JPH11502406A - 単純反復配列の増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.単純反復配列を含む制限断片を選択的に増幅する方法であって: (a)出発DNAを2以上の異なる制限酵素で消化して制限断片を得る工程で あって、これらの酵素の少なくとも一つは、単純反復配列にオーバーラップする か又は隣接したその認識ヌクレオチド配列で、またはその近傍で切断する酵素( 第一の制限酵素と言う)であり、またこれらの酵素の少なくとも一つは、該制限 断片を増幅可能な制限断片、好ましくは4塩基配列に切断する酵素(第二の制限 酵素という)である工程と、 (b)前記制限酵素によって生成された前記制限断片の各端部に、適切な二本 鎖オリゴヌクレオチド・アダプターを連結する工程と、 (c)ステップ(b)の該制限断片を、下記一般構造をもった2以上の増幅プ ライマーを使用して増幅する工程であって、 − 一つのプライマーは、5’末端に、第一の制限酵素で産生された制限 断片の共通配列またはその一部と適合する配列を有し、3’末端には単純反復配 列の配列と適合する少なくとも5つのヌクレイオチドを有するプライマー(プラ イマー1と称する)であり; − 一つのプライマーは、5’末端に、第二の制限酵素で産生された制限 断片の共通配列またはその一部と適合する配列を但持し、3’末端に、0、1、 2、3、4、またはそれ以上、特に0から3の範囲のランダムに選択されたヌク レオチドチドを但持するプライマー(プライマー2と称する) である工程と、 (d)増幅された断片を回収する工程とを具備した方法。 2.請求項1に記載の制限断片の選択的増幅法であって、前記異種PCRプラ イマーは下記一般的デザインを有する方法: − 一つのプライマーは、その5’末端には、第一の制限酵素のアダプタ ー配列およびその認識部位の配列、またはその一部と適合する配列を有し、また その3’末端には、単純反復配列の配列と適合する少なくとも5つのヌクレオチ ドを但持する(プライマー1いう)。 − 一つのプラーマーは、その5’末端に、第二の制限酵素のアダプター 配列およびその認識配列、またはその一部と適合する配列を有し、またその3’ 末端には、0から4の範囲のランダムに選択されたヌクレオチド配列を有する( プライマー2という) 3.請求項1または2に記載の方法であって、前記第一の制限酵素は、前記単 純反復配列とオーバーラップしない少なくとも一つのヌクレオチドを含む認識配 列を有する方法。 4.請求項1または3に記載の方法であって、前記第一の制限酵素は、前記単 純反復配列に直接隣接して位置する認識部位を有する方法。 5.請求項1から4の何れかに記載の方法であって、前記制限断片は2以上の 連続増幅工程で増幅され、 (i)第一の増幅工程では、下記一般的デザインを有する二つの異なったPC Rプライマー − プライマー1は、その5’末端に、該第一の制限酵素によって産生さ れる制限断片の共通配列と適合する配列を有し、またその3’末端には、単純反 復配列と適合する0から3、特に01、2、または3の範囲のヌクレオチドを有 するプライマーであり; − プライマー2は、その5’末端に、該第二の制限酵素によって産生さ れる制限断片の共通配列に適合した配列を有し、またその3’末端には、0から 3、特に、0、1、2、または3の範囲のランダムに選択されたヌクレオチド配 列を有するプライマーである; が使用され、 (ii)次の各増幅工程では、下記の二つの異なるPCRプライマー、 − プライマー1は、第一の増幅工程におけるプライマー1と同様のヌク レオチド配列を有し、その3’末端には、該単純反復配列の配列と適合する少な くとも一つの付加的ヌクレオチドを有するプライマーであり; − プライマー2は、第一の工程におけるプライマー2と同一であるかま たは第一の増幅工程におけるプライマー2と同様のヌクレイオチド配 列を有し、その3’末端には、少なくとも一つの付加的なランダムに選択された ヌクレイオチドを有するプライマーである; が使用される方法。 6.請求項1〜5の何れかに記載の方法であって、前記第一の制限酵素はタイ プ2制限酵素であり、前記プライマー1は、その5’末端に該第一の制限酵素の アダプターの配列またはその一部と適合する配列を有し、その3’末端には、単 純反復配列の配列と適合する少なくとも5ヌクレオチドを有する方法。 7.請求項1〜6の何れかに記載の方法であって、前記出発DNAはゲノムD NAである方法。 8.請求項7に記載の方法であって、前記ゲノムDNAは、動物、植物、また はヒト等の真核生物起源である方法。 9.請求項1〜8の何れかに記載の方法であって、前記増幅された断片は、D NAフィンガープリンティングとして回収される方法。 10.異なった標的DNAs間での多形、夫々の類似性を同定する方法であっ て、請求項9によって得られる該標的DNAの各々からのDNAフィンガープリ ントを比較して、前記異なった標的DNAsのDNAフィンガープリンティング 間の相違、夫々の類似性を同定することを具備した方法。 11.選択的プライマーであって: (i)その5’末端の、アダプターまたはその一部に相当する配列と; (ii)その3’末端の、少なくとも一つの単純反復配列単位の配列またはそ の一部に相当する少なくとも5つのヌクレオチド とを具備する選択的プライマー。 12.請求項11に記載の選択的プライマーであって、更にターゲテイング制 限酵素の配列またはその一部に相当する配列を具備する選択的プライマー。 13.標的DNA起源の単純反復配列を含む少なくとも一つの制限断片を増幅 するためのキットであって、請求項11または12に記載の少なくとも一つのプ ライマーを具備するキット。 14.請求項13によるキットであって、更に − 少なくとも一は、単純反復配列にオーバーラップまたは隣接するそ の認識配列またはその近傍で切断するターゲテイング酵素であり、また少なくと も一つは、好ましくは4塩基配列に切断する高頻度切断酵素である、2以上の制 限酵素と; − 上記の対応する制限酵素によって生成した両末端に適合した一端を を有する、少なくとも二つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチド・アダプターと; − その5’末端に、前記高頻度切断酵素のアダプターの配列およびそ の認識配列またはその一部と適合する配列を有し、その3’末端には0〜4の範 囲のランダムに選択されたヌクレオチドを有する少なくとも一つのプライマー とを具備したキット。 15.請求項13または14に記載の遺伝学的分析のための診断キット。 16.請求項13または14に記載の法医学分析のための診断キット。 17.請求項13または14に記載の、動物または植物における遺伝子的特質 の遺伝を検出するための診断キット。
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