JP2001258578A - 新規ＦａｂＤ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 抗生物質活性をスクリーンし、感染、機能不
全及び疾患の発生病理におけるその役割の測定に使用で
きる因子の提供。 【解決手段】 （ａ）Ｓｔｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ由来の特定の配列のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性
を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチド；及び（ｃ）（ａ）
又は（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連
続した塩基を有してなるポリヌクレオチド；からなる群
より選択されるメンバーを有してなる単離ポリヌクレオ
チド。
全及び疾患の発生病理におけるその役割の測定に使用で
きる因子の提供。 【解決手段】 （ａ）Ｓｔｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ由来の特定の配列のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性
を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチド；及び（ｃ）（ａ）
又は（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連
続した塩基を有してなるポリヌクレオチド；からなる群
より選択されるメンバーを有してなる単離ポリヌクレオ
チド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一つに、新規に同
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、およびその
変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関するものである。特に、これら
の点および他の点に関して、本発明は、Ｆａｂ（脂肪酸
生合成）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（以
下、「ＦａｂＤ」という）に関する。
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、およびその
変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関するものである。特に、これら
の点および他の点に関して、本発明は、Ｆａｂ（脂肪酸
生合成）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（以
下、「ＦａｂＤ」という）に関する。
【０００２】
【従来の技術】飽和脂肪酸の生合成についての経路は原
核生物と真核生物にて非常に類似している。しかし、化
学反応は変化していないにもかかわらず、その生合成機
構は非常に異なっている。脊椎動物および酵母は、各
々、そのすべての酵素活性が１または２本のポリペプチ
ド鎖でコード化される、Ｉ型脂肪酸シンセターゼ（ＦＡ
Ｓ）を有する。アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）は複合
体の一体不可分なものである。反対に、大部分の細菌お
よび植物ＦＡＳ（ＩＩ型）においては、反応は、各々、
別個の一機能性酵素により触媒化され、そのＡＣＰは分
離タンパク質である。マイコバクテリアはＩ型およびＩ
Ｉ型ＦＡＳを有する点で独特である；前者は基本的な脂
肪酸生合成に関与するのに対して、後者はミコール酸な
どの複雑型細胞のエンベロープ脂質の合成に関与してい
る。したがって、広域スペクトル抗生物質により細菌系
を選択的に阻害するかなりの可能性があるのは明らかで
ある（Rock,C.＆Cronan,J.，Biochimica et Biophysica
Acta 1302，1−16（1996）；Jackowski，S.，In Emerg
ing Targets in Antibacterial and Antifungal Chemot
herapy. J.Sutcliffe＆N.Georgopapadakou編、Chapman
＆Hall，New York；Jackowski，S.ら、J.Biol.Chem. 26
4，7624−7629（1989））。
核生物と真核生物にて非常に類似している。しかし、化
学反応は変化していないにもかかわらず、その生合成機
構は非常に異なっている。脊椎動物および酵母は、各
々、そのすべての酵素活性が１または２本のポリペプチ
ド鎖でコード化される、Ｉ型脂肪酸シンセターゼ（ＦＡ
Ｓ）を有する。アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）は複合
体の一体不可分なものである。反対に、大部分の細菌お
よび植物ＦＡＳ（ＩＩ型）においては、反応は、各々、
別個の一機能性酵素により触媒化され、そのＡＣＰは分
離タンパク質である。マイコバクテリアはＩ型およびＩ
Ｉ型ＦＡＳを有する点で独特である；前者は基本的な脂
肪酸生合成に関与するのに対して、後者はミコール酸な
どの複雑型細胞のエンベロープ脂質の合成に関与してい
る。したがって、広域スペクトル抗生物質により細菌系
を選択的に阻害するかなりの可能性があるのは明らかで
ある（Rock,C.＆Cronan,J.，Biochimica et Biophysica
Acta 1302，1−16（1996）；Jackowski，S.，In Emerg
ing Targets in Antibacterial and Antifungal Chemot
herapy. J.Sutcliffe＆N.Georgopapadakou編、Chapman
＆Hall，New York；Jackowski，S.ら、J.Biol.Chem. 26
4，7624−7629（1989））。
【０００３】生合成サイクルにおける第1工程は、Ｆａ
ｂＨによりマロニル−ＡＣＰとアセチル−ＣｏＡを縮合
させる工程である。この前に、ＦａｂＤ、マロニルＣｏ
Ａ：ＡＣＰトランスアシラーゼによりＡＣＰとマロニル
−ＣｏＡとからマロニル−ＡＣＰが合成される。その
後、マロニル−ＡＣＰを生長鎖アシル−ＡＣＰと縮合さ
せる（ＦａｂＢおよびＦａｂＦ、各々、シンターゼＩお
よびＩＩ）。伸長サイクルにおける第２工程は、ＮＡＤ
ＰＨ−依存性β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（Ｆ
ａｂＧ）によるケトエステル還元である。その後、β−
ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＦａｂＡまた
はＦａｂＺのいずれか）で脱水して、トランス−２−エ
ノイル−ＡＣＰとし、それを順次、ＮＡＤＨ−依存性エ
ノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＩ）でアシル−Ａ
ＣＰに変える。このサイクルの次のラウンドでは、１サ
イクル当たり２個の炭素原子を加え、最終的にパルミト
イル−ＡＣＰを得、ついでパルミトイル−ＡＣＰによる
ＦａｂＨおよびＦａｂＩのフィードバック阻害によりそ
のサイクルを大きく停止させる（Heathら、J.Biol.Che
m. ２７１、1833−1836（1996））。
ｂＨによりマロニル−ＡＣＰとアセチル−ＣｏＡを縮合
させる工程である。この前に、ＦａｂＤ、マロニルＣｏ
Ａ：ＡＣＰトランスアシラーゼによりＡＣＰとマロニル
−ＣｏＡとからマロニル−ＡＣＰが合成される。その
後、マロニル−ＡＣＰを生長鎖アシル−ＡＣＰと縮合さ
せる（ＦａｂＢおよびＦａｂＦ、各々、シンターゼＩお
よびＩＩ）。伸長サイクルにおける第２工程は、ＮＡＤ
ＰＨ−依存性β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（Ｆ
ａｂＧ）によるケトエステル還元である。その後、β−
ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＦａｂＡまた
はＦａｂＺのいずれか）で脱水して、トランス−２−エ
ノイル−ＡＣＰとし、それを順次、ＮＡＤＨ−依存性エ
ノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＩ）でアシル−Ａ
ＣＰに変える。このサイクルの次のラウンドでは、１サ
イクル当たり２個の炭素原子を加え、最終的にパルミト
イル−ＡＣＰを得、ついでパルミトイル−ＡＣＰによる
ＦａｂＨおよびＦａｂＩのフィードバック阻害によりそ
のサイクルを大きく停止させる（Heathら、J.Biol.Che
m. ２７１、1833−1836（1996））。
【０００４】セルレニン（cerulenin）およびチオラク
トマイシン（thiolactomycin）は細菌性脂肪酸生合成の
強力かつ選択的阻害剤である。グラム陰性菌にてこれら
の阻害剤を用いる広範囲に及ぶ研究により、この生合成
経路が生存に不可欠であることが証明された。グラム陽
性菌ではほとんど研究はなされていない。完全にＦａｂ
Ｄ活性を欠く変異体は何ら記載されていない。ＦａｂＤ
に対する哺乳動物相同体は未だ同定されていない。市販
の抗生物質は脂肪酸生合成を拮抗することを目的とする
ものではなく、したがって新規な抗生物質が既知の抗生
物質耐性機構により不活性となることはありそうもな
い。ＦａｂＤを標的とする化合物を含め、新種の抗生物
質化合物を開発することが望まれている。
トマイシン（thiolactomycin）は細菌性脂肪酸生合成の
強力かつ選択的阻害剤である。グラム陰性菌にてこれら
の阻害剤を用いる広範囲に及ぶ研究により、この生合成
経路が生存に不可欠であることが証明された。グラム陽
性菌ではほとんど研究はなされていない。完全にＦａｂ
Ｄ活性を欠く変異体は何ら記載されていない。ＦａｂＤ
に対する哺乳動物相同体は未だ同定されていない。市販
の抗生物質は脂肪酸生合成を拮抗することを目的とする
ものではなく、したがって新規な抗生物質が既知の抗生
物質耐性機構により不活性となることはありそうもな
い。ＦａｂＤを標的とする化合物を含め、新種の抗生物
質化合物を開発することが望まれている。
【０００５】明らかに、化合物を抗生物質活性について
スクリーンするのに用いることのでき、感染、機能不全
および疾患の発生病理におけるその役割を測定するのに
用いることのできる因子が必要とされている。かくし
て、感染、機能不全または疾患の予防、改善または治癒
において役割を果たしうる因子を同定し、特徴付ける必
要がある。本発明のポリペプチドは、既知のマロニルＣ
ｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ対してアミノ酸配列相
同性を有する。
スクリーンするのに用いることのでき、感染、機能不全
および疾患の発生病理におけるその役割を測定するのに
用いることのできる因子が必要とされている。かくし
て、感染、機能不全または疾患の予防、改善または治癒
において役割を果たしうる因子を同定し、特徴付ける必
要がある。本発明のポリペプチドは、既知のマロニルＣ
ｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ対してアミノ酸配列相
同性を有する。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、ポリペプチド、とりわけ図２（配列番号２）に示す
アミノ酸配列およびエシェリキアア・コリ（Escherichi
a coli）ＦａｂＤなどの他のタンパク質の既知アミノ酸
配列間の相同性により、新規ＦａｂＤペプチドとして同
定されたポリペプチドを提供することである。本発明の
さらなる目的は、さらに、ＦａｂＤポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、特に本明細書においてＦａｂ
Ｄと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供することである。
は、ポリペプチド、とりわけ図２（配列番号２）に示す
アミノ酸配列およびエシェリキアア・コリ（Escherichi
a coli）ＦａｂＤなどの他のタンパク質の既知アミノ酸
配列間の相同性により、新規ＦａｂＤペプチドとして同
定されたポリペプチドを提供することである。本発明の
さらなる目的は、さらに、ＦａｂＤポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、特に本明細書においてＦａｂ
Ｄと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）に示す配列のＦａｂＤポリペプチドをコ
ードする領域またはそのフラグメント、アナログまたは
誘導体を有する。本発明の別の特に好ましい具体例に
は、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含んでなるス
タフィロコッカス・アウレウス（Stphylococcus aureu
s）由来の新規マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラ
ーゼタンパク質、またはそのフラグメント、アナログま
たは誘導体がある。本発明のこの態様によれば、ＮＣＩ
ＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフィロコッカス
・アウレウス細菌クローン、スタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９により発現可能な成熟ポリペプチド
をコードする単離核酸分子が提供される。
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）に示す配列のＦａｂＤポリペプチドをコ
ードする領域またはそのフラグメント、アナログまたは
誘導体を有する。本発明の別の特に好ましい具体例に
は、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含んでなるス
タフィロコッカス・アウレウス（Stphylococcus aureu
s）由来の新規マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラ
ーゼタンパク質、またはそのフラグメント、アナログま
たは誘導体がある。本発明のこの態様によれば、ＮＣＩ
ＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフィロコッカス
・アウレウス細菌クローン、スタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９により発現可能な成熟ポリペプチド
をコードする単離核酸分子が提供される。
【０００８】本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘
導体、または変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トを含め、そのフラグメントを包含する、ＦａｂＤ、特
にスタフィロコッカス・ＦａｂＤをコードする単離され
た核酸分子、およびそれらからなる組成物が提供され
る。本発明の別の態様によれば、特に遺伝的免疫処置の
治療または予防を目的として、本発明のポリヌクレオチ
ドの使用が提供される。本発明のこの態様の特に好まし
い具体例には、ＦａｂＤの天然の対立遺伝子変種および
それによりコードされるポリペプチドがある。
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘
導体、または変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トを含め、そのフラグメントを包含する、ＦａｂＤ、特
にスタフィロコッカス・ＦａｂＤをコードする単離され
た核酸分子、およびそれらからなる組成物が提供され
る。本発明の別の態様によれば、特に遺伝的免疫処置の
治療または予防を目的として、本発明のポリヌクレオチ
ドの使用が提供される。本発明のこの態様の特に好まし
い具体例には、ＦａｂＤの天然の対立遺伝子変種および
それによりコードされるポリペプチドがある。
【０００９】本発明のこの態様によれば、本明細書にお
いてＦａｂＤと称されるスタフィロコッカスの新規ポリ
ペプチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床
的もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変種およ
び誘導体、および前記したフラグメントおよびアナログ
の変種および誘導体、およびそれらの組成物が提供され
る。本発明のこの態様の特に好ましい具体例には、Ｆａ
ｂＤ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるＦａ
ｂＤポリペプチドの変種がある。本発明のこの態様の好
ましい具体例では、前記したＦａｂＤポリペプチドの製
造方法を提供する。本発明のさらに別の態様によれば、
例えば、抗体を含め、抗菌剤として有用なかかるポリペ
プチドの阻害物質が提供される。
いてＦａｂＤと称されるスタフィロコッカスの新規ポリ
ペプチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床
的もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変種およ
び誘導体、および前記したフラグメントおよびアナログ
の変種および誘導体、およびそれらの組成物が提供され
る。本発明のこの態様の特に好ましい具体例には、Ｆａ
ｂＤ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるＦａ
ｂＤポリペプチドの変種がある。本発明のこの態様の好
ましい具体例では、前記したＦａｂＤポリペプチドの製
造方法を提供する。本発明のさらに別の態様によれば、
例えば、抗体を含め、抗菌剤として有用なかかるポリペ
プチドの阻害物質が提供される。
【００１０】本発明のこの態様および他の態様のある種
の好ましい具体例によれば、とりわけ、上気道疾患（例
えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾
患（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば、分
泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例え
ば、大脳膿瘍）、眼疾患（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角
膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎
および尿管疾患（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲
膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚疾患（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節疾患（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）を治療するために、ＦａｂＤ発現
を評価し；遺伝的変異をアッセイし；およびＦａｂＤポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投与し、細
菌、特にスタフィロコッカスに対する免疫学的応答を誘
起する、生成物、組成物および方法が提供される。
の好ましい具体例によれば、とりわけ、上気道疾患（例
えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾
患（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば、分
泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例え
ば、大脳膿瘍）、眼疾患（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角
膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎
および尿管疾患（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲
膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚疾患（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節疾患（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）を治療するために、ＦａｂＤ発現
を評価し；遺伝的変異をアッセイし；およびＦａｂＤポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投与し、細
菌、特にスタフィロコッカスに対する免疫学的応答を誘
起する、生成物、組成物および方法が提供される。
【００１１】本発明のこのおよび他の態様のある種の好
ましい具体例によれば、ＦａｂＤポリペプチド配列にハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチドが提供され
る。本発明のこの態様のある種のさらに好ましい具体例
において、ＦａｂＤポリペプチドに対する抗体が提供さ
れる。本発明の別の態様によれば、好ましくは、静菌剤
または殺菌剤でもある、ＦａｂＤアゴニストが提供され
る。本発明のさらに別の態様によれば、好ましくは、静
菌剤または殺菌剤でもある、ＦａｂＤアンタゴニストが
提供される。本発明のさらなる態様では、細胞に、また
は多細胞生物に投与するための、ＦａｂＤポリヌクレオ
チドまたはＦａｂＤポリペプチドを含んでなる組成物を
提供する。開示した本発明の精神および観点内での種々
の変更および修飾は、以下の記載を読むこと、および本
明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易
に明らかとなろう。
ましい具体例によれば、ＦａｂＤポリペプチド配列にハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチドが提供され
る。本発明のこの態様のある種のさらに好ましい具体例
において、ＦａｂＤポリペプチドに対する抗体が提供さ
れる。本発明の別の態様によれば、好ましくは、静菌剤
または殺菌剤でもある、ＦａｂＤアゴニストが提供され
る。本発明のさらに別の態様によれば、好ましくは、静
菌剤または殺菌剤でもある、ＦａｂＤアンタゴニストが
提供される。本発明のさらなる態様では、細胞に、また
は多細胞生物に投与するための、ＦａｂＤポリヌクレオ
チドまたはＦａｂＤポリペプチドを含んでなる組成物を
提供する。開示した本発明の精神および観点内での種々
の変更および修飾は、以下の記載を読むこと、および本
明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易
に明らかとなろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるＦａｂＤ−結合分子
は、例えば酵素基質、細胞膜成分および古典的なレセプ
ターを含め、本発明のＦａｂＤポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドと特異的に結合または相互作用する分子ま
たはイオンをいう。本発明のポリペプチドと、結合また
は相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、本
発明のポリペプチドに対して独占的であることが好まし
く、またはその結合は本発明のポリペプチドに高度に特
異的であることもまた好ましく、またはその結合は本発
明のポリペプチドを包含するタンパク質群に高度に特異
的であることも好ましく、または本発明のポリペプチド
を含む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特異
的であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペプ
チドに特異的に結合する抗体および抗体由来の物質をも
包含する。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるＦａｂＤ−結合分子
は、例えば酵素基質、細胞膜成分および古典的なレセプ
ターを含め、本発明のＦａｂＤポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドと特異的に結合または相互作用する分子ま
たはイオンをいう。本発明のポリペプチドと、結合また
は相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、本
発明のポリペプチドに対して独占的であることが好まし
く、またはその結合は本発明のポリペプチドに高度に特
異的であることもまた好ましく、またはその結合は本発
明のポリペプチドを包含するタンパク質群に高度に特異
的であることも好ましく、または本発明のポリペプチド
を含む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特異
的であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペプ
チドに特異的に結合する抗体および抗体由来の物質をも
包含する。
【００１３】「遺伝的エレメント」は、一般に、ポリペ
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
【００１４】「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、場合によっては、配列
を比較して測定されるような、二つまたはそれ以上のポ
リペプチド配列間または二つまたはそれ以上のポリヌク
レオチド配列間の関係である。当該分野において、「同
一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの鎖の間の
合致により決定されるような２つのポリペプチドまたは
ポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意味する。
「同一性」および「類似性」は共に容易に算出できる
（Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オ
ックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨ
ーク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome
Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence
Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、
ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequ
ence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,
G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequence A
nalysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍ
ストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年）。２つ
のポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド間の同一
性および類似性を測定するための多くの方法がある一方
で、その両方の用語は当業者に周知である（Ｓequence
Ａnalysis in ＭolecularＢiology，von Heinje，Ｇ.，
ＡcademicＰress，1987；Ｓquence ＡnalysisＰrimer，
Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereux，Ｊ.，編、Ｍ Ｓtockt
onＰress，Ｎew Ｙork，1991；およびＣarillo，Ｈ.，
およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.，ＡppliedＭath.，
48：1073（1988））。２つの配列間で同一性または類似
