JPH09507642A

JPH09507642A - 核酸のフィンガープリンティング、生成物および方法

Info

Publication number: JPH09507642A
Application number: JP7528536A
Authority: JP
Inventors: カエタノ−アノレス，グスタボ; バッサム，ブラント・ジェイ; グレッショフ，ピーター・エム
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・コーポレーション
Priority date: 1993-10-20
Filing date: 1994-10-18
Publication date: 1997-08-05
Also published as: CA2174748A1; EP0725835A1; AU8083794A; WO1995033853A1; US6074818A

Abstract

(57)【要約】核酸フィンガープリンティングの改良を開示する。この方法は核酸分析の信頼性が向上したプロフィールを生成する。新規プライマーおよび他の手段も示される。有用生成物が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】核酸のフィンガープリンティング、生成物および方法発明の分野本発明は、核酸「核酸のフィンガープリンティング」に関する。関連特許出願本特許出願は、１９９３年１月１９日出願、発明の名称「ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング」、発明者「Gustavo Caetano-Anolles，Brant BassamおよびP eter Gresshoff」の係属中の特許出願第０８／００６，３８０号の一部継続出願である。この出願、即ち「第１の親」出願は参考文献として本明細書中に取り込まれる。この方法は、「ＤＡＦ」というニックネームを有している。それは、現在知られている中でフィンガープリンティング生成物の最高の解像を提供する。本出願はまた、１９９１年３月２８日出願、発明の名称「ＤＮＡの銀染色」、発明者「Gustavo Caetano-Anolles，Brant BassamおよびPeter Gresshoff」の第０７／６７６，８６９号（「第２の親」出願）の一部継続出願であり、この出願も参考文献として本明細書中に取り込まれる。発明の背景少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用してＤＮＡ鋳型の任意の断片をプライマー伸長して、増幅フラグメントの特徴的セットを生成させるＤＮＡフィンガープリンティングのための新規方法は、遺伝的関係の分析における価値が増大していることが示されている。フィンガープリントの複雑性は、非常に簡単で、ゲノムマッピングに理想的なものから、高度に複雑でフィンガープリンティングにより適したものまで多様である。参考文献として本明細書中に取り込まれ、添付する（証拠１）、Bio/Technology，Vol．10: 937，１９９２年９月を参照されたし。ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）は、ＤＮＡの任意の領域の酵素的増幅であり、このＤＮＡに任意の配列の短いオリゴヌクレオチドプライマーが向けられ、複雑であるが特徴的なＤＮＡフィンガープリントを生成する。本発明者により提唱される制限機構は、「任意オリゴヌクレオチドプライマーによるＤＮＡの増幅（Amplifying DNA with Arbitrary Oligonucleotide Primers）」、評論、1993、Cold Spring Harbor Laboratory Press中に見られ、これは参考文献として本明細書中に取り込まれ、本明細書に添付する（証拠２）。第２および３頁に記載されている段階的（step by step）増幅の記載は特に興味深い。本発明に関連して用いられる用語および専門用語は当技術分野で既知である。例えば、「オリゴヌクレオチド」、「プライマー」、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」、「ＤＮＡ多型性」、「制限断片長多型」（「ＲＦＬＰ」）、「ランダム核酸フラグメント」、「ＤＮＡフィンガープリンティング」、または「ＤＮＡタイピング（typing）」、「遺伝子型決定（genotyping）」、「プロフィーリング（profiling）」、「ＤＮＡ同定分析」、または「ＤＮＡ多型性」、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）、「ＤＮＡ増幅」、「ランダム増幅された多型性ＤＮＡ」（「ＲＡＰＤ」）、「アンプリコン」および「ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング」（「ＤＡＦ」）については、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（Mullis）、第５，１２６，２３９号（Livak et al.）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０３５６７号（Caetano-Anolles et al.）などの特許および他の科学文献中で議論されており、これらは参考文献として本明細書中に取り込まれる。「ゲノム」（「複雑および単純」）については、マイコプラズマに対する１０⁶の小さいものからある種の植物および水陸両生動物に対する１０¹ ¹ ｂｐ程度の大きいものまでの範囲に渡るもので、参考文献として本明細書中に取り込まれる、Genes IV，Benjamin Lewinによる、24章（1990）を参照されたし。図面の簡単な説明図１は、ヘアピンプライマーＨＰ₇および異なるプライマー配列を用いて得られたプロフィールのゲルの写真を示す。図２は、異なるヘアピンを有する典型的ヘアピンプライマーを用いたプロフィールのゲルの写真である。図３は、プライマーがＩおよび／またはＮ（Ｎは、４種の塩基のいずれか１種を示す）によって例示の通り置換された一定の塩基を有する場合のゲルの写真を示す。発明の要旨本発明は、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）での方法および生成物における新規な改良を提供する。本発明の生成物は、ＤＡＦにおける改良のみならず、ランダム増幅された多型性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析またはその変形法のような複合任意アンプリコンプロフィーリング（ＭＡＡＰ）技術における改良をも提供する。本発明は、ＤＡＦの核酸生成物（単数または複数）を再増幅して５’末端に機能領域が伸長した核酸配列を合成する方法を提供する。本発明のもう一つ別の態様は、特定数のヌクレオチドの３’末端を有する新規なオリゴヌクレオチドプライマー、特には短いプライマー、並びに、それらのＤＡＦまたは他のＭＡＡＰ技術における使用を提供する。本発明の重要な態様は、誤って対合したプライマーからの増幅を減少し、プライマーの３’末端の機能から生じる生成物の形成を最適化するための各種の技術および手段を提供する。