JPH1175862A - 新規トポイソメラーゼｉｉｉ - Google Patents
新規トポイソメラーゼｉｉｉInfo
- Publication number
- JPH1175862A JPH1175862A JP9320251A JP32025197A JPH1175862A JP H1175862 A JPH1175862 A JP H1175862A JP 9320251 A JP9320251 A JP 9320251A JP 32025197 A JP32025197 A JP 32025197A JP H1175862 A JPH1175862 A JP H1175862A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- polynucleotide
- topoisomerase iii
- dna
- topoisomerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000323 DNA Topoisomerases Proteins 0.000 title claims description 171
- 102000003915 DNA Topoisomerases Human genes 0.000 title claims description 167
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 252
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 245
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 241
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 161
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 160
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims abstract description 23
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims abstract description 19
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 83
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 5
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 108010046308 Type II DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 13
- 102000007537 Type II DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 5
- -1 e.g. Substances 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 3
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 3
- 108010082463 DNA reverse gyrase Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 2
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 2
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- ALSTYHKOOCGGFT-KTKRTIGZSA-N (9Z)-octadecen-1-ol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCO ALSTYHKOOCGGFT-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- OFQCQIGMURIECL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(diethylamino)ethyl]-2',6'-dimethylspiro[isoquinoline-4,4'-oxane]-1,3-dione;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.O=C1N(CCN(CC)CC)C(=O)C2=CC=CC=C2C21CC(C)OC(C)C2 OFQCQIGMURIECL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000359383 Desulfurococcus amylolyticus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010014666 Endocarditis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000009118 appropriate response Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010516 arginylation Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 208000009361 bacterial endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000007940 bacterial gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 231100000244 chromosomal damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000011243 crosslinked material Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000003221 ear drop Substances 0.000 description 1
- 229940047652 ear drops Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000003885 eye ointment Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 201000007119 infective endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003883 ointment base Substances 0.000 description 1
- XMLQWXUVTXCDDL-UHFFFAOYSA-N oleyl alcohol Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCO XMLQWXUVTXCDDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055577 oleyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なトポイソメラーゼＩＩＩおよび該タン
パク質をコードするＤＮＡが望まれている。 【解決手段】 本発明は （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から１４７を有してな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
パク質をコードするＤＮＡが望まれている。 【解決手段】 本発明は （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から１４７を有してな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願は、１９９６年１０月１
５日に提出された米国仮特許出願番号６０／０２８６０
３号の権利を主張するものである。本発明は、一つに、
新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド；該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種およ
び誘導体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、
およびその変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニス
トおよびアンタゴニストの使用に関するものである。特
に、これらの点および他の点に関して、本発明は、細菌
性「トポイソメラーゼＩＩＩ」のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドに関する。
５日に提出された米国仮特許出願番号６０／０２８６０
３号の権利を主張するものである。本発明は、一つに、
新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド；該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種およ
び誘導体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、
およびその変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニス
トおよびアンタゴニストの使用に関するものである。特
に、これらの点および他の点に関して、本発明は、細菌
性「トポイソメラーゼＩＩＩ」のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】より効果的な抗生物質には、細菌性遺伝
子の発現、制御または活性に共通するモードを妨害する
ものがある。近年、ＤＮＡのスーパーコイル化が毒性遺
伝子制御の一つの方法であり得ると示唆されている。ス
ーパーコイル化に因るＤＮＡ密度の局所的な増減は、温
度、嫌気生活、および重量オスモル濃度などの種々環境
条件に対する応答に関係している。空間的に構成された
遺伝子のスーパーコイル化の増減により、遺伝子群の転
写装置の構成要素へのアクセサビリティーを適宜制御す
ることで、感染性病原体がかかる環境条件に対して有効
な応答を示すかもしれない。１型トポイソメラーゼおよ
びＤＮＡジャイレース（ＤＮＡ gyrase）を含む、ＤＮ
Ａスーパーコイル化のレベルに影響するように作用す
る、ＤＮＡトポイソメラーゼなどの酵素が同定されてい
る。かかる酵素はそれに対する潜在的抗生物質としての
化合物をスクリーニングするための有用な標的に相当す
る。
子の発現、制御または活性に共通するモードを妨害する
ものがある。近年、ＤＮＡのスーパーコイル化が毒性遺
伝子制御の一つの方法であり得ると示唆されている。ス
ーパーコイル化に因るＤＮＡ密度の局所的な増減は、温
度、嫌気生活、および重量オスモル濃度などの種々環境
条件に対する応答に関係している。空間的に構成された
遺伝子のスーパーコイル化の増減により、遺伝子群の転
写装置の構成要素へのアクセサビリティーを適宜制御す
ることで、感染性病原体がかかる環境条件に対して有効
な応答を示すかもしれない。１型トポイソメラーゼおよ
びＤＮＡジャイレース（ＤＮＡ gyrase）を含む、ＤＮ
Ａスーパーコイル化のレベルに影響するように作用す
る、ＤＮＡトポイソメラーゼなどの酵素が同定されてい
る。かかる酵素はそれに対する潜在的抗生物質としての
化合物をスクリーニングするための有用な標的に相当す
る。
【０００３】ＤＮＡトポイソメラーゼによるＤＮＡ形質
転換は、一本鎖または二本鎖のどちらかの開裂によりな
される。かかる形質転換により得られるリンキング数
（Ｌｋ）のユニット変化が２種のトポイソメラーゼの間
の最も機能的な違いである（P.O.Brown & N.R.Cozzarel
li、Science 206:1081-1083（1979））。リンキング数
（Ｌｋ）は一本の鎖がもう一本の鎖に広がる表面と交差
する回数の代数的数である。一過性の一本鎖切断を介し
て反応が進行し、Ｌｋを一工程で変化させるＤＮＡトポ
イソメラーゼは１型と分類され、二本鎖切断を介して反
応が進行し、Ｌｋを二工程にて変化させる酵素は２型と
分類される。
転換は、一本鎖または二本鎖のどちらかの開裂によりな
される。かかる形質転換により得られるリンキング数
（Ｌｋ）のユニット変化が２種のトポイソメラーゼの間
の最も機能的な違いである（P.O.Brown & N.R.Cozzarel
li、Science 206:1081-1083（1979））。リンキング数
（Ｌｋ）は一本の鎖がもう一本の鎖に広がる表面と交差
する回数の代数的数である。一過性の一本鎖切断を介し
て反応が進行し、Ｌｋを一工程で変化させるＤＮＡトポ
イソメラーゼは１型と分類され、二本鎖切断を介して反
応が進行し、Ｌｋを二工程にて変化させる酵素は２型と
分類される。
【０００４】２型トポイソメラーゼファミリーのメンバ
ーは、ＤＮＡジャイレース、細菌性トポイソメラーゼＩ
Ｖ、Ｔ−線状ＤＮＡトポイソメラーゼ、真核生物ＤＮＡ
トポイソメラーゼＩＩおよびサルフォロバス・アシドカ
ルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の好熱
性トポイソメラーゼＩＩを包含する（A.Kikuchiら、Sys
t.Appl.Microbiol.7:72-78（1986）；J.Katoら、J.Bio
l.Chem.267:25676-25684（1992）；W.M.Huang、ＤＮＡ
トポロジーおよびその生物学的効果（N.R.Cozzarelliお
よびJ.C.Wang編、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、ニューヨーク）264-284（199
0）；T.-S.Hisch、ＤＮＡトポロジーおよびその生物学
的効果（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニュー
ヨーク）243-263（1990）を参照のこと）。１２種ほど
の２型酵素のコーディング配列が決定されており、その
データはこれらの全ての酵素が進化的および構造的に関
連していることを示唆する。２型トポイソメラーゼによ
り触媒されるトポロジー反応は、ＤＮＡ（ＤＮＡジャイ
レース）への負のスーパーコイルの導入、スーパーコイ
ル化ＤＮＡの弛緩、らせん環の連環形成（またはその解
離）、ＤＮＡの結節および未結節を包含する。
ーは、ＤＮＡジャイレース、細菌性トポイソメラーゼＩ
Ｖ、Ｔ−線状ＤＮＡトポイソメラーゼ、真核生物ＤＮＡ
トポイソメラーゼＩＩおよびサルフォロバス・アシドカ
ルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の好熱
性トポイソメラーゼＩＩを包含する（A.Kikuchiら、Sys
t.Appl.Microbiol.7:72-78（1986）；J.Katoら、J.Bio
l.Chem.267:25676-25684（1992）；W.M.Huang、ＤＮＡ
トポロジーおよびその生物学的効果（N.R.Cozzarelliお
よびJ.C.Wang編、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、ニューヨーク）264-284（199
0）；T.-S.Hisch、ＤＮＡトポロジーおよびその生物学
的効果（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニュー
ヨーク）243-263（1990）を参照のこと）。１２種ほど
の２型酵素のコーディング配列が決定されており、その
データはこれらの全ての酵素が進化的および構造的に関
連していることを示唆する。２型トポイソメラーゼによ
り触媒されるトポロジー反応は、ＤＮＡ（ＤＮＡジャイ
レース）への負のスーパーコイルの導入、スーパーコイ
ル化ＤＮＡの弛緩、らせん環の連環形成（またはその解
離）、ＤＮＡの結節および未結節を包含する。
【０００５】１型トポイソメラーゼのファミリーは、細
菌性トポイソメラーゼＩ、イー・コリ（E.coli）トポイ
ソメラーゼＩＩＩ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ（R.A.Kim & J.C.Wang、J.B
iol.Chem.267:17178-17185（1992））、ヒトトポイソメ
ラーゼＩＩＩ（Hanaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:3653-
3657（1996））、細菌性酵素に密接に類似した葉緑体由
来の１型トポイソメラーゼ（J.Siedleckiら、Nucleic A
cids Res.11:1523-1536（1983）、好熱性逆ジャイレー
ス（A.Kikuchi、ＤＮＡ；「トポロジーおよびその生物
学的効果」（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニ
ューヨーク）285-298（1990）：C.Bouthier de la Tour
ら、J.Bact.173:3921-3923（1991））、好熱性ディー・
アミロリティカス（D.amylolyticus）トポイソメラーゼ
ＩＩＩ（A.Ｉ.Slesarevら、J.Biol.Chem.266:12321-123
28（1991））、核トポイソメラーゼＩおよびミトコンド
リアおよびポックスウイルス由来の密接に関連する酵素
（N.Osheroff、Pharmac.Ther.41:223-241（1989））か
らなる。触媒機構に関して、これらのトポイソメラーゼ
は二つの群に分けられる。Ａ群は作用するのに２価のカ
チオンを必要とし、５′ホスホリル末端で一過性の共有
結合性複合体を形成する酵素からなる（原核生物性１型
トポイソメラーゼ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ、およびヒトトポイソメラ
ーゼＩＩＩ）。Ｂ群は、作用するのに２価のカチオンを
必要とせず、３′ホスホリル末端で一過性の共有結合す
る１型トポイソメラーゼを含む（核トポイソメラーゼ
Ｉ、一般に真核生物性トポイソメラーゼＩと称せられる
ミトコンドリアおよびポックスウイルスに由来する酵
素）。１型トポイソメラーゼは以下のトポロジー反応を
行う：これらはスーパーコイル化ＤＮＡ（逆ジャイレー
スを除く）を弛緩し、一本鎖環状ＤＮＡまたは二本鎖Ｄ
ＮＡ（ただし、少なくとも１つの分子がニックまたはギ
ャップを有する）を連環形成（またはその解離）する
か、または一本鎖環と相互反応し、トポロジカルな結節
を導入する（１型−Ａ群トポイソメラーゼ）。１型−Ａ
群トポイソメラーゼに属する逆ジャイレースはｃＤＮＡ
に正のスーパーコイルを導入できることがわかった唯一
のトポイソメラーゼである。
菌性トポイソメラーゼＩ、イー・コリ（E.coli）トポイ
ソメラーゼＩＩＩ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ（R.A.Kim & J.C.Wang、J.B
iol.Chem.267:17178-17185（1992））、ヒトトポイソメ
ラーゼＩＩＩ（Hanaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:3653-
3657（1996））、細菌性酵素に密接に類似した葉緑体由
来の１型トポイソメラーゼ（J.Siedleckiら、Nucleic A
cids Res.11:1523-1536（1983）、好熱性逆ジャイレー
ス（A.Kikuchi、ＤＮＡ；「トポロジーおよびその生物
学的効果」（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニ
ューヨーク）285-298（1990）：C.Bouthier de la Tour
ら、J.Bact.173:3921-3923（1991））、好熱性ディー・
アミロリティカス（D.amylolyticus）トポイソメラーゼ
ＩＩＩ（A.Ｉ.Slesarevら、J.Biol.Chem.266:12321-123
28（1991））、核トポイソメラーゼＩおよびミトコンド
リアおよびポックスウイルス由来の密接に関連する酵素
（N.Osheroff、Pharmac.Ther.41:223-241（1989））か
らなる。触媒機構に関して、これらのトポイソメラーゼ
は二つの群に分けられる。Ａ群は作用するのに２価のカ
チオンを必要とし、５′ホスホリル末端で一過性の共有
結合性複合体を形成する酵素からなる（原核生物性１型
トポイソメラーゼ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ、およびヒトトポイソメラ
ーゼＩＩＩ）。Ｂ群は、作用するのに２価のカチオンを
必要とせず、３′ホスホリル末端で一過性の共有結合す
る１型トポイソメラーゼを含む（核トポイソメラーゼ
Ｉ、一般に真核生物性トポイソメラーゼＩと称せられる
ミトコンドリアおよびポックスウイルスに由来する酵
素）。１型トポイソメラーゼは以下のトポロジー反応を
行う：これらはスーパーコイル化ＤＮＡ（逆ジャイレー
スを除く）を弛緩し、一本鎖環状ＤＮＡまたは二本鎖Ｄ
ＮＡ（ただし、少なくとも１つの分子がニックまたはギ
ャップを有する）を連環形成（またはその解離）する
か、または一本鎖環と相互反応し、トポロジカルな結節
を導入する（１型−Ａ群トポイソメラーゼ）。１型−Ａ
群トポイソメラーゼに属する逆ジャイレースはｃＤＮＡ
に正のスーパーコイルを導入できることがわかった唯一
のトポイソメラーゼである。
【０００６】ＤＮＡトポイソメラーゼに関する研究は、
ＤＮＡ酵素学から開発療法へと進歩している。細菌性Ｄ
ＮＡトポイソメラーゼＩＩはキノロン抗生物質の治療上
重要な標的である；哺乳動物性ＤＮＡトポイソメラーゼ
ＩＩは多くの強力な抗腫瘍薬の細胞性標的である（K.Dr
lica、Microbiol.Rev.48:273-289（1984）およびBioche
mistry 27:2253-2259（1988）；B.S.Glisson & W.E.Ros
s、Pharmacol.Ther.32:89-106（1987）；A.L.Bodley &
L.F.Liu、Biotechnology 6:1315-1319（1988）；L.F.Li
u、Annu.Rev.Biochem.58:351-375（1989））。トポイソ
メラーゼＩＩ毒と称されるこれらの薬物は、開裂可能な
複合体と称される主要な共有結合性反応中間体を捕捉す
ることにより、ＩＩ型トポイソメラーゼの切断−再結合
反応を妨害する。哺乳動物性トポイソメラーゼＩは、こ
れもまた共有結合性反応中間体を捕捉する抗腫瘍薬トポ
テカン（米国特許第５００４７５８号）の細胞性標的で
ある。
ＤＮＡ酵素学から開発療法へと進歩している。細菌性Ｄ
ＮＡトポイソメラーゼＩＩはキノロン抗生物質の治療上
重要な標的である；哺乳動物性ＤＮＡトポイソメラーゼ
ＩＩは多くの強力な抗腫瘍薬の細胞性標的である（K.Dr
lica、Microbiol.Rev.48:273-289（1984）およびBioche
mistry 27:2253-2259（1988）；B.S.Glisson & W.E.Ros
s、Pharmacol.Ther.32:89-106（1987）；A.L.Bodley &
L.F.Liu、Biotechnology 6:1315-1319（1988）；L.F.Li
u、Annu.Rev.Biochem.58:351-375（1989））。トポイソ
メラーゼＩＩ毒と称されるこれらの薬物は、開裂可能な
複合体と称される主要な共有結合性反応中間体を捕捉す
ることにより、ＩＩ型トポイソメラーゼの切断−再結合
反応を妨害する。哺乳動物性トポイソメラーゼＩは、こ
れもまた共有結合性反応中間体を捕捉する抗腫瘍薬トポ
テカン（米国特許第５００４７５８号）の細胞性標的で
ある。
【０００７】前記したように、細菌性Ｉ型トポイソメラ
ーゼ（トポイソメラーゼＩ＆ＩＩＩ）はＤＮＡトポロジ
ーを変化させる酵素であり、複製、転写および組換えを
含め、多くの極めて重要な細胞性工程に関与する（Lutt
inger,A.、Molecular Microbiol.15(4):601-608（199
5））。これらの酵素はＤＮＡ一本鎖を一時的に切断
し、裂け目にＤＮＡ一本鎖または二本鎖を通し、最終的
に裂け目を再閉する。ＤＮＡ基質の開裂により、酵素の
チロシン残基およびＤＮＡ鎖の開裂部位における５′末
端間に共有結合が形成される（Roca,J.A.、TTBS 20:156
-160（1995））。
ーゼ（トポイソメラーゼＩ＆ＩＩＩ）はＤＮＡトポロジ
ーを変化させる酵素であり、複製、転写および組換えを
含め、多くの極めて重要な細胞性工程に関与する（Lutt
inger,A.、Molecular Microbiol.15(4):601-608（199
5））。これらの酵素はＤＮＡ一本鎖を一時的に切断
し、裂け目にＤＮＡ一本鎖または二本鎖を通し、最終的
に裂け目を再閉する。ＤＮＡ基質の開裂により、酵素の
チロシン残基およびＤＮＡ鎖の開裂部位における５′末
端間に共有結合が形成される（Roca,J.A.、TTBS 20:156
-160（1995））。
【０００８】共有結合−酵素−ＤＮＡ複合体（開裂可能
な複合体）を安定化させる酵素阻害は染色体損傷および
細菌性細胞死を引き起こす。さらに、この機構は１回の
阻害事象により細胞死に至る可能性がある。開裂可能な
複合体を安定化することにより作用する低分子量の阻害
剤は、特に活性部位の領域におけるトポイソメラーゼＩ
およびＩＩＩの広範囲に及ぶアミノ酸配列類似性のた
め、その両方のトポイソメラーゼで作用できる。したが
って、点突然変異より生じるそのような薬物に対する将
来の高レベルの耐性の可能性を低くすることができる。
な複合体）を安定化させる酵素阻害は染色体損傷および
細菌性細胞死を引き起こす。さらに、この機構は１回の
阻害事象により細胞死に至る可能性がある。開裂可能な
複合体を安定化することにより作用する低分子量の阻害
剤は、特に活性部位の領域におけるトポイソメラーゼＩ
およびＩＩＩの広範囲に及ぶアミノ酸配列類似性のた
め、その両方のトポイソメラーゼで作用できる。したが
って、点突然変異より生じるそのような薬物に対する将
来の高レベルの耐性の可能性を低くすることができる。
【０００９】Ｉ型トポイソメラーゼの阻害剤は、例え
ば、ＤＮＡとの共有結合複合体においてタンパク質を安
定化できる阻害剤であり、細菌に対して致死的または抑
制的であり、そのため抗菌治療において有用である。ス
トレプトコッカス属遺伝子および遺伝子生成物を抗生物
質の開発のための標的として用いることは特に好ましい
ことである。ストレプトコッカス属は微生物の医学的に
重要な属を形成している。これらは浸潤性および毒素性
の二つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤
性感染は一般に皮膚表面および組織深部に影響する膿瘍
を形成する特徴がある。ストレプトコッカス・ニューモ
ニエ（Ｓ.pneumoniae）は癌患者における菌血症の２次
誘発原因である。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血
栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的
である。ストレプトコッカス属の毒素特性よりもたらさ
れる、少なくとも３種の臨床症状がある。これらの疾病
の出現は、組織浸潤および菌血症に対抗するように、外
毒素の作用をもたらす。これらの症状は：ストレプトコ
ッカス食中毒、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショ
ック症候群を包含する。
ば、ＤＮＡとの共有結合複合体においてタンパク質を安
定化できる阻害剤であり、細菌に対して致死的または抑
制的であり、そのため抗菌治療において有用である。ス
トレプトコッカス属遺伝子および遺伝子生成物を抗生物
質の開発のための標的として用いることは特に好ましい
ことである。ストレプトコッカス属は微生物の医学的に
重要な属を形成している。これらは浸潤性および毒素性
の二つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤
性感染は一般に皮膚表面および組織深部に影響する膿瘍
を形成する特徴がある。ストレプトコッカス・ニューモ
ニエ（Ｓ.pneumoniae）は癌患者における菌血症の２次
誘発原因である。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血
栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的
である。ストレプトコッカス属の毒素特性よりもたらさ
れる、少なくとも３種の臨床症状がある。これらの疾病
の出現は、組織浸潤および菌血症に対抗するように、外
毒素の作用をもたらす。これらの症状は：ストレプトコ
ッカス食中毒、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショ
ック症候群を包含する。
【００１０】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、ポリペプチド、図２（配列番号：２）に示すアミノ
酸配列およびバシラス・サチリス（Bacillus subtili
s）トポイソメラーゼＩ（これは図２の配列に対して同
一性２５.２％、類似性４２.２％である）などの他のタ
ンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性により、新規ト
ポイソメラーゼＩＩＩとして同定されたポリペプチドを
提供することである。本発明のさらなる目的は、さら
に、トポイソメラーゼＩＩＩをコードするポリヌクレオ
チド、特に本明細書において細菌性トポイソメラーゼＩ
ＩＩと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供することである。
