JP4018734B2

JP4018734B2 - 単純反復配列の増幅

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Publication number: JP4018734B2
Application number: JP2006323883A
Authority: JP
Inventors: マルティン・ティー・アール・カウパー; マルク・ザボー; ピーター・フォス
Original assignee: ケイヘーネ・エヌ・ブイ
Priority date: 1995-01-16
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2007-12-05
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Description

本発明は、植物および動物の育種、ヒト、植物および動物における遺伝的同一性テスト、疾病の同定およびスクリーニング、法医学分析、並びに遺伝子の標識付与および単離を含む分野（しかしこれには限定されない）にわたるＤＮＡフィンガープリンティングまたはＤＮＡ特徴識別(DNA fingerprinting)の応用およびＤＮＡマーカーの使用に関する。更に詳細には、本発明は、単純反復配列からなる制限断片の選択的増幅に基づくＤＮＡ特徴識別(DNA fingerprinting)の汎用法に関する。本発明はまた、異なった応用分野において、本発明の方法に使用される合成ＤＮＡ分子およびそれに基づく生成物に関する。

ＤＮＡフィンガープリンティングにＰＣＲを基本とする方法を使用するによって、微生物型識別、植物および動物の育種、およびヒト遺伝学的テストのような広範で多様な分野において、ＤＮＡ識別(DNA typing)および遺伝的分析の応用される範囲が急速に拡大してきている。これらの方法によって、ＤＮＡの多形性と称される遺伝物質における小さな変化が検出される。現在のＤＮＡ識別技術の主たる限界は、研究中の遺伝物質にＤＮＡの多形性が欠けていることに由来する。一般に、ＤＮＡの多形性は、ランダム変異、ヌクレオチドの変化または挿入、および欠損の結果であり、これらは各生物学的種の遺伝物質中に蓄積されてきた。ある種においてはランダム変異の頻度が高いようだが、他の種ではこのような変異が起こるのは稀である。その結果、ランダム変異を検出するＤＮＡフィンガープリンティング法は、前者では非常に有益だが後者では有益でない。このように、ＤＮＡ識別の使用は、後者の種類の生物学的種に厳しく制限されている。この制限を克服するために、高度に可変性のＤＮＡセグメントまたはＤＮＡ配列をターゲットとしたＤＮＡ識別法が開発されてきた。高度に可変性を示すタイプのＤＮＡ配列の一つは、いわゆる単純反復配列(simple sequence repeats)と呼ばれる。これらは、１、２、３または４のヌクレオチドの縦列反復配列(tandemly repeated sequence)からなるＤＮＡ配列である。４ヌクレオチドを超える反復ユニットも時々見られる。このような配列は、遺伝物質における縦列反復ユニット数に違いがあり、反復数のこのような違いは、ＤＮＡ複製間で起こるエラーが高率であることによって生ずるものと思われる。単純反復配列の各反復数は異なった対立遺伝子形(allelic form)を構成するので、単純反復配列に基づくＤＮＡマーカーは、現在利用可能な最も有益なタイプのマーカーである。単純反復配列ＤＮＡマーカーを使用する際の制限は２つある。即ち、（a）これらのマーカーの開発は、非常に労力を要し時間のかかるもので、夫々の生物学的種について繰り返す必要がある。また、（ｂ）これらのマーカーの検出は、ＤＮＡマーカーが別々のＰＣＲ反応で個別的同定される単一の遺伝子座分析システムに制限される。

これらの制約を考慮すると、単純反復配列に基づくマーカーシステムの応用範囲を広げるために、単純反復配列マーカーの検出および単離をより効率的に行うことができるＤＮＡ識別法が強く要望されている。

本発明の目的は、効率的で且つ一般的に応用可能なＤＮＡフィンガープリンティング法であって、単純反復配列マーカーを単離する際の労力を要する段階を不要とする方法を提供することであり、このＤＮＡフィンガープリンティング方法は、単一多遺伝子座分析法において多くの単純反復配列マーカーを検出する簡単な方法を提供する。

生物種のゲノム中で単純反復配列を確認する際の主要な問題は、このような配列が一般には極く稀にしか起こならいことにあり、従って、このような配列はランダムＤＮＡフィンガープリンティングにおいても極く稀にしか表れないことにある。本発明において、我々は、ＤＮＡにおける単純反復配列（ＤＮＡフィンガープリンティング中に表示することができる）を選択的に増幅するための方法を考案した。この方法は、これよりも初期の出願（制限断片を選択的に増幅するＤＮＡフィンガープリンティング法の開発；ＥＰ０５３４８５８）を基にしている。要するに、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０５３４８５８に記載されている選択的制限断片増幅法は、ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、合成オリゴヌクレオチド・アダプターを該末端に連結し、「選択的ＰＣＲプライマー」を使用して該制限断片の一組を増幅し、該増幅断片を適切なゲルシステム上で分別することから構成される。その選択性の原理は、選択的ＰＣＲプライマーのデザインにある。一般に、これらのプライマーは、制限断片の末端にある共通配列と適合する配列と、該共通配列の３’末端に付加された可変数のランダムヌクレオチド（選択的ヌクレオチドと呼ばれる）とから構成される。これらの選択的ヌクレオチドによって、適合した配列のある制限断片のみが増幅されることが確実となる。ＰＣＲプライマーがそのターゲットのＤＮＡ断片を有効に増幅するためには、３’ヌクレオチドが完全に適合しなければならないので、この選択原理によって、忠実度が非常に高くなる。このことによって、確実に、使用された選択ヌクレオチドに完全に適合した断片のみが増幅される。更に、この選択は、両末端に同時に適用することが実現されることを理解しなければならない。何故なら、ＰＣＲ反応で指数関数的増幅を達成するためには、両方のＤＮＡ鎖がコピーされる必要があるからである。広範な研究によって、この選択的制限断片増幅法は如何なる生物種起源のＤＮＡに対しても効果的に適用することができ、高度な再現性のある詳細なＤＮＡフィンガープリンティングを生じることが示されている。

