JPH04229200A - 改良ｌｃｒ法 - Google Patents

改良ｌｃｒ法

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JPH04229200A
JPH04229200A JP3219720A JP21972091A JPH04229200A JP H04229200 A JPH04229200 A JP H04229200A JP 3219720 A JP3219720 A JP 3219720A JP 21972091 A JP21972091 A JP 21972091A JP H04229200 A JPH04229200 A JP H04229200A
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lcr
reaction
probes
ligation
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JP3219720A
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Keith C Backman
キース・シー・バックマン
George H Shimer
ジョージ・エイチ・シャイマー
John J Carrino
ジョン・ジェイ・カリノ
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Original Assignee
Abbott Laboratories
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Publication date
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸配列の検出に関す
る。さらに詳しくは、リガーゼ連鎖反応（Ｌｉｇａｓｅ
　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）による核酸
配列の検出において、バックグラウンドに対する相対的
シグナルを目的配列に依存して増大させる方法に関する
。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＬＣ
Ｒの一つの側面には、試料中の特定核酸配列の存在の検
出法が含まれる。ＬＣＲは、２セットの核酸プローブを
用いた目的配列に依存したライゲーションを特徴とする
。第一セットのプローブの成員は、末端と末端とが隣接
した位置関係で目的鎖にハイブリダイズするように設計
されている。かくして並んだ隣接プローブは、ホスホジ
エステル結合を鋳型に依存した仕方で生成させることに
よりライゲートさせる。かくして新たに生成した分子は
、鋳型として機能し（目的配列相補体が存在していれば
そのように機能するように）、プローブの第二のペアの
ライゲーションを媒体して、さらに第一のペアのプロー
ブをライゲートさせるための新たな鋳型を生成する（以
下、同様に続く）。
【０００３】以下に一層詳細に記載するように、ＬＣＲ
の性能（ｐｏｗｅｒ）は、ライゲートした各セットのプ
ローブがさらにライゲートするための鋳型として機能し
得るということによっており、そのことによって増大し
た（幾何級数的）速度にてライゲーションを生じる。す
なわち、各サイクルによって、増大した数のライゲート
目的配列含有分子が加えられるのである。ＬＣＲは、Ｅ
Ｐ−Ａ−３２０３０８に開示されている。ＬＣＲは、特
定ホスホジエステル結合を生成させることによって次の
サイクルでそのような結合を生成させるための鋳型の数
を増幅させることから、ＬＣＲはまた増幅法としても特
徴付けられる。ここで、核酸の合成という意味でＬＣＲ
が増幅法であるというのではない。ＬＣＲ生成物は、提
供したプローブの配列に関する情報を有するが、該情報
は目的鎖の配列情報と必ずしも同じではない。
【０００４】理想的には、上記鋳型に依存したライゲー
ションは、鋳型が存在する場合に、そして鋳型が存在す
る場合にのみ起こる。しかしながら、実際には、鋳型に
依存しないライゲーションも同様に起こることがある。 鋳型に依存しないライゲーションにより増幅可能な生成
物が生じ、その結果、目的鎖の不在下でもバックグラウ
ンドシグナルを生じ得る。さらに詳しく説明すると、該
方法のほぼ全般を通じて、ＬＣＲプローブのセットは一
般に目的ＤＮＡよりも有意に過剰量で存在している。こ
れらの過剰な相補的プローブはお互いの間で自由にハイ
ブリダイズして平滑末端二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、こ
の分子が目的鎖とは独立にＤＮＡリガーゼによって接合
され（目的鎖に媒体されたライゲーションに比べれば実
質的に低い効率ではあるが）、その結果、疑似鋳型が生
成し、これが鋳型に依存したライゲーションの連鎖反応
を起こし、ＬＣＲにおいて偽りの「バックグラウンド」
シグナルを生成することになる。
【０００５】上記のようなＬＣＲ増幅における偽りのバ
ックグラウンドを制御する一つの方法は、プローブの末
端を修飾してライゲーション（所望でない平滑末端ライ
ゲーションを含む）をさせないようにし、その後、鋳型
に依存した仕方で該修飾を元に戻す方法である（バック
マン（Ｂａｃｋｍａｎ）、ボンド（Ｂｏｎｄ）、カリー
ノ（Ｃａｒｒｉｎｏ）およびラフラー（Ｌａｆｆｌｅｒ
）のＥＰ−Ａ−０４３９１８２参照）。
