JPH10113189A - 新規 ＲＮａｓｅＰ - Google Patents

新規 ＲＮａｓｅＰ

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JPH10113189A
JPH10113189A JP9185672A JP18567297A JPH10113189A JP H10113189 A JPH10113189 A JP H10113189A JP 9185672 A JP9185672 A JP 9185672A JP 18567297 A JP18567297 A JP 18567297A JP H10113189 A JPH10113189 A JP H10113189A
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JP
Japan
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polypeptide
polynucleotide
sequence
rnase
seq
Prior art date
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Application number
JP9185672A
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English (en)
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Sabine Guth
ザビーネ・グート
Joanne Jennings
ジョアン・ジェニングス
Catherine D Prescott
キャサリン・デニス・プレスコット
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SmithKline Beecham Ltd
SmithKline Beecham Corp
Original Assignee
SmithKline Beecham Ltd
SmithKline Beecham Corp
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Filing date
Publication date
Application filed by SmithKline Beecham Ltd, SmithKline Beecham Corp filed Critical SmithKline Beecham Ltd
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 スタフィロコッカス・アウレウス由来のＲＮ
ａｓｅ Ｐを提供する。 【解決手段】 ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコードし
ているポリヌクレオチド、およびＲＮａｓｅ ＰのＲＮ
Ａに転写されるポリヌクレオチド、ならびにＲＮａｓｅ
ＰのＲＮＡ成分および蛋白成分。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドの特定の
ものにコードされたポリペプチド、ＲＮＡおよびポリペ
プチドの分子複合体、かかるポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、ならびにかかるポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの製造、およびそのポリヌクレオチド
で形質転換された組み換え宿主細胞に関する。詳細に
は、本発明は、スタフィロコッカス、特にエス・アウレ
ウス（S.aureus）由来のかかるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドに関する。また本発明は、かかるオリヌク
レオチドおよび／またはポリペプチドの生合成、アッセ
ンブリーまたは作用ならびに治療におけるかかる阻害剤
の使用に関する。
【０００２】本発明は、新規細菌リボヌクレオ蛋白（ri
bonucleoprotein）複合体およびその構成成分に関す
る。より詳細には、本発明は、ＲＮａｓｅ Ｐ、詳細に
はスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus a
ureus）由来のＲＮａｓｅ Ｐ、ならびに抗微生物化合
物の同定のためのスクリーニングにおけるＲＮａｓｅＰ
まらはその成分の使用に関し、さらに本発明は、治療に
おけるかかる化合物の使用にも関する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】スタ
フィロコッカスは医学上重要な微生物の属を構成してい
る。それらは２つのタイプの疾病（侵入性および毒素発
生性）を生じさせることが知られている。一般的には侵
入性感染は、皮膚表面および深部組織の両方に変化をも
たらす膿瘍形成によって特徴づけられている。エス・ア
ウレウスは、ガン患者において、細菌では２番目の主な
病因である。骨髄炎、敗血性関節炎、敗血性血栓性静脈
炎および急性細菌性心内膜炎は比較的ありふれている。
スタフィロコッカスの毒素発生特性から生じる少なくと
も３つの臨床的症状がある。これらの疾病の証拠は、組
織侵入および細菌血症に対立するものとしての外毒素の
作用から生じる。これらの症状は、スタフィロコッカス
食物汚染、熱傷皮膚症候群および毒物ショック症候群を
包含する。
【０００４】スタフィロコッカス・アウレウス感染の頻
度は、過去２０年間で劇的に上昇した。これは多数の抗
生物質耐性株の出現および弱体化した免疫系を有する人
口の増加によるとされている。標準的な抗生物質のいく
つかまたは全部に耐性であるスタフィロコッカス・アウ
レウスの単離はもはや珍しいことではない。このこと
は、新しい抗微生物剤およびこの生物に関する診断試験
の必要性を引き起こした。
【０００５】病原性に関連しているある種のスタフィロ
コッカスの蛋白が同定されており、それは例えば、コア
グラーゼ、ヘモリシン、ロイコシジンおよびエキソおよ
びエンドエンテロトキシンであり、抗微生物スクリーニ
ングは結果に片寄りがあるため、常にさらなる標的が有
用である。よって、新たな標的は新しいクラスの抗微生
物剤の発見を可能にする。
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
【０００６】本発明は、新規リボヌクレオ蛋白複合体、
詳細にはスタフィロコッカス・アウレウス由来のかかる
複合体、ならびに別々に単離されたそのＲＮＡおよび蛋
白成分に関する。
【０００７】本発明のもう１つの態様によれば、かかる
複合体の蛋白およびＲＮＡ成分をコードしているポリヌ
クレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。
【０００８】詳細には、本発明は、本明細書に示すＤＮ
Ａ配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】また本発明は、本明細書に示す配列に由来
する新規オリゴヌクレオチドに関し、該オリゴヌクレオ
チドは、例えばＲＮＡまたは蛋白成分の発現に対する阻
害剤として作用しうるものである。オリゴヌクレオチド
またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて触媒活
性を直接阻害することもでき、あるいはＲＮＡ蛋白複合
体形成を妨害することにより間接的に活性を阻害するこ
ともできる。蛋白およびＲＮＡ成分は、別個に、あるい
は複合体となって、抗微生物化合物を同定するように設
計されたスクリーニングにおける標的としても有用であ
る。
【００１０】表１〜表３［配列番号：２］に示すアミノ
酸配列と既知アミノ酸配列または他の蛋白配列（例え
ば、ビー・ズブチリス（B.subtilis）のＲＮａｓｅ Ｐ
蛋白）との間の相同性によって新規ＲＮａｓｅポリペプ
チドであると同定されたポリペプチドを提供することが
本発明の１の目的である。
【００１１】ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチド、詳細には本明細書においてＲＮ
ａｓｅ Ｐと命名されたポリペプチドをコードしている
ポリヌクレオチド、ならびにＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ、
詳細には触媒ＲＮＡに転写されるポリヌクレオチドを提
供することが本発明のさらなる目的である。
【００１２】本発明の特に好ましい具体例において、ポ
リヌクレオチドは、表１〜表３に示す配列［配列番号：
１］を含むＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドまたはその変種
をコードしていて、かつ全長の遺伝子を含んでいる領域
を含む。
【００１３】本発明のもう１つの特に好ましい具体例に
おいて、表１〜表３のアミノ酸配列［配列番号：２］含
むスタフィロコッカス・アウレウス由来の新規ＲＮａｓ
ｅＰ蛋白またはその変種が提供される。
【００１４】本発明のもう１つの態様によれば、寄託株
に含まれるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ
２９株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードして
いる単離核酸分子が提供される。
【００１５】本発明のもう１つの態様において、ＲＮａ
ｓｅ Ｐ、詳細にはスタフィロコッカス・アウレウスの
ＲＮａｓｅ Ｐをコードしている単離核酸分子（ｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび触媒ＲＮＡを包含）
が提供される。。
【００１６】本発明のもう１つの態様によれば、治療ま
たは予防目的、詳細には遺伝学的免疫のための本発明ポ
リヌクレオチドの使用が提供される。ＲＮａｓｅ Ｐお
よびそれによりコードされるポリペプチドの天然に存在
する対立遺伝子変種は本発明特の好ましい具体例に含ま
れる。
【００１７】本発明のもう１つの態様において、本明細
書においてＲＮａｓｅ Ｐ呼ばれるスタフィロコッカス
・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的
に、診断的に、予防的に、臨床的にまたは治療上有用な
その変種、さらにそれを含んでなる組成物が提供され
る。
【００１８】ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子の天然に存在する対
立遺伝子によりコードされるＲＮａｓｅポリペプチドの
変種は本発明の特に好ましい具体例に含まれる。
【００１９】本発明の好ましい具体例において、上記Ｒ
Ｎａｓｅ Ｐポリペプチドの製造方法が提供される。
【００２０】本発明のさらにもう１つの態様において、
抗細菌剤として有用な、かかるポリペプチドに対する阻
害剤が提供され、それには例えば抗体が包含される。
【００２１】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
ＲＮａｓｅ Ｐ発現の評価、疾病の治療、遺伝学的変化
のアッセイ、ならびに細菌、詳細にはスタフィロコッカ
ス・アウレウス細菌に対する免疫学的応答を生じさせる
ためのＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドの生物への投与のための製品、組成物および方法が
提供される。該疾病とは、例えば、上部気道の感染症
（例、中耳炎、細菌性気管支炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下部気道の感染症（例、膿胸、肺膿瘍）、心疾患
（例、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例、分泌性下痢、
脾臓の膿瘍、腹膜後の膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例、脳の膿
瘍）、眼疾（例、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前
中隔および眼窩の蜂巣炎、涙嚢炎）、腎臓および尿道の
疾患（例、副睾丸炎、腎臓内および腎臓周囲の膿瘍、毒
物ショック症候群）、皮膚疾患（例、膿痂疹、毛包炎、
皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷からの感染、細菌性筋炎）、骨
および関節の疾患（例、敗血性関節炎、骨髄炎）であ
る。
【００２２】本発明の特定の好ましい具体例および本発
明の他の態様によれば、特に、厳密な条件下でＲＮａｓ
ｅ Ｐポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーション
するポリヌクレオチドが提供される。
【００２３】本発明の特定の好ましい具体例において、
ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドに対する抗体が提供され
る。
【００２４】本発明の他の具体例において、本発明ポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドと結合あるいは相互作
用してこれを阻害または活性化する化合物の同定方法が
提供される。該方法は、化合物と本発明ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドとの間の結合または相互作用を可
能にする条件下で本発明ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて化合
物との結合または相互作用を評価し（かかる結合または
相互作用は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと化
合物との結合または相互作用に応答して検出可能なシグ
ナルを発することのできる第２の化合物に関連したもの
である）次いで、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
と化合物との結合または相互作用から生じるシグナルの
存在または不存在を検出することにより化合物がポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドと結合あるいは相互作用
してその活性を阻害または活性化するかどうかを調べる
ことを特徴とする。
【００２５】本発明のさらにもう１つの態様によれば、
ＲＮａｓｅ Ｐアゴニストおよびアンタゴニスト、好ま
しくは静細菌または殺細菌アゴニストおよびアンタゴニ
ストが提供される。
【００２６】本発明のさらなる態様において、細胞また
は多細胞生物に投与するための、ＲＮａｓｅ Ｐポリヌ
クレオチドまたはＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドを含んで
なる組成物が提供される。
【００２７】以下の説明を読んで、あるいは本開示の他
の部分を読んで、開示された本発明の精神および範囲内
での種々の変更および修飾は当業者に容易に明らかとな
るだろう。
【００２８】当該技術分野で知られた用語である「同一
性」とは、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレ
オチド間の配列関連性の程度を意味し、かかる２つの配
列間の合致により決定される。同一性および類似性は両
方とも容易に計算されうる（Computational Molecular
Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New
York,1988;Biocomputing Informations and Genome Pro
jects,Smith,D.W.,ed,Academic Press,New York,1993;C
omputer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,
A.M.and Griffin,H.G.,eds,Humana Press,New Jersey,1
994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Hei
nje,G.,Academic Press,1987；およびSequence Analysi
s Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.eds.,M Stockton
Press,New York,1991；およびCarillo,H.,and Lipman,
D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)）。同一性を
決定するための好ましい方法は、試験される２つの配列
間の合致が最大となるように設計される。同一性および
類似性を決定する方法はコンピュータープログラムにお
いて集成されている。２つの配列間の同一性および類似
性の決定に好ましいコンピュータープログラム法は、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.,et al.,Nucle
ic Acids Research 12(1):387(1984)）、BLASTP,BLASTA
N,FASTA（Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1
990)）を包含するが、これらに限らない。BLAST Xプロ
グラムはＮＣＢＩおよび他のソースから広く市販されて
いる（BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH
Bethesda,MD 20894;Altshul,S.,et al.,J.Mol.Biol.21
5:403-410(1990)）。例示として、対照配列である配列
番号：１のヌクレオチド配列に対して例えば９５％の同
一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドとは、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列の１００
個のヌクレオチドのそれぞれにつき５個までの点突然変
異をそのポリヌクレオチドが含んでいてもよいというこ
とを除いて、そのポリヌクレオチドは対照配列と同一で
あることが意味される。言い換えると、対照ヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために
は、対照配列中のヌクレオチドの５％までを欠失または
他のヌクレオチドで置換してもよく、あるいは対照配列
中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドを対
照配列に挿入してもよい。対照配列に対するこれらの変
異は対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置あ
るいはそれらの末端位置間のいずれかの部分で生じてよ
い。これらの変異は、対照配列中において個々に散在し
てもよく、また対照配列中の１またはそれ以上の隣接し
た群中に存在していてもよい。同様に、対照配列である
配列番号：２のアミノ酸配列に対して例えば９５％の同
一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、
配列番号：２の対照アミノ酸配列の１００個のアミノ酸
のそれぞれにつき５個までの点突然変異をそのポリペプ
チドが含んでいてもよいということを除いて、そのポリ
ペプチドは対照配列と同一であることが意味される。言
い換えると、対照アミノ酸配列に対して少なくとも９５
％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
を得るためには、対照配列中のアミノ酸の５％までを欠
失または他のアミノ酸で置換してもよく、あるいは対照
配列中の全アミノ酸の５％までの数のアミノ酸を対照配
列に挿入してもよい。対照配列に対するこれらの変異は
対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置あ
るいはそれらの末端位置間のいずれかの部分で生じてよ
い。これらの変異は、対照配列中において個々に散在し
てもよく、また対照配列中の１またはそれ以上の隣接し
た群中に存在していてもよい。
【００２９】「単離」とは、「人の手」による天然状態
からの変更を意味し、すなわち、天然において単離され
る場合には、本来の環境から変化または除去されるこ
と、あるいはその両方を意味する。
【００３０】例えば、天然状態の生きた動物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、天然状態における共存物質から分
離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書の用語によれば「単離」されたものであ
る。
【００３１】一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポ
リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチ
ドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮ
ＡまたはＤＮＡであってよい。よって、本明細書の用語
ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本鎖ＤＮ
Ａ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、１本鎖
および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の
混ざったＲＮＡをいい、より典型的には、２本鎖のもの
または１本鎖および２本鎖領域の混ざったものをいう。
さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチドは、ＲＮＡま
たはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んで
なる３本鎖をいう。かかる領域中の鎖は同じ分子由来で
あってもよく、また異なる分子由来であってもよい。そ
の領域は１つまたはそれ以上の分子の全体を含みうる
が、典型的には、いくつかの分子の１の領域を含む。３
本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、１のオリゴ
ヌクレオチドである。本明細書の用語ポリヌクレオチド
は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記ＤＮＡま
たはＲＮＡを包含する。よって、安定性または他の理由
のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
は、本明細書にいう「ポリヌクレオチド」である。その
うえ、例えばイノシンまたはトリチウム化されたような
修飾塩基のごとき普通でない塩基を含んでなるＤＮＡま
たはＲＮＡも本明細書にいうポリヌクレオチドである。
当業者に知られた多くの有用な目的の非常に多くの修飾
がＤＮＡおよびＲＮＡについて行われていることが認識
されよう。本明細書の用語ポリヌクレオチドは、かかる
化学的に、酵素的、あるいは代謝的に修飾された形態の
ポリヌクレオチド、ならびに、特にウイルスの特徴およ
び単一・複合細胞を包含する細胞の特徴を示すＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００３２】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾ペプチド結合により互いに直鎖状に結合した２個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたは蛋
白をいうために用いられる。本明細書において該用語は
短鎖（当該分野において通常にはペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーという）および長鎖（当該分野に
おいて一般的には蛋白といい、種々のタイプがある）の
両方をいう。ポリペプチドは、しばしば２０個の天然ア
ミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含み、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスのみ
ならず当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても
末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を一定のポリペ
プチド中で修飾できることが理解されよう。ポリペプチ
ドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも、ここに挙
げるには膨大すぎるが、それらは基本的な教科書および
さらに詳細な研究論文に記載されており、さらには膨大
な研究文献にも記載されており、それら当業者によく知
られている。本発明ポリペプチド中に存在してもよい知
られている修飾のうち、少しの例を挙げると、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共