該選択的制限断片増幅の好ましい手法では、二つの異なる制限酵素を組み合わせて使用する。一つは、稀少配列をターゲットするために働く酵素（稀少切断制限酵素）であり、第二の酵素は、制限断片のサイズを有効に増幅されるサイズ範囲まで減少させるために働く酵素（高頻度切断酵素）である。稀少配列をターゲテイングすることによって、ＤＮＡ断片の出発混合物の複雑性は基本的に減少し、従ってより信頼性のある正確な増幅を達成することができる。

選択的制限断片増幅のための該ＤＮＡフィンガープリンティング法では、二つのタイプのＤＮＡマーカー：即ち、（ａ）ポイント変異に基づく優性マーカー、(ｂ)挿入または欠損に基づく共優性マーカーが検出される。高率の配列多形を有する種々のＤＮＡｓにおいては、選択的制限断片増幅方法により多くの優性マーカーが生成される。これらの優性マーカーは、単一対立形質性である。より近親のＤＮＡｓではマーカーバンドはより低い頻度で表れ、その結果、十分なマーカーを得るためには、より多くの特徴識別（フィンガープリント）を行わなくてはならない。更に、共優性のマーカーが検出される頻度は、優先マーカーの検出頻度よりもはるかに低い。単純反復配列は、特殊タイプの共優性マーカーとなる。これらの反復要素は、通常は高度の長さ多形を示す。更に、これら遺伝子の多重対立形質が屡々存在し、これらに対して高度の多形情報容量（ＰＩＣ）を与える。

本発明の方法は、共優性のマーカーが好ましく生成される、有効かつ通常に使用できるＤＮＡフィンガープリンティング法を提供する。

発明の概要

本発明において、我々は新規なターゲテング原理を開発した。この方法では、選択的に増幅された制限断片が単純反復配列を多く含むように、ターゲテイング制限酵素およびターゲテイング選択性ＰＣＲプライマーの組み合せを使用した。単純反復配列とは、１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチドの少なくとも二つの縦列に繰り返される単純反復配列ユニットからなるＤＮＡ配列をいう。本発明の原理（図１に示され、概略が図９に示されている）は、その認識配列が選択された単純反復配列とオーバーラップするか、または正確に隣接するように選択されたターゲテイング制限酵素を使用することにある。この方法においては、正確に制限断片の一端にターゲットされた単純反復配列を有する制限断片からなる制限断片の混合物が得られる。適切な二本鎖合成オリゴヌクレオチド（「アダプター」と称する）を、ターゲテイング制限酵素によって生成した端部に連結すると、その末端に共通の配列を有する、一組の制限断片（ターゲットされた単純反復配列が共通配列に隣接している）を含んだ制限断片が得られる。要するに、このプロセスによって、単純反復配列に隣接した二つの可変配列の一つが共通配列と置換される。これによって、ターゲットされた単純反復配列を保持する制限断片を選択的に増幅するように、共通配列および反復配列の一部を含む包括的なＰＣＲプライマーの設計が可能になる。該共通配列はアダプター配列を含み、更に、使用された制限酵素に選択的によっては、任意に認識配列またはその一部および／または切断部位またはその一部を含んでいる。当該プロセスの次のステップは、ターゲテイング酵素によって生じた制限断片のサイズを効率的なＰＣＲ増幅に適合するサイズ範囲まで低下するという一般液な目的のために作用する高頻度切断制限酵素で該ＤＮＡを切断して、該高頻度切断制限酵素によって生じた末端に適切なアダプターを連結することである。当業者は、このステップがターゲテイング制限酵素が関わる開裂・連結工程と同時に行ない得ることを理解するであろう。該ターゲテイング制限酵素は、ターゲットされる単純反復配列のタイプに基づいて選択される。該第二の酵素の選択は、研究中の標的ＤＮＡのタイプ、標的ＤＮＡにある第二の酵素の認識部位の推定頻度、およびターゲッテイング酵素と組み合わせて得られる制限断片の推定サイズに依存する。下記工程では、ターゲットされる単純反復配列を保持する制限断片は、下記の一般的なデザインの二つの異なったＰＣＲプライマーを使用して増幅される。即ち、プライマー１は、その５’末端に、第一の制限酵素および適宜なアダプター連結によって生じる制限断片の末端にある共通配列と適合する配列を有し、またその３’末端には、単純反復配列の配列に適合する少なくとも５つのヌクレオチドを有する。プライマー２は、その５´末端に、第二の制限酵素および適切なアダプター連結によって生じた制限断片の末端にある共通配列に適合する配列を有し、またその３’末端には、０、１、２、３、４またはそれ以上の範囲のランダムに選択されたヌクレオチドを有する。定義された配列に適合した配列は、対応する鎖と同様のヌクレオチド配列を有する配列と称され、或いは定義された配列またはその一部の対立鎖の相補配列と称される。

本発明によって得られるＰＣＲ生成物は、標準ゲルマトリックスを用いたゲル電気泳動法等の標準分別法を使用して同定することができる。もし、所定のターゲット酵素によって、単一ゲル上に表示できる制限断片よりも多くの、ターゲットされた反復を含む制限断片が生成されるならば、高頻度切断末端に対する選択的プライマー中に適切な数の選択的ヌクレオチドを使用して、不連続な数の増幅された断片を得ることができる。

本発明による方法は、二つの異なる酵素を使用することに限定されない。１以上のターゲテイング制限酵素を、一以上の高頻度切断制限酵素と組み合わせて使用しることができる。

