JPH1094396A - ランダムにプライムされた増幅を用いてヌクレオチド配列を取得する方法 - Google Patents
ランダムにプライムされた増幅を用いてヌクレオチド配列を取得する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体から取得したポリヌクレオチドを用いて
不完全なクローンから未知の配列を取得する迅速かつ簡
便な方法に対する要求がある。 【解決手段】 既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未
知ポリヌクレオチド配列を取得する方法であって：
（ａ）第１プライマーを用いて未知配列を増幅し；
（ｂ）ランダムプライマーおよび第２プライマーを用い
て（ａ）の増幅による産物を増幅する；工程からなる方
法。
不完全なクローンから未知の配列を取得する迅速かつ簡
便な方法に対する要求がある。 【解決手段】 既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未
知ポリヌクレオチド配列を取得する方法であって：
（ａ）第１プライマーを用いて未知配列を増幅し；
（ｂ）ランダムプライマーおよび第２プライマーを用い
て（ａ）の増幅による産物を増幅する；工程からなる方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はランダムにプライム
された増幅を用いてヌクレオチド配列を得る方法に関す
る。
された増幅を用いてヌクレオチド配列を得る方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＰＣ
Ｒはポリヌクレオチド配列の増幅法として周知の方法で
ある（Saikiら、Nature,324:163-166（1986））。ＰＣ
Ｒの種々の変形および他の核酸増幅法が開示されている
が、ｉｎ ｓｉｔｕ コロニーハイブリダイゼーのような
通常的な手段を用いずに、生体から取得したポリヌクレ
オチドを用いて、不完全なクローンから未知の配列を獲
得する、迅速で簡単な方法に対する要求を満足させるも
のは無い。本発明はこのような未知の配列を迅速に取得
する方法を提供するものである。
Ｒはポリヌクレオチド配列の増幅法として周知の方法で
ある（Saikiら、Nature,324:163-166（1986））。ＰＣ
Ｒの種々の変形および他の核酸増幅法が開示されている
が、ｉｎ ｓｉｔｕ コロニーハイブリダイゼーのような
通常的な手段を用いずに、生体から取得したポリヌクレ
オチドを用いて、不完全なクローンから未知の配列を獲
得する、迅速で簡単な方法に対する要求を満足させるも
のは無い。本発明はこのような未知の配列を迅速に取得
する方法を提供するものである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】夲発明は、既知ポリヌク
レオチド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列を
取得する方法であって、第１プライマーを用いて未知配
列を増幅し、ランダムプライマーおよび第２プライマー
を用いて第１の増幅工程の増幅による産物を増幅する工
程を含んでなる方法を提供する。また、既知配列の上流
または下流のどちらかにある、例えば停止コドンの下流
にある未知配列をフランキングする既知配列中の第１プ
ライマーを選択し、既知配列の末端から該配列が伸長す
る、その末端に隣接する第２プライマーを選択し、第１
プライマーを用いて未知配列を増幅し、ランダムプライ
マーおよび第２プライマーを用いて第１の増幅工程の産
物を増幅し、未知配列の増幅産物を取得する工程からな
る、既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未知ポリヌク
レオチド配列を取得する方法も提供するものである。例
えば欠落した配列が既知配列の上流または下流にある場
合、第２プライマーは既知配列を有してなる末端で選択
されるであろう。
レオチド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列を
取得する方法であって、第１プライマーを用いて未知配
列を増幅し、ランダムプライマーおよび第２プライマー
を用いて第１の増幅工程の増幅による産物を増幅する工
程を含んでなる方法を提供する。また、既知配列の上流
または下流のどちらかにある、例えば停止コドンの下流
にある未知配列をフランキングする既知配列中の第１プ
ライマーを選択し、既知配列の末端から該配列が伸長す
る、その末端に隣接する第２プライマーを選択し、第１
プライマーを用いて未知配列を増幅し、ランダムプライ
マーおよび第２プライマーを用いて第１の増幅工程の産
物を増幅し、未知配列の増幅産物を取得する工程からな
る、既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未知ポリヌク
レオチド配列を取得する方法も提供するものである。例
えば欠落した配列が既知配列の上流または下流にある場
合、第２プライマーは既知配列を有してなる末端で選択
されるであろう。
【０００４】さらに、既知配列の上流または下流のどち
らかの未知配列をフランキングする第１プライマーを選
択し、既知配列の末端の近くで第２プライマーを選択
し、第１プライマーを用いて未知配列を増幅し、ランダ
ムプライマーおよび第２プライマーを用いて第１の増幅
工程の産物を増幅する工程からなる、既知ポリヌクレオ
チド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列を取得
する方法も提供するものである。本明細書に用いる「末
端近く」または「末端に接近した」とは、鋳型の末端ヌ
クレオチドから数個のヌクレオチド、例えば２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、２０もしくは３０個、
または末端に最も接近した位置で、そこに有用なプライ
マーがアニーリングまたはハイブリダイズして増幅反応
を開始できる、鋳型の末端ヌクレオチドの位置を意味す
る。既知配列の”末端近くの”第２プライマーの例は、
以下の実施例で提示する。
らかの未知配列をフランキングする第１プライマーを選
択し、既知配列の末端の近くで第２プライマーを選択
し、第１プライマーを用いて未知配列を増幅し、ランダ
ムプライマーおよび第２プライマーを用いて第１の増幅
工程の産物を増幅する工程からなる、既知ポリヌクレオ
チド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列を取得
する方法も提供するものである。本明細書に用いる「末
端近く」または「末端に接近した」とは、鋳型の末端ヌ
クレオチドから数個のヌクレオチド、例えば２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、２０もしくは３０個、
または末端に最も接近した位置で、そこに有用なプライ
マーがアニーリングまたはハイブリダイズして増幅反応
を開始できる、鋳型の末端ヌクレオチドの位置を意味す
る。既知配列の”末端近くの”第２プライマーの例は、
以下の実施例で提示する。
【０００５】本発明はまた、第２プライマーの標識方法
を提供する。本発明はまた、ランダムプライマーがヘキ
サヌクレオチドまたはそれより長い配列である方法を提
供する。本発明はまた、第１または第２の増幅工程が約
１０の反応サイクルを含んでなる方法を提供する。本発
明は、増幅工程がＰＣＲを含んでなるか、またはそのよ
うな工程がＲＮａｓｅＰ配列を増幅する方法を提供す
る。
を提供する。本発明はまた、ランダムプライマーがヘキ
サヌクレオチドまたはそれより長い配列である方法を提
供する。本発明はまた、第１または第２の増幅工程が約
１０の反応サイクルを含んでなる方法を提供する。本発
明は、増幅工程がＰＣＲを含んでなるか、またはそのよ
うな工程がＲＮａｓｅＰ配列を増幅する方法を提供す
る。
【０００６】
【発明の実施の態様】本発明は、ゲノムライブラリーを
プローブする通常の方法とは異なる、部分的遺伝子断片
から更なる配列データを取得するための、新規な、迅速
で簡単な方法を提供する。いずれかのゲノムライブラリ
ーをランダムに配列決定し、次いで別の配列との配列の
相同性を検討すると、望ましい断片を同定することがで
きる。望ましい断片のポリヌクレオチド領域の、計画さ
れたまたは誘導された翻訳産物が、相同的なタンパク質
のＣ端部分と有意に相同的であるが、Ｎ端部分が欠落し
ている場合、本発明の方法を用いて欠落したＮ端部分を
取得できる。
プローブする通常の方法とは異なる、部分的遺伝子断片
から更なる配列データを取得するための、新規な、迅速
で簡単な方法を提供する。いずれかのゲノムライブラリ
ーをランダムに配列決定し、次いで別の配列との配列の
相同性を検討すると、望ましい断片を同定することがで
きる。望ましい断片のポリヌクレオチド領域の、計画さ
れたまたは誘導された翻訳産物が、相同的なタンパク質
のＣ端部分と有意に相同的であるが、Ｎ端部分が欠落し
ている場合、本発明の方法を用いて欠落したＮ端部分を
取得できる。
【０００７】この方法のある態様では、既知配列（「既
知配列」または「既知配列断片」）の任意の位置におけ
る、既知配列に相補的な二つの異なる逆プライマー、お
よびランダムプライマー、例えばヘキサメア（ヘキサヌ