性を測定するのに通常用いられる方法は、Ｃarillo，
Ｈ.およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.Ａpplied Ｍat
h.，48：1073（1988）に開示されている方法を包含する
が、これに限定されるものではない。同一性を決定する
ための好ましい方法は、試験する２つの配列間で最も良
く適合するように設計される。同一性および類似性を測
定する方法は、コンピュータープログラムに組み込まれ
ている。二つの配列間の同一性および類似性を測定する
好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログ
ラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Resea
rch 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA
（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（199
0）））を包含するが、これらに限定されるものではな
い。
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、場合によっては、配列
を比較して測定されるような、二つまたはそれ以上のポ
リペプチド配列間または二つまたはそれ以上のポリヌク
レオチド配列間の関係である。当該分野において、「同
一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの鎖の間の
合致により決定されるような２つのポリペプチドまたは
ポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意味する。
「同一性」および「類似性」は共に容易に算出できる
（Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オ
ックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨ
ーク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome
Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence
Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、
ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequ
ence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,
G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequence A
nalysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍ
ストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年）。２つ
のポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド間の同一
性および類似性を測定するための多くの方法がある一方
で、その両方の用語は当業者に周知である（Ｓequence
Ａnalysis in ＭolecularＢiology，von Heinje，Ｇ.，
ＡcademicＰress，1987；Ｓquence ＡnalysisＰrimer，
Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereux，Ｊ.，編、Ｍ Ｓtockt
onＰress，Ｎew Ｙork，1991；およびＣarillo，Ｈ.，
およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.，ＡppliedＭath.，
48：1073（1988））。２つの配列間で同一性または類似
性を測定するのに通常用いられる方法は、Ｃarillo，
Ｈ.およびＬipman，Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.Ａpplied Ｍat
h.，48：1073（1988）に開示されている方法を包含する
が、これに限定されるものではない。同一性を決定する
ための好ましい方法は、試験する２つの配列間で最も良
く適合するように設計される。同一性および類似性を測
定する方法は、コンピュータープログラムに組み込まれ
ている。二つの配列間の同一性および類似性を測定する
好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログ
ラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Resea
rch 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA
（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（199
0）））を包含するが、これらに限定されるものではな
い。
【００１５】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
【００１６】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチドは、
しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称され
る短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチドは、
しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称され
る短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００１７】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。本発明
のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、例
示を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有
結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド
結合形成、脱メチル化、共有交差結合形成、シスチン形
成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマー−
カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒド
ロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸
化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プ
レニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニ
ル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸付
加、およびユビキチン化がある。かかる修飾は当業者に
周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されている。
いくつかの特に一般的な修飾、例えば糖鎖形成、脂質結
合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル
化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化は最も基礎
的なテキスト、例えばProteins-Structure and Molecul
ar Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freemanan
d Company、ニューヨーク（1993）に記載されている。
例えば、Posttranslational Covalent Modification of
Proteins、B.C.Johnson編、アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Prot
ein Modifications ：Perspective and Prospects、1〜
12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（1990）
およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslation
al Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:4
8-62（1992）で提供される論文などの多くの詳細な論文
が、本主題に利用できる。ポリペプチドはいつも完全に
直鎖であるとは限らないということは周知であり、前記
した通りであると理解されよう。例えばポリペプチドは
ユビキチン化の結果分岐していてもよく、一般には、天
然のプロセッシング事象を含む翻訳後の事象、および天
然では起こらない人為的操作によりもたらされる事象の
結果、分岐のある、または分岐のない環状にできる。環
状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、非翻訳天
然のプロセッシングにより、および同様に全く合成的な
方法で合成できる。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖
およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプ
チドのどこででも起こり得る。実際、共有結合の修飾に
よる、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル基また
はその両方の遮断は、天然および合成ポリペプチドに共
通し、かかる修飾は同様に本発明のポリペプチドにも存
在し得る。例えば、イー・コリ（E.coli.）または他の
細胞で作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、タン
パク質溶解のプロセッシングの前にほとんど必ずＮ−ホ
ルミルメチオニンになるであろう。ペプチドの翻訳後の
修飾の間に、ＮＨ2末端でメチオニン残基を除去でき
る。従って、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニ
ン含有およびメチオニン不含の両方のアミノ末端変種の
使用を意図する。ポリペプチドに起こる修飾はしばしば
それの作り方に影響される。例えば、宿主にクローン化
遺伝子を発現することにより作られるポリペプチドで
は、修飾の特性および程度は、大部分、宿主細胞の翻訳
後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配列に存在する
修飾シグナルにより決定される。例えば、周知のよう
に、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主では起こら
ないことがはしばしばである。従って、糖鎖形成が望ま
しい場合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、一般に、真
核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞は、しばし
ば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行う；この理
由で昆虫細胞発現系が、とりわけ、糖鎖形成の本来のパ
ターンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現する
ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用
される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいく
つかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ること
は理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる
場合、「ポリペプチド」なる用語は、全てのこのような
修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包
含する。
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。本発明
のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、例
示を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有
結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド
結合形成、脱メチル化、共有交差結合形成、シスチン形
成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマー−
カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒド
ロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸
化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プ
レニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニ
ル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸付
加、およびユビキチン化がある。かかる修飾は当業者に
周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されている。
いくつかの特に一般的な修飾、例えば糖鎖形成、脂質結
合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル
化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化は最も基礎
的なテキスト、例えばProteins-Structure and Molecul
ar Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freemanan
d Company、ニューヨーク（1993）に記載されている。
例えば、Posttranslational Covalent Modification of
Proteins、B.C.Johnson編、アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Prot
ein Modifications ：Perspective and Prospects、1〜
12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（1990）
およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslation
al Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:4
8-62（1992）で提供される論文などの多くの詳細な論文
が、本主題に利用できる。ポリペプチドはいつも完全に
直鎖であるとは限らないということは周知であり、前記
した通りであると理解されよう。例えばポリペプチドは
ユビキチン化の結果分岐していてもよく、一般には、天
然のプロセッシング事象を含む翻訳後の事象、および天
然では起こらない人為的操作によりもたらされる事象の
結果、分岐のある、または分岐のない環状にできる。環
状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、非翻訳天
然のプロセッシングにより、および同様に全く合成的な
方法で合成できる。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖
およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプ
チドのどこででも起こり得る。実際、共有結合の修飾に
よる、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル基また
はその両方の遮断は、天然および合成ポリペプチドに共
通し、かかる修飾は同様に本発明のポリペプチドにも存
在し得る。例えば、イー・コリ（E.coli.）または他の
細胞で作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、タン
パク質溶解のプロセッシングの前にほとんど必ずＮ−ホ
ルミルメチオニンになるであろう。ペプチドの翻訳後の
修飾の間に、ＮＨ2末端でメチオニン残基を除去でき
る。従って、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニ
ン含有およびメチオニン不含の両方のアミノ末端変種の
使用を意図する。ポリペプチドに起こる修飾はしばしば
それの作り方に影響される。例えば、宿主にクローン化
遺伝子を発現することにより作られるポリペプチドで
は、修飾の特性および程度は、大部分、宿主細胞の翻訳
後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配列に存在する
修飾シグナルにより決定される。例えば、周知のよう
に、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主では起こら
ないことがはしばしばである。従って、糖鎖形成が望ま
しい場合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、一般に、真
核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞は、しばし
ば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行う；この理
由で昆虫細胞発現系が、とりわけ、糖鎖形成の本来のパ
ターンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現する
ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用
される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいく
つかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ること
は理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる
場合、「ポリペプチド」なる用語は、全てのこのような
修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包
含する。
【００１８】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。（１）ヌクレオチド配列に
て他の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレ
オチド。一般に、違いは対照標準と変種のヌクレオチド
配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同
一であるものに限られる。以下に記すように、変種にお
けるヌクレオチドの配列の変化はサイレントであっても
よい。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコ
ードされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型
のサイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準
と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。（２）アミノ酸配列にて他の対照標準のポリペ
プチドと異なるポリペプチド。一般に、違いは対照標準
と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領
域で同一であるものに限られる。変種および対照標準の
ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じてい
てもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていてもよ
い。
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。（１）ヌクレオチド配列に
て他の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレ
オチド。一般に、違いは対照標準と変種のヌクレオチド
配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同
一であるものに限られる。以下に記すように、変種にお
けるヌクレオチドの配列の変化はサイレントであっても
よい。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコ
ードされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型
のサイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準
と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。（２）アミノ酸配列にて他の対照標準のポリペ
プチドと異なるポリペプチド。一般に、違いは対照標準
と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領
域で同一であるものに限られる。変種および対照標準の
ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じてい
てもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていてもよ
い。
【００１９】本発明は、とりわけ、以下により詳細に記
載する、新規ＦａｂＤポリペプチドおよびそれをコード
するポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、エシ
ェリキア・コリのＦａｂＤポリペプチドに対するアミノ
酸配列相同性により関連付けられる、スタフィロコッカ
ス・アウレウスの新規ＦａｂＤ遺伝子のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、各
々、図１（配列番号１）および図２（配列番号２）に示
すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するＦａｂＤ、
ならびに本明細書において「寄託クローン」または「寄
託クローンのＤＮＡ」と称するＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１中のＤＮＡのＦａｂＤヌクレオチドおよびアミノ
酸配列に関する。図１（配列番号１）および図２（配列
番号２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、寄
託クローンのＤＮＡを配列決定することにより得られた
ことは理解されよう。従って、寄託菌のＦａｂＤの配列
が、その配列（およびそれをコードする配列）と図１
（配列番号１）および図２（配列番号２）の配列の間の
いずれの不一致についても調節するものである。
載する、新規ＦａｂＤポリペプチドおよびそれをコード
するポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、エシ
ェリキア・コリのＦａｂＤポリペプチドに対するアミノ
酸配列相同性により関連付けられる、スタフィロコッカ
ス・アウレウスの新規ＦａｂＤ遺伝子のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、各
々、図１（配列番号１）および図２（配列番号２）に示
すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するＦａｂＤ、
ならびに本明細書において「寄託クローン」または「寄
託クローンのＤＮＡ」と称するＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１中のＤＮＡのＦａｂＤヌクレオチドおよびアミノ
酸配列に関する。図１（配列番号１）および図２（配列
番号２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、寄
託クローンのＤＮＡを配列決定することにより得られた
ことは理解されよう。従って、寄託菌のＦａｂＤの配列
が、その配列（およびそれをコードする配列）と図１
（配列番号１）および図２（配列番号２）の配列の間の
いずれの不一致についても調節するものである。
【００２０】特に、実験室条件および宿主感染条件下で
の生存性に適用すると、その技法は細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに利用できる。それ自体生存
に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持
に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用
いることができる。これらの方法の一つにより配列の発
現を同定するで、その機能についてのさらなる情報が得
られ、かかる配列をスクリーニングの標的としてさらに
開発するための選別が可能となる。簡単には、これらの
研究は例えば：
の生存性に適用すると、その技法は細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに利用できる。それ自体生存
に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持
に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用
いることができる。これらの方法の一つにより配列の発
現を同定するで、その機能についてのさらなる情報が得
られ、かかる配列をスクリーニングの標的としてさらに
開発するための選別が可能となる。簡単には、これらの
研究は例えば：
【００２１】１）シグナチャータグ化突然変異法（Sign
ature Tagged Mutagenesis：STM） この技法は、Henselら、Science269:400-403（1995）に
記載されており、その内容を出典明示により本明細書の
一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発は、所定
感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を
同定するものである。この技法は、種々の手段（例えば
トランスポゾン）により、標的生物にランダムに突然変
異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非
常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体
および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタグ
は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション
分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感
染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により表
される。ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓtrepto
coccus pneumoniae）においては、トランスポゾンシス
テムはあまり開発されていないので、タグ化突然変異体
を作るためのより有効な方法は、その内容を出典明示に
より本明細書の一部とする、Morrisonら、J.Bacteriol.
