全溶出液の1/12を除き全てを、Bsalで消化して、該レポーターアダプターを除去し、かつ該フラグメントの末端塩基を該レポーターに連結した。消化はBsalバッファー(NEB) 中で、55℃にて1.5 時間実施し、該バッファーは、100 μｌ当たりBsal を20単位含有する。消化は、初めに該カラムに添加した体積の約２倍の系中で実施した。Bsalは最後に添加し、この反応系の1/40を該酵素の添加前に採取して、未切断コントロールとして、アガロースゲル上で調べた。同様に、この反応系の 1/40を、該反応後に検査して、消化が生じたことを確認した。Bsalは、pBR322の 3323Eag1〜EcoR1 フラグメントを切断して、929 塩基のフラグメントと2494塩基を含むフラグメントとを与える。これらのフラグメントは、該EcoR1 およびEag1 末端に付加されたアダプターのために、幾分大きいように思われる。該コントロール反応由来の消化物および該主反応由来の消化物の1/12を、上記のようにして（但し、70% エタノールによる洗浄は省略した）、フェノール／クロロホルムで２度抽出し、かつエタノール沈殿させることにより精製した。該コントロール反応由来の未消化試料および未消化主反応系の1/12に対応する試料を同様にして精製した。但し、フェノール／クロロホルム抽出をも省略した。該沈殿した試料を蛍光ゲルリーダー（以下を参照のこと）によって分析するために保持した。該主反応系を、上記の如くフェノール／クロロホルムで２度抽出し、更に上記のようにS-400マイクロスピンカラムに通すことにより精製した。総量約400 μ ｌおよび100 μｌの残りの反応系を、４つのカラム各々について使用した。これにより、レポーターの連結の該第一のサイクルが完了し、引き続き切断が行なわれ、次の塩基が分析のために露呈された。アダプターの連結の第二のサイクル、引き続き行われる切断を開始した。新規なレポーターを、該精製された主反応系中に新規に形成された付着末端に連結した。全溶出液は480 μｌであった。連結は、同一の割合の試薬を使用して、該第一の主レポーター連結と同様に実施したが、最終反応体積を600 μｌとした。この連結系を精製し、エタノール沈殿させ、かつ該オリゴヌクレオチドを、該第一の主レポーター連結について記載したように、サイズセップ400 スピンカラムによって除去した。Bsal消化を上記の如く実施した。但し、該反応系の1/6を未切断コントロールとして採取し、かつ消化後の該反応系の1/6 を、切断コントロールとして採取した。これら２つの試料を精製し、該第一の主レポーター連結後の該試料について説明した如き、エタノール沈殿として保存した。残りのBsal切断材料をも、前に記載したように、精製し、かつ新規なレポーターアダプターに連結し、第三の連結サイクルおよびその後の切断を開始した。精製およびBsal消化を前に記載したように実施した。但し、該第一溶出液の半分を未切断コントロールとして保存し、かつその残りをBsalで消化した。該切断試料を、上記の如くフェノール／クロロホルム抽出により精製し、次いで両試料を上記のようにエタノール沈殿法によって回収した。これにより、連結および切断の該第三のサイクルが完了した。各サイクル中に、特に該カラムに通す際に生ずる損失を斟酌して、各連続するサイクル中の該主反応の増大する割合を、試料として採取することが適しているものと立証された。損失はより小さなフラグメントについて最も顕著であり、これは使用したカラムのサイズ−分離特性を反映しているものと思われる。従って、このような態様においては、分析のために大きなフラグメントを使用することが好ましいであろう。EcoR1で切断する前に末端が遮断された、pBR322のBsalおよびEag1切断フラグメントは、これをどのようにして達成し得るかの１例であるはずである。該フラグメントは該精製中に保持されるのに十分大きい必要があるが、その後の分析において決定できない程に大きいものであってはならない。90 0 〜1800塩基対が適当な範囲である。もう一つの戦略をも、極めて類似する実験において採用した。この場合、大きなフラグメントを処理し、次いで試料を制限エンドヌクレアーゼで切断した。該制限エンドヌクレアーゼは、分析に適したより小さなフラグメントを形成し、かつその上に対象とする末端を見出すことができた。