KR20010032432A - 균력 관련 핵산 서열 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세균성 균력 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산 서열(예를 들어, DNA), 및 재조합 기술에 의해서 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 항세균성 화합물(antibacterial compound) 또는 정균성 화합물(bacteriostatic compound)의 스크린용으로 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

균력 관련 핵산 서열 및 이의 용도{VIRULENCE-ASSOCIATED NUCLEIC ACID SEQUENCES AND USES THEREOF}

본 발명은 미생물의 병원성과 관련된 핵산 분자, 유전자 및 폴리펩타이드에 관한 것이다.

병원체는 그들의 숙주내에서 감염, 또는 질병을 유발시키기 위해서 유전학적 전략(genetic strategies)을 사용한다. 미생물 병원성의 발현은 복잡한 유전학적 조절 경로에 의존한다. 미생물 병원성의 논지를 파악하는 것은 병원성 균력의 기작을 이해하고 감염 및 질병을 정복하는데에 필요한 신규의 "항-균력 제제(anti-virulence agent) 또는 항-병원성 제제(anti-pathogenic agent)"를 개발하는 데에 필수 불가결한 것이다.

하나의 특정 실시예에서, 사람에 대한 기회 감염성 병원체인, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)는 토양, 흙 및 식물에서 분리된 편재성 그램-음성 세균이다[Palleroni, J.N.In:Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, ed.,J.G.Holt, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD,pp141-172, 1984]. 다수의 피.아에루기노사 균력 인자(virulence factor)에 대해서 기술되어 왔으며, 이들의 대다수, 예를 들어 엑소톡신 A, 엘라스타제, 및 포스포리파제 C와 같은 균력 인자는 이들의 세포 독성 활성을 기초로 생화학적으로 처음 검출되었다[Fink,R.B. Pseudomonas aeruginosa the Opportunist:Pathogenesis and Disease, Boca CRC Press Inc.,1993]. 실질적으로, 이들 인자에 대응하는 유전자들 또는 이들 인자들의 발현을 조절하는 유전자들이 동정되었다. 일반적으로, 포유 동물 세균 병원체내 대부분의 병원성-관련 유전자가 생물 검정법을 사용하여 최초로 검출되었다. 포유 동물 병원체와는 대조적으로, 식물 병원체내 병원성 관련 유전자를 동정하는데에는 통상적으로 단순 조직 유전학적 전략이 사용된다. 랜덤한 트랜스포손-매개성 돌연 변이 수행후, 수천개의 식물 병원체 돌연 변이 클론을 각각의 식물에 독립적으로 접종하여 이들이 숙주 세포와의 병원성 상호 작용에 영향을 미치는 돌연변이를 포함하는지 여부를 결정하였다[Boucher et al.,J.Bacteriol. 168:5626-5623, 1987;Comai and Kosuge, J.Bacteriol.149:40-46, 1982; Lindgren et al., J.Bacteriol. 168:512-522,1986;Rahame et al., J.Bacteriol. 173:575-586, 1991;Willis et al., Mol. Plant-Microbe Interact.3:149-156,1990]. 다수의 동물들이 병원균의 공격을 받았음이 틀림없었기 때문에 모든 포유 동물의 병원성 모델을 사용한 비교 실험은 명확한 결과를 나타내지 않았다.

[발명의 요약]

우리는 병원체에 병원성 또는 균력을 부여하는데에 관련된 다수의 핵산 분자, 폴리펩타이드 및 작은 분자(예를 들어, 페나진)를 동정하여 이들을 특징지어 왔다. 따라서 이러한 발견은 예를 들어, 병원체 유전자 발현을 선택적으로 스위치 온 또는 오프시켜 병원체의 병원성 및 균력을 차단시킬 수 있거나, 또는 미생물의 병원성에 관련된 폴리펩타이드의 활성을 불활성화시키거나 또는 억제시키는 "항-균력" 제제를 평가 및 동정하기 위한 약물-스크리닝 검정법(drug-screening assay)의 기반을 제공한다. 이러한 분자들을 타겟팅시키는 약물은 상기 항-균력 제제로서 유용하다.

본 발명의 제 1 양상은 하기 서열중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 상기된 서열중의 임의의 서열 또는 이들의 절편을 포함하며; 병원체(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사와 같은 세균성 병원체)로부터 유래된다. 추가적으로, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 각각의 벡터 및 세포; 및 세포내에서 발현시키기 위하여 배치시킨 본 발명의 핵산으로 형질 전환된 세포를 제조하는 단계, 상기 형질 전환된 세포를 핵산 분자를 발현시키는 조건하에서 배양시키는 단계 및 제조합 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 제조 방법을 포함한다. 본 발명의 제 2 양상은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 이와 같이 발현시켜 제조된 재조합 폴리펩타이드 및 이와 같은 제조합 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하여 결합하는 실질적으로 순수한 항체에 관한 것이다.

본 발명의 제 3 양상은 하기 서열중 임의의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

바람직하게, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 상기 서열중 임의의 단편을 포함할 수 있으며; 병원체(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사와 같은 세균성 병원체)로부터 수득할 수 있다.

본 발명과 관련된 제 4 양상은

(a)본 발명의 분리된 핵산 분자중 임의의 하나를 발현시키는 병원성 세포를 제공하는 단계; 및

(b)상기 병원성 세포를 후보 화합물(candidate compound)과 접촉시키는 단계를 포함하는 병원성 균력 인자(pathogenic virulence factor)의 발현을 감소시킬 수 있는(예를 들어 전사시 수준 또는 전사후 수준으로)화합물 동정 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 후보 화합물과 접촉후 핵산의 발현이 감소되는 것은 병원성 균력 인자의 발현을 감소시키는 화합물을 동정할 수 있는 수단이 되는 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 병원성 세포는 포유 동물 또는 식물을 감염시킨다.

본 발명과 관련된 제 5 양상은

(a)후보 화합물을 결합이 허용되는 조건하에서 본 발명의 아미노산 서열중의 임의의 하나를 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

(b)상기 후보 화합물과 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법으로서, 병원성 균력 인자의 발현을 감소시킬 수 있는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명의 제 6 양상은

(a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

(b)상기 포유 동물에 본 발명의 핵산 분자중 임의의 하나에 의해 코드화되는 폴리펩타이드의 발현 및 활성을 억제하는 조성물을 치료학적으로 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물내의 병원성 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 병원체는 슈도모나스 아에루기노사이다.

본 발명의 제 7 양상은

(a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

(b)상기 포유 동물에 본 발명의 핵산 분자중 임의의 하나에 의해 코드화되는 폴리펩타이드와 결합하여 이의 활성을 억제하는 조성물을 치료학적으로 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물내 병원성 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 병원성 감염은 슈도모나스 아에루기노사에 의해서 발생한다.

추가로, 본 발명의 제 8 양상은

(a)슈도모나스 세포를 제공하는 단계;

(b)상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및

(c)페나진의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 슈도모나스 세포의 균력을 억제하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 처리되지 않은 대조구 배양액에 비하여 페나진이 감소된 것은 상기 화합물이 상기 슈도모나스 세포의 균력을 억제시키는 것을 나타내는 척도가 된다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 슈도모나스 아에루기노사이고; 상기 세포는 세포 배양액에 존재하며; 상기 페나진은 흡광계(예를 들어, 피오시아닌은 520㎚에서의 흡광도로 검출됨)로 검출된다. 일반적으로 피오시아닌은 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 방법에 따라서 검출된다.

"분리된 핵산 분자(isolated nucleic acid)"란, 본 발명의 핵산 분자로부터 수득된, 상기 유기체의 자연 발생적 게놈(naturally-occuring genome)내에 상기 유전자를 플랭킹하고 있는 유전자를 갖지 않는 핵산(예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 상기 용어에는 예를 들어, 벡터에 합체된 재조합 DNA; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스에 합체된 재조합 DNA; 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈성 DNA에 합체된 재조합 DNA; 또는 다른 서열들과 독립적으로 분리된 분자의 형태(예를 들어, cDNA 또는 PCR에 의하여 합성되었거나 또는 제한 엔도뉴클레아제에 의하여 생산된 게놈성 DNA 또는 cDNA 절편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 더욱이, 상기 용어는 DNA 분자 및 추가의 폴리펩타이드 서열을 코드화하는 혼성 유전자의 일부분인 재조합 DNA로부터 전사된 RNA를 포함한다.

"폴리펩타이드(polypeptide)"란, 길이 또는 전사후 변형(post-transcriptional modification)(예를 들어, 포도당화 또는 인산화)에 상관없는, 아미노산의 임의의 사슬을 의미한다.

"실질적으로 순수한 폴리펩타이드(substantially pure polypeptide)"란, 자연적으로 결합하는 성분들로부터 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 의미한다. 통상적으로, 상기 폴리펩타이드는 이와 자연적으로 결합되어 있는 단백질 및 자연 발생적 유기 분자로부터 60중량% 이상 분리되었을 때 실질적으로 순수하다. 바람직하게는, 상기 본 발명의 폴리펩타이드인 조제물은 75중량%이상, 더욱 바람직하게는 90중량%이상, 가장 바람직하게는 99중량%이상이다. 본 발명의 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 예를 들어, 자연 소스(예를 들어, 병원체)로부터 추출하거나; 이러한 폴리펩타이드를 코드화하는 재조합 핵산을 발현시키거나; 또는 상기 단백질을 화학적으로 합성시킴으로써 수득될 수 있다. 순도는 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, 또는 HPLC 분석법과 같은 임의의 적당한 방법으로 측정될 수 있다.

"실질적으로 동일한(substantially identical)"이란, 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기술된 아미노산 서열중 임의의 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기술된 핵산 서열중 임의의 하나)과 25% 이상의 동일성을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게, 이러한 서열은 비교용으로 사용된 서열에 대하여 아미노산 또는 핵산 수준에서 30%, 40%, 50%, 60%, 더욱 바람직하게는 80% 그리고 가장 바람직하게는 95% 동일하다.

통상적으로 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WT 53705, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 할당시킴으로써 동일하거나 또는 유사한 서열과 매치시킨다. 통상적으로 보존적 치환은 다음과 같은 그룹을 포함한다:글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하는 표준적 접근 방법에 있어서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있으며, 여기서 확률이 e^-3내지 e^-100라는 것은 기깝게 연관된 것임을 나타내는 척도가 된다.

"형질 전환된 세포(transformed cell)"이란, 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 분자를 재조합 DNA 기술(본원에 사용된)에 의해서 도입시킨 세포를 의미한다.

"발현을 위하여 위치된(positioned for expression)"이란, 서열의 전사 및 해독을 지휘하는 DNA 서열(즉, 예를 들어 본 발명의 재조합 폴리펩타이드 또는 RNA 분자 합성을 촉진하는 DNA 서열)에 인접하여 위치하는 DNA 분자를 의미한다.

"정제된 항체(purified antibody)"란, 자연적으로 결합된 단백질 및 자연 발생 유기 분자로 부터 분리된 60중량% 이상의 항체를 의미한다. 바람직하게, 상기 조제물은 75중량% 이상, 더욱 바람직하게 90중량% 이상, 그리고 가장 바람직하게 99중량% 이상의 항체이다. 본 발명의 정제된 항체는 예를 들어, 본 발명의 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 표준적인 기술을 사용하여 수득될 수 있다.

"특이적으로 결합함(specifically binds)"이란, 화합물 또는 항체가 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하여 결합하지만 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 자연적으로 포함하는 생물 표본과 같은 표본에서 실질적으로 다른 분자를 인식하여 결합하지 않는 것을 의미한다.

"유래된(derived from)"이란, 분리되었거나 또는 자연 발생적 서열을 갖는 서열(예를 들어, cDNA, 게놈성 DNA, 합성 DNA 또는 이들의 조합)을 의미한다.

"병원체 억제(inhibition a pathogen)"이란, 진핵 숙주 유기체내 병원체-매개성 질병 또는 감염의 발생 또는 진행을 감소(decrease), 억압(supress), 약화(attenuation), 감퇴(diminish) 또는 저지(arrest)시키는 후보 화합물의 능력을 의미한다. 바람직하게, 이러한 억제는 임의의 적당한 병원성 검정법(예를 들어, 본원에 기술된 검정법)에서 후보 화합물이 존재하지 않을때의 증상에 비해서 병원성을 5% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 50% 이상 감소시킨다. 하나의 특정 실시예에서, 상기 억제는 후보 화합물 또는 추출물에 노출시킨 숙주 유기체내에서 병원체에 대한 화합물-매개성 억제를 나타내는 병원성 증상, 즉 상기 화합물에 노출시키지 않은 숙주 유기체내에서의 병원성 증상의 수준에 비하여 증상의 수준이 감소되었는지 여부를 모니터링함으로써 측정될 수 있다.

"병원성 균력 인자(pathogenic virulence factor)"란, 진핵 숙주 유기체에서 질병 또는 감염을 유발시킬 수 없는 병원체를 제외한 세포 성분(예를 들어, 전사 인자와 같은 단백질 및 이러한 단백질을 코드화하는 유전자)을 의미한다.

본 발명은 미생물의 병원성을 특이적으로 블로킹시키는 약물의 개발에 유용한 다수의 타겟을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법은 진핵 숙주 유기체내에서 사용하기에 안전하며 병원성 미생물에 효능(즉, 병원체의 균력을 억제하는 효능)이 있는 화합물(즉, 상기 유기체의 정상적인 발생 및 생리 현상에 악영향을 미치지 않는 화합물)을 동정하는 용이한 수단을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법은 처리량의 부피가 많고, 고감수성이며 복잡하지 않은 임의의 수의 항-균력 효과를 갖는 화합물을 실질적으로 분석하는 루트를 제공한다. 상기 방법들은 또한 수행함에 있어서 비용이 비교적 저렴하며 정제된 형태 또는 크루드한 형태로 발견되는 소량의 활성 기질을 분석할 수 있다.

