JPH06343498A - 核酸プローブ及び核酸検出方法 - Google Patents
核酸プローブ及び核酸検出方法Info
- Publication number
- JPH06343498A JPH06343498A JP13364093A JP13364093A JPH06343498A JP H06343498 A JPH06343498 A JP H06343498A JP 13364093 A JP13364093 A JP 13364093A JP 13364093 A JP13364093 A JP 13364093A JP H06343498 A JPH06343498 A JP H06343498A
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- Japan
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- nucleic acid
- pcr
- sequence
- acid probe
- probe
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試料の塩基配列のうち既知の部分が数十塩基
程度でもＰＣＲによる増幅を利用した核酸プローブによ
る標的核酸の検出を可能とする方法を提供すること。 【構成】 核酸プローブにＰＣＲ用プライマーがアニー
ルする部分を規定するＰＣＲ用配列のセットをＰＣＲに
必要な間隔で予め設けておく。
程度でもＰＣＲによる増幅を利用した核酸プローブによ
る標的核酸の検出を可能とする方法を提供すること。 【構成】 核酸プローブにＰＣＲ用プライマーがアニー
ルする部分を規定するＰＣＲ用配列のセットをＰＣＲに
必要な間隔で予め設けておく。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸プローブ及び該プ
ローブを用いた核酸検出方法に関する。
ローブを用いた核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一本鎖のＤＮＡやＲＮＡが互いに相補性
を有している場合、相補性を有する部分が結合して二本
鎖となりハイブリッドを形成する。このハイブリダイゼ
ーション反応を利用した核酸の検出や定量のための方法
としてサザン法等の種々の方法があり、遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニン
グ、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺
伝子工学的手法における基本技術の一つとなっている。
を有している場合、相補性を有する部分が結合して二本
鎖となりハイブリッドを形成する。このハイブリダイゼ
ーション反応を利用した核酸の検出や定量のための方法
としてサザン法等の種々の方法があり、遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニン
グ、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺
伝子工学的手法における基本技術の一つとなっている。
【０００３】核酸のハイブリダイゼーションを利用した
分析方法としては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブに
ハイブリッドの検出のための標識を施し、これを試料核
酸とハイブリダイズさせ、形成されるハイブリッドをプ
ローブに付与した標識を利用して検出する方法が一般的
である。
分析方法としては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブに
ハイブリッドの検出のための標識を施し、これを試料核
酸とハイブリダイズさせ、形成されるハイブリッドをプ
ローブに付与した標識を利用して検出する方法が一般的
である。
【０００４】しかし、試料が極めて微量な場合などは検
出が困難となるという問題がある。このような問題を克
服する一つの方法としては、発色や蛍光等の検出に利用
する特性の強度が高い標識を用いる方法や、標識の特性
を増幅させる方法などが開発されている。
出が困難となるという問題がある。このような問題を克
服する一つの方法としては、発色や蛍光等の検出に利用
する特性の強度が高い標識を用いる方法や、標識の特性
を増幅させる方法などが開発されている。
【０００５】また、これとは別のアプローチとして、試
料自体を増幅した後に、核酸プローブとのハイブリダイ
ゼーションを行うという方法もある。この試料の増幅手
法として最も成功を収めているのが、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；
Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３３１，１９８８；特開昭
６２−２１４３５５号公報；特開昭６２−２４０８６２
号公報；Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ．Ｂ．＆Ｆａｌｏｏｎａ，
