JPH06343499A - 核酸検出方法 - Google Patents
核酸検出方法Info
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- JPH06343499A JPH06343499A JP13461593A JP13461593A JPH06343499A JP H06343499 A JPH06343499 A JP H06343499A JP 13461593 A JP13461593 A JP 13461593A JP 13461593 A JP13461593 A JP 13461593A JP H06343499 A JPH06343499 A JP H06343499A
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- Japan
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- nucleic acid
- pcr
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- hybrid
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試料の塩基配列のうち既知の部分が数十塩基
程度でもＰＣＲによる増幅を利用した核酸プローブによ
る標的核酸の検出を可能とする方法を提供すること。 【構成】 標的核酸と核酸プローブのハイブリッド体が
形成されたときのみにＰＣＲで増幅されるＰＣＲ用の核
酸断片を用いる。
程度でもＰＣＲによる増幅を利用した核酸プローブによ
る標的核酸の検出を可能とする方法を提供すること。 【構成】 標的核酸と核酸プローブのハイブリッド体が
形成されたときのみにＰＣＲで増幅されるＰＣＲ用の核
酸断片を用いる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸プローブを用いた
ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出方法に関
する。
ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】一本鎖のＤＮＡやＲＮＡが互いに相補性
を有している場合、相補性を有する部分が結合して二本
鎖となりハイブリッドを形成する。このハイブリダイゼ
ーション反応を利用した核酸の検出や定量のための方法
としてサザン法等の種々の方法があり、遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニン
グ、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺
伝子工学的手法における基本技術の一つとなっている。
を有している場合、相補性を有する部分が結合して二本
鎖となりハイブリッドを形成する。このハイブリダイゼ
ーション反応を利用した核酸の検出や定量のための方法
としてサザン法等の種々の方法があり、遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニン
グ、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺
伝子工学的手法における基本技術の一つとなっている。
【０００３】核酸のハイブリダイゼーションを利用した
分析方法としては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブに
ハイブリッドの検出のための標識を施し、これを試料核
酸とハイブリダイズさせ、形成されるハイブリッドをプ
ローブに付与した標識を利用して検出する方法が一般的
である。
分析方法としては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブに
ハイブリッドの検出のための標識を施し、これを試料核
酸とハイブリダイズさせ、形成されるハイブリッドをプ
ローブに付与した標識を利用して検出する方法が一般的
である。
【０００４】しかし、試料が極めて微量な場合などは検
出が困難となるという問題がある。このような問題を克
服する一つの方法としては、発色や蛍光等の検出に利用
する特性の強度が高い標識を用いる方法や、標識の特性
を増幅させる方法などが開発されている。
出が困難となるという問題がある。このような問題を克
服する一つの方法としては、発色や蛍光等の検出に利用
する特性の強度が高い標識を用いる方法や、標識の特性
を増幅させる方法などが開発されている。
【０００５】また、これとは別のアプローチとして、試
料自体を増幅した後に、核酸プローブとのハイブリダイ
ゼーションを行うという方法もある。この試料の増幅手
法として最も成功を収めているのが、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；
Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３３１，１９８８；特開昭
６２−２１４３５５号公報；特開昭６２−２４０８６２
号公報；Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ．Ｂ．＆Ｆａｌｏｏｎａ，
Ｆ．Ａ．：Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍ．；１５５，，３
３５〜３５０，１９８７等参照）である。ＰＣＲの原理
は非常に簡単であり、まず増幅したい領域を含んだ２本
鎖ＤＮＡを熱変性し、得られた一本鎖ＤＮＡの増幅した
領域の３’末端部のそれぞれにＰＣＲ用のプライマーを
アニールさせる。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いてア
ニールした３’側のプライマーを出発点として５’方向
にＤＮＡを伸長させ、相補鎖を合成する。ここまでの工
程を１サイクルとし、一本鎖化のための熱変性から相補
鎖合成までの工程を繰り返すことによって２種のプライ
マーで挟まれた部分の配列を１サイクル毎に倍々に増幅
させることができる。例えば、サイクルを２５回も繰り
返すと、理論的には２25、すなわち１００万倍以上に増
幅されることになる。この原理を応用したものは既に商
品化され、必要試薬とともにキットとして得られている
（例えばＧｅｎｅ ＡｍｐTM：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ社製）。
料自体を増幅した後に、核酸プローブとのハイブリダイ
ゼーションを行うという方法もある。この試料の増幅手
法として最も成功を収めているのが、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；
Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３３１，１９８８；特開昭
６２−２１４３５５号公報；特開昭６２−２４０８６２
号公報；Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ．Ｂ．＆Ｆａｌｏｏｎａ，
Ｆ．Ａ．：Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍ．；１５５，，３
３５〜３５０，１９８７等参照）である。ＰＣＲの原理
は非常に簡単であり、まず増幅したい領域を含んだ２本
鎖ＤＮＡを熱変性し、得られた一本鎖ＤＮＡの増幅した
領域の３’末端部のそれぞれにＰＣＲ用のプライマーを
アニールさせる。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いてア
ニールした３’側のプライマーを出発点として５’方向
にＤＮＡを伸長させ、相補鎖を合成する。ここまでの工
程を１サイクルとし、一本鎖化のための熱変性から相補
鎖合成までの工程を繰り返すことによって２種のプライ
マーで挟まれた部分の配列を１サイクル毎に倍々に増幅
させることができる。例えば、サイクルを２５回も繰り
返すと、理論的には２25、すなわち１００万倍以上に増
幅されることになる。この原理を応用したものは既に商
品化され、必要試薬とともにキットとして得られている