もう一つ別の態様では、本発明は、５’末端にヘアピン構造または他の均等構造を含む新規な任意オリゴヌクレオチドプライマー、並びにそれらのＤＡＦまたは他のＭＡＡＰ技術における使用を提供する。もう一つ別の多少関連する態様では、本発明は、プリンまたはピリミジン置換ポリアミド（ＰＮＡ、ポリアミド核酸に対して）を含む新規な任意オリゴヌクレオチドプライマー、並びにそれらのＤＡＦまたは他のＭＡＡＰ技術における使用を提供する。本発明はさらに、選択した鋳型ＤＮＡの複合エンドヌクレアーゼ消化、およびその後のＤＡＦまたは他のＭＡＡＰ技術によるＤＮＡ消化の処理を提供する。本発明は、改良された非常に熱安定性のあるＤＮＡポリメラーゼ、即ち、Ther mo Aquaticus の先端を切断した誘導体（AmpliTaq）の使用を提供し、これは、ＤＡＦおよび他のＭＡＡＰ技術での使用に特によく適している。本発明によれば、サイクル条件、例えば、温度、核酸鋳型に対するプライマーの量のような改良されたＤＡＦ用核酸増幅パラメーター、複合プライマーの共同使用、および本発明のさらに詳細な説明から明らかとなるであろう他の側面が提供される。本発明の各種の方法および生成物は、選択したプライマー（単数または複数）により生成したフィンガープリントの情報内容（即ち、バンドの数および多型性）の顕著な増加を提供する。本発明によれば、本明細書中に開示される方法論および新規な生成物における各種の改良は、いわゆるＤＡＦ法、一般にはＭＡＡＰ方法論と一緒に、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、個々に使用することができる。例えば、３個の末端（３’末端）の一本鎖ヌクレオチドのみを有する核酸増幅フィンガープリンティング用の任意のミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーを使用するという、本明細書中以下おいて使用されるような本発明の重要な特徴は、ＤＡＦまたは本明細書中以下において記載する他のものような現存するＭＡＡＰ技術のいずれにも適用することができる。発明の好ましい態様の詳細な説明本発明の方法は、最初の増幅で用いたプライマーと共通の配列を有し、最初の増幅で用いたプライマーより短くてもよいが、好ましくはそれより長い、少なくとも１つの任意プライマーにより、ＤＡＦから得られた核酸フラグメント（単数または複数）を増幅することを含む。選択した長さのプライマーによる再増幅のために、核酸フラグメントの混合物または単一の単離された核酸フラグメント、好ましくは最初の増幅から得られた精製生成物を鋳型として使用することができる。再増幅のための方法はさらに、Mol. Gen. Genet. 235: 157-165（1992）（「M GG 1992」）中に記載されており、これは本開示の一部を構成する参考文献として本明細書中に取り込まれ、証拠３として本明細書に添付する。図３Ａ−Ｃ中に、共通配列を共有する異なる長さのプライマーが、単一の単離されかつ精製された生成物またはオクタマーによる最初の増幅から得た生成物の混合物を増幅することが示されることが分かるであろう。図５Ａ、Ｂは、示したオクタマーを用いて得られた単離されかつ精製された単一の生成物の再増幅の全ての生成物を示す。逆に、ペンタマーおよびオクタマーを使用して、プライマーによって最初に生成した生成物を再増幅した（図６Ａ、Ｂ）再増幅フラグメントは、それらの各々の５’末端に付加配列を含み、これが可視化バンドにおけるシフトを生じさせ、分析する核酸についてのさらなる情報を提供する。例えば、遺伝子を標的とする診断用途および他の用途のためのハイブリダイゼーションプローブのような選択された用途のための、選択的に特別に作成した伸長した５’末端配列を含むような再増幅生成物は実用的に大きな興味がある。生成物は、所望の配列の連結した末端を有するＤＮＡフラグメントとは区別される。１２および１５ヌクレオチドのような８ヌクレオチドより長いプライマーは、最初の鋳型配列とのアニーリング中にプライマー／鋳型の二量体上に５’オーバーハングを生成するが、全ての場合に鋳型ＤＮＡを増幅した。より長いプライマー、例えば長さ３０ヌクレオチドも、生成物に対して意図される用途に依存して考えることができる。好ましくは、長さが少なくとも８ヌクレオチドのプライマーが、本明細書中に記載されるように伸長される。本発明は、プライマーに関するさらに重要な態様を提供する。従来技術は、最小の有用なプライマーの長さは９塩基のオリゴヌクレオチドであることを一般的に教示している（Williams et al. (1990)，ＲＡＰＤ法）。本出願に対する第１の親出願は、増幅および生成物の可視化の成功のために少なくとも５ヌクレオチドを提唱している。いかなる長さのオリゴヌクレオチドプライマーにおいても、所謂「コア」領域を特定するのは、３’末端から最初の５ヌクレオチドであることが今回見つかった。これらの５ヌクレオチドがなければ、プライマー伸長開始（priming）という事象は生じないようである。「最適化部位（optimizer）」領域と本明細書中で呼ばれるヌクレオチド６から８を含む次の領域は、より効率的な増幅に貢献する。プライマー伸長開始標的部位を認識するのに重要な役割を演じるのはこの領域である。９から上流へ例えば３０に至る次の塩基ドメインは、「５’伸長テイル」領域と見なされる。これらの付加的なヌクレオチドは、増幅されたスペクトルを穏やかにのみ変化させるであろう。従って、本発明者の見方によれば、プライマーは、３’末端から始まって、５ヌクレオチドのコア領域と、その後のドメイン「最適化部位」を含み、プライマーの長さは全部で７または８ヌクレオチドになるものと見なすことができる。大豆およびヒトのようなより複雑なゲノムの増幅のためには、好ましくはプライマーは８ヌクレオチドを含み、細菌および菌類のようなより単純なゲノムのためにはそれは７ヌクレオチドを含むであろう。７または８ヌクレオチドドメインに対するヌクレオチドの付加は、各々、ＤＮＡパターンの情報の内容を大きくは増加させない。従って、本発明によれば、コアおよび最適化部位ドメインは、増幅反応の主要な決定因子であり、生成される増幅生成物の数および性質を決定する。しかしながら、本明細書中以下に教示するように、コア領域は３ヌクレオチドにまで減少させることができることが意外なことに見つかった。これらの所見は、任意に選択した配列の５’末端からヌクレオチドを除去することによって設計された関連ヌクレオチドのセットを、数種の鋳型の直接の増幅のために使用するという研究に基づくものである。長さ５から８ｎｔの関連プライマーによって生成したパターンは複雑性およびバンド分布において相違していた。驚くべきことに、プライマーの長さを増加すると増幅生成物の数は増大した。対照的に、長さ８および１０ｎｔのプライマーは視覚的には同一のパターンを生成した一方、より長いプライマーにより生成したパターンは異なっていたが、幾つかの共通のバンドを示した。最後の２つの５’末端ヌクレオチドにおける塩基置換により幾つかの異なる増幅フラグメントが生成したが、全体のパターンは非常に似ていた。これは（上記のように）８ｎｔ３’末端領域を越える配列は増幅に対して穏やかにのみ影響することを示している。これらおよび関連した研究により、他の既知の方法により使用されるようなより長いプライマーは必要ではないことが示唆される。