本発明は、動物、植物またはヒト起源のゲノムＤＮＡを、例えば制限酵素で消化して得られる単純反復配列を含んだ制限断片を選択的に増幅することに基づくＤＮＡフィンガープリンティングの汎用法に関する。この方法は、（ａ）出発ＤＮＡを、単純反復配列にオーバーラップするかまたは隣接する認識配列において、またはその近傍において切断する少なくとも一つの酵素（第一の制限酵素と称す）と、好ましくは4塩基配列において切断する少なくとも一つの酵素（第二の制限酵素と称す）とを含む２以上の異なる消化制限酵素で消化する工程と、（ｂ）異なる二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを、該制限酵素によって生成した断片の両端の各々に連結（ここで該アダプターは、対応する制限酵素によって産生された5’末端と適合する一末端を但持するようにデザインされている）する工程と、（ｃ）下記一般的デザインを有する二つ以上の異なるＰＣＲプライマーを使用して制限断片を選択的に増幅する工程であって：一つのプライマーは、その５‘末端に、第一の制限酵素のアダプターおよびその認識部位の配列に適合する配列、またはその一部を有すると共に、その３’末端には単純反復配列の配列に適合する少なくとも５つのヌクレオチドを有し（プライマー１と称する）、また一つのプライマーは、５‘末端に、第二の制限酵素アダプターの配列およびその認識配列に適合する配列、またはその一部を有すると共に、その３’末端には、０、１、２、３、４またはそれ以上のランダムに選択されたヌクレオチドを有する（プライマー２と称される）ものである工程とを具備する。

好ましくは、ターゲテイング制限酵素の認識配列は、単純反復配列のすぐ隣に位置している。

本発明の好ましい態様において、単純反復配列からなる制限断片の選択的増幅は、選択的プライマーを使用した選択的増幅反応を、選択性をあげながら、すなわち該プライマーの3’末端における選択ヌクレオチドの数を増しながら、連続カスケード反応で実施される。各工程は、単純反復配列を含む制限断片を富化するステップを形成する。

本発明の好ましい態様では、特殊な単純反復配列をターゲットするために使用される制限酵素は、その認識配列が反復配列に最大限にオーバーラップするように選択されるのが好ましい。該認識配列は、少なくとも単純反復配列単位またはその一部を少なくとも一つ含むこと、および該単純反復配列単位とオーバーラップしない少なくとも一つのヌクレオチドからなることが好ましい。最大限オーバーラップすることの論理的根拠は、このようにすれば、研究中のゲノムに存在する反復配列を最大可能な数に増幅できることにある。例えば、制限酵素HinfＩは、下記4塩基：（ATTC）n, (AATC)n, (ACTC)n, (AGTC)ｎをターゲットするために使用できる。各々の場合、HinfＩ認識配列ＧＡＮＴＣ5ヌクレオチドのうち４つが、ただ一つの非オーバーラップヌクレオチドを除いて、該反復をオーバーラップする。このターゲテイング酵素によって、すべての起こりうる反復の25％（１／４）を増幅できる。別の例には、３塩基リピート（ＡＡＣ）ｎをターゲットする制限酵素ＭaｅIIIが包含される。この場合、ＭａｅIII認識部位ＧＴＮＡＣの５つのヌクレオチドのうち３つのみが、２つの隣接する非オーバーラップヌクレオチドを残して、該反復配列とオーバーラップする。この酵素は、存在する１６の（ＡＡＣ）ｎ反復、つまり、ジヌクレオチドＧＴに隣接した反復のわずか一つのみをターゲットする。３つの非オーバーラップヌクレオチドの場合、ターゲットされた反復の数は６４のうちわずか一つである。図２には、２、３および４塩基の異なる反復をターゲットするために使用され得る好ましい制限酵素が掲載されている。

ターゲット制限酵素は、タイプ１またはタイプ２の制限酵素のグループから選択され得る。タイプ１の制限酵素は、核酸の鎖を認識配列内で切断するパリンドローム制限酵素である。図１０に概略を示すが、そこでは、ＸｂａＩが、タイプ１の制限酵素の例としてあげられている。

本発明のより好ましい態様では、ターゲテイング制限酵素は、タイプ２の制限酵素グループに属す。タイプ２の制限酵素は、認識配列の外にある核酸の鎖を切断する非パリンドローム制限酵素である。タイプ２の制限酵素を使用すると、単純反復配列が付加的に選択される。該付加的選択は、その一端に、一つ以上の単純反復配列単位またはその一部の配列に適合した配列を有する一本鎖伸長物を但持したオリグヌクレオチド・アダプターを使用することにより得られる。該オリゴヌクレオチド・アダプターの一本鎖伸長物に対して相補的な一本鎖伸長物を持つ制限断片のみが、該アダプターに連結される。図式的な図１１に示されている。図１１では、タイプ２の制限酵素の例としてＢｓｍＡＩが挙げられている。下記工程では、これらの制限断片は、下記の一般的デザインを有する二つの異なったＰＣＲプライマーを使用して選択的に増幅される。即ち、プライマー１は、５‘末端に、第一の制限酵素のアダプターの配列に適合した配列を有し、その後に第一の制限酵素の認識部位またはその一部の配列に適合した配列が続き、そして伸長物に適合する配列が続き、３’末端には、単純反復配列の配列に適合する少なくとも５つのヌクレオチドを但持する。また、プライマー２は、５‘末端に、第二の制限酵素のアダプターの配列およびその認識配列に適合する配列を有し、その３’末端には、０、１、２、３、４またはそれ以上のランダムに選択されたヌクレオチドを有する。

プライマー１の５’末端にある選択ヌクレオチドの配列は、単純反復配列の配列またはその配列の一部と同じ位相である配列を有し、かつ第一の制限酵素の認識部位中に存在する配列を有する少なくとも一つの単純反復配列単位またはその一部を含んでいる。

複数組の単純反復配列のフィンガープリンティングが、固定されたターゲテイングプライマー（プライマー１）と組み合わせた高頻度切断プライマー（プライマー２）のパネルを使用した本発明の方法によって得ることができる。

本発明の好ましい態様では、消化および連結工程が一工程で実施される。両末端にアダプターが連結された制限断片を得るために、アダプターは一端が該制限断片の両末端の何れにも連結できるように、また連結後、該制限酵素の認識部位が基に戻らないようにデザインされている。