（例えばＧｅｎｅ ＡｍｐTM：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ社製）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】このように、ＰＣＲ
は、試料が少ない場合の核酸検出において非常に有力な
方法であるが、先に説明したように２種のプライマーを
用意する必要があり、このプライマーで挟まれる領域の
長さが数百塩基とある程度限定される。このことは、試
料中のプライマーがアニールする２つの領域が既知であ
り、しかもこれらの領域の間隔が数百塩基である必要が
あることを示している。従って、例えば、試料の塩基配
列の長さが短い場合や、試料の塩基配列のうち２０塩基
程度しかわかっていない場合には、ＰＣＲ法にそのまま
利用できないという問題がある。
は、試料が少ない場合の核酸検出において非常に有力な
方法であるが、先に説明したように２種のプライマーを
用意する必要があり、このプライマーで挟まれる領域の
長さが数百塩基とある程度限定される。このことは、試
料中のプライマーがアニールする２つの領域が既知であ
り、しかもこれらの領域の間隔が数百塩基である必要が
あることを示している。従って、例えば、試料の塩基配
列の長さが短い場合や、試料の塩基配列のうち２０塩基
程度しかわかっていない場合には、ＰＣＲ法にそのまま
利用できないという問題がある。
【０００７】また、試料の有する塩基配列は多種多様で
あり、適当なＰＣＲ用プライマーを選択するための煩雑
な操作を必要とする場合も多い。
あり、適当なＰＣＲ用プライマーを選択するための煩雑
な操作を必要とする場合も多い。
【０００８】本発明は上記課題を解決すべくなされたも
のであり、核酸プローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによる標的核酸の検出に、ＰＣＲによる検出情報の増
幅を常に適用可能な核酸検出方法を提供することを目的
とする。
のであり、核酸プローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによる標的核酸の検出に、ＰＣＲによる検出情報の増
幅を常に適用可能な核酸検出方法を提供することを目的
とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の核酸検出方法
は、標的核酸とハイブリダイズし得る配列を有する核酸
プローブを用いた核酸検出方法において、（ａ）試料と
前記核酸プローブを反応させる過程と、（ｂ）試料に前
記標的核酸が含まれている場合に形成される標的核酸と
核酸プローブのハイブリッド体と、未反応の核酸プロー
ブを分離する過程と、（ｃ）前記ハイブリッド体にＰＣ
Ｒ用核酸断片を選択的に結合させる過程と、（ｄ）該Ｐ
ＣＲ用核酸断片に対してＰＣＲを行う過程と、（ｅ）該
ＰＣＲにより増幅された核酸断片を検出する過程と、を
有することを特徴とする。
は、標的核酸とハイブリダイズし得る配列を有する核酸
プローブを用いた核酸検出方法において、（ａ）試料と
前記核酸プローブを反応させる過程と、（ｂ）試料に前
記標的核酸が含まれている場合に形成される標的核酸と
核酸プローブのハイブリッド体と、未反応の核酸プロー
ブを分離する過程と、（ｃ）前記ハイブリッド体にＰＣ
Ｒ用核酸断片を選択的に結合させる過程と、（ｄ）該Ｐ
ＣＲ用核酸断片に対してＰＣＲを行う過程と、（ｅ）該
ＰＣＲにより増幅された核酸断片を検出する過程と、を
有することを特徴とする。
【００１０】本発明の方法は、試料中の分析対象として
の標的核酸をＰＣＲにより増幅するのではなく、ＰＣＲ
により増幅される核酸断片を別途用意し、これがハイブ
リッド体が形成されている場合にのみ増幅されるように
したもので、このＰＣＲ用核酸断片を用いることで、標
的核酸の塩基配列に関係なく検出情報のＰＣＲによる増
幅が可能となり、しかも標的核酸に応じてＰＣＲ用プラ
イマーの配列を選択するという煩雑な操作が不要とな
る。
の標的核酸をＰＣＲにより増幅するのではなく、ＰＣＲ
により増幅される核酸断片を別途用意し、これがハイブ
リッド体が形成されている場合にのみ増幅されるように
したもので、このＰＣＲ用核酸断片を用いることで、標
的核酸の塩基配列に関係なく検出情報のＰＣＲによる増
幅が可能となり、しかも標的核酸に応じてＰＣＲ用プラ
イマーの配列を選択するという煩雑な操作が不要とな
る。
【００１１】本発明の核酸検出方法の一例を、図１の
（ａ）〜（ｅ）に示す。この例においては、まず、試料
を適当な担体２に固定し、これに標的核酸検出用の核酸
プローブを反応させる。図１（ａ）に示すように、試料
に標的核酸２が存在する場合には、標的核酸２と核酸プ
ローブ３のハイブリッド体が担体１上に形成される。次
に、未反応の核酸プローブを除去し、図１（ｂ）の状態
を得る。（ａ）及び（ｂ）の操作には公知のハイブリダ
イゼーションによる核酸検出方法で用いられている操作
が利用できる。
（ａ）〜（ｅ）に示す。この例においては、まず、試料
を適当な担体２に固定し、これに標的核酸検出用の核酸
プローブを反応させる。図１（ａ）に示すように、試料
に標的核酸２が存在する場合には、標的核酸２と核酸プ
ローブ３のハイブリッド体が担体１上に形成される。次
に、未反応の核酸プローブを除去し、図１（ｂ）の状態
を得る。（ａ）及び（ｂ）の操作には公知のハイブリダ
イゼーションによる核酸検出方法で用いられている操作
が利用できる。
【００１２】ここで、ＰＣＲ用核酸断片６を担体１上の
ハイブリッド体に選択的に結合させる。このハイブリッ
ド体とＰＣＲ用核酸断片の選択的結合は、これら双方に
これらの選択的結合を可能とする修飾を施す方法等が利
用できる。このような修飾としては、特異的結合を行う
物質を導入しておく方法等が利用でき、アビジン（また
はストレプトアビシン）とビオチンの特異的反応を利用
することができる。例えば、図１（ｃ）のように、ハイ
ブリッド体側の核酸プローブとＰＣＲ用核酸断片側の双
方にビオチン４、５を修飾し、これらをアビジン７を介
して特異的に結合することができる。更に、ハイブリッ
ド体上でそこに結合している核酸プローブをプライマー
として利用し、標的核酸側を鋳型とした鎖伸展反応を行
い、新たに形成される鎖内にＰＣＲ用核酸断片が選択的
に結合する部位を形成する方法等が利用できる。例え
ば、図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、ハイブリッド体
上で核酸プローブ３をプライマーとして利用した標的核
酸２側を鋳型とした鎖伸展反応を行い、新たに形成され
る鎖内にビオチン４で修飾された部位を形成し、これに
アビジン７を介してＰＣＲ用核酸断片６側のビオチン５
と結合させる等が利用できる。
ハイブリッド体に選択的に結合させる。このハイブリッ
ド体とＰＣＲ用核酸断片の選択的結合は、これら双方に
これらの選択的結合を可能とする修飾を施す方法等が利
用できる。このような修飾としては、特異的結合を行う
物質を導入しておく方法等が利用でき、アビジン（また
はストレプトアビシン）とビオチンの特異的反応を利用
することができる。例えば、図１（ｃ）のように、ハイ
ブリッド体側の核酸プローブとＰＣＲ用核酸断片側の双
方にビオチン４、５を修飾し、これらをアビジン７を介
して特異的に結合することができる。更に、ハイブリッ
ド体上でそこに結合している核酸プローブをプライマー
として利用し、標的核酸側を鋳型とした鎖伸展反応を行
い、新たに形成される鎖内にＰＣＲ用核酸断片が選択的
に結合する部位を形成する方法等が利用できる。例え
ば、図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、ハイブリッド体
上で核酸プローブ３をプライマーとして利用した標的核
酸２側を鋳型とした鎖伸展反応を行い、新たに形成され
る鎖内にビオチン４で修飾された部位を形成し、これに
アビジン７を介してＰＣＲ用核酸断片６側のビオチン５
と結合させる等が利用できる。
【００１３】以上説明したハイブリッド体とＰＣＲ用核
酸断片との選択的結合が終了したところで、これと未反
応のＰＣＲ用核酸断片とを分離してから、図１（ｄ）に
示したように、プライマー８、９を加えて、ハイブリッ
ド体に結合しているＰＣＲ用断片６のＰＣＲによる増幅
を行う。このＰＣＲ用断片としては良好なＰＣＲによる
増幅が行える構成を有していれば良く、標的核酸や核酸