Ｆ．Ａ．：Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍ．；１５５，，３
３５〜３５０，１９８７等参照）である。ＰＣＲの原理
は非常に簡単であり、まず増幅したい領域を含んだ２本
鎖ＤＮＡを熱変性し、得られた一本鎖ＤＮＡの増幅させ
たい領域の３’末端部のそれぞれにＰＣＲ用のプライマ
ーをアニールさせる。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用い
てアニールした３’側のプライマーを出発点として５’
方向に一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを伸長させ、相
補鎖を合成する。ここまでの工程を１サイクルとし、一
本鎖化のための熱変性から相補鎖合成までの工程を繰り
返すことによって２種のプライマーで挟まれた部分の配
列を１サイクル毎に倍々に増幅させることができる。例
えば、サイクルを２５回も繰り返すと、理論的には
２25、すなわち１００万倍以上に増幅されることにな
る。この原理を応用したものは既に商品化され、必要試
薬とともにキットとして得られている（例えばＧｅｎｅ
ＡｍｐTM：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）。
料自体を増幅した後に、核酸プローブとのハイブリダイ
ゼーションを行うという方法もある。この試料の増幅手
法として最も成功を収めているのが、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；
Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３３１，１９８８；特開昭
６２−２１４３５５号公報；特開昭６２−２４０８６２
号公報；Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ．Ｂ．＆Ｆａｌｏｏｎａ，
Ｆ．Ａ．：Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍ．；１５５，，３
３５〜３５０，１９８７等参照）である。ＰＣＲの原理
は非常に簡単であり、まず増幅したい領域を含んだ２本
鎖ＤＮＡを熱変性し、得られた一本鎖ＤＮＡの増幅させ
たい領域の３’末端部のそれぞれにＰＣＲ用のプライマ
ーをアニールさせる。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用い
てアニールした３’側のプライマーを出発点として５’
方向に一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを伸長させ、相
補鎖を合成する。ここまでの工程を１サイクルとし、一
本鎖化のための熱変性から相補鎖合成までの工程を繰り
返すことによって２種のプライマーで挟まれた部分の配
列を１サイクル毎に倍々に増幅させることができる。例
えば、サイクルを２５回も繰り返すと、理論的には
２25、すなわち１００万倍以上に増幅されることにな
る。この原理を応用したものは既に商品化され、必要試
薬とともにキットとして得られている（例えばＧｅｎｅ
ＡｍｐTM：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】このように、ＰＣＲ
は、試料が少ない場合の核酸検出において非常に有力な
方法であるが、先に説明したように２種のプライマーを
用意する必要があり、このプライマーで挟まれる領域の
長さが数百塩基とある程度限定される。このことは、プ
ライマーがアニールする試料中の２つの領域が既知であ
り、しかもこれらの領域の間隔が数百塩基である必要が
あることを示している。従って、例えば、試料の塩基配
列の長さが短い場合や、試料の塩基配列のうち２０塩基
程度しかわかっていない場合には、ＰＣＲ法が適用しに
くいという問題がある。
は、試料が少ない場合の核酸検出において非常に有力な
方法であるが、先に説明したように２種のプライマーを
用意する必要があり、このプライマーで挟まれる領域の
長さが数百塩基とある程度限定される。このことは、プ
ライマーがアニールする試料中の２つの領域が既知であ
り、しかもこれらの領域の間隔が数百塩基である必要が
あることを示している。従って、例えば、試料の塩基配
列の長さが短い場合や、試料の塩基配列のうち２０塩基
程度しかわかっていない場合には、ＰＣＲ法が適用しに
くいという問題がある。
【０００７】また、試料の有する塩基配列は多種多様で
あり、適当なＰＣＲ用プライマーを選択するための煩雑
な操作を必要とする場合も多い。
あり、適当なＰＣＲ用プライマーを選択するための煩雑
な操作を必要とする場合も多い。
【０００８】本発明は上記課題を解決すべくなされたも
のであり、核酸プローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによる標的核酸の検出に、ＰＣＲによる検出情報の増
幅を常に簡便に行える核酸検出方法および該方法に用い
る核酸プローブを提供することを目的とする。