159:870（1984）に記載される挿入-複製突然変異法を用
いる。
ature Tagged Mutagenesis：STM） この技法は、Henselら、Science269:400-403（1995）に
記載されており、その内容を出典明示により本明細書の
一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発は、所定
感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を
同定するものである。この技法は、種々の手段（例えば
トランスポゾン）により、標的生物にランダムに突然変
異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非
常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体
および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタグ
は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション
分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感
染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により表
される。ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓtrepto
coccus pneumoniae）においては、トランスポゾンシス
テムはあまり開発されていないので、タグ化突然変異体
を作るためのより有効な方法は、その内容を出典明示に
より本明細書の一部とする、Morrisonら、J.Bacteriol.
159:870（1984）に記載される挿入-複製突然変異法を用
いる。
【００２２】２）インビボ発現法（In Vivo Expression
Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA．91:2
634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268（1994）に記載されており、各
々の内容を出典明示により本明細書の一部とする。IVET
は、実験培養と比較した場合、感染において重要な役割
を有する、感染中にアップレギュレーションする遺伝子
を同定する。この技法により同定される配列は感染の確
立/維持に重要な役割を有する。
Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA．91:2
634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268（1994）に記載されており、各
々の内容を出典明示により本明細書の一部とする。IVET
は、実験培養と比較した場合、感染において重要な役割
を有する、感染中にアップレギュレーションする遺伝子
を同定する。この技法により同定される配列は感染の確
立/維持に重要な役割を有する。
【００２３】この技法では、標的生物のランダムな染色
体フラグメントは、プラスミドベクターのプロモーター
不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プー
ルを宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収
し、リポーター遺伝子発現の存在を評価できる。発現し
たリポーター遺伝子の上流に担持される染色体フラグメ
ントは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけ
るプロモーターまたは遺伝子部分を担持するはずであ
る。組換え酵素遺伝子の上流を配列決定すると、アップ
レギュレーションされた遺伝子を同定できる。
体フラグメントは、プラスミドベクターのプロモーター
不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プー
ルを宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収
し、リポーター遺伝子発現の存在を評価できる。発現し
たリポーター遺伝子の上流に担持される染色体フラグメ
ントは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけ
るプロモーターまたは遺伝子部分を担持するはずであ
る。組換え酵素遺伝子の上流を配列決定すると、アップ
レギュレーションされた遺伝子を同定できる。
【００２４】３）特徴ディスプレイ この技法は、その内容を出典明示により本明細書の一部
とする、Chuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（199
3）に記載されている。この方法はランダムプライムＲ
Ｔ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することによ
り、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および感
染後のプロフィールを比較することにより、感染中にア
ップレギュレーションおよびダウンレギュレーションさ
れる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が配列決定
され、ライブラリー配列に適合させられる。
とする、Chuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（199
3）に記載されている。この方法はランダムプライムＲ
Ｔ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することによ
り、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および感
染後のプロフィールを比較することにより、感染中にア
ップレギュレーションおよびダウンレギュレーションさ
れる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が配列決定
され、ライブラリー配列に適合させられる。
【００２５】４）トランスポゾン突然変異誘発による条
件致死変異体の発生 この技法は、de Lorenzo，V.ら、Gene 123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene 125:69-73（1993）およびT
akiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に
記載されており(その内容を出典明示により本明細書の
一部とする）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニター観察には、フローサイトメトリー（細胞
分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化
学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反
応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等があ
る。
件致死変異体の発生 この技法は、de Lorenzo，V.ら、Gene 123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene 125:69-73（1993）およびT
akiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に
記載されており(その内容を出典明示により本明細書の
一部とする）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニター観察には、フローサイトメトリー（細胞
分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化
学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反
応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等があ
る。
【００２６】５）化学的突然変異法による条件致死突然
変異体の発生 この技法は、出典明示により本明細書の一部とする、Be
ckwith,J.Methods inEnzymology204:3-18（1991）に記
載されている。この技法では標的生物のランダム化学的
突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異な
る温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異な
る温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定の
ためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった
単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のよう
に、非許容温度での増殖における変化を正確にモニター
し、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生
物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補
し、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライ
ブラリー配列と適合させることができる。これらの技法
の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利で
あったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も
関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子
は感染に必須であると認識されているが、実際には感染
の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確
立された慢性の感染の治療のために開発された抗細菌物
質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。
変異体の発生 この技法は、出典明示により本明細書の一部とする、Be
ckwith,J.Methods inEnzymology204:3-18（1991）に記
載されている。この技法では標的生物のランダム化学的
突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異な
る温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異な
る温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定の
ためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった
単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のよう
に、非許容温度での増殖における変化を正確にモニター
し、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生
物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補
し、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライ
ブラリー配列と適合させることができる。これらの技法
の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利で
あったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も
関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子
は感染に必須であると認識されているが、実際には感染
の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確
立された慢性の感染の治療のために開発された抗細菌物
質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。
【００２７】６）ＲＴ−ＰＣＲ 細菌のメッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコ
ッカス・アウレウスのものを、細菌感染した組織、例え
ば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダム
ヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの逆
転写により、続いて遺伝子特異的プライマー対でのＰＣ
Ｒにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られた
ＰＣＲ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在お
よび量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝子
に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の種々
の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制御
に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が新
規な抗菌物質をスクリーニングする標的に相当すること
が明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライマ
ーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物
は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解さ
れるべきである。これにより研究者は、感染組織から簡
単で迅速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間し
か生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を
得ることができる。最適には、ＴＲＩゾール（ギブコ−
ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊するこ
とにより、細菌性ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織から調製
し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指示に従ってプ
ロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除
去する。好ましくは、適宜標識した配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブを用いてノーザンをプロービングす
ることにより検出されるようなスタフィロコッカス・ア
ウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスタフ
ィロコッカス・アウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡの
最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシングが
最適化される。典型的には、最適には８から２５サイク
ルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマー対
には５’色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物は
６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanner
（ＡＢＩ製）を用いて検出および定量する。
ッカス・アウレウスのものを、細菌感染した組織、例え
ば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダム
ヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの逆
転写により、続いて遺伝子特異的プライマー対でのＰＣ
Ｒにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られた
ＰＣＲ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在お
よび量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝子
に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の種々
の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制御
に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が新
規な抗菌物質をスクリーニングする標的に相当すること
が明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライマ
ーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物
は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解さ
れるべきである。これにより研究者は、感染組織から簡
単で迅速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間し
か生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を
得ることができる。最適には、ＴＲＩゾール（ギブコ−
ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊するこ
とにより、細菌性ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織から調製
し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指示に従ってプ
ロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除
去する。好ましくは、適宜標識した配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブを用いてノーザンをプロービングす
ることにより検出されるようなスタフィロコッカス・ア
ウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスタフ
ィロコッカス・アウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡの
最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシングが
最適化される。典型的には、最適には８から２５サイク
ルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマー対
には５’色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物は
６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanner
（ＡＢＩ製）を用いて検出および定量する。
【００２８】本発明の配列に適用する場合、これらの技
法を用いると、感染中に発現する細菌性タンパク質の種
類、抗細菌治療に利用できる阻害物質の直接的同定が可
能になる。
法を用いると、感染中に発現する細菌性タンパク質の種
類、抗細菌治療に利用できる阻害物質の直接的同定が可
能になる。
【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図２（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するＦａｂＤポリペプチドをコード
する単離ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で提供
される遺伝子についての２種の異なるＧＴＧ初期コドン
（メチオニン）開始部位が得られる。図１（配列番号
１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提
供される情報を用いて、ＦａｂＤポリペプチドをコード
する本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニン
グおよびスクリーニングの手法、例えば、出発物質とし
てスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９からの
染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決
定し、つづいて完全長のクローンを得るための手法を用
いて得ることができる。例えば、図１（配列番号１）に
示す配列などの本発明の配列のポリヌクレオチドを得る
ためには、典型的には、イー・コリまたはいくつかの他
の適当な宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、
部分配列に由来する、好ましくは１７量体またはそれ以
上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドでプロー
ブする。ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有するク
ローンは、非常にストリンジェントな洗浄操作に付すこ
とにより区別できる。元の配列から設計された配列決定
プライマーで同定された個々のクローンを配列決定する
ことにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝子配列
を決定することが可能である。都合よくは、かかる配列
決定をプラスミドクローンから調製された変性二本鎖Ｄ
ＮＡを用いて実施する。適当な技術については、Maniat
is,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecular Clo
ning，A Laboratory Manual，第２版；コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・
スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）；（ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング1.９０および
変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこ
と）に記載されている。本発明の一例として、図１（配
列番号１）に示すポリヌクレオチドは、スタフィロコッ
カス・アウレウスＷＣＵＨ２９に由来するＤＮＡライブ
ラリー中で見出したものである。
定アミノ酸配列を有するＦａｂＤポリペプチドをコード
する単離ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で提供
される遺伝子についての２種の異なるＧＴＧ初期コドン
（メチオニン）開始部位が得られる。図１（配列番号
１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提
供される情報を用いて、ＦａｂＤポリペプチドをコード
する本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニン
グおよびスクリーニングの手法、例えば、出発物質とし
てスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９からの
染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決
定し、つづいて完全長のクローンを得るための手法を用
いて得ることができる。例えば、図１（配列番号１）に
示す配列などの本発明の配列のポリヌクレオチドを得る
ためには、典型的には、イー・コリまたはいくつかの他
の適当な宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、
部分配列に由来する、好ましくは１７量体またはそれ以
上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドでプロー
ブする。ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有するク
ローンは、非常にストリンジェントな洗浄操作に付すこ
とにより区別できる。元の配列から設計された配列決定
プライマーで同定された個々のクローンを配列決定する
ことにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝子配列
を決定することが可能である。都合よくは、かかる配列
決定をプラスミドクローンから調製された変性二本鎖Ｄ
ＮＡを用いて実施する。適当な技術については、Maniat
is,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecular Clo
ning，A Laboratory Manual，第２版；コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・
スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）；（ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング1.９０および
変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこ
と）に記載されている。本発明の一例として、図１（配
列番号１）に示すポリヌクレオチドは、スタフィロコッ
カス・アウレウスＷＣＵＨ２９に由来するＤＮＡライブ
ラリー中で見出したものである。
【００３０】寄託菌クローンのＦａｂＤをコードするＤ
ＮＡを配列決定する結果わかるように、本発明のＦａｂ
Ｄは、構造的に、Ｆａｂ（脂肪酸生合成）ファミリーの
他のタンパク質に関連付けられる。こうして得られたＤ
ＮＡ配列を図１（配列番号１）に示す。これは、各々、
当該分野にて知られているアミノ酸残基の分子量を用い
て計算することのできる推定分子量を有する、図２（配
列番号２）に示すおよその数のアミノ酸残基を有するタ
ンパク質をコードするオープンリーディングフレームを
有する。このタンパク質は、既知タンパク質の中でも、
エシェリキア・コリＦａｂＤタンパク質に対して最大の
相同性を示す。図２（配列番号２）のＦａｂＤは、エシ
ェリキア・コリＦａｂＤのアミノ酸配列と著しい相同性
を有する。
ＮＡを配列決定する結果わかるように、本発明のＦａｂ
Ｄは、構造的に、Ｆａｂ（脂肪酸生合成）ファミリーの
他のタンパク質に関連付けられる。こうして得られたＤ
ＮＡ配列を図１（配列番号１）に示す。これは、各々、
当該分野にて知られているアミノ酸残基の分子量を用い
て計算することのできる推定分子量を有する、図２（配
列番号２）に示すおよその数のアミノ酸残基を有するタ
ンパク質をコードするオープンリーディングフレームを
有する。このタンパク質は、既知タンパク質の中でも、
エシェリキア・コリＦａｂＤタンパク質に対して最大の
相同性を示す。図２（配列番号２）のＦａｂＤは、エシ
ェリキア・コリＦａｂＤのアミノ酸配列と著しい相同性
を有する。
【００３１】本発明のポリヌクレオチドは、クローニン
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃDＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１（配列番号１）に示すポリヌクレオ
チドのコーディング配列と同一であってもよい。さら
に、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結果、、図
２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる配
列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃDＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１（配列番号１）に示すポリヌクレオ
