JPH10215885A - 新規ｌｅｐ - Google Patents
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- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗生物質活性をスクリーンし、感染、機能不
全および疾患の発生病理におけるその役割を測定するの
に用いることのできる因子が必要とされている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸
１ないし２０４からなるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有す
るポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）また
は（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続
した塩基を有してなるポリヌクレオチド；からなる群よ
り選択されるメンバーを有してなる単離ポリヌクレオチ
ドを提供する。
全および疾患の発生病理におけるその役割を測定するの
に用いることのできる因子が必要とされている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸
１ないし２０４からなるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有す
るポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）また
は（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続
した塩基を有してなるポリヌクレオチド；からなる群よ
り選択されるメンバーを有してなる単離ポリヌクレオチ
ドを提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一つに、新規に同
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、およびその
変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関するものである。特に、これら
の点および他の点に関して、本発明は、新規なリーダー
ペプチダーゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチド
（以下、「ｌｅｐ」という）に関する。
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、およびその
変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関するものである。特に、これら
の点および他の点に関して、本発明は、新規なリーダー
ペプチダーゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチド
（以下、「ｌｅｐ」という）に関する。
【０００２】
ストレプトコッカス属（Streptococci） ストレプトコッカスは医学的に重要な微生物属を形成し
ており、ヒトに、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血
症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例え
ば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎を含め、いくつかの型
の疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコ
ッカス属の単離から１００年以上も経過しているため、
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pn
eumoniae）は、より詳細な研究が為されている微生物の
一つである。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であると
いう初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffi
thならびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究にて
断言された。ストレプトコッカス・ニューモニエ（S.pn
eumoniae）に関する研究は膨大であるにも関わらず、こ
の微生物の毒性に関しては多くの疑問が残されている。
抗生物質の開発のための標的としてストレプトコッカス
属の遺伝子および遺伝子産物を用いるのはとりわけ好ま
しいことである。
ており、ヒトに、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血
症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例え
ば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎を含め、いくつかの型
の疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコ
ッカス属の単離から１００年以上も経過しているため、
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pn
eumoniae）は、より詳細な研究が為されている微生物の
一つである。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であると
いう初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffi
thならびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究にて
断言された。ストレプトコッカス・ニューモニエ（S.pn
eumoniae）に関する研究は膨大であるにも関わらず、こ
の微生物の毒性に関しては多くの疑問が残されている。
抗生物質の開発のための標的としてストレプトコッカス
属の遺伝子および遺伝子産物を用いるのはとりわけ好ま
しいことである。
【０００３】細胞表面タンパク質 微生物の異なる宿主組織への付着に関与し、細菌性発生
病理における重要な因子であると考えられるスタフィロ
コッカスおよびストレプトコッカスの数種の細胞表面結
合タンパク質が、過去１０年間に同定された（Patti,J.
M.ら、MSCRAMM-Mediated Adherence of Microorganisms
to Host Tissues（1994） Annu.Rev.Microbiol. 48：8
5−617）。別の方法は、抗菌剤標的、例えば、フィブロ
ネクチン結合タンパク質（EP0294349、EP0397633、WO94
／18327）、フィブリノーゲン結合タンパク質（WO94／0
6830）、コラーゲン結合タンパク質（WO92／07002）お
よび骨シアロプロテイン結合タンパク質（WO94／1331
0）などのスタフィロコッカス・アウレウス由来のその
ようなタンパク質を扱うように提唱されている。その結
合タンパク質またはその結合フラグメントを抗菌剤とし
て用い、生物が宿主組織に結合するのを遮断し、ワクチ
ンのように宿主動物にて該生物に対する抗体を出現させ
るか、または抗原のように該生物の宿主組織への結合を
遮断するのに用いることのできる治療抗体を出現させ
る。
病理における重要な因子であると考えられるスタフィロ
コッカスおよびストレプトコッカスの数種の細胞表面結
合タンパク質が、過去１０年間に同定された（Patti,J.
M.ら、MSCRAMM-Mediated Adherence of Microorganisms
to Host Tissues（1994） Annu.Rev.Microbiol. 48：8
5−617）。別の方法は、抗菌剤標的、例えば、フィブロ
ネクチン結合タンパク質（EP0294349、EP0397633、WO94
／18327）、フィブリノーゲン結合タンパク質（WO94／0
6830）、コラーゲン結合タンパク質（WO92／07002）お
よび骨シアロプロテイン結合タンパク質（WO94／1331
0）などのスタフィロコッカス・アウレウス由来のその
ようなタンパク質を扱うように提唱されている。その結
合タンパク質またはその結合フラグメントを抗菌剤とし
て用い、生物が宿主組織に結合するのを遮断し、ワクチ
ンのように宿主動物にて該生物に対する抗体を出現させ
るか、または抗原のように該生物の宿主組織への結合を
遮断するのに用いることのできる治療抗体を出現させ
る。
【０００４】リーダーペプチド 合成部位より１またはそれ以上の膜を介して転座するタ
ンパク質の大部分は、最初、シグナルまたはリーダーペ
プチドとして知られるＮ−末端延長部で合成される（Wi
ckner,W.ら、Ann.Rev.Biochem. 60：101−124（199
1））。成熟タンパク質を生成するためにシグナル配列
のタンパク質分解切断が、その転座の間にまたはそのす
ぐ後に起こり、シグナルまたはリーダーペプチダーゼ
（SPase）として知られる酵素により、原核および真核
の両生物にてその切断は触媒される。細菌性SPaseは１
つの（グラム陽性（Ｇ+）およびグラム陰性（Ｇ-）菌）
または２つの（Ｇ-）菌トランスメンブランセクション
により膜にアンカーされている単一のポリペプチドから
なる膜タンパク質である。細菌性SPaseの予想されるア
ミノ酸配列は高レベルの類似性を示し、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli；Wolfe,P.B.ら、J.Biol.Chem.
258：12073−12080（1983））、シュードモナス・フル
オレッセンス（Pseudomonas fluorescens；Black,M.T.
ら、Biochem.J. 282：539−543（1992））、サルモネラ
・チフィムリウム（Salmonella typhimurium；van Dij
i，J.M.ら、Mol.Gen.Genet. 223：244−240（199
0））、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus i
nfluenzae；Fleischmann,R.D.ら、Science 269：496−5
12（1995））、ホルミジウム・ラミノサム（Phormidium
laminosum；Packer,J.C.ら、Plant Mol.Biol. 27：199
−204（1995）、K.Creggら：Signal peptidase from St
aphylococcus aureus Manuscript JB765−96）、ブラデ
ィリゾビウム・ヤポニカム（Bradyrhizobium japonicu
m；Muller，P.ら、Mol.Microbiol. 18：831−840（199
5））、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter cap
sulatus；Klug,G.ら、GenBank entry、受入番号26830
5）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis；２本の
染色体および２本のプラスミド起源（Akagawaら、Micro
biol. 141：3241−3245（1995）；Meljer,M.J.J.ら、Mo
l.Microbiol. 17：621−631；van Diji,J.M.ら、EMBO
J.II：2819−2828（1992））、バシラス・リヘニフォル
ミス（Bacillus licheniformis；Hoang,V.ら、（1993）
Science P42668（emb1／genbank／ddbj data banksに
寄託））、バシラス・カルドチリカス（Bacillus caldo
tyricus：van Diji，J.m.（1993）．Sequence p41027
（emb1／genbank／ddbj data banksに寄託））、バシラ
ス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquifac
iens（２つの染色体遺伝子）；Hoang,V.およびJ.Hofeme
ister、Biochem. Biophys. Acta 1269：64−68；van Di
ji,J.M. （1993） Sequence p41026（emb1／genbank／d
dbj data banksに寄託））について知られており、バシ
ラス・プミリス（Bacillus pumilis；Hoang,V.およびJ.
Hofemeister、Biochem.Biophys.Acta 1269：64−68（19
95）について部分配列が報告されている。これらの酵素
は包括的に１型シグナルピペラーゼと定義されている
（van Diji,J.M.ら、EMBO J.II：2819−2828（199
2））。今回、１５種の細菌性SPase（および１６番目は
部分配列）のアミノ酸配列を報告するが、最も研究され
ているものはエシェリキア・コリからのリーダーペプチ
ダーゼ（LpaseまたはLepB）およびバシラス・サチリス
からのSPase（SipS）である。
ンパク質の大部分は、最初、シグナルまたはリーダーペ
プチドとして知られるＮ−末端延長部で合成される（Wi
ckner,W.ら、Ann.Rev.Biochem. 60：101−124（199
1））。成熟タンパク質を生成するためにシグナル配列
のタンパク質分解切断が、その転座の間にまたはそのす
ぐ後に起こり、シグナルまたはリーダーペプチダーゼ
（SPase）として知られる酵素により、原核および真核
の両生物にてその切断は触媒される。細菌性SPaseは１
つの（グラム陽性（Ｇ+）およびグラム陰性（Ｇ-）菌）
または２つの（Ｇ-）菌トランスメンブランセクション
により膜にアンカーされている単一のポリペプチドから
なる膜タンパク質である。細菌性SPaseの予想されるア
ミノ酸配列は高レベルの類似性を示し、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli；Wolfe,P.B.ら、J.Biol.Chem.
258：12073−12080（1983））、シュードモナス・フル
オレッセンス（Pseudomonas fluorescens；Black,M.T.
ら、Biochem.J. 282：539−543（1992））、サルモネラ
・チフィムリウム（Salmonella typhimurium；van Dij
i，J.M.ら、Mol.Gen.Genet. 223：244−240（199
0））、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus i
nfluenzae；Fleischmann,R.D.ら、Science 269：496−5
12（1995））、ホルミジウム・ラミノサム（Phormidium
laminosum；Packer,J.C.ら、Plant Mol.Biol. 27：199
−204（1995）、K.Creggら：Signal peptidase from St
aphylococcus aureus Manuscript JB765−96）、ブラデ
ィリゾビウム・ヤポニカム（Bradyrhizobium japonicu
m；Muller，P.ら、Mol.Microbiol. 18：831−840（199
5））、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter cap
sulatus；Klug,G.ら、GenBank entry、受入番号26830
5）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis；２本の
染色体および２本のプラスミド起源（Akagawaら、Micro
biol. 141：3241−3245（1995）；Meljer,M.J.J.ら、Mo
l.Microbiol. 17：621−631；van Diji,J.M.ら、EMBO
J.II：2819−2828（1992））、バシラス・リヘニフォル
ミス（Bacillus licheniformis；Hoang,V.ら、（1993）
Science P42668（emb1／genbank／ddbj data banksに
寄託））、バシラス・カルドチリカス（Bacillus caldo
tyricus：van Diji，J.m.（1993）．Sequence p41027
（emb1／genbank／ddbj data banksに寄託））、バシラ
ス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquifac
iens（２つの染色体遺伝子）；Hoang,V.およびJ.Hofeme
ister、Biochem. Biophys. Acta 1269：64−68；van Di
ji,J.M. （1993） Sequence p41026（emb1／genbank／d
dbj data banksに寄託））について知られており、バシ
ラス・プミリス（Bacillus pumilis；Hoang,V.およびJ.
Hofemeister、Biochem.Biophys.Acta 1269：64−68（19
95）について部分配列が報告されている。これらの酵素
は包括的に１型シグナルピペラーゼと定義されている
（van Diji,J.M.ら、EMBO J.II：2819−2828（199
2））。今回、１５種の細菌性SPase（および１６番目は
部分配列）のアミノ酸配列を報告するが、最も研究され
ているものはエシェリキア・コリからのリーダーペプチ
ダーゼ（LpaseまたはLepB）およびバシラス・サチリス
からのSPase（SipS）である。
【０００５】LPase活性はエシェリキア・コリにおける
細胞増殖に不可欠であるとされている。LPaseをコード
するｌｅｐＢ遺伝子の発現を調節可能なａｒａプロモー
ター（Dalbey，R.E.およびWickner、260：15925−1593
1）または天然プロモーターの部分的欠失（Date,T.、J.
Bacteriol. 154：76−83（1983））のいずれかで調節す
る実験により、LPase生成の最小化は細胞増殖および分
裂の停止に関連することがわかった。加えて、成熟した
ｌｅｐＢ遺伝子を有するエシェリキア・コリ株（E.coli
IT41）は増殖速度が劇的に減少し、増殖培地の温度を
４２℃まで昇温させると、迅速かつ著しいプレタンパク
質の蓄積を示すことがわかった（Inada，T.ら、J.Bacte
riol.171：585−587（1988））。これらの結果は、LPas
eに代わりうる遺伝子産物がエシェリキア・コリにはな
く、ｌｅｐＢがエシェリキア・コリ染色体における単一
コピーであることを意味する。このことは、Ｇ＋バシラ
ス属の少なくとも少なくとも２種、バシラス・サチリス
およびバシラス・アミロリクファシエンスでは反対であ
る。これらの各バシラス種中に少なくとも２種の相同的
SPase遺伝子が存在することが知られている。ｓｉｐＳ
遺伝子は、実験室条件下で細胞増殖速度および生存率に
影響を与えることなく、バシラス・サチリス168の染色
体より欠失させ、なおプレα−アミラーゼを処理しうる
変異株を生成することができる（K.M.CreggおよびM.T.B
lack、非公開）。推定SPase配列（Akagawaら、Microbio
l. 141：3241−3245（1995）はこの活性に関与する遺伝
子産物であり、および／またはバシラス・サチリスが２
以上のSPase遺伝子を有していてもよい。別個のSPase相
同体をコードする２またはそれ以上の遺伝子が密接に関
連する種のバシラス・アミロリクファシエンスの染色体
上にあり（Hoang,V.およびJ.Hofemeister、Biochim.Bio
phys.Acta 1269：64−68（1995））、ブラディリゾビウ
ム・ヤポニカムが1以上のSPaseを有していることを示唆
する証拠がある（Muller,P.ら、Mol.Microbiol. 18：83
1−840（1995）；Muller,P.ら、Planta 197：163−175
（1995））。Ｇ+菌の７属由来のSPase配列は現在公知で
あるが、Ｇ+ユーバクテリアのうち、単一バシラス属だ
けがSPase特性について試験されている。したがって、
バシラス・サチリスおよびバシラス・アミロリクファシ
エンスと異なり、例外的な分泌活性について知られてい
ない、Ｇ+ユーバクテリアが重複する基質特性を有する
１以上のSPaseをコードする遺伝子を有しているかどう
か、または単一のSPase遺伝子を有する点でより密接に
エシェリキア・コリおよびヘモフィルス・インフルエン
ゼ（あるいは他のＧ−ユーバクテリア）に似ているかど
うかを決定することに興味があると思われる。偏性Ｇ+
−様細胞内細菌、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Myco
plasma genitalium）の完全なゲノム配列の最近の刊行
物により、SPaseの中で異種性に関連する興味ある特性
もまた明らかにされた（Fraser,C.M.ら、Science 270：
397−403（1995））。エシェリキア・コリLPaseの阻害
剤が報告されている（Allsop,A.E.ら、Bioorg＆Med.Che
m.Letts. 5：443−448（1995））。
細胞増殖に不可欠であるとされている。LPaseをコード
するｌｅｐＢ遺伝子の発現を調節可能なａｒａプロモー
ター（Dalbey，R.E.およびWickner、260：15925−1593
1）または天然プロモーターの部分的欠失（Date,T.、J.
Bacteriol. 154：76−83（1983））のいずれかで調節す
る実験により、LPase生成の最小化は細胞増殖および分
裂の停止に関連することがわかった。加えて、成熟した
ｌｅｐＢ遺伝子を有するエシェリキア・コリ株（E.coli
IT41）は増殖速度が劇的に減少し、増殖培地の温度を
４２℃まで昇温させると、迅速かつ著しいプレタンパク
質の蓄積を示すことがわかった（Inada，T.ら、J.Bacte
riol.171：585−587（1988））。これらの結果は、LPas
eに代わりうる遺伝子産物がエシェリキア・コリにはな
く、ｌｅｐＢがエシェリキア・コリ染色体における単一
コピーであることを意味する。このことは、Ｇ＋バシラ
ス属の少なくとも少なくとも２種、バシラス・サチリス
およびバシラス・アミロリクファシエンスでは反対であ
る。これらの各バシラス種中に少なくとも２種の相同的
SPase遺伝子が存在することが知られている。ｓｉｐＳ
遺伝子は、実験室条件下で細胞増殖速度および生存率に
影響を与えることなく、バシラス・サチリス168の染色
体より欠失させ、なおプレα−アミラーゼを処理しうる
変異株を生成することができる（K.M.CreggおよびM.T.B
lack、非公開）。推定SPase配列（Akagawaら、Microbio
l. 141：3241−3245（1995）はこの活性に関与する遺伝
子産物であり、および／またはバシラス・サチリスが２
以上のSPase遺伝子を有していてもよい。別個のSPase相
同体をコードする２またはそれ以上の遺伝子が密接に関
連する種のバシラス・アミロリクファシエンスの染色体
上にあり（Hoang,V.およびJ.Hofemeister、Biochim.Bio
phys.Acta 1269：64−68（1995））、ブラディリゾビウ
ム・ヤポニカムが1以上のSPaseを有していることを示唆
する証拠がある（Muller,P.ら、Mol.Microbiol. 18：83
1−840（1995）；Muller,P.ら、Planta 197：163−175
（1995））。Ｇ+菌の７属由来のSPase配列は現在公知で
あるが、Ｇ+ユーバクテリアのうち、単一バシラス属だ
けがSPase特性について試験されている。したがって、
バシラス・サチリスおよびバシラス・アミロリクファシ
エンスと異なり、例外的な分泌活性について知られてい
ない、Ｇ+ユーバクテリアが重複する基質特性を有する
１以上のSPaseをコードする遺伝子を有しているかどう
か、または単一のSPase遺伝子を有する点でより密接に
エシェリキア・コリおよびヘモフィルス・インフルエン
ゼ（あるいは他のＧ−ユーバクテリア）に似ているかど
うかを決定することに興味があると思われる。偏性Ｇ+
−様細胞内細菌、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Myco
plasma genitalium）の完全なゲノム配列の最近の刊行
物により、SPaseの中で異種性に関連する興味ある特性
もまた明らかにされた（Fraser,C.M.ら、Science 270：
397−403（1995））。エシェリキア・コリLPaseの阻害
剤が報告されている（Allsop,A.E.ら、Bioorg＆Med.Che
m.Letts. 5：443−448（1995））。
【０００６】LPaseはヒスタミンを触媒塩基として利用
しない（Black,M.T.ら、Biochem.J.282：539−543（199
2）；Sung,M.およびR.E.Dalbey、J.Biol.Chem. 267：13
154−13159（1992））が、その代わり、この触媒塩基と
しての役割を果たすためにリジン側鎖を利用する（Blac
k,M.T.ら、J.Bacteriol. 175：4957−4961（1993）；Ts
chantz,W.R.ら、J.Biol.Chem. 268：27349−27354（199
3））新規な一連のセリンプロテアーゼに属することを
示唆する証拠が蓄積している。これらの観察およびエシ
ェリキア・コリ由来のLexAと比較することにより、セリ
ン−リジン触媒ダイアドが、LexAが触媒するペプチド結
合加水分解の間に作用すると考えられる（Slilaty,S.N.
