JPH10201486A - 新規トポイソメラーゼｉｉｉ - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なトポイソメラーゼＩＩＩおよび該タン
パク質をコードするＤＮＡが望まれている。 【解決手段】 本発明は （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から７７１を有してな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
パク質をコードするＤＮＡが望まれている。 【解決手段】 本発明は （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から７７１を有してな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願は、１９９６年１０月１
５日に提出された米国仮特許出願番号６０／０２８４１
７号の権利を主張するものである。本発明は、一つに、
新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド；該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種およ
び誘導体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、
およびその変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニス
トおよびアンタゴニストの使用に関するものである。特
に、これらの点および他の点に関して、本発明は、細菌
性「トポイソメラーゼＩＩＩ」のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドに関する。
５日に提出された米国仮特許出願番号６０／０２８４１
７号の権利を主張するものである。本発明は、一つに、
新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド；該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種およ
び誘導体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、
およびその変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニス
トおよびアンタゴニストの使用に関するものである。特
に、これらの点および他の点に関して、本発明は、細菌
性「トポイソメラーゼＩＩＩ」のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】より効果的な抗生物質には、細菌性遺伝
子の発現、制御または活性に共通するモードを妨害する
ものがある。近年、ＤＮＡのスーパーコイル化が毒性遺
伝子制御の一つの方法であり得ると示唆されている。ス
ーパーコイル化に因るＤＮＡ密度の局所的な増減は、温
度、嫌気生活、および重量オスモル濃度などの種々環境
条件に対する応答に関係している。空間的に構成された
遺伝子のスーパーコイル化の増減により、遺伝子群の転
写装置の構成要素へのアクセサビリティーを適宜制御す
ることで、感染性病原体がかかる環境条件に対して有効
な応答を示すかもしれない。１型トポイソメラーゼおよ
びＤＮＡジャイレース（ＤＮＡ gyrase）を含む、ＤＮ
Ａスーパーコイル化のレベルに影響するように作用す
る、ＤＮＡトポイソメラーゼなどの酵素が同定されてい
る。かかる酵素はそれに対する潜在的抗生物質としての
化合物をスクリーニングするための有用な標的に相当す
る。
子の発現、制御または活性に共通するモードを妨害する
ものがある。近年、ＤＮＡのスーパーコイル化が毒性遺
伝子制御の一つの方法であり得ると示唆されている。ス
ーパーコイル化に因るＤＮＡ密度の局所的な増減は、温
度、嫌気生活、および重量オスモル濃度などの種々環境
条件に対する応答に関係している。空間的に構成された
遺伝子のスーパーコイル化の増減により、遺伝子群の転
写装置の構成要素へのアクセサビリティーを適宜制御す
ることで、感染性病原体がかかる環境条件に対して有効
な応答を示すかもしれない。１型トポイソメラーゼおよ
びＤＮＡジャイレース（ＤＮＡ gyrase）を含む、ＤＮ
Ａスーパーコイル化のレベルに影響するように作用す
る、ＤＮＡトポイソメラーゼなどの酵素が同定されてい
る。かかる酵素はそれに対する潜在的抗生物質としての
化合物をスクリーニングするための有用な標的に相当す
る。
【０００３】ＤＮＡトポイソメラーゼによるＤＮＡ形質
転換は、一本鎖または二本鎖のどちらかの開裂によりな
される。かかる形質転換により得られるリンキング数
（Ｌｋ）のユニット変化が２種のトポイソメラーゼの間
の最も機能的な違いである（P.O.Brown & N.R.Cozzarel
li、Science 206:1081-1083（1979））。リンキング数
（Ｌｋ）は一本の鎖がもう一本の鎖に広がる表面と交差
する回数の代数的数である。一過性の一本鎖切断を介し
て反応が進行し、Ｌｋを一工程で変化させるＤＮＡトポ
イソメラーゼは１型と分類され、二本鎖切断を介して反
応が進行し、Ｌｋを二工程にて変化させる酵素は２型と
分類される。
転換は、一本鎖または二本鎖のどちらかの開裂によりな
される。かかる形質転換により得られるリンキング数
（Ｌｋ）のユニット変化が２種のトポイソメラーゼの間
の最も機能的な違いである（P.O.Brown & N.R.Cozzarel
li、Science 206:1081-1083（1979））。リンキング数
（Ｌｋ）は一本の鎖がもう一本の鎖に広がる表面と交差
する回数の代数的数である。一過性の一本鎖切断を介し
て反応が進行し、Ｌｋを一工程で変化させるＤＮＡトポ
イソメラーゼは１型と分類され、二本鎖切断を介して反
応が進行し、Ｌｋを二工程にて変化させる酵素は２型と
分類される。
【０００４】２型トポイソメラーゼファミリーのメンバ
ーは、ＤＮＡジャイレース、細菌性トポイソメラーゼＩ
Ｖ、Ｔ−線状ＤＮＡトポイソメラーゼ、真核生物ＤＮＡ
トポイソメラーゼＩＩおよびサルフォロバス・アシドカ
ルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の好熱
性トポイソメラーゼＩＩを包含する（A.Kikuchiら、Sys
t.Appl.Microbiol.7:72-78（1986）；J.Katoら、J.Bio
l.Chem.267:25676-25684（1992）；W.M.Huang、ＤＮＡ
トポロジーおよびその生物学的効果（N.R.Cozzarelliお
よびJ.C.Wang編、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、ニューヨーク）264-284（199
0）；T.-S.Hisch、ＤＮＡトポロジーおよびその生物学
的効果（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニュー
ヨーク）243-263（1990）を参照のこと）。１２種ほど
の２型酵素のコーディング配列が決定されており、その
データはこれらの全ての酵素が進化的および構造的に関
連していることを示唆する。２型トポイソメラーゼによ
り触媒されるトポロジー反応は、ＤＮＡ（ＤＮＡジャイ
レース）への負のスーパーコイルの導入、スーパーコイ
ル化ＤＮＡの弛緩、らせん環の連環形成（またはその解
離）、ＤＮＡの結節および未結節を包含する。
ーは、ＤＮＡジャイレース、細菌性トポイソメラーゼＩ
Ｖ、Ｔ−線状ＤＮＡトポイソメラーゼ、真核生物ＤＮＡ
トポイソメラーゼＩＩおよびサルフォロバス・アシドカ
ルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の好熱
性トポイソメラーゼＩＩを包含する（A.Kikuchiら、Sys
t.Appl.Microbiol.7:72-78（1986）；J.Katoら、J.Bio
l.Chem.267:25676-25684（1992）；W.M.Huang、ＤＮＡ
トポロジーおよびその生物学的効果（N.R.Cozzarelliお
よびJ.C.Wang編、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、ニューヨーク）264-284（199
0）；T.-S.Hisch、ＤＮＡトポロジーおよびその生物学
的効果（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニュー
ヨーク）243-263（1990）を参照のこと）。１２種ほど
の２型酵素のコーディング配列が決定されており、その
データはこれらの全ての酵素が進化的および構造的に関
連していることを示唆する。２型トポイソメラーゼによ
り触媒されるトポロジー反応は、ＤＮＡ（ＤＮＡジャイ
レース）への負のスーパーコイルの導入、スーパーコイ
ル化ＤＮＡの弛緩、らせん環の連環形成（またはその解
離）、ＤＮＡの結節および未結節を包含する。
【０００５】１型トポイソメラーゼのファミリーは、細
菌性トポイソメラーゼＩ、イー・コリ（E.coli）トポイ
ソメラーゼＩＩＩ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ（R.A.Kim & J.C.Wang、J.B
iol.Chem.267:17178-17185（1992））、ヒトトポイソメ
ラーゼＩＩＩ（Hanaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:3653-
3657（1996））、細菌性酵素に密接に類似した葉緑体由
来の１型トポイソメラーゼ（J.Siedleckiら、Nucleic A
cids Res.11:1523-1536（1983）、好熱性逆ジャイレー
ス（A.Kikuchi、ＤＮＡ；「トポロジーおよびその生物
学的効果」（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニ
ューヨーク）285-298（1990）：C.Bouthier de la Tour
ら、J.Bact.173:3921-3923（1991））、好熱性ディー・
アミロリティカス（D.amylolyticus）トポイソメラーゼ
ＩＩＩ（A.Ｉ.Slesarevら、J.Biol.Chem.266:12321-123
28（1991））、核トポイソメラーゼＩおよびミトコンド
リアおよびポックスウイルス由来の密接に関連する酵素
（N.Osheroff、Pharmac.Ther.41:223-241（1989））か
らなる。触媒機構に関して、これらのトポイソメラーゼ
は二つの群に分けられる。Ａ群は作用するのに２価のカ
チオンを必要とし、５′ホスホリル末端で一過性の共有
結合性複合体を形成する酵素からなる（原核生物性１型
トポイソメラーゼ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ、およびヒトトポイソメラ
ーゼＩＩＩ）。Ｂ群は、作用するのに２価のカチオンを
必要とせず、３′ホスホリル末端で一過性の共有結合す
る１型トポイソメラーゼを含む（核トポイソメラーゼ
Ｉ、一般に真核生物性トポイソメラーゼＩと称せられる
ミトコンドリアおよびポックスウイルスに由来する酵
素）。１型トポイソメラーゼは以下のトポロジー反応を
行う：これらはスーパーコイル化ＤＮＡ（逆ジャイレー
スを除く）を弛緩し、一本鎖環状ＤＮＡまたは二本鎖Ｄ
ＮＡ（ただし、少なくとも１つの分子がニックまたはギ
ャップを有する）を連環形成（またはその解離）する
か、または一本鎖環と相互反応し、トポロジカルな結節
を導入する（１型−Ａ群トポイソメラーゼ）。１型−Ａ
群トポイソメラーゼに属する逆ジャイレースはｃＤＮＡ
に正のスーパーコイルを導入できることがわかった唯一
のトポイソメラーゼである。
菌性トポイソメラーゼＩ、イー・コリ（E.coli）トポイ
ソメラーゼＩＩＩ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ（R.A.Kim & J.C.Wang、J.B
iol.Chem.267:17178-17185（1992））、ヒトトポイソメ
ラーゼＩＩＩ（Hanaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:3653-
3657（1996））、細菌性酵素に密接に類似した葉緑体由
来の１型トポイソメラーゼ（J.Siedleckiら、Nucleic A
cids Res.11:1523-1536（1983）、好熱性逆ジャイレー
ス（A.Kikuchi、ＤＮＡ；「トポロジーおよびその生物
学的効果」（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニ
ューヨーク）285-298（1990）：C.Bouthier de la Tour
ら、J.Bact.173:3921-3923（1991））、好熱性ディー・
アミロリティカス（D.amylolyticus）トポイソメラーゼ
ＩＩＩ（A.Ｉ.Slesarevら、J.Biol.Chem.266:12321-123
28（1991））、核トポイソメラーゼＩおよびミトコンド
リアおよびポックスウイルス由来の密接に関連する酵素
（N.Osheroff、Pharmac.Ther.41:223-241（1989））か
らなる。触媒機構に関して、これらのトポイソメラーゼ
は二つの群に分けられる。Ａ群は作用するのに２価のカ
チオンを必要とし、５′ホスホリル末端で一過性の共有
結合性複合体を形成する酵素からなる（原核生物性１型
トポイソメラーゼ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ、およびヒトトポイソメラ
ーゼＩＩＩ）。Ｂ群は、作用するのに２価のカチオンを
必要とせず、３′ホスホリル末端で一過性の共有結合す
る１型トポイソメラーゼを含む（核トポイソメラーゼ
Ｉ、一般に真核生物性トポイソメラーゼＩと称せられる
ミトコンドリアおよびポックスウイルスに由来する酵
素）。１型トポイソメラーゼは以下のトポロジー反応を
行う：これらはスーパーコイル化ＤＮＡ（逆ジャイレー
スを除く）を弛緩し、一本鎖環状ＤＮＡまたは二本鎖Ｄ
ＮＡ（ただし、少なくとも１つの分子がニックまたはギ
ャップを有する）を連環形成（またはその解離）する
か、または一本鎖環と相互反応し、トポロジカルな結節
を導入する（１型−Ａ群トポイソメラーゼ）。１型−Ａ
群トポイソメラーゼに属する逆ジャイレースはｃＤＮＡ
に正のスーパーコイルを導入できることがわかった唯一
のトポイソメラーゼである。
【０００６】ＤＮＡトポイソメラーゼに関する研究は、
ＤＮＡ酵素学から開発療法へと進歩している。細菌性Ｄ
ＮＡトポイソメラーゼＩＩはキノロン抗生物質の治療上
重要な標的である；哺乳動物性ＤＮＡトポイソメラーゼ
ＩＩは多くの強力な抗腫瘍薬の細胞性標的である（K.Dr
lica、Microbiol.Rev.48:273-289（1984）およびBioche
mistry 27:2253-2259（1988）；B.S.Glisson & W.E.Ros
s、Pharmacol.Ther.32:89-106（1987）；A.L.Bodley &
L.F.Liu、Biotechnology 6:1315-1319（1988）；L.F.Li
u、Annu.Rev.Biochem.58:351-375（1989））。トポイソ
メラーゼＩＩ毒と称されるこれらの薬物は、開裂可能な
複合体と称される主要な共有結合性反応中間体を捕捉す
ることにより、ＩＩ型トポイソメラーゼの切断−再結合
反応を妨害する。哺乳動物性トポイソメラーゼＩＩは、
これもまた共有結合性反応中間体を捕捉する抗腫瘍薬ト
ポテカン（米国特許第５００４７５８号）の細胞性標的
である。
ＤＮＡ酵素学から開発療法へと進歩している。細菌性Ｄ
ＮＡトポイソメラーゼＩＩはキノロン抗生物質の治療上
重要な標的である；哺乳動物性ＤＮＡトポイソメラーゼ
ＩＩは多くの強力な抗腫瘍薬の細胞性標的である（K.Dr
lica、Microbiol.Rev.48:273-289（1984）およびBioche
mistry 27:2253-2259（1988）；B.S.Glisson & W.E.Ros
s、Pharmacol.Ther.32:89-106（1987）；A.L.Bodley &
L.F.Liu、Biotechnology 6:1315-1319（1988）；L.F.Li
u、Annu.Rev.Biochem.58:351-375（1989））。トポイソ
メラーゼＩＩ毒と称されるこれらの薬物は、開裂可能な
複合体と称される主要な共有結合性反応中間体を捕捉す
ることにより、ＩＩ型トポイソメラーゼの切断−再結合
反応を妨害する。哺乳動物性トポイソメラーゼＩＩは、
これもまた共有結合性反応中間体を捕捉する抗腫瘍薬ト
ポテカン（米国特許第５００４７５８号）の細胞性標的
である。
【０００７】前記したように、細菌性Ｉ型トポイソメラ
ーゼ（トポイソメラーゼＩ＆ＩＩＩ）はＤＮＡトポロジ
ーを変化させる酵素であり、複製、転写および組換えを
含め、多くの極めて重要な細胞性工程に関与する（Lutt
inger,A.、Molecular Microbiol.15(4):601-608（199
5））。これらの酵素はＤＮＡ一本鎖を一時的に切断
し、裂け目にＤＮＡ一本鎖または二本鎖を通し、最終的
に裂け目を再閉する。ＤＮＡ基質の開裂により、酵素の
チロシン残基およびＤＮＡ鎖の開裂部位における５′末
端間に共有結合が形成される（Roca,J.A.、TTBS 20:156
-160（1995））。
ーゼ（トポイソメラーゼＩ＆ＩＩＩ）はＤＮＡトポロジ
ーを変化させる酵素であり、複製、転写および組換えを
含め、多くの極めて重要な細胞性工程に関与する（Lutt
inger,A.、Molecular Microbiol.15(4):601-608（199
5））。これらの酵素はＤＮＡ一本鎖を一時的に切断
し、裂け目にＤＮＡ一本鎖または二本鎖を通し、最終的
に裂け目を再閉する。ＤＮＡ基質の開裂により、酵素の
チロシン残基およびＤＮＡ鎖の開裂部位における５′末
端間に共有結合が形成される（Roca,J.A.、TTBS 20:156
-160（1995））。
【０００８】共有結合−酵素−ＤＮＡ複合体（開裂可能
な複合体）を安定化させる酵素阻害は染色体損傷および
細菌性細胞死を引き起こす。さらに、この機構は１回の
阻害事象により細胞死に至る可能性がある。開裂可能な
複合体を安定化することにより作用する低分子量の阻害
剤は、特に活性部位の領域におけるトポイソメラーゼＩ
およびＩＩＩの広範囲に及ぶアミノ酸配列類似性のた
め、その両方のトポイソメラーゼで作用できる。したが
って、点突然変異より生じるそのような薬物に対する将
来の高レベルの耐性の可能性を低くすることができる。
な複合体）を安定化させる酵素阻害は染色体損傷および
細菌性細胞死を引き起こす。さらに、この機構は１回の
阻害事象により細胞死に至る可能性がある。開裂可能な
複合体を安定化することにより作用する低分子量の阻害
剤は、特に活性部位の領域におけるトポイソメラーゼＩ
およびＩＩＩの広範囲に及ぶアミノ酸配列類似性のた
め、その両方のトポイソメラーゼで作用できる。したが
って、点突然変異より生じるそのような薬物に対する将
来の高レベルの耐性の可能性を低くすることができる。
【０００９】Ｉ型トポイソメラーゼの阻害剤は、例え
ば、ＤＮＡとの共有結合複合体においてタンパク質を安
定化できる阻害剤であり、細菌に対して致死的または抑
制的であり、そのため抗菌治療において有用である。ス
タフィロコッカス属遺伝子および遺伝子生成物を抗生物
質の開発のための標的として用いることは特に好ましい
ことである。スタフィロコッカス属は微生物の医学的に
重要な属を形成している。これらは浸潤性および毒素性
の二つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤
性感染は一般に皮膚表面および組織深部に影響する膿瘍
を形成する特徴がある。スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓ.aureus）は癌患者における菌血症の２次誘発原
因である。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈
炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的であ
る。スタフィロコッカス属の毒素特性よりもたらされ
る、少なくとも３種の臨床症状がある。これらの疾病の
出現は、組織浸潤および菌血症に対抗するように、外毒
素の作用をもたらす。これらの症状は：スタフィロコッ
カス食中毒、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショッ
ク症候群を包含する。
ば、ＤＮＡとの共有結合複合体においてタンパク質を安
定化できる阻害剤であり、細菌に対して致死的または抑
制的であり、そのため抗菌治療において有用である。ス
タフィロコッカス属遺伝子および遺伝子生成物を抗生物
質の開発のための標的として用いることは特に好ましい
ことである。スタフィロコッカス属は微生物の医学的に
重要な属を形成している。これらは浸潤性および毒素性
の二つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤
性感染は一般に皮膚表面および組織深部に影響する膿瘍
を形成する特徴がある。スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓ.aureus）は癌患者における菌血症の２次誘発原
因である。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈
炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的であ
る。スタフィロコッカス属の毒素特性よりもたらされ
る、少なくとも３種の臨床症状がある。これらの疾病の
出現は、組織浸潤および菌血症に対抗するように、外毒
素の作用をもたらす。これらの症状は：スタフィロコッ
カス食中毒、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショッ
ク症候群を包含する。
【００１０】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、ポリペプチド、とりわけ図３（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列およびヘモフィラス・インフルエンザ
（Ｈaemophilus influenzae）トポイソメラーゼＩＩＩ
などの他のタンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性に
より、新規トポイソメラーゼＩＩＩとして同定されたポ
リペプチドを提供することである。本発明のさらなる目
的は、さらに、トポイソメラーゼＩＩＩをコードするポ
リヌクレオチド、特に本明細書において細菌性トポイソ
メラーゼＩＩＩと称するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供することである。
は、ポリペプチド、とりわけ図３（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列およびヘモフィラス・インフルエンザ
（Ｈaemophilus influenzae）トポイソメラーゼＩＩＩ
などの他のタンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性に
より、新規トポイソメラーゼＩＩＩとして同定されたポ
リペプチドを提供することである。本発明のさらなる目
的は、さらに、トポイソメラーゼＩＩＩをコードするポ
リヌクレオチド、特に本明細書において細菌性トポイソ
メラーゼＩＩＩと称するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
および２（配列番号：１）に示す配列における、トポイ
ソメラーゼＩＩＩをコードする領域を有する。本発明の
別の特に好ましい具体例には、（配列番号：２）のアミ
ノ酸配列を含んでなるスタフィロコッカス・アウレウス
由来の新規トポイソメラーゼＩＩＩタンパク質、または
そのフラグメント、アナログまたは誘導体がある。本発
明のこの態様によれば、寄託株ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス・ポ
リヌクレオチドにより発現可能な成熟ポリペプチドをコ
ードする単離核酸分子が提供される。
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
および２（配列番号：１）に示す配列における、トポイ
ソメラーゼＩＩＩをコードする領域を有する。本発明の
別の特に好ましい具体例には、（配列番号：２）のアミ
ノ酸配列を含んでなるスタフィロコッカス・アウレウス
由来の新規トポイソメラーゼＩＩＩタンパク質、または
そのフラグメント、アナログまたは誘導体がある。本発
明のこの態様によれば、寄託株ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス・ポ
リヌクレオチドにより発現可能な成熟ポリペプチドをコ
ードする単離核酸分子が提供される。
【００１２】本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは
治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、ま
たは変種、アナログおよび誘導体のフラグメントを含
め、そのフラグメントを包含する、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ、特にスタフィロコッカス・トポイソメラーゼＩＩ
Ｉをコードする単離された核酸分子が提供される。本発
明のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラ
ーゼＩＩＩの天然の対立遺伝子変種がある。
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは
治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、ま