【０００６】ウー（Ｗｕ）らは、「ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｚｅ　Ｃｈａｉ
ｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（エーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）
ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス、１９８９）、２３３〜２３６頁」の中で対立
遺伝子特異的増幅法を記載している。一つの観点におい
て、ウーらは、ＰＣＲで富ませたＤＮＡ配列のために、
ＬＡＲ（「リガーゼ増幅反応」、ＬＣＲの別名）を対立
遺伝子特異的検出システムとして用いることができるこ
とを示唆している。ウーらは、ＬＣＲを行う前に、最初
の鋳型制御反応としてＰＣＲを使用することを提案して
いるように思われる。
【０００７】ウーらはまた、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５
６０〜５６９（１９８９）において種々の増幅法を再検
討している。ウーらは、ＬＡＲ（ＬＣＲ）およびＰＣＲ
の両方について検討している。一つの態様として、ウー
らは、１セットのみのライゲート可能プローブを用いた
（その相補的セットを用いない）一次（ｌｉｎｅａｒ）
ＬＣＲ反応を記載している。しかしながら、ウーらは、
最初の一次ＬＣＲの後に完全ＬＣＲを組み合わせること
により得られる利点については示唆も評価もしていない
。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、制御され
た鋳型依存反応からなる第一工程を加えることによりＬ
ＣＲ法を改良することができることを発見した。該鋳型
依存反応において、ＬＣＲにおける鋳型依存ライゲーシ
ョンに関与し得る鋳型群が増大され、ＬＣＲに関与し得
る鋳型分子の有害量の鋳型非依存（すなわち、目的核酸
の不在下での）生成が実質的に回避される。ここで「有
害量」とは偽りの鋳型の量を意味し、該偽りの鋳型は該
最初の制御反応を行わないＬＣＲに比べて感度を制限す
るものである。本発明の一つの態様において、該制御反
応は、有害な平滑末端ライゲーションを実質的に回避さ
せるように制御もしくは偏重させた（ｗｅｉｇｈｔｅｄ
）鋳型依存ライゲーションである。
【０００９】さらに詳しく説明すると、制御ライゲーシ
ョンの一つの好ましい態様において、目的相補鎖に対応
する配列を有するライゲーション生成物に比べて、目的
鎖の配列または目的鎖に対応する配列（たとえば、目的
鎖と同一の配列または目的鎖とハイブリダイズし得るプ
ローブをライゲートすることにより調製した配列）を有
するライゲーション生成物を選択的に生成するように該
最初の鋳型依存ライゲーションを著しく偏重させる（本
明細書において「２つの目的鎖」または「目的鎖および
目的相補鎖」なる語は、最初の目的鎖が二本鎖である場
合のみならず、目的鎖が最初一本鎖であってもライゲー
ション反応により一本鎖目的鎖の少なくとも一部にハイ
ブリダイズし得るライゲーション生成物を速やかに生成
する場合にも用いる。従って、本明細書においては、も
ともと一本鎖としてのみ存在する目的鎖のためのアッセ
イを記載する際に、第一および第二目的鎖なる語は目的
鎖および目的相補鎖なる語と交互に同じ意味で用いる）
。
【００１０】本発明の好ましい態様において、目的鎖の
一方の鎖が、実際上、鋳型制御ライゲーションに関わる
。というのは、鋳型により生成したライゲーション生成
物をさらに増幅用に用いるための手段（すなわち、試薬
）が実際上、殆どまたは全く提供されていないからであ
る。好ましい極端な場合には、そのような二次的なライ
ゲーションのための手段が全く提供されておらず、また
制御反応においてはライゲーションはライゲーションの
サイクル数の実質的な一次関数である。そのような理由
から、最初の制御ライゲーション工程を、ホスホジエス
テル結合の一次増幅または「一次プレ増幅」とも呼ぶ。 上記最初の反応は通常１０〜５０サイクルからなるが、
１００サイクルまたはそれ以上行ってもよい。
【００１１】本明細書において、一方の鎖の配列に対す
るライゲーション数が「選択的に」起こるとか、一方の
鎖のライゲーションの方に反応が「偏重される」という
場合、それは、第一の工程において一方の目的鎖からの
方が第二の目的鎖からよりも優先的に生成物が生成する
ことを意味している。このことは、主として、２つのそ
れぞれの鎖に選択的に働く試薬（プローブ）の比率を変
えることにより行うことができる。この比率は、１：１
（各鎖に働く試薬を等量で用いる）から無限大（一方の
鎖に働く試薬は存在しない）まで連続的に制御すること
ができる。本発明の第一の観点の好ましい態様において
は、この制御反応の特徴は、１セットの第一核酸プロー
ブを提供し、ついで該第一プローブを鋳型に依存した仕
方でライゲートさせて、該第一の目的配列にハイブリダ
イズし得る分子をさらに生成させることである。しかし
ながら、「第二」プローブは提供しない。
【００１２】本発明の第一の観点の他の好ましい態様は
、ＤＮＡリガーゼが平滑末端ライゲーションに比べてニ
ック（ｎｉｃｋｅｄ）部位をライゲートする（すなわち
、鋳型依存ライゲーション）ことを決定的に優先すると
いう事実を利用するものである。詳しく説明すると、所
望の鋳型依存ライゲーションは遥かに効率的であり、し