クレオチド）プライマーまたはそれより長いプライマ
ー、例えば市販されているもの（例えば、ギブコ（Gibc
o）または公知方法を用いて作られるものを用いる二工
程増幅反応を含む。これらのプライマーを用いて既知配
列断片の伸長した配列、例えば完全な３’または５’ポ
リヌクレオチド配列を得ることができる。このような配
列を得るためには、生体の核酸の選別した配列断片、例
えばゲノムＤＮＡまたはｃＲＮＡを、制限酵素で部分的
に消化し、増幅用の鋳型として用いるために直線化す
る。環状化した鋳型もまた用いることができるが、直線
状の鋳型が好ましい。第１プライマー（本明細書では
「プライマー＃１」または「第１プライマー」と称す
る）を、既知配列断片の上流または下流のどちらかの未
知配列のフランキングにアニーリングし、第２プライマ
ー（本明細書では「プライマー＃２」または「第２プラ
イマー」と称する）は断片の既知配列領域の末端に接近
した所にある（例えば既知配列の末端に隣接して、好ま
しくはプライマーは末端で出発し、その長さに沿って伸
長する）。本発明の方法は、増幅工程でＰＣＲを用いる
のが好ましい（Saikiら、Nature，324:163-166（198
6））。この方法を用いる場合、この望ましい配列の増
幅は、ランダムプライマーを第２の工程におけるその配
列に結合させるのが有利である。
知配列」または「既知配列断片」）の任意の位置におけ
る、既知配列に相補的な二つの異なる逆プライマー、お
よびランダムプライマー、例えばヘキサメア（ヘキサヌ
クレオチド）プライマーまたはそれより長いプライマ
ー、例えば市販されているもの（例えば、ギブコ（Gibc
o）または公知方法を用いて作られるものを用いる二工
程増幅反応を含む。これらのプライマーを用いて既知配
列断片の伸長した配列、例えば完全な３’または５’ポ
リヌクレオチド配列を得ることができる。このような配
列を得るためには、生体の核酸の選別した配列断片、例
えばゲノムＤＮＡまたはｃＲＮＡを、制限酵素で部分的
に消化し、増幅用の鋳型として用いるために直線化す
る。環状化した鋳型もまた用いることができるが、直線
状の鋳型が好ましい。第１プライマー（本明細書では
「プライマー＃１」または「第１プライマー」と称す
る）を、既知配列断片の上流または下流のどちらかの未
知配列のフランキングにアニーリングし、第２プライマ
ー（本明細書では「プライマー＃２」または「第２プラ
イマー」と称する）は断片の既知配列領域の末端に接近
した所にある（例えば既知配列の末端に隣接して、好ま
しくはプライマーは末端で出発し、その長さに沿って伸
長する）。本発明の方法は、増幅工程でＰＣＲを用いる
のが好ましい（Saikiら、Nature，324:163-166（198
6））。この方法を用いる場合、この望ましい配列の増
幅は、ランダムプライマーを第２の工程におけるその配
列に結合させるのが有利である。
【０００８】第１の工程にて、タンパク質のＣ端および
未知Ｎ端配列の上流をコードする逆鎖を、プライマー＃
１を用いて増幅し、一本鎖産物を得た。増幅温度は約２
５℃から７５℃が好ましく、より好ましいのは約５０℃
から７０℃であり、最も好ましいのは５５℃である。サ
イクル数は約１から１００サイクルが好ましく、より好
ましいのは約５から２０サイクルであり、最も好ましい
のは約１０サイクルである。本発明の模式的な具体的方
法を図１に表す。この模式図は決して本発明を限定する
ものではなく、本発明の特定の態様を例示するにすぎな
い。クエスチョンマークは未知配列の領域を示す。
未知Ｎ端配列の上流をコードする逆鎖を、プライマー＃
１を用いて増幅し、一本鎖産物を得た。増幅温度は約２
５℃から７５℃が好ましく、より好ましいのは約５０℃
から７０℃であり、最も好ましいのは５５℃である。サ
イクル数は約１から１００サイクルが好ましく、より好
ましいのは約５から２０サイクルであり、最も好ましい
のは約１０サイクルである。本発明の模式的な具体的方
法を図１に表す。この模式図は決して本発明を限定する
ものではなく、本発明の特定の態様を例示するにすぎな
い。クエスチョンマークは未知配列の領域を示す。
【０００９】第２の工程では、プライマー＃２は標識化
するのが好ましく、ランダムプライマー、好ましくはペ
ンタマー、ヘキサマーまたはヘプタマーを加え、アニー
リング温度を下げてランダムプライマーをＤＮＡにアニ
ーリングさせる。アニーリング温度は増幅反応、とりわ
けＰＣＲ反応のためのアニーリングの温度として当業界
に周知であり、約２５℃が好ましい。プライマーの標識
化は、ポリヌクレオチドプライマーを標識する任意の周
知の方法を用いて、末端標識化するのが好ましい。好ま
しい標識法には、例えば32Ｐ末端標識化、蛍光標識化ま
たは比色標識化等があり、とりわけ核酸の標識化に典型
的に用いられる標識が好ましい。
するのが好ましく、ランダムプライマー、好ましくはペ
ンタマー、ヘキサマーまたはヘプタマーを加え、アニー
リング温度を下げてランダムプライマーをＤＮＡにアニ
ーリングさせる。アニーリング温度は増幅反応、とりわ
けＰＣＲ反応のためのアニーリングの温度として当業界
に周知であり、約２５℃が好ましい。プライマーの標識
化は、ポリヌクレオチドプライマーを標識する任意の周
知の方法を用いて、末端標識化するのが好ましい。好ま
しい標識法には、例えば32Ｐ末端標識化、蛍光標識化ま
たは比色標識化等があり、とりわけ核酸の標識化に典型
的に用いられる標識が好ましい。
【００１０】増幅反応は、任意の該反応において、多く
の異なる断片を生じることが予想される。しかしなが
ら、主要な産物はプライマー＃２およびランダムプライ
マーによりプライムされるものである。これらの産物
は、配列の欠落部分（例えばタンパク質のＣまたはＮ端
半分）を生じると予想されることから特に興味深く、こ
れらは標識されるので簡単にモニターできる。既知の方
法、例えばゲル電気泳動およびフィルムへの曝露を用い
て増幅産物を分離した後、例えばオートラジオグラムの
視覚または自動検査により、わずかの標識化バンドが同
定可能である。これらの断片は続いて適当なベクター、
例えばｐＵＣ１９またはｐＢＲ３２２にクローン化し、
例えば周知の配列決定法により配列決定できる。
の異なる断片を生じることが予想される。しかしなが
ら、主要な産物はプライマー＃２およびランダムプライ
マーによりプライムされるものである。これらの産物
は、配列の欠落部分（例えばタンパク質のＣまたはＮ端
半分）を生じると予想されることから特に興味深く、こ
れらは標識されるので簡単にモニターできる。既知の方
法、例えばゲル電気泳動およびフィルムへの曝露を用い
て増幅産物を分離した後、例えばオートラジオグラムの
視覚または自動検査により、わずかの標識化バンドが同
定可能である。これらの断片は続いて適当なベクター、
例えばｐＵＣ１９またはｐＢＲ３２２にクローン化し、
例えば周知の配列決定法により配列決定できる。
【００１１】本発明は、任意の生体からの、および幾つ
かの生体または化学合成反応から、例えばウイルス、バ
クテリオファージ、真核生物および原核生物、例えばユ
ーバクテリア、アルカエバクテリアまたはポリヌクレオ
チド合成器からのポリヌクレオチド配列の混合物からの
未知配列の増幅および決定に用いることができる。増幅
反応を実施する前に逆転写を用いることができ、それに
より未知配列によりコードされるＲＮＡの逆転写酵素複
製物を増幅でき、未知配列を取得できる。
かの生体または化学合成反応から、例えばウイルス、バ
クテリオファージ、真核生物および原核生物、例えばユ
ーバクテリア、アルカエバクテリアまたはポリヌクレオ
チド合成器からのポリヌクレオチド配列の混合物からの
未知配列の増幅および決定に用いることができる。増幅
反応を実施する前に逆転写を用いることができ、それに
より未知配列によりコードされるＲＮＡの逆転写酵素複
製物を増幅でき、未知配列を取得できる。
【００１２】本明細書で用いられる「（複数の）プライ
マー」とは、相対的に短いポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド、好ましくは約５から５０ヌクレオチド
の長さの配列を意味する。プライマー、例えば一本鎖Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、しばしば化学的方法、例え
ば自動オリゴヌクレオチド合成器に付す方法により合成
される。しかしながら、プライマーは、インビトロ組換
えＤＮＡ媒介法等の種々の方法、並びに細胞および生体
中のＤＮＡ発現により作製できる。最初、化学合成した
ＤＮＡを、典型的には、５’リン酸塩なしで得る。この
ようなオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ
分子を形成するのに慣用的に用いられるＤＮＡリガーゼ
を利用するライゲーション反応によるホスフォジエステ
ル結合形成の基質ではない。化学合成したプライマーの
３’末端は、通常遊離の水酸基を有し、リガーゼ、例え
ばＴ４リガーゼの存在下、別のポリヌクレオチド例えば
別のオリゴヌクレオチドの５’リン酸塩とホスフォジエ
ステル結合を容易に形成する。周知のように、この反応
は、望む場合、ライゲーションの前にその他の（複数
の）ポリヌクレオチドの５’リン酸塩を除去することに
より、選択的に防御できる。
マー」とは、相対的に短いポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド、好ましくは約５から５０ヌクレオチド