有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタ
ミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、
グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニ
レーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、
アルギニン化のごとき転移−ＲＮＡにより媒介される蛋
白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがあ
る。かかる修飾は当業者によく知られており、科学文献
に非常に詳細に記載されている。いくつかの特によく行
われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質付加は、
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd E
d.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,New York
(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されている。
多くの詳細なレビューがこの問題について利用でき、例
えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF P
ROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(19
83)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Modificat
ions:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Seifter
et al.,Analysis for protein modifications and nonp
rotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)お
よびRattman et al.,Protein Synthesis:Posttranslati
onal Modificationsand Aging.Ann.N.Y.Acad.Sci.663:4
8-62(1992)にある。ポリペプチドは分枝したものまたは
分枝のあるまたはない環状のものであってもよい。翻訳
後の天然プロセスおよび全くの合成法によっても、環
状、分枝および分枝つき環状のポリペプチドが合成され
うる。
【００３３】本明細書の用語「変種」は、対照ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドであるが、必須の特性は保持して
いるものをいう。典型的なポリヌクレオチド変種は対照
ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるものであ
る。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
を変化させるものであってもよく、変化させるものでな
くてもよい。以下に述べるように、ヌクレオチド変化
は、対照配列によりコードされるポリペプチドにおいて
アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切形を生じさせ
るものであってもよい。典型的なポリペプチド変種は対
照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものである。一
般的には、対照配列と変種の配列とが全体的に極めて近
似していて多くの領域で同一であるように、相違は限定
される。変種および対照ポリペプチドは、１個またはそ
れ以上の置換、付加、欠失（いかなる組み合わせで起こ
ってもよい）によってアミノ酸配列が異なっていてもよ
い。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コ
ードによりコードされたものであってもよく、そうでな
くてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変
種は対立遺伝子変種のごとき天然に存在するものであっ
てもよく、あるいは天然には存在しないものであっても
よい。天然に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドの変種を、当業者に知られた突然変異法により、
直接合成により、および他の組みかえ法により製造して
もよい。
【００３４】リボヌクレオ蛋白ＲＮａｓｅ Ｐは、転移
ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の生合成において重要な役割を果た
している。ｔＲＮＡはそれ自体蛋白生合成の主要中間体
である。ＲＮａｓｅ Ｐは、エンドリボ核酸分解作用に
よって前駆体ＲＮＡを成熟ｔＲＮＡにプロセッシングす
る機能を有する。真核細胞における複合体は２個のサブ
ユニット（触媒ＲＮＡおよび蛋白コ−フェクター）から
構成されている。ある種のＲＮａｓｅ Ｐ分枝に関する
最近のレビューが存在する。例えば、L.A.Kirsebom,Mol
ecular Microbiology 17(3),411-420(1995)またはN.R.P
ace and J.W.Brown,J.Bacteriol.177(8),1919-1928(199
5)参照。
【００３５】本発明は、以下により詳細に説明する新規
ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドおよびポリヌクレオチドに
関する。詳細には、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウスの新規ＲＮａｓｅ Ｐのポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関し、アミノ酸配列相同性により図２
および図５、ならびに配列番号：２に示すＲＮａｓｅＰ
のポリペプチドに関連づけられるものである。本発明
は、特に、表１〜表３、配列番号：１および配列番号：
２にそれぞれ示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
を有するＲＮａｓｅ Ｐ、ならびに寄託株中のＤＮＡの
ＲＮａｓｅ Ｐヌクレオチド配列およびそれによりコー
ドされるアミノ酸配列に関する。また本発明は、ＲＮａ
ｓｅ ＰのＲＮＡ成分、詳細にはその触媒ＲＮＡ成分、
ならびにかかる成分が転写される配列に関する。
【００３６】ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分 系統発生論的比較により２次構造モデリングが容易とな
り、最小の共通構造（図１）の同定が容易となる。ＲＮ
ａｓｅ ＰのＲＮＡの構造に関するデータはＲＮａｓｅ
Ｐデータベースにおいて利用可能である（w.w.w.(htt
p://jwbrown.mbio.ncsu.edu/RNaseP/home.hmtl）。ＲＮ
Ａ成分が転写される本発明ポリヌクレオチドを図３［配
列番号：１４］に示す。
【００３７】一般的には、わずかのヌクレオチドが保存
されているが、水素結合領域における補正的塩基変化
は、ユーバクテリアにおいて全体構造が保存されている
ことを示すものである。１次構造配列の普遍的な保存
（イー・コリ（E.coli）：６１−７４、３５３−３６
０）は他の保存されたヌクレオチドまたはある程度保存
されたヌクレオチドとともに機能的重要性に関与してい
るが、その意義はわかっていない。現在に至るまで、す
べてのＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ分子は折り畳まれて共通
「カゴ様」構造に適合することができ、このドメインを
越えると、原核生物のＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡと真核生
物のＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡとの間の説得力のある構造
上の類似性は存在しない。
【００３８】ＲＮａｓｅ Ｐの蛋白成分 当該蛋白の正確な機能的役割はわかっていない。該蛋白
成分が必ずしも触媒活性に必要とされないようにインビ
トロにおいて実験条件を確立できるが、インビボにおい
ては該蛋白成分は必要であるように思われる。エス・ア
ウレウス由来の新規ＲＮａｓｅ Ｐの蛋白成分が同定さ
れており、図２に示すアミノ酸配列［配列番号：２］に
より特徴づけられている。その中でエス・アウレウス
（Ｓａｕ）配列を他の微生物由来の配列と併置比較して
ある。
【００３９】例えば、図５［配列番号：１および２］に
示す配列に基づいて得られたプローブを用いて、Maniat
is et al.（上記）に詳述されたin situコロニーハイブ
リダイゼーションによりゲノムライブラリーを探索する
ことにより、無傷のＲＮａｓｅ Ｐの蛋白成分をコード
している全長の配列を得ることができる。
【００４０】
【表１】
【表２】
【表３】
【００４１】本発明ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、表１〜表３のポリペプチド［配
列番号：２］（詳細には成熟ポリペプチド）ならびにポ
リペプチドおよびフラグメント（特に、ＲＮａｓｅ Ｐ
の生物学的活性を有するもの、さらに表１〜表３［配列
番号：２］のポリペプチドまたは対応部分に対して少な
くとも７０％の同一性を有するもの、好ましくは表１〜
表３［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なくと
も８０％の同一性を有するもの、より好ましくは表１〜
表３［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なくと
も９０％の同一性を有するもの、さらに好ましくは表１
〜表３［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なく
とも９５％の同一性を有するもの）を包含し、さらにま
た、一般的には少なくとも３０個のアミノ酸、より好ま
しくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチド
のかかる部分を伴ったかかるポリペプチドの部分を包含
する。
【００４２】また本発明は、表１〜表３（Ｄ）に示す式
で示されるポリペプチド［配列番号：２］を包含し、式
中のアミノ末端において、Ｘは水素であり、カルボキシ
ル末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ1および
Ｒ2はいずれかのアミノ酸残基であり、ｎは１から１０
０までの間の整数である。いずれかのＲ基により示され
たアミノ酸残基の伸長部分（Ｒは１個より多い）はヘテ
ロポリマーまたはホモポリマーであってよく、好ましく
はヘテロポリマーである。
【００４３】フラグメントは、全体的に上記ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の一部と同じであるがすべてが同じで
はないアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。
ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドについては、フラグメント
は「単独」であってもよく、あるいは大きなポリペプチ
ド中に含まれていてもよい（大きなフラグメント中でフ
ラグメントは部分もしくは領域を形成している）。最も
好ましくは、フラグメントは１本の連続した領域、１本
の大きなポリペプチドである。
【００４４】好ましいフラグメントは、例えば、表１〜
表３［配列番号：２］のアミノ酸配列の一部を有する切
断されたポリペプチドまたはその変種（例えば、アミノ
末端を含む一連の残基、またはカルボキシル末端を含む
一連の残基）を包含する。宿主細胞中、詳細にはスタフ
ィロコッカス・アウレウス中の本発明ポリペプチドの分
解形態も好ましい。アルファ−ヘリックスおよびアルフ
ァ−ヘリックス形成領域、ベータ−シートおよびベータ
−シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイ
ルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、ア
ルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブ
ル領域、表面形成領域および高抗原性インデックス領域
を含んでなるフラグメントのごとき、構造的または機能
的属性により特徴づけられるフラグメントがさらに好ま
しい。
【００４５】ＲＮａｓｅ Ｐ活性を伝達する生物学的に
活性のあるフラグメントも好ましく、それらには類似の
活性または改善された活性を有するもの、あるいは望ま
しくない活性を低下させられたものが包含される。動
物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラ
グメントも包含される。スタフィロコッカス・アウレウ
スの生存に必須の機能、あるいは個体、特にヒトにおい
て疾病を開始し維持する能力を付与する酵素の受容体ま
たはドメインを含むフラグメントが特に好ましい。
【００４６】本発明ポリペプチドのフラグメントである
変種を、ペプチド合成による対応全長ポリペプチドの製
造に使用してもよい。それゆえ、変種を本発明全長ポリ
ペプチド製造の中間体として使用してもよい。
【００４７】本発明ポリヌクレオチド 本発明のもう１つの態様は単離ポリヌクレオチドに関
し、それらは、表１〜表３の推定アミノ酸配列［配列番
号：２］を有するＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコード
している全長の遺伝子、およびそれに密接に関連したポ
リヌクレオチドおよびそれらの変種を包含する。
【００４８】配列番号：１、３、４および１４に示すポ
リヌクレオチド配列のごとき本明細書に示された情報を
用い、標準的クローニングおよびスクリーニング法（例
えば、スタフィロコッカス・アウレウス ＷＣＵＨ２９
細胞を出発材料として用い、次いで、全長のクローンを
得るといった、細菌からの染色体ＤＮＡフラグメントの
クローニングおよび配列決定のごとき方法）を用いてＲ
Ｎａｓｅ ＰのポリペプチドまたはＲＮＡ（配列番号：
３から転写されるような）をコードしている本発明ポリ
ヌクレオチドを得てもよい。例えば、配列番号：１、
３、４および１４に示すような本発明ポリヌクレオチド
配列を得るためには、典型的には、イー・コリまたは他
のいくつかの適当な宿主中のスタフィロコッカス・アウ
レウス ＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライ
ブラリーを、部分配列由来の好ましくは１７量体または
それ以上の放射性標識オリゴヌクレオチドで探索する。
次いで、厳密な条件を用いて、プローブと同じＤＮＡを
担持しているクローンを識別することができる。かくし
て同定された個々のクローンを、もとの配列から設計さ
れた配列決定プライマーを用いて配列決定することによ
り、両方向への配列の伸長が可能となり、全長の遺伝子
配列が決定される。便利には、プラスミドクローンから
調製された変性２本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決定を
行う。適当な方法はManiatis,T.,Fritsch,E.F.and Samb
rook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,
2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold S
pring Harbor,New York(1989)に記載されている（特
に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング
１．９０および変性２本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定 １
３．７０参照）。本発明の例示として、表１〜表３に示
すポリヌクレオチド［配列番号：４および５］はスタフ
ィロコッカス・アウレウス ＷＣＵＨ２９由来のＤＮＡ
ライブラリー中に見いだされたものである。
【００４９】表１〜表３［配列番号：１］に示す特定の
ＤＮＡ配列は、表１〜表３［配列番号：２］に示すアミ
ノ酸残基の数にほぼ等しい数のアミノ酸残基を有する蛋
白（推定アミノ酸は当該分野にてよく知られたアミノ酸
残基の分子量を用いて計算できる）をコードしている読
み枠を含んでいる。配列番号：１のポリヌクレオチドの
ヌクレオチド番号１から３５１までは配列番号：２のポ
リペプチドをコードしている。ストップコドンは配列番
号：１のヌクレオチド番号３５２から始まる。
【００５０】寄託株のＲＮａｓｅ Ｐをコートしている
ＤＮＡを配列決定した結果により示されるように、本発
明のＲＮａｓｅ ＰはＲＮａｓｅファミリーの他の蛋白
と構造的に関連している。本発明蛋白は、既知蛋白の中
ではビー・ズブチリス（B.subtilis）に対して最大の相
同性を示す。表１〜表３［配列番号：２］のＲＮａｓｅ
Ｐは、その前著にわたって、ビー・ズブチリスのＲＮ
ａｓｅ Ｐポリペプチドに関して有意な同一性および類
似性を有している。
【００５１】本発明は、その全長にわたって、表１〜表
３［配列番号：１］のコーディング配列と同一性のある
ポリヌクレオチド配列を提供する。また、成熟ポリペプ
チドまたはそのフラグメントに関するコーディング配
列、ならびに他のコーディング配列を伴った読み枠中の
成熟ポリペプチドまたはフラグメントに関するコーディ
ング配列（例えば、リーダーまたは分泌配列、プレまた
はプロまたはプレプロ蛋白配列をコードしている）も本
発明により提供される。ポリヌクレオチドは、非コーデ
ィング配列（例えば、イントロンおよび転写されるが翻
訳されない非コーディング５’および３’配列、ターミ
ネーションシグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを
安定化する配列、イントロン、ポリアデニレーションシ
グナル、およびさらなるアミノ酸をコードしているさら
なるコーディング配列を含んでいてもよい（含んでいて
もよいものはこれらに限らない）。例えば、ポリペプチ
ドがペプチドのごときマーカー配列に融合していてもよ
く、該マーカー配列は融合ポリペプチドの精製を容易に
するものであってよい。本発明の特定の具体例におい
て、マーカー配列は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,In
c）中のタグのごときヘキサヒスチジンペプチドであ
り、マーカー配列についてはGentz et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.,USA 86,821-824(1989)に記載されている。Wil
son et al.,Cell 37:767(1984)に記載されており、ＨＡ
タグについてはWilson et al.,Cell 37:767(1984)に記
載されている。また本発明ポリヌクレオチドは、構造遺
伝子および遺伝子発現を制御する配列に本来的に結合し
ている配列（これらの配列に限らない）を包含する。
【００５２】本発明の好ましい具体例は、表１〜表３の
配列番号：１に示すヌクレオチド１から３５１または３
５４までを含むポリヌクレオチドであり、ＲＮａｓｅ
Ｐのポリペプチドをコードしているものである。
【００５３】また本発明は、表１〜表３（Ｃ）［配列番
号：１］および（Ｆ）［配列番号：３］に示す式で示さ
れるポリヌクレオチドを包含し、式中、分子の５’末端
においてＸは水素であり、分子の３’末端においてＹは
水素または金属であり、Ｒ1およびＲ2はいずれかの核酸
残基であり、ｎは１から３００までの間の整数である。
いずれかのＲ基により示されたアミノ酸残基の伸長部分
（Ｒは１個より多い）はヘテロポリマーまたはホモポリ
マーであってよく、好ましくはヘテロポリマーである。
表（Ｆ）［配列番号：３］にＳ配列についての好ましい
具体例は、１ないし１０または１ないし２０、詳細には
１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である
Ｒ１またはＲ２を有する。また本発明は、かかるポリヌ
クレオチドから転写されるＲＮＡ、詳細には触媒ＲＮＡ
を提供する。
【００５４】本明細書の用語「ポリペプチドをコードし
ているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプチドをコ
ードしている配列、詳細には細菌ポリペプチド、より詳
細には表１〜表３［配列番号：２］に示すアミノ酸配列
を有するスタフィロコッカス・アウレウスのＲＮａｓｅ
Ｐのポリペプチドをコードしている配列を含むポリヌ
クレオチドを包含する。また該用語は、コーディングお
よび／または非コーディング配列を含んでいてもよいさ
らなる領域とともにポリペプチドをコーディングしてい
る１個の連続した領域または連続していない領域（例え
ば、統合されたファージまたは挿入配列または修正配列
により分断されているもの）を含むポリヌクレオチドを
包含する。
【００５５】さらに本発明は、表１〜表３［配列番号：
２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種を
コードしている本明細書記載のポリヌクレオチドの変種
に関する。本発明ポリヌクレオチドのフラグメントであ
る変種を用いて全長の本発明ポリヌクレオチドを合成し
てもよい。
【００５６】ヌクレオチド塩基についての標準的なＡ、
Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ表記法に加えて、用語「Ｎ」も用いる。
「Ｎ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの４種の塩基のいずれか
がＤＮＡまたはＲＮＡ配列の指示された位置に存在して
もよいことを意味する。ただし、好ましい具体例におい
て、隣接ヌクレオチド位置と組み合わされ、正しい読み
枠において読まれた場合に、Ｎはかかる読み枠における
未熟なターミネーションコドンを生じる効果を有するで
あろう。
【００５７】さらに特に好ましい具体例はＲＮａｓｅ
Ｐ変種をコードしているポリヌクレオチドであり、その
変種は、表１〜表３［配列番号：２］のＲＮａｓｅ Ｐ
のポリペプチドのアミノ酸配列を有し、そのうち数個、
少数、５ないし１０個、１ないし５個、１ないし３、
２、１個または０個のアミノ酸残基が置換、欠失または
付加（いずれの組み合わせでもよい）されている。これ
らのうち、ＲＮａｓｅＰの特性および活性を変化させな
いサイレント置換、付加および欠失が特に好ましい。
【００５８】本発明のさらに好ましい具体例は、その全
長にわたって、表１〜表３［配列番号：２］に示すアミ
ノ酸配列を有するＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％、
６０％または７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド、ならびにかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチドである。また、その全長にわたって、寄託株
のＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する
領域を含むポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的な
ポリヌクレオチドが最も非常に好ましい。この点におい
て、全長にわたって少なくとも９０％の同一性のあるポ
リヌクレオチドが特に好ましく、これらの好ましいポリ
ヌクレオチドのうち少なくとも９５％の同一性を有する
ものが特に好ましい。そのうえ、少なくとも９５％の同
一性を有するもののうち少なくとも９７％の同一性を有
するものが非常に好ましく、これらのうち少なくとも９
８％および少なくとも９９％の同一性を有するものが特
に非常に好ましく、少なくとも９９％の同一性を有する
ものがより好ましい。
【００５９】本発明の好ましい具体例は、その全長にわ
たり、配列番号：３、４または１４に示すヌクレオチド
配列を有するＲＮａｓｅ Ｐのポリヌクレオチドに対し
て少なくとも５０％、６０％または７０％の同一性を有
するポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチ
ドの相補的なポリヌクレオチドである。また、その前著
にわたり、寄託株のＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチドに
対して少なくとも８０％の同一性を有する領域を含むポ
リヌクレオチド、ならびにそれに相補的なポリヌクレオ
チドが最も非常に好ましい。この点において、全長にわ
たって少なくとも９０％の同一性のあるポリヌクレオチ
ドが特に好ましく、これらの好ましくはポリヌクレオチ
ドのうち少なくとも９５％の同一性を有するものが特に
好ましい。そのうえ、少なくとも９５％の同一性を有す
るもののうち少なくとも９７％の同一性を有するものが
非常に好ましく、これらのうち少なくとも９８％および