例えは、pBR322のNdel〜Bsalフラグメントを使用した。この場合、該Ndel サイトに最も近接する該Bsal生成末端を、該レポーターアダプターの使用前に遮断した。次いで、Taq1を使用して、該サイクリング工程中に採取された試料から、分析に適したフラグメントを生成した。各試料に対応する該エタノール沈殿を、３μｌのTEおよび３μｌのゲル装填バッファー（ホルムアミド、50mMEDTA +可視量のデキストランブルー）中に再溶解した。各試料を製造業者等の指示に従って、A.B.I．373A を使用した、電気泳動法によって分析した。短いプレート（読み取り用の６cmのウエル）を使用した。電気泳動は、0.5％の過硫酸アンモニウムおよび0.05% のTEMED と共に重合した6 %ポリアクリルアミドゲルを使用して、30ワットにて3.5 時間実施した。重合されていないゲル溶液を、80 gの尿素、24mlの40% の29:1アクリルアミド：ビスアクリルアミド、60mlのミリＱグレード(Milli Q grade) の水（ミリポア）および 2gの混合床イオン交換樹脂を使用して調製した。30分間攪拌を行い、次いで固体物質を、0.2 μｍのナルゲン(Nalgene) フィルタを介して濾過することにより除去した。16ml TBE(1ｌ当たり、108gのTris塩基、55 gの硼酸および8.3gのNa₂EDT A)および水を添加して160 mlとし、脱ガスを実施した。より高い解像度が必要とされる場合には、24cmの読み取り用のウエル（大きなプレート）を使用した。シグナル強度が強すぎる場合には、試料をゲル装填バッファー中に希釈した。電気泳動図を、通常は組み込まれていないレポーターである、最大のピークに従って評価した。従って、必要な場合には、染料尺度の高さを減じて、小さなピークを増強した。フィルタセットＡを使用し、またサイズマーカーとして、Rox 350、Rox 500、 Rox 1000、Rox 2500をも泳動させた。ジーンスキャン(Genescan) 672コレクションを電気泳動中に走行させ、かつジーンスキャン 672分析を、解析のために使用した。レポーターの該フラグメントへの連結は、正確なレポーターが利用可能であった場合にのみ観測された。コントロール中に、ただ一つの標識されたレポーターのみをBamH1、Eag1、EcoR1 切断pBR322と共に用いた場合、標識されたフラグメントは、（実際の走行に依存して）ゲルの走査点850および1050（それぞれ375および564 塩基フラグメントに対応する）にのみ、かつ該TAMRA レポーター（黄色）が存在する場合にのみ観測された。このことは、予想されるように、該TAMRA レポーター上の5'末端Ｇの、露出したBamHi 付着末端との連結に対応し、従ってシグナルは黄色のレーンにおいてのみ観測できた。該連結反応中にリガーゼが添加されなかった場合には、如何なる試料においても有意な標識は観測されず、このことは該レポーターの連結が、該フラグメントを標識するために必要であることを示している。該第一のサイクル中、４種のレポーターアダプターの全てが存在する場合、有意な標識は、該375 および564 塩基フラグメントに対応する位置における該TAMR A(黄色) レーンのみに観測された。これも、また該375 および564 塩基フラグメントに対する該TAMRA アダプターの末端Ｇの正確な連結と一致している。その他のレーンはこの位置で有意に標識されることはなかった（第3(a)図参照）。１サイクル後、同一の２つのフラグメントは、予想されたように、BamH1 付着末端がGGATCCであるがために、TAMRA で再度標識され、従って該配列中への該3' 方向に更に１個の塩基が、依然としてＣ上にある。該929 Bsal〜EcoR1フラグメントに対応する、位置1450における付随的なフラグメントも、標識されることが観測された。このフラグメントは、予想されるように、FAM(ブルー) で標識される。というのは、該FAM レポーターの5'末端における該Ｃが、該Bsalにより生成された付着端部の5'末端に対する該3'方向における露出した４個の塩基を介してＧと対を形成するはずであるからである。３つの可能な末端が利用可能であるこの場合において、予想されたレポーターのみが適当な末端を見つけたことは重要である。