たは変種、アナログおよび誘導体のフラグメントを含
め、そのフラグメントを包含する、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ、特にスタフィロコッカス・トポイソメラーゼＩＩ
Ｉをコードする単離された核酸分子が提供される。本発
明のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラ
ーゼＩＩＩの天然の対立遺伝子変種がある。
【００１３】本発明のこの態様によれば、本明細書にお
いてトポイソメラーゼＩＩＩと称されるスタフィロコッ
カス属起源の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診
断学的、もしくは治療的に有用なそのフラグメント、お
よび前記した変種、誘導体およびアナログ、およびその
フラグメントが提供される。治療を目的として、例え
ば、スタフィロコッカス感染などの細菌感染に対して宿
主に免疫を付与することによる治療を含め、疾患を治療
するのに用いることができるトポイソメラーゼＩＩＩポ
リペプチド、特に細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペ
プチドを提供することも本発明の目的である。
いてトポイソメラーゼＩＩＩと称されるスタフィロコッ
カス属起源の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診
断学的、もしくは治療的に有用なそのフラグメント、お
よび前記した変種、誘導体およびアナログ、およびその
フラグメントが提供される。治療を目的として、例え
ば、スタフィロコッカス感染などの細菌感染に対して宿
主に免疫を付与することによる治療を含め、疾患を治療
するのに用いることができるトポイソメラーゼＩＩＩポ
リペプチド、特に細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペ
プチドを提供することも本発明の目的である。
【００１４】本発明のさらなる態様によれば、治療また
は予防を目的として、例えば抗菌剤またはワクチンとし
ての、本発明のポリペプチド、とりわけそのフラグメン
トの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、治
療または予防を目的として、特に遺伝的免疫における、
本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラー
ゼＩＩＩ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされる
トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの変種がある。
は予防を目的として、例えば抗菌剤またはワクチンとし
ての、本発明のポリペプチド、とりわけそのフラグメン
トの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、治
療または予防を目的として、特に遺伝的免疫における、
本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラー
ゼＩＩＩ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされる
トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの変種がある。
【００１５】本発明の別の目的は、前記のポリペプチ
ド、ポリペプチドのフラグメント、変種および誘導体、
その変種および誘導体のフラグメント、並びに前記した
もののアナログの製造方法を提供することである。本発
明のこの態様の好ましい具体例では、外因的に誘導され
たトポイソメラーゼＩＩＩのコード化ポリヌクレオチド
を発現可能なように挿入した宿主細胞を、宿主において
トポイソメラーゼＩＩＩを発現するような条件下で培養
し、次いで発現したポリペプチドを回収することからな
る、前記したトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの製
造方法を提供する。
ド、ポリペプチドのフラグメント、変種および誘導体、
その変種および誘導体のフラグメント、並びに前記した
もののアナログの製造方法を提供することである。本発
明のこの態様の好ましい具体例では、外因的に誘導され
たトポイソメラーゼＩＩＩのコード化ポリヌクレオチド
を発現可能なように挿入した宿主細胞を、宿主において
トポイソメラーゼＩＩＩを発現するような条件下で培養
し、次いで発現したポリペプチドを回収することからな
る、前記したトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの製
造方法を提供する。
【００１６】本発明の別の目的によれば、とりわけ研
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組成
物、工程および方法が提供される。本発明のさらに別の
態様によれば、抗菌剤として有用なかかるポリペプチド
の阻害物質が提供される。特にかかるポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明のこの態様および他の態
様のある種の好ましい具体例によれば、細菌感染を検出
するのに有用な、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ配列に
ハイブリダイゼーションするプローブが提供される。
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組成
物、工程および方法が提供される。本発明のさらに別の
態様によれば、抗菌剤として有用なかかるポリペプチド
の阻害物質が提供される。特にかかるポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明のこの態様および他の態
様のある種の好ましい具体例によれば、細菌感染を検出
するのに有用な、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ配列に
ハイブリダイゼーションするプローブが提供される。
【００１７】本発明のこの態様のある種のさらなる好ま
しい具体例では、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド
に対する抗体が提供される。この点における特に好まし
い具体例では、その抗体はスタフィロコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩに対して選択的である。本発明の別の
態様によれば、トポイソメラーゼＩＩＩアゴニストが提
供される。好ましいアゴニストには、トポイソメラーゼ
ＩＩＩ結合分子に結合し、トポイソメラーゼＩＩＩ誘起
反応を惹起または増強する、トポイソメラーゼＩＩＩを
模倣する分子がある。また、好ましいアゴニストには、
トポイソメラーゼＩＩＩをコードする遺伝子もしくはト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、または他のトポイ
ソメラーゼＩＩＩ活性のモジュレーターと相互作用し、
それにより、１またはそれ以上のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉの効果を強化または増強する分子があり、好ましくは
静菌性または殺菌性でもある。
しい具体例では、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド
に対する抗体が提供される。この点における特に好まし
い具体例では、その抗体はスタフィロコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩに対して選択的である。本発明の別の
態様によれば、トポイソメラーゼＩＩＩアゴニストが提
供される。好ましいアゴニストには、トポイソメラーゼ
ＩＩＩ結合分子に結合し、トポイソメラーゼＩＩＩ誘起
反応を惹起または増強する、トポイソメラーゼＩＩＩを
模倣する分子がある。また、好ましいアゴニストには、
トポイソメラーゼＩＩＩをコードする遺伝子もしくはト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、または他のトポイ
ソメラーゼＩＩＩ活性のモジュレーターと相互作用し、
それにより、１またはそれ以上のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉの効果を強化または増強する分子があり、好ましくは
静菌性または殺菌性でもある。
【００１８】本発明のさらに別の態様によれば、トポイ
ソメラーゼＩＩＩアンタゴニストが提供される。好まし
いアンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合
し、トポイソメラーゼＩＩＩ結合分子の結合を阻害する
か、またはトポイソメラーゼＩＩＩおよびトポイソメラ
ーゼＩＩＩ結合分子の間で形成される複合体を安定化
し、トポイソメラーゼＩＩＩから生じるさらなる生物学
的活性を防御するアンタゴニストがある。また好ましい
アンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合す
るかまたは相互作用し、１またはそれ以上のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの効果を阻害するか、またはトポイソメラ
ーゼＩＩＩの発現を妨げ、また好ましくは静菌性または
殺菌性でもある分子がある。
ソメラーゼＩＩＩアンタゴニストが提供される。好まし
いアンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合
し、トポイソメラーゼＩＩＩ結合分子の結合を阻害する
か、またはトポイソメラーゼＩＩＩおよびトポイソメラ
ーゼＩＩＩ結合分子の間で形成される複合体を安定化
し、トポイソメラーゼＩＩＩから生じるさらなる生物学
的活性を防御するアンタゴニストがある。また好ましい
アンタゴニストには、トポイソメラーゼＩＩＩに結合す
るかまたは相互作用し、１またはそれ以上のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの効果を阻害するか、またはトポイソメラ
ーゼＩＩＩの発現を妨げ、また好ましくは静菌性または
殺菌性でもある分子がある。
【００１９】本発明のさらなる態様では、インビトロで
細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、
または多細胞生物に投与するための、トポイソメラーゼ
ＩＩＩポリヌクレオチドまたはトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。本発明の
この態様のある種の好ましい具体例において、該組成物
は、宿主生物においてトポイソメラーゼＩＩＩポリペプ
チドを発現し、免疫学的応答、好ましくはスタフィロコ
ッカスまたは関連生物に対するかかる宿主の免疫性を亢
進させるためのトポイソメラーゼＩＩＩポリヌクレオチ
ドを含んでなる。
細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、
または多細胞生物に投与するための、トポイソメラーゼ
ＩＩＩポリヌクレオチドまたはトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。本発明の
この態様のある種の好ましい具体例において、該組成物
は、宿主生物においてトポイソメラーゼＩＩＩポリペプ
チドを発現し、免疫学的応答、好ましくはスタフィロコ
ッカスまたは関連生物に対するかかる宿主の免疫性を亢
進させるためのトポイソメラーゼＩＩＩポリヌクレオチ
ドを含んでなる。
【００２０】本発明のその他の目的、特徴、利点および
態様は、以下の記載より当業者に明らかとなろう。しか
しながら、以下の記載および明確な実施例は、本発明の
好ましい具体例を示すものであり、単に説明として示さ
れるものであると認識すべきである。開示した本発明の
精神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の
記載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読む
ことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
態様は、以下の記載より当業者に明らかとなろう。しか
しながら、以下の記載および明確な実施例は、本発明の
好ましい具体例を示すものであり、単に説明として示さ
れるものであると認識すべきである。開示した本発明の
精神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の
記載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読む
ことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００２１】
定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合分子は、例えばスーパーコイル化ＤＮＡなどの酵
素基質、細胞膜成分および古典的なレセプターを含め、
本発明のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと特異的に結合または相互作用する分子
またはイオンをいう。本発明のポリペプチドと、結合ま
たは相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、
本発明のポリペプチドに対して独占的であることが好ま
しく、またはその結合は本発明のポリペプチドに高度に
特異的であることもまた好ましく、またはその結合は本
発明のポリペプチドを包含するタンパク質群に高度に特
異的であることも好ましく、または本発明のポリペプチ
ドを含む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特
異的であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペ
プチドに特異的に結合する抗体および抗体由来の物質を
も包含する。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合分子は、例えばスーパーコイル化ＤＮＡなどの酵
素基質、細胞膜成分および古典的なレセプターを含め、
本発明のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと特異的に結合または相互作用する分子
またはイオンをいう。本発明のポリペプチドと、結合ま
たは相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、
本発明のポリペプチドに対して独占的であることが好ま
しく、またはその結合は本発明のポリペプチドに高度に
特異的であることもまた好ましく、またはその結合は本
発明のポリペプチドを包含するタンパク質群に高度に特
異的であることも好ましく、または本発明のポリペプチ
ドを含む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特
異的であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペ
プチドに特異的に結合する抗体および抗体由来の物質を
も包含する。
【００２２】「遺伝的エレメント」は、一般に、ポリペ
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
【００２３】「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、配列を比較して測定さ
れるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間
または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、
時には、かかる配列の鎖の間の合致により決定されるよ
うなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関連
性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は
共に容易に算出できる（Computational Molecular Biol
ogy，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティ
ー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：In
formatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、アカ
デミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer A
nalysis of Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャ
ージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Bio
logy，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチドまたは２つ
のポリペプチド間の同一性および類似性を測定するため
の多くの方法がある一方で、その両方の用語は当業者に
周知である（ＳequenceＡnalysis in ＭolecularＢiolo
gy，von Heinje，Ｇ.，ＡcademicＰress，1987；Ｓquen
ce ＡnalysisＰrimer，Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereu
x，Ｊ.，編、Ｍ ＳtocktonＰress，Ｎew Ｙork，1991；
およびＣarillo，Ｈ.，およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ
Ｊ.，ＡppliedＭath.，48：1073（1988））。２つの配
列間で同一性または類似性を測定するのに通常用いられ
る方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡ
Ｍ Ｊ.Ａpplied Ｍath.，48：1073（1988）に開示され
ている方法を包含するが、これに限定されるものではな
い。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する
配列間で最も良く適合するように設計される。同一性お
よび類似性を測定する方法は、コンピュータープログラ
ムに組み込まれている。二つの配列間の同一性および類
似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法
は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nuc
leic Acids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLA
STNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：
403（1990）））を包含するが、これらに限定されるも
のではない。
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、配列を比較して測定さ
れるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間
または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、
時には、かかる配列の鎖の間の合致により決定されるよ
うなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関連
性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は
共に容易に算出できる（Computational Molecular Biol
ogy，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティ
ー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：In
formatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、アカ
デミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer A
nalysis of Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャ
ージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Bio
logy，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチドまたは２つ
のポリペプチド間の同一性および類似性を測定するため
の多くの方法がある一方で、その両方の用語は当業者に
周知である（ＳequenceＡnalysis in ＭolecularＢiolo
gy，von Heinje，Ｇ.，ＡcademicＰress，1987；Ｓquen
ce ＡnalysisＰrimer，Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereu
x，Ｊ.，編、Ｍ ＳtocktonＰress，Ｎew Ｙork，1991；
およびＣarillo，Ｈ.，およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ
Ｊ.，ＡppliedＭath.，48：1073（1988））。２つの配
列間で同一性または類似性を測定するのに通常用いられ
る方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡ
Ｍ Ｊ.Ａpplied Ｍath.，48：1073（1988）に開示され
ている方法を包含するが、これに限定されるものではな
い。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する
配列間で最も良く適合するように設計される。同一性お
よび類似性を測定する方法は、コンピュータープログラ
ムに組み込まれている。二つの配列間の同一性および類
似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法
は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nuc
leic Acids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLA
STNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：
403（1990）））を包含するが、これらに限定されるも
のではない。
【００２４】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
【００２５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチド（複
数でも可）なる語は、しばしば、オリゴヌクレオチドと
称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチド（複
数でも可）なる語は、しばしば、オリゴヌクレオチドと
称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００２６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。本発明
のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、２
ないし３例示として示すと、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、
硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク
質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。かか
る修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に
記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば
糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボ
シル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Struc
ture and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighto
n、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に
記載されている。例えば、Posttranslational Covalent
Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミ
ック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttr
anslational Protein Modifications ：Perspective an
d Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:
626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：
Posttranslational Modifications and Aging，Ann.N.
Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）で提供される論文などの
多くの詳細な論文が、本主題に利用できる。ポリペプチ
ドはいつも完全に直鎖であるとは限らないということは
周知であり、前記した通りであると理解されよう。例え
ばポリペプチドはユビキチン化の結果分岐していてもよ
く、一般には、天然のプロセッシング事象を含む翻訳後
の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも
たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない
環状にできる。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同
様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。実際、
共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシル基またはその両方の遮断は、天然および合成
ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に本発明のポ
リペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ（E.co
li.）または他の細胞で作られるポリペプチドのアミノ
末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシングの前にほ
とんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろう。ペ
プチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端でメチオニン
残基を除去できる。従って、本発明は、本発明のタンパ
ク質のメチオニン含有およびメチオニン不含の両方のア
ミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに起こる
修飾はしばしばそれの作り方に影響される。例えば、宿
主にクローン化遺伝子を発現することにより作られるポ
リペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部分、宿
主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配
列に存在する修飾シグナルにより決定される。例えば、
周知のように、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主
では起こらないことがはしばしばである。従って、糖鎖
形成が望ましい場合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、
一般に、真核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行
う；この理由で昆虫細胞発現系が、糖鎖形成の本来のパ
ターンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現する
ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用
される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいく
つかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ること
は理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる
場合、「ポリペプチド」なる用語は、全てのこのような
修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包
含する。
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。本発明
のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、２
ないし３例示として示すと、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、
硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク
質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。かか
る修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に
記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば
糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボ
シル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Struc
ture and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighto
n、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に
記載されている。例えば、Posttranslational Covalent
Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミ
ック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttr
anslational Protein Modifications ：Perspective an
d Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:
626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：
Posttranslational Modifications and Aging，Ann.N.
Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）で提供される論文などの
多くの詳細な論文が、本主題に利用できる。ポリペプチ
ドはいつも完全に直鎖であるとは限らないということは
周知であり、前記した通りであると理解されよう。例え
ばポリペプチドはユビキチン化の結果分岐していてもよ
く、一般には、天然のプロセッシング事象を含む翻訳後
の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも
たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない
環状にできる。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同
様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。実際、
共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシル基またはその両方の遮断は、天然および合成
ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に本発明のポ
リペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ（E.co
li.）または他の細胞で作られるポリペプチドのアミノ
末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシングの前にほ
とんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろう。ペ
プチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端でメチオニン
残基を除去できる。従って、本発明は、本発明のタンパ
ク質のメチオニン含有およびメチオニン不含の両方のア
ミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに起こる
修飾はしばしばそれの作り方に影響される。例えば、宿
主にクローン化遺伝子を発現することにより作られるポ
リペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部分、宿
主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配
列に存在する修飾シグナルにより決定される。例えば、
周知のように、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主
では起こらないことがはしばしばである。従って、糖鎖
形成が望ましい場合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、
一般に、真核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行
う；この理由で昆虫細胞発現系が、糖鎖形成の本来のパ
ターンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現する
ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用
される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいく
つかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ること
は理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる
場合、「ポリペプチド」なる用語は、全てのこのような
修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包
含する。
【００２７】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。ポリヌクレオチドに関し
て、違いは、一般に、対照標準と変種のヌクレオチド配
列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一
であるものに限られる。以下に記すように、変種におけ
るヌクレオチドの配列の変化はサイレントであってもよ
い。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコー
ドされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型の
サイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。ポリペプチドに関して、違いは、一般に、対照
標準と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多く
の領域で同一であるものに限られる。変種および対照標
準のポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、
欠失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じて
いてもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていても
よい。
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。ポリヌクレオチドに関し
て、違いは、一般に、対照標準と変種のヌクレオチド配
列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一
であるものに限られる。以下に記すように、変種におけ
るヌクレオチドの配列の変化はサイレントであってもよ
い。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコー
ドされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型の
サイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。ポリペプチドに関して、違いは、一般に、対照
標準と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多く
の領域で同一であるものに限られる。変種および対照標
準のポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、
欠失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じて
いてもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていても
よい。
【００２８】本発明は、とりわけ、以下により詳細に記
載する、新規トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドおよ
びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、
本発明は、例えば、ヘモフィラス・インフルエンザのト
ポイソメラーゼＩＩＩタンパク質に対するアミノ酸配列
相同性により関連付けられる、スタフィロコッカス・ア
ウレウスの新規トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドに関する。スタフィロコ
ッカス・アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩに対して
最も近いのは、アミノ酸のレベルで３３％同一、５２％
類似しており、ヌクレオチドのレベルで５７％同一であ
るヘモフィラス・インフルエンザ・トポイソメラーゼＩ
ＩＩであり、アミノ酸のレベルで３０％同一、５３％類
似しており、ヌクレオチドのレベルで６６％同一である
イー・コリ（Ｅ.coli）トポイソメラーゼＩＩＩであ
る。これらの相同性の測定は、ＧenticsＣomputerＧrou
p BESTFITプログラムを用いて行った。本発明は特に図
１および２（配列番号：１）および図３（配列番号：
２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するス
タフィロコッカス・トポイソメラーゼＩＩＩ、ならびに
本明細書において「寄託生物」または「寄託生物のＤＮ
Ａ」と称するＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１より単離可
能なＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列に関する。図１および２（配列番号：
１）および図３（配列番号：２）に示すヌクレオチドお
よびアミノ酸配列は、寄託生物のＤＮＡを配列決定する
ことにより得られたことは理解されよう。従って、寄託
クローンの配列が、その配列（およびそれをコードする
配列）と図１および２（配列番号：１）および図３（配
列番号：２）の配列の間のいずれの不一致に関しても調
節するものである。
載する、新規トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドおよ
びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、
本発明は、例えば、ヘモフィラス・インフルエンザのト
ポイソメラーゼＩＩＩタンパク質に対するアミノ酸配列
相同性により関連付けられる、スタフィロコッカス・ア
ウレウスの新規トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドに関する。スタフィロコ
ッカス・アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩに対して
最も近いのは、アミノ酸のレベルで３３％同一、５２％
類似しており、ヌクレオチドのレベルで５７％同一であ
るヘモフィラス・インフルエンザ・トポイソメラーゼＩ
ＩＩであり、アミノ酸のレベルで３０％同一、５３％類
似しており、ヌクレオチドのレベルで６６％同一である
イー・コリ（Ｅ.coli）トポイソメラーゼＩＩＩであ
る。これらの相同性の測定は、ＧenticsＣomputerＧrou
p BESTFITプログラムを用いて行った。本発明は特に図
１および２（配列番号：１）および図３（配列番号：
２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するス
タフィロコッカス・トポイソメラーゼＩＩＩ、ならびに
本明細書において「寄託生物」または「寄託生物のＤＮ
Ａ」と称するＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１より単離可
能なＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列に関する。図１および２（配列番号：
１）および図３（配列番号：２）に示すヌクレオチドお
よびアミノ酸配列は、寄託生物のＤＮＡを配列決定する
ことにより得られたことは理解されよう。従って、寄託
クローンの配列が、その配列（およびそれをコードする
配列）と図１および２（配列番号：１）および図３（配
列番号：２）の配列の間のいずれの不一致に関しても調
節するものである。
【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図３（配列番号：２）の
推定アミノ酸配列を有するスタフィロコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコードする単離ポリヌ
クレオチドを提供する。図１および２（配列番号：１）
に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提供さ
れる情報を用いて、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的な
クローニングおよびスクリーニングの手法を用いて得る
ことができる。配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用いて
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るために
は、典型的には、イー・コリまたはいくつかの他の適当
な宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２
９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、図１お
よび２の配列に由来する、好ましくは１７量体またはそ
れ以上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドでプ
ローブする。ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有す
るクローンは、非常にストリンジェントな洗浄操作に付
すことにより区別できる。元の配列から設計された配列
決定プライマーで同定された個々のクローンを配列決定
することにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝子
配列を決定することが可能である。都合よくは、かかる
配列決定をプラスミドクローンから調製された変性二本
鎖ＤＮＡを用いて実施する。適当な技術については、Ma
niatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrook、J．、Molecu
lar Cloning，A Laboratory Manual（第2版；コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1989）；ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング1.９０および
変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこ
と）に記載されている。本発明の一例として、図１およ
び２に示すポリヌクレオチドは、実施例１に記載されて
いるように、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＩＭ
Ｂ４０７７１に由来するＤＮＡライブラリー中で見出し
たものである。
推定アミノ酸配列を有するスタフィロコッカス・トポイ
ソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコードする単離ポリヌ
クレオチドを提供する。図１および２（配列番号：１）
に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提供さ
れる情報を用いて、トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的な
クローニングおよびスクリーニングの手法を用いて得る
ことができる。配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用いて
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るために
は、典型的には、イー・コリまたはいくつかの他の適当
な宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２
９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、図１お
よび２の配列に由来する、好ましくは１７量体またはそ
れ以上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドでプ
ローブする。ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有す
るクローンは、非常にストリンジェントな洗浄操作に付
すことにより区別できる。元の配列から設計された配列
決定プライマーで同定された個々のクローンを配列決定
することにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝子
配列を決定することが可能である。都合よくは、かかる
配列決定をプラスミドクローンから調製された変性二本
鎖ＤＮＡを用いて実施する。適当な技術については、Ma
niatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrook、J．、Molecu
lar Cloning，A Laboratory Manual（第2版；コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1989）；ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング1.９０および
変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこ
と）に記載されている。本発明の一例として、図１およ
び２に示すポリヌクレオチドは、実施例１に記載されて
いるように、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＩＭ
Ｂ４０７７１に由来するＤＮＡライブラリー中で見出し
たものである。
【００３０】寄託クローンのトポイソメラーゼＩＩＩを
コードする配列を文献に報告されている配列と比較する
ことによりわかるように、本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩは、構造的に、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩファ
ミリーの他のタンパク質に関連付けられる。好ましいＤ
ＮＡ配列を図１および２（配列番号：１）に示す。これ
は、約７１１個のアミノ酸残基のタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを有する。このタンパ
ク質は、既知タンパク質の中でも、ヘモフィラス・イン
フルエンザ・トポイソメラーゼＩタンパク質に対して最
大の相同性を示す。
コードする配列を文献に報告されている配列と比較する
ことによりわかるように、本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩは、構造的に、細菌性トポイソメラーゼＩＩＩファ
ミリーの他のタンパク質に関連付けられる。好ましいＤ
ＮＡ配列を図１および２（配列番号：１）に示す。これ
は、約７１１個のアミノ酸残基のタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを有する。このタンパ
ク質は、既知タンパク質の中でも、ヘモフィラス・イン
フルエンザ・トポイソメラーゼＩタンパク質に対して最
大の相同性を示す。
【００３１】本発明のポリヌクレオチドは、クローニン
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１および２（配列番号：１）に示すポ
リヌクレオチドのコーディング配列と同一であってもよ
い。さらに、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結
果、図３（配列番号：２）のポリペプチドをコードする
異なる配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１および２（配列番号：１）に示すポ
リヌクレオチドのコーディング配列と同一であってもよ
い。さらに、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結
果、図３（配列番号：２）のポリペプチドをコードする
異なる配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３２】図３（配列番号：２）のポリペプチドをコ
ードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、
プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌
配列をコードするコーディング配列；付加非コーディン
グ配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共に
またはなしで、例えば、限定するものではないが、転写
にて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止
シグナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。ＤＮＡはまた、本発明のトポイソメラ
ーゼＩＩＩをコードするｍＲＮＡの転写を指令するよう
に機能するプロモーター領域を有していてもよい。その
ようなプロモーターは、独立して、組換え発現系におけ
る異種遺伝子の転写を指令するのに有用であるかもしれ
ない。さらには、該ポリペプチドは、融合ポリペプチド
の精製を促す、ペプチドなどのマーカー配列に融合して
いてもよい。本発明のこの態様のある具体例において、
マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、
とりわけｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテ
ィッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得られるタグであり、多
くが市販により入手可能である。例えば、Gentzら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載され
るように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の通常
の精製法を提供する。インフルエンザ・ヘマググルチニ
ン・タンパク質由来のエピトープに対応する、ＨＡタグ
もまた融合タンパク質の生成に使用でき、これについて
は例えばWilsonら、Cell，37:767（1984）に記載されて
いる。
ードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、
プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌
配列をコードするコーディング配列；付加非コーディン
グ配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共に
またはなしで、例えば、限定するものではないが、転写
にて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止
シグナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。ＤＮＡはまた、本発明のトポイソメラ
ーゼＩＩＩをコードするｍＲＮＡの転写を指令するよう
に機能するプロモーター領域を有していてもよい。その
ようなプロモーターは、独立して、組換え発現系におけ
る異種遺伝子の転写を指令するのに有用であるかもしれ
ない。さらには、該ポリペプチドは、融合ポリペプチド
の精製を促す、ペプチドなどのマーカー配列に融合して
いてもよい。本発明のこの態様のある具体例において、
マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、
とりわけｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテ
ィッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得られるタグであり、多
くが市販により入手可能である。例えば、Gentzら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載され
るように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の通常
の精製法を提供する。インフルエンザ・ヘマググルチニ
ン・タンパク質由来のエピトープに対応する、ＨＡタグ
もまた融合タンパク質の生成に使用でき、これについて
は例えばWilsonら、Cell，37:767（1984）に記載されて
いる。
【００３３】前記によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
３（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有する、スタ
フィロコッカス・アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩ
のポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオ
チド包含する。この用語は、さらにコーディングおよび
／または非コーディング配列を含有していてもよい、付
加領域と共に該ポリペプチドをコードする単一の連続領
域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージも
しくは挿入配列またはエディティング（editing）によ
り分断される）を含む、ポリヌクレオチドを包含する。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
３（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有する、スタ
フィロコッカス・アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩ
のポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオ
チド包含する。この用語は、さらにコーディングおよび
／または非コーディング配列を含有していてもよい、付
加領域と共に該ポリペプチドをコードする単一の連続領
域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージも
しくは挿入配列またはエディティング（editing）によ
り分断される）を含む、ポリヌクレオチドを包含する。
【００３４】本発明はさらに、図３（配列番号：２）の
推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書で前
記したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオ
チドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然の変種
であってもよく、または自然に発生することが知られて
いない変種であってもよい。このようなポリヌクレオチ
ドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物