出発ＤＮＡは、植物、動物、ヒト等の真核生物起源のゲノムＤＮＡまたはその断片でもよい。

本発明の方法では、一つの遺伝子座の多数の対立形質の検出が可能である。更に本発明の方法では、一分析で、多数の遺伝子座の検出が可能である。

本発明は更に、該発明の方法を応用したキットに関する。該キットは、上記の制限酵素、二本鎖合成オリゴヌクレオチド配列および本発明による選択プライマーを具備する。本発明の手法によって得られた増幅された断片は、ゲル上で分別されて、ＤＮＡフィンガープリンティングが得られる。

下記実施例および図は本発明を例示するものであるが、本願はこれらの実施例には限定されない。

実施例１：（ＴＣ）ｎモチ―フの制限酵素ＢａｓｍＩによるターゲテング
＜序論＞
ＢｓｍＡＩは、配列ＧＴＣＴＣｎ ^↓ ｎｎｎｎ _↑を認識する。（ＴＣ）ｎ繰り返し（モチーフまたは反復モチーフと称される）のために、この特殊型認識配列ＧＴＣＴＣｔ ^↓ ｃｔｃｔ _↑がターゲットされた。この実施例では、実施例２および３のように、認識配列の外側で切断する制限酵素が使用される。これによってオーバーハングが形成され、特異的なアダプター配列を使用することによる連結中の選択が可能となる。ここでは、連結反応中に（ＴＣ）ｎモチーフを選択することを可能とするアダプターが使用される。該方法は、更に図１１に説明される。

Ａ）ＤＮＡの単離および修飾
テンプレート調製物の最初の段階では、ＤＮＡを稀少切断制限酵素および高頻度カッターとしてのＭｓｅＩ（Ｔ／ＴＡＡ）によってＤＮＡの制限を行う。反復モチーフをターゲットするためには一般に、両酵素が良く働きまたその後の連結反応にも適する緩衝液を使用する。該ＤＮＡは、３７℃で最低１時間で制限される。高品質のＡＦＬＰフィンガープリンティングを行うためには、ＤＮＡ断片の殆どは、＜５００ｂｐとすべきである。ＭｓｅＩ（ＴＴＡＡ）は、殆どの植物および動物種で小さなＤＮＡ断片を与える。このように、ＤＮＡを、その後のポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）で十分増幅できるサイズまで切り整えられる。

実施例１では、ＣＥＰＨ（ヒト多形性研究所、パリ、フランス）から入手されたヒト族１４２３起源のＤＮＡ上で、該方法がテストされた。最初に、ヒトＤＮＡが、二つの酵素：ＢｓｍＡＩ（単純反復配列モチーフの境界をターゲットする）およびＭｓｅＩの組み合せで、切断された。ＤＮＡを制限するための反応条件は
0.5 μグラムＤＮＡ
５単位ＢｓｍＡＩ（稀少カッター、ニューイングランド、バイオラボ）
１０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＡｃｐＨ７.5
10 mM MgAc
50 mM Kac
5 mM DTT
50 ng/μｌＢＳＡ
全量で４０μリットル
制限反応は、ＢｓｍＡＩにとって至適な温度５５℃の温度で開始された。１時間後、５単位のＭｓｅＩ（ニューイングランド、バイオラボ）を添加し、インキュベーションを３７℃で更に一時間続けた。

ＤＮＡの制限を行った後、二つのアダプターが制限断片に連結される。ＭｓｅＩアダプターは下記構造を有している。

5 - GACGATGAGTCCTGAG - 3
3 - TACTCAGGACTCAT - 5
ＭｓｅＩアダプターのデザインおよび使用については、既にヨーロッパ特許出願ＥＰ０５３４８５８で記載されている。本実施例および次の一連の実施例に使用されるすべての稀少切断アダプターは、ＥＰ０５３４８５８に記載されるように同一重量モル濃度のオリゴヌクレオチドを使用して調製される。

ＢｓｍＡＩアダプターは、下記デザインを持つ。

5 - ビオチン - CTCGTAGACTGCGTACC - 3
3 - TCTGACGCATGGGAGA - 5
このＢｓｍＡＩアダプターは、配列５―ＡＧＡＧから始まるボトム鎖を含む。このデザインによって、アダプターは、ＢｓｍＡＩ断片：５―ＣＴＣＴのオーバーハングとして存在する４ヌクレオチド（ＮＮＮＮ）の配列の２５６の起こりうる順列のうちの１つにのみ連結され得る。この配列は、該タイプ（ＣＴ）の二つの反復モチーフを含む。

アダプターは、連結後、制限部位が元に戻らないようにデザインされている。連結反応の間、制限酵素は依然活性を持つ。このように、断片コンカテマーが制限されているので、断片対断片の連結は抑制される。アダプターはりん酸化されていないのでアダプター対アダプター連結は不可能である。

アダプターの連結は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０５３４８５８に記載されている様に行われた。次に、ビオチン化された断片を非ビオチン化された断片から記載（ヨーロッパ特許出願ＥＰ０５３４８５８）のように分離してテンプレート分子を精製した。

Ｂ）反復モチーフ境界を含むテンプレート分子の増幅
該ＤＮＡを修飾した後、テンプレートＤＮＡの調製、二段階の増幅を行ない、単純反復配列モチーフをターゲットした。選択的制限断片増幅反応（ＡＦＬＰ反応とも称される）において、３’伸長部によるＡＦＬＰプライマーの選択性は、３選択ヌクレオチド長までは一般的に良好である。より長い伸長部を使用するときは、選択的増幅は連続工程で行うことが好ましい。各工程では、伸長部での３ヌクレオチド以下がテンプレートＤＮＡ混合物からのサブセットに対して選択的でなくてはならない。このように、各工程で良好な選択性が保証される。単純反復配列モチーフのターゲテイングには、少なくとも５選択的ヌクレオチドを持つ伸長部を使用することが不可欠である。工程１では、最大数３つの選択的ヌクレオチドが使用される（プレ増幅）。最終増幅では、該伸長部が反復モチーフをターゲットとするのに必要な全５またはそれ以上の選択的ヌクレオチドを含む。この手法を変更して、シークエンス・ゲル上で良好に解像することができる断片数で、フィンガープリンティングを得るために必要な全伸長ヌクレオチド数によっては、任意の工程で、伸長部に使用される選択的ヌクレオチドは少なくてもよい。