본 발명의 기타 양상 및 이점들은 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명확해 질 것이다.

우선 도면에 관하여 설명하고자 한다.

도면 설명

도 1은 코스미드 BI48(서열 1)의 물리적 맵 및 동정된 개방 해독특(open reading frame)(ORFs)의 방향성을 나타내는 개략도이다.

도 2는 코스미드 BI48(서열 1)의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 것이다.

도 3은 하기 서열에 대한 뉴클레오타이드를 나타내는 것이다.

도 4는 하기 서열로부터 추론되는 아미노산 서열을 나타내는 것이다.

도 5는 33A9 서열에 의하여 코드화된 단백질을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열 102)을 나타내는 것이다.

도 6a는 33A9 서열에 의하여 코드화된 단백질을 코드화하는 추론되는 아미노산 서열(서열 103)을 나타내는 것이다.

도 6b는 33A9 서열 및 이들의 각각의 아미노산 서열(ORFs1-10; 서열199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207 및 208)에서 동정된 몇몇 ORFs1-10(서열189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 및 198)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

도 7은 하기와 같은 3개의 ORFs의 위치를 동정하는 34B12ECOR1 절편 맵의 물리적 맵을 나타내는 것이다 :ORF1(L-S), ORF2 및 ORF1S. ORF1(L-S)(서열 105 및 107), ORF2(서열 106 및 108) 및 ORF1-S(서열 208 및 209)을 포함하는 pho34B12 삽입 서열(서열 104)에 대응하는 뉴클레오타이드 서열도 나타내었다.

도 8은 도 7에 도시된 ORF1(L-S)(서열 107)의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 9는 도 7에 도시된 ORF2(서열 108)의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 10은 36A4 삽입 서열에 대응하는 뉴클레오타이드 서열(서열 109)을 나타내는 것이다.

도 11은 상기 36A4 서열에 의해서 코드화되는 펩타이드의 추론된 아미노산 서열(서열109)을 나타내는 것이다. 상기 36A4 서열에 의해서 코드화되는 예상 펩타이드는 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)의 hrpM 유전자와 상동성을 갖는다[Loubens 외 다수, Mol. Microbiol. 10:329-340, 1993].

도 12는 36A4 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 동정된 인접 서열 2507(contig 2507)의 뉴클레오타이드 서열(서열 111)을 나타내는 것이다.

도 13은 23A2 삽입 서열에 대응하는 뉴클레오타이드 서열(서열 112)에 대응하는 뉴클레오타이드 서열(서열 112)을 나타내는 것이다.

도 14a는 상기 23A2 서열에 의하여 코드화되는 펩타이드의 추론된 아미노산 서열(서열 113)을 나타내는 것이다. 상기 23A2 서열로써 예상되는 펩타이드는 슈도모나스 아에루기노사(CD10 균주)의 공지의 단백질과 상동성을 갖는다:mexA 유전자. 상기 유전자는 2개의 다른 유전자(mexB 및 oprM)도 포함하는 오페론의 일부이다;GenBank 수탁 번호:L11616.

도 14b는 PA14 mexA 및 mexB의 뉴클레오타이드 서열(서열 148) 및 예상 아미노산 서열의 일부(서열 149 및 150)를 나타내는 것이다.

도 15는 3E8 서열 태그를 사용하여 동정된 PAO1 페나진 오페론의 뉴클레오타이드 서열(서열 114)을 나타내는 것이다.

도 16a는 상기 3E8 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 115)을 나타내는 것이다.

도 16b는 상기 3E8 서열 태그에 플랭킹하고 있는 뉴클레오타이드 서열(서열 160)을 나타내는 것이다.

도 17은 추론되는 3E8 PHZA 아미노산 서열(서열 116)을 나타내는 것이다.

도 18a는 추론되는 3E8 PHZB 아미노산 서열(서열 117)을 나타내는 것이다.

도 18b는 추론되는 3E8 PHZA 아미노산 서열의 일부(서열 117)를 나타내는 것이다.

도 18c는 추론되는 3E8 PHZB 아미노산 서열의 일부(서열 117)를 나타내는 것이다.

도 18d는 추론되는 3E8 PHZC 아미노산 서열의 일부(서열 117)를 나타내는 것이다.

도 18e는 PA14 phzR의 뉴클레오타이드 서열(서열 164) 및 예상 아미노산 서열의 일부를 나타내는 것이다.

도 19는 상기 34H4 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 118)을 나타내는 것이다.

도 20은 33C7 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 119)을 나타내는 것이다.

도 21은 25a12.3 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 120)을 나타내는 것이다.

도 22는 8c12 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 121)을 나타내는 것이다.

도 23은 2a8 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 122)을 나타내는 것이다.

도 24a는 각각 41A5, 50E12, 35A9, pho23, 16G12 및 25F1 TnphoA 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 123, 124, 125, 126, 127 및 128)을 나타내는 것이다.

도 24b는 PA14 pho15의 뉴클레오타이드 서열(서열 166) 및 예상 아미노산 서열(서열 167)을 나타내는 것이다.

도 24c는 YgdP_Pa(서열 169) 및 PtsP_Pa(서열 170)을 코드화하는 PA14 50E12의 뉴클레오타이드 서열(서열 168)을 나타내는 것이다.

도 24d는 mtrR_Pa(서열 172)를 코드화하는 PA14 35A9의 뉴클레오타이드 서열(서열 171)을 나타내는 것이다.

도 24e는 ORFT(서열 174), ORFU(서열 175) 및 DjlA_Pa(서열 176)을 코드화하는 PA14 25F1의 뉴클레오타이드 서열(서열 173)을 나타내는 것이다.

도 25는 슈도모나스 아에루기노사인 PA01 및 PA14의 phnA 및 phnB 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열 129)을 각각 나타낸 것이다.

도 26은 PHNA의 추론된 아미노산 서열(서열 130)을 나타내는 것이다.

도 27은 PA14 degP 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열131)을 나타내는 것이다.

도 28은 PA14 degP 유전자의 아미노산 서열(서열132)을 나타내는 것이다.

도 29는 슈도모나스 아에루기노사 균주 8830의 algD 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열 133)을 나타내는 것이다.

도 30은 슈도모나스 아에루기노사 균주 8830의 algD 유전자의 추론된 아미노산 서열(서열 134)을 나타내는 것이다.

도 31은 25A12를 사용하여 동정된 1126 인접 서열의 뉴클레오타이드 서열(서열 135)을 나타내는 것이다.

도 32는 3개의 동정된 ORF들 즉, ORFA(서열 440), ORFB(서열441) 및 ORFC(서열 442)를 나타내는 33C7을 사용하여 동정된 1344 인접 서열(서열 136)의 물리적 맵을 나타낸 것이다. 각각의 ORF에 의해서 코드화되는 상기 ORFA(서열 443), ORFB(서열444) 및 ORFC(서열 445)의 아미노산 서열도 나타내고 있다.

도 33은 1G2 서열 태그의 뉴클레오타이드 서열(서열 137)을 나타내는 것이다.

도 34a-d는 씨. 엘레간스(C.elegans)의 슬로우-킬링 검정법(slow-killing assay)을 사용한 TnphoA 돌연 변이의 벌레 병원성 표현형에 대한 상보성을 나타내는 그래프이다.

도 34a는 돌연 변이 12A1(-◇-)의 비병원성 표현형이 균주 12A1(pKDT17)(-○-)의 트랜스포손내에서 본질적 lacZ 프로모터를 제한하는 조건하에서 PAO1로부터 lasR 유전자에 의한 야생형 PA14 수준(-■-)과 완전히 상보적일 수 있다는 것을 나타내는 그래프이다. 재구성된 lasR 돌연 변이체, PA14 lasR-G(-□-)는 12A1(-◇-)와 같은 비병원성이다. 1일된(one-day-old) 성체를 사용한 실험 결과를 나타내었다.

도 34b는 pho15의 지연-사멸(delayed-killing) 표현형의 상보성을 나타내는 그래프이다. 균주 pho15(pEcdsbA)(-◇-) 및 pho15(pPAdsbA)는 lacZ 프로모터를 제한하는 조건하에서 트랜스포손내 이.콜라이(E.Coli) 및 피.아에루기노사로부터 각각 수득한 dsbA 유전자를 운반한다.

도 34c는 25F1의 지연 사멸 표현형은 오로지 orf338 및 orf338-orf224-djlA_Pa를 포함하는 플라스미드를 운반하는 균주 25F1(pORF338) 및 25F1(p3-ORFs)에 의해 부분적으로 복구된다는 것을 나타내는 그래프이다.

도 34d는 orf159-pstP_Pa오페론과 50E12의 상보성을 나타내는 그래프이다. 돌연 변이체 12AI와 같은 균주 50e12(pUCP18)는 63 시간이 경과한 후에도 벌레을 사멸시키지 않았다. 추정되는 orf159-pstP_Pa오페론을 발현시키는 균주 50E12(pMT205-lac) 및 균주 50E12(pMT206-nat) 모두는 씨. 엘레간스를 사멸시킬 수 있었다. 50E12(pMT205-lac)에서, orf159-pstP_Pa의 전사는 lacZ 프로모터의 제한을 받는 반면에, 50E12(pMT205-nat)에서, 상기 오페론은 이의 자연 상태의 프로모터에 의한 제한을 받지 않는다.

각각의 데이터 포인트는 3-4 복제물의 ±SD의 평균을 나타낸다. 다른 표시가 없더라도, 동시화된(synchronized) L4 벌레들이 실험에 사용될 수 있다. 각각의 상보성 분석에 대해 2 이상의 독립 실험이 수행되었다.

도 35a는 phnA 및 phnB 유전자에 의해서 코드화되며 코리스메이트(chorismate)의 안트라닐레이트로의 전환을 촉매화하는 안트라닐레이트 합성제 복합체(anthranilate synthase complex)를 나타내는 개략도이다. 안트라닐레이트는 피.아에루기노사, 균주 PAO1의 피오시아닌에 대한 전구체로서 사용된다[Essar et al., J.Bacteriol. 172:884-900, 1990]. 이중 화살표는 안트라닐레이트의 피오시아닌으로의 전환으로부터 유도되는 정의되지 않은 다수의 단계들을 나타낸다.

도 35b는 phnA 및 phnB 유전자 내부 1602bp의 틀-내부(in-frame) 결실에 의한 ΔphnAphnB 돌연 변이체의 발생을 나타내는 개략도이다.

도 35c는 씨.엘레간스 내에서의 급속 사멸(fast killing)에 ΔphnAphnB 돌연 변이체가 미치는 효과를 나타내는 것이다. 급속 사멸 검정법은 야생형 PA14 균주, TnphoA 돌연 변이체 3E8 또는 상기 ΔphnAphnB 균주를 사용하여 수행된다. 상기 세균을 최초로 노출시킨후 3 시간 경과하여 벌레의 폐사율(mortality)을 모니터링하였으며 ΔphnAphnB 균주, 3E8에서 보여지는 급속 사멸에서의 폐해를 다른 페나진 돌연 변이체의 것과 비교하였다.

균력 인자 동정 및 특징화

본원에 기술된 바와 같이, 사람의 기회 감염성 병원체인 슈도모나스 아에루기노사의 균력 인자를 동정하는 생체내 병원성 발병 모델로서 식물이 사용되었다. 비교적 약한 병원성인 돌연 변이체에 대한 식물 잎 검정법에서 동정된 피.아에루기노사 균주 UCBPP-PA14의 TnphoA 돌연 변이체들 9개중 9개 모두는 마우스 화상 검정법(mouse burn assay)에서 병원성이 상당히 감소되었는데, 이는 곧 피.아에루기노사가 상기 양자의 숙주를 감염시키는 다수의 공통적인 전략을 이용한다는 것을 말해주는 것이다. 이들 9개의 돌연 변이체들중 7개는 아직 공지되지 않은 유전자들에 TnphoA 삽입물을 포함하였다. 상기 결과는 사람 세균성 병원체의 임의의 비포유 동물 숙주가 포유 동물 병원체내에 포함된 신규의 세균성 균력 인자를 동정하는데에 사용될 수 있을 것임을 나타낸다. 이하 본 발명의 청구 범위를 기술하는 실험 예를 기술할 것이며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 실험들은 다음과 같은 기술을 사용하여 수행되었다.

균주, 생장 조건 및 플라스미드

여러 실험실에서 집중적으로 연구되어 온 피.아에루기노사 균주UCBPP-PA14[Ausubel et al.,Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원); Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995] 및 피.아에루기노사 균주PAK[Ishimoto and Lory, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:1954-1957, 1989] 및 PAO1[Holley et al.,Microbiol.Rev.43:73-102, 1979]는 신규의 균력-관련 유전자들을 동정하는 실험에 사용된 사람의 임상 분리 균주이다

37℃에서 피.아에루기노사 및 에스케리치아 콜라이 균주를 생장시키는데에 Luria Bertani 발효액 및 아가가 사용되었다. 뿐만 아니라 최소 배양액(M9)도 피.아에루기노사를 생장시키는데에 사용되었다.

