JP2002525076A - モジュラーオリゴヌクレオチドによるプライマーエクステンション産物の単離方法 - Google Patents
モジュラーオリゴヌクレオチドによるプライマーエクステンション産物の単離方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、プライマーエクステンション産物、とくに配列決定反応産物を単離する方法であって、その産物はi)プライマー結合領域、ii)挿入体およびiii)ベクター由来の配列、に相当するか、または相補的な配列と、ベクター由来の配列に相補的であって、かつ当該プライマーエクステンション産物上の隣接する伸長部分に結合する、少なくとも二つの部分からなり、単離のために使用されるモジュラーオリゴヌクレオチドとを含むものであり、さらにモジュラーオリゴヌクレオチド自体および本発明におけるその使用を提供する。
【化１】
Description
本発明は、相補的な核酸分子への一連の連続的なヌクレオチド塩基の結合を改
善する方法、とくに捕獲オリゴヌクレオチドの結合を改善する際に使用される方
法、配列決定産物といったプライマーエクステンション産物を単離するための方
法，モジュラーオリゴヌクレオチド、および本発明を実施するためのキットに関
する。
善する方法、とくに捕獲オリゴヌクレオチドの結合を改善する際に使用される方
法、配列決定産物といったプライマーエクステンション産物を単離するための方
法，モジュラーオリゴヌクレオチド、および本発明を実施するためのキットに関
する。
【０００１】 相補的なヌクレオチド塩基の相互への結合は、今世紀の科学における最も意義
深く基本的な発見の一つであるということができ、生化学分野の急速な発展の先
触れとなった。その発見は、生命の連続性の根底にある仕組みの理解させるもの
であるとはいえ、分子生物学の有用な手段の開発への基礎をも提供したのである
。
深く基本的な発見の一つであるということができ、生化学分野の急速な発展の先
触れとなった。その発見は、生命の連続性の根底にある仕組みの理解させるもの
であるとはいえ、分子生物学の有用な手段の開発への基礎をも提供したのである
。
【０００２】 自然界に見出される核酸分子の単離および配列決定は，分子生物学者の共通す
る目標である。核酸分子を単離するための相補的なオリゴヌクレオチドの使用は
、ごく普通のことである。同様に相補的オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸分子
を結合させるために頻繁に使用され、鋳型に対する相補的鎖を作成するためのエ
クステンション反応のプライマーとして作用し、さらにポリメラーゼ連鎖反応（
PCR）と配列決定といった実験操作の基盤を形成する。
る目標である。核酸分子を単離するための相補的なオリゴヌクレオチドの使用は
、ごく普通のことである。同様に相補的オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸分子
を結合させるために頻繁に使用され、鋳型に対する相補的鎖を作成するためのエ
クステンション反応のプライマーとして作用し、さらにポリメラーゼ連鎖反応（
PCR）と配列決定といった実験操作の基盤を形成する。
【０００３】 しかしながら、鋳型へのまたは標的DNAへのオリゴヌクレオチドの結合の特異
性は、多くのパラメーターに依存し、それらの何れもが非効率な結合を生じさせ
、かつ、結果的に劣る実験結果をもたらすかも知れないものである。上記相互作
用の特異性は、Tm、すなわち二本鎖が解離する温度の測定によって都合よく決定
することができる。しかし、これもまた他のパラメーター、例えば反応が行われ
る緩衝液に依存する。特定の実験系に関して、Tmは、相補性の程度、標的および
／またはオリゴヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチドの誘導体形成およびオ
リゴヌクレオチドの長さを含む様々な因子により影響を受けるであろう。したが
って、同一実験条件下でこれらのパラメーターを変更することにより上昇したTm により実証されるようにオリゴヌクレオチドの結合は改善されるかも知れない。
しかし、これらのパラメーターを変えることにより達成できる変化は限られてい
る。
性は、多くのパラメーターに依存し、それらの何れもが非効率な結合を生じさせ
、かつ、結果的に劣る実験結果をもたらすかも知れないものである。上記相互作
用の特異性は、Tm、すなわち二本鎖が解離する温度の測定によって都合よく決定
することができる。しかし、これもまた他のパラメーター、例えば反応が行われ
る緩衝液に依存する。特定の実験系に関して、Tmは、相補性の程度、標的および
／またはオリゴヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチドの誘導体形成およびオ
リゴヌクレオチドの長さを含む様々な因子により影響を受けるであろう。したが
って、同一実験条件下でこれらのパラメーターを変更することにより上昇したTm により実証されるようにオリゴヌクレオチドの結合は改善されるかも知れない。
しかし、これらのパラメーターを変えることにより達成できる変化は限られてい
る。
【０００４】 以来、標的DNAの隣接領域に結合する少なくとも2個のモジュール（オリゴヌク
レオチド）から構成されるモジュラープローブまたはプライマーは、この別々の
モジュールと同じ長さにわたる単一のオリゴヌクレオチドに比べて良好な結合を
示すことが見出されている（WO98／13522参照）。例えば、２つの隣接する18量
体オリゴヌクレオチドは、複合36量体オリゴヌクレオチドよりもより効率的に標
的DNAに結合していくことが見出されている。
レオチド）から構成されるモジュラープローブまたはプライマーは、この別々の
モジュールと同じ長さにわたる単一のオリゴヌクレオチドに比べて良好な結合を
示すことが見出されている（WO98／13522参照）。例えば、２つの隣接する18量
体オリゴヌクレオチドは、複合36量体オリゴヌクレオチドよりもより効率的に標
的DNAに結合していくことが見出されている。
【０００５】 配列決定目的に隣接モジュールから構成されたプライマーを使用することは以
前に記載されている（Kotlerら、 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, p42
41-4245; Kieleczawa ら、1992, Science, 258, p1787-1791; および Szybalski
, 1990, Gene, 90, p177-178）。しかしながら、これらの場合において、モジュ
ラープライマーは、比較的短いプライマーの全配列のライブラリーを現実的に予
備合成できるよう、より長いプライマーと置き換えるために使用された。なぜな
ら、それらはより長いプライマーに比べて配列変更の可能性がより少ないからで
ある。すべての場合に、モジュラープライマーは同じ条件下での配列決定反応に
おいて、より長いプライマーと同じ良好な効率を有することが示されていたのみ
であった。これと対照的にＷＯ98／13522に記載された発明においては、１個の
オリゴヌクレオチドを別々の成分に切り離した場合、より良好な結合さえも達成
される。その上、ＷＯ98／13522以前の研究では、モジュールが鋳型に結合され
た場合にモジュール間で１つ（またはそれ以上）の塩基を有しない場合にのみ、
モジュラープライマーの効果が達成されうることが示されている。ＷＯ98／1352
2および本明細書に記載される改善された結合では、モジュール間に何らのギャ
ップも存在しない場合に、より良好な結合すら観察されるのであるが、前記のよ
うな制限は何ら適用されない。
前に記載されている（Kotlerら、 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, p42
41-4245; Kieleczawa ら、1992, Science, 258, p1787-1791; および Szybalski
, 1990, Gene, 90, p177-178）。しかしながら、これらの場合において、モジュ
ラープライマーは、比較的短いプライマーの全配列のライブラリーを現実的に予
備合成できるよう、より長いプライマーと置き換えるために使用された。なぜな
ら、それらはより長いプライマーに比べて配列変更の可能性がより少ないからで
ある。すべての場合に、モジュラープライマーは同じ条件下での配列決定反応に
おいて、より長いプライマーと同じ良好な効率を有することが示されていたのみ
であった。これと対照的にＷＯ98／13522に記載された発明においては、１個の
オリゴヌクレオチドを別々の成分に切り離した場合、より良好な結合さえも達成
される。その上、ＷＯ98／13522以前の研究では、モジュールが鋳型に結合され
た場合にモジュール間で１つ（またはそれ以上）の塩基を有しない場合にのみ、
モジュラープライマーの効果が達成されうることが示されている。ＷＯ98／1352
2および本明細書に記載される改善された結合では、モジュール間に何らのギャ
ップも存在しない場合に、より良好な結合すら観察されるのであるが、前記のよ
うな制限は何ら適用されない。
【０００６】 Lin ら（Lin ら、1989, Biochemistry, 28, p1054-1061）は、恐らくは塩基の
スタッキングによる協同効果が隣接的に結合したオリゴヌクレオチドの間に生じ
、それがTmを増大させると記載している。しかしながら、これは完全長モジュラ
ープライマーを有する複合プライマーではなく、モジュラープライマーのモジュ
ール一つの結合のみと対比される。このように、ＷＯ98／13522に示された知見
は従来技術に比較してかなりの進歩を示し、標的核酸分子へのオリゴヌクレオチ
ドの改善された結合が必要とされる場合に多数の適用を備えている。
スタッキングによる協同効果が隣接的に結合したオリゴヌクレオチドの間に生じ
、それがTmを増大させると記載している。しかしながら、これは完全長モジュラ
ープライマーを有する複合プライマーではなく、モジュラープライマーのモジュ
ール一つの結合のみと対比される。このように、ＷＯ98／13522に示された知見
は従来技術に比較してかなりの進歩を示し、標的核酸分子へのオリゴヌクレオチ
ドの改善された結合が必要とされる場合に多数の適用を備えている。
【０００７】 本明細書にも記載されるＷＯ98／13522の方法は、好ましくはオリゴヌクレオ
チドの形態をしたヌクレオチド塩基の標的核酸分子への結合の改善が要求される
いかなる適用において使用できる。理論に束縛されることを望むものではないが
、モジュラーオリゴヌクレオチドの使用により、 tRNA 中のみならず他の核酸分
子中にも存在する核酸分子の三次構造の崩壊が可能となると思われる。かかる三
次構造は、モジュラーオリゴヌクレオチドの「部分」類が一緒に合成される比較
的長いオリゴヌクレオチドを用いては、単一の分子のように効果的に崩壊される
とは思われない。したがって、核酸分子の領域への結合の改善を必要とする適用
は、その核酸分子がこの領域へのオリゴヌクレオチドの結合を阻止または損なう
であろう三次構造を有するが、本発明から利益を得るであろう。それゆえＷＯ98
／13522の発明は、複製、増幅、転写、逆転写および／または配列決定を包含す
る方法においてモジュラーオリゴヌクレオチドがプライマーとして役立つ適用、
またはモジュラーオリゴヌクレオチドが標的核酸分子の検出および／またはもし
くは単離のためのプローブとして役立つ適用を記載する。適当な状況のもとでは
、モジュラーオリゴヌクレオチドは、例えばプライマーとして、そしてまた、こ
うして生産された核酸生成物、例えば増幅 DNA のための捕獲／検出プローブと
しての両方で役立つことにより、前記した機能の両方を提供することは認識され
よう。
チドの形態をしたヌクレオチド塩基の標的核酸分子への結合の改善が要求される
いかなる適用において使用できる。理論に束縛されることを望むものではないが
、モジュラーオリゴヌクレオチドの使用により、 tRNA 中のみならず他の核酸分
子中にも存在する核酸分子の三次構造の崩壊が可能となると思われる。かかる三
次構造は、モジュラーオリゴヌクレオチドの「部分」類が一緒に合成される比較
的長いオリゴヌクレオチドを用いては、単一の分子のように効果的に崩壊される
とは思われない。したがって、核酸分子の領域への結合の改善を必要とする適用
は、その核酸分子がこの領域へのオリゴヌクレオチドの結合を阻止または損なう
であろう三次構造を有するが、本発明から利益を得るであろう。それゆえＷＯ98
／13522の発明は、複製、増幅、転写、逆転写および／または配列決定を包含す
る方法においてモジュラーオリゴヌクレオチドがプライマーとして役立つ適用、
またはモジュラーオリゴヌクレオチドが標的核酸分子の検出および／またはもし
くは単離のためのプローブとして役立つ適用を記載する。適当な状況のもとでは
、モジュラーオリゴヌクレオチドは、例えばプライマーとして、そしてまた、こ
うして生産された核酸生成物、例えば増幅 DNA のための捕獲／検出プローブと
しての両方で役立つことにより、前記した機能の両方を提供することは認識され
よう。
【０００８】 ＷＯ98／13522に記載されたモジュラーオリゴヌクレオチドは、プライマーに
よって生成される配列決定産物といったプライマーエクステンション産物の単離
において比類なき優越性を提供することが今や見出されている。そのような産物
は電気泳動法系にかける前に、合成後、精製しおよび／または濃縮する必要があ
る。長大ゲノムの配列決定プロジェクトでは、多数の試料が取り扱われ、自動化
が重要な要件となる。沈殿、抽出、もしくは遠心工程を含むアッセイは自動化す
ることが困難である。実験室のプロトコルでは、アルコールによる沈殿が常法的
に使用されているけれども、これは自動化することは困難である。モジュラープ
ローブの使用により、例えば伝統的なＴ７ＤＮＡポリメラーゼ配列決定またはサ
イクル配列決定プロトコルにより生成される産物を捕獲することができる。ゆえ
に、これらモジュラーオリゴヌクレオチドは、プライマーエクステンション産物
を単離する方法の開発を可能とするものであり、当該方法は、上記プライマーエ
クステンション産物上の隣接伸長部分に、少なくとも二つの部分（モジュール）
からなる相補的モジュラーオリゴヌクレオチドを結合させる工程または工程（複
数）を少なくとも包含し、少なくとも一のモジュール（捕獲モジュール）は、固
定化されているか、または固定化手段を有する。
よって生成される配列決定産物といったプライマーエクステンション産物の単離
において比類なき優越性を提供することが今や見出されている。そのような産物
は電気泳動法系にかける前に、合成後、精製しおよび／または濃縮する必要があ
る。長大ゲノムの配列決定プロジェクトでは、多数の試料が取り扱われ、自動化
が重要な要件となる。沈殿、抽出、もしくは遠心工程を含むアッセイは自動化す
ることが困難である。実験室のプロトコルでは、アルコールによる沈殿が常法的
に使用されているけれども、これは自動化することは困難である。モジュラープ
ローブの使用により、例えば伝統的なＴ７ＤＮＡポリメラーゼ配列決定またはサ
イクル配列決定プロトコルにより生成される産物を捕獲することができる。ゆえ
に、これらモジュラーオリゴヌクレオチドは、プライマーエクステンション産物
を単離する方法の開発を可能とするものであり、当該方法は、上記プライマーエ
クステンション産物上の隣接伸長部分に、少なくとも二つの部分（モジュール）
からなる相補的モジュラーオリゴヌクレオチドを結合させる工程または工程（複
数）を少なくとも包含し、少なくとも一のモジュール（捕獲モジュール）は、固
定化されているか、または固定化手段を有する。
【０００９】 大規模の使用に好適な方法を開発するために、サンプルあたりの配列決定産物
の精製コストを検討することも重要である。以前の方法がゲル電気泳動法による
分離（スピンカラムもまた使用されていたが）の前に、サンガー・フラグメント
を精製し濃縮することに頼っていたが、単離のためのモジュラーオリゴヌクレオ
チドの使用が、ハイブリダイゼーション事象に依存するため、固形支持体、例え
ば常磁性ビーズの再使用が可能である。
の精製コストを検討することも重要である。以前の方法がゲル電気泳動法による
分離（スピンカラムもまた使用されていたが）の前に、サンガー・フラグメント
を精製し濃縮することに頼っていたが、単離のためのモジュラーオリゴヌクレオ
チドの使用が、ハイブリダイゼーション事象に依存するため、固形支持体、例え
ば常磁性ビーズの再使用が可能である。
【００１０】 ＷＯ98／13522に記載された方法は、エクステンション産物を合成するために
使用される異なるプライマーに関して、使用のために適合されても良いことが認
識されるだろう。したがって、例えば特定のプライマーにより生成されるプライ
マーエクステンション産物において、そのプライマーに相当する領域が存在し、
当該領域に相補的なモジュラーオリゴヌクレオチドを作成することによりプライ
マーエクステンション産物を単離するために使用することができる。
使用される異なるプライマーに関して、使用のために適合されても良いことが認
識されるだろう。したがって、例えば特定のプライマーにより生成されるプライ
マーエクステンション産物において、そのプライマーに相当する領域が存在し、
当該領域に相補的なモジュラーオリゴヌクレオチドを作成することによりプライ
マーエクステンション産物を単離するために使用することができる。
【００１１】 しかしながら、そうした方法は、遊離プライマーと誤って調製された産物とが
ともに結合し、これによりモジュラーオリゴヌクレオチドにより捕獲される限界
を有する。このことは、自動化の可能性とは異なって、エタノールによる沈殿（
そうした産物すべてを沈殿する）の使用にほとんど有利さをもたらさないもので
ある。
ともに結合し、これによりモジュラーオリゴヌクレオチドにより捕獲される限界
を有する。このことは、自動化の可能性とは異なって、エタノールによる沈殿（
そうした産物すべてを沈殿する）の使用にほとんど有利さをもたらさないもので
ある。
【００１２】 しかしながら、今やモジュラーオリゴヌクレオチドがプライマー由来領域以外
のプライマーエクステンション産物の領域に向けてもよいことが見出され、そう
した方法は驚くべき有利な結果をもたらす。 かくして第一の観点から見ると本発明は、鋳型ベクターから産生されたプライ
マーエクステンション産物を単離する方法を提供する。その産物は、i)プライマ
ー結合領域、ii)挿入体、iii)ベクター由来の配列、これらに相当する、または
相補的な配列を有しており、上記方法は、当該プライマーエクステンション産物
上に隣接する伸長部分に、少なくとも二つの部分（モジュール）からなるモジュ
ラーオリゴヌクレオチドを結合させる工程または工程（複数）を少なくとも包含
し、該モジュラーオリゴヌクレオチドは、当該プライマーエクステンション産物
の該ベクター由来の配列に相補的であって、しかも結合できるものであり、少な
くとも一のモジュール（捕獲モジュール）は、固定化されているか、または固定
化手段を有する。
のプライマーエクステンション産物の領域に向けてもよいことが見出され、そう
した方法は驚くべき有利な結果をもたらす。 かくして第一の観点から見ると本発明は、鋳型ベクターから産生されたプライ
マーエクステンション産物を単離する方法を提供する。その産物は、i)プライマ
ー結合領域、ii)挿入体、iii)ベクター由来の配列、これらに相当する、または
相補的な配列を有しており、上記方法は、当該プライマーエクステンション産物
上に隣接する伸長部分に、少なくとも二つの部分（モジュール）からなるモジュ
ラーオリゴヌクレオチドを結合させる工程または工程（複数）を少なくとも包含
し、該モジュラーオリゴヌクレオチドは、当該プライマーエクステンション産物
の該ベクター由来の配列に相補的であって、しかも結合できるものであり、少な
くとも一のモジュール（捕獲モジュール）は、固定化されているか、または固定
化手段を有する。
【００１３】 好ましくは、上記モジュラーオリゴヌクレオチドは、そのモジュラーオリゴヌ
クレオチドにより繋がれる標的分子（本明細書ではプライマーエクステンション
産物もしくは配列決定産物として呼ぶ）の領域と相補的な単一のオリゴヌクレオ
チドに比較して改善された結合を示すものである。 本明細書で使用される、結合に関する用語「改善」は標的核酸分子に結合する
特異性、安定性または能力の増大を示すことを意図する。「結合」は当業上知ら
れた（例えば本明細書に記載する）任意の方法にしたがって測定でき、そして熟
練した名宛人（addressee）にとって明白なとおり、適切な緩衝剤、温度および
他の条件の確立に依るであろう。モジュラーオリゴヌクレオチドの結合は、その
すべての部分を同時にまたは択一的に結合させることにより実施することができ
、各工程でモジュールの一つまたはそれ以上の結合を包含する連続工程を実施す
ることができる。本明細書で使用する「相補的」は適切な場合は、問題の核酸分
子のヌクレオチド配列と相補的な任意の一連の連続的なヌクレオチド塩基、オリ
ゴヌクレオチドまたは標的／鋳型核酸、またはその相当する RNA、DNA、または
核酸類似体、ペプチド核酸（PNA）を包含することが意図される。モジュラーオ
リゴヌクレオチドのモジュールは異なる核酸分子、例えば DNA および PNA の複
合体として構成されうる。あるいはまた、個々のモジュールが RNA、DNA または
PNA のみで形成されうるが、しかしモジュラープローブ内の異なるモジュール
は異なる核酸からなることもできる。したがって、例えば、PNA モジュールは捕
獲プローブとして使用できるが、隣接モジュールはエクステンション操作（例え
ば RT-PCR、DNA 配列決定等）が DNA モジュールを用いて実施できるように DNA
で構成されることができる。核酸分子の相補性は、「相補的」核酸、または適
切な場合はオリゴヌクレオチドまたは一連のヌクレオチドが高度に厳格な条件下
で相互に結合するが、幾らかのミスマッチが存在しうる非絶対的相補性をその範
囲内に包含する。かかるオリゴヌクレオチドは非厳格条件下（例えば 6xSSC/50%
ホルムアミド、室温）で結合し、そして高度に厳格な条件下（例えば 2xSSC, 6
5 ℃）で洗浄されるものであり、ここで SSC=0.15M NaCl、0.015 M クエン酸ナ
トリウム、pH 7.2 である。
クレオチドにより繋がれる標的分子（本明細書ではプライマーエクステンション
産物もしくは配列決定産物として呼ぶ）の領域と相補的な単一のオリゴヌクレオ
チドに比較して改善された結合を示すものである。 本明細書で使用される、結合に関する用語「改善」は標的核酸分子に結合する
特異性、安定性または能力の増大を示すことを意図する。「結合」は当業上知ら
れた（例えば本明細書に記載する）任意の方法にしたがって測定でき、そして熟
練した名宛人（addressee）にとって明白なとおり、適切な緩衝剤、温度および
他の条件の確立に依るであろう。モジュラーオリゴヌクレオチドの結合は、その
すべての部分を同時にまたは択一的に結合させることにより実施することができ
、各工程でモジュールの一つまたはそれ以上の結合を包含する連続工程を実施す
ることができる。本明細書で使用する「相補的」は適切な場合は、問題の核酸分
子のヌクレオチド配列と相補的な任意の一連の連続的なヌクレオチド塩基、オリ
ゴヌクレオチドまたは標的／鋳型核酸、またはその相当する RNA、DNA、または
核酸類似体、ペプチド核酸（PNA）を包含することが意図される。モジュラーオ
リゴヌクレオチドのモジュールは異なる核酸分子、例えば DNA および PNA の複
合体として構成されうる。あるいはまた、個々のモジュールが RNA、DNA または
PNA のみで形成されうるが、しかしモジュラープローブ内の異なるモジュール
は異なる核酸からなることもできる。したがって、例えば、PNA モジュールは捕
獲プローブとして使用できるが、隣接モジュールはエクステンション操作（例え
ば RT-PCR、DNA 配列決定等）が DNA モジュールを用いて実施できるように DNA
で構成されることができる。核酸分子の相補性は、「相補的」核酸、または適
切な場合はオリゴヌクレオチドまたは一連のヌクレオチドが高度に厳格な条件下
で相互に結合するが、幾らかのミスマッチが存在しうる非絶対的相補性をその範
囲内に包含する。かかるオリゴヌクレオチドは非厳格条件下（例えば 6xSSC/50%
ホルムアミド、室温）で結合し、そして高度に厳格な条件下（例えば 2xSSC, 6
5 ℃）で洗浄されるものであり、ここで SSC=0.15M NaCl、0.015 M クエン酸ナ
トリウム、pH 7.2 である。
【００１４】 「核酸分子」は、とりわけ、RNA、mRNA、DNA、例えばレトロウイルス RNA か
らの cDNA、ゲノム DNA、ミトコンドリア DNA 等およびＰＮＡを包含することが
意図される。DNA は一本鎖または二本鎖であることができる。二本鎖 DNA が使
用される場合は、モジュラーオリゴヌクレオチドの結合を可能にするために例え
ば加熱してその構造物を一本鎖形態に崩壊させることによるような適当な操作が
必要とされうる。「標的」核酸には、本発明方法により単離される分子、すなわ
ちプライマーエクステンションもしくは配列決定産物も包含される。標的核酸分
子に結合するヌクレオチド塩基またはオリゴヌクレオチドは、それらが前記した
相補性要件を満たす能力を保持するという条件で、修飾または誘導体形成できる
。例えば、メチル化、エチル化またはカルボキシル化された塩基、または他のこ
のように修飾されたかまたは普通でない塩基が使用できる。あるいはまた、核酸
骨格が修飾されていてもよく、例えば PNAユニットでもよい。あるいはまた、塩
基は標識例えばビオチンまたは色素のようなハプテンを担持できる。「オリゴヌ