プレ増幅工程の後、プレ増幅されたテンプレート混合物がテンプレートとして使用され、単純反復配列モチーフを特定する６ヌクレオチドによる特異的伸長を、ＡＦＬＰプライマーの一つに使用して、ＡＦＬＰ反応が行われた。これらの実施例においてその他のＡＦＬＰプライマーとして、標準ＭｓｅＩプライマーが使用された。この実施例では、（ＣＴ）ｎモチーフの稀少切断酵素であるＢｓｍＡＩによるターゲテングについての方法が記載されている。他の配列モチーフは夫々、制限酵素、アダプター配列およびプライマー独自の組み合せによってターゲットされる。

該二つの連続ＰＣＲ反応は、下記のように行なわれた。

下記成分を含む５０μｌの反応混合物を会合させた。

５μｌビオチン化されたテンプレート再懸濁物
３０ng 無標識ＢｓｍＡＩプライマー１a
３０ng 無標識ＭｓｅＩプライマー２a
0.8 mM dNTPs
1.5 mM MgCl₂
50 mM KCl
10 mM Tris-Cl pH=8.3
0.4 U Tag ポリメラーゼ（パーキンエルマー）
ＰＣＲの条件は、次の通りである。

パーキンエルマー９６００熱サイクラーのサイクル概要：
３０秒９４℃変性
３０秒６５℃アニーリングサイクル１
６０秒７２℃伸長
低アニーリング（１２サイクル）
各サイクルの温度は、０．７℃ サイクル２―１３
３０秒９４℃変性
３０秒５６℃アニーリングサイクル１４―３６
６０秒７２℃伸長
二段階ＡＦＬＰ反応における第二の工程は、ＡＦＬＰ反応は最初の工程と同様のサイクル条件で行う。第一の増幅工程の反応混合物から小部分を取り、第二の増幅工程の出発物質として使用する。この目的のために、第一の増幅生成物は、Ｔ０．１Ｅ中で２０倍に希釈され、各ＡＦＬＰ反応用に５μｌが取り出される。第二の増幅ステップのための該反応混合物は下記成分を含む。

５μｌの２０倍希釈のプレ増幅混合物
５ng ³³P放射性標識ＢｓｍＡＩプライマー１ｂ
30 ng 無標識ＭｓｅＩプライマー２ｂ
0.8ｍＭｄＮＴＰｓ
1.5 ｍＭＭｇＣｌ_２
50ｍＭＫＣｌ
10 mM Tris-Cl, pH=8.3
0.4 U Taqポリメラーゼ（パーキンエルマー）
プライマーの標識付けは、記載（ヨーロッパ特許出願ＥＰ５３４８５７）のように実施された。

本実施例に使用されたプライマーは次の通りである：
工程１ＢｓｍＡＩプライマー１a: 5-GACTGCGTACCCTCTCTC
このプライマーは、全部で３つの選択的ヌクレオチド（＋３とも表記される）を含む。下記プライマーにおいては、伸長部の長さについてのこの短縮表記を使用する。

工程２
プライマーの組み合せ１（ＰＣ１）
ＢｓｍＡＩプライマー１ｂ：
５ - ³³P - GACTGCGTACCCTCTCTCTCT (+6)
MseI プライマー２ｂ: 5 - GATGAGTCCTGAGTAATCT (+3)
プライマーの組み合せ2（ＰＣ2）
ＢｓｍＡＩプライマー１ｂ：
５ - ³³P - GACTGCGTACCCTCTCTCTCT (+6)
MseI プライマー２ｂ: 5 - GATGAGTCCTGAGTAATCA (+3)
Ｃ）増幅生成物の分析
第二の増幅反応からの放射性標識を施した生成物は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０５３４８５８に記載の様に分析された。該反応の生成物は、図３に表示される。

実施例２：（ＣＴＴ）ｎモチーフの制限酵素ＥａｒＩによるターゲテイング
制限酵素ＥａｒＩは、ＣＴＣＴＴＣｎ ^↓ nnn _↑の配列を認識する。（ＣＴＴ）_ｎモチーフをターゲテングするためには、特殊フォームの認識配列、ＣＴＣＴＴＣＴ ^↓ ｔｃｔ _↑がターゲットされる。この実施例では、実施例１におけるように、その認識部位の外側を切断する制限酵素が使用される。これによって、オーバーハングが産生され、このオーバーハングは、連結の際に、特異的アダプター配列を使用するという選択を可能にする。この方法は、更に図１１に説明される。（ＣＴＴ）ｎモチーフをターゲテイングする場合、稀少切断酵素、アダプター配列およびプライマー配列に対応する要素は、実施例２では、ここに記載した配列と置き換えられなくてはならない。

Ａ）ＤＮＡの単離およ修飾
本実施例のために、我々は、４つの種のわからない胡椒の育種系からＤＮＡを単離した。ＤＮＡは、スチュアートおよびビア（１９９３）、バイオテクニク１４、７４８―７５０に記載のＣＴＡＢ手法を使用して単離された。ＤＮＡｓは、酵素ＥａｒＩによる切断を３７℃で行い、ＤＮＡがＥａｒＩおよびＭｓｅＩによって共消化された以外は、実施例１に記載されたように制限、修飾された。テンプレートが実施例１に記載のように調製増幅された。これには、ＥａｒＩ制限酵素によって産生された３’- ＡＧＡオーバーハングに対する特殊なアダプターが必要とされた。

（ＴＴＣ）ｎモチーフをターゲテングするＥａｒＩアダプターは、下記のデザインを有する。

５ - ビオチン - CTCGTAGACTGCCTACC
TCTGACGCATGGAGA - 5
なお、このＥａｒＩアダプターは、特に配列５’-TCTにターゲットされるボトム鎖を含む。