に適用される方法を含め、突然変異誘発技術により作る
ことができる。
推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書で前
記したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオ
チドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然の変種
であってもよく、または自然に発生することが知られて
いない変種であってもよい。このようなポリヌクレオチ
ドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物
に適用される方法を含め、突然変異誘発技術により作る
ことができる。
【００３５】この点における変種には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換は１またはそれ以上のヌクレオ
チドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディ
ング領域またはその両方において変化していてもよい。
コーディング領域における変化が保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれな
い。この点に関する本発明の特に好ましい具体例には、
図３（配列番号：２）に示すスタフィロコッカス・トポ
イソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド；それらの変種、アナ
ログ、誘導体およびフラグメントがある。
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換は１またはそれ以上のヌクレオ
チドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディ
ング領域またはその両方において変化していてもよい。
コーディング領域における変化が保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれな
い。この点に関する本発明の特に好ましい具体例には、
図３（配列番号：２）に示すスタフィロコッカス・トポ
イソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド；それらの変種、アナ
ログ、誘導体およびフラグメントがある。
【００３６】この点において、さらに特に好ましくは、
図３（配列番号：２）のスタフィロコッカス・トポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドで、そのうち、数個、わず
かな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個の
アミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されているアミノ酸配列を有する、トポイソメラ
ーゼＩＩＩ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および欠
失であり、トポイソメラーゼＩＩＩの特性および活性を
変えないものである。また、この点に関してとりわけ好
ましいものは、保存的置換である。最も好ましいもの
は、置換されていない、図３（配列番号：２）のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。本発明のさらに好ましい態様は、図３（配
列番号：２）に示すアミノ酸配列を有するトポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、お
よびかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。また、寄託クローンのスタフィロコッカス・
アウレウスＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも８
０％同一である領域を有するポリヌクレオチド、および
それらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。こ
の点において、その同じものに対して少なくとも９０％
の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好まし
く、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特
に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好ま
しく、その中でも少なくとも９８％および少なくとも９
９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％
であるのがより好ましい。
図３（配列番号：２）のスタフィロコッカス・トポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドで、そのうち、数個、わず
かな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個の
アミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されているアミノ酸配列を有する、トポイソメラ
ーゼＩＩＩ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および欠
失であり、トポイソメラーゼＩＩＩの特性および活性を
変えないものである。また、この点に関してとりわけ好
ましいものは、保存的置換である。最も好ましいもの
は、置換されていない、図３（配列番号：２）のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。本発明のさらに好ましい態様は、図３（配
列番号：２）に示すアミノ酸配列を有するトポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、お
よびかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。また、寄託クローンのスタフィロコッカス・
アウレウスＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも８
０％同一である領域を有するポリヌクレオチド、および
それらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。こ
の点において、その同じものに対して少なくとも９０％
の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好まし
く、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特
に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好ま
しく、その中でも少なくとも９８％および少なくとも９
９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％
であるのがより好ましい。
【００３７】この点に関してとりわけ好ましい具体例
は、さらには、図１および２（配列番号：１）のＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の
生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドである。本発明はさらに本明細
書で前記した配列にハイブリダイゼーションするポリヌ
クレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下で本明細書で前記したポ
リヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関する。本明細書で用いる「ストリンジェン
トな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列
間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の
同一性がある場合にのみ起こることを意味する。
は、さらには、図１および２（配列番号：１）のＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の
生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドである。本発明はさらに本明細
書で前記した配列にハイブリダイゼーションするポリヌ
クレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下で本明細書で前記したポ
リヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関する。本明細書で用いる「ストリンジェン
トな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列
間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の
同一性がある場合にのみ起こることを意味する。
【００３８】本発明のポリヌクレオチドアッセイについ
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする完全
長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ならびにト
ポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子に対して高度な配列類似性
を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを
単離することができる。かかるプローブは、一般に、少
なくとも１５塩基を有してなる。好ましくは、かかるプ
ローブは少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０
塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは少なくと
も３０塩基を有し、５０以下の塩基を有する。例えば、
トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のコーディング領域は、
既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴヌク
レオチドプローブを合成することにより単離できる。つ
いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、
ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイ
ズするかを決定する。
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする完全
長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ならびにト
ポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子に対して高度な配列類似性
を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを
単離することができる。かかるプローブは、一般に、少
なくとも１５塩基を有してなる。好ましくは、かかるプ
ローブは少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０
塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは少なくと
も３０塩基を有し、５０以下の塩基を有する。例えば、
トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子のコーディング領域は、
既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴヌク
レオチドプローブを合成することにより単離できる。つ
いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、
ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイ
ズするかを決定する。
【００３９】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列（配列番号：１）より誘導さ
れる、オリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオ
チドは、本明細書において同定されたスタフィロコッカ
ス・アウレウス遺伝子が、全体としてまたは部分的に、
感染組織にて転写されるかどうかを決定するために、本
明細書に前記した方法でのＰＣＲプライマーとして使用
できる。かかる配列はまた、病因が達した感染の段階お
よび型の診断にも有用であると思われる。ポリヌクレオ
チドは、成熟タンパク質に、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸が加わるか、またはその内部に
アミノ酸が加わった（例えば成熟形態が一つ以上のポリ
ペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードでき
る。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質の
プロセッシングにおいて役割を有し、タンパク質を運
び、タンパク質の半減期を長くしたり短くしたり、また
はとりわけアッセイもしくは生成のためのタンパク質の
操作を容易にすることができる。インビボで一般的なよ
うに、付加アミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク質
からプロセッシングで取り除かれる。
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列（配列番号：１）より誘導さ
れる、オリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオ
チドは、本明細書において同定されたスタフィロコッカ
ス・アウレウス遺伝子が、全体としてまたは部分的に、
感染組織にて転写されるかどうかを決定するために、本
明細書に前記した方法でのＰＣＲプライマーとして使用
できる。かかる配列はまた、病因が達した感染の段階お
よび型の診断にも有用であると思われる。ポリヌクレオ
チドは、成熟タンパク質に、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸が加わるか、またはその内部に
アミノ酸が加わった（例えば成熟形態が一つ以上のポリ
ペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードでき
る。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質の
プロセッシングにおいて役割を有し、タンパク質を運
び、タンパク質の半減期を長くしたり短くしたり、また
はとりわけアッセイもしくは生成のためのタンパク質の
操作を容易にすることができる。インビボで一般的なよ
うに、付加アミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク質
からプロセッシングで取り除かれる。
【００４０】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
【００４１】寄託材料 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９は、ナシ
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アン
ド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）、
アバディーン、スコットランドに１９９５年９月１１日
に寄託され、ＮＣＩＭＢ番号４０７７１を付された。寄
託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブ
ダペスト条約の条件下で行われている。特許が発行され
ると何らの制限または条件もなく、最終的には株は分譲
される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３
５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄
託が実施可能要件であることを承認するものではない。
寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびに
それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象を調節するも
のである。寄託材料を製造、使用または販売するために
はライセンスが必要であるが、そのようなライセンスは
ここで付与されるものではない。
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アン
ド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）、
アバディーン、スコットランドに１９９５年９月１１日
に寄託され、ＮＣＩＭＢ番号４０７７１を付された。寄
託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブ
ダペスト条約の条件下で行われている。特許が発行され
ると何らの制限または条件もなく、最終的には株は分譲
される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３
５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄
託が実施可能要件であることを承認するものではない。
寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびに
それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象を調節するも
のである。寄託材料を製造、使用または販売するために
はライセンスが必要であるが、そのようなライセンスは
ここで付与されるものではない。
【００４２】ポリペプチド 本発明はさらには図３（配列番号：２）の推定アミノ酸
配列を有する細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグ
メント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、
図３（配列番号：２）のポリペプチドをいう場合、かか
るポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドを意味する。元のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの少なくとも９０％の活性を保持するフラ
グメント、誘導体およびアナログが好ましい。元のトポ
イソメラーゼＩＩＩの少なくとも９５％の活性を保持す
るフラグメント、誘導体およびアナログが好ましい。従
って、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性
成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク
質を包含する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例では、該ポリペプチ
ドは組換えポリペプチドである。
配列を有する細菌性トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチ
ドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグ
メント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、
図３（配列番号：２）のポリペプチドをいう場合、かか
るポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドを意味する。元のトポイソメ
ラーゼＩＩＩの少なくとも９０％の活性を保持するフラ
グメント、誘導体およびアナログが好ましい。元のトポ
イソメラーゼＩＩＩの少なくとも９５％の活性を保持す
るフラグメント、誘導体およびアナログが好ましい。従
って、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性
成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク
質を包含する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例では、該ポリペプチ
ドは組換えポリペプチドである。
【００４３】図３（配列番号：２）のポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１また
はそれ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸
残基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換された
もので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコー
ドされたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）
１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、
または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例え
ばポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリ
エチレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）
付加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟
ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用い
られる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであ
ってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナロ
グは本明細書の教示より当業者であれば得られると考え
られる。
ラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１また
はそれ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸
残基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換された
もので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコー
ドされたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）
１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、
または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例え
ばポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリ
エチレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）
付加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟
ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用い
られる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであ
ってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナロ
グは本明細書の教示より当業者であれば得られると考え
られる。
【００４４】この点において、本発明の特に好ましい具
体例には、図３（配列番号：２）のスタフィロコッカス
・トポイソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体がある。好ましい変種には、保存的アミノ酸置換
により対照標準と異なる変種がある。かかる置換は、ポ
リペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミ
ノ酸で置換したものである。典型的には、保存的置換と
して認められるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、
ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換え；ヒドロキシ
ル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐおよ
びＧｌｕの取り替え、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間
での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの取り替えお
よび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置き換えである。
体例には、図３（配列番号：２）のスタフィロコッカス
・トポイソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体がある。好ましい変種には、保存的アミノ酸置換
により対照標準と異なる変種がある。かかる置換は、ポ
リペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミ
ノ酸で置換したものである。典型的には、保存的置換と
して認められるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、
ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換え；ヒドロキシ
ル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐおよ
びＧｌｕの取り替え、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間
での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの取り替えお
よび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置き換えである。
【００４５】この点においてさらに好ましいのは、数
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図３（配列番号：２）のトポイソメ
ラーゼＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列を有する、変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそ
のフラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
これらの中でもとりわけ好ましいのは、トポイソメラー
ゼＩＩＩの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。またこの点において特に好
ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは、置
換していない図３（配列番号：２）のアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好まし
く、均質になるまで精製するのが好ましい。
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図３（配列番号：２）のトポイソメ
ラーゼＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列を有する、変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそ
のフラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
これらの中でもとりわけ好ましいのは、トポイソメラー
ゼＩＩＩの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。またこの点において特に好
ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは、置
換していない図３（配列番号：２）のアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好まし
く、均質になるまで精製するのが好ましい。
【００４６】本発明のポリペプチドは、図３（配列番
号：２）のポリペプチド、特に成熟ポリペプチド、なら
びに図３（配列番号：２）のポリペプチドに対して少な
くとも８０％の同一性を有するポリペプチド、好ましく
は図３（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なく
とも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０
％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９５％の類
似性を有するポリペプチド、なおさらに好ましくは図３
（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９
５％の同一性を有するポリペプチドを包含し、また一般
に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少な
くとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのその
ような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包含
する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分
は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチド
を製造するのに用いることができる；従って、該フラグ
メントは完全長のポリペプチドを製造するための中間体
として用いることができる。本発明のポリヌクレオチド
のフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長のポ
リヌクレオチドを合成することができる。
号：２）のポリペプチド、特に成熟ポリペプチド、なら
びに図３（配列番号：２）のポリペプチドに対して少な
くとも８０％の同一性を有するポリペプチド、好ましく
は図３（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なく
とも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０
％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９５％の類
似性を有するポリペプチド、なおさらに好ましくは図３
（配列番号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９
５％の同一性を有するポリペプチドを包含し、また一般
に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少な
くとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのその
ような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包含
する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分
は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチド
を製造するのに用いることができる；従って、該フラグ
メントは完全長のポリペプチドを製造するための中間体