プローブの有する塩基配列に関係なくその構成を選択で
きる。例えば、図４に示すように、ＰＣＲ用プライマー
の結合位置を規定する配列１４、１５で挟まれた増幅領
域１６と、ハイブリッド体への結合部位を有する構成の
ものが利用でき、配列１４、１５で規定れる増幅領域の
長さは、３００〜７００ｂ程度とするのが望ましい。な
お、ＰＣＲ用プライマーの結合位置を規定する配列は２
以上存在していてもよく、それらの中から目的に応じて
選択した２種で規定された増幅領域の増幅を行うことが
もきる。
酸断片との選択的結合が終了したところで、これと未反
応のＰＣＲ用核酸断片とを分離してから、図１（ｄ）に
示したように、プライマー８、９を加えて、ハイブリッ
ド体に結合しているＰＣＲ用断片６のＰＣＲによる増幅
を行う。このＰＣＲ用断片としては良好なＰＣＲによる
増幅が行える構成を有していれば良く、標的核酸や核酸
プローブの有する塩基配列に関係なくその構成を選択で
きる。例えば、図４に示すように、ＰＣＲ用プライマー
の結合位置を規定する配列１４、１５で挟まれた増幅領
域１６と、ハイブリッド体への結合部位を有する構成の
ものが利用でき、配列１４、１５で規定れる増幅領域の
長さは、３００〜７００ｂ程度とするのが望ましい。な
お、ＰＣＲ用プライマーの結合位置を規定する配列は２
以上存在していてもよく、それらの中から目的に応じて
選択した２種で規定された増幅領域の増幅を行うことが
もきる。
【００１４】ＰＣＲ用核酸断片としては、一本鎖のもの
及び二本鎖部分を有するものの両方が利用できる。二本
鎖部分を有する場合には、ＰＣＲに先立ってこれを解離
させて一本鎖にし、得られた一本鎖にＰＣＲをかける
（図３参照）。なお、ハイブリッド体への結合部位の種
類によっては、それがＰＣＲで増幅される領域に存在す
ることでＰＣＲ効率が低下するなどの問題がある場合に
は、ＰＣＲ用核酸断片として二本鎖のものを用い、その
一方の鎖をハイブリッド体との結合に用い、他方の鎖を
増幅用に用いることで正確かつ効率良いＰＣＲによる増
幅を行うことができる。
及び二本鎖部分を有するものの両方が利用できる。二本
鎖部分を有する場合には、ＰＣＲに先立ってこれを解離
させて一本鎖にし、得られた一本鎖にＰＣＲをかける
（図３参照）。なお、ハイブリッド体への結合部位の種
類によっては、それがＰＣＲで増幅される領域に存在す
ることでＰＣＲ効率が低下するなどの問題がある場合に
は、ＰＣＲ用核酸断片として二本鎖のものを用い、その
一方の鎖をハイブリッド体との結合に用い、他方の鎖を
増幅用に用いることで正確かつ効率良いＰＣＲによる増
幅を行うことができる。
【００１５】なお、ハイブリッド体にＰＣＲ用核酸断片
を結合した後に、ハイブリッド体から核酸プローブとＰ
ＣＲ用核酸断片の複合体を加熱などの操作によって分離
し、分離された複合体を用いてＰＣＲを行っても良く、
それによってＰＣＲ用のプライマーと試料とのミスアニ
ールを防ぐことができる。
を結合した後に、ハイブリッド体から核酸プローブとＰ
ＣＲ用核酸断片の複合体を加熱などの操作によって分離
し、分離された複合体を用いてＰＣＲを行っても良く、
それによってＰＣＲ用のプライマーと試料とのミスアニ
ールを防ぐことができる。
【００１６】本発明の方法で用いる核酸プローブやＰＣ
Ｒ用核酸断片、各種プライマー等の核酸としては、合成
された核酸、自然界から分離した核酸、自然界から分離
した核酸に合成部分を追加したもの、各種の修飾を行っ
たものなど目的に応じて使用できる。また、ＰＣＲに
は、公知の方法が利用できる。
Ｒ用核酸断片、各種プライマー等の核酸としては、合成
された核酸、自然界から分離した核酸、自然界から分離
した核酸に合成部分を追加したもの、各種の修飾を行っ
たものなど目的に応じて使用できる。また、ＰＣＲに
は、公知の方法が利用できる。
【００１７】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する
が、これらは本発明の範囲をなんら限定するものではな
い。 実施例１（核酸プローブの作成） プラスミドｐＵＣ１９の有する塩基配列と相補的な以下
に示す配列（配列番号：１）からなるオリゴヌクレオチ
ド（一本鎖ＤＮＡ）をＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社、３８
１型）により合成し、核酸プローブとした。 配列番号：１ 5' GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATG 3' 更に、これをプライマー伸展法によりビオチン化してビ
オチン化核酸プローブを得た。すなわち、まず、以下の
配列： 配列番号：９ 5' ATATACATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATG
3' をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置で合成し、
これと先に合成した配列番号：１のオリゴヌクレオチド
（各々２μｌ）を混合し、これに１０×アニーリング溶
液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、５００ｍＭ ＮａＣｌ）５μｌ中を加え、更に蒸留
水にて全量を５０μｌに調製した。この容器を６５℃の
温水の入ったビーカーの中で１０分間加温し、その後室
温になるまでゆっくり冷却した（所要時間約１時間）。
この反応により、オリゴヌクレオチドにおける相補的な
配列間（下線部分）でのアニールを生じさせ、その部分
を二本鎖とした。次に、この溶液５０μｌに、１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ及び１ｍＭ ｄＣＴＰの溶
液（各２μｌ）、０．４ｍＭビオチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ
社）５μｌ及び１０×アニーリング溶液の５μｌを加
え、更に蒸留水にて全量を１００μｌに調製した。よく
混和した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（Ｔ
ＯＹＯＢＯ）１６単位を加え、３７℃で１時間反応さ
せ、伸展反応を行い、配列番号：１のＤＮＡの３’末端
側にビオチンを導入し、ビオチン化核酸プローブを得
た。
が、これらは本発明の範囲をなんら限定するものではな
い。 実施例１（核酸プローブの作成） プラスミドｐＵＣ１９の有する塩基配列と相補的な以下
に示す配列（配列番号：１）からなるオリゴヌクレオチ
ド（一本鎖ＤＮＡ）をＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社、３８
１型）により合成し、核酸プローブとした。 配列番号：１ 5' GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATG 3' 更に、これをプライマー伸展法によりビオチン化してビ
オチン化核酸プローブを得た。すなわち、まず、以下の
配列： 配列番号：９ 5' ATATACATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATG
3' をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置で合成し、
これと先に合成した配列番号：１のオリゴヌクレオチド
（各々２μｌ）を混合し、これに１０×アニーリング溶
液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、５００ｍＭ ＮａＣｌ）５μｌ中を加え、更に蒸留
水にて全量を５０μｌに調製した。この容器を６５℃の
温水の入ったビーカーの中で１０分間加温し、その後室
温になるまでゆっくり冷却した（所要時間約１時間）。
この反応により、オリゴヌクレオチドにおける相補的な
配列間（下線部分）でのアニールを生じさせ、その部分
を二本鎖とした。次に、この溶液５０μｌに、１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ及び１ｍＭ ｄＣＴＰの溶
液（各２μｌ）、０．４ｍＭビオチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ
社）５μｌ及び１０×アニーリング溶液の５μｌを加
え、更に蒸留水にて全量を１００μｌに調製した。よく
混和した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（Ｔ
ＯＹＯＢＯ）１６単位を加え、３７℃で１時間反応さ
せ、伸展反応を行い、配列番号：１のＤＮＡの３’末端
側にビオチンを導入し、ビオチン化核酸プローブを得
た。
【００１８】また、以下の配列（配列番号：２〜５）を
それぞれ有する４種のオリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮ
Ａ）を個々にＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社、３８１型）に
より合成した。 配列番号：２ 5' ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CGCTAGAGTAAGTAGTT 3' 配列番号：３ 5' TATATATATATAGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATAACTACTTACTCTAGC 配列番号：４ 5' TATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCGCGCGCGCGCGC 3' 配列番号：５ 5' AAACGACGAGCGTGACGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATCGCGCGCGCGCG 3' 次に、容器内で、上記の４種（配列番号２〜５）のオリ
ゴヌクレオチド（各２μｇ）に１０×アニーリング溶液
５μｌを加え、更に蒸留水にて全量を５０μｌに調製し
た。この容器を６５℃の温水の入ったビーカーの中で１
０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷却した
（所要時間約１時間）。この反応により、オリゴヌクレ
オチドにおける相補的な配列間（下線部分）でのアニー
ルを生じさせ、その部分を二本鎖とした。次に、この溶
液５０μｌに、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ及
び１ｍＭ ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）、０．４ｍＭビ
オチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ社）５μｌ及び１０×アニーリ
ング溶液の５μｌを加え、更に蒸留水にて全量を１００
μｌに調製した。よく混和した後、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を加え、３
７℃で１時間反応させ、伸展反応を行い、反応混合液か
ら以下に示すプラスミドｐＵＣ１９の塩基配列の一部に
相補的な配列を含む下記の配列（配列番号：６）を有す
る二本鎖ＤＮＡをゲル濾過（Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ２：Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）により単離した。 配列番号：６ 5' ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CGCTAGAGTAAGTAGTTATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCTATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCATGCATGCGCGCGCGCGCGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCGTCACGCTCGTCGTTT 3' 実施例２（検出例） プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
それぞれ有する４種のオリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮ
Ａ）を個々にＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社、３８１型）に
より合成した。 配列番号：２ 5' ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CGCTAGAGTAAGTAGTT 3' 配列番号：３ 5' TATATATATATAGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATAACTACTTACTCTAGC 配列番号：４ 5' TATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCGCGCGCGCGCGC 3' 配列番号：５ 5' AAACGACGAGCGTGACGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATCGCGCGCGCGCG 3' 次に、容器内で、上記の４種（配列番号２〜５）のオリ
ゴヌクレオチド（各２μｇ）に１０×アニーリング溶液
５μｌを加え、更に蒸留水にて全量を５０μｌに調製し
た。この容器を６５℃の温水の入ったビーカーの中で１
０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷却した
（所要時間約１時間）。この反応により、オリゴヌクレ
オチドにおける相補的な配列間（下線部分）でのアニー
ルを生じさせ、その部分を二本鎖とした。次に、この溶
液５０μｌに、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ及
び１ｍＭ ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）、０．４ｍＭビ
オチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ社）５μｌ及び１０×アニーリ
ング溶液の５μｌを加え、更に蒸留水にて全量を１００
μｌに調製した。よく混和した後、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を加え、３
７℃で１時間反応させ、伸展反応を行い、反応混合液か
ら以下に示すプラスミドｐＵＣ１９の塩基配列の一部に
相補的な配列を含む下記の配列（配列番号：６）を有す
る二本鎖ＤＮＡをゲル濾過（Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ２：Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）により単離した。 配列番号：６ 5' ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CGCTAGAGTAAGTAGTTATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCTATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCATGCATGCGCGCGCGCGCGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCGTCACGCTCGTCGTTT 3' 実施例２（検出例） プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
【００１９】試料１μｇ／３μｌをニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成したビオチン化核酸プローブ（一本鎖）２
μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全量
を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルター
を浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの中