は、ポリペプチド、図２（配列番号：２）に示すアミノ
酸配列およびバシラス・サチリス（Bacillus subtili
s）トポイソメラーゼＩ（これは図２の配列に対して同
一性２５.２％、類似性４２.２％である）などの他のタ
ンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性により、新規ト
ポイソメラーゼＩＩＩとして同定されたポリペプチドを
提供することである。本発明のさらなる目的は、さら
に、トポイソメラーゼＩＩＩをコードするポリヌクレオ
チド、特に本明細書において細菌性トポイソメラーゼＩ
ＩＩと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号：１）に示す配列における、トポイソメラー
ゼＩＩＩをコードする領域を有する。本発明の別の特に
好ましい具体例には、（配列番号：２）のアミノ酸配列
を含んでなるストレプトコッカス・ニューモニエ（Stre
ptococcus pneumoniae）由来の新規トポイソメラーゼＩ
ＩＩタンパク質、またはそのフラグメント、アナログま
たは誘導体がある。本発明のこの態様によれば、寄託株
ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４に含まれるストレプトコ
ッカス・ニューモニエ・ポリヌクレオチドにより発現可
能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供
される。
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号：１）に示す配列における、トポイソメラー
ゼＩＩＩをコードする領域を有する。本発明の別の特に
好ましい具体例には、（配列番号：２）のアミノ酸配列
を含んでなるストレプトコッカス・ニューモニエ（Stre
ptococcus pneumoniae）由来の新規トポイソメラーゼＩ
ＩＩタンパク質、またはそのフラグメント、アナログま
たは誘導体がある。本発明のこの態様によれば、寄託株
ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４に含まれるストレプトコ
ッカス・ニューモニエ・ポリヌクレオチドにより発現可
能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供
される。
【００１２】本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは
治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、ま
たは変種、アナログおよび誘導体のフラグメントを含
め、そのフラグメントを包含する、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ、特にストレプトコッカス・トポイソメラーゼＩＩ
Ｉをコードする単離された核酸分子が提供される。本発
明のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラ
ーゼＩＩＩの天然の対立遺伝子変種がある。
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは
治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、ま
たは変種、アナログおよび誘導体のフラグメントを含
め、そのフラグメントを包含する、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ、特にストレプトコッカス・トポイソメラーゼＩＩ
Ｉをコードする単離された核酸分子が提供される。本発
明のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラ
ーゼＩＩＩの天然の対立遺伝子変種がある。
【００１３】本発明のこの態様によれば、本明細書にお
いてトポイソメラーゼＩＩＩと称されるストレプトコッ
カス属起源の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診
断学的、もしくは治療的に有用なそのフラグメント、お
よび前記した変種、誘導体およびアナログ、およびその
フラグメントが提供される。治療を目的として、例え
ば、ストレプトコッカス感染などの細菌感染に対して宿
主に免疫を付与することによる治療を含め、疾患を治療
するのに用いることができるトポイソメラーゼＩＩＩポ
リペプチド、特に細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペ
プチドを提供することも本発明の目的である。
いてトポイソメラーゼＩＩＩと称されるストレプトコッ
カス属起源の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診
断学的、もしくは治療的に有用なそのフラグメント、お
よび前記した変種、誘導体およびアナログ、およびその
フラグメントが提供される。治療を目的として、例え
ば、ストレプトコッカス感染などの細菌感染に対して宿
主に免疫を付与することによる治療を含め、疾患を治療
するのに用いることができるトポイソメラーゼＩＩＩポ
リペプチド、特に細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペ
プチドを提供することも本発明の目的である。
【００１４】本発明のさらなる態様によれば、治療また
は予防を目的として、例えば抗菌剤またはワクチンとし
ての、本発明のポリペプチド、とりわけそのフラグメン
トの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、治
療または予防を目的として、特に遺伝的免疫における、
本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラー
ゼＩＩＩ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされる
トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの変種がある。
は予防を目的として、例えば抗菌剤またはワクチンとし
ての、本発明のポリペプチド、とりわけそのフラグメン
トの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、治
療または予防を目的として、特に遺伝的免疫における、
本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラー
ゼＩＩＩ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされる
トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの変種がある。
【００１５】本発明の別の目的は、前記のポリペプチ
ド、ポリペプチドのフラグメント、変種および誘導体、
その変種および誘導体のフラグメント、並びに前記した
もののアナログの製造方法を提供することである。本発
明のこの態様の好ましい具体例では、外因的に誘導され
たトポイソメラーゼＩＩＩのコード化ポリヌクレオチド
を発現可能なように挿入した宿主細胞を、宿主において
トポイソメラーゼＩＩＩを発現するような条件下で培養
し、次いで発現したポリペプチドを回収することからな
る、前記したトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの製
造方法を提供する。
ド、ポリペプチドのフラグメント、変種および誘導体、
その変種および誘導体のフラグメント、並びに前記した
もののアナログの製造方法を提供することである。本発
明のこの態様の好ましい具体例では、外因的に誘導され
たトポイソメラーゼＩＩＩのコード化ポリヌクレオチド
を発現可能なように挿入した宿主細胞を、宿主において
トポイソメラーゼＩＩＩを発現するような条件下で培養
し、次いで発現したポリペプチドを回収することからな
る、前記したトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの製
造方法を提供する。
【００１６】本発明の別の目的によれば、とりわけ研
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組成
物、工程および方法が提供される。本発明のさらに別の
態様によれば、抗菌剤として有用なかかるポリペプチド
の阻害物質が提供される。特にかかるポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明のこの態様および他の態
様のある種の好ましい具体例によれば、細菌感染を検出
するのに有用な、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ配列に
ハイブリダイゼーションするプローブが提供される。
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組成
物、工程および方法が提供される。本発明のさらに別の
態様によれば、抗菌剤として有用なかかるポリペプチド
の阻害物質が提供される。特にかかるポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明のこの態様および他の態
様のある種の好ましい具体例によれば、細菌感染を検出
するのに有用な、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ配列に
ハイブリダイゼーションするプローブが提供される。
【００１７】本発明のこの態様のある種のさらなる好ま
しい具体例では、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド
に対する抗体が提供される。この点における特に好まし
い具体例では、その抗体はストレプトコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩに対して選択的である。本発明の別の
態様によれば、トポイソメラーゼＩＩＩアゴニストが提
供される。好ましいアゴニストには、トポイソメラーゼ
ＩＩＩ結合分子に結合し、トポイソメラーゼＩＩＩ誘起
反応を惹起または増強する、トポイソメラーゼＩＩＩを
模倣する分子がある。また、好ましいアゴニストには、
トポイソメラーゼＩＩＩをコードする遺伝子もしくはト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、または他のトポイ
ソメラーゼＩＩＩ活性のモジュレーターと相互作用し、
それにより、１またはそれ以上のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉの効果を強化または増強する分子があり、好ましくは
静菌性または殺菌性でもある。
しい具体例では、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド
に対する抗体が提供される。この点における特に好まし
い具体例では、その抗体はストレプトコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩに対して選択的である。本発明の別の
態様によれば、トポイソメラーゼＩＩＩアゴニストが提
供される。好ましいアゴニストには、トポイソメラーゼ
ＩＩＩ結合分子に結合し、トポイソメラーゼＩＩＩ誘起
反応を惹起または増強する、トポイソメラーゼＩＩＩを
模倣する分子がある。また、好ましいアゴニストには、
トポイソメラーゼＩＩＩをコードする遺伝子もしくはト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、または他のトポイ
ソメラーゼＩＩＩ活性のモジュレーターと相互作用し、
それにより、１またはそれ以上のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉの効果を強化または増強する分子があり、好ましくは
静菌性または殺菌性でもある。
【００１８】本発明のさらに別の態様によれば、トポイ
ソメラーゼＩＩＩアンタゴニストが提供される。好まし
いアンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合
し、トポイソメラーゼＩＩＩ結合分子の結合を阻害する
か、またはトポイソメラーゼＩＩＩおよびトポイソメラ
ーゼＩＩＩ結合分子の間で形成される複合体を安定化
し、トポイソメラーゼＩＩＩから生じるさらなる生物学
的活性を防御するアンタゴニストがある。また好ましい
アンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合す
るかまたは相互作用し、１またはそれ以上のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの効果を阻害するか、またはトポイソメラ
ーゼＩＩＩの発現を妨げ、また好ましくは静菌性または
殺菌性でもある分子がある。
ソメラーゼＩＩＩアンタゴニストが提供される。好まし
いアンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合
し、トポイソメラーゼＩＩＩ結合分子の結合を阻害する
か、またはトポイソメラーゼＩＩＩおよびトポイソメラ
ーゼＩＩＩ結合分子の間で形成される複合体を安定化
し、トポイソメラーゼＩＩＩから生じるさらなる生物学
的活性を防御するアンタゴニストがある。また好ましい
アンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合す
るかまたは相互作用し、１またはそれ以上のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの効果を阻害するか、またはトポイソメラ
ーゼＩＩＩの発現を妨げ、また好ましくは静菌性または
殺菌性でもある分子がある。
【００１９】本発明のさらなる態様では、インビトロで
細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、
または多細胞生物に投与するための、トポイソメラーゼ
ＩＩＩポリヌクレオチドまたはトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。本発明の
この態様のある種の好ましい具体例において、該組成物
は、宿主生物においてトポイソメラーゼＩＩＩポリペプ
チドを発現し、免疫学的応答、好ましくはストレプトコ
ッカスまたは関連生物に対するかかる宿主の免疫性を亢
進させるためのトポイソメラーゼＩＩＩポリヌクレオチ
ドを含んでなる。
細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、
または多細胞生物に投与するための、トポイソメラーゼ
ＩＩＩポリヌクレオチドまたはトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。本発明の
この態様のある種の好ましい具体例において、該組成物
は、宿主生物においてトポイソメラーゼＩＩＩポリペプ
チドを発現し、免疫学的応答、好ましくはストレプトコ
ッカスまたは関連生物に対するかかる宿主の免疫性を亢
進させるためのトポイソメラーゼＩＩＩポリヌクレオチ
ドを含んでなる。
【００２０】本発明のその他の目的、特徴、利点および
態様は、以下の記載より当業者に明らかとなろう。しか
しながら、以下の記載および明確な実施例は、本発明の
好ましい具体例を示すものであり、単に説明として示さ
れるものであると認識すべきである。開示した本発明の
精神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の
記載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読む
ことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
態様は、以下の記載より当業者に明らかとなろう。しか
しながら、以下の記載および明確な実施例は、本発明の
好ましい具体例を示すものであり、単に説明として示さ
れるものであると認識すべきである。開示した本発明の
精神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の
記載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読む
ことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００２１】
定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合分子は、例えばスーパーコイル化ＤＮＡなどの酵
素基質、細胞膜成分および古典的なレセプターを含め、
本発明のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと特異的に結合または相互作用する分子
またはイオンをいう。本発明のポリペプチドと、結合ま
たは相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、
本発明のポリペプチドに対して独占的であることが好ま
しく、またはその結合は本発明のポリペプチドに高度に
特異的であることもまた好ましく、またはその結合は本
発明のポリペプチドを包含するタンパク質群に高度に特
異的であることも好ましく、または本発明のポリペプチ
ドを含む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特
異的であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペ
プチドに特異的に結合する抗体および抗体由来の物質を
も包含する。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合分子は、例えばスーパーコイル化ＤＮＡなどの酵
素基質、細胞膜成分および古典的なレセプターを含め、
本発明のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと特異的に結合または相互作用する分子
またはイオンをいう。本発明のポリペプチドと、結合ま
たは相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、
本発明のポリペプチドに対して独占的であることが好ま
しく、またはその結合は本発明のポリペプチドに高度に
特異的であることもまた好ましく、またはその結合は本
発明のポリペプチドを包含するタンパク質群に高度に特
異的であることも好ましく、または本発明のポリペプチ
ドを含む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特
異的であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペ
プチドに特異的に結合する抗体および抗体由来の物質を
も包含する。
【００２２】「遺伝的エレメント」は、一般に、ポリペ
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
【００２３】「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、配列を比較して測定さ
れるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間
または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、
時には、かかる配列の鎖の間の合致により決定されるよ
うなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関連
性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は
共に容易に算出できる（Computational Molecular Biol
ogy，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティ
ー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：In
formatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、アカ
デミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer A
nalysis of Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャ
ージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Bio
logy，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチドまたは２つ
のポリペプチド間の同一性および類似性を測定するため
の多くの方法がある一方で、その両方の用語は当業者に
周知である（ＳequenceＡnalysis in ＭolecularＢiolo
gy，von Heinje，Ｇ.，ＡcademicＰress，1987；Ｓquen
ce ＡnalysisＰrimer，Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereu
x，Ｊ.，編、Ｍ ＳtocktonＰress，Ｎew Ｙork，1991；
およびＣarillo，Ｈ.，およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ
Ｊ.，ＡppliedＭath.，48：1073（1988））。２つの配
列間で同一性または類似性を測定するのに通常用いられ
る方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡ
Ｍ Ｊ.Ａpplied Ｍath.，48：1073（1988）に開示され
ている方法を包含するが、これに限定されるものではな
い。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する
配列間で最も良く適合するように設計される。同一性お
よび類似性を測定する方法は、コンピュータープログラ
ムに組み込まれている。二つの配列間の同一性および類
似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法
は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nuc
leic Acids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLA
STNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：
403（1990）））を包含するが、これらに限定されるも
のではない。
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、配列を比較して測定さ
れるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間
または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、
時には、かかる配列の鎖の間の合致により決定されるよ
うなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関連
性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は
共に容易に算出できる（Computational Molecular Biol
ogy，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティ
ー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：In
formatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、アカ
デミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer A
nalysis of Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャ
ージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Bio
logy，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチドまたは２つ
のポリペプチド間の同一性および類似性を測定するため
の多くの方法がある一方で、その両方の用語は当業者に
周知である（ＳequenceＡnalysis in ＭolecularＢiolo
gy，von Heinje，Ｇ.，ＡcademicＰress，1987；Ｓquen
ce ＡnalysisＰrimer，Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereu
x，Ｊ.，編、Ｍ ＳtocktonＰress，Ｎew Ｙork，1991；
およびＣarillo，Ｈ.，およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ
Ｊ.，ＡppliedＭath.，48：1073（1988））。２つの配
列間で同一性または類似性を測定するのに通常用いられ
る方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡ
Ｍ Ｊ.Ａpplied Ｍath.，48：1073（1988）に開示され
ている方法を包含するが、これに限定されるものではな
い。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する
配列間で最も良く適合するように設計される。同一性お
よび類似性を測定する方法は、コンピュータープログラ
ムに組み込まれている。二つの配列間の同一性および類
似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法
は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nuc
leic Acids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLA
STNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：
403（1990）））を包含するが、これらに限定されるも
のではない。
【００２４】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
【００２５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチド（複
数でも可）なる語は、しばしば、オリゴヌクレオチドと
称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチド（複
数でも可）なる語は、しばしば、オリゴヌクレオチドと
称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００２６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。本発明
のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、２
ないし３例示として示すと、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、
硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク
質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。かか
る修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に
記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば
糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボ
シル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Struc
ture and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighto
n、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に
記載されている。例えば、Posttranslational Covalent
Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミ
ック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttr
anslational Protein Modifications ：Perspective an
d Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:
626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：
Posttranslational Modifications and Aging，Ann.N.
Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）で提供される論文などの
多くの詳細な論文が、本主題に利用できる。ポリペプチ
ドはいつも完全に直鎖であるとは限らないということは
周知であり、前記した通りであると理解されよう。例え
ばポリペプチドはユビキチン化の結果分岐していてもよ
く、一般には、天然のプロセッシング事象を含む翻訳後
の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも
たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない
環状にできる。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同
様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。実際、
共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシル基またはその両方の遮断は、天然および合成
ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に本発明のポ
リペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ（E.co
li.）または他の細胞で作られるポリペプチドのアミノ
末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシングの前にほ
とんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろう。ペ
プチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端でメチオニン
残基を除去できる。従って、本発明は、本発明のタンパ
ク質のメチオニン含有およびメチオニン不含の両方のア
ミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに起こる
修飾はしばしばそれの作り方に影響される。例えば、宿
主にクローン化遺伝子を発現することにより作られるポ
リペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部分、宿
主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配
列に存在する修飾シグナルにより決定される。例えば、
周知のように、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主
では起こらないことがはしばしばである。従って、糖鎖
形成が望ましい場合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、
一般に、真核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行
う；この理由で昆虫細胞発現系が、糖鎖形成の本来のパ
ターンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現する
ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用
される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいく
つかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ること
は理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる
場合、「ポリペプチド」なる用語は、全てのこのような
修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包
含する。
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。本発明
のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、２
ないし３例示として示すと、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、
硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク
質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。かか
る修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に
記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば
糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボ
シル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Struc
ture and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighto
n、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に
記載されている。例えば、Posttranslational Covalent
Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミ
ック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttr
anslational Protein Modifications ：Perspective an
d Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:
626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：
Posttranslational Modifications and Aging，Ann.N.
Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）で提供される論文などの
多くの詳細な論文が、本主題に利用できる。ポリペプチ
ドはいつも完全に直鎖であるとは限らないということは
周知であり、前記した通りであると理解されよう。例え
ばポリペプチドはユビキチン化の結果分岐していてもよ
く、一般には、天然のプロセッシング事象を含む翻訳後
の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも
たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない
環状にできる。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同
様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。実際、
共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシル基またはその両方の遮断は、天然および合成
ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に本発明のポ
リペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ（E.co
li.）または他の細胞で作られるポリペプチドのアミノ
末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシングの前にほ
とんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろう。ペ
プチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端でメチオニン
残基を除去できる。従って、本発明は、本発明のタンパ
ク質のメチオニン含有およびメチオニン不含の両方のア
ミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに起こる
修飾はしばしばそれの作り方に影響される。例えば、宿
主にクローン化遺伝子を発現することにより作られるポ
リペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部分、宿
主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配
列に存在する修飾シグナルにより決定される。例えば、
周知のように、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主
では起こらないことがはしばしばである。従って、糖鎖
形成が望ましい場合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、
一般に、真核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行
う；この理由で昆虫細胞発現系が、糖鎖形成の本来のパ
ターンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現する
ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用
される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいく
つかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ること
は理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる
場合、「ポリペプチド」なる用語は、全てのこのような
修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包
含する。
【００２７】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。ポリヌクレオチドに関し
て、違いは、一般に、対照標準と変種のヌクレオチド配
列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一
であるものに限られる。以下に記すように、変種におけ
るヌクレオチドの配列の変化はサイレントであってもよ
い。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコー
ドされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型の
サイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。ポリペプチドに関して、違いは、一般に、対照
標準と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多く
の領域で同一であるものに限られる。変種および対照標
準のポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、
欠失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じて
いてもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていても
よい。
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。ポリヌクレオチドに関し
て、違いは、一般に、対照標準と変種のヌクレオチド配
列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一
であるものに限られる。以下に記すように、変種におけ
るヌクレオチドの配列の変化はサイレントであってもよ
い。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコー
ドされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型の
サイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。ポリペプチドに関して、違いは、一般に、対照
標準と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多く
の領域で同一であるものに限られる。変種および対照標
準のポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、
欠失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じて
いてもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていても
よい。
【００２８】本発明は、とりわけ、以下により詳細に記
載する、新規トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドおよ
びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、
本発明は、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）
のトポイソメラーゼＩポリペプチドに対するアミノ酸配
列相同性により関連付けられる、ストレプトコッカス・
ニューモニエの新規トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に図１（配列番号：１）および図２（配列番号：２）
に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するストレ
プトコッカス・トポイソメラーゼＩＩＩ、ならびに本明
細書において「寄託生物」または「寄託生物のＤＮＡ」
と称するＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４より単離可能な
ＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列に関する。図１（配列番号：１）および図２
（配列番号：２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配
列は、寄託生物のＤＮＡを配列決定することにより得ら
れたことは理解されよう。従って、寄託クローンの配列
が、その配列（およびそれをコードする配列）と図１
（配列番号：１）および図２（配列番号：２）の配列の
間のいずれの不一致に関しても調節するものである。
載する、新規トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドおよ
びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、
本発明は、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）
のトポイソメラーゼＩポリペプチドに対するアミノ酸配
列相同性により関連付けられる、ストレプトコッカス・
ニューモニエの新規トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に図１（配列番号：１）および図２（配列番号：２）
に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するストレ
プトコッカス・トポイソメラーゼＩＩＩ、ならびに本明
細書において「寄託生物」または「寄託生物のＤＮＡ」
と称するＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４より単離可能な
ＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列に関する。図１（配列番号：１）および図２
（配列番号：２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配
列は、寄託生物のＤＮＡを配列決定することにより得ら
れたことは理解されよう。従って、寄託クローンの配列
が、その配列（およびそれをコードする配列）と図１
（配列番号：１）および図２（配列番号：２）の配列の
間のいずれの不一致に関しても調節するものである。
【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図２（配列番号：２）の
推定アミノ酸配列を有するストレプトコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコードする単離ポリヌ
クレオチドを提供する。図１（配列番号：１）に示すポ
リヌクレオチド配列などの本明細書にて提供される情報
を用いて、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコー
ドする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニ
ングおよびスクリーニングの手法を用いて得ることがで
きる。配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用いてタンパク
質をコードするポリヌクレオチドを得るためには、典型
的には、イー・コリまたはいくつかの他の適当な宿主中
のストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３の
染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、図１の配列
に由来する、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さ
の、放射標識したオリゴヌクレオチドでプローブする。
ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有するクローン
は、非常にストリンジェントな洗浄操作に付すことによ
り区別できる。元の配列から設計された配列決定プライ
マーで同定された個々のクローンを配列決定することに
より、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝子配列を決定
することが可能である。都合よくは、かかる配列決定を
プラスミドクローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを
用いて実施する。適当な技術については、Maniatis,
T.、Fritsch,E.F.およびSambrook、J．、Molecular Clo
ning，A Laboratory Manual（第2版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（1989）；ハイブリダイ
ゼーションによるスクリーニング1.９０および変性二本
鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）に記
載されている。本発明の一例として、図１に示すポリヌ
クレオチドは、実施例１に記載されているように、スト
レプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３に由来す
るＤＮＡライブラリー中で見出したものである。
推定アミノ酸配列を有するストレプトコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコードする単離ポリヌ
クレオチドを提供する。図１（配列番号：１）に示すポ
リヌクレオチド配列などの本明細書にて提供される情報
を用いて、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコー
ドする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニ
ングおよびスクリーニングの手法を用いて得ることがで
きる。配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用いてタンパク
質をコードするポリヌクレオチドを得るためには、典型
的には、イー・コリまたはいくつかの他の適当な宿主中
のストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３の
染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、図１の配列
に由来する、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さ
の、放射標識したオリゴヌクレオチドでプローブする。
ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有するクローン
は、非常にストリンジェントな洗浄操作に付すことによ
り区別できる。元の配列から設計された配列決定プライ
マーで同定された個々のクローンを配列決定することに
より、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝子配列を決定
することが可能である。都合よくは、かかる配列決定を
プラスミドクローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを
用いて実施する。適当な技術については、Maniatis,
T.、Fritsch,E.F.およびSambrook、J．、Molecular Clo
ning，A Laboratory Manual（第2版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（1989）；ハイブリダイ
ゼーションによるスクリーニング1.９０および変性二本
鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）に記
載されている。本発明の一例として、図１に示すポリヌ
クレオチドは、実施例１に記載されているように、スト
レプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３に由来す
るＤＮＡライブラリー中で見出したものである。
【００３０】寄託クローンのトポイソメラーゼＩＩＩを
コードする配列を文献に報告されている配列と比較する
ことによりわかるように、本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩは、構造的に、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩファ
ミリーの他のタンパク質に関連付けられる。好ましいＤ
ＮＡ配列を図１（配列番号：１）に示す。これは、約１
４７個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを有する。このタンパク質は、
既知タンパク質の中でも、バシラス・サチリス・トポイ
ソメラーゼＩタンパク質に対して最大の相同性を示す。
図２（配列番号：２）のトポイソメラーゼＩＩＩは、バ
シラス・サチリス・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列
と、約２５.２％の同一性、および約４２.２％の類似性
を有する。
コードする配列を文献に報告されている配列と比較する
ことによりわかるように、本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩは、構造的に、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩファ
ミリーの他のタンパク質に関連付けられる。好ましいＤ
ＮＡ配列を図１（配列番号：１）に示す。これは、約１
４７個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを有する。このタンパク質は、
既知タンパク質の中でも、バシラス・サチリス・トポイ
ソメラーゼＩタンパク質に対して最大の相同性を示す。
図２（配列番号：２）のトポイソメラーゼＩＩＩは、バ
シラス・サチリス・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列
と、約２５.２％の同一性、および約４２.２％の類似性
を有する。
【００３１】本発明のポリヌクレオチドは、クローニン
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃDＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１（配列番号：１）に示すポリヌクレ
オチドのコーディング配列と同一であってもよい。さら
に、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結果、、図
２（配列番号：２）のポリペプチドをコードする異なる
配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃDＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１（配列番号：１）に示すポリヌクレ
オチドのコーディング配列と同一であってもよい。さら
に、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結果、、図
２（配列番号：２）のポリペプチドをコードする異なる
配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３２】図２（配列番号：２）のポリペプチドをコ
ードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、
プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌
配列をコードするコーディング配列；付加非コーディン
グ配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共に
またはなしで、例えば、限定するものではないが、転写
にて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止
シグナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。ＤＮＡはまた、本発明のトポイソメラ
ーゼＩＩＩをコードするｍＲＮＡの転写を指令するよう
に機能するプロモーター領域を有していてもよい。その
ようなプロモーターは、独立して、組換え発現系におけ
る異種遺伝子の転写を指令するのに有用であるかもしれ
ない。さらには、該ポリペプチドは、融合ポリペプチド
の精製を促す、ペプチドなどのマーカー配列に融合して
いてもよい。本発明のこの態様のある具体例において、
マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、
とりわけｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテ
ィッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得られるタグであり、多
くが市販により入手可能である。例えば、Gentzら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載され
るように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の通常
の精製法を提供する。インフルエンザ・ヘマググルチニ
ン・タンパク質由来のエピトープに対応する、ＨＡタグ
もまた融合タンパク質の生成に使用でき、これについて
は例えばWilsonら、Cell，37:767（1984）に記載されて
いる。
ードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、
プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌
配列をコードするコーディング配列；付加非コーディン
グ配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共に
またはなしで、例えば、限定するものではないが、転写
にて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止
シグナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。ＤＮＡはまた、本発明のトポイソメラ
ーゼＩＩＩをコードするｍＲＮＡの転写を指令するよう
に機能するプロモーター領域を有していてもよい。その
ようなプロモーターは、独立して、組換え発現系におけ
る異種遺伝子の転写を指令するのに有用であるかもしれ
ない。さらには、該ポリペプチドは、融合ポリペプチド
の精製を促す、ペプチドなどのマーカー配列に融合して
いてもよい。本発明のこの態様のある具体例において、
マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、
とりわけｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテ
ィッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得られるタグであり、多
くが市販により入手可能である。例えば、Gentzら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載され
るように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の通常
の精製法を提供する。インフルエンザ・ヘマググルチニ
ン・タンパク質由来のエピトープに対応する、ＨＡタグ
もまた融合タンパク質の生成に使用でき、これについて
は例えばWilsonら、Cell，37:767（1984）に記載されて
いる。
【００３３】前記によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有する、スト
レプトコッカス・ニューモニエ・トポイソメラーゼＩＩ
Ｉのポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレ
オチド包含する。この用語は、さらにコーディングおよ
び／または非コーディング配列を含有していてもよい、
付加領域と共に該ポリペプチドをコードする単一の連続
領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージ
もしくは挿入配列またはエディティング（editing）に
より分断される）を含む、ポリヌクレオチドを包含す
る。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有する、スト
レプトコッカス・ニューモニエ・トポイソメラーゼＩＩ
Ｉのポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレ
オチド包含する。この用語は、さらにコーディングおよ
び／または非コーディング配列を含有していてもよい、
付加領域と共に該ポリペプチドをコードする単一の連続
領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージ
もしくは挿入配列またはエディティング（editing）に
より分断される）を含む、ポリヌクレオチドを包含す
る。
【００３４】本発明はさらに、図２（配列番号：２）の
推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書で前
記したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオ
チドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然の変種
であってもよく、または自然に発生することが知られて
いない変種であってもよい。このようなポリヌクレオチ
ドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物
に適用される方法を含め、突然変異誘発技術により作る
ことができる。
推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書で前
記したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオ
チドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然の変種
であってもよく、または自然に発生することが知られて
いない変種であってもよい。このようなポリヌクレオチ
ドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物
に適用される方法を含め、突然変異誘発技術により作る
ことができる。
【００３５】この点における変種には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換は１またはそれ以上のヌクレオ
チドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディ
ング領域またはその両方において変化していてもよい。
コーディング領域における変化が保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれな
い。この点に関する本発明の特に好ましい具体例には、
図２（配列番号：２）に示すストレプトコッカス・トポ
イソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド；それらの変種、アナ
ログ、誘導体およびフラグメントがある。
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換は１またはそれ以上のヌクレオ
チドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディ
ング領域またはその両方において変化していてもよい。
コーディング領域における変化が保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれな
い。この点に関する本発明の特に好ましい具体例には、
図２（配列番号：２）に示すストレプトコッカス・トポ
イソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド；それらの変種、アナ
ログ、誘導体およびフラグメントがある。
【００３６】この点において、さらに特に好ましくは、
図２（配列番号：２）のストレプトコッカス・トポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドで、そのうち、数個、わず
かな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個の
アミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されているアミノ酸配列を有する、トポイソメラ
ーゼＩＩＩ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および欠
失であり、トポイソメラーゼＩＩＩの特性および活性を
変えないものである。また、この点に関してとりわけ好
ましいものは、保存的置換である。最も好ましいもの
は、置換されていない、図２（配列番号：２）のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。本発明のさらに好ましい態様は、図２（配
列番号：２）に示すアミノ酸配列を有するトポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、お
よびかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。また、寄託クローンのストレプトコッカス・
ニューモニエＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
８０％同一である領域を有するポリヌクレオチド、およ
びそれらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。
この点において、その同じものに対して少なくとも９０
％の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好まし
く、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特
に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好ま
しく、その中でも少なくとも９８％および少なくとも９
９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％
であるのがより好ましい。
図２（配列番号：２）のストレプトコッカス・トポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドで、そのうち、数個、わず
かな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個の
アミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されているアミノ酸配列を有する、トポイソメラ
ーゼＩＩＩ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および欠
失であり、トポイソメラーゼＩＩＩの特性および活性を
変えないものである。また、この点に関してとりわけ好
ましいものは、保存的置換である。最も好ましいもの
は、置換されていない、図２（配列番号：２）のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。本発明のさらに好ましい態様は、図２（配
列番号：２）に示すアミノ酸配列を有するトポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、お
よびかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。また、寄託クローンのストレプトコッカス・
ニューモニエＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
８０％同一である領域を有するポリヌクレオチド、およ
びそれらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。
この点において、その同じものに対して少なくとも９０
％の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好まし
く、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特
に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好ま
しく、その中でも少なくとも９８％および少なくとも９
９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％
であるのがより好ましい。
【００３７】この点に関してとりわけ好ましい具体例
は、さらには、図１（配列番号：１）のＤＮＡによりコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的
機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドである。本発明はさらに本明細書で前記
した配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において、本発明は、特に、ストリ
ンジェントな条件下で本明細書で前記したポリヌクレオ
チドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに
関する。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」
なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間で少なく
とも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性があ
る場合にのみ起こることを意味する。
は、さらには、図１（配列番号：１）のＤＮＡによりコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的
機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドである。本発明はさらに本明細書で前記
した配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において、本発明は、特に、ストリ
ンジェントな条件下で本明細書で前記したポリヌクレオ
チドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに
関する。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」
なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間で少なく
とも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性があ
る場合にのみ起こることを意味する。
【００３８】本発明のポリヌクレオチドアッセイについ
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする完全
長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ならびにト
ポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子に対して高度な配列類似性
を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを
単離することができる。かかるプローブは、一般に、少
なくとも１５塩基を有してなる。好ましくは、かかるプ
ローブは少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０
塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは少なくと
も３０塩基を有し、５０以下の塩基を有する。例えば、
トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のコーディング領域は、
既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴヌク
レオチドプローブを合成することにより単離できる。つ
いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、
ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイ
ズするかを決定する。
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする完全
長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ならびにト
ポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子に対して高度な配列類似性
を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを
単離することができる。かかるプローブは、一般に、少
なくとも１５塩基を有してなる。好ましくは、かかるプ
ローブは少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０
塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは少なくと
も３０塩基を有し、５０以下の塩基を有する。例えば、
トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のコーディング領域は、
既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴヌク
レオチドプローブを合成することにより単離できる。つ
いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、
ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイ
ズするかを決定する。
【００３９】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列（配列番号：１）より誘導さ
れる、オリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオ
チドは、本明細書において同定されたストレプトコッカ
ス・ニューモニエ遺伝子が、全体としてまたは部分的
に、感染組織にて転写されるかどうかを決定するため
に、本明細書に前記した方法でのＰＣＲプライマーとし
て使用できる。かかる配列はまた、病因が達した感染の
段階および型の診断にも有用であると思われる。ポリヌ
クレオチドは、成熟タンパク質に、さらなるアミノもし
くはカルボキシル末端アミノ酸が加わるか、またはその
内部にアミノ酸が加わった（例えば成熟形態が一つ以上
のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコード
できる。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク
質のプロセッシングにおいて役割を有し、タンパク質を
運び、タンパク質の半減期を長くしたり短くしたり、ま
たはとりわけアッセイもしくは生成のためのタンパク質
の操作を容易にすることができる。インビボで一般的な
ように、付加アミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク
質からプロセッシングで取り除かれる。
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列（配列番号：１）より誘導さ
れる、オリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオ
チドは、本明細書において同定されたストレプトコッカ
ス・ニューモニエ遺伝子が、全体としてまたは部分的
に、感染組織にて転写されるかどうかを決定するため
に、本明細書に前記した方法でのＰＣＲプライマーとし
て使用できる。かかる配列はまた、病因が達した感染の
段階および型の診断にも有用であると思われる。ポリヌ
クレオチドは、成熟タンパク質に、さらなるアミノもし
くはカルボキシル末端アミノ酸が加わるか、またはその
内部にアミノ酸が加わった（例えば成熟形態が一つ以上
のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコード
できる。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク
質のプロセッシングにおいて役割を有し、タンパク質を
運び、タンパク質の半減期を長くしたり短くしたり、ま
たはとりわけアッセイもしくは生成のためのタンパク質
の操作を容易にすることができる。インビボで一般的な
ように、付加アミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク
質からプロセッシングで取り除かれる。
【００４０】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
【００４１】寄託材料 ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３は、
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭ
Ｂ）、アバディーン、スコットランドに１９９６年４月
１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ番号４０７９４を付され
た。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関
するブダペスト条約の条件下で行われている。特許が発
行されると何らの制限または条件もなく、最終的には株
は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供さ
れ、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるよう
な、寄託が実施可能要件であることを承認するものでは
ない。寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、な
らびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸
配列は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象を調節す
るものである。寄託材料を製造、使用または販売するた
めにはライセンスが必要であるが、そのようなライセン
スはここで付与されるものではない。
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭ
Ｂ）、アバディーン、スコットランドに１９９６年４月
１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ番号４０７９４を付され
た。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関
するブダペスト条約の条件下で行われている。特許が発
行されると何らの制限または条件もなく、最終的には株
は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供さ
れ、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるよう
な、寄託が実施可能要件であることを承認するものでは
ない。寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、な
らびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸
配列は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象を調節す
るものである。寄託材料を製造、使用または販売するた
めにはライセンスが必要であるが、そのようなライセン
スはここで付与されるものではない。
【００４２】ポリペプチド 本発明はさらには図２（配列番号：２）の推定アミノ酸
配列を有する細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグ
メント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、
図２（配列番号：２）のポリペプチドをいう場合、かか
るポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドを意味する。元のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの少なくとも９０％の活性を保持するフラ
グメント、誘導体およびアナログが好ましい。元のトポ
イソメラーゼＩＩＩの少なくとも９５％の活性を保持す
るフラグメント、誘導体およびアナログが好ましい。従
って、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性
成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク
質を包含する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例では、該ポリペプチ
ドは組換えポリペプチドである。
配列を有する細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグ
メント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、
図２（配列番号：２）のポリペプチドをいう場合、かか
るポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドを意味する。元のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの少なくとも９０％の活性を保持するフラ
グメント、誘導体およびアナログが好ましい。元のトポ
イソメラーゼＩＩＩの少なくとも９５％の活性を保持す
るフラグメント、誘導体およびアナログが好ましい。従
って、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性
成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク
質を包含する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例では、該ポリペプチ
ドは組換えポリペプチドである。
【００４３】図２（配列番号：２）のポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１また
はそれ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸
残基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換された
もので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコー
ドされたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）
１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、
または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例え
ばポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリ
エチレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）
付加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟
ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用い
られる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであ
ってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナロ
グは本明細書の教示より当業者であれば得られると考え
られる。
ラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１また
はそれ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸
残基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換された
もので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコー
ドされたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）
１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、
または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例え
ばポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリ
エチレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）
付加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟
ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用い
られる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであ
ってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナロ
グは本明細書の教示より当業者であれば得られると考え
られる。
【００４４】この点において、本発明の特に好ましい具
体例には、図２（配列番号：２）のストレプトコッカス
・トポイソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体がある。好ましい変種には、保存的アミノ酸置換
により対照標準と異なる変種がある。かかる置換は、ポ
リペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミ
ノ酸で置換したものである。典型的には、保存的置換と
して認められるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、
ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換え；ヒドロキシ
ル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐおよ
びＧｌｕの取り替え、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間
での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの取り替えお
よび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置き換えである。
体例には、図２（配列番号：２）のストレプトコッカス
・トポイソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体がある。好ましい変種には、保存的アミノ酸置換
により対照標準と異なる変種がある。かかる置換は、ポ
リペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミ
ノ酸で置換したものである。典型的には、保存的置換と
して認められるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、
ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換え；ヒドロキシ
ル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐおよ
びＧｌｕの取り替え、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間
での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの取り替えお
よび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置き換えである。
【００４５】この点においてさらに好ましいのは、数
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図２（配列番号：２）のトポイソメ
ラーゼＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列を有する、変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそ
のフラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
これらの中でもとりわけ好ましいのは、トポイソメラー
ゼＩＩＩの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。またこの点において特に好
ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは、置