の長さの配列を意味する。プライマー、例えば一本鎖Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、しばしば化学的方法、例え
ば自動オリゴヌクレオチド合成器に付す方法により合成
される。しかしながら、プライマーは、インビトロ組換
えＤＮＡ媒介法等の種々の方法、並びに細胞および生体
中のＤＮＡ発現により作製できる。最初、化学合成した
ＤＮＡを、典型的には、５’リン酸塩なしで得る。この
ようなオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ
分子を形成するのに慣用的に用いられるＤＮＡリガーゼ
を利用するライゲーション反応によるホスフォジエステ
ル結合形成の基質ではない。化学合成したプライマーの
３’末端は、通常遊離の水酸基を有し、リガーゼ、例え
ばＴ４リガーゼの存在下、別のポリヌクレオチド例えば
別のオリゴヌクレオチドの５’リン酸塩とホスフォジエ
ステル結合を容易に形成する。周知のように、この反応
は、望む場合、ライゲーションの前にその他の（複数
の）ポリヌクレオチドの５’リン酸塩を除去することに
より、選択的に防御できる。
【００１３】「プラスミド（複数）」は、本明細書で
は、当業者に周知の標準的命名法にしたがって、小文字
のｐを付し、および／または続いて大文字および／また
は数字で示される。本明細書に開示する出発プラスミド
は、制約を受けずに市販により、公に取得可能であるか
または、周知の確立された技法を通常的に適用すること
により、取得可能なプラスミドから構築することができ
る。本発明に準じて使用できる多くのプラスミド並びに
その他のクローニングおよび発現ベクターは、周知であ
り、当業者に容易に取得できる。さらに、当業者は本発
明の使用に適したその他のプラスミドをいくらでも容易
に構築することができる。本発明におけるこのようなプ
ラスミドおよびその他のベクターの特性、構築および使
用は、本明細書より当業者に容易に理解され得る。
は、当業者に周知の標準的命名法にしたがって、小文字
のｐを付し、および／または続いて大文字および／また
は数字で示される。本明細書に開示する出発プラスミド
は、制約を受けずに市販により、公に取得可能であるか
または、周知の確立された技法を通常的に適用すること
により、取得可能なプラスミドから構築することができ
る。本発明に準じて使用できる多くのプラスミド並びに
その他のクローニングおよび発現ベクターは、周知であ
り、当業者に容易に取得できる。さらに、当業者は本発
明の使用に適したその他のプラスミドをいくらでも容易
に構築することができる。本発明におけるこのようなプ
ラスミドおよびその他のベクターの特性、構築および使
用は、本明細書より当業者に容易に理解され得る。
【００１４】本明細書で用いる「ポリヌクレオチド（複
数）」または「配列（複数）」とは、通常改変されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡも
しくはＤＮＡになり得る任意のポリリボヌクレオチドま
たはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。従っ
て、例えば本明細書で用いるポリヌクレオチドは、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、並びに
一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖、より通常的には二本鎖、もしくは三本鎖、または一
本鎖および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮ
Ａを含むハイブリッド分子を意味する。さらに、本明細
書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ
またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味す
る。このような領域における鎖は同一の分子または異な
る分子からのものでよい。この領域は一またはそれ以上
の分子の全てを含み得るが、より典型的には分子の一部
の領域のみを含む。三重らせんの分子の一つは、しばし
ばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いるポリヌ
クレオチドまたは配列なる用語には、一またはそれ以上
の改変した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ
が含まれる。このように、安定性またはその他の理由で
改変した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書
で意図する用語である「ポリヌクレオチド」である。さ
らに、イノシン等の通常的でない塩基、またはトリチル
化塩基等の改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは（二つ
の例だけ示す）、本明細書で用いられる用語である、ポ
リヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目
的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの改変
がなされていることは、明らかであろう。本明細書で用
いられるポリヌクレオチドなる用語は、ポリヌクレオチ
ドのこのような化学的、酵素的または代謝的に改変した
形態およびとりわけウイルス並びに単細胞および複合細
胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態
を包含する。
数）」または「配列（複数）」とは、通常改変されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡも
しくはＤＮＡになり得る任意のポリリボヌクレオチドま
たはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。従っ
て、例えば本明細書で用いるポリヌクレオチドは、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、並びに
一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖、より通常的には二本鎖、もしくは三本鎖、または一
本鎖および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮ
Ａを含むハイブリッド分子を意味する。さらに、本明細
書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ
またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味す
る。このような領域における鎖は同一の分子または異な
る分子からのものでよい。この領域は一またはそれ以上
の分子の全てを含み得るが、より典型的には分子の一部
の領域のみを含む。三重らせんの分子の一つは、しばし
ばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いるポリヌ
クレオチドまたは配列なる用語には、一またはそれ以上
の改変した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ
が含まれる。このように、安定性またはその他の理由で
改変した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書
で意図する用語である「ポリヌクレオチド」である。さ
らに、イノシン等の通常的でない塩基、またはトリチル
化塩基等の改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは（二つ
の例だけ示す）、本明細書で用いられる用語である、ポ
リヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目
的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの改変
がなされていることは、明らかであろう。本明細書で用
いられるポリヌクレオチドなる用語は、ポリヌクレオチ
ドのこのような化学的、酵素的または代謝的に改変した
形態およびとりわけウイルス並びに単細胞および複合細
胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態
を包含する。
【００１５】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に記
載する。実施例は特定の具体例を参考にすることで単に
本発明を説明のするものである。これらの例示は本発明
の特定の具体的な態様を説明するものであるが、開示す
る発明の範囲の限定または制限を表すものではない。全
ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的
な技術を用いて実施でき、これは当業者に周知で通常的
である。以下の実施例の通常的な分子生物学的技術は、
標準的な実験マニュアル、例えばSambrookら、Molecula