で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ま
した（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配列
の部分で二本鎖が形成される。フィルターを溶液から取
出し、蒸留水で二度洗浄して過剰なプローブを取り除い
た後、１０００μｌの緩衝液Ｑ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０
５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に素早く浸漬した。一
分間室温で放置後、３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を
追加した緩衝液Ｑ中にフィルターを２０分間浸した。こ
れを、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含む緩衝液
Ｑに浸し、１０分間室温で放置した。次に、緩衝液で３
度洗浄後、実施例１で作成したＰＣＲ用断片を熱変性に
より一本鎖としたもの（２μｇ）を緩衝液Ｑ中でフィル
ターと反応させた。この反応によって、フィルター上に
ハイブリッド体が形成されている場合には、これにＰＣ
Ｒ用核酸断片がアビジン−ビオチン結合により選択的に
結合する。次に、フィルターを２度洗浄した後、Ａｍｐ
ｌｉ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）バッファ溶液に浸漬
し、これに以下のＰＣＲ用プライマー（各３００ｎＭ、
２μｌ）を用い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）
のプロトコルに従ってＰＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） ＰＣＲ反応には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のサーマ
ルサイクラーを用い、以下の温度サイクルを使用した。
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成したビオチン化核酸プローブ（一本鎖）２
μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全量
を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルター
を浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの中
で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ま
した（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配列
の部分で二本鎖が形成される。フィルターを溶液から取
出し、蒸留水で二度洗浄して過剰なプローブを取り除い
た後、１０００μｌの緩衝液Ｑ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０
５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に素早く浸漬した。一
分間室温で放置後、３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を
追加した緩衝液Ｑ中にフィルターを２０分間浸した。こ
れを、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含む緩衝液
Ｑに浸し、１０分間室温で放置した。次に、緩衝液で３
度洗浄後、実施例１で作成したＰＣＲ用断片を熱変性に
より一本鎖としたもの（２μｇ）を緩衝液Ｑ中でフィル
ターと反応させた。この反応によって、フィルター上に
ハイブリッド体が形成されている場合には、これにＰＣ
Ｒ用核酸断片がアビジン−ビオチン結合により選択的に
結合する。次に、フィルターを２度洗浄した後、Ａｍｐ
ｌｉ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）バッファ溶液に浸漬
し、これに以下のＰＣＲ用プライマー（各３００ｎＭ、
２μｌ）を用い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）
のプロトコルに従ってＰＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） ＰＣＲ反応には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のサーマ
ルサイクラーを用い、以下の温度サイクルを使用した。
【００２０】９０℃３分間の初期熱変性をした後、９０
℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間の工程を２５サ
イクル行い、最後に７２℃で１０分間行った。
℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間の工程を２５サ
イクル行い、最後に７２℃で１０分間行った。
【００２１】ＰＣＲ反応終了後、反応液を電気泳動法に
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
【００２２】実施例３（検出例） プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
【００２３】試料１μｇ／３μｌをニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成したビオチン化核酸プローブ（一本鎖）２
μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全量
を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルター
を浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの中
で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ま
した（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配列
の部分で二本鎖が形成される。フィルターを溶液から取
出し、蒸留水で二度洗浄して過剰なプローブを取り除い
た後、１０００μｌの緩衝液Ｑに素早く浸漬した。一分
間室温で放置後、３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を追
加した緩衝液Ｑ中にフィルターを２０分間浸した。これ
を、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含む緩衝液Ｑ
に浸し、１０分間室温で放置した。次に、緩衝液で３度
洗浄後、実施例１で作成したＰＣＲ用断片（二本鎖）の
２μｇを緩衝液Ｑ中でフィルターと反応させた。この反
応によって、フィルター上にハイブリッド体が形成され
ている場合には、これにＰＣＲ用核酸断片がアビジン−
ビオチン結合により選択的に結合する。次に、フィルタ
ーを２度洗浄した後、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲ
Ａ）バッファ溶液を加え、９５℃で５分間加温し、フィ
ルターを取り除いた残りの溶液を、ＰＣＲ用チューブに
移し、これに以下のＰＣＲ用プライマー（各３００ｎ
Ｍ、２μｌ）を用い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲ
Ａ）のプロトコルに従ってＰＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） なお、ＰＣＲ反応は、実施例２と同様の温度サイクル条
件で行った。
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成したビオチン化核酸プローブ（一本鎖）２
μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全量