そのような方法は実際上、プライマー有効ドメインの３’末端の最初の５−８ヌクレオチドを使用している。本発明のこれらの側面のさらなる説明のためには、上記引用した、任意オリゴヌクレオチドプライマーによるＤＮＡの増幅（Amplifying DNA with ArbitraryO ligonucleotide Primers）、Gustavo Caetano-Anollesが参照される。第１の親出願ではペンタマーの使用が教示されているが、より長いプライマーの各種の成分ドメインの役割の十分な意義は完全には理解されていなかった。プライマーに関連して、Livak et al.の米国特許第５，１２６，２３９号は、プライマーは「ヘアピン」構造を形成しない配列を含むことが好ましいことを教示していることが注目される。本発明によれば、プライー伸長開始ＤＮＡ増幅のための機能的限界らしいとこれまで考えられたこと（５ヌクレオチド）がさらに３ヌクレオチドまで減少可能であることが最も意外なことに見いだされた。本発明によれば、これらのプライマーは、３’末端に３ヌクレオチドを、そして５’ 末端にヘアピンを含む。これらのプライマーは本明細書中では「ヘアピンまたはミニ−ヘアピンプライマー」と称される。これらの任意プライマーは、フィンガープリンティングにおいてこれまで使用されていた他のプライマーと違って、意外なことに、核酸鋳型から核酸の任意の領域を増幅するために３’末端に任意の３ヌクレオチドの最小の組み合わせのみを必要としている。図１は、ＤＮＡの増幅のための配列ＧＣＧＡＧＣのミニ−ヘアピン（ＨＰ₇）を５’末端に有する配列関連プライマーの使用を示す。パネルＡは、インドネシア果実バット（Pteropus Hypomelanus）からのＤＮＡの増幅を示し、大豆（Glycine max cv. Bragg）（パネルＢ）、バクテリウム（E . coli 株Smith 92）（パネルＣ）およびバクテリオファージ（ラムダ cI857indI Sam 7）（パネルＤ）を示す。この実験および関連実験は、僅か３塩基対の任意ドメイン（例示された場合では、ＣＴＧ）を有するミニ−ヘアピンプライマーが再生可能なフィンガープリントを生成することを示している。ヘアピン配列ＨＰ₇自体はフィンガープリントを生成することができないことに注目すべきであり、これは、最も活性のあるアニーリング配列が３’末端のものであることを示している。他の実験条件下では３塩基対未満を有するドメインを有するプライマーは再生可能なフィンガープリントを適切に生成することができるかもしれないことを完全に排除するべきではない。この理論によって限定されることを意図するわけではないが、単一のプライマーによって開始した増幅生成物は少なくともプライマー自体と同じ長さの末端へアピン対称の領域を有しているという特別の特徴を共有しているようである。これらの生成物の効率的な増幅を生じさせるためには、プライマーはＤＮＡポリメラーゼが鎖の伸長によって二量体を固定し安定化するのに十分長くこれらのヘアピンループ複合体に置換すべきである。ヘアピンループ妨害の程度は各フラグメントに対して同じではなく、このためにいくつかのフラグメントを優先的に増幅することが可能になる。プライマーの長さを増加することによる増幅のこの側面に関する研究は、プライマーが８ヌクレオチドドメインより長い場合には、ヘアピンループとのアニーリングとより良く競合できることを示唆する。慣用のフィンガープリンティング方法論が長さ８ヌクレオチド以上のプライマーの使用を教示する理由はこのためである。Williams et al. 1991を参照されたし。しかしながら意外なことに、任意ミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーは基本的に増幅を決定する３ヌクレオチドを３’末端に有していることのみが必要であることが見つかった。本発明のヘアピンプライマーは増幅生成物上でのヘアピン形成を阻害し、これまで利用可能なものよりより接近し易いプライマー伸長開始部位を作ることができる。本発明によるこの知見の最大の興味のある結果は、本発明により今回、６４個の異なるプライマーの密接なセットが提供され、これはＤＮＡの既知の４塩基の任意のものを含むヌクレオチドの配列の全ての組み合わせの全部である。従って、本発明は、３’末端における任意配列の３ヌクレオチドと５’末端を構成するヘアピンループとの６４種の異なるプライマーを含む増幅のためのキットを提供する。例示的ミニ−ヘアピンプライマーは以下のように表すことができる：ここで、３’領域は４ヌクレオチドＧＣＴＨ３’から成り、ヘアピンは相補的塩基の２ヌクレオチドのステムと３ヌクレオチドの一本鎖ループとから成る。もう一つのプライマーは、同じヘアピンと３’末端のＣＴＧで構築される。別の例示的プライマーは、ＨＰ₇−ＣＴＧ、ＨＰ₇−ＧＣＴＧ、ＨＰ₃−ＧＡＧＣＴＧ、ＨＰ₇−ＣＣＧＡＧＣＴＧである。ＤＮＡの増幅のための配列ＧＣＧＡＡＧＣのミニ−ヘアピンＨＰ₇を５’末端に有する配列関連プライマーの使用を示す図１を参照されたし。合成した他のプライマーには、ＨＰ₇＝ＧＣＧＡＡＧＣ、ＨＰ₈＝ＧＣＧＡＡＡＧＣ、およびＨＰ₈＝ＧＣＧＴＴＡＧＣが含まれた。図２は大豆cv. BraggまたはE.coli（単離されたSmith 92）（各々パネルＡおよびＢ）を増幅した場合の他のミニ−ヘアピンを示す。ミニ−ヘアピンは以下の配列を有する：ＨＰ₈−ＧＣＴＧ、ＨＰ₇−ＧＣＴＧ、ＨＰ₈−ＧＡＧＣＴＧ、ＨＰ₈−ＧＡＧＣＴＧ、ＨＰ₇−ＧＡＧＣＴＧ。プライマーの５’末端のヘアピンループのための多くの配列の変形体は、ＨＰ₇ と同様に安定なミニ−ヘアピンを形成する。例えば、ＤＮＡフラグメント、ｄ（ＧＣＧＡＡＡＧＣ）はＧＡＡＡループとステムの僅か２ＧＣ対から成る安定なヘアピン構造を形成する。ミニヘアピンプライマーが異なるループ配列および／または異なる基幹配列を有する場合は本発明の範囲内である。以下のものが考えられる：ｄ（ＣＧＧＡＡＡＧＣ）、ｄ（ＧＣＧＮＡＡＧＣ）（ここでＮはＡ（示される）、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかである）。３’末端は３またはそれ以上のヌクレオチドの任意の組み合わせにより構成される。さらに、ｒ（ＧＣＧＡＡＡＧＣ）のようなＲＮＡフラグメントも選択したプライマーの５’末端上にヘアピンループを形成する。好ましくは、本発明での使用のための任意ミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーは２以上のＧ−Ｃ塩基対をステム領域として有し、そして、ループ領域中に好ましくはＧＡＡまたはＧＡである少なくとも１つのＡを含む３または４のヌクレオチドを含むようである。任意ミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＡＦに関連して非常に有用であるが、他の任意の複合任意アンプリコンプロフィーリング（ＭＡＡＰ）技術においても有用である。任意ミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＤＮＡ増幅フィンガープリンティングは以下のように実施される。修飾プライマーを使用して、５’末端に配列ＧＣＧＡＡＡＧＣのミニ−ヘアピン（ＨＰ₇）を有する、図１に示されるような関連配列のプライマーを使用して、ＤＮＡ鋳型からＤＮＡの任意の領域を増幅した。