少なくとも９９％の同一性を有するものが特に非常に好
ましく、少なくとも９９％の同一性を有するものがより
好ましい。
【００６０】好ましい具体例は、表１〜表３［配列番
号：１］のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
と実質的に同じ生物学的機能または活性を保有している
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、また
は配列番号：３、４または１４のＤＮＡにより転写され
るＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分と実質的に同じポリヌク
レオチドである。
【００６１】さらに本発明は上記配列にハイブリダイゼ
ーションするポリヌクレオチドに関する。この点におい
て、本発明は、特に、厳密な条件下にて上記ポリヌクレ
オチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド
に関する。本明細書の用語「厳密な条件」および「厳密
なハイブリダイゼーション条件」は、配列間に少なくと
も９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある
場合にハイブリダイゼーションが起こることを意味す
る。厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、５０％
ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１
５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナト
リウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫
酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌの変
性サケ・精子ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩、次
いで約６５℃における０．１ｘＳＳＣでのハイブリダイ
ゼーション支持体の洗浄である。ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrook et a
l.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.;C
old Spring Harbor,N.Y.,(1989)の特に第１１章に説明
されている。
【００６２】また本発明は、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件下にて、配列番号：１または配列番号：３また
は配列番号：４または配列番号：１４に示すポリヌクレ
オチド配列またはそのフラグメントを有するプローブを
用いて配列番号：１または配列番号：３または配列番
号：４または配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配
列に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーをスク
リーニングし、そのＤＮＡ配列を単離することにより得
ることのできるポリヌクレオチド配列を必須としてなる
ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチド
を得るのに有用なフラグメントは、例えば、本明細書の
いずれかの場所に記載されたプローブおよびプライマー
を包含する。
【００６３】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
て本明細書において説明するように、例えば、上記本発
明ポリヌクレオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤ
ＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして用
いて、ＲＮａｓｅ Ｐをコードしている全長のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離してもよく、ＲＮａｓｅＰ
遺伝子に対して高度な類似性を有する他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離してもよい。一般的に
は、かかるプローブは少なくとも１５個の塩基を含む。
好ましくはかかるプローブは少なくとも３０個の塩基を
有し、少なくとも５０個の塩基を有していてもよい。特
に好ましいプローブは少なくとも３０個の塩基を有し、
５０個またはそれ以下の塩基を有するものである。
【００６４】配列番号：１および／または２および／ま
たは３および／または４および／または１４の配列由来
のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチド
を、説明されているように本発明方法において使用して
もよいが、好ましくはＰＣＲに使用して本発明において
同定されたポリヌクレオチドが全部または部分的に感染
組織中の細菌において転写されているかどうかを決定す
る。かかる配列は、病原菌によって引き起こされた感染
の段階および感染のタイプの診断において有用でもあ
る。
【００６５】また本発明は、成熟蛋白およびさらなるア
ミノまたはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペ
プチド内部のアミノ酸であるポリペプチドをコードして
いてもよいポリペプチドを提供する（成熟形態が例えば
１個以上のポリペプチド鎖を有する場合）。かかる配列
は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシングにお
いて役割を果たし、蛋白を輸送し、半減期を延長または
短縮し、あるいはとりわけアッセイまたは製造のために
蛋白の取り扱いを容易にしうる。インビボにおける一般
的なケースとして、さらなるアミノ酸が細胞酵素により
成熟蛋白からプロセッシングされうる。
【００６６】１個またはそれ以上のプロ配列に融合した
成熟形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白はポリペプ
チドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去され
た場合、一般的にはかかる不活性前駆体が活性化され
る。いくつかまたは全部のプロ配列が活性化の前に除去
されうる。一般的には、かかる前駆体をプロ蛋白と呼
ぶ。
【００６７】まとめると、本発明ポリヌクレオチドは、
成熟蛋白、成熟蛋白およびリーダー配列（プレ蛋白とい
う）、１個またはそれ以上のプロ配列（リーダー配列で
はない）を有する成熟蛋白の前駆体、またはプレプロ蛋
白（プロ蛋白に対する前駆体であり、リーダー配列およ
び１個またはそれ以上のプロ配列（一般的には活性かつ
成熟形態のポリペプチドを生じるプロセッシング工程の
間に除去される）を有する）をコードしていてもよい。
【００６８】エス・アウレウスのＲＮａｓｅ ＰのＲＮ
Ａ構造遺伝子のクローニング イー・コリ（E.coli）宿主中のランダムに配列されたエ
ス・アウレウスのＤＮＡライブラリーからの配列を含む
特許エス・アウレウスのデータベースにおいてビー・ズ
ブチリス（B.subtilis）のＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡに対
する部分相同体が同定された。この相同体（Ａ３３２０
２：ビー・ズブチリスのＲＮＡヌクレオチド３１１−４
６０）を図３［配列番号：１４］に示す。
【００６９】これらのデータに基づくＰＣＲプライマー
を遺伝子の３’末端に対して設計し（プライマー：５’
−ＣＧＣ ＧＡＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＴＴ
ＴＡＴ ＡＣＧ−３’）［配列番号：５］、第２のプラ
イマーを５’ドメイン中の普遍的保存配列に基づいて設
計した（５’−ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＧ
Ｃ ＴＣ−３’）［配列番号：６］（ＲＮａｓｅ Ｐデ
ータベースw.w.w.から利用可能）。それらのプライマー
により遺伝子の約９０％が回収可能となった。ＲＮＡ生
成物に予想ヘリックスＰ１およびＰ２（図１）を生じさ
せる縮重プライマー（５’−C／TＧＡＴＡＴＴＴＣG／T
ＧA／GＴＡＡT／CＣ−３’）［配列番号：１３］を用い
て、完全な構造遺伝子を増幅した。構造遺伝子をＴ７プ
ロモーターの後ろにクローンし、配列決定したところ、
ビー・ズブチリス相同体に対して高い関連性が示された
（図２）。当業者は、上記縮重プライマー［配列番号：
１３］のごとき本発明方法および化合物を用いて、ヘリ
ックスＰ１およびＰ２をコードしている（転写してい
る）正確なエス・アウレウスのゲノム配列を決定するこ
とができる。
【００７０】予想２次構造を図４に示し、それはビー・
ズブチリスに関して得られるデータの基づくものであ
り、それによりヘリックス（例えば、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ
８、Ｐ１２）中の限られた数の補正塩基変化の存在、ヘ
リックスＰ３およびＰ９の明らかな短縮、およびヘリッ
クスＰ１８の伸長が明らかとなる。
【００７１】さらなる説明および定義 例えば、23 St.Machar Drive,Aberdeen AB2 1RY,Scotla
ndにあるNational Collections of Industrial and Mar
ine Bacteria Ltd（ＮＣＩＭＢという）に１９９５年９
月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ寄託番号４０７７１を
付与されたスタフィロコッカス・アウレウス ＷＣＵＨ
２９株を含む寄託物を用いて スクリーニングすること
により、ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子のコーディング領域を単
離することができる。寄託により該株はスタフィロコッ
カス・アウレウス ＷＣＵＨ２９と命名された。当該ス
タフィロコッカス・アウレウス株寄託物を、本明細書に
おいて「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」という。
【００７２】寄託株は全長のＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を含
んでいる。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配列な
らびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸
配列は、本明細書の配列の記載と矛盾するときも支配的
である。
【００７３】寄託株の寄託は特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約に従って行われ
た。該株は特許付与により制限なく公衆に解放されるで
あろう。寄託株は当業者の便宜のためだけに提供され、
寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２の規定を満たすように
寄託株が要求されるという承認ではない。
【００７４】寄託株およびそれに由来する化合物の製
造、使用または販売にはライセンスが必要であるかもし
れず、かかるライセンスはこれにより承認されない。
【００７５】本明細書に開示されたヌクレオチド配列
を、当該分野で知られた化学合成法により得ることもで
き、あるいは本明細書開示の特定の配列から構築された
プローブを用いてＤＮＡ標品を探索することによりエス
・アウレウス ＷＣＵＨ２９から得ることもできる。別
法として、開示された配列由来のオリゴヌクレオチド
を、細菌ゲノムソースからの配列のＰＣＲによるクロー
ニングプロセスにぴてＰＣＲプライマーとして使用する
こともできる。かかる配列は、病原菌により引き起こさ
れた感染のタイプの診断においても有用であることが認
識される。
【００７６】本発明ポリヌクレオチドはＲＮＡ形態また
はＤＮＡ形態であってよく、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは２本鎖ま
たは１本鎖であってよく、１本鎖の場合にはコーディン
グ鎖または非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であっ
てよい。ポリペプチドをコードしているコーディング配
列は、示されたコーディング配列と同じであってもよ
く、あるいは遺伝学的コードの縮重の結果として別のコ
ーディング配列となっていてもよい。
【００７７】よって、用語「ポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチド」は、当該ポリペプチドに関する
コーディング配列のみを含むポリヌクレオチドならびに
さらなるコーディングおよび／または非コーディング配
列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００７８】それゆえ、本発明は、同じ読み枠において
成熟ポリペプチドに関するコーディング配列が宿主から
のポリペプチドの発現および分泌を促進するポリヌクレ
オチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を
制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）
に融合しているポリヌクレオチドを包含する。リーダー
配列を有するポリペプチドはプレ蛋白であり、宿主細胞
により開裂されて成熟形態のポリペプチドを生じるリー
ダー配列を有していてもよい。ポリヌクレオチドは、成
熟蛋白およびさらなる５’アミノ酸残基であるプロ蛋白
をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟蛋白は
プロ蛋白であり、当該蛋白の不活性形態である。プロ配
列が開裂されると、活性成熟蛋白が残る。
【００７９】よって、例えば、本発明ポリヌクレオチド
は成熟蛋白をコードしていてもよく、あるいはプロ配列
を有する蛋白またはプロ配列とプレ配列（リーダー配
列）の両方を有する蛋白をコードしていてもよい。さら
に、本明細書に示すアミノ酸配列はＮＨ2末端のメチオ
ニン残基を示す。しかしながら、ペプチドの翻訳後修飾
の間にこの残基が付加されてもよいことが理解される。
したがって、本発明は、本明細書開示の各蛋白のメチオ
ニン含有アミノ末端変種およびメチオニン不含アミノ末
端変種の両方の使用を企図する。
【００８０】本発明ポリヌクレオチドは、遺伝子の５’
または３’末端のマーカー配列（本発明ポリペプチドの
精製を可能にする）に読み枠を合わせて融合したコーデ
ィング配列を有していてもよい。マーカー配列は、細菌
宿主の場合にマーカーに融合したポリペプチドの精製を
可能にするｐＱＥシリーズのベクター（Quiagen Inc.か
ら市販）により供給されるヘキサヒスチジンタグであっ
てもよい。別法として、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）
融合系を用いてもよい。この系において、興味の対象で
ある遺伝子を、ＭＢＰをコードしている融合ｍａｌＥ遺
伝子（New England BioLabsにより供給される）に融合
させる。マルトースに対するＭＢＰのアフィニティーに
より、融合生成物を１つの工程で精製する。前以て付与
されたＸａ開裂部位により、対象とする遺伝子産物から
のＭＢＰ成分の効果的な除去が可能になる。
【００８１】下記実施例の理解を容易にするために、特
定の頻出方法および／または用語を説明する。
【００８２】「プラスミド」は、当業者によく知られた
慣用的命名法により、大文字および／または数字が前お
よび／または後に続く小文字のｐにより命名される。本
発明における出発プラスミドは市販されているか、制限
なく公に利用できるものであるか、あるいは公表された
方法により利用可能なプラスミドから構築できるもので
ある。さらに、記載されたものと同等なプラスミドは当
該分野において知られており、当業者に明らかであろ
う。
【００８３】「ＤＮＡの消化」とは、ＤＮＡ中の特定配
列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂をい
う。本明細書の種々の制限酵素は市販されており、それ
らの反応条件、コファクターおよび使用される他の必要
物は知られており、当業者にとり日常的である。分析目
的には、典型的には、２０μｌの反応バッファー中で１
μｇのＤＮＡフラグメントを約２ユニットの酵素で消化
する。プラスミド構築用のＤＮＡフラグメントの単離目
的には、典型的には、反応規模に応じて反応体積を増加
させて５ないし５０μｌのＤＮＡを２０ないし２５０ユ
ニットの酵素で消化する。個々の制限酵素に適するバッ
ファーおよび基質量は標準的な研究室用マニュアル、例
えば、後に引用する文献に記載されており、それらは市
販業者により詳述されている。３７℃で１時間のインキ
ュベーション時間を通常使用するが、標準的手順、販売
者の指示および個々の反応に応じて条件を変化させても
よい。消化後、反応物を分析することができ、当業者に
とり日常的な既知方法を用いてアガロースまたはポリア
クリルアミドゲルによりフラグメントを精製することが
できる。一般的には、開裂フラグメントのサイズ分離を
１％アガロースゲルを用いて行う。
【００８４】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２本鎖相補的ポリデオキシヌ
クレオチド鎖をいい、それらを化学合成することもでき
る。かかる合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を有し
ておらず、よって、キナーゼ存在下でＡＴＰを用いるリ
ン酸付加を行わないと別のオリゴヌクレオチドに連結し
ないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、デホスホリ
レーションされていないフラグメントに連結するであろ
う。
【００８５】「連結」とは、２本鎖核酸フラグメント間
のホスホジエステル結合形成プロセスをいう（Maniati
s,T.,et al.,上記文献の１４６頁）。特記しない限り、
０．５μｇの同モル量の連結すべきＤＮＡフラグメント
につき１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガー
ゼ」という）を用い、既知バッファーおよび条件を用い
て連結を行う。
【００８６】好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは、均
一にまで精製される。
【００８７】「レプリコン」は、インビボにおけるＤＮ
Ａ複製の自律的ユニットとして機能する、すなわち自分
自身の制御下で複製しうる遺伝学的エレメント（例え
ば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００８８】「ベクター」は、プラスミド、ファージま
たはコスミドのごときレプリコンであり、それに別のＤ
ＮＡセグメントが結合して結合セグメントの複製を引き
起こすようなものであってもよい。
【００８９】「２本鎖ＤＮＡ分子」は、２本鎖らせん
（弛緩したものおよびスーパーコイル状態のもの両方）
になったデオキシリボヌクレオチド（塩基はアデニン、
グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態を
いう。この用語は分子の１次および２次構造のみをい
い、特定の３次形態に限定するものではない。よって、
この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制
限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色
体中に見いだされる２本鎖ＤＮＡを包含する。特定の２
本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、ＤＮＡの非転写
鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同配列を有する鎖）
に沿って５’から３’方向へと配列を記載する通常の慣
用に従って配列を記載してもよい。
【００９０】「特定蛋白の配列をコードしているＤＮ
Ａ」または「特定蛋白をコードしているヌクレオチド」
は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、転写され
てポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列をいう。
【００９１】「プロモーター配列」は、細胞においてＲ
ＮＡポリメラーゼが結合可能であり、かつ下流（３’方
向）のコーディング配列の転写を開始することのできる
ＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的で、プ
ロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開始コドン
（例えば、ＡＴＧ）により３’末端に結合されており、
上流に伸長してバックグラウンド以上の検出可能なレベ
ルの転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレ
メントを含んでいる。プロモーター中の配列に転写開始
部位（便利には、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピング
により明らかにされる）ならびにＲＮＡポリメアーゼの
結合に応答可能な蛋白結合ドメイン（共通配列）が見い
だされてもよい。真核生物のプロモーターは、ＴＡＴＡ
ボックスおよびＣＡＴボックスを含む（しばしばではあ
るが常にではない）。原核生物のプロモーターは−１０
および−３５共通配列を含む。
【００９２】ＤＮＡ「調節配列」は、宿主細胞において
コーディング配列の発現（すなわち、転写および翻訳）
を起こさせるプロモーター配列、リボソーム結合部位、
ポリアデニレーションシグナル、転写終結配列、上流の
調節ドメイン、エンハンサー等をまとめていう。
【００９３】ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に
結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで
それがコーディング配列によりコードされるポリペプチ
ドに翻訳される場合に、制御配列は細胞中のコーディン
グ配列の「発現を指令」する。
【００９４】「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列により形
質転換またはトランスフェクションされている細胞、あ
るいは外来ＤＮＡ配列により形質転換またはトランスフ
ェクションされうる細胞である。
【００９５】かかる外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入さ
れた場合、細胞は外来ＤＮＡにより「形質転換」されて
いる。外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体Ｄ
ＮＡ中に組み込まれて（共有結合されて）いてもよく、
あるいは組み込まれていなくてもよい。原核生物および
酵母においては、例えば、外来ＤＮＡはエピソームエレ
メント（例えばプラスミド）上に維持されてもよい。真
核細胞に関しては、安定に形質転換またはトランスフェ
クションされた細胞は、外来ＤＮＡが染色体中に組み込
まれて、それが染色体複製により娘細胞に遺伝するよう
になった細胞である。外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団を
含む細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力に
より、この安定性が示される。
【００９６】「クローン」は、有糸分裂により単一細胞
または共通の祖先から得られる細胞集団である。「細胞
系」は、インビトロで多くの世代にわたり安定に増殖し
うる初代細胞のクローンである。
【００９７】ＤＮＡ構築物の「外来」領域は、別のＤＮ
Ａ分子中の同定可能なセグメントであるか、または別の
ＤＮＡ分子に結合しているＤＮＡセグメントである。該
領域は、天然においては他の分子と結合した形では見い
だされない。
【００９８】ＲＮａｓｅ Ｐの蛋白成分の調製 本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、遺
伝子工学により得られる本発明ベクターを伴った宿主細
胞、および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造
にも関する。
【００９９】それゆえ、本発明のさらなる態様によれ
ば、宿主中で該ポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドを発現させ、次いで、発現生成物を回収するこ
とによる、組み換え法による該ポリペプチドをコードし
ているポリペプチドの製造方法も提供される。別法とし
て、慣用的なペプチド合成装置により、本発明ポリペプ