かも、濃度の低下による該効率の減少は平滑末端ライゲ
ーションの場合に比べてゆっくりとしているのである。 それゆえ、最初の制御工程において少なくとも一方のプ
ローブセットの濃度を非常に低く保持しておけば平滑末
端ライゲーションの起こる機会は無視できるほど小さく
なる。 選択されたプローブセットの濃度は１００倍まで下げる
ことができるが、約１０倍の下げで充分であると思われ
る。たとえば、制御反応工程において、標準反応容器（
２０〜５０μｌ）当たり各プローブの濃度を１０１１プ
ローブまたはそれ以下とするのが好ましい。これは、５
０μｌ当たり約１０１２の標準ＬＣＲプローブ濃度と対
比される。
【００１３】ライゲートしたプローブの増加率はプロー
ブ濃度を減少させることによって減少するが、そのよう
な減少は最初の制御工程においては許容し得るものであ
る。該最初の制御工程は、ライゲートした種を検出可能
な量で直接提供するよりも、むしろ標準ＬＣＲのために
最初に存在する鋳型の数を増加させるために行われるか
らである。要約すると、本発明は、平滑末端ライゲーシ
ョンの危険性を相対的に最小に抑えながら、所望でない
平滑末端ライゲーションと所望の鋳型依存ライゲーショ
ンとの相対効率の差を利用してＬＣＲ鋳型を鋳型に依存
した仕方で生成させるものであり、それにより、その後
に行うＬＣＲ反応の結果を改善するものである。
【００１４】上記本発明の第一の観点における２つの好
ましい態様は、連続体の両極端を表すものである。すな
わち、一方において相補的プローブを用いることなく一
つの目的鎖に対する両プローブを標準濃度で用い、他方
において両方の鎖に対する両プローブを低濃度で用いる
。本発明がこの連続体の中間部分も包含することは当業
者であれば理解できるであろう。すなわち、両方の鎖に
対するプローブを用い、一方の鎖に対するプローブの集
団の方に傾き、プローブ二本鎖の生成および平滑末端ラ
イゲーションの起こりやすさが有害とならないように濃
度を制御する。たとえば、少なくとも一方のプローブセ
ットについて５０μｌ容器当たり１０１１分子以下のプ
ローブが上記のように存在していてよい。
【００１５】本発明の第二の観点は、最初の制御工程で
核酸（好ましくはＤＮＡ）重合を用いてＬＣＲの鋳型を
生成させることを特徴とする。重合は鋳型に依存するの
で、重合伸長生成物の生成には一般に意図する目的配列
の存在を必要とする。重合伸長生成物が意図する目的鎖
以外の部分から生成される限りにおいて、そのような生
成物はその後のＬＣＲに有意な影響を与えないであろう
。というのは、そのような生成物は鋳型として働かない
からである。従って、標準ＰＣＲ、または他方の鎖に対
して一方の鎖を選択的に増幅させるように偏重させた重
合は最初の制御反応として機能し得る。ＰＣＲを最初の
制御反応として用いた後にＬＣＲを行うことによる顕著
な利点は、偽りのＰＣＲ伸長生成物からのシグナルを排
除することにより、ＰＣＲを単独で行った場合に比べて
特異性が増大する結果になることである。
【００１６】本発明の第二の観点の一つの態様において
、制御反応は、目的分子（ＴＭ）の一方の鎖の３’末端
からライゲーション部分（その後のＬＣＲで起こる）に
相補的な単一のプライマー核酸配列のコピーを、核酸ポ
リメラーゼ、および鋳型依存重合に適したヌクレオシド
三リン酸（デオキシヌクレオシド三リン酸をも包含し、
むしろこの方が好ましくさえある）とともに提供するこ
とからなる。通常のＰＣＲとは異なり、この場合のＰＣ
Ｒでは、通常のＰＣＲにおいて通常用いる他の鎖に対す
るプライマーは殆どまたは全く提供されない。それゆえ
、この方法は、「非対称ＰＣＲ」と呼ばれる。
【００１７】このポリメラーゼに基づく制御工程も、上
記リガーゼに基づく制御工程と全く同様に連続的なもの
である。そのような試薬は、まずプライマーを目的核酸
配列にハイブリダイズさせ、ついで得られたハイブリッ
ドをポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸と反応さ
せて伸長生成物／鋳型を生成するサイクルの繰り返しに
用いられる。変性させると、第一の目的鎖の配列にハイ
ブリダイズし得る一本鎖伸長生成物配列を生じる。つい
で、このサイクルをある回数繰り返す。
【００１８】上記２つの制御反応（重合およびライゲー
ション）は、順番に行うことができる。重合を先に行う
のが好ましい。また、いずれかのタイプの制御反応（重
合またはライゲーション）を用いる場合は、上記のよう
に一方の鎖に対応する配列を生成するように反応を偏重
させることができる。第二の同時平行制御反応を別の容
器で行ってもよく、該第二の反応は第二の目的鎖に対応
する配列を生成するように偏重させる。ついで、これら
２つの制御増幅工程の生成物を混合し、ＬＣＲに供する
２つの目的鎖の配列集団がほぼ等しくなるようにする。
【００１９】上記制御反応態様を行った後、標準ＬＣＲ
アッセイを行って幾何級数的な増幅を達成させる。該ア
ッセイにおいて、両方の目的鎖配列に対応する配列を有
するプローブをライゲートさせ、各ライゲーション生成
物はその後のライゲーションの鋳型として機能する。詳
しく説明すると、幾何級数的工程において、第一核酸プ
ローブは一つの目的核酸配列の隣接部分にハイブリダイ
ズし、鋳型（もともとの目的鎖の相補体か、または最初
の目的鎖の存在に依存した仕方でプローブがライゲート
することにより生成したライゲーション生成物）の存在
に依存した反応によりライゲートされる。つぎに、上記