使用した方法は以下の通りであった：ＤＡＦ反応は、３μＭのプライマー、０．３ユニット／μｌのAmpliTaq StoffelＤＮＡポリメラーゼ（ Perkin-Elmer／Cetus、Norwalk、ＣＴ）、２００μＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、４ｍＭのＭｇＳＯ₄、１０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１％トライトン、２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、および約０．１ｎｇ／μｌの鋳型ＤＮＡを含む全量２０−２５μｌ中で行った。混合物は、再循環温空気温度循環器（Bios、New Haven、CT）中で、９６℃で３０秒、３０℃で３０秒、および７２℃で３０秒の３５サイクルで増幅した。増幅生成物を、参考文献として本明細書中に取り込まれ、添付する（証拠４）Caetano-Anolles et a l. Biotechnology Vol. 9: 553-557、(1991)に記載されるように、ポリエステル裏地の５％ポリアクリルアミド−尿素ミニゲル中で分離し、銀で染色した。３μ ｌのローディング緩衝液（５Ｍの尿素および０．０２％のキシレンシアノールＦＦ）と混合した各増幅反応液の１／１０希釈液の３μｌをウェルに装填し、１００Ｖで約８０分間泳動した。ピコグラムレベルでのＤＮＡの検出を、参考文献として本明細書中に取り込まれ、添付する（証拠５）Bassam et al. Anal.Biochem .，Vol．196，80-83(1991)に記載されているような銀染色によって行った。わずか３ヌクレオチドの任意配列を有するミニ−ヘアピンプライマーを使用すると、図１のパネルＣおよびＤに（各々E．coli 株およびバクテリオファージラムダ）示されるように小さいゲノムのより確実なフィンガープリンティングが与えられる。各々５’ＨＰ₇を有するこれらの３’末端ヌクレオチドの６４の組み合わせを示すプライマーの密接なセットは上記概説した操作を行うことによって入手可能である。バクテリオファージラムダを用いる同様のフィンガープリンティングが入手できる。１以上のプライマーを使用することを望む場合、２またはそれ以上のプライマーのキットを使用できる。本発明によればさらに、任意プライマーの３’または５’末端の１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドが、選択した塩基によって置換されている新規なプライマーが構築される。例示的塩基は、ヒポキサンチン（Ｉ）、６Ｈ，８Ｈ０３，４−ジヒドロピリミド〔４．５ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン（Ｐ）および２−アミノ−６−メトキシアミノプリン（Ｋ）である。他の塩基を考えることもできる。同様に４種の塩基、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかを別の塩基で置き換えることができる。Ｉがイノシンを示し、Ｎが４種の塩基：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか１種を示す図３を参照されたし。これらの研究から、このような短いプライマーにおいてヌクレオチドを置換することにより、プライマー伸長開始部位に関するその識別機能は少なくとも一部は遮蔽されるようである。有効なプライマー伸長開始部位は効率的により短くなり、その特異性のいくらかは失われる。これは、未だ十分に理解されておらず、あるいは探究されていない重要な適用性を有している。図３において、フィンガープリンティングをこれらの置換を導入することによって特別に作成することもできる。ある場合には、プロフィールはかなり単純化し（特に、Ｉが３’末端に導入される場合）、他の場合には、プロフィールは非常に複雑化する（３’末端に変質塩基を導入することによって）。本明細書中上記提示した結果により、ＭＡＡＰ技術のためのプライマーは３以上のヌクレオチドを標的ＤＮＡ潜在領域を「スクリーニング」してそれらにアニーリングする３’末端に含む必要がなく、本明細書中上記で「５’伸長テイル」と記載された領域は適切な最適化部位により一部または全部を置換した場合には必要不可欠なものではないことが示される。本発明により提供される例示はヘアピンプライマーである。しかしながら、プライマーの５’ドメインを変形するという概念はヘアピン変形に限定されない。均等な効果を有する他の任意の変形が本発明の範囲内のものであると理解される。５’末端の化学的変形を行ってもよい。プライマーＤＮＡの５’末端をＦＡＭ、ブルー、ＪＯＥ、グリーン、ＴＡＭＲＡ、イエローまたはＲＯＸにより蛍光団標識することは可能である。十分な増幅が生じる。例示されるのは、ＦＡＭで５’を蛍光標識されたプライマーＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧであり、これを用いて２つの異なる芝生ＤＮＡサンプルを増幅した。増幅産物はＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒＡＢＩ３６２を用いて分離されうる。引用により本明細書の一部をなす（証拠６）、ＲＡＰＤテクノロジーの植物育成への応用、ジョイントプラントブリーディングシンポジアシリーズ（ＪｏｉｎｔＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇＳｙｍｐｏｓｉａＳｅｒｉｅｓ）、１９９２年１１月１日を参照されたい。少なくとも１つのプライマーをビオチン化、例えばビオチンまたはビオチン類似体（ビオチンオビジン）に共有結合させる。「リポーター」グループと称される他のグループを５’末端に用いることができる。他の種のプライマーは、５’末端がポリアミド核酸（ＰＮＡ）により修飾されたものである。そのようなポリアミドは、ＤＮＡのデオキシリボースリン酸バックボーンをアキラルポリアミド（ａｃｈｉｒａｌｐｏｌｙａｍｉｄｅ）バックボーンで置換することによりデザインされる。そのようなオリゴマーは、鎖置換により二本鎖ＤＮＡの相補性標的を認識する。したがって、そのようなプライマーは３ヌクレオチド（所望であればそれ以上）の３’末端を有するＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドの５’末端、および所望であれば残りのプライマーを構成するＤＮＡ断片、例えば２から５または６ヌクレオチドからなる。典型的なＰＮＡの構造は、引用により本明細書の一部をなすニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５４：１４９７−１５００（１９９１）およびエグホルム（Ｅｇｈｏｌｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６５：５６６−５６８（１９９３）に示される（証拠７および８）。３’末端の効率または機能を最大にするかまたは増大させるために３’末端から７、８または９ヌクレオチドを過ぎて５’末端を有するプライマーは概念も実施も、知りうる限りでは全く新規である。