クレオチド」はDNA（または逆転写後の RNA）、RNA または PNA の任意の一片を
包含し、そして RNA、DNA および／または PNA のキメラ(chimers) の使用にも
及ぶ。
らの cDNA、ゲノム DNA、ミトコンドリア DNA 等およびＰＮＡを包含することが
意図される。DNA は一本鎖または二本鎖であることができる。二本鎖 DNA が使
用される場合は、モジュラーオリゴヌクレオチドの結合を可能にするために例え
ば加熱してその構造物を一本鎖形態に崩壊させることによるような適当な操作が
必要とされうる。「標的」核酸には、本発明方法により単離される分子、すなわ
ちプライマーエクステンションもしくは配列決定産物も包含される。標的核酸分
子に結合するヌクレオチド塩基またはオリゴヌクレオチドは、それらが前記した
相補性要件を満たす能力を保持するという条件で、修飾または誘導体形成できる
。例えば、メチル化、エチル化またはカルボキシル化された塩基、または他のこ
のように修飾されたかまたは普通でない塩基が使用できる。あるいはまた、核酸
骨格が修飾されていてもよく、例えば PNAユニットでもよい。あるいはまた、塩
基は標識例えばビオチンまたは色素のようなハプテンを担持できる。「オリゴヌ
クレオチド」はDNA（または逆転写後の RNA）、RNA または PNA の任意の一片を
包含し、そして RNA、DNA および／または PNA のキメラ(chimers) の使用にも
及ぶ。
【００１５】 「モジュラーオリゴヌクレオチド」とは、一つより多い部分から構成されるプ
ライマー／プローブオリゴヌクレオチドを指す。それぞれの部分は全体のモジュ
ールと呼ばれるオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いられる「隣接」とは
、相互に近接して存在する核酸分子の非重複領域、例えば 100 または 50 ヌク
レオチド塩基未満離れて、好ましくは 10 塩基離れて、特に好ましくは 2 塩基
未満離れて、そして最も好ましくはその間に塩基なし、すなわち直接隣接するこ
とを意味することを意図する。したがって、モジュラーオリゴヌクレオチドを包
含する前記した「一つのオリゴヌクレオチド」は、モジュラーオリゴヌクレオチ
ドのすべての部分におけるヌクレオチド塩基の合計より多いヌクレオチドを包含
しうる。なぜなら、モジュラーオリゴヌクレオチドの各モジュールの結合部位の
間の領域に対して相補的である塩基もまた、結合された場合のモジュールが直接
には隣接していない場合に包含されるからである。
ライマー／プローブオリゴヌクレオチドを指す。それぞれの部分は全体のモジュ
ールと呼ばれるオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いられる「隣接」とは
、相互に近接して存在する核酸分子の非重複領域、例えば 100 または 50 ヌク
レオチド塩基未満離れて、好ましくは 10 塩基離れて、特に好ましくは 2 塩基
未満離れて、そして最も好ましくはその間に塩基なし、すなわち直接隣接するこ
とを意味することを意図する。したがって、モジュラーオリゴヌクレオチドを包
含する前記した「一つのオリゴヌクレオチド」は、モジュラーオリゴヌクレオチ
ドのすべての部分におけるヌクレオチド塩基の合計より多いヌクレオチドを包含
しうる。なぜなら、モジュラーオリゴヌクレオチドの各モジュールの結合部位の
間の領域に対して相補的である塩基もまた、結合された場合のモジュールが直接
には隣接していない場合に包含されるからである。
【００１６】 ここで使用される「単離」とは、たとえそれが存在するサンプルから除去され
ないとしても、すなわち物理的分離または精製が必ずしも行われないとしても、
標的核酸の捕獲を包含することを意図する。ここで使用されるサンプルからの標
的の「捕獲」とは、サンプル中に存在する他のＤＮＡ分子から有効に単離するこ
とをいい、標的はサンプル中にオリゴヌクレオチドを標的に結合させることで含
まれている。しかしながら、物理的分離または精製が行われることが有利である
。これにより先行技術、例えば、配列決定産物を含むサンプルが毛細管に入れら
れる「メガベース」（MegaBASE、Amersham Pharmacia Biotech社）およびABI370
0（Applied Biosystems Inc.）といった高い処理量のＤＮＡ配列決定装置におい
て経験する諸問題を克服することができる。しかしながらそうした毛細管は、サ
ンプル中に余りに多くの鋳型ＤＮＡ（例えばプラスミド、ＰＣＲ産物、Ｍ１３）
が存在すると詰まってしまう。対照的に本発明の好ましい観点からは、配列決定
産物は、例えば捕獲モジュールが結合する、またはおそらく結合する磁性ビーズ
の使用によりサンプルの残りから分離することができる。それゆえこの方法は、
サンプル中に存在する鋳型の量の変動にもちこたえる（実施例４を参照）。結果
は、エタノールによる沈殿という常法を使用すると、毛細管は鋳型の増大する量
に対処できないことを示している。反対に本明細書に記載される単離方法は、サ
ンプル中の鋳型レベルの如何を問わず良好な結果をもたらしている。
ないとしても、すなわち物理的分離または精製が必ずしも行われないとしても、
標的核酸の捕獲を包含することを意図する。ここで使用されるサンプルからの標
的の「捕獲」とは、サンプル中に存在する他のＤＮＡ分子から有効に単離するこ
とをいい、標的はサンプル中にオリゴヌクレオチドを標的に結合させることで含
まれている。しかしながら、物理的分離または精製が行われることが有利である
。これにより先行技術、例えば、配列決定産物を含むサンプルが毛細管に入れら
れる「メガベース」（MegaBASE、Amersham Pharmacia Biotech社）およびABI370
0（Applied Biosystems Inc.）といった高い処理量のＤＮＡ配列決定装置におい
て経験する諸問題を克服することができる。しかしながらそうした毛細管は、サ
ンプル中に余りに多くの鋳型ＤＮＡ（例えばプラスミド、ＰＣＲ産物、Ｍ１３）
が存在すると詰まってしまう。対照的に本発明の好ましい観点からは、配列決定
産物は、例えば捕獲モジュールが結合する、またはおそらく結合する磁性ビーズ
の使用によりサンプルの残りから分離することができる。それゆえこの方法は、
サンプル中に存在する鋳型の量の変動にもちこたえる（実施例４を参照）。結果
は、エタノールによる沈殿という常法を使用すると、毛細管は鋳型の増大する量
に対処できないことを示している。反対に本明細書に記載される単離方法は、サ
ンプル中の鋳型レベルの如何を問わず良好な結果をもたらしている。
【００１７】 本明細書で触れるように、プライマー結合領域、挿入体およびベクター由来の
配列への言及は、それらに相補的である配列も含み、例えば本発明のモジュラー
オリゴヌクレオチドは、プライマーエクステンション産物のベクター由来の領域
に結合し、これによりそれに相補的でありもとのベクターに相当する配列を有す
ることが理解されるであろう。
配列への言及は、それらに相補的である配列も含み、例えば本発明のモジュラー
オリゴヌクレオチドは、プライマーエクステンション産物のベクター由来の領域
に結合し、これによりそれに相補的でありもとのベクターに相当する配列を有す
ることが理解されるであろう。
【００１８】 本明細書で使用される「鋳型ベクター」の言及は、プライマーエクステンショ
ン産物が生成される核酸の何れかの部分、つまり核酸伸長反応に敏感である当該
部分をいい、プライマー結合領域、挿入体（ＤＮＡの一部、例えば配列決定用）
およびモジュラーオリゴヌクレオチドが向けられる領域を含むものである。好ま
しい態様においては、該鋳型ベクターは、先行技術において知られたベクターで
あり、例えばpBluescriptSKまたはIISK、pGEM-3Z、4Zまたは5Z、pUC18またはpUC
19、RIT27またはRIT28であり、これらは機能を変えた付加的配列を含む。そうし
た場合に、「挿入体」とは、適切な制限酵素の使用によりベクターの制限部位に
挿入される核酸の一部である。しかし、挿入体は、例えば結合（ligation）とい
った他の手段により鋳型ベクターに提供されてもよい。
ン産物が生成される核酸の何れかの部分、つまり核酸伸長反応に敏感である当該
部分をいい、プライマー結合領域、挿入体（ＤＮＡの一部、例えば配列決定用）
およびモジュラーオリゴヌクレオチドが向けられる領域を含むものである。好ま
しい態様においては、該鋳型ベクターは、先行技術において知られたベクターで
あり、例えばpBluescriptSKまたはIISK、pGEM-3Z、4Zまたは5Z、pUC18またはpUC
19、RIT27またはRIT28であり、これらは機能を変えた付加的配列を含む。そうし
た場合に、「挿入体」とは、適切な制限酵素の使用によりベクターの制限部位に
挿入される核酸の一部である。しかし、挿入体は、例えば結合（ligation）とい
った他の手段により鋳型ベクターに提供されてもよい。
【００１９】 プライマーエクステンション産物は、ベクターに存在するもしくは導入された
プライマー部位を使用することにより直接的に調製してもよく、あるいは中間産
物のエクステンション、例えばさらにプライマー部位を導入するPCRプライマー
を使用することにより鋳型ベクターのPCR増幅による産物のエクステンションに
より、鋳型ベクターから間接的に産生してもよい。そうした場合に関連するプラ
イマー部位は、PCR産物の部位であり、すなわち最終的プライマーエクステンシ
ョン反応のプライマー部位である。
プライマー部位を使用することにより直接的に調製してもよく、あるいは中間産
物のエクステンション、例えばさらにプライマー部位を導入するPCRプライマー
を使用することにより鋳型ベクターのPCR増幅による産物のエクステンションに
より、鋳型ベクターから間接的に産生してもよい。そうした場合に関連するプラ
イマー部位は、PCR産物の部位であり、すなわち最終的プライマーエクステンシ
ョン反応のプライマー部位である。
【００２０】 ベクター由来の配列は、鋳型ベクターの任意の部分から由来するものであり、
プライマー結合領域および挿入体を除外する（下記のコメントを条件にして）。
したがって、「鋳型ベクター」よりは「ベクター」の言及の方が、挿入体がない
ベクター、例えば上記のベクターのいずれかを指すものである。 上述したように、本発明においてはモジュラーオリゴヌクレオチドは、プライ
マーまたは誤って調製された産物を単離することを回避するために使用される。
この目的のために、上記したようにそのようなモジュラーオリゴヌクレオチドは
、ベクター由来の配列に相補的でありしかも結合することができる。しかし、全
体として、その相補性および結合は、プライマーまたは誤って調製された産物を
捕獲できるほどに充分ではないと仮定するならば、何らかの相補性が、モジュラ
ーオリゴヌクレオチドの１またはそれ以上のモジュールとプライマー結合領域お
よび／または挿入体間に存在するかも知れないと認識されるだろう。これより、
一例として、モジュラーオリゴヌクレオチドのモジュール中の一つにある一部分
が、プライマー結合配列（もしくは挿入体）、例えば４塩基対より少ない配列に
相補的であってもよいが、プライマーを捕獲するには不十分であろう。さらに、
捕獲モジュールの相補性がどの分子を捕獲するのかを最後には、指示するため、
モジュラーオリゴヌクレオチドの非捕獲モジュールはプライマー結合配列（もし
くは挿入体）に充分相補的であるかもしれない。しかし、捕獲モジュールは、捕
獲できるほどに充分にプライマー結合配列に相補的ではないと仮定するなら、望
ましくない産物は捕獲されないだろう。後者の場合、取り込まれないプライマー
への結合の原因となるように、調節するモジュール濃度を増大させる必要がある
だろう。
プライマー結合領域および挿入体を除外する（下記のコメントを条件にして）。
したがって、「鋳型ベクター」よりは「ベクター」の言及の方が、挿入体がない
ベクター、例えば上記のベクターのいずれかを指すものである。 上述したように、本発明においてはモジュラーオリゴヌクレオチドは、プライ
マーまたは誤って調製された産物を単離することを回避するために使用される。
この目的のために、上記したようにそのようなモジュラーオリゴヌクレオチドは
、ベクター由来の配列に相補的でありしかも結合することができる。しかし、全
体として、その相補性および結合は、プライマーまたは誤って調製された産物を
捕獲できるほどに充分ではないと仮定するならば、何らかの相補性が、モジュラ
ーオリゴヌクレオチドの１またはそれ以上のモジュールとプライマー結合領域お
よび／または挿入体間に存在するかも知れないと認識されるだろう。これより、
一例として、モジュラーオリゴヌクレオチドのモジュール中の一つにある一部分
が、プライマー結合配列（もしくは挿入体）、例えば４塩基対より少ない配列に
相補的であってもよいが、プライマーを捕獲するには不十分であろう。さらに、
捕獲モジュールの相補性がどの分子を捕獲するのかを最後には、指示するため、
モジュラーオリゴヌクレオチドの非捕獲モジュールはプライマー結合配列（もし
くは挿入体）に充分相補的であるかもしれない。しかし、捕獲モジュールは、捕
獲できるほどに充分にプライマー結合配列に相補的ではないと仮定するなら、望
ましくない産物は捕獲されないだろう。後者の場合、取り込まれないプライマー
への結合の原因となるように、調節するモジュール濃度を増大させる必要がある
だろう。
【００２１】 上記の場合において、取り込まれないプライマーもしくは誤って調製された産
物を捕獲することなく、当該プライマー配列に何らかの相補性が生じてもよい。
挿入体に対する相補性もまた許容され得るが、もっともそのような場合、挿入体
に相当する領域を含むプライマーエクステンション産物を捕獲することが望まし
い。それゆえその産物の捕獲を可能とするために、縮退ヌクレオチドのセットと
して、モジュラーオリゴヌクレオチドの適切な領域を合成してもよく、これによ
りあらゆる可能な変更はカバーされ、挿入体の配列に無関係にモジュールに対す
る必要な結合が起こるであろう。しかしながらモジュラーオリゴヌクレオチドは
、ベクター由来の配列にのみ相補的であることが好ましい。
物を捕獲することなく、当該プライマー配列に何らかの相補性が生じてもよい。
挿入体に対する相補性もまた許容され得るが、もっともそのような場合、挿入体
に相当する領域を含むプライマーエクステンション産物を捕獲することが望まし
い。それゆえその産物の捕獲を可能とするために、縮退ヌクレオチドのセットと
して、モジュラーオリゴヌクレオチドの適切な領域を合成してもよく、これによ
りあらゆる可能な変更はカバーされ、挿入体の配列に無関係にモジュールに対す
る必要な結合が起こるであろう。しかしながらモジュラーオリゴヌクレオチドは
、ベクター由来の配列にのみ相補的であることが好ましい。
【００２２】 これらのモジュラーオリゴヌクレオチドの設計において、２つの主要なＤＮＡ
配列決定化学反応、すなわち等熱プロトコル（T7ＤＮＡポリメラーゼまたは誘導
体）ばかりでなくサイクル配列決定（TaqＤＮＡポリメラーゼまたは誘導体）の
両者用の色素ターミネータまたは色素プライマーの使用が検討された結果、モジ
ュラーオリゴヌクレオチドは、どちらの系でも両用できる。重要なことは、固定
化された捕獲プローブは配列決定プライマーに対し充分に相補的ではなく、その
捕獲プローブを用いて、配列決定産物を生成し、その結果、プライマー配列に対
応する任意の配列が捕獲されるようになる。色素プライマー化学の場合、これは
、伸長されたサンガー・フラグメントとともに同時精製されない不使用の標識色
素プライマーに帰着するが、このことはクラマトグラムでバックグラウンドを減
じるのに貢献する。さらに驚くことにこのことは、また本明細書の実施例および
以下に詳述するように配列決定の正確度を向上するのにも貢献する。色素ターミ
ネータ化学（色素プライマー用のみならず）の場合、誤って調製された配列決定
産物は、該誤産物および捕獲プローブ間に相補性を欠くために精製されない。再
びこれはバックグランドを減じ、また配列決定の正確度を向上させることができ
る。
配列決定化学反応、すなわち等熱プロトコル（T7ＤＮＡポリメラーゼまたは誘導
体）ばかりでなくサイクル配列決定（TaqＤＮＡポリメラーゼまたは誘導体）の
両者用の色素ターミネータまたは色素プライマーの使用が検討された結果、モジ
ュラーオリゴヌクレオチドは、どちらの系でも両用できる。重要なことは、固定
化された捕獲プローブは配列決定プライマーに対し充分に相補的ではなく、その
捕獲プローブを用いて、配列決定産物を生成し、その結果、プライマー配列に対
応する任意の配列が捕獲されるようになる。色素プライマー化学の場合、これは
、伸長されたサンガー・フラグメントとともに同時精製されない不使用の標識色
素プライマーに帰着するが、このことはクラマトグラムでバックグラウンドを減
じるのに貢献する。さらに驚くことにこのことは、また本明細書の実施例および
以下に詳述するように配列決定の正確度を向上するのにも貢献する。色素ターミ
ネータ化学（色素プライマー用のみならず）の場合、誤って調製された配列決定
産物は、該誤産物および捕獲プローブ間に相補性を欠くために精製されない。再
びこれはバックグランドを減じ、また配列決定の正確度を向上させることができ
る。
【００２３】 これらの新しい方法において、モジュラーオリゴヌクレオチドの設計に２つの
異なるアプローチが採られる。最初に、専らのまたは特異的なモジュラーオリゴ
ヌクレオチドが設計され、これは具体的には大規模プロジェクトにおける使用に
適切であり、そこでは同一のベクターおよび挿入体のクローニングサイトが広範
に利用されている。この場合、モジュラーオリゴヌクレオチドが、挿入体のクロ
ーニング後、もとのまま（intact）に保たれるベクターの多重クローニングサイ
トの各部においてアニールする。
異なるアプローチが採られる。最初に、専らのまたは特異的なモジュラーオリゴ
ヌクレオチドが設計され、これは具体的には大規模プロジェクトにおける使用に
適切であり、そこでは同一のベクターおよび挿入体のクローニングサイトが広範
に利用されている。この場合、モジュラーオリゴヌクレオチドが、挿入体のクロ
ーニング後、もとのまま（intact）に保たれるベクターの多重クローニングサイ
トの各部においてアニールする。
【００２４】 かくして本発明は、好ましい特徴において鋳型ベクターから生成されるプライ
マーエクステンション産物を単離する方法を提供し、その産物は、i)プライマー
結合領域、ii)挿入体およびiii)ベクター由来の配列に相当するまたは相補的な
配列を含むものであり、該プライマーエクステンション産物の該ベクター由来の
配列は、鋳型ベクターを産生するのに使われるベクターの任意の領域から由来す
るもので、該ベクターの多重クローニングサイトの特定の制限部位に挿入体をク
ローンした後、損なわれずもとのままであるその一部を含む。モジュラーオリゴ
ヌクレオチドは、当該一部にアニールする。
マーエクステンション産物を単離する方法を提供し、その産物は、i)プライマー
結合領域、ii)挿入体およびiii)ベクター由来の配列に相当するまたは相補的な
配列を含むものであり、該プライマーエクステンション産物の該ベクター由来の
配列は、鋳型ベクターを産生するのに使われるベクターの任意の領域から由来す
るもので、該ベクターの多重クローニングサイトの特定の制限部位に挿入体をク
ローンした後、損なわれずもとのままであるその一部を含む。モジュラーオリゴ
ヌクレオチドは、当該一部にアニールする。
【００２５】 例えば、ベクターpUC18の挿入体に前方方向のユニバーサル・プライマーエク
ステンション反応の産物の捕獲のために、本発明の方法に使用される好適なモジ
ュラーオリゴヌクレオチドは、次の配列の1つを有するモジュラーオリゴヌクレ
オチドを含む。
ステンション反応の産物の捕獲のために、本発明の方法に使用される好適なモジ
ュラーオリゴヌクレオチドは、次の配列の1つを有するモジュラーオリゴヌクレ
オチドを含む。
【００２６】
【数１】
【００２７】 好ましくは、上記モジュラーオリゴヌクレオチドで、最後に掲げられたモジュ
ールは、捕獲モジュールであり（すなわちJL-C1/USP、JL-C2/USP）、固定化のた
めの残基、好ましくは5'末端のビオチン分子を含んでもよい。したがって、更な
る観点において本発明は、ベクターpUC18内の挿入体に関し、前進方向でありプ
ライマーエクステンション産物、とくにプライマー、USPを単離する発明の方法
を提供する。該オリゴヌクレオチドは、次のヌクレオチド配列の１つを含む。
ールは、捕獲モジュールであり（すなわちJL-C1/USP、JL-C2/USP）、固定化のた
めの残基、好ましくは5'末端のビオチン分子を含んでもよい。したがって、更な
る観点において本発明は、ベクターpUC18内の挿入体に関し、前進方向でありプ
ライマーエクステンション産物、とくにプライマー、USPを単離する発明の方法
を提供する。該オリゴヌクレオチドは、次のヌクレオチド配列の１つを含む。
【００２８】
【数２】
【００２９】 またはそれらの類似体または誘導体。 本発明の専一的なモジュラーオリゴヌクレオチドの別の例として、次の配列を
有するオリゴヌクレオチドにより与えられる： ５’-ACCCAATTCGCCCTATAG-３’＋5'-TGAGTCGTATTAC-３’ またはそれらの類似体または誘導体。特に好ましくは、最初に述べたオリゴヌク
レオチドは、捕獲プローブのように、さらに2番目のオリゴヌクレオチドは調節
性モジュールのように振舞う。
有するオリゴヌクレオチドにより与えられる： ５’-ACCCAATTCGCCCTATAG-３’＋5'-TGAGTCGTATTAC-３’ またはそれらの類似体または誘導体。特に好ましくは、最初に述べたオリゴヌク
レオチドは、捕獲プローブのように、さらに2番目のオリゴヌクレオチドは調節
性モジュールのように振舞う。
【００３０】 本明細書にいう類似体または誘導体とは、変更したまたは誘導体化したヌクレ
オチド塩基または上記したオリゴヌクレオチドを含み、これらはここに記載する
相補性の要件を充足する能力を保持し、例えば標識または固定化の手段を保持す
るヌクレオチドを含む。代わりに、前に定義された特定の塩基が、本明細書で記
載された相補性の定義からはずれるほどの程度に標的核酸への結合を妨げない他
の非相補的塩基もしくは誘導体化した塩基により置換されてもよい。
オチド塩基または上記したオリゴヌクレオチドを含み、これらはここに記載する
相補性の要件を充足する能力を保持し、例えば標識または固定化の手段を保持す
るヌクレオチドを含む。代わりに、前に定義された特定の塩基が、本明細書で記
載された相補性の定義からはずれるほどの程度に標的核酸への結合を妨げない他
の非相補的塩基もしくは誘導体化した塩基により置換されてもよい。
【００３１】 本発明の方法での使用に好適な、これらのモジュラーオリゴヌクレオチドおよ
び他のものは、本発明のさらなる観点を形成する。 プライマーエクステンション産物を捕獲するための適切なモジュラーオリゴヌ
クレオチドの設計のための第２のアプローチは、与えられたベクターの多重クロ
ーニングサイト中に、すなわち最も極端に位置した制限部位さえもクローニング
に使用することができるけれども、クローンされた挿入物から生成したプライマ
ーエクステンション産物に結合しかつ捕獲することができる一般的なモジュラー
オリゴヌクレオチドの製造である。かくして、より好ましい特徴において、本発
明は、鋳型ベクターから生成されるプライマーエクステンション産物を単離する
方法を提供し、その産物は、i)プライマー結合領域、ii)挿入体およびiii)ベク
ター由来の配列、に相当するまたは相補的な配列を含むものであり、上記方法は
、当該プライマーエクステンション産物上に隣接する伸長部分に、少なくとも二
つの部分（モジュール）からなるモジュラーオリゴヌクレオチドを結合させる工
程または工程（複数）を少なくとも包含し、該モジュラーオリゴヌクレオチドは
、該ベクター由来の配列に相補的であり、しかも結合できるものであり、当該プ
ライマーエクステンション産物の該ベクター由来の配列は、鋳型ベクターを産生
するのに使われるベクターの任意の領域から由来するもので、挿入体がその中に
クローンされる該ベクターの多重クローニングサイトの制限部位に関係なく、挿
入体をクローンした後、もとのままであるその一部を含む。モジュラーオリゴヌ
クレオチドは、当該一部にアニールされ、 少なくとも一のモジュール（捕獲モジュール）は、固定化されているか、また
は固定化手段を有しており、好ましくは、上記結合が40から60℃の間で、15分間
から90分間、行われる。
び他のものは、本発明のさらなる観点を形成する。 プライマーエクステンション産物を捕獲するための適切なモジュラーオリゴヌ
クレオチドの設計のための第２のアプローチは、与えられたベクターの多重クロ
ーニングサイト中に、すなわち最も極端に位置した制限部位さえもクローニング
に使用することができるけれども、クローンされた挿入物から生成したプライマ
ーエクステンション産物に結合しかつ捕獲することができる一般的なモジュラー
オリゴヌクレオチドの製造である。かくして、より好ましい特徴において、本発
明は、鋳型ベクターから生成されるプライマーエクステンション産物を単離する
方法を提供し、その産物は、i)プライマー結合領域、ii)挿入体およびiii)ベク
ター由来の配列、に相当するまたは相補的な配列を含むものであり、上記方法は
、当該プライマーエクステンション産物上に隣接する伸長部分に、少なくとも二
つの部分（モジュール）からなるモジュラーオリゴヌクレオチドを結合させる工
程または工程（複数）を少なくとも包含し、該モジュラーオリゴヌクレオチドは
、該ベクター由来の配列に相補的であり、しかも結合できるものであり、当該プ
ライマーエクステンション産物の該ベクター由来の配列は、鋳型ベクターを産生