を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルター
を浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの中
で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ま
した（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配列
の部分で二本鎖が形成される。フィルターを溶液から取
出し、蒸留水で二度洗浄して過剰なプローブを取り除い
た後、１０００μｌの緩衝液Ｑに素早く浸漬した。一分
間室温で放置後、３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を追
加した緩衝液Ｑ中にフィルターを２０分間浸した。これ
を、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含む緩衝液Ｑ
に浸し、１０分間室温で放置した。次に、緩衝液で３度
洗浄後、実施例１で作成したＰＣＲ用断片（二本鎖）の
２μｇを緩衝液Ｑ中でフィルターと反応させた。この反
応によって、フィルター上にハイブリッド体が形成され
ている場合には、これにＰＣＲ用核酸断片がアビジン−
ビオチン結合により選択的に結合する。次に、フィルタ
ーを２度洗浄した後、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲ
Ａ）バッファ溶液を加え、９５℃で５分間加温し、フィ
ルターを取り除いた残りの溶液を、ＰＣＲ用チューブに
移し、これに以下のＰＣＲ用プライマー（各３００ｎ
Ｍ、２μｌ）を用い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲ
Ａ）のプロトコルに従ってＰＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） なお、ＰＣＲ反応は、実施例２と同様の温度サイクル条
件で行った。
【００２４】ＰＣＲ反応終了後、反応液を電気泳動法に
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
【００２５】実施例４ プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
【００２６】試料１μｇ／３μｌをニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成した非ビオチン化核酸プローブ（一本鎖）
２μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全
量を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルタ
ーを浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの
中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷
ました（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配
列の部分で二本鎖が形成される。
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成した非ビオチン化核酸プローブ（一本鎖）
２μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全
量を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルタ
ーを浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの
中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷
ました（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配
列の部分で二本鎖が形成される。
【００２７】フィルターを溶液から取出し、蒸留水で二
度洗浄して過剰なプローブを取り除いた後、これを、１
０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ及び１０ｍＭ
ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）、４ｍＭビオチン化ＵＴＰ
（ＢＲＬ社）５μｌ及び１０×アニーリング溶液の５０
μｌの混合液に蒸留水を加えて５００μｌとしたものに
加え、よく混和した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を添加してから３７℃
で１時間加温し、伸展反応を行った。
度洗浄して過剰なプローブを取り除いた後、これを、１
０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ及び１０ｍＭ
ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）、４ｍＭビオチン化ＵＴＰ
（ＢＲＬ社）５μｌ及び１０×アニーリング溶液の５０
μｌの混合液に蒸留水を加えて５００μｌとしたものに
加え、よく混和した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を添加してから３７℃
で１時間加温し、伸展反応を行った。
【００２８】フィルターを蒸留水で３度洗浄してから、
１０００μｌの緩衝液Ｑに素早く浸漬した。一分間室温
で放置後、３％ＢＳＡを追加した緩衝液Ｑ中にフィルタ
ー移し、２０分間浸した。次に、これを、２μｇ／ｍｌ
のストレプトアビジンを含む緩衝液Ｑに浸し、１０分間
室温で放置した。更に、緩衝液で３度洗浄後、実施例１
で作成したＰＣＲ用断片を熱変性により一本鎖化したも
の（２μｇ）を緩衝液Ｑ中でフィルターと反応させた。
この反応によって、フィルター上にハイブリッド体が形
成されている場合には、これにＰＣＲ用核酸断片がアビ
ジン−ビオチン結合により選択的に結合する。次に、フ
ィルターを２度洗浄した後、ＡｍｐｌｉＴａｑ （ＴＡ
ＫＡＲＡ）バッファ溶液に浸漬し、これに以下のＰＣＲ
用プライマー（各３００ｎＭ、２μｌ）を用い、Ｇｅｎ
ｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコルに従ってＰ
ＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） なお、ＰＣＲ反応は、実施例２と同様の温度サイクル条
件で行った。
１０００μｌの緩衝液Ｑに素早く浸漬した。一分間室温
で放置後、３％ＢＳＡを追加した緩衝液Ｑ中にフィルタ
ー移し、２０分間浸した。次に、これを、２μｇ／ｍｌ
のストレプトアビジンを含む緩衝液Ｑに浸し、１０分間
室温で放置した。更に、緩衝液で３度洗浄後、実施例１
で作成したＰＣＲ用断片を熱変性により一本鎖化したも
の（２μｇ）を緩衝液Ｑ中でフィルターと反応させた。
この反応によって、フィルター上にハイブリッド体が形
成されている場合には、これにＰＣＲ用核酸断片がアビ
ジン−ビオチン結合により選択的に結合する。次に、フ
ィルターを２度洗浄した後、ＡｍｐｌｉＴａｑ （ＴＡ
ＫＡＲＡ）バッファ溶液に浸漬し、これに以下のＰＣＲ
用プライマー（各３００ｎＭ、２μｌ）を用い、Ｇｅｎ
ｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコルに従ってＰ
ＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） なお、ＰＣＲ反応は、実施例２と同様の温度サイクル条
件で行った。
【００２９】ＰＣＲ反応終了後、反応液を電気泳動法に
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
【００３０】実施例５ プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
【００３１】試料１μｇ／３μｌをニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成した非ビオチン化核酸プローブ（一本鎖）
２μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全
量を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルタ
ーを浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの
中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷
ました（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配
列の部分で二本鎖が形成される。
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成した非ビオチン化核酸プローブ（一本鎖）
２μｇに１０×アニーリング溶液５００μｌを加え、全
量を蒸留水で５０００μｌとした溶液に、このフィルタ
ーを浸漬した。これを６５℃の温水の入ったビーカーの
中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷
ました（所要時間：約１時間）。この反応で相補的な配
列の部分で二本鎖が形成される。
【００３２】フィルターを溶液から取出し、蒸留水で二
度洗浄して過剰なプローブを取り除いた後、これを、１
０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ及び１０ｍＭ
ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）、４ｍＭビオチン化ＵＴＰ
（ＢＲＬ社）５μｌ及び１０×アニーリング溶液の５０
μｌの混合液に蒸留水を加えて５００μｌとしたものに
加え、よく混和した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を添加してから３７℃
で１時間加温し、伸展反応を行った。
度洗浄して過剰なプローブを取り除いた後、これを、１
０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ及び１０ｍＭ
ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）、４ｍＭビオチン化ＵＴＰ
（ＢＲＬ社）５μｌ及び１０×アニーリング溶液の５０
μｌの混合液に蒸留水を加えて５００μｌとしたものに
加え、よく混和した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を添加してから３７℃
で１時間加温し、伸展反応を行った。
【００３３】フィルターを蒸留水で３度洗浄してから、
１０００μｌの緩衝液Ｑに素早く浸漬した。一分間室温
で放置後、３％ＢＳＡを追加した緩衝液Ｑ中にフィルタ
ー移し、２０分間浸した。次に、これを、２μｇ／ｍｌ
のストレプトアビジンを含む緩衝液Ｑに浸し、１０分間
室温で放置した。更に、緩衝液で３度洗浄後、実施例１
で作成したＰＣＲ用断片（二本鎖：２μｇ）を緩衝液Ｑ
中でフィルターと反応させた。この反応によって、フィ
ルター上にハイブリッド体が形成されている場合には、
これにＰＣＲ用核酸断片がアビジン−ビオチン結合によ
り選択的に結合する。次に、フィルターを２度洗浄した
後、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）バッファ溶
液を加え、９５℃で５分間加温し、フィルターを取り除
いた残りの溶液を、ＰＣＲ用チューブに移し、これに以
下のＰＣＲ用プライマー（各３００ｎＭ、２μｌ）を用
い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコル
に従ってＰＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） なお、ＰＣＲ反応は、実施例２と同様の温度サイクル条
件で行った。
１０００μｌの緩衝液Ｑに素早く浸漬した。一分間室温
で放置後、３％ＢＳＡを追加した緩衝液Ｑ中にフィルタ
ー移し、２０分間浸した。次に、これを、２μｇ／ｍｌ
のストレプトアビジンを含む緩衝液Ｑに浸し、１０分間
室温で放置した。更に、緩衝液で３度洗浄後、実施例１
で作成したＰＣＲ用断片（二本鎖：２μｇ）を緩衝液Ｑ
中でフィルターと反応させた。この反応によって、フィ
ルター上にハイブリッド体が形成されている場合には、
これにＰＣＲ用核酸断片がアビジン−ビオチン結合によ
り選択的に結合する。次に、フィルターを２度洗浄した
後、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）バッファ溶
液を加え、９５℃で５分間加温し、フィルターを取り除
いた残りの溶液を、ＰＣＲ用チューブに移し、これに以
下のＰＣＲ用プライマー（各３００ｎＭ、２μｌ）を用
い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコル
に従ってＰＣＲ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：GCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） なお、ＰＣＲ反応は、実施例２と同様の温度サイクル条
件で行った。
【００３４】ＰＣＲ反応終了後、反応液を電気泳動法に
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
より分析した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９株及びＨＢ
１０１株からの試料のレーンではバンドは認められなか
ったが、プラスミドｐＵＣ１９のレーンでは約０．３ｋ
ｂ付近にバンドが認められ、プローブ中の増幅領域がＰ
ＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵＣ１９の試料をプ
ローブで検出できることが確認された。
【００３５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、試料をＰＣＲで
増幅するのではなく、ＰＣＲ用核酸断片を用い、それが
標的核酸と核酸プローブとのハイブリッド体が形成され
たときにのみ増幅される構成を取るので、ＰＣＲ用プラ
イマーとして該ＰＣＲ用核酸断片に対応するものを用意
すればよく、試料に応じてＰＣＲ用プライマーをその都
度選択する必要がなくなり、分析操作の簡便化が図れ
る。また、このようなＰＣＲ用核酸断片を追加的に用い
ることで、数１０塩基程度しか既知でない核酸試料に対
してもＰＣＲ反応が適用でき、高感度な検出が可能とな
る。
増幅するのではなく、ＰＣＲ用核酸断片を用い、それが
標的核酸と核酸プローブとのハイブリッド体が形成され
たときにのみ増幅される構成を取るので、ＰＣＲ用プラ
イマーとして該ＰＣＲ用核酸断片に対応するものを用意
すればよく、試料に応じてＰＣＲ用プライマーをその都
度選択する必要がなくなり、分析操作の簡便化が図れ
る。また、このようなＰＣＲ用核酸断片を追加的に用い
ることで、数１０塩基程度しか既知でない核酸試料に対
してもＰＣＲ反応が適用でき、高感度な検出が可能とな
る。
【００３６】