これを実行するためのすべての手段または均等物または結果を記載することは実質的に不可能である。当業者は本明細書の教示から利益を受け、そして自身の目的のために応用する可能性は排除できない。したがって、本発明者により期待され、意図されることは、実質的に同じ様式で実行し且つ実質的に同じかまたはより良い結果を達成する実質的に均等な手段は、本発明の範囲内であると考え、請求の範囲の文字どおりの記載の範囲に制限されないことである。本発明により教示されるとおり、フィンガープリントの可視化に必要なオリゴヌクレオチドの数は３と決定された。「オプチマイザー」、例えば５’末端の「ヘアピン」を有するプライマーの場合、この数は論理上の極限である１ヌクレオチドにまで減じうると考えられる。さらに、３’末端の最初の３ヌクレオチドの内の１つ以上のヌクレオチドは縮重塩基で置換できる。さらに、「ヘアピン」は鋳型の鎖を認識することが観察された。したがって、ヌクレオチドのコアを用いずに、即ちプライマーとしてヘアピンを用いることにより増幅を生じさせることが可能である。本発明は、多形性を検出する可能性をさらに顕著に増大させるための手段および方法を提供する。該方法は増幅の前に制限エンドヌクレアーゼを用いた鋳型核酸の消化を含む。エンドヌクレアーゼによる消化と短いオリゴヌクレオチドプライマーにより指令されるＤＮＡの任意の部分（ストレッチ）の増幅との組み合わせは、近縁のカビおよびバクテリア単離物、植物品種および真核生物の容易な識別を可能にする。消化された鋳型ＤＮＡのＭＡＡＰ分析は、ダイズの発生遺伝子座（グリシンｍａｘＬ）に連結した分子マーカーを同定した。小結節形成を制御するｎｔｓ座位において変異させた、ＥＭＳで導入した小結節過形成性の同種同系ラインは、２−３の制限酵素により予め消化された鋳型の増幅により、互いにおよびそれらの親の培養物から識別できた。全部で４２のＤＮＡ多形性がたった１９のオクタマープライマーを用いて検出された。消化なしには、２５のプライマーはこれらダイズ遺伝子形を識別できなかった。いくつかの多形性生成物は、対立遺伝子の変異体ｎｔｓ３８２およびnｔｓ１００７の間の交配によるＦ２ファミリーおよび先祖のＧ．ｓｏｊａＳｉｅｂ．＆Ｓｕｃｃ．ＰＩ４６８．３９７においてｎｔｓ部位に強く共分離された。所望であれば、予めの消化の後、エンドヌクレアーゼによる増幅産物の後消化を行ってもよい。あらゆるプライマーが本発明のこの態様に用いられる。本明細書において議論されるプライマーは特に有用である。プライマーの混合物も利用可能である。増幅は、ペンタマー、ヘプタマーまたはオクタマーを用いて実施された。より長いオリゴヌクレオチドプライマーを使用することも可能である。予めの消化は十分に行うことが好ましい。制限ヌクレアーゼがゲノミックＤＮＡを消化する本発明の別の態様においては、本発明の別の態様と同様に、ＤＮＡは動物、植物または人から得ることができる。プライマーが反応する制限断片の数はゲノムのサイズおよびゲノム中の制限エンドヌクレアーゼに標的部位が存在する頻度に依存し、その頻度は主として標的部位中のヌクレオチドの数により決定される。一般に使用される制限エンドヌクレアーゼの標的部位のヌクレオチドの数は４から８の間である。生物のゲノムサイズは広範囲に、微生物の数百万塩基対から動物および植物の数十億塩基対である。したがって、制限酵素を用いたゲノミックＤＮＡ分子の消化後に得られる制限断片の数は数百から数百万に変化しうる。二本鎖ＤＮＡの特異的塩基配列を認識して標的部位毎にＤＮＡ分子の両方の鎖を切断するものであれば、あらゆる制限酵素が使用されうる。平滑末端または粘着末端を生じるエンドヌクレアーゼを用いた。ＤＮＡ配列は公知配列である必要はない。代表的に有用なエンドヌクレアーゼは以下のものである：ＨａｅＩＩＩ，Ｓａｕ３Ａ，ＢａｍＨＩおよびＭｓｐＩ。他の制限酵素ももちろん使用可能であり、引用により本明細書の一部をなすＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、セクション３．１．６から３．１．２０から選択される。制限部位または近傍における切断は、通常は隠蔽されて複製に利用不可能なアンプリコンを、より利用されやすくする。さらなる記載として、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２４１：６４−６７（１９９３）（証拠９）およびそのレビューに引用されている「任意のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＤＮＡの適用」を参照されたく、これらは引用により本明細書の一部をなす。ＤＡＦは、原核生物および真核生物のかなり近縁な遺伝子形の識別に特に有用であることがわかった。特定の植物株の遺伝的改良およびそのような改良の効果を、互いに及び起源の株から識別することが特に難しい場合がある。本発明により生じる特定の核酸ゲノムの核酸特性のスペクトルは、本明細書に記載されるような可視化のために有用なだけではなくさらなる使用のための出発核酸断片としても有用である。そのような核酸生成物のプールまたはライブラリーは、直接、本発明の方法の応用の為にまたはさらなる処理により、例えば後制限エンドヌクレアーゼ処理により得ることができる。混合ゲノムに対する本発明のフィンガープリントの応用は、とても興味深い。プライマーを作って、選択的に増幅し、そしてそれらのＤＮＡ断片の混合物中の標的ゲノムをフィンガープリントすることができる。その状態の実例は窒素固定に見いだされる。Azolla-Anabaena共生は、何世紀にもわたり稲作の窒素生物肥料として使用されてきた。共生の遺伝学的改良は、Azolla-Anabaena入手源およびＡｎａｂａｅｎａ系を同定するのが困難なために制限されてきた。この開発では、原核生物AnabaenaのＤＮＡと真核生物AzollaのＤＮＡ双方に由来するＤＮＡ抽出物の混合物が存在する。ＤＡＦは無傷の共生から抽出されたＤＮＡを使用してAzolla-Anabaenaの入手源を区別して陽性に同定することができた。より詳細な説明は、本明細書中に参考文献として取り込まれ添付されるPlan t Molecular Biology ，Vol.21:363-373（1993）（証拠１０）を参照いただきたい。従って、増幅し、概観を描くのに例えばＤＮＡ断片のような核酸の複雑な混合物を使用するのが役立つ場合がある。本発明において、原核生物および真核生物の核酸のフィンガープリントを行うのに複数の任意のプライマーを使用できる。プライマーは同じヌクレオチド長のものが好ましい。例えば２つのプライマーを使用して得られた増幅産物は、個々のプライマーを別々に使用して得られた増幅産物を単に併せた結果とは異なるフィンガープリントを与えた。あるバンドは消え、一方別のバンドが生じ、そして両方の場合に共通するバンドは少なかった。各プライマーはゲノムの別々のある特定の部分を増幅し、増幅産物の特徴的な組を産生する。複数のプライマーを使用すると、各プライマーによって開始される伸長産物の重ね合わせから新しい産物が生じ、一方消える産物もある。または、増幅中のアニーリング部位の競合から新たなフィンガープリントパターンが生じ得る。数種のプライマーを使用する技術は”マルチプレックス（multiplex）”と呼称されている。さらに、分離が困難なゲノムに対しても、マルチプレックスＤＡＦはＤＮＡフィンガープリントを生じさせるための別の方法となる。