するのに使われるベクターの任意の領域から由来するもので、挿入体がその中に
クローンされる該ベクターの多重クローニングサイトの制限部位に関係なく、挿
入体をクローンした後、もとのままであるその一部を含む。モジュラーオリゴヌ
クレオチドは、当該一部にアニールされ、 少なくとも一のモジュール（捕獲モジュール）は、固定化されているか、また
は固定化手段を有しており、好ましくは、上記結合が40から60℃の間で、15分間
から90分間、行われる。
【００３２】 次の表は、本発明の一般的な(しかも特異的な)タイプの多数のモジュラーオリ
ゴヌクレオチドの詳細を与えるものであり、核酸挿入体がクローンされて入れら
れる特定のベクターから産生されるプライマーエクステンション産物の収集に使
用されてもよい。
ゴヌクレオチドの詳細を与えるものであり、核酸挿入体がクローンされて入れら
れる特定のベクターから産生されるプライマーエクステンション産物の収集に使
用されてもよい。
【００３３】
【表１】
【００３４】 固定化手段は捕獲モジュールの核酸配列の本来的な一部分であることができ、
例えば相補的オリゴ dA 配列を担持する固形支持体に結合するためにポリＴテイ
ルを備えることができる。オリゴ dT 配列を担持する支持体に結合されるべきポ
リＡテイルを有する捕獲モジュールを使用することは勧められないことは認識さ
れよう。というのは、そうすることはサンプル中に存在する可能性のある mRNA
の捕獲を来す可能性があるからである。固定化性支持体に直接または間接に取り
付けられうる配列と相補的である他の特異的な配列もまた、固定化目的のための
捕獲モジュールの一部分を形成しうる。
例えば相補的オリゴ dA 配列を担持する固形支持体に結合するためにポリＴテイ
ルを備えることができる。オリゴ dT 配列を担持する支持体に結合されるべきポ
リＡテイルを有する捕獲モジュールを使用することは勧められないことは認識さ
れよう。というのは、そうすることはサンプル中に存在する可能性のある mRNA
の捕獲を来す可能性があるからである。固定化性支持体に直接または間接に取り
付けられうる配列と相補的である他の特異的な配列もまた、固定化目的のための
捕獲モジュールの一部分を形成しうる。
【００３５】 前記した方法は、標的核酸への結合に必要とされるもの以上に、捕獲モジュー
ルにさらなるヌクレオチドを添加することを包含する。このやり方での拡張は常
に必要なわけではなく、そして固定化手段は、結合パートナーを介した固定化性
支持体への直接的または間接的取り付けを可能にするために、オリゴヌクレオチ
ド合成期間中または合成後に捕獲モジュールのヌクレオチドに導入されうる。好
都合には、結合対の適切な第１のパートナーを得るためには誘導体形成されたヌ
クレオチドを合成期間中に使用できる。結合対の第２のパートナーが次に支持体
に担持される。こうして好適に誘導体形成された捕獲オリゴヌクレオチドには、
アビジンまたはストレプトアビジンに結合するためのビオチンを担持するもの、
抗体（モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい）または抗体フラグ
メントに結合するためのエピトープまたはハプテン（例えばジゴキシゲニン）を
担持するもの、または DNA または PNA 結合性タンパク質（例えばオリゴヌクレ
オチドに取り付けられた lac オペレーター配列に結合する lac I リプレッサー
タンパク質）に結合するための DNA 配列を担持するものが包含される。他の好
適な対形成物にはタンパク質Ａ−抗体、タンパク質Ｇ−ヒト血清アルブミン(HSA
) およびそれらの機能的部分が包含される。先に記した結合対のパートナーのど
ちらか、またはその機能性部分がオリゴヌクレオチドに結合しうることは認識さ
れよう。ストレプトアビジン／ビオチン結合系は、ヌクレオチド配列内にビオチ
ンを比較的容易に取り込めるゆえ、そして事実ビオチン標識ヌクレオチドが商業
的に容易に入手しうるゆえに分子生物学において非常に普通に使用され、したが
ってこれは支持体への捕獲モジュールの一つの好ましい取り付け方法である。
ルにさらなるヌクレオチドを添加することを包含する。このやり方での拡張は常
に必要なわけではなく、そして固定化手段は、結合パートナーを介した固定化性
支持体への直接的または間接的取り付けを可能にするために、オリゴヌクレオチ
ド合成期間中または合成後に捕獲モジュールのヌクレオチドに導入されうる。好
都合には、結合対の適切な第１のパートナーを得るためには誘導体形成されたヌ
クレオチドを合成期間中に使用できる。結合対の第２のパートナーが次に支持体
に担持される。こうして好適に誘導体形成された捕獲オリゴヌクレオチドには、
アビジンまたはストレプトアビジンに結合するためのビオチンを担持するもの、
抗体（モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい）または抗体フラグ
メントに結合するためのエピトープまたはハプテン（例えばジゴキシゲニン）を
担持するもの、または DNA または PNA 結合性タンパク質（例えばオリゴヌクレ
オチドに取り付けられた lac オペレーター配列に結合する lac I リプレッサー
タンパク質）に結合するための DNA 配列を担持するものが包含される。他の好
適な対形成物にはタンパク質Ａ−抗体、タンパク質Ｇ−ヒト血清アルブミン(HSA
) およびそれらの機能的部分が包含される。先に記した結合対のパートナーのど
ちらか、またはその機能性部分がオリゴヌクレオチドに結合しうることは認識さ
れよう。ストレプトアビジン／ビオチン結合系は、ヌクレオチド配列内にビオチ
ンを比較的容易に取り込めるゆえ、そして事実ビオチン標識ヌクレオチドが商業
的に容易に入手しうるゆえに分子生物学において非常に普通に使用され、したが
ってこれは支持体への捕獲モジュールの一つの好ましい取り付け方法である。
【００３６】 オリゴヌクレオチドを固定化するための数多くの好適な支持体、およびそれら
へのヌクレオチドの取り付け方法は当業上よく知られておりそして文献中に広く
記載されている。したがって例えば、アガロース、セルロース、アルギネート、
テフロン（登録商標）、ラテックスまたはポリスチレンのようなポリマー物質で 造られたシート、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバー片、プレート、マ イクロタイターウエル、チューブ、計量棒、粒子、ファイバーまたは毛細管の形 態をした支持体を使用できる。微粒子状物質、特にビーズが一般的に好ましい。 例えば、セファロースまたはポリスチレンビーズを使用できる。好都合には、支 持体は磁気粒子例えば Dynal AS (Oslo, Norway) により製造されそして DYNABE ADS なる商標のもとに販売されている超常磁性ビーズを包含しうる。チップ類は 例えば Nilsson ら（1995, Anal. Biochem., 224, p400-408)により記載される ように小規模実験系を提供するための固形支持体として使用できる。
へのヌクレオチドの取り付け方法は当業上よく知られておりそして文献中に広く
記載されている。したがって例えば、アガロース、セルロース、アルギネート、
テフロン（登録商標）、ラテックスまたはポリスチレンのようなポリマー物質で 造られたシート、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバー片、プレート、マ イクロタイターウエル、チューブ、計量棒、粒子、ファイバーまたは毛細管の形 態をした支持体を使用できる。微粒子状物質、特にビーズが一般的に好ましい。 例えば、セファロースまたはポリスチレンビーズを使用できる。好都合には、支 持体は磁気粒子例えば Dynal AS (Oslo, Norway) により製造されそして DYNABE ADS なる商標のもとに販売されている超常磁性ビーズを包含しうる。チップ類は 例えば Nilsson ら（1995, Anal. Biochem., 224, p400-408)により記載される ように小規模実験系を提供するための固形支持体として使用できる。
【００３７】 固形支持体は捕獲モジュールを取り付けるためのヒドロキシル、カルボキシル
、アルデヒドまたはアミノ基のような官能基を担持できる。これらは、支持体を
処理して、そのような官能基の一つを担持するポリマー、例えばヒドロキシル基
を生成させるためのポリグリコールと一緒のポリウレタン、またはヒドロキシル
基を生成させるためのセルロース誘導体、カルボキシル基を生成させるためのア
クリル酸またはメタクリル酸のコポリマーまたはポリマー、またはアミノ基を生
成させるためのアミノアルキル化ポリマーの表面コーティングを生成させること
により一般に提供できる。米国特許第4,654,267 号には多くのかかる表面コーテ
ィングの導入が記載されている。
、アルデヒドまたはアミノ基のような官能基を担持できる。これらは、支持体を
処理して、そのような官能基の一つを担持するポリマー、例えばヒドロキシル基
を生成させるためのポリグリコールと一緒のポリウレタン、またはヒドロキシル
基を生成させるためのセルロース誘導体、カルボキシル基を生成させるためのア
クリル酸またはメタクリル酸のコポリマーまたはポリマー、またはアミノ基を生
成させるためのアミノアルキル化ポリマーの表面コーティングを生成させること
により一般に提供できる。米国特許第4,654,267 号には多くのかかる表面コーテ
ィングの導入が記載されている。
【００３８】 あるいはまた、支持体はアビジンまたはストレプトアビジン、DNA 結合性タン
パク質または抗体または抗体フラグメントのような他の取付け部分を担持できる
。ストレプトアビジン被覆 DYNABEADS は Dynal AS から商業的に入手できる。
好ましくは、固形支持体上のストレプトアビジンに結合するのに使用できるビオ
チン部分を担持する固定化性オリゴヌクレオチドが生成される。
パク質または抗体または抗体フラグメントのような他の取付け部分を担持できる
。ストレプトアビジン被覆 DYNABEADS は Dynal AS から商業的に入手できる。
好ましくは、固形支持体上のストレプトアビジンに結合するのに使用できるビオ
チン部分を担持する固定化性オリゴヌクレオチドが生成される。
【００３９】 本発明による単離方法または捕獲方法があとに続いてもよいし続かなくてもよ
い標的核酸の検出が意図される場合、モジュラーオリゴヌクレオチドのモジュー
ルの少なくとも一つを標識できる。 本明細書で使用される用語「標識」は、例えばその酵素的特性、放射線放出、
散乱または吸収特性によって、または検出可能な結果を生ずる相補的試薬へのそ
の結合能または協同作業能、例えば酵素との相互作用によるシグナル生成、ガス
発生、光の放出、色の変化、混濁度生成、沈殿生成等によって、定性的または定
量的、直接的または間接的に評価できる任意の標識を指す。かかる標識または標
識用手段は特に診断アッセイの分野でよく知られており、そして例えば酵素、発
色団または発蛍光団（例えばフルオレセインおよびローダミンのような色素）、
放射性標識、化学ルミネセンス化合物または電子密度の高い試薬例えばフェリチ
ン、ヘモシアニンまたはコロイド状金が包含される。分光光度測定による評価の
ための色を生成させるのに酵素活性を用いる標識を使用でき、例をあげれば適当
な基質の添加に際し検出に好適なシグナルを生成しうるβ−ガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼである。
い標的核酸の検出が意図される場合、モジュラーオリゴヌクレオチドのモジュー
ルの少なくとも一つを標識できる。 本明細書で使用される用語「標識」は、例えばその酵素的特性、放射線放出、
散乱または吸収特性によって、または検出可能な結果を生ずる相補的試薬へのそ
の結合能または協同作業能、例えば酵素との相互作用によるシグナル生成、ガス
発生、光の放出、色の変化、混濁度生成、沈殿生成等によって、定性的または定
量的、直接的または間接的に評価できる任意の標識を指す。かかる標識または標
識用手段は特に診断アッセイの分野でよく知られており、そして例えば酵素、発
色団または発蛍光団（例えばフルオレセインおよびローダミンのような色素）、
放射性標識、化学ルミネセンス化合物または電子密度の高い試薬例えばフェリチ
ン、ヘモシアニンまたはコロイド状金が包含される。分光光度測定による評価の
ための色を生成させるのに酵素活性を用いる標識を使用でき、例をあげれば適当
な基質の添加に際し検出に好適なシグナルを生成しうるβ−ガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼである。
【００４０】 標識は好都合には合成期間中または合成後にモジュラーオリゴヌクレオチドの
一部分中に導入される。これは例えばオリゴヌクレオチドに結合対の一方のパー
トナーを付与し（合成期間中または合成後）、そして次に標識を備えた第２の結
合パートナーを結合させることにより、固定化のための手段を得ると同様の方法
で達成できる。第１のパートナーは慣用の結合対例えばビオチン：ストレプトア
ビジンの一方であることができるし、または第２の分子が特異的に結合するであ
ろうオリゴヌクレオチド配列それ自身の一部分であることもできる。あるいは、
標識例えば放射性標識ヌクレオチドを担持する誘導体化されたヌクレオチドがオ
リゴヌクレオチドの合成に使用されるかまたは合成後に誘導体形成できる。ある
いはまた、本来的に標識例えば放射性標識を担持しうるかまたは標識の結合に好
適でありうる標的核酸に対して相補的でない部分を用いてモジュールを合成する
こともできる。モジュールへのかかる拡張は、本発明による定義によれば、これ
らモジュールにまたがる一つのオリゴヌクレオチドと比較した、モジュラーオリ
ゴヌクレオチドへの結合改善が観察されるか否かを判定する場合にはモジュール
の一部分であるとは見なされない。しかしながら、単離される産物、すなわちプ
ライマーエクステンションまたは配列決定の産物が、例えば上記の何れかの方法
によって、特にエクステンションのための標識プライマー（例えば、色素）の使
用、または標識ターミネータヌクレオチドの使用により標識されるならば一般に
より好都合であろうことは認識されるであろう。そうした標識は、プライマーエ
クステンション産物の分離の前にモジュラーオリゴヌクレオチドの成分が除去さ
れるならば、特に必要とされる。
一部分中に導入される。これは例えばオリゴヌクレオチドに結合対の一方のパー
トナーを付与し（合成期間中または合成後）、そして次に標識を備えた第２の結
合パートナーを結合させることにより、固定化のための手段を得ると同様の方法
で達成できる。第１のパートナーは慣用の結合対例えばビオチン：ストレプトア
ビジンの一方であることができるし、または第２の分子が特異的に結合するであ
ろうオリゴヌクレオチド配列それ自身の一部分であることもできる。あるいは、
標識例えば放射性標識ヌクレオチドを担持する誘導体化されたヌクレオチドがオ
リゴヌクレオチドの合成に使用されるかまたは合成後に誘導体形成できる。ある
いはまた、本来的に標識例えば放射性標識を担持しうるかまたは標識の結合に好
適でありうる標的核酸に対して相補的でない部分を用いてモジュールを合成する
こともできる。モジュールへのかかる拡張は、本発明による定義によれば、これ
らモジュールにまたがる一つのオリゴヌクレオチドと比較した、モジュラーオリ
ゴヌクレオチドへの結合改善が観察されるか否かを判定する場合にはモジュール
の一部分であるとは見なされない。しかしながら、単離される産物、すなわちプ
ライマーエクステンションまたは配列決定の産物が、例えば上記の何れかの方法
によって、特にエクステンションのための標識プライマー（例えば、色素）の使
用、または標識ターミネータヌクレオチドの使用により標識されるならば一般に
より好都合であろうことは認識されるであろう。そうした標識は、プライマーエ
クステンション産物の分離の前にモジュラーオリゴヌクレオチドの成分が除去さ
れるならば、特に必要とされる。
【００４１】 本発明を実施するには、本方法は標的核酸への捕獲オリゴヌクレオチドの結合
に先立ってまたはそれに続いて、標的分子を含有するサンプルを固定化捕獲オリ
ゴヌクレオチドと接触させることにより、モジュールが固定化手段を備える場合
に固形支持体に捕獲モジュールを取り付けるさらなる工程を付加的に包含しうる
。ひとたび固形支持体に結合されると、特に精製目的のためまたは検出工程での
バックグラウンドを除去するために洗浄工程を実施するのが好都合でありうる。
好ましくは、捕獲オリゴヌクレオチドは標的核酸分子を含有するサンプルの添加
に先立って固形支持体に結合される。
に先立ってまたはそれに続いて、標的分子を含有するサンプルを固定化捕獲オリ
ゴヌクレオチドと接触させることにより、モジュールが固定化手段を備える場合
に固形支持体に捕獲モジュールを取り付けるさらなる工程を付加的に包含しうる
。ひとたび固形支持体に結合されると、特に精製目的のためまたは検出工程での
バックグラウンドを除去するために洗浄工程を実施するのが好都合でありうる。
好ましくは、捕獲オリゴヌクレオチドは標的核酸分子を含有するサンプルの添加
に先立って固形支持体に結合される。
【００４２】 異なるモジュールを別々に加えてもよいが、本発明の好ましい態様においては
、前記プライマーエクステンション産物は、前記モジュラーオリゴヌクレオチド
のすべてのモジュールと単一のハイブリダイゼーション工程で、直接に接触させ
る。 本発明の方法を用いる操作においては、所望の結果を得るのに適切であれば単
離、分離、精製、および／または評価などの付加的な工程を実施できる。したが
って、例えば、本発明の方法は、以下の付加的な工程の少なくとも１つを包含し
うる、すなわち： ａ）捕獲モジュールが固定化手段を備えている場合、モジュラーオリゴヌクレオ
チドの捕獲モジュールを固形支持体に結合させる； ｂ）標的核酸（プライマーエクステンション産物）を含有するサンプルをモジュ
ラーオリゴヌクレオチドと接触させる； ｃ）標的核酸を含有するサンプルをモジュラーオリゴヌクレオチドの調節性モジ
ュールと接触させる； ｄ）標的核酸を含有するサンプルを固定化捕獲オリゴヌクレオチドと接触させて
、オリゴヌクレオチドを標的核酸に結合せしめる； ｅ）サンプルから、捕獲モジュールに結合した標的核酸を分離する； ｆ）前記ｅ）で分離された標的核酸を洗浄する； ｇ）プライマーエクステンション／配列決定産物の分離後、標的核酸に結合した
標識の存在または量を評価する； 例えば、工程（ｃ）および（ｄ）は、実質的に工程（ｂ）を２部分で実施する
ものであるから、前記工程のすべてを任意の所定の操作に組み込めるというわけ
ではないことは認識されよう。
、前記プライマーエクステンション産物は、前記モジュラーオリゴヌクレオチド
のすべてのモジュールと単一のハイブリダイゼーション工程で、直接に接触させ
る。 本発明の方法を用いる操作においては、所望の結果を得るのに適切であれば単
離、分離、精製、および／または評価などの付加的な工程を実施できる。したが
って、例えば、本発明の方法は、以下の付加的な工程の少なくとも１つを包含し
うる、すなわち： ａ）捕獲モジュールが固定化手段を備えている場合、モジュラーオリゴヌクレオ
チドの捕獲モジュールを固形支持体に結合させる； ｂ）標的核酸（プライマーエクステンション産物）を含有するサンプルをモジュ
ラーオリゴヌクレオチドと接触させる； ｃ）標的核酸を含有するサンプルをモジュラーオリゴヌクレオチドの調節性モジ
ュールと接触させる； ｄ）標的核酸を含有するサンプルを固定化捕獲オリゴヌクレオチドと接触させて
、オリゴヌクレオチドを標的核酸に結合せしめる； ｅ）サンプルから、捕獲モジュールに結合した標的核酸を分離する； ｆ）前記ｅ）で分離された標的核酸を洗浄する； ｇ）プライマーエクステンション／配列決定産物の分離後、標的核酸に結合した
標識の存在または量を評価する； 例えば、工程（ｃ）および（ｄ）は、実質的に工程（ｂ）を２部分で実施する
ものであるから、前記工程のすべてを任意の所定の操作に組み込めるというわけ
ではないことは認識されよう。
【００４３】 本明細書で使用される「評価」なる用語は、サンプル中の標的核酸の量につい
ての絶対値を得る意味での定量、そしてまた、例えば研究中のサンプル中の標的
核酸の存在を単に示すための半定量的または定性的評価を得る意味での定量の両
方を包含する。評価はまた、例えば増幅反応によって、検出する分子のさらなる
生成をも包含しうる。モジュラーオリゴヌクレオチドの結合を達成するために異
なる逐次的な工程を用いうることは明白であろう。例えば、モジュラーオリゴヌ
クレオチドの一部分をサンプルと接触させ、次に結合させ続いてモジュラーオリ
ゴヌクレオチドの他の部分を接触および結合させることができる。あるいはまた
、接触工程は同時に実施されてもよい。
ての絶対値を得る意味での定量、そしてまた、例えば研究中のサンプル中の標的
核酸の存在を単に示すための半定量的または定性的評価を得る意味での定量の両
方を包含する。評価はまた、例えば増幅反応によって、検出する分子のさらなる
生成をも包含しうる。モジュラーオリゴヌクレオチドの結合を達成するために異
なる逐次的な工程を用いうることは明白であろう。例えば、モジュラーオリゴヌ
クレオチドの一部分をサンプルと接触させ、次に結合させ続いてモジュラーオリ
ゴヌクレオチドの他の部分を接触および結合させることができる。あるいはまた
、接触工程は同時に実施されてもよい。
【００４４】 本発明によれば有用性のあるモジュラーオリゴヌクレオチドは、その各々が異
なる寸法を有し得る異なる数のモジュール（標的核酸分子に結合した場合にそれ
らの間にスペースがあるかまたはない）から作られ得ることは認識されよう。異
なる標的部位に向けられたモジュラーオリゴヌクレオチドの使用が、有用性を有
することが判明しているが（ＷＯ98／13522）、個々の実験条件下で所定部位へ
の最適な結合を得るためにはモジュール数および／またはモジュール寸法の幾分
かの適当な変更が適切でありうる。かかる最適化は本明細書に例示される種類の
試行錯誤の実験が用いられうる熟練した名宛人の範囲内である。したがって、一
般的に、５またはそれ以下のモジュール、好ましくは２または３モジュールでモ
ジュラーオリゴヌクレオチドを構成し、各モジュールは４またはそれ以上のヌク
レオチド塩基を含有する。好ましくは、モジュラーオリゴヌクレオチドは合計で
少なくとも 10 ヌクレオチド、好ましくは少なくとも 18、例えば 18, 24, 27,
29, 31, 33 または36 ヌクレオチドを含有する。モジュール類は、標的核酸（す
なわちプライマーエクステンション産物）に結合される場合は、好ましくは 10
ヌクレオチド塩基より少なく離れており、特に好ましくは２塩基より少なく離れ
、特別に好ましくはその間に塩基が存在しない。標的に結合した場合に２より少
ない塩基が捕獲モジュールおよび第１の隣接調節性モジュールを隔てることが、
特に好ましい。
なる寸法を有し得る異なる数のモジュール（標的核酸分子に結合した場合にそれ
らの間にスペースがあるかまたはない）から作られ得ることは認識されよう。異
なる標的部位に向けられたモジュラーオリゴヌクレオチドの使用が、有用性を有
することが判明しているが（ＷＯ98／13522）、個々の実験条件下で所定部位へ
の最適な結合を得るためにはモジュール数および／またはモジュール寸法の幾分
かの適当な変更が適切でありうる。かかる最適化は本明細書に例示される種類の
試行錯誤の実験が用いられうる熟練した名宛人の範囲内である。したがって、一
般的に、５またはそれ以下のモジュール、好ましくは２または３モジュールでモ
ジュラーオリゴヌクレオチドを構成し、各モジュールは４またはそれ以上のヌク
レオチド塩基を含有する。好ましくは、モジュラーオリゴヌクレオチドは合計で
少なくとも 10 ヌクレオチド、好ましくは少なくとも 18、例えば 18, 24, 27,
29, 31, 33 または36 ヌクレオチドを含有する。モジュール類は、標的核酸（す
なわちプライマーエクステンション産物）に結合される場合は、好ましくは 10
ヌクレオチド塩基より少なく離れており、特に好ましくは２塩基より少なく離れ
、特別に好ましくはその間に塩基が存在しない。標的に結合した場合に２より少
ない塩基が捕獲モジュールおよび第１の隣接調節性モジュールを隔てることが、
特に好ましい。
【００４５】 本発明で使用するのに特に好ましいモジュラーオリゴヌクレオチドの特徴は、
２または３モジュールを有するものであり、各モジュールは＞５ヌクレオチド、
好ましくは≧９≦18、例えば ９, 11, 13, 15 または 18 ヌクレオチドを有する
。３モジュールが使用された場合、２-部分モジュラーオリゴヌクレオチドにお
ける総ヌクレオチドが＞27、好ましくは≧29、例えば 29, 31, 33 または 36 で
あるように、そして３-部分モジュラーオリゴヌクレオチドにおいては＞23、好
ましくは≧27、例えば 27, 31, 33 または 36 ヌクレオチドであるように、２モ
ジュールが用いられた場合よりわずかに短いモジュールを使用してもよい。
２または３モジュールを有するものであり、各モジュールは＞５ヌクレオチド、
好ましくは≧９≦18、例えば ９, 11, 13, 15 または 18 ヌクレオチドを有する
。３モジュールが使用された場合、２-部分モジュラーオリゴヌクレオチドにお
ける総ヌクレオチドが＞27、好ましくは≧29、例えば 29, 31, 33 または 36 で
あるように、そして３-部分モジュラーオリゴヌクレオチドにおいては＞23、好
ましくは≧27、例えば 27, 31, 33 または 36 ヌクレオチドであるように、２モ
ジュールが用いられた場合よりわずかに短いモジュールを使用してもよい。
【００４６】 モジュラーオリゴヌクレオチドのモジュールは当業上よく知られた化学的また