およびJ.Little.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3987−
3991（1987））のと同様、LPaseにて作用しているかも
しれないと提案された（Black,M.T.ら、J.Bacteriol. 1
75：4957−4961（1993））。同様の観察が、バシラス・
サチリス由来のSPase（van Diji，J.M.ら、J.Biol.Che
m. 270：3611−3618（1995））およびエシェリキア・コ
リ由来のTsp外質（periplasmic）プロテアーゼ（Keile
r,K.C.およびR.T.Sauer、Biol.Chem. 270：28864−2886
8（1995））についてなされているため、SipSのLexAと
の類似性が一次構造のいくつかの領域にまで拡張して示
唆されている（van Diji,J.M.ら、J.Biol.Chem. 270：3
611−3618（1995））。エシェリキア・コリLPase（Blac
k,M.T.、J.Bacteriol. 175：4957−4961（1993）；Tsch
antz,W.R.ら、J.Biol.Chem. 268：27349−27354（199
3））およびバシラス・サチリスSPase（van Diji,J.M.
ら、J.Biol.Chem. 270：3611−3618（1995））の触媒活
性について臨界的であることがわかっており、触媒ダイ
アドを形成すると考えられる、セリンおよびリジン残基
（エシェリキア・コリLPaseを番号付けして、各々、90
および145）が、共にスタフィロコッカス・アウレウス
（S.aureus）タンパク質SpsB（S36およびK77）にて保持
されている。加えて、155位（エシェリキア・コリLPase
を番号付けして280）にあるアスパラギン酸もまた保持
されている（この残基が、エシェリキア・コリ由来のLP
aseについてはそれほど重要ではない（Sung,M．および
R.E.Dalbey.、J.Biol.Chem. 267：13154−13159（199
2）が、SipS SPaseの活性の点で重要である（van Diji,
J.M.ら、J.Biol.Chem. 270：3611−3618（1995））のは
明らかである。
しない（Black,M.T.ら、Biochem.J.282：539−543（199
2）；Sung,M.およびR.E.Dalbey、J.Biol.Chem. 267：13
154−13159（1992））が、その代わり、この触媒塩基と
しての役割を果たすためにリジン側鎖を利用する（Blac
k,M.T.ら、J.Bacteriol. 175：4957−4961（1993）；Ts
chantz,W.R.ら、J.Biol.Chem. 268：27349−27354（199
3））新規な一連のセリンプロテアーゼに属することを
示唆する証拠が蓄積している。これらの観察およびエシ
ェリキア・コリ由来のLexAと比較することにより、セリ
ン−リジン触媒ダイアドが、LexAが触媒するペプチド結
合加水分解の間に作用すると考えられる（Slilaty,S.N.
およびJ.Little.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3987−
3991（1987））のと同様、LPaseにて作用しているかも
しれないと提案された（Black,M.T.ら、J.Bacteriol. 1
75：4957−4961（1993））。同様の観察が、バシラス・
サチリス由来のSPase（van Diji，J.M.ら、J.Biol.Che
m. 270：3611−3618（1995））およびエシェリキア・コ
リ由来のTsp外質（periplasmic）プロテアーゼ（Keile
r,K.C.およびR.T.Sauer、Biol.Chem. 270：28864−2886
8（1995））についてなされているため、SipSのLexAと
の類似性が一次構造のいくつかの領域にまで拡張して示
唆されている（van Diji,J.M.ら、J.Biol.Chem. 270：3
611−3618（1995））。エシェリキア・コリLPase（Blac
k,M.T.、J.Bacteriol. 175：4957−4961（1993）；Tsch
antz,W.R.ら、J.Biol.Chem. 268：27349−27354（199
3））およびバシラス・サチリスSPase（van Diji,J.M.
ら、J.Biol.Chem. 270：3611−3618（1995））の触媒活
性について臨界的であることがわかっており、触媒ダイ
アドを形成すると考えられる、セリンおよびリジン残基
（エシェリキア・コリLPaseを番号付けして、各々、90
および145）が、共にスタフィロコッカス・アウレウス
（S.aureus）タンパク質SpsB（S36およびK77）にて保持
されている。加えて、155位（エシェリキア・コリLPase
を番号付けして280）にあるアスパラギン酸もまた保持
されている（この残基が、エシェリキア・コリ由来のLP
aseについてはそれほど重要ではない（Sung,M．および
R.E.Dalbey.、J.Biol.Chem. 267：13154−13159（199
2）が、SipS SPaseの活性の点で重要である（van Diji,
J.M.ら、J.Biol.Chem. 270：3611−3618（1995））のは
明らかである。
【０００７】明らかに、化合物を抗生物質活性について
スクリーンするのに用いることのでき、感染、機能不全
および疾患の発生病理におけるその役割を測定するのに
用いることのできる因子が必要とされている。かくし
て、感染、機能不全または疾患の予防、改善または治癒
において役割を果たしうる因子を同定し、特徴付ける必
要がある。ある具体例において、本発明のポリペプチド
は、保存アミノ酸残基３４−４３および７５−８４を有
し、公知のセリンプロテアーゼタンパク質に対してアミ
ノ酸配列相同性を有する。
スクリーンするのに用いることのでき、感染、機能不全
および疾患の発生病理におけるその役割を測定するのに
用いることのできる因子が必要とされている。かくし
て、感染、機能不全または疾患の予防、改善または治癒
において役割を果たしうる因子を同定し、特徴付ける必
要がある。ある具体例において、本発明のポリペプチド
は、保存アミノ酸残基３４−４３および７５−８４を有
し、公知のセリンプロテアーゼタンパク質に対してアミ
ノ酸配列相同性を有する。
【０００８】本発明の従来技術の参考文献およびその例 1.Akagawa E., K. Kurita, T. Sugawara, K. Nakamura,
Y. Kasahara, N. Ogasawara, and Yumane. 1995. Dete
rmination of a 17848 bp nucleotide sequence around
the 390 region of the Bacillus subtilis chromosom
e and similarity analysis of the products of 5puta
tive ORFS. Microbiol. 141:3241-3245. 2.AIIsop, A.E., G. Brooks, G. Bruton, S. Coulton,
P.D. Edwards, I.K.Hatton, A.C. Kaura, S.D. McLean,
N.D. Pearson, T. Smale and R. Southgate. 1995. Pe
nem inhibitors of bacterial signal peptidase. Bioo
rg, & Med. Chem. Letts. 5:443-448. 3.Black, M.T. 1993. Evidence that the catalytic ac
tivity of prokaryote leader tidase depends upon th
e operatiof of a serine-lysine catalyticdyad. J. B
acteriol. 175:4957-496 1. 4.Black, M.T., J.G.R. Munn, and A.E. Allsop. 1992.
On the catalytic mechanism of prokaryotic leader
peptidase 1. Biochem. J. 282:539-543. 5.Dalbey, R.E. and Wickner. Leader peptidase catal
yzes the release ofexported proteins from the oute
r surface of the Escherichia coli plasmamembrane.
J. Bioil. Chem. 260: 15925-1593 1. 6.Date, T. 1983. Demonstration by a novel genetic
technique that leader peptidase is an essential en
zyme of Escheria coli. J. Bacteriol. 154:76-83. 7.Devereus, J., P. Haeberli and O, Smithies. 1984.
A comprehensive set of sequence analysis programs
for the VAX. Nucleic Acids Res. 12:387-395. 8.Fleischmann, R.D., M.D. Adams, O. White, R.A. Cl
ayton, E.F. Kirkness, A.R. Kerlavage, C.J. Bult,
J.-F. Tomb, B.A. Dougherty, J.M. Memck, K.McKenne
y, G. Sutton, W. Fitzhugh, C. Fields, J.D. Gocayn
e, J. Scott, R.Shirley, L.-I. Liu, A. Glodek, J.M.
Kelly, J.F. Weidman, C.A. Phillips,T. Spriggs, E.
Hedblom, M.D. Cotton, T.R. Utterback, M.C. Hanna,
D.T. Nguyen, D.M. Saudek, R.C. Brandon, L.D. Fin
e, J.L. Frichtman, J.I. Fuhrmann, N.S.M. Geoghage
n, C.L. Gnehm, L.A. McDonald, K.V. Small, C.M. Fra
ser, H.O. Smith and J.C. Venter. 1995. Whole-genom
e random sequencing and assembly of Haemophilus in
fluenzae Rd. Science 269:496-512. 9. Fraser, C.M., J.D. Gocayne, O. White, M.D. Adam
s, R.A. Clayton, R.D. Fleischmann, C.J. Bult, A.R.
Kerlavage, G. Sutton, j.M. Kelley, J.L.Frichtman,
J.F. Weidman, K.V. Small, M. Sandusky, J. Fuhrman
n, D. Nguyen, T.R. Utterback, D.M. Saudek, C.A. Ph
illips, J.M. memck, J.-F. Tomb, B.A. Dougherty, K.
F. Bott, P.-C. Hu, T.S. Lucier, S.C. Peterson, H.
O. Smith, C.A. Hutchison III, and J.C. Venter. 199
5. The minimal gene complement of Mycoplasma genit
alum. Science 270:397-403. 10. Hamilto, C.M., M. Aldea, B.K. Wshbum, P. Babit
zke, and S.R. Kushner. 1989. New method for genera
ting deletions and gene replacements in Escherichi
a coli. J.Bacteriol. 171:4617-4622. 11. Hoang, V., A. Birger and J. Hofemeister. 1993.
Sequence P42668 submitted to emb 1/genbank/ddbj d
ata banks. 12. Hoang, V. and J. Hofemeister. 1995. B. Amyloli
quefaciens possesses a second type 1 sigal peptid
ase with extensive sequence similarity toother Bac
illus SPases. Biochim. Biophys. Acta 1269:64-68. 13. Hojrup, P., M.S. Jensen, and T.E. Peterson. 19
95. Amino acid sequence of bovine protein Z: a vit
amin K-dependent serine protease homolog FEBS Lett
s. 184:333-338. 14. Inada, T., D.I. Court, K. Ito, and Y. Nakamur
a. 1988. Conditionally lethal amber mutations in t
he leader peptidase gene of Escherichia coli. J. B
acteriol. 171:585-587. 15. Jacob, F., B. Joris, and J.-M. Frire. 199 1. A
ctive site serine mutants of the Streptomyces albu
s G p-hctamase. Biochem. J. 277:647-652. 16. Keiler, K.C. and R.T. Sauer. 1995. Identificat
ion of active site residues of the Tsp protease..
Biol. Cehm. 270:28864-28868. 17. Klug, G., A. Jaeger, C. Heck, and R. Rauhut. 1
996. GenBank entry,accession number 268305. 18. Kurosky, A., D.R. Barneft, T.-H. Lee, B. Touch
stone, R.E. Hay, M.S. Amotte, B.H. Bowman and W.M.
Fitch. Covalent structure of human haptoglobin: A
serine protease homolog Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 77:3388-3392. 19. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structnral pro
teins during the assembly of the head of bacteriop
hage T4. Nature (London) 227:680-685. 20. Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation
of deoxyribonucleicacid from microorganisms. J. M
oi. Biiol. 3:208-218. 21. Meljer, W.J.J., A. deJong, G. Bea, A. Wiseman,
H. Tjalsma, G. Venema, S. Bron and J.M. van Dijl.
1995. The endogenous B. sLLbtilis (natto)plasmids
PTAI015 and PTA1040 contain signal peptidase-enco
ding aenes: identification of a new structural mo
dule on cryptic plasmids. M01. Microbiol. 17:621-6
31. 22. M{iller, P., K. Ahrens and A. Klaucke. 1995. A
TnphoA insertion within the Bradyrhizobiumjaponic
um sipS gene, homologous to prokaryotic signal pep
tidases, results in extensive changes in the expre
ssion of PMB-specific nodulins of infected soybean
(Glycine max) celIS. Mol. Microbiol. 18:831-840. 23. Miiller, P., K. Ahrens and A. Klaucke. 1995. T
nphoA insertyion within the Bradyrhiiobium japolii
cum that impair cell and tissue differenctiation i
n Glycine max nodules. Planta 197:163.175. 24. Nakamura, T., T. Nishizawa, M. Haiya, T. Seki,
M. Shimonishi, A. Sugimura, K. Tashire and S. Shi
mizu. 1989. Molecular cloining and expression of h
uman hepatocyte growth factor. Nature (London) 34
2:440-443. 25. Packer, J.C., D. Andre and C.J. Howe. 1995. Cl
oning and sequence analysis of a sigal peptidase I
from the theromophilic cyanobacterium Phorimiduom
lamipzosum. Plant Mol. Biol. 27:199-204. K. Creg
g, I. Wilding nd M. Black: Sigal peptidase from St
aphylococcus aureus Manuscript JB765-96. 26. Petersen, L.C., J.J. Birkoft, and H. Flodgaar
d. 1933. Binding of bovine pancreatic trypsin inhi
bitor and a proteolytically inactive serineprotein
ase homologue. ,Eur. J.Biochem. 214:271-279. 27. Rlfai, S., V. Barbancon, G. PreVost and Y. Pie
mont. 1989 Syntheticexfolliativetoxin A and B DNA
probes for detection of toxigenic. Staphylococcus
aureusstrains. J. Clin Microbiol. 27:504-506. 28. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 19
89. Molecular Cioning: a Labaoratory manual ,２nd
ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Sprin
g Harbor NY. 29. Schenk, S. and R.A. Laddaga. 1992. Improved me
thod for electroporation of Staphylococcus aureus
FEMS Miocrobiol. Letts. 94: 133- 138. 30. Slilaty, S.N. and J. Little. 1987. Lystine-156
and serine- 119 arerequired for LexA repressor c
levage: a possible mechanism. Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA 84:3987:3991. 31. Sung, M. and R.E. Dalbey. 1992. Identification
of potential active-site residues in the Escheric
hia coli leader peptidase. I. Biol. Chem 267:13154
- 13 159. 32. Toth, M.J., E.J. Murgola and P. Schimmel. 198
8. Evidence for aunique first positoncodon-anticod
on mismatch in Vivo. J. Mol. Biol. 201:45 1-454. 33. Tschantz, W.R., M. Sung, V.M., Delgado-Partlin
and R.E. Dalbey. 1993. A serineand a lysine resid
ue implicated in the catalytic mechanism of the Es
cherichia coli leader peptidase. J. Biol. Chem. 26
8:27349-27354. 34. van Dijl, J.M. 1993. Sequence p41027, submitte
d to embl/genbanWddbj data banks． 35. van Dijl, J.M. 1993. Sequence p41026, submitte
d to embl/genbank/ddbj data banks. 36．van Dijl, J.M., A. de Jong, H. Smith, S. Bron
and G. Venema. 1991.Non-functional expression of E
scherichia coli siZnal peptidase I in B.subtilis.
J. Gen. Microbiol. 137:2073-2083. 37． van Dijl, J.M., A. de Jong, J. Vehmaanpera,
G. Venema and S. Bron. 1992. Signal peptidase I of
B.subtilis: patterns of conserved amino acids in
prokaryotic and eukaryotic type I signal peptidas
es. EMBO J. 11:2819-2828. 38. van Dijl, J.M., A. de Jong, G. Venema and S. B
ron. 1995. Identification of the potential active
site of the signal peptidase SipS of B.subtilis.
J. Biol. Chem. 270:3611-3618. 39. van Dijl, J.M. R. van den Bergh, T. Reversma,
H. Smith, S. Bron and G. Venema. 1990. Molecular c
loning of the Salmonella ryphimurion lep gene in E
scherichia cofi. Mol. Gen. Genet. 223:233-240. 40. Vanklompenberg, W.P. Whitley, R. Diemel, G. yo
n Heijne and B. de Kruijff. 1995. A quantitative a
ssay to determine the amount of signla peptidase-I
in Escherichia coli and the orientation of membra
ne vesicles. Mol. Membrane. Biol. 12:349-353. 41. Villafane, R., D.H. Bechhofer, C.S. Narayanan
and D. Dubnau. 1987.Replication control genes of p
lasmid PE194. J. Bacteriol. 169:4822=4829.42. Wick
ner, W., A.J.M. Driessen and F.U. Hartl. 199 1. Th
e enzymologyof protein translocation across the Es
cherichia coli plasma membmne. Ann. Rev. Biochem.6
0: 101-124. 43. Wolfe, P.B., W. Wickner and J.M. Goodman. 198
3. Sequence of the leader peptidase gene of Escher
ichia coli and the orietation of leader peptidase
in the bacterial envelope. J. Biol. Chem. 258: 120
73-12080.
Y. Kasahara, N. Ogasawara, and Yumane. 1995. Dete
rmination of a 17848 bp nucleotide sequence around
the 390 region of the Bacillus subtilis chromosom
e and similarity analysis of the products of 5puta
tive ORFS. Microbiol. 141:3241-3245. 2.AIIsop, A.E., G. Brooks, G. Bruton, S. Coulton,
P.D. Edwards, I.K.Hatton, A.C. Kaura, S.D. McLean,
N.D. Pearson, T. Smale and R. Southgate. 1995. Pe
nem inhibitors of bacterial signal peptidase. Bioo
rg, & Med. Chem. Letts. 5:443-448. 3.Black, M.T. 1993. Evidence that the catalytic ac
tivity of prokaryote leader tidase depends upon th
e operatiof of a serine-lysine catalyticdyad. J. B
acteriol. 175:4957-496 1. 4.Black, M.T., J.G.R. Munn, and A.E. Allsop. 1992.
On the catalytic mechanism of prokaryotic leader
peptidase 1. Biochem. J. 282:539-543. 5.Dalbey, R.E. and Wickner. Leader peptidase catal
yzes the release ofexported proteins from the oute
r surface of the Escherichia coli plasmamembrane.
J. Bioil. Chem. 260: 15925-1593 1. 6.Date, T. 1983. Demonstration by a novel genetic
technique that leader peptidase is an essential en
zyme of Escheria coli. J. Bacteriol. 154:76-83. 7.Devereus, J., P. Haeberli and O, Smithies. 1984.
A comprehensive set of sequence analysis programs
for the VAX. Nucleic Acids Res. 12:387-395. 8.Fleischmann, R.D., M.D. Adams, O. White, R.A. Cl
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J.-F. Tomb, B.A. Dougherty, J.M. Memck, K.McKenne
y, G. Sutton, W. Fitzhugh, C. Fields, J.D. Gocayn
e, J. Scott, R.Shirley, L.-I. Liu, A. Glodek, J.M.
Kelly, J.F. Weidman, C.A. Phillips,T. Spriggs, E.
Hedblom, M.D. Cotton, T.R. Utterback, M.C. Hanna,
D.T. Nguyen, D.M. Saudek, R.C. Brandon, L.D. Fin
e, J.L. Frichtman, J.I. Fuhrmann, N.S.M. Geoghage
n, C.L. Gnehm, L.A. McDonald, K.V. Small, C.M. Fra
ser, H.O. Smith and J.C. Venter. 1995. Whole-genom
e random sequencing and assembly of Haemophilus in
fluenzae Rd. Science 269:496-512. 9. Fraser, C.M., J.D. Gocayne, O. White, M.D. Adam
s, R.A. Clayton, R.D. Fleischmann, C.J. Bult, A.R.
Kerlavage, G. Sutton, j.M. Kelley, J.L.Frichtman,
J.F. Weidman, K.V. Small, M. Sandusky, J. Fuhrman
n, D. Nguyen, T.R. Utterback, D.M. Saudek, C.A. Ph
illips, J.M. memck, J.-F. Tomb, B.A. Dougherty, K.