数種のプライマーのプールはまた、多型性ＤＮＡを発見するための機会を増やすことができる。一群の品種間の多型を明らかにするのが困難な場合でも、混合物中のプライマーのサブセットはこれらの多型を個別に明らかにでき、従って、マルチプレックスＤＡＦは近い種間のスクリーニングにおける最初の使用を提供するであろうことが示唆されている。任意のプライマーを使用したＲＮＡ増幅のために、鮮明なフィンガープリント（この方法を、ｃＤＡＦ相補性ＤＮＡ増幅フィンガープリントと呼称する）もまた開発された。全ての場合において材料は、新生根毛の領域に由来するダイズＢｒａｇｇ品種の根から抽出したＲＮＡであった。使用したプライマーはＣＧＣＧＧＣＣＡ、ＣＧＣＧＧＣＣＡおよびＴＴＴＴＴＴ（Ｔ₆と呼ぶ）、ＧＣＧＣ、ＧＣＧＣおよびＴ₆、ＣＣＴＧＴ、ＣＣＴＧＴおよびＴ₆，ＡＡＴＧＣ，そして最後にＡＡＴＧＣおよびＴ₆であった。全ての組み合わせでフィンガープリントが産生された。研究では０.５μｇ／μｌのＲＮＡを、２０ＵＭｏＭｕＬＶ逆転写酵素を用いて１μｇ総プライマー、２ＵＲＮＡａｓｉｎ並びにヌクレオチドおよび塩化マグネシウムを含む適当なバッファーの存在下、２３℃で１０分間混合物をインキュベートし、続いて４２℃で３０分間インキュベートすることにより逆転写した。得られた反応物を、ＤＡＦ分析の鋳型として転写に用いたものと同じプライマーと共に処理した。ＤＡＦ発明の種々の態様と関連しての複数のプライマーが使用された。複数のプライマーを用いた芝生ＤＮＡのＤＮＡ増幅によって、ゲノム多様性、品種同定および関連する適応遺伝子座の遺伝子マッピングの理解が高められた。本明細書中に参考文献として取り込まれ添付される，Golf Course Management，Vol.61:8 0-86(1993)をご参照いただきたい（証拠１１）。これらの研究で使用した複数のプライマーはヌクレオチド、ＧＴＡＴＣＧＧＣ＋ＧＡＣＧＴＡＧＧであった。使用されたＤＮＡポリメラーゼは短縮された変異体、AmpliTaqのStoffel断片と呼ばれるものであった（Perkin-Elmer/Cetus）。ＣＧＣＧＧＣＣＡおよびＧＣＴＧＧＴＧＧ、そして、ＣＧＣＧＧＣＣＡ、ＧＣＴＧＧＴＧＧおよびＡＡＴＧＧＡＧＣまたはStaphylococcusaureus FDA 574の配列のプライマーの混合物を用いたフィンガープリントは複雑なバンドパターンを示した。先に引用したBiotechnology，Vol.9:553-557（1991）をご参照いただきたい。５−１５の範囲のプライマーの他の混合物も本発明の実施に有用である。２つまたはそれ以上のプライマーが使用できる。知られているように、大部分のＤＮＡポリメラーゼは鋳型鎖にハイブリダイズするプライマーを含む核酸物質のプライマー伸長反応を、プライマーの３’末端が鋳型鎖の５’末端に対応して中断されるように行う。鋳型鎖はＤＮＡまたはＲＮＡである。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸長するのに使用される。ＲＮＡ鋳型については、逆転写酵素が使用可能な核酸ポリメラーゼの例である。伸長反応において使用する核酸ポリメラーゼの選択は、鋳型の性質に依存する。本発明において、短縮変異体、Thermos aquaticus(AmpliTaq)由来のＤＮＡポリメラーゼのいわゆるStoffel断片が特に有用であるあることが見いだされた。S toffel断片は高熱安定性の組換えＤＮＡポリメラーゼであって、Ｎ末端の２８９アミノ酸残基を欠失している。これは、最適マグネシウムの範囲が広く、熱安定性が高められおり、付随する３'−５'または５'−３'エクソヌクレアーゼ活性を伴わない。この酵素はPerkin-Elmer/Cetusのパンフレットに記載されている。この酵素は改善されたＤＡＦ反応を与え、短い産物の増幅に特に有効であり、従って他のＤＮＡポリメラーゼと比較してより情報性の高いフィンガープリントを産生することができる。好ましくは、０.２から０.４ユニット／μｌの間のStoffe l断片は明確な一定した結果を与え、一方AmpliTaqは０.０７５から０.１ユニット／μｌのみが適当であった。一般にStoffel断片は、それぞれより多い量の、増幅産物のより広い分布を与えた。このことは、小さい産物（３００ｂｐ以下）において特に顕著であった。両ポリメラーゼは共に４ｍＭマグネシウムで一定したフィンガープリントを与えたが、Stoffel酵素は約８ｍＭより高い濃度で阻害されたのに対し、Stoffel断片は約１２ｍＭまでのマグネシウム濃度に耐えることができる。他のＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは少なくとも実質的に同等の熱安定性のものも、他のＮ−末端短縮 Thermus aquaticus（Taq）ＤＮＡポリメラーゼＩと同様に使用可能である。KlenTaqＩおよびKlenTaq LAと名付けられているポリメラーゼはこの目的のために特に適当である。上述した研究においてStoffel断片の変わりにKlenTaqＩを使用した場合、匹敵する結果が得られた。ダイズシスト線虫（Heterodera glycines）由来のＤＮＡおよびダイズＤＮＡを、プライマーＧＴＡＡＣＧＧＣＣとＣＣＧＡＧＣＴＧ、及びKlenTaq IとKlenT aq LAを用いて増幅した。本発明において、増幅反応中のサイクルにおけるアニーリング温度は、以前から通常使用されている温度、ＰＣＲおよびＲＡＰＤの典型的なパラメーターである一般約３０−３５℃、よりも有意に高い温度範囲において行うことができる。７−１５ヌクレオチドのプライマーが約１５℃から７５℃の温度範囲において判読可能で意味のあるプロフィールを与えることは注目すべきである。ヘプタマーは１５℃から６０℃の範囲において、好ましくは４５℃から６０℃の範囲においてＤＮＡ増幅を行った。ペンタマーでも約５５℃でＤＡＦ産物を与える。オクタマーは、約１５℃から６５℃の範囲で意味のあるプロフィールを与える。ＤＡＦ産物は他のＭＡＡＰ技術とは反対に、アニーリング、伸長および変性の間に非常に耐性があるようである。一般に、増幅は２回から、可視化のために適当な数の増幅産物を得るために最適なサイクル数まで（例えば３５サイクル、即ち、再循環する空温サイクラー（ Bios，New Haven，CT.）中で、９６℃で３０秒、適当なアニーリング温度で３０秒、そして７２℃で３０秒）行われる。一般に、特に約５００ｂｐより短いＤＡＦ産物については、融解温度（９６℃ ）および非ストリンジェントなプライマーアニーリング温度（記載した範囲で）の二段階サンクルが増幅のために十分である。伸長反応は不要である。３０−３５サイクル以上で一定した産物が得られた。５０までのサイクル数はフィンガープリントの質に影響を与えずに使用することができる。本発明において、プライマー濃度は以前から使用されてきた濃度よりも多く、特に核酸鋳型の量よりも多く使用されるのが有効であることが発見された。ＤＡＦ以外の先行技術ＭＡＡＰ技術は、一般にプライマー濃度を越えるＤＮＡ鋳型濃度を使用したが、ＤＡＦ法はＤＮＡ鋳型を越えるプライマーの濃度を提供する。７ｍｅｒから１５ｍｅｒのプライマーについては約３μＭのプライマー濃度を使用し、より短いプライマー（５ｍｅｒおよび６ｍｅｒ）については約１０−３０μＭ濃度で使用する。