は他の適当な合成により調製されうる。幾つかの有用なオリゴヌクレオチドは、
固定化のためのビオチン分子が結合されて商業的に入手できる（例えば、KEBO,
Stockholm, Sweden)。 好ましい態様において、２つのモジュールからなるモジュラーオリゴヌクレオ
チドが使用され、該モジュールの１つ、捕獲モジュールは固形支持体に固定化さ
れる。
は他の適当な合成により調製されうる。幾つかの有用なオリゴヌクレオチドは、
固定化のためのビオチン分子が結合されて商業的に入手できる（例えば、KEBO,
Stockholm, Sweden)。 好ましい態様において、２つのモジュールからなるモジュラーオリゴヌクレオ
チドが使用され、該モジュールの１つ、捕獲モジュールは固形支持体に固定化さ
れる。
【００４７】 上述したように特別のアプローチにおいて、上記のベクター由来の配列は、特
定ベクターの任意の領域から由来するものであり、該ベクターの多重クローニン
グサイトの特定制限部位に挿入体をクローンした後、インタクト（intact）のま
まであるその一部分を含み、モジュラーオリゴヌクレオチドは、当該部分にアニ
ールする。好ましくは、モジュラーオリゴヌクレオチドが、アニールするそのベ
クターの当該部分は、多重クローニングサイトまたは周辺配列に由来する。
定ベクターの任意の領域から由来するものであり、該ベクターの多重クローニン
グサイトの特定制限部位に挿入体をクローンした後、インタクト（intact）のま
まであるその一部分を含み、モジュラーオリゴヌクレオチドは、当該部分にアニ
ールする。好ましくは、モジュラーオリゴヌクレオチドが、アニールするそのベ
クターの当該部分は、多重クローニングサイトまたは周辺配列に由来する。
【００４８】 一般的アプローチにおいて、上記のベクター由来の配列は、特定ベクターの任
意の領域にするものであり、挿入体がその中にクローンされる特定ベクターの多
重クローニングサイトの制限部位に関係なく、挿入体をクローンした後、インタ
クトのままであるその一部を含み、モジュラーオリゴヌクレオチドが、当該一部
にアニールする。好ましくは、モジュラーオリゴヌクレオチドが、アニールする
そのベクターの当該部分は、多重クローニングサイトまたは周辺配列、とくに好
ましくは、先行する配列、多重クローニングサイトに由来する。適切な配列の選
択は、使用されるベクターに依存するだろう。ある場合にはこの一般的アプロー
チは、乱されていないベクター由来の配列が余りに短ければ可能ではない。その
場合、特別アプローチのモジュラーオリゴヌクレオチドがより適切であろう。
意の領域にするものであり、挿入体がその中にクローンされる特定ベクターの多
重クローニングサイトの制限部位に関係なく、挿入体をクローンした後、インタ
クトのままであるその一部を含み、モジュラーオリゴヌクレオチドが、当該一部
にアニールする。好ましくは、モジュラーオリゴヌクレオチドが、アニールする
そのベクターの当該部分は、多重クローニングサイトまたは周辺配列、とくに好
ましくは、先行する配列、多重クローニングサイトに由来する。適切な配列の選
択は、使用されるベクターに依存するだろう。ある場合にはこの一般的アプロー
チは、乱されていないベクター由来の配列が余りに短ければ可能ではない。その
場合、特別アプローチのモジュラーオリゴヌクレオチドがより適切であろう。
【００４９】 一般にプライマーエクステンション産物の単離に使用されるモジュラーオリゴ
ヌクレオチドは、上述したような特徴（好ましくは、標的核酸上へ隣接して直接
結合する２個のモジュールを含み、そのモジュールは長さにして９および１８ヌ
クレオチドの間にある）を具えており、プライマーエクステンション産物のベク
ター由来の配列に相補的でありしかも結合できる。上記の特別のまたは一般的ア
プローチにおける使用に適切なモジュラーオリゴヌクレオチドの個々の例が、表
１に掲げられ、本発明の好ましい特徴を含んでいる。
ヌクレオチドは、上述したような特徴（好ましくは、標的核酸上へ隣接して直接
結合する２個のモジュールを含み、そのモジュールは長さにして９および１８ヌ
クレオチドの間にある）を具えており、プライマーエクステンション産物のベク
ター由来の配列に相補的でありしかも結合できる。上記の特別のまたは一般的ア
プローチにおける使用に適切なモジュラーオリゴヌクレオチドの個々の例が、表
１に掲げられ、本発明の好ましい特徴を含んでいる。
【００５０】 上述したような特別のモジュラーオリゴヌクレオチドの場合、様々なオリゴヌ
クレオチドが、何れの制限酵素が使用されるかに依存して何れが適切であるのか
、設計されるけれども、あらゆる制限酵素挿入点を利用することは可能ではない
。例えば、表１に記載の特別なｐＵＣ18プローブは、挿入体がBamH1、SmaI、Kpn
I部位にクローンされるなら有用性を有している。表１のBluescript特別モジュ
ラーオリゴヌクレオチドは、挿入体がそのクローニングサイトにおいて任意の制
限部位に導入される場合に使用することができる。
クレオチドが、何れの制限酵素が使用されるかに依存して何れが適切であるのか
、設計されるけれども、あらゆる制限酵素挿入点を利用することは可能ではない
。例えば、表１に記載の特別なｐＵＣ18プローブは、挿入体がBamH1、SmaI、Kpn
I部位にクローンされるなら有用性を有している。表１のBluescript特別モジュ
ラーオリゴヌクレオチドは、挿入体がそのクローニングサイトにおいて任意の制
限部位に導入される場合に使用することができる。
【００５１】 参考のため、図１は、ベクターｐＵＣ18について本発明によるモジュラーオリ
ゴヌクレオチドの結合部位を説明するが、該ベクターにおいてその諸部分を含む
プライマーエクステンション産物が順方向で生成される。枠で囲んだ領域は、一
般的アプローチのモジュラーオリゴヌクレオチドが向けられるベクターの範囲を
示す。特別アプローチモジュラーオリゴヌクレオチドの配列が、太字で与えられ
ている。このベクターからの配列決定産物といったプライマーエクステンション
産物の生成に好適なプライマーが示されている。
ゴヌクレオチドの結合部位を説明するが、該ベクターにおいてその諸部分を含む
プライマーエクステンション産物が順方向で生成される。枠で囲んだ領域は、一
般的アプローチのモジュラーオリゴヌクレオチドが向けられるベクターの範囲を
示す。特別アプローチモジュラーオリゴヌクレオチドの配列が、太字で与えられ
ている。このベクターからの配列決定産物といったプライマーエクステンション
産物の生成に好適なプライマーが示されている。
【００５２】 本発明に使用されるように、特別のベクターの多重クローニングサイトは、当
業に知られた領域を言い、核酸フラグメントの挿入のためのベクターに存在する
。 上記のアプローチを使用して、すなわちベクター由来の配列に向けられたモジ
ュラーオリゴヌクレオチドを使用して達成される配列決定産物の捕獲が効率的で
あるのみならず、反応の特異性が、（本明細書の実施例に記載されたように）配
列決定反応に向上した正確さを提供する。達成されてきた結果は、期待をしのぐ
ものであり、捕獲は非特異的結合が顕著になくとも達成されるようである。かく
して該方法は、分離のために配列決定産物を捕獲することに特に向いているだけ
でなく、特異性の結果として、複雑な混合物から（特定の挿入物に関する）配列
決定産物の全体集団を選択するために使用してもよい。実施例で説明されている
ように、様々な配列決定産物集団は、これらの産物が別々の配列決定伸長反応の
あと混合されてきた場合か、あるいは様々な配列決定伸長反応が同時的に行われ
る場合に単離してよい。
業に知られた領域を言い、核酸フラグメントの挿入のためのベクターに存在する
。 上記のアプローチを使用して、すなわちベクター由来の配列に向けられたモジ
ュラーオリゴヌクレオチドを使用して達成される配列決定産物の捕獲が効率的で
あるのみならず、反応の特異性が、（本明細書の実施例に記載されたように）配
列決定反応に向上した正確さを提供する。達成されてきた結果は、期待をしのぐ
ものであり、捕獲は非特異的結合が顕著になくとも達成されるようである。かく
して該方法は、分離のために配列決定産物を捕獲することに特に向いているだけ
でなく、特異性の結果として、複雑な混合物から（特定の挿入物に関する）配列
決定産物の全体集団を選択するために使用してもよい。実施例で説明されている
ように、様々な配列決定産物集団は、これらの産物が別々の配列決定伸長反応の
あと混合されてきた場合か、あるいは様々な配列決定伸長反応が同時的に行われ
る場合に単離してよい。
【００５３】 これは多重配列決定が行われている状況では極めて有利であり、これは、同一
のプライマーが異なる配列決定産物の生成に使用できるからである。しかし、配
列決定産物集団の類のない配列特徴（すなわち、異なるベクターを使用した場合
には違っているベクター由来の配列）に向けられたモジュラーオリゴヌクレオチ
ドを使用して様々な集団を選択することができる。これにより異なるプライマー
を使用する不利（異なる効率性を示すかもしれない）および使用されたプライマ
ーの異なる性質に基づいて配列を除く不利を克服する。
のプライマーが異なる配列決定産物の生成に使用できるからである。しかし、配
列決定産物集団の類のない配列特徴（すなわち、異なるベクターを使用した場合
には違っているベクター由来の配列）に向けられたモジュラーオリゴヌクレオチ
ドを使用して様々な集団を選択することができる。これにより異なるプライマー
を使用する不利（異なる効率性を示すかもしれない）および使用されたプライマ
ーの異なる性質に基づいて配列を除く不利を克服する。
【００５４】 本発明の上述した方法は最適化され、捕獲プローブの最適なハイブリダイゼー
ションは、54℃辺り、例えば40〜60℃、特に好ましくは50〜58℃で行われる。こ
のことは、その値が使用された系における捕獲プローブのTmに近接しているため
に驚くべき発見である。捕獲は、最適には少なくとも15分間、例えば15〜19分間
行われるべきであることが見出された。さらに、使用された調節性モジュール量
は、ビーズ150μｇあたり少なくとも調節性モジュール30ピコモルの最適条件で
捕獲効率に影響を及ぼすことが見出された。したがって、例えば20〜50ピコモル
で使用されるべきであり、例えば30〜40ピコモルである。しかしながら、これら
の値は異なる系では変化するかもしれないことは理解されるであろう。適切な最
適化は、熟練した名宛人の範囲内である。
ションは、54℃辺り、例えば40〜60℃、特に好ましくは50〜58℃で行われる。こ
のことは、その値が使用された系における捕獲プローブのTmに近接しているため
に驚くべき発見である。捕獲は、最適には少なくとも15分間、例えば15〜19分間
行われるべきであることが見出された。さらに、使用された調節性モジュール量
は、ビーズ150μｇあたり少なくとも調節性モジュール30ピコモルの最適条件で
捕獲効率に影響を及ぼすことが見出された。したがって、例えば20〜50ピコモル
で使用されるべきであり、例えば30〜40ピコモルである。しかしながら、これら
の値は異なる系では変化するかもしれないことは理解されるであろう。適切な最
適化は、熟練した名宛人の範囲内である。
【００５５】 特に配列決定産物が色素ターミネータ化学（例えば Big Dye Terminator, Per
kin ElmerInc.および ET Terminatory, Amersham Pharmacia Biotech）の使用に
より生成される場合には、PEG（ポリエチレングリコール）を含めることにより
産物の捕獲に驚くべき改善をもたらすことが観察された。したがって、好ましく
は本発明の方法は、PEG含有緩衝液中でハイブリダイゼーションによりモジュラ
ーオリゴヌクレオチドのモジュールを結合させることを含む。例えば、捕獲のた
めの緩衝液は、6XSSPE(0.9M NaCl, pH7.4, 60mM Na2H2PO4H2O, 7.5mM EDTA)を含
んでもよい。
kin ElmerInc.および ET Terminatory, Amersham Pharmacia Biotech）の使用に
より生成される場合には、PEG（ポリエチレングリコール）を含めることにより
産物の捕獲に驚くべき改善をもたらすことが観察された。したがって、好ましく
は本発明の方法は、PEG含有緩衝液中でハイブリダイゼーションによりモジュラ
ーオリゴヌクレオチドのモジュールを結合させることを含む。例えば、捕獲のた
めの緩衝液は、6XSSPE(0.9M NaCl, pH7.4, 60mM Na2H2PO4H2O, 7.5mM EDTA)を含
んでもよい。
【００５６】 本発明のこの観点は、また標的核酸分子、特に色素ターミネータ化学または同
等方法論により生成された産物へのモジュラープローブのハイブリダイゼーショ
ンの改善に一般的適用性を有する。したがって、本発明は、サンプル中の相補的
核酸分子への一連の連続ヌクレオチド塩基の結合を改善する方法もまた提供する
ものであり、該方法は、当該サンプル中にある該標的核酸分子上の直接的に隣接
する伸長部分に、該ヌクレオチド塩基を含む少なくとも二つの部分（モジュール
）からなる相補的モジュラーオリゴヌクレオチドを結合させる工程または工程（
複数）を少なくとも包含し、該結合工程はポリエチレングリコールの存在下で行
われる。好ましくは該モジュラーオリゴヌクレオチドは、モジュラーオリゴヌク
レオチドにより繋がれた標的分子の領域に相補的である単一のオリゴヌクレオチ
ドと比較して改善された結合を示すが、好ましくは、少なくとも１つのモジュー
ル（捕獲モジュール）は固定化されているか、または固定化のための手段を有す
る。
等方法論により生成された産物へのモジュラープローブのハイブリダイゼーショ
ンの改善に一般的適用性を有する。したがって、本発明は、サンプル中の相補的
核酸分子への一連の連続ヌクレオチド塩基の結合を改善する方法もまた提供する
ものであり、該方法は、当該サンプル中にある該標的核酸分子上の直接的に隣接
する伸長部分に、該ヌクレオチド塩基を含む少なくとも二つの部分（モジュール
）からなる相補的モジュラーオリゴヌクレオチドを結合させる工程または工程（
複数）を少なくとも包含し、該結合工程はポリエチレングリコールの存在下で行
われる。好ましくは該モジュラーオリゴヌクレオチドは、モジュラーオリゴヌク
レオチドにより繋がれた標的分子の領域に相補的である単一のオリゴヌクレオチ
ドと比較して改善された結合を示すが、好ましくは、少なくとも１つのモジュー
ル（捕獲モジュール）は固定化されているか、または固定化のための手段を有す
る。
【００５７】 本発明の方法が固形支持体としてビーズを使用する場合、このビーズは配列決
定産物を溶出後に結合／洗浄緩衝液でビーズを洗浄することにより繰り返し、20
の追加回数まで使用できることが見出されている。したがって、このことは容易
に自動化に応え得る技術を提供する。モジュラーオリゴヌクレオチドのすべての
モジュールは同時に使用されることが好ましいことも見出されている。かくして
本発明は、ゲノム全体の配列決定プロジェクトに使用されることが好適な一段階
方法を提供する。なぜならばこの方法は、(i)上昇させた温度での捕獲およびモ
ジュラーオリゴヌクレオチドの使用により達成された多重配列決定プールから個
々の配列決定反応の選択的精製、(ii)捕獲ビーズを再使用する複式サイクル、お
よび(iii)加熱及び低塩緩衝液を使用する簡単な溶出プロトコルを提供するため
である。
定産物を溶出後に結合／洗浄緩衝液でビーズを洗浄することにより繰り返し、20
の追加回数まで使用できることが見出されている。したがって、このことは容易
に自動化に応え得る技術を提供する。モジュラーオリゴヌクレオチドのすべての
モジュールは同時に使用されることが好ましいことも見出されている。かくして
本発明は、ゲノム全体の配列決定プロジェクトに使用されることが好適な一段階
方法を提供する。なぜならばこの方法は、(i)上昇させた温度での捕獲およびモ
ジュラーオリゴヌクレオチドの使用により達成された多重配列決定プールから個
々の配列決定反応の選択的精製、(ii)捕獲ビーズを再使用する複式サイクル、お
よび(iii)加熱及び低塩緩衝液を使用する簡単な溶出プロトコルを提供するため
である。
【００５８】 本発明による方法は、好ましくは、以下の工程を包含する。すなわち １）プライマーエクステンション産物を含有するサンプルをモジュラーオリゴヌ
クレオチドのすべてのモジュールと接触させる、ここで捕獲モジュールは固形支
持体に固定化されている； ２）前記モジュールをハイブリダイゼーションにより結合させる； ３）前記固形支持体に結合された標的プライマーエクステンション産物を分離す
る； ４）前記固形支持体を洗浄する。
クレオチドのすべてのモジュールと接触させる、ここで捕獲モジュールは固形支
持体に固定化されている； ２）前記モジュールをハイブリダイゼーションにより結合させる； ３）前記固形支持体に結合された標的プライマーエクステンション産物を分離す
る； ４）前記固形支持体を洗浄する。
【００５９】 本発明は、ベクター内の核酸挿入体のヌクレオチド配列を決定する方法に付加
的に拡張される。その方法において、配列決定産物は当該ベクター上で適切な伸
長反応を行うことにより公知技術の方法によって生成され、配列決定産物は、上
記の方法により単離される。このように単離された産物は、適当な技術、例えば
ゲル電気泳動法、ガスクロマトグラフィー、またはHPLCによって分離される。該
配列決定産物に付されたラベルは、視覚化されて当該挿入物またはその一部の配
列を決定することができる。
的に拡張される。その方法において、配列決定産物は当該ベクター上で適切な伸
長反応を行うことにより公知技術の方法によって生成され、配列決定産物は、上
記の方法により単離される。このように単離された産物は、適当な技術、例えば
ゲル電気泳動法、ガスクロマトグラフィー、またはHPLCによって分離される。該
配列決定産物に付されたラベルは、視覚化されて当該挿入物またはその一部の配
列を決定することができる。
【００６０】 本発明は、さらなる観点から本明細書に記載されたモジュラーオリゴヌクレオ
チドおよび本発明の方法におけるそれらの使用を提供する。 本発明は、また本発明の方法を行うためのキットに拡張され、少なくとも次の
物を含む；本発明の方法に使用するのに好適な２またはそれ以上の部分を有する
モジュラーオリゴヌクレオチド。
チドおよび本発明の方法におけるそれらの使用を提供する。 本発明は、また本発明の方法を行うためのキットに拡張され、少なくとも次の
物を含む；本発明の方法に使用するのに好適な２またはそれ以上の部分を有する
モジュラーオリゴヌクレオチド。
【００６１】 好ましくは、すくなくともモジュールのうちの１つは固定化されているか、ま
たは固定化のための手段を有する。少なくともモジュールのうちの１つをラベル
して標識核酸分子を検出することができるようにしてもよい。追加として適当な
緩衝液および／または固形支持体が与えられてもよい。 以下の実施例は説明のために与えられているものである。本発明を実施するの
に関係ある実施例および一般的方法論は、さらにＷＯ98／13522に見出されるだ
ろう。本明細書にある実施例は後述するような図への言及を含む。
たは固定化のための手段を有する。少なくともモジュールのうちの１つをラベル
して標識核酸分子を検出することができるようにしてもよい。追加として適当な
緩衝液および／または固形支持体が与えられてもよい。 以下の実施例は説明のために与えられているものである。本発明を実施するの
に関係ある実施例および一般的方法論は、さらにＷＯ98／13522に見出されるだ
ろう。本明細書にある実施例は後述するような図への言及を含む。
【００６２】
【００６３】
【実施例１】モジュラープローブとして捕獲オリゴヌクレオチドおよび少なく
とも1つの追加的なオリゴヌクレオチドを用いるssDNAの捕獲 この実施例は、特異的なオリゴヌクレオチドモジュールが予めDNAにハイブリ
ッド形成されている場合の固定化捕獲オリゴヌクレオチドによるssDNAの捕獲に
ついての数倍の増大を示す。捕獲オリゴヌクレオチド（この実施例では、捕獲オ
リゴヌクレオチド、または固定化オリゴヌクレオチドという）およびDNAとハイ
ブリッド形成したオリゴヌクレオチド（この実施例では、オリゴヌクレオチドモ
ジュールという）が一緒になってモジュラープローブのモジュールとなる。
とも1つの追加的なオリゴヌクレオチドを用いるssDNAの捕獲 この実施例は、特異的なオリゴヌクレオチドモジュールが予めDNAにハイブリ
ッド形成されている場合の固定化捕獲オリゴヌクレオチドによるssDNAの捕獲に
ついての数倍の増大を示す。捕獲オリゴヌクレオチド（この実施例では、捕獲オ
リゴヌクレオチド、または固定化オリゴヌクレオチドという）およびDNAとハイ
ブリッド形成したオリゴヌクレオチド（この実施例では、オリゴヌクレオチドモ
ジュールという）が一緒になってモジュラープローブのモジュールとなる。
【００６４】 種々の組み合わせの捕獲オリゴヌクレオチドとDNAに結合するためのオリゴヌ
クレオチドモジュールとを使用した。したがって、18マー捕獲オリゴヌクレオチ
ドは18、15、13、11、9または5マーオリゴヌクレオチドモジュールのいずれかと
ともに用い、9マー捕獲オリゴヌクレオチドは第2のオリゴヌクレオチドモジュー
ル（18、15、13、11、9または5マー）とともに、またはなしで、9マーオリゴヌ
クレオチドとともに用いた。また、モジュールのアニーリング部位間に1ヌクレ
オチド間隔を有するモジュラープローブも試験した。モジュラー作用をさらに調
査するために、36マービオチニル化オリゴヌクレオチド（18マー捕獲オリゴヌク
レオチドC1および18マーオリゴヌクレオチドモジュールH1-18からなる）を設計
し、そのHCV捕獲効率について試験した。
クレオチドモジュールとを使用した。したがって、18マー捕獲オリゴヌクレオチ
ドは18、15、13、11、9または5マーオリゴヌクレオチドモジュールのいずれかと
ともに用い、9マー捕獲オリゴヌクレオチドは第2のオリゴヌクレオチドモジュー
ル（18、15、13、11、9または5マー）とともに、またはなしで、9マーオリゴヌ
クレオチドとともに用いた。また、モジュールのアニーリング部位間に1ヌクレ
オチド間隔を有するモジュラープローブも試験した。モジュラー作用をさらに調
査するために、36マービオチニル化オリゴヌクレオチド（18マー捕獲オリゴヌク
レオチドC1および18マーオリゴヌクレオチドモジュールH1-18からなる）を設計
し、そのHCV捕獲効率について試験した。
【００６５】 <材料および方法> <PCR増幅（鋳型生成）> pGEMTM-Tベクター（Promega，Madison，WI，USA）中に２つのC型肝炎ウィルス（
HCV）遺伝子型（2bおよび3a）の5'非翻訳領域（NTR）を含有するクローンをPCR
における鋳型として用いて、バイオセンサー分析用の324bpフラグメントを生成
した。PCR増幅は各プライマーOU49およびOD66それぞれの0.2μMを用いて行った
。
HCV）遺伝子型（2bおよび3a）の5'非翻訳領域（NTR）を含有するクローンをPCR
における鋳型として用いて、バイオセンサー分析用の324bpフラグメントを生成
した。PCR増幅は各プライマーOU49およびOD66それぞれの0.2μMを用いて行った
。
【００６６】
【数３】
【００６７】 増幅は、Perkin-Elmer 9600サーモサイクラー（Perkin-Elmer，Norwalk，CT）
を用い、10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、2mM MgCl2、0.1％ Tween TM
20、0.2mM dNTPおよび0.5UのAmpliTaqTM DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer，Fo
ster City，CA）を含む50μlの反応容積中で行った。温度プロファイルは94℃
で5分間、（94℃で15分間、62℃で45分間、72℃で60分間）の30サイクル、およ
び72℃で10分間での終結であった。
を用い、10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、2mM MgCl2、0.1％ Tween TM
20、0.2mM dNTPおよび0.5UのAmpliTaqTM DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer，Fo
ster City，CA）を含む50μlの反応容積中で行った。温度プロファイルは94℃
で5分間、（94℃で15分間、62℃で45分間、72℃で60分間）の30サイクル、およ
び72℃で10分間での終結であった。
【００６８】 <1本鎖調製> ビオチニル化したPCR産物はストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Dynabeads TM M-280ストレプトアビジン，Dynal，Oslo，Norway）上に固定化し、そしてス
トランド特異的溶出により、ハイブリッド形成用の純粋な鋳型を得た（Hultman
ら，1989，Nucl.Acids RES.,17,p4937-4946）。50μlの結合／洗浄緩衝液（10mM
Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTA、２M NaCl、1mM β-メルカプトエタノール
、0.1％ Tween TM 20 ）中で5mg／mlのビーズとともに室温で15分間インキュベ
ートすることにより、50マイクロリットルのPCR産物を捕獲した。洗浄し上澄を
除去した後、ストランドを0.1M NaOHの10μlで５分間インキュベートすること
により分離した。非ビオチニル化ストランドを有するアルカリ性上澄を6μlの0.