換していない図２（配列番号：２）のアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好まし
く、均質になるまで精製するのが好ましい。
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図２（配列番号：２）のトポイソメ
ラーゼＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列を有する、変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそ
のフラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
これらの中でもとりわけ好ましいのは、トポイソメラー
ゼＩＩＩの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。またこの点において特に好
ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは、置
換していない図２（配列番号：２）のアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好まし
く、均質になるまで精製するのが好ましい。
【００４６】本発明のポリペプチドは、図２（配列番
号：２）のポリペプチド、特に成熟ポリペプチド、なら
びに図２（配列番号：２）のポリペプチドに対して少な
くとも８０％の同一性を有するポリペプチド、好ましく
は図２（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なく
とも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０
％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９５％の類
似性を有するポリペプチド、なおさらに好ましくは図２
（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９
５％の同一性を有するポリペプチドを包含し、また一般
に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少な
くとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのその
ような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包含
する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分
は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチド
を製造するのに用いることができる；従って、該フラグ
メントは完全長のポリペプチドを製造するための中間体
として用いることができる。本発明のポリヌクレオチド
のフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長のポ
リヌクレオチドを合成することができる。
号：２）のポリペプチド、特に成熟ポリペプチド、なら
びに図２（配列番号：２）のポリペプチドに対して少な
くとも８０％の同一性を有するポリペプチド、好ましく
は図２（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なく
とも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０
％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９５％の類
似性を有するポリペプチド、なおさらに好ましくは図２
（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９
５％の同一性を有するポリペプチドを包含し、また一般
に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少な
くとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのその
ような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包含
する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分
は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチド
を製造するのに用いることができる；従って、該フラグ
メントは完全長のポリペプチドを製造するための中間体
として用いることができる。本発明のポリヌクレオチド
のフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長のポ
リヌクレオチドを合成することができる。
【００４７】フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、トポイソ
メラーゼＩＩＩのフラグメント、特に図２（配列番号：
２）に示すアミノ酸を有するトポイソメラーゼＩＩＩの
フラグメント、および図２（配列番号：２）のトポイソ
メラーゼＩＩＩの変種および誘導体のフラグメントを有
してなるポリペプチドがある。この点において、フラグ
メントは前記のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドお
よびその変種または誘導体のアミノ酸配列が、全てでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
メラーゼＩＩＩのフラグメント、特に図２（配列番号：
２）に示すアミノ酸を有するトポイソメラーゼＩＩＩの
フラグメント、および図２（配列番号：２）のトポイソ
メラーゼＩＩＩの変種および誘導体のフラグメントを有
してなるポリペプチドがある。この点において、フラグ
メントは前記のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドお
よびその変種または誘導体のアミノ酸配列が、全てでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
【００４８】かかるフラグメントは、「自立してい
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、トポイソメラーゼＩＩＩフラグメントのアミノ末端
に融合した異型のプレおよびプロポリペプチド領域、お
よび該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加
領域を有し、宿主中に発現するように設計された前駆体
ポリペプチド内に含まれる本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本
明細書の意図するところの一の態様におけるフラグメン
トは、トポイソメラーゼＩＩＩ由来の融合ポリペプチド
または融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を意味
する。
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、トポイソメラーゼＩＩＩフラグメントのアミノ末端
に融合した異型のプレおよびプロポリペプチド領域、お
よび該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加
領域を有し、宿主中に発現するように設計された前駆体
ポリペプチド内に含まれる本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本
明細書の意図するところの一の態様におけるフラグメン
トは、トポイソメラーゼＩＩＩ由来の融合ポリペプチド
または融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を意味
する。
【００４９】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
例として、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４
０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９
０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１０
０〜１２５および１１０〜１４０のアミノ酸の長さを有
するポリヌクレオチドフラグメントが挙げられる。これ
に関して、「約」は、特に、言及した範囲、およびどち
らかの末端または両方の末端で数個、わずかな、５、
４、３、２または１個のアミノ酸が多いまたは少ない範
囲を包含する。
例として、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４
０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９
０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１０
０〜１２５および１１０〜１４０のアミノ酸の長さを有
するポリヌクレオチドフラグメントが挙げられる。これ
に関して、「約」は、特に、言及した範囲、およびどち
らかの末端または両方の末端で数個、わずかな、５、
４、３、２または１個のアミノ酸が多いまたは少ない範
囲を包含する。
【００５０】本発明の特に好ましいフラグメントには、
トポイソメラーゼＩＩＩの切断突然変異体がある。切断
突然変異体は、アミノ末端を含む残基の一連の残基（す
なわち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキ
シル末端を含む一連の残基の欠失、または二重切断突然
変異体のように一つはアミノ末端を含み、一つはカルボ
キシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除
けば、図２（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、またはその変種も
しくは誘導体を包含する。前記した大きさの範囲のフラ
グメントもまた切断フラグメントの好ましい具体例であ
り、一般に、フラグメントの中でも特に好ましい。宿主
細胞における本発明のポリヌクレオチドの減成形態もま
た好ましい。
トポイソメラーゼＩＩＩの切断突然変異体がある。切断
突然変異体は、アミノ末端を含む残基の一連の残基（す
なわち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキ
シル末端を含む一連の残基の欠失、または二重切断突然
変異体のように一つはアミノ末端を含み、一つはカルボ
キシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除
けば、図２（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、またはその変種も
しくは誘導体を包含する。前記した大きさの範囲のフラ
グメントもまた切断フラグメントの好ましい具体例であ
り、一般に、フラグメントの中でも特に好ましい。宿主
細胞における本発明のポリヌクレオチドの減成形態もま
た好ましい。
【００５１】また本発明のこの態様にて、トポイソメラ
ーゼＩＩＩの構造的または機能的属性により特徴づけら
れるフラグメントも好ましい。この点において本発明の
好ましい具体例は、トポイソメラーゼＩＩＩのアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域
（「アルファー領域」）、ベータシートおよびベータシ
ート形成領域（「ベータ領域」）、ターンおよびターン
形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル領域」）、親水領域、疎水領域、アルフ
ァー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界
面形成領域および高抗原指数領域からなるフラグメント
を包含する。
ーゼＩＩＩの構造的または機能的属性により特徴づけら
れるフラグメントも好ましい。この点において本発明の
好ましい具体例は、トポイソメラーゼＩＩＩのアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域
（「アルファー領域」）、ベータシートおよびベータシ
ート形成領域（「ベータ領域」）、ターンおよびターン
形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル領域」）、親水領域、疎水領域、アルフ
ァー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界
面形成領域および高抗原指数領域からなるフラグメント
を包含する。
【００５２】さらに好ましい領域は、トポイソメラーゼ
ＩＩＩの活性を媒介する領域である。この点において、
類似活性もしくは改善された活性を有するもの、または
望ましくない活性を減じたフラグメントを含め、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの化学的、生物学的またはその他の活
性を有するフラグメントが最も好ましい。慣用的には、
周知方法にてフラグメントを生成し、ついで後記するよ
うな都合のよいアッセイにて、そのフラグメントの活性
を天然のトポイソメラーゼＩＩＩと比較する。この点に
おいて、配列もしくは位置または両方において、バシラ
ス・サチリス・トポイソメラーゼＩを包含する、図２
（配列番号：２）に示す関連ポリペプチドなどの関連ポ
リペプチドの活性な領域に対して相同である領域を有す
るフラグメントが非常に好ましい。この点において、特
に好ましいフラグメントには、前記した切断突然変異体
がある。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメント
は、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的である
フラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌ
クレオチドに関する。この点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記するような、好ましいフラグメント
に対応するポリヌクレオチドである。
ＩＩＩの活性を媒介する領域である。この点において、
類似活性もしくは改善された活性を有するもの、または
望ましくない活性を減じたフラグメントを含め、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの化学的、生物学的またはその他の活
性を有するフラグメントが最も好ましい。慣用的には、
周知方法にてフラグメントを生成し、ついで後記するよ
うな都合のよいアッセイにて、そのフラグメントの活性
を天然のトポイソメラーゼＩＩＩと比較する。この点に
おいて、配列もしくは位置または両方において、バシラ
ス・サチリス・トポイソメラーゼＩを包含する、図２
（配列番号：２）に示す関連ポリペプチドなどの関連ポ
リペプチドの活性な領域に対して相同である領域を有す
るフラグメントが非常に好ましい。この点において、特
に好ましいフラグメントには、前記した切断突然変異体
がある。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメント
は、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的である
フラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌ
クレオチドに関する。この点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記するような、好ましいフラグメント
に対応するポリヌクレオチドである。
【００５３】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは複数の
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
【００５４】宿主細胞内のポリヌクレオチド構築物を従
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
【００５５】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
【００５６】ある点において中でも好ましいベクター
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点におけるある好ましい具体例では、ベクタ
ーは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導
可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現
するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現
であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ま
しいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容
易である環境因子により発現を誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核お
よび真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現ベ
クターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されてい
る。
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点におけるある好ましい具体例では、ベクタ
ーは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導
可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現
するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現
であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ま
しいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容
易である環境因子により発現を誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核お
よび真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現ベ
クターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されてい
る。
【００５７】非常に多くの種類の発現ベクターを用い
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
【００５８】適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻
訳されるべきポリペプチドの終末部分に適当に位置する
終止コドンを含む。
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻
訳されるべきポリペプチドの終末部分に適当に位置する
終止コドンを含む。
【００５９】加えて、構築物は、発現を制御および誘起
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばストレプトコッカス（レンサ球菌）、スタフィロコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス（枯草菌）細
胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細
胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプ
テラＳf９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈe
Ｌa、Ｃ１２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェ
ス（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばストレプトコッカス（レンサ球菌）、スタフィロコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス（枯草菌）細
胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細
胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプ
テラＳf９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈe
Ｌa、Ｃ１２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェ
ス（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
【００６０】市販されている以下のベクターを例示とし
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
【００６１】制限部位または候補プロモーター（candid
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
【００６２】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
【００６３】本発明のポリペプチドの異種構造配列をコ
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、
開始コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位
および開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフ
レームは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端
に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構
築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転
写領域の３′末端に適宜配置される転写終止シグナルは
また、ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、
開始コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位
および開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフ
レームは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端
に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構
築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転
写領域の３′末端に適宜配置される転写終止シグナルは
また、ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。
【００６４】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加し、精製中またはその後の操
作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性
を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプ
チドに領域を付加することもできる。かかる領域はポリ
ペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部
分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出
を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にする
のは、当該分野でよくあることであり、慣用される技術
である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可
溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来す
る異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫
グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパ
ク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示す
る。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処
理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分
と融合させ、アンタゴニストを同定することができる。
D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8：
52-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal of Bi
ological Chemistry，270（16)：9459-9471（1995）を
参照のこと。
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加し、精製中またはその後の操
作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性
を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプ
チドに領域を付加することもできる。かかる領域はポリ
ペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部
分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出
を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にする
のは、当該分野でよくあることであり、慣用される技術
である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可
溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来す
る異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫
グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパ
ク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示す
る。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処
理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分
と融合させ、アンタゴニストを同定することができる。
D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8：
52-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal of Bi
ological Chemistry，270（16)：9459-9471（1995）を
参照のこと。
【００６５】ついで、典型的には、細胞を遠心分離によ
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。
【００６６】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’隣接非転写配列を有
していてもよい。この点におけるある好ましい具体例で
は、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位由来のＤＮＡ配列は、これらの型の必要とされ
る非転写遺伝的エレメントに用いられる。トポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、
周知方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製で
きる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離
および／または精製中に変性する場合、再び活性なコン
ホメーションを得るために、タンパク質を再生するため
の周知の技術を用いることができる。
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’隣接非転写配列を有
していてもよい。この点におけるある好ましい具体例で
は、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位由来のＤＮＡ配列は、これらの型の必要とされ
る非転写遺伝的エレメントに用いられる。トポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、
周知方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製で
きる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離