として用いることができる。本発明のポリヌクレオチド
のフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長のポ
リヌクレオチドを合成することができる。
【００４７】フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、トポイソ
メラーゼＩＩＩのフラグメント、特に図３（配列番号：
２）に示すアミノ酸を有するトポイソメラーゼＩＩＩの
フラグメント、および図３（配列番号：２）のトポイソ
メラーゼＩＩＩの変種および誘導体のフラグメントを有
してなるポリペプチドがある。この点において、フラグ
メントは前記のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドお
よびその変種または誘導体のアミノ酸配列が、全てでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
メラーゼＩＩＩのフラグメント、特に図３（配列番号：
２）に示すアミノ酸を有するトポイソメラーゼＩＩＩの
フラグメント、および図３（配列番号：２）のトポイソ
メラーゼＩＩＩの変種および誘導体のフラグメントを有
してなるポリペプチドがある。この点において、フラグ
メントは前記のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドお
よびその変種または誘導体のアミノ酸配列が、全てでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
【００４８】かかるフラグメントは、「自立してい
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、トポイソメラーゼＩＩＩフラグメントのアミノ末端
に融合した異型のプレおよびプロポリペプチド領域、お
よび該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加
領域を有し、宿主中に発現するように設計された前駆体
ポリペプチド内に含まれる本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本
明細書の意図するところの一の態様におけるフラグメン
トは、トポイソメラーゼＩＩＩ由来の融合ポリペプチド
または融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を意味
する。
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、トポイソメラーゼＩＩＩフラグメントのアミノ末端
に融合した異型のプレおよびプロポリペプチド領域、お
よび該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加
領域を有し、宿主中に発現するように設計された前駆体
ポリペプチド内に含まれる本発明のトポイソメラーゼＩ
ＩＩポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本
明細書の意図するところの一の態様におけるフラグメン
トは、トポイソメラーゼＩＩＩ由来の融合ポリペプチド
または融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を意味
する。
【００４９】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
例として、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４
０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９
０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１０
０〜１２５および１１０〜１４０、１２０−１５０、２
００−３００、１−１７５または１−７１１のアミノ酸
の長さを有するポリヌクレオチドフラグメントが挙げら
れる。これに関して、「約」は、特に、言及した範囲、
およびどちらかの末端または両方の末端で数個、わずか
な、５、４、３、２または１個のアミノ酸が多いまたは
少ない範囲を包含する。
例として、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４
０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９
０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１０
０〜１２５および１１０〜１４０、１２０−１５０、２
００−３００、１−１７５または１−７１１のアミノ酸
の長さを有するポリヌクレオチドフラグメントが挙げら
れる。これに関して、「約」は、特に、言及した範囲、
およびどちらかの末端または両方の末端で数個、わずか
な、５、４、３、２または１個のアミノ酸が多いまたは
少ない範囲を包含する。
【００５０】本発明の特に好ましいフラグメントには、
トポイソメラーゼＩＩＩの切断突然変異体がある。切断
突然変異体は、アミノ末端を含む残基の一連の残基（す
なわち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキ
シル末端を含む一連の残基の欠失、または二重切断突然
変異体のように一つはアミノ末端を含み、一つはカルボ
キシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除
けば、図３（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、またはその変種も
しくは誘導体を包含する。前記した大きさの範囲のフラ
グメントもまた切断フラグメントの好ましい具体例であ
り、一般に、フラグメントの中でも特に好ましい。宿主
細胞における本発明のポリヌクレオチドの減成形態もま
た好ましい。
トポイソメラーゼＩＩＩの切断突然変異体がある。切断
突然変異体は、アミノ末端を含む残基の一連の残基（す
なわち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキ
シル末端を含む一連の残基の欠失、または二重切断突然
変異体のように一つはアミノ末端を含み、一つはカルボ
キシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除
けば、図３（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するト
ポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド、またはその変種も
しくは誘導体を包含する。前記した大きさの範囲のフラ
グメントもまた切断フラグメントの好ましい具体例であ
り、一般に、フラグメントの中でも特に好ましい。宿主
細胞における本発明のポリヌクレオチドの減成形態もま
た好ましい。
【００５１】また本発明のこの態様にて、トポイソメラ
ーゼＩＩＩの構造的または機能的属性により特徴づけら
れるフラグメントも好ましい。この点において本発明の
好ましい具体例は、トポイソメラーゼＩＩＩのアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域
（「アルファー領域」）、ベータシートおよびベータシ
ート形成領域（「ベータ領域」）、ターンおよびターン
形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル領域」）、親水領域、疎水領域、アルフ
ァー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界
面形成領域および高抗原指数領域からなるフラグメント
を包含する。
ーゼＩＩＩの構造的または機能的属性により特徴づけら
れるフラグメントも好ましい。この点において本発明の
好ましい具体例は、トポイソメラーゼＩＩＩのアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域
（「アルファー領域」）、ベータシートおよびベータシ
ート形成領域（「ベータ領域」）、ターンおよびターン
形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル領域」）、親水領域、疎水領域、アルフ
ァー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界
面形成領域および高抗原指数領域からなるフラグメント
を包含する。
【００５２】さらに好ましい領域は、トポイソメラーゼ
ＩＩＩの活性を媒介する領域である。この点において、
類似活性もしくは改善された活性を有するもの、または
望ましくない活性を減じたフラグメントを含め、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの化学的、生物学的またはその他の活
性を有するフラグメントが最も好ましい。慣用的には、
周知方法にてフラグメントを生成し、ついで後記するよ
うな都合のよいアッセイにて、そのフラグメントの活性
を天然のトポイソメラーゼＩＩＩと比較する。この点に
おいて、配列もしくは位置または両方において、イー・
コリ・トポイソメラーゼＩＩＩおよびヘモフィラス・イ
ンフルエンザ・トポイソメラーゼＩＩＩを包含する、図
３（配列番号：２）に示す関連ポリペプチドなどの関連
ポリペプチドの活性な領域に対して相同である領域を有
するフラグメントが非常に好ましい。この点において、
特に好ましいフラグメントには、前記した切断突然変異
体がある。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメン
トは、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的であ
るフラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記
のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダ
イゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレ
オチド、およびそのフラグメントをコードするポリヌク
レオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリ
ヌクレオチドに関する。この点において、好ましいポリ
ヌクレオチドは、前記するような、好ましいフラグメン
トに対応するポリヌクレオチドである。
ＩＩＩの活性を媒介する領域である。この点において、
類似活性もしくは改善された活性を有するもの、または
望ましくない活性を減じたフラグメントを含め、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの化学的、生物学的またはその他の活
性を有するフラグメントが最も好ましい。慣用的には、
周知方法にてフラグメントを生成し、ついで後記するよ
うな都合のよいアッセイにて、そのフラグメントの活性
を天然のトポイソメラーゼＩＩＩと比較する。この点に
おいて、配列もしくは位置または両方において、イー・
コリ・トポイソメラーゼＩＩＩおよびヘモフィラス・イ
ンフルエンザ・トポイソメラーゼＩＩＩを包含する、図
３（配列番号：２）に示す関連ポリペプチドなどの関連
ポリペプチドの活性な領域に対して相同である領域を有
するフラグメントが非常に好ましい。この点において、
特に好ましいフラグメントには、前記した切断突然変異
体がある。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメン
トは、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的であ
るフラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記
のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダ
イゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレ
オチド、およびそのフラグメントをコードするポリヌク
レオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリ
ヌクレオチドに関する。この点において、好ましいポリ
ヌクレオチドは、前記するような、好ましいフラグメン
トに対応するポリヌクレオチドである。
【００５３】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは複数の
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
【００５４】宿主細胞内のポリヌクレオチド構築物を従
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
【００５５】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
【００５６】ある点において中でも好ましいベクター
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点におけるある好ましい具体例では、ベクタ
ーは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導
可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現
するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現
であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ま
しいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容
易である環境因子により発現を誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核お
よび真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現ベ
クターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されてい
る。
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点におけるある好ましい具体例では、ベクタ
ーは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導
可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現
するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現
であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ま
しいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容
易である環境因子により発現を誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核お
よび真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現ベ
クターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されてい
る。
【００５７】非常に多くの種類の発現ベクターを用い
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
【００５８】適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻
訳されるべきポリペプチドの終末部分に適当に位置する
終止コドンを含む。
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻
訳されるべきポリペプチドの終末部分に適当に位置する
終止コドンを含む。
【００５９】加えて、構築物は、発現を制御および誘起
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばスタフィロコッカス（レンサ球菌）、ストレプトコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス（枯草菌）細
胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細
胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプ
テラＳf９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈe
Ｌa、Ｃ１２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェ
ス（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばスタフィロコッカス（レンサ球菌）、ストレプトコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス（枯草菌）細
胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細
胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプ
テラＳf９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈe
Ｌa、Ｃ１２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェ
ス（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
【００６０】市販されている以下のベクターを例示とし
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
【００６１】制限部位または候補プロモーター（candid
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
【００６２】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
【００６３】本発明のポリペプチドの異種構造配列をコ
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、
開始コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位
および開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフ
レームは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端
に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構
築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転
写領域の３′末端に適宜配置される転写終止シグナルは
また、ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、
開始コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位
および開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフ
レームは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端
に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構
築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転
写領域の３′末端に適宜配置される転写終止シグナルは
また、ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。
【００６４】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加し、精製中またはその後の操
作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性
を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプ
チドに領域を付加することもできる。かかる領域はポリ
ペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部
分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出
を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にする
のは、当該分野でよくあることであり、慣用される技術
である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可
溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来す
る異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫
グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパ
ク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示す
る。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処
理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分
と融合させ、アンタゴニストを同定することができる。
D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8：
52-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal of Bi
ological Chemistry，270（16)：9459-9471（1995）を
参照のこと。
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加し、精製中またはその後の操
作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性
を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプ
チドに領域を付加することもできる。かかる領域はポリ
ペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部
分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出
を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にする
のは、当該分野でよくあることであり、慣用される技術
である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可
溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来す
る異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫
グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパ
ク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示す
る。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処
理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分
と融合させ、アンタゴニストを同定することができる。
D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8：
52-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal of Bi
ological Chemistry，270（16)：9459-9471（1995）を
参照のこと。
【００６５】ついで、典型的には、細胞を遠心分離によ
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。
【００６６】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’隣接非転写配列を有
していてもよい。この点におけるある好ましい具体例で
は、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位由来のＤＮＡ配列は、これらの型の必要とされ
る非転写遺伝的エレメントに用いられる。トポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、
周知方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製で
きる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離
および／または精製中に変性する場合、再び活性なコン
ホメーションを得るために、タンパク質を再生するため
の周知の技術を用いることができる。
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’隣接非転写配列を有
していてもよい。この点におけるある好ましい具体例で
は、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位由来のＤＮＡ配列は、これらの型の必要とされ
る非転写遺伝的エレメントに用いられる。トポイソメラ
ーゼＩＩＩポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、
周知方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製で
きる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離
および／または精製中に変性する場合、再び活性なコン
ホメーションを得るために、タンパク質を再生するため
の周知の技術を用いることができる。
【００６７】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、化学合成法の産物および組換え技法により原核
または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞から製造した産物を包含する。組
換え産生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドは糖鎖形成されてもいてもまたはされていなく
てもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、ある
場合は宿主媒介工程の結果として、開始修飾メチオニン
残基をも含んでいてもよい。トポイソメラーゼＩＩＩポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って
種々の用途、特にトポイソメラーゼＩＩＩの化学的およ
び生物学的特性を利用する用途に使用することができ
る。さらなる用途は、細胞、組織および生物の障害の診
断および治療に関する。本発明のこれらの態様を、以下
においてさらに説明する。
た産物、化学合成法の産物および組換え技法により原核
または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞から製造した産物を包含する。組
換え産生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドは糖鎖形成されてもいてもまたはされていなく
てもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、ある
場合は宿主媒介工程の結果として、開始修飾メチオニン
残基をも含んでいてもよい。トポイソメラーゼＩＩＩポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って
種々の用途、特にトポイソメラーゼＩＩＩの化学的およ
び生物学的特性を利用する用途に使用することができ
る。さらなる用途は、細胞、組織および生物の障害の診
断および治療に関する。本発明のこれらの態様を、以下
においてさらに説明する。
【００６８】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのトポイソメラーゼＩＩＩポリ
ヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動
物、特にヒトにおいて細菌性トポイソメラーゼＩＩＩを
検出することにより、疾患の診断に加え、診断を限定
し、または診断を可能とする診断方法が得られるであろ
う。トポイソメラーゼＩＩＩ産生細菌に感染した真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）、特に哺乳
動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は個体の細胞お
よび組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から
入手できる。組織生検および剖検材もまた、診断アッセ
イに用いるための個体由来のサンプルとして好ましい。
細菌性ＤＮＡは検出に直接使用してもよく、または分析
前にＰＣＲを用いて酵素的に増幅させてもよい。ＰＣＲ
（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同様に用いることができる。一例と
して、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸に相補
的なＰＣＲプライマーを用いて、トポイソメラーゼＩＩ
Ｉの存在および発現を同定および分析できる。ＰＣＲを
用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する
原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析によ
り特徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺伝子型
と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および挿
入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射標
識したトポイソメラーゼＩＩＩＲＮＡに、また別法とし
て放射標識したトポイソメラーゼＩＩＩアンチセンス
ＤＮＡにハイブリダイゼーションすることにより同定で
きる。完全に対合する配列は、ＲＮaseＡ消化により、
または融解温度の差異により、誤対合二重らせんと区別
できる。
レオチドを検出するためのトポイソメラーゼＩＩＩポリ
ヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動
物、特にヒトにおいて細菌性トポイソメラーゼＩＩＩを
検出することにより、疾患の診断に加え、診断を限定
し、または診断を可能とする診断方法が得られるであろ
う。トポイソメラーゼＩＩＩ産生細菌に感染した真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）、特に哺乳
動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は個体の細胞お
よび組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から
入手できる。組織生検および剖検材もまた、診断アッセ
イに用いるための個体由来のサンプルとして好ましい。
細菌性ＤＮＡは検出に直接使用してもよく、または分析
前にＰＣＲを用いて酵素的に増幅させてもよい。ＰＣＲ
（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同様に用いることができる。一例と
して、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸に相補
的なＰＣＲプライマーを用いて、トポイソメラーゼＩＩ
Ｉの存在および発現を同定および分析できる。ＰＣＲを
用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する