1667mM HCl、および1μlの280mM Tris-HCl（pH7.5）および100mM MgCl2を用
いて中和した。共溶出したビオチニル化ストランドがセンサーチップ上のストレ
プトアビジンと相互作用するのを阻止するために、沈降したストレプトアビジン
ビーズの第２回分（250μg）を混合し、上澄を集めた。一つの実験内の個々のサ
ンプル間の相違を低減させるために、溶出した1本鎖DNAを一括した。調製された
1本鎖DNAをPhastSystemTMおよびPhastGelTM DNA Buffer StripsおよびDNA S
ilver Staining Kit（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）を用いて10−1
5％PAGE上で定性的および定量的に分析した。
トランド特異的溶出により、ハイブリッド形成用の純粋な鋳型を得た（Hultman
ら，1989，Nucl.Acids RES.,17,p4937-4946）。50μlの結合／洗浄緩衝液（10mM
Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTA、２M NaCl、1mM β-メルカプトエタノール
、0.1％ Tween TM 20 ）中で5mg／mlのビーズとともに室温で15分間インキュベ
ートすることにより、50マイクロリットルのPCR産物を捕獲した。洗浄し上澄を
除去した後、ストランドを0.1M NaOHの10μlで５分間インキュベートすること
により分離した。非ビオチニル化ストランドを有するアルカリ性上澄を6μlの0.
1667mM HCl、および1μlの280mM Tris-HCl（pH7.5）および100mM MgCl2を用
いて中和した。共溶出したビオチニル化ストランドがセンサーチップ上のストレ
プトアビジンと相互作用するのを阻止するために、沈降したストレプトアビジン
ビーズの第２回分（250μg）を混合し、上澄を集めた。一つの実験内の個々のサ
ンプル間の相違を低減させるために、溶出した1本鎖DNAを一括した。調製された
1本鎖DNAをPhastSystemTMおよびPhastGelTM DNA Buffer StripsおよびDNA S
ilver Staining Kit（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）を用いて10−1
5％PAGE上で定性的および定量的に分析した。
【００６９】 ＜オリゴヌクレオチド＞ センサーチップ上に固定化するためのビオチニル化オリゴヌクレオチドおよび
ssHCVのPCR産物にハイブリッド形成するためのオリゴヌクレオチドはKEBO，Stoc
kholm，Swedenから購入した。オリゴヌクレオチド配列は位置１については表２
に、そして位置２については表３に示す。
ssHCVのPCR産物にハイブリッド形成するためのオリゴヌクレオチドはKEBO，Stoc
kholm，Swedenから購入した。オリゴヌクレオチド配列は位置１については表２
に、そして位置２については表３に示す。
【００７０】 ＜バイオセンサー分析＞ すべての実験でBIAcoreTM2000装置（Pharmacia Biosensor，Uppsala，Sweden
）を使用した。約4000RUストレプトアビジン（1000RUはストレプトアビジン約1n
g／mm2に相当する）で予め被覆したセンサーチップSA（Pharmacia Biosensor）
を用いた。実験は注入および操作緩衝液として6X SSPE（0.9M NaCl（pH7.4）
、60mM NaH2PO4、7.5mM EDTAおよび0.005％（v/v）Surfactant P20（Pharmac
ia Biosensor））を用い、25℃で行った。センサーチップ上に捕獲のためのビ
オチニル化オリゴヌクレオチドを、1μMビオチニル化オリゴヌクレオチドを含有
する50μlの6X SSPEを30μl／分の流速で注入することにより、約500-1000RU（
1000RUは約1ng／mm2に相当する）（Stenbergら、1991,Ｊ.Colloid Interface
Sci.,143，p513-526）のレベルまで固定化した。ハイブリッド形成実験で使用す
る前後に、該センサーチップを50mM NaOH（5μl、5μl／分）で3回パルス処理
して、表面を再生（R）させた。固定化オリゴヌクレオチドを伴わないフローセ
ル（flow cell）１つを参照として用いた。
）を使用した。約4000RUストレプトアビジン（1000RUはストレプトアビジン約1n
g／mm2に相当する）で予め被覆したセンサーチップSA（Pharmacia Biosensor）
を用いた。実験は注入および操作緩衝液として6X SSPE（0.9M NaCl（pH7.4）
、60mM NaH2PO4、7.5mM EDTAおよび0.005％（v/v）Surfactant P20（Pharmac
ia Biosensor））を用い、25℃で行った。センサーチップ上に捕獲のためのビ
オチニル化オリゴヌクレオチドを、1μMビオチニル化オリゴヌクレオチドを含有
する50μlの6X SSPEを30μl／分の流速で注入することにより、約500-1000RU（
1000RUは約1ng／mm2に相当する）（Stenbergら、1991,Ｊ.Colloid Interface
Sci.,143，p513-526）のレベルまで固定化した。ハイブリッド形成実験で使用す
る前後に、該センサーチップを50mM NaOH（5μl、5μl／分）で3回パルス処理
して、表面を再生（R）させた。固定化オリゴヌクレオチドを伴わないフローセ
ル（flow cell）１つを参照として用いた。
【００７１】 ＜ハイブリッド形成および1本鎖捕獲＞ 一定に回転させながらハイブリッド形成オーブン内で54℃で45分間インキュベ
ートすることにより、オリゴヌクレオチドモジュールをss標的DNAとハイブリッ
ド形成させ、次に室温まで冷却した。ハイブリッド形成は約200nM ssDNAおよび
500nMオリゴヌクレオチドを含有する100μlの6X SSPE中で行った。
ートすることにより、オリゴヌクレオチドモジュールをss標的DNAとハイブリッ
ド形成させ、次に室温まで冷却した。ハイブリッド形成は約200nM ssDNAおよび
500nMオリゴヌクレオチドを含有する100μlの6X SSPE中で行った。
【００７２】 40μlのハイブリッド形成混合物を5μl／分の流速で固定化捕獲オリゴヌクレ
オチド上に注入した。ハイブリッド形成プローブを含有しないコントロールサン
プルを、全く同じ方法で処理した。オリゴヌクレオチド表面を50mM NaOH（5μl
、5μl／分）で再生した。 ＜結果＞ HCVの非翻訳領域（NTR）の324塩基対（bp）フラグメントをPCRにより生成した
。dsDNAを磁気ビーズ分離により融解解離させて、バイオセンサーのセンサーチ
ップ上に固定化されたオリゴヌクレオチドによる捕獲に好適なssDNAを得た。し
た。このssDNAをセンサーチップ上に注入するに先立ちオリゴヌクレオチドモジ
ュールとハイブリッド形成させると、HCV DNAが高度に効率的に捕獲された。
オチド上に注入した。ハイブリッド形成プローブを含有しないコントロールサン
プルを、全く同じ方法で処理した。オリゴヌクレオチド表面を50mM NaOH（5μl
、5μl／分）で再生した。 ＜結果＞ HCVの非翻訳領域（NTR）の324塩基対（bp）フラグメントをPCRにより生成した
。dsDNAを磁気ビーズ分離により融解解離させて、バイオセンサーのセンサーチ
ップ上に固定化されたオリゴヌクレオチドによる捕獲に好適なssDNAを得た。し
た。このssDNAをセンサーチップ上に注入するに先立ちオリゴヌクレオチドモジ
ュールとハイブリッド形成させると、HCV DNAが高度に効率的に捕獲された。
【００７３】 この実施例では生物学的事象をリアルタイムで監視できるようにするバイオセ
ンサー技術（Joenssonら、1991，Biotechniques，11，620-672）を用いた。この
方法は固定化のための固形支持体としてセンサーチップを利用する。検出は、セ
ンサー表面での時間に対する屈折率の変化を監視するための表面プラズモン共鳴
（SPR）に基づいている。変化は表面上に結合された分子の質量に比例し、時間
に対する共鳴単位（RU）としていわゆるセンサーグラムに示される。固定は迅速
で、結合されたオリゴヌクレオチドの量は、応答ユニットを注入パルスの前後で
比較することにより、700RUであると測定される。センサー表面を50mM NaOHで
再生(R)後、その固定化された捕獲オリゴヌクレオチドをハイブリッド形成によ
る1本鎖DNA標的の捕獲に使用した。1本鎖標的DNAのみがセンサーチップ上に注入
された場合は、無視できる量しかハイブリッド形成しない（<20RU）。これと対
照的に、捕獲オリゴヌクレオチドに隣接するように設計された予めアニーリング
されたオリゴヌクレオチドモジュールH1（18マー）を有する1本鎖標的をセンサ
ーチップ(C)上に通過させた場合は、かなりの量（250RU）が保持された。
ンサー技術（Joenssonら、1991，Biotechniques，11，620-672）を用いた。この
方法は固定化のための固形支持体としてセンサーチップを利用する。検出は、セ
ンサー表面での時間に対する屈折率の変化を監視するための表面プラズモン共鳴
（SPR）に基づいている。変化は表面上に結合された分子の質量に比例し、時間
に対する共鳴単位（RU）としていわゆるセンサーグラムに示される。固定は迅速
で、結合されたオリゴヌクレオチドの量は、応答ユニットを注入パルスの前後で
比較することにより、700RUであると測定される。センサー表面を50mM NaOHで
再生(R)後、その固定化された捕獲オリゴヌクレオチドをハイブリッド形成によ
る1本鎖DNA標的の捕獲に使用した。1本鎖標的DNAのみがセンサーチップ上に注入
された場合は、無視できる量しかハイブリッド形成しない（<20RU）。これと対
照的に、捕獲オリゴヌクレオチドに隣接するように設計された予めアニーリング
されたオリゴヌクレオチドモジュールH1（18マー）を有する1本鎖標的をセンサ
ーチップ(C)上に通過させた場合は、かなりの量（250RU）が保持された。
【００７４】 <位置１における捕獲プローブとして18マーオリゴヌクレオチドを使用する モジュラー効果の調査> 18マービオチニル化捕獲オリゴヌクレオチド（C1）をストレプトアビジンセン
サーチップ上に固定した。予めハイブリット形成されたオリゴヌクレオチドモジ
ュールを有するかまたは有しない１本鎖HCV DNAを方法セクションに記載したよ
うにセンサーチップ上に注入した。その結果を、異なるセンサーチップ間の絶対
的な応答の変動の結果として、独立した実験から標準化された値を表わし、これ
はチップ表面上に被覆されたストレプトアビジンの量に応じ、したがって、固定
化された捕獲オリゴヌクレオチドの量および捕獲効率に影響している。18マー固
定化捕獲オリゴヌクレオチド（C1）上に注入されたssDNAでの低い捕獲効率が観
察された。たとえ10アデニンの5'スペーサーが18マーと共に用いられた場合でも
同様に低い捕獲が見られた（C1x10A、表2）。後続の捕獲実験において、ss標的D
NAおよびオリゴヌクレオチドモジュールを含むプレハイブリッド形成した複合体
を使用した。オリゴヌクレオチドモジュールを長さにおいて18から5ヌクレオチ
ドまでかえたのだが、すべては固定化捕獲オリゴヌクレオチドの3'末端に隣接し
てアニーリングするように設計した（表2）。特異的なオリゴヌクレオチドモジ
ュール（H1-18、15、13、11；18から11マー）を用いることにより、オリゴヌク
レオチドモジュールを欠く実験と比較して相当の捕獲増大（230から320RU）が観
察された。しかしながら、H1が長さ9ヌクレオチド未満の場合は、捕獲効率が非
常に減少し、時には消失した。異なるコントロールによれば、オリゴヌクレオチ
ドまたは非特異的DNAの相互作用から生ずる応答は無視できるので、固定化捕獲
オリゴヌクレオチドと１本鎖DNA／オリゴヌクレオチドモジュール複合体間のハ
イブリッド形成についての特異性が明白に示される。異なるモジュール間で18ヌ
クレオチドギャップが存在する場合には捕獲は起こらなかった。
サーチップ上に固定した。予めハイブリット形成されたオリゴヌクレオチドモジ
ュールを有するかまたは有しない１本鎖HCV DNAを方法セクションに記載したよ
うにセンサーチップ上に注入した。その結果を、異なるセンサーチップ間の絶対
的な応答の変動の結果として、独立した実験から標準化された値を表わし、これ
はチップ表面上に被覆されたストレプトアビジンの量に応じ、したがって、固定
化された捕獲オリゴヌクレオチドの量および捕獲効率に影響している。18マー固
定化捕獲オリゴヌクレオチド（C1）上に注入されたssDNAでの低い捕獲効率が観
察された。たとえ10アデニンの5'スペーサーが18マーと共に用いられた場合でも
同様に低い捕獲が見られた（C1x10A、表2）。後続の捕獲実験において、ss標的D
NAおよびオリゴヌクレオチドモジュールを含むプレハイブリッド形成した複合体
を使用した。オリゴヌクレオチドモジュールを長さにおいて18から5ヌクレオチ
ドまでかえたのだが、すべては固定化捕獲オリゴヌクレオチドの3'末端に隣接し
てアニーリングするように設計した（表2）。特異的なオリゴヌクレオチドモジ
ュール（H1-18、15、13、11；18から11マー）を用いることにより、オリゴヌク
レオチドモジュールを欠く実験と比較して相当の捕獲増大（230から320RU）が観
察された。しかしながら、H1が長さ9ヌクレオチド未満の場合は、捕獲効率が非
常に減少し、時には消失した。異なるコントロールによれば、オリゴヌクレオチ
ドまたは非特異的DNAの相互作用から生ずる応答は無視できるので、固定化捕獲
オリゴヌクレオチドと１本鎖DNA／オリゴヌクレオチドモジュール複合体間のハ
イブリッド形成についての特異性が明白に示される。異なるモジュール間で18ヌ
クレオチドギャップが存在する場合には捕獲は起こらなかった。
【００７５】 <捕獲プローブとして9マーオリゴヌクレオチドを使用するモジュラー効果
の調査> 9マービオチニル化捕獲オリゴヌクレオチド（C2）をSAセンサーチップ上に固
定化し、かつオリゴヌクレオチドモジュールをより小さいモジュールに断片化し
た。予想される通り、固定化された捕獲ノナマー（C2）を単独で使用した場合は
DNAの捕獲は観察されなかった。ノナマーオリゴヌクレオチドモジュール（H4）
およびオリゴヌクレオチドモジュール（H1-18、15、13、11、9）を使用した場合
、ssDNAがうまく捕獲された。しかしながら、短いペンタマーモジュール（H1-5
）を用いるモジュールによりアシストされた捕獲は、単独のノナマーオリゴヌク
レオチドモジュール（H4）の使用と同様に成功しなかった。これらの結果は、最
も重要なパラメーターは捕獲オリゴヌクレオチドの長さではなく、むしろ使用さ
れたオリゴヌクレオチドモジュールの数および長さに依存することを示唆する。
この概念を証明するために、18および9マー固定化捕獲オリゴヌクレオチドの両
方について対照実験を実施した。初めに、捕獲オリゴヌクレオチドの上に同様の
サイズの非特異的DNAを注入することにより、およびオリゴヌクレオチドモジュ
ールを単独で注入することにより、非特異的な相互作用を調査した。応答の増大
は観察されなかった。2番目に、非特異的なDNAを標的DNAおよびオリゴヌクレオ
チドモジュールとともにインキュベートした。捕獲はなお特異的であり、そして
非特異的DNAからの妨害は観察されなかった。それゆえモジュラーアプローチは
、非関連DNAを用いて挑戦された場合に、何らシグナル低下を伴うことなく特異
的標的を捕獲する能力を有する。非捕獲オリゴヌクレオチドモジュールの間に18
ヌクレオチドギャップが存在する場合には、捕獲は生じない。
の調査> 9マービオチニル化捕獲オリゴヌクレオチド（C2）をSAセンサーチップ上に固
定化し、かつオリゴヌクレオチドモジュールをより小さいモジュールに断片化し
た。予想される通り、固定化された捕獲ノナマー（C2）を単独で使用した場合は
DNAの捕獲は観察されなかった。ノナマーオリゴヌクレオチドモジュール（H4）
およびオリゴヌクレオチドモジュール（H1-18、15、13、11、9）を使用した場合
、ssDNAがうまく捕獲された。しかしながら、短いペンタマーモジュール（H1-5
）を用いるモジュールによりアシストされた捕獲は、単独のノナマーオリゴヌク
レオチドモジュール（H4）の使用と同様に成功しなかった。これらの結果は、最
も重要なパラメーターは捕獲オリゴヌクレオチドの長さではなく、むしろ使用さ
れたオリゴヌクレオチドモジュールの数および長さに依存することを示唆する。
この概念を証明するために、18および9マー固定化捕獲オリゴヌクレオチドの両
方について対照実験を実施した。初めに、捕獲オリゴヌクレオチドの上に同様の
サイズの非特異的DNAを注入することにより、およびオリゴヌクレオチドモジュ
ールを単独で注入することにより、非特異的な相互作用を調査した。応答の増大
は観察されなかった。2番目に、非特異的なDNAを標的DNAおよびオリゴヌクレオ
チドモジュールとともにインキュベートした。捕獲はなお特異的であり、そして
非特異的DNAからの妨害は観察されなかった。それゆえモジュラーアプローチは
、非関連DNAを用いて挑戦された場合に、何らシグナル低下を伴うことなく特異
的標的を捕獲する能力を有する。非捕獲オリゴヌクレオチドモジュールの間に18
ヌクレオチドギャップが存在する場合には、捕獲は生じない。
【００７６】 <オリゴヌクレオチドモジュール間のギャップの効果> 先の実験から、オリゴヌクレオチドモジュール間に18ヌクレオチドの長さのギ
ャップおよび／または固定化捕獲プローブを用いる捕獲効率に及ぼす有害な作用
は明白であった。オリゴヌクレオチドモジュールがアシストした捕獲アプローチ
の制約をさらに分析するために、モジュラープローブのモジュール間に１つのヌ
クレオチドギャップを導入した。H1-11マー捕獲オリゴヌクレオチドおよび２つ
のノナマーオリゴヌクレオチドモジュール（H4およびH1-9）を再構築し、それら
のアニーリング部位を標的DNAの5'末端方向へ１ヌクレオチドシフトさせ、それ
ぞれH2、H5およびH3と改名した（表２）。より低い効率ではあったが不連続なプ
ローブは１本鎖標的を捕獲できることが比較により示された。
ャップおよび／または固定化捕獲プローブを用いる捕獲効率に及ぼす有害な作用
は明白であった。オリゴヌクレオチドモジュールがアシストした捕獲アプローチ
の制約をさらに分析するために、モジュラープローブのモジュール間に１つのヌ
クレオチドギャップを導入した。H1-11マー捕獲オリゴヌクレオチドおよび２つ
のノナマーオリゴヌクレオチドモジュール（H4およびH1-9）を再構築し、それら
のアニーリング部位を標的DNAの5'末端方向へ１ヌクレオチドシフトさせ、それ
ぞれH2、H5およびH3と改名した（表２）。より低い効率ではあったが不連続なプ
ローブは１本鎖標的を捕獲できることが比較により示された。
【００７７】 <長いオリゴヌクレオチドのより短いモジュールへのフラグメント化> この実験は、伸長された捕獲オリゴヌクレオチドをより短いモジュラーユニッ
トにフラグメント化することにより効率が改善できるか否かをさらに調査するた
めに行われた。固定化された27マーオリゴヌクレオチドが捕獲に使用された場合
または合計アニーリング長さ27ヌクレオチドを有する２つのオリゴヌクレオチド
が使用された場合は、DNAの捕獲はわずかであった。しかしながら、この27ヌク
レオチド伸長部が3つノナマーにフラグメント化された場合は高度に効率的な捕
獲が観察された。これは、１本鎖標的DNAを効率的に捕獲するのに失敗した36ヌ
クレオチド捕獲オリゴヌクレオチド（C4）（表2）によりさらに実証され、一方
オリゴヌクレオチドモジュールおよびより短い固定化捕獲プローブの使用は捕獲
をかなり改善した。
トにフラグメント化することにより効率が改善できるか否かをさらに調査するた
めに行われた。固定化された27マーオリゴヌクレオチドが捕獲に使用された場合
または合計アニーリング長さ27ヌクレオチドを有する２つのオリゴヌクレオチド
が使用された場合は、DNAの捕獲はわずかであった。しかしながら、この27ヌク
レオチド伸長部が3つノナマーにフラグメント化された場合は高度に効率的な捕
獲が観察された。これは、１本鎖標的DNAを効率的に捕獲するのに失敗した36ヌ
クレオチド捕獲オリゴヌクレオチド（C4）（表2）によりさらに実証され、一方
オリゴヌクレオチドモジュールおよびより短い固定化捕獲プローブの使用は捕獲
をかなり改善した。
【００７８】 この効果がHCVゲノムの他の位置（位置2）でも観察されるか否かを調査するた
めに、18マーオリゴヌクレオチドモジュールと共に第２の18マー捕獲オリゴヌク
レオチドを設計した。このオリゴヌクレオチド配列を表3に示す。 <HCVゲノムの位置２におけるモジュラー効果の調査> 18マービオチニル化捕獲オリゴヌクレオチド（OMD2）を前記したようにしてSA
センサーチップ上に固定化した。18マーオリゴヌクレオチドモジュール（OMD6）
と共にssDNAを注入すると、400RUの増加をもたらし、一方ssHCV単独では捕獲さ
れなかった。
めに、18マーオリゴヌクレオチドモジュールと共に第２の18マー捕獲オリゴヌク
レオチドを設計した。このオリゴヌクレオチド配列を表3に示す。 <HCVゲノムの位置２におけるモジュラー効果の調査> 18マービオチニル化捕獲オリゴヌクレオチド（OMD2）を前記したようにしてSA
センサーチップ上に固定化した。18マーオリゴヌクレオチドモジュール（OMD6）
と共にssDNAを注入すると、400RUの増加をもたらし、一方ssHCV単独では捕獲さ
れなかった。
【００７９】 <結論> この実施例はチップ上に固定化された18マーオリゴヌクレオチドによりssHCV
はわずかしか捕獲されないかまたは全然捕獲されないことを説明している。ssHC
Vを18、15、13または11ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドモジュールと
インキュベートした場合には、かなりの捕獲増大が観察された。しかしながら、
ssHCV DNAを9マーまたは5マーオリゴヌクレオチドモジュールとインキュベート
すると、捕獲増大はもたらさなかった。18マー捕獲オリゴヌクレオチドおよび18
マーオリゴヌクレオチドモジュールの代わりに36マー捕獲オリゴヌクレオチドを
使用した場合は、HCVの捕獲は少ししか観察されなかった。これらの結果はモジ
ュラー効果をさらに実証している。捕獲オリゴヌクレオチド上に同様のサイズの
非HCV ssPCR産物（同様の方法で処理された）を注入することにより、HCV DNAの
非特異的なハイブリッド形成を調査した。オリゴヌクレオチドモジュールの非特
異的なハイブリッド形成を調査し、そしてこれも除外した。
はわずかしか捕獲されないかまたは全然捕獲されないことを説明している。ssHC
Vを18、15、13または11ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドモジュールと
インキュベートした場合には、かなりの捕獲増大が観察された。しかしながら、
ssHCV DNAを9マーまたは5マーオリゴヌクレオチドモジュールとインキュベート
すると、捕獲増大はもたらさなかった。18マー捕獲オリゴヌクレオチドおよび18
マーオリゴヌクレオチドモジュールの代わりに36マー捕獲オリゴヌクレオチドを
使用した場合は、HCVの捕獲は少ししか観察されなかった。これらの結果はモジ
ュラー効果をさらに実証している。捕獲オリゴヌクレオチド上に同様のサイズの
非HCV ssPCR産物（同様の方法で処理された）を注入することにより、HCV DNAの
非特異的なハイブリッド形成を調査した。オリゴヌクレオチドモジュールの非特
異的なハイブリッド形成を調査し、そしてこれも除外した。
【００８０】 9マー固定化捕獲オリゴヌクレオチドが単独で捕獲に使用された場合、または
単一の9マーオリゴヌクレオチドモジュールと共に使用された場合は、DNAの捕獲
は観察されなかった。しかしながら、2つの9マーオリゴヌクレオチドモジュール
をDNAと共にインキュベートすると、固定化された9マーによる高度に効率的な捕
獲が観察された。これらのオリゴヌクレオチドは、9マーオリゴヌクレオチドモ
ジュールを有する18マー捕獲オリゴヌクレオチドのように、DNA上の同一の位置
でアニーリングするが、ハイブリッド形成は1つのオリゴヌクレオチドモジュー
ルとは対照的に、2つのオリゴヌクレオチドモジュールが使用される場合にのみ
観察される。
単一の9マーオリゴヌクレオチドモジュールと共に使用された場合は、DNAの捕獲
は観察されなかった。しかしながら、2つの9マーオリゴヌクレオチドモジュール
をDNAと共にインキュベートすると、固定化された9マーによる高度に効率的な捕
獲が観察された。これらのオリゴヌクレオチドは、9マーオリゴヌクレオチドモ
ジュールを有する18マー捕獲オリゴヌクレオチドのように、DNA上の同一の位置
でアニーリングするが、ハイブリッド形成は1つのオリゴヌクレオチドモジュー
ルとは対照的に、2つのオリゴヌクレオチドモジュールが使用される場合にのみ
観察される。
【００８１】 モジュラープローブの第２および第3オリゴヌクレオチド間に18および9ヌクレ
オチドスペースが挿入された場合はモジュラー効果は消失した。該モジュール間
にスペースを挿入する効果をさらに調査するために、それらの間に１つのヌクレ
オチドギャップを有する3つの9マーオリゴヌクレオチドを設計した。これら1つ
のヌクレオチドギャップはHCV DNAの捕獲をわずかに低下させるように見えるが
、しかしそれにもかかわらず約50から100RUという良好なハイブリッド形成シグ
ナルが得られた。捕獲オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチドモジュー
ルとのギャップにより、第２および第3モジュール間のギャップよりわずかによ
り効率的な捕獲を生じた。2つのモジュールを有するモジュラープローブのモジ
ュール間の単一のギャップも非モジュラープローブより捕獲が改善されたが、モ
ジュール間にギャップを有しない2つのモジュールモジュラープローブについて
は低下した。
オチドスペースが挿入された場合はモジュラー効果は消失した。該モジュール間
にスペースを挿入する効果をさらに調査するために、それらの間に１つのヌクレ
オチドギャップを有する3つの9マーオリゴヌクレオチドを設計した。これら1つ
のヌクレオチドギャップはHCV DNAの捕獲をわずかに低下させるように見えるが
、しかしそれにもかかわらず約50から100RUという良好なハイブリッド形成シグ
ナルが得られた。捕獲オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチドモジュー
ルとのギャップにより、第２および第3モジュール間のギャップよりわずかによ
り効率的な捕獲を生じた。2つのモジュールを有するモジュラープローブのモジ
ュール間の単一のギャップも非モジュラープローブより捕獲が改善されたが、モ
ジュール間にギャップを有しない2つのモジュールモジュラープローブについて
は低下した。
【００８２】 18マーオリゴヌクレオチドモジュールを、固定化されたオリゴヌクレオチドに
よる捕獲に先立ちDNAにハイブリッド形成させた場合、200倍のシグナル増大が観
察されたように、位置2に相補的なモジュラープローブを用いる実験結果により
さらにモジュラー理論が支持される。
よる捕獲に先立ちDNAにハイブリッド形成させた場合、200倍のシグナル増大が観
察されたように、位置2に相補的なモジュラープローブを用いる実験結果により
さらにモジュラー理論が支持される。
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
【実施例２】モジュラープローブとして捕獲オリゴヌクレオチドおよび少なくと
も１つの追加的なオリゴヌクレオチドを用いるUSPプライマーにより生成したシ
ークエンシング産物の捕獲 普遍的シークエンシングプライマー（USP）の伸長により生成したシークエン