および／または精製中に変性する場合、再び活性なコン
ホメーションを得るために、タンパク質を再生するため
の周知の技術を用いることができる。
【００６７】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、化学合成法の産物および組換え技法により原核
または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞から製造した産物を包含する。組
換え産生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドは糖鎖形成されてもいてもまたはされていなく
てもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、ある
場合は宿主媒介工程の結果として、開始修飾メチオニン
残基をも含んでいてもよい。トポイソメラーゼＩＩＩポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って
種々の用途、特にトポイソメラーゼＩＩＩの化学的およ
び生物学的特性を利用する用途に使用することができ
る。さらなる用途は、細胞、組織および生物の障害の診
断および治療に関する。本発明のこれらの態様を、以下
においてさらに説明する。
た産物、化学合成法の産物および組換え技法により原核
または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞から製造した産物を包含する。組
換え産生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドは糖鎖形成されてもいてもまたはされていなく
てもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、ある
場合は宿主媒介工程の結果として、開始修飾メチオニン
残基をも含んでいてもよい。トポイソメラーゼＩＩＩポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って
種々の用途、特にトポイソメラーゼＩＩＩの化学的およ
び生物学的特性を利用する用途に使用することができ
る。さらなる用途は、細胞、組織および生物の障害の診
断および治療に関する。本発明のこれらの態様を、以下
においてさらに説明する。
【００６８】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのトポイソメラーゼＩＩＩポリ
ヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動
物、特にヒトにおいて細菌性トポイソメラーゼＩＩＩを
検出することにより、疾患の診断に加え、診断を限定
し、または診断を可能とする診断方法が得られるであろ
う。トポイソメラーゼＩＩＩ産生細菌に感染した真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）、特に哺乳
動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は個体の細胞お
よび組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から
入手できる。組織生検および剖検材もまた、診断アッセ
イに用いるための個体由来のサンプルとして好ましい。
細菌性ＤＮＡは検出に直接使用してもよく、または分析
前にＰＣＲを用いて酵素的に増幅させてもよい。ＰＣＲ
（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同様に用いることができる。一例と
して、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸に相補
的なＰＣＲプライマーを用いて、トポイソメラーゼＩＩ
Ｉの存在および発現を同定および分析できる。ＰＣＲを
用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する
原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析によ
り特徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺伝子型
と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および挿
入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射標
識したトポイソメラーゼＩＩＩＲＮＡに、また別法とし
て放射標識したトポイソメラーゼＩＩＩアンチセンス
ＤＮＡにハイブリダイゼーションすることにより同定で
きる。完全に対合する配列は、ＲＮaseＡ消化により、
または融解温度の差異により、誤対合二重らせんと区別
できる。
レオチドを検出するためのトポイソメラーゼＩＩＩポリ
ヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動
物、特にヒトにおいて細菌性トポイソメラーゼＩＩＩを
検出することにより、疾患の診断に加え、診断を限定
し、または診断を可能とする診断方法が得られるであろ
う。トポイソメラーゼＩＩＩ産生細菌に感染した真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）、特に哺乳
動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は個体の細胞お
よび組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から
入手できる。組織生検および剖検材もまた、診断アッセ
イに用いるための個体由来のサンプルとして好ましい。
細菌性ＤＮＡは検出に直接使用してもよく、または分析
前にＰＣＲを用いて酵素的に増幅させてもよい。ＰＣＲ
（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同様に用いることができる。一例と
して、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸に相補
的なＰＣＲプライマーを用いて、トポイソメラーゼＩＩ
Ｉの存在および発現を同定および分析できる。ＰＣＲを
用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する
原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析によ
り特徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺伝子型
と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および挿
入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射標
識したトポイソメラーゼＩＩＩＲＮＡに、また別法とし
て放射標識したトポイソメラーゼＩＩＩアンチセンス
ＤＮＡにハイブリダイゼーションすることにより同定で
きる。完全に対合する配列は、ＲＮaseＡ消化により、
または融解温度の差異により、誤対合二重らせんと区別
できる。
【００６９】対照標準の遺伝子および突然変異を有する
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく細菌の種々の株の
遺伝的タイピングは、変性剤を含むまたは含まないゲル
中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出する
ことにより達成できる。小さな配列の欠失および挿入は
高分解ゲル電気泳動により可視化できる。種々の配列の
ＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融
解温度によって、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が
ゲル中の異なる位置で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲ
ル上にて区別できる（例えば、Meyersら、Science，23
0:1242（1985）参照）。
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく細菌の種々の株の
遺伝的タイピングは、変性剤を含むまたは含まないゲル
中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出する
ことにより達成できる。小さな配列の欠失および挿入は
高分解ゲル電気泳動により可視化できる。種々の配列の
ＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融
解温度によって、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が
ゲル中の異なる位置で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲ
ル上にて区別できる（例えば、Meyersら、Science，23
0:1242（1985）参照）。
【００７０】特異的な位置での配列の変化はまた、ＲＮ
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッテ
ィングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッテ
ィングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
【００７１】本発明の遺伝子の突然変異または多形型を
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもでき
る。診断用の核酸は、限定されるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検材を含む、感染した
個体の細胞から、または上記した供給源より単離または
培養した細菌から得ることもできる。細菌性ＤＮＡを直
接的に検出するのに用いてもよく、または分析前にＰＣ
Ｒ（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））を用いて
酵素的に増幅させてもよい。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変
異を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例え
ば、ＧeneＳcanなどの自動検出系と組み合わせて用いる
のが特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目
的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。
一例として、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸
に相補的なＰＣＲプライマーを公知方法を用いて製造
し、突然変異を同定および分析するのに用いる。例え
ば、欠失および挿入を、正常の遺伝子型との比較におい
て、増幅産物の大きさの変化により検出できる。点突然
変異は放射標識したＲＮＡ、また別法として放射標識し
たアンチセンスＤＮＡ配列に増幅したＤＮＡをハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
した配列は、ＲＮaseＡ消化により、または融解温度の
差により、誤対合二重らせんと区別できる。これらのプ
ライマーは個体由来のサンプルから単離したトポイソメ
ラーゼＩＩＩｃＤＮＡを増幅させるのに用いることがで
きる。本発明はまた、その５′および／または３′末端
から除去した１、２、３または４個のヌクレオチドを有
するプライマーも提供する。該プライマーを用いて個体
から単離した遺伝子を増幅させ、ついでその遺伝子をＤ
ＮＡ配列を明らかにするための種々の技法に供してもよ
い。このようにして、ＤＮＡ配列における突然変異を検
出してもよい。
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもでき
る。診断用の核酸は、限定されるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検材を含む、感染した
個体の細胞から、または上記した供給源より単離または
培養した細菌から得ることもできる。細菌性ＤＮＡを直
接的に検出するのに用いてもよく、または分析前にＰＣ
Ｒ（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））を用いて
酵素的に増幅させてもよい。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変
異を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例え
ば、ＧeneＳcanなどの自動検出系と組み合わせて用いる
のが特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目
的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。
一例として、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸
に相補的なＰＣＲプライマーを公知方法を用いて製造
し、突然変異を同定および分析するのに用いる。例え
ば、欠失および挿入を、正常の遺伝子型との比較におい
て、増幅産物の大きさの変化により検出できる。点突然
変異は放射標識したＲＮＡ、また別法として放射標識し
たアンチセンスＤＮＡ配列に増幅したＤＮＡをハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
した配列は、ＲＮaseＡ消化により、または融解温度の
差により、誤対合二重らせんと区別できる。これらのプ
ライマーは個体由来のサンプルから単離したトポイソメ
ラーゼＩＩＩｃＤＮＡを増幅させるのに用いることがで
きる。本発明はまた、その５′および／または３′末端
から除去した１、２、３または４個のヌクレオチドを有
するプライマーも提供する。該プライマーを用いて個体
から単離した遺伝子を増幅させ、ついでその遺伝子をＤ
ＮＡ配列を明らかにするための種々の技法に供してもよ
い。このようにして、ＤＮＡ配列における突然変異を検
出してもよい。
【００７２】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、
細胞および組織中のトポイソメラーゼＩＩＩのレベルを
検出するための定量および診断アッセイなどの診断アッ
セイに関する。このように、例えば、正常な対照標準の
組織サンプルと比較し、トポイソメラーゼＩＩＩタンパ
ク質の発現を検出することについて本発明に係る診断ア
ッセイを用いて、感染の存在を検出することができる。
宿主由来のサンプル中の本発明のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉタンパク質などのタンパク質のレベルを測定するため
に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ
る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好まし
い。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、トポイソメラーゼＩ
ＩＩに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製する。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合
するリポーター抗体が調製される。リポーター抗体は放
射活性、蛍光または酵素試薬、この例においては西洋ワ
サビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬に結合す
る。
細胞および組織中のトポイソメラーゼＩＩＩのレベルを
検出するための定量および診断アッセイなどの診断アッ
セイに関する。このように、例えば、正常な対照標準の
組織サンプルと比較し、トポイソメラーゼＩＩＩタンパ
ク質の発現を検出することについて本発明に係る診断ア
ッセイを用いて、感染の存在を検出することができる。
宿主由来のサンプル中の本発明のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉタンパク質などのタンパク質のレベルを測定するため
に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ
る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好まし
い。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、トポイソメラーゼＩ
ＩＩに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製する。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合
するリポーター抗体が調製される。リポーター抗体は放
射活性、蛍光または酵素試薬、この例においては西洋ワ
サビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬に結合す
る。
【００７３】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
【００７４】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。
【００７５】別法として、ファージディスプレイ技術を
利用して、抗Ｆｂｐの保持に関してスクリーニングした
ヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパ
ートリー由来の、または未処理のライブラリー由来のポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択
することができる（McCafferty,J.ら、Nature 348：552
-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10：779-78
3（1992））。これらの抗体の親和性は、チェーンシャ
フリング（chain shuffling）（Clackson,T.ら、Nature
352：624-628（1991））により改善することもでき
る。２つの抗原結合ドメインがあるならば、各ドメイン
を、「二特異的」抗体と称される、異なるエピトープに
向けることができる。
利用して、抗Ｆｂｐの保持に関してスクリーニングした
ヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパ
ートリー由来の、または未処理のライブラリー由来のポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択
することができる（McCafferty,J.ら、Nature 348：552
-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10：779-78
3（1992））。これらの抗体の親和性は、チェーンシャ
フリング（chain shuffling）（Clackson,T.ら、Nature
352：624-628（1991））により改善することもでき
る。２つの抗原結合ドメインがあるならば、各ドメイン
を、「二特異的」抗体と称される、異なるエピトープに
向けることができる。
【００７６】前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチ
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けトポイソメラーゼＩＩＩに対する抗体を用いて、感
染、特に細菌感染、特にストレプトコッカス感染を阻害
および／または治療し、ならびに抗生物質治療の効能を
モニターすることができる。
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けトポイソメラーゼＩＩＩに対する抗体を用いて、感
染、特に細菌感染、特にストレプトコッカス感染を阻害
および／または治療し、ならびに抗生物質治療の効能を
モニターすることができる。
【００７７】ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
【００７８】ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
【００７９】抗体またはその誘導体を修飾して、個体に
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。
【００８０】本発明のポリヌクレオチドを遺伝的免疫に
使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの
筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（19
92）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264：16985（1989））、リ
ン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Res
hef、Proc.Nat'l.Acad.Sci.（USA）83：9551（198
6））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（Kan
edaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tan
gら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Ce
ll Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロウ
イルスを用いたインビボ感染（Seegerら、Proc.Nat'l.A
cad.Sci. （USA）81：5849（1984））などの適当な送達
方法を用いる。
使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの
筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（19
92）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264：16985（1989））、リ
ン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Res
hef、Proc.Nat'l.Acad.Sci.（USA）83：9551（198
6））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（Kan
edaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tan
gら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Ce
ll Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロウ
イルスを用いたインビボ感染（Seegerら、Proc.Nat'l.A
cad.Sci. （USA）81：5849（1984））などの適当な送達
方法を用いる。
【００８１】トポイソメラーゼＩＩＩ結合分子およびア
ッセイ 本発明はまた、トポイソメラーゼＩＩＩに結合する結合
分子などの分子の同定方法をも提供する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩに結合するタンパク質、例えば結合タンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、
例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング
より同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュア
ル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immuno
logy、1(2)：第5章（1991）に記載されている。例えば
発現クローニングをこの目的に用いることができる。こ
の目的のために、ポリアデニル化ＲＮＡをトポイソメラ
ーゼＩＩＩを発現する細胞から調製し、このＲＮＡから
ｃＤＮＡライブラリーを作り、ライブラリーをプールに
分割し、そのプールをトポイソメラーゼＩＩＩを発現し
ない細胞に個々にトランスフェクトする。ついで、トラ
ンスフェクトした細胞を標識したトポイソメラーゼＩＩ
Ｉに曝露する。トポイソメラーゼＩＩＩは、放射性ヨウ
素化または部位特異的タンパク質キナーゼ用の認識部位
の封入の標準法を包含する種々の周知の技術により標識
できる。曝露した後、細胞を固定し、トポイソメラーゼ
ＩＩＩの結合を測定する。これらの方法は、都合よく
は、ガラススライド上で実施する。
ッセイ 本発明はまた、トポイソメラーゼＩＩＩに結合する結合
分子などの分子の同定方法をも提供する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩに結合するタンパク質、例えば結合タンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、
例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング
より同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュア
ル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immuno
logy、1(2)：第5章（1991）に記載されている。例えば
発現クローニングをこの目的に用いることができる。こ
の目的のために、ポリアデニル化ＲＮＡをトポイソメラ
ーゼＩＩＩを発現する細胞から調製し、このＲＮＡから
ｃＤＮＡライブラリーを作り、ライブラリーをプールに
分割し、そのプールをトポイソメラーゼＩＩＩを発現し
ない細胞に個々にトランスフェクトする。ついで、トラ
ンスフェクトした細胞を標識したトポイソメラーゼＩＩ
Ｉに曝露する。トポイソメラーゼＩＩＩは、放射性ヨウ
素化または部位特異的タンパク質キナーゼ用の認識部位
の封入の標準法を包含する種々の周知の技術により標識
できる。曝露した後、細胞を固定し、トポイソメラーゼ
ＩＩＩの結合を測定する。これらの方法は、都合よく
は、ガラススライド上で実施する。
【００８２】トポイソメラーゼＩＩＩ結合細胞を生成す
るｃＤＮＡのプールを同定する。これらの陽性体からサ
ブプールを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、前
記のとおりスクリーニングする。サブプール化および再
スクリーニング法を繰り返し、結合分子などの推定され
る結合分子をコードする１またはそれ以上の単クローン
を単離できる。別法として、標識リガンドを、結合分子
のごときそれが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和的に連
結させることができる。架橋した物質をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離し、Ｘ線
フィルムに曝露する。リガンド結合を含有する標識複合
体を切除し、ペプチドフラグメントに分解し、タンパク
質マイクロシーケンシングに供することができる。マイ
クロシーケンシングにより得られたアミノ酸配列を用い
て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
独特なまたは同義性オリゴヌクレオチドプローブを設計
し、推定される結合分子をコードする遺伝子を同定する
ことができる。また、本発明のポリペプチドを用いて、
細胞中、または無細胞調製物中の、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ結合分子、例えば結合分子のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合能力を評価することができる。本発明のポリペプ
チドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ラ
イブラリー、および天然の生成物混合物中の小型分子基
質とリガンドとの結合を評価することもできる。
るｃＤＮＡのプールを同定する。これらの陽性体からサ
ブプールを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、前
記のとおりスクリーニングする。サブプール化および再
スクリーニング法を繰り返し、結合分子などの推定され
る結合分子をコードする１またはそれ以上の単クローン
を単離できる。別法として、標識リガンドを、結合分子
のごときそれが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和的に連
結させることができる。架橋した物質をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離し、Ｘ線
フィルムに曝露する。リガンド結合を含有する標識複合
体を切除し、ペプチドフラグメントに分解し、タンパク
質マイクロシーケンシングに供することができる。マイ
クロシーケンシングにより得られたアミノ酸配列を用い
て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
独特なまたは同義性オリゴヌクレオチドプローブを設計
し、推定される結合分子をコードする遺伝子を同定する
ことができる。また、本発明のポリペプチドを用いて、