F. Bott, P.-C. Hu, T.S. Lucier, S.C. Peterson, H.
O. Smith, C.A. Hutchison III, and J.C. Venter. 199
5. The minimal gene complement of Mycoplasma genit
alum. Science 270:397-403. 10. Hamilto, C.M., M. Aldea, B.K. Wshbum, P. Babit
zke, and S.R. Kushner. 1989. New method for genera
ting deletions and gene replacements in Escherichi
a coli. J.Bacteriol. 171:4617-4622. 11. Hoang, V., A. Birger and J. Hofemeister. 1993.
Sequence P42668 submitted to emb 1/genbank/ddbj d
ata banks. 12. Hoang, V. and J. Hofemeister. 1995. B. Amyloli
quefaciens possesses a second type 1 sigal peptid
ase with extensive sequence similarity toother Bac
illus SPases. Biochim. Biophys. Acta 1269:64-68. 13. Hojrup, P., M.S. Jensen, and T.E. Peterson. 19
95. Amino acid sequence of bovine protein Z: a vit
amin K-dependent serine protease homolog FEBS Lett
s. 184:333-338. 14. Inada, T., D.I. Court, K. Ito, and Y. Nakamur
a. 1988. Conditionally lethal amber mutations in t
he leader peptidase gene of Escherichia coli. J. B
acteriol. 171:585-587. 15. Jacob, F., B. Joris, and J.-M. Frire. 199 1. A
ctive site serine mutants of the Streptomyces albu
s G p-hctamase. Biochem. J. 277:647-652. 16. Keiler, K.C. and R.T. Sauer. 1995. Identificat
ion of active site residues of the Tsp protease..
Biol. Cehm. 270:28864-28868. 17. Klug, G., A. Jaeger, C. Heck, and R. Rauhut. 1
996. GenBank entry,accession number 268305. 18. Kurosky, A., D.R. Barneft, T.-H. Lee, B. Touch
stone, R.E. Hay, M.S. Amotte, B.H. Bowman and W.M.
Fitch. Covalent structure of human haptoglobin: A
serine protease homolog Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 77:3388-3392. 19. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structnral pro
teins during the assembly of the head of bacteriop
hage T4. Nature (London) 227:680-685. 20. Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation
of deoxyribonucleicacid from microorganisms. J. M
oi. Biiol. 3:208-218. 21. Meljer, W.J.J., A. deJong, G. Bea, A. Wiseman,
H. Tjalsma, G. Venema, S. Bron and J.M. van Dijl.
1995. The endogenous B. sLLbtilis (natto)plasmids
PTAI015 and PTA1040 contain signal peptidase-enco
ding aenes: identification of a new structural mo
dule on cryptic plasmids. M01. Microbiol. 17:621-6
31. 22. M{iller, P., K. Ahrens and A. Klaucke. 1995. A
TnphoA insertion within the Bradyrhizobiumjaponic
um sipS gene, homologous to prokaryotic signal pep
tidases, results in extensive changes in the expre
ssion of PMB-specific nodulins of infected soybean
(Glycine max) celIS. Mol. Microbiol. 18:831-840. 23. Miiller, P., K. Ahrens and A. Klaucke. 1995. T
nphoA insertyion within the Bradyrhiiobium japolii
cum that impair cell and tissue differenctiation i
n Glycine max nodules. Planta 197:163.175. 24. Nakamura, T., T. Nishizawa, M. Haiya, T. Seki,
M. Shimonishi, A. Sugimura, K. Tashire and S. Shi
mizu. 1989. Molecular cloining and expression of h
uman hepatocyte growth factor. Nature (London) 34
2:440-443. 25. Packer, J.C., D. Andre and C.J. Howe. 1995. Cl
oning and sequence analysis of a sigal peptidase I
from the theromophilic cyanobacterium Phorimiduom
lamipzosum. Plant Mol. Biol. 27:199-204. K. Creg
g, I. Wilding nd M. Black: Sigal peptidase from St
aphylococcus aureus Manuscript JB765-96. 26. Petersen, L.C., J.J. Birkoft, and H. Flodgaar
d. 1933. Binding of bovine pancreatic trypsin inhi
bitor and a proteolytically inactive serineprotein
ase homologue. ,Eur. J.Biochem. 214:271-279. 27. Rlfai, S., V. Barbancon, G. PreVost and Y. Pie
mont. 1989 Syntheticexfolliativetoxin A and B DNA
probes for detection of toxigenic. Staphylococcus
aureusstrains. J. Clin Microbiol. 27:504-506. 28. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 19
89. Molecular Cioning: a Labaoratory manual ,２nd
ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Sprin
g Harbor NY. 29. Schenk, S. and R.A. Laddaga. 1992. Improved me
thod for electroporation of Staphylococcus aureus
FEMS Miocrobiol. Letts. 94: 133- 138. 30. Slilaty, S.N. and J. Little. 1987. Lystine-156
and serine- 119 arerequired for LexA repressor c
levage: a possible mechanism. Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA 84:3987:3991. 31. Sung, M. and R.E. Dalbey. 1992. Identification
of potential active-site residues in the Escheric
hia coli leader peptidase. I. Biol. Chem 267:13154
- 13 159. 32. Toth, M.J., E.J. Murgola and P. Schimmel. 198
8. Evidence for aunique first positoncodon-anticod
on mismatch in Vivo. J. Mol. Biol. 201:45 1-454. 33. Tschantz, W.R., M. Sung, V.M., Delgado-Partlin
and R.E. Dalbey. 1993. A serineand a lysine resid
ue implicated in the catalytic mechanism of the Es
cherichia coli leader peptidase. J. Biol. Chem. 26
8:27349-27354. 34. van Dijl, J.M. 1993. Sequence p41027, submitte
d to embl/genbanWddbj data banks． 35. van Dijl, J.M. 1993. Sequence p41026, submitte
d to embl/genbank/ddbj data banks. 36．van Dijl, J.M., A. de Jong, H. Smith, S. Bron
and G. Venema. 1991.Non-functional expression of E
scherichia coli siZnal peptidase I in B.subtilis.
J. Gen. Microbiol. 137:2073-2083. 37． van Dijl, J.M., A. de Jong, J. Vehmaanpera,
G. Venema and S. Bron. 1992. Signal peptidase I of
B.subtilis: patterns of conserved amino acids in
prokaryotic and eukaryotic type I signal peptidas
es. EMBO J. 11:2819-2828. 38. van Dijl, J.M., A. de Jong, G. Venema and S. B
ron. 1995. Identification of the potential active
site of the signal peptidase SipS of B.subtilis.
J. Biol. Chem. 270:3611-3618. 39. van Dijl, J.M. R. van den Bergh, T. Reversma,
H. Smith, S. Bron and G. Venema. 1990. Molecular c
loning of the Salmonella ryphimurion lep gene in E
scherichia cofi. Mol. Gen. Genet. 223:233-240. 40. Vanklompenberg, W.P. Whitley, R. Diemel, G. yo
n Heijne and B. de Kruijff. 1995. A quantitative a
ssay to determine the amount of signla peptidase-I
in Escherichia coli and the orientation of membra
ne vesicles. Mol. Membrane. Biol. 12:349-353. 41. Villafane, R., D.H. Bechhofer, C.S. Narayanan
and D. Dubnau. 1987.Replication control genes of p
lasmid PE194. J. Bacteriol. 169:4822=4829.42. Wick
ner, W., A.J.M. Driessen and F.U. Hartl. 199 1. Th
e enzymologyof protein translocation across the Es
cherichia coli plasma membmne. Ann. Rev. Biochem.6
0: 101-124. 43. Wolfe, P.B., W. Wickner and J.M. Goodman. 198
3. Sequence of the leader peptidase gene of Escher
ichia coli and the orietation of leader peptidase
in the bacterial envelope. J. Biol. Chem. 258: 120
73-12080.
【０００９】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、ポリペプチド、とりわけ図２に示されるアミノ酸配
列およびsp／P41027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I
（SPASE I）（LEA...‐1 147 5.3 e−38 4）タンパク質
などの他のタンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性に
より、新規ｌｅｐペプチドとして同定されたポリペプチ
ドを提供することである。本発明のさらなる目的は、さ
らに、ｌｅｐポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、特に本明細書においてｌｅｐと称するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
は、ポリペプチド、とりわけ図２に示されるアミノ酸配
列およびsp／P41027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I
（SPASE I）（LEA...‐1 147 5.3 e−38 4）タンパク質
などの他のタンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性に
より、新規ｌｅｐペプチドとして同定されたポリペプチ
ドを提供することである。本発明のさらなる目的は、さ
らに、ｌｅｐポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、特に本明細書においてｌｅｐと称するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）に示す配列のｌｅｐポリペプチドをコー
ドする領域またはそのフラグメント、アナログまたは誘
導体を有する。本発明の別の特に好ましい具体例には、
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含んでなるストレ
プトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoni
ae）由来の新規セリンプロテアーゼタンパク質、または
そのフラグメント、アナログまたは誘導体がある。本発
明のこの態様によれば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４
に含まれる菌株のストレプトコッカス・ニューモニエ０
１００９９３により発現可能な成熟ポリペプチドをコー
ドする単離核酸分子が提供される。
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）に示す配列のｌｅｐポリペプチドをコー
ドする領域またはそのフラグメント、アナログまたは誘
導体を有する。本発明の別の特に好ましい具体例には、
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含んでなるストレ
プトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoni
ae）由来の新規セリンプロテアーゼタンパク質、または
そのフラグメント、アナログまたは誘導体がある。本発
明のこの態様によれば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４
に含まれる菌株のストレプトコッカス・ニューモニエ０
１００９９３により発現可能な成熟ポリペプチドをコー
ドする単離核酸分子が提供される。
【００１１】本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘
導体、または変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トを含め、そのフラグメントを包含する、ｌｅｐ、特に
ストレプトコッカス・ｌｅｐをコードする単離された核
酸分子、およびそれらからなる組成物が提供される。本
発明の別の態様によれば、特に遺伝的免疫処置の治療ま
たは予防を目的として、本発明のポリヌクレオチドの使
用が提供される。本発明のこの態様の特に好ましい具体
例には、ｌｅｐの天然の対立遺伝子変種およびそれによ
りコードされるポリペプチドがある。
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘
導体、または変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トを含め、そのフラグメントを包含する、ｌｅｐ、特に
ストレプトコッカス・ｌｅｐをコードする単離された核
酸分子、およびそれらからなる組成物が提供される。本
発明の別の態様によれば、特に遺伝的免疫処置の治療ま
たは予防を目的として、本発明のポリヌクレオチドの使
用が提供される。本発明のこの態様の特に好ましい具体
例には、ｌｅｐの天然の対立遺伝子変種およびそれによ
りコードされるポリペプチドがある。
【００１２】本発明のこの態様によれば、本明細書にお
いてｌｅｐと称されるストレプトコッカスの新規ポリペ
プチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変種および
誘導体、および前記したフラグメントおよびアナログの
変種および誘導体、およびそれらの組成物が提供され
る。本発明のこの態様の特に好ましい具体例には、ｌｅ
ｐ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるｌｅｐ
ポリペプチドの変種がある。本発明のこの態様の好まし
い具体例では、前記したｌｅｐポリペプチドの製造方法
を提供する。本発明のさらに別の態様によれば、例え
ば、抗体を含め、抗菌剤として有用なかかるポリペプチ
ドの阻害物質が提供される。
いてｌｅｐと称されるストレプトコッカスの新規ポリペ
プチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変種および
誘導体、および前記したフラグメントおよびアナログの
変種および誘導体、およびそれらの組成物が提供され
る。本発明のこの態様の特に好ましい具体例には、ｌｅ
ｐ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるｌｅｐ
ポリペプチドの変種がある。本発明のこの態様の好まし
い具体例では、前記したｌｅｐポリペプチドの製造方法
を提供する。本発明のさらに別の態様によれば、例え
ば、抗体を含め、抗菌剤として有用なかかるポリペプチ
ドの阻害物質が提供される。
【００１３】本発明のこの態様の特定の好ましい具体例
によれば、とりわけ、ｌｅｐ発現を評価し、中耳炎、結
膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心
内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染のような髄膜炎を治
療し、遺伝的変異を評価し、生物にｌｅｐポリペプチド
またはポリヌクレオチドを投与し、細菌、特にストレプ
トコッカスに対する免疫学的応答を生じさせるための、
生成物、組成物および方法が提供される。
によれば、とりわけ、ｌｅｐ発現を評価し、中耳炎、結
膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心
内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染のような髄膜炎を治
療し、遺伝的変異を評価し、生物にｌｅｐポリペプチド
またはポリヌクレオチドを投与し、細菌、特にストレプ
トコッカスに対する免疫学的応答を生じさせるための、
生成物、組成物および方法が提供される。
【００１４】本発明のこのおよび他の態様の特定の好ま
しい具体例によれば、ｌｅｐポリペプチド配列にハイブ
リダイゼーションするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のこの態様の特定のさらに好ましい具体例におい
て、ｌｅｐポリペプチドに対する抗体が提供される。本
発明の別の態様によれば、好ましくは、静菌剤または殺
菌剤でもある、ｌｅｐアゴニストが提供される。本発明
のさらに別の態様によれば、好ましくは、静菌剤または
殺菌剤でもある、ｌｅｐアンタゴニストが提供される。
本発明のさらなる態様では、単細胞または多細胞生物に
投与するための、ｌｅｐポリヌクレオチドまたはｌｅｐ
ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。開示した
本発明の精神および観点内での種々の変更および修飾
は、以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。
しい具体例によれば、ｌｅｐポリペプチド配列にハイブ
リダイゼーションするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のこの態様の特定のさらに好ましい具体例におい
て、ｌｅｐポリペプチドに対する抗体が提供される。本
発明の別の態様によれば、好ましくは、静菌剤または殺
菌剤でもある、ｌｅｐアゴニストが提供される。本発明
のさらに別の態様によれば、好ましくは、静菌剤または
殺菌剤でもある、ｌｅｐアンタゴニストが提供される。
本発明のさらなる態様では、単細胞または多細胞生物に
投与するための、ｌｅｐポリヌクレオチドまたはｌｅｐ
ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。開示した
本発明の精神および観点内での種々の変更および修飾
は、以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。
【００１５】
定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるｌｅｐ−結合分子は、
例えば酵素基質、細胞膜成分および古典的なレセプター
を含め、本発明のｌｅｐポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドと特異的に結合または相互作用する分子またはイ
オンをいう。本発明のポリペプチドと、結合または相互
作用分子を含め、そのような分子間の結合は、本発明の
ポリペプチドに対して独占的であることが好ましく、ま
たはその結合は本発明のポリペプチドに高度に特異的で
あることもまた好ましく、またはその結合は本発明のポ
リペプチドを包含するタンパク質群に高度に特異的であ
ることも好ましく、または本発明のポリペプチドを含
む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特異的で
あってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペプチド
に特異的に結合する抗体および抗体由来の物質をも包含
する。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるｌｅｐ−結合分子は、
例えば酵素基質、細胞膜成分および古典的なレセプター
を含め、本発明のｌｅｐポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドと特異的に結合または相互作用する分子またはイ
オンをいう。本発明のポリペプチドと、結合または相互
作用分子を含め、そのような分子間の結合は、本発明の
ポリペプチドに対して独占的であることが好ましく、ま
たはその結合は本発明のポリペプチドに高度に特異的で
あることもまた好ましく、またはその結合は本発明のポ
リペプチドを包含するタンパク質群に高度に特異的であ
ることも好ましく、または本発明のポリペプチドを含
む、少なくともその一つが数種のタンパク質に特異的で
あってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペプチド
に特異的に結合する抗体および抗体由来の物質をも包含
する。
【００１６】「遺伝的エレメント」は、一般に、ポリペ
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該
エレメントはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝
的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作
の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはと
りわけベクター内にも含まれていてもよい。
【００１７】「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、配列を比較して測定さ
れるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間
または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、
時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により決定さ
れるような２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド
配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」および
「類似性」は共に容易に算出できる（Computational Mo
lecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユ
ニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；Bioc
omputing：Informatics and Genome Projects，Smith,
D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年；Computer Analysisof Sequence Data，パートＩ，G
riffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレ
ス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in
Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミック・
プレス、1987年；およびSequence Analysis Primer，Gr
ibskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチド
または２つのポリペプチド間の同一性および類似性を測
定するための多くの方法がある一方で、その両方の用語
は当業者に周知である（ＳequenceＡnalysis in Ｍolec
ularＢiology，von Heinje，Ｇ.，ＡcademicＰress，19
87；Ｓquence ＡnalysisＰrimer，Ｇribskov，Ｍ.およ
びＤevereux，Ｊ.，編、Ｍ ＳtocktonＰress，Ｎew Ｙo
rk，1991；およびＣarillo，Ｈ.，およびＬipman，
Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.，ＡppliedＭath.，48：1073（198
8））。２つの配列間で同一性または類似性を測定する
のに通常用いられる方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipm
an，Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.Ａpplied Ｍath.，48：1073（19
88）に開示されている方法を包含するが、これに限定さ
れるものではない。同一性を決定するための好ましい方
法は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように
設計される。同一性および類似性を測定する方法は、コ
ンピュータープログラムに組み込まれている。二つの配
列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュ
ータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387
（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.
ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含する
が、これらに限定されるものではない。
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。当該分野にて周知であるように
「同一性」または「類似性」は、配列を比較して測定さ
れるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間
または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の
関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、
時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により決定さ
れるような２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド
配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」および
「類似性」は共に容易に算出できる（Computational Mo
lecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユ
ニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；Bioc
omputing：Informatics and Genome Projects，Smith,
D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年；Computer Analysisof Sequence Data，パートＩ，G
riffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレ
ス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in
Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミック・
プレス、1987年；およびSequence Analysis Primer，Gr
ibskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチド
または２つのポリペプチド間の同一性および類似性を測
定するための多くの方法がある一方で、その両方の用語
は当業者に周知である（ＳequenceＡnalysis in Ｍolec
ularＢiology，von Heinje，Ｇ.，ＡcademicＰress，19
87；Ｓquence ＡnalysisＰrimer，Ｇribskov，Ｍ.およ
びＤevereux，Ｊ.，編、Ｍ ＳtocktonＰress，Ｎew Ｙo
rk，1991；およびＣarillo，Ｈ.，およびＬipman，
Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.，ＡppliedＭath.，48：1073（198
8））。２つの配列間で同一性または類似性を測定する
のに通常用いられる方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipm
an，Ｄ.，ＳＩＡＭ Ｊ.Ａpplied Ｍath.，48：1073（19
88）に開示されている方法を包含するが、これに限定さ
れるものではない。同一性を決定するための好ましい方
法は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように
設計される。同一性および類似性を測定する方法は、コ
ンピュータープログラムに組み込まれている。二つの配
列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュ
ータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387
（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.
ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含する
が、これらに限定されるものではない。
【００１８】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
ら変化させられた、すなわち、天然物の場合、その本来
の環境から変化または除去あるいはその両方が行われた
ことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていな
いが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用
いる用語としての「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は、天然の
染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌク
レオチドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡな
どの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長
および発現のために、融合タンパク質を形成したりする
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養
物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中
または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも
本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえ
る。というのはこれらは天然の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶
液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液
中に生じさせてもよく、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
【００１９】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチドは、
しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称され
る短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをも意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む
ハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用い
るポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味す
る。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分
子由来のものでよい。この領域はこれらの分子の一つま
たはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的
にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領
域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがし
ばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基
を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
このように、安定性または他の理由で修飾された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が意図
するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例
だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の
「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリ
ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ
リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝
的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型
細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡお
よびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチドは、
しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称され
る短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００２０】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野の他の発行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの
型があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖
の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に
２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外
のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミ
ノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような
自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたもの
が含まれるが、当業者に周知の化学的修飾技術によって
も修飾できることは理解されよう。ポリペプチドに自然
に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところ
なく掲示することはできないが、基礎的なテキストおよ
びさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。
【００２１】本発明のポリペプチドに施すことができる
既知の修飾には、例を挙げると、アセチル化、アシル
化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、
環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結
合形成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホル
ミル化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩ
アンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、
ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタン
パク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。
かかる修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳
細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例
えば糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基の
ガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ
リボシル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-S
tructure and Molecular Properties、第2版、T.E.Crei
ghton、W.H.Freeman andCompany、ニューヨーク（199
3）に記載されている。例えば、Posttranslational Cov
alent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,
Posttranslational Protein Modifications：Perspecti
ve and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymo
l.182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synth
esis：Posttranslational Modifications and Aging，A
nn.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）で提供される論文
などの多くの詳細な論文が、本主題に利用できる。ポリ
ペプチドはいつも完全に直鎖であるとは限らないという
ことは周知であり、前記した通りであると理解されよ
う。例えばポリペプチドはユビキチン化の結果分岐して
いてもよく、一般には、天然のプロセッシング事象を含
む翻訳後の事象、および天然では起こらない人為的操作
によりもたらされる事象の結果、分岐のある、または分
岐のない環状にできる。環状、分岐および分岐した環状
ポリペプチドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、
および同様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペ
プチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキ
シル末端を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得
る。実際、共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミ
ノまたはカルボキシル基またはその両方の遮断は、天然
および合成ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に
本発明のポリペプチドにも存在し得る。例えば、イー・
コリ（E.coli.）または他の細胞で作られるポリペプチ
ドのアミノ末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシン
グの前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるで
あろう。ペプチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端で
メチオニン残基を除去できる。従って、本発明は、本発
明のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニン不含
の両方のアミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチ
ドに起こる修飾はしばしばそれの作り方に影響される。
例えば、宿主にクローン化遺伝子を発現することにより
作られるポリペプチドでは、修飾の特性および程度は、
大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチド
アミノ酸配列に存在する修飾シグナルにより決定され
る。例えば、周知のように、糖鎖形成はイー・コリのよ
うな細菌宿主では起こらないことがはしばしばである。
従って、糖鎖形成が望ましい場合、ポリペプチドを、糖
鎖形成宿主、一般に、真核細胞にて発現させるべきであ
る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後
糖鎖形成を行う；この理由で昆虫細胞発現系が、とりわ
け、糖鎖形成の本来のパターンを有する哺乳動物タンパ
ク質を効率よく発現するように開発されている。同様の
考察が他の修飾にも適用される。修飾の同一の型が、所
定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じまたは異な
る程度で存在し得ることは理解されよう。また、所定の
ポリペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。一
般に、本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」なる用
語は、全てのこのような修飾、特に宿主細胞においてポ
リヌクレオチドを発現することにより合成したポリペプ
チドに存在する修飾を包含する。
既知の修飾には、例を挙げると、アセチル化、アシル
化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、
環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結
合形成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホル
ミル化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩ
アンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、
ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタン
パク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。
かかる修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳
細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例
えば糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基の
ガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ
リボシル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-S
tructure and Molecular Properties、第2版、T.E.Crei
ghton、W.H.Freeman andCompany、ニューヨーク（199
3）に記載されている。例えば、Posttranslational Cov
alent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,
Posttranslational Protein Modifications：Perspecti
ve and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymo
l.182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synth
esis：Posttranslational Modifications and Aging，A
nn.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）で提供される論文
などの多くの詳細な論文が、本主題に利用できる。ポリ
ペプチドはいつも完全に直鎖であるとは限らないという
ことは周知であり、前記した通りであると理解されよ
う。例えばポリペプチドはユビキチン化の結果分岐して
いてもよく、一般には、天然のプロセッシング事象を含
む翻訳後の事象、および天然では起こらない人為的操作
によりもたらされる事象の結果、分岐のある、または分
岐のない環状にできる。環状、分岐および分岐した環状
ポリペプチドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、
および同様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペ
プチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキ
シル末端を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得
る。実際、共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミ
ノまたはカルボキシル基またはその両方の遮断は、天然
および合成ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に
本発明のポリペプチドにも存在し得る。例えば、イー・
コリ（E.coli.）または他の細胞で作られるポリペプチ
ドのアミノ末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシン
グの前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるで
あろう。ペプチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端で
メチオニン残基を除去できる。従って、本発明は、本発
明のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニン不含
の両方のアミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチ
ドに起こる修飾はしばしばそれの作り方に影響される。
例えば、宿主にクローン化遺伝子を発現することにより
作られるポリペプチドでは、修飾の特性および程度は、
大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチド
アミノ酸配列に存在する修飾シグナルにより決定され
る。例えば、周知のように、糖鎖形成はイー・コリのよ
うな細菌宿主では起こらないことがはしばしばである。
従って、糖鎖形成が望ましい場合、ポリペプチドを、糖
鎖形成宿主、一般に、真核細胞にて発現させるべきであ
る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後
糖鎖形成を行う；この理由で昆虫細胞発現系が、とりわ
け、糖鎖形成の本来のパターンを有する哺乳動物タンパ
ク質を効率よく発現するように開発されている。同様の
考察が他の修飾にも適用される。修飾の同一の型が、所
定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じまたは異な
る程度で存在し得ることは理解されよう。また、所定の
ポリペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。一
般に、本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」なる用
語は、全てのこのような修飾、特に宿主細胞においてポ
リヌクレオチドを発現することにより合成したポリペプ
チドに存在する修飾を包含する。
【００２２】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。（１）ヌクレオチド配列に
て他の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレ
オチド。一般に、違いは対照標準と変種のヌクレオチド
配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同
一であるものに限られる。以下に記すように、変種にお
けるヌクレオチドの配列の変化はサイレントであっても
よい。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコ
ードされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型
のサイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準
と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。（２）アミノ酸配列にて他の対照標準のポリペ
プチドと異なるポリペプチド。一般に、違いは対照標準
と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領
域で同一であるものに限られる。変種および対照標準の
ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じてい
てもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていてもよ
い。
またはポリペプチドの「変種（複数でも可）」なる用語
は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであ
る。この意味の変種は、本明細書の以下およびその他の
部分でより詳細に記載する。（１）ヌクレオチド配列に
て他の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレ
オチド。一般に、違いは対照標準と変種のヌクレオチド
配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同
一であるものに限られる。以下に記すように、変種にお
けるヌクレオチドの配列の変化はサイレントであっても
よい。すなわち、その変化がポリヌクレオチドによりコ
ードされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型
のサイレント変化に限定される場合、変種は、対照標準
と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよ
い。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよ
うに、対照標準配列によりコードされるポリペプチドに
おけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をも
たらす。（２）アミノ酸配列にて他の対照標準のポリペ
プチドと異なるポリペプチド。一般に、違いは対照標準
と変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領
域で同一であるものに限られる。変種および対照標準の
ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じてい
てもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていてもよ
い。
【００２３】本発明は、とりわけ、以下により詳細に記
載する、新規ｌｅｐポリペプチドおよびそれをコードす
るポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、sp／P4
1027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I（SPASE I）（LE
A...‐1 147 5.3 e−38 4）ポリペプチドに対するアミ
ノ酸配列相同性により関連付けられる、ストレプトコッ
カス・ニューモニエの新規ｌｅｐ遺伝子のポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、各
々、図１および図２に示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するｌｅｐ、ならびに本明細書において「寄託
菌株」または「寄託菌株のＤＮＡ」と称するＮＣＩＭＢ
受託番号４０７９４中のＤＮＡのｌｅｐヌクレオチドお
よびアミノ酸配列に関する。図１（配列番号１）および
図２（配列番号２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列は、寄託菌株のＤＮＡを配列決定することにより得
られたことは理解されよう。従って、寄託菌株のｌｅｐ
の配列が、その配列（およびそれをコードする配列）と
図１（配列番号１）および図２（配列番号２）の配列の
間のいずれの不一致についても調節するものである。
載する、新規ｌｅｐポリペプチドおよびそれをコードす
るポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、sp／P4
1027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I（SPASE I）（LE
A...‐1 147 5.3 e−38 4）ポリペプチドに対するアミ
ノ酸配列相同性により関連付けられる、ストレプトコッ
カス・ニューモニエの新規ｌｅｐ遺伝子のポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、各
々、図１および図２に示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するｌｅｐ、ならびに本明細書において「寄託
菌株」または「寄託菌株のＤＮＡ」と称するＮＣＩＭＢ
受託番号４０７９４中のＤＮＡのｌｅｐヌクレオチドお
よびアミノ酸配列に関する。図１（配列番号１）および
図２（配列番号２）に示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列は、寄託菌株のＤＮＡを配列決定することにより得
られたことは理解されよう。従って、寄託菌株のｌｅｐ
の配列が、その配列（およびそれをコードする配列）と
図１（配列番号１）および図２（配列番号２）の配列の
間のいずれの不一致についても調節するものである。
【００２４】特に、実験室条件および宿主感染条件下で
の生存性に適用すると、その技法は細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに利用できる。それ自体生存
に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持
に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用
いることができる。これらの方法の一つにより配列の発
現を同定するで、その機能についてのさらなる情報が得
られ、かかる配列をスクリーニングの標的としてさらに
開発するための選別が可能となる。簡単には、これらの
研究は例えば：
の生存性に適用すると、その技法は細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに利用できる。それ自体生存
に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持
に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用
いることができる。これらの方法の一つにより配列の発
現を同定するで、その機能についてのさらなる情報が得
られ、かかる配列をスクリーニングの標的としてさらに
開発するための選別が可能となる。簡単には、これらの
研究は例えば：
【００２５】１）シグナチャータグ化突然変異法（Sign
ature Tagged Mutagenesis：STM） この技法は、Henselら、Science269:400-403（1995）に
記載されており、その内容を出典明示により本明細書の
一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発は、所定
感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を
同定するものである。この技法は、種々の手段（例えば
トランスポゾン）により、標的生物にランダムに突然変
異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非
常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体
および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタグ
は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション
分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感
染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により表
される。ストレプトコッカス・ニューモニエにおいて
は、トランスポゾンシステムはあまり開発されていない
ので、タグ化突然変異体を作るより有効な方法は、その
内容を出典明示により本明細書の一部とする、Morrison
ら、J.Bacteriol.159:870（1984）に記載される挿入-複
製突然変異法を用いることである。
ature Tagged Mutagenesis：STM） この技法は、Henselら、Science269:400-403（1995）に
記載されており、その内容を出典明示により本明細書の
一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発は、所定
感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を
同定するものである。この技法は、種々の手段（例えば
トランスポゾン）により、標的生物にランダムに突然変
異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非
常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体
および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタグ
は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション
分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感
染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により表
される。ストレプトコッカス・ニューモニエにおいて
は、トランスポゾンシステムはあまり開発されていない
ので、タグ化突然変異体を作るより有効な方法は、その
内容を出典明示により本明細書の一部とする、Morrison
ら、J.Bacteriol.159:870（1984）に記載される挿入-複
製突然変異法を用いることである。
【００２６】２）インビボ発現法（In Vivo Expression
Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA．91:
2634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents
and Diseases 2:263-268（1994）に記載されており、各
々の内容を出典明示により本明細書の一部とする。IVET
は、実験培養と比較した場合、感染において重要な役割
を有する、感染中にアップレギュレーションする遺伝子
を同定する。この技法により同定される配列は感染の確
立／維持に重要な役割を有する。この技法では、標的生
物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベク
ターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクロ
ーン化される。プールを宿主に導入し、感染後の種々の
時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存在を評
価できる。発現したリポーター遺伝子の上流に担持され
る染色体フラグメントは、感染中に正常なアップレギュ
レーションをうけるプロモーターまたは遺伝子部分を担
持するはずである。組換え酵素遺伝子の上流を配列決定
すると、アップレギュレーションされた遺伝子を同定で
きる。
Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA．91:
2634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents
and Diseases 2:263-268（1994）に記載されており、各
々の内容を出典明示により本明細書の一部とする。IVET
は、実験培養と比較した場合、感染において重要な役割
を有する、感染中にアップレギュレーションする遺伝子
を同定する。この技法により同定される配列は感染の確
立／維持に重要な役割を有する。この技法では、標的生
物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベク
ターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクロ
ーン化される。プールを宿主に導入し、感染後の種々の
時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存在を評
価できる。発現したリポーター遺伝子の上流に担持され
る染色体フラグメントは、感染中に正常なアップレギュ
レーションをうけるプロモーターまたは遺伝子部分を担
持するはずである。組換え酵素遺伝子の上流を配列決定
すると、アップレギュレーションされた遺伝子を同定で
きる。
【００２７】３）特徴ディスプレイ この技法は、その内容を出典明示により本明細書の一部
とする、Chuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（199
3）に記載されている。この方法はランダムプライムＲ
Ｔ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することによ
り、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および感
染後のプロフィールを比較することにより、感染中にア
ップレギュレーションおよびダウンレギュレーションさ
れる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が配列決定
され、ライブラリー配列に適合させられる。
とする、Chuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（199
3）に記載されている。この方法はランダムプライムＲ
Ｔ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することによ
り、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および感
染後のプロフィールを比較することにより、感染中にア
ップレギュレーションおよびダウンレギュレーションさ
れる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が配列決定
され、ライブラリー配列に適合させられる。
【００２８】４）トランスポゾン突然変異誘発による条
件致死変異体の発生 この技法は、de Lorenzo，V.ら、Gene 123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene 125:69-73（1993）およびT
akiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に
記載されており(その内容を出典明示により本明細書の
一部とする）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニター観察には、フローサイトメトリー（細胞
分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化
学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反
応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等があ
る。
件致死変異体の発生 この技法は、de Lorenzo，V.ら、Gene 123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene 125:69-73（1993）およびT
akiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に
記載されており(その内容を出典明示により本明細書の
一部とする）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニター観察には、フローサイトメトリー（細胞
分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化
学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反
応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等があ
る。
【００２９】５）化学的突然変異法による条件致死突然
変異体の発生 この技法は、出典明示により本明細書の一部とする、Be
ckwith,J.Methods inEnzymology204:3-18（1991）に記
載されている。この技法では標的生物のランダム化学的
突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異な
る温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異な
る温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定の
ためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった
単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のよう
に、非許容温度での増殖における変化を正確にモニター
し、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生
物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補
し、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライ
ブラリー配列と適合させることができる。これらの技法
の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利で
あったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も
関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子
は感染に必須であると認識されているが、実際には感染
の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確
立された慢性の感染の治療のために開発された抗細菌物
質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。
変異体の発生 この技法は、出典明示により本明細書の一部とする、Be
ckwith,J.Methods inEnzymology204:3-18（1991）に記
載されている。この技法では標的生物のランダム化学的
突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異な
る温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異な
る温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定の
ためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった
単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のよう
に、非許容温度での増殖における変化を正確にモニター
し、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生
物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補
し、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライ
ブラリー配列と適合させることができる。これらの技法
の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利で
あったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も
関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子
は感染に必須であると認識されているが、実際には感染
の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確
立された慢性の感染の治療のために開発された抗細菌物
質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。
【００３０】６）ＲＴ−ＰＣＲ 細菌のメッセンジャーＲＮＡ、好ましくはストレプトコ
ッカス・ニューモニエのものを、細菌感染した組織、例
えば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダ
ムヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの
逆転写により、続いて遺伝子特異的プライマー対でのＰ
ＣＲにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られ
たＰＣＲ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在
および量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝
子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の種
々の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制
御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が
新規な抗菌物質をスクリーニングする標的に相当するこ
とが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライ
マーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製
物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解
されるべきである。これにより研究者は、感染組織から
簡単で迅速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間
しか生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種
を得ることができる。最適には、ＴＲＩゾール（ギブコ
−ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊する
ことにより、細菌性ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織から調
製し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指示に従って
プロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを
除去する。好ましくは、適宜標識した配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いてノーザンをプロービング
することにより検出されるようなスタフィロコッカス・
アウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスト
レプトコッカス・ニューモニエの１６ＳリボソームＲＮ
Ａの最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシン
グが最適化される。典型的には、最適には８から２５サ
イクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマ
ー対には５’色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成
物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanne
r（ＡＢＩ製）を用いて検出および定量する。本発明の
配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感染中
に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療に利用できる
阻害物質の同定が可能になる。
ッカス・ニューモニエのものを、細菌感染した組織、例
えば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダ
ムヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの
逆転写により、続いて遺伝子特異的プライマー対でのＰ
ＣＲにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られ
たＰＣＲ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在
および量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝
子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の種
々の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制
御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が
新規な抗菌物質をスクリーニングする標的に相当するこ
とが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライ
マーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製
物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解
されるべきである。これにより研究者は、感染組織から
簡単で迅速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間
しか生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種
を得ることができる。最適には、ＴＲＩゾール（ギブコ
−ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊する
ことにより、細菌性ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織から調
製し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指示に従って
プロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを
除去する。好ましくは、適宜標識した配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いてノーザンをプロービング
することにより検出されるようなスタフィロコッカス・
アウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスト
レプトコッカス・ニューモニエの１６ＳリボソームＲＮ
Ａの最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシン
グが最適化される。典型的には、最適には８から２５サ
イクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマ
ー対には５’色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成
物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanne
r（ＡＢＩ製）を用いて検出および定量する。本発明の
配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感染中
に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療に利用できる
阻害物質の同定が可能になる。
【００３１】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図２（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するｌｅｐポリペプチドをコードす