シング産物の同定および／または捕獲方法は、以下のモジュラープローブを使用
してHCVについて実施例１で述べたのと類似して行われた：
も１つの追加的なオリゴヌクレオチドを用いるUSPプライマーにより生成したシ
ークエンシング産物の捕獲 普遍的シークエンシングプライマー（USP）の伸長により生成したシークエン
シング産物の同定および／または捕獲方法は、以下のモジュラープローブを使用
してHCVについて実施例１で述べたのと類似して行われた：
【００８６】
【数４】
【００８７】 ここでJL-C1／USP＋JL-C2／USPは捕獲オリゴヌクレオチドである。
【００８８】
【実施例３】 配列決定産物（sequencing products）を捕獲するためのモジュ
ラーオリゴヌクレオチドの使用 以下の例は、他の配列決定産物群（population）とともに、任意に錯混合物中
に存在してもよい、特定のプライマー／ベクター／挿入体（inserts）に対応す
る、配列決定産物群を捕獲するためのモジュラーオリゴヌクレオチドの使用につ
いて記載するものである。原料および方法 ［一本鎖（single）鋳型実験］ ＜PCR−生成物の調製＞ 種々の挿入物を含むpUC18およびpBluescriptプラスミドを、RIT 27 (5'-GCTTC
CGGCTCGTATGTTGTGTG-3')およびRIT 28 (5'-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3')プライ
マーとともに、PCRで鋳型として用いた。増幅は、Perkin-Elmer 9600サーモサイ
クラー（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用いて、10mM Tris−HCl（pH 8.3）、5
0mM KCl、2mM MgCl2、0.1％ TweenTM 20、0.2mM dNTP's、0.5 UのTaq DNAポリメ
ラーゼ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）および0.075μMの各プライマーを含む、5
0μlの反応容量で行った。温度プロファイルは、94℃で5分間、次に、94℃で30
秒間および72℃で2分間を30サイクルで、さらに72℃で10分間で終結した。 ＜4色の色素(dye)プライマーを用いたサイクルシークエンシング＞ 下記の試薬を、（氷上で）一緒に混合した：ＡおよびＣの混合（物） ：26 mM Tris−HCl（pH 9.0）、6.5mM MgCl2、150μm d
NTP、0.5μm ddNTP（ＡまたはＣ）、1.5 Uのサーモシーケナーゼ（ThermoSequen
ase）(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)、20nMユニバーサル（順方向）シ
ークエンシングプライマー（USP）、5'−色素−CGTTGTAAAACGACGGCCAGT−3'、ま
たは逆方向シークエンシングプライマー（RSP）、5'−色素−TTCACACAGGAAACAGC
TATGACC−3'、Ａ反応（系） Joe-dyeおよびＣ反応（系） Fam-dye（Genpak Ltd,
England）、1μl PCR生成物、および、反応につき10μlの最終体積になるよう
な水。ＧおよびＴの混合（物） ：26 mM Tris−HCl（pH 9.0）、6.5mM MgCl2、150μm d
NTP、0.5μm ddNTP（ＧまたはＴ）、1.5 Uのサーモシーケナーゼ（ThermoSequen
ase）、20nM USPまたはRSPプライマー、Ｇ反応（系） Tamra-dyeおよびＴ反応（
系） Rox-dye（Genpak Ltd, England）、2μl PCR生成物、および、反応につき2
0μlの最終体積になるような水。
ラーオリゴヌクレオチドの使用 以下の例は、他の配列決定産物群（population）とともに、任意に錯混合物中
に存在してもよい、特定のプライマー／ベクター／挿入体（inserts）に対応す
る、配列決定産物群を捕獲するためのモジュラーオリゴヌクレオチドの使用につ
いて記載するものである。原料および方法 ［一本鎖（single）鋳型実験］ ＜PCR−生成物の調製＞ 種々の挿入物を含むpUC18およびpBluescriptプラスミドを、RIT 27 (5'-GCTTC
CGGCTCGTATGTTGTGTG-3')およびRIT 28 (5'-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3')プライ
マーとともに、PCRで鋳型として用いた。増幅は、Perkin-Elmer 9600サーモサイ
クラー（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用いて、10mM Tris−HCl（pH 8.3）、5
0mM KCl、2mM MgCl2、0.1％ TweenTM 20、0.2mM dNTP's、0.5 UのTaq DNAポリメ
ラーゼ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）および0.075μMの各プライマーを含む、5
0μlの反応容量で行った。温度プロファイルは、94℃で5分間、次に、94℃で30
秒間および72℃で2分間を30サイクルで、さらに72℃で10分間で終結した。 ＜4色の色素(dye)プライマーを用いたサイクルシークエンシング＞ 下記の試薬を、（氷上で）一緒に混合した：ＡおよびＣの混合（物） ：26 mM Tris−HCl（pH 9.0）、6.5mM MgCl2、150μm d
NTP、0.5μm ddNTP（ＡまたはＣ）、1.5 Uのサーモシーケナーゼ（ThermoSequen
ase）(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)、20nMユニバーサル（順方向）シ
ークエンシングプライマー（USP）、5'−色素−CGTTGTAAAACGACGGCCAGT−3'、ま
たは逆方向シークエンシングプライマー（RSP）、5'−色素−TTCACACAGGAAACAGC
TATGACC−3'、Ａ反応（系） Joe-dyeおよびＣ反応（系） Fam-dye（Genpak Ltd,
England）、1μl PCR生成物、および、反応につき10μlの最終体積になるよう
な水。ＧおよびＴの混合（物） ：26 mM Tris−HCl（pH 9.0）、6.5mM MgCl2、150μm d
NTP、0.5μm ddNTP（ＧまたはＴ）、1.5 Uのサーモシーケナーゼ（ThermoSequen
ase）、20nM USPまたはRSPプライマー、Ｇ反応（系） Tamra-dyeおよびＴ反応（
系） Rox-dye（Genpak Ltd, England）、2μl PCR生成物、および、反応につき2
0μlの最終体積になるような水。
【００８９】 サイクルシークエンシングは、95℃で1分間、次に、96℃で30秒間および56℃
で1分間の間で28サイクルする、温度プロファイルを用いて行った。続いて、サ
イクルシークエンシング生成物（サイクル配列決定産物）を固相捕獲に先立って
プールした。 ＜ビーズの調製＞ （表１から選択された）捕獲プローブに共有結合した常磁性ビーズ（10mg/ml
）15マイクロリットルを、15μlの結合／洗浄（B/W）バッファー（10mM Tris−H
Cl pH 7.5、1mM EDTA、2M NaCl、1mM β−メルカプトエタノール、0.1% Tween 2
0）で2回洗浄した。洗浄したビーズを、15μlの6XSSPE（0.9M NaCl pH 7.4、60m
M NaH2PO4H2O、7.5mM EDTA）中で再懸濁した。 ＜サイクルシークエンシング生成物の捕獲＞ プールしたサイクルシークエンシング生成物の55マイクロリットルを、115μl
の6XSSPE中の、30ｐモルの（表1から選択された）調節性（modulating）モジュ
ール、150μgのビーズ、および水とともに、54℃で15分間インキュベートした。
このビーズを、100μlのB/Wバッファー中で、一回洗浄し、また、100μlの1 X T
Eバッファー中で、一回洗浄した。捕獲されたサイクルシークエンシング生成物
は、2μlの95％ホルムアミドを用いて、377 ABIシークエンサー上の装填に先立
ってビーズから溶出した。 ＜最適化＞ アッセイを、特異的pUC18順方向ビーズ用に最適化した（表１）。ビーズの量
を、40μgから250μgの間で変化させ、その結果、全容量に、104μlから125μl
の間で変化が生じ、また、その効率を、各ゲル電気泳動実験後に、異なる蛍光体
に対して自動的発生するピークシグナルを分析することにより測定した。次に、
調節性モジュールの量を、（115μlの一定の全容量中で）150μgのビーズを用い
て、0から50ｐモルの間で変化させた。20℃から70℃間での温度滴定を、150μg
のビーズおよび30ｐモルの調節性モジュールを用い、固定化プローブのアニーリ
ング温度に近い温度区間で集中して行った。54℃、次いで行った室温でのインキ
ュベーションの両方における、最終的インキュベーション時間は、0から15分の
間で研究された。 ＜シークエンス生成物の混合物＞ 捕獲プローブの特異性を研究するために、異なるサイクルシークエンシング生
成物の混合物を用いて実験を行った。さらなる特異性を調査するために、pUC18
ビーズをpBluescriptサイクルシークエンシング生成物とともにインキュベート
し、またその逆も行った。これを達成するために、pBluescriptに特異的な固定
化プローブを有するビーズを、適当な調節性モジュール（表１）と一緒に合成し
た。これらの2つの鋳型のPCR生成物が生じ、続いて、これらを2つのベクターに
対し同一の、順方向および逆方向シークエンシング（配列決定）プライマーを使
用して、両方向で、４つの別々のサイクルシークエンシング反応に用いた。これ
らの４つのサイクルシークエンシング生成物を、さらに、等しい割合で、55μl
（一つの（single）サンプルの正常体積）、または220μl（一つのサンプルの4
倍の体積）の最終的容量の混合物となるように混合した。さらに、捕獲ビーズは
、その特異的シークエンシング生成物、すなわち、pUC18ベクター上で順方向シ
ークエンスプライマーによって生じた、pUC18ビーズが捕獲したシークエンシン
グ反応（生成物）、およびpBluescriptベクター上で順方向シークエンスプライ
マーによって生じた、pBluescriptビーズが捕獲したシークエンシング反応（生
成物）を高める（enrich）ために使用した。捕獲は、通常と同様、より少ない量
で行ったが、220μl使用したときは、反応系の全量が354μlまで増加した。 ＜水処理および加熱処理を行うことによる、捕獲されたシークエンシング生成物
の溶出＞ 上述のように2μlの95％ホルムアミドを用いるか、または、水および加熱処理
することのいずれかで、サイクルシークエンシング生成物をビーズから溶出した
。後者のケースでは、捕獲されたサイクルシークエンシング生成物を、10μlの
水中で再懸濁し、3分間、95℃に加熱した。まだ熱いうちに、上澄み液を、新し
い試験管に移した。装填バッファー（2μlの95%ホルムアミド）を、上澄み液に
加え、95℃で水を蒸発させた。 ＜ビーズの再利用＞ ビーズの再利用の実験は、両方の溶出方法を用いて行った。同じビーズを用い
て、6回繰り返し捕獲を行った。捕獲と捕獲との間に、ビーズを、ビーズの調製
で記載したのと同様の方法で洗浄した。 ＜比較用エタノール沈殿＞ サイクルシークエンシング生成物の55マイクロリットルを、138μlの96%エタ
ノールおよび5.5μlの3M NaAcを用いて沈殿させ、-20℃で10分間インキュベート
した後、20分間遠心分離することにより、DNAを回収した。得られたペレットを
、700μlの80%エタノール中で洗浄し、次いで5-10分間、遠心分離を行った。最
終的に、ペレットを（一晩あるいは高速真空（speedvac）で10分間）乾燥し、2
μlの95%ホルムアミド中で再懸濁した。 ［多重実験］ pUC18およびpBluescriptの両方から、上述のようにして得られた、4つの色素
−プライマーPCR生成物を用いた多重サイクルシークエンシングを、4重サイクル
シークエンシング反応のテンプレートとして利用した。4つの異なるシークエン
シング生成物を得るために、ユニバーサル（USP）および逆方向（RSP）シークエ
ンシングプライマーを用いた。反応は、一本鎖鋳型のところで上述したように、
プライマーおよびPCR生成物の増加した体積を補正するために、水の量を減らし
て行った。 ＜多重サイクルシークエンシングからのサイクルシークエンシング生成物の捕獲
＞ 上述した4重サイクルシークエンシングでは、4つの異なるシークエンシング生
成物が得られる。これらは、各ビーズおよび調節性モジュールを用い、反復形式
で捕獲された。最初のビーズとともにインキュベートした後、上澄み液を新しい
試験管に移し、150μgの次のビーズと30ｐモルの対応する調節性モジュールとを
加えた。さらに54℃で15分間、インキュベーションを行った。これをそれぞれの
シークエンスごとに繰り返した。捕獲されたシークエンシング生成物を有するビ
ーズは、一本鎖鋳型で記載したように処理した。結果 これらの実験において、約1200bpの挿入体を有するpUC18プラスミド標的と、
隣接する調節性モジュール（表１、図２）と一緒に生じたサンガー（Sanger）フ
ラグメントの共通のベクター由来の配列と相補的な、固定化プローブ（表１）を
有する捕獲ビーズとからなるモデル系を用いた。本ケースのPCR生成物におけるD
NA鋳型は、サイクルシークエンシング反応で、DNAの供給源として用いられ、一
本鎖サンガーフラグメントを生じた。これらのフラグメントは、（固定化プロー
ブを有する）ビーズおよび調節性モジュールと一緒に混合することによる一段階
反応で、ハイブリッド形成することにより、ビーズ表面に捕獲された。
で1分間の間で28サイクルする、温度プロファイルを用いて行った。続いて、サ
イクルシークエンシング生成物（サイクル配列決定産物）を固相捕獲に先立って
プールした。 ＜ビーズの調製＞ （表１から選択された）捕獲プローブに共有結合した常磁性ビーズ（10mg/ml
）15マイクロリットルを、15μlの結合／洗浄（B/W）バッファー（10mM Tris−H
Cl pH 7.5、1mM EDTA、2M NaCl、1mM β−メルカプトエタノール、0.1% Tween 2
0）で2回洗浄した。洗浄したビーズを、15μlの6XSSPE（0.9M NaCl pH 7.4、60m
M NaH2PO4H2O、7.5mM EDTA）中で再懸濁した。 ＜サイクルシークエンシング生成物の捕獲＞ プールしたサイクルシークエンシング生成物の55マイクロリットルを、115μl
の6XSSPE中の、30ｐモルの（表1から選択された）調節性（modulating）モジュ
ール、150μgのビーズ、および水とともに、54℃で15分間インキュベートした。
このビーズを、100μlのB/Wバッファー中で、一回洗浄し、また、100μlの1 X T
Eバッファー中で、一回洗浄した。捕獲されたサイクルシークエンシング生成物
は、2μlの95％ホルムアミドを用いて、377 ABIシークエンサー上の装填に先立
ってビーズから溶出した。 ＜最適化＞ アッセイを、特異的pUC18順方向ビーズ用に最適化した（表１）。ビーズの量
を、40μgから250μgの間で変化させ、その結果、全容量に、104μlから125μl
の間で変化が生じ、また、その効率を、各ゲル電気泳動実験後に、異なる蛍光体
に対して自動的発生するピークシグナルを分析することにより測定した。次に、
調節性モジュールの量を、（115μlの一定の全容量中で）150μgのビーズを用い
て、0から50ｐモルの間で変化させた。20℃から70℃間での温度滴定を、150μg
のビーズおよび30ｐモルの調節性モジュールを用い、固定化プローブのアニーリ
ング温度に近い温度区間で集中して行った。54℃、次いで行った室温でのインキ
ュベーションの両方における、最終的インキュベーション時間は、0から15分の
間で研究された。 ＜シークエンス生成物の混合物＞ 捕獲プローブの特異性を研究するために、異なるサイクルシークエンシング生
成物の混合物を用いて実験を行った。さらなる特異性を調査するために、pUC18
ビーズをpBluescriptサイクルシークエンシング生成物とともにインキュベート
し、またその逆も行った。これを達成するために、pBluescriptに特異的な固定
化プローブを有するビーズを、適当な調節性モジュール（表１）と一緒に合成し
た。これらの2つの鋳型のPCR生成物が生じ、続いて、これらを2つのベクターに
対し同一の、順方向および逆方向シークエンシング（配列決定）プライマーを使
用して、両方向で、４つの別々のサイクルシークエンシング反応に用いた。これ
らの４つのサイクルシークエンシング生成物を、さらに、等しい割合で、55μl
（一つの（single）サンプルの正常体積）、または220μl（一つのサンプルの4
倍の体積）の最終的容量の混合物となるように混合した。さらに、捕獲ビーズは
、その特異的シークエンシング生成物、すなわち、pUC18ベクター上で順方向シ
ークエンスプライマーによって生じた、pUC18ビーズが捕獲したシークエンシン
グ反応（生成物）、およびpBluescriptベクター上で順方向シークエンスプライ
マーによって生じた、pBluescriptビーズが捕獲したシークエンシング反応（生
成物）を高める（enrich）ために使用した。捕獲は、通常と同様、より少ない量
で行ったが、220μl使用したときは、反応系の全量が354μlまで増加した。 ＜水処理および加熱処理を行うことによる、捕獲されたシークエンシング生成物
の溶出＞ 上述のように2μlの95％ホルムアミドを用いるか、または、水および加熱処理
することのいずれかで、サイクルシークエンシング生成物をビーズから溶出した
。後者のケースでは、捕獲されたサイクルシークエンシング生成物を、10μlの
水中で再懸濁し、3分間、95℃に加熱した。まだ熱いうちに、上澄み液を、新し
い試験管に移した。装填バッファー（2μlの95%ホルムアミド）を、上澄み液に
加え、95℃で水を蒸発させた。 ＜ビーズの再利用＞ ビーズの再利用の実験は、両方の溶出方法を用いて行った。同じビーズを用い
て、6回繰り返し捕獲を行った。捕獲と捕獲との間に、ビーズを、ビーズの調製
で記載したのと同様の方法で洗浄した。 ＜比較用エタノール沈殿＞ サイクルシークエンシング生成物の55マイクロリットルを、138μlの96%エタ
ノールおよび5.5μlの3M NaAcを用いて沈殿させ、-20℃で10分間インキュベート
した後、20分間遠心分離することにより、DNAを回収した。得られたペレットを
、700μlの80%エタノール中で洗浄し、次いで5-10分間、遠心分離を行った。最
終的に、ペレットを（一晩あるいは高速真空（speedvac）で10分間）乾燥し、2
μlの95%ホルムアミド中で再懸濁した。 ［多重実験］ pUC18およびpBluescriptの両方から、上述のようにして得られた、4つの色素
−プライマーPCR生成物を用いた多重サイクルシークエンシングを、4重サイクル
シークエンシング反応のテンプレートとして利用した。4つの異なるシークエン
シング生成物を得るために、ユニバーサル（USP）および逆方向（RSP）シークエ
ンシングプライマーを用いた。反応は、一本鎖鋳型のところで上述したように、
プライマーおよびPCR生成物の増加した体積を補正するために、水の量を減らし
て行った。 ＜多重サイクルシークエンシングからのサイクルシークエンシング生成物の捕獲
＞ 上述した4重サイクルシークエンシングでは、4つの異なるシークエンシング生
成物が得られる。これらは、各ビーズおよび調節性モジュールを用い、反復形式
で捕獲された。最初のビーズとともにインキュベートした後、上澄み液を新しい
試験管に移し、150μgの次のビーズと30ｐモルの対応する調節性モジュールとを
加えた。さらに54℃で15分間、インキュベーションを行った。これをそれぞれの
シークエンスごとに繰り返した。捕獲されたシークエンシング生成物を有するビ
ーズは、一本鎖鋳型で記載したように処理した。結果 これらの実験において、約1200bpの挿入体を有するpUC18プラスミド標的と、
隣接する調節性モジュール（表１、図２）と一緒に生じたサンガー（Sanger）フ
ラグメントの共通のベクター由来の配列と相補的な、固定化プローブ（表１）を
有する捕獲ビーズとからなるモデル系を用いた。本ケースのPCR生成物におけるD
NA鋳型は、サイクルシークエンシング反応で、DNAの供給源として用いられ、一
本鎖サンガーフラグメントを生じた。これらのフラグメントは、（固定化プロー
ブを有する）ビーズおよび調節性モジュールと一緒に混合することによる一段階
反応で、ハイブリッド形成することにより、ビーズ表面に捕獲された。
【００９０】 このモデル系を用いた初期実験では、捕獲したフラグメントを有するビーズを
洗浄し、その後、ホルムアミド中で再懸濁し、（それによってフラグメントがビ
ーズ表面から溶出し、）さらにオートメーションDNAシークエンサーに装填した
。 これらの初期実験の例を図3に示した。図3は、捕獲を54℃で行った後の、対応
するゲルプロファイル（gelfile）を示している。実際、この初期かつ相対的定
量分析は、参照サンプルのような同様のフラグメント強度に導くことのできる、
アシスト調節性モジュールの優位性を示した（レーン３および４をレーン５と比
較した）。さらに、異った、得られたDNAシークエンスの質を、標準評価（stand
ard evaluation）ソフトウェアを用いて比較したところ、捕獲戦略を使用した場
合の精度が改良されたことを示した（データ表示なし）。
洗浄し、その後、ホルムアミド中で再懸濁し、（それによってフラグメントがビ
ーズ表面から溶出し、）さらにオートメーションDNAシークエンサーに装填した
。 これらの初期実験の例を図3に示した。図3は、捕獲を54℃で行った後の、対応
するゲルプロファイル（gelfile）を示している。実際、この初期かつ相対的定
量分析は、参照サンプルのような同様のフラグメント強度に導くことのできる、
アシスト調節性モジュールの優位性を示した（レーン３および４をレーン５と比
較した）。さらに、異った、得られたDNAシークエンスの質を、標準評価（stand
ard evaluation）ソフトウェアを用いて比較したところ、捕獲戦略を使用した場
合の精度が改良されたことを示した（データ表示なし）。
【００９１】 エタノール沈殿した原料は、最初の500bpにわたって、92.6％の精度を有し、
他方で、モジュラープローブを用いた捕獲では、96.6%の精度を有していた。プ
ローブなしのサンプルの精度は、90.2%であった。 ＜捕獲効率の最適化＞ 捕獲プロトコルをさらに改良するために、たとえば、ビーズおよび調節性モジ
ュールの量、インキュベーション温度およびインキュベーション時間などといっ
た、多くのパラメーターを調査した。
他方で、モジュラープローブを用いた捕獲では、96.6%の精度を有していた。プ
ローブなしのサンプルの精度は、90.2%であった。 ＜捕獲効率の最適化＞ 捕獲プロトコルをさらに改良するために、たとえば、ビーズおよび調節性モジ
ュールの量、インキュベーション温度およびインキュベーション時間などといっ
た、多くのパラメーターを調査した。
【００９２】 再び、モデル系を、pUC18系および対応する捕獲ビーズから構成した。実験の
最初のセットで、ビーズの量を調査した。全ての最適化（optimisation）におい
て、3倍の（triplicate）サンプルを、40から250μgの範囲のビーズ中で分析し
た。図4Aで示すように、150μgより少ない量のビーズでは、効率の軽微な減少が
観察された。第二に、調節性モジュールを、捕獲につき0から50ｐモル区間で調
査した。30ｐモルより少ない量では、効率の減少が観察された（図4B）。第三に
、捕獲温度を20℃から70℃の区間で調査した。図4Cで示したように、捕獲温度は
、（固定化プローブのTmに近い）54℃で、最大の収率を有し、それより高温およ
び低温の双方では、かなり鋭い現象カーブを有するといったように、効率に対し
て明らかな影響を及ぼす。最後に、最適捕獲温度（54℃）でのインキュベーショ
ン時間を、続けて行う室温でのインキュベーションと同様、調査した。図4Dおよ
び4Eに示したデータから、捕獲で最大収率を得るためには、この捕獲温度でのイ
ンキュベーションが少なくとも15分間必要とされ、他方でこの収率は、室温での
インキュベーション時間に関連しては、むしろ変化しないことが明らかである。 ＜ビーズの再利用＞ ビーズの繰り返し再利用の２つの形式について調査した。最初のプロトコルは
、捕獲後のホルムアミド溶出、およびゲルへの直接装填を基礎としており、一方
、第二のプロトコルは、低塩バッファー中における95℃での加熱遊離およびホル
ムアミドが加えられている新しい試験管への上澄み液の移送を含んでいる。残っ
ている水は、加熱により蒸発させる。再利用を6回繰り返したサイクルに関する
最初のプロトコルの結果を図5Aに示す。グラフは、各サイクル後のシグナル強度
および最初の500塩基の精度を示している。シグナルおよび精度は、6サイクル後
においてさえ、高いままである。オートメーション化および毒性のホルムアミド
の取り扱いという観点から好ましいプロトコルである、過熱遊離した場合の対応
するデータでは、幾分高い精度を示した（図5B）。 ＜捕獲プロトコルの特異性＞ 最適化プロトコルの特異性を調査するために、付加的なプラスミドベクター、
すなわち、前に用いたpUC18プラスミドとほぼ同じ長さの挿入体を有するpBluesc
riptを含むように、モデル系を拡張した。この方法については、上述の「シーク
エンス生成物の混合物」で、４つの別々のサイクルシークエンシング反応の生成
物を混合し、選択した群の捕獲を行ったことが記載されている。得られたデータ
を図6に示す。それぞれの棒線（バー）は、特異的ビーズの使用に対応しており
、また、それは、500bpにわたって優れた精度を有するような、特異的捕獲が達
成され、サンプル量の増加によって、期待したより高いシグナルが生じるという
証拠である。コントロールとして、固定化プローブまたは調節性モジュールを有
する、相同性のない、無関係のサイクルシークエンシング生成物を、2種類の型
のビーズを用いて試験したが、測定可能なシグナルを示さなかった（図６）。 ＜多重シークエンシングおよび精製＞ 多重系を、捕獲ビーズおよび付随する調節性モジュールを用いて得られる、類
のない特異性を利用し得るように確立した。原理は、（約800から1500bpの挿入
体を含む）標的としての２つのプラスミドとともに、順方向および逆方向のシー
クエンシングプライマーに対応する、平行するサイクルシークエンス反応を、一
本の試験管内で行うこと、また、種々のシークエンシング反応により生じるプー
ルから、捕獲ビーズを使用して、個々の反応を繰り返し高めることであった。た
とえば、最初のラウンドの捕獲で、pUC18（逆方向）ビーズを使用して対応する
標的を捕獲し、続いて、上澄み液を、次の段階、たとえばpUC18（順方向）ビー
ズなどを用いた捕獲に移す。そして、この結果、個々の溶出および装填を可能と
する「方向的に（directionally）」捕獲された原料を有する4つのビーズを生じ
る。典型的クトマトグラムを図７に示す。図７は、4重サイクルシークエンシン
グ反応（２方向で、２つのプラスミド）からの３つの個々のサイクルシークエン
ス反応の特異的捕獲について示している。考察 上記の結果は、エタノール沈殿によるサイクルシークエンシング生成物の精製
を、モジュラーオリゴヌクレオチドを使用する捕獲アッセイに置換してもよいこ
とを示している。
最初のセットで、ビーズの量を調査した。全ての最適化（optimisation）におい
て、3倍の（triplicate）サンプルを、40から250μgの範囲のビーズ中で分析し
た。図4Aで示すように、150μgより少ない量のビーズでは、効率の軽微な減少が
観察された。第二に、調節性モジュールを、捕獲につき0から50ｐモル区間で調
査した。30ｐモルより少ない量では、効率の減少が観察された（図4B）。第三に
、捕獲温度を20℃から70℃の区間で調査した。図4Cで示したように、捕獲温度は