트랜스포손 돌연 변이 유발

이.콜라이 균주 SM10λpir내에서 자살 플라스미드(suicide plasmid)인 TnphoA를 사용하여 UCBPP-PA14의 트랜스포손 매개성 돌연 변이 유발 실험을 수행하였다[Taylor et al.,J.Bacteriol.171:1870-1878, 1989]. 상기 배양액에서 생장시킨 공여 세포 및 수용 세포를 Luria Bertani 아가 플레이트상에 함께 도말시켜 37℃에서 8-10시간 동안 배양한후 최종적으로 리파마이신(100㎍/㎖)(이.콜라이 공여 세포 선별용) 및 카나마이신(200㎍/㎖)(TnphoA 포함 피.아에루기노사 세포 선별용)을 상기 Luria Bertani 아가 플레이트상에 도말하였다. 리파마이신 및 카나마이신 상에서 생장한 콜로니들을 암피실린(300㎍/㎖) 함유 Luria Bertani 플레이트상에 복사하였다; 암피실린 저항성 콜로니들은 상기 UCBPP-PA14 게놈에 일체화된 pRT731을 나타내는 것으로서 이들을 제거하였다.

알칼리성 포스파타제 활성

2500개의 광합성 UCBPP-PA14 TnphoA 돌연 변이체를 40㎍/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인도리 포스페이트(XP)를 함유하는 펩톤 글루코즈 아가 플레이트상에서 스크리닝하였다[Ostroff et al., J.Bacteriol. 172:5915-5923, 1990]. 펩톤 배양액은 유전자 내부성 청-녹 색소 피오시아닌 및 형광 황색 색소 피오베르딘의 생성을 억압시키지 않기 때문에, PhoA+ 돌연 변이체에 의하여 발생되는 세포질 알칼리성 포스파타제에 의해서 XP가 탈인산화되는 결과로 발색되는 청색을 눈으로 확인할 수 있도록 이를 배양액로 사용하였다.

생장 조건 및 돌연 변이체 분리 전략

37℃, L-발효액에서 충분히 생장시킨 피.아에루기노사를 10mM MgSO₄에서 세척시키고, 10mM MgSO₄에서 흡광도 0.2(600㎚)가 되도록 재현탁시켰으며 1:100 - 1:1000(세균 밀도 약 10⁶내지 10⁵에 대응)으로 희석시켰다. 상기 희석된 세포들의 약 10㎖를 온실(26℃)의 MetroMix 화분 토양에서 생장시킨 12주된 양상추(Romain 및 Great lake 변종) 줄기에 Pipetman으로 접종시켰다. 이후 상기 줄기를 0.1% 표백제로 세척시킨후 10mM의 MgSO₄로 함침시킨 Whatman 필터(Whatman#1) 1장을 깔아 놓은 지름 15㎝ 페트리 플레이트상에 방치하였다. 각각의 양상추 잎의 주맥에 시험될 3개의 상이한 TnphoA-발생된 피.아에루기노사 돌연 변이체를 접종시켰으며, 이때 UCBPP-PA14 균주를 대조구로 하였다. 이후 상기 플레이트를 실험 내내 28-30℃, 상대 습도 90-100%의 생장실에 방치시켰다. 5일간 날마다 증상들을 모니터하였다.

아라비돕시스(Arabidopsis) 잎의 침윤 모델(infiltration model)에서, 상기와 같이 생장시킨후 세척시킨 피.아에루기노사 균주를 10mM MgSO₄1:100의 비율(잎의 원형 부위당 세균 밀도 10³/㎠에 대응)로 희석시킨후 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)의 침윤 방식으로 6주된 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물의 잎에 접종시켰다[Ausubel et al., Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs, 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원); Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995; Dong et al.,Plant Cell 3:61-72, 1991]. 배양 조건 및 증상 모니터는 양상추 실험에서와 동일하게 수행하였다. 세균을 함유하는 잎의 세포간액을 수득하여 기술된 바와 같은 방법으로 세균수를 측정하였다[Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995; Dong et al.,Plant Cell 3:61-72, 1991]. 시료당 2개의 잎 원반으로부터 4개의 상이한 시료들을 취하였다. 10mM MgSO₄가 접종된 대조구 식물에서는 아무런 증상도 나타나지 않았다.

마우스 폐사율 연구

상기한 바와 같이 무게가 25-30그램이며 6주된 수컷 AKR/J 마우스(Jackson 실험실)의 복부 피부 상에 전체 피부에 대하여 5%의 화상 부위를 형성시켰다[Ausubel et al., Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs, 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원); Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995; Stevens, J. Burn Care Rehabil. 15:232-235, 1994]. 마우스에 화상을 입힌 즉시 이곳에 피.아에루기노사 세포 5×10³~10⁵를 접종시킨후 10일간 날마다 패혈증으로 폐사된 마우스의 수를 모니터 하였다. 동물 연구 방법은 Animal Studies of the Massachusetts General Hospital 분과 위원회로부터 검토되어 승인되었다. Yates 보정 또는 Fisher 정확도 테스트를 이용하는 χ²시험을 통하여 폐사율 데이터에 대한 통계학적 검정률을 결정하였다. 상기 그룹들간의 편차는 통계 검정률 P≤0.05의 범위에 있는 것으로 보여진다.

TnphoA 돌연 변이체의 DNA 조작, 분자 클로닝 및 서열 분석

페놀 추출법에 의하여 피.아에루기노사의 염색체 DNA를 분리하여[Storm and Lory, J.Bacteriol. 165:367-372, 1986], Ausubel 외 다수 공저 "Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, 1996"에 기술된 바와 같이 DNA 블럿 연구 및 혼성화 연구를 수행하였다.

올리고뉴클레오타이드 5'-AATATCGCCCTGAGCAGC-3'(LGR1)(서열 138) 및 5'-AATACACTCACTATGCGCTG-3'(LGR2)(서열 139)은 TnphoA의 5' 말단의 반대 사슬의 서열과 대응되는 것이다. 올리고뉴클레오타이드 5'-CCATCTCATCAGAGGGTA-3'(LGR3)(서열 140) 및 5'-CGTTACCATGTTAGGAGGTC-3'(LGR4)(서열 141)은 TnphoA의 3' 말단의 반대 사슬의 서열과 대응되는 것이다. 역전 PCR(inverse PCR;IPCR)을 이용하여 TnphoA 삽입 부위에 인접한 DNA 서열을 증폭시키는 데에 LGR1과 LGR2 또는 LGR3과 LGR4를 사용하였다[Ochman et al.,1993, A Guide to Methods and Applications eds.,Innis, M.A.,States, D.J.,1990]. 크기가 350 - 600bp의 범위에 있는 증폭된 DNA 절편을 IPCR 산물의 말단을 채워 pBlueScript SK+/-에 클로닝시킨후 다시 pBlueScript SK+/-의 EcoRV 부위에 서브클로닝시켰다. IPCR-증폭 산물의 서열을 결정하기 위하여, Sequenase 2.0 kit(U.S. Biochemical, Inc.)을 사용하여 이중 사슬 DNA 시퀀싱을 수행하였다. 수득된 서열을 BLASTX 프로그램을 사용하여 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 비중복성(non-redundant) 펩타이드 서열 데이터베이스와 비교하였다[Gish and States,Nat.Genet.3:266-272, 1993].

pho34B12 돌연 변이에 대응하는 유전자를 포함하는 야생형 클론의 UCBPP-PA14 게놈성 라이브러리로부터의 분리 및 DNA 조작

UCBPP-PA14 TnphoA 돌연 변이체인 pho34B12 돌연 변이체로부터 생산된 IPCR 산물을 무작위 프라이밍된 DNA 라벨링 키트를 사용하여 라벨링시켜(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 이를 상기 pho34B12 돌연 변이에 대응하는 유전자를 포함하는 클론에 대한 pJSR1(Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995)내 UCBPP-PA14 염색체 DNA의 게놈성 라이브러리를 프로빙하는데에 사용하였다. 벡터 및 절편의 말단을 채워 pLGRE34B12를 구성한후 pho34B12 돌연 변이체에 대응하는 코스미드 클론 pLGR34B12에서 동정한 3.7kb의 EcoRI 절편을 pBR54의 EcoRI 부위에 서브클로닝시켰다[Roberts et al.,J.Bacteriol.172:6204-6216, 1990]. 동일한 서열을 pCVD의 SmaI 부위에 서브클로닝시켜[Donnenberg and Kaper, Infect. Immun.59:4310-4317, 1991] pLGR34를 구성하였다. 상기 pLGR34는 Donnenberg and Kaper, Infect. Immun.59:4310-4317, 1991에 기술된 바와 같이 돌연 변이된 pho34B12 유전자를 야생형 복사물로 대체시키는데에 사용되었다. 상기 3.7kb EcoRI 절편은 또한 pBlueScript SK+/-의 EcoRI 부위에 서브클로닝되어 pBSR34B12를 구성하여 DNA 서열 분석에 사용되었다.

반대편 사슬상의 2개의 오버래핑된 오픈 리딩 프레임(ORF1 및 ORF2)을 포함하는 pho34B12 삽입물에 대응되는 1659bp 서열을 GenBank에 제출하였으며 수탁 번호 AF031571을 부여받았다. ORF1은 1148bp(뉴클레오타이드 361-1509)이며 ORF2는 1022bp(뉴클레오타이드 436-1458)이다. 상기 2개의 ORF의 오버래핑 부위는 436 - 1458 뉴클레오타이드이다. ORF1은 758bp 코드화 지역에 대응하는 751 뉴클레오타이드의 두번째 추정 해독 개시 부위를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 5'-CGCATCGTCGAAACGCTGGCGGCC-3'(서열 142) 및 5'-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3'(서열 143)는 ORF1을 포함하는 pBSR34B12의 1100bp를 증폭시키는데에 사용되었다. 상기 2개의 추정 개시 부위가 ORF1에 존재하기 때문에, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 5'-TGCGCAACGATACGCCGTTGCCGACGATC-3'(서열 144) 및 5'-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3'(Reg3)(서열 145) 또한 ORF2를 포함하는 pBSR34B12의 1302bp 절편을 증폭시키는데에 사용되었다. 모든 프라이머의 조합체가 각각의 ORF의 추정 상류 조절 요소를 포함하도록 디자인되었다. 수득된 PCR 산물(1100, 1659 및 1302bp)을 pCR2.1(Introgen Inc.)에 클로닝하여 pLE15, pLE1 및 pLE2를 각각 구성하였다. 3개의 산물들 모두는 pBR54에 서브클로닝되어 pRRLE15, pRRLE1 및 pRRLE2를 각각 구성하였다.

TnphoA 돌연 변이체의 효소 활성

LB 배양액에서 18 시간 동안 생장한 피.아에루기노사 균주를 효소 활성 검정법에 사용하였다. 단백질 분해 활성(proteolytic activity) 및 탄력 섬유 분해 활성(elastolytic activity)을 전술한 바와 같이 결정하였다[Toder et al.,Mol.Microbiol.5:2003-2010, 1991]. 기술된 바와 같이[Essar et al.,J.Bact. 172:884-900, 1990] 피오시아닌을 정량하였다. 5%의 양 적혈구로 보충된 트립티카제(Trypticase) 간장콩 아가(BBL)를 함유하는 플레이트상에서 배양시킨후 용혈 활성을 검출하였다[Ostroff and Vasil, J.Bacteriol.169:4957, 1987].

비극성 GacA 돌연 변이 유발

BamHI 링커를 사용하여 코스미드 pLGR43의 gacA유전자를 함유하는 3.5kb PstI 절편[Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995]을 자살 벡터 pEGBR 내 유일한 BamHI 제한 부위[Akerley et al.,Cell 80:611-620, 1995]로 클로닝시켜 UCBPP-PA14내 비극성 gacA 돌연 변이체를 구성하였다. 이후 카나마이신 카세트의 3' 말단에서 gacA의 하류 부분의 전사를 유지시키고 해독을 다시 개시하도록 pUC18K의 카나마이신 내성 유전자 카세트를 포함하는 950bpEcoRI-HindII Klenow 말단 보충된(end-filled) 절편(Menard et al.,J.Bacteriol.175:5899-5906, 1993)을 gacA의 유일한 BamHI 제한 부위(블런트 말단화된)에 클로닝시켰다. gacA 유전자내에 전사 가능 방향으로 존재하는 카나마이신 유전자 카세트를 포함하는, 결과로 생성된 구성물인 SW7-4이 변형된 gacA 유전자를 야생형 UCBPP-PA14 게놈에 재조합시키는 상동성 재조합(homologous recombination)에 의한 마커 교환에 사용되었다.

피.아에루기노사 균력 인자의 분리 및 특징화

상기 방법을 사용하여, 피.아에루기노사 UCBPP-PA14 게놈을 트랜스포손인 TnphoA 로 돌연 변이시킨후 상기 양배추 줄기 검정법에서 결함된 병원성에 대하여 2500 광합성 돌연 변이체를 스크리닝하였다. 이러한 양배추 검정법은 단일 양배추 줄기상의 몇몇 돌연 변이체를 시험하는데에 유용하다. 흥미롭게도, 양배추는 UCBPP-PA14에 의한 감염에 대하여 감수성일 뿐만 아니라, 널리 특징화되어 알려진 피.아에루기노사 균주, PAK(Ishimoto and Lory, Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:1954-1957, 1989) 및 PAO1(Holley et al., Microbiol.Rev.43:73, 1979)에도 감수성이었다. 상기 후자의 균주들은 양배추 잎에서 증식되어 UCBPP-PA14에 의해서 유발되는 증상과 유사한 질병의 증상을 나타냈으며, 이들을 물에 침지시켰더니 감염후 4-5일간의 경미한 부패증을 보였다. 감염 후기에, 모든 3개의 피.아에루기노사 균주는 양배추 잎의 주맥을 침투하였으며, 이로써 조직은 연화되어 쇠약해졌다.