Bsalによる消化は、予期されるように、この酵素が該レポーターアダプターを除去する場合には、該第一のサイクル後に生ずる標識付与を無効にした。該第二のサイクルにおける標識付与は、単なる該第一のサイクルからの持込みの結果ではない。レポーターの該第二および第三の連結後のBsalによる消化も、この酵素が該連結されたレポーターアダプターを除去する場合には、予期されるように、該標識付与を無意味なものとする。レポーターの該第三の連結後に観測される該標識付与も有意である。というのは、該BamH1 により生成された末端が、該JOE レポーター（緑色）により標識されることが観測され、このことは、更に一個の塩基除去が該第二のBsa1切断中に発生し、かつ該予想されたレポーターが該第三のレポーター連結中に添加された場合にのみ起こり得るからである。これとは対照的に、青および黄色標識の組み合わせが、該Bsa1〜EcoR1 フラグメントにつき観測される。これは、該第二のBsa1消化の際に、相互に排他的に利用し得る２つの可能なBsa1サイトがあるためであると予想される。このレポーターにより与えられた一つは、該レポーターと該pBR322内の１個の塩基の除去をもたらす。該pBR322により与えられた該Bsa1サイトは、該レポーターの除去をもたらすが、pBR322の塩基は除去しない。従って、２つの可能な末端はEcoR1〜Bsa1により発生した末端に生ずる。これらは、残る該末端に依存して、該TAMRA レポーター(G) または該FA M レポーター(C) の何れかにより、様々に標識される。染料の痕跡量が、Bsa1による該連結されたレポーターの除去後に、該フラグメント上に残されている可能性がある。これは、制限エンドヌクレアーゼが100％の効率をもつ訳ではないことから、予想されることである。このことはこの方法に殆ど影響を与えない。というのは、少なくとも95％の効率をもつ制限エンドヌクレアーゼを選択することにより、消化後も残留する少量の標識を、該レポーターの連結の際に添加された大量の標識から識別できるからである。該制限酵素の少数の不首尾の寄与によるノイズは、該方法の少なくとも20サイクルまでは、問題を生ずるとは考えられない。該フェノール／クロロホルム抽出の間に該Bsa1を除去するために、注意を要する。Bsa1消化後に２回を越えるフェノール／クロロホルム抽出を利用して、該Bs a1の「持込み」を最小化することができる。また、少量の酵素をより長期間に渡り使用することができる。更にまた、より不安定な酵素を使用することも可能であった。同様な実験において、pBR322の該小さなおよび大きなNdel〜Bsalフラグメントの該レポーターによる標識付与を、切断および連結の２サイクルを通じて、該Nd el末端において監視した。蛍光ゲルリーダーに載せる前に、試料をTaq1により切断して、該使用したゲル系上で分析し得るフラグメントを生成した。オリゴヌクレオチドは実施例１に記載のものであった。この場合、該短いおよび大きなNdel〜Taq1フラグメント両者は、４個のレポーターの連結の第一のサイクル後は赤であり、該レポーターへの連結の該第二のサイクル後には緑であった。これらの結果は予想通りであり、かつ該第一のレポーター連結の際の該Ｔ特異的末端連結化をもつ該レポーターおよび該第二の連結の際の該Ａ特異的末端連結化をもつ該レポーターのみと一致しており、また該レポーターに隣接するpBR322の塩基はBsa1消化中に除去される。同様に、予想されるように、該遮断されていないBsa1により生成された末端は、一つのレポーターの連結後には青であり、かつ上で論じた如く、該第二のレポーター連結後には青および黄色であった。サイクル間でのフラグメントの精製では、精製中に生ずる損失を斜酌すると、大量の出発材料を使用することが要求される。すると、これは反応系の体積の増太をもたらす。このことは、フラグメントを固体相上に固定化した場合には克服される。というのは、これにより該フラグメントが該工程から分離される機会がなくなるからである。反応系体積が、該固体相を覆うのに十分な深さをもつことのみが要求されるに過ぎない。