、（固定化プローブのTmに近い）54℃で、最大の収率を有し、それより高温およ
び低温の双方では、かなり鋭い現象カーブを有するといったように、効率に対し
て明らかな影響を及ぼす。最後に、最適捕獲温度（54℃）でのインキュベーショ
ン時間を、続けて行う室温でのインキュベーションと同様、調査した。図4Dおよ
び4Eに示したデータから、捕獲で最大収率を得るためには、この捕獲温度でのイ
ンキュベーションが少なくとも15分間必要とされ、他方でこの収率は、室温での
インキュベーション時間に関連しては、むしろ変化しないことが明らかである。 ＜ビーズの再利用＞ ビーズの繰り返し再利用の２つの形式について調査した。最初のプロトコルは
、捕獲後のホルムアミド溶出、およびゲルへの直接装填を基礎としており、一方
、第二のプロトコルは、低塩バッファー中における95℃での加熱遊離およびホル
ムアミドが加えられている新しい試験管への上澄み液の移送を含んでいる。残っ
ている水は、加熱により蒸発させる。再利用を6回繰り返したサイクルに関する
最初のプロトコルの結果を図5Aに示す。グラフは、各サイクル後のシグナル強度
および最初の500塩基の精度を示している。シグナルおよび精度は、6サイクル後
においてさえ、高いままである。オートメーション化および毒性のホルムアミド
の取り扱いという観点から好ましいプロトコルである、過熱遊離した場合の対応
するデータでは、幾分高い精度を示した（図5B）。 ＜捕獲プロトコルの特異性＞ 最適化プロトコルの特異性を調査するために、付加的なプラスミドベクター、
すなわち、前に用いたpUC18プラスミドとほぼ同じ長さの挿入体を有するpBluesc
riptを含むように、モデル系を拡張した。この方法については、上述の「シーク
エンス生成物の混合物」で、４つの別々のサイクルシークエンシング反応の生成
物を混合し、選択した群の捕獲を行ったことが記載されている。得られたデータ
を図6に示す。それぞれの棒線（バー）は、特異的ビーズの使用に対応しており
、また、それは、500bpにわたって優れた精度を有するような、特異的捕獲が達
成され、サンプル量の増加によって、期待したより高いシグナルが生じるという
証拠である。コントロールとして、固定化プローブまたは調節性モジュールを有
する、相同性のない、無関係のサイクルシークエンシング生成物を、2種類の型
のビーズを用いて試験したが、測定可能なシグナルを示さなかった（図６）。 ＜多重シークエンシングおよび精製＞ 多重系を、捕獲ビーズおよび付随する調節性モジュールを用いて得られる、類
のない特異性を利用し得るように確立した。原理は、（約800から1500bpの挿入
体を含む）標的としての２つのプラスミドとともに、順方向および逆方向のシー
クエンシングプライマーに対応する、平行するサイクルシークエンス反応を、一
本の試験管内で行うこと、また、種々のシークエンシング反応により生じるプー
ルから、捕獲ビーズを使用して、個々の反応を繰り返し高めることであった。た
とえば、最初のラウンドの捕獲で、pUC18（逆方向）ビーズを使用して対応する
標的を捕獲し、続いて、上澄み液を、次の段階、たとえばpUC18（順方向）ビー
ズなどを用いた捕獲に移す。そして、この結果、個々の溶出および装填を可能と
する「方向的に（directionally）」捕獲された原料を有する4つのビーズを生じ
る。典型的クトマトグラムを図７に示す。図７は、4重サイクルシークエンシン
グ反応（２方向で、２つのプラスミド）からの３つの個々のサイクルシークエン
ス反応の特異的捕獲について示している。考察 上記の結果は、エタノール沈殿によるサイクルシークエンシング生成物の精製
を、モジュラーオリゴヌクレオチドを使用する捕獲アッセイに置換してもよいこ
とを示している。
【００９３】
【実施例４】 ハイブリッド形成間のPEGの使用、毛細管電気泳動および多重シ
ークエンシングにおけるモジュラープローブの使用原料および方法 ＜DNAサンプル（プラスミドおよびPCR生成物）＞ （バクテリアのゲノムショットガンライブラリー由来の）種々の挿入体を含む
pUC18およびpBluescriptプラスミドを、シークエンシング反応中で直接（下記参
照）、あるいはAmpliTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を使
用する実施例３で記載したように、RIT 27 (5'-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3')お
よびRIT 28 (5'-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3')プライマーとともにPCR増幅にお
ける鋳型として使用した。 ＜色素プライマーおよび色素ターミネーターを用いるサイクルシークエンシング
＞ Amersham Pharmacia Biotech MegaBACE 1000 シークエンサー（MegaBACE）の
ための色素プライマーサイクルシークエンシング反応を、Amersham Pharmacia B
iotech社（Cleveland, USA）により提供されるETプライマーキット中で、記載さ
れているように行った。Applied Biosystem 377 XL Prism DNA シークエンサー
（ABI 377）のための色素ターミネーターサイクルシークエンシング反応を、Per
kin Elmer社（Norwalk, Connecticut, USA）により提供されるBig Dyeターミネ
ーターキット中で、記載されているように行った。多重シークエンシングは、２
つのプライマー（USPおよびRSP）および／またはランダムpUC18およびpBluescri
ptクローン由来の２つの異なるサンプル（PCR生成物）を組み合わせることによ
って行った。 ＜サイクルシークエンシング生成物の捕獲および溶出＞ サイクルシークエンシング生成物を、実施例３で記載したようにインキュベー
トした。すなわち、生成物は、30ｐモルのモジュラープローブおよびあらかじめ
洗浄したビーズ（150μg）とともに、全容積115μlの6XSSPE（0.9M NaCl pH7.4,
60mM NaH2PO4 H2O, 7.5mM EDTA）中で、54℃で5分間インキュベートした。多重
シークエンシングのケースでは、上澄み液を繰り返し捕獲のための新しいビーズ
を有する新しい試験管に移した。その後、ビーズを100μl B/Wバッファー（10mM
Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA、2M NaCl、0.1% Tween 20）中で一回洗浄し、100
μlの1 X TEバッファー中で一回洗浄した。捕獲されたサイクルシークエンシン
グ生成物は、室温で、2.5μlの装填バッファー（PE Applied Biosystems, UK）
を用いて、ビーズから溶出し、その後、ABI 377 XL Prism DNA Sequencerに装填
あるいは10μlの装填バッファー（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて装填
し、さらに、MegaBACE DNAシークエンサーに注入した。Big Dye ターミネーター
化学を用いて生じるシークエンシング生成物（一重および多重反応の両方）を捕
獲するために、捕獲用バッファーには、最終濃度が5％となるように加えられたP
EG6000（ポリエチレングリコール）（Merck）が含まれていた。結果 （A）色素ターミネーターにより生じるシークエンシング生成物を捕獲するため
のPEG6000の使用 pBluescriptクローンを、ベクタープライマーを使用して、PCRにより増幅させ
、続いて、製造元によるところの非標識ユニバーサルシークエンシングプライマ
ーを使用して塩基配列を決定した。pBluescript順方向ビーズおよび対応するモ
ジュラープローブを使用する捕獲を、捕獲用バッファー中に異なる量で含まれる
PEG6000を用いて行った。前述のように、洗浄と溶出を行い、シークエンシング
生成物をABI377 DNAシークエンサーに装填した。ABIゲルプロファイルの分析に
よって測定されるように、最適な結合が、5％のPEG6000を用いたときに得られた
（データは示していない）。0％および5％のPEG6000に対応するクロマトグラム
を図８および図９に示す。高いシグナル（269から803の相対ユニット）、長い読
み取り長およびより多数の規則正しい（more even）シグナルを有する5％のPEG
を用いた捕獲に比較して、PEGを含まない捕獲用バッファー（図８）では、（45
から162の相対ユニット間で変動する）より弱いシグナル、より短い読み取り長
（read length）、およびより高いバックグラウンドを示す。 （B）毛細管電気泳動における異なる量のプラスミド鋳型の影響 毛細管電気泳動は、毛細管に電気挿入(electroinjection)する間に、多すぎる
量の鋳型DNAを使用するとき、制限を受けるという事実がよく知られている。こ
のことは、図10（クロマトグラム全体図）、および表４（要約）に例示されてお
り、表４は、異なる量のpUC18プラスミド（25ngから1200ngのプラスミド）を使
用し、色素プライマー化学（Mega BACE, Amersham Pharmacia Biotech）を用い
たサイクルシークエンシング反応を行い、続いて、エタノール沈殿を行った後の
結果を示している。100から800ngのプラスミドに関して図10に示すように、プラ
スミド量を増加させた場合は、シークエンシングピークが遅れ、その結果、最高
濃度では、読み取り可能なシークエンスがなくなる。これに対し、図11（クロマ
トグラム図）、表４（要約）では、異なる量のプラスミドを用いることができ、
磁性ビーズ捕獲を使用したとき、たとえ高濃度のプラスミドでも、長いシークエ
ンシングの読み取りが得られる。このように、高濃度における問題が、ビーズア
プローチにより解決されることが、この実験で明確に示されている。 （C） 毛細管電気泳動を用いる多重シークエンシングの効率 オートメーション化された環境中で、毛細管電気泳動を使用する、多重シーク
エンシングの効率をさらに評価するために、共通するサイクルシークエンシング
反応に用いる、プールされた２つのPCR生成物を基礎に実験を計画した。これは
、8個のpUC18ランダムクローンおよび8個のpBluescriptランダムクローンのPCR
増幅、さらに、色素プライマー化学（MegaBACE, Amersham Pharmacia Biotech）
を使用するサイクルシークエンシグのための共通の試験管に各生成物を１つ入れ
プールすることにより達成した。したがって、サイクルシークエンシングは、４
つのシークエンシング生成物を同時に生じた。Phrep20は、どのくらいの範囲を
読めるか（塩基の数）を測定する確立されたアルゴリズムであり、MBは、この装
置用に開発された同様のアルゴリズムである。
ークエンシングにおけるモジュラープローブの使用原料および方法 ＜DNAサンプル（プラスミドおよびPCR生成物）＞ （バクテリアのゲノムショットガンライブラリー由来の）種々の挿入体を含む
pUC18およびpBluescriptプラスミドを、シークエンシング反応中で直接（下記参
照）、あるいはAmpliTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を使
用する実施例３で記載したように、RIT 27 (5'-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3')お
よびRIT 28 (5'-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3')プライマーとともにPCR増幅にお
ける鋳型として使用した。 ＜色素プライマーおよび色素ターミネーターを用いるサイクルシークエンシング
＞ Amersham Pharmacia Biotech MegaBACE 1000 シークエンサー（MegaBACE）の
ための色素プライマーサイクルシークエンシング反応を、Amersham Pharmacia B
iotech社（Cleveland, USA）により提供されるETプライマーキット中で、記載さ
れているように行った。Applied Biosystem 377 XL Prism DNA シークエンサー
（ABI 377）のための色素ターミネーターサイクルシークエンシング反応を、Per
kin Elmer社（Norwalk, Connecticut, USA）により提供されるBig Dyeターミネ
ーターキット中で、記載されているように行った。多重シークエンシングは、２
つのプライマー（USPおよびRSP）および／またはランダムpUC18およびpBluescri
ptクローン由来の２つの異なるサンプル（PCR生成物）を組み合わせることによ
って行った。 ＜サイクルシークエンシング生成物の捕獲および溶出＞ サイクルシークエンシング生成物を、実施例３で記載したようにインキュベー
トした。すなわち、生成物は、30ｐモルのモジュラープローブおよびあらかじめ
洗浄したビーズ（150μg）とともに、全容積115μlの6XSSPE（0.9M NaCl pH7.4,
60mM NaH2PO4 H2O, 7.5mM EDTA）中で、54℃で5分間インキュベートした。多重
シークエンシングのケースでは、上澄み液を繰り返し捕獲のための新しいビーズ
を有する新しい試験管に移した。その後、ビーズを100μl B/Wバッファー（10mM
Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA、2M NaCl、0.1% Tween 20）中で一回洗浄し、100
μlの1 X TEバッファー中で一回洗浄した。捕獲されたサイクルシークエンシン
グ生成物は、室温で、2.5μlの装填バッファー（PE Applied Biosystems, UK）
を用いて、ビーズから溶出し、その後、ABI 377 XL Prism DNA Sequencerに装填
あるいは10μlの装填バッファー（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて装填
し、さらに、MegaBACE DNAシークエンサーに注入した。Big Dye ターミネーター
化学を用いて生じるシークエンシング生成物（一重および多重反応の両方）を捕
獲するために、捕獲用バッファーには、最終濃度が5％となるように加えられたP
EG6000（ポリエチレングリコール）（Merck）が含まれていた。結果 （A）色素ターミネーターにより生じるシークエンシング生成物を捕獲するため
のPEG6000の使用 pBluescriptクローンを、ベクタープライマーを使用して、PCRにより増幅させ
、続いて、製造元によるところの非標識ユニバーサルシークエンシングプライマ
ーを使用して塩基配列を決定した。pBluescript順方向ビーズおよび対応するモ
ジュラープローブを使用する捕獲を、捕獲用バッファー中に異なる量で含まれる
PEG6000を用いて行った。前述のように、洗浄と溶出を行い、シークエンシング
生成物をABI377 DNAシークエンサーに装填した。ABIゲルプロファイルの分析に
よって測定されるように、最適な結合が、5％のPEG6000を用いたときに得られた
（データは示していない）。0％および5％のPEG6000に対応するクロマトグラム
を図８および図９に示す。高いシグナル（269から803の相対ユニット）、長い読
み取り長およびより多数の規則正しい（more even）シグナルを有する5％のPEG
を用いた捕獲に比較して、PEGを含まない捕獲用バッファー（図８）では、（45
から162の相対ユニット間で変動する）より弱いシグナル、より短い読み取り長
（read length）、およびより高いバックグラウンドを示す。 （B）毛細管電気泳動における異なる量のプラスミド鋳型の影響 毛細管電気泳動は、毛細管に電気挿入(electroinjection)する間に、多すぎる
量の鋳型DNAを使用するとき、制限を受けるという事実がよく知られている。こ
のことは、図10（クロマトグラム全体図）、および表４（要約）に例示されてお
り、表４は、異なる量のpUC18プラスミド（25ngから1200ngのプラスミド）を使
用し、色素プライマー化学（Mega BACE, Amersham Pharmacia Biotech）を用い
たサイクルシークエンシング反応を行い、続いて、エタノール沈殿を行った後の
結果を示している。100から800ngのプラスミドに関して図10に示すように、プラ
スミド量を増加させた場合は、シークエンシングピークが遅れ、その結果、最高
濃度では、読み取り可能なシークエンスがなくなる。これに対し、図11（クロマ
トグラム図）、表４（要約）では、異なる量のプラスミドを用いることができ、
磁性ビーズ捕獲を使用したとき、たとえ高濃度のプラスミドでも、長いシークエ
ンシングの読み取りが得られる。このように、高濃度における問題が、ビーズア
プローチにより解決されることが、この実験で明確に示されている。 （C） 毛細管電気泳動を用いる多重シークエンシングの効率 オートメーション化された環境中で、毛細管電気泳動を使用する、多重シーク
エンシングの効率をさらに評価するために、共通するサイクルシークエンシング
反応に用いる、プールされた２つのPCR生成物を基礎に実験を計画した。これは
、8個のpUC18ランダムクローンおよび8個のpBluescriptランダムクローンのPCR
増幅、さらに、色素プライマー化学（MegaBACE, Amersham Pharmacia Biotech）
を使用するサイクルシークエンシグのための共通の試験管に各生成物を１つ入れ
プールすることにより達成した。したがって、サイクルシークエンシングは、４
つのシークエンシング生成物を同時に生じた。Phrep20は、どのくらいの範囲を
読めるか（塩基の数）を測定する確立されたアルゴリズムであり、MBは、この装
置用に開発された同様のアルゴリズムである。
【００９４】 図12は、pBluescript順方向ビーズ（およびモジュラー）を用いて生じたシー
クエンシング反応の反復磁性プルアウト（最初の捕獲）、およびその後のそれぞ
れのプルアウトのために、上澄み液をpBluescript逆方向ビーズ（およびモジュ
ラー）を用いたインキュベート（第二の捕獲を示す）。この後、２つのシークエ
ンシング反応が上澄み液中に残った。さらに、これらの操作を、手動の誤り／変
動を防止する社内ロボット装置（in-house robotic instrument）、PSS（Anders
Holmberg, unpublished）を使用して達成した。比較として、対応する一つの反
応（一つの鋳型と一つのシークエンシングプライマー）および二重反応（一つの
鋳型と二つのシークエンシングプライマー）の両方を含めている。このデータか
ら、２つの選択的ベースコールアルゴリズムのいずれかを使用する多重性にもか
かわらず、読み取り長が保持されていることは明らかである。
クエンシング反応の反復磁性プルアウト（最初の捕獲）、およびその後のそれぞ
れのプルアウトのために、上澄み液をpBluescript逆方向ビーズ（およびモジュ
ラー）を用いたインキュベート（第二の捕獲を示す）。この後、２つのシークエ
ンシング反応が上澄み液中に残った。さらに、これらの操作を、手動の誤り／変
動を防止する社内ロボット装置（in-house robotic instrument）、PSS（Anders
Holmberg, unpublished）を使用して達成した。比較として、対応する一つの反
応（一つの鋳型と一つのシークエンシングプライマー）および二重反応（一つの
鋳型と二つのシークエンシングプライマー）の両方を含めている。このデータか
ら、２つの選択的ベースコールアルゴリズムのいずれかを使用する多重性にもか
かわらず、読み取り長が保持されていることは明らかである。
【００９５】
【表４】
【００９６】 SEQUENCE LISTING <110> Dynal AS Lundeberg, Joakim Uhlen, Mathias Jones, Elizabeth L <120> Method <130> 68835/003 <140> PCT/GB99/03056 <141> 1999-09-15 <160> 49 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-H1/USP <400> 1 gacgtccag 9 <210> 2 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-C2/USP <400> 2 ctgagatct 9 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-H2/USP <400> 3 gttcgaacgt acg 13 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-C1/USP <400> 4 gacgtccagc tgagatct 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide, dedicated modular oligonucleotide <400> 5 acccaattcg ccctatag 18 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide, dedicated modular oligonucleotide <400> 6 tgagtcgtat tac 13 <210> 7 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonuleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide, pUC18/pRIT28, forward, capture probe, generic <400> 7 nnaagcttac t 11 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18/pRIT28, forward, modulating module, generic <400> 8 ggccgtcgtt ttacaacg 18 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18/pRIT28, forward, capture probe, generic <400> 9 nnaagcttgg cact 14 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, forward, capture probe, generic <400> 10 nnnnaattcg ccctatag 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, reverse, capture probe, generic <400> 11 gaattcacgg aaatcatg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide- pUC18, reverse, modulating module, generic <400> 12 gtcatagctg tttcctgt 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, reverse, capture probe, generic <400> 13 nngaattcgt aatcatggtc 20 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, reverse, modulating module, generic <400> 14 atagctgttt cctgtgt 17 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, reverse, capture probe, generic <400> 15 tccagctttt gttcc 15 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, reverse, modulating module, generic <400> 16 ctttagtgag ggttaatt 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, reverse, capture probe, generic <400> 17 agctccagct tttgttcc 18 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pGEM3Z, reverse, capture probe, generic <400> 18 nnttgagtat tctatag 17 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pGEM3Z, reverse, modulating module, generic <400> 19 tgtcacctaa atagct 16 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, capture probe, specific <400> 20 tctagagtcg acctgcag 18 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, modulating module, specific <400> 21 gcatgcaagc tt 12 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, capture probe, specific <400> 22 cgagctcgaa ttcgtaatc 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, modulating module, specific <400> 23 atggtcatag ctgtttcc 18 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OU49 <400> 24 ggcgacactc caccatgaat c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OD66 <400> 25 ggtgcacggt ctacgagacc 20 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 26 tgcctgatag ggtgcttgcg agtgccccgg gaggtctcgt agaccgtgca cc 52 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - c1 <400> 27 agagcatctg gcacgtgg 18 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - c1x10A <400> 28 agagcatctg gcacgtggaa aaaaaaaa 28 <210> 29 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - C2 <400> 29 ggcacgtgg 9 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - C3 <400> 30 gggccctcca gagcatctgg cacgtgg 27 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - C4 <400> 31 acgctcacgg ggccctccag agcatctggc acgtgg 36 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-18 <400> 32 acgctcacgg ggccctcc 18 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-15 <400> 33 ctcacggggc cctcc 15 <210> 34 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-13 <400> 34 cacggggccc tcc 13 <210> 35 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-11 <400> 35 cggggccctc c 11 <210> 36 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-9 <400> 36 gggccctcc 9 <210> 37 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-5 <400> 37 cctcc 5 <210> 38 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide- H2 <400> 38 acggggccct c 11 <210> 39 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H3 <400> 39 ggggccctc 9 <210> 40 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide -H4 <400> 40 agagcatct 9 <210> 41 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H5 <400> 41 cagagcatc 9 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H6 <400> 42 gggccctcca gagcatct 18 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H7 <400> 43 cggactatcc cacga 15 <210> 44 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide H8 <400> 44 acgctcacg 9 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 45 ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtaca 36 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OMD2 <400> 46 cgccttggcc actcatgt 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OMD6 <400> 47 cctctcggta tcaccaga 18 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - RIT 27 <400> 48 gcttccggct cgtatgttgt gtg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - RIT28 <400> 49 aaagggggat gtgctgcaag gcg 23