r Cloning：ALaboratory Manual、第2編；コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク州（1989）に記載されるよう
に実施できる。
載する。実施例は特定の具体例を参考にすることで単に
本発明を説明のするものである。これらの例示は本発明
の特定の具体的な態様を説明するものであるが、開示す
る発明の範囲の限定または制限を表すものではない。全
ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的
な技術を用いて実施でき、これは当業者に周知で通常的
である。以下の実施例の通常的な分子生物学的技術は、
標準的な実験マニュアル、例えばSambrookら、Molecula
r Cloning：ALaboratory Manual、第2編；コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク州（1989）に記載されるよう
に実施できる。
【００１６】以下の実施例で示す全ての部分または量
は、他に規定しない場合、重量で表す。以下の実施例に
おける断片のサイズ分離は、他に記載しない場合、Samb
rookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第
2編；コールドスプリングハーバーラボラトリープレ
ス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（19
89）および多くのその他の参考文献例えばGoeddelら、N
ucleic Acids Res.8:4057（1980）に記載される、寒天
およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧ
Ｅ」）の標準技法を用いて実施した。
は、他に規定しない場合、重量で表す。以下の実施例に
おける断片のサイズ分離は、他に記載しない場合、Samb
rookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第
2編；コールドスプリングハーバーラボラトリープレ
ス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（19
89）および多くのその他の参考文献例えばGoeddelら、N
ucleic Acids Res.8:4057（1980）に記載される、寒天
およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧ
Ｅ」）の標準技法を用いて実施した。
【００１７】実施例１ スタヒロコッカス・アウレウス（S.aureus）ゲノムクロ
ーンの欠落配列の取得 スタヒロコッカス・アウレウスのゲノムライブラリーを
ランダムに配列決定し、続いてバシラス・サチリス（B.
subtilis）Ｐタンパク質配列で配列相同性を調査し、３
２４塩基対（本明細書では「ｂｐ」と記載する）の断片
を同定する。この断片の最初の１９３ヌクレオチドはバ
シラス・サチリスＰタンパク質および原核細胞ＲＮａｓ
ｅＰタンパク質のＣ端半分に有意な相同性を示した。推
定スタヒロコッカス・アウレウスＲＮａｓｅＰタンパク
質のＮ末端領域は欠落していた。推定スタヒロコッカス
・アウレウスＲＮａｓｅＰタンパク質を図1に示す。ス
タヒロコッカス・アウレウス：バシラス・サチリスの類
似性は58.７％、相同性は34.９％である。
ーンの欠落配列の取得 スタヒロコッカス・アウレウスのゲノムライブラリーを
ランダムに配列決定し、続いてバシラス・サチリス（B.
subtilis）Ｐタンパク質配列で配列相同性を調査し、３
２４塩基対（本明細書では「ｂｐ」と記載する）の断片
を同定する。この断片の最初の１９３ヌクレオチドはバ
シラス・サチリスＰタンパク質および原核細胞ＲＮａｓ
ｅＰタンパク質のＣ端半分に有意な相同性を示した。推
定スタヒロコッカス・アウレウスＲＮａｓｅＰタンパク
質のＮ末端領域は欠落していた。推定スタヒロコッカス
・アウレウスＲＮａｓｅＰタンパク質を図1に示す。ス
タヒロコッカス・アウレウス：バシラス・サチリスの類
似性は58.７％、相同性は34.９％である。
【００１８】
【表１】
【００１９】エシェリキア・コリ（Escherichia coli；
Ｅｃｏ）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabili
s；Ｐｍｉ）、ストレプトマイセス・ビキニエンシス（S
treptomyces bikiniensis；Ｓｂｉ）、ミクロコッカス
・ルテウス（Micrococcus luteus；Ｍｌｕ）、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis；Ｂｓｕ）、スタヒロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus；Ｓａ
ｕ）
Ｅｃｏ）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabili
s；Ｐｍｉ）、ストレプトマイセス・ビキニエンシス（S
treptomyces bikiniensis；Ｓｂｉ）、ミクロコッカス
・ルテウス（Micrococcus luteus；Ｍｌｕ）、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis；Ｂｓｕ）、スタヒロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus；Ｓａ
ｕ）
【００２０】一例の本発明の２工程ＰＣＲ反応を、各々
１５〜３９および１９４〜２１５の位置の既知配列（以
下に示す）に相補的な２つの異なる逆プライマーと一緒
に用い、ランダムヘキサマープライマー（ギブコ）を用
いてスタヒロコッカス・アウレウスspp遺伝子の完全な
５’配列を得た。ＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩで部分
的に消化したスタヒロコッカス・アウレウスゲノムＤＮ
Ａを鋳型として供した。プライマー＃１（１９４〜２１
５位置、表２）は停止コドンＴＡＡのすぐ下流をアニー
リングし、プライマー＃２（１５〜３９位置、表２）は
既知配列の末端近くにある。
１５〜３９および１９４〜２１５の位置の既知配列（以
下に示す）に相補的な２つの異なる逆プライマーと一緒
に用い、ランダムヘキサマープライマー（ギブコ）を用
いてスタヒロコッカス・アウレウスspp遺伝子の完全な
５’配列を得た。ＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩで部分
的に消化したスタヒロコッカス・アウレウスゲノムＤＮ
Ａを鋳型として供した。プライマー＃１（１９４〜２１
５位置、表２）は停止コドンＴＡＡのすぐ下流をアニー
リングし、プライマー＃２（１５〜３９位置、表２）は
既知配列の末端近くにある。
【００２１】
【表２】
【００２２】第１の工程では、タンパク質のＣ端および
未知Ｎ端配列の上流をコードする逆鎖をプライマー＃１
を用いて増幅し、一本鎖産物を得た。望ましい配列をこ
のように増幅すると、次工程でランダムプライマーをそ
の配列に結合させるのに有利になる。第２の工程では、
32Ｐ末端標識化プライマー＃２、およびランダムヘキサ
マーを添加し、アニーリング温度を２５℃まで下げて、
短いランダムプライマーをＤＮＡにアニーリングさせ
た。
未知Ｎ端配列の上流をコードする逆鎖をプライマー＃１
を用いて増幅し、一本鎖産物を得た。望ましい配列をこ
のように増幅すると、次工程でランダムプライマーをそ
の配列に結合させるのに有利になる。第２の工程では、
32Ｐ末端標識化プライマー＃２、およびランダムヘキサ
マーを添加し、アニーリング温度を２５℃まで下げて、
短いランダムプライマーをＤＮＡにアニーリングさせ
た。
【００２３】ＰＣＲは多くの異なる断片を生じさせるこ
とが予想されるが、主要な産物はプライマー＃２および
ランダムプライマー（以下を参照）によりプライムすべ
きである。これらの産物はタンパク質のＮ端半分をコー
ドするはずであるので最も興味深く、放射性標識化され
ているのでモニターできる。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動
およびフィルムへの曝露により分離した後、オートラジ
オグラムで可視化された放射性標識化バンドはわずかで
ある。これらの断片は、続いて適当なベクター（例えば
ｐＵＣ１９）にクローン化できる。
とが予想されるが、主要な産物はプライマー＃２および
ランダムプライマー（以下を参照）によりプライムすべ
きである。これらの産物はタンパク質のＮ端半分をコー
ドするはずであるので最も興味深く、放射性標識化され
ているのでモニターできる。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動
およびフィルムへの曝露により分離した後、オートラジ
オグラムで可視化された放射性標識化バンドはわずかで
ある。これらの断片は、続いて適当なベクター（例えば
ｐＵＣ１９）にクローン化できる。
【００２４】実施例２ ランダムプライマーを用いるＰＣＲ ２つのプライマーは以下の配列：プライマー＃１（２２
メル）５’ＧＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＣ３’[配列番号：３]およびプライマー＃２（２５メ