１５ｍｅｒプライマーより長いプライマーについては、３μＭ未満の濃度、例えば２μＭまたはそれ未満で十分な結果が得られる。ペンタマーを用いた増幅はしばしば約３０μＭで行われる。一般に使用される鋳型の濃度は０.１ｎｇ／μｌから１００ｎｇ／μｌの範囲である。最少のＩｎｇ／μ ｌの鋳型は、原核生物またバクテリオファージのような複雑性の低いゲノムの信頼できるフィンガープリントを産生する。鋳型濃度の実際的な上限の１ｎｇ／μ ｌはこの場合十分満足がいくようである。プライマーの３μＭ溶液は５ｍｅｒから１０ｍｅｒのプライマーについてそれぞれ約５から１ｎｇ／μｌの範囲である。より複雑な真核生物（植物、動物、哺乳動物、ヒト等）のある鋳型については、１,０００,０００倍の上限を定める、約１ｐｇの全ＤＮＡ（１μｇプライマー）ほどの少ない量を使用することもできる。反応で０.２μｇの全プライマーを使用した場合、上限は好ましくはプライマー／鋳型の割合が２００,０００である。典型的には、５ｍｅｒで細菌を増幅するためには（５ｎｇ／μｌプライマーにたいして１ｎｇ／μｌ鋳型）、好ましい割合は約５であり、ある場合には約２まで下げることができる。オクタマー（８ｎｇ／μｌプライマーにたいして１ｎｇ／μｌ鋳型）については、好ましい割合は約８である。ダイズおよび哺乳動物のような複雑なゲノムを５ｍｅｒで増幅するためには（５ｎｇ／μｌプライマーにたいして０.１ｎｇ／μｌ鋳型）、割合は５０である。５から８または９ヌクレオチドのプライマーについては、割合は約５から各々８０または９０までが好ましい。プライマーの最小から最大範囲の好ましい実際的な範囲は、好ましくは鋳型に応じて約２から１,０００,０００、好ましくは約５から約２００,０００である。これらのパラメーターは当業者へのガイドラインとして与えられる。もし当業者が、おそらく他の操作パラメーターに対して他の調整をして、これらのガイドライン（割合、制限等）からはみ出して実行しようとしても、その者はまだ（文字通りではないが）本発明の思想およびその教示の範囲であろうと考えられる。本発明では、方法論における種々の改良および本明細書中に記載された新しい産物は、ＤＡＦ方法若しくはＭＡＡＰ方法論一般、またはそれらのあらゆる組み合わせと呼ばれるものとの関係において個別に使用することができる。例えば、たった３ヌクレオチドの核酸増幅フィンガープリントに、任意のミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーを使用するという本発明の特徴は、あらゆる既存のＭＡＡＰ技術または後述される他の技術に応用することができる。本明細書中に開示されるミニ−ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーは、記載されているまたはその他のＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによる重合化を利用したあらゆる核酸の増幅において有用であると期待される。アンプリコンの増幅を増強する５’末端を有する同等のプライマーもまた他のＭＡＡＰ技術において使用できる。本発明の教示に従い、このような上述したプライマーが使用されたか否かにかかわらず、反応の産物の再増幅も行うことができる。同様に、エンドヌクレアーゼ制限酵素を用いたプレ消化もまた、これまでのＤＡＦ工程のみ対して、または本明細書中に記載される他のあらゆる改良とともに応用することができる。同様に、エンドヌクレアーゼ制限酵素による鋳型のプレ消化は、ＤＡＦまたはＭＡＡＰ以外のＰＣＲ法を含む伝統的工程を使用した産物に対しても使用できる。Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４,６８３,１９５号およびＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４,６８３,２０２号を御参照いただきたい。これらは、核酸のあられる特定の領域を増幅するのに使用できる複製連鎖反応を開示している。本発明による産物の比較は、当業者に知られている多種の技術を用いて行うことができる。産物の電気泳動ゲルの観察によって、増幅された産物のサイズ及び量を左右する多型性、並びに増幅された領域を決める多型性が明らかにされる。サイズ分画の好ましい方法は、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルマトリックスを通した電気泳動である。本発明の産物を可視化するより好ましい方法は、第２番目の親出願および同時継続している出願第号に開示されている方法による。本発明の産物を可視化するのに有用であろう他の参考文献は、既に引用され、本明細書中に参考文献として取り込まれる種々の文献中に見いだされる。当業者が必要な場合に有用であろうと思われる、種々のテキストおよび研究室マニュアルは以下のものを含む：Current Protocols，Vols.1 and 2，編集Ausub elら。当業者には明らかであろうが、以下の記載においては本発明の思想または範囲から離れることなく、本発明の実施において多くの修飾、変更および置換を行うことが可能である。複数のプライマーを使用して得られたプロフィールは情報性が高く、そして場合によっては１つのプライマーの使用の方が好ましい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バッサム，ブラント・ジェイオーストラリア連邦クイーンズランド 4072，クイーンズランド，ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド，ジョン・ハインズ・ビルディング，フィフス・レベル，コーパレイティブ・リサーチ・センター・フォー・トロピカル・プラント・パソロジー（番地なし) (72)発明者グレッショフ，ピーター・エムアメリカ合衆国テネシー州37907，ノックスヴィル，ケンプトン・ロード 801

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程からなる、未知配列の核酸サンプルのプロフィールを決定し、該核酸配列が他の核酸配列と同一か否かを決定する方法；ａ）５〜２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーで、核酸の少なくとも一方の鎖を処理し、そして該プライマーを核酸鋳型の各鎖の多数の任意サイトにアニーリングさせ、前記各サイトはプライマーを構成するヌクレオチドに実質的に相補的であり、こうして最初のプライムされた鋳型のセットを多数形成し、ｂ）上記プライムされた鋳型を核酸ポリメラーゼで処理して多数の延長鎖を生成させ、該延長鎖はプライマーと鋳型に実質的に相補するヌクレオチドの配列とからなり且つ鋳型鎖に沿って延長して鋳型鎖の５’末端または鋳型上の次のプライマー結合サイトで停止し、したがって該延長鎖の数は実質的にプライマー結合サイトの数に対応し、ｃ）鋳型鎖から延長鎖を変性させて、新たに合成された延長鎖および元の鋳型鎖セットの各々が鋳型として機能するようにし、その際プライマーと鋳型の濃度比は約２対約１，０００，０００であり、ｄ）工程(a)、(b)および(c)を反復して、未知核酸配列に特徴的かつユニークな核酸フラグメントのスペクトルを生成させ、ｅ）前記フラグメントのスペクトルを分離し、そしてｆ）前記核酸配列に付随するフラグメントの特徴的プロフィールを、高度に複雑な複数バンドのプロフィールとして決定する。