표 1에 요약된 바와 같이, 양배추 주쇄에서의 부패 증상들이 야생형 균주에 비하여 거의 안나타나거나, 약하게 나타나거나 또는 온화하게(moderate) 나타나는 스크리닝된 2500 광합성 돌연 변이체 중에서 UCBPP-PA14의 9개의 TnphoA-유발성 돌연 변이체를 동정하였다.

a:시료당 2개의 원반형 잎을 사용하여 4개의 상이한 시료를 취하였다. 실험 과정동안 10mM MgSO₄를 접종시킨 대조구 식물에서는 아무런 증상을 나타내지 않았다. 3개의 독립 실험 결과 모두 유사하였다.

b:감염후 4-5일 경과후 관찰되는 증상. 무(none)는 아무런 증상이 나타나지 않았음을 의미하고; 황화(chroisis)는 접종 부위 주변이 황색으로 변하였음을 의미하며; 약(weak)은 접종 부위 주변의 조직이 부분적으로 수분-침윤 및 황화되었음을 의미하고; 온화(moderate)는 접종 부위 주변의 연화된 조직의 대부분이 수분-침윤 및 황화되었음을 의미하며; 심각(severe)은 접종 부위 주변이 감염후 2-3일 경과후에 수분-침윤(water-infiltration) 반응 지역 및 황화 현상을 특징으로 하는 전체 잎의 심각한 연화-부패 상태를 의미하는 것이다.

c:모든 동물 실험은 실험당 8-10 동물들을 사용하여 2회 이상 수행되었다. 각각의 독립 실험에서는 폐사율이 유사하였다. 마우스는 약 5×103-5×105의 세포로 주사되었다.

d:BLASTX 분석 결과, 상동성이 높은 코드화된 단백질은 수득되지 않은 것으로 나타났다.

임의의 돌연 변이에서는 잎의 심각한 연화는 관찰되지 않았다. 프로브로서 TnphoA의 카나마이신 저항성 부여 유전자를 포함하는 1542bp인 BgII-BamHI 절편을 사용하는 DNA 블럿 분석법에 의하여 9개의 돌연 변이체가 각각 단일 TnphoA 삽입물을 포함하는 것으로 밝혀졌다.

상기 9개의 UCBPP-PA14 TnphoA 돌연 변이체중 2개, 즉 Pho34B1 및 Pho15는 알칼리성 포스파타제 활성을 발현시켰는데, 이는 상기 TnphoA 삽입물들을 포함하는 유전자들이 막에 부착된 단백질 또는 분비성 단백질을 코드화한다는 것을 시사해 주는 것이다[Tayler et al., J.Bact.171:1870-1878, 1989;Manoil and Beckwith, Proc. Natl.Acad.Sci USA 82:5117, 1985].

병원성을 정량하는 방법으로서 아라비돕시스 잎에서의 4일간 진행 경과에 대한 이들의 생장 속도를 측정하여 상기 9개의 TnphoA 돌연 변이체를 추가로 시험하였다[Rhame et al., Science 268:1899-1902, 1995;Dong et al.,Plant Cell 3:61-72, 1991]. 부유 배양액(rich media) 또는 최소 배양액 모두에서, 야생형 균주에 비하여 상기 돌연 변이체 모두는 생장 속도에 있어서 중요한 차이점은 발견되지 않았지만, 아라비돕시스 잎에서의 9개의 돌연 변이체의 시간에 대한 생장 속도는 야생형 균주에서 보다 더욱 느렸다. 표 1은 감염후 4일째 되는 날의 각각의 돌연 변이체의 최대 생장 속도를 나열한 것이다. 9개의 돌연 변이체 모두에서, 덜 심각한 증상이 발병한다는 것은 잎에서의 세균 수가 감소되었음을 의미하는 것이다. 33C7을 제외한 돌연 변이체 모두는 약한 또는 순한 부패증 및 다양한 정도의 백화(황화) 현상을 갖는 수분 침지 증상(water-soaking symptoms)을 나타냈다(표 1). 그러나, 흥미롭게도, 표 1에 요약된 바와 같이, 각각의 돌연 변이들의 증식 수준은 이들이 나타내는 증상의 심각성과는 직접적으로 연관되지는 않았다. 예를 들어, 돌연 변이체 25A12(도 21)는 돌연 변이체 33A9(도 5 및 도 6a-b), Pho34B12(도 7 , 8 및 도 9) 및 34H4(도 19)와 유사한 수준으로 생장하였으며, 돌연 변이체 25A12는 야생형 UCBPP-PA14보다 10배 정도 낮은 수준으로 생장하여 매우 약한 증상을 보였다. 이와 유사하게, 돌연 변이체 33C7(도 20), Pho15(도 24b) 및 25FI(도 24a) 모두는 상기와 유사한 최대 생장 수준(즉, 야생형 생장에서 보다 약 10³배 낮은)에 도달하였으나; 돌연 변이체 33C7만은 임의의 질병 증상을 일으키지는 않았다(표 1). 10개의 돌연 변이체들중 증상 및 증식 정도에서 관찰되는 차이는 이들 돌연 변이체들이 식물 감염 경로의 여러 단계에 관여하는 유전자들에 삽입물을 운반한다는 사실을 시사하는 것이다.

식물 잎 검정법에서 병원성이 약했던 9개의 TnphoA-유발성 돌연 변이체들 각각의 병원성은 열에 의한 전체-두께의 표피 화상(surfice burn)을 통하여 측정되었다[Rhame et al., Science 268:1899-1902, 1995; Stevens et al.,J.of Burn Care and Rehabil. 15:232-235, 1994]. 표 1에 나타낸 바와 같이, 9개의 돌연 변이체는 모두 야생형과 25A12 및16G을 제외한 투여량에서 P≤0.05이라는 점에서 상당히 차이점을 나타내고 있었는데, 이는 더욱 높은 투여량인 5×10⁵세포에서 야생형과 크게 다르지 않은 결과였다. 표 1에 나타낸 데이터와 더불어서, 돌연 변이체 33A9는 또한 더욱 높은 투여량인 5×10⁵에서 조차도 폐사율을 나타내지 않았다.

우리는 보다 약한 병원성인 9개의 돌연 변이체에 공지된 유전자들이 삽입되어 있는지 여부를 결정하기 위하여 DNA 블럿 분석법 및 DNA 서열 분석법을 사용하였다. DNA 블럿 분석법을 통하여 돌연 변이체 ID7은 이전에 식물 및 동물 모두에서 피.아에루기노사에 대한 중요한 병원성 인자라는 것을 알아낸 gacA 유전자내에 TnphoA 삽입물을 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있었다[Ausubel et al.,Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원); Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995] 및 피.아에루기노사 균주PAK[Ishimoto and Lory, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:1954-1957, 1989] 및 PAO1[Holley et al.,Microbiol.Rev.43:73-102, 1979]. 다른 8개의 돌연 변이체에 있어서는 역방향 중합 효소 연쇄 반응(IPCR)을 사용하여 TnphoA 삽입 부위에 인접한 DNA 서열에 대응하는 증폭 산물을 생성하였다[Ochman et al., A Guide to Methods and Applications, eds., Innis, M.A.,States, D.J.,1990]. 상기 IPCR 산물은 클로닝되어 DNA 서열 분석법에 의해 분석되었다. 돌연 변이체 Pho15는 이미 GenBank에 기탁시킨(수탁 번호 U84728) 피.아에루기노사 유전자(균주 PA10)내에 삽입된 TnphoA 유전자를 포함하였다. 세포질 이황화 결합 형성 효소를 코드화하는 아조토박터 비넬란디(Azotobacter vinelandii) dsbA 유전자와 매우 고도의 유사성을 보였다[Bardwell et al., Cell 67:581-189, 1991]. 세균성 식물 병원체(phytopathogen)인 어위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi) 및 사람 병원성인 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 비브리오 콜레라(Vibrio chollera)내 dsbA의 상동체가 병원성 발생에 요구된다[Shervchik et al., Mol.Microbiol 16:745-753, 1995; Peek and Taylor, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6210-6214, 1992; Watarai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:4927-4931, 1995]. BLASTX 프로그램을 사용한 컴퓨터 분석에 의하여 존재하는 TnphoA의 7개의 삽입물에 대응하는 DNA 서열모든 가능한 리딩 프레임내에서 해독되며, 임의의 공지된 유전자들과 그다지 유사성을 갖지는 않은 것으로 밝혀졌다(표 1).

상기 병원성이 약한 9개의 돌연 변이체가 전술된 1차 균력 인자 및/또는 대사 경로가 결함되었다는 사실을 기초로 하여 상기 병원성이 약한 9개의 돌연 변이체를 분류하는 여러 가지의 생화학적 시험을 수행하였다. 모든 돌연 변이체에 대하여 프로테아제, 엘라스타제(elastase) 및 포스포리파제 활성 및 이들의 2차 대사 산물인 피오시아닌을 분비하는 능력에 대한 검정법을 수행하였다[Toder et al.,Mol.Microbiol. 5:2003-2010, 1991; Essar et al.,J.Bact. 172:884-900, 1990;Ostroff and Vasil, J.Bacteriol.169:4597-4601, 1987]. 피오시아닌은 반응성 산소 매개물을 발생시켜 포유 동물 및 세균 세포를 사멸시키고 피.아에루기노사 균력 인자로서 포함되는 대부분의 임상 균주에 의해서 분비되는 산화 환원-활성을 갖는 페나진 화합물이다[Hassett et al.,Infect. Immun.60:328-336, 1992;Kanthakumar et al.,Infect. Immun.61:2848-2853, 1993;Miller et al.,Infect. Immun. 64:182, 1996]. 돌연 변이체 33C7, 33A9, 34H4, 25F1 및 16G12는 사용된 임의의 생화학적 검정법에서 어떠한 결함도 나타내지 않았다. 돌연 변이체 Pho34B12는 혈청 아가 플레이트 상에서의 용혈 활성이 감소되었고, 엘라스타제 활성도 저하되었으며(~50%) 검출 가능할 정도의 피오시아닌 생산도 나타내지 않았다. 돌연 변이체 Pho15는 엘라스타제 활성만을 나타내었으며 야생형에 비하여 단백질 분해 활성이 저하되었다. 돌연 변이체 25A12는 엘라스타제 활성이 50% 감소되었다. 최종적으로, gacA에 삽입물을 포함하는 돌연 변이체 1D7는 야생형에 비하여 피오시아닌 수준이 약 50% 감소되었다. 돌연 변이체 1D7에 더하여 2차 독립 gacA::TnphoA 돌연 변이체, 33D11이 식물 스크리닝에 의하여 동정 되었다. 상기 후자의 돌연 변이체 역시 피오시아닌 생산이 유사한 정도로 감소되었으며 식물 및 마우스 모두의 경우에서 균력이 감소되었다.

상기 돌연 변이체들의 DNA 서열 분석 및 생화학 시험 방법에 기초하여, 돌연 변이체 1D7 및 Pho34B12내 TnphoA 삽입물에 의하여 타겟팅된 유전자들이 추가의 분석을 위하여 선택되었다. 상기 논의된 바와 같이, 1D7는 이미 피.아에루기노사내 균력 인자를 코드화하는것으로 밝힌 gacA 유전자내에 삽입물을 포함하였다[Rhame et al.,Mol.Microbiol. 22:715, 1996]. 그러나, 2개의 gacA::TnphoA 삽입물(1D7 및 33D11), 이미 구성된 gacA 삽입 돌연 변이체[Ausubel et al.,Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원); Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995] 및 몇몇 공지된 균력 인자 생성에 영향을 미치는 독립적으로 구성된 피.아에루기노사 gacA 돌연 변이체 모두는 하나 이상의 유전자 즉, gacA의 하류에 바로 인접해 있는 이.콜라이 uvrC 유전자의 상동체에 극성 효과를 미쳤다. 본원에 기술된 gacA 유전자의 하류 유전자에 대한 극성 효과에 따르기 보다는 오픈 리딩 프레임 그 자체의 결함에 따른 결과인 gacA 돌연 변이체의 병원성 표현형 상실의 명백한 증거를 제공하는 데에 있어서, 우리는 카나마이신 내성을 부여하는 유전자를 코드화하는 DNA 카세트를 사용한 UCBPP-PA14내 비국성 gacA 돌연 변이체를 구성하였다. 중요한 것은, 비극성 gacA 돌연 변이체가 상기 gacA::TnphoA 돌연 변이체(1D7)과 같이 마우스 검정법(폐사율 50%) 및 아라비돕시스 검정법(4일 경과후 3×105 cfu/㎠ 수준까지 생장)에서 동일한 감소 수준을 보였으나, 극성 gacA 돌연 변이체의 과도한 UV 감수성은 보이지 않았다는 것이다. 1D7과 같이, 상기 비극성 gacA 돌연 변이체는 또한 야생형에 비하여 저하된 수준으로(50%) 피오시아닌을 분비하였다.

추가 분석용으로 돌연 변이체 Pho34B12가 다음과 같은 이유로 선택되었다. 첫째, Pho34B12내 삽입물은 피.아에루기노사 피오시아닌 생물 합성 유전자 phnA 및 phnB(Essar et al., J.Bact.172:884-900, 1990) 즉, 이전에 특징화된 바 없는 피. 아에루기노사 게놈의 어느 지역내 하류에 바로 위치하기 때문이다. 두번째, 상기 Pho34B12 삽입물은 엘라스타제 및 용형 활성의 감소를 포함하는 다면적 표현형(pleiotropic phenotype)을 나타내는데, 이는 Pho34B12 TnphoA 삽입물이 위치하는 유전자가 다양한 병원성 인자의 조절자를 코드화할 것이라는 것을 시사해 주는 것이다.