ライゲートした第一プローブにハイブリダイズした第二
核酸プローブを鋳型に依存した仕方でライゲートさせて
、その後のサイクルで第一プローブをライゲートさせる
ための鋳型をさらに生成させる。それゆえ、第一の増幅
工程のライゲーション生成物はＬＣＲによる幾何級数的
ライゲーションに供される。
【００２０】本発明の第三の観点は、上記（ライゲーシ
ョンに基づく）一次プレ増幅を行うための一次プレ増幅
／ＬＣＲキットに関し、該キットはＤＮＡリガーゼ、少
なくとも一つの核酸プローブセット、鋳型依存ポリメラ
ーゼ、上記プライマー配列、およびポリメラーゼによる
重合に適したヌクレオシド三リン酸からなる。リガーゼ
およびポリメラーゼの両方とも熱安定性であるのが好ま
しい。
【００２１】本発明は、平滑末端ライゲーションによる
偽りの（鋳型に依存しない）シグナルを回避させる工程
において目的鎖を含有する分子の数を増加させることに
より、感度を実質的に高めることができる。本発明はま
た、試薬濃度、およびサイクル数などの他のプレ増幅変
数を制御することにより最終的なＬＣＲシグナル感度を
最適化することができる。
【００２２】本発明の利点を評価する一つの方法は以下
の通りである。上記理由により、目的配列の不在下でさ
えも、充分なサイクル数の後では偽りのバックグラウン
ドシグナルが殆ど常にＬＣＲにおいて生じるであろう。 アッセイの評価は、目的鎖の存在下で確実にシグナルを
生じるＬＣＲサイクル数と目的鎖の不在下でシグナルを
生成しやすいサイクル数とで規定される「窓口」（サイ
クル数にて）により行うことができる。本発明によれば
、ＬＣＲの前の制御鋳型依存反応により、目的鎖の不在
下でバックグラウンドシグナルが現れるサイクル数を実
質的に減少させることなくシグナルを生成するのに必要
なＬＣＲサイクル数を減少させることによって、この「
窓口」を広げることができる。
【００２３】また、本発明の利点は、アッセイの感度の
向上により評価することもできる。言い換えると、標準
ＬＣＲに比べて、本発明の最初の制御増幅は目的鎖を含
有しない試料から目的鎖を含有する試料を識別する能力
に優れている。つぎに、本発明を図面に基づいて説明す
る。図１において、一本鎖核酸目的分子（たとえば、Ｄ
ＮＡ）（以下、「ＴＭ」ともいう）は、既知の核酸配列
目的配列（以下、「ＴＳ」ともいう）を含んでいる（Ｔ
ＳはＴＭのすべてである必要はないことに注意）。分子
ＴＭは試料中で一本鎖分子として存在していてよい。試
料はまた二本鎖（ハイブリダイズした）目的鎖分子を含
有していてもよいが、その場合は便宜的に一方の鎖をＴ
Ｍ、他方の鎖をＴＭ’と呼ぶことにする。同様に、ＴＳ
’はＴＳに相補的な配列を示す。
【００２４】図１において、本発明による制御増幅をＴ
ＳにハイブリダイズしたプローブＰ１およびＰ２の鋳型
依存ライゲーションにより示す（図１、工程Ａ）。変性
するとライゲートしたＰ１・Ｐ２はＴＭから分離される
。 このＰ１・Ｐ２はＰ１およびＰ２のライゲーションのた
めの鋳型として機能し得ないことに注意すべきである。 各サイクルは、（ａ）一本鎖ＴＳを用意し、（ｂ）Ｐ１
およびＰ２をＴＳにハイブリダイズし、（ｃ）Ｐ１およ
びＰ２を鋳型（ＴＳ）に依存したライゲーション反応に
よりライゲートしてＴＳ−Ｐ１・Ｐ２二本鎖を生成させ
、ついで（ｄ）得られたＴＳ−Ｐ１・Ｐ２二本鎖を変性
させて配列ＴＳを有する最初の鋳型分子およびライゲー
トした相補的分子Ｐ１・Ｐ２を生成させる、ことからな
る。各サイクルにおいて特定収量のＰ１・Ｐ２が得られ
、この収量は最初に存在する目的ＴＳのみの関数である
（一次相においてＴＳ配列は生成されないので）。相補
的なＰ１’およびＰ２’配列は存在していないので、Ｐ
１およびＰ２が平滑末端（鋳型に依存しない）ライゲー
ションによる偽りのバックグラウンドに貢献することは
実際上ない。
【００２５】所望の数の一次プレ増幅サイクルの後、Ｌ
ＣＲ工程（図２）において、一次プレ増幅のＰ１・Ｐ２
生成物を増幅させるためにプローブＰ１’およびＰ２’
を添加する。Ｐ１・Ｐ２生成物の存在下での幾何級数的
ＬＣＲ増幅により、予測可能なサイクル数以内にシグナ
ルが生成する。多くの場合、最初の制御増幅なしでＬＣ
Ｒを目的鎖に直接適用したときは、シグナルを生成させ
るのに一層多くのＬＣＲサイクル数が必要である。この
ように本発明は、所望でない平滑末端ライゲーション生
成物が、鋳型により生成したシグナルを生じるサイクル
範囲でＬＣＲシグナルを生成するのに充分な量で存在す
る機会を実質的に少なくする。
【００２６】図３では、図１に示したライゲーションと
は対照的に一次プレ増幅を重合により達成させる。この
場合も、目的分子ＴＭの目的配列ＴＳは相補的配列ＴＳ
’のコピーを生成させるのに用いられる。ＴＳの３’末
端に相補的な配列Ｃを有するプライマー配列Ｐｒを用意
する。もちろん、このプライマーは、目的分子（ＴＭ）
の３’末端からライゲーション部分（その後のＬＣＲが
起こる）にハイブリダイズさせるためにのみ必要である
。配列ＣをＴＳにハイブリダイズさせ、ポリメラーゼお
よびヌクレオチド三リン酸を加えて鋳型に依存した仕方
で配列Ｃを伸長させてＴＳ’の付加コピーを含有するＰ
ｒ・ＴＳ’を生成させる。上記ライゲーションに基づく
制御反応と同様に、複数のサイクルの結果は複数のコピ
ーとなるが、それらコピーは該一次工程においてさらに
増幅させるための鋳型としては機能しない（第二プライ
マーは除いてあるので）。
【００２７】リガーゼかまたはポリメラーゼ酵素のいず
れかを用いる制御プレ増幅法は、ＬＣＲの感度を高める