原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析によ
り特徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺伝子型
と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および挿
入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射標
識したトポイソメラーゼＩＩＩＲＮＡに、また別法とし
て放射標識したトポイソメラーゼＩＩＩアンチセンス
ＤＮＡにハイブリダイゼーションすることにより同定で
きる。完全に対合する配列は、ＲＮaseＡ消化により、
または融解温度の差異により、誤対合二重らせんと区別
できる。
【００６９】対照標準の遺伝子および突然変異を有する
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく細菌の種々の株の
遺伝的タイピングは、変性剤を含むまたは含まないゲル
中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出する
ことにより達成できる。小さな配列の欠失および挿入は
高分解ゲル電気泳動により可視化できる。種々の配列の
ＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融
解温度によって、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が
ゲル中の異なる位置で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲ
ル上にて区別できる（例えばMeyersら、Science，230:1
242（1985）参照）。
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく細菌の種々の株の
遺伝的タイピングは、変性剤を含むまたは含まないゲル
中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出する
ことにより達成できる。小さな配列の欠失および挿入は
高分解ゲル電気泳動により可視化できる。種々の配列の
ＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融
解温度によって、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が
ゲル中の異なる位置で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲ
ル上にて区別できる（例えばMeyersら、Science，230:1
242（1985）参照）。
【００７０】特異的な位置での配列の変化はまた、ＲＮ
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッテ
ィングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッテ
ィングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
【００７１】本発明の遺伝子の突然変異または多形型を
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもでき
る。診断用の核酸は、限定されるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検材を含む、感染した
個体の細胞から、または上記した供給源より単離または
培養した細菌から得ることもできる。細菌性ＤＮＡを直
接的に検出するのに用いてもよく、または分析前にＰＣ
Ｒ（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））を用いて
酵素的に増幅させてもよい。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変
異を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例え
ば、ＧeneＳcanなどの自動検出系と組み合わせて用いる
のが特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目
的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。
一例として、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸
に相補的なＰＣＲプライマーを公知方法を用いて製造
し、突然変異を同定および分析するのに用いる。そのプ
ライマーを用いて、例えば、ＰＣＲなどの公知方法を利
用し、完全長の遺伝子配列を得ることができる。そのよ
うなプライマーとして、例えば、５′−ＴＡＡＡＡＧＡ
ＡＣＧＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧ−３′［配列番号：４］
（上部プライマー）および５′−ＡＡＡＡＡＣＡＡＴＡ
ＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＣＴ−３′［配列番号：５］
（下部プライマー）。例えば、欠失および挿入を、正常
の遺伝子型との比較において、増幅産物の大きさの変化
により検出できる。点突然変異は放射標識したＲＮＡ、
また別法として放射標識したアンチセンスＤＮＡ配列に
増幅したＤＮＡをハイブリダイゼーションすることによ
り同定できる。完全に対合した配列は、ＲＮaseＡ消化
により、または融解温度の差により、誤対合二重らせん
と区別できる。これらのプライマーは個体由来のサンプ
ルから単離したトポイソメラーゼＩＩＩｃＤＮＡを増幅
させるのに用いることができる。本発明はまた、その
５′および／または３′末端から除去した１、２、３ま
たは４個のヌクレオチドを有するプライマーも提供す
る。該プライマーを用いて個体から単離した遺伝子を増
幅させ、ついでその遺伝子をＤＮＡ配列を明らかにする
ための種々の技法に供してもよい。このようにして、Ｄ
ＮＡ配列における突然変異を検出してもよい。
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもでき
る。診断用の核酸は、限定されるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検材を含む、感染した
個体の細胞から、または上記した供給源より単離または
培養した細菌から得ることもできる。細菌性ＤＮＡを直
接的に検出するのに用いてもよく、または分析前にＰＣ
Ｒ（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））を用いて
酵素的に増幅させてもよい。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変
異を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例え
ば、ＧeneＳcanなどの自動検出系と組み合わせて用いる
のが特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目
的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。
一例として、トポイソメラーゼＩＩＩをコードする核酸
に相補的なＰＣＲプライマーを公知方法を用いて製造
し、突然変異を同定および分析するのに用いる。そのプ
ライマーを用いて、例えば、ＰＣＲなどの公知方法を利
用し、完全長の遺伝子配列を得ることができる。そのよ
うなプライマーとして、例えば、５′−ＴＡＡＡＡＧＡ
ＡＣＧＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧ−３′［配列番号：４］
（上部プライマー）および５′−ＡＡＡＡＡＣＡＡＴＡ
ＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＣＴ−３′［配列番号：５］
（下部プライマー）。例えば、欠失および挿入を、正常
の遺伝子型との比較において、増幅産物の大きさの変化
により検出できる。点突然変異は放射標識したＲＮＡ、
また別法として放射標識したアンチセンスＤＮＡ配列に
増幅したＤＮＡをハイブリダイゼーションすることによ
り同定できる。完全に対合した配列は、ＲＮaseＡ消化
により、または融解温度の差により、誤対合二重らせん
と区別できる。これらのプライマーは個体由来のサンプ
ルから単離したトポイソメラーゼＩＩＩｃＤＮＡを増幅
させるのに用いることができる。本発明はまた、その
５′および／または３′末端から除去した１、２、３ま
たは４個のヌクレオチドを有するプライマーも提供す
る。該プライマーを用いて個体から単離した遺伝子を増
幅させ、ついでその遺伝子をＤＮＡ配列を明らかにする
ための種々の技法に供してもよい。このようにして、Ｄ
ＮＡ配列における突然変異を検出してもよい。
【００７２】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、
細胞および組織中のトポイソメラーゼＩＩＩのレベルを
検出するための定量および診断アッセイなどの診断アッ
セイに関する。このように、例えば、正常な対照標準の
組織サンプルと比較し、トポイソメラーゼＩＩＩタンパ
ク質の発現を検出することについて本発明に係る診断ア
ッセイを用いて、感染の存在を検出することができる。
宿主由来のサンプル中の本発明のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉタンパク質などのタンパク質のレベルを測定するため
に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ
る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好まし
い。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、トポイソメラーゼＩ
ＩＩに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製する。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合
するリポーター抗体が調製される。リポーター抗体は放
射活性、蛍光または酵素試薬、この例においては西洋ワ
サビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬に結合す
る。
細胞および組織中のトポイソメラーゼＩＩＩのレベルを
検出するための定量および診断アッセイなどの診断アッ
セイに関する。このように、例えば、正常な対照標準の
組織サンプルと比較し、トポイソメラーゼＩＩＩタンパ
ク質の発現を検出することについて本発明に係る診断ア
ッセイを用いて、感染の存在を検出することができる。
宿主由来のサンプル中の本発明のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉタンパク質などのタンパク質のレベルを測定するため
に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ
る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好まし
い。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、トポイソメラーゼＩ
ＩＩに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製する。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合
するリポーター抗体が調製される。リポーター抗体は放
射活性、蛍光または酵素試薬、この例においては西洋ワ
サビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬に結合す
る。
【００７３】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
【００７４】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。
【００７５】別法として、ファージディスプレイ技術を
利用して、抗Ｆｂｐの保持に関してスクリーニングした
ヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパ
ートリー由来の、または未処理のライブラリー由来のポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択
することができる（McCafferty,J.ら、Nature 348：552
-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10：779-78
3（1992））。これらの抗体の親和性は、チェーンシャ
フリング（chain shuffling）（Clackson,T.ら、Nature
352：624-628（1991））により改善することもでき
る。２つの抗原結合ドメインがあるならば、各ドメイン
を、「二特異的」抗体と称される、異なるエピトープに
向けることができる。
利用して、抗Ｆｂｐの保持に関してスクリーニングした
ヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパ
ートリー由来の、または未処理のライブラリー由来のポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択
することができる（McCafferty,J.ら、Nature 348：552
-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10：779-78
3（1992））。これらの抗体の親和性は、チェーンシャ
フリング（chain shuffling）（Clackson,T.ら、Nature
352：624-628（1991））により改善することもでき
る。２つの抗原結合ドメインがあるならば、各ドメイン
を、「二特異的」抗体と称される、異なるエピトープに
向けることができる。
【００７６】前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチ
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けトポイソメラーゼＩＩＩに対する抗体を用いて、感
染、特に細菌感染、特にスタフィロコッカス感染を阻害
および／または治療し、ならびに抗生物質治療の効能を
モニターすることができる。
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けトポイソメラーゼＩＩＩに対する抗体を用いて、感
染、特に細菌感染、特にスタフィロコッカス感染を阻害
および／または治療し、ならびに抗生物質治療の効能を
モニターすることができる。
【００７７】ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
【００７８】ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
【００７９】抗体またはその誘導体を修飾して、個体に
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。
【００８０】本発明のポリヌクレオチドを遺伝的免疫に
使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの
筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（19
92）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264：16985（1989））、リ
ン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Res
hef、Proc.Nat'l.Acad.Sci.（USA）83：9551（198
6））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（Kan
edaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tan
gら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Ce
ll Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロウ
イルスを用いたインビボ感染（Seegerら、Proc.Nat'l.A
cad.Sci. （USA）81：5849（1984））などの適当な送達
方法を用いる。
使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの
筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（19
92）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264：16985（1989））、リ
ン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Res
hef、Proc.Nat'l.Acad.Sci.（USA）83：9551（198
6））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（Kan
edaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tan
gら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Ce
ll Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロウ
イルスを用いたインビボ感染（Seegerら、Proc.Nat'l.A
cad.Sci. （USA）81：5849（1984））などの適当な送達
方法を用いる。
【００８１】トポイソメラーゼＩＩＩ結合分子およびア
ッセイ 本発明はまた、トポイソメラーゼＩＩＩに結合する結合
分子などの分子の同定方法をも提供する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩに結合するタンパク質、例えば結合タンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、
例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング
より同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュア
ル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immuno
logy、1(2)：第5章（1991）に記載されている。例えば
発現クローニングをこの目的に用いることができる。こ
の目的のために、ポリアデニル化ＲＮＡをトポイソメラ
ーゼＩＩＩを発現する細胞から調製し、このＲＮＡから
ｃＤＮＡライブラリーを作り、ライブラリーをプールに
分割し、そのプールをトポイソメラーゼＩＩＩを発現し
ない細胞に個々にトランスフェクトする。ついで、トラ
ンスフェクトした細胞を標識したトポイソメラーゼＩＩ
Ｉに曝露する。トポイソメラーゼＩＩＩは、放射性ヨウ
素化または部位特異的タンパク質キナーゼ用の認識部位
の封入の標準法を包含する種々の周知の技術により標識
できる。曝露した後、細胞を固定し、トポイソメラーゼ
ＩＩＩの結合を測定する。これらの方法は、都合よく
は、ガラススライド上で実施する。
ッセイ 本発明はまた、トポイソメラーゼＩＩＩに結合する結合
分子などの分子の同定方法をも提供する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩに結合するタンパク質、例えば結合タンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、
例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング
より同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュア
ル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immuno
logy、1(2)：第5章（1991）に記載されている。例えば
発現クローニングをこの目的に用いることができる。こ
の目的のために、ポリアデニル化ＲＮＡをトポイソメラ
ーゼＩＩＩを発現する細胞から調製し、このＲＮＡから
ｃＤＮＡライブラリーを作り、ライブラリーをプールに
分割し、そのプールをトポイソメラーゼＩＩＩを発現し
ない細胞に個々にトランスフェクトする。ついで、トラ
ンスフェクトした細胞を標識したトポイソメラーゼＩＩ
Ｉに曝露する。トポイソメラーゼＩＩＩは、放射性ヨウ
素化または部位特異的タンパク質キナーゼ用の認識部位
の封入の標準法を包含する種々の周知の技術により標識
できる。曝露した後、細胞を固定し、トポイソメラーゼ
ＩＩＩの結合を測定する。これらの方法は、都合よく
は、ガラススライド上で実施する。
【００８２】トポイソメラーゼＩＩＩ結合細胞を生成す
るｃＤＮＡのプールを同定する。これらの陽性体からサ
ブプールを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、前
記のとおりスクリーニングする。サブプール化および再
スクリーニング法を繰り返し、結合分子などの推定され
る結合分子をコードする１またはそれ以上の単クローン
を単離できる。別法として、標識リガンドを、結合分子
のごときそれが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和的に連
結させることができる。架橋した物質をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離し、Ｘ線
フィルムに曝露する。リガンド結合を含有する標識複合
体を切除し、ペプチドフラグメントに分解し、タンパク
質マイクロシーケンシングに供することができる。マイ
クロシーケンシングにより得られたアミノ酸配列を用い
て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
独特なまたは同義性オリゴヌクレオチドプローブを設計
し、推定される結合分子をコードする遺伝子を同定する
ことができる。また、本発明のポリペプチドを用いて、
細胞中、または無細胞調製物中の、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ結合分子、例えば結合分子のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合能力を評価することができる。本発明のポリペプ
チドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ラ
イブラリー、および天然の生成物混合物中の小型分子基
質とリガンドとの結合を評価することもできる。
るｃＤＮＡのプールを同定する。これらの陽性体からサ
ブプールを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、前
記のとおりスクリーニングする。サブプール化および再
スクリーニング法を繰り返し、結合分子などの推定され
る結合分子をコードする１またはそれ以上の単クローン
を単離できる。別法として、標識リガンドを、結合分子
のごときそれが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和的に連
結させることができる。架橋した物質をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離し、Ｘ線
フィルムに曝露する。リガンド結合を含有する標識複合
体を切除し、ペプチドフラグメントに分解し、タンパク
質マイクロシーケンシングに供することができる。マイ
クロシーケンシングにより得られたアミノ酸配列を用い
て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
独特なまたは同義性オリゴヌクレオチドプローブを設計
し、推定される結合分子をコードする遺伝子を同定する
ことができる。また、本発明のポリペプチドを用いて、
細胞中、または無細胞調製物中の、トポイソメラーゼＩ
ＩＩ結合分子、例えば結合分子のトポイソメラーゼＩＩ
Ｉ結合能力を評価することができる。本発明のポリペプ
チドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ラ
イブラリー、および天然の生成物混合物中の小型分子基
質とリガンドとの結合を評価することもできる。
【００８３】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 前記したように、DNA密度の増加および減少は、環境攻
撃に対する細菌応答に関連している。従って、調節する
こと、すなわち、作動または拮抗することで、適当な応
答が潜在的抗生物質効果をもたらしうる。本発明はま
た、細胞上のトポイソメラーゼＩＩＩの作用、例えば、
スーパーコイル化DNAなどの基質分子との相互作用を亢
進または遮断する化合物を同定するためのスクリーニン
グ方法をも提供する。細胞でのトポイソメラーゼＩＩＩ
の作用を遮断する化合物は、毒として作用し、ＤＮＡと
の共有結合性複合体にてトポイソメラーゼＩＩＩを安定
化し、細胞成長において阻害効果をもたらす、化合物を
包含する。アンタゴニストはトポイソメラーゼＩＩＩの
天然の生物学的機能を低下させる化合物である。アゴニ
ストはトポイソメラーゼＩＩＩの天然の生物学的機能を
増強する化合物である。
イおよび分子 前記したように、DNA密度の増加および減少は、環境攻
撃に対する細菌応答に関連している。従って、調節する
こと、すなわち、作動または拮抗することで、適当な応
答が潜在的抗生物質効果をもたらしうる。本発明はま
た、細胞上のトポイソメラーゼＩＩＩの作用、例えば、
スーパーコイル化DNAなどの基質分子との相互作用を亢
進または遮断する化合物を同定するためのスクリーニン
グ方法をも提供する。細胞でのトポイソメラーゼＩＩＩ
の作用を遮断する化合物は、毒として作用し、ＤＮＡと
の共有結合性複合体にてトポイソメラーゼＩＩＩを安定
化し、細胞成長において阻害効果をもたらす、化合物を
包含する。アンタゴニストはトポイソメラーゼＩＩＩの
天然の生物学的機能を低下させる化合物である。アゴニ
ストはトポイソメラーゼＩＩＩの天然の生物学的機能を
増強する化合物である。
【００８４】Barrettら、Antimicrob.Ａgents.Ｃhemoth
er. 34：1（1990）は、トポイソメラーゼの阻害を測定
するのに用いることのできるインビトロアッセイを報告
する。これらのアッセイは触媒アッセイと非触媒アッセ
イに分類できる。細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ用の触
媒アッセイは、例えば、スーパーコイル化ＤＮＡの弛緩
を測定するためのアッセイを包含する。「切断複合体」
アッセイとしても知られている非触媒アッセイは、重要
な共有結合性反応中間体の形成を測定するものである。
Ｆroelich−ＡmmonおよびＯsheroff Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 2
70：21429（1995）はトポイソメラーゼ毒の非触媒アッ
セイの機構的原理を開示している。
er. 34：1（1990）は、トポイソメラーゼの阻害を測定
するのに用いることのできるインビトロアッセイを報告
する。これらのアッセイは触媒アッセイと非触媒アッセ
イに分類できる。細菌性トポイソメラーゼＩＩＩ用の触
媒アッセイは、例えば、スーパーコイル化ＤＮＡの弛緩
を測定するためのアッセイを包含する。「切断複合体」
アッセイとしても知られている非触媒アッセイは、重要
な共有結合性反応中間体の形成を測定するものである。
Ｆroelich−ＡmmonおよびＯsheroff Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 2
70：21429（1995）はトポイソメラーゼ毒の非触媒アッ
セイの機構的原理を開示している。
【００８５】スーパーコイル化ＤＮＡ弛緩アッセイ 弛緩反応の阻害剤についてスクリーニングするために、
候補の阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
を、Ｍg2+または別の二価金属イオン含有の適当な緩衝
液中、スーパーコイル化ＤＮＡ基質、例えば、プラスミ
ドまたはファージDNAと一緒にインキュベートする。反
応生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化
エチジウム染色により可視化し、密度計により定量す
る。
候補の阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
を、Ｍg2+または別の二価金属イオン含有の適当な緩衝
液中、スーパーコイル化ＤＮＡ基質、例えば、プラスミ
ドまたはファージDNAと一緒にインキュベートする。反
応生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化
エチジウム染色により可視化し、密度計により定量す
る。
【００８６】ＤＮＡオリゴマー切断アッセイ 適当な切断部位、例えば２２量体、ＧＡＡＴＧＡＧＣＣ
ＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴ（配列番号：３）を含有す
る一本鎖ＤＮＡオリゴマーまたは適宜標識した誘導体を
基質として用いる。適当な標識は、使用する個々のアッ
セイに従って、オリゴの５′または３’末端で結合した
放射標識または蛍光発色団である。基質を適当な緩衝液
中、候補阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
と共にインキュベートする。緩衝液はＭg2+または別の
二価金属イオンを含有してもよい。Ｍg2+は切断反応に
必須ではないが、それを含んでいることがある種の阻害
剤の相互反応を促進するのに望ましい。反応を適当な変
性剤、例えば１％ＳＤＳまたは１００ｍＭ ＮaＯＨを添
加することで停止させる。切断可能な複合体の形成（重
要な共有結合性反応の中間体の安定化）は、多くの方法
により測定することができる。例えば、変性ポリアクリ
ルアミドゲルを用いる電気泳動を使用して、５′標識化
切断ＤＮＡ産物を分離し、それを密度計により定量する
ことのできるする。また、３’標識化ＤＮＡ産物をトポ
イソメラーゼＩＩＩとの共有結合により検定してもよ
い。これは、沈殿タンパク質に伴う放射標識したＤＮＡ
を測定する、ＳＤＳ／Ｋ沈殿アッセイにより、またはト
ポイソメラーゼＩＩＩを抗体を用いて固定する、捕獲ア
ッセイフォーマットにより行い、結合した標識ＤＮＡの
量を測定することができる。
ＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴ（配列番号：３）を含有す
る一本鎖ＤＮＡオリゴマーまたは適宜標識した誘導体を
基質として用いる。適当な標識は、使用する個々のアッ
セイに従って、オリゴの５′または３’末端で結合した
放射標識または蛍光発色団である。基質を適当な緩衝液
中、候補阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩＩの調製物
と共にインキュベートする。緩衝液はＭg2+または別の
二価金属イオンを含有してもよい。Ｍg2+は切断反応に
必須ではないが、それを含んでいることがある種の阻害
剤の相互反応を促進するのに望ましい。反応を適当な変
性剤、例えば１％ＳＤＳまたは１００ｍＭ ＮaＯＨを添
加することで停止させる。切断可能な複合体の形成（重
要な共有結合性反応の中間体の安定化）は、多くの方法
により測定することができる。例えば、変性ポリアクリ
ルアミドゲルを用いる電気泳動を使用して、５′標識化
切断ＤＮＡ産物を分離し、それを密度計により定量する
ことのできるする。また、３’標識化ＤＮＡ産物をトポ
イソメラーゼＩＩＩとの共有結合により検定してもよ
い。これは、沈殿タンパク質に伴う放射標識したＤＮＡ
を測定する、ＳＤＳ／Ｋ沈殿アッセイにより、またはト
ポイソメラーゼＩＩＩを抗体を用いて固定する、捕獲ア
ッセイフォーマットにより行い、結合した標識ＤＮＡの
量を測定することができる。
【００８７】全細胞アッセイ 潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストならびに毒の
トポイソメラーゼＩＩＩ様効果は、例えば、候補分子と