チドを合成法により製造することもできる。
【０１００】例えば、クローニングベクターまたは発現
ベクターであってもよい本発明ベクターを用いて宿主細
胞を遺伝子操作（トランスダクションまたは形質転換ま
たはトランスフェクション）する。ベクターは、例え
ば、プラスミド、コスミド、ファージ等の形態であって
もよい。プロモーターの活性化、形質転換体の選択また
は遺伝子の増幅に適するように修飾した栄養培地で遺伝
子操作された細胞を培養することができる。温度、ｐＨ
等のごとき培養条件は発現のために選択された宿主細胞
についてすでに用いられている条件であり、当業者に明
らかであろう。
【０１０１】適当な発現ベクターは、染色体ＤＮＡ配
列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列を含み、
例えば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウ
イルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤ
ＮＡの組み合わせから得られるベクターである。しかし
ながら、宿主中で複製可能で死滅しないものであるかぎ
り、他のベクターを用いてもよい。
【０１０２】組み換え生産のために、宿主細胞を遺伝子
操作して発現系またはその一部または本発明ポリヌクレ
オチドを含むようにすることができる。Davis et al.,B
ASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)およびSambro
ok et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2n
d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpri
ng Harbor N.Y.(1989)のごとき標準的な研究室マニュア
ルに記載された方法により、例えば、リン酸カルシウム
トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによる
トランスフェクション、トランスベクション、マイクロ
インジェクション、カチオン性脂質によるトランスフェ
クション、エレクトロポレーション、トランスダクショ
ン、スクレイプ・ローディング（scrape loding）、弾
丸による導入および感染により、ポリヌクレオチドの宿
主細胞中への導入を行うことができる。
【０１０３】適当な宿主の典型例は、ストレプトコッカ
ス、腸内細菌イー・コリ、ストレプトミセスおよびバチ
ルス細胞のごとき細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギ
ルス細胞のごとき真菌細胞；Drosophila S2およびSpodo
ptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈ
ｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびBowe
sメラノーマ細胞のごとき動物細胞；ならびに植物細胞
を包含する。
【０１０４】多種多様な発現系を用いて本発明ポリペプ
チドを製造することができる。かかるベクターは、特
に、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター
を包含し、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バ
クテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来
のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入エレ
メント由来のベクター、酵母染色体エレメント由来のベ
クター、バキュロウイルス、ＳＶ４０のごときパポバウ
イルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォウ
ルポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウ
イルスのごときウイルス由来のベクター、ならびにそれ
らの組み合わせ由来のベクター（例えば、コスミドおよ
びファージミドのごときプラスミドおよびバクテリオフ
ァージの遺伝学的エレメント由来のもの）がある。発現
系構築物は、発現を調節する制御領域および発現を引き
起こす制御領域を含んでいてもよい。一般的には、宿主
中でのポリヌクレオチドの維持、増殖または発現、およ
び／またはポリペプチドの発現に適した系またはベクタ
ーを、この点において発現に使用してもよい。種々のよ
く知られた方法、例えば、Sambrook et al.,MOLECULAR
CLONING:A LABORATORYMANUAL（上記）に示されたような
方法により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入してもよ
い。
【０１０５】種々の方法により適当なＤＮＡ配列をベク
ターに挿入してもよい。一般的には、当該分野において
知られている方法により、ＤＮＡ配列を適当な制限エン
ドヌクレアーゼ部位中に挿入する。
【０１０６】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
合成を指令する適当な発現制御配列に作動可能に連結さ
れる。かかるプロモーターの典型例として、ＬＴＲまた
はＳＶ４０プロモーター、イー・コリのｌａｃまたはｔ
ｒｐ、ラムダファージのＰLプロモーターおよび真核細
胞または原核細胞中またはそれらのウイルス中で遺伝子
発現を制御することが知られている他のプロモーターが
挙げられる。発現ベクターは、翻訳開始および／または
転写終結のためのリボソーム結合部位を含んでいてもよ
い。ベクターは、発現増幅に適した配列を含んでいても
よい。
【０１０７】さらに、好ましくは、発現ベクターは、宿
主細胞の選択のための表現型を生じさせる１またはそれ
以上の選択可能マーカー遺伝子（例えば、真核細胞培養
にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐
性、あるいはイー・コリにおいてはテトラサイクリンま
たはアンピシリン耐性）を含む。
【０１０８】遺伝子を、プロモーター、リボソーム結合
部位（細菌での発現のために）および所望によりオペレ
ーター（これらをまとめて「制御エレメント」という）
の制御下に置いて、この発現構築物を含むベクターによ
り形質転換された宿主細胞中で所望蛋白をコードしてい
るＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるようにすることがで
きる。コーディング配列はシグナルペプチドまたはリー
ダー配列を含んでいてもよく、あるいは含んでいなくて
もよい。例えば、イー・コリのｔａｃプロモーターまた
はプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）プロモーターならびに
シグナル配列を用いて本発明ポリペプチドを発現させる
ことができる。翻訳後プロセッシングにおいて宿主細胞
によりリーダー配列は除去されうる。例えば、米国特許
第４，４３１，７３９；４，４２５，４３７；４，３３
８，３９７号参照。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトラ
ンスフェラーゼ）ベクターまたは他の選択可能マーカー
を有するベクターを用いて、プロモーター領域を所望遺
伝子から選択することができる。２つの適当なベクター
はＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特に名を挙
げることのできる細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａ
ｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰR，ＰLおよびｔｒ
ｐを包含する。真核プロモーターはＣＭＶ即時初期、Ｈ
ＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レト
ロウイルス由来のＬＴＲｓ、およびマウス・メタロチオ
ネイン−Ｉを包含する。適当なベクターおよびプロモー
ターの選択は当業者のレベルの範囲内のことである。
【０１０９】制御配列のほかに、宿主細胞の増殖に応答
して蛋白配列の発現を調節する調節配列を付加すること
が望ましい。調節配列は当業者に知られており、その例
は、調節化合物の存在下で化学的または物理的刺激に応
答して遺伝子発現をスイッチオンまたはオフする調節配
列を包含する。他のタイプの調節エレメント、例えば、
エンハンサー配列がベクター中に存在していてもよい。
【０１１０】特定のコーディング配列が適当な調節配列
を伴ってベクター中に存在するように発現ベクターを構
築する。制御配列に対するコーディング配列の位置およ
び方向は、コーディング配列が制御配列の制御下で転写
される位置および方向である（すなわち、制御配列にお
いてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーデ
ィング配列を転写する位置および方向）。コーディング
配列の修飾はこの目的の達成のために望ましい。例え
ば、いくつかの場合において、配列を修飾してそれが適
当な方向で制御配列に結合するように（すなわち、読み
枠を維持）することが必要である。上記クローニングベ
クターのごときベクターへの挿入前に、制御配列および
他の調節配列をコーディング配列に連結してもよい。別
法として、すでに制御配列および適当な制限部位を含ん
でいる発現ベクター中にコーディング配列を直接クロー
ンすることもできる。
【０１１１】一般的には、組み換え発現ベクターは、宿
主細胞の形質転換を可能にするための複製開始点および
選択可能マーカー（例えば、イー・コリのアンピシリン
耐性遺伝子およびエス・セレビシエ（S.cerevisiae）の
ｔｒｐ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指
令するための高度に発現される遺伝子由来のプロモータ
ーを含むであろう。翻訳開始および終結配列、そして好
ましくはペリプラズム空間または細胞外培地中への翻訳
蛋白の分泌を指令しうるリーダー配列を伴った適当な様
相として異種構造配列を集合させる。異種配列が、所望
特性（例えば、発現された組み換え生成物の安定化また
は精製の単純化）を付与するＮ−末端同定ペプチドを含
む融合蛋白をコードしていてもよい。
【０１１２】上記のような適当なＤＮＡ配列ならびに適
当なプロモーターもしくは制御配列を含むベクターを用
いて適当な宿主を形質転換して、蛋白を発現させてもよ
い。
【０１１３】より詳細には、本発明は、上で広く説明し
た１個またはそれ以上の配列を含む組み換え構築物を包
含する。該構築物はベクター（プラスミドまたはウイル
スベクターのごときベクター、その中において本発明配
列が順方向または逆方向に挿入されている）を含む。こ
の具体例の好ましい態様において、構築物はさらに調節
配列（例えば、本発明配列に作動可能に連結されたプロ
モーターを包含）を含む。多数の適当なベクターおよび
プロモーターは当業者に知られており、市販されてい
る。例として下記ベクターを示す。細菌：ｐＥＴ−３ベ
クター（Stratagene）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱ
Ｅ−９（Qiagen）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、phagescript、
ｐｓｉＸ１７４、pbluescript SK、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ
８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（St
ratagene）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫ
Ｋ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmaci
a）。真核細胞：ｐＢｌｕｅＢａｃIII（Invitrogen）、
ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐ
ＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Pharmacia）。しかしながら、宿主
中で複製可能で死滅しない限り他のプラスミドまたはベ
クターを用いてもよい。
【０１１４】クローニングとの組み換えＤＮＡベクター
および形質転換可能な宿主細胞の例は、バクテリオファ
ージλ（イー・コリ（E.coli））、ｐＢＲ３２２（イー
・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２
３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陽性
細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ＭＥ２９０
（非イー・コリ−グラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（イー
・コリおよびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s））、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプ
トミセス（Streptomyces））、ｐＵＣ６（ストレプトミ
セス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス（Saccharomyce
s））、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（サ
ッカロミセス）を包含する。一般的には、"DNA Clonin
g":Vols. I &II.Glover et al.,ed.IRL Press Oxford(1
985)(1987)およびT.Maniatis et al.,"Molecular Cloni
ng"Cold Harbor Laboratory(1982)参照。
【０１１５】いくつかの場合において、宿主生物からの
ポリペプチドの分泌（分泌シグナルはその後開裂され
る）を引き起こす配列を付加することが好ましいかもし
れない。
【０１１６】宿主細胞において、適当なプロモーターの
制御下でポリペプチドを発現させることができる。本発
明ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて無細胞翻訳系を用
いてかかる蛋白を生産することもできる。原核宿主およ
び真核宿主とともに用いる適当なクローニングおよび発
現ベクターはSambrook et al.,MOLECULAR CLONING:ALAB
ORATORY MANUAL,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laborato
ry Press,Cold Spring Harbor N.Y.(1989)により説明さ
れている。
【０１１７】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度になるまでの宿主株の増殖の後、選択されたプロモ
ーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的
誘導）により誘導し、適当時間細胞を培養する。
【０１１８】典型的には、細胞を遠心分離により集め、
物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出
物をさらに精製する。
【０１１９】慣用的方法（凍結−融解サイクリング、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用）によ
り、蛋白発現に用いられる微生物細胞を破壊することが
できる（かかる方法は当業者によく知られている）。
【０１２０】発現系および選択された宿主によっては、
対象ポリペプチドが発現される条件下で上記発現ベクタ
ーにより形質転換された増殖中の宿主細胞により、本発
明ポリペプチドを製造してもよい。次いで、ポリペプチ
ドを宿主細胞から単離精製する。発現系がポリペプチド
を増殖培地中に分泌する場合、ポリペプチドを培地から
直接精製することができる。ポリペプチドが分泌されな
い場合には、細胞溶解物から単離するか、あるいは細胞
膜フラクションから回収する。ポリペプチドが細胞表面
に局在化している場合には、細胞全体または単離された
膜を所望遺伝子産物のアッセイ可能なソースとして用い
ることができる。イー・コリのごとき細菌宿主において
発現されたポリペプチドは、封入体からの単離および再
生を必要とするかもしれない。成熟蛋白が、過剰発現さ
れた不溶性生成物を生じる非常に疎水性の領域を有する
場合には、疎水性領域を欠失した切断蛋白を発現するこ
とが望ましいかも知れない。適当な増殖条件および回収
方法の選択は当業者の範囲内のことである。
【０１２１】硫酸アンモニウムまたはエタノールによる
沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水
性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ
ィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法
により、組み換え細胞培養物からポリペプチドを回収し
精製することができる。成熟蛋白の立体配置を完成させ
るために、必要に応じて蛋白再生工程を用いることがで
きる。最後に、最終精製工程のために高品質液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【０１２２】組み換え製造法に用いる宿主によっては、
本発明ポリペプチドがグリコシレーションされていたり
されていなかったりするかもしれない。本発明ポリペプ
チドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよ
い。
【０１２３】ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分の調製 標準的条件（通常には、製造元（例えばPromega）の推
奨条件）に従って、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる
ラン−オフ（run-off）インビトロ転写によりＲＮａｓ
ｅ ＰのＲＮＡ分子を精製する。適当な制限酵素により
プラスミドを直鎖状にして、ＲＮａｓｅ ＲのＲＮＡを
コードしている全長の遺伝子を含む直鎖状ｄｓＤＮＡを
得る。インビトロ開裂アッセイにおいて使用する前にＲ
ＮＡを調製用変性アクリルアミドゲルから精製するかま
たは沈殿させる。ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡおよびその蛋
白（ＲＮａｓｅ Ｐ蛋白）と複合体となったＲＮＡにつ
いての基質を、クローン化された遺伝子のインビトロ転
写により得ることができる。有用な基質はプレ−ｔＲＮ
ＡMetまたはイー・コリもしくはビー・ズブチリスのプ
レ−４．５Ｓ分子を包含するがこれらに限らず、上記Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼにより指令されるインビトロ転
写系を用いてかかる基質を発現させてもよい。自動合成
によりＲＮＡを調製することもできる。
【０１２４】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明は、本明細書記載のＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ部
分、蛋白部分および／または無傷のＲＮＡ／蛋白複合体
を妨害する薬剤のスクリーニング法に関する。該方法
は、試験薬剤による蛋白および／またはＲＮＡの活性の
妨害を測定することを特徴とする。例えば、選択された
ＲＮＡ部分が触媒活性を有するために、適当な精製およ
び処方後に、天然または合成ＲＮＡ基質を変換する能力
によりＲＮＡの活性がフォローされる。化学合成された
別の試験化合物または天然産物をかかる酵素活性のアッ
セイに含ませることにより、天然または合成基質と競争
または酵素活性を阻害する付加物を検出することができ
る。
【０１２５】本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細
胞、無細胞標品、化学的ライブラリー、および天然産物
混合物における小型分子基質およびリガンドの結合を評
価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然基質
およびリガンドであってもよく、あるいは構造的または
機能的模倣物であってもよい。例えば、Coligan et a
l.,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5
参照
【０１２６】また本発明はＲＮａｓｅ Ｐポリペプチド
またはポリヌクレオチドの作用を促進（アゴニスト）ま
たはブロック（アンタゴニスト）する化合物、詳細に
は、静細菌および／または殺細菌化合物のスクリーニン
グ法を提供する。該スクリーニング方法は高処理量の方
法を用いる。例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト
のスクリーニングのためには、ＲＮａｓｅ Ｐポリペプ
チドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガン
ドを含む合成反応混合物、細胞成分（例えば膜、細胞エ
ンベロープもしくは細胞壁）またはそれらの調製品を、
ＲＮａｓｅ Ｐアゴニストまたはアンタゴニスト候補分
子の不存在下または存在下でインキュベーションする。
ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドのアゴニストまたはアンタ
ゴニストとしての候補分子の能力は、標識リガンドの結
合減少またはかかる基質からの生成物の生成減少に反映
される。むやみに結合する分子、すなわち、ＲＮａｓｅ
Ｐポリペプチドの効果を誘導しない分子は良好なアン
タゴニストである可能性がある。十分に結合し、基質か
らの生成物の生成速度を増大させる分子はアゴニストで
ある。リポーター系の使用により、基質からの生成物の
生成速度またはレベルの検出を容易にしてもよい。この
点において有用なリポーター系は、生成物に変換される
発色標識基質、ＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチドまたは
ポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、
および当該分野で知られた結合アッセイを包含するが、
これらに限らない。
【０１２７】ＲＮａｓｅ Ｐアンタゴニストのついての
別のアッセイ例は、競争阻害アッセイに適した条件下で
ＲＮａｓｅ Ｐおよび潜在的アンタゴニストをＲＮａｓ
ｅＰ結合分子、組み換えＲＮａｓｅ Ｐ結合分子、天然
基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模
倣物と結合させる競争アッセイである。例えば、放射性
標識または発色化合物でＲＮａｓｅ Ｐを標識して、結
合分子に結合したＲＮａｓｅ Ｐ分子数または生成物に
変換されたＲＮａｓｅ Ｐ分子数を正確に決定して有効
なアンタゴニストの有効性を評価することができる。
【０１２８】有効なアンタゴニストは、本発明ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドに結合して、そのことによ
りその活性を阻害あるいは消失させる小型有機分子、ペ
プチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。有効なア
ンタゴニストは、結合分子のごとく、結合分子と同じ部
位に結合するがＲＮａｓｅ Ｐにより誘導される活性を
誘導せず、そのことによりＲＮａｓｅ Ｐの結合を排除
することによってＲＮａｓｅ Ｐの作用を妨害する小型
有機分子、ペプチド、密接に関連した蛋白、または抗体
のごときポリペプチドであってもよい。
【０１２９】有効なアンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合し、これを占領し、そのことにより細胞
の結合分子への結合を妨害して正常な生物学的活性を妨
害する小型分子を包含する。小型分子の例は、小型有機
分子、ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、こ
れらに限らない。他の有効なアンタゴニストはアンチセ
ンス分子を包含する（これらの分子の説明については、
Okano,J.Neurochem.56:560(1991):OLIGODEOXYNUCLEOTID
ES AS ANTISENSE INHIBITIORS OF GENE EXPESSION,CRC
Press,Boca Raton,FL(1988)参照）。好ましい有効なア
ンタゴニストは、ＲＮａｓｅ Ｐ関連化合物およびＲＮ
ａｓｅ Ｐ変種を包含する。
【０１３０】本明細書に示した各ＤＮＡ配列を抗微生物