ル）５’ＣＧＴＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＧ
ＴＴＴＣ３’[配列番号：４]で設計した（ギブコＢＲＬ
により注文合成した）。増幅の第１の工程の反応混合物
（１００ｍｌ）は以下の成分を含有してなる：
メル）５’ＧＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＣ３’[配列番号：３]およびプライマー＃２（２５メ
ル）５’ＣＧＴＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＧ
ＴＴＴＣ３’[配列番号：４]で設計した（ギブコＢＲＬ
により注文合成した）。増幅の第１の工程の反応混合物
（１００ｍｌ）は以下の成分を含有してなる：
【００２５】７１ｍｌ 滅菌ｄｄＨ2Ｏ １０ｍｌ １０ｘテルモポール反応緩衝液（ＮＥＢ） ２ｍｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ） ５ｍｌ １００ｎｇ／ｍｌのプライマー＃１ １ｍｌ ２００ｎｇ／ｍｌのスタヒロコッカス・アウレ
ウスゲノムＤＮＡ（ＨindＩＩＩ消化） １０ｍｌ １０ｎｇ／ｍｌのランダムプライマー（ギブ
コBRL#48190-011） １ｍｌ ２Ｕ／ｍｌのベントポリメラーゼ（ＮＥＢ） 全ての反応組成物は、薄壁５００ｍｌチューブ（ペルキ
ンエルマージーンアンプチューブ）に加え、鉱物油２滴
で被覆し、ＰＣＲ中の蒸発を防いだ。
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ） ５ｍｌ １００ｎｇ／ｍｌのプライマー＃１ １ｍｌ ２００ｎｇ／ｍｌのスタヒロコッカス・アウレ
ウスゲノムＤＮＡ（ＨindＩＩＩ消化） １０ｍｌ １０ｎｇ／ｍｌのランダムプライマー（ギブ
コBRL#48190-011） １ｍｌ ２Ｕ／ｍｌのベントポリメラーゼ（ＮＥＢ） 全ての反応組成物は、薄壁５００ｍｌチューブ（ペルキ
ンエルマージーンアンプチューブ）に加え、鉱物油２滴
で被覆し、ＰＣＲ中の蒸発を防いだ。
【００２６】反応混合物を９５℃で３分間インキュベー
トし、ＤＮＡを変性させる。第１のＰＣＲ工程は、ペル
キンエルマーＤＮＡテルモサイクラー４８０で、９５℃
で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で1分間の
１０サイクルを用いて実施した。その後、放射性標識化
プライマー＃２混合物（１００ｎｇ／ｍｌのプライマー
＃２を１５ｍｌ、[ｇ−32Ｐ]ＡＴＰ末端標識化プライマ
ー＃２を１ｍｌ、１０ｘテルモポル緩衝液２ｍｌ）を５
ｍｌ反応混合物に添加し、ＰＣＲをアニーリング温度を
下げて：９５℃で４５秒間、２５℃で４５秒間および７
２℃で１分間６０サイクル続けて実施した。産物の試料
をゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムで染色し、Ｕ
Ｖ光下でＤＮＡを可視化した。ゲルはフィルムに曝露
し、放射性標識化バンドを可視化した。
トし、ＤＮＡを変性させる。第１のＰＣＲ工程は、ペル
キンエルマーＤＮＡテルモサイクラー４８０で、９５℃
で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で1分間の
１０サイクルを用いて実施した。その後、放射性標識化
プライマー＃２混合物（１００ｎｇ／ｍｌのプライマー
＃２を１５ｍｌ、[ｇ−32Ｐ]ＡＴＰ末端標識化プライマ
ー＃２を１ｍｌ、１０ｘテルモポル緩衝液２ｍｌ）を５
ｍｌ反応混合物に添加し、ＰＣＲをアニーリング温度を
下げて：９５℃で４５秒間、２５℃で４５秒間および７
２℃で１分間６０サイクル続けて実施した。産物の試料
をゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムで染色し、Ｕ
Ｖ光下でＤＮＡを可視化した。ゲルはフィルムに曝露
し、放射性標識化バンドを可視化した。
【００２７】産物をｐＵＣ１９にクローン化し、配列決
定した。更なる配列情報はｓｐｐ遺伝子を完全なものと
した。従って、全遺伝子は次の方法におけるＰＣＲによ
り回収できた：
定した。更なる配列情報はｓｐｐ遺伝子を完全なものと
した。従って、全遺伝子は次の方法におけるＰＣＲによ
り回収できた：
【００２８】ｓｐｐ遺伝子の５’末端半分は、上述の2
工程ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物はＱＩＡクイックＰ
ＣＲ精製カラムを用いて清浄し、５０ｍｌ水中に回収し
た。試料をSpeedVacTM ＳＣ１１０（サヴァント）中真
空下で最終容量２５ｍｌまで濃縮した。２０ｍｌを７Ｍ
尿素含有８％ポリアクリルアミドゲル1.６ｍｍに載せ、
ゲル電気泳動により分析した。ゲルを臭化エチジウム
（水中１ｍｇ／ｍｌ）で染色し、ＤＮＡを可視化し、写
真化した。ゲルを次いで乾燥し、フィルムに曝露した。
工程ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物はＱＩＡクイックＰ
ＣＲ精製カラムを用いて清浄し、５０ｍｌ水中に回収し
た。試料をSpeedVacTM ＳＣ１１０（サヴァント）中真
空下で最終容量２５ｍｌまで濃縮した。２０ｍｌを７Ｍ
尿素含有８％ポリアクリルアミドゲル1.６ｍｍに載せ、
ゲル電気泳動により分析した。ゲルを臭化エチジウム
（水中１ｍｇ／ｍｌ）で染色し、ＤＮＡを可視化し、写
真化した。ゲルを次いで乾燥し、フィルムに曝露した。
【００２９】臭化エチジウム染色ゲルおよびオートラジ
オグラムの両方に可視化された幾つかのバンドが明らか
にされた。これらは５０塩基対から２０００塩基対を超
す大きさの範囲であり、幾つかのバンドは他より濃かっ
た。最も顕著なバンドは約５０塩基対、１５０塩基対、
４００塩基対および８００塩基対の大きさであった。
オグラムの両方に可視化された幾つかのバンドが明らか
にされた。これらは５０塩基対から２０００塩基対を超
す大きさの範囲であり、幾つかのバンドは他より濃かっ
た。最も顕著なバンドは約５０塩基対、１５０塩基対、
４００塩基対および８００塩基対の大きさであった。
【００３０】実施例３ ＰＣＲ断片のクローニングおよび配列決定 ＰＣＲ断片はブラント末端で、ＳｍａＩ切断ｐＵＣ１９
にクローン化した。１００ｎｇのベクターＤＮＡをＰＣ
Ｒ産物１．０ｍｌおよび１．５ｍｌと、１６℃で一晩ラ
イゲーションさせた。エシェリキア・コリＸＬ１青色細
胞（アルファ完全化）を電気泳動により形質転換し、Ｉ
ＰＴＧおよびｘ−ガル（青色／白色スクリーニング用）
含有選択プレートに載せた。
にクローン化した。１００ｎｇのベクターＤＮＡをＰＣ
Ｒ産物１．０ｍｌおよび１．５ｍｌと、１６℃で一晩ラ
イゲーションさせた。エシェリキア・コリＸＬ１青色細
胞（アルファ完全化）を電気泳動により形質転換し、Ｉ
ＰＴＧおよびｘ−ガル（青色／白色スクリーニング用）
含有選択プレートに載せた。
【００３１】これらの細胞の形質転換の結果、ＰＣＲ産
物の存在中、白色コロニーは約８．５％であり、一方挿
入していない対照ライゲーションでは白色コロニーは
４．６％にしかならなかった。白色コロニーはｌａｃ
Ｚ’遺伝子の解読枠の崩壊の結果、ｂ−ガラクトシダー
ゼホロ酵素を形成する能力を喪失しており、もはやｘ−
ガルを切断することができなかった。解読枠は、（ＰＣ
Ｒ産物の存在下）挿入または制限酵素調製物のエクソヌ
クレアーゼ活性により崩壊し、末端ヌクレオチドの切断
によりベクターのＳａｍ Ｉ部位が破壊され、その結果
ライゲーション後フレームシフトした。
物の存在中、白色コロニーは約８．５％であり、一方挿
入していない対照ライゲーションでは白色コロニーは
４．６％にしかならなかった。白色コロニーはｌａｃ
Ｚ’遺伝子の解読枠の崩壊の結果、ｂ−ガラクトシダー
ゼホロ酵素を形成する能力を喪失しており、もはやｘ−
ガルを切断することができなかった。解読枠は、（ＰＣ
Ｒ産物の存在下）挿入または制限酵素調製物のエクソヌ
クレアーゼ活性により崩壊し、末端ヌクレオチドの切断
によりベクターのＳａｍ Ｉ部位が破壊され、その結果
ライゲーション後フレームシフトした。
【００３２】１８個の白色コロニーをとり、２ｍｌの培
養物として成長させ、プラスミドを調製した。各プラス
ミド試料をＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ（多重クロ
ーニング部位で切断）で直線化し、オ１％ＴＡＥ寒天ゲ
ル上にリジナルのｐＵＣ１９と並んで載せる。
養物として成長させ、プラスミドを調製した。各プラス
ミド試料をＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ（多重クロ
ーニング部位で切断）で直線化し、オ１％ＴＡＥ寒天ゲ
ル上にリジナルのｐＵＣ１９と並んで載せる。
【００３３】７個のプラスミドは制限消化で短い断片を
放出した。ｐＵＣ１９のＡｃｃＩ部位は一つしか無いの
で、これらの組換えプラスミドはこの酵素の制限部位で
一つの挿入物を必ず含有する。３個のプラスミドはｐＵ
Ｃ１９よりも長いようであるが、断片は放出しない。そ
の他の８個のプラスミドは、ｐＵＣ１９と同じ大きさで
あるが、挿入物を有していないようであった。
放出した。ｐＵＣ１９のＡｃｃＩ部位は一つしか無いの
で、これらの組換えプラスミドはこの酵素の制限部位で
一つの挿入物を必ず含有する。３個のプラスミドはｐＵ