Pho34B12내 2차 돌연 변이가 TnphoA 삽입물보다 병원성 표현형 상실에 보다 영향력이 있다는 사실에 대한 가능성을 배제하는데에 있어서, 우리는 상기 Pho34B12::TnphoA 돌연 변이체를 상동성 제조합에 의하여 이에 대응하는 야생형의 유전자와 치환시켰다. 이는 식물 및 동물 모두에서의 병원성 결함 뿐만 아니라 용혈 활성 및 탄력 섬유 분해 활성의 복구 및 야생형 수준만큼의 피오시아닌 생산을 결과하였다.(이하 표 2 참조)

a:상기 표 1의 설명 참조

상기 표 2의 결과로부터 Pho34B12내에 TnphoA가 삽입되면 병원성 상실과 같은 상기 균주의 다면적 표현형을 발현시킨다는 것을 알 수 있다. 상기 Pho34B12::TnphoA 삽입물(하기 참조)의 다음에 위치하는 종결 코돈의 500bp 하류에 ORF들이 존재하지 않을 것이라는 사실은 TnphoA가 돌연 변이체 Pho34B12의 표현형에 영향력이 있는 하류 유전자에 극성 효과를 나타내지 않을 것이라는 예상을 가능케 한다. Pho34B12 및 phnAB 지역의 일부를 포함하는 3.7kb의 삽입 서열을 포함하는 플라스미드(pLGRE34B12)를 갖는 Pho34B12에 대한 유전자 상보성 분석결과 엘라스타제 활성 및 용혈 활성이 야생형의 수준으로 복구되었으며 피오시아닌도 야생형의 경우보다 10배 이상으로 과잉 생산되었다는 사실을 알 수 있었다(표 2). 그러나, 아라비돕시스 및 마우스 모두에서의 Pho34B12의 결함된 병원성 표현형은 pLGRE34B12에 의해서 보완되지 않았는데(표 2), 이는 대부분 Pho34B12에 대응하는 야생형 유전자의 복수개의 복사본이 존재하기 때문일 것이다.

추가의 DNA 분석법에 따르면 Pho34B12 돌연 변이체는 반대 방향으로 전사되어 지는 거의 완벽히 오버래핑되는 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF1 및 ORF2)을 코드화한다는 사실을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, ORF1은 2개의 잠재성 메티오닌 개시 코돈(ORF1-S 및 ORF1-L)을 가졌다. ORF1-S 및 ORF1-L에 의해서 코드화되는 예상 단백질들은 다수의 원핵 생물 막의 지질 단백질에서 발견되는 지질 부착 부위와 대응하는 교감 모티브(consensus motif)를 포함하였다[Hayashi and Wu, J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471, 1990]. 상기 막 지질 단백질은 전구체 신호 펩타이드로 합성되는데, 이는 Pho34B12 삽입물의 Pho+ 표현형을 설명해 주는 것이다[Hayashi and Wu, J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471, 1990]. ORF2에 의해 코드화되는 예상 단백질은 전사 조절자인 LysR 군에서 발견되는 '헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix)' 모티브와 유사한 N-말단 '헬릭스-턴-헬릭스' DNA-결합 모티브를 포함하였다[Henikoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:6602-6606, 1988; Viale et al.,J.Bacteriol., 173:5224-5229, 1991]. 상기 단백질 군들은 포유 동물 및 식물 병원성 발생에 관여하는 조절자들을 포함한다[Finlay and Falkow, Microbiol. and Mol. Biol. Rev.61:136-169, 1997]. 거의 완벽하게 오버래핑되는 2개의 기능성 ORF의 존재는 세균 세포에서는 이례적인 경우이다.

Pho34B12 지역에서 코드화되는 ORF들중 어느 것이 기능성인지 결정하기 위하여, ORF1-S, ORF1-L 및 ORF2에 대응하는 PCR 산물을 포함하는 플라스미드를 사용하는 상보성 분석을 추가로 수행하였다(도 7). 피오시아닌 및 탄력 섬유 분해 활성의 발현은 ORF2에 의하여 코드화되는 단백질을 합성하는 플라스미드(pRRLE2)에 의하여 야생형 수준의 20-40%까지 복구된다. 이와 유사하게, 상기 보완된 균주의 용혈 활성도 부분적으로 복구된다. ORF1-S 및 ORF1-L과 각각 대응되는 플라스미드 pRRLE1 및 pRRLE15로 보완된 Pho34B12의 상보성 역시 용혈 활성, 피오시아닌 활성 및 탄력 섬유 분해 활성이 복구된다. 그러나, 흥미롭게도 플라스미드 pRRLE1 및 pRRLE15가 존재하는 경우에는 엘라스타제 활성 수준이 2배 상승하였으며 피오시아닌 생성도 10배 상승하였다. pRRLE1, pRRLE15 뿐만 아니라 pRRLE2 모두는 식물 또는 동물에서 돌연 변이체 Pho34B12의 병원성 표현형 상실을 보완하였다(표 2). 부위 편향성 돌연 변이 유발(site directed mutagenesis)을 포함하는 이러한 지역들에 대한 추가적인 특징화는 3개의 ORF들중 어느 것이 식물 및 동물의 병원성에 필요한지를 추가로 밝혀줄 것이다.

상기 제시된 데이터는 포유 동물의 병원성 유발에 중요한 역할을 하며 이전에 공지된 바 없는 피.아에루기노사 균력 인자(유전자)들이 식물내 약화된 병원성 증상을 보이는 것들에 대한 피.아에루기노사 돌연 변이체를 랜덤하게 스크리닝함으로써 용이하게 동정될 수 있음을 말해주는 것이다[Ausubel et al.,Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원); Rahme et al., Science 268:1899-1902, 1995]. 다른 한편으로, 식물에서 보다 약한 균력 활성을 나타내는 분리된 9개의 돌연 변이체 모두가 마우스에서도 약한 병원성을 나타낸다는 것은 예상하지 못했다. 상기 결과를 가장 간단하게 해석하면 식물 및 동물에서 피.아에루기노사 병원성이 발현되는 데에는 기본 균력 유전자로 생각될 수 있는 유전자 세트를 실질적으로 오버래핑하는 것이 필요하다는 것이다. 다른 해석은 동정된 유전자들중 몇몇(즉, Pho34B12)은 조절 단백질을 코드화할 수 있으며, 식물 또는 동물에 특이적일 수 있는 하위 세트인 상이한 주효 인자(effector) 분자를 조절한다는 것이다. 또한 이러한 연구(9개중 7개)에서 동정될 대다수의 돌연 변이체는 이전에 공지된 바 없는 유전자들에 대응할 것이라는 것은 예상하지 못했다. 쁘아종 분포 곡선을 사용하여 피.아에루기노사 5.9Mb에 대한 게놈 크기 및 1.1kb의 평균 유전자 크기를 계산한 결과, 시험되는데에 필요한 총 수의 25%인 시험된 2,500 돌연 변이체들은 상기 검정법에서 각 유전자의 시험에 약 95%의 확률을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다. 따라서, 피.아에루기노사 균력 돌연 변이체에 대한 스크리닝이 충분치 못하기 때문에, 발견되어져야 할, 병원성에 중요한 역할을 담당하고 있는 피.아에루기노사 유전자들이 아직도 많이 남아있는 것으로 보여진다.

중요한 것은, 식물 병원성 발현에 중요한 모델에서 동정된 것으로서 이전에 공지된 균력 인자(유전자)들중 2 이상은 마우스 화상 모델에서 피.아에루기노사에 대한 중요한 균력 인자일 뿐만 아니라, 다른 그램-음성 병원체에서도 중요한 균력 인자인 것으로 알려져 있다. 이들 후자의 병원성 인자(유전자)에는 dsbA 및 gacA를 포함한다[Shevchik et al. Mol.Microbiol.16:745-753, 1995;Peek and Taylor, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6210-6214, 1992; Watarai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4927-4931, 1995;Johnson et al.,Mol.Microbiol.22:715, 1996]. 이는 피.아에루기노사에서 동정된 다수의 이전에 공지된 바 없는 인자들이 일반적으로 그램-음성 병원성 발현(pathogenesis)에 관련되어 있을것이라는 점을 시사해 주는 것이다.

상기 연구를 통하여 얻을 수 있는 다른 중요한 결론은 지금까지 개발되어온 생체내 스크리닝법의 고처리량이 명백한 생화학적 결함과 관련되지 않은 병원성 인자들을 동정할 수 있다는 것이다. 돌연 변아체들 33C7, 33A9, 34H4, 25F1 및 16G12는 몇몇 공지된 피.아에루기노사 병원성 인자에서 검출 가능한 결함을 나타내지는 않았으며, 중요한 것은 돌연 변이체 33C7 및 33A9는 마우스 모델에서 가장 쇠약해졌다. 더욱이, 돌연 변이체 Pho34B12 및 25A12가 공지된 균력 인자의 생산아 감소되었음에도 불구하고, 상기 돌연 변이체들에 대응하는 유전자들은 이전에 동정된 바 없는데, 이는 상기 돌연 변이체에서 생화학적 결함이 간단한 고처리량 스크리닝법(high throughput screen)을 통하여 용이하게 효율적으로 동정될 수 없기 때문이다. 이는 병원성 표현형의 상실을 스크리닝하는 감수성을 확증해 주는 것이다.

지난 수년간, 세균 병원성 인자들의 동정용 고처리량 스크리닝법이 개시되었다. IVET(생체내 발현 기술)는 병원성 발현중에 특이적으로 활성화되는 프로모터를 동정하며[Wang et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93:10434-10439, 1996;Mahan et al., Science 259:686-688, 1993], STM(signiture-tagged transposon method)은 숙주내 생존에 필요한 유전자들을 동정하고[Hensel, Science 268:400-403, 1995] DFI(Differential fluorescence induction)는 특정 조건하에서 또는 특정 숙주 세포형에서 활성화되는 유전자를 동정하기 위하여 정렬한 녹색 형광 단백질 및 형광 활성화 세포를 이용한다[Valdivia and Falkow, Mol.Microbiol.22:367-378,1996]. 상기 방법은 본원에 기술한 방법중 하나와 상보적이며 각각의 방법은 장단점을 갖는다. 비 척추 동물인 숙주 세포내 스크리닝 방법의 장점중 하나는 상기 IVET 및 DFI 방법이 병원성-관련 유전자 발현을 측정하는 반면에, 본원 발명의 방법은 병원성을 직접적으로 측정할 수 있다는 것이다. STM 방법과는 달리, 접종에 사용되는 세균 돌연 변이체의 혼합 세포군에 의해 트랜스포손내에서 그 기능이 보완될 수 없는 유전자를 동정하는데에는 비 척추 동물에서 행해지는 본 발명의 스크리닝 방법은 각각의 돌연 변이체 클론을 시험하는 것을 포함한다.

기타 균력 타겟

상기 33A9 핵산 서열(도 5 및 도 6a-b)이 코스미드 클론 BI48에서도 동정되었다(도 1). 상기 코스미드는 전체 부분이 시퀀싱되었으며 이의 서열을 도 2에 나타내었다. 표준 데이터베이스 분석법을 사용하여, 몇몇 추가 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 동정하였다(도 3 및 도 4). 상기 분석법을 표 3에 요약하였다. 상기 서열들과 같이, 도 3 및 도 4에서 발견된 서열들중 임의의 하나는 병원체의 균력을 감소시키는 화합물을 스크리닝(예를 들어 본원에 기술된 방법들을 사용하여)하는데에 사용될 수 있다.

균주 PA14의 코스미드 pBI48로부터 수득한 서열은 33A9이 필리(pili) 유전자 클러스터의 약 5kb 상류에 위치한다는 사실을 밝혔다(도 1, 표 3). 상기 클러스터는 필리 형성을 조절하는데에 관여하는 것으로 알려진 pilS/pilR 유전자를 포함한다. 더욱이, 33A9의 상류 서열 분석법은 이전에 동정된 서열과 어떠한 상동성도 보이지 않았는데, 이는 33A9 주위의 모든 지역이 병원성 섬(pathogenecity island)을 정의할 수 있는 가능성이 있음을 시사하는 것이다. 도 3(orf19544), 도 4((orf19544), 5, 6a 및 6b는 상기 33A9 뉴클레오타이드 및 동정된 ORF들을 나타내고 있다.