Ｂ）テンプレートＤＮＡの増幅
続く増幅反応には、下記のプライマーが使用される。

工程１
ＥａｒＩプライマー１a： 5 - GACTGCGTACCTCTTC (+2)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAAA (+1)
工程２
ＥａｒＩプライマー１a： 5 - ^３３ＰGACTGCGTACCTCTTCTTC (+5)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAAATT (+3)
生成物の増幅が実施例１に記載のように行われた。

Ｃ）増幅生成物の分析
増幅生成物の分析は、フジックス（Fujix）ＢＡＳ２０００ホスホアイメージャー(phosphorimager)を使用してゲル像を得る以外は上記記載の通りであった。結果を図４に示す。

実施例３：（ＣＣＴＴ）ｎモチーフの制限酵素ＥａｒＩによるターゲテイング
制限酵素ＥａｒＩは、ＣＴＣＴＴＣ ^↓ nnn _↑の配列を認識する。ターゲテング（ＣＣＴＴ）ｎモチーフをターゲテイングするため、この認識配列の特殊フォーム、ＣＴＣＴＴＴＣｃ ^↓ｔｔｃ_↑がターゲットされる。これは、その認識部位の外側を切断する制限酵素の第３の例である。これによって、オーバーハングが産生され、連結の際に特異的アダプター配列の選択が可能となる。この方法は、更に図１１に説明される。稀少切断酵素、アダプター配列およびプライマー配列に対応する図１１の要素は、実施例３では、ここに記載した配列と置き換えられなくてはならない。

Ａ）ＤＮＡの単離および修飾
本実施例では、我々は、ヒトＤＮＡｓおよび品種のわからないチキン起源のＤＮＡを分析した。ヒトＤＮＡｓは、ＣＥＰＨから得られ、元々は下記個人に由来する：１４２４０３、１４２３０３、１４１３０３および８８４０３（図５、パネル１、レーン１から４）。チキン血液由来のＤＮＡｓは、１０μｌの凍結血液を使用し、マニアチスら（１９８２）による記載の手法に従って単離された。チキンのＤＮＡｓによって得られたパターンはレーン１から４、パネルＩＩに表示される。

（ＴＴＣＣ）ｎモチーフをターゲテイングする場合、ＥａｒＩ制限断片にある配列５’―ＴＴＣをターゲットするように、ボトム鎖が特異的にデザインされている。

（ＴＴＣＣ）ｎモチーフをターゲットするためのＥａｒＩアダプターは下記のデザインを有する。

５ - ビオチン - CTCGTAGACTGCGTACC
TCTGACGCATGGAAG - 5
該ＤＮＡｓの修飾は、実施例２に記載のように行われた。

Ｂ）テンプレートＤＮＡの増幅
生成物の増幅は、下記のプライマーを使用して行われた。

工程１
ＥａｒＩプライマー１a： 5 - GACTGCGTACCTTCCT (+2)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAAA (+1)
工程２
ＥａｒＩプライマー１a： 5 - ^３３ＰGACTGCGTACCTTCCTTCC (+5)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAAATT (+3)
生成物の増幅が実施例１に記載のように行われた。

Ｃ）増幅された生成物の分析
増幅生成物の分析は、フジックス（Fujix）ＢＡＳ２０００ホスホアイメージャーを使用してゲル像を得る以外は上記記載の通りであった。その結果を図５に示した。

実施例４：（ＴＡＡＡ）ｎモチーフの制限酵素ＤｒａＩによるターゲテイング
制限酵素ＤｒａＩは、ＴＴＴ^↓ ＡＡＡ _↑の配列を認識する。本実施例では、平滑末端断片を生成する稀少切断制限酵素が使用される。この方法は、図１に一般的に説明される。（ＴＡＡＡ）ｎモチーフをターゲテイングする場合、図１に記載の稀少切断酵素、アダプター配列およびプライマー配列は、実施例４に記載された配列と置き換えられなくてはならない。

ＣＥＰＨ（ヒト多形性研究所、パリ、フランス）から入手されたヒト族８８４（個人１―１６）起源のＤＮＡについて該方法がテストされた。

Ａ）ＤＮＡの修飾
ＤＮＡの修飾が、実施例２に記載のように行われた。

ＤｒａＩアダプターは、下記のデザインを持つ
５'- ビオチン - CTCGTAGACTGCGTACA
CATCTGACGCATGT - 5'
なお、ＤｒａＩは、平滑末端を産生し、よって平滑末端のアダプターを必要とする。連結に続いて、ビオチン化されたテンプレートの分子が実施例１に記載のように精製される。

Ｂ）テンプレートＤＮＡの増幅
増幅は、下記のプライマーを使用して行われた。

工程１
ＤｒａＩプライマー１a： 5 -GTAGACTGCGTACAAAATAA (+3)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAATA (+2)
工程２
ＤｒａＩプライマー１ｂ：5 -^３３Ｐ- GTAGACTGCGTACAAAATAAATA (+6)
ＭｓｅＩプライマー２b：5 - GATGAGTCCTGAGTAATATC (+4)
生成物の増幅が実施例１に記載のように行われた。

Ｃ）増幅生成物の分析
第二の増幅反応起源の放射標識された生成物はヨーロッパ特許出願ＥＰ０５３４８５８に記載されたように分析された。反応生成物は図６に表示されている。

実施例５：（ＴＧ）ｎモチーフの制限酵素ＮＬＡIIIによるターゲテイング
制限酵素NlAIIIは、^↓CATG _↑の配列を認識する。本実施例では、付着末端の断片を産生する制限酵素が使用される。この方法は、図１０に詳しく説明されている。（ＴＧ）ｎモチーフをターゲテイングする場合、図１０に記載の、稀少切断酵素、アダプター配列およびプライマー配列に対応する要素は、実施例５に記載された配列と置き換えられなくてはならない。

該方法は、品種のわからない系のキュウリ起源のＤＮＡについてテストされた。ＤＮＡは、実施例１に記載のように単離された。

NlaIIIアダプターは、下記のデザインを持つ
５ - ビオチン - CTCGTAGACTGCGTACCCATG
TCTGACGCATGG - 5
テンプレート分子は、実施例１に記載のように精製された。