Ｃ１９よりも長いようであるが、断片は放出しない。そ
の他の８個のプラスミドは、ｐＵＣ１９と同じ大きさで
あるが、挿入物を有していないようであった。
【００３４】挿入物を含有する１０個のプラスミドは、
正および逆ｐＵＣ／Ｍ１３配列決定プライマーの両方で
配列決定した。ＡｃｃＩ消化後の断片を放出した６個の
プラスミドのうち５個は、プライマー＃２配列で始まる
２１３塩基対挿入物および既知の１４塩基対、続いて全
てのプラスミドに共通の１７４ヌクレオチドの配列（表
3、配列１）を組み入れた。６個のプラスミドの一つで
は、挿入物（表3、配列２）はわずかに異なった：最初
の１３７のヌクレオチドは配列１と共通するが（表３、
点線）、挿入物の配列はこれを越えた伸長し、配列１か
ら逸脱した（表３参照）。
正および逆ｐＵＣ／Ｍ１３配列決定プライマーの両方で
配列決定した。ＡｃｃＩ消化後の断片を放出した６個の
プラスミドのうち５個は、プライマー＃２配列で始まる
２１３塩基対挿入物および既知の１４塩基対、続いて全
てのプラスミドに共通の１７４ヌクレオチドの配列（表
3、配列１）を組み入れた。６個のプラスミドの一つで
は、挿入物（表3、配列２）はわずかに異なった：最初
の１３７のヌクレオチドは配列１と共通するが（表３、
点線）、挿入物の配列はこれを越えた伸長し、配列１か
ら逸脱した（表３参照）。
【００３５】
【表３】
【００３６】表３では、プライマー＃２配列は太字で示
し、既知１４塩基は下線を付した（既知配列とはイタリ
ックで示す３個所異なる）。配列１および２（表３参
照）の予期される翻訳産物は、バシラス・サチリスＰ−
タンパク質と著しい相同性を示し、これらの挿入物がｓ
ｐｐ遺伝子の５’領域の全配列情報を含有していること
を示唆した。
し、既知１４塩基は下線を付した（既知配列とはイタリ
ックで示す３個所異なる）。配列１および２（表３参
照）の予期される翻訳産物は、バシラス・サチリスＰ−
タンパク質と著しい相同性を示し、これらの挿入物がｓ
ｐｐ遺伝子の５’領域の全配列情報を含有していること
を示唆した。
【００３７】２個のプラスミドでは、挿入物はｓｐｐ遺
伝子の３’半分に続くプライマー＃１の配列で出発する
（表３、配列３）。この配列は既に周知であるが、スタ
ヒロコッカス・アウレウスライブラリーをランダムに配
列決定することで取得したオリジナルの配列データーに
比較して、９個の塩基が異なる（表３で太字で示す）。
２個のプラスミドはＰＣＲ中の非特異的プライミングの
結果、異なる配列を有する挿入物を含有した。
伝子の３’半分に続くプライマー＃１の配列で出発する
（表３、配列３）。この配列は既に周知であるが、スタ
ヒロコッカス・アウレウスライブラリーをランダムに配
列決定することで取得したオリジナルの配列データーに
比較して、９個の塩基が異なる（表３で太字で示す）。
２個のプラスミドはＰＣＲ中の非特異的プライミングの
結果、異なる配列を有する挿入物を含有した。
【００３８】実施例４ 配列データーの分析 新規に得た配列データーは一緒に表し、ｓｐｐ構造遺伝
子の完全な配列を示すと予想される。解読枠は既に３’
領域の部分的配列より既知である。この解読枠に準じ、
出発コドンＡＴＧはプライマー＃２配列の上流１７４塩
基対を同定できる（上記表３参照）。遺伝子の全長は３
５４塩基対である（表４）。
子の完全な配列を示すと予想される。解読枠は既に３’
領域の部分的配列より既知である。この解読枠に準じ、
出発コドンＡＴＧはプライマー＃２配列の上流１７４塩
基対を同定できる（上記表３参照）。遺伝子の全長は３
５４塩基対である（表４）。
【００３９】
【表４】
【００４０】ｓｐｐ遺伝子（ＳＰタンパク質）の予想さ
れる翻訳産物は、１１７アミノ酸[配列番号：９]であ
る：この翻訳配列は、表５に示すように、５個の異なる
原核生物からのＲＮａｓｅＰタンパク質の確立されたア
ミノ酸配列と共に列挙した。
れる翻訳産物は、１１７アミノ酸[配列番号：９]であ
る：この翻訳配列は、表５に示すように、５個の異なる
原核生物からのＲＮａｓｅＰタンパク質の確立されたア
ミノ酸配列と共に列挙した。
【００４１】
【表５】
【００４２】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli；
Ｅｃｏ）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabili
s；Ｐｍｉ）、ストレプトマイセス・ビキニエンシス（S
treptomyces bikiniensis；Ｓｂｉ）、ミクロコッカス
・ルテウス（Micrococcus luteus；Ｍｌｕ）、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis；Ｂｓｕ）、スタヒロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus；Ｓａ
ｕ） 黄色ブドウ球菌ＳＰタンパク質は枯草菌Ｐタンパク質配
列とよく適合し、枯草菌タンパク質と有意な相同性を示
した。
Ｅｃｏ）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabili
s；Ｐｍｉ）、ストレプトマイセス・ビキニエンシス（S
treptomyces bikiniensis；Ｓｂｉ）、ミクロコッカス
・ルテウス（Micrococcus luteus；Ｍｌｕ）、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis；Ｂｓｕ）、スタヒロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus；Ｓａ
ｕ） 黄色ブドウ球菌ＳＰタンパク質は枯草菌Ｐタンパク質配
列とよく適合し、枯草菌タンパク質と有意な相同性を示
した。
【００４３】実施例５ ｓｐｐ遺伝子のＰＣＲ スタヒロコッカス・アウレウスは、以下のＤＮＡプライ
マーを用いるＰＣＲにより増幅した： 正プライマー（２３メル）：５’ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＧ
ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ３’[配列番号：１０] 逆プライマー（４１メル）：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴ
ＡＴＴＡＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣ
ＴＴＴＧＧＣ３’[配列番号：１１]
マーを用いるＰＣＲにより増幅した： 正プライマー（２３メル）：５’ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＧ
ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ３’[配列番号：１０] 逆プライマー（４１メル）：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴ
ＡＴＴＡＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣ
ＴＴＴＧＧＣ３’[配列番号：１１]
【００４４】逆プライマーは、pMalc2への直接的なクロ
ーニングのための、５’末端に付着したBamHI制限部位
（太字で示す）を含有する。ＨindＩＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼで部分的に消化したゲノムスタヒロコッカス
・アウレウスＤＮＡを鋳型として供した。ＰＣＲ１００
μは以下を含有する：
ーニングのための、５’末端に付着したBamHI制限部位
（太字で示す）を含有する。ＨindＩＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼで部分的に消化したゲノムスタヒロコッカス
・アウレウスＤＮＡを鋳型として供した。ＰＣＲ１００
μは以下を含有する：
【００４５】７７μｌ 無菌ｄｄＨ2Ｏ １０μｌ １０ｘテルモポール緩衝液（ＮＥＢ） ２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ−混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ） ５μｌ １００ｎｇ／μｌの正プライマー ５μｌ １００ｎｇ／μｌの逆プライマー １μｌ ２００ｎｇ／μｌのスタヒロコッカス・アウレ
ウス １μｌ ベントＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ） ５μｌ １００ｎｇ／μｌの正プライマー ５μｌ １００ｎｇ／μｌの逆プライマー １μｌ ２００ｎｇ／μｌのスタヒロコッカス・アウレ
ウス １μｌ ベントＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
【００４６】全ての反応組成物は、薄壁５００μｌチュ
ーブ（ペルキンエルマージーンアンプチューブ）に加
え、鉱物油（シグマ）２滴で被覆し、ＰＣＲ中の蒸発を
防いだ。反応混合物を９５℃で３分間インキュベート
し、ＤＮＡを変性させる。最初のＰＣＲ工程を、ペルキ
ンエルマーＤＮＡテルモサイクラー４８０で、９５℃で
４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で１分間の３