化合物の発見および開発に用いてもよい。発現されたな
らば、コードされた蛋白を抗微生物剤のスクリーニング
のための標的として使用することができる。さらに、コ
ードされた蛋白のアミノ末端をコードしているＤＮＡ配
列または個々のｍＲＮＡのシャイン−ダルガノ配列また
は他の翻訳容易化配列を用いてアンチセンス配列を構築
し、対象コーディング配列の発現を制御することもでき
る。
【０１３１】本発明は、病原体および感染の続発症に応
答しうる哺乳動物宿主の間の最初の物理的相互作用を妨
害するための、本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチド
または阻害剤の使用を提供する。詳細には、本発明分子
を以下のことに用いてもよい：内在デバイス上の哺乳動
物細胞外マトリックス蛋白または傷における細胞外マト
リックス蛋白への細菌（詳細にはグラム陽性細菌）の付
着防止；ＲＮａｓｅＰ蛋白により媒介される哺乳動物細
胞侵入のブロック、例えば哺乳動物のチロシンキナーゼ
のホスホリレーション開始（Rosenshine et al., Infec
t.Immun.60:2211(1992)）；哺乳動物細胞外マトリック
ス蛋白および組織ダメージを伝達する細菌のＲＮａｓｅ
Ｐ蛋白の間における細菌付着のブロック；および内在
デバイスの移植または他の外科的方法以外のものにより
開始される感染における病原菌の正常な増殖のブロッ
ク。
【０１３２】例えば、上部気道の感染（例えば、中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気
道の感染（例えば、膿胸、肺膿瘍）、心臓の感染（例え
ば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下
痢、脾性の膿瘍、腹膜後の膿瘍）、ＣＮＳの感染（例え
ば、脳の膿瘍）、目の感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、ダルクリオ
システィティス（darcryocystitis）、腎臓および尿道
の感染（例えば、副睾丸炎、腎臓内および腎臓周囲の膿
瘍、毒素ショック症候群）、皮膚の感染（例えば、膿痂
疹、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷からの感染、細菌
性筋炎）、骨および関節の感染（例えば、腐敗性関節
炎、骨髄炎）のごとき疾病の抑制および治療に本発明ア
ンタゴニストおよびアゴニストを使用してもよい。
【０１３３】ＨＴＰスクリーニング法：ＲＮａｓｅ Ｐ
により指令されるＲＮＡ基質の開裂を阻害する化合物を
検出するためにアッセイを開発することができる。いく
つかの可能なアッセイフォーマットは、化学合成による
部位特異的な様式におけるＲＮＡ中に標識を取り込む能
力に基づくＨＴＰスクリーニングに適する。慣用的な放
射性に基づくフォーマットが好ましいが、均質な蛍光に
よるフォーマットも、その後のリード化合物の追跡調査
に有用である。両方のフォーマットの使用が本発明によ
り企図される。
【０１３４】機能的ＲＮａｓｅ Ｐアッセイ ＲＮＡ基質中の適当な位置にビオチンを導入し、５’末
端を３２Ｐで標識する。ストレプトアビジンを介して基
質を９６ウェルプレートに連結する。基質のＲＮａｓｅ
Ｐ依存的加水分解の後、放射性標識した５’リーダー
開裂生成物がバルク溶液相中に放出され、シンチレーシ
ョンカウングにかける。別法として、ＲＮＡ基質をスト
レプトアビジン被覆フラッシュプレート（flashplate）
に結合し、溶液相への放射活性６量体の放出がシグナル
の減少を引き起こすようにする。この別法は、均質かつ
連続的アッセイフォーマットであり、アッセイ開始後に
さらなる操作を必要としないという利点を有する。両方
のフォーマットは、同じＲＮＡ基質を用いるので、本発
明の実施において有用である。
【０１３５】ＲＮＡフラグメントライブラリーのレスキ
ュー ＲＮＡと相互作用する化合物の効果的な同定法が企図さ
れる。その概念は、ＲＮＡフラグメント上に再構成され
る薬剤結合部位の過剰発現に基づく。該フラグメントは
薬剤をキレートし、無傷のリボザイムの連続的機能発揮
を可能にする（図６）。この方法は、リボソームＲＮＡ
に結合するリガンドの探索において、最近になって記載
された（Howard,B-A,et al.,Biochem.Cell Bio.73(11/1
2):1161-1166(1995)）選択後、薬剤認識のための最小標
的構造を提供すると思われるランダムなＲＮＡフラグメ
ントを合理的な薬剤設計のためのプロトコール中に取り
入れる。したがって、Ｍ１ ＲＮＡに基づくランダムな
フラグメントライブラリーが得られ、ＲＮＡ／蛋白相互
作用を壊す化合物の同定のためのＨＴＰスクリーニング
（図７）に使用する。
【０１３６】環状ペプチドファージライブラリー 柔軟性のあるリード化合物中へのコンホーメーション上
の束縛の取り入れは、リード能増強のための強力な方法
であり、ペプチド模倣物の設計の分野において特に有用
である（Al-Obeidi,F.et al.,J.Med.Chem.32:2555-2561
(1989);Barkrt,P.L.et al.,J.Med.Chem.35:2040-2048(1
992)）。環化は、ストレプトアビジンに対する高アフィ
ニテイーリガンドの同定により能力が示されたペプチド
におけるベータターン形成傾向を増大させることが示さ
れている（Lee,M.S.,et al.,FEBSLett.359:113-118(199
5)）。この場合において、隣接システイン残基を伴った
環状ペプチドライブラリーが構築され、ファージアッセ
ンブリーの間における効果的なジスルフィド結合形成お
よび環化が可能となった。２個のジスルフィドで架橋さ
れた環状ペプチドのストレプトアビジン結合結晶構造に
より、両方のペプチドがベータターンコンホーメーショ
ンであることが示された（Kahn,M.（ゲスト編集者）,19
93,Tetrahedron 49,Symp.50,3433-3677）
【０１３７】多くの生物学的相互作用においてベータタ
ーンは重要な認識エレメントであり、それゆえ、小型の
束縛されたベータターン模倣物の設計に努力が払われて
きた（Kahn,M.（ゲスト編集者）,1993,Tetrahedron 49,
Symp.50,3433-3677）。この方法は、ＲＮａｓｅ Ｐに
適用した場合、阻害剤分子としてのペプチド模倣物の合
成に適した環状ペプチドの同定が可能となる。環状８量
体ペプチドディスプレイライブラリーを構築して、一定
のＲＮＡドメインと相互作用するペプチドを同定するた
めに使用してもよい。
【０１３８】２次評価 ＳＥＬＥＸ：指数的豊富化によるリガンドの系統的発
展： 合理的な薬剤設計およびＨＴＰスクリーニングによ
り同定された化合物の２次評価を助けるものとしての構
造の分析のためのＲＮＡ ＰのＲＮＡ（Ｍ１ ＲＮＡ）
の蛋白結合のためのＲＮＡ認識モチーフを同定する試み
においてこの方法を用いてもよい。当該方法は、高アフ
ィニティーで蛋白に特異的に結合するＲＮＡフラグメン
トの繰り返し選択および増幅に基づくものである（Szos
tak,J.W.,TIBS 17:89-93(1992)）。ＲＮＡフラグメント
のインビトロ合成およびそれらの蛋白に結合する分子の
その後の選択のために、エス・アウレウスおよびイー・
コリのＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡに基づくフラグメントラ
イブラリーを構築してもよい。化学的および酵素的構造
の探索法を、蛋白／ＲＮＡ保護研究と組み合わせて用い
て不活性部位をマッピングしてもよい。得られたＲＮＡ
フラグメントに基づくＳＥＬＥＸをさらに発展させてＲ
ＮＡ認識のための最小構造必須要件を決定してもよい。
【０１３９】ＲＮａｓｅ Ｐアッセンブリーの破壊 蛋白／ＲＮＡフラグメントペアーの同定により、それら
のアッセンブリーを破壊する化合物のスクリーニングを
開発することができる。固定化蛋白（ビオチン／ストレ
プトアビジン）に結合した標識ＲＮＡの薬剤により誘導
された破壊は、同時に起こるＲＮＡの存在により発生す
るシグナルの減少／消失を引き起こす（図６）。
【０１４０】ＲＮＡ／薬剤相互作用 薬剤耐性を付与するＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡフラグメン
ト（上記ＲＮＡフラグメントレスキューライブラリー）
を配列決定して、結合部位をマッピングする試みにおけ
る薬剤の存在下または不存在下での化学的および酵素的
構造探索のためにインビトロで発現させてもよい。薬剤
結合のための最小構造必須要件の同定のための試みにお
いて、ＳＥＬＥＸをリード化合物に適用してもよい。
【０１４１】ＲＮａｓｅ Ｐ基質 ＨＴＰスクリーニングのために、プレ−ｔＲＮＡおよび
プレ−４．５Ｓ ＲＮＡ誘導体を含む最小ＲＮＡ基質を
化学合成してもよい（例えば、図８）。特定のヌクレオ
チドのリボース２’−ヒドロキシル基を用いるＲＮＡ−
リガンド相互作用を、適当に修飾されたＲＮＡフラグメ
ントの化学合成により探索してもよい。リボヌクレオチ
ドに特徴的なＣ3’−エンド立体配置を保持するため
に、２’−メトキシおよび２’−フルオロリボヌクレオ
チドアナログを用いることができ、後者が立体的理由に
より好ましい。２’−置換基を欠くヌクレオチドは望ま
しくないＣ2’−エンド立体配置をとる。
【０１４２】本発明は、本明細書記載のいずれかの方法
により同定される阻害剤にも関する。ＲＮＡ Ｐ作用の
酵素的性質のため、遷移状態の模倣物、生成物放出に対
する阻害剤または基質結合に対する阻害剤として作用す
る阻害剤を同定しうることが理解される。
【０１４３】診断アッセイ また、本発明は、診断試薬として使用する本発明ＲＮａ
ｓｅ Ｐポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生
物、詳細には哺乳動物、特にヒトにおけるＲＮａｓｅ
Ｐの検出は、疾病の診断方法を提供する。ＲＮａｓｅ
Ｐ遺伝子を含む生物による真核生物（「個体」とい
う）、詳細には哺乳動物、特にヒトの感染を、種々の方
法により核酸レベルで検出してもよい。
【０１４４】感染した個体の細胞および組織（例えば、
骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚）から診断用核酸を得
てもよい。ゲノムＤＮＡを検出に直接用いてもよく、あ
るいは分析前にＰＣＲまたは他の増幅法により酵素的に
増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に使用し
てもよい。増幅を用い、原核細胞遺伝子の遺伝子型の分
析により、個体に存在する原核生物の種および株の特徴
づけを行ってもよい。対照配列の遺伝子型との比較にお
いて、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を
検出することができる。増幅ＤＮＡを標識ＲＮａｓｅ
Ｐポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせ
ることにより点突然変異を同定することができる。ＲＮ
ａｓｅ消化または融解温度の相違により、完全に合致し
た配列をミスマッチ２本鎖から識別することができる。
変性剤を伴うゲルまたは伴わないゲルにおけるＤＮＡフ
ラグメントの電気泳動度の変化により、あるいは直接Ｄ
ＮＡ配列決定により、ＤＮＡ配列の相違を検出してもよ
い。例えば、Meyers et al.,Science,230:1242(1985)参
照。ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレアーゼ保
護アッセイまたは化学的開裂法により、特定位置での配
列の変化を明らかにしてもよい。Cotton et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci,USA,85:4397-4401(1985)参照。
【０１４５】セロタイプ分けをするための種々の方法に
より、本発明遺伝子の変異または多型性を有する細胞を
ＲＮＡレベルで検出してもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ
を用いて変異を検出することができる。例えば、GeneSc
anのような自動検出系と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲの使
用が特に好ましい。同じ目的、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣ
ＲにＲＮＡまたはｃＤＮＡを用いてもよい。例として、
ＲＮａｓｅ Ｐをコードしている核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを用いて変異を同定し分析することができ
る。典型的なプライマーの例を実施例に示す。さらに本
発明は、５’および／または３’末端から１、２、３ま
たは４個のヌクレオチドが除去されたこれらのプライマ
ーも提供する。これらのプライマーを、特に、個体由来
の試料から単離されたＲＮａｓｅ ＰのＤＮＡの増幅に
用いてもよい。プライマーを用いて感染個体から単離さ
れた遺伝子を増幅して、その遺伝子をＤＮＡ配列を調べ
るための種々の方法に供してもよい。このようにして、
ＤＮＡ配列中の変異を検出し、これを用いて感染を診断
し、さらに感染病原体のセタイプ分けおよび／または分
類を行ってもよい。
【０１４６】さらに本発明は、疾病、好ましくは細菌感
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染、最も好ましくは上部気道の感染（例えば、中
耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下部
気道の感染（例えば、膿胸、肺膿瘍）、心臓の感染（例
えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性
下痢、脾性の膿瘍、腹膜後の膿瘍）、ＣＮＳの感染（例
えば、脳の膿瘍）、目の感染（例えば、眼瞼炎、結膜
炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、ダルク
リオシスティティス（darcryocystitis）、腎臓および
尿道の感染（例えば、副睾丸炎、腎臓内および腎臓周囲
の膿瘍、毒素ショック症候群）、皮膚の感染（例えば、
膿痂疹、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷からの感染、
細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例えば、腐敗性関
節炎、骨髄炎）のごとき疾病の診断方法であって、個体
由来の試料から表１〜表３［配列番号：１］の配列を有
するポリヌクレオチドの発現のレベルの増大を決定する
ことを特徴とする方法を提供する。ポリヌクレオチドの
定量の関する分野においてよく知られた方法のいずれ
か、例えば、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ
保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイ
ゼーション法を用いてＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチド
の発現の増大または低下を測定することができる。
【０１４７】さらに、正常対象組織試料と比較してＲＮ
ａｓｅ Ｐの過剰発現を検出するための本発明による診
断アッセイを用いて感染の存在を検出してもよい。宿主
由来の試料中のＲＮａｓｅ Ｐ蛋白のレベルを決定する
のに用いることのできるアッセイ方法は当業者によく知
られている。かかるアッセイ方法はラジオイムノアッセ
イ、競争的混合アッセイ、ウェスタンブロット分析およ
びＥＬＩＳＡアッセイを包含する。
【０１４８】抗体 本発明ポリペプチドまたはその変種、あるいはそれらを
発現する細胞を免疫原として用いてかかるポリペプチド
に対して免疫特異的な抗体を得ることができる。本明細
書の用語「抗体」は、モノクローナルおよびポリクロー
ナル抗体、キメラ、１本鎖、類人猿化抗体およびヒト化
抗体、ならびにＦａｂフラグメント（Ｆａｂ免疫グロブ
リン発現ライブラリーの生成物を包含）を包含する。
【０１４９】酵素処理により、例えば、パパインを用い
てＦｃ部分からＦａｂ部分を開裂することにより、もと
のモノクローナル抗体からＦａｂフラグメントを調製し
てもよい。
【０１５０】常用プロトコールを用いて、動物、好まし
くは非ヒト動物にポリペプチドまたはエピトープ含有フ
ラグメント、アナログあるいは細胞を投与することによ
り、本発明ポリペプチドに対して生成される抗体を得る
ことができる。次いで、そのようにして得られた抗体は
ポリペプチド自体に結合するであろう。このようにし
て、無傷のポリペプチド全体に結合する抗体を得るため
に、ポリペプチドのフラグメントのみをコードしている
配列でさえも用いることができる。次いで、かかる抗体
を用いて当該ポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。
【０１５１】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を
用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler
andMilstein Nature 1975 256:495-497）、トリオーマ
法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.,Im
munology Today 1983 4:72）およびヒト・モノクローナ
ル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co
le et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.
Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を包含する。
【０１５２】１種またはそれ以上の元のポリペプチドお
よび／または融合蛋白を用いて、ハイブリドーマをスク
リーニングして、高い結合アフィニテイーを有し、他の
スタフィロコッカス種と容易に交差反応をする細胞系を
選択する。選択された細胞系を倍よして所望Ｍａｂを得
る。
【０１５３】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を
製造することができる。また、トランスジェニックマウ
スを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対
するヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１５４】別法として、ファージディスプレイライブ
ラリーを用いて、抗ＲＮａｓｅ Ｐを有することについ
てスクリーニングされたヒト由来の、あるいは無処理の
ライブラリー由来のＰＣＲ増幅されたリンパ球のｖ−遺
伝子のレパートリーから得られた、ポリペプチドに対す
る結合活性を有する抗体遺伝子を選択してもよい（McCa
fferty,J.et al.,(1990),Nature 348,552-554;Marks,J.
et al.,(1992)Biotechnology 10,779-783）。チェイン
・シャフリング（chain-shuffling）（Clackson,T.et a
l.,(1991)Nature 352,624-628）により、それらの抗体
のアフィニティーを改善することもできる。
【０１５５】ポリペプチドおよび／または融合蛋白に対
する高アフィニティーに関して抗体をスクリーニングす
べきである。
【０１５６】上述のごとく、最終抗体のフラグメントを
調製してもよい。
【０１５７】抗体は、分子量約１５００００の無処理の
抗体またはその誘導体、例えば、Skerra,A and Pluckth
um,A.,Science 240:1038-1040(1988)に記載されたよう
なＦａｂフラグメントまたはＦｖフラグメントであって
もよい。２個の抗原結合ドメインが存在する場合、各ド
メインは異なるエピトープに対して指向されるもの（バ
イスペシフィック（bispecific）抗体という）であって
もよい。
【０１５８】詳細には、本発明の元の蛋白またはポリペ
プチドフラグメントよりもわずかに長いかまたはわずか
に短い誘導体を用いてもよい。さらに、１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が修飾されているポリペプチドを用
いてもよい。かかるペプチドを、例えば、アミノ酸の置
換、付加または転移により、またはアミノ酸の化学的修
飾により調製してもよい。一般的には、かかるすべての
置換および修飾はペプチド化学の当業者によく知られて
いる。
【０１５９】上記抗体を用いてポリペプチドを発現する
クローンを単離または同定して、アフィニティークロマ
トグラフィーによりポリペプチドを精製してもよい。
【０１６０】よって、特に、ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチ
ドに対する抗体を用いて感染を、とりわけ細菌感染を、
特に上部気道の感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、
急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気道の感染（例えば、
膿胸、肺膿瘍）、心臓の感染（例えば、感染性心内膜
炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下痢、脾性の膿瘍、
腹膜後の膿瘍）、ＣＮＳの感染（例えば、脳の膿瘍）、
目の感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、
前中隔および眼窩蜂巣炎、ダルクリオシスティティス
（darcryocystitis）、腎臓および尿道の感染（例え
ば、副睾丸炎、腎臓内および腎臓周囲の膿瘍、毒素ショ
ック症候群）、皮膚の感染（例えば、膿痂疹、毛包炎、
皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷からの感染、細菌性筋炎）、骨
および関節の感染（例えば、腐敗性関節炎、骨髄炎）の
ごとき疾病を治療してもよい。
【０１６１】好ましくは、本発明ポリペプチドの発現に
ついて上で説明したような適当な発現系において、該抗
体をコードしているＤＮＡポリマーの発現により抗体を
調製する。発現系のためのベクターの選択は、一部に
は、宿主によって決定されるであろう。宿主はイー・コ
リ（好ましくはＢ株）またはストレプトミセス種のごと
き原核細胞であってもよく、あるいはマウス・Ｃ１２
７、マウス・ミエローマ、ヒト・ＨｅＬａ、チャイニー
ズハムスター・卵巣、糸状菌もしくは単細胞真菌または
昆虫細胞のごとき真核細胞であってもよい。宿主はトラ
ンスジェニック動物またはトランスジェニック植物（例
えば、Hiatt,A.et al.,Nature 340:76-78(1989)に記載
されたようなもの）であってもよい。適当なベクターは
プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよび組み
換えウイルス、例えばバキュロウイルスおよびワクシニ
ア由来のウイルスを包含する。
【０１６２】ポリペプチド変種は、抗原的に、エピトー
プ的にまたは免疫学的に同等な変種であり、本発明の特
別な態様を形成するものである。本明細書の用語「抗原
的に同様な誘導体」は、特定の抗体によって特異的に認
識されるポリペプチドまたはその同等物を包含し、抗体
は、本発明蛋白またはポリペプチドに対して生成された
場合、病原体と哺乳動物宿主との間の直接的な物理的相
互作用を妨害する。本明細書の用語「免疫学的に同等な
誘導体」は、動物において抗体を生成させるための適当
な処方に含有させて使用されるペプチドまたはその同等
物を包含し、それらが使用された場合、抗体は病原体と
哺乳動物宿主との間の直接的な物理的相互作用を妨害す
る。
【０１６３】抗原的または免疫学的に同等な誘導体また
はその融合蛋白のごときポリペプチドを抗原として用い
てマウスまたはラットもしくはニワトリのごとき他の動
物を免疫する。融合蛋白はポリペプチドに安定性を与え
る。抗原は、例えば抱合により、免疫原性担体蛋白、例
えばウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール
リムペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合していても
よい。また、複数コピーの蛋白またはポリペプチドを含
む複数の抗原性ペプチド、あるいはその抗原的または免
疫学的に同等なポリペプチドは、免疫原性を改善して担
体の使用を不要にするに十分に抗原的でありうる。
【０１６４】好ましくは、個体においてより免疫原性を
少なくするように抗体またはその変種を修飾する。例え
ば、固体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体を
「ヒト化」してもよく、ヒト化抗体においてはハイブリ
ドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクロー
ナル抗体中に移植されている。それは例えば、Jones,P.