のに有用である。たとえば、制御した最初の増幅は、制
御した最初の増幅を行わないコントロールに比べてシグ
ナル／ノイズ比を増加させる。標準ＬＣＲアッセイに比
べてアッセイの感度が向上するという点で評価するとき
、制御増幅は感度を１０倍またはそれ以上高め、それゆ
え目的鎖を含有しない試料から所望の目的鎖を含有する
試料を識別する能力が高められる。
【００２８】一般に、制御増幅は１０〜１００サイクル
行う。ついで、試料中に存在する酵素の活性を失活させ
るのに充分な温度にて試料を加熱処理する。最初の制御
増幅がリガーゼに基づく増幅である場合は、この工程は
任意的なものである。必要なら、ついでＬＣＲ反応を支
持するため当業者に知られた仕方で反応混合物を適当に
調節する（緩衝液、ｐＨ等）。
【００２９】完全なＬＣＲプローブセットとして機能す
るのに充分な濃度でオリゴヌクレオチドをさらに加え、
また新たなリガーゼを加えてもよく、目的鎖に富んだ試
料でＬＣＲを行う。一般に、オリゴヌクレオチドは、幾
何級数相において１０〜１００ｎＭ、さらに好ましくは
３０〜１００ｎＭの最終濃度にて等量で用いる。リガー
ゼ一次増幅反応のためにオリゴヌクレオチド、試薬およ
びサイクル条件に関してさらに考慮すべき点は幾何級数
ＬＣＲの場合と同じであり、ＥＰ−Ａ−３２０３０８に
一般に開示されている。制御ポリメラーゼ反応に用いる
ことのできる条件は、一般にマニアティスらのモレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）（１９８１コールドスプリングハーバー）および
パネット（Ｐａｎｅｔ）およびコラナ（Ｋｈｏｒａｎａ
）（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５２
１３〜５２２１に開示されている。この重合は、一つの
プライマーのみを用いる点で米国特許第４，６８３，２
０２号および同第４，６８３，１９５号に開示されてい
るものとは異なっている。
【００３０】
【実施例】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１（ライゲーションによる制御増幅）下記二本鎖
目的ＤＮＡ配列は、市販のベクターｐＵＣ１９中に存在
している。単純化するため、一本鎖で示してある。配列
中の「−」は、プローブのライゲーションを行おうと意
図している点を示す。
【化１】 この目的配列のプレ増幅に使用するため該目的配列にハ
イブリダイズするように下記プローブを設計した。
【化２】
【００３１】プライマーＡおよびＢ並びにそれらの相補
体（Ａ’およびＢ’）の調製は、アプライドバイオシス
テムズモデル３８０Ｂを用いて標準法により行った。バ
ーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）
（１９８７）のガイド・トゥー・モレキュラー・クロー
ニング・テクニークス（Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）４
３８頁以下に記載の一般法により、プライマーＡ’およ
びＢをポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰで処理し
て５’末端をリン酸化した。トゥー（Ｔｕ）およびコー
エン（Ｃｏｈｅｎ）（１９８０）のＧｅｎｅ１０：１７
７〜１８３に記載の一般法により、ターミナルトランス
フェラーゼおよび−３２Ｐ−ｄＣｏＴＰ［コルデシピン
（Ｃｏｒｄｅｃｙｐｉｎ）］で処理してプライマーＡ’
の３’末端を放射性標識した。
【００３２】熱安定リガーゼの調製は、ＥＰ−Ａ−０３
７３９６２に記載の方法に従って行った。「１×ＬＣＲ
緩衝液」（すなわち、５０ｍＭ　ＥＰＰＳ、ｐＨ７．８
、１００ｍＭ　ＫＣｌ、１０．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１
．０ｍＭジチオトレイトール、１．０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ
、１０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）および１００μ
Ｍ　ＮＡＤ、２０μｇ／ｍｌ担体ＤＮＡ（ウシ胸腺ＤＮ
Ａなど）並びに等量のプライマーＡおよびＢ（各８５ｎ
Ｍ）を含有する試料を調製した。熱安定リガーゼの存在
下、１０００個の目的鎖分子を含有する試料について制
御増幅を行った。 単一のサイクルは下記工程からなっており、一次または
幾何級数のいずれかのリガーゼ媒体増幅と同じであった
。（ａ）９０℃で１分間加熱してＤＮＡを変性させる。 （ｂ）５０℃で１分間インキュベートして隣接プローブ
をアニールおよびライゲートさせる。
【００３３】５０サイクル後、反応を停止させ、１０分
間沸騰させてリガーゼを変性させた。ついで、この「プ
レ増幅」試料にＬＣＲプローブセットの他の２つのプロ
ーブ（Ａ’およびＢ’；各８０ｎＭ）および新たなリガ
ーゼを加え、サイクルをさらに２０〜５０サイクル行っ
た。 種々の時点で試料を採取し、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。 コントロールとして、４つのプローブおよび０かまたは
１０００の目的鎖を用いて標準ＬＣＲ反応を行った。試
料を採取し、プレ増幅反応と同様にして分析した。
【００３４】目的鎖配列を含有しないコントロール試料