のであり、核酸プローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによる標的核酸の検出に、ＰＣＲによる検出情報の増
幅を常に簡便に行える核酸検出方法および該方法に用い
る核酸プローブを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の核酸プローブ
は、標的核酸とハイブリダイズし得る検出用配列と、両
端がＰＣＲ用配列で規定されたＰＣＲで増幅される領域
を有することを特徴とする。
は、標的核酸とハイブリダイズし得る検出用配列と、両
端がＰＣＲ用配列で規定されたＰＣＲで増幅される領域
を有することを特徴とする。
【００１０】本発明の核酸プローブの有する検出用配列
は、検出対象としての標的核酸の有する塩基配列とハイ
ブリダイズするものであり、この塩基配列を利用して検
出が行われる。一方、ＰＣＲ用配列は、ＰＣＲ時におい
てＰＣＲ用プライマーがアニールする部分を規定するも
のであり、このＰＣＲ用配列が予めセットされているこ
とで、標的核酸の塩基配列に関係なく検出情報のＰＣＲ
による増幅を容易に行うことができ、しかもＰＣＲ用プ
ライマーの配列は、ＰＣＲ用配列に応じて予め決められ
ているので、標的核酸に応じたＰＣＲ用プライマーの選
択の必要はなくなる。
は、検出対象としての標的核酸の有する塩基配列とハイ
ブリダイズするものであり、この塩基配列を利用して検
出が行われる。一方、ＰＣＲ用配列は、ＰＣＲ時におい
てＰＣＲ用プライマーがアニールする部分を規定するも
のであり、このＰＣＲ用配列が予めセットされているこ
とで、標的核酸の塩基配列に関係なく検出情報のＰＣＲ
による増幅を容易に行うことができ、しかもＰＣＲ用プ
ライマーの配列は、ＰＣＲ用配列に応じて予め決められ
ているので、標的核酸に応じたＰＣＲ用プライマーの選
択の必要はなくなる。
【００１１】本発明の核酸プローブの基本構成を図１、
図２（ａ）〜（ｃ）に示す。図１の核酸プローブは、標
的核酸の有する配列と相補的な配列からなり、標的核酸
とハイブリダイズする検出用配列１と、ＰＣＲで増幅さ
れる領域４を規定するＰＣＲ用配列２、３とを有する。
なお、ＰＣＲ用配列２、３のうち３’側に位置する部分
に第１のＰＣＲ用プライマーがアニールし、５’側のＰ
ＣＲ用配列は、二本鎖形成反応で得られた５’側のＰＣ
Ｒ用配列に対する相補鎖に第２のＰＣＲ用プライマーが
アニールすることになる。
図２（ａ）〜（ｃ）に示す。図１の核酸プローブは、標
的核酸の有する配列と相補的な配列からなり、標的核酸
とハイブリダイズする検出用配列１と、ＰＣＲで増幅さ
れる領域４を規定するＰＣＲ用配列２、３とを有する。
なお、ＰＣＲ用配列２、３のうち３’側に位置する部分
に第１のＰＣＲ用プライマーがアニールし、５’側のＰ
ＣＲ用配列は、二本鎖形成反応で得られた５’側のＰＣ
Ｒ用配列に対する相補鎖に第２のＰＣＲ用プライマーが
アニールすることになる。
【００１２】ＰＣＲ用配列２は、図２（ａ）及び（ｂ）
に示すように、検出用配列１と重複したり、一つの配列
が検出用配列１とＰＣＲ用配列とを兼ねるようにするこ
ともできる。更に、図２（ｃ）のようにＰＣＲ用配列を
２以上設けて複数の増幅領域４、４’を設定しておき、
必要に応じてそのひとつをプライマーの選択により増幅
させてもよい。
に示すように、検出用配列１と重複したり、一つの配列
が検出用配列１とＰＣＲ用配列とを兼ねるようにするこ
ともできる。更に、図２（ｃ）のようにＰＣＲ用配列を
２以上設けて複数の増幅領域４、４’を設定しておき、
必要に応じてそのひとつをプライマーの選択により増幅
させてもよい。
【００１３】増幅領域４の長さは、ＰＣＲにおいて良好
な増幅が行える程度され、例えば３００〜７００塩基程
度が望ましい。
な増幅が行える程度され、例えば３００〜７００塩基程
度が望ましい。
【００１４】本発明の核酸プローブは、合成された核
酸、自然界から分離した核酸、自然界から分離した核酸
に合成部分を追加したもの、各種の修飾を行ったものな
ど目的に応じて使用できる。
酸、自然界から分離した核酸、自然界から分離した核酸
に合成部分を追加したもの、各種の修飾を行ったものな
ど目的に応じて使用できる。
【００１５】以上の構成の本発明の核酸プローブを用い
た標的核酸の検出は例えば以下のようにして行うことが
できる。例えば、図１の構成の核酸プローブを用いる場
合には、まず、図３（ａ）に示すように、試料を適当な
担体５に固定し、これを核酸プローブ６を含む溶液と反
応させる。この反応により、図３（ｂ）に示すように、
担体５上に標的核酸７が存在すれば、これに核酸プロー
ブ６がハイブリダイズしてハイブリッド体が形成され
る。次に、担体７を適当な溶液で洗浄することで、未反
応の核酸プローブと標的核酸にハイブリダイズした核酸
プローブとを分離し、図３（ｃ）で示す状態を得ること
ができる。これらの（ａ）〜（ｃ）の操作には、公知の
ハイブリダイゼーションのための操作が利用できる。次
に、図３（ｄ）に示すように、核酸プローブ６の有する
ＰＣＲ用配列を利用したＰＣＲを可能とする２種のプラ
イマーを用いたＰＣＲ反応を担体５上に固定されている