配列番号：１ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT G 41 配列番号：２ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCGC TAGAGTAAGT 60 AGTT 64 配列番号：３ 配列の長さ：１２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATATATATA TAGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT 60 GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATAA CTACTTACTC 120 TAGC 124 配列番号：４ 配列の長さ：１２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATATATATA TAATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC 60 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCGC GCGCGCGCGC 120 配列番号：５ 配列の長さ：７６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAACGACGAG CGTGACGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT 60 GCATCGCGCG CGCGCG 76 配列番号：６ 配列の長さ：３４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCGC TAGAGTAAGT 60 AGTTATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC 120 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC TATATATATA TAATGCATGC 180 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC 240 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCGC GCGCGCGCGC ATGCATGCAT GCATGCATGC 300 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCGT CACGCTCGTC GTTT 344 配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTAGAGTAA GTAGTT 16 配列番号：８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACGACGAGC GTGAC 15 配列番号：９ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATATACATTC GCCATTCAGG CTGCGCAACT GTTGGGAAGG GCGATG
【図１】本発明の核酸検出方法において核酸プローブに
ＰＣＲ用核酸断片を結合させる場合の操作の一例を示す
図であり、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ）の
手順で操作を行うことを示す。
ＰＣＲ用核酸断片を結合させる場合の操作の一例を示す
図であり、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ）の
手順で操作を行うことを示す。
【図２】本発明の核酸検出方法においてハイブリッド体
上で核酸プローブをプライマーとした進展反応を行う場
合の操作の一例を示す図であり、（ａ）→（ｂ）→
（ｃ）の手順で操作を行うことを示す。
上で核酸プローブをプライマーとした進展反応を行う場
合の操作の一例を示す図であり、（ａ）→（ｂ）→
（ｃ）の手順で操作を行うことを示す。
【図３】本発明の核酸検出方法においてＰＣＲ用核酸断
片に二本鎖のものを用いた場合の操作の一例を示す図で
あり、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）の手順で操作を行うこと
を示す。
片に二本鎖のものを用いた場合の操作の一例を示す図で
あり、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）の手順で操作を行うこと
を示す。
【図４】本発明の核酸検出方法に用いるＰＣＲ用核酸断
片の構成の一例を示す図である。
片の構成の一例を示す図である。
１ 担体 ２ 標的核酸 ３ 核酸プローブ ４、５ ビオチン部 ６、１３ ＰＣＲ用核酸断片 ７ アビジン ８、９ ＰＣＲ用プライマー １０ 増幅された核酸断片 １１、１２ モノマー １３ａ、１３ｂ ＰＣＲ用二本鎖核酸断片から得られた
一本鎖断片 １４、１５ ＰＣＲで増幅される領域を規定する配列 １６ 増幅領域
一本鎖断片 １４、１５ ＰＣＲで増幅される領域を規定する配列 １６ 増幅領域
Claims (7)
- 【請求項１】 標的核酸とハイブリダイズし得る配列を
有する核酸プローブを用いた核酸検出方法において、
（ａ）試料と前記核酸プローブを反応させる過程と、
（ｂ）試料に前記標的核酸が含まれている場合に形成さ
れる標的核酸と核酸プローブのハイブリッド体と、未反
応の核酸プローブを分離する過程と、（ｃ）前記ハイブ
リッド体にＰＣＲ用核酸断片を選択的に結合させる過程
と、（ｄ）該ＰＣＲ用核酸断片に対してＰＣＲを行う過
程と、（ｅ）該ＰＣＲにより増幅された核酸断片を検出
する過程と、を有することを特徴とする核酸検出方法。 - 【請求項２】 ハイブリッド体とＰＣＲ用核酸断片の選
択的結合を、ＰＣＲ用核酸断片をハイブリッド体を構成
する核酸プローブに選択的に結合することで行う請求項
１に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項３】 ハイブリッド体とＰＣＲ用核酸断片の選
択的結合を、ハイブリッド体上でそこに結合している核
酸プローブをプラマーとした伸展反応を行い、得られた
二本鎖部分にＰＣＲ用核酸断片が選択的に結合できる部
位を形成した後、該部位にＰＣＲ用核酸断片を結合させ
る請求項１に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項４】 ハイブリッド体へのＰＣＲ用核酸断片の
選択的結合を、ハイブリッド体とＰＣＲ用核酸断片の双
方に選択的結合を可能とする修飾を施すことでおこなう
請求項２または３に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項５】 ハイブリッド体へのＰＣＲ用核酸断片の
選択的結合を、アビジン−ビオチン結合を利用しておこ
なう請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の検出方法。 - 【請求項６】 ＰＣＲ用核酸断片が二本鎖部分を有する
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の検出方法。 - 【請求項７】 ハイブリッド体に二本鎖部分を有するＰ
ＣＲ用核酸断片を選択的に結合させた後に、ＰＣＲ用核
酸断片の二本鎖部分を解離させて得られた一本鎖断片に
ＰＣＲをかける請求項６に記載の核酸の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13461593A JPH06343499A (ja) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | 核酸検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13461593A JPH06343499A (ja) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | 核酸検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343499A true JPH06343499A (ja) | 1994-12-20 |
Family
ID=15132539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13461593A Pending JPH06343499A (ja) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | 核酸検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06343499A (ja) |
-
1993
- 1993-06-04 JP JP13461593A patent/JPH06343499A/ja active Pending
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