からは特徴的な動力学のシグナルが得られ、１０００個
の目的鎖配列を含有する試料（しかし、制御増幅は行わ
ない）からは非常に似た動力学のシグナルが得られた。 しかしながら、最初の制御増幅に供した目的鎖含有試料
中のシグナルは、他の場合に比べてＬＣＲ（幾何級数的
増幅）手順において少なくとも４〜６サイクル早く出現
した。それゆえ、制御増幅から開始することにより、プ
レ増幅を行わない場合には識別が困難であるときに１０
００個の目的鎖をバックグラウンドから容易に識別する
ことができる。このことにより、一次プレ増幅を行わな
いときには確実に行うことが不可能であるような目的鎖
の数の同定が可能となり、感度が高められる。
【００３５】実施例２（重合による制御増幅）重合によ
る一次プレ増幅もまた、ＬＣＲアッセイの感度を高める
。実施例２でも実施例１と同じ目的鎖およびプローブ配
列を用いる。１０００個の目的鎖を含有する試料に、単
一のオリゴヌクレオチドプローブＡのみを加える。上記
マニアティスらの文献に記載の方法に従って、熱安定Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびｄＮＴＰｓを加える
（重合に関する上記文献も参照）。５０回のハイブリダ
イゼーション、伸長および変性サイクルを行う。 ついで、反応を停止させ、１０分間沸騰させてポリメラ
ーゼの活性を失活させる。
【００３６】全プレ増幅試料をエタノール沈殿させ、遠
心分離にかけ、残留する塩をエタノール洗浄により除き
、沈殿を乾燥させた。ついで、この沈殿を標準ＬＣＲ反
応混合物中に再懸濁し、プローブＡ、Ｂ、Ａ’、Ｂ’（
各プローブにつき８０ｎＭ）を加え、熱安定リガーゼを
加え、ＬＣＲを行った。１０００個または０個の目的鎖
を含有するコントロールについても行った。
【００３７】実施例３（連続制御増幅）実施例１に記載
の目的鎖およびプローブ配列を用い、１０００個の目的
鎖を含有する試料に単一のオリゴヌクレオチドプローブ
Ａを加える。実施例２に記載のようにしてポリメラーゼ
に基づくプレ増幅を行う（沈殿、洗浄、ＬＣＲ緩衝液中
への再懸濁およびリガーゼ酵素の添加を含む）。実施例
２とは違って、プローブＡ’およびＢ’のみを加え、プ
ローブＢは加えない。プローブＢの不在下では幾何級数
的増幅は起こらず、それゆえ、第二の一次増幅工程が開
始される。この一次反応は５０サイクル行い、この時点
で実施例１と同様にして反応を停止させ、新たな熱安定
リガーゼおよびプローブＢを加え、幾何級数的増幅を２
０〜５０サイクル行う。コントロールは前記実施例と同
様にして行ってよい。
【００３８】実施例４（ＩＭｘＲ装置での検出を伴う制
御増幅） 下記配列を有する二本鎖ＤＮＡ（ヒトパピローマウイル
スタイプ１６のＬ１領域から採取）を目的鎖として用い
、一次プレ増幅を行った。該配列は、単純化するため一
本鎖で示してあり、配列中のハイフンはライゲーション
部位を表している。
【化３】 目的配列のプレ増幅に使用するため、上記目的配列にハ
イブリダイズするように下記プローブセットを設計した
。これらプローブは標準法により合成した（Ｆｌ＝フル
オレセイン、Ｂｉｏ＝ビオチン）。
【化４】
【００３９】プローブ１７９．１の５’末端は、下記Ｉ
Ｍｘ　ＭＥＩＡアッセイに使用するためフルオレセイン
でハプテン化した（ｈａｐｔｅｎａｔｅｄ）。下記式：
【化５】 で示されるオリゴヌクレオチド（ＩＤ　Ｎｏ３）（式中
、ＸはアミノモディファイアーＩＩＴＭ（クロンテック
））（０．９Ａ２６０単位／μＬ）の溶液（１５μＬ）
を、暗所、室温にてホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
２；４８５μＬ）中に溶解したフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ、コダック；４ｍｇ）で１５時間
処理した。過剰のＦＩＴＣをＮＡＰ−５カラム（ファル
マシア）上で除き、溶離液をスピードバックＴＭ［サバ
ン・インスツルメンツ（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ）］上で容量１００μＬに濃縮した。
【００４０】この溶液をホルムアミド（２００μＬ）で
希釈し、試料を厚さ１．５ｍｍの１２％アクリルアミド
／８Ｍ尿素ゲル上、４０Ｗの定電力で電気泳動にかけて
分離した。５時間後に電気泳動を停止させ、ゲル上の生
成物バンドを長波ＵＶ陰影化により視覚化した。生成物
は非標識出発物質に比べて移動度が低かった。ＦＩＴＣ
−オリゴバンドを切り出し、１．０Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム（３ｍｌ）で一夜抽出し、得られた水性抽出
物を凍結乾燥した。残渣を蒸留水中で再構成し、ついで
ＮＡＰ−５で脱塩した。ハプテン化した後、得られたプ
ローブをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス、１
ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に１０１２分子／μＬに希釈した。
【００４１】５’アミノモディファイアーＩＩＴＭの代
わりに３’−アミノＣＰＧ（グレン・リサーチ）を用い
、プローブ１７９．２（ＩＤ　Ｎｏ４）の３’末端を上
記と同様にしてハプテン化した。このプローブをポリヌ
クレオチドキナーゼで処理し、１０１２分子／μＬに希
釈した。
【００４２】プローブ１７９．３の３’末端を下記のよ