ハイブリッド体に対して行い、核酸プローブ６の有する
増幅領域の増幅を行い、図３（ｅ）に示すように増幅さ
れた核酸１０得る。この増幅された核酸１０を回収し、
電気泳動などで分析することで、標的核酸が試料中に存
在していたことが確認できる。なお、ＰＣＲを行う前
に、担体に固定された標的核酸に結合しているプローブ
核酸を標的核酸から解離させて、これにＰＣＲをかけて
も良い。この核酸プローブの解離には、加熱等が利用で
きる。
た標的核酸の検出は例えば以下のようにして行うことが
できる。例えば、図１の構成の核酸プローブを用いる場
合には、まず、図３（ａ）に示すように、試料を適当な
担体５に固定し、これを核酸プローブ６を含む溶液と反
応させる。この反応により、図３（ｂ）に示すように、
担体５上に標的核酸７が存在すれば、これに核酸プロー
ブ６がハイブリダイズしてハイブリッド体が形成され
る。次に、担体７を適当な溶液で洗浄することで、未反
応の核酸プローブと標的核酸にハイブリダイズした核酸
プローブとを分離し、図３（ｃ）で示す状態を得ること
ができる。これらの（ａ）〜（ｃ）の操作には、公知の
ハイブリダイゼーションのための操作が利用できる。次
に、図３（ｄ）に示すように、核酸プローブ６の有する
ＰＣＲ用配列を利用したＰＣＲを可能とする２種のプラ
イマーを用いたＰＣＲ反応を担体５上に固定されている
ハイブリッド体に対して行い、核酸プローブ６の有する
増幅領域の増幅を行い、図３（ｅ）に示すように増幅さ
れた核酸１０得る。この増幅された核酸１０を回収し、
電気泳動などで分析することで、標的核酸が試料中に存
在していたことが確認できる。なお、ＰＣＲを行う前
に、担体に固定された標的核酸に結合しているプローブ
核酸を標的核酸から解離させて、これにＰＣＲをかけて
も良い。この核酸プローブの解離には、加熱等が利用で
きる。
【００１６】図１（ａ）及び（ｂ）に示した構成の核酸
プローブでは、標的核酸とハイブリダイズする部分とＰ
ＣＲで増幅される部分が重複しているので、図３に示す
工程において、図３（ｃ）の工程後に、図４（ａ）、
（ｂ）に示すように核酸プローブの標的核酸からの分離
操作を行い、分離された核酸プローブにＰＣＲをかけ
る。いずれにしても、担体に固定された標的核酸から核
酸プローブを分離して、これにＰＣＲをかけることで、
ＰＣＲ用のプライマーが担体に固定された試料とミスア
ニールすることを防ぐことができるので好ましい。
プローブでは、標的核酸とハイブリダイズする部分とＰ
ＣＲで増幅される部分が重複しているので、図３に示す
工程において、図３（ｃ）の工程後に、図４（ａ）、
（ｂ）に示すように核酸プローブの標的核酸からの分離
操作を行い、分離された核酸プローブにＰＣＲをかけ
る。いずれにしても、担体に固定された標的核酸から核
酸プローブを分離して、これにＰＣＲをかけることで、
ＰＣＲ用のプライマーが担体に固定された試料とミスア
ニールすることを防ぐことができるので好ましい。
【００１７】ＰＣＲに用いるプライマーとしては、核酸
プローブのＰＣＲ用配列のうち、増幅される領域の３’
端領域にあるものに対して相補的な配列を有するもの
と、増幅される領域の５’端領域にあるものと同じ配列
を有するものの２種のプライマーが用いられる。ＰＣＲ
反応には、公知の方法が利用できる。
プローブのＰＣＲ用配列のうち、増幅される領域の３’
端領域にあるものに対して相補的な配列を有するもの
と、増幅される領域の５’端領域にあるものと同じ配列
を有するものの２種のプライマーが用いられる。ＰＣＲ
反応には、公知の方法が利用できる。
【００１８】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する
が、これらは本発明の範囲をなんら限定するものではな
い。
が、これらは本発明の範囲をなんら限定するものではな
い。
【００１９】実施例１（核酸プローブの作成） 以下に示す配列（配列番号：１〜４）の４種のオリゴヌ
クレオチド（一本鎖ＤＮＡ）をそれぞれ個々にＤＮＡ合
成装置（ＡＢＩ社、３８１型）により合成した。 配列番号：１ 5' GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCGCTAGAGT
AAGTAGTT 3' 配列番号：２ 5' TATATATATATAGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATAACTACTTACTCTAGC 3' 配列番号：３ 5' TATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCGCGCGCGCGCGC 3' 配列番号：４ 5' AAACGACGAGCGTGACGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATCGCGCGCGCGCG 3' 次に、容器内で、上記の４種のオリゴヌクレオチド（各
２μｇ）に、１０×アニーリング溶液（１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６０ｍＭ ＭｇＣｌ2、