チドのコーディング配列と同一であってもよい。さら
に、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結果、、図
２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる配
列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３２】図２（配列番号２）のポリペプチドをコー
ドする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド
のコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、プ
ロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌配
列をコードするコーディング配列；付加非コーディング
配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共にま
たはなしで、例えば、限定するものではないが、転写に
て役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止シ
グナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。かくして、例えば、該ポリペプチド
は、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどのマ
ーカー配列に融合していてもよい。本発明のこの態様の
ある具体例において、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジ
ンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キアゲ
ン・インコーポレーティッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得
られるタグであり、多くが市販により入手可能である。
例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-8
24（1989）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは
融合タンパク質の通常の精製法を提供する。インフルエ
ンザ・ヘマググルチニン・タンパク質由来のエピトープ
に対応する、ＨＡタグもまた融合タンパク質の生成に使
用でき、これについては例えばWilsonら、Cell，37：76
7（1984）に記載されている。本発明のポリヌクレオチ
ドはまた、構造遺伝子およびその自然に付随する遺伝的
エレメントからなるポリヌクレオチドを包含するが、こ
れに限定されるものではない。
ドする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド
のコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、プ
ロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌配
列をコードするコーディング配列；付加非コーディング
配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共にま
たはなしで、例えば、限定するものではないが、転写に
て役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止シ
グナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。かくして、例えば、該ポリペプチド
は、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどのマ
ーカー配列に融合していてもよい。本発明のこの態様の
ある具体例において、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジ
ンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キアゲ
ン・インコーポレーティッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得
られるタグであり、多くが市販により入手可能である。
例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-8
24（1989）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは
融合タンパク質の通常の精製法を提供する。インフルエ
ンザ・ヘマググルチニン・タンパク質由来のエピトープ
に対応する、ＨＡタグもまた融合タンパク質の生成に使
用でき、これについては例えばWilsonら、Cell，37：76
7（1984）に記載されている。本発明のポリヌクレオチ
ドはまた、構造遺伝子およびその自然に付随する遺伝的
エレメントからなるポリヌクレオチドを包含するが、こ
れに限定されるものではない。
【００３３】前記によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する、スタフ
ィロコッカス・アウレウス・ＦａｂＤのポリペプチドを
コードする配列を有するポリヌクレオチド包含する。こ
の用語は、さらにコーディングおよび／または非コーデ
ィング配列を含有していてもよい、付加領域と共に該ポ
リペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領
域（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列ま
たはエディティング（editing）により分断される）を
含む、ポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、
図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコード
する、本明細書で前記したポリヌクレオチドの変種に関
する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変
種などの天然の変種であってもよく、または自然に発生
することが知られていない変種であってもよい。このよ
うなポリヌクレオチドの非天然変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に適用される方法を含め、突然変異
誘発技術により作ることができる。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する、スタフ
ィロコッカス・アウレウス・ＦａｂＤのポリペプチドを
コードする配列を有するポリヌクレオチド包含する。こ
の用語は、さらにコーディングおよび／または非コーデ
ィング配列を含有していてもよい、付加領域と共に該ポ
リペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領
域（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列ま
たはエディティング（editing）により分断される）を
含む、ポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、
図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコード
する、本明細書で前記したポリヌクレオチドの変種に関
する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変
種などの天然の変種であってもよく、または自然に発生
することが知られていない変種であってもよい。このよ
うなポリヌクレオチドの非天然変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に適用される方法を含め、突然変異
誘発技術により作ることができる。
【００３４】この点における変種には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換、欠失または付加は１またはそ
れ以上のヌクレオチドに起こる。変種はコーディングも
しくは非コーディング領域またはその両方において変化
していてもよい。コーディング領域における変化が保存
的または非保存的アミノ酸置換、欠損または付加を生成
するかもしれない。この点に関する本発明の特に好まし
い具体例には、図２（配列番号２）に示すＦａｂＤのア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；それらの変種、アナログ、誘導体およびフラ
グメントならびに変種、アナログおよび誘導体のフラグ
メントがある。この点において、さらに特に好ましく
は、図２（配列番号２）のＦａｂＤポリペプチドで、そ
のうち、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、
２、１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わ
せで置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有
する、ＦａｂＤ変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよ
び誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でも
とりわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および
欠失であり、ＦａｂＤの特性および活性を変えないもの
である。また、この点に関してとりわけ好ましいもの
は、保存的置換である。最も好ましいものは、置換され
ていない、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換、欠失または付加は１またはそ
れ以上のヌクレオチドに起こる。変種はコーディングも
しくは非コーディング領域またはその両方において変化
していてもよい。コーディング領域における変化が保存
的または非保存的アミノ酸置換、欠損または付加を生成
するかもしれない。この点に関する本発明の特に好まし
い具体例には、図２（配列番号２）に示すＦａｂＤのア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；それらの変種、アナログ、誘導体およびフラ
グメントならびに変種、アナログおよび誘導体のフラグ
メントがある。この点において、さらに特に好ましく
は、図２（配列番号２）のＦａｂＤポリペプチドで、そ
のうち、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、
２、１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わ
せで置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有
する、ＦａｂＤ変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよ
び誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でも
とりわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および
欠失であり、ＦａｂＤの特性および活性を変えないもの
である。また、この点に関してとりわけ好ましいもの
は、保存的置換である。最も好ましいものは、置換され
ていない、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３５】本発明のさらに好ましい態様は、図２（配
列番号２）に示すアミノ酸配列を有するＦａｂＤポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわ
たって少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、およ
びかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
である。また、寄託クローンのスタフィロコッカス・ア
ウレウスＤＮＡのＦａｂＤポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドに対して全長にわたって少なくとも８０
％同一である領域を有するポリヌクレオチド、およびそ
れらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。この
点において、その同じものに対して全長にわたって少な
くとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドがとり
わけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有す
るものが特に好ましい。さらには、少なくとも９５％の
同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であるの
がより好ましく、その中でも少なくとも９８％および少
なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なく
とも９９％であるのがより好ましい。
列番号２）に示すアミノ酸配列を有するＦａｂＤポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわ
たって少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、およ
びかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
である。また、寄託クローンのスタフィロコッカス・ア
ウレウスＤＮＡのＦａｂＤポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドに対して全長にわたって少なくとも８０
％同一である領域を有するポリヌクレオチド、およびそ
れらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。この
点において、その同じものに対して全長にわたって少な
くとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドがとり
わけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有す
るものが特に好ましい。さらには、少なくとも９５％の
同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であるの
がより好ましく、その中でも少なくとも９８％および少
なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なく
とも９９％であるのがより好ましい。
【００３６】この点に関して好ましい具体例は、さらに
は、図１（配列番号１）のＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドである。本発明はさらに本明細書で前記した配列にハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。
この点において、本発明は、特に、ストリンジェントな
条件下で本明細書で前記したポリヌクレオチドにハイブ
リダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明
細書で用いる「ストリンジェントな条件」なる用語は、
ハイブリダイゼーションが配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ
起こることを意味する。
は、図１（配列番号１）のＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドである。本発明はさらに本明細書で前記した配列にハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。
この点において、本発明は、特に、ストリンジェントな
条件下で本明細書で前記したポリヌクレオチドにハイブ
リダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明
細書で用いる「ストリンジェントな条件」なる用語は、
ハイブリダイゼーションが配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ
起こることを意味する。
【００３７】本発明のポリヌクレオチドアッセイについ
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、ＦａｂＤをコードする完全長ｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離し、ならびにＦａｂＤ遺伝子に
対して高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離することができる。かかる
プローブは、一般に、少なくとも１５塩基を有してな
る。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０塩基
からなり、少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好
ましいプローブは少なくとも３０塩基を有し、５０以下
の塩基を有する。例えば、ＦａｂＤ遺伝子のコーディン
グ領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、
オリゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離
できる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列
を有する標識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリー
ニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハ
イブリダイズするかを決定する。
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、ＦａｂＤをコードする完全長ｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離し、ならびにＦａｂＤ遺伝子に
対して高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離することができる。かかる
プローブは、一般に、少なくとも１５塩基を有してな
る。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０塩基
からなり、少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好
ましいプローブは少なくとも３０塩基を有し、５０以下
の塩基を有する。例えば、ＦａｂＤ遺伝子のコーディン
グ領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、
オリゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離
できる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列
を有する標識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリー
ニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハ
イブリダイズするかを決定する。
【００３８】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列番号３および４を含め、配列
番号１または２の配列より誘導される、オリゴヌクレオ
チドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書にお
いて同定された配列、特にスタフィロコッカス・アウレ
ウス遺伝子が、全体としてまたは部分的に、感染組織に
て転写されるかどうかを決定するために、本明細書にて
記載した方法、好ましくはＰＣＲにて使用できる。かか
る配列はまた、病因が達した感染の段階および型の診断
にも有用であると思われる。ポリヌクレオチドは、成熟
タンパク質に、さらなるアミノもしくはカルボキシル末
端アミノ酸が加わるか、またはその内部にアミノ酸が加
わった（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を
有する場合）ポリペプチドをコードできる。かかる配列
は前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシング
において役割を有し、タンパク質を運び、タンパク質の
半減期を長くしたり短くしたり、またはとりわけアッセ
イもしくは生成のためのタンパク質の操作を容易にする
ことができる。インビボで一般的なように、付加アミノ
酸は、細胞酵素により成熟タンパク質からプロセッシン
グで取り除かれる。
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列番号３および４を含め、配列
番号１または２の配列より誘導される、オリゴヌクレオ
チドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書にお
いて同定された配列、特にスタフィロコッカス・アウレ
ウス遺伝子が、全体としてまたは部分的に、感染組織に
て転写されるかどうかを決定するために、本明細書にて
記載した方法、好ましくはＰＣＲにて使用できる。かか
る配列はまた、病因が達した感染の段階および型の診断
にも有用であると思われる。ポリヌクレオチドは、成熟
タンパク質に、さらなるアミノもしくはカルボキシル末
端アミノ酸が加わるか、またはその内部にアミノ酸が加
わった（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を
有する場合）ポリペプチドをコードできる。かかる配列
は前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシング
において役割を有し、タンパク質を運び、タンパク質の
半減期を長くしたり短くしたり、またはとりわけアッセ
イもしくは生成のためのタンパク質の操作を容易にする
ことができる。インビボで一般的なように、付加アミノ
酸は、細胞酵素により成熟タンパク質からプロセッシン
グで取り除かれる。
【００３９】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
【００４０】寄託材料 寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関する
ブダペスト条約の条件下で行われている。特許が発行さ
れると何らの制限または条件もなく、最終的には株は分
譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、
寄託が実施可能要件であることを承認するものではな
い。スタフィロコッカス・アウレウス菌のＷＣＵＨ２９
を含む寄託菌は、ナショナル・コレクション・オブ・イ
ンダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテ
ッド（ＮＣＩＭＢ）、スコットランド、アバディーンＡ
Ｂ２ １ＲＹ、マーカー・ドライブ２３ストリートに１
９９５年９月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４
０７７１を付された。そのスタフィロコッカス・アウレ
ウス細菌クローン寄託菌を、以下、「寄託クローン」ま
たは「寄託クローンのＤＮＡ」と称する。寄託材料は、
寄託により「ＮＣＩＭＢ４０７７１」と称される。寄託
材料に含まれるＦａｂＤポリヌクレオチドの配列、なら
びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象を調節する
ものである。寄託材料を製造、使用または販売するため
にはライセンスが必要であるが、そのようなライセンス
はここで付与されるものではない。
ブダペスト条約の条件下で行われている。特許が発行さ
れると何らの制限または条件もなく、最終的には株は分
譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、
寄託が実施可能要件であることを承認するものではな
い。スタフィロコッカス・アウレウス菌のＷＣＵＨ２９
を含む寄託菌は、ナショナル・コレクション・オブ・イ
ンダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテ
ッド（ＮＣＩＭＢ）、スコットランド、アバディーンＡ
Ｂ２ １ＲＹ、マーカー・ドライブ２３ストリートに１
９９５年９月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４
０７７１を付された。そのスタフィロコッカス・アウレ
ウス細菌クローン寄託菌を、以下、「寄託クローン」ま
たは「寄託クローンのＤＮＡ」と称する。寄託材料は、
寄託により「ＮＣＩＭＢ４０７７１」と称される。寄託
材料に含まれるＦａｂＤポリヌクレオチドの配列、なら
びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象を調節する
ものである。寄託材料を製造、使用または販売するため
にはライセンスが必要であるが、そのようなライセンス
はここで付与されるものではない。
【００４１】ポリペプチド 本発明はさらには、図２（配列番号２）に示されるよう
な長さのアミノ酸の推定アミノ酸配列を有するＦａｂＤ
ポリペプチドに関する。本発明はまたこれらのポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体にも関す
る。「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」
なる用語は、図２（配列番号２）のポリペプチドをいう
場合、かかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機
能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従っ
て、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性成
熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク質
を包含する。
な長さのアミノ酸の推定アミノ酸配列を有するＦａｂＤ
ポリペプチドに関する。本発明はまたこれらのポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体にも関す
る。「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」
なる用語は、図２（配列番号２）のポリペプチドをいう
場合、かかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機
能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従っ
て、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性成
熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク質
を包含する。
【００４２】図２（配列番号２）のポリペプチドのフラ
グメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１または
それ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸残
基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換されたも
ので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコード
されたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１
またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、ま
たは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば
ポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリエ
チレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）付