２．比率が約５対約２００，０００の範囲である、請求項１の方法。３．比率が約５対約８０の範囲であり、そのときプライマーが５〜８ヌクレオチドを有するものである、請求項２の方法。４．比率が約８であり、そのときプライマーが８ヌクレオチドを有するものである、請求項３の方法。５．５’末端にヘアピン構造を有し、３’末端にヌクレオチド配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー。６．ヌクレオチド配列が少なくとも３ヌクレオチドを有する請求項３のプライマー。７．ヌクレオチド配列が３〜８ヌクレオチドを有する請求項６のプライマー。８．ヘアピンが少なくとも二つの相補的塩基を有するステムと一本鎖ループとから構成されている、請求項６のプライマー。９．ヘアピンが２〜１２ヌクレオチドを有する請求項６のプライマー。１０．ヌクレオチド配列が３個のヌクレオチドを有する、請求項７のプライマー。１１．ヌクレオチドヘアピン配列は同一で、ＤＮＡの既知４塩基の任意のものから選んだ３ヌクレオチドを有する配列の全組み合わせを構成する、請求項１５の６４種の異なるプライマーの組み合わせ。１２．下記工程からなる、未知配列の核酸サンプルのプロフィールを決定し、該核酸配列が他の核酸配列と同一か否かを決定する方法；ａ）ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーで、核酸の少なくとも一方の鎖を処理し、そして該プライマーを核酸鋳型の各鎖の多数の任意サイトにアニーリングさせ、前記各サイトはプライマーを構成するヌクレオチドに実質的に相補的であり、こうして最初のプライムされた鋳型のセットを多数形成し、ｂ）上記プライムされた鋳型を核酸ポリメラーゼで処理して多数の延長鎖を生成させ、該延長鎖はプライマーと鋳型に実質的に相補するヌクレオチドの配列とからなり且つ鋳型鎖に沿って延長して鋳型鎖の５’末端または鋳型上の次のプライマー結合サイトで停止し、したがって該延長鎖の数は実質的にプライマー結合サイトの数に対応し、ｃ）鋳型鎖から延長鎖を変性させて、新たに合成された延長鎖および元の鋳型鎖セットの各々が鋳型として機能するようにし、ｄ）工程(a)、(b)および(c)を反復して、未知核酸配列に特徴的かつユニークな核酸フラグメントのスペクトルを生成させ、ｅ）前記フラグメントのスペクトルを分離し、そしてｆ）前記核酸の配列に付随するフラグメントの特徴的プロフィールを決定し、該プロフィールは高度に複雑な複数バンドのプロフィールであり、プライマーはヘアピンプライマーである。１３．プライマーが５’末端にヘアピン構造を有し、３’末端にヌクレオチド配列を有する、請求項１２の方法。１４．ヘアピンが２〜１２ヌクレオチドを有する請求項１３の方法。１５．ヌクレオチド配列が３〜８ヌクレオチドを有する請求項１３の方法。１６．ヌクレオチド配列が３ヌクレオチドを有する請求項１５の方法。１７．下記工程からなる、未知配列の核酸サンプルのプロフィールを決定し、該核酸配列が他の核酸配列と同一か否かを決定する方法；ａ）５〜１５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーで、核酸の少なくとも一方の鎖を処理し、そして該プライマーを核酸鋳型の各鎖の多数の任意サイトにアニーリングさせ、前記各サイトはプライマーを構成するヌクレオチドに実質的に相補的であり、こうして最初のプライムされた鋳型のセットを多数形成し、ｂ）上記プライムされた鋳型を核酸ポリメラーゼで処理して多数の延長鎖を生成させ、該延長鎖はプライマーと鋳型に実質的に相補するヌクレオチドの配列とからなり且つ鋳型鎖に沿って延長して鋳型鎖の５’末端または鋳型上の次のプライマー結合サイトで停止し、したがって該延長鎖の数は実質的にプライマー結合サイトの数に対応し、ｃ）鋳型鎖から延長鎖を変性させて、新たに合成された延長鎖および元の鋳型鎖セットの各々が鋳型として機能するようにし、ｄ）工程(a)、(b)および(c)を反復して、未知核酸配列に特徴的かつユニークな核酸フラグメントのスペクトルを生成させ、ｅ）前記フラグメントのスペクトルを分離し、そしてｆ）前記核酸の配列に付随するフラグメントの特徴的プロフィールを決定し、該プロフィールは高度に複雑な複数バンドのプロフィールであり、前記プライマーは３ヌクレオチドの３’末端を有し、そして標的サイトを探してアニーリングするときのプライマーのコアドメインの役割を最適化するために機能する修飾された５’末端を有し、それにより生成されるフラグメントスペクトル中の情報量を最大にする。１８．修飾された５’末端がポリアミド核酸ＤＮＡハイブリッドである、請求項１７の方法。１９．修飾された５’末端が蛍光団である請求項１８の方法。２０．サンプル中の核酸が、制限フラグメントを生じさせるために制限エンドヌクレアーゼで消化されたＤＮＡ配列である請求項１の方法。２１．核酸ポリメラーゼが、AmpliTaqの短縮フラグメントである請求項１の方法。２２．ポリメラーゼがKlenTaqＩである請求項２１の方法。２３．工程(d)の後かつ工程(e)および(f)の前に、増幅された核酸フラグメントの再増幅のための下記の後処理工程を有する請求項１の方法；最初のフラグメントのスペクトルを分離し、当該スペクトルについて工程(a) で用いたものより長いプライマーを用いて工程(a)、(b)および(c)を繰り返し、そして該最初のスペクトルに対して工程(a)、(b)および(c)を繰り返して第２のフラグメントのスペクトルを生成させ、(e)該第２のフラグメントのセットを分離し、そして(d)該核酸の配列に付随する特徴的フラグメントプロフィールを決定し、該プロフィールは、後処理による再増幅を行っていない最初のフラグメントスペクトルから得られるものと異なり且つより特徴的なものである。２４．最初のフラグメントスペクトルからフラグメントを単離および精製したものについて上記後処理を行う、請求項２３の後処理方法。２５．プライマーが７〜１５ヌクレオチドを有し、工程(b)でのアニーニング工程を約１５ないし約７５℃の温度範囲で行う請求項１の方法。２６．プライマーが７〜１０ヌクレオチドを有し、アニーリング工程を約１５ないし約６５℃の温度範囲で行う請求項２５の方法。２７．プライマーが８ヌクレオチドを有し、温度が約４５ないし約６５℃の範囲である請求項２６の方法。２８．核酸の処理を二種のプライマーで同時に行い、一方のプライマーで生じるよりも一層特徴的なプロフィールを生ぜしめる請求項１の方法。２９．同じヌクレオチド長さの二種のプライマーを用いて処理を行う請求項２８の方法。３０．核酸ポリメラーゼがTaq DNAポリメラーゼＩのＮ−末端短縮フラグメントである請求項２９の方法。３１．きわめて近縁な植物ゲノムの核酸サンプルについて行う請求項３９の方法。３２．請求項１の方法で得られる核酸混合物。３３．請求項２０の方法で得られる核酸混合物。３４．請求項３３の方法で得られる核酸混合物。３５．乾燥し、展開されたポリアクリルアミドゲルで核酸のスペクトルを視覚化することを含む請求項１の方法。３６．請求項３４の方法の生成物である最初の核酸フラグメントの永久記録を含む、展開され乾燥されたゲル。３７．支持体に支持されたゲルである、請求項３５のゲル。