６０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）５μｌを加え、更に蒸留水にて全量を５０μｌ
に調製した。この容器を６５℃の温水の入ったビーカー
の中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり
冷却した（所要時間約１時間）。この反応により、オリ
ゴヌクレオチドにおける相補的な配列間（下線部分）で
のアニールを生じさせた。次に、この溶液５０μｌに、
１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ及び１ｍＭ ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）及び１０×
アニーリング溶液の５μｌを加え、更に蒸留水にて全量
を１００μｌに調製した。よく混和した後、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を
加え、３７℃で１時間反応させ、伸展反応を行い、反応
混合液から以下に示すプラスミドｐＵＣ１９有する塩基
配列と相補的な配列を含む下記の配列（配列番号：５）
を有する二本鎖ＤＮＡをゲル電気泳動で単離し、ゲルか
ら分離、抽出した。 配列番号：５ 5' GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCGCTAGAGT
AAGTAGTTATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC
ATGCTATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC
ATGCATGCATGCGCGCGCGCGCGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCGTCACGCTCGTCGTTT 3' 実施例２（検出例） プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
クレオチド（一本鎖ＤＮＡ）をそれぞれ個々にＤＮＡ合
成装置（ＡＢＩ社、３８１型）により合成した。 配列番号：１ 5' GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCGCTAGAGT
AAGTAGTT 3' 配列番号：２ 5' TATATATATATAGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATAACTACTTACTCTAGC 3' 配列番号：３ 5' TATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATG
CATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCGCGCGCGCGCGC 3' 配列番号：４ 5' AAACGACGAGCGTGACGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA
TGCATGCATGCATGCATCGCGCGCGCGCG 3' 次に、容器内で、上記の４種のオリゴヌクレオチド（各
２μｇ）に、１０×アニーリング溶液（１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６０ｍＭ ＭｇＣｌ2、
６０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）５μｌを加え、更に蒸留水にて全量を５０μｌ
に調製した。この容器を６５℃の温水の入ったビーカー
の中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり
冷却した（所要時間約１時間）。この反応により、オリ
ゴヌクレオチドにおける相補的な配列間（下線部分）で
のアニールを生じさせた。次に、この溶液５０μｌに、
１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ及び１ｍＭ ｄＣＴＰの溶液（各２μｌ）及び１０×
アニーリング溶液の５μｌを加え、更に蒸留水にて全量
を１００μｌに調製した。よく混和した後、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片（ＴＯＹＯＢＯ）１６単位を
加え、３７℃で１時間反応させ、伸展反応を行い、反応
混合液から以下に示すプラスミドｐＵＣ１９有する塩基
配列と相補的な配列を含む下記の配列（配列番号：５）
を有する二本鎖ＤＮＡをゲル電気泳動で単離し、ゲルか
ら分離、抽出した。 配列番号：５ 5' GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCGCTAGAGT
AAGTAGTTATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC
ATGCTATATATATATAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC
ATGCATGCATGCGCGCGCGCGCGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAT
GCATGCATGCATGCATGCATGCGTCACGCTCGTCGTTT 3' 実施例２（検出例） プラスミドｐＵＣ１９と、大腸菌ＪＭ１０９及びＨＢ１
０１株からそれぞれ常法により調製した全ＤＮＡを試料
として個々に用い以下の操作を行った。
【００２０】試料１μｇ／３μｌをニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成した核酸プローブ２μｇに１０×アニーリ
ング溶液５００μｌを加え、全量を蒸留水で５０００μ
ｌとした溶液に、このフィルターを浸漬した。これを６
５℃の温水の入ったビーカーの中で１０分間加温し、そ
の後室温になるまでゆっくり冷ました（所要時間：約１
時間）。この反応で相補的な配列の部分で二本鎖が形成
される。フィルターを溶液から取出し、蒸留水で二度洗
浄して過剰なプローブを取り除いた後、１０００μｌの
Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）バッファ溶液に
浸漬し、９５℃、５分間加温し、素早くフィルターを取
り除いた。この加温操作で、試料中に標的核酸が含ま
れ、これにプローブがハイブリッドしている場合に、溶
液中にプローブが遊離する。
ィルター（シュライヒャーシャネル）にスポットした。
自然乾燥後８０℃、２時間の焼付けを行った。次に、実
施例１で合成した核酸プローブ２μｇに１０×アニーリ
ング溶液５００μｌを加え、全量を蒸留水で５０００μ
ｌとした溶液に、このフィルターを浸漬した。これを６
５℃の温水の入ったビーカーの中で１０分間加温し、そ
の後室温になるまでゆっくり冷ました（所要時間：約１
時間）。この反応で相補的な配列の部分で二本鎖が形成
される。フィルターを溶液から取出し、蒸留水で二度洗
浄して過剰なプローブを取り除いた後、１０００μｌの
Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）バッファ溶液に
浸漬し、９５℃、５分間加温し、素早くフィルターを取
り除いた。この加温操作で、試料中に標的核酸が含ま
れ、これにプローブがハイブリッドしている場合に、溶
液中にプローブが遊離する。
【００２１】次に、フィルターを取り除いたＰＣＲ溶液
を、ＰＣＲ反応用チューブに写し、これに以下のＰＣＲ
用プライマーを入れ（各３００ｎＭ、２μｌ）、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコルに従ってＰＣ
Ｒ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：CCCTTCCCAACAGTTG（合成ＤＮＡ）（配列番号６）
またはGCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） ＰＣＲ反応には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のサーマ
ルサイクラーを用い、以下の温度サイクルを使用した。
を、ＰＣＲ反応用チューブに写し、これに以下のＰＣＲ
用プライマーを入れ（各３００ｎＭ、２μｌ）、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐTM（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコルに従ってＰＣ
Ｒ反応を行った。 ＰＣＲ用プライマー Ｐ１：CCCTTCCCAACAGTTG（合成ＤＮＡ）（配列番号６）
またはGCTAGAGTAAGTAGTT（合成ＤＮＡ）（配列番号７） Ｐ２：AACGACGAGCGTGAC（ＴＡＫＡＲＡ）（配列番号
８） ＰＣＲ反応には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のサーマ
ルサイクラーを用い、以下の温度サイクルを使用した。
【００２２】９０℃３分間の初期熱変性をした後、９０
℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間の工程を２５サ
イクル行い、最後に７２℃で１０分間行った。
℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間の工程を２５サ
イクル行い、最後に７２℃で１０分間行った。
【００２３】ＰＣＲ反応終了後、チューブから反応液を
取り、電気泳動法により展開して分析した。大腸菌ＪＭ
１０９株及びＨＢ１０１株からの試料のレーンではバン
ドは認められなかったが、プラスミドｐＵＣ１９のレー
ンでは約０．３ｋｂ付近にバンドが認められ、プローブ
中の増幅領域がＰＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵ
Ｃ１９の試料をプローブで検出できることが確認され
た。
取り、電気泳動法により展開して分析した。大腸菌ＪＭ
１０９株及びＨＢ１０１株からの試料のレーンではバン