et al.,(1986)Nature 321,522-525またはTempest et a
l.,(1991)Biotechnology9,266-273に記載されている。
結合活性を有するヒト化モノクローナル抗体またはその
フラグメントは本発明の特別な態様を形成する。
【０１６５】修飾は１の「ヒト化」抗体に限る必要はな
く、他の霊長類配列（例えば、Newman,R.et al.,Biotec
hnology 10:1455-1460(1992)）を使用してもよい。
【０１６６】遺伝学的免疫における本発明ポリペプチド
の使用は、好ましくは、筋肉中へのプラスミドＤＮＡの
直接注射（Wolff et al.,Hum Mol Genet 1992,1:363お
よびManthorpe et al.,Hum Gene Ther.1963:4,419）、
特異的蛋白担体と複合体化したＤＮＡの送達（Wu et a
l.,J.Biol.Chem1989:264,16985）、ＤＮＡとリン酸カル
シウムとの共沈（Benvenisty & Reshef,PNAS USA,1986:
83:9551）、種々の形態のリポソームへのＤＮＡの封入
（Kaneda et al.,Science 1989:423,375）、微粒子爆弾
（Tang et al.,Nature 1992,356:152およびEisenbraun
et al.,DNA CellBiol 1993,12:791）およびクローン化
されたレトロウイルスベクターを用いるインビボ感染
（Seeger et al.,PNAS USA 1984:81,5849）のごとき適
当な送達法を用いるものである。
【０１６７】ワクチン 本発明のもう１つの態様は、個体、詳細には哺乳動物に
おける免疫学的応答の誘導方法であって、抗体および／
またはＴ細胞免疫応答を生じさせて感染、詳細には細菌
感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・アウレウス感
染から個体を防御するに十分なＲＮａｓｅ Ｐまたはそ
のフラグメントもしくは変種を個体に接種することを特
徴とする方法に関する。また、かかる免疫学的応答が細
菌の複製を遅延させるようになる方法も提供される。本
発明のさらにもう１つの態様は、個体における免疫学的
応答の誘導方法であって、インビボにおいてＲＮａｓｅ
Ｐまたはそのフラグメントもしくは変種を発現させるた
めに、ＲＮａｓｅ Ｐまたはそのフラグメントもしくは
変種の発現を指令する核酸ベクターをかかる個体に送達
して免疫学的応答を誘導することを特徴とする方法に関
する。免疫学的応答は、例えば、抗体および／またはＴ
細胞（例えばサイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ
細胞）の免疫応答を発生させること、該個体を疾病から
防御すること（疾病がすでに個体内で確立されているか
否かにかかわらず）である。遺伝子を投与する１の経路
は、微粒子または他のものの上のコーティングとして遺
伝子を所望細胞中に加速的に導入することによるもので
ある。かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核
酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいても
よい。
【０１６８】本発明のさらなる態様は免疫学的組成物に
関し、該組成物は、体内で免疫学的応答を誘導されうる
かまたは誘導されている個体中に導入された場合、かか
る個体中でＲＮａｓｅ Ｐまたはそれによりコードされ
ている蛋白に対する免疫学的応答を誘導するものであ
る。該組成物は、組み換えＲＮａｓｅ Ｐまたはそれに
よりコードされている蛋白を含み、さらに該ＲＮａｓｅ
Ｐまたはそれによりコードされている蛋白の抗原をコ
ードしていてこれを発現するＤＮＡを含む。免疫学的応
答を治療的または予防的に用いてもよく、また免疫学的
応答は、ＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生成するよう
な抗体免疫性または細胞免疫性の形態であってもよい。
【０１６９】ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドまたはそのフ
ラグメントを共存蛋白に融合させてもよく、該共存蛋白
はそれ自身抗体を生じないが、第１の蛋白を安定化し、
免疫原性および防御的特性を有する融合蛋白を生じさせ
るものである。よって、好ましくは、融合組み換え蛋白
はさらにヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilu
s influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベータ−ガラクト
シダーゼのごとき抗原性共存蛋白を含んでおり、比較的
大きな共存蛋白は蛋白を安定化してその製造および精製
を容易にする。そのうえ、共存蛋白は免疫系の全身化さ
れた刺激を提供するという意味でアジュバントとしても
作用しうる。共存蛋白を第１のアミノ末端またはカルボ
キシ末端のいずれに結合させてもよい。
【０１７０】組成物、詳細にはワクチン組成物、ならび
に本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免
疫刺激性ＤＮＡ配列（例えば、Sato,Y.et al.Science 2
73:352(1966)に記載されたような）を含む組成物が本発
明により提供される。
【０１７１】また、スタフィロコッカス・アウレウスで
の感染の動物モデルにおける遺伝学的免疫実験に使用さ
れるＤＮＡ構築物中のポリヌクレオチドまたは細菌細胞
表面蛋白の非可変領域をコードしていることが示された
その特定のフラグメントの使用方法が本発明により提供
される。該方法は、予防的または治療的免疫応答を引き
起こす能力のある蛋白エピトープの同定に特に有用であ
るだろう。このアプローチは、動物の必須の器官から特
に価値のあるモノクローナル抗体をその後調製すること
を可能にし、該抗体は感染に対抗し、感染を除去するも
のであり、哺乳動物、詳細にはヒトにおける細菌感染、
詳細にはスタフィロコッカス・アウレウス感染の予防薬
または治療薬の開発が可能になる。
【０１７２】ポリペプチドを宿主に接種する抗原として
用いて、細菌の侵入に対して防御を行う（例えば、ダメ
ージを受けた組織への細菌の付着をブロックすることに
よる）特異的抗体を生産してもよい。組織ダメージの例
は、例えば機械的、化学的もしくは熱的ダメージによ
る、または内在性デバイスの移植による皮膚または結合
組織における傷、あるいは口、乳腺、尿道もしくは膣の
ごとき粘膜における傷を包含する。
【０１７３】また本発明は、適当な担体と混合された本
発明免疫原性組み換え蛋白を含むワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、皮下、筋肉内、静脈
または皮内投与が好ましい。非経口投与に適した処方
は、抗酸化剤、バッファー、静細菌剤および処方を個体
の体液（好ましくは血液）と等張にする溶質を含有して
いてもよい水性または非水性滅菌注射用溶液；ならびに
懸濁剤または増粘剤を含有していてもよい水性または非
水性滅菌懸濁液を包含する。処方を１回分または複数回
分を容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れ
て提供してもよく、使用直前に滅菌担体を添加すること
のみを必要とする凍結乾燥状態とし保存してもよい。ワ
クチン処方は処方の免疫原性を向上させるためのアジュ
バント系、例えば、当該分野で知られた水中油系および
他の系を含有していてもよい。用量はワクチンの比活性
によるであろうし、常用される実験により容易に決定す
ることができる。
【０１７４】特定のＲＮａｓｅ Ｐ蛋白について本発明
を説明したが、本発明は、天然に存在するフラグメン
ト、ならびに組み換え蛋白の免疫学的特性に実質的に影
響しない付加、欠失または置換を有する類似の蛋白を包
含する。
【０１７５】組成物、キットおよび投与 また本発明は、上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを含んで
なる組成物に関する。対象への投与に適した医薬担体の
ごとき細胞、組織または生物について使用される未滅菌
または滅菌担体と組み合わせて本発明ポリペプチドを用
いてもよい。かかる組成物は、例えば、媒体、添加物ま
たは治療上有効量の本発明ポリペプチドおよび医薬上許
容される担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体
は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、
水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物を
包含するが、これらに限らない。処方は投与モードに適
合すべきである。さらに本発明は、上記本発明組成物の
１種またはそれ以上の成分を充填した１個またはそれ以
上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関す
る。
【０１７６】本発明のポリペプチドおよび他の化合物を
単独で、あるいは治療化合物のごとき他の化合物と組み
合わせて使用してよい。
【０１７７】効果的で便利な方法、例えば、特に、局
所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医
薬組成物を投与してよい。
【０１７８】治療において、あるいは予防薬として、活
性薬剤を注射可能組成物、例えば滅菌水性分散物、好ま
しくは等張滅菌水性分散物として個体に投与してもよ
い。
【０１７９】別法として、組成物を局所適用するため
に、例えば軟膏、クリーム、ローション、目の軟膏、点
眼剤、点耳剤、洗口剤、薬剤含浸包帯および縫糸ならび
にエアロゾルの形態として処方してもよい。かかる局所
処方は適合する慣用的担体、例えば、クリームまたは軟
膏基材、およびローションにはエタノールまたはオレイ
ルアルコールを含有していてもよい。かかる担体は処方
の約１重量％ないし約９８重量％、より通常には処方の
約８０重量％までを占めるであろう。
【０１８０】哺乳動物、詳細にはヒトへの投与には、活
性薬剤の１日の投与レベルは０．０１ｍｇ／ｋｇないし
１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであろう。
いずれの場合にも医師は、個体にとり最適な実際の用量
を決定するであろうし、その用量は個々の個体の年齢、
体重および応答により変更されるであろう。上記用量は
平均的な場合の典型例である。もちろん、より多いまた
はより少ない用量が良い場合もあり、かかる用量は本発
明の範囲内である。
【０１８１】内在デバイスは、外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル、すなわち個体の体内に
導入され、長時間その場所に留まるデバイスを包含す
る。かかるデバイスは、例えば、人工関節、心臓弁、ペ
ースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液
シャント、尿道カテーテル、連続歩行用腹膜透析（ＣＡ
ＰＤ）カテーテルを包含する。
【０１８２】本発明組成物を注射により投与して、内在
デバイスの挿入の少し前に細菌に対する全身的効果を達
成してもよい。外科手術後、デバイスが体内にある期間
中処置を継続してもよい。さらに、外科的方法のための
手術時のカバーを広げて細菌の傷への感染、詳細にはス
タフィロコッカス・アウレウスの傷への感染を防止する
ために本発明組成物を用いることもできる。
【０１８３】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトは、細菌血症を生じさせうる歯科的処置の前に抗生
物質による予防をすべきであると考えている。末期の重
い感染症は、時々、補てつ関節の損失を引き起こす重大
な合併症であり、高い罹病率および死亡率を伴う。それ
ゆえ、この状況において活性薬剤を予防用抗生物質のか
わりに使用することが可能であるかもしれない。
【０１８４】上記処置のほかに、一般的には本発明組成
物を傷の治療剤として用いて、抗生物質による予防のか
わりに、あるいはそれとともに歯科的試料における予防
的使用のために、傷を受けた組織に露出したマトリック
ス蛋白への細菌の付着を防止してもよい。
【０１８５】別法として、本発明組成物を用いて挿入前
に内在デバイスを洗浄してもよい。好ましくは、傷また
は内在デバイスの洗浄のは活性薬剤を１μｇ／ｍｌない
し１０ｍｇ／ｍｌの濃度とする。
【０１８６】便利には、ワクチン組成物は注射可能形態
である。慣用的アジュバントを用いて免疫応答を促進し
てもよい。ワクチン接種のための適当な１回分の用量は
抗原０．５〜５マイクログラム／ｋｇであり、好ましく
は、かかる用量を１ないし３回、１ないし３週間の間隔
で投与する。示された用量範囲内では、適当な個体への
投与を不可能にするような好ましくない毒物学的効果は
本発明化合物については観察されないであろう。
【０１８７】本明細書に開示された各文献を、参照によ
りその全体が本明細書に記載されているものとみなす。
本願が優先権を主張しているいずれの特許出願も、参照
によりその全体が本明細書に記載されているものとみな
す。
【０１８８】
【実施例】下記実施例により本発明をさらに説明する。
実施例は、個々の具体例を参照することにより、本発明
の説明のためだけに提供される。これらの例示は、本発
明の特定の態様を説明するが、開示された発明の範囲を
何ら限定するものでない。
【０１８９】特記しない限り、すべての実施例は、当業
者によく知られた日常的な標準的方法を用いて行われた
ものである。Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING:A LA
BORATORY MANUAL,2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laborat
ory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)のごとき標
準的な研究室用マニュアルに記載されているようにして
下記実施例の日常的な分子生物学の方法を行うことがで
きる。
【０１９０】特記しないかぎり、下記実施例に示すすべ
ての部または量は重量によるものである。
【０１９１】特記しないかぎり、Sambrook et al.,MOLE
CULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.;Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.
Y.(1989)および多くの他の文献、例えば、Goeddel et a
l.,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)による文献に記載
のアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）の標準的方法を用いて下記実施例における
フラグメントのサイズによる分離を行った。
【０１９２】実施例１ ランダムプライマーを用いるＰ
ＣＲ この方法は、ゲノムライブラリーを探索することとは無
関係に、部分遺伝子フラグメントからさらなる配列のデ
ータを得るための迅速方法を説明する。
【０１９３】エス・アウレウスのゲノムライブラリーの
ランダム配列決定、次いで、ビー・ズブチリスのＰ−蛋
白配列との配列相同性の探索により、３２４塩基対（ｂ
ｐという）のフラグメントの同定を行った。このフラグ
メントのはじめの１９３個のヌクレオチドは、ビー・ズ
ブチリスのＰ−蛋白のＣ−末端側半分および他の原核生
物のＲＮａｓｅ Ｐ蛋白と有意な相同性を示した。推定
上のエス・アウレウスのＲＮａｓｅ Ｐ蛋白のＮ−末端
ドメインは失われているものと推定された。
【０１９４】推定されたエス・アウレウスのＲＮａｓｅ
Ｐ蛋白配列は、ビー・ズブチリスのものに対して５
８．７％の類似性、３４．９％の同一性を示す（ＲＮａ
ｓｅＰ蛋白配列の併置比較については図２参照）。
【０１９５】それぞれ１５−３９および１９４−２１５
の位置の既知配列に相補的な２個の異なる逆プライマー
（下表４参照）ならびにランダムヘキサマープライマー
（Gibco）を用いる新規２工程ＰＣＲを用いてエス・ア
ウレウスｓｐｐ遺伝子の完全な５’配列を得た。Ｈｉｎ
ｄIIIまたはＰｓｔIで部分消化されたエス・アウレウス
のゲノムＤＮＡは鋳型として役立った。プライマー＃１
（位置１９４−２１５）はストップコドンのすぐ下流に
アニーリングし、プライマー＃２（位置１５−３９）は
既知配列の末端に密接していた（表４参照）。
【０１９６】
【表４】
【０１９７】第１工程において、蛋白のＣ末端および未
知Ｎ末端配列の上流をコードしている逆鎖をプライマー
＃１を用いて増幅し、図９にダイヤグラムを示す１本鎖
生成物を得た。この所望配列の増幅は、次の工程の配列
へのランダムプライマーの結合に有利であった。
【０１９８】第２工程において、32Ｐ−末端標識プライ
マー＃２およびランダムヘキサマーを添加し、アニーリ
ング温度を２５℃まで低下させて短いランダムプライマ
ーのＤＮＡへのアニーリングを可能にした。
【０１９９】ＰＣＲは多くの異なるフラグメントを生じ
ると予想されるが、主生成物はプライマー＃２およびラ
ンダムプライマーによりプライムされた生成物のはずで
ある（下記参照）。これらの生成物のみが興味の対象で
あり、蛋白のＮ末端側半分をコードしているはずであ
り、それらは放射性標識されていたのでモニターするこ
とができた。ゲル電気泳動およびフィルムへの露出によ
るＰＣＲ生成物の分離後、限られた数の放射性標識バン
ドがオートラジオグラム上に見られるはずである。この
方法を図１０にダイヤグラムとして示す。次いで、これ
らのフラグメントを適当なベクター、例えばｐＵＣ１９
中にクローンし、常用方法を用いて配列決定することが
できる。
【０２００】実施例２ ランダムプライマーを用いるｓ
ｐｐ５’ドメインのＰＣＲ ｓｐｐ遺伝子の５’側半分を、本明細書記載の２工程Ｐ
ＣＲ反応にて増幅した。QIAquick PCR精製カラムを用い
てＰＣＲ生成物を取り、５０μｌの水中に回収した。Sp
eedVac SC110（Savat）にて、試料を最終体積２５μｌ
まで減圧濃縮した。２０μｌを、７Ｍ尿素を含有する
１．６ｍｍの８％ポリアクリルアミドゲルに乗せ、ゲル
電気泳動により分析した。ゲルを臭化エチジウム（Ｈ2
Ｏ中１μｇ／ｍｌ）で染色してＤＮＡを可視化し、写真
を取った。次いで、ゲルを乾燥し、フィルムに露出し
た。
【０２０１】臭化エチジウム染色ゲルならびにオートラ
ジオグラムの両方に見られる数本の明確なバンドが存在
した。それらは５０ｂｐないし２０００ｂｐ以上のサイ
ズであり、いくつかのバンドは他のものよりも明確であ
った。最も目立ったバンドは約５０ｂｐ、１５０ｂｐ、
４００ｂｐおよび８００ｂｐのサイズであった。
【０２０２】実施例３ ＰＣＲフラグメントのショット
ガンクローニング：ＰＣＲフラグメントのクローニング
および配列決定 ＰＣＲ生成物を平滑末端化し、ＳｍａＩで切断したｐＵ
Ｃ１９中にクローンした。１００ｎｇのベクターと１．
０μｌおよび１．５μｌのＰＣＲ生成物との連結を、１
６℃で一晩行った。イー・コリ ＸＬ１青色細胞（α−
相補性）をエレクトロポレーションにより形質転換し、
ＩＰＴＧおよびｘ−ｇａｌ含有選択プレート上に撒いた
（青色／白色スクリーニングのために）。これらの細胞
の形質転換により、ＰＣＲ生成物の存在下で約８．５％
の白色コロニーが得られたが、インサートなしの対照連
結反応においてはわずか４．６％の白色コロニーしか見
られなかった。白色コロニーは、ｌａｃＺ’遺伝子にお
ける読み枠破壊の結果としてβ−ガラクトシダーゼホロ
酵素生成能を消失しており、もはやｘ−ｇａｌを開裂す
ることができなかった。読み枠はインサートにより破壊
され（ＰＣＲ生成物の存在下にて）、あるいは制限酵素
標品にエキソヌクレアーゼ活性により破壊された。該エ
キソヌクレアーゼ活性は末端ヌクレオチドを開裂するこ
とによってベクターのＳｍａＩ部位を破壊し、連結後の
フレームシフトを引き起こした。
【０２０３】１８個の白色コロニーを拾い、２ｍｌの培
養物として増殖させてプラスミドを調製した。ＡｃｃＩ
制限エンドヌクレアーゼで各プラスミド試料を直鎖状に
し（複数のクローニング部位における切断）、１％ Ｔ
ＡＥアガロースゲル上を元のｐＵＣ１９と並べて泳動さ
せた。
【０２０４】結果は、制限的消化により７個のプラスミ
ドが短いフラグメントを生じたことを示した。ｐＵＣ１
９にはただ１個のＡｃｃＩ部位が存在するので、これら
の組み換えプラスミドは、この酵素に関する制限部位を
有するインサートを含むにちがいない。３個のプラスミ
ドはｐＵＣ１９よりも大きいと思われたが、フラグメン
トは得られなかった。他の８個のプラスミドはｐＵＣ１
９と同じサイズであり、インサートを有しているとは思
えなかった。
【０２０５】インサートを含む１０個のプラスミドを、
順方向および逆方向ｐＵＣ／Ｍ１３配列決定プライマー
を用いて配列決定した。
【０２０６】ＡｃｃＩ消化後にフラグメントを生じた６
個のプラスミドのうち５個が２１３ｂｐのインサートを
有しており、該インサートはプライマー＃２配列および
既知の１４ｂｐから開始し、すべてのプラスミドに共通
の１７４個のヌクレオチドが後に続いていた（配列１、
表５）。６個のプラスミドのうち１個において、インサ
ート（配列２、表５）はわずかに異なっていた。すなわ
ち、最初の１３７個のヌクレオチドは配列１と共通であ
ったが（点線）、インサート配列はこの部分を越えて配
列１から逸脱していた（表５参照）。
【０２０７】
【表５】
【０２０８】プライマー＃２の配列を太字で示し、既知
の１４個の塩基に下線を付した（イタリックで示すよう
に既知配列に３つの変化がある）。
【０２０９】配列１および２の予想翻訳生成物は、ビー
・ズブチリスのｐ−蛋白に対して有意な相同性を示し、
これらのインサートがｓｐｐ遺伝子の５’ドメインにつ
いての全配列情報を含むことが示された。
【０２１０】２個のプラスミドにおいて、インサートは
プライマー＃１の配列から開始し、ＳＰＰ遺伝子の３’
側半分が後に続いていた（配列３、表５）。この配列は
すでに知られているが、エス・アウレウスのライブラリ
ーのランダム配列決定により得られた元の配列データと
比較すると、新たな配列は９個の塩基の変化（太字で示
す）を示した。
【０２１１】２個のプラスミドは異なる配列のインサー
トを含んでおり、それはＰＣＲにおける非特異的プライ
ミングの結果であった。
【０２１２】実施例４ 配列データの分析 新たに得られた配列データを一緒に記載し、ｓｐｐ構造
遺伝子の完全配列を示すと予測した。３’ドメインの部
分配列から読み枠を決定した。この読み枠により、スタ
ートコドンＡＴＧがプライマー＃２配列の１７４ｂｐ上
流に確認された（上記参照）。遺伝子の全長は３５４ｂ
ｐであった。
【０２１３】ｓｐｐ遺伝子のヌクレオチド配列を表１〜