る単離ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で提供さ
れる遺伝子についての２種の異なるＧＴＧ初期コドン
（メチオニン）開始部位が得られる。図１（配列番号
１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提
供される情報を用いて、ｌｅｐポリペプチドをコードす
る本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニング
およびスクリーニングの手法、例えば、出発物質として
ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３から
の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列
決定し、つづいて完全長のクローンを得るための手法を
用いて得ることができる。例えば、図１（配列番号１）
に示す配列などの本発明の配列のポリヌクレオチドを得
るためには、典型的には、イー・コリまたはいくつかの
他の適当な宿主中のストレプトコッカス・ニューモニエ
０１００９９３の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーを、部分配列に由来する、好ましくは１７量体または
それ以上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドで
プローブする。ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有
するクローンは、非常にストリンジェントな洗浄操作に
付すことにより区別できる。元の配列から設計された配
列決定プライマーで同定された個々のクローンを配列決
定することにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝
子配列を決定することが可能である。都合よくは、かか
る配列決定をプラスミドクローンから調製された変性二
本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適当な技術については、
Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecul
ar Cloning，A Laboratory Manual，第２版；コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）；
（ハイブリダイゼーションによるスクリーニング1.９０
および変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参
照のこと）に記載されている。本発明の一例として、図
１（配列番号１）に示すポリヌクレオチドは、ストレプ
トコッカス・ニューモニエ０１００９９３に由来するＤ
ＮＡライブラリー中で見出したものである。
定アミノ酸配列を有するｌｅｐポリペプチドをコードす
る単離ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で提供さ
れる遺伝子についての２種の異なるＧＴＧ初期コドン
（メチオニン）開始部位が得られる。図１（配列番号
１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提
供される情報を用いて、ｌｅｐポリペプチドをコードす
る本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニング
およびスクリーニングの手法、例えば、出発物質として
ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３から
の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列
決定し、つづいて完全長のクローンを得るための手法を
用いて得ることができる。例えば、図１（配列番号１）
に示す配列などの本発明の配列のポリヌクレオチドを得
るためには、典型的には、イー・コリまたはいくつかの
他の適当な宿主中のストレプトコッカス・ニューモニエ
０１００９９３の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーを、部分配列に由来する、好ましくは１７量体または
それ以上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドで
プローブする。ついで、該プローブと同一のＤＮＡを有
するクローンは、非常にストリンジェントな洗浄操作に
付すことにより区別できる。元の配列から設計された配
列決定プライマーで同定された個々のクローンを配列決
定することにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺伝
子配列を決定することが可能である。都合よくは、かか
る配列決定をプラスミドクローンから調製された変性二
本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適当な技術については、
Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecul
ar Cloning，A Laboratory Manual，第２版；コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）；
（ハイブリダイゼーションによるスクリーニング1.９０
および変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参
照のこと）に記載されている。本発明の一例として、図
１（配列番号１）に示すポリヌクレオチドは、ストレプ
トコッカス・ニューモニエ０１００９９３に由来するＤ
ＮＡライブラリー中で見出したものである。
【００３２】寄託菌株のｌｅｐをコードするＤＮＡを配
列決定する結果わかるように、本発明の新規ｌｅｐは、
構造的に、リーダーペプチダーゼファミリーの他のタン
パク質に関連付けられる。こうして得られたＤＮＡ配列
を図１（配列番号１）に示す。これは、各々、当該分野
にて知られているアミノ酸残基の分子量を用いて計算す
ることのできる推定分子量を有する、図２（配列番号
２）に示すおよその数のアミノ酸残基を有するタンパク
質をコードするオープンリーディングフレームを有す
る。このタンパク質は、既知タンパク質の中でも、sp／
P41027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I（SPASE I）
（LEA...‐1 147 5.3 e−38 4）タンパク質に対して最
大の相同性を示す。図２（配列番号２）のｌｅｐは、sp
／P41027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I（SPASE I）
（LEA...‐1 147 5.3 e−38 4）のアミノ酸配列とその
全長にわたって約４８％の同一性およびその全長にわた
って約６５％の類似性を有する。
列決定する結果わかるように、本発明の新規ｌｅｐは、
構造的に、リーダーペプチダーゼファミリーの他のタン
パク質に関連付けられる。こうして得られたＤＮＡ配列
を図１（配列番号１）に示す。これは、各々、当該分野
にて知られているアミノ酸残基の分子量を用いて計算す
ることのできる推定分子量を有する、図２（配列番号
２）に示すおよその数のアミノ酸残基を有するタンパク
質をコードするオープンリーディングフレームを有す
る。このタンパク質は、既知タンパク質の中でも、sp／
P41027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I（SPASE I）
（LEA...‐1 147 5.3 e−38 4）タンパク質に対して最
大の相同性を示す。図２（配列番号２）のｌｅｐは、sp
／P41027／LEPC BACCL SIGNAL PEPTIDASE I（SPASE I）
（LEA...‐1 147 5.3 e−38 4）のアミノ酸配列とその
全長にわたって約４８％の同一性およびその全長にわた
って約６５％の類似性を有する。
【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、クローニン
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１（配列番号１）に示すポリヌクレオ
チドのコーディング配列と同一であってもよい。さら
に、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結果、、図
２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる配
列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセ
ンス鎖としても知られているコーディング鎖であっても
よく、またはアンチセンス鎖とも称される非コーディン
グ鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーデ
ィング配列は、図１（配列番号１）に示すポリヌクレオ
チドのコーディング配列と同一であってもよい。さら
に、それは、遺伝暗号の重複性（同義性）の結果、、図
２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる配
列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３４】図２（配列番号２）のポリペプチドをコー
ドする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド
のコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、プ
ロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌配
列をコードするコーディング配列；付加非コーディング
配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共にま
たはなしで、例えば、限定するものではないが、転写に
て役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止シ
グナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。かくして、例えば、該ポリペプチド
は、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどのマ
ーカー配列に融合していてもよい。本発明のこの態様の
ある具体例において、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジ
ンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キアゲ
ン・インコーポレーティッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得
られるタグであり、多くが市販により入手可能である。
例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-8
24（1989）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは
融合タンパク質の通常の精製法を提供する。インフルエ
ンザ・ヘマググルチニン・タンパク質由来のエピトープ
に対応する、ＨＡタグもまた融合タンパク質の生成に使
用でき、これについては例えばWilsonら、Cell，37：76
7（1984）に記載されている。本発明のポリヌクレオチ
ドはまた、構造遺伝子およびその自然に付随する遺伝的
エレメントからなるポリヌクレオチドを包含するが、こ
れに限定されるものではない。
ドする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド
のコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列および付加コーディング配列、例えばプレ、プ
ロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまたは分泌配
列をコードするコーディング配列；付加非コーディング
配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共にま
たはなしで、例えば、限定するものではないが、転写に
て役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止シ
グナルを含む）などの非コーディング配列５′および
３′配列、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメ
ント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ酸をコ
ードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列を包含するが、これらに限定され
るものではない。かくして、例えば、該ポリペプチド
は、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどのマ
ーカー配列に融合していてもよい。本発明のこの態様の
ある具体例において、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジ
ンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キアゲ
ン・インコーポレーティッド（Ｑiagen,Ｉnc.）より得
られるタグであり、多くが市販により入手可能である。
例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-8
24（1989）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは
融合タンパク質の通常の精製法を提供する。インフルエ
ンザ・ヘマググルチニン・タンパク質由来のエピトープ
に対応する、ＨＡタグもまた融合タンパク質の生成に使
用でき、これについては例えばWilsonら、Cell，37：76
7（1984）に記載されている。本発明のポリヌクレオチ
ドはまた、構造遺伝子およびその自然に付随する遺伝的
エレメントからなるポリヌクレオチドを包含するが、こ
れに限定されるものではない。
【００３５】前記によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する、ストレ
プトコッカス・ニューモニエｌｅｐのポリペプチドをコ
ードする配列を有するポリヌクレオチド包含する。この
用語は、さらにコーディングおよび／または非コーディ
ング配列を含有していてもよい、付加領域と共に該ポリ
ペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列また
はエディティング（editing）により分断される）を含
む、ポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図
２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードす
る、本明細書で前記したポリヌクレオチドの変種に関す
る。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変種
などの天然の変種であってもよく、または自然に発生す
ることが知られていない変種であってもよい。このよう
なポリヌクレオチドの非天然変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に適用される方法を含め、突然変異
誘発技術により作ることができる。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する、ストレ
プトコッカス・ニューモニエｌｅｐのポリペプチドをコ
ードする配列を有するポリヌクレオチド包含する。この
用語は、さらにコーディングおよび／または非コーディ
ング配列を含有していてもよい、付加領域と共に該ポリ
ペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列また
はエディティング（editing）により分断される）を含
む、ポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図
２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードす
る、本明細書で前記したポリヌクレオチドの変種に関す
る。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変種
などの天然の変種であってもよく、または自然に発生す
ることが知られていない変種であってもよい。このよう
なポリヌクレオチドの非天然変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に適用される方法を含め、突然変異
誘発技術により作ることができる。
【００３６】この点における変種には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換、欠失または付加は１またはそ
れ以上のヌクレオチドに起こる。変種はコーディングも
しくは非コーディング領域またはその両方において変化
していてもよい。コーディング領域における変化が保存
的または非保存的アミノ酸置換、欠損または付加を生成
するかもしれない。この点に関する本発明の特に好まし
い具体例には、図２（配列番号２）に示すｌｅｐのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド；それらの変種、アナログ、誘導体およびフラグ
メントならびに変種、アナログおよび誘導体のフラグメ
ントがある。この点において、さらに特に好ましくは、
図２（配列番号２）のｌｅｐポリペプチドで、そのう
ち、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、
１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有す
る、ｌｅｐ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および欠
失であり、ｌｅｐの特性および活性を変えないものであ
る。また、この点に関してとりわけ好ましいものは、保
存的置換である。最も好ましいものは、置換されていな
い、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドである。
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換、欠失または付加は１またはそ
れ以上のヌクレオチドに起こる。変種はコーディングも
しくは非コーディング領域またはその両方において変化
していてもよい。コーディング領域における変化が保存
的または非保存的アミノ酸置換、欠損または付加を生成
するかもしれない。この点に関する本発明の特に好まし
い具体例には、図２（配列番号２）に示すｌｅｐのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド；それらの変種、アナログ、誘導体およびフラグ
メントならびに変種、アナログおよび誘導体のフラグメ
ントがある。この点において、さらに特に好ましくは、
図２（配列番号２）のｌｅｐポリペプチドで、そのう
ち、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、
１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有す
る、ｌｅｐ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および欠
失であり、ｌｅｐの特性および活性を変えないものであ
る。また、この点に関してとりわけ好ましいものは、保
存的置換である。最も好ましいものは、置換されていな
い、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３７】本発明のさらに好ましい態様は、図２（配
列番号２）に示すアミノ酸配列を有するｌｅｐポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわた
って少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、および
かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドで
ある。また、寄託菌株のストレプトコッカス・ニューモ
ニエＤＮＡのｌｅｐポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して全長にわたって少なくとも８０％同一
である領域を有するポリヌクレオチド、およびそれらに
相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。この点にお
いて、その同じものに対して全長にわたって少なくとも
９０％の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好
ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有するもの
が特に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性
を有するものの中でも少なくとも９７％であるのがより
好ましく、その中でも少なくとも９８％および少なくと
も９９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９
９％であるのがより好ましい。
列番号２）に示すアミノ酸配列を有するｌｅｐポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわた
って少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、および
かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドで
ある。また、寄託菌株のストレプトコッカス・ニューモ
ニエＤＮＡのｌｅｐポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して全長にわたって少なくとも８０％同一
である領域を有するポリヌクレオチド、およびそれらに
相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。この点にお
いて、その同じものに対して全長にわたって少なくとも
９０％の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好
ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有するもの
が特に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性
を有するものの中でも少なくとも９７％であるのがより
好ましく、その中でも少なくとも９８％および少なくと
も９９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９
９％であるのがより好ましい。
【００３８】本発明のさらに好ましい具体例は、図１
（配列番号１）に示されるコード配列の補体ならびにフ
ランキングヌクレオチド配列からなる図３（配列番号
３）に示されるポリヌクレオチド配列である。この点に
関して好ましい具体例は、さらには、図１（配列番号
１）のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実
質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明は
さらに本明細書で前記した配列にハイブリダイゼーショ
ンするポリヌクレオチドに関する。この点において、本
発明は、特に、ストリンジェントな条件下で本明細書で
前記したポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションす
るポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる「スト
リンジェントな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーシ
ョンが配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくと
も９７％の同一性がある場合にのみ起こることを意味す
る。
（配列番号１）に示されるコード配列の補体ならびにフ
ランキングヌクレオチド配列からなる図３（配列番号
３）に示されるポリヌクレオチド配列である。この点に
関して好ましい具体例は、さらには、図１（配列番号
１）のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実
質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明は
さらに本明細書で前記した配列にハイブリダイゼーショ
ンするポリヌクレオチドに関する。この点において、本
発明は、特に、ストリンジェントな条件下で本明細書で
前記したポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションす
るポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる「スト
リンジェントな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーシ
ョンが配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくと
も９７％の同一性がある場合にのみ起こることを意味す
る。
【００３９】本発明のポリヌクレオチドアッセイについ
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、ｌｅｐをコードする完全長ｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離し、ならびにｌｅｐ遺伝子に対し
て高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができる。かかるプロ
ーブは、一般に、少なくとも１５塩基を有してなる。好
ましくは、かかるプローブは少なくとも３０塩基からな
り、少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好ましい
プローブは少なくとも３０塩基を有し、５０以下の塩基
を有する。例えば、ｌｅｐ遺伝子のコーディング領域
は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴ
ヌクレオチドプローブを合成することにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有
する標識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニン
グし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブ
リダイズするかを決定する。
て本明細書でさらに説明するように、例えば、前記した
ように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、ｌｅｐをコードする完全長ｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離し、ならびにｌｅｐ遺伝子に対し
て高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができる。かかるプロ
ーブは、一般に、少なくとも１５塩基を有してなる。好
ましくは、かかるプローブは少なくとも３０塩基からな
り、少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好ましい
プローブは少なくとも３０塩基を有し、５０以下の塩基
を有する。例えば、ｌｅｐ遺伝子のコーディング領域
は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴ
ヌクレオチドプローブを合成することにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有
する標識オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニン
グし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブ
リダイズするかを決定する。
【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列番号３および４を含め、配列
番号１または２の配列より誘導される、オリゴヌクレオ
チドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書にお
いて同定されたストレプトコッカス・ニューモニエ遺伝
子が、全体としてまたは部分的に、感染組織にて転写さ
れるかどうかを決定するために、本明細書にて記載した
方法、好ましくはＰＣＲにて使用できる。かかる配列は
また、病因が達した感染の段階および型の診断にも有用
であると思われる。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク
質に、さらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ
酸が加わるか、またはその内部にアミノ酸が加わった
（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する
場合）ポリペプチドをコードできる。かかる配列は前駆
体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにおい
て役割を有し、タンパク質を運び、タンパク質の半減期
を長くしたり短くしたり、またはとりわけアッセイもし
くは生成のためのタンパク質の操作を容易にすることが
できる。インビボで一般的なように、付加アミノ酸は、
細胞酵素により成熟タンパク質からプロセッシングで取
り除かれる。
チドは、さらにはポリヌクレオチドアッセイに関連して
本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患
の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材
料として使用できる。配列番号３および４を含め、配列
番号１または２の配列より誘導される、オリゴヌクレオ
チドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書にお
いて同定されたストレプトコッカス・ニューモニエ遺伝
子が、全体としてまたは部分的に、感染組織にて転写さ
れるかどうかを決定するために、本明細書にて記載した
方法、好ましくはＰＣＲにて使用できる。かかる配列は
また、病因が達した感染の段階および型の診断にも有用
であると思われる。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク
質に、さらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ
酸が加わるか、またはその内部にアミノ酸が加わった
（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する
場合）ポリペプチドをコードできる。かかる配列は前駆
体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにおい
て役割を有し、タンパク質を運び、タンパク質の半減期
を長くしたり短くしたり、またはとりわけアッセイもし
くは生成のためのタンパク質の操作を容易にすることが
できる。インビボで一般的なように、付加アミノ酸は、
細胞酵素により成熟タンパク質からプロセッシングで取
り除かれる。
【００４１】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去されると、このような不活性前駆体は一般に活性化さ
れる。プロ配列のいくつかまたは全てを、活性化の前に
除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタン
パク質と称される。総じて、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
【００４２】寄託材料 寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関する
ブダペスト条約の条件下で行われている。特許が発行さ
れると何らの制限または条件もなく、最終的には株は分
譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、
寄託が実施可能要件であることを承認するものではな
い。ストレプトコッカス・ニューモニエｌｅｐ菌株を含
む寄託菌は、ナショナル・コレクション・オブ・インダ
ストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
（ＮＣＩＭＢ）、スコットランド、アバディーンＡＢ２
１ＲＹ、マーカー・ドライブ２３ストリートに１９９
６年４月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７
９４を付された。そのストレプトコッカス・ニューモニ
エ菌株寄託菌を、以下、「寄託菌株」または「寄託菌株
のＤＮＡ」と称する。寄託材料は、寄託により「ＮＣＩ
ＭＢ４０７９４」と称される、完全長ｌｅｐＤＮＡを含
有する菌株である。寄託材料に含まれるｌｅｐポリヌク
レオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列の記載と矛
盾する事象を調節するものである。寄託材料を製造、使
用または販売するためにはライセンスが必要であるが、
そのようなライセンスはここで付与されるものではな
い。
ブダペスト条約の条件下で行われている。特許が発行さ
れると何らの制限または条件もなく、最終的には株は分
譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、
寄託が実施可能要件であることを承認するものではな
い。ストレプトコッカス・ニューモニエｌｅｐ菌株を含
む寄託菌は、ナショナル・コレクション・オブ・インダ
ストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
（ＮＣＩＭＢ）、スコットランド、アバディーンＡＢ２
１ＲＹ、マーカー・ドライブ２３ストリートに１９９
６年４月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７
９４を付された。そのストレプトコッカス・ニューモニ
エ菌株寄託菌を、以下、「寄託菌株」または「寄託菌株
のＤＮＡ」と称する。寄託材料は、寄託により「ＮＣＩ
ＭＢ４０７９４」と称される、完全長ｌｅｐＤＮＡを含
有する菌株である。寄託材料に含まれるｌｅｐポリヌク
レオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列の記載と矛
盾する事象を調節するものである。寄託材料を製造、使
用または販売するためにはライセンスが必要であるが、
そのようなライセンスはここで付与されるものではな
い。
【００４３】ポリペプチド 本発明はさらには、図２（配列番号２）に示されるよう
な長さが２０４アミノ酸の推定アミノ酸配列を有し、２
３４７１キロダルトンの推定分子量を有するｌｅｐポリ
ペプチドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチド
のフラグメント、アナログおよび誘導体にも関する。
「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる
用語は、図２（配列番号２）のポリペプチドをいう場
合、かかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能
または活性を保持するポリペプチドを意味する。従っ
て、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性成
熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク質
を包含する。
な長さが２０４アミノ酸の推定アミノ酸配列を有し、２
３４７１キロダルトンの推定分子量を有するｌｅｐポリ
ペプチドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチド
のフラグメント、アナログおよび誘導体にも関する。
「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる
用語は、図２（配列番号２）のポリペプチドをいう場
合、かかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能
または活性を保持するポリペプチドを意味する。従っ
て、アナログは、プロタンパク質部分を切断して活性成
熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク質
を包含する。
【００４４】図２（配列番号２）のポリペプチドのフラ
グメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１または
それ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸残
基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換されたも
ので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコード
されたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１
またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、ま
たは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば
ポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリエ
チレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）付
加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポ
リペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いら
れる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであっ
てもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログ
は、本明細書の教示より当業者に明らかであると考えら
れる。
グメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）１または
それ以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸残
基（好ましくは同類アミノ酸残基）により置換されたも
ので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコード
されたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１
またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、ま
たは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば
ポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えばポリエ
チレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）付
加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポ
リペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いら
れる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであっ
てもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログ
は、本明細書の教示より当業者に明らかであると考えら
れる。
【００４５】この点において、本発明の特に好ましい具
体例には、図２（配列番号２）のｌｅｐのアミノ酸配列
を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体お
よびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、ア
ナログおよび誘導体がある。また、この点において、本
発明の特に好ましい具体例は、ｌｅｐのアミノ酸配列を
有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およ
びフラグメント、およびそのフラグメントの変種、アナ
ログおよび誘導体である。好ましい変種には、保存的ア
ミノ酸置換により対照標準と異なる変種がある。かかる
置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似し
た別のアミノ酸で置換したものである。典型的には、保
存的置換として認められるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌ
ａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換
え；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性
残基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り替え、アミド残基Ａｓｎ
およびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒ
ｇの取り替えおよび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置
き換えである。
体例には、図２（配列番号２）のｌｅｐのアミノ酸配列
を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体お
よびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、ア
ナログおよび誘導体がある。また、この点において、本
発明の特に好ましい具体例は、ｌｅｐのアミノ酸配列を
有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およ
びフラグメント、およびそのフラグメントの変種、アナ
ログおよび誘導体である。好ましい変種には、保存的ア
ミノ酸置換により対照標準と異なる変種がある。かかる
置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似し
た別のアミノ酸で置換したものである。典型的には、保
存的置換として認められるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌ
ａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換
え；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性
残基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り替え、アミド残基Ａｓｎ
およびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒ
ｇの取り替えおよび芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置
き換えである。
【００４６】この点においてさらに好ましいのは、数
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図２（配列番号２）のｌｅｐポリペ
プチドのアミノ酸配列を有する、変種、アナログ、誘導
体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。これらの中でもとり
わけ好ましいのは、ｌｅｐの特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠失である。またこの
点において特に好ましいのは、保存的置換である。最も
好ましいのは、置換していない図２（配列番号２）のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供され
るのが好ましく、均質になるまで精製するのが好まし
い。
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１また
は０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠
失または付加した、図２（配列番号２）のｌｅｐポリペ
プチドのアミノ酸配列を有する、変種、アナログ、誘導
体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。これらの中でもとり
わけ好ましいのは、ｌｅｐの特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠失である。またこの
点において特に好ましいのは、保存的置換である。最も
好ましいのは、置換していない図２（配列番号２）のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供され
るのが好ましく、均質になるまで精製するのが好まし
い。
【００４７】本発明のポリペプチドは、図２（配列番号
２）のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに
図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも
７０％の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２
（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも８０
％の同一性、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポ
リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（さらに
好ましくは少なくとも９０％の同一性）、その上さらに
好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドに対して
少なくとも９５％の類似性（その上さらに好ましくは９
５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、また一
般に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少
なくとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのそ
のような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包
含する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部
分は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチ
ドを製造するのに用いることができる；従って、該フラ
グメントは完全長のポリペプチドを製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長の
ポリヌクレオチドを合成することができる。
２）のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに
図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも
７０％の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２
（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも８０
％の同一性、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポ
リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（さらに
好ましくは少なくとも９０％の同一性）、その上さらに
好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドに対して