【図１】 図１は、ベクターｐＵＣ18から順方向で生成されるプライマーエクス
テンション産物の単離において使用されるモジュラーオリゴヌクレオチドの概略
的表示であり、ここで、枠で囲んだ領域は、一般的アプローチのモジュラーオリ
ゴヌクレオチドが向けられるベクターの範囲を示しており、特別アプローチのモ
ジュラーオリゴヌクレオチドの配列が、太字で与えられている。さらにプライマ
ーエクステンション産物の生成に好適なプライマーが示されている。
テンション産物の単離において使用されるモジュラーオリゴヌクレオチドの概略
的表示であり、ここで、枠で囲んだ領域は、一般的アプローチのモジュラーオリ
ゴヌクレオチドが向けられるベクターの範囲を示しており、特別アプローチのモ
ジュラーオリゴヌクレオチドの配列が、太字で与えられている。さらにプライマ
ーエクステンション産物の生成に好適なプライマーが示されている。
【図２】 図２は、モジュラーおよび捕獲プローブの設計の図示的概略を示す
。
。
【図３】 図３は、順方向でのｐＵＣ18の使用のため、モジュラーオリゴヌク
レオチドとして表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチドを使用したゲル電気
泳動後のゲルプロフィール（gelfile）を示す生のデータを表示する。レーン1-2
：調節性モジュールがない捕獲、レーン3-4：調節性モジュールによる捕獲、レ
ーン5：エタノールで沈殿した物質。
レオチドとして表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチドを使用したゲル電気
泳動後のゲルプロフィール（gelfile）を示す生のデータを表示する。レーン1-2
：調節性モジュールがない捕獲、レーン3-4：調節性モジュールによる捕獲、レ
ーン5：エタノールで沈殿した物質。
【図４】 図４は、順方向でのｐＵＣ18の使用のため、モジュラーオリゴヌク
レオチドとして表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチドを使用したモジュラ
ー捕獲の最適化の結果を示す。(A)ビーズ量の滴定、(B)調節性モジュール量の滴
定、(C)温度の滴定、(D)54℃でのインキュベーション時間の滴定、(E)室温での
インキュベーション時間の滴定。
レオチドとして表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチドを使用したモジュラ
ー捕獲の最適化の結果を示す。(A)ビーズ量の滴定、(B)調節性モジュール量の滴
定、(C)温度の滴定、(D)54℃でのインキュベーション時間の滴定、(E)室温での
インキュベーション時間の滴定。
【図５】 図５は、ビーズの再使用で、（A）ホルムアミドでの溶出（B）加熱
および水での溶出を示す。
および水での溶出を示す。
【図６】 図６は、２つのビーズタイプで試験した多重サイクル配列決定反応
からのモジュラー捕獲の特異性およびバックグラウンドを示す。すなわちA) 順
方向でのｐＵＣ18の使用のための表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチド、
およびB) 順方向でのｐBluescriptの使用のための表１の特別のモジュラーオリ
ゴヌクレオチド。
からのモジュラー捕獲の特異性およびバックグラウンドを示す。すなわちA) 順
方向でのｐＵＣ18の使用のための表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチド、
およびB) 順方向でのｐBluescriptの使用のための表１の特別のモジュラーオリ
ゴヌクレオチド。
【図７】 図７は 四重サイクル配列決定反応（A） 順方向でのｐＵＣ18の使用
のための表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチド、およびB) 順方向でのｐB
luescriptの使用のための表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチド、およびC
) 逆方向でのｐBluescriptの使用のための表１の一般的モジュラーオリゴヌクレ
オチドを使用した二つの方向での二つのプラスミド）からの各サイクル配列決定
反応の特異的捕獲を示す代表的であって部分的なクロマトグラムを表す。
のための表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチド、およびB) 順方向でのｐB
luescriptの使用のための表１の特別のモジュラーオリゴヌクレオチド、およびC
) 逆方向でのｐBluescriptの使用のための表１の一般的モジュラーオリゴヌクレ
オチドを使用した二つの方向での二つのプラスミド）からの各サイクル配列決定
反応の特異的捕獲を示す代表的であって部分的なクロマトグラムを表す。
【図８】 図８は、PEG 6000の非存在下で色素ターミネータが生成された配列決
定産物の捕獲を示すクロマトグラムを表す。
定産物の捕獲を示すクロマトグラムを表す。
【図９】 図９は、図８に対応するが、配列決定産物の捕獲の間に、５％ PEG 60
00を含めた場合を示す。
00を含めた場合を示す。
【図１０】 図１０は、MegaBACEによる電気泳動法用毛細管に、エタノール沈殿
により調製された種々の量の鋳型とともにサンプルを入れた効果を示す。
により調製された種々の量の鋳型とともにサンプルを入れた効果を示す。
【図１１】 図１１は、図１０に対応するが、電気泳動法の前に、モジュラープ
ローブを使用してサンプルがビーズ上への捕獲により調製された場合を示す。
ローブを使用してサンプルがビーズ上への捕獲により調製された場合を示す。
【図１２】 図１２は、PPSロボットでの単一、二重または四重配列決定の結果
を示す。
を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年２月２８日（２００２．２．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Dynal AS Lundeberg, Joakim Uhlen, Mathias Jones, Elizabeth L <120> Method <130> 68835/003 <140> PCT/GB99/03056 <141> 1999-09-15 <160> 49 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-H1/USP <400> 1 gacgtccag 9 <210> 2 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-C2/USP <400> 2 ctgagatct 9 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-H2/USP <400> 3 gttcgaacgt acg 13 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide JL-C1/USP <400> 4 gacgtccagc tgagatct 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide, dedicated modular oligonucleotide <400> 5 acccaattcg ccctatag 18 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide, dedicated modular oligonucleotide <400> 6 tgagtcgtat tac 13 <210> 7 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonuleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide, pUC18/pRIT28, forward, capture probe, generic <400> 7 nnaagcttac t 11 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18/pRIT28, forward, modulating module, generic <400> 8 ggccgtcgtt ttacaacg 18 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18/pRIT28, forward, capture probe, generic <400> 9 nnaagcttgg cact 14 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, forward, capture probe, generic <400> 10 nnnnaattcg ccctatag 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, reverse, capture probe, generic <400> 11 gaattcacgg aaatcatg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide- pUC18, reverse, modulating module, generic <400> 12 gtcatagctg tttcctgt 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, reverse, capture probe, generic <400> 13 nngaattcgt aatcatggtc 20 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, reverse, modulating module, generic <400> 14 atagctgttt cctgtgt 17 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, reverse, capture probe, generic <400> 15 tccagctttt gttcc 15 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, reverse, modulating module, generic <400> 16 ctttagtgag ggttaatt 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pBluescript, reverse, capture probe, generic <400> 17 agctccagct tttgttcc 18 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1)..() <223> n denotes the production of a family of degenerate oligonucleotides such that all possible permutations are produced <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pGEM3Z, reverse, capture probe, generic <400> 18 nnttgagtat tctatag 17 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pGEM3Z, reverse, modulating module, generic <400> 19 tgtcacctaa atagct 16 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, capture probe, specific <400> 20 tctagagtcg acctgcag 18 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, modulating module, specific <400> 21 gcatgcaagc tt 12 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, capture probe, specific <400> 22 cgagctcgaa ttcgtaatc 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - pUC18, forward, modulating module, specific <400> 23 atggtcatag ctgtttcc 18 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OU49 <400> 24 ggcgacactc caccatgaat c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OD66 <400> 25 ggtgcacggt ctacgagacc 20 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 26 tgcctgatag ggtgcttgcg agtgccccgg gaggtctcgt agaccgtgca cc 52 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - c1 <400> 27 agagcatctg gcacgtgg 18 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - c1x10A <400> 28 agagcatctg gcacgtggaa aaaaaaaa 28 <210> 29 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - C2 <400> 29 ggcacgtgg 9 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - C3 <400> 30 gggccctcca gagcatctgg cacgtgg 27 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - C4 <400> 31 acgctcacgg ggccctccag agcatctggc acgtgg 36 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-18 <400> 32 acgctcacgg ggccctcc 18 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-15 <400> 33 ctcacggggc cctcc 15 <210> 34 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-13 <400> 34 cacggggccc tcc 13 <210> 35 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-11 <400> 35 cggggccctc c 11 <210> 36 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-9 <400> 36 gggccctcc 9 <210> 37 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H1-5 <400> 37 cctcc 5 <210> 38 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide- H2 <400> 38 acggggccct c 11 <210> 39 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H3 <400> 39 ggggccctc 9 <210> 40 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide -H4 <400> 40 agagcatct 9 <210> 41 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H5 <400> 41 cagagcatc 9 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H6 <400> 42 gggccctcca gagcatct 18 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - H7 <400> 43 cggactatcc cacga 15 <210> 44 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide H8 <400> 44 acgctcacg 9 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 45 ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtaca 36 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OMD2 <400> 46 cgccttggcc actcatgt 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - OMD6 <400> 47 cctctcggta tcaccaga 18 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - RIT 27 <400> 48 gcttccggct cgtatgttgt gtg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide - RIT28 <400> 49 aaagggggat gtgctgcaag gcg 23
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウーレン マシアス スウェーデン エス−100 44 ストック ホルム デパートメント オブ バイオケ ミストリー アンド バイオテクノロジー ロイヤル インスティテュート オブ テクノロジー シーイーエムユー バイオ テクニック エービー Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA19 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR62 QR82 QS25 QX01
Claims (18)
- 【請求項１】 鋳型ベクターから生成されたプライマーエクステンション産物が、 i)プライマー結合領域、 ii)挿入体、および iii)ベクター由来の配列 に相当するもしくは相補的な配列を含み、該プライマーエクステンション産物上
の隣接伸長部に少なくとも二つの部分（モジュール）からなるモジュラーオリゴ
ヌクレオチドを結合させる少なくとも一つまたはそれ以上の工程を含み、該モジ
ュラーオリゴヌクレオチドが該プライマーエクステンション産物の該ベクター由
来の配列に相補的であって、かつ、結合することができ、少なくとも一のモジュ
ール（捕獲モジュール）は固定化されているか、または固定化の手段を有するこ
とを特徴とする、プライマーエクステンション産物の単離方法。 - 【請求項２】 上記プライマーエクステンション産物の上記ベクター由来の配列が、鋳型ベク
ターを作成するために使用されるベクターの任意の領域に由来するものであり、
かつ、該ベクターの多重クローニングサイトの特定制限部位に挿入体をクローニ
ングした後もインタクトのままの部分であって、そこへモジュラーオリゴヌクレ
オチドがアニールする部分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 上記プライマーエクステンション産物の上記ベクター由来の配列が、鋳型ベク
ターを作成するために使用されるベクターの任意の領域に由来するものであり、
挿入体がクローン化され、さらにモジュラーオリゴヌクレオチドがアニールする
該ベクターの多重クローニングサイトの制限部位に関係なく挿入体をクローニン
グした後もインタクトのままである部分を含むことを特徴とする、請求項１また
は２に記載の方法。 - 【請求項４】 上記モジュラーオリゴヌクレオチドが、二つまたは三つのモジュールからなる
、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 各モジュールが9個以上18個以下のヌクレオチドを有する、請求項１〜４のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 上記モジュラーオリゴヌクレオチドが合計で少なくとも１８個のヌクレオチド
からなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 上記モジュールが上記プライマーエクステンション産物に結合する際に2塩基
よりも少なく離れている、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 上記モジュールが直接的に隣接していることを特徴とする、請求項７に記載の
方法。 - 【請求項９】 固定化がストレプトアビジン：ビオチン結合システムによるものであることを
特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 上記プライマーエクステンション産物が、1回のハイブリダイゼーション工程
で上記モジュラーオリゴヌクレオチドのすべてのモジュールと直接に接触するこ
とを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 1) 捕獲モジュールが固形支持体に固定化されており、プライマーエクステンシ
ョン産物を含む試料と、モジュラーオリゴヌクレオチドのすべてのモジュールと
を直接に接触させること、 2)上記モジュールをハイブリダイゼーションにより結合させること、 3)該固形支持体に結合された、標的プライマーエクステンション産物を分離する
こと、 4)該固形支持体を洗浄すること の工程を含む、請求項１〜10のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 上記結合が40から60℃の間で、15分間から90分間、行われることを特徴とする
、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 上記モジュラーオリゴヌクレオチドが表１に挙げられたオリゴヌクレオチドか
ら選択されるか、あるいはそれらの類似体もしくは誘導体であることを特徴とす
る、請求項１〜12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 上記プライマーエクステンション産物が配列決定反応産物であることを特徴と
する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１〜９のいずれかで定義されたモジュラーオリゴヌクレオチド。
- 【請求項１６】 請求項１〜14のいずれかで定義された方法における、請求項15で定義されたモ
ジュラーオリゴヌクレオチドの使用方法。 - 【請求項１７】 少なくとも次のものを含む、請求項１〜14のいずれかで定義された方法を実施
するためのキット： 請求項１〜９のいずれかで定義されたモジュラーオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１８】 ベクター上で適切な延長反応を行うことにより、配列決定産物を生成し、該配
列決定産物を請求項１〜14のいずれかに記載された方法により単離し、単離され
た産物を適切な技術により分離し、その配列決定産物に担持されたラベルを視覚
化して挿入体もしくはその部分の配列決定を可能となるようにする、ベクター内
の核酸挿入体のヌクレオチド配列を決定する方法。
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