加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポ
リペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いら
れる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであっ
てもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログ
は、本明細書の教示より当業者に明らかであると考えら
れる。
グメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１または
それ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸残
基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換されたも
ので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコード
されたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１
またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、ま
たは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば
ポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリエ
チレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）付
加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポ
リペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いら
れる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであっ
てもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログ
は、本明細書の教示より当業者に明らかであると考えら
れる。
【００４３】この点において、本発明の特に好ましい具
体例には、図２（配列番号２）のＦａｂＤのアミノ酸配
列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体
およびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、
アナログおよび誘導体がある。また、この点において、
本発明の特に好ましい具体例は、ＦａｂＤのアミノ酸配
列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体
およびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、
アナログおよび誘導体である。好ましい変種には、保存
的アミノ酸置換により対照標準と異なる変種がある。か
かる置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を特性の類
似した別のアミノ酸で置換したものである。典型的に
は、保存的置換として認められるのは、脂肪族アミノ酸
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き
換え；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸
性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り替え、アミド残基Ａｓ
ｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡ
ｒｇの取り替えおよび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での
置き換えである。
体例には、図２（配列番号２）のＦａｂＤのアミノ酸配
列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体
およびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、
アナログおよび誘導体がある。また、この点において、
本発明の特に好ましい具体例は、ＦａｂＤのアミノ酸配
列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体
およびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、
アナログおよび誘導体である。好ましい変種には、保存
的アミノ酸置換により対照標準と異なる変種がある。か
かる置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を特性の類
似した別のアミノ酸で置換したものである。典型的に
は、保存的置換として認められるのは、脂肪族アミノ酸
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き
換え；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸
性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り替え、アミド残基Ａｓ
ｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡ
ｒｇの取り替えおよび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での
置き換えである。
【００４４】この点においてさらに好ましいのは、数
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図２（配列番号２）のＦａｂＤポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有する、変種、アナログ、誘
導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの
変種、アナログおよび誘導体である。これらの中でもと
りわけ好ましいのは、ＦａｂＤの特性および活性を変化
させないサイレント置換、付加および欠失である。また
この点において特に好ましいのは、保存的置換である。
最も好ましいのは、置換していない図２（配列番号２）
のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明の
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供
されるのが好ましく、均質になるまで精製するのが好ま
しい。
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図２（配列番号２）のＦａｂＤポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有する、変種、アナログ、誘
導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの
変種、アナログおよび誘導体である。これらの中でもと
りわけ好ましいのは、ＦａｂＤの特性および活性を変化
させないサイレント置換、付加および欠失である。また
この点において特に好ましいのは、保存的置換である。
最も好ましいのは、置換していない図２（配列番号２）
のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明の
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供
されるのが好ましく、均質になるまで精製するのが好ま
しい。
【００４５】本発明のポリペプチドは、図２（配列番号
２）のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに
図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも
７０％の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２
（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも８０
％の同一性、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポ
リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（さらに
好ましくは少なくとも９０％の同一性）、その上さらに
好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドに対して
少なくとも９５％の類似性（その上さらに好ましくは９
５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、また一
般に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少
なくとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのそ
のような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包
含する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部
分は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチ
ドを製造するのに用いることができる；従って、該フラ
グメントは完全長のポリペプチドを製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長の
ポリヌクレオチドを合成することができる。
２）のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに
図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも
７０％の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２
（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも８０
％の同一性、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポ
リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（さらに
好ましくは少なくとも９０％の同一性）、その上さらに
好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドに対して
少なくとも９５％の類似性（その上さらに好ましくは９
５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、また一
般に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少
なくとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのそ
のような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包
含する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部
分は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチ
ドを製造するのに用いることができる；従って、該フラ
グメントは完全長のポリペプチドを製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長の
ポリヌクレオチドを合成することができる。
【００４６】フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、ＦａｂＤ
のフラグメント、特に図２（配列番号２）に示すアミノ
酸を有するＦａｂＤのフラグメント、および図２（配列
番号２）のＦａｂＤの変種および誘導体のフラグメント
を有してなるポリペプチドがある。この点において、フ
ラグメントは前記のＦａｂＤポリペプチドおよびその変
種または誘導体のアミノ酸配列が、全てではなく一部に
対して全く同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである。
のフラグメント、特に図２（配列番号２）に示すアミノ
酸を有するＦａｂＤのフラグメント、および図２（配列
番号２）のＦａｂＤの変種および誘導体のフラグメント
を有してなるポリペプチドがある。この点において、フ
ラグメントは前記のＦａｂＤポリペプチドおよびその変
種または誘導体のアミノ酸配列が、全てではなく一部に
対して全く同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである。
【００４７】かかるフラグメントは、「自立してい
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、ＦａｂＤのフラグメントのアミノ末端に融合した異
型のプレおよびプロポリペプチド領域、および該フラグ
メントのカルボキシル末端に融合した付加領域を有し、
宿主中に発現するように設計された前駆体ポリペプチド
内に含まれる本発明のＦａｂＤポリペプチドのフラグメ
ントに関する。従って、本明細書の意図するところの一
の態様におけるフラグメントは、ＦａｂＤ由来の融合ポ
リペプチドまたは融合タンパク質の一つのまたは複数の
部分を意味する。
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、ＦａｂＤのフラグメントのアミノ末端に融合した異
型のプレおよびプロポリペプチド領域、および該フラグ
メントのカルボキシル末端に融合した付加領域を有し、
宿主中に発現するように設計された前駆体ポリペプチド
内に含まれる本発明のＦａｂＤポリペプチドのフラグメ
ントに関する。従って、本明細書の意図するところの一
の態様におけるフラグメントは、ＦａｂＤ由来の融合ポ
リペプチドまたは融合タンパク質の一つのまたは複数の
部分を意味する。
【００４８】本発明の好ましいフラグメントは、例え
ば、ＦａｂＤの切断ポリペプチドを包含する。切断ポリ
ペプチドは、アミノ末端を含む一連の残基（すなわち、
連続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル末端
を含む一連の残基の欠失、または二重切断突然変異体の
ように一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシル末
端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除けば、図
２のアミノ酸配列を有するＦａｂＤポリペプチド、また
はその変種もしくは誘導体を包含する。前記した大きさ
の範囲のフラグメントもまた切断フラグメントの好まし
い具体例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好
ましい。宿主細胞、特にスタフィロコッカスにおける本
発明のポリヌクレオチドの減成形態もまた好ましい。
ば、ＦａｂＤの切断ポリペプチドを包含する。切断ポリ
ペプチドは、アミノ末端を含む一連の残基（すなわち、
連続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル末端
を含む一連の残基の欠失、または二重切断突然変異体の
ように一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシル末
端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除けば、図
２のアミノ酸配列を有するＦａｂＤポリペプチド、また
はその変種もしくは誘導体を包含する。前記した大きさ
の範囲のフラグメントもまた切断フラグメントの好まし
い具体例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好
ましい。宿主細胞、特にスタフィロコッカスにおける本
発明のポリヌクレオチドの減成形態もまた好ましい。
【００４９】また本発明のこの態様にて、ＦａｂＤの構
造的または機能的属性により特徴づけられるフラグメン
トも好ましい。この点において本発明の好ましい具体例
は、ＦａｂＤのアルファーヘリックスおよびアルファー
ヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート
形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよび
コイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親
媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界面形成領
域、基質結合領域および高抗原指数領域からなるフラグ
メントおよびかかるフラグメントの組み合わせを包含す
る。
造的または機能的属性により特徴づけられるフラグメン
トも好ましい。この点において本発明の好ましい具体例
は、ＦａｂＤのアルファーヘリックスおよびアルファー
ヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート
形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよび
コイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親
媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界面形成領
域、基質結合領域および高抗原指数領域からなるフラグ
メントおよびかかるフラグメントの組み合わせを包含す
る。
【００５０】さらに好ましい領域は、ＦａｂＤの活性を
媒介する領域である。この点において、類似活性もしく
は改善された活性を有するもの、または望ましくない活
性を減じたフラグメントを含め、ＦａｂＤの化学的、生
物学的またはその他の活性を有するフラグメントが最も
好ましい。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメン
トは、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的であ
るフラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記
のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダ
イゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレ
オチド、およびそのフラグメントをコードするポリヌク
レオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリ
ヌクレオチドに関する。この点において、好ましいポリ
ヌクレオチドは、前記するような、好ましいフラグメン
トに対応するポリヌクレオチドである。
媒介する領域である。この点において、類似活性もしく
は改善された活性を有するもの、または望ましくない活
性を減じたフラグメントを含め、ＦａｂＤの化学的、生
物学的またはその他の活性を有するフラグメントが最も
好ましい。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメン
トは、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的であ
るフラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記
のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダ
イゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレ
オチド、およびそのフラグメントをコードするポリヌク
レオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリ
ヌクレオチドに関する。この点において、好ましいポリ
ヌクレオチドは、前記するような、好ましいフラグメン
トに対応するポリヌクレオチドである。
【００５１】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは複数の
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
【００５２】宿主細胞内のポリヌクレオチド構築物を従
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
【００５３】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
【００５４】ある点において中でも好ましいベクター
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点におけるある好ましい具体例では、ベクタ
ーは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導
可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現
するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現
であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ま
しいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容
易である環境因子により発現を誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核お
よび真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現ベ
クターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されてい
る。
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点におけるある好ましい具体例では、ベクタ
ーは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導
可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現
するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現
であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ま
しいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容
易である環境因子により発現を誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核お
よび真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現ベ
クターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されてい
る。
【００５５】非常に多くの種類の発現ベクターを用い
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
【００５６】適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻
訳されるべきポリペプチドの終末部分に適当に位置する
終止コドンを含む。
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻
訳されるべきポリペプチドの終末部分に適当に位置する
終止コドンを含む。
【００５７】加えて、構築物は、発現を制御および誘起
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばストレプトコッカス（レンサ球菌）、スタフィロコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス細胞；真菌細
胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳf９
細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨeＬa、Ｃ１
２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェス（Bow
s）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばストレプトコッカス（レンサ球菌）、スタフィロコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス細胞；真菌細
胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳf９
細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨeＬa、Ｃ１
２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェス（Bow
s）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
【００５８】市販されている以下のベクターを例示とし
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
【００５９】制限部位または候補プロモーター（candid
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
【００６０】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
【００６１】本発明のポリペプチドの異種構造配列をコ
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、
開始コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位
および開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフ
レームは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端
に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構
築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転
写領域の３′末端に適宜配置される転写終止シグナルは
また、ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、
開始コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位
および開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフ
レームは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端
に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構
築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転
写領域の３′末端に適宜配置される転写終止シグナルは
また、ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。
【００６２】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−末端に付加し、精製中またはその後の操作および貯
蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性を改善す
る。また、精製を容易にするために、ポリペプチドに領
域を付加することもできる。かかる領域はポリペプチド
の最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部分をポリ
ペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出を誘起
し、安定性を改善するかまたは精製を容易にするのは、
当該分野でよくあることであり、慣用される技術であ