ドは認められなかったが、プラスミドｐＵＣ１９のレー
ンでは約０．３ｋｂ付近にバンドが認められ、プローブ
中の増幅領域がＰＣＲで増幅されたこと、すなわちｐＵ
Ｃ１９の試料をプローブで検出できることが確認され
た。
【００２４】
【発明の効果】本発明の核酸プローブの構成によれば、
核酸プローブ中に予めＰＣＲ用プライマーがアニールす
る部分を規定するＰＣＲ用配列がセットされているの
で、ＰＣＲ用プライマーとして該ＰＣＲ用配列に対応す
るものを用意すればよく、試料に応じてＰＣＲ用プライ
マーをその都度選択する必要がなくなり、分析操作の簡
便化が図れる。また、このようなＰＣＲ用配列を核酸プ
ローブに予めセットしたことで、数１０塩基程度しか既
知でない核酸試料に対してもＰＣＲ反応は適用でき、高
感度な検出が可能となる。
核酸プローブ中に予めＰＣＲ用プライマーがアニールす
る部分を規定するＰＣＲ用配列がセットされているの
で、ＰＣＲ用プライマーとして該ＰＣＲ用配列に対応す
るものを用意すればよく、試料に応じてＰＣＲ用プライ
マーをその都度選択する必要がなくなり、分析操作の簡
便化が図れる。また、このようなＰＣＲ用配列を核酸プ
ローブに予めセットしたことで、数１０塩基程度しか既
知でない核酸試料に対してもＰＣＲ反応は適用でき、高
感度な検出が可能となる。
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ：１０５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GATGCATGCA TGCATGCATG 60 CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCG CTAGAGTAAG TAGTT 105 配列番号：２ 配列の長さ：１２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATATATATA TAGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT 60 GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATAA CTACTTACTC 120 TAGC 124 配列番号：３ 配列の長さ：１２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATATATATA TAATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC 60 ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCGC GCGCGCGCGC 120 配列番号：４ 配列の長さ：７６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAACGACGAG CGTGACGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT GCATGCATGC ATGCATGCAT 60 GCATCGCGCG CGCGCG 76 配列番号：５ 配列の長さ：３８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GATGCATGCA TGCATGCATG 60 CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCG CTAGAGTAAG TAGTTATGCA TGCATGCATG 120 CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCA TGCATGCATG 180 CATGCATGCA TGCATGCATG CTATATATAT ATAATGCATG CATGCATGCA TGCATGCATG 240 CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCA TGCATGCATG 300 CATGCATGCG CGCGCGCGCG CATGCATGCA TGCATGCATG CATGCATGCA TGCATGCATG 360 CATGCATGCG TCACGCTCGT CGTTT 385 配列番号：６ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCTTCCCAA CAGTTG 16 配列番号：７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTAGAGTAA GTAGTT 配列番号：８ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACGACGAGC GTGAC
【図１】本発明の核酸プローブの構成を示す図である。
【図２】本発明の核酸プローブの他の構成を示す図であ
り、（ａ）は検出用配列とＰＣＲ用配列の１つが重複し
ている構成、（ｂ）は検出用配列とＰＣＲ用配列の１つ
が同一である構成、（ｃ）はＰＣＲ用配列が３つある構