これは液体フィルムと等価であり、従って固体相を利用した場合には、反応容積（およびコスト）は低下する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程を含む、二本鎖核酸の集団を配列決定する方法 (a) その認識部位がその切断部位から離されている（転移されている：displa ced）ところの核酸のための所定のヌクレアーゼ認識配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプターを該核酸にリゲートする、ここで該転位は、該リゲーションの結果として、得られたリゲーション生成物中に切断部位（これは、そこで切断すると、該核酸の一つの鎖から一又は複数の塩基の除去を結果する）を作るようなものである； (b) (a) からのリゲーション生成物を該ヌクレアーゼで切断して、不等の鎖長の二本鎖生成物を作る； (c) (b) からの該生成物を、延びる（extending）一本鎖を有する二本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプターの集団とのリゲーションに付す、ここでアダプターの該集団は、それらの延びる一本鎖内に、所定の数の塩基を構成する一又は複数の塩基の順列、任意的に全ての可能な順列を有する分子を含み、かつここで各順列は、夫々のユニークなかつ検出可能な標識を備えられており、該集団中の各アダプターは、その認識部位がその切断部位から離されているヌクレアーゼのためのヌクレアーゼ認識配列を有し、該転位は、この工程(c) のリゲーションの結果として、そこで開裂すると(b) からの該生成物の一つの鎖からの一又は複数の塩基の除去を結果するを作るようなものである； (d) (c) からのリゲーション生成物を分離する； (e) (c) からの分離されたリゲーション生成物を(c) のヌクレアーゼで開裂して、(c) のヌクレアーゼの認識部位を有するフラグメントの集団を作る； (f) (d) において分離されたリゲーション生成物により有される標識を分析するか、又は(e) からのフラグメントにより有される標識を分析する；そして (g) 所望の配列を決定するのに必要な回数、工程(c)〜(f)を繰返す、但し、最後の繰返しは任意的に工程(e)を省略する。２．工程(a) の前に、核酸の上記集団を、次の工程で用いられるヌクレアーゼで処理する、請求項１の方法。３．各工程(c) で用いられるヌクレアーゼが、工程(a) で用いられるヌクレアーゼと同じでない、請求項１又は２の方法。４．上記アダプターがオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一つの方法。５．上記核酸が固定化される請求項１〜４のいずれか一つの方法。６．固定化が、工程(f) の分析を走査、任意的に蛍光走査により行うことを許す平らな基体を用いて行なわれる、請求項５の方法。７．上記基体がプレート又はフィルムである、請求項６の方法。８．上記アダプターが、少なくとも二つの異なる上記ヌクレアーゼ認識配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチド配列を有する少なくともいくつかのアダプターである、請求項１〜７のいずれか一つの方法。９．少くとも幾分知られた配列を有する又は備えられた一本鎖核酸を配列決定する方法であって、下記の工程を含む方法 (a) 該核酸中の決定されるべき未知の配列に極近接した該既知配列にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする； (b) 未知配列に極近接する該オリゴヌクレオチドの末端を、リゲートされるその末端に位置するところの所定の数の塩基の全ての可能な順列を含むオリゴヌクレオチド配列を有する標識されたアダプターの集団とのリゲーションに付す、ここで該集団のアダプターは、所望により、同時に、予め選択された群で、又は一つづつ用いられる； (c) (b) でリゲートされた該集団から特定のアダプターを検出する； (d) 該一以上の所定の塩基を除き該特定のリゲートされたアダプターの全てを除去し、それにより、得た生成物の二本鎖領域を延長する；そして (e) 未知配列を決定するために必要な程度に工程 (b)〜(d) を繰返す、但し最終の繰返しは所望により工程(d) を省略する。 10．上記アダプターがオリゴヌクレオチドである、請求項９の方法。 11．