る。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可溶化
または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来する異
種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４ ５３
３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫グロ
ブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパク質
またはその一部とからなる融合タンパク質を開示する。
薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処理能
力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分と融
合させ、アンタゴニストを同定することができる。D.Be
nnettら、Journal of Molecular Recognition，8巻：52
-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal of Biol
ogical Chemistry，270巻（16)：9459-9471（1995）を
参照のこと。
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−末端に付加し、精製中またはその後の操作および貯
蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性を改善す
る。また、精製を容易にするために、ポリペプチドに領
域を付加することもできる。かかる領域はポリペプチド
の最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部分をポリ
ペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出を誘起
し、安定性を改善するかまたは精製を容易にするのは、
当該分野でよくあることであり、慣用される技術であ
る。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可溶化
または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来する異
種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４ ５３
３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫グロ
ブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパク質
またはその一部とからなる融合タンパク質を開示する。
薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処理能
力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分と融
合させ、アンタゴニストを同定することができる。D.Be
nnettら、Journal of Molecular Recognition，8巻：52
-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal of Biol
ogical Chemistry，270巻（16)：9459-9471（1995）を
参照のこと。
【００６３】ついで、典型的には、細胞を遠心分離によ
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’非転写配列を有して
いてもよい。ＦａｂＤポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィ
ーを含む、周知方法により、組換え細胞培養物から回収
かつ精製できる。最も好ましくは、高性能液体クロマト
グラフィーを精製に用いる。ポリペプチドが単離および
／または精製中に変性する場合、再び活性なコンホメー
ションを得るために、タンパク質を再生するための周知
の技術を用いることができる。
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’非転写配列を有して
いてもよい。ＦａｂＤポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィ
ーを含む、周知方法により、組換え細胞培養物から回収
かつ精製できる。最も好ましくは、高性能液体クロマト
グラフィーを精製に用いる。ポリペプチドが単離および
／または精製中に変性する場合、再び活性なコンホメー
ションを得るために、タンパク質を再生するための周知
の技術を用いることができる。
【００６４】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのＦａｂＤポリヌクレオチドの
使用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに
おいてＦａｂＤを検出することにより、疾患の診断方法
が得られるであろう。ＦａｂＤ遺伝子を有する生物に感
染した真核生物（本明細書において「個体」とも称す
る）、特に哺乳動物、特にヒトを、種々の技術により、
ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸
は感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋
肉、軟骨および皮膚から入手できる。ゲノムＤＮＡは検
出に直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用い
て酵素的に増幅させてもよい（Saikiら、Nature 324：1
63-166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に
用いることができる。一例として、ＦａｂＤをコードす
る核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＦａｂＤ
の存在および／または発現を同定および分析できる。Ｐ
ＣＲを用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存
在する原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分
析により特徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺
伝子型と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失お
よび挿入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを
放射性標識したＦａｂＤ ＲＮＡに、また別法として放
射性標識したＦａｂＤアンチセンス ＤＮＡにハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
する配列は、ＲＮaseＡ消化により、または融解温度の
差異により、誤対合二重らせんと区別できる。
レオチドを検出するためのＦａｂＤポリヌクレオチドの
使用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに
おいてＦａｂＤを検出することにより、疾患の診断方法
が得られるであろう。ＦａｂＤ遺伝子を有する生物に感
染した真核生物（本明細書において「個体」とも称す
る）、特に哺乳動物、特にヒトを、種々の技術により、
ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸
は感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋
肉、軟骨および皮膚から入手できる。ゲノムＤＮＡは検
出に直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用い
て酵素的に増幅させてもよい（Saikiら、Nature 324：1
63-166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に
用いることができる。一例として、ＦａｂＤをコードす
る核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＦａｂＤ
の存在および／または発現を同定および分析できる。Ｐ
ＣＲを用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存
在する原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分
析により特徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺
伝子型と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失お
よび挿入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを
放射性標識したＦａｂＤ ＲＮＡに、また別法として放
射性標識したＦａｂＤアンチセンス ＤＮＡにハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
する配列は、ＲＮaseＡ消化により、または融解温度の
差異により、誤対合二重らせんと区別できる。
【００６５】対照標準の遺伝子および突然変異を有する
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的特徴付け
は、変性剤を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡフラグ
メントの電気泳動度の変化を検出することにより達成で
きる。小さな配列の欠失および挿入は高分解ゲル電気泳
動により可視化できる。種々の配列のDNAフラグメント
は、その個々の融解または部分的融解温度によって、種
々のＤＮＡフラグメントの移動度がゲル中の異なる位置
で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲル上にて区別できる
（例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照）。
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的特徴付け
は、変性剤を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡフラグ
メントの電気泳動度の変化を検出することにより達成で
きる。小さな配列の欠失および挿入は高分解ゲル電気泳
動により可視化できる。種々の配列のDNAフラグメント
は、その個々の融解または部分的融解温度によって、種
々のＤＮＡフラグメントの移動度がゲル中の異なる位置
で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲル上にて区別できる
（例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照）。
【００６６】特異的な位置での配列の変化はまた、ＲＮ
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティ
ングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティ
ングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
【００６７】本発明の遺伝子の突然変異または多形型を
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、DNAレベルで検出することもできる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを突然変異を検出するのに使用で
きる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、ＧeneＳcanなどの自動
検出系と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−Ｐ
ＣＲに用いることができる。一例として、ＦａｂＤをコ
ードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを変異を同定
および分析するのに用いることができる。代表的なプラ
イマーを表１に列挙する。
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、DNAレベルで検出することもできる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを突然変異を検出するのに使用で
きる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、ＧeneＳcanなどの自動
検出系と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−Ｐ
ＣＲに用いることができる。一例として、ＦａｂＤをコ
ードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを変異を同定
および分析するのに用いることができる。代表的なプラ
イマーを表１に列挙する。
【００６８】 表１ ＦａｂＤポリヌクレオチドの増幅に用いられるプライマー 配列番号 プライマー配列 ３ ５’−CCGCTCGAGATGAGTAAAACAGCAATTATTTTTCCG−３’ ４ ５’−CGGGATCCCTGTTACTAAAGCACTCTTAGTCA−３’
【００６９】上記プライマーは個体由来のサンプルから
単離したＦａｂＤ ＤＮＡを増幅させるのに用いること
ができる。本発明はまた、これらのプライマーの５′お
よび／または３′末端から除去した１、２、３または４
個のヌクレオチドを有するプライマーも提供する。該プ
ライマーを用いて個体から単離した遺伝子を増幅し、つ
いでその遺伝子をDNA配列を明らかにするための種々の
技法に供してもよい。このようにして、ＤＮＡ配列にお
ける突然変異を診断してもよい。
単離したＦａｂＤ ＤＮＡを増幅させるのに用いること
ができる。本発明はまた、これらのプライマーの５′お
よび／または３′末端から除去した１、２、３または４
個のヌクレオチドを有するプライマーも提供する。該プ
ライマーを用いて個体から単離した遺伝子を増幅し、つ
いでその遺伝子をDNA配列を明らかにするための種々の
技法に供してもよい。このようにして、ＤＮＡ配列にお
ける突然変異を診断してもよい。
【００７０】本発明は、疾患、好ましくは細菌感染、さ
らに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス感染、
最も好ましくは上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気
管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例え
ば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内
膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹
膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患
（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管疾患（例え
ば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮
膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨お
よび関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を診
断する方法であって、個体から由来のサンプルより、図
１（配列番号１）の配列を有するポリヌクレオチドの発
現レベルの増加を測定することからなる方法を提供す
る。ＦａｂＤポリヌクレオチドの発現の増加は、例え
ば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブ
ロッティングおよび他のハイブリダイゼーションなどの
ポリヌクレオチドの定量について当該分野にて周知の方
法を用いて測定することができる。
らに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス感染、
最も好ましくは上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気
管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例え
ば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内
膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹
膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患
（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管疾患（例え
ば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮
膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨お
よび関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を診
断する方法であって、個体から由来のサンプルより、図
１（配列番号１）の配列を有するポリヌクレオチドの発
現レベルの増加を測定することからなる方法を提供す
る。ＦａｂＤポリヌクレオチドの発現の増加は、例え
ば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブ
ロッティングおよび他のハイブリダイゼーションなどの
ポリヌクレオチドの定量について当該分野にて周知の方
法を用いて測定することができる。
【００７１】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、
細胞および組織中のＦａｂＤタンパク質のレベルを検出
するための定量および診断アッセイなどの診断アッセイ
に関する。このように、例えば、正常な対照標準の組織
サンプルと比較し、ＦａｂＤタンパク質の過剰発現を検
出することについて本発明に係る診断アッセイを用い
て、感染の存在を検出することができる。宿主由来のサ
ンプル中のＦａｂＤタンパク質のレベルを測定するため
に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ
る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好まし
い。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、ＦａｂＤに特異的な
抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する。加え
て、一般に、モノクローナル抗体に結合するリポーター
抗体が調製される。リポーター抗体は放射活性、蛍光ま
たは酵素試薬、この例においては西洋ワサビペルオキシ
ダーゼなどの検出可能な試薬に結合する。
細胞および組織中のＦａｂＤタンパク質のレベルを検出
するための定量および診断アッセイなどの診断アッセイ
に関する。このように、例えば、正常な対照標準の組織
サンプルと比較し、ＦａｂＤタンパク質の過剰発現を検
出することについて本発明に係る診断アッセイを用い
て、感染の存在を検出することができる。宿主由来のサ
ンプル中のＦａｂＤタンパク質のレベルを測定するため
に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ
る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好まし
い。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、ＦａｂＤに特異的な
抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する。加え
て、一般に、モノクローナル抗体に結合するリポーター
抗体が調製される。リポーター抗体は放射活性、蛍光ま
たは酵素試薬、この例においては西洋ワサビペルオキシ
ダーゼなどの検出可能な試薬に結合する。
【００７２】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
【００７３】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。別法として、
ファージディスプレイ技術を利用して、抗Ｆｂｐの保持
に関してスクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣ
Ｒ増幅したｖ−遺伝子のレパートリー由来の、または未
処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活
性を有する抗体遺伝子を選択することができる（McCaff
erty,J.ら、Nature 348：552-554（1990）；Marks,J.
ら、Biotechnology 10：779-783（1992））。これらの
抗体の親和性は、チェーンシャフリング（chain shuffl
ing）（Clackson,T.ら、Nature 352：624-628（199
1））により改善することもできる。２つの抗原結合ド
メインがあるならば、各ドメインを、「二特異的」抗体
と称される、異なるエピトープに向けることができる。
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。別法として、
ファージディスプレイ技術を利用して、抗Ｆｂｐの保持
に関してスクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣ
Ｒ増幅したｖ−遺伝子のレパートリー由来の、または未
処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活
性を有する抗体遺伝子を選択することができる（McCaff
erty,J.ら、Nature 348：552-554（1990）；Marks,J.
ら、Biotechnology 10：779-783（1992））。これらの
抗体の親和性は、チェーンシャフリング（chain shuffl
ing）（Clackson,T.ら、Nature 352：624-628（199
1））により改善することもできる。２つの抗原結合ド
メインがあるならば、各ドメインを、「二特異的」抗体
と称される、異なるエピトープに向けることができる。
【００７４】前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチ
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けＦａｂＤに対する抗体を用いて、感染、特に細菌感
染、とりわけ上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば、
蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内膜
炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜
後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患
（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管疾患（例え
ば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮
膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨お
よび関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を阻
害および／または治療することができる。
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けＦａｂＤに対する抗体を用いて、感染、特に細菌感
染、とりわけ上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば、
蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内膜
炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜
後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患
（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管疾患（例え
ば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮
膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨お
よび関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を阻
害および／または治療することができる。
【００７５】ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
【００７６】ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
【００７７】抗体またはその誘導体を修飾して、個体に
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。本発明のポリヌ
クレオチドを遺伝的免疫に使用する場合、好ましくは、
例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolff
ら、Hum.Mol.Genet.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.
Gene Ther.4：419（1963））、特異的タンパク質キャリ
ヤを複合させたＤＮＡの送達（Wuら、J.Biol.Chem.26
4：16985（1989））、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ
共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS （USA）83：9551（1
986））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（K
anedaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（T
angら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA
Cell Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロ
ウイルスを用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS （US
A）81：5849（1984））などの適当な送達方法を用い
る。
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。本発明のポリヌ
クレオチドを遺伝的免疫に使用する場合、好ましくは、
例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolff
ら、Hum.Mol.Genet.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.
Gene Ther.4：419（1963））、特異的タンパク質キャリ
ヤを複合させたＤＮＡの送達（Wuら、J.Biol.Chem.26
4：16985（1989））、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ
共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS （USA）83：9551（1
986））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（K
anedaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（T
angら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA
Cell Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロ
ウイルスを用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS （US
A）81：5849（1984））などの適当な送達方法を用い
る。
【００７８】ＦａｂＤ−結合分子およびアッセイ 本発明はまた、ＦａｂＤに結合する結合分子などの分子
の同定方法をも提供する。ＦａｂＤに結合するタンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、
例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング
より同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュア
ル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immuno
logy、1（2）：第5章（1991）に記載されている。ま
た、標識されたリガンドを細胞抽出物に光親和性結合さ
せることもできる。また、本発明のポリペプチドを用い
て、細胞中、または無細胞調製物中の、ＦａｂＤ結合分
子のＦａｂＤ結合能力を評価することができる。本発明
のポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製
物、化学的ライブラリー、および天然の生成物混合物中
の小型分子基質とリガンドとの結合を評価することもで
きる。
の同定方法をも提供する。ＦａｂＤに結合するタンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、
例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング
より同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュア
ル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immuno
logy、1（2）：第5章（1991）に記載されている。ま
た、標識されたリガンドを細胞抽出物に光親和性結合さ
せることもできる。また、本発明のポリペプチドを用い
て、細胞中、または無細胞調製物中の、ＦａｂＤ結合分
子のＦａｂＤ結合能力を評価することができる。本発明
のポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製
物、化学的ライブラリー、および天然の生成物混合物中
の小型分子基質とリガンドとの結合を評価することもで
きる。
【００７９】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明はまた、Ｆａｂ結合分子との相互作用などの、Ｆ
ａｂＤポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を亢
進（アゴニスト）または遮断（アンタゴニスト）する化
合物を同定するための化合物のスクリーニング方法をも
提供する。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを
スクリーニングするために、膜、細胞エンベロープもし
くは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれ
らのいずれかの調製物を、ＦａｂＤに結合する分子を発
現する細胞より調製することができる。該調製物を、Ｆ
ａｂＤアゴニストまたはアンタゴニストであるかもしれ
ない候補分子の存在下または不在下で標識したＦａｂＤ
と一緒にインキュベーションする。候補分子が結合分子
に結合する能力は、標識リガンドの結合の低下に反映さ
れる。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちＦａ
ｂＤ結合分子の結合において、ＦａｂＤの効果を誘起し
ない分子は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニストで
あろう。よく結合し、ＦａｂＤと同じまたは密接に関連
する効果を誘起する分子はアゴニストである。
イおよび分子 本発明はまた、Ｆａｂ結合分子との相互作用などの、Ｆ
ａｂＤポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を亢
進（アゴニスト）または遮断（アンタゴニスト）する化
合物を同定するための化合物のスクリーニング方法をも
提供する。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを
スクリーニングするために、膜、細胞エンベロープもし
くは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれ
らのいずれかの調製物を、ＦａｂＤに結合する分子を発
現する細胞より調製することができる。該調製物を、Ｆ
ａｂＤアゴニストまたはアンタゴニストであるかもしれ
ない候補分子の存在下または不在下で標識したＦａｂＤ
と一緒にインキュベーションする。候補分子が結合分子
に結合する能力は、標識リガンドの結合の低下に反映さ
れる。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちＦａ
ｂＤ結合分子の結合において、ＦａｂＤの効果を誘起し
ない分子は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニストで
あろう。よく結合し、ＦａｂＤと同じまたは密接に関連
する効果を誘起する分子はアゴニストである。
【００８０】潜在的アゴニストおよびアンタゴニストの
ＦａｂＤ様効果は、例えば、候補分子と細胞または適当
な細胞調製物との相互反応の後の、リポーターシステム
の活性を測定し、ＦａｂＤまたはＦａｂＤと同じ効果を
惹起する分子の効果を比較することにより測定される。
この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に
転換される比色標識基質、ＦａｂＤ活性の変化に応答す
るリポーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッ
セイを包含するが、これらに限定するものではない。Ｆ
ａｂＤアンタゴニストのアッセイの別の例は、競争阻害
アッセイに適した条件下で、ＦａｂＤおよび潜在的なア
ンタゴニストを、膜結合ＦａｂＤ結合分子、組換えＦａ
ｂＤ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質
もしくはリガンド擬似物質と混合する、競合アッセイで
ある。ＦａｂＤを例えば放射活性または比色化合物によ
り標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換し
たＦａｂＤ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタ
ゴニストの効果を評価できる。
ＦａｂＤ様効果は、例えば、候補分子と細胞または適当
な細胞調製物との相互反応の後の、リポーターシステム
の活性を測定し、ＦａｂＤまたはＦａｂＤと同じ効果を
惹起する分子の効果を比較することにより測定される。
この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に
転換される比色標識基質、ＦａｂＤ活性の変化に応答す
るリポーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッ
セイを包含するが、これらに限定するものではない。Ｆ
ａｂＤアンタゴニストのアッセイの別の例は、競争阻害
アッセイに適した条件下で、ＦａｂＤおよび潜在的なア
ンタゴニストを、膜結合ＦａｂＤ結合分子、組換えＦａ
ｂＤ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質
もしくはリガンド擬似物質と混合する、競合アッセイで
ある。ＦａｂＤを例えば放射活性または比色化合物によ
り標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換し
たＦａｂＤ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタ
ゴニストの効果を評価できる。
【００８１】スクリーンのもう一つ別の例は、トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）可溶性マロニル−ＣｏＡ由来の放射性
標識したマロネートを、アクセプターとしてＡＣＰを用
い、ＴＣＡ不溶性マロニル−ＡＣＰに取り込ませること
である。濾過した後、放射性産物を測定することができ
る。そのスクリーンは、マイクロタイタープレートおよ
びシンチレーションカウンターを用いて、好ましい高処
理フォーマットに容易に適用される。取り込み量が減少
すれば、アンタゴニストであると同定され、取り込み量
が増加するばアゴニストと同定することができる。潜在
的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合
し、それによりその活性を阻害し、消滅させる小有機分
子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜
在的アンタゴニストはまた、ＦａｂＤ誘発活性を誘導し
ない結合分子のような、結合分子の同一部位に結合し、
ＦａｂＤを結合より排除することによりＦａｂＤの作用
を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のよう
な小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよ
い。
ロ酢酸（ＴＣＡ）可溶性マロニル−ＣｏＡ由来の放射性
標識したマロネートを、アクセプターとしてＡＣＰを用
い、ＴＣＡ不溶性マロニル−ＡＣＰに取り込ませること
である。濾過した後、放射性産物を測定することができ
る。そのスクリーンは、マイクロタイタープレートおよ
びシンチレーションカウンターを用いて、好ましい高処
理フォーマットに容易に適用される。取り込み量が減少
すれば、アンタゴニストであると同定され、取り込み量
が増加するばアゴニストと同定することができる。潜在
的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合
し、それによりその活性を阻害し、消滅させる小有機分
子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜
在的アンタゴニストはまた、ＦａｂＤ誘発活性を誘導し
ない結合分子のような、結合分子の同一部位に結合し、
ＦａｂＤを結合より排除することによりＦａｂＤの作用
を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のよう
な小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよ
い。
【００８２】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合して占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる小分子
を包含する。小分子の例は、小有機分子、ペプチド、ペ
プチド様分子を包含するが、これらに限定するものでは
ない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する（これらの分子についての記載に関して
は、Okano,J.，Neurochem. 56：60（1991）；Oligodeox
ynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expre
ssion，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（1
988）を参照のこと）。他の潜在的アンタゴニストは、
ＦａｂＤに関連する化合物およびその誘導体を包含す
る。
の結合部位に結合して占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる小分子
を包含する。小分子の例は、小有機分子、ペプチド、ペ
プチド様分子を包含するが、これらに限定するものでは
ない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する（これらの分子についての記載に関して
は、Okano,J.，Neurochem. 56：60（1991）；Oligodeox
ynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expre
ssion，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（1
988）を参照のこと）。他の潜在的アンタゴニストは、
ＦａｂＤに関連する化合物およびその誘導体を包含す
る。
【００８３】特定の態様において、本発明は、感染の続
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明のポリペプチド、
ポリヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。特
に本発明の分子を、ｉ）細菌、特にグラム陽性細菌の内
在装置上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、ま
たは創傷部の細胞外マトリックスタンパク質への付着の
直接または間接的な妨げ；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロ
シンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵
入を媒介するマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラー
ゼタンパク質の直接または間接的遮断（Rosenshineら、
Infect.Immun.60：2211(1992))；ｉｉｉ）哺乳動物細胞
外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性
マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼタンパク質
との間の細菌付着の直接または間接的遮断；ｉｖ）内在
装置の埋め込みまたはその他の手術以外により開始した
感染における病因の正常な進行の直接または間接的遮断
に使用することができる。
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明のポリペプチド、
ポリヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。特
に本発明の分子を、ｉ）細菌、特にグラム陽性細菌の内
在装置上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、ま
たは創傷部の細胞外マトリックスタンパク質への付着の
直接または間接的な妨げ；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロ
シンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵
入を媒介するマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラー
ゼタンパク質の直接または間接的遮断（Rosenshineら、
Infect.Immun.60：2211(1992))；ｉｉｉ）哺乳動物細胞
外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性
マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼタンパク質
との間の細菌付着の直接または間接的遮断；ｉｖ）内在
装置の埋め込みまたはその他の手術以外により開始した
感染における病因の正常な進行の直接または間接的遮断
に使用することができる。
【００８４】本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は抗
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現時に、コーディングされたタンパク質は、抗菌薬物の
スクリーニングのための目的物質として用いることがで
きる。加えて、コーディングされたタンパク質もしくは
Shine-Delgarnoまたはその他の個々のｍＲＮＡの翻訳容
易化配列のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用
いて、目的のコーディング配列の発現を調節するアンチ
センス配列を構築することができる。アンタゴニストお
よびアゴニストは、例えば、上気道疾患（例えば中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道
疾患（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば感染
性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば分泌性下痢、脾臓膿
瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば大脳膿瘍）、眼
疾患（例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管疾患（例え
ば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショッ
ク症候群）、皮膚疾患（例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿
瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨および
関節疾患（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の阻害に用
いることができる。
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現時に、コーディングされたタンパク質は、抗菌薬物の
スクリーニングのための目的物質として用いることがで
きる。加えて、コーディングされたタンパク質もしくは
Shine-Delgarnoまたはその他の個々のｍＲＮＡの翻訳容
易化配列のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用
いて、目的のコーディング配列の発現を調節するアンチ
センス配列を構築することができる。アンタゴニストお
よびアゴニストは、例えば、上気道疾患（例えば中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道
疾患（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば感染
性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば分泌性下痢、脾臓膿
瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば大脳膿瘍）、眼
疾患（例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管疾患（例え
ば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショッ
ク症候群）、皮膚疾患（例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿
瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨および
関節疾患（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の阻害に用
いることができる。
【００８５】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なＦａｂＤ、またはその抗原性フラグメントもしく
は変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、
とりわけスタフィロコッカス感染から保護することから
なる方法に関する。本発明のまた別の態様は、個体にて
免疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療によ
り免疫学的応答を誘発させるためにＦａｂＤまたはその
フラグメントもしくは変種をインビボで発現させるのに
ＦａｂＤまたはそのフラグメントもしくは変種をコード
する遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から
保護する方法に関する。本発明のさらなる態様は、免疫
学的応答を宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に
導入した場合、そのような宿主中でＦａｂＤまたはそれ
によりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、該ＦａｂＤの抗原を
コードし、発現するＤＮＡまたはそれによりコードされ
るタンパク質を含んでなる、組換えＦａｂＤまたはそれ
によりコードされるタンパク質を有してなる組成物に関
する。
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なＦａｂＤ、またはその抗原性フラグメントもしく
は変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、
とりわけスタフィロコッカス感染から保護することから
なる方法に関する。本発明のまた別の態様は、個体にて
免疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療によ
り免疫学的応答を誘発させるためにＦａｂＤまたはその
フラグメントもしくは変種をインビボで発現させるのに
ＦａｂＤまたはそのフラグメントもしくは変種をコード
する遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から
保護する方法に関する。本発明のさらなる態様は、免疫
学的応答を宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に
導入した場合、そのような宿主中でＦａｂＤまたはそれ
によりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、該ＦａｂＤの抗原を
コードし、発現するＤＮＡまたはそれによりコードされ
るタンパク質を含んでなる、組換えＦａｂＤまたはそれ
によりコードされるタンパク質を有してなる組成物に関
する。
【００８６】ＦａｂＤまたはそのフラグメントは、それ
自身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定化
し、免疫原性があり防御特性を有する融合タンパク質を
形成することができる補タンパク質（co-protein）と融
合できる。このように融合した組換えタンパク質は、好
ましくはさらに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーター
ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成お
よび精製を容易にする比較的大きな補タンパク質を有し
てなる。さらには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激
を提供するという意味で、アジュバントとして作用し得
る。補タンパク質は第１のタンパク質のアミノまたはカ
ルボキシル末端のいずれに結合してもよい。
自身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定化
し、免疫原性があり防御特性を有する融合タンパク質を
形成することができる補タンパク質（co-protein）と融
合できる。このように融合した組換えタンパク質は、好
ましくはさらに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーター
ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成お
よび精製を容易にする比較的大きな補タンパク質を有し
てなる。さらには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激
を提供するという意味で、アジュバントとして作用し得
る。補タンパク質は第１のタンパク質のアミノまたはカ
ルボキシル末端のいずれに結合してもよい。
【００８７】本発明は、スタフィロコッカス・アウレウ
スに感染した動物モデルにおける、このような遺伝的免
疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌性細胞表面タン
パク質の非可変領域をコードすることがわかっている前
記のポリヌクレオチドまたはとりわけそのフラグメント
を用いる方法であって、とりわけ予防的または治療的免
疫反応を生じることができるタンパク質エピトープを同
定するのに有用な方法を提供するものである。このアプ
ローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけるスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗しまたは一掃するのに成功し
た動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体
を引き続き調製することを可能にすると考えられる。ポ
リペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害す
ることにより、細菌の侵入に対して防御的な特異的抗体
を産生するための宿主のワクチン化のための抗原として
使用することができる。組織損傷の例は、例えば機械
的、化学的もしくは熱損傷により、または内在装置の埋
め込みにより、引き起こされた皮膚または結合組織の創
傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷を
包含する。
スに感染した動物モデルにおける、このような遺伝的免
疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌性細胞表面タン
パク質の非可変領域をコードすることがわかっている前
記のポリヌクレオチドまたはとりわけそのフラグメント
を用いる方法であって、とりわけ予防的または治療的免
疫反応を生じることができるタンパク質エピトープを同
定するのに有用な方法を提供するものである。このアプ
ローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけるスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗しまたは一掃するのに成功し
た動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体
を引き続き調製することを可能にすると考えられる。ポ
リペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害す
ることにより、細菌の侵入に対して防御的な特異的抗体
を産生するための宿主のワクチン化のための抗原として
使用することができる。組織損傷の例は、例えば機械
的、化学的もしくは熱損傷により、または内在装置の埋
め込みにより、引き起こされた皮膚または結合組織の創
傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷を
包含する。
【００８８】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のＦａｂＤに関して記載されている
が、これは天然のタンパク質および、実質的に組換えタ
ンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失または置
換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含する
ことが理解されよう。
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のＦａｂＤに関して記載されている
が、これは天然のタンパク質および、実質的に組換えタ
ンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失または置
換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含する
ことが理解されよう。
【００８９】組成物 本発明はまた前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