成をそれぞれ示す。
り、（ａ）は検出用配列とＰＣＲ用配列の１つが重複し
ている構成、（ｂ）は検出用配列とＰＣＲ用配列の１つ
が同一である構成、（ｃ）はＰＣＲ用配列が３つある構
成をそれぞれ示す。
【図３】本発明の核酸検出方法を説明する模式図であ
り、図中（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ）の手
順で操作を行うことを示す。
り、図中（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ）の手
順で操作を行うことを示す。
【図４】本発明の核酸検出方法における過程を示す図で
あり、（ａ）は担体上のハイブリッド体からの核酸プロ
ーブの分離過程を、（ｂ）は分離された核酸プローブを
用いたＰＣＲをそれぞれ示す。
あり、（ａ）は担体上のハイブリッド体からの核酸プロ
ーブの分離過程を、（ｂ）は分離された核酸プローブを
用いたＰＣＲをそれぞれ示す。
１ 検出用配列 ２、３、３’ ＰＣＲ用配列 ４、４’ 増幅領域 ５ 担体 ６ 核酸プローブ ７ 標的核酸 ８、９ ＰＣＲ用プライマー １０ 増幅された核酸断片
Claims (6)
- 【請求項１】 標的核酸とハイブリダイズし得る検出用
配列と、両端がＰＣＲ用配列で規定されたＰＣＲで増幅
される領域を有することを特徴とする核酸プローブ。 - 【請求項２】 検出用配列とＰＣＲで増幅される領域と
が重複部分を有する請求項１に記載の核酸プローブ。 - 【請求項３】 検出用配列がＰＣＲ用配列の一方を兼ね
ている請求項２に記載の核酸プローブ。 - 【請求項４】 標的核酸の核酸プローブを用いた検出方
法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸プロ
ーブと試料とを水性媒体中で反応させる過程と、該試料
中に標的核酸が含まれていた場合に形成される核酸プロ
ーブと標的核酸のハイブリッド体を未反応の核酸プロー
ブと分離する過程と、該ハイブリッド体に、該ハイブリ
ッド体を構成する核酸プローブの有するＰＣＲ用配列に
対応するプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ用配
列で規定された領域を増幅する過程と、該ＰＣＲにより
増幅された核酸断片を検出する過程とを有することを特
徴とする核酸検出方法。 - 【請求項５】 未反応の核酸プローブと分離されたハイ
ブリッド体から核酸プローブを分離してＰＣＲにかける
請求項３に記載の核酸検出方法。 - 【請求項６】 ハイブリッド体からの核酸プローブの分
離が加熱処理による請求項４に記載の核酸検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13364093A JPH06343498A (ja) | 1993-06-03 | 1993-06-03 | 核酸プローブ及び核酸検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13364093A JPH06343498A (ja) | 1993-06-03 | 1993-06-03 | 核酸プローブ及び核酸検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343498A true JPH06343498A (ja) | 1994-12-20 |
Family
ID=15109550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13364093A Pending JPH06343498A (ja) | 1993-06-03 | 1993-06-03 | 核酸プローブ及び核酸検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06343498A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989012946A1 (en) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | E W D, Electronic-Werke Deutschland Gmbh | Passive loudspeaker enclosure for television receiver |
-
1993
- 1993-06-03 JP JP13364093A patent/JPH06343498A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989012946A1 (en) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | E W D, Electronic-Werke Deutschland Gmbh | Passive loudspeaker enclosure for television receiver |
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