各工程(d) が、アダプターオリゴヌクレオチド配列にホスホチオネート結合を編入する（それにより、エキソヌクレアーゼが該アダプターを切断できて、上記所定の数の塩基を残す）ことによって促進される、請求項９又は10の方法。 12．上記アダプターが固定化され、その際任意的に、走査たとえば蛍光走査による工程(c) 検出を可能にする平らな基体を用いる、請求項９〜11のいずれか一つの方法。 13．核酸の配列決定において、その切断部位から離されている（displaced）認識部位を有するヌクレアーゼを用いる方法。 14．核酸を配列決定するためのキットにおいて、その切断部位から離されている認識部位を有する少なくとも一つのヌクレアーゼ、及び／又は、延長する（exte nding）鎖中に１以上の所定の塩基を、及びその切断部位から離されている認識部位を有するヌクレアーゼのための認識部位を含む二本鎖部分を有する不等長の鎖がある二本鎖オリゴヌクレオチド集団を含むところのキット。 15．請求項１記載の方法の実施のための指示書をも含む、請求項14のキット。 16．上記オリゴヌクレオチドが少なくとも２つの異なる上記認識部位を有する請求項14又は15のキット。 17．核酸を配列決定するためのキットにおいて、その末端に所定の数の塩基を含む１本鎖オリゴヌクレオチド配列を有する標識されたアダプターを含み、ここで該アダプターの標識は、それらの夫々の所定の塩基に対して特異的であるところのキット。 18．請求項９の方法の実施のための指示書をも含む請求項17のキット。 19．その認識部位がその切断部位から離されているヌクレアーゼのための所定のヌクレアーゼ認識部位を含む２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプター分子であって、請求項１の方法のために用いられるアダプター分子。 20．少なくとも２つの異なる上記認識部位を含む請求項19のアダプター分子。 21．所定の１又は複数の塩基を含む延長する一本鎖を有する２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプター分子において、該分子が、その認識部位が切断部位から離されているところのヌクレアーゼのためのヌクレアーゼ認識配列及び各所定の塩基（１又は複数）に対して特異的な標識をも含み、好ましくは該分子が請求項の方法のために用いられるものであるところの、アダプター分子。 22．少なくとも２つの異なる上記認識配列を含む、請求項21のアダプター分子。 23．その末端に所定の１又は複数のを含む１本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むアダプター分子において、該分子がさらに各所定の塩基（１又は複数）に対して特異的な標識を含み、該分子が請求項９の方法において用いられるものであるアダプター分子。 24．一度に所定の数の塩基を核酸の配列から逐次に除去すること（ここで所定の塩基除去の各工程から残った生成物は、該塩基に対し特異的でありかつオリゴヌクレオチド配列を含む標識されたアダプターにリゲートされる）、又はプライマーを配列決定される核酸にハイブリダイズし、そして該プライマーを一度に所定の数の塩基だけ逐次延長すること（ここで該加えられる塩基は配列決定される核酸中の塩基に相補的であり、該塩基付加工程の各々は、該塩基に対し特異的でありかつ該所定の塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む標識されたアダプターの使用により達成される）を含み；いずれの場合にも該標識されたアダプターの標識はその夫々の所定の塩基に対し特異的であるところの、核酸を配列決定する方法。 25．標識されたアダプターがオリゴヌクレオチドである請求項24の方法。 26．上記アダプターが固定化され、かつ該方法が上記プライマーを逐次延長することにより進行する請求項24、又は25の方法。 27．該方法が、配列決定される上記核酸から塩基を逐次除去すること、及び塩基除去の初めの工程の前に上記核酸が制限エントヌクレアーゼの作用に付される請求項24又は25の方法。 28．核酸の集団が同時に配列決定される請求項24〜27のいずれか一つの方法。 29．核酸の上記集団が固定化される請求項28の方法。 30．不規則な形状のビーズ又は他の不規則な形状の物理的支持体を用い、これに核酸を結合させることによる、核酸を整理する方法。