더욱이, 상기 pBI48 코스미드 클론으로부터 수득된 서열을 분석하면 33A9의 약 2kb 하류에 위치하는 서열을 발견할 수 있으며, 이는 곧 tRNA 서열들(도 1, ORF 22626)이 매우 강한 상동성을 갖는다는 것을 알려주는 것이다. 상기 tRNA 서열들의 상류에 위치하는 지역을 분석한 결과 상기 데이터베이스에 존재하는 서열과 어떠한 상동성도 보이지 않았기 때문에, 또한 tRNA 서열이 DNA 삽입에 대한 "열점(hot spot)"을 나타내기 때문에, 우리는 상기 tRNA 서열이 PA14내에 존재하는 병원성 섬 삽입 위치의 오른쪽 경계라는 가정을 세웠다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 삽입된 외래 DNA 조각을 나타낼 수 있는 지역의 크기는 약 25kb이다. 추정의 병원성 섬의 상류에 위치하는 경계를 동정하는 것은 삽입된 DNA 조각의 정확한 크기를 확정하는 데에 도움이 될 것이다. 더욱이, 상기 33A9 지역을 분석한 결과 일체화 효소(integrase) 및 전위 효소(transposase)에 대한 단백질 수준에서의 상동성을 갖는 하나 이상의 서열(각각 ORF 21421, ORF 8109)이 존재한다는 것을 알 수 있었다. 마지막으로, 본원의 데이터를 통하여 상기 33A9 위치는 몇몇 병원성이 강한 피.아에루기노사 임상 분리 균주내에는 존재하지만, PAO1 즉, 피.아에루기노사의 병원성이 약한 균주내에는 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

상기 pBI48 코스미드로부터 얻어진 시퀀싱 데이터는 또한 세포 부착에 관련된 인식 모티브를 포함하는 33A9 유전자를 플랭킹하고 있는(flank) 2개의 서열이 존재한다는 것을 나타내었다. 33A9의 상류 및 하류인, ORF11738(2436bp) 및 ORF23228(2565bp)의 서열(도 1) 분석 결과, 상기 2개의 오픈 리딩 프레임내 RGD 모티브가 존재한다는 것을 알 수 있었다. RGD 트리펩타이드 서열은 숙주 세포 표면 인테그린(integrin)에 결합하는 특징적인 진핵 생물 인식 모티브이며 세균 부착에 관여하는 것으로 알려져 왔다. 숙주 세포를 모방함으로써, RGD 모티브를 포함하는 세균 부착 인자(bacterial adhesins)는 세포-세포 부착을 촉진하는데에 필요한 응답을 숙주내에서 효과적으로 수행할 수 있다.

상기 2개의 RGD-포함 ORF의 발현은 33A9 및 야생형 균주 PA14 모두에서 평가되었다. 전사 수준은 ORF11738 및 ORF23228의 내부 지역에 대응한 방사능 라벨링된 DNA 프로브로 혼성화시켜 결정할 수 있다. 돌연 변이체 33A9내 2개의 ORF는 야생형 PA14에 비하여 전사 수준이 감소되었으며, 이는 곧 ORF11738 및 ORF23228에 의해 코드화된 유전자들은 모두 33A9에 의해서 조절됨을 나타내는 것이다. 이들 데이터는 33A9이 숙주 세포 표면에 세균이 부착되는데에 관여하는 유전자 발현을 조절하는데에 영향력이 있는 다중 유전자(multigene) 조절자로서의 역할을 갖고 있다는 것을 말해주는 것이다.

더욱이, Ausubel et al.,Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity, USSNs 08/411,560(1995,3,25 출원), 08/852,927(1997, 5,7 출원) 및 08/962,750(1997,11,3 출원)에 기술된 식물 및 선충류 스크린 검정법(슬로우-킬링 검정법 또는 급속 사멸 검정법)을 사용하여, 균력이 감소된 슈도모나스 아에루기노사 균주의 몇몇 다른 돌연 변이체가 동정되었다.

슬로우-킬링 검정법(slow-killing assay)

슬로우-킬링 검정법에 있어서, 밤새 배양된 세균 배양액 10㎕를 NG 플레이트[Sulston and Hodgkin저 "The Nematode Caenorhabditis elegance, W.B.Wood, ed., Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory, 188, pp.587-606"에 기술된 NGM 아가를 수정하여(0.25% 펩톤 대신 0.35% 펩톤을 사용) 제작한 배양액] 상에 도말시킨후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 실온(23-25℃)에서 8-24시간 경과후 각각의 플레이트(지름 3.5㎝)상에 40-50마리의 자웅 동체인 L4 씨.엘레간스 균주 브리스톨(Bristol)의 알을 접종한후, 통계를 내기 위하여 1회 접종당 3-4회의 복사를 수행하였다. 이후 상기 플레이트를 25℃에서 배양시킨후 4-6시간 마다 죽은 벌레의 수를 측정하였다. 작은 솔로 건드렸을때 더 이상 움직이지 않고 아가미가 펌프 운동을 하지 않을때 이를 죽은 개체로 간주하였다. 검정된 돌연 변이체의 각 배취에 대해서, PA14 및 이.콜라이 OP50을 양성 및 음성 대조구로 사용하였다. 상기 플레이트의 벽에 고정되어 사멸한 임의의 벌레는 본 분석법에서 제외하였다. LT₅₀를 결정하기 위하여 데이터를 그래프로 나타내었다(사멸한 벌레 % vs 시험 균주에 노출시킨 시간(시)). 상기 데이터를 SYSTAT 5.2.1 프로그램을 이용하여 상기 공식에 대한 곡선: 사멸% = A+(1-A)/(1+exp(B-G×log(노출후 경과 시간)))에 적용시켰다(단, 여기서 A는 OP50 대조 실험에서 사멸한 벌레의 비율을 의미하는 것이고, B 및 G는 상기 곡선에 맞도록 변화 가능한 파라미터이다.) 일단 B 및 G가 결정되면, LT₅₀은 다음의 공식을 이용하여 계산된다. 즉, LT₅₀= exp(B-G)×(1-2×A)^(1/G).

상기 스크리닝을 진행하는 과정에서, 우리는 2개의 관찰 결과를 이용할 수 있다. 첫째, 벌레의 사멸 시간이 길수록, 더욱 많은 병원체 후손이 생산된다. 둘째, 애벌레 발달 단계가 이를수록 피.아에루기노사에 의한 사멸에 더욱 저항성이 강하다. 이와 같은 사실은 우리에게 병원 잠재성이 경미한 정도로만 결함된 TphoA 돌연 변이체 동정에 대한 편리하고 감수성이 뛰어난 검정법을 제공해 준다. 상기 약화된 돌연 변이체들은 벌레들을 사멸시키는데에 그 효과가 떨어지며, 생존 병원체들에 의한 병원체 후손 생산을 통하여 용이하게 관찰 가능한 표현형에서의 약화된 결함 조차도 효과적으로 증폭시킨다. 그러므로, 약화된 PA14::TphoA 돌연 변이체를 포함하는 플레이트상에서, 초기에 접종된 자웅 동체로부터, 수백 마리의 벌레들을 얻을 수 있다. 비병원성 돌연 변이체를 접종시킨 플레이트상에서는 5일이 경과할 때까지 수천 마리의 벌레가 생장하였으며 세균 로운(bacterial lawn)도 완전히 소모된 반면에, 야생형 균주가 접종된 플레이트상에서는 극소수의 또는 거의 살아있는 벌레들을 발견할 수 없었다. 예비 스크리닝을 통하여 동정된 추정되는 비병원성 또는 약화된 돌연 변이체들이 다시 시험되었으며, 이들의 균력 검정하여 씨.엘레간스-사멸 역학(killing kinetics)을 결정하였다.

급속-사멸 검정법

본 급속 사멸 검정법(fast-killing assay)은 슬로우-사멸 검정법과 같이, 질병-유발 미생물 균력 인자들을 동정하는데에 유용하다. 뿐만 아니라, 상기 검정법은 병원성을 억제시키거나 또는 유기체의 병원체에 대한 내성 능력을 증가시킬 수 있는 치료제를 동정하는 데에도 유용하다. 바람직한 구체예에서, 상기 급속 사멸 검정법은 화합물, 예를 들어 콜히친과 같은 독소에 대한 투과성이 증가된 선충류 균주를 사용하여 수행된다. 이와 같이 투과성이 증가된 선충류의 예로서는 -이에 한정되는 것은 아니지만- 예를 들어 PGP-1, PGP-3 또는 MRP-1과 같은 P-당단백질에 돌연 변이가 발생한 동물들을 포함한다. 이러한 돌연 변이 선충류는 막투과성이 증가됨에 따라 독소들에 대한 감수성이 증가되었기 때문에 상기 급속 사멸 검정법에 유용하다. 이와 같은 특징으로 인하여 독소 화합물에 대하여 전체적인 감수성 및 내성간의 차이가 증가된 검정법을 수행할 수 있는 것이다. 상기 급속 사멸 검정법은 또한 이하 기술된 바와 같이 배양 배양액의 삼투성을 증가시킴으로써도 수행될 수 있다.

본원에서 사용된 급속 사멸 검정법의 조건은 다음과 같다. 즉, KingsB에서 밤새 생장시킨 PA14 배양액을 펩톤-글루코즈 배양액(PG)(1% Bacto-Peptone, 1% NaCl, 1% 글루코즈, 1.7% Bacto-Agar)를 함유하는 플레이트(지름 3.5㎝)상에 도말하였다. 급속 사멸 효율은 삼투압에 의존하는 것으로 밝혀졌으므로, 상기 배양액에 0.15M의 솔비톨을 첨가하여 PG 배양액을 개질시켰다. 상기 세균 배양액을 도말한후, 플레이트를 37℃에서 24 시간 동안 배양시킨후 8-12시간 동안 실온에 방치하였다. 15-20마리의 벌레들이 상기 틀레이트에 방치되었는데, 이후 다시 이를 25℃에서 배양시켰다. 각각의 독립적인 검정법들은 3-4개의 복사판(replicate)으로 구성되었다. 벌레의 폐사 여부를 시간별로 측정하였는데, 이때 상기한 바와 같이 건드렸을때 반응을 하지 않는 개체들을 죽은 것으로 간주하였다. 이.콜라이 균주 DH5α를 상기 급속 사멸 검정법의 대조구로 사용하였다.

이들 균주를 상기 동정된 균주들과 함께 분석한 결과, 이들은 다음을 포함하는 몇몇 상이한 군으로 분류되었다: 어떤 돌연 변이체들은 식물 및 선충류 모두에 대하여 약한 병원성을 나타낸 반면에, 다른 돌연 변이체들은 병원성이 식물 또는 선충류중 어느 한쪽에서만 병원성이 감소되었을뿐 양쪽의 경우 모두에서 감소되지는 않았다. 식물에서 약한 병원성을 나타낸 세균 돌연 변이체들은 침윤후(days post-infiltration;DPI) 4일째 되는날 동일한 실험 세트내에서 2개의 표준 편차의 평균 최대 역가(5개의 잎 시료에서 얻어진)는 야생형의 경우에 비하여 낮았다. 4 DPI에서의 야생형에 의하여 이르른 최대 수준은 식물 방어 반응 생장 조건에서의 최소의 변수로 인하여 실험들 사이의 최대치만큼 다양할 수 있었기 때문에 상기 야생형 대조구가 필요했다. 이와 유사하게, 상기 생장중인 벌레들의 50%가 사멸되는데에 요구되는 평균 시간(3개의 복사판으로부터의 LT₅₀)이 동일 실험에서의 야생형 PA14의 LT₅₀보다 작은 2개의 표준 편차를 나타내었다면 돌연 변이체는 병원성이 감소된 것으로 특징지워 진다.

일반적으로, 식물에서의 병원성이 감소된 돌연 변이체 균주들은 16G12, 25A12, 33A9 및 33C7을 포함하였고; 선충류에서 병원성이 감소된 돌연 변이체 균주들은 35A9, 44B1, 1G2, 8C12 및 2A8을 포함하였으며, 식물 및 선충류 모두에서 병원성이 감소된 균주들은 25F1, 41A5, 50E12, pho15, 12A1, pho23, 34B12, 34H4, 3E8, 23A2 및 36A4를 포함하였다. 표 4 및 표 5(이하)에 이들 돌연 변이체들의 병원성 표현형이 요약되었다. 삽입 돌연 변이로 인하여 균력이 감소된 균주들 각각에 대하여 서열 분석을 수행하였다. 표 4 및 표 5에 요약한 바와 같이, DNA 서열 분석을 통하여 신규의 그리고 공지된 유전자들이 본원 발명의 스크린 검정법을 통하여 동정되었음을 알 수 있었다. 50E12 및 41C1으로부터 얻은 서열들은 이.콜라이내에서 알려지지 않은 기능을 갖는 이미 기술한 오픈 리딩 프레임(ORFs)과 매우 유사하였다. 돌연 변이체 35A9는 엔.고노로이아에(N.gonorrhoeae)(SwissProt P39897)의 mtrR 상동체를 동정하였다. 돌연 변이체 25F1은 씨.테피디움(C.tepidium)의 orfT, MPK 및 DjlA_Ec-와 동일한 오페론 코드화 3 단백질을 동정하였다. 48D9, 35H7 및 12A1으로 부터 수득된 서열들은 각각 lemA, gacA, rasR 유전자들과 대응되었다. 돌연 변이체 41A5 및 44B1내 결함된 서열(disrupted sequence)들은 GenBank에 기탁된 임의의 서열과 거의 상동성을 보이지 않았다(PAO1 데이터베이스내 44B1 삽입 서열에 대응하는 서열이 동정되지 않았기 때문에 44B1-서열 태그는 단지 148bp). 따라서, 상기 서열들은 균력 인자들을 추가로 동정하였다. 상기 실험들을 통하여 수득된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열들을 도 10, 11, 12, 13, 14a, 14b, 15, 16, 16a, 16b, 17, 18a, 18b, 18c, 18d 및 18e 및 도 22, 23, 24a, 24b, 24c, 24d, 24e, 25, 26, 27 및 28에 나타내었다.