細胞または適当な細胞調製物との相互作用の後の遺伝子
発現における変化に感受的なリポーターステムの活性を
決定することにより測定できる。この点において有用な
リポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基
質、トポイソメラーゼＩＩＩ活性の変化に応答するリポ
ーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを
包含するが、これらに限定するものではない。
トポイソメラーゼＩＩＩ様効果は、例えば、候補分子と
細胞または適当な細胞調製物との相互作用の後の遺伝子
発現における変化に感受的なリポーターステムの活性を
決定することにより測定できる。この点において有用な
リポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基
質、トポイソメラーゼＩＩＩ活性の変化に応答するリポ
ーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを
包含するが、これらに限定するものではない。
【００８８】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
滅させるか、またはＤＮＡとの重要な共有結合性反応中
間体を安定化する、小型有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはま
た、トポイソメラーゼＩＩＩ誘導活性を誘発することな
く、結合分子などの結合分子の同一の部位に結合する、
密接に関連したタンパク質または抗体などの小型有機分
子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、それによ
りトポイソメラーゼＩＩＩを結合から排除してトポイソ
メラーゼＩＩＩの作用を妨げる。潜在的アンタゴニスト
は、ポリペプチドの結合部位に結合し、その結合部位を
占領し、それにより結合分子などの細胞性結合分子への
結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる、小型分子を
包含する。小型分子としては、例えば、小型有機分子、
ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに
限定するものではない。
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
滅させるか、またはＤＮＡとの重要な共有結合性反応中
間体を安定化する、小型有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはま
た、トポイソメラーゼＩＩＩ誘導活性を誘発することな
く、結合分子などの結合分子の同一の部位に結合する、
密接に関連したタンパク質または抗体などの小型有機分
子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、それによ
りトポイソメラーゼＩＩＩを結合から排除してトポイソ
メラーゼＩＩＩの作用を妨げる。潜在的アンタゴニスト
は、ポリペプチドの結合部位に結合し、その結合部位を
占領し、それにより結合分子などの細胞性結合分子への
結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる、小型分子を
包含する。小型分子としては、例えば、小型有機分子、
ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに
限定するものではない。
【００８９】その他の潜在的なアンタゴニストはアンチ
センス分子を包含する。アンチセンス技術を用いて、ア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または二重も
しくは三重らせん形成により遺伝子発現を調節すること
ができる。アンチセンス技術については、例えばOkano,
J.、Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，Ｃ
ＲＣプレス、ＢocaＲaton、フロリダ（1988）に記載さ
れている。三重らせん形成については、例えば、Lee
ら、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；Cooney
ら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Scie
nce 251：1360（1991）に記載されている。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの
結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの５′コーディング部
分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であるように設計され、それによりトポイソ
メラーゼＩＩＩの転写および生成が妨げられる。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡ
にハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のトポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドへの翻訳を遮断する。前記
のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され、アンチ
センスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボで発現し、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの生成を阻害することもできる。
センス分子を包含する。アンチセンス技術を用いて、ア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または二重も
しくは三重らせん形成により遺伝子発現を調節すること
ができる。アンチセンス技術については、例えばOkano,
J.、Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，Ｃ
ＲＣプレス、ＢocaＲaton、フロリダ（1988）に記載さ
れている。三重らせん形成については、例えば、Lee
ら、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；Cooney
ら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Scie
nce 251：1360（1991）に記載されている。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの
結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの５′コーディング部
分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であるように設計され、それによりトポイソ
メラーゼＩＩＩの転写および生成が妨げられる。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡ
にハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のトポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドへの翻訳を遮断する。前記
のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され、アンチ
センスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボで発現し、トポイ
ソメラーゼＩＩＩの生成を阻害することもできる。
【００９０】好ましい潜在的アンタゴニストは、本明細
書で提供する各々のＤＮＡ配列が、抗細菌化合物の発見
および開発に用いられる化合物およびその誘導体を包含
する。発現でコードされたタンパク質は、抗菌剤のスク
リーニングのための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質またはShine-Delgarnoの
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列または他の個々
のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコー
ディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築
することがきる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニ
ストは、例えば以下に記載するような、医薬上許容でき
る担体と共に組成物として用いることができる。このア
ンタゴニストおよびアゴニストを用いて、スタフィロコ
ッカス感染を阻害することができる。
書で提供する各々のＤＮＡ配列が、抗細菌化合物の発見
および開発に用いられる化合物およびその誘導体を包含
する。発現でコードされたタンパク質は、抗菌剤のスク
リーニングのための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質またはShine-Delgarnoの
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列または他の個々
のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコー
ディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築
することがきる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニ
ストは、例えば以下に記載するような、医薬上許容でき
る担体と共に組成物として用いることができる。このア
ンタゴニストおよびアゴニストを用いて、スタフィロコ
ッカス感染を阻害することができる。
【００９１】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なトポイソメラーゼＩＩＩ、またはその抗原性フラ
グメントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、
特に細菌感染、とりわけスタフィロコッカス感染から保
護することからなる方法に関する。本発明のまた別の態
様は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、
遺伝子治療により免疫学的応答を誘発させるためにトポ
イソメラーゼＩＩＩまたはそのフラグメントもしくは変
種をインビボで発現させるのにトポイソメラーゼＩＩＩ
またはその抗原性フラグメントもしくは変種をコードす
る遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から保
護する方法に関する。
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なトポイソメラーゼＩＩＩ、またはその抗原性フラ
グメントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、
特に細菌感染、とりわけスタフィロコッカス感染から保
護することからなる方法に関する。本発明のまた別の態
様は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、
遺伝子治療により免疫学的応答を誘発させるためにトポ
イソメラーゼＩＩＩまたはそのフラグメントもしくは変
種をインビボで発現させるのにトポイソメラーゼＩＩＩ
またはその抗原性フラグメントもしくは変種をコードす
る遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から保
護する方法に関する。
【００９２】本発明のさらなる態様は、免疫学的応答を
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、そのような宿主中でトポイソメラーゼＩＩＩまたは
それによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応
答を誘起する免疫学的組成物であって、該トポイソメラ
ーゼＩＩＩの抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそ
れによりコードされるタンパク質を含んでなる、組換え
トポイソメラーゼＩＩＩまたはそれによりコードされる
タンパク質を有してなる組成物に関する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩまたはそのフラグメントは、それ自身は抗体
を産生しないが、第１のタンパク質を安定化し、免疫原
性があり防御特性を有する融合タンパク質を形成するこ
とができる補タンパク質（co-protein）と融合できる。
このように融合した組換えタンパク質は、好ましくはさ
らに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシ
ダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成および精製を
容易にする比較的大きな補タンパク質を有してなる。さ
らには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激を提供する
という意味で、アジュバントとして作用し得る。補タン
パク質は第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル
末端のいずれに結合してもよい。
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、そのような宿主中でトポイソメラーゼＩＩＩまたは
それによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応
答を誘起する免疫学的組成物であって、該トポイソメラ
ーゼＩＩＩの抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそ
れによりコードされるタンパク質を含んでなる、組換え
トポイソメラーゼＩＩＩまたはそれによりコードされる
タンパク質を有してなる組成物に関する。トポイソメラ
ーゼＩＩＩまたはそのフラグメントは、それ自身は抗体
を産生しないが、第１のタンパク質を安定化し、免疫原
性があり防御特性を有する融合タンパク質を形成するこ
とができる補タンパク質（co-protein）と融合できる。
このように融合した組換えタンパク質は、好ましくはさ
らに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシ
ダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成および精製を
容易にする比較的大きな補タンパク質を有してなる。さ
らには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激を提供する
という意味で、アジュバントとして作用し得る。補タン
パク質は第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル
末端のいずれに結合してもよい。
【００９３】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のトポイソメラーゼＩＩＩに関して
記載されているが、これは天然のタンパク質および、実
質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付
加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグ
メント（例えば、５０％またはそれ以上の配列相同性を
有する）を包含することが理解されよう。
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のトポイソメラーゼＩＩＩに関して
記載されているが、これは天然のタンパク質および、実
質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付
加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグ
メント（例えば、５０％またはそれ以上の配列相同性を
有する）を包含することが理解されよう。
【００９４】組成物 本発明はまた前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
【００９５】キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を１ま
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
【００９６】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまた
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
【００９７】治療において、または予防用に、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
【００９８】哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
【００９９】本発明の組成物を注射により投与し、内在
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、スタフィロコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、スタフィロコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
【０１００】前記の治療に加え、本発明の組成物は、一
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、トポイソメラーゼを含有する
細菌の存在を検出するための診断試薬として使用でき
る。本明細書に開示されている文献を、出典明示により
その全内容を本明細書の一部とする。本願が先に請求す
るいずれの親出願も出典明示によりその全内容を本明細
書の一部とする。以下の実施例を容易に理解するため
に、特定の汎用する方法および／または用語を記載す
る。
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、トポイソメラーゼを含有する
細菌の存在を検出するための診断試薬として使用でき
る。本明細書に開示されている文献を、出典明示により
その全内容を本明細書の一部とする。本願が先に請求す
るいずれの親出願も出典明示によりその全内容を本明細
書の一部とする。以下の実施例を容易に理解するため
に、特定の汎用する方法および／または用語を記載す
る。
【０１０１】
【実施例】本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく
説明する。実施例は単に具体的な態様に対する参考とし
て本発明を説明するために提供するものである。これら
の例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するもので
あり、本発明に開示する範囲を限定または規定するもの
ではない。本明細書で用いる特定の用語は前記した定義
で説明されている。全ての実施例は、別に詳細に記載す
るもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法を用い
て実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学的技術
は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laborat
ory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク州（1989）ような標準的な実験室マ
ニュアルに記載されるように実施できる。以下の実施例
で示す全ての部分または量は、特記しない限り、重量で
示す。
説明する。実施例は単に具体的な態様に対する参考とし
て本発明を説明するために提供するものである。これら
の例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するもので
あり、本発明に開示する範囲を限定または規定するもの
ではない。本明細書で用いる特定の用語は前記した定義
で説明されている。全ての実施例は、別に詳細に記載す
るもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法を用い
て実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学的技術
は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laborat
ory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク州（1989）ような標準的な実験室マ
ニュアルに記載されるように実施できる。以下の実施例
で示す全ての部分または量は、特記しない限り、重量で
示す。
【０１０２】以下の実施例におけるフラグメントのサイ
ズ分離は特記しない限り、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）および多
くの他の文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.8:4
057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法を用いて実
施した。特記しない限り、ライゲーションは、標準的な
緩衝液、インキュベーション温度および時間、略等モル
濃度の量の連結するＤＮＡフラグメントの、ならびにＤ
ＮＡ０．５μｇあたりほぼ１０単位のＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成した。（配列番号：
１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イ
ー・コリ中スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２
９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを配列決定
することにより入手した。
ズ分離は特記しない限り、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）および多
くの他の文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.8:4
057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法を用いて実
施した。特記しない限り、ライゲーションは、標準的な
緩衝液、インキュベーション温度および時間、略等モル
濃度の量の連結するＤＮＡフラグメントの、ならびにＤ
ＮＡ０．５μｇあたりほぼ１０単位のＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成した。（配列番号：
１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イ
ー・コリ中スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２
９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを配列決定
することにより入手した。
【０１０３】（配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を用い
て、トポイソメラーゼＩＩＩタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを得るために、通常、イー・コリ中のス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体Ｄ
ＮＡのクローンのライブラリー、またはその他の適当な
宿主を、部分配列に由来する、好ましくは１７量体また
はそれより長い放射性標識オリゴヌクレオチドでプロー
ブする。プローブのＤＮＡに同一のＤＮＡを担持するク
ローンを、次いで、非常にストリンジェントに洗浄して
区別した。原配列から設計した配列決定プライマーを用
いてこのように同定した個々のクローンを配列決定する
ことにより、次に配列を両方向に伸長し、遺伝子を全長
にわたって決定することが可能になる。都合よくは、プ
ラスミドクローンから製造した変性二本鎖ＤＮＡを用い
て、このような配列決定を実施する。適当な技術につい
ては、Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、M
olecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版；コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州
（1989）に記載されている。（Screening By Hybridiza
tion 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded
DNA Templates 13.70参照）
て、トポイソメラーゼＩＩＩタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを得るために、通常、イー・コリ中のス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体Ｄ
ＮＡのクローンのライブラリー、またはその他の適当な
宿主を、部分配列に由来する、好ましくは１７量体また
はそれより長い放射性標識オリゴヌクレオチドでプロー
ブする。プローブのＤＮＡに同一のＤＮＡを担持するク
ローンを、次いで、非常にストリンジェントに洗浄して
区別した。原配列から設計した配列決定プライマーを用
いてこのように同定した個々のクローンを配列決定する
ことにより、次に配列を両方向に伸長し、遺伝子を全長
にわたって決定することが可能になる。都合よくは、プ
ラスミドクローンから製造した変性二本鎖ＤＮＡを用い
て、このような配列決定を実施する。適当な技術につい
ては、Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、M
olecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版；コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州
（1989）に記載されている。（Screening By Hybridiza
tion 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded
DNA Templates 13.70参照）
【０１０４】実施例１：スタフィロコッカス・アウレウ
スからの新規トポイソメラーゼＩＩＩをコードするＤＮ
Ａの単離 （配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドをイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウ
レウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入
手した。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮ
Ａを含有する２個またはそれ以上のクローンの配列決定
データを、（配列番号：１）に示す連続したＤＮＡ配列
を構築するために使用する場合もある。ライブラリーは
慣用的方法、例えば以下の方法１および２により製造で
きる。全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウ
スＷＣＵＨ２９株より、標準法に準じて単離し、二つの
方法のどちらかによりサイズ分画する。
スからの新規トポイソメラーゼＩＩＩをコードするＤＮ
Ａの単離 （配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドをイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウ
レウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入
手した。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮ
Ａを含有する２個またはそれ以上のクローンの配列決定
データを、（配列番号：１）に示す連続したＤＮＡ配列
を構築するために使用する場合もある。ライブラリーは
慣用的方法、例えば以下の方法１および２により製造で
きる。全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウ
スＷＣＵＨ２９株より、標準法に準じて単離し、二つの
方法のどちらかによりサイズ分画する。
【０１０５】方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニ
ードルに通して機械的に剪断する。11kbpまでの大きさ
のＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
ードルに通して機械的に剪断する。11kbpまでの大きさ
のＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【０１０６】方法２ 全細胞ＤＮＡは、四種の制限酵素（ＲｓａＩ、Ｐａｌ
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
【０１０７】実施例２：トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子
発現の特性化 ａ）感染組織サンプルからのスタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌのサイロ保存チューブ（cyro-Soreage tubes）中
の感染組織サンプルを−８０℃の保存からドライアイス
エタノール浴中に取り出す。微生物安全キャビネット中
でサンプルを一度に８まで崩壊させるが、残ったサンプ
ルはドライアイスエタノール浴中で凍結させておく。組
織サンプル中で細菌を崩壊させるために、組織５０〜１
００ｍｇをシリカ／セラミック・マトリックス（ＢＩＯ
１０１）を含有するＦａｓｔＲＮＡチューブに移す。す
ぐに抽出試薬（ＦａｓｔＲＮＡ試薬、ＢＩＯ１０１）１
ｍｌを加え、サンプル：試薬の容積比を約１：２０にす
る。そのチューブをレシプロケーティング・シェーカー
（reciprocating shaker）（FastPrepＦＰ１２０、ＢＩ
Ｏ１０１）中、６０００ｒｐｍで２０〜１２０秒振とう
する。粗ＲＮＡ調製物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理／イソプロパノール沈
殿溶液（ＢＩＯ１０１）で沈殿させる。必要な場合、Ｒ
ＮＡ沈殿物をこのイソプロパノール溶液中で−８０℃で
保存する。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇで１
０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水中、容
量/容量）で洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、ＤＥＰ
Ｃ−処理水0.1ｍｌに再懸濁する。
発現の特性化 ａ）感染組織サンプルからのスタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌのサイロ保存チューブ（cyro-Soreage tubes）中
の感染組織サンプルを−８０℃の保存からドライアイス
エタノール浴中に取り出す。微生物安全キャビネット中
でサンプルを一度に８まで崩壊させるが、残ったサンプ
ルはドライアイスエタノール浴中で凍結させておく。組
織サンプル中で細菌を崩壊させるために、組織５０〜１
００ｍｇをシリカ／セラミック・マトリックス（ＢＩＯ
１０１）を含有するＦａｓｔＲＮＡチューブに移す。す
ぐに抽出試薬（ＦａｓｔＲＮＡ試薬、ＢＩＯ１０１）１
ｍｌを加え、サンプル：試薬の容積比を約１：２０にす
る。そのチューブをレシプロケーティング・シェーカー
（reciprocating shaker）（FastPrepＦＰ１２０、ＢＩ
Ｏ１０１）中、６０００ｒｐｍで２０〜１２０秒振とう