うにしてハプテン化した。下記式：
【化６】 で示されるオリゴヌクレオチド（ＩＤ　Ｎｏ５）（式中
、Ｘは３’−アミノＣＰＧ（ＣＰＧ＝制御多孔質ガラス
；グレン・リサーチ））（０．３７８Ａ２６０単位／μ
Ｌ）の溶液（３５μＬ）を、１００ｍＭリン酸緩衝液／
ＤＭＦ（ｐＨ７．５）（２１５／２５０μＬ）中のビオ
チン−（アミノカプロイル）２−ＮＨＳ活性エステル（
クロンテック；１０ｍｇ）で室温にて１５時間処理した
。フルオレセインの場合と同じ手順および電気泳動によ
り短波ＵＶ陰影化で生成物バンドが得られ、このものは
出発物質よりも４塩基分だけ移動が遅かった。切り出し
および抽出を行い、フルオレセインの場合と同様にして
脱塩を行った。このプローブをポリヌクレオチドキナー
ゼおよびＡＴＰで処理して５’末端をリン酸化し、１０
１２分子／μＬに希釈した。
【００４３】プローブ１７９．４（ＩＤ　Ｎｏ６）の５
’末端を上記と同様にしてハプテン化し、１０１２分子
／μＬに希釈した。下記５０μＬ容量中で各一次プレ増
幅を行った。 （μＬ） ｄＨ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　３２．７５５×ＬＣＲ緩衝液　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０１
０ｍＭ　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．５１７９．１（１０１２分子／μＬ
）　　　　　　　　　　　　　０．５１７９．３（１０
１２分子／μＬ）　　　　　　　　　　　　　０．７５
目的鎖（種々の濃度）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１．５１×リガーゼ（１単位が１分間当
たり に１μＭのニックＤＮＡを封じる場合、２〜１０×１０
６単位）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５０．０
【００４４】
可能な場合は、一層大きなプール容量の反応容量から調
製し、これをアリコートに分割した。個々の各反応液に
鉱油（３０μＬ）を重層した。各反応アリコート（リガ
ーゼを除く）を１００℃に３分間供して目的鎖を変性さ
せ、ついで８５℃に３０秒間および５０℃に２０秒間供
した。ついで、リガーゼ（１μＬ）を加えた。このプレ
増幅反応を５０熱サイクル（８５℃で３０秒の後、５０
℃で２０秒）行った。
【００４５】ＬＣＲ幾何級数増幅相は、下記成分のプー
ルの３μＬアリコートを加えることにより行った。 ｄＨ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１．７５μＬ１７９．２（１０１２分子／μＬ）
　　　　０．７５μＬ１７９．４（１０１２分子／μＬ
）　　　　０．５μＬＬＣＲ反応は３０サイクル行った
。適当なコントロールについても行った。一次プレ増幅
を行う場合と行わない場合との比較条件下におけるＬＣ
Ｒを比較すると、図４に示すように一次プレ増幅は感度
を有意に高めた。
【００４６】実施例５（最初のプローブの濃度を減少さ
せること）本実施例では、平滑末端ライゲーションを制
御するための方法としてプローブの濃度を下げることに
よる鋳型依存ライゲーションを記載する。下記ストック
溶液を調製した。 ストック溶液＃１ 　　６．３μＬ　　　　１０×ＬＣＲ緩衝液　　４．５
μＬ　　　　１０ｍＭ　ＮＡＤ　　６．２μＬ　　　　
Ｈ２Ｏ 　　４．５μＬ　　　　１０１１オリゴヌクレオチド／
μＬの各プローブ１０．０μＬ　　　　Ｃｏｔ３２Ｐ−
（コルデシピン）標識プローブストック溶液＃２ 　　２．０μＬ　　　　１０×ＬＣＲ緩衝液　　４．４
μＬ　　　　１０１２オリゴヌクレオチド／μＬの各プ
ローブ
【００４７】溶液＃１（１０μＬ）のアリコート
を、バックグラウンドＤＮＡ（３．０μＬ）とともに、
目的鎖を用いまたは用いずに４つの各０．６５ｍｌ容エ
ッペンドルフチューブに入れた。ＬＣＲ反応を開始させ
、２０サイクル続けた。このチューブを遠心分離でしば
らく回転させ、９０℃に戻した。溶液＃２（４．０μＬ
）を各チューブに加え、標準ＬＣＲと同様にして温度サ
イクルを続けた。図５は、コントロール（標準ＬＣＲ）
および最初の制御（低濃度プローブ）ライゲーション（
「ＩＣＬ」と称する）を行った場合の結果を示す。
【００４８】実施例６（最初の制御反応としてのＰＣＲ
）プライマーＡおよびＢ（表１）を用い、幾つかの襄胞
性繊維症（ＣＦ）群から得たゲノムＤＮＡ試料からＣＦ
遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは３０サイクル
行った。各サイクルは、９４℃で６０秒間のインキュベ
ーション、６２℃で４３秒間のインキュベーション、お
よび７２℃で１２０秒間のインキュベーションからなっ
ていた。
【００４９】ＰＣＲの後、反応生成物を水で１：２００
に希釈し、１μＬアリコートをＬＣＲ反応の目的鎖とし
て、正常ＣＦ対立遺伝子および主要な欠損ＣＦ対立遺伝
子（３つのヌクレオチドが欠失している）［リオーダン
（Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
５：１０６６（１９８９）；ケレム（Ｋｅｒｅｍ，Ｂ．
）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５：１０７３（１９８９）］
に特異的なプローブセットとともに用いた。正常および