우리는 또한 TphoA 돌연 변이체인 41A5, 50E12, 41C1, 35A9, 48D9, 12A1, 44B1 및 35H7에 대하여 포유 동물 병원성에 중요한 공지의 피.아에루기노사 균력 인자에 결함을 포함하는지의 여부를 평가하는 표준 생화학 시험의 준비를 마련하였다. 상기 시험에는 다음의 것을 포함하였다: 과산화수소에 대한 감수성 검정용 표준 플레이트 검정법 및 세포외 단백질 분해 효소, 엘라스티제, 포스포리파제C 및 피오시아닌의 표준적 정량 분석. 다음의 경우를 제외하고, PA14TphoA 돌연 변이체즐의 대다수는 부모 PA14 균주와 생화학적으로 구별이 되지 않았다. 돌연 변이체 12A1은 탄력 섬유 분해 활성 및 단백질 분해 활성이 감소되었으나 피오시아닌은 과잉 생산되었다. 돌연 변이체 50E12는 PA14보다 피오시아닌의 생산 수준이 3배 높았다. 돌연 변이체 41A5는 단백질 분해 활성이 야생형의 약 70%였다.

상기 슬로우 킬링 검정법을 사용하여 동정된 돌연 변이체들 각각의 DNA 서열에 대한 분석 및 생화학적 분석법에 대한 상세한 설명을 이하 절에서 제시하고자 한다.

돌연 변이체 12A1

12A1내 상기 Tn phoA 삽입 서열을 이미 기술한 피.아에루기노사 PA01의 lasR 유전자의 코돈 154에 삽입하였다. 12A1의 표현형은 다른 공지의 lasR 돌연 변이체와 마찬가지로, 다면 발현성으로서, 여기에는 엘라스타제 및 프로테아제 생산의 감소를 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 12A1은 정상기의 부모 PA14 균주보다 피오시아닌 합성이 2-3배 증가하였다. 더욱이, GTP(PA14lasR:;GFP19-1)을 발현시키는 lasR 돌연 변이체는 투여후 48시간 경과후 씨.엘레간스 창자내에서의 형광성이 매우 낮게 검출된 것으로 보아 벌레의 장에서 생존하지 못하였음을 알 수 있었다.

도 34a는 12A1의 결함된 선충류의 슬로우 킬링 표현형은 피.아에루기노사 PAO1 lasR 유전자가 균주 12A1(pKDT17)내 본질적 lacZ 프로모터(constitutive lacZ promoter)의 제어하 트랜스포손내 발현될때 완벽하게 복구되었다. 12A1(pKDT17)내에서의 엘라스타제 생산도 역시 야생형 수준으로 복구된 것으로 관찰되었으마, 피오시아닌은 과잉 생산되지는 않았다. 피오시아닌-과잉 생상 표현형은 예상되지 않았기 때문에, 우리는 상기 PA14 게놈내 젠타마이신 카세트에 의하여 결함된 lasR 유전자의 마커를 변형시켜 신규의 lasR 돌연 변이체인 lasR::Gm을 구성하였다. 상기 lasR::Gm 돌연 변이체는 12A1과 같이 비병원성이었으나(도 34a), 피오시아닌은 정상 수준으로 합성되었는데, 이는 곧 12A1에 피오시아닌 합성의 상승 조절의 결과를 가져오는 2차 돌연 변이가 잠복되어 있음을 시사해 주는 것이다. 상기 결과는 또한 약화된 병원성 표현형과 정상기가 무관한 동안 피오시아닌 합성이 상승 조절된다는 것을 나타내는 것이었다.

돌연 변이체 pho15

pho15내 dsbA 유전자의 결함이 비병원성 표현형에 영향려이 있다는 사실이 밝혀졌다. 도 24b는 PA14pho15의 뉴클레오타이드 서열(서열 166) 및 예상 아미노산 서열(서열 167)을 나타내고 있다. 씨.엘레칸스내 pho15의 병원성 결합 표현형은 또한 pho15 배경에서 이.콜라이 dsbA_Ec유전자 또는 트랜스포손내 PA14dsbA_Pa유전자의 본질적 발현(constitutive expression)에 의해서 완전히 복구된다는 사실을 알 수 있었다(도 34b). 이 실험에 있어서, 상기 이.콜라이 dsbA_Ec유전자는 다음과 같이 pUCP18에 클로닝되었다. PCR-증폭된 이.콜라이 dsbA 유전자를 pBAD18의 KpnI 및 XbaI 부위에 클로닝시켜 pCH3을 제조하였다. 이로써 상기 이.콜라이 dsbA 유전자를 이.콜라이의 아라비노즈 프로모터의 조절하에 두었다. 이.콜라이 dsbA를 포함하는 700bpKpnI/SphI 절편을 pUCP18의 KpnI/SphI 부위에 클로닝시켜 pEcdsA를 제조하였으며, 이로써 이.콜라이 dsbA 유전자를 이.콜라이의 본질적 lacZ 프로모터 조절하에 두었다. pEcdsA는 실질적으로 PA14 및 pho15를 형질 전환시켜 각각 균주 PA(pEcdsA) 및 pho15(pEcdsA)를 구성하였다.

PA14dsbA_Pa는 다음과 같이 구성되었다. PA01(GenBank 수탁 번호 U84726)의 dsbA 서열을 기초로 하여, 프라이머TMW8(5'-GCACTGATCGCTGCGTAGCACGGC-3', 서열 177) 및 프라이머 TMW9(5'-TGACGTAGCCGGAACGCAGGCTGC-3', 서열 178)이 dsbA 유전자 및 PA14의 게놈성 DNA로부터 얻은 dsbA 유전자의 해독 시작 부위의 상류 176bp를 포함하는 1126bp 절편을 증폭시키는데에 사용되었다. 상기 절편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)을 사용하여 pCR2.1로 클로닝시켜 pCRdsbA 를 제조하였다. 상기 SalI/XbaI 절편-포함 dsbA를 SalI/XbaI 절단된 pUCP18로 클로닝시켜 pPAdsbA를 구성하였으며, 이로써 상기 dsbA를 본질적 lacZ 푸로모터의 조절하에 두었다. 균주 pho15(PAdsbA)는 pho15를 pPAdsbA_Pa로 형질전환시켜 제조되었다.

돌연 변이체 25F1

25F1에서, TnphoA는 338 아미노산 단백질을 코드화하는 추정 유전자 (orf338)의 코돈 100내 즉, 추정 3-유전자 오페론의 첫번째 유전자에 삽입된 것으로 밝혀졌다. 상기 예상 하류 유전자(orf224 및 orf252)는 각각 224 및 252 아미노산 단백질을 코드화하는 것이다. GAP 분석에 따르면 orf338은 씨.테피듐(C.tepidum)(GenBank 수탁 번호 U58313)의 orfT와 28.5% 동일(37.7% 유사)하였다. ORF224의 BLASTP가 진핵 생물, 원시 세균(archebacteria), 시아노박테리아 및 마이코박테리아로부터 만노즈-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라제(MPG;EC2.7.7.13)을 동정하였으나. 피.아에루기노사와 근연 관계에 있는 프로테오박테리아로부터는 그렇지 못하였다.공지의 모든 MPG들이 359-388 아미노산으로 구성된 반면에, ORF224는 224 아미노산으로만 구성되었기 때문에 ORF224가 기능성 MPG인지는 분명하지 않다. ORF252는 이.콜라이 Djl_Ac와 상동성이다. Djl_Ac는 2-성분 히스티딘 키나제 신호-전달 시스템을 포함하여 정확한 어셈블리, 막 단백질의 활성 및/또는 수를 유지하는 역할을 하는 것으로 생각된다.

orf338이 벌레의 병원성 감소에 영향력이 있는것인지의 여부를 시험하기 위하여, 우리는 orf338만을 포함하는 균주, 25Fl(pORF338)의 사멸 역학을 야생형 PA14 및 25F1 포함 벡터들과 비교하였다. 상기 25Fl(pORF338)은 다음과 같이 구성되었다.

1.8kb PCR-절편 포함 482bp 상류 프로모터 서열, 전체 길이의 orf338 및 말단이 잘린 orf224를 프라이머 F2327(5'-CGAGGAATCCAGTCGAGGTG-3', 서열 179) 및 프라이머R4180(5'-GCAAGATGCAGCCGAGAGTAG-3', 서열 180)을 사용하여 PA14 게놈성 DNA로부터 증폭시켰다(ExpandTM High Fidelity System, Boehringer Mannheim). 결과로 얻어진 산물을 벡터 pCR2.1(TA Cloning, Invitrogen)에 클로닝시켜 플라스미드 pMT403C-R을 구성하였다. pMT403C-R로 부터 수득된 SacI/XbaI 절편 즉, 상기 PCR 산물을 포함하는 절편을 pUCP18의 SacI/XbaI에 클로닝시켰는데, 이로써 orf338을 이의 본래의 프로모터(native prmoter)의 조절하에 두었다. 25F1을 pORF338로 형질 전환시켜 균주 25F1(pORF338)을 제조하였다.

뿐만 아니라, 전체 오페론(orf338, orf224 및 djlA_Pa)을 포함하는 균주는 다음과 같이 구성되었다. PCR 기술을 사용하여 orf338, orf224 및 djlA_Pa을 포함하는 3.6kb 게놈성 절편 및 이들의 상류 전사 서열을 프라이머RIF3115(5'-GTCAGAATTCTCAGCTTGACGTTGTTGCCC-3', 서열 181) 및 RIR6757(5'-GTCAGAATTCGACTTCTATTACCGCGACGCC-3', 서열 182)를 사용하여 증폭시켰다. EcoRI 부위(밑줄친 부분)는 프라이머내에 존재하나, 게놈성 서열에는 존재하지 않았다. 상기 PCR 산물의 양 사슬을 시퀀싱하여 균주 PA14내 orf338, orf224 및 djlA_Pa서열을 결정하였다. pUCP18의 EcoRI 부위로 상기 PCR EcoRI 절단 산물을 클로닝시켰으며, 이때의 삽입 방향은 제한 절단에 의하여 결정된다. orf338, orf224 및 djlA_Pa가 존재하는 플라스미드 p3-ORF들을 그들 본래의 프로모터의 조절하에 두었으며 이후 이들은 25F1을 형질 전환시켜 균주 25F1(p3-ORF)을 제조하는데에 사용되었다.

도 34c에 나타낸 바와 같이, 균주 25F1(pORF338)는 상기 슬로우 킬링 표현형과 완전히 상보적이지는 않았다. 균주 25F1(p3-ORF) 즉, 전체 오페론(orf338, orf224 및 djlA_Pa)을 포함하는 균주 25F1 또한 돌연 변이체 표현형과 부분적으로 상보성을 나타냈다. 이와 같은 결과는 상기 TnphoA가 병원성 표현형에 영향력이 있다는 것을 나타내는 것이며; 부분 상보성은 유전자 도스량에 따른 결과일 수 있다. 균주 25F1(pORF338)에 비하여 25F1(p3-ORF)에 의한 폐사율이 더욱 높은 것은 하류 유전자, ORF224 및/또는 DjlA_Pa역시 PA14 균력 발현에 역할을 할 수 있다는 것을 추가로 시사해 주는 것이다.

도 24e는 ORFT(서열 174), ORFU(서열 175) 및 DjlA_Pa(서열 176)을 코드화하는 PA14 25F1의 뉴클레오타이드 서열(서열 173)을 나타내는 것이다.

돌연 변이체 50E12

50E12내 TnphoA 삽입물이 이.콜라이의 PstP_Ec단백질과 43% 동일한(54% 유사한) 예상 759 아미노산 단백질의 코돈 39내에 삽입되었다. 서열 분석을 기초로 하여, pstP_Ec단백질은 효소 INtr, 즉 N-말단 Nif-A 도메인 및 C-말단 효소I 도메인을 갖는 738 아미노산 단백질을 코드화하는 것으로 예상된다. 여기서 상기 후자는 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템에서 기능을 한다. 상기 Nif-A 도메인은 신호 전달 기능, 즉 직접적으로 작은 분자 신호를 감지하거나 또는 NtrL-유사 단백질로부터 신호를 수용하는 것으로 생각된다. 둘중 하나의 기작은 효소I 도메인의 촉매 활성을 조절할 수 있는데; 이로써 포스포릴라제 NPr(질소-관련 HPr)이 RpoN-의존성 오페론의 전사를 조절한는 것을 시사해 준다. 곧 상기 PA14pstP_Pa상동체의 상류는 PST_Pa와 함께 전사되는 것으로 보이는 159 아미노산 단백질을 코드화하는 것으로 예상되는 오픈 리딩 프레임(orf159)이다. 도 24c는 YgdP_Pa(서열 169) 및 PST_Pa(서열 170)을 코드화하는 PA14 50E12의 뉴클레오타이드 서열(서열 168)을 나타내는 것이다. ORF159는 에치.인플루엔자(H.influenza)(GenBank 수탁 번호 Q57045) 및 이.콜라이(GenBank 수탁 번호 Q46930)에서 발견되는 공지되지 않은 기능의 YgdP 단백질과 62.3-64%의 동일성을 나타낸다. 상기 단백질들은 헬리코박터 피로리(Helicobacter pyrori) 및 바토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis)내 침입 단백질A와 매우 관련성이 많다. 비.바실리포르미스 침입 단백질 A(SwissPort 수탁 번호 P35640)는 ailA에 의해서 코드화되는데, 여기서 이와 함께 존재하지만 독립적으로 전사되는 유전자 ailB는 이.콜라이에 사람의 적혈구를 침입하는 능력을 부여한다.

50E12의 상보성에 대하여, 2개의 균주가 시험되었다: 50E12(pMT206-lac) 및 50E12(pMT206-nat). 균주 50E12(pMT206-lac)는 플라스미드 pMT206-lac를 포함하였는데, 이로써 orf159 및 pstPPa의 전사를 본질적 lacZ 프로모터의 조절하에 두었다. 이들 균주 각각은 다음과 같이 구성되었다.