する。粗ＲＮＡ調製物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理／イソプロパノール沈
殿溶液（ＢＩＯ１０１）で沈殿させる。必要な場合、Ｒ
ＮＡ沈殿物をこのイソプロパノール溶液中で−８０℃で
保存する。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇで１
０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水中、容
量/容量）で洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、ＤＥＰ
Ｃ−処理水0.1ｍｌに再懸濁する。
【０１０８】１％寒天ゲル上をサンプルを走らせること
により、単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム
で染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＥＮＡ生成物を可
視化する。感染組織からの細菌性ＲＮＡの単離を示すた
めに、１ｘＭＯＰＳ、2.2Ｍホルムアルデヒドゲルを走
らせ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アメルシャム）にブロッティ
ングしたものを吸引する。次にスタフィロコッカス・ア
ウレウスの１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的な３２Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチドプローブでブロットをハイブリダイゼー
ションする（K.Greisen、M.Loeffelholz、A.Purohitお
よびD.Leong、J.Clin.Microbiol.32:335-351（199
4））。配列５’−ｇｃｔｃｃｔａａａａｇｇｔｔａｃ
ｔｃｃａｃｃｇｇｃ−３’のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いる。ハイブリダイジングバンドの大きさ
はノーザンブロットにおいて、インビトロで成長したス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離し
た対照ＲＮＡのハイブリダイジングバンドと比較した。
ＴＢＥゲル上で可視化する場合、正確に大きさを測った
細菌性１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが、哺乳動物ＲＮＡの広
範な同義性を示す全ＲＮＡサンプル中で検出できる。
により、単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム
で染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＥＮＡ生成物を可
視化する。感染組織からの細菌性ＲＮＡの単離を示すた
めに、１ｘＭＯＰＳ、2.2Ｍホルムアルデヒドゲルを走
らせ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アメルシャム）にブロッティ
ングしたものを吸引する。次にスタフィロコッカス・ア
ウレウスの１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的な３２Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチドプローブでブロットをハイブリダイゼー
ションする（K.Greisen、M.Loeffelholz、A.Purohitお
よびD.Leong、J.Clin.Microbiol.32:335-351（199
4））。配列５’−ｇｃｔｃｃｔａａａａｇｇｔｔａｃ
ｔｃｃａｃｃｇｇｃ−３’のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いる。ハイブリダイジングバンドの大きさ
はノーザンブロットにおいて、インビトロで成長したス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離し
た対照ＲＮＡのハイブリダイジングバンドと比較した。
ＴＢＥゲル上で可視化する場合、正確に大きさを測った
細菌性１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが、哺乳動物ＲＮＡの広
範な同義性を示す全ＲＮＡサンプル中で検出できる。
【０１０９】ｂ）スタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終容量５７μｌの緩衝液中ＲＮＡase-フリーＤＮＡas
eＩ（ジンハンター（ＧeneＨunter）１０単位と３７℃
で３０分間処理することにより、ＲＮＡサンプル５０μ
ｇからＤＮＡを除去した。ＤＮＡaseを不活性化し、フ
ェノール：クロロホルム抽出により除去した。３Ｍ Ｎ
ａＯＡｃ５μｌおよび１００％ＥｔＯＨ２００μｌでＲ
ＮＡを沈殿させ、１２０００ｇで１０分間遠心し、ペレ
ット状にする。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇ
で１０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水
中、容量／容量）で洗浄し、５−１０分間空気乾燥し、
ＤＥＰＣ−処理水１０〜２０μｌに再懸濁する。清浄Ｒ
ＮＡサンプルの１：１０００希釈後、ＲＮＡ収量をＯＤ
260により定量する。必要な場合、ＲＮＡを−８０℃で
保存し、１週間以内に逆転写する。
ＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終容量５７μｌの緩衝液中ＲＮＡase-フリーＤＮＡas
eＩ（ジンハンター（ＧeneＨunter）１０単位と３７℃
で３０分間処理することにより、ＲＮＡサンプル５０μ
ｇからＤＮＡを除去した。ＤＮＡaseを不活性化し、フ
ェノール：クロロホルム抽出により除去した。３Ｍ Ｎ
ａＯＡｃ５μｌおよび１００％ＥｔＯＨ２００μｌでＲ
ＮＡを沈殿させ、１２０００ｇで１０分間遠心し、ペレ
ット状にする。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇ
で１０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水
中、容量／容量）で洗浄し、５−１０分間空気乾燥し、
ＤＥＰＣ−処理水１０〜２０μｌに再懸濁する。清浄Ｒ
ＮＡサンプルの１：１０００希釈後、ＲＮＡ収量をＯＤ
260により定量する。必要な場合、ＲＮＡを−８０℃で
保存し、１週間以内に逆転写する。
【０１１０】ｃ）感染組織由来のＲＮＡサンプルからの
ｃＤＮＡの製造 ＤＮＡase処理ＲＮＡのサンプル10μｌをFirst Strand
cDNA Synthesis kitのSuperScript Preamplification S
ystem（ギブコＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ）を用
いて、製造者の指示書に従って逆転写する。ランダムヘ
キサマー１ｎｇを用いて各反応をプライムする。SuperS
criptＩＩ逆転写酵素を添加しない対照もまた走らせ
る。ＰＣＲ反応の前に、＋／−ＲＴの両方のサンプルを
ＲＮaseＨで処理する。
ｃＤＮＡの製造 ＤＮＡase処理ＲＮＡのサンプル10μｌをFirst Strand
cDNA Synthesis kitのSuperScript Preamplification S
ystem（ギブコＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ）を用
いて、製造者の指示書に従って逆転写する。ランダムヘ
キサマー１ｎｇを用いて各反応をプライムする。SuperS
criptＩＩ逆転写酵素を添加しない対照もまた走らせ
る。ＰＣＲ反応の前に、＋／−ＲＴの両方のサンプルを
ＲＮaseＨで処理する。
【０１１１】ｄ）細菌性ｃＤＮＡ種の存在を決定するた
めのＰＣＲおよび蛍光原性プローブ（fluorogenic prob
es）の使用 二つのＰＣＲプライマー間でアニーリングする、５’お
よび３’末端でリポーターおよびクエンチャー（quench
er）蛍光色素で各々標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ＦＱプローブ）の存在下、PE Applied Biosystems
7700 SequenceDetection Systemにおいて標的配列を増
幅することにより、特異的配列を検出する。プライマー
間でプローブが結合した場合、特異的な生成物のみが検
出される。ＰＣＲ増幅を行うので、最初Ｔａｑポリメラ
ーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりローブからリポー
ター色素が開裂される。リポーター色素がクエンチャー
色素から物理的に分離された場合に生じるシグナルは、
装着したＣＣＤカメラでシグナルを測定することにより
検出できる。生じた各々のシグナルは、一つの標的鎖の
増幅に対応して開裂された一つのプローブに匹敵する。
めのＰＣＲおよび蛍光原性プローブ（fluorogenic prob
es）の使用 二つのＰＣＲプライマー間でアニーリングする、５’お
よび３’末端でリポーターおよびクエンチャー（quench
er）蛍光色素で各々標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ＦＱプローブ）の存在下、PE Applied Biosystems
7700 SequenceDetection Systemにおいて標的配列を増
幅することにより、特異的配列を検出する。プライマー
間でプローブが結合した場合、特異的な生成物のみが検
出される。ＰＣＲ増幅を行うので、最初Ｔａｑポリメラ
ーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりローブからリポー
ター色素が開裂される。リポーター色素がクエンチャー
色素から物理的に分離された場合に生じるシグナルは、
装着したＣＣＤカメラでシグナルを測定することにより
検出できる。生じた各々のシグナルは、一つの標的鎖の
増幅に対応して開裂された一つのプローブに匹敵する。
【０１１２】指示書に従って、PE Applied Biosystem T
aqMan PCR Core Regent Kitを用いてＰＣＲ反応を組み
立て、各反応物は１０ｘ ＰＣＲ 緩衝液ＩＩ ５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣl2７μｌ、３００ｎＭ正プライマー 5
μｌ，逆プライマー ５μｌ、特異的ＦＱプローブ ５μ
ｌ、１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１０ｍＭ
ｄＧＴＰおよび２０ｍＭ ｄＵＴＰを各々１μｌ、蒸留
水13.25μｌ、AmpEraseＵＮＧ０.５μｌ、およびAmpliT
aq DNAポリメラーゼ０.２５μｌを含有し、全量４５μ
ｌにする。以下の温度サイクル条件下で増幅する：５０
℃で2分間維持し、９５℃で１０分間維持し、９５℃の
４０サイクルを１５秒間、および６０℃で１分間、続い
てサンプルが回収されるまで２５℃を維持する。検出は
実時間で行う。反応の最後にデータを回収する。
aqMan PCR Core Regent Kitを用いてＰＣＲ反応を組み
立て、各反応物は１０ｘ ＰＣＲ 緩衝液ＩＩ ５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣl2７μｌ、３００ｎＭ正プライマー 5
μｌ，逆プライマー ５μｌ、特異的ＦＱプローブ ５μ
ｌ、１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１０ｍＭ
ｄＧＴＰおよび２０ｍＭ ｄＵＴＰを各々１μｌ、蒸留
水13.25μｌ、AmpEraseＵＮＧ０.５μｌ、およびAmpliT
aq DNAポリメラーゼ０.２５μｌを含有し、全量４５μ
ｌにする。以下の温度サイクル条件下で増幅する：５０
℃で2分間維持し、９５℃で１０分間維持し、９５℃の
４０サイクルを１５秒間、および６０℃で１分間、続い
てサンプルが回収されるまで２５℃を維持する。検出は
実時間で行う。反応の最後にデータを回収する。
【０１１３】ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写反応、実
験条件下で転写されることが知られている遺伝子に沿っ
た増幅およびゲノムＤＮＡ１μｇの増幅を包含できる。
ＤＮＡ ＰＣＲまたはＲＴ／ＰＣＲにおいてシグナルを
生じなかったプライマーおよび対応するプローブは、Ｐ
ＣＲに失敗したものであり、このようなものは有用でな
い。ＤＮＡ ＰＣＲでシグナルを生じたものの二つのク
ラスはＲＴ／ＰＣＲで区別される：１．インビボで転写
されなかった遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグ
ナルを生じることができない；および２．インビボで転
写した遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグナルを
生じ、＋ＲＴサンプルにおけるシグナルは−ＲＴ対照に
おけるシグナル（少しでも存在する場合）より強いこと
が示される。これらの分析に基づいて、スタフィロコッ
カス・アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子がイ
ンビボで発現されたことが見出された。
験条件下で転写されることが知られている遺伝子に沿っ
た増幅およびゲノムＤＮＡ１μｇの増幅を包含できる。
ＤＮＡ ＰＣＲまたはＲＴ／ＰＣＲにおいてシグナルを
生じなかったプライマーおよび対応するプローブは、Ｐ
ＣＲに失敗したものであり、このようなものは有用でな
い。ＤＮＡ ＰＣＲでシグナルを生じたものの二つのク
ラスはＲＴ／ＰＣＲで区別される：１．インビボで転写
されなかった遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグ
ナルを生じることができない；および２．インビボで転
写した遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグナルを
生じ、＋ＲＴサンプルにおけるシグナルは−ＲＴ対照に
おけるシグナル（少しでも存在する場合）より強いこと
が示される。これらの分析に基づいて、スタフィロコッ
カス・アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子がイ
ンビボで発現されたことが見出された。
【０１１４】実施例２で用いたプライマーは以下のとお
りである： topＢ fwdプライマー ＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＴＣＧＡＧＣＧＴ [配列番号：６] topＢ revプライマー ＧＴＧＣＣＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴ [配列番号：７] topＢプローブ ＦＡＭ−ＣＣＴＣＣＧＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＣＧ− ＴＡＭＲＡ [配列番号：８]
りである： topＢ fwdプライマー ＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＴＣＧＡＧＣＧＴ [配列番号：６] topＢ revプライマー ＧＴＧＣＣＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴ [配列番号：７] topＢプローブ ＦＡＭ−ＣＣＴＣＣＧＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＣＧ− ＴＡＭＲＡ [配列番号：８]
【０１１５】プライマーのＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ標識
およびかかるプライマーの使用については報告されてい
る（Lee,L.G.、Connell,C.R.およびBloch,W.、「蛍光原
性プローブを用いるニック翻訳ＰＣＲによる対立遺伝子
の区別」Nucleic Acids Research 21:3761-3766（199
3）；Livak,K.J.、Flood,S.J.A.、Marmaro,J.、Giusti,
W.およびDcetz,K.、「反対の末端で蛍光色素を有するオ
リゴヌクレオチドがＰＣＲ生成物および核酸ハイブリダ
イゼーションを検出するのに有用なクエンチングしたプ
ローブシステムを提供する」PCR Methods and Applicat
ion 4:357-362（1995））。
およびかかるプライマーの使用については報告されてい
る（Lee,L.G.、Connell,C.R.およびBloch,W.、「蛍光原
性プローブを用いるニック翻訳ＰＣＲによる対立遺伝子
の区別」Nucleic Acids Research 21:3761-3766（199
3）；Livak,K.J.、Flood,S.J.A.、Marmaro,J.、Giusti,
W.およびDcetz,K.、「反対の末端で蛍光色素を有するオ
リゴヌクレオチドがＰＣＲ生成物および核酸ハイブリダ
イゼーションを検出するのに有用なクエンチングしたプ
ローブシステムを提供する」PCR Methods and Applicat
ion 4:357-362（1995））。
【０１１６】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人： グウィン，マイケル カレンダー，ハワード パルマー，レスリー （ｉｉ）発明の名称： 新規トポイソメラーゼＩＩＩ （ｉｉｉ）配列の数： ８ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態： ディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム： ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア： ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： １９９７年１０月１５日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： ６０／０２８，４１７ （Ｂ）出願日： １９９６年１０月１５日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名： ギミ，エドワード・アール （Ｂ）登録番号： ３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号： Ｐ５０５６７ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号： ６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態： ディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム： ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア： ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： １９９７年１０月１５日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： ６０／０２８，４１７ （Ｂ）出願日： １９９６年１０月１５日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名： ギミ，エドワード・アール （Ｂ）登録番号： ３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号： Ｐ５０５６７ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号： ６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【０１１７】(1) 配列番号１についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２８０３塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号１:
【化１】
【０１１８】(2) 配列番号２についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ７１１アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：タンパク質 (xi) 配列の記載: 配列番号２:
【化２】
【化３】
【０１１９】(2) 配列番号３についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２２ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号３:
【化４】
【０１２０】(1) 配列番号４についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２０塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号４:
【化５】
【０１２１】(1) 配列番号５についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２３塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号５:
【化６】
【０１２２】(1) 配列番号６についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２５塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号６:
【化７】
【０１２３】(1) 配列番号７についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２１塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号７:
【化８】
【０１２４】(1) 配列番号８についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２１塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号８:
【化９】
【図１】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩＩＩ遺伝子の配列および周辺領域（コーディ
ング配列に下線を付す）からなるスタフィロコッカス・
アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩのポリヌクレオチ
ド配列（配列番号：１）を示す。
メラーゼＩＩＩ遺伝子の配列および周辺領域（コーディ
ング配列に下線を付す）からなるスタフィロコッカス・
アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩのポリヌクレオチ
ド配列（配列番号：１）を示す。
【図２】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩＩＩ遺伝子の配列および周辺領域（コーディ
ング配列に下線を付す）からなるスタフィロコッカス・
アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩのポリヌクレオチ
ド配列（配列番号：１）を示す。
メラーゼＩＩＩ遺伝子の配列および周辺領域（コーディ
ング配列に下線を付す）からなるスタフィロコッカス・
アウレウス・トポイソメラーゼＩＩＩのポリヌクレオチ
ド配列（配列番号：１）を示す。
【図３】 図１および２のポリヌクレオチド・コーデ
ィング配列から推定したスタフィロコッカス・アウレウ
ス・トポイソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列（配列番
号：２）を示す。
ィング配列から推定したスタフィロコッカス・アウレウ
ス・トポイソメラーゼＩＩＩのアミノ酸配列（配列番
号：２）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/566 33/566 33/573 Ａ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/52 ＡＤＺ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 マイケル・エヌ・グウィン アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州チ ェスター・スプリングス、カントリー・ウ ェイ1011番 (72)発明者 ハワード・カレンダー アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ビル・スミス・ブ ールバード1220番 (72)発明者 レスリー・エム・パーマー アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、チャールストン・グリーン919 番
Claims (28)
- 【請求項１】（ａ）配列番号：２のアミノ酸１から７１
１を有してなるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌ
クレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号：１に示すポリヌクレオチドを
有してなる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号：２に示すポリペプチド配列を
コードする配列番号：１に示すヌクレオチドを有してな
る請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸１から７１１を
有してなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポ
リヌクレオチド。 - 【請求項７】（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１から
単離可能なスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）のトポイソメラーゼＩＩＩをコードす
るポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性
を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項２記載のＤＮＡを有してなるベク
ター。 - 【請求項９】 請求項８記載のベクターを有してなる宿
主細胞。 - 【請求項１０】 トポイソメラーゼＩＩＩポリペプチド
の製造方法であって、請求項９に記載の宿主を、該ポリ
ペプチドを発現するのに十分な培地中、および条件下で
培養し、その発現したポリペプチドを回収することを特
徴とする方法。 - 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、宿主細胞が、適当な培養条件下、請求項８
に記載のベクターに含まれるｃＤＮＡによりコードされ
るトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドを発現するよう
に、該宿主細胞を該ベクターで形質転換またはトランス
フェクションすることを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 配列番号：２のアミノ酸１から７１１
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。 - 【請求項１３】 配列番号：２に示すアミノ酸を有して
なるポリペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１５】 請求項１２に記載のポリペプチドの活
性を阻害するアンタゴニスト。 - 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１５に記載のア
ンタゴニストを個体に投与することからなる、トポイソ
メラーゼＩＩＩポリペプチドの阻害を必要とする個体の
治療方法。 - 【請求項１７】 分析用核酸プローブによりサンプル中
のトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドをコードする核
酸を検出することを特徴とするトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドの発現に付随する疾患の診断方法におい
て、請求項１に記載の核酸の少なくとも１５個の連続し
たヌクレオチド塩基の配列を有する核酸プローブを分析
用プローブとして用いることからなる診断方法。 - 【請求項１８】 核酸プローブ配列が配列番号：３であ
る請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 サンプル中のトポイソメラーゼＩＩＩ
ポリペプチドの生物学的特性を検出することを特徴とす
るトポイソメラーゼＩＩＩポリペプチドの発現に付随す
る疾患の診断方法において、請求項１２に記載のポリペ
プチドをトポイソメラーゼＩＩＩとして用いることから
なる診断方法。 - 【請求項２０】 検出される生物学的特性が免疫学的特
性または酵素的特性である請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 モジュレーターであると思われる化合
物を、請求項１２に記載のトポイソメラーゼＩＩＩおよ
びその基質からなる反応混合物と混合し、該化合物を含
まない対照となる反応混合物の活性と比較した場合の該
トポイソメラーゼＩＩＩ活性における調節作用を検出す
ることからなる、トポイソメラーゼＩＩＩ活性のモジュ
レーターの同定方法。 - 【請求項２２】 化合物がアンタゴニストであり、その
調節作用がスーパーコイル化ＤＮＡ弛緩アッセイにて測
定した場合にトポイソメラーゼＩＩＩ触媒活性を減少さ
せることにある請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 化合物がアンタゴニストであり、その
調節作用がＤＮＡオリゴマー開裂可能な複合体アッセイ
にて測定した場合にトポイソメラーゼＩＩＩ非触媒活性
を減少させることにある請求項２１記載の方法。 - 【請求項２４】 オリゴマー開裂可能な複合体アッセイ
にて配列番号：３の核酸を用いる請求項２３記載の方
法。 - 【請求項２５】 抗体を産生するのに十分な請求項１２
に記載のトポイソメラーゼＩＩＩまたはそのフラグメン
トもしくは変種を哺乳動物に接種し、該動物をスタフィ
ロコッカス感染から保護することからなる、哺乳動物に
て免疫学的応答を誘起する方法。 - 【請求項２６】 遺伝子治療により、インビボでトポイ
ソメラーゼＩＩＩ、またはそのフラグメントもしくは変
種を発現させるために請求項１に記載のトポイソメラー
ゼＩＩＩまたはそのフラグメントもしくは変種をコード
する遺伝子を送達し、免疫学的応答を誘発させて抗体を
産生し、該動物をスタフィロコッカス疾患から保護する
ことからなる、哺乳動物にて免疫学的応答を誘起する方
法。 - 【請求項２７】 哺乳動物に導入した場合、哺乳動物に
おいてトポイソメラーゼＩＩＩに対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、請求項１２に記載の
ポリヌクレオチドまたはその免疫学的フラグメントと、
担体とからなる免疫学的組成物。 - 【請求項２８】 配列番号：３、配列番号：４、配列番
号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：
８からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2841796P | 1996-10-15 | 1996-10-15 | |
| US60/028417 | 1996-10-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10201486A true JPH10201486A (ja) | 1998-08-04 |
Family
ID=21843341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9320252A Withdrawn JPH10201486A (ja) | 1996-10-15 | 1997-10-15 | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6025156A (ja) |
| EP (1) | EP0837138A3 (ja) |
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