少なくとも９５％の類似性（その上さらに好ましくは９
５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、また一
般に少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少
なくとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのそ
のような部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包
含する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部
分は、ペプチド合成により対応する完全長のポリペプチ
ドを製造するのに用いることができる；従って、該フラ
グメントは完全長のポリペプチドを製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長の
ポリヌクレオチドを合成することができる。
【００４８】フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、ｌｅｐの
フラグメント、特に図２（配列番号２）に示すアミノ酸
を有するｌｅｐのフラグメント、および図２（配列番号
２）のｌｅｐの変種および誘導体のフラグメントを有し
てなるポリペプチドがある。この点において、フラグメ
ントは前記のｌｅｐポリペプチドおよびその変種または
誘導体のアミノ酸配列が、全てではなく一部に対して全
く同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。
フラグメント、特に図２（配列番号２）に示すアミノ酸
を有するｌｅｐのフラグメント、および図２（配列番号
２）のｌｅｐの変種および誘導体のフラグメントを有し
てなるポリペプチドがある。この点において、フラグメ
ントは前記のｌｅｐポリペプチドおよびその変種または
誘導体のアミノ酸配列が、全てではなく一部に対して全
く同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。
【００４９】かかるフラグメントは、「自立してい
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、ｌｅｐのフラグメントのアミノ末端に融合した異型
のプレおよびプロポリペプチド領域、および該フラグメ
ントのカルボキシル末端に融合した付加領域を有し、宿
主中に発現するように設計された前駆体ポリペプチド内
に含まれる本発明のｌｅｐポリペプチドのフラグメント
に関する。従って、本明細書の意図するところの一の態
様におけるフラグメントは、ｌｅｐ由来の融合ポリペプ
チドまたは融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を
意味する。
る」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部
ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含ま
れる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連
続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしなが
ら、数個のフラグメントが単一の、より大きなポリペプ
チド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体例
は、ｌｅｐのフラグメントのアミノ末端に融合した異型
のプレおよびプロポリペプチド領域、および該フラグメ
ントのカルボキシル末端に融合した付加領域を有し、宿
主中に発現するように設計された前駆体ポリペプチド内
に含まれる本発明のｌｅｐポリペプチドのフラグメント
に関する。従って、本明細書の意図するところの一の態
様におけるフラグメントは、ｌｅｐ由来の融合ポリペプ
チドまたは融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を
意味する。
【００５０】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
例は、例えば、アミノ酸番号１−２０、２１−４０、４
１−６０，６１−８０、８１−１００、１０１−１２
０、１２１−１４０、１４１−１６０、１６１−１８
０、１８１−２０４からのフラグメント、およびこれら
のアミノ酸フラグメントの組み合わせを包含する。これ
に関連して、本明細書における「約」なる語は、特記し
た範囲から、その片方または両端で数個、わずかな、
５、４、３、２または１個のアミノ酸が多いかまたは少
ないものを包含する。
例は、例えば、アミノ酸番号１−２０、２１−４０、４
１−６０，６１−８０、８１−１００、１０１−１２
０、１２１−１４０、１４１−１６０、１６１−１８
０、１８１−２０４からのフラグメント、およびこれら
のアミノ酸フラグメントの組み合わせを包含する。これ
に関連して、本明細書における「約」なる語は、特記し
た範囲から、その片方または両端で数個、わずかな、
５、４、３、２または１個のアミノ酸が多いかまたは少
ないものを包含する。
【００５１】本発明の好ましいフラグメントは、例え
ば、ｌｅｐの切断ポリペプチドを包含する。切断ポリペ
プチドは、アミノ末端を含む一連の残基（すなわち、連
続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル末端を
含む一連の残基の欠失、または二重切断突然変異体のよ
うに一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシル末端
を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除けば、図２
のアミノ酸配列を有するｌｅｐポリペプチド、またはそ
の変種もしくは誘導体を包含する。前記した大きさの範
囲のフラグメントもまた切断フラグメントの好ましい具
体例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好まし
い。宿主細胞、特にストレプトコッカスにおける本発明
のポリヌクレオチドの減成形態もまた好ましい。
ば、ｌｅｐの切断ポリペプチドを包含する。切断ポリペ
プチドは、アミノ末端を含む一連の残基（すなわち、連
続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル末端を
含む一連の残基の欠失、または二重切断突然変異体のよ
うに一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシル末端
を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除けば、図２
のアミノ酸配列を有するｌｅｐポリペプチド、またはそ
の変種もしくは誘導体を包含する。前記した大きさの範
囲のフラグメントもまた切断フラグメントの好ましい具
体例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好まし
い。宿主細胞、特にストレプトコッカスにおける本発明
のポリヌクレオチドの減成形態もまた好ましい。
【００５２】また本発明のこの態様にて、ｌｅｐの構造
的または機能的属性により特徴づけられるフラグメント
も好ましい。この点において本発明の好ましい具体例
は、ｌｅｐのアルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形
成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコ
イル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親媒
性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界面形成領
域、基質結合領域および高抗原指数領域からなるフラグ
メントおよびかかるフラグメントの組み合わせを包含す
る。
的または機能的属性により特徴づけられるフラグメント
も好ましい。この点において本発明の好ましい具体例
は、ｌｅｐのアルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形
成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコ
イル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親媒
性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、界面形成領
域、基質結合領域および高抗原指数領域からなるフラグ
メントおよびかかるフラグメントの組み合わせを包含す
る。
【００５３】さらに好ましい領域は、ｌｅｐの活性を媒
介する領域である。この点において、類似活性もしくは
改善された活性を有するもの、または望ましくない活性
を減じたフラグメントを含め、ｌｅｐの化学的、生物学
的またはその他の活性を有するフラグメントが最も好ま
しい。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメント
は、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的である
フラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌ
クレオチドに関する。この点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記するような、好ましいフラグメント
に対応するポリヌクレオチドである。
介する領域である。この点において、類似活性もしくは
改善された活性を有するもの、または望ましくない活性
を減じたフラグメントを含め、ｌｅｐの化学的、生物学
的またはその他の活性を有するフラグメントが最も好ま
しい。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメント
は、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的である
フラグメントである。本発明はまた、とりわけ、前記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌ
クレオチドに関する。この点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記するような、好ましいフラグメント
に対応するポリヌクレオチドである。
【００５４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは複数の
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
ポリヌクレオチドを有してなるベクター、本発明のベク
ターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術によ
る本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞
は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本
発明のポリペプチドを発現することができる。ポリヌク
レオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ
ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法に
より行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験
室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methodsin Mol
ecular Biology，（1986）およびSambrookら、Molecula
r Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記
載されている。
【００５５】宿主細胞内のポリヌクレオチド構築物を従
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
来の方法に用いて、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。また、本発明のポリペ
プチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現させ
ることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮ
Ａ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を
製造することもできる。原核および真核生物宿主で用い
る適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
【００５６】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および／または数字が続
くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プ
ラスミドは、市販されているか、汎用されているか、ま
たは周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプ
ラスミドより構築することができる。本発明に従って用
いることのできる、多くのプラスミドおよび他のクロー
ニングおよび発現ベクターが周知であり、当業者であれ
ば容易に利用することもできる。
【００５７】ある点において中でも好ましいベクター
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点における特定の好ましい具体例では、ベク
ターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘
導可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発
現するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発
現であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好
ましいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が
容易である環境因子により発現を誘導できるベクターで
ある。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核
および真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現
ベクターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されて
いる。
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、
宿主における発現に有効なシス作用調節領域を有してな
る。適当なトランス作用因子は宿主により供給される
か、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。この点における特定の好ましい具体例では、ベク
ターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘
導可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発
現するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発
現であってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好
ましいベクターは、温度および栄養添加物などの操作が
容易である環境因子により発現を誘導できるベクターで
ある。本発明のこの態様に適当な種々ベクターは、原核
および真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現
ベクターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されて
いる。
【００５８】非常に多くの種類の発現ベクターを用い
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポ
ックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイル
ス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよ
びファージミド（phagemids）のプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント由来のベクターのごと
き、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本
発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。一
般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌク
レオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ
のベクターも、この点における発現に使用できる。
【００５９】適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始コドン、例えばＡ
ＵＧまたはＧＵＧ、そして翻訳されるべきポリペプチド
の終末部分に適当に位置する終止コドンを含む。
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、
適当な発現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、
ｍＲＮＡ転写を指令する。かかるプロモーターの代表例
としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これに限定され
ない。一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を
含み、転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコー
ディング部分は、開始部分に翻訳開始コドン、例えばＡ
ＵＧまたはＧＵＧ、そして翻訳されるべきポリペプチド
の終末部分に適当に位置する終止コドンを含む。
【００６０】加えて、構築物は、発現を制御および誘起
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばストレプトコッカス（レンサ球菌）、スタフィロコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス細胞；真菌細
胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳf９
細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨeＬa、Ｃ１
２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェス（Bow
s）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節する
ことにより機能するであろう。伸長および発現のための
ベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅領
域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Labor
atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を
有するであろう。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例
えばストレプトコッカス（レンサ球菌）、スタフィロコ
ッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレ
プトマイセスおよびバシラス・サチリス細胞；真菌細
胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳf９
細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨeＬa、Ｃ１
２７、３T３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェス（Bow
s）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。
【００６１】市販されている以下のベクターを例示とし
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Ｓtratagene）
より入手可能なｐＢＳベクター、ファージェスクリプト
（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescr
ipt）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐharm
acia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ま
しい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能な
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがあ
る。これらのベクターは単に多くの市販されている周知
のベクターを例示するために列挙してあるにすぎず、本
発明のこの態様に従って使用するのに、当業者に入手可
能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した他のプラスミドまたはベクター
が、本発明のこの態様において使用できることは理解さ
れよう。
【００６２】制限部位または候補プロモーター（candid
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有するかもしれないフラグメントを導入するための部位
の下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユ
ニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベク
ターを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモータ
ー領域を選択することができる。周知のように、プロモ
ター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位
でベクターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こ
し、その活性は標準的なＣＡＴアッセイにより検出でき
る。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に
適するベクターが周知であり、容易に入手可能である。
本発明のポリヌクレオチドを発現するためのプロモータ
ーには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら
ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に
得ることができるプロモーターもある。
【００６３】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発
現遺伝子に由来し、下流の構造配列の転写を指令するプ
ロモーターおよびベクターに暴露した後の細胞を含有す
るベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含
む。
【００６４】本発明のポリペプチドの異種構造配列をコ
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するコドン、例えばＡＵＧまたはＧ
ＵＧの５′にある。一般に、開始コドン、通常ＡＵＧで
始まり、リボソーム結合部位および開始ＡＵＧの間にあ
る、オープンリーディングフレームは他にない。また、
一般に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンがあり、
真核生物宿主で用いられる構築物中に、ポリアデニル化
シグナルがあるであろう。転写領域の３′末端に適宜配
置される転写終止シグナルはまた、ポリヌクレオチド構
築物に含まれていてもよい。
ードする本発明のポリヌクレオチドを、一般に、標準法
を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能
的に連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５′にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリペ
プチドの翻訳を開始するコドン、例えばＡＵＧまたはＧ
ＵＧの５′にある。一般に、開始コドン、通常ＡＵＧで
始まり、リボソーム結合部位および開始ＡＵＧの間にあ
る、オープンリーディングフレームは他にない。また、
一般に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンがあり、
真核生物宿主で用いられる構築物中に、ポリアデニル化
シグナルがあるであろう。転写領域の３′末端に適宜配
置される転写終止シグナルはまた、ポリヌクレオチド構
築物に含まれていてもよい。
【００６５】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加し、精製中またはその後の操
作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性
を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプ
チドに領域を付加することもできる。かかる領域はポリ
ペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部
分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出
を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にする
のは、当該分野でよくあることであり、慣用される技術
である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可
溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来す
る異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫
グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパ
ク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示す
る。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処
理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分
と融合させ、アンタゴニストを同定することができる。
D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8
巻：52-58（1995）およびK.Johansonら、TheJournal of
Biological Chemistry，270巻（16)：9459-9471（199
5）を参照のこと。
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
が発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに内在性であってもよ
く、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチド
は、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発
現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機
能性領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加し、精製中またはその後の操
作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続性
を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプ
チドに領域を付加することもできる。かかる領域はポリ
ペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド部
分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出
を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にする
のは、当該分野でよくあることであり、慣用される技術
である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを可
溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来す
る異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫
グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパ
ク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示す
る。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高処
理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分
と融合させ、アンタゴニストを同定することができる。
D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8
巻：52-58（1995）およびK.Johansonら、TheJournal of
Biological Chemistry，270巻（16)：9459-9471（199
5）を参照のこと。
【００６６】ついで、典型的には、細胞を遠心分離によ
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’非転写配列を有して
いてもよい。新規ｌｅｐポリペプチドは、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを含む、周知方法により、組換え細胞培養物から回
収かつ精製できる。最も好ましくは、高性能液体クロマ
トグラフィーを精製に用いる。ポリペプチドが単離およ
び／または精製中に変性する場合、再び活性なコンホメ
ーションを得るために、タンパク質を再生するための周
知の技術を用いることができる。
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使
用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に
周知である。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’非転写配列を有して
いてもよい。新規ｌｅｐポリペプチドは、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを含む、周知方法により、組換え細胞培養物から回
収かつ精製できる。最も好ましくは、高性能液体クロマ
トグラフィーを精製に用いる。ポリペプチドが単離およ
び／または精製中に変性する場合、再び活性なコンホメ
ーションを得るために、タンパク質を再生するための周
知の技術を用いることができる。
【００６７】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのｌｅｐポリヌクレオチドの使
用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、特にヒトにお
いてｌｅｐを検出することにより、疾患の診断方法が得
られるであろう。ｌｅｐ遺伝子を有する生物に感染した
真核生物（本明細書において「個体」とも称する）、特
に哺乳動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡま
たはＲＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は感染し
た個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨
および皮膚から入手できる。ゲノムＤＮＡは検出に直接
使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いて酵素的
に増幅させてもよい（Saikiら、Nature 324：163-166
（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に用いる
ことができる。一例として、ｌｅｐをコードする核酸に
相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ｌｅｐの存在およ
び／または発現を同定および分析できる。ＰＣＲを用い
て、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する原核
生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特
徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺伝子型と比
較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および挿入を
検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射性標識
したｌｅｐ ＲＮＡに、また別法として放射性標識した
ｌｅｐアンチセンス ＤＮＡにハイブリダイゼーション
することにより同定できる。完全に対合する配列は、Ｒ
ＮaseＡ消化により、または融解温度の差異により、誤
対合二重らせんと区別できる。
レオチドを検出するためのｌｅｐポリヌクレオチドの使
用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、特にヒトにお
いてｌｅｐを検出することにより、疾患の診断方法が得
られるであろう。ｌｅｐ遺伝子を有する生物に感染した
真核生物（本明細書において「個体」とも称する）、特
に哺乳動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡま
たはＲＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は感染し
た個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨
および皮膚から入手できる。ゲノムＤＮＡは検出に直接
使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いて酵素的
に増幅させてもよい（Saikiら、Nature 324：163-166
（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に用いる
ことができる。一例として、ｌｅｐをコードする核酸に
相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ｌｅｐの存在およ
び／または発現を同定および分析できる。ＰＣＲを用い
て、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する原核
生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特
徴づけできる。例えば、対照標準の配列の遺伝子型と比
較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および挿入を
検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射性標識
したｌｅｐ ＲＮＡに、また別法として放射性標識した
ｌｅｐアンチセンス ＤＮＡにハイブリダイゼーション
することにより同定できる。完全に対合する配列は、Ｒ
ＮaseＡ消化により、または融解温度の差異により、誤
対合二重らせんと区別できる。
【００６８】対照標準の遺伝子および突然変異を有する
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的特徴付け
は、変性剤を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡフラグ
メントの電気泳動度の変化を検出することにより達成で
きる。小さな配列の欠失および挿入は高分解ゲル電気泳
動により可視化できる。種々の配列のDNAフラグメント
は、その個々の融解または部分的融解温度によって、種
々のＤＮＡフラグメントの移動度がゲル中の異なる位置
で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲル上にて区別できる
（例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照）。
遺伝子間の配列の違いはまた、直接的ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。加えて、クローン化Ｄ
ＮＡセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するた
めのプローブとして用いることができる。かかる方法の
感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することに
より、非常に増強させることができる。例えば、配列決
定プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲに
より生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、
放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、
または蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うこと
ができる。ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的特徴付け
は、変性剤を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡフラグ
メントの電気泳動度の変化を検出することにより達成で
きる。小さな配列の欠失および挿入は高分解ゲル電気泳
動により可視化できる。種々の配列のDNAフラグメント
は、その個々の融解または部分的融解温度によって、種
々のＤＮＡフラグメントの移動度がゲル中の異なる位置
で遅れる、変性ホルムアミド勾配ゲル上にて区別できる
（例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照）。
【００６９】特異的な位置での配列の変化はまた、ＲＮ
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティ
ングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
aseおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイま
たは化学的切断法によって明らかにすることができる
（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:43
97-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＲＮase保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決
定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長
多形性（restriction fragment length polymorphism
「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティ
ングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき
る。従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加
えて、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ anal
ysis）により検出することもできる。
【００７０】本発明の遺伝子の突然変異または多形型を
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、DNAレベルで検出することもできる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを突然変異を検出するのに使用で
きる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、ＧeneＳcanなどの自動
検出系と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−Ｐ
ＣＲに用いることができる。これらのプライマーは個体
由来のサンプルから単離したｌｅｐ ＤＮＡを増幅させ
るのに用いることができる。本発明はまた、これらのプ
ライマーの５′および／または３′末端から除去した
１、２、３または４個のヌクレオチドを有するプライマ
ーも提供する。該プライマーを用いて個体から単離した
遺伝子を増幅し、ついでその遺伝子をDNA配列を明らか
にするための種々の技法に供してもよい。このようにし
て、ＤＮＡ配列における突然変異を診断してもよい。
有する細胞をまた、例えば、抗原型決定を可能とする種
々の技法により、DNAレベルで検出することもできる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを突然変異を検出するのに使用で
きる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、ＧeneＳcanなどの自動
検出系と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−Ｐ
ＣＲに用いることができる。これらのプライマーは個体
由来のサンプルから単離したｌｅｐ ＤＮＡを増幅させ
るのに用いることができる。本発明はまた、これらのプ
ライマーの５′および／または３′末端から除去した
１、２、３または４個のヌクレオチドを有するプライマ
ーも提供する。該プライマーを用いて個体から単離した
遺伝子を増幅し、ついでその遺伝子をDNA配列を明らか
にするための種々の技法に供してもよい。このようにし
て、ＤＮＡ配列における突然変異を診断してもよい。
【００７１】本発明は、疾患、好ましくは細菌感染、さ
らに好ましくはストレプトコッカス・ニューモニエ感
染、最も好ましくは中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄
膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊
髄液の感染のような髄膜炎を診断する方法であって、個
体から由来のサンプルより、図１（配列番号１）の配列
を有するポリヌクレオチドの発現レベルの増加を測定す
ることからなる方法を提供する。ｌｅｐポリヌクレオチ
ドの発現の増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒ
Ｎase保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブ
リダイゼーションなどのポリヌクレオチドの定量につい
て当該分野にて周知の方法を用いて測定することができ
る。
らに好ましくはストレプトコッカス・ニューモニエ感
染、最も好ましくは中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄
膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊
髄液の感染のような髄膜炎を診断する方法であって、個
体から由来のサンプルより、図１（配列番号１）の配列
を有するポリヌクレオチドの発現レベルの増加を測定す
ることからなる方法を提供する。ｌｅｐポリヌクレオチ
ドの発現の増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒ
Ｎase保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブ
リダイゼーションなどのポリヌクレオチドの定量につい
て当該分野にて周知の方法を用いて測定することができ
る。
【００７２】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、
細胞および組織中のｌｅｐタンパク質のレベルを検出す
るための定量および診断アッセイなどの診断アッセイに
関する。このように、例えば、正常な対照標準の組織サ
ンプルと比較し、ｌｅｐタンパク質の過剰発現を検出す
ることについて本発明に係る診断アッセイを用いて、感
染の存在を検出することができる。宿主由来のサンプル
中のｌｅｐタンパク質のレベルを測定するために用いる
ことができるアッセイ技法は当業者に周知である。かか
るアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合ア
ッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッ
セイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬ
ＩＳＡアッセイではまず、ｌｅｐに特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製する。加えて、一般
に、モノクローナル抗体に結合するリポーター抗体が調
製される。リポーター抗体は放射活性、蛍光または酵素
試薬、この例においては西洋ワサビペルオキシダーゼな
どの検出可能な試薬に結合する。
細胞および組織中のｌｅｐタンパク質のレベルを検出す
るための定量および診断アッセイなどの診断アッセイに
関する。このように、例えば、正常な対照標準の組織サ
ンプルと比較し、ｌｅｐタンパク質の過剰発現を検出す
ることについて本発明に係る診断アッセイを用いて、感
染の存在を検出することができる。宿主由来のサンプル
中のｌｅｐタンパク質のレベルを測定するために用いる
ことができるアッセイ技法は当業者に周知である。かか
るアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合ア
ッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッ
セイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬ
ＩＳＡアッセイではまず、ｌｅｐに特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製する。加えて、一般
に、モノクローナル抗体に結合するリポーター抗体が調
製される。リポーター抗体は放射活性、蛍光または酵素
試薬、この例においては西洋ワサビペルオキシダーゼな
どの検出可能な試薬に結合する。
【００７３】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにｌｅｐフラグメントまたはｌｅｐ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにｌｅｐフラグメントまたはｌｅｐ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全
体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリ
ペプチドを単離することができる。
【００７４】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。別法として、
ファージディスプレイ技術を利用して、抗Ｆｂｐの保持
に関してスクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣ
Ｒ増幅したｖ−遺伝子のレパートリー由来の、または未
処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活
性を有する抗体遺伝子を選択することができる（McCaff
erty,J.ら、Nature 348：552-554（1990）；Marks,J.