表３［配列番号：１］に示す。スタートコドン（ＡＴ
Ｇ）およびストップコドン（ＴＡＡ）をともに太字で示
す。ｓｐｐ遺伝子の推定翻訳生成物（ＳＰ蛋白）は１１
７個のアミノ酸であり、これも表１〜表３［配列番号：
２］に示す。
【０２１４】翻訳配列を、５種の異なる原核生物由来の
ＲＮａｓｅ Ｐの既知アミノ酸配列と併置比較した。こ
れらの併置比較を図２に示す。エス・アウレウス ＳＰ
蛋白配列はビー・ズブチリスのＰ−蛋白配列とよく一致
し、ビー・ズブチリス蛋白の対して有意な相同性を示し
た。
【０２１５】実施例５ ｓｐｐ遺伝子のＰＣＲ 新たに得られた配列データを用いて、全長のｓｐｐ構造
遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマーを設計した。
【０２１６】ＰＣＲにより、分光学的測定によれば２μ
ｇの全ＤＮＡ収量の約３６０ｂｐの単一バンドが得られ
た。QIAquick PCR精製カラムを用いてそのＤＮＡフラグ
メントを取り、８０μｇの水中に回収した。
【０２１７】実施例６ ｐＭａｌｃ２中へのｓｐｐのク
ローニング ｐＭａｌｃ２ベクターは、クローンされた遺伝子（New
England BioLabs）から得られる蛋白の発現および精製
のための方法を提供する。ベクターおよびその使用に関
してはGuan,C.,Li,P.,Riggs,P.D.and Inoue,H.(1987)Ge
ne 67,21-30;Mania,C.V.et al.(1988)Gene 74,365-373;
Ausbel,F.M.et al.(eds)Current prot.in Molecular Bi
ol.(1992)中Riggs,P.執筆部分;Kellerman and Ferenci
(1982)Methods in Enzymol.90,459-463;Yanisch-Perro
n,C.et al(1985)Gene 33,103-119;Zagursky,R.J.and Be
rman,M.L.(1984)Gene 27,183-191も参照。マルトース結
合蛋白（ＭＢＰ）をコードしているイー・コリのｍａｌ
Ｅ遺伝子の下流にクローンされた遺伝子を挿入し、ＭＢ
Ｐ融合蛋白を発現させた。その方法には、ｌａｃリプレ
ッサーの制御下の強力な「ｔａｃ」プロモーターを用
い、さらにマルトースに対するＭＢＰのアフィニテイー
を用いる融合蛋白の１段階精製を用いた。対象遺伝子の
挿入のために、ｍａｌＥおよびｌａｃＺ間のユニークな
制限部位が利用可能であり、形質転換体の青色／白色ス
クリーニングが可能である。さらに該ベクターは、ポリ
リンカーのちょうど５’末端に位置する特異的因子Ｘａ
プロテアーゼの認識部位を含んでいる。これにより、遺
伝子がＸｍｎＩ部位中にクローンされた場合に対象蛋白
に結合したベクター由来の残基を残すことなく、精製後
にＭＢＰを開裂させることが可能となる。
【０２１８】実施例７ ｓｐｐのＰＣＲ生成物ｎｏｐＭ
ａｌｃ２中への連結 １μｇの蛋白融合ベクターｐＭａｌｃ２をＸｍｎＩおよ
びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで切断して、ｓｐ
ｐ構造遺伝子の方向づけされたクローニングを可能にし
た。小さな１５ｂｐののインサートを除去するために、
QIAquick PCR精製カラムを用いて消化物を取り、ＤＮＡ
を９０μｌの水中に回収した。試料をアガロースゲル電
気泳動により分析してベクターの完全な消化を確認し
た。両酵素とともに３７℃で３０分インキュベーション
後、ベクターは完全に切断された。
【０２１９】ｓｐｐのＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩで消化
し、QIAquick PCR精製カラムを用いて回収した。
【０２２０】ベクターおよびインサートを、２０μｌの
反応溶液中、１６℃で一晩連結した。インサートに対す
るベクターのモル比は１：５であった。エレクトロポレ
ーション用にＤＮＡを調製するために、QIAquick Nucle
otide Removalカラムを用いて連結反応物を脱塩した。
【０２２１】実施例８ イー・コリ ＸＬ−１青色細胞
の形質転換 ４０μｌの電気的に受容可能なイー・コリ ＸＬ−１青
色細胞を、２μｌの脱塩された連結反応物を用いて形質
転換した。エレクトロポレーション後、細胞を１ｍｌの
ＳＯＣ培地中に回収した。アンピシリン、ＩＰＴＧおよ
びｘ−ｇａｌを含有するＬＢプレート上に１：１００希
釈物５０μｌを撒き、３７℃で一晩インキュベーション
した。１１個の白色および１個の青色コロニーを回収し
た。１１この白色コロニーを増殖させ、プラスミドをク
ローンから単離した。プラスミドの配列決定により、１
１個のプラスミドのうち６個が正しいｓｐｐインサート
を含むことが示された。得られたプラスミドをｐＭａｌ
ｃ２：：ｓｐｐと命名し、融合蛋白をＭＢＰ−ＳＰＰと
命名した。
【０２２２】実施例９ 細胞の増殖およびイー・コリ
ＸＬ−１青色ｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐにおける融合蛋白
の誘導 イー・コリ ＸＬ−１青色ｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐの１
リットル培養物を、３７℃、２２０ｒｐｍで増殖させ、
Ａ600が０．６になった時点で１ｍＭ ＩＰＴＧを添加
することによりＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白を誘導した。誘
導を２時間継続した。その期間中Ａ600をモニターし
て、誘導期間中において細胞がまだ増殖していることを
確認した。０．５、１．０、１．５および２時間後に培
養物から１ｍｌの試料を取り、細胞をペレット化し、ペ
レットを１００μｌのＳＤＳゲル負荷用バッファーに再
懸濁した。試料のうち３μｌをクーマシー染色を用いる
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０２２３】細胞は融合蛋白の過剰発現により影響を受
けなかった。細胞は増殖し続け、ＩＰＴＧ誘導２時間後
にＡ600は１．４３に達した。
【０２２４】試料からの蛋白抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分離し、ウエスタントランスファーによりニトロ
セルロース膜上に移行させた。膜を抗−ＭＢＰウサギ血
清およびＨＲＰ結合抗−ウサギ抗体とともにインキュベ
ーションし、次いで、ＥＣＬ検出を行うことにより、Ｍ
ＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白を免疫検出することができた。ウ
エスタンブロットにより、２種の蛋白がＩＰＴＧ添加に
より誘導されたことが明らかとなった。主要蛋白は予想
分子量約５６ｋＤであり、少量生産された第２の蛋白は
１０ないし１５ｋＤ大きかった。ｓｐｐ配列の分析によ
り、イー・コリには稀なＡＵＡ（ｉｌｅ）およびＡＧＡ
（ａｒｇ）コドンの蓄積が明らかとなった。イー・コリ
におけるＡＧＡの正常な頻度は０．２７％であり、ＡＵ
Ａについては０．５１％である。ｓｐｐ配列は４．３％
のＡＧＡおよび５．１％のＡＵＡを含んでいた。稀なコ
ドンを大量に含む蛋白が過剰発現した場合、これらのコ
ドンはフレームシフトおよび他の変化した翻訳を引き起
こす可能性がある。
【０２２５】プラスミドｐＲＩ９５２からＡｒｇＵ ｔ
ＲＮＡ（ｔＲＮＡUCU）およびＩｌｅＸ ｔＲＮＡ（ｔ
ＲＮＡUAU）を構成的に発現する別のイー・コリを得る
ことができる。
【０２２６】実施例１０ イー・コリ Ｗ３１１０ ｐ
ＲＩ９５２の形質転換 ５０μｌの電気的に受容可能なイー・コリ Ｗ３１１０
ｐＲＩ９５２細胞を、２μｌの脱塩された連結反応物
で形質転換した。エレクトロポレーション後に１ｍｌの
ＳＯＣ培地中に細胞を回収した。１００μｌの培養物を
アンピシリン、ＩＰＴＧおよびｘ−ｇａｌを含有する選
択ＬＢプレート（アンピシリン，ｃａｍ）上に撒き、３
７℃で一晩インキュベーションした。プレート上の増殖
コロニーが多すぎて計数できなかった。５個の白色コロ
ニーを選択し、それらのプラスミドを単離した。プラス
ミドの配列決定により、すべてのプラスミドが正しいｓ
ｐｐインサートを含むことが示された。
【０２２７】実施例１１ 細胞の増殖およびイー・コリ
Ｗ３１１０ ｐＲＩ９５２ ｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐ
における融合蛋白の誘導 上記のごとく細胞を増殖させ、融合蛋白の発現を誘導し
た。誘導期間中も細胞は増殖を続け、Ａ600は０．６か
ら１．４５になった。ＩＰＴＧ添加０．０、０．５、
１．５および２．５時間後に試料を取り、蛋白抽出物を
クーマシーブルー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥならび
に免疫検出を用いるウェスタントランスファーにより分
析した。稀なｔＲＮＡ ＩｌｅＸおよびＡｒｇＵの過剰
発現は、抗−ＭＢＰ血清により検出した場合にＩＰＴＧ
誘導の間に過剰発現される１種のＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋
白においてのみ起こった。
【０２２８】実施例１２ アフィニテイークロマトグラ
フィーによるＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白の精製 最適な誘導後、細胞（イー・コリ Ｗ３１１０ ｐＲＩ
９５２ ｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐ）を集め、既知方法を
用いて凍結−融解サイクル後に超音波処理により細胞壁
を弱体化して細胞を破壊した。細胞残渣を遠心分離によ
り除去し、粗抽出物の蛋白濃度をBIO-RAD Protein Assa
yを用いて決定した。粗抽出物中の全蛋白量は８６ｍｇ
であった。粗抽出物試料をクーマシーブルーを用いるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、超音波処理の間
に融合蛋白が細胞から放出されたことが示された。
【０２２９】次いで、粗抽出物をアミロース樹脂カラム
（ＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白が結合）にポンプで送り、カ
ラムバッファーで十分に洗浄することにより未結合蛋白
をカラムから除去した。次いで、本明細書記載の方法を
用いて、１０ｍＭマルトースを補足したカラムバッファ
ーで融合蛋白を溶離した。溶出液を３ｍｌのフラクショ
ンとして集めた。精製工程中試料を取り、クーマシーブ
ルー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ほ
とんどすべての融合蛋白がアミロース樹脂に結合し、痕
跡量のみがフロー−スルー中に見いだされ、融合蛋白は
カラムから洗い流されなかった。フラクション４から１
１までが合理的な量の蛋白を含んでおり、これらをプー
ルし、濃度１ｍｇ／ｍｌの２５ｍｌの蛋白溶液を得た。
【０２３０】実施例１３ 融合蛋白の因子Ｘａ開裂およ
びＭＢＰとＳＰＰとの分離 ５００μｇの因子Ｘａプロテアーゼを溶液に添加し、４
℃で一晩融合蛋白を開裂させた。因子Ｘａとのインキュ
ベーションの前後でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分析
して開裂の完了をモニターした。１５時間後、ほとんど
すべての融合蛋白が開裂し、４２ｋＤのＭＢＰおよび約
１４ｋＤのＳＰＰが得られた。
【０２３１】ＳＰ蛋白は因子Ｘａ開裂により容易に沈殿
し、遠心分離によりＭＢＰから分離することができた。
ＳＰＰペレットを３回洗浄市、次いで、５ｍｌのカラム
バッファーに懸濁した。ＭＢＰは溶液に残り、上清中に
見いだされたが、ペレットは主としてＳＰ蛋白および１
種の少量の混入蛋白からなっており、合理的に純粋なＳ
ＰＰ標品が得られた。全ＳＰＰ収量は２．１８ｍｇ／１
リットル培養液であった。ＳＰＰ標品をカラムバッファ
ーで希釈して最終濃度０．３２ｍｇ／ｍｌとした。１ｍ
Ｍ ＤＴＴを添加してシステイン残基間の分子内ジスル
フィド結合形成を防止した。７Ｍ尿素の添加により変性
させ、見かけ上完全に蛋白を可溶化させた。蛋白の一部
を取り、急冷し、−８０℃で保存した。
【０２３２】実施例１４ ＳＰ ＲＮＡのインビトロ転
写 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてプラスミドｐＳＰＲ
からＳＰ ＲＮＡをインビトロ転写した。ｐＳＰＲは、
Ｔ７プロモーターの後ろにエス・アウレウスｓｐｒ遺伝
子を有するｐＵＣ１９誘導体である。ＢａｍＨＩ制限エ
ンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを直鎖状にして転
写の流れを可能にした。Ambion MEGAscriptTMT7キット
をＳＰ ＲＮＡの大規模転写に使用した。転写反応を３
０℃で行って、合成中にＲＮＡが正しいコンホーメーシ
ョンにゆっくりと折り畳まれるようにした。CLOTECH Ch
roma-Spin 30カラムを用いてＲＮＡを非変性条件下で取
り、ＲＮＡを４０μｌの水中に回収した。７尿素含有５
％ポリアクリルアミドゲルＴＢＥゲル上のゲル電気泳動
により転写物の品質をモニターした。ＴＬＣプレートに
ＵＶ照射することによりＲＮＡを可視化した。
【０２３３】ｐＳＰＲからのＳＰ ＲＮＡのインビトロ
転写により、４０１ヌクレオチドのサイズと予想される
単一のＲＮＡ生成物が得られた。全ＲＮＡ収率は１４０
μｇであった（分光学的に測定）。ＲＮＡを取り、４０
μｌの水中に回収し、２９μＭ溶液を得て、これを−２
０℃で保存した。
【０２３４】実施例１５ ［α−32Ｐ］ＵＴＰを含むイ
ー・コリのｐｔＲＮＡmetのインビトロ転写 ［α−32Ｐ］ＵＴＰの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ（Epicenter）によりＲＮａｓｅ Ｐの基質であるイ
ー・コリのｐｔＲＮＡmetをインビトロ転写してＲＮＡ
を内部標識した。ＤＮＡ鋳型ｐＧｅｍ３Ｚ−ｐｔＲＮＡ
をＢｓｔＮＩ制限エンドヌクレアーゼで直鎖状にして転
写の流れを可能にした。２０μｌ反応溶液中３７℃で６
０分間転写を行った。取り込まれなかったヌクレオチド
を除去するために、CLOTECH Chroma-Spin 10カラムを用
いて９３ｎｔ ＲＮＡ（配列を下に示す）を非変性条件
下で取った。ＲＮＡプローブの比活性を計算するため
に、ＲＮＡを取る前後で１μｌの試料を取り、５ｍｌの
シンチレーションカクテルと混合しンシンチレーション
カウンターでカウントした。
【０２３５】 ｐＧｅｍ−３Ｚ中のｐｔＲＮＡmet 転写物の配列（９３量体）５’→３’ ［配列番号：１２］： ＧＧＧＣＧ ＡＡＵＵＣ ＧＣＣＵＣ ＧＧＣＵＡ ＣＧＵＡＧ ＣＵＣＡＧ ＵＵＧＧＵ ＵＡＧＡＧ ＣＡＣＡＵ ＣＡＣＵＣ ＡＵＡＡＵ ＧＡＵＧＧ ＧＧＵＣＡ ＣＡＧＧＵ ＵＣＧＡＡ ＵＣＣＣＧ ＵＣＧＵＡ ＧＣＣＡＣ ＣＡＧ
【０２３６】ｐｔＲＮＡmetの転写により２μＭ（６ｎ
ｇ／μｌ）溶液を得た。分子の６４．３％が転写物に取
り込まれ、比活性は２．１７１ｘ１０8ｃｐｍ／μｇで
あった。
【０２３７】実施例１６ ｐ６ＡＴ−１の５’末端標識 バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用
い、高比活性［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（６０００μＣｉ／μ
ｌ）を用いて、化学合成ＲＮＡ分子ｐ６ＡＴ−１（４２
ヌクレオチド）を５’末端標識した。１０μｌの反応溶
液中３７℃で３０分標識を行った。酵素を９５℃で２分
間熱失活させた。塩、取り込まれなかったヌクレオチド
および酵素を除去するために、７Ｍ尿素含有２０％ポリ
アクリルアミドゲルＴＢＥゲルからｐ６ＡＴ−１を精製
した。ＲＮＡをゲルスライスから抽出し、３００ｍＭ
ＮａＯＡｃおよび２．５倍体積のエタノールで沈殿させ
た。１４０００ｇ、４℃で遠心分離後、ＲＮＡペレット
を冷７０％エタノールで洗浄した。ペレットを風乾し、
次いで、５０μｌの水中に懸濁した。０．５μｌを濾紙
ディスクにスポットしシンチレーションカウンター（Ch
erenkov analysis）でカウントした。
【０２３８】末端標識により、活性６４００００ｃｐｍ
／μｌのｐ６ＡＴ−１標品が得られた。
【０２３９】実施例１７ ＳＰ ＲＮＡ反応のための最
適バッファー条件の決定 イー・コリ Ｍ１ ＲＮＡは、１００ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2中でｐｔＲＮＡmetまたは最小基質ｐ６ＡＴ−
１を開裂しうる。エス・アウレウスのＳＰ ＲＮＡによ
るこれらの基質の開裂のための条件も未知であり、イー
・コリについて最適化された条件とは明らかに異なって
いた。多くの異なるバッファー条件を調べてエス・アウ
レウスのリボザイムによるこれらの基質の開裂のための
最適バッファー条件を決定した。
【０２４０】ホロ酵素反応において１００ｎＭ ＳＰ
ＲＮＡ、さらに２００ｎＭ ＳＰ蛋白を用い、開裂反応
（２０μｌ）をすべて３７℃で３０分行った。基質（ｐ
ｔＲＮＡmetまたはｐ６ＡＴ−１）を痕跡量添加した
（単一ターンオーバー反応）。変性ゲル電気泳動および
オートラジオグラフィーまたはホスホールイメージャー
（phosphorimager）（Molecular Dynamics Storm 860）
による可視化による無傷の前駆体および開裂リーダー配
列のサイズ分析により開裂をモニターした。
【０２４１】１００ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ７．５、
１００ｍＭ ＭｇＣｌ2および１Ｍまたは２Ｍの１価塩
（ＫＣｌまたはＮＨ4Ｃｌ）中ですべての実験を行っ
た。１Ｍ ＫＣｌまたはＮＨ4Ｃｌでは検出可能な開裂
はほどんど起こらなかった。２Ｍの１価塩を用いた場合
に開裂が起こった。塩化カリウムは塩化アンモニウムよ
りも良い結果を生じた。
【０２４２】以下のセクションに記載するさらなるパラ
メーター最適化の後、１価塩濃度のさらなる最適化を行
った。
【０２４３】実施例１９ ｐ６ＡＴ−１開裂に対するｐ
Ｈの影響 ＳＰ ＲＮＡによるｐ６ＡＴ−１開裂を促進する能力に
ついて、１００ｍＭＭｇＣｌ2、２Ｍ ＫＣｌおよび１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ７．０、７．５および
８．０を含むバッファーを試験した。３種すべてのバッ
ファーにおいて基質は開裂されたが、ｐＨ７．０におい
てはほとんど開裂されず、ｐＨ８．０において最適であ
った。
【０２４４】実施例２０ ｐ６ＡＴ−１開裂に対するＰ
ＥＧ８０００の影響 ポリエチレングリコールの添加は、イー・コリのＭ１
ＲＮＡによる基質開裂を促進することが示されている。
ここで、ＳＰ ＲＮＡによるｐ６ＡＴ−１開裂に対する
異なるＰＥＧ８０００濃度の影響を示した。１Ｍ ＫＣ
ｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2を含有する反応系に１％、２．５％および５
％ ＰＥＧを添加した。ＰＥＧ濃度の上昇に伴って基質
開裂能が向上し、それゆえ、その後の反応には５％ Ｐ
ＥＧを用いることにした。
【０２４５】実施例２１ ｐ６ＡＴ−１プロセッシング
に対するＭｇＣｌ2必須因子ＭｇＣｌ2濃度を１００ｍＭ
から１０ｍＭまで連続的に低下させて、ＳＰ ＲＮＡが
基質をプロセッシングしうる最低マグネシウムイオン濃
度を決定した。２Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・
Ｃｌ ｐＨ８および５％ ＰＥＧを含有するバッファー
中で１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭおよび１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2を試験した。
【０２４６】１００ｍＭ ＭｇＣｌ2において開裂結果
が得られた。しかしながら、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2にお
いてもＳＰ ＲＮＡはｐ６ＡＴ−１をプロセッシング
し、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2においてもある程度プロセッ
シングした。１０ｍＭ ＭｇＣｌ2においては開裂が観
察されなかった。
【０２４７】実施例２２ ｐ６ＡＴ−１開裂に対するＫ
Ｃｌ必須因子の決定 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2および５％ＰＥＧ中のＫＣｌ濃度を４０ｍＭか
ら１．５Ｍまで連続的に上昇させた。４００ｍＭ未満の
ＫＣｌ濃度では開裂は起こらなかった。４００ｍＭ Ｋ
Ｃｌにおいてｐ６ＡＴ−１プロセッシングはやはり非常
に起こりにくかったが、塩濃度の上昇とともにプロセッ
シングは増大し、１．５Ｍ ＫＣｌにおいて最大レベル
２７％に達した。その値はイー・コリ Ｍ１ ＲＮＡに
よるｐ６ＡＴ−１開裂（２０分後に３５％の基質が開裂
された）に比肩しうる。ＳＰ ＲＮＡによるｐ６ＡＴ−
１開裂のための最良バッファー条件は、１．５Ｍ ＫＣ
ｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５％ ＰＥＧであった。
【０２４８】実施例２３ ＳＰ ＲＮＡによるｐｔＲＮ
Ａmet開裂に対するＫＣｌ必須因子 上記と同じバッファー条件でｐｔＲＮＡmetを開裂し
た。ｐｔＲＮＡmetはｐ６ＡＴ−１よりも良い基質であ
った。ｐ６ＡＴ−１とは対照的に、ｐｔＲＮＡmetは４
００ｍＭ未満のＫＣｌ濃度でプロセッシング可能であっ
た。ある程度の開裂が２０ｍＭ ＫＣｌにおいてすでに
検出可能であったが、これらの条件下ではｐ６ＡＴ−１
の開裂は観察できなかった。開裂速度はＫＣｌ濃度の上
昇とともに増大した。１５０ｍＭ ＫＣｌにおいて、５
０％以上の基質が開裂され、８００ｍＭ ＫＣｌにおい
ては８２％に達した。濃度１Ｍまたはそれ以上におい
て、約８５％のｐｔＲＮＡが開裂されたはさらなる増加
は検出できなかった。そのことは基質の１５％が未開裂
であったことを示すものである。陽性対照としてのイー
・コリ Ｍ１ ＲＮＡは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
ｐＨ７．５、１００ｍＭＮＨ4Ｃｌ、１００ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2中で８０％の基質を２０分以内で開裂した。ｐ
ｔＲＮＡmet開裂のための最良のバッファー条件は、１
Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８、１
００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％ ＰＥＧであった。
【０２４９】実施例２４ エス・アウレウスのＲＮａｓ