０サイクルを用いて実施した。
ーブ（ペルキンエルマージーンアンプチューブ）に加
え、鉱物油（シグマ）２滴で被覆し、ＰＣＲ中の蒸発を
防いだ。反応混合物を９５℃で３分間インキュベート
し、ＤＮＡを変性させる。最初のＰＣＲ工程を、ペルキ
ンエルマーＤＮＡテルモサイクラー４８０で、９５℃で
４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で１分間の３
０サイクルを用いて実施した。
【００４７】ＰＣＲ産物をＱＩＡクイック精製キットを
用いて清浄し、未使用のプライマーおよび鉱物油を除去
した。試料を寒天ゲル電気泳動により分析した。新規に
得た配列データーを用いて、ｓｐｐ構造遺伝子の全長を
増幅するためのＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲの
結果、分光光度測定により決定されるように、全ＤＮＡ
収量２μｇの約３６０塩基対の単一のバンドを得た。Ｄ
ＮＡ断片はＱＩＡクイックＰＣＲ精製カラムを用いて清
浄し、８０μｌの水中に回収した。
用いて清浄し、未使用のプライマーおよび鉱物油を除去
した。試料を寒天ゲル電気泳動により分析した。新規に
得た配列データーを用いて、ｓｐｐ構造遺伝子の全長を
増幅するためのＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲの
結果、分光光度測定により決定されるように、全ＤＮＡ
収量２μｇの約３６０塩基対の単一のバンドを得た。Ｄ
ＮＡ断片はＱＩＡクイックＰＣＲ精製カラムを用いて清
浄し、８０μｌの水中に回収した。
【００４８】
（１）一般的情報 （ｉ）出願人：グート，ザビーネ プレスコット，キャサリン （ｉｉ）発明の名称：ランダムにプライムされた増幅を
用いてヌクレオチド配列を取得する方法 （ｉｉｉ）配列の数：１１ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウュードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター読取り可能な形態 （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windows Version 2.0 用のＦａｓ
ｔＳＥＱ （ｖｉ）現出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０１９２３４ （Ｂ）出願日：１９９６年６月６日 （Ａ）出願番号：６０／０２９９２８ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１日 （Ａ）出願番号：６０／０２９９２９ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ジミー，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８８９１ （Ｃ）処理番号：Ｐ５０５８４ （ｉｘ）テレコミュニケーション情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
用いてヌクレオチド配列を取得する方法 （ｉｉｉ）配列の数：１１ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウュードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター読取り可能な形態 （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windows Version 2.0 用のＦａｓ
ｔＳＥＱ （ｖｉ）現出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０１９２３４ （Ｂ）出願日：１９９６年６月６日 （Ａ）出願番号：６０／０２９９２８ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１日 （Ａ）出願番号：６０／０２９９２９ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ジミー，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８８９１ （Ｃ）処理番号：Ｐ５０５８４ （ｉｘ）テレコミュニケーション情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【００４９】（２）配列番号：１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１
【化１】
【００５０】（２）配列番号：２に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：８５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２
【化２】
【００５１】（２）配列番号：３に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３
【化３】
【００５２】（２）配列番号：４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４
【化４】
【００５３】（２）配列番号：５に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５
【化５】
【００５４】（２）配列番号：６に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６
【化６】
【００５５】（２）配列番号：７に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１７０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：７
【化７】
【００５６】（２）配列番号：８に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３５４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：８
【化８】
【００５７】（２）配列番号：９に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１１７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：９
【化９】
【００５８】（２）配列番号：１０に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０
【化１０】
【００５９】（２）配列番号：１１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：４１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１
【化１１】
【図１】 第１の増幅工程の具体例を示す模式図であ
る。
る。
【図２】 第２の増幅工程の具体例を示す模式図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 ザビーネ・グート アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ペン・サークル 1091番 アパートメント・ジー501 (72)発明者 キャサリン・デニス・プレスコット アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノ リスタウン、ウィローブルック・ドライブ 523番
Claims (20)
- 【請求項１】 既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未
知ポリヌクレオチド配列を取得する方法であって： （ａ） 第１プライマーを用いて未知配列を増幅し； （ｂ） ランダムプライマーおよび第２プライマーを用
いて（ａ）の増幅による産物を増幅する；工程からなる
方法。 - 【請求項２】 既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未
知ポリヌクレオチド配列を取得する方法であって： （ａ） 既知配列の上流または下流のどちらかの未知配
列をフランキングする第１プライマーを選択し； （ｂ） 既知配列の末端近くの第２プライマーを選択
し； （ｃ） 第１プライマーを用いて未知配列を増幅し； （ｄ） ランダムプライマーおよび第２プライマーを用
いて（ｃ）の増幅による産物を増幅する；工程からなる
方法。 - 【請求項３】 既知ポリヌクレオチド配列に隣接する未
知ポリヌクレオチド配列を取得する方法であって：既知
配列の上流または下流のどちらかの未知配列をフランキ
ングする第１プライマーを選択し；既知配列の末端近く
の第２プライマーを選択し； （ａ） 第１プライマーを用いて未知配列を増幅し； （ｂ） ランダムプライマーおよび第２プライマーを用
いて（ａ）の増幅による産物を増幅する；工程からなる
方法。 - 【請求項４】 第２プライマーが標識化されている請求
項１記載の方法。 - 【請求項５】 ランダムプライマーがヘキサヌクレオチ