ら、Biotechnology 10：779-783（1992））。これらの
抗体の親和性は、チェーンシャフリング（chain shuffl
ing）（Clackson,T.ら、Nature 352：624-628（199
1））により改善することもできる。２つの抗原結合ド
メインがあるならば、各ドメインを、「二特異的」抗体
と称される、異なるエピトープに向けることができる。
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において公知のいずれかの技術を用いることができる。
例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256：
495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4：72
（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記
載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本鎖抗体の
生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対する一本鎖抗体を産生することができる。また、ト
ランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の
生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対
するヒト化抗体を発現することができる。別法として、
ファージディスプレイ技術を利用して、抗Ｆｂｐの保持
に関してスクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣ
Ｒ増幅したｖ−遺伝子のレパートリー由来の、または未
処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活
性を有する抗体遺伝子を選択することができる（McCaff
erty,J.ら、Nature 348：552-554（1990）；Marks,J.
ら、Biotechnology 10：779-783（1992））。これらの
抗体の親和性は、チェーンシャフリング（chain shuffl
ing）（Clackson,T.ら、Nature 352：624-628（199
1））により改善することもできる。２つの抗原結合ド
メインがあるならば、各ドメインを、「二特異的」抗体
と称される、異なるエピトープに向けることができる。
【００７５】前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチ
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けｌｅｐに対する抗体を用いて、感染、特に細菌感染、
とりわけ中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈
洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染
のような髄膜炎を阻害および／または治療することがで
きる。
ドを発現するクローンを単離もしくは同定し、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／ま
たは精製するための固体支持体に結合させることで、該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
けｌｅｐに対する抗体を用いて、感染、特に細菌感染、
とりわけ中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈
洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染
のような髄膜炎を阻害および／または治療することがで
きる。
【００７６】ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
様を形成する、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学
的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原
的に等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タン
パク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病
原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用
を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろ
うポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細
書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊
椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨げるように作用するペプチドま
たはそれの同等物を包含する。
【００７７】ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウス
またはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質
はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗
原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピ
ーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するた
めに十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しな
くてすむ。
【００７８】抗体またはその誘導体を修飾して、個体に
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。本発明のポリヌ
クレオチドを遺伝的免疫に使用する場合、好ましくは、
例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolff
ら、Hum.Mol.Genet.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.
Gene Ther.4：419（1963））、特異的タンパク質キャリ
ヤを複合させたＤＮＡの送達（Wuら、J.Biol.Chem.26
4：16985（1989））、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ
共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS （USA）83：9551（1
986））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（K
anedaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（T
angら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA
Cell Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロ
ウイルスを用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS （US
A）81：5849（1984））などの適当な送達方法を用い
る。
おける免疫原性を低下させるのが好ましい。例えば、個
体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが
最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の
相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクローナル抗
体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。本発明のポリヌ
クレオチドを遺伝的免疫に使用する場合、好ましくは、
例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolff
ら、Hum.Mol.Genet.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.
Gene Ther.4：419（1963））、特異的タンパク質キャリ
ヤを複合させたＤＮＡの送達（Wuら、J.Biol.Chem.26
4：16985（1989））、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ
共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS （USA）83：9551（1
986））、種々の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（K
anedaら、Science 243：375（1989））、微粒子爆撃（T
angら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA
Cell Biol.12：791（1993））およびクローン化レトロ
ウイルスを用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS （US
A）81：5849（1984））などの適当な送達方法を用い
る。
【００７９】新規ｌｅｐ−結合分子およびアッセイ 本発明はまた、ｌｅｐに結合する結合分子などの分子の
同定方法をも提供する。ｌｅｐに結合するタンパク質を
コードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、例え
ばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティングより
同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例
えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology、
1（2）：第5章（1991）に記載されている。また、標識
されたリガンドを細胞抽出物に光親和性結合させること
もできる。また、本発明のポリペプチドを用いて、細胞
中、または無細胞調製物中の、ｌｅｐ結合分子のｌｅｐ
結合能力を評価することができる。本発明のポリペプチ
ドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライ
ブラリー、および天然の生成物混合物中の小型分子基質
とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの
基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドである
か、または構造静または機能性模倣体であってもよい。
同定方法をも提供する。ｌｅｐに結合するタンパク質を
コードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、例え
ばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティングより
同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例
えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology、
1（2）：第5章（1991）に記載されている。また、標識
されたリガンドを細胞抽出物に光親和性結合させること
もできる。また、本発明のポリペプチドを用いて、細胞
中、または無細胞調製物中の、ｌｅｐ結合分子のｌｅｐ
結合能力を評価することができる。本発明のポリペプチ
ドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライ
ブラリー、および天然の生成物混合物中の小型分子基質
とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの
基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドである
か、または構造静または機能性模倣体であってもよい。
【００８０】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明はまた、ｌｅｐ結合分子との相互作用などの、ｌ
ｅｐポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を亢進
（アゴニスト）または遮断（アンタゴニスト）する化合
物を同定するための化合物のスクリーニング方法をも提
供する。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをス
クリーニングするために、膜、細胞エンベロープもしく
は細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれら
のいずれかの調製物を、ｌｅｐに結合する分子を発現す
る細胞より調製することができる。該調製物を、ｌｅｐ
アゴニストまたはアンタゴニストであるかもしれない候
補分子の存在下または不在下で標識したｌｅｐと一緒に
インキュベーションする。候補分子が結合分子に結合す
る能力は、標識リガンドの結合の低下に反映される。結
合しても影響を及ぼさない分子、すなわちｌｅｐ結合分
子の結合において、ｌｅｐの効果を誘起しない分子は、
ほとんどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく
結合し、ｌｅｐと同じまたは密接に関連する効果を誘起
する分子はアゴニストである。
イおよび分子 本発明はまた、ｌｅｐ結合分子との相互作用などの、ｌ
ｅｐポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を亢進
（アゴニスト）または遮断（アンタゴニスト）する化合
物を同定するための化合物のスクリーニング方法をも提
供する。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをス
クリーニングするために、膜、細胞エンベロープもしく
は細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれら
のいずれかの調製物を、ｌｅｐに結合する分子を発現す
る細胞より調製することができる。該調製物を、ｌｅｐ
アゴニストまたはアンタゴニストであるかもしれない候
補分子の存在下または不在下で標識したｌｅｐと一緒に
インキュベーションする。候補分子が結合分子に結合す
る能力は、標識リガンドの結合の低下に反映される。結
合しても影響を及ぼさない分子、すなわちｌｅｐ結合分
子の結合において、ｌｅｐの効果を誘起しない分子は、
ほとんどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく
結合し、ｌｅｐと同じまたは密接に関連する効果を誘起
する分子はアゴニストである。
【００８１】潜在的アゴニストおよびアンタゴニストの
ｌｅｐ様効果は、例えば、候補分子と細胞または適当な
細胞調製物との相互反応の後の、リポーターシステムの
活性を測定し、ｌｅｐまたはｌｅｐと同じ効果を惹起す
る分子の効果を比較することにより測定される。この点
に関して有用なリポーターシステムは、生成物に転換さ
れる比色標識基質、ｌｅｐ活性の変化に応答するリポー
ター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを包
含するが、これらに限定するものではない。ｌｅｐアン
タゴニストのアッセイの別の例は、競争阻害アッセイに
適した条件下で、ｌｅｐおよび潜在的なアンタゴニスト
を、膜結合ｌｅｐ結合分子、組換えｌｅｐ結合分子、天
然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド
擬似物質と混合する、競合アッセイである。ｌｅｐを例
えば放射活性または比色化合物により標識し、結合分子
に結合した、または生成物に変換したｌｅｐ分子の数を
正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価
できる。
ｌｅｐ様効果は、例えば、候補分子と細胞または適当な
細胞調製物との相互反応の後の、リポーターシステムの
活性を測定し、ｌｅｐまたはｌｅｐと同じ効果を惹起す
る分子の効果を比較することにより測定される。この点
に関して有用なリポーターシステムは、生成物に転換さ
れる比色標識基質、ｌｅｐ活性の変化に応答するリポー
ター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを包
含するが、これらに限定するものではない。ｌｅｐアン
タゴニストのアッセイの別の例は、競争阻害アッセイに
適した条件下で、ｌｅｐおよび潜在的なアンタゴニスト
を、膜結合ｌｅｐ結合分子、組換えｌｅｐ結合分子、天
然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド
擬似物質と混合する、競合アッセイである。ｌｅｐを例
えば放射活性または比色化合物により標識し、結合分子
に結合した、または生成物に変換したｌｅｐ分子の数を
正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価
できる。
【００８２】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害し、消滅
させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体
を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、ｌｅｐ誘発
活性を誘導しない結合分子のような、結合分子の同一部
位に結合し、ｌｅｐを結合より排除することによりｌｅ
ｐの作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗
体のような小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであっ
てもよい。
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害し、消滅
させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体
を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、ｌｅｐ誘発
活性を誘導しない結合分子のような、結合分子の同一部
位に結合し、ｌｅｐを結合より排除することによりｌｅ
ｐの作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗
体のような小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであっ
てもよい。
【００８３】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合して占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる小分子
を包含する。小分子の例は、小有機分子、ペプチド、ペ
プチド様分子を包含するが、これらに限定するものでは
ない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する（これらの分子についての記載に関して
は、Okano,J.，Neurochem. 56：60（1991）；Oligodeox
ynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expre
ssion，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（1
988）を参照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニスト
は、ｌｅｐに関連する化合物およびその誘導体を包含す
る。
の結合部位に結合して占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる小分子
を包含する。小分子の例は、小有機分子、ペプチド、ペ
プチド様分子を包含するが、これらに限定するものでは
ない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する（これらの分子についての記載に関して
は、Okano,J.，Neurochem. 56：60（1991）；Oligodeox
ynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expre
ssion，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（1
988）を参照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニスト
は、ｌｅｐに関連する化合物およびその誘導体を包含す
る。
【００８４】特定の態様において、本発明は、感染の続
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明のポリペプチド、
ポリヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。特
に本発明の分子を、ｉ）細菌、特にグラム陽性細菌の内
在装置上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、ま
たは創傷部の細胞外マトリックスタンパク質への付着の
妨げ；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのリン
酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するセリン
プロテアーゼタンパク質の遮断（Rosenshineら、Infec
t.Immun.60：2211(1992))；ｉｉｉ）哺乳動物細胞外マ
トリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性セリ
ンプロテアーゼタンパク質との間の細菌付着の遮断；ｉ
ｖ）内在装置の埋め込みまたはその他の手術以外により
開始した感染における病因の正常な進行の遮断に使用す
ることができる。
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明のポリペプチド、
ポリヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。特
に本発明の分子を、ｉ）細菌、特にグラム陽性細菌の内
在装置上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、ま
たは創傷部の細胞外マトリックスタンパク質への付着の
妨げ；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのリン
酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するセリン
プロテアーゼタンパク質の遮断（Rosenshineら、Infec
t.Immun.60：2211(1992))；ｉｉｉ）哺乳動物細胞外マ
トリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性セリ
ンプロテアーゼタンパク質との間の細菌付着の遮断；ｉ
ｖ）内在装置の埋め込みまたはその他の手術以外により
開始した感染における病因の正常な進行の遮断に使用す
ることができる。
【００８５】本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は抗
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現時に、コーディングされたタンパク質は、抗菌薬物の
スクリーニングのための目的物質として用いることがで
きる。加えて、コーディングされたタンパク質もしくは
Shine-Delgarnoまたはその他の個々のｍＲＮＡの翻訳容
易化配列のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用
いて、目的のコーディング配列の発現を調節するアンチ
センス配列を構築することができる。アンタゴニストお
よびアゴニストは、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌
血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例
えば脳脊髄液の感染のような髄膜炎の阻害に用いること
ができる。
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現時に、コーディングされたタンパク質は、抗菌薬物の
スクリーニングのための目的物質として用いることがで
きる。加えて、コーディングされたタンパク質もしくは
Shine-Delgarnoまたはその他の個々のｍＲＮＡの翻訳容
易化配列のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用
いて、目的のコーディング配列の発現を調節するアンチ
センス配列を構築することができる。アンタゴニストお
よびアゴニストは、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌
血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例
えば脳脊髄液の感染のような髄膜炎の阻害に用いること
ができる。
【００８６】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なｌｅｐ、またはその抗原性フラグメントもしくは
変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、と
りわけストレプトコッカス感染から保護することからな
る方法に関する。本発明のまた別の態様は、個体にて免
疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療により
免疫学的応答を誘発させるためにｌｅｐまたはそのフラ
グメントもしくは変種をインビボで発現させるのにｌｅ
ｐまたはそのフラグメントもしくは変種をコードする遺
伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から保護す
る方法に関する。本発明のさらなる態様は、免疫学的応
答を宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入し
た場合、そのような宿主中でｌｅｐまたはそれによりコ
ードされるタンパク質に対する免疫学的応答を誘起する
免疫学的組成物であって、該ｌｅｐの抗原をコードし、
発現するＤＮＡまたはそれによりコードされるタンパク
質を含んでなる、組換えｌｅｐまたはそれによりコード
されるタンパク質を有してなる組成物に関する。
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なｌｅｐ、またはその抗原性フラグメントもしくは
変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、と
りわけストレプトコッカス感染から保護することからな
る方法に関する。本発明のまた別の態様は、個体にて免
疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療により
免疫学的応答を誘発させるためにｌｅｐまたはそのフラ
グメントもしくは変種をインビボで発現させるのにｌｅ
ｐまたはそのフラグメントもしくは変種をコードする遺
伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から保護す
る方法に関する。本発明のさらなる態様は、免疫学的応
答を宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入し
た場合、そのような宿主中でｌｅｐまたはそれによりコ
ードされるタンパク質に対する免疫学的応答を誘起する
免疫学的組成物であって、該ｌｅｐの抗原をコードし、
発現するＤＮＡまたはそれによりコードされるタンパク
質を含んでなる、組換えｌｅｐまたはそれによりコード
されるタンパク質を有してなる組成物に関する。
【００８７】ｌｅｐまたはそのフラグメントは、それ自
身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定化
し、免疫原性があり防御特性を有する融合タンパク質を
形成することができる補タンパク質（co-protein）と融
合できる。このように融合した組換えタンパク質は、好
ましくはさらに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーター
ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成お
よび精製を容易にする比較的大きな補タンパク質を有し
てなる。さらには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激
を提供するという意味で、アジュバントとして作用し得
る。補タンパク質は第１のタンパク質のアミノまたはカ
ルボキシル末端のいずれに結合してもよい。本発明によ
れば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
と、Sato,Y．ら、Science 273：352（1996）に記載され
ているような免疫刺激性ＤＮＡ配列とからなる組成物、
特にワクチン組成物および方法が提供される。
身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定化
し、免疫原性があり防御特性を有する融合タンパク質を
形成することができる補タンパク質（co-protein）と融
合できる。このように融合した組換えタンパク質は、好
ましくはさらに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーター
ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、その生成お
よび精製を容易にする比較的大きな補タンパク質を有し
てなる。さらには、補タンパク質は、免疫系の汎用刺激
を提供するという意味で、アジュバントとして作用し得
る。補タンパク質は第１のタンパク質のアミノまたはカ
ルボキシル末端のいずれに結合してもよい。本発明によ
れば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
と、Sato,Y．ら、Science 273：352（1996）に記載され
ているような免疫刺激性ＤＮＡ配列とからなる組成物、
特にワクチン組成物および方法が提供される。
【００８８】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニエに感染した動物モデルにおける、このような
遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌性細胞
表面タンパク質の非可変領域をコードすることがわかっ
ている前記のポリヌクレオチドまたはとりわけそのフラ
グメントを用いる方法であって、とりわけ予防的または
治療的免疫反応を生じることができるタンパク質エピト
ープを同定するのに有用な方法を提供するものである。
このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけるス
トレプトコッカス・ニューモニエ感染の予防薬または治
療的処置の開発のために、感染に抵抗しまたは一掃する
のに成功した動物の必須器官から特に価値あるモノクロ
ーナル抗体を引き続き調製することを可能にすると考え
られる。ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付