ｅ Ｐオロ酵素反応の最適なバッファー条件の決定：ホ
ロ酵素によるｐ６ＡＴ−１開裂 低マグネシウム濃度において異なるＫＣｌ濃度範囲にわ
たりエス・アウレウスのＲＮａｓｅ Ｐホロ酵素のｐ６
ＡＴ−１開裂を調べた。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％ ＰＥＧおよび４
０ｍＭないし１．５Ｍ ＫＣｌにおいてすべての反応を
行った。４０ｍＭ ＫＣｌにおいて開裂が観察できた。
１価塩の濃度の上昇とともに開裂速度は増大し、１５０
ｍＭでピークに達し、ピークにおいて５０％の基質がプ
ロセッシングされた。高いＫＣｌ濃度において、開裂速
度は再び低下し、６００ｍＭのＫＣｌにおいてはｐ６Ａ
Ｔ−１プロセッシングは起こらなかった。イー・コリの
ホロ酵素対照は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ
７．５、１００ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
において５７％のｐ６ＡＴ−１を２０分以内に開裂し
た。ホロ酵素によるｐ６ＡＴ−１開裂の最適バッファー
は、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％ ＰＥＧ８
０００であった。最適条件下で、エス・アウレウスのＲ
Ｎａｓｅ Ｐホロ酵素によりｐ６ＡＴ−１の５０％開裂
されたのに対してわずか２７％のｐ６ＡＴ−１しか開裂
されなかったことから、ｐ６ＡＴ−１はＳＰ ＲＮＡよ
りもホロ酵素にとって良い基質であった。
【０２５０】実施例２５ ホロ酵素によるｐｔＲＮＡ開
裂に対するＭｇＣｌ2必須因子 エス・アウレウスＲＮａｓｅ Ｐホロ酵素は、ｐ６ＡＴ
−１プロセッシングに用いた条件下ではｐｔＲＮＡｍｅ
ｔを開裂しなかった。１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の場合、い
すれのＫＣｌ濃度においてもホロ酵素は基質を開裂しな
かった。マグネシウムイオン濃度を２０ｍＭまで上昇さ
せ、ホロ酵素によるｐｔＲＮＡ開裂ならびにＳＰ ＲＮ
Ａリボザイムを異なるＫＣｌ濃度において試験した。バ
ッファーは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８，２０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％ ＰＥＧおよび１０ｍＭ、５０
ｍＭ、１５０ｍＭ、６００ｍＭまたは１．５Ｍ ＫＣｌ
を含有していた。
【０２５１】１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および低ＫＣｌ濃度
におけるホロ酵素によるｐｔＲＮＡの開裂は非常にわず
かであった。２０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１５０ｍＭ
ＫＣｌにおいて、ホロ酵素はｐｔＲＮＡを非常によくプ
ロセッシングし、基質の５４％が２０分以内に開裂され
た。低パーゼンテージの基質のみのプロセッシングが６
００ｍＭ ＫＣｌにおいて検出されたが、良好な開裂が
１．５Ｍ ＫＣｌにおいて起こった。これらの条件下で
はＳＰ ＲＮＡのみでもｐｔＲＮＡを開裂可能であった
が、低塩濃度においてはｐｔＲＮＡを開裂不可能であっ
た。それゆえ、ホロ酵素によりｐｔＲＮＡｍｅｔ開裂の
最適ＭｇＣｌ2濃度は２０ｍＭであった。
【０２５２】実施例２６ 最適ＫＣｌ濃度の決定 ２０ｍＭから１．５Ｍまでの異なるＫＣｌ濃度における
ｐｔＲＮＡmet開裂能についてエス・アウレウスのＲＮ
ａｓｅ Ｐｈｏｌｏ酵素を試験した。バッファーは１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５％ ＰＥＧ ８０００および上記モル濃度のＫＣ
ｌを含有していた。
【０２５３】２０ｍＭの低濃度ＫＣｌの場合にもホロ酵
素はｐｔＲＮＡmetを開裂することができた。開裂速度
は塩濃度とともに上昇し、１５０ｍＭでピークに達し、
基質の５５％がプロセッシングされた。２００ｍＭ以上
のＫＣｌ濃度においては開裂速度はＫＣｌ濃度とともに
低下したが１Ｍ ＫＣｌにおいて再び改善され、１．５
Ｍで最大速度となった。高塩濃度での開裂はホロ酵素活
性によるものではないが、高ＫＣｌ濃度におけるＳＰ
ＲＮＡリボザイム活性の結果によるものであった。
【０２５４】ｐｔＲＮＡmetは、エス・アウレウスのＲ
Ｎａｓｅ Ｐホロ酵素よりもＳＰＲＮＡにとってよい基
質であった。ホロ酵素によるｐｔＲＮＡmet開裂の最適
バッファー条件は、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％
ＰＥＧであった。
【０２５５】実施例２６ 株の選択、ライブラリーの製
造および配列決定 配列番号：１で示されるＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドを、イー・コリ中のスタフィロコッカス・アウレ
ウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーから得
た。重複したスタフィロコッカス・アウレウスのＤＮＡ
を含む２個またはそれ以上のクローンからの配列決定の
データを用いて配列番号：１の連続したＤＮＡ配列を構
築した。以下の常用方法（方法１および２）によりライ
ブラリーを調製してもよい。
【０２５６】以下の２つの方法のいずれかによる標準的
手順およびサイズ分画により全細胞ＤＮＡをスタフィロ
コッカス・アウレウス ＷＣＵＨ２９から単離する。
【０２５７】方法１ ニードルに通して標準的手順によるサイズ分画を行うた
めに全細胞ＤＮＡを機械的に剪断する。エキソヌクレア
ーゼおよびＤＮＡポリメラーゼでの処理により１１ｋｂ
ｐまでのサイズのＤＮＡフラグメントを平滑末端化し、
次いで、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。すでにＥｃｏ
ＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩ中にフ
ラグメントを連結し、ライブラリーを標準的手順により
パッケージングし、パッケージングされたライブラリー
でイー・コリを感染させる。標準的手順によりライブラ
リーを増幅する。
【０２５８】方法２ ライブラリーベクター（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、
ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５１）中へのクローニング用の
一連のフラグメントを得るのに適した１種または混合さ
れた制限酵素を用いて全細胞ＤＮＡを部分的に加水分解
する。標準的手順によりかかるフラグメントをサイズ分
画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、次い
で、すでにＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩ中にフラグメントを連結し、標準的手順によりライ
ブラリーをパッケージングし、パッケージングされたラ
イブラリーでイー・コリを感染させる。
【０２５９】
【配列表】
【０２６０】（１）一般的情報 （ｉ）出願人：Ｇｕｔｈ，Ｓａｂｉｎｅ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｊｏａｎｎｅ Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ （ｉｉ）発明の名称：新規ＲＮａｓｅ Ｐ （ｉｉｉ）配列の数：１４ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スェードランド・ロード７０９ （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター読み取り可能形態： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン２．０
用ＦａｓｔＳＥＱ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年６月６日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：６０／０１９，２３４ （Ｂ）出願日：１９９６年６月６日 （Ａ）出願番号：６０／０２９，９２８ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Ｇｉｍｍｉ，Ｅｄｗａｒｄ Ｒ （Ｂ）登録番号：３８，８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０４９３ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス番号：
【０２６１】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
【０２６２】
【化１】
【０２６３】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
【０２６４】
【化２】
【０２６５】（２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：
【０２６６】
【化３】
【０２６７】（２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：
【０２６８】
【化４】
【０２６９】（２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
【０２７０】
【化５】
【０２７１】（２）配列番号：６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：
【０２７２】
【化６】
【０２７３】（２）配列番号：７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：
【０２７４】
【化７】
【０２７５】（２）配列番号：８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：
【０２７６】
【化８】
【０２７７】（２）配列番号：９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：
【０２７８】
【化９】
【０２７９】（２）配列番号：１０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：
【０２８０】
【化１０】
【０２８１】（２）配列番号：１１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：
【０２８２】
【化１１】
【０２８３】（２）配列番号：１２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：
【０２８４】
【化１２】
【０２８５】（２）配列番号：１３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３：
【０２８６】
【化１３】
【０２８７】（２）配列番号：１４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４：
【０２８８】
【化１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、公表された配列の情報に基づくＲＮ
ａｓｅ ＰのＲＮＡの２次構造モデルを示す。
【図２】 図２は、本発明スタフィロコッカスのＲｎａ
ｓｅ Ｐ蛋白成分と文献に報告されている他の蛋白成分
との併置比較である。
【図３】 図３は、無傷のゲノムをクローンするのに用
いるＲＮＡ成分をコードしているＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子
［配列番号：１４］の１領域をコードしているスタフィ
ロコッカスＤＮＡを、ビー・ズブチリス由来のＲＮａｓ
ｅ ＰのＲＮＡ成分に関する遺伝子をコードそているＤ
ＮＡと比較して示す。
【図４】 図４は、本発明ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分
に関する推定２次構造を、ビー・ズブチリス由来のＲＮ
Ａ成分と比較して示す。
【図５】 図５は、エス・アウレウスのＲＮａｓｅ Ｐ
の蛋白成分のアミノ酸配列およびそれをコードしている
ＤＮＡ配列を示す［配列番号：１および２］。
【図６】 図６は、薬剤／ＲＮＡ相互作用を同定するた
めの全細胞レスキューアッセイのスキームを示す。
【図７】 図７は、ＲＮＡ／蛋白相互作用を妨害する化
合物を同定するためのスクリーニングのスキームを示
す。
【図８】 図８は、最小ＲＮａｓｅ Ｐ基質の具体例
［配列番号：４］の例を示す。
【図９】 図９は、ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子の第１の増幅
工程の特定の具体例のダイヤグラムを示す。
【図１０】 図１０は、ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子の第２の
増幅工程の特定の具体例のダイヤグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/22 9/22 9/99 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＸ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 ザビーネ・グート アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ペン・サークル 1091番 アパートメント・ジー501 (72)発明者 ジョアン・ジェニングス イギリス、ティエヌ12・０キュージー、ケ ント、ステイプルハースト、ステイショ ン・ロード、シングルトン (72)発明者 キャサリン・デニス・プレスコット アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノ リスタウン、ウィローブルック・ドライブ 523番

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記（ａ）〜（ｇ）からなる群より選択
    されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
    ド： （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチド
    をコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも
    ５０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１、３または４の核酸配列を含むポリ
    ヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有す
    るポリヌクレオチド； （ｃ）寄託株スタフィロコッカス・アウレウス（Staphy
    lococcus aureus）に含まれるＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子に
    より発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードして
    いるポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一
    性を有するポリヌクレオチド； （ｄ）寄託株に含まれるＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ遺伝子
    により発現されるのと同じ触媒ＲＮＡを含むポリヌクレ
    オチドに対して少なくとも５０％の同一性を有するポリ
    ヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも
    ７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ドをコードしているポリヌクレオチド； （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の
    ポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチ
    ド；および （ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または
    （ｆ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の一連の
    塩基を含むポリヌクレオチド
  2. 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
    ド。
  4. 【請求項４】 配列番号：１に示す核酸配列を含む請求
    項２のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
    ３５４までを含むポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
    ペプチドをコードする請求項２のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 請求項１のポリヌクレオチドを含むベク
    ター。
  8. 【請求項８】 請求項７のベクターを含む宿主細胞。
  9. 【請求項９】 該ＤＮＡによりコードされているポリペ
    プチドを請求項８の宿主細胞から発現させることを特徴
    とするポリペプチドの製造方法。
  10. 【請求項１０】 該ポリペプチドまたはフラグメントの
    生産に十分な条件下で請求項８の宿主を培養することを
    特徴とするＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドまたはフラグメ
    ントの製造方法。
  11. 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
    少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
    ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
    むポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１のポリペプチドに対する抗
    体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１のポリペプチドの活性また
    は発現を阻害するアンタゴニスト。
  15. 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１１のポリペプ
    チドを個体に投与することを特徴とする、ＲＮａｓｅ
    Ｐポリペプチドを必要とする個体の治療方法。
  16. 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１４のアンタゴ
    ニストを個体に投与することを特徴とする、ＲＮａｓｅ
    Ｐポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療方
    法。
  17. 【請求項１７】 （ａ）該ポリペプチドをコードしてい
    る核酸配列を決定し、次いで／あるいは（ｂ）個体由来
    の試料中の該ポリペプチドの存在または量について分析
    することを特徴とする、個体における請求項１１のポリ
    ペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１１のポリペプチドと化合物と
    の間の相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチド
    を含んでなる組成物をスクリーニングすべき化合物と接
    触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作用
    は、化合物と該ポリペプチドとの相互作用に応答して検
    出可能シグナルを生じることのできる第２の成分に関連
    している）、次いで化合物と該ポリペプチドとの相互作
    用から生じたシグナルの存在または不存在を検出するこ
    とにより、化合物が該ポリペプチドと相互作用してその
    活性を阻害または活性化するかどうかを決定することを
    特徴とする、請求項１１のポリペプチドと相互作用して
    その活性を阻害または活性化する化合物の同定方法。
  19. 【請求項１９】 抗体および／またはＴ細胞免疫系を生
    じさせるに十分な請求項１１のＲＮａｓｅ Ｐまたはそ
    のフラグメントもしくは変種を哺乳動物に接種して該動
    物を疾病から防御することを特徴とする、哺乳動物にお
    ける免疫学的応答の誘導方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１のＲＮａｓｅ Ｐポリペプ
    チドまたはそのフラグメントもしくは変種の発現を指令
    する核酸ベクターをインビボで送達して、抗体および／
    またはＴ細胞免疫応答を生じさせる免疫学的応答を誘導
    し、哺乳動物を疾病から防御することを特徴とする、哺
    乳動物における免疫学的応答の誘導方法。
  21. 【請求項２１】 スタフィロコッカス・アウレウスから
    単離されたＲＮａｓｅ Ｐ
  22. 【請求項２２】 配列番号：１の配列のＲＮＡ成分を有
    する請求項１記載のＲＮａｓｅ Ｐ。
  23. 【請求項２３】 配列番号：２の配列の蛋白成分を含む
    請求項１記載のＲＮａｓｅ Ｐ。
  24. 【請求項２４】 請求項２３の成分をコードしている単
    離ＤＮＡ。
  25. 【請求項２５】 請求項２４のＤＮＡの個別発現または
    同時発現方法。
  26. 【請求項２６】 配列番号：１から１０までに示す１ま
    たはそれ以上のＲＮａｓｅ Ｐ成分を含むＲＮａｓｅ
    Ｐ阻害剤の同定のためのスクリーニング。
  27. 【請求項２７】 スタフィロコッカス・アウレウスのＲ
    Ｎａｓｅ Ｐの単離ＲＮＡ成分。
  28. 【請求項２８】 スタフィロコッカス・アウレウスのＲ
    Ｎａｓｅ Ｐの単離蛋白成分。
  29. 【請求項２９】 請求項２２の成分をコードしている単
    離ＤＮＡ。
  30. 【請求項３０】 配列番号：５から１２までからなる群
    から選択されるポリヌクレオチド。
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