ドである請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 増幅工程（ａ）が約１０の反応サイクル
を含んでなる請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 増幅工程がＰＣＲを含んでなる請求項１
記載の方法。 - 【請求項８】 増幅工程によりＲＮａｓｅＰ配列を増幅
する請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 第２プライマーが標識化されている請求
項２記載の方法。 - 【請求項１０】 ランダムプライマーがヘキサヌクレオ
チドである請求項２記載の方法。 - 【請求項１１】 増幅工程（ａ）が約１０の反応サイク
ルを含んでなる請求項２記載の方法。 - 【請求項１２】 増幅工程がＰＣＲを含んでなる請求項
２記載の方法。 - 【請求項１３】 増幅工程によりＲＮａｓｅＰ配列を増
幅する請求項２記載の方法。 - 【請求項１４】 第２プライマーが標識化されている請
求項３記載の方法。 - 【請求項１５】 ランダムプライマーがヘキサヌクレオ
チドである請求項３記載の方法。 - 【請求項１６】 増幅工程（ａ）が約１０の反応サイク
ルを含んでなる請求項３記載の方法。 - 【請求項１７】 増幅工程がＰＣＲを含んでなる請求項
３記載の方法。 - 【請求項１８】 増幅工程によりＲＮａｓｅＰ配列を増
幅する請求項３記載の方法。 - 【請求項１９】 配列番号：１０または１１に示すプラ
イマーを用いてＲＮａｓｅＰポリペプチドを増幅する方
法。 - 【請求項２０】 配列番号：１、２、３、４、１０およ
び１１からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1923496P | 1996-06-06 | 1996-06-06 | |
| US2992896P | 1996-11-01 | 1996-11-01 | |
| US2992996P | 1996-11-01 | 1996-11-01 | |
| US60/019234 | 1996-11-01 | ||
| US60/029928 | 1996-11-01 | ||
| US60/029929 | 1996-11-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1094396A true JPH1094396A (ja) | 1998-04-14 |
Family
ID=27361190
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9185671A Pending JPH1094396A (ja) | 1996-06-06 | 1997-06-06 | ランダムにプライムされた増幅を用いてヌクレオチド配列を取得する方法 |
| JP9185672A Pending JPH10113189A (ja) | 1996-06-06 | 1997-06-06 | 新規 ＲＮａｓｅＰ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9185672A Pending JPH10113189A (ja) | 1996-06-06 | 1997-06-06 | 新規 ＲＮａｓｅＰ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0811696A3 (ja) |
| JP (2) | JPH1094396A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104256320A (zh) * | 2014-10-16 | 2015-01-07 | 哈尔滨艾博雅食品科技开发有限公司 | 一种桑葚再制米的制作方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6403337B1 (en) | 1996-01-05 | 2002-06-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Staphylococcus aureus genes and polypeptides |
| WO1999011653A1 (en) * | 1997-09-04 | 1999-03-11 | Smithkline Beecham Corporation | Novel rnase p |
| JP2002525083A (ja) * | 1998-09-01 | 2002-08-13 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ遺伝子およびポリペプチド |
| US6649744B1 (en) | 1999-05-07 | 2003-11-18 | Smithkline Beecham Corporation | Rnase P polypeptides, polynucleotides, and methods using their mechanisms of action |
| WO2000070025A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-23 | Smithkline Beecham Corporation | Methods of using rnase p reaction mechanisms of action |
| EP1130091A3 (en) * | 2000-03-01 | 2001-11-14 | Message Pharmaceuticals, Inc. | Bacterial RNaseP Proteins and their use in identifying antibacterial compounds |
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|---|---|---|---|---|
| US5043272A (en) * | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
| US5407799A (en) * | 1989-09-14 | 1995-04-18 | Associated Universities, Inc. | Method for high-volume sequencing of nucleic acids: random and directed priming with libraries of oligonucleotides |
| US5401630A (en) * | 1991-05-03 | 1995-03-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Species-specific DNA-DNA hybridization probe prepared using chromosome size DNA |
| DE69332665T2 (de) * | 1992-03-11 | 2003-11-27 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Methode um mrna zu klonieren |
| WO1995032283A1 (en) * | 1994-05-23 | 1995-11-30 | Indiana University Foundation | Sequence-specific endonucleases, and preparation and use of same |
-
1997
- 1997-06-06 EP EP97303900A patent/EP0811696A3/en not_active Withdrawn
- 1997-06-06 EP EP97303918A patent/EP0811688A3/en not_active Withdrawn
- 1997-06-06 JP JP9185671A patent/JPH1094396A/ja active Pending
- 1997-06-06 JP JP9185672A patent/JPH10113189A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104256320A (zh) * | 2014-10-16 | 2015-01-07 | 哈尔滨艾博雅食品科技开发有限公司 | 一种桑葚再制米的制作方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0811688A3 (en) | 1998-01-14 |
| EP0811688A2 (en) | 1997-12-10 |
| JPH10113189A (ja) | 1998-05-06 |
| EP0811696A3 (en) | 1998-01-07 |
| EP0811696A2 (en) | 1997-12-10 |
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|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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