欠失ＣＦ対立遺伝子の増幅に用いるＬＣＲプローブは、
表１に示してある。プローブＣ’、Ｅ’およびＤ’を実
施例１と同様にしてリン酸化した。ＬＣＲを２５サイク
ル行った。各サイクルは、８５℃で３０秒間のインキュ
ベーション、および５０℃で２０秒間のインキュベーシ
ョンからなっていた。
【００５０】正常対立遺伝子の同定のため、オリゴヌク
レオチドＣ’およびＤを７．５×１０１１分子／反応に
て、およびオリゴヌクレオチドＥおよびＤ’を５×１０
１１分子／反応にて用いた。欠失対立遺伝子に対しても
、オリゴヌクレオチドＣ’およびＤを７．５×１０１１
分子／反応にて、およびオリゴヌクレオチドＥおよびＤ
’を５×１０１１分子／反応にて用いた。各場合の反応
容量は５０μＬであった。ＬＣＲの後、反応生成物をＩ
ＭｘＲＭＥＩＡアッセイにより分析した。選択した代表
的な結果を表２に示す。すべての患者で「ＰＣＲ陽性」
　であったが、ＬＣＲによりＣＦ対立遺伝子を有するキ
ャリヤをＣＦ対立遺伝子を有しないキャリヤから識別す
ることができた。
【００５１】本実施例は、正常対立遺伝子を「真の」目
的鎖とし欠失対立遺伝子を偽りの伸長とみた場合に本発
明の改良を示している。表１
【表１】 表２
【表２】 他の態様も本発明に包含される。たとえば、実施例５の
低濃度プローブ制御増幅を上記偏重増幅工程の１または
２以上と組み合わせることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】　　本発明の１実施態様における一次プレ増幅
工程を示す模式図である。
【図２】　　一次プレ増幅工程の後に行うＬＣＲを示す
模式図である。
【図３】　　本発明の第二の実施態様における一次プレ
増幅工程を示す模式図である。
【図４】　　実施例４におけるアッセイの結果を示すグ
ラフである。
【図５】　　実施例５におけるアッセイの結果を示すグ
ラフである。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　試料中の目的核酸に対してリガーゼ連
    鎖反応（ＬＣＲ）を行う方法において、該ＬＣＲを行う
    前に第一鋳型依存制御反応により、該目的核酸の存在下
    で選択的に該ＬＣＲにおいて鋳型として機能し得る分子
    集団を増加させ、該目的核酸の不在下で該ＬＣＲにおい
    て機能し得る有害量の鋳型分子の生成を実質的に防ぎ、
    該鋳型依存制御反応が、目的鎖にハイブリダイズし得る
    ライゲート可能な第一セットの核酸プローブを、目的鎖
    の相補体またはライゲートした第一プローブにハイブリ
    ダイズし得るライゲート可能な第二セットのプローブに
    対して実質的に過剰量にて供給し、ついで、該第一セッ
    トのプローブを鋳型依存的にライゲートさせることから
    なり、該制御反応において該第二セットのプローブを、
    目的鎖とは独立な有害なライゲーションを実質的に防ぐ
    のに充分な低濃度にて供給する、ことを特徴とする方法
    。
  2. 【請求項２】　　該制御反応において目的相補鎖の配列
    を含有する増幅生成物は実質的に生成されず、該第一制
    御反応のための実質的に唯一の鋳型が該目的核酸である
    、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】　　該第一制御反応に使用した容器とは別
    の容器において同時平行鋳型依存制御反応をさらに行い
    、該同時平行制御反応が、該目的相補鎖に対応する配列
    を含有する生成物を選択的に生成させ該目的鎖に対応す
    る配列を含有する生成物は実質的に生成させないように
    偏重させた反応からなり、該第一制御反応の生成物を該
    同時平行制御反応の生成物と混合する工程をさらに含み
    、該混合物においてＬＣＲを行う、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】　　該鋳型依存制御反応が、該ＬＣＲプロ
    ーブのセットのうち少なくとも一方のセットを平滑末端
    ライゲーションを実質的になくすのに充分に低い濃度で
    使用したリガーゼ連鎖反応からなる、請求項１に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】　　一方のプローブのセットの濃度が他方
    のプローブのセットの濃度の約１０倍である、請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】　　反応容器の容量が２０〜５０μｌであ
    り、該一方のセットのＬＣＲプローブについての両プロ
    ーブの濃度が１０１１分子以下である、請求項４に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】　　該制御反応が、鋳型依存重合工程およ
    び鋳型依存ライゲーション工程からなり、該ライゲーシ
    ョン工程が、有害量の平滑末端ライゲーション生成物を
    実質的に生成させない鋳型依存ライゲーションからなる
    、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】　　該重合工程を第一に行い、該ライゲー
    ション工程を第二に行う、請求項７に記載の方法。
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