細胞中、または無細胞調製物中の、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ結合分子、例えば結合分子のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合能力を評価することができる。本発明のポリペプ
チドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ラ
イブラリー、および天然の生成物混合物中の小型分子基
質とリガンドとの結合を評価することもできる。
【００８３】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 前記したように、DNA密度の増加および減少は、環境攻
撃に対する細菌応答に関連している。従って、調節する
こと、すなわち、作動または拮抗することで、適当な応
答が潜在的抗生物質効果をもたらしうる。本発明はま
た、細胞上のトポイソメラーゼＩＩＩの作用、例えば、
スーパーコイル化DNAなどの基質分子との相互作用を亢
進または遮断する化合物を同定するためのスクリーニン
グ方法をも提供する。細胞でのトポイソメラーゼＩＩＩ
の作用を遮断する化合物は、毒として作用し、ＤＮＡと
の共有結合性複合体にてトポイソメラーゼＩＩＩを安定
化し、細胞成長において阻害効果をもたらす、化合物を
包含する。アンタゴニストはトポイソメラーゼＩＩＩの
天然の生物学的機能を低下させる化合物である。アゴニ
ストはトポイソメラーゼＩＩＩの天然の生物学的機能を
増強する化合物である。
イおよび分子 前記したように、DNA密度の増加および減少は、環境攻
撃に対する細菌応答に関連している。従って、調節する
こと、すなわち、作動または拮抗することで、適当な応
答が潜在的抗生物質効果をもたらしうる。本発明はま
た、細胞上のトポイソメラーゼＩＩＩの作用、例えば、
スーパーコイル化DNAなどの基質分子との相互作用を亢
進または遮断する化合物を同定するためのスクリーニン
グ方法をも提供する。細胞でのトポイソメラーゼＩＩＩ
の作用を遮断する化合物は、毒として作用し、ＤＮＡと
の共有結合性複合体にてトポイソメラーゼＩＩＩを安定
化し、細胞成長において阻害効果をもたらす、化合物を
包含する。アンタゴニストはトポイソメラーゼＩＩＩの
天然の生物学的機能を低下させる化合物である。アゴニ
ストはトポイソメラーゼＩＩＩの天然の生物学的機能を
増強する化合物である。
【００８４】Ｂarrettら、Antimicrob.Ａgents.Ｃhemot
her. 34：1（1990）は、トポイソメラーゼの阻害を測定
するのに用いることのできるインビトロアッセイを報告
する。これらのアッセイは触媒アッセイと非触媒アッセ
イに分類できる。細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ用の触
媒アッセイは、例えば、スーパーコイル化ＤＮＡの弛緩
を測定するためのアッセイを包含する。「切断複合体」
アッセイとしても知られている非触媒アッセイは、重要
な共有結合性反応中間体の形成を測定するものである。
Ｆroelich−ＡmmonおよびＯsheroff Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 2
70：21429（1995）はトポイソメラーゼ毒の非触媒アッ
セイの機構的原理を開示している。
her. 34：1（1990）は、トポイソメラーゼの阻害を測定
するのに用いることのできるインビトロアッセイを報告
する。これらのアッセイは触媒アッセイと非触媒アッセ
イに分類できる。細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ用の触
媒アッセイは、例えば、スーパーコイル化ＤＮＡの弛緩
を測定するためのアッセイを包含する。「切断複合体」
アッセイとしても知られている非触媒アッセイは、重要
な共有結合性反応中間体の形成を測定するものである。
Ｆroelich−ＡmmonおよびＯsheroff Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 2
70：21429（1995）はトポイソメラーゼ毒の非触媒アッ
セイの機構的原理を開示している。
【００８５】スーパーコイル化ＤＮＡ弛緩アッセイ 弛緩反応の阻害剤についてスクリーニングするために、
候補の阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
を、Ｍg2+または別の二価金属イオン含有の適当な緩衝
液中、スーパーコイル化ＤＮＡ基質、例えば、プラスミ
ドまたはファージＤＮＡと一緒にインキュベートする。
反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭
化エチジウム染色により可視化し、密度計により定量す
る。
候補の阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
を、Ｍg2+または別の二価金属イオン含有の適当な緩衝
液中、スーパーコイル化ＤＮＡ基質、例えば、プラスミ
ドまたはファージＤＮＡと一緒にインキュベートする。
反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭
化エチジウム染色により可視化し、密度計により定量す
る。
【００８６】ＤＮＡオリゴマー切断アッセイ 適当な切断部位、例えば２２量体、ＧＡＡＴＧＡＧＣＣ
ＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴ（配列番号：３）を含有す
る一本鎖ＤＮＡオリゴマーまたは適宜標識した誘導体を
基質として用いる。適当な標識は、使用する個々のアッ
セイに従って、オリゴの５′または３’末端で結合した
放射標識または蛍光発色団である。基質を適当な緩衝液
中、候補阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
と共にインキュベートする。緩衝液はＭg2+または別の
二価金属イオンを含有してもよい。Ｍg2+は切断反応に
必須ではないが、それを含んでいることがある種の阻害
剤の相互反応を促進するのに望ましい。反応を適当な変
性剤、例えば１％ＳＤＳまたは１００ｍＭ ＮａＯＨを
添加することで停止させる。切断可能な複合体の形成
（重要な共有結合性反応の中間体の安定化）は、多くの
方法により測定することができる。例えば、変性ポリア
クリルアミドゲルを用いる電気泳動を使用して、５′標
識化切断ＤＮＡ産物を分離し、それを密度計により定量
することのできるする。また、３’標識化ＤＮＡ産物を
トポイソメラーゼＩＩＩとの共有結合により検定しても
よい。これは、沈殿タンパク質に伴う放射標識したＤＮ
Ａを測定する、ＳＤＳ／Ｋ沈殿アッセイにより、または
トポイソメラーゼＩＩＩを抗体を用いて固定する、捕獲
アッセイフォーマットにより行い、結合した標識ＤＮＡ
の量を測定することができる。
ＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴ（配列番号：３）を含有す
る一本鎖ＤＮＡオリゴマーまたは適宜標識した誘導体を
基質として用いる。適当な標識は、使用する個々のアッ
セイに従って、オリゴの５′または３’末端で結合した
放射標識または蛍光発色団である。基質を適当な緩衝液
中、候補阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
と共にインキュベートする。緩衝液はＭg2+または別の
二価金属イオンを含有してもよい。Ｍg2+は切断反応に
必須ではないが、それを含んでいることがある種の阻害
剤の相互反応を促進するのに望ましい。反応を適当な変
性剤、例えば１％ＳＤＳまたは１００ｍＭ ＮａＯＨを
添加することで停止させる。切断可能な複合体の形成
（重要な共有結合性反応の中間体の安定化）は、多くの
方法により測定することができる。例えば、変性ポリア
クリルアミドゲルを用いる電気泳動を使用して、５′標
識化切断ＤＮＡ産物を分離し、それを密度計により定量
することのできるする。また、３’標識化ＤＮＡ産物を
トポイソメラーゼＩＩＩとの共有結合により検定しても
よい。これは、沈殿タンパク質に伴う放射標識したＤＮ
Ａを測定する、ＳＤＳ／Ｋ沈殿アッセイにより、または
トポイソメラーゼＩＩＩを抗体を用いて固定する、捕獲
アッセイフォーマットにより行い、結合した標識ＤＮＡ
の量を測定することができる。
【００８７】全細胞アッセイ 潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストならびに毒の
トポイソメラーゼＩＩＩ様効果は、例えば、候補分子と
細胞または適当な細胞調製物との相互作用の後の遺伝子
発現における変化に感受的なリポーターステムの活性を
決定することにより測定できる。この点において有用な
リポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基
質、トポイソメラーゼＩＩＩ活性の変化に応答するリポ
ーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを
包含するが、これらに限定するものではない。
トポイソメラーゼＩＩＩ様効果は、例えば、候補分子と
細胞または適当な細胞調製物との相互作用の後の遺伝子
発現における変化に感受的なリポーターステムの活性を
決定することにより測定できる。この点において有用な
リポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基
質、トポイソメラーゼＩＩＩ活性の変化に応答するリポ
ーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを
包含するが、これらに限定するものではない。
【００８８】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
滅させるか、またはＤＮＡとの重要な共有結合性反応中
間体を安定化する、小型有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはま
た、トポイソメラーゼＩＩＩ誘導活性を誘発することな
く、結合分子などの結合分子の同一の部位に結合する、
密接に関連したタンパク質または抗体などの小型有機分
子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、それによ
りトポイソメラーゼＩＩＩを結合から排除してトポイソ
メラーゼＩＩＩの作用を妨げる。潜在的アンタゴニスト
は、ポリペプチドの結合部位に結合し、その結合部位を
占領し、それにより結合分子などの細胞性結合分子への
結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる、小型分子を
包含する。小型分子としては、例えば、小型有機分子、
ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに
限定するものではない。
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
滅させるか、またはＤＮＡとの重要な共有結合性反応中
間体を安定化する、小型有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはま
た、トポイソメラーゼＩＩＩ誘導活性を誘発することな
く、結合分子などの結合分子の同一の部位に結合する、
密接に関連したタンパク質または抗体などの小型有機分
子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、それによ
りトポイソメラーゼＩＩＩを結合から排除してトポイソ
メラーゼＩＩＩの作用を妨げる。潜在的アンタゴニスト
は、ポリペプチドの結合部位に結合し、その結合部位を
占領し、それにより結合分子などの細胞性結合分子への
結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる、小型分子を
包含する。小型分子としては、例えば、小型有機分子、
ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに
限定するものではない。
【００８９】その他の潜在的なアンタゴニストはアンチ
センス分子を包含する。アンチセンス技術を用いて、ア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または二重も
しくは三重らせん形成により遺伝子発現を調節すること
ができる。アンチセンス技術については、例えばOkano,
J.、Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，Ｃ
ＲＣプレス、ＢocaＲaton、フロリダ（1988）に記載さ
れている。三重らせん形成については、例えば、Lee
ら、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；Cooney
ら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Scie
nce 251：1360（1991）に記載されている。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの
結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの５′コーディング部
分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であるように設計され、それによりトポイソ
メラーゼＩＩＩの転写および生成が妨げられる。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡ
にハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のトポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドへの翻訳を遮断する。前記
のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され、アンチ
センスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボで発現し、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの生成を阻害することもできる。
センス分子を包含する。アンチセンス技術を用いて、ア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または二重も
しくは三重らせん形成により遺伝子発現を調節すること
ができる。アンチセンス技術については、例えばOkano,
J.、Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，Ｃ
ＲＣプレス、ＢocaＲaton、フロリダ（1988）に記載さ
れている。三重らせん形成については、例えば、Lee
ら、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；Cooney
ら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Scie
nce 251：1360（1991）に記載されている。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの
結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの５′コーディング部
分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であるように設計され、それによりトポイソ
メラーゼＩＩＩの転写および生成が妨げられる。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡ
にハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のトポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドへの翻訳を遮断する。前記
のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され、アンチ
センスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボで発現し、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの生成を阻害することもできる。
【００９０】好ましい潜在的アンタゴニストは、本明細
書で提供する各々のＤＮＡ配列が、抗細菌化合物の発見
および開発に用いられる化合物およびその誘導体を包含
する。発現でコードされたタンパク質は、抗菌剤のスク
リーニングのための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質またはShine-Delgarnoの
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列または他の個々
のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコー
ディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築
することがきる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニ
ストは、例えば以下に記載するような、医薬上許容でき
る担体と共に組成物として用いることができる。このア
ンタゴニストおよびアゴニストを用いて、ストレプトコ
ッカス感染を阻害することができる。
書で提供する各々のＤＮＡ配列が、抗細菌化合物の発見
および開発に用いられる化合物およびその誘導体を包含
する。発現でコードされたタンパク質は、抗菌剤のスク
リーニングのための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質またはShine-Delgarnoの
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列または他の個々
のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコー
ディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築
することがきる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニ
ストは、例えば以下に記載するような、医薬上許容でき
る担体と共に組成物として用いることができる。このア
ンタゴニストおよびアゴニストを用いて、ストレプトコ
ッカス感染を阻害することができる。
【００９１】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なトポイソメラーゼＩＩＩ、またはその抗原性フラ
グメントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、
特に細菌感染、とりわけストレプトコッカス感染から保
護することからなる方法に関する。本発明のまた別の態
様は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、
遺伝子治療により免疫学的応答を誘発させるためにトポ
イソメラーゼＩＩＩまたはそのフラグメントもしくは変
種をインビボで発現させるのにトポイソメラーゼＩＩＩ
またはその抗原性フラグメントもしくは変種をコードす
る遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から保
護する方法に関する。
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なトポイソメラーゼＩＩＩ、またはその抗原性フラ
グメントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、
特に細菌感染、とりわけストレプトコッカス感染から保
護することからなる方法に関する。本発明のまた別の態
様は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、
遺伝子治療により免疫学的応答を誘発させるためにトポ
イソメラーゼＩＩＩまたはそのフラグメントもしくは変
種をインビボで発現させるのにトポイソメラーゼＩＩＩ
またはその抗原性フラグメントもしくは変種をコードす
る遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から保
護する方法に関する。
【００９２】本発明のさらなる態様は、免疫学的応答を
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、そのような宿主中でトポイソメラーゼＩＩＩまたは
それによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応
答を誘起する免疫学的組成物であって、該トポイソメラ
ーゼＩＩＩの抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそ
れによりコードされるタンパク質を含んでなる、組換え
トポイソメラーゼＩＩＩまたはそれによりコードされる
タンパク質を有してなる組成物に関する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩまたはそのフラグメントは、それ自身は抗体
を産生しないが、第１のタンパク質を安定化し、免疫原
性があり防御特性を有する融合タンパク質を形成するこ
とができる補タンパク質（co-protein）と融合できる。
このように融合した組換えタンパク質は、好ましくはさ
らに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシ
ダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成および精製を
容易にする比較的大きな補タンパク質を有してなる。さ
らには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激を提供する
という意味で、アジュバントとして作用し得る。補タン
パク質は第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル
末端のいずれに結合してもよい。
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、そのような宿主中でトポイソメラーゼＩＩＩまたは
それによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応
答を誘起する免疫学的組成物であって、該トポイソメラ
ーゼＩＩＩの抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそ
れによりコードされるタンパク質を含んでなる、組換え
トポイソメラーゼＩＩＩまたはそれによりコードされる
タンパク質を有してなる組成物に関する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩまたはそのフラグメントは、それ自身は抗体
を産生しないが、第１のタンパク質を安定化し、免疫原
性があり防御特性を有する融合タンパク質を形成するこ
とができる補タンパク質（co-protein）と融合できる。
このように融合した組換えタンパク質は、好ましくはさ
らに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシ
ダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成および精製を
容易にする比較的大きな補タンパク質を有してなる。さ
らには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激を提供する
という意味で、アジュバントとして作用し得る。補タン
パク質は第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル
末端のいずれに結合してもよい。
【００９３】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のトポイソメラーゼＩＩＩに関して
記載されているが、これは天然のタンパク質および、実
質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付
加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグ
メント（例えば、５０％またはそれ以上の配列相同性を
有する）を包含することが理解されよう。
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のトポイソメラーゼＩＩＩに関して
記載されているが、これは天然のタンパク質および、実
質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付
加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグ
メント（例えば、５０％またはそれ以上の配列相同性を
有する）を包含することが理解されよう。
【００９４】組成物 本発明はまた前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
【００９５】キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を１ま
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
【００９６】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまた
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
【００９７】治療において、または予防用に、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
【００９８】哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
【００９９】本発明の組成物を注射により投与し、内在
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、ストレプトコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、ストレプトコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
【０１００】前記の治療に加え、本発明の組成物は、一
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、トポイソメラーゼを含有する
細菌の存在を検出するための診断試薬として使用でき
る。本明細書に開示されている文献を、出典明示により
その全内容を本明細書の一部とする。本願が先に請求す
るいずれの親出願も出典明示によりその全内容を本明細
書の一部とする。以下の実施例を容易に理解するため
に、特定の汎用する方法および／または用語を記載す
る。
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、トポイソメラーゼを含有する
細菌の存在を検出するための診断試薬として使用でき
る。本明細書に開示されている文献を、出典明示により
その全内容を本明細書の一部とする。本願が先に請求す
るいずれの親出願も出典明示によりその全内容を本明細
書の一部とする。以下の実施例を容易に理解するため
に、特定の汎用する方法および／または用語を記載す
る。
【０１０１】
【実施例】本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく
説明する。実施例は単に具体的な態様に対する参考とし
て本発明を説明するために提供するものである。これら
の例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するもので
あり、本発明に開示する範囲を限定または規定するもの
ではない。本明細書で用いる特定の用語は前記した定義
で説明されている。全ての実施例は、別に詳細に記載す
るもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法を用い
て実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学的技術
は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laborat
ory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク州（1989）ような標準的な実験室マ
ニュアルに記載されるように実施できる。以下の実施例
で示す全ての部分または量は、特記しない限り、重量で
示す。
説明する。実施例は単に具体的な態様に対する参考とし
て本発明を説明するために提供するものである。これら
の例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するもので
あり、本発明に開示する範囲を限定または規定するもの
ではない。本明細書で用いる特定の用語は前記した定義
で説明されている。全ての実施例は、別に詳細に記載す
るもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法を用い
て実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学的技術
は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laborat
ory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク州（1989）ような標準的な実験室マ