【００９０】キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を１ま
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
【００９１】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまた
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
【００９２】治療において、または予防用に、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
【００９３】哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
【００９４】本発明の組成物を注射により投与し、内在
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、スタフィロコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、スタフィロコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
【００９５】前記の治療に加え、本発明の組成物は、一
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトラ
ンスアシラーゼタンパク質を含有する細菌の存在を検出
するための診断試薬として使用できる。以下の実施例を
容易に理解するために、特定の汎用する方法および／ま
たは用語を記載する。
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトラ
ンスアシラーゼタンパク質を含有する細菌の存在を検出
するための診断試薬として使用できる。以下の実施例を
容易に理解するために、特定の汎用する方法および／ま
たは用語を記載する。
【００９６】
【実施例】本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく
説明する。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様
を説明するものであり、本発明に開示する範囲を限定ま
たは規定するものではない。本明細書で用いる特定の用
語は前記した用語説明で説明する。全ての実施例は、別
に詳細に記載するもの以外は、当業者に周知で慣用され
る標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分
子生物学的技術は、例えばSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）ような標
準的な実験室マニュアルに記載されるように実施でき
る。
説明する。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様
を説明するものであり、本発明に開示する範囲を限定ま
たは規定するものではない。本明細書で用いる特定の用
語は前記した用語説明で説明する。全ての実施例は、別
に詳細に記載するもの以外は、当業者に周知で慣用され
る標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分
子生物学的技術は、例えばSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）ような標
準的な実験室マニュアルに記載されるように実施でき
る。
【００９７】実施例１：ライブラリー生成 配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
をイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウス
の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡを
含有する２個またはそれ以上のクローンの配列決定デー
タを、配列番号１に示す連続したＤＮＡ配列を構築する
ために使用する場合もある。ライブラリーは慣用的方
法、例えば以下の方法１および２により製造できる。全
細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵ
Ｈ２９より、標準法に準じて単離し、二つの方法のどち
らかによりサイズ分画する。
をイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウス
の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡを
含有する２個またはそれ以上のクローンの配列決定デー
タを、配列番号１に示す連続したＤＮＡ配列を構築する
ために使用する場合もある。ライブラリーは慣用的方
法、例えば以下の方法１および２により製造できる。全
細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵ
Ｈ２９より、標準法に準じて単離し、二つの方法のどち
らかによりサイズ分画する。
【００９８】方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニ
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【００９９】方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター中にクローニン
グするための一連のフラグメントを生成するのに適する
制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩおよ
びＢｓｈｌ２３５Ｉ）の一またはその組み合わせで部分
加水分解し、かかるフラグメントを標準法によりサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラ
ムダＺａｐＩＩにライゲートし、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、そのパッケージングしたライ
ブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーは標
準法により増幅する。
グするための一連のフラグメントを生成するのに適する
制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩおよ
びＢｓｈｌ２３５Ｉ）の一またはその組み合わせで部分
加水分解し、かかるフラグメントを標準法によりサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラ
ムダＺａｐＩＩにライゲートし、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、そのパッケージングしたライ
ブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーは標
準法により増幅する。
【０１００】実施例２ ＦａｂＤ酵素活性分析 ＦａｂＤ活性は、アクセプターとしてＡＣＰを用い、ト
リクロロ酢酸可溶性14Ｃ−マロニル−ＣｏＡ由来の14Ｃ
−マロネートのＴＣＡ不溶性14Ｃ―マロニル―ＡＣＰへ
の取り込みを介して容易にアッセイすることができる。
試験化合物をこのアッセイに加え、該化合物が酵素活性
を亢進するかまたは拮抗するかを決定することができ
る。
リクロロ酢酸可溶性14Ｃ−マロニル−ＣｏＡ由来の14Ｃ
−マロネートのＴＣＡ不溶性14Ｃ―マロニル―ＡＣＰへ
の取り込みを介して容易にアッセイすることができる。
試験化合物をこのアッセイに加え、該化合物が酵素活性
を亢進するかまたは拮抗するかを決定することができ
る。
【０１０１】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ジェントリー，ダニエル ロンズデイル，ジョン ペアソン，スチュアート ペイン，デイビッド （ｉｉ）発明の名称： 新規ＦａｂＤ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ（登録商標）用 Fas
t SEQ バージョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年３月２８日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０３０６８５ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１３日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ギミー，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ５０００４ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス： （２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGAGTAAAA CAGCAATTAT TTTTCCGGGA CAAGGTGCCC AAAAAGTTGG TATGGCACAA 60 GATTTGTTTA ATAACAATGA TCAAGCAACT GAAATTTTAA CTTCAGCAGC AAAGACGTTA 120 GACTTTGATA TTTTAGAGAC AATGTTTACT GATGAAGAAG GTAAATTGGG TGAAACTGAA 180 AACACGCAAC CAGCTTTATT GACGCATAGT TCGGCATTAT TAGCAGCGCT AAAAATTTTG 240 AATCCTGATT TTACTATGGG GCATAGTTTA GGTGAATATT CAAGTTTAGT TGCAGCTGAC 300 GTATTATCAT TTGAAGATGC AGTTAAAATT GTTAGAAAAC GTGGTCAATT AATGGCGCAA 360 GCATTTCCTA CTGGTGTAGG AAGCATGGCT GCAGTATTGG GATTAGATTT TGATAAAGTC 420 GATGAAATTT GTAAGTCATT ATCATCTGAT GACAAAATAA TTGAACCAGC AAACATTAAT 480 TGCCCAGGTC AAATTGTTGT TTCAGGTCAC AAAGCTTTAA TTGATGAGCT AGTAGAAAAA 540 GGTAAATCAT TAGGTGCAAA ACGTGTCATG CCTTTAGCAG TATCTGGACC ATTCCATTCA 600 TCGCTAATGA AAGTGATTGA AGAAGATTTT TCAAGTTACA TTAATCAATT TGAATGGCGT 660 GATGCTAAGT TTCCTGTAGT TCAAAATGTA AATGCGCAAG GTGAAACTGA CAAAGAAGTA 720 ATTAAATCTA ATATGGTCAA GCAATTATAT TCACCAGTAC AATTCATTAA CTCAACAGAA 780 TGGCTAATAG ACCAAGGTGT TGATCATTTT ATTGAAATTG GTCCTGGAAA AGTTTTATCT 840 GGCTTAATTA AAAAAATAAA TAGAGATGTT AAGTTAACAT CAATTCAAAC TTTAGAAGAT 900 GTGAAAGGAT GGAATGAAAA TGACTAA 927 （２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Ser Lys Thr Ala Ile Ile Phe Pro Gly Gln Gly Ala Gln Lys Val 1 5 10 15 Gly Met Ala Gln Asp Leu Phe Asn Asn Asn Asp Gln Ala Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Ser Ala Ala Lys Thr Leu Asp Phe Asp Ile Leu Glu Thr Met 35 40 45 Phe Thr Asp Glu Glu Gly Lys Leu Gly Glu Thr Glu Asn Thr Gln Pro 50 55 60 Ala Leu Leu Thr His Ser Ser Ala Leu Leu Ala Ala Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Asn Pro Asp Phe Thr Met Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ser Ser Leu 85 90 95 Val Ala Ala Asp Val Leu Ser Phe Glu Asp Ala Val Lys Ile Val Arg 100 105 110 Lys Arg Gly Gln Leu Met Ala Gln Ala Phe Pro Thr Gly Val Gly Ser 115 120 125 Met Ala Ala Val Leu Gly Leu Asp Phe Asp Lys Val Asp Glu Ile Cys 130 135 140 Lys Ser Leu Ser Ser Asp Asp Lys Ile Ile Glu Pro Ala Asn Ile Asn 145 150 155 160 Cys Pro Gly Gln Ile Val Val Ser Gly His Lys Ala Leu Ile Asp Glu 165 170 175 Leu Val Glu Lys Gly Lys Ser Leu Gly Ala Lys Arg Val Met Pro Leu 180 185 190 Ala Val Ser Gly Pro Phe His Ser Ser Leu Met Lys Val Ile Glu Glu 195 200 205 Asp Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Glu Trp Arg Asp Ala Lys Phe 210 215 220 Pro Val Val Gln Asn Val Asn Ala Gln Gly Glu Thr Asp Lys Glu Val 225 230 235 240 Ile Lys Ser Asn Met Val Lys Gln Leu Tyr Ser Pro Val Gln Phe Ile 245 250 255 Asn Ser Thr Glu Trp Leu Ile Asp Gln Gly Val Asp His Phe Ile Glu 260 265 270 Ile Gly Pro Gly Lys Val Leu Ser Gly Leu Ile Lys Lys Ile Asn Arg 275 280 285 Asp Val Lys Leu Thr Ser Ile Gln Thr Leu Glu Asp Val Lys Gly Trp 290 295 300 Asn Glu Asn Asp 305
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ（登録商標）用 Fas
t SEQ バージョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年３月２８日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０３０６８５ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１３日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ギミー，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ５０００４ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス： （２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGAGTAAAA CAGCAATTAT TTTTCCGGGA CAAGGTGCCC AAAAAGTTGG TATGGCACAA 60 GATTTGTTTA ATAACAATGA TCAAGCAACT GAAATTTTAA CTTCAGCAGC AAAGACGTTA 120 GACTTTGATA TTTTAGAGAC AATGTTTACT GATGAAGAAG GTAAATTGGG TGAAACTGAA 180 AACACGCAAC CAGCTTTATT GACGCATAGT TCGGCATTAT TAGCAGCGCT AAAAATTTTG 240 AATCCTGATT TTACTATGGG GCATAGTTTA GGTGAATATT CAAGTTTAGT TGCAGCTGAC 300 GTATTATCAT TTGAAGATGC AGTTAAAATT GTTAGAAAAC GTGGTCAATT AATGGCGCAA 360 GCATTTCCTA CTGGTGTAGG AAGCATGGCT GCAGTATTGG GATTAGATTT TGATAAAGTC 420 GATGAAATTT GTAAGTCATT ATCATCTGAT GACAAAATAA TTGAACCAGC AAACATTAAT 480 TGCCCAGGTC AAATTGTTGT TTCAGGTCAC AAAGCTTTAA TTGATGAGCT AGTAGAAAAA 540 GGTAAATCAT TAGGTGCAAA ACGTGTCATG CCTTTAGCAG TATCTGGACC ATTCCATTCA 600 TCGCTAATGA AAGTGATTGA AGAAGATTTT TCAAGTTACA TTAATCAATT TGAATGGCGT 660 GATGCTAAGT TTCCTGTAGT TCAAAATGTA AATGCGCAAG GTGAAACTGA CAAAGAAGTA 720 ATTAAATCTA ATATGGTCAA GCAATTATAT TCACCAGTAC AATTCATTAA CTCAACAGAA 780 TGGCTAATAG ACCAAGGTGT TGATCATTTT ATTGAAATTG GTCCTGGAAA AGTTTTATCT 840 GGCTTAATTA AAAAAATAAA TAGAGATGTT AAGTTAACAT CAATTCAAAC TTTAGAAGAT 900 GTGAAAGGAT GGAATGAAAA TGACTAA 927 （２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Ser Lys Thr Ala Ile Ile Phe Pro Gly Gln Gly Ala Gln Lys Val 1 5 10 15 Gly Met Ala Gln Asp Leu Phe Asn Asn Asn Asp Gln Ala Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Ser Ala Ala Lys Thr Leu Asp Phe Asp Ile Leu Glu Thr Met 35 40 45 Phe Thr Asp Glu Glu Gly Lys Leu Gly Glu Thr Glu Asn Thr Gln Pro 50 55 60 Ala Leu Leu Thr His Ser Ser Ala Leu Leu Ala Ala Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Asn Pro Asp Phe Thr Met Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ser Ser Leu 85 90 95 Val Ala Ala Asp Val Leu Ser Phe Glu Asp Ala Val Lys Ile Val Arg 100 105 110 Lys Arg Gly Gln Leu Met Ala Gln Ala Phe Pro Thr Gly Val Gly Ser 115 120 125 Met Ala Ala Val Leu Gly Leu Asp Phe Asp Lys Val Asp Glu Ile Cys 130 135 140 Lys Ser Leu Ser Ser Asp Asp Lys Ile Ile Glu Pro Ala Asn Ile Asn 145 150 155 160 Cys Pro Gly Gln Ile Val Val Ser Gly His Lys Ala Leu Ile Asp Glu 165 170 175 Leu Val Glu Lys Gly Lys Ser Leu Gly Ala Lys Arg Val Met Pro Leu 180 185 190 Ala Val Ser Gly Pro Phe His Ser Ser Leu Met Lys Val Ile Glu Glu 195 200 205 Asp Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Glu Trp Arg Asp Ala Lys Phe 210 215 220 Pro Val Val Gln Asn Val Asn Ala Gln Gly Glu Thr Asp Lys Glu Val 225 230 235 240 Ile Lys Ser Asn Met Val Lys Gln Leu Tyr Ser Pro Val Gln Phe Ile 245 250 255 Asn Ser Thr Glu Trp Leu Ile Asp Gln Gly Val Asp His Phe Ile Glu 260 265 270 Ile Gly Pro Gly Lys Val Leu Ser Gly Leu Ile Lys Lys Ile Asn Arg 275 280 285 Asp Val Lys Leu Thr Ser Ile Gln Thr Leu Glu Asp Val Lys Gly Trp 290 295 300 Asn Glu Asn Asp 305
【図１】 スタフィロコッカス・アウレウス・ＦａｂＤ
のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】 図１のポリヌクレオチド配列から推定され
る、スタフィロコッカス・アウレウス・ＦａｂＤのアミ
ノ酸配列（配列番号２）を示す。
る、スタフィロコッカス・アウレウス・ＦａｂＤのアミ
ノ酸配列（配列番号２）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 1/00 11/00 9/00 11/02 11/00 13/00 11/02 17/00 13/00 19/02 17/00 19/08 19/02 25/00 19/08 27/02 25/00 27/16 27/02 31/04 27/16 Ｃ０７Ｋ 14/31 31/04 16/12 Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/12 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/563 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/563 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ジョン・ティモシー・ロンズデイル アメリカ合衆国19341ペンシルベニア州エ クストン、エッジウッド・ドライブ407番 (72)発明者 デイビッド・ジョン・ペイン アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州フ ェニックスビル、ウォーターフォール・ウ ェイ618番 (72)発明者 スチュアート・キャンベル・ペアソン アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、ハイポイント・ドライブ75番
Claims (23)
- 【請求項１】（ａ）図２に示されるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同
一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるメンバーを有してなる単
離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 図２に示されるポリペプチド配列をコー
ドする請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 図１に示されるポリヌクレオチドからな
る請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 図２に示されるポリペプチドをコードす
る請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含
まれるＤＮＡにより発現されるのと同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７
０％の同一性を有し、図１に示されるポリヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の塩基を有してなるポリヌクレオチド；から
なる群より選択されるメンバーを有してなる単離ポリヌ
クレオチド。 - 【請求項８】 請求項２に記載のＤＮＡを有してなるベ
クター。 - 【請求項９】 請求項８に記載のベクターを有してなる
宿主細胞。 - 【請求項１０】 ポリペプチドの製造方法であって、請
求項９に記載の宿主から、該ＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドを発現させることからなる方法。 - 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、細胞が請求項８に記載のベクターに含まれ
るｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現する
ように、該細胞を該ベクターで形質転換またはトランス
フェクションすることからなる方法。 - 【請求項１２】 図２に示されるポリペプチドに対して
少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有してなる
ポリペプチド。 - 【請求項１３】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を
有してなるポリペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１２に記載のポ
リペプチドを個体に投与することからなる、ＦａｂＤを
必要とする個体の治療方法。 - 【請求項１６】 そのポリペプチドをコードするＤＮＡ
を個体に付与し、インビボにて該ポリペプチドを発現さ
せることにより、治療上有効量のポリペプチドを投与す
る請求項１６記載の方法。 - 【請求項１７】 ＦａｂＤポリペプチドを阻害する必要
のある個体の治療法であって、治療上有効量の請求項１
５に記載のアンタゴニストを投与することからなる方
法。 - 【請求項１８】 請求項１２記載のポリペプチドの発現
に関連する疾患の診断方法であって、該ポリペプチドを
コードする核酸配列を測定することからなる方法。 - 【請求項１９】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
２に記載のポリペプチドの存在について分析することか
らなる診断方法。 - 【請求項２０】 請求項１２に記載のポリペプチドと結
合し、その活性を阻害する化合物を同定する方法であっ
て、 細胞表面にポリペプチドについての結合部を発現する細
胞（その結合部は、化合物の該結合部への結合に応答し
て検出可能なシグナルを提供する能力を有する第２成分
に関与する）を、結合部への結合を可能とする条件下で
スクリーニングすべき化合物と接触させ、 該化合物と該結合部の相互作用から生じるシグナルの有
無を検出することによって、その化合物が結合部に結合
し、その結合部を活性化または阻害するかどうかを決定
することからなる方法。 - 【請求項２１】 哺乳動物にて免疫学的応答を誘発する
方法であって、抗体を産生するのに十分なＦａｂＤまた
はそのフラグメントまたは変種を哺乳動物に接種し、該
哺乳動物を疾患から保護することからなる方法。 - 【請求項２２】 哺乳動物において免疫学的応答を誘発
する方法であって、遺伝子治療を介して、インビボにて
ＦａｂＤまたはそのフラグメントまたは変種を発現させ
るために、ＦａｂＤフラグメントまたはその変種をコー
ドする遺伝子をデリバリーし、免疫学的応答を誘発し、
抗体を産生させ、該動物を疾患から保護する方法。 - 【請求項２３】 哺乳動物に導入した場合、哺乳動物に
おいて所定のＦａｂＤポリペプチドまたはそれよりコー
ドされるタンパク質に対する免疫学的応答を誘起する免
疫学的組成物であって、ＦａｂＤポリヌクレオチドまた
はそれからコードされるタンパク質をコードし、かつ発
現するＤＮＡからなる免疫学的組成物。
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