着を阻害することにより、細菌の侵入に対して防御的な
特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のための
抗原として使用することができる。組織損傷の例は、例
えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、または内在
装置の埋め込みにより、引き起こされた皮膚または結合
組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣
の創傷を包含する。
ューモニエに感染した動物モデルにおける、このような
遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌性細胞
表面タンパク質の非可変領域をコードすることがわかっ
ている前記のポリヌクレオチドまたはとりわけそのフラ
グメントを用いる方法であって、とりわけ予防的または
治療的免疫反応を生じることができるタンパク質エピト
ープを同定するのに有用な方法を提供するものである。
このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけるス
トレプトコッカス・ニューモニエ感染の予防薬または治
療的処置の開発のために、感染に抵抗しまたは一掃する
のに成功した動物の必須器官から特に価値あるモノクロ
ーナル抗体を引き続き調製することを可能にすると考え
られる。ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付
着を阻害することにより、細菌の侵入に対して防御的な
特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のための
抗原として使用することができる。組織損傷の例は、例
えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、または内在
装置の埋め込みにより、引き起こされた皮膚または結合
組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣
の創傷を包含する。
【００８９】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のｌｅｐに関して記載されている
が、これは天然のタンパク質および、実質的に組換えタ
ンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失または置
換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含する
ことが理解されよう。
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが
好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血
液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性
滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有してい
てもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したア
ンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高
めるアジュバント系、例えば水中油系または当該分野で
公知の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定でき
る。本発明はある種のｌｅｐに関して記載されている
が、これは天然のタンパク質および、実質的に組換えタ
ンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失または置
換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含する
ことが理解されよう。
【００９０】組成物 本発明はまた前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物で使用するための非滅菌もしくは滅
菌した担体と組み合わせて用いることができる。このよ
うな組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の
本発明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体ま
たは賦形剤からなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適合させなければ
ならない。
【００９１】キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を１ま
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製品、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
【００９２】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまた
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症等を考
慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標
準法により決定されることは理解されよう。
【００９３】治療において、または予防用に、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸
ならびにエアゾルの形態に処方してもよく、例えば保存
剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびク
リームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含
有してもよい。このような局所用処方はまた、適合する
慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、および
ローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコー
ルも含めることができる。このような担体は処方の約１
％から約９８重量％であってもよく；より一般的には、
処方の約８０重量％までとする。
【００９４】哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
成分の１日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、個々の個体の年齢、体重および応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個
体もあり、それらも本発明の範囲内である。内在装置に
は外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に
導入され、長時間その位置に止まる装置が包含される。
このような装置には、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等を包含する。
【００９５】本発明の組成物を注射により投与し、内在
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、ストレプトコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを
広げて、ストレプトコッカス創傷感染を防御するために
用いることができる。多くの整形外科医は、補綴関節を
有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前に、抗生物
質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重
い感染は、重篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失
し、著しい羅病率および死亡率を伴う。従って、該活性
物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用す
ることにまで拡張することが可能である。
【００９６】前記の治療に加え、本発明の組成物は、一
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、セリンプロテアーゼタンパク
質を有する細菌の存在を検出するための診断試薬として
使用できる。以下の実施例を容易に理解するために、特
定の汎用する方法および／または用語を記載する。
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。また、
本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用
できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、
１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ま
しい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都
合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。前記の抗体もまた、セリンプロテアーゼタンパク
質を有する細菌の存在を検出するための診断試薬として
使用できる。以下の実施例を容易に理解するために、特
定の汎用する方法および／または用語を記載する。
【００９７】
【実施例】本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく
説明する。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様
を説明するものであり、本発明に開示する範囲を限定ま
たは規定するものではない。本明細書で用いる特定の用
語は前記した用語説明で説明する。全ての実施例は、別
に詳細に記載するもの以外は、当業者に周知で慣用され
る標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分
子生物学的技術は、例えばSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）ような標
準的な実験室マニュアルに記載されるように実施でき
る。
説明する。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様
を説明するものであり、本発明に開示する範囲を限定ま
たは規定するものではない。本明細書で用いる特定の用
語は前記した用語説明で説明する。全ての実施例は、別
に詳細に記載するもの以外は、当業者に周知で慣用され
る標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分
子生物学的技術は、例えばSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）ような標
準的な実験室マニュアルに記載されるように実施でき
る。
【００９８】実施例１：ライブラリー生成 配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
をイー・コリにおけるストレプトコッカス・ニューモニ
エの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するストレプトコッカス・ニューモニエＤＮＡ
を含有する２個またはそれ以上のクローンの配列決定デ
ータを、配列番号１に示す連続したＤＮＡ配列を構築す
るために使用する場合もある。ライブラリーは慣用的方
法、例えば以下の方法１および２により製造できる。全
細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニエ０１
００９９３より、標準法に準じて単離し、二つの方法の
どちらかによりサイズ分画する。
をイー・コリにおけるストレプトコッカス・ニューモニ
エの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するストレプトコッカス・ニューモニエＤＮＡ
を含有する２個またはそれ以上のクローンの配列決定デ
ータを、配列番号１に示す連続したＤＮＡ配列を構築す
るために使用する場合もある。ライブラリーは慣用的方
法、例えば以下の方法１および２により製造できる。全
細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニエ０１
００９９３より、標準法に準じて単離し、二つの方法の
どちらかによりサイズ分画する。
【００９９】方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニ
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【０１００】方法２ 全細胞ＤＮＡは、四種の制限酵素（ＲｓａＩ、Ｐａｌ
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
【０１０１】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ロネット，マイケル （ｉｉ）発明の名称： 新規ｌｅｐ （ｉｉｉ）配列の数：３ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Fast SEQ バージョン１.５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：０８／７５６２９９ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月２５日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ギミー，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５９５ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Fast SEQ バージョン１.５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：０８／７５６２９９ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月２５日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ギミー，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５９５ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【０１０２】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６１２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセチカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメントの型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGAATTCAT TTAAAAATTT CTTAAAAGAG TGGGGACTGT TCCTCCTAAT TCTGTCATTA 60 CTAGCTTTAA GTCGTATCTT TTTTTGGAGC AATGTTCGCG TAGAAGGACA TTCCATGGAT 120 CCGACCCTAG CGGATGGCGA AATTCTCTTC GTTGTAAAAC ACCTTCCTAT TGACCGTTTT 180 GATATCGTGG TGGCCCATGA GGAAGATGGC AATAAGGACA TCGTCAAGCG CGTGATTGGA 240 ATGCCTGGCG ACACCATTCG TTACGAAAAT GATAAACTCT ACATCAATGA CAAAGAAACG 300 GACGAGCCTT ATCTAGCAGA CTATATCAAA CGCTTCAAGG ATGACAAACT CCAAAGCACT 360 TACTCAGGCA AGGGCTTTGA AGGAAATAAA GGAACTTTCT TTAGAAGTAT CGCTCAAAAA 420 GCCCAAGCCT TCACAGTTGA TGTCAACTAC AACACCAACT TTAGCTTTAC TGTTCCAGAA 480 GGAGAATACC TTCTCCTCGG AGATGACCGC TTGGTTTCGA GCGACAGCCG CCACGTAGGT 540 ACCTTCAAAG CAAAAGATAT CACAGGGGAA GCTAAATTCC GCTTCTGGCC AATCACCCGT 600 ATCGGAACAT TT 612
【０１０３】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセチカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Asn Ser Phe Lys Asn Phe Leu Lys Glu Trp Gly Leu Phe Leu Leu 1 5 10 15 Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Arg Ile Phe Phe Trp Ser Asn Val 20 25 30 Arg Val Glu Gly His Ser Met Asp Pro Thr Leu Ala Asp Gly Glu Ile 35 40 45 Leu Phe Val Val Lys His Leu Pro Ile Asp Arg Phe Asp Ile Val Val 50 55 60 Ala His Glu Glu Asp Gly Asn Lys Asp Ile Val Lys Arg Val Ile Gly 65 70 75 80 Met Pro Gly Asp Thr Ile Arg Tyr Glu Asn Asp Lys Leu Tyr Ile Asn 85 90 95 Asp Lys Glu Thr Asp Glu Pro Tyr Leu Ala Asp Tyr Ile Lys Arg Phe 100 105 110 Lys Asp Asp Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ser Gly Lys Gly Phe Glu Gly 115 120 125 Asn Lys Gly Thr Phe Phe Arg Ser Ile Ala Gln Lys Ala Gln Ala Phe 130 135 140 Thr Val Asp Val Asn Tyr Asn Thr Asn Phe Ser Phe Thr Val Pro Glu 145 150 155 160 Gly Glu Tyr Leu Leu Leu Gly Asp Asp Arg Leu Val Ser Ser Asp Ser 165 170 175 Arg His Val Gly Thr Phe Lys Ala Lys Asp Ile Thr Gly Glu Ala Lys 180 185 190 Phe Arg Phe Trp Pro Ile Thr Arg Ile Gly Thr Phe 195 200
【０１０４】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３５３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセチカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメントの型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： CTGTCTTGAG ACCAATCCCT TGAAATGGCT ACTTGAAAAG TACTTGACCA AGCCCTTACT 60 AGTTGGTTTT GCGCGATCAT AACGACTGAT TTGCAGTTGT TCTCCATACT TGGAGTGCTG 120 GACAATTTGC CCCCAAAAAG TATAGTCTTC GCCCTCAATT ACATCAGCCA TGGTTCCTGT 180 GACAATGATT TCAAAATCAT CAAAATCCTC TGCGTCCGTA TCGTCGATTT CTAGGAGGAG 240 GATGCGATAA AAATTGCTGG GATTTTCAAA AATAATCCGT TCAATAGTTC CTGAAAAATA 300 AACTTCCATC GAATTCCTTT GCATGAATAG GTGAGAGTTG AGGTGTTTCT GTTCTGGTAA 360 GTTTAGATAG TACCAATCAT TTTCTCACGA TAGAAGAAGA GGCTGAGATT GGTGATTCTC 420 GGCCTCTTAG GTTTCTTAAA ATGTTCCGAT ACGGGTGATT GGCCAGAAGC GGAATTTAGC 480 TTCCCCTGTG ATATCTTTTG CTTTGAAGGT ACCTACGTGG CGGCTGTCGC TCGAAACCAA 540 GCGGTCATCT CCGAGGAGAA GGTATTCTCC TTCTGGAACA GTAAAGCTAA AGTTGGTGTT 600 GTAGTTGACA TCAACTGTGA AGGCTTGGGC TTTTTGAGCG ATACTTCTAA AGAAAGTTCC 660 TTTATTTCCT TCAAAGCCCT TGCCTGAGTA AGTGCTTTGG AGTTTGTCAT CCTTGAAGCG 720 TTTGATATAG TCTGCTAGAT AAGGCTCGTC CGTTTCTTTG TCATTGATGT AGAGTTTATC 780 ATTTTCGTAA CGAATGGTGT CGCCAGGCAT TCCAATCACG CGCTTGACGA TGTCCTTATT 840 GCCATCTTCC TCATGGGCCA CCACGATATC AAAACGGTCA ATAGGAAGGT GTTTTACAAC 900 GAAGAGAATT TCGCCATCCG CTAGGGTCGG ATCCATGGAA TGTCCTTCTA CGCGAACATT 960 GCTCCAAAAA AAGATACGAC TTAAAGCTAG TAATGACAGA ATTAGGAGGA ACAGTCCCCA 1020 CTCTTTTAAG AAATTTTTAA ATGAATTCAT AACTTACCTT TCTAAGCGTT TTTTCGCTTT 1080 TTCAGTGTTT TTAAAGTGCA ATTTGGCGCA GAAGTTGAGT CCCTGCATAC CATAGGCTTG 1140 CAAAATCTGG CTAGCCACCT TGTCAGAAGC CGTTCCAGCT CCACTTGGAA GCTGATAACC 1200 CAGTTCTCGT CCCAGATTTT CAAGATTTTC CAGAAAGAGA TCACGCGCAA TGACAGAAGA 1260 AACTGCGACA GACAAGTATT TGCCCTCAGC CTTTTCTTCT AAGCTGATAG GATTGCTGAA 1320 ACGATTGGCC TCTTGTGCCA AGTACTTGTC ATA 1353
【図１】 新規ストレプトコッカス・ニューモニエ ｌ
ｅｐのＤＮＡ配列（配列番号１）のコーディング配列を
示す。そのコーディング配列はヌクレオチド１から開始
し、ヌクレオチド６１２で終える。開始コドン（ＡＴ
Ｇ）は太文字で下線を付してある。停止コドン（ＵＵ
Ｕ）にも下線を付す。
ｅｐのＤＮＡ配列（配列番号１）のコーディング配列を
示す。そのコーディング配列はヌクレオチド１から開始
し、ヌクレオチド６１２で終える。開始コドン（ＡＴ
Ｇ）は太文字で下線を付してある。停止コドン（ＵＵ
Ｕ）にも下線を付す。
【図２】 図１のポリヌクレオチド配列から推定され
る、ストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐのアミ
ノ酸配列（配列番号２）を示す。
る、ストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐのアミ
ノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】 図1のｌｅｐコーディング配列の補体を含む
非コーディングＤＮＡ鎖およびフランキング配列の新規
なストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐ ＤＮＡ配
列（配列番号３）を示す。
非コーディングＤＮＡ鎖およびフランキング配列の新規
なストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐ ＤＮＡ配
列（配列番号３）を示す。
【図４】 図1のｌｅｐコーディング配列の補体を含む
非コーディングＤＮＡ鎖およびフランキング配列の新規
なストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐ ＤＮＡ配
列（配列番号３）を示す。
非コーディングＤＮＡ鎖およびフランキング配列の新規
なストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐ ＤＮＡ配
列（配列番号３）を示す。
【図５】 図1のｌｅｐコーディング配列の補体を含む
非コーディングＤＮＡ鎖およびフランキング配列の新規
なストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐ ＤＮＡ配
列（配列番号３）を示す。
非コーディングＤＮＡ鎖およびフランキング配列の新規
なストレプトコッカス・ニューモニエ ｌｅｐ ＤＮＡ配
列（配列番号３）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/09 ＡＢＭ Ｃ０７Ｋ 14/315 39/395 ＡＢＬ Ｃ１２Ｎ 1/21 48/00 ＡＤＺ 9/52 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/52 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ａ６１Ｋ 31/70 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ // Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＣＤ Ｃ１２Ｐ 21/08 37/547 ＡＢＥ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (24)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号２のアミノ酸１ないし２０４からなるポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少な
くとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるメンバーを有してなる単
離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号３に示されるヌクレオチド１な
いし１３５３からなる請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項５】 配列番号１に示されるヌクレオチド１な
いし６１２からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸１ないし２０４か
らなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌ
クレオチド。 - 【請求項７】 （ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４に含まれるｌｅｐ
遺伝子により発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の
同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の塩基を有してなるポリヌクレオチド；から
なる群より選択されるメンバーを有してなる単離ポリヌ
クレオチド。 - 【請求項８】 請求項２に記載のＤＮＡを有してなるベ
クター。 - 【請求項９】 請求項８に記載のベクターを有してなる
宿主細胞。 - 【請求項１０】 ポリペプチドの製造方法であって、請
求項９に記載の宿主から、該ＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドを発現させることからなる方法。 - 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、細胞が請求項８に記載のベクターに含まれ
るｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現する
ように、該細胞を該ベクターで形質転換またはトランス
フェクションすることからなる方法。 - 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸１ないし２０４
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。 - 【請求項１３】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を
有してなるポリペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１５】 請求項１２に記載のポリペプチドの活
性を阻害するアンタゴニスト。 - 【請求項１６】 ｌｅｐを必要とする個体の治療法であ
って、治療上有効量の請求項１２に記載のポリペプチド
を個体に投与することからなる方法。 - 【請求項１７】 そのポリペプチドをコードするＤＮＡ
を個体に付与し、インビボにて該ポリペプチドを発現さ
せることにより、治療上有効量のポリペプチドを投与す
る請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 ｌｅｐポリペプチドを阻害する必要の
ある個体の治療法であって、治療上有効量の請求項１５
に記載のアンタゴニストを投与することからなる方法。 - 【請求項１９】 請求項１２に記載のポリペプチドの発
現に関連する疾患の診断方法であって、該ポリペプチド
をコードする核酸配列を測定することからなる方法。 - 【請求項２０】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
２に記載のポリペプチドの存在について分析することか
らなる診断方法。 - 【請求項２１】 請求項１２に記載のポリペプチドと結
合し、その活性を阻害する化合物を同定する方法であっ
て、 細胞表面にポリペプチドについての結合部を発現する細
胞（その結合部は、化合物の該結合部への結合に応答し
て検出可能なシグナルを提供する能力を有する第２成分
に関与する）を、結合部への結合を可能とする条件下で
スクリーニングすべき化合物と接触させ、 該化合物と該結合部の相互作用から生じるシグナルの有
無を検出することによって、その化合物が結合部に結合
し、その結合部を活性化または阻害するかどうかを決定
することからなる方法。 - 【請求項２２】 哺乳動物にて免疫学的応答を誘発する
方法であって、抗体を産生するのに十分なｌｅｐまたは
そのフラグメントまたは変種を哺乳動物に接種し、該哺
乳動物を疾患から保護することからなる方法。 - 【請求項２３】 哺乳動物において免疫学的応答を誘発
する方法であって、遺伝子治療を介して、インビボにて
ｌｅｐまたはそのフラグメントまたは変種を発現させる
ために、ｌｅｐフラグメントまたはその変種をコードす
る遺伝子をデリバリーし、免疫学的応答を誘発し、抗体
を産生させ、該動物を疾患から保護する方法。 - 【請求項２４】 哺乳動物に導入した場合、哺乳動物に
おいて所定のｌｅｐポリペプチドまたはそれよりコード
されるタンパク質に対する免疫学的応答を誘起する免疫
学的組成物であって、ｌｅｐポリヌクレオチドまたはそ
れからコードされるタンパク質をコードし、かつ発現す
るＤＮＡからなる免疫学的組成物。
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