ニュアルに記載されるように実施できる。以下の実施例
で示す全ての部分または量は、特記しない限り、重量で
示す。
【０１０２】以下の実施例におけるフラグメントのサイ
ズ分離は特記しない限り、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）および多
くの他の文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.8:4
057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法を用いて実
施した。特記しない限り、ライゲーションは、標準的な
緩衝液、インキュベーション温度および時間、略等モル
濃度の量の連結するＤＮＡフラグメントの、ならびにＤ
ＮＡ０.５μｇあたりほぼ１０単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（「リガーゼ」）を用いて達成した。（配列番号：
１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イ
ー・コリ中ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００
９９３の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを配列
決定することにより入手した。
ズ分離は特記しない限り、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）および多
くの他の文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.8:4
057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法を用いて実
施した。特記しない限り、ライゲーションは、標準的な
緩衝液、インキュベーション温度および時間、略等モル
濃度の量の連結するＤＮＡフラグメントの、ならびにＤ
ＮＡ０.５μｇあたりほぼ１０単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（「リガーゼ」）を用いて達成した。（配列番号：
１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イ
ー・コリ中ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００
９９３の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを配列
決定することにより入手した。
【０１０３】（配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を用い
て、トポイソメラーゼＩＩＩタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを得るために、通常、イー・コリ中のス
トレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３の染色
体ＤＮＡのクローンのライブラリー、またはその他の適
当な宿主を、部分配列に由来する、好ましくは１７量体
またはそれより長い放射性標識オリゴヌクレオチドでプ
ローブする。プローブのＤＮＡに同一のＤＮＡを担持す
るクローンを、次いで、非常にストリンジェントに洗浄
して区別した。原配列から設計した配列決定プライマー
を用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定
することにより、次に配列を両方向に伸長し、遺伝子を
全長にわたって決定することが可能になる。都合よく
は、プラスミドクローンから製造した変性二本鎖ＤＮＡ
を用いて、このような配列決定を実施する。適当な技術
については、Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambroo
kら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク州（1989）に記載されている。（Screening By Hybri
dization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stra
nded DNA Templates 13.70参照）
て、トポイソメラーゼＩＩＩタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを得るために、通常、イー・コリ中のス
トレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３の染色
体ＤＮＡのクローンのライブラリー、またはその他の適
当な宿主を、部分配列に由来する、好ましくは１７量体
またはそれより長い放射性標識オリゴヌクレオチドでプ
ローブする。プローブのＤＮＡに同一のＤＮＡを担持す
るクローンを、次いで、非常にストリンジェントに洗浄
して区別した。原配列から設計した配列決定プライマー
を用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定
することにより、次に配列を両方向に伸長し、遺伝子を
全長にわたって決定することが可能になる。都合よく
は、プラスミドクローンから製造した変性二本鎖ＤＮＡ
を用いて、このような配列決定を実施する。適当な技術
については、Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambroo
kら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク州（1989）に記載されている。（Screening By Hybri
dization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stra
nded DNA Templates 13.70参照）
【０１０４】実施例１：ストレプトコッカス・ニューモ
ニエからの新規トポイソメラーゼＩＩＩをコードするＤ
ＮＡの単離 （配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドをイー・コリにおけるストレプトコッカス・ニュ
ーモニエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより
入手した。重複するストレプトコッカス・ニューモニエ
ＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンの配列
決定データを、（配列番号：１）に示す連続したＤＮＡ
配列を構築するために使用する場合もある。ライブラリ
ーは慣用的方法、例えば以下の方法１および２により製
造できる。全細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ０１００９９３株より、標準法に準じて単離
し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。
ニエからの新規トポイソメラーゼＩＩＩをコードするＤ
ＮＡの単離 （配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドをイー・コリにおけるストレプトコッカス・ニュ
ーモニエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより
入手した。重複するストレプトコッカス・ニューモニエ
ＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンの配列
決定データを、（配列番号：１）に示す連続したＤＮＡ
配列を構築するために使用する場合もある。ライブラリ
ーは慣用的方法、例えば以下の方法１および２により製
造できる。全細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ０１００９９３株より、標準法に準じて単離
し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。
【０１０５】方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニ
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【０１０６】方法２ 全細胞ＤＮＡは、四種の制限酵素（ＲｓａＩ、Ｐａｌ
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
【０１０７】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人： グウィン，マイケル カレンダー，ハワード （ｉｉ）発明の名称： 新規トポイソメラーゼＩＩＩ （ｉｉｉ）配列の数： ３ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態： ディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム： ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア： ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： １９９７年１０月１４日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： ６０／０２８，６０３ （Ｂ）出願日： １９９６年１０月１５日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名： ギミ，エドワード・アール （Ｂ）登録番号： ３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号： Ｐ５０５６５ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号： ６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態： ディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム： ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア： ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： １９９７年１０月１４日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： ６０／０２８，６０３ （Ｂ）出願日： １９９６年１０月１５日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名： ギミ，エドワード・アール （Ｂ）登録番号： ３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号： Ｐ５０５６５ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号： ６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【０１０８】(1) 配列番号１についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ４４２塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号１:
【化１】
【０１０９】(2) 配列番号２についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: １４８アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 (xi) 配列の記載: 配列番号２:
【化２】
【０１１０】(2) 配列番号３についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２２ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号３:
【化３】
【図１】 ストレプトコッカス・ニューモニエ・トポ
イソメラーゼＩＩＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
イソメラーゼＩＩＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
【図２】 図１のポリヌクレオチド配列から推定した
ストレプトコッカス・ニューモニエ・トポイソメラーゼ
ＩＩＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
ストレプトコッカス・ニューモニエ・トポイソメラーゼ
ＩＩＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/00 9/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 マイケル・エヌ・グウィン アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州チ ェスター・スプリングス、カントリー・ウ ェイ1011番 (72)発明者 ハワード・カレンダー アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ビル・スミス・ブ ールバード1220番
Claims (27)
- 【請求項１】（ａ）配列番号：２のアミノ酸１から１４
７を有してなるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌ
クレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
４４２を有してなる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号：２に示すポリペプチド配列を
コードする配列番号：１に示すヌクレオチドを有してな
る請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸１から１４７を
有してなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポ
リヌクレオチド。 - 【請求項７】（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４から
単離可能なストレプトコッカス・ニューモニエ（Strept
ococcus pneumpniae）のトポイソメラーゼＩＩＩをコー
ドするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同
一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項２記載のＤＮＡを有してなるベク
ター。 - 【請求項９】 請求項８記載のベクターを有してなる宿
主細胞。 - 【請求項１０】 トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド
の製造方法であって、請求項９に記載の宿主を、該ポリ
ペプチドを発現するのに十分な培地中、および条件下で
培養し、その発現したポリペプチドを回収することを特
徴とする方法。 - 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、宿主細胞が、適当な培養条件下、請求項８
に記載のベクターに含まれるｃＤＮＡによりコードされ
るトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドを発現するよう
に、該宿主細胞を該ベクターで形質転換またはトランス
フェクションすることを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 配列番号：２のアミノ酸１から１４７
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。 - 【請求項１３】 配列番号：２に示すアミノ酸を有して
なるポリペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１５】 請求項１２に記載のポリペプチドの活
性を阻害するアンタゴニスト。 - 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１５に記載のア
ンタゴニストを個体に投与することからなる、トポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドの阻害を必要とする個体の
治療方法。 - 【請求項１７】 分析用核酸プローブによりサンプル中
のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコードする核
酸を検出することを特徴とするトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドの発現に付随する疾患の診断方法におい
て、請求項１に記載の核酸の少なくとも１５個の連続し
たヌクレオチド塩基の配列を有する核酸プローブを分析
用プローブとして用いることからなる診断方法。 - 【請求項１８】 核酸プローブ配列が配列番号：３であ
る請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 サンプル中のトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドの生物学的特性を検出することを特徴とす
るトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの発現に付随す
る疾患の診断方法において、請求項１２に記載のポリペ
プチドをトポイソメラーゼＩＩＩとして用いることから
なる診断方法。 - 【請求項２０】 検出される生物学的特性が免疫学的特
性または酵素的特性である請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 モジュレーターであると思われる化合
物を、請求項１２に記載のトポイソメラーゼおよびその
基質からなる反応混合物と混合し、該化合物を含まない
対照となる反応混合物の活性と比較した場合の該トポイ
ソメラーゼＩＩＩ活性における調節作用を検出すること
からなる、トポイソメラーゼＩＩＩ活性のモジュレータ
ーの同定方法。 - 【請求項２２】 化合物がアンタゴニストであり、その
調節作用がスーパーコイル化ＤＮＡ弛緩アッセイにて測
定した場合にトポイソメラーゼＩＩＩ触媒活性を減少さ
せることにある請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 化合物がアンタゴニストであり、その
調節作用がＤＮＡオリゴマー開裂可能な複合体アッセイ
にて測定した場合にトポイソメラーゼＩＩＩ非触媒活性
を減少させることにある請求項２１記載の方法。 - 【請求項２４】 オリゴマー開裂可能な複合体アッセイ
にて配列番号：３の核酸を用いる請求項２３記載の方
法。 - 【請求項２５】 抗体を産生するのに十分な請求項１２
に記載のトポイソメラーゼＩＩＩまたはそのフラグメン
トもしくは変種を哺乳動物に接種し、該動物をストレプ
トコッカス感染から保護することからなる、哺乳動物に
て免疫学的応答を誘起する方法。 - 【請求項２６】 遺伝子治療により、インビボでトポイ
ソメラーゼＩＩＩ、またはそのフラグメントもしくは変
種を発現させるために請求項１に記載のトポイソメラー
ゼＩＩＩまたはそのフラグメントもしくは変種をコード
する遺伝子を送達し、免疫学的応答を誘発させて抗体を
産生し、該動物をストレプトコッカス疾患から保護する
ことからなる、哺乳動物にて免疫学的応答を誘起する方
法。 - 【請求項２７】 哺乳動物に導入した場合、哺乳動物に
おいてトポイソメラーゼＩＩＩに対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、請求項１２に記載の
ポリヌクレオチドまたはその免疫学的フラグメントと、
担体とからなる免疫学的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2860396P | 1996-10-15 | 1996-10-15 | |
| US60/028603 | 1996-10-15 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003124025A Division JP2004000215A (ja) | 1996-10-15 | 2003-04-28 | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175862A true JPH1175862A (ja) | 1999-03-23 |
Family
ID=21844371
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9320251A Pending JPH1175862A (ja) | 1996-10-15 | 1997-10-15 | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ |
| JP2003124025A Withdrawn JP2004000215A (ja) | 1996-10-15 | 2003-04-28 | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003124025A Withdrawn JP2004000215A (ja) | 1996-10-15 | 2003-04-28 | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5962303A (ja) |
| EP (1) | EP0837137A3 (ja) |
| JP (2) | JPH1175862A (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1025217B1 (en) * | 1997-10-24 | 2006-10-04 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
| EP1042361A1 (en) * | 1997-12-31 | 2000-10-11 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Essential bacterial genes and their use |
| DE19916227A1 (de) * | 1999-04-10 | 2000-11-02 | Merlin Mikrobiolog Diag Gmbh | Verfahren zur genotypischen Klassifizierung |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| EP2105496B1 (en) | 2000-12-08 | 2013-02-20 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US7079775B2 (en) * | 2001-02-05 | 2006-07-18 | Finisar Corporation | Integrated memory mapped controller circuit for fiber optics transceiver |
| ATE483976T1 (de) * | 2001-06-05 | 2010-10-15 | Exelixis Inc | Gfats als modifikatoren des p53-wegs und verwendungsverfahren |
| JP4210769B2 (ja) * | 2001-11-22 | 2009-01-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法 |
| US20040132133A1 (en) * | 2002-07-08 | 2004-07-08 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for the production, identification and purification of fusion proteins |
| JP2007512838A (ja) | 2003-12-01 | 2007-05-24 | インヴィトロジェン コーポレーション | 組換え部位を含む核酸分子およびその使用方法 |
| US20050227309A1 (en) | 2004-01-21 | 2005-10-13 | Corry Schuyler B | Optically-detectable enzyme substrates and their method of use |
| US20090098611A1 (en) * | 2004-02-27 | 2009-04-16 | Wood David W | Self-cleaving affinity tags and methods of use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5004758A (en) * | 1987-12-01 | 1991-04-02 | Smithkline Beecham Corporation | Water soluble camptothecin analogs useful for inhibiting the growth of animal tumor cells |
| US6013505A (en) * | 1996-10-08 | 2000-01-11 | Smithkline Beecham Corporation | Topoisomerase I |
| US5910414A (en) * | 1996-10-15 | 1999-06-08 | Smithkline Beecham Corporation | Topoisomerase I of streptococcus pneumoniae |
-
1997
- 1997-10-14 US US08/949,584 patent/US5962303A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-15 JP JP9320251A patent/JPH1175862A/ja active Pending
- 1997-10-15 EP EP97308158A patent/EP0837137A3/en not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-04-26 US US09/299,861 patent/US6277620B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-04-28 JP JP2003124025A patent/JP2004000215A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0837137A3 (en) | 2000-01-12 |
| JP2004000215A (ja) | 2004-01-08 |
| US5962303A (en) | 1999-10-05 |
| EP0837137A2 (en) | 1998-04-22 |
| US6277620B1 (en) | 2001-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH10201486A (ja) | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ | |
| JP2008029344A (ja) | 新規化合物 | |
| JPH10191988A (ja) | 新規ＧｂｐＡ | |
| JP2001519651A (ja) | 新規化合物 | |
| JPH1175862A (ja) | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ | |
| JPH10165187A (ja) | 新規唾液結合蛋白質 | |
| US6251387B1 (en) | Topoisomerase I | |
| US6274139B1 (en) | Topoisomerase I | |
| JPH11137275A (ja) | 新規グリコーゲンホスホリラーゼ | |
| JP2001505050A (ja) | 新規ＦａｂＨ | |
| JP2001258578A (ja) | 新規ＦａｂＤ | |
| US6573066B1 (en) | FtsH from Staphylococcus aureus | |
| JP2002262891A (ja) | スタフィロコッカス・アウレウス由来の２成分シグナルトランスダクションシステムタンパク質 | |
| JPH10201484A (ja) | 新規ＦｔｓＬ | |
| JP2002253278A (ja) | 新規ｔｉｇ | |
| JPH10313873A (ja) | 新規ＤｉｖＩＢ | |
| JPH10313879A (ja) | 新規化合物 | |
| JPH10225296A (ja) | 新規ｓｐｏ−ｒｅｌ | |
| JP2002125671A (ja) | 新規ｒｓｂＵ−１ | |
| JPH11164695A (ja) | 新規アミノペプチダーゼ | |
| JPH10225295A (ja) | ＲｓｂＷ−１ | |
| JP2002253274A (ja) | 新規化合物 | |
| JPH11137271A (ja) | 新規ｐｃｒＡ | |
| JPH11318469A (ja) | 新規ｆｏｌＣ | |
| JPH10337188A (ja) | 新規ｇｒｅＡ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20030527 |