Ｂ）テンプレートＤＮＡの増幅
増幅は下記のプライマーを使用して行われた．
工程１
Nla III プライマー１a： 5 - CTGCGTACCCATGTGT (+3)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAAA (+1)
工程２
Nla IIIプライマー１ｂ： 5 -^３３Ｐ- GCGTACCCATGTGTGTG +6)
ＭｓｅＩプライマー２b：5 - GATGAGTCCTGAGTAAATT (+3)
生成物の増幅が実施例１に記載のように行われた。

Ｃ）増幅生成物の分析
増幅生成物の分析は、フジックス（Fujix）ＢＡＳ２０００ホスホアイメージャーを使用してゲル像を得る以外は上記記載の通りである。結果を図7に示す。

実施例6：（ＴAＧA）ｎモチーフの制限酵素のXbaIによるターゲテイング
制限酵素XbaIは、T^↓CTAG _↑Aの配列を認識する。本実施例では、付着末端の断片を産生する制限酵素が使用される。この方法は、図１０に詳しく説明されている。

該方法は、品種のわからないキュウリの系起源のＤＮＡについてテストされた。ＤＮＡは、実施例２に記載のように単離された。

ＸｂａＩアダプターは、下記のデザインを持つ
５ - ビオチン - CTCGTAGACTGCTAGATA
TCTGACGCATGTGATC - 5
テンプレート分子は、実施例１に記載のように精製された。

Ｂ）テンプレートＤＮＡの増幅
増幅は下記のプライマーを使用して行われた．
工程１
XbaI プライマー１a： 5 - CTGCGTACACATGATA (+2)
ＭｓｅＩプライマー２a： 5- GATGAGTCCTGAGTAA (+0)
工程２
XbaIプライマー１ｂ： 5 -^３３Ｐ- GCGTACACTAGATAGAT (+6)
ＭｓｅＩプライマー２b：5 - GATGAGTCCTGAGTAACT (+2)
生成物の増幅が実施例１に記載のように行われた。

Ｃ）増幅生成物の分析
増幅生成物の分析は、フジックス（Fujix）ＢＡＳ２０００ホスホアイメージャーを使用してゲル像を得る以外は実施例１記載の通りである。結果を図8に示す。図８は、左に示した６０から９０ヌクレオチドの範囲の生成物を含む像の断面を示す。像には、１２の品種のわからないトマト改良品種系起源のフィンガープリンティング・パターンを持つ１２レーンがある。同様のパターンは別のトマト品種改良系でも得られる。

図１は、単純反復配列を含む制限断片の選択的増幅の一般的概念の大要を図示している。文字は下記を示す。

Ｘ：０、１、２または３ヌクレオチドの任意配列
Ｙ：任意ヌクレオチド
ＸＹ：１、２、３または４ヌクレオチドの単純反復配列
［ＸＹ］ｎｎ回反復ユニットからなる単純反復配列
Ｘ’Ｙ’：ＸＹと相補的配列
Ｔ：非オーバーラップヌクレオチド
ＴＸ：ターゲット制限部位配列
Ｔ’Ｘ’：ＴＸの相補的配列
ＦＦ：高頻度切断制限部位配列
Ｆ’Ｆ’：ＦＦと相補的な配列
ＡＡＡＡＡ：切断されたＴＸ部位と連結される合成アダプタ配列
ＢＢＢＢＢ：切断されたＦＦ部位と連結される合成アダプタ配列
ＡＡＡＡＡＴ［ＸＹ］ｎ制限断片の選択的増幅のために使用された
特異的ＰＣＲプライマーの一般的デザイン
図２−１は、単純反復配列をターゲテイングするための好ましい制限酵素の例を示している。該単純反復配列もしくは該反復の一部またはその相補的配列は、その認識部位に下線を施してある。制限酵素開裂部位は矢印で示してある。図２−２は、単純反復配列をターゲテイングするための好ましい制限酵素の例を示している。該単純反復配列もしくは該反復の一部またはその相補的配列は、その認識部位に下線を施してある。制限酵素開裂部位は矢印で示してある。図２−３は、単純反復配列をターゲテイングするための好ましい制限酵素の例を示している。該単純反復配列もしくは該反復の一部またはその相補的配列は、その認識部位に下線を施してある。制限酵素開裂部位は矢印で示してある。図２−４は、単純反復配列をターゲテイングするための好ましい制限酵素の例を示している。該単純反復配列もしくは該反復の一部またはその相補的配列は、その認識部位に下線を施してある。制限酵素開裂部位は矢印で示してある。図３は、（ＴＣ）ｎ繰り返しの制限酵素ＢｓｍＡＩを用いたターゲテイングを図示している。標準４.５％のポリアクリルアミド・ゲル上で分析された電気泳動図を図に示す。図には、二つのパネル（ＰＣ１およびＰＣ２）が含まれ、これには、ＢｓｍＡＩ＋６プライマーを、３’伸長部―ＴＣＴ（パネル１）または３’伸長部―ＴＣＡ（パネルＩＩ）を含むＭｓｅＩプライマー＋３との組み合わせによって増幅した生成物が含まれる。これらのパネルで分析したＤＮＡｓは、ＣＥＰＨ族１４２３、１〜１５メンバー起源である。生成物の大きさは、図の左余白に示したように、６０ヌクレオチドから５００ヌクレオチドにわたる。矢印は、マーカーを含む共優性単純反復配列の明らかな例を示している。図４は、（ＣＴＴ）ｎ繰り返しの、制限酵素ＥａｒＩによるターゲテングを図示している。図には、図の左余白に示される２５０ヌクレオチド〜３２０ヌクレオチドの範囲の生成物を含む像の断面図が示される。４つのレーン（１から４）は、４つの独立した育種系の胡椒由来のＤＮＡを使用して産生された特徴識別パターンを示す。他の栽培変種についても同様のパターンが得られよう。図５は、（ＣＣＴＴ）ｎ繰り返しの制限酵素ＥａｒＩによるターゲテングを図示している。図には、左余白に示される１８０ヌクレオチドから２７０ヌクレオチドの範囲での生成物を含む像の断面図が示される。該像には２つのパネル（ＩおよびＩＩ、像の上に示す）が含まれ、夫々は４つのレーンを含む。パネルＩでは、ヒトＣＥＰＨ族（１４２４０３、１４２３０３、１４１３０３、８８４０３、夫々、１、２、３、４レーンに示す）由来の４固体起源のＤＮＡｓが分析された。パネルＩＩには、チキン育種系（レーン１から４）由来の４つの異なるチキン由来のパターンが含まれる。同様のパターンは、他のチキン育種系でも得られよう。図６は、制限酵素ＤｒａＩによる（ＴＡＡＡ）ｎ繰り返しのターゲテイングを図示している。図には、標準4.5％ポリアクリルアミド・ゲル上で分析された電気泳動図が示される。図には、像の左余白に示される３５０から５００ヌクレオチドの範囲での生成物による特徴識別が含まれる。この像において分析されたＤＮＡｓは、ＣＥＰＨ族８８４、１〜１６メンバー起源であった。矢印は、マーカーを含む共優性単純反復配列の例を指す。図７は、制限酵素ＮｌａIIIによる（ＴＧ）ｎ繰り返しのターゲテイングを図示している。図には、左余白に示される６０ヌクレオチドから１１０ヌクレオチドの範囲での生成物を含む像の断面が示される。該像には、種別のはっきり分からない８キュウリ育種系由来のフィンガープリンティングパターンを有する８レーンが含まれる。同様のパターンは、他のキュウリ育種系でも得られよう。図８は、制限酵素ＸｂａＩによる（ＴＡＧＡ）ｎ繰り返しのターゲテイングを説明している。図には、左余白に示される６０ヌクレオチドから９０ヌクレオチドの範囲での生成物を含む像の断面が示される。該像には、種別のはっきりしない１２トマト育種系由来のフィンガープリンティングパターンを有する１２レーンが含まれる。同様のパターンは、他のトマト育種系でも得られよう。図９には、単純反復配列を含む制限断片の選択的増幅の概略的アウトラインが提供されている。陰を付したボックスはアダプターおよびターゲッテイング制限酵素の認識部位の部分を表し、黒塗りボックスはアダプターおよび高頻度切断制限酵素の認識部位を表し、中空ボックスは単純反復配列ユニットを示し、線は単純反復配列をフランキングする核酸配列を示す。長い矢は、適合および非適合の選択的プライマー１および、短い矢は適合および非適合の選択的プライマー２を示す。両プライマーがその断片の末端と適合する制限断片のみが、指数級数的に増幅する。図１０は、ターゲテイング酵素としてＸｂａＩ等のタイプ１の制限酵素を使用し、ＭｓｅＩ等の高頻度切断酵素を使用した、単純反復配列を含む制限断片の選択的増幅の概要を図示している。該ターゲットされた単純反復配列は、（ＴＡＧＡ）ｎであり、この反復のターゲテイングは、小さなミシン目線囲みで描かれている。選択的増幅は２段階で行われる。図１１は、ターゲテイング酵素としてＢｓｍＡＩ等のタイプ２の制限酵素を使用し、ＭｓｅＩ等の高頻度切断酵素を使用した、単純反復配列を含む制限断片の選択的増幅の概要を図示している。該ターゲットされた単純反復配列は、（ＴＣ）ｎであり、この反復のターゲテイングは、小さなミシン目線囲みで描かれている。選択的増幅は２段階で行われる。

Claims

標的ＤＮＡからの単純反復配列を含んでなる少なくとも一つの制限断片を増幅するためのキットであって：少なくとも、
・前記単純反復配列にオーバーラップまたは直接隣接する認識ヌクレオチド配列において、または該認識ヌクレオチド配列の外側において開裂させる制限酵素（ターゲッティング制限酵素という）により生じる末端に適合した一つの末端を有する、二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターと、
・下記の配列（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる配列を有する一つのプライマーと
（ｉ）その５’末端における、（ａ）前記ターゲッティング制限酵素で前記標的ＤＮＡを消化し、且つ（ｂ）前記二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを前記工程（ａ）により生じた制限断片の末端にライゲートすることにより生じた、制限断片末端の共通配列に適合する配列；および
（ｉｉ）その３’末端における、前記単純反復配列の配列に適合する少なくとも５つのヌクレオチド
を具備するキット。
標的ＤＮＡからの単純反復配列を含んでなる少なくとも一つの制限断片を増幅するためのキットであって：少なくとも、
・二以上の制限酵素であって、少なくとも一つの制限酵素は、前記単純反復配列にオーバーラップまたは直接隣接する認識ヌクレオチド配列において、または該認識ヌクレオチド配列の外側において開裂させる制限酵素（ターゲッティング制限酵素という）であり、また少なくとも一つは高頻度切断制限酵素である二以上の制限酵素と；
・対応する前記制限酵素により生じる末端に適合する一つの末端を有する、少なくとも二つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターと；
・下記の配列（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる配列を有する少なくとも一つのプライマーと；
（ｉ）その５’末端における、（ａ）前記ターゲッティング制限酵素で前記標的ＤＮＡを消化し、且つ（ｂ）前記二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを前記工程（ａ）により生じた制限断片の末端にライゲートすることにより生じた、前記ターゲッティング制限酵素で生じた制限断片末端の共通配列に適合する配列；および
（ｉｉ）その３’末端における、前記単純反復配列の配列に適合する少なくとも５つのヌクレオチド
・前記高頻度切断制限酵素に対応する前記アダプターの配列に適合する５’末端の配列、前記高頻度切断制限酵素の認識配列またはその一部、およびその３’末端のランダムに選択された０〜４のヌクレオチドを有する、少なくとも一つのプライマーと
を具備するキット。
遺伝学的分析のための、請求項１または２に記載の診断キット。
法医学分析のための、請求項１または２に記載の診断キット。
動物または植物における遺伝子的特質の遺伝を検出するための、請求項１または２に記載の診断キット。