양 말단에 EcoRI 부위를 포함하는 4.3 kb PCR 절편을 다음의 프라이머들을 사용하여 피.아에루기노사 PA14의 게놈성 DNA로부터 증폭시켰다. 즉, 프라이머 RIF1698(5'-GTCAGAATTCGATGTTCCAGTCCCAGATCCC-3'; 서열 183) 및 RIR6002(5'-GTCAGAATTCCAGTAGACCACCGCCGAGAG-3'; 서열 184) 이들 절편을 pUCP18의 EcoRI 부위에 클로닝시켜 pMT206-lac 및 pMT206-nat을 제조하였다; 이들의 동일성은 제한 절단으로 확인되었다. pMT206-lac에서, orf159 및 pstPPa는 본질적 lacZ 프로모터 및 이들의 본래의 프로모터 모두의 조절하에 있다. 단지 이들 본래의 프로모터는 pMT206-nat내 orf159 및 pstPPa의 전사를 조절한다.

도 34d에 나타낸 바와 같이, 양 균주들 모두는 돌연 변이 표현형을 벌레의 100%를 사멸시키데에 야생형 균주보다 더욱 오랜 시간인 보완된 균주가 필요로 하는 시간으로 보완되었다. 화상 입힌 마우스 검정법에서 부분 상보성이 관찰되었다: 균주 50E12(pMT206-nat)의 5×10⁵으로 감염시킨 후의 마우스 폐사율은 39%엿는데, 이는 야생형 균주 및 50E12 각각에 의하여 감염되었을때의 100% 및 0%의 경우와 비교되는 결과였다. 상기 결과들은 추정 orf159-pstPPa 오페론이 선충류 및 마우스에서의 피.아에루기노사 병원성 발생과 관련되어 있다는 것을 나타내는 것이다.

돌연 변이체 35A9

35A9내 TnphoA 삽입물은 엔.고노로에아 MtrRNg 단백질에 매우 가깝게 관련되어 있는(31.5% 동일성) 추정 210 아미노산 서열(orf210에 의하여 코드화되는)에 위치하는데, 여기서 상기 삽입물은 세균 전사 조절 단백질을 포함하는 헬릭스-턴-헬릭스의 TetR 패밀리에 속한다. ORF210은 피.아에루기노사의 에너지 의존성 유출(Energy dependent efflux;EDE) 시스템의 구성 요소들과 상동성인 3개의 유전자에 인접해 있으며, 전사 형태도 다양하다. PA01로부터 스득된 서열 분석 결과, 이들 4개의 유전자들은 피.아에루기노사의 신규의 에너지 의존성 유출 시스템을 정의한다는 것을 알 수 있었다. 전술한 피.아에루기노사의 다른 EDE 시스템에는 mexR, mexA-mexB-orfK 시스템, nfxB, mexC-mexD-oprJ 시스템 및 nfxC, mexE-mexF-oprN 시스템이 있다. 도 24d는 mtrRPa(서열 172)를 코드화하는 PA14 35A9의 뉴클레오타이드 서열(서열 171)을 나타낸다.

돌연 변이체 37H7 및 1D7

돌연 변이체 37H7으로부터 수득한 IPCR 산물을 분석한 결과. 214 아미노산 GacA 단백질의 코돈 188내에 TnphoA이 삽입되어 있다는 것을 알 수 있었다. DNA 블럿 분석법을 통하여 1D7 역시 gacA 유전자내에 삽입 서열을 포함하고 있음이 확인되었다.

돌연 변이체 48D9

세균성 2-성분 조절자 패밀리에 속하는 감지 키나제인, 925 아미노산 LemA-상동체의 491 코돈 및 492 코돈 사이에 TnphoA가 삽입되었다. 피.시린가에(P.syringae)내 LemA의 동계 반응 조절자는 GacA이며 GacA+LemA는 다수의 균력 인자들의 발현에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

돌연 변이체 41C1

TnphoA는 돌연 변이체 41C1내 추정 이.콜라이 내막 단백질의 AefA-상동체(SwissPort P77338)내에 삽입되었다. 이것은 30-40kD UPF0003 단백질 패밀리(PROSITE PDOC00959)의 구성원이다. 이.콜라이에 더하여, 씨네코시스티스(Synechocystis) 균주 PCC 6803 및 메타노코커스 자나스키(Methanococcus jannaschii)에도 존재한다.

뿐만 아니라, 균주 pho34B12, 3E8, 8C12, 1G2, 35A9 및 23A2 역시 페나진-마이너스 돌연 변이체 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, pho34B12, 3E8, 8C12 및 1G2 돌연 변이체는 색소 합성이 감소된 것을 알 수 있었다. 피.아에루기노사 균주의 특징적인 색은 가장 널리 알려진 청록 색소, 피오시아닌(1-하이드록시-5-메틸 페나진)과 같은, 흔히 페나진으로 알려져 있는 트리싸이클릭 2차 대사 산물에 기인한 것이다. 세균 돌연 변이체내 색소 발현 감소 현상이 최소한 부분적으로나마 피오시아닌 감소에 기인하는 것인지 여부를 시험하기 위하여, 상기 색소의 수준을 야생형 PA14 및 급속 사멸 검정법을 사용하여 얻어진 모든 돌연 변이체내에서 정량하였다. 상기 분석법의 결과, 색소 표현형이 감소된 pho34B12, 3E8, 8C12, 1G2 및 6A6 돌연 변이체 역시 피오시아닌 합성이 야생형 균주의 10-50% 범위의 수준으로 감소되었다는 것을 알 수 있었다. 다른 돌연 변이체, 13C9, 23A2 및 36A4는 야생형 균주에 필적할만한 피오시아닌 수준을 나타냈다.

뿐만 아니라, 3E8내 TnphoA 돌연 변이에 의하여 결함된 서열은 슈도모나스 플루오레센스의 phzB 유전자와 상동성을 갖는 단백질일 것으로 예상되었는데, 이는 2차 산물인 페나진(GenBank 수탁 번호:L48616) 생산에 관련된 오페론의 일부이다. 상기 phzB 유전자는 또한 슈도모나스 오레오패이션스(Pseudomonas aureofaciens)의 phzY(GenBank 수탁 번호 AF007801) 유전자와 상동체이다. 슈도모나스 아에루기노사내 상기 지역을 포함하는 서열 태그, 코스미드(1G2503)를 사용하여 데이터 베이스를 동정한 결과, 이는 phzA 및 phzB 유전자 뿐만 아니라, 페나진 생합성에 관여할 것으로 생각되는 다른 유전자, pcnC 및 D 유전자(GenBank 수탁 번호 AF005404)도 포함하는 것으로 밝혀졌다. 상기 4개의 균주들 즉, 34B12, 3E8,23A12 및 35A9의 마우스 화상 검정법에서의 병원성을 관찰하였다. 놀랍게도, 이 실험 결과 페나진 결함 균주는 병원성이 감소되었는데, 이는 곳 TnphoA 삽입 서열에 의해서 결함된 유전자들이 포유 동물 균력 인자라는 것을 시사해 주는 것이다. 이들 균주들에 있어서, 태그 서열을 포함하여 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열들을 도 7-9, 13, 14a, 14b, 15, 16a, 16b, 17, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 22, 24a, 24b, 24c, 24d, 24e 및 33에 나타냈다. 더욱이, 도 25 및 26은 슈도모나스 아에루기노사의 pnhA 및 pnhB 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 PHNA의 추론된 아미노산 서열을 각각 나타내고 있는 것이다.

상기한 바 있는 급속 사멸 검정법을 사용하여 동정된 돌연 변이체 각각에 대한 DNA 서열 분석 및 생화학적 분석법에 관한 상세한 설명을 이하 절에서 기술하였다.

돌연 변이체 36A4, 23A2 및 13C9

야생형 수준으로 피오시아닌을 합성하는 상기 3개의 돌연 변이체들로부터 수득한 DNA 서열 태그는 슈도모나스의 공지된 유전자들과 상동성을 갖는다. 돌연 변이체 36A4는 식물 병원체인 슈도모나스 시린가에의 병원성을 조절하는 위치로서 앞서 동정된 hrpM에 상동성인 유전자내에 삽입된 TnphoA를 포함하였다[Mills and Mukhopadhyay, "Pseudomonas:biotransformations, pathogenesis, and evolving technology, S.Silver, A.M.Chakrebarty, B.Iglewiski, and S.Kaplan, eds.,American Society for Microbiology, 1990, pp.47-57, Mukhopadhay et al., J.Bacteriol.170:5479-5488, 1988";GenBank 수탁 번호 140793). 상기 위치는 또한 이.콜라이의 mdoH 유전자와 상동성을 갖는데, 이는 세포질 글루칸의 생합성에 관여하는 효소를 코드화한다[Loubens et al., Mol.Microbiol. 10:329-340, 1993;GenBank 수탁 번호 X64197]. 돌연 변이체 23A2내 TnphoA 삽입물은 피.아에루기노사 균주 PAO1내 mexA로서 앞서 동정된 유전자내에 삽입된다[Pool et al., Mol.Microbiol. 10:529-544, 1993;GenBank 수탁 번호 L11616]. mexA 산물은 광범위한 기질 특이성을 갖는 비-ATPase 배출 펌프로서, 동일 오페론내 포함된 2개의 유전자 즉, mexB 및 oprM의 산물과 함께 작용을 하는 것으로 보여지는 세포질-막-관련 지질 단백질일 것으로 예상된다[Li et al., Antimicrob.Agents,Chemother, 39:1948-1953, 1995]. 색소 합성이 야생형 수준인 세번째 돌연 변이체에 플랭킹되어 있는 DNA의 서열 분석 결과, 13C9은 피.아에루기노사 균주 PAO1내 이미 공지된 다른 유전자인, orp(GenBank 수탁 번호 U54794)와 상응하는 것으로 나타났다. Orp, 즉 포스포리파제 C의 삼투 보호물-의존성(osmoprotectant-dependent) 조절자는 병원성 인자 PlcH, 즉 피.아에루기노사에 의해 합성된 포스포리파제 C의 2가지 동족 형태(isoform)중 하나의 발현을 조절하는 인자로서 동정되었다[Sage et al., Mol.Micrbiol. 23:43-56, 1997].

돌연 변이체 1G2 및 8C12

2개의 비발색성 돌연 변이체 1G2 및 8C12의 분자학적 분석 결과, 상기 1G2 삽입 서열을 플랭킹하고 있는 DNA가 히스티딘 키나제의 특징적인 모티브를 포함하고 있음에도 불구하고, 이들은 신규의 유전자에 삽입 서열을 포함하고 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 유전자는 PAO1 게놈 데이터 베이스내에 존재하지 않았다. 상기 8C12 서열 태그가 상기 PAO1 데이터 베이스내 유전자와 상동성인 것으로 동정되었지만, 이 유전자내에서 중요한 모티브는 발견되지 않았다.

돌연 변이체 3E8 및 6A6

2개의 돌연 변이체, 3E8 및 6A6은 이미 공지된 피.플루오레센스 균주 2-79내 phzB 유전자(GenBank 수탁 번호 AF 007801) 및 피.오레오패이션스 균주 30-84내 phzY 유전자(GenBank 수탁 번호 L48616)에 상동성인 동일 유전자에 TnphoA 삽입 서열을 포함하였다. 이들 2개의 돌연 변이체는 정확하게 동일한 위치에 TnphoA이 삽입되었으나, 이들이 2개의 상이한 돌연 변이 라이브러리로부터 수득된 것으로 보아 이들은 독립적인 분리 서열이었다. 상기 phzB 및 phzY는 동일한 서열 모티브를 포함하지 않았는데도, 이들은 피.플루오레센스 및 피.오레오패이션스내 페나진-1-카복실레이트(PCA)의 생산을 조절하는 것으로 알려진 오페론내에 존재하였다[Mavrodi et al.,J.Bacteriol. 180:2541-2548, 1998].

돌연 변이체 pho34A12

최종 비발색성 돌연 변이체 pho34b12내 TnphoA 삽입 서열을 플랭킹하고 있는 DNA는 앞서 클로닝되었으며, 그 결과 이하 설명된 바와 같은 신규의 위치를 갖는것으로 나타났다. 흥미롭게도, 상기 삽입 서열은 피.아에루기노사 균주 PAO1에서 동정된 것과 같은, 페나진 생합성 유전자인 phnA 및 phnB의 하류에 바로 인접하여 존재한다[Essar et al., J.Bacteriol.172:884-900, 1990].

페나진은 씨.엘레간스의 급속 사멸시 요구된다.

급속 사멸 스크리닝에서 발색성 또는 비발색성 돌연 변이체를 분리한 결과, 상기 급속 사멸 과정에는 하나 이상의 인자가 관여한다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 3E8 및 6A6 돌연 변이체(페나진 합성을 조절하는 것으로 공지된 오페론내에 삽입 서열을 포함하는)의 분자학적 분석에 의하면, 상기 페나진이 급속 사멸을 매개하는 독소의 하나의 클래스라는 것을 강력히 시사하고 있다. 이러한 가설을 직접 시험하기 위하여, 추가적인 돌연 변이, ΔphnAphnB를 제조하여 다음과 같이 연구하였다.

상기 페나진 생합성 유전자인 phnA 및 phnB(Essar et al.,J.Bacteriol.172:884-900, 1990)유전자는 앞서 특징화된 PA14내 pho34B TnphoA 삽입 서열의 상류에 위치한다(GenBank 수탁 번호 AF031571). 상기 지역의 야생형 서열에 대응하는 3.7kb EcoRI 절편(pLGR34로부터 수득한)을 pBluescript SK/+에 서브 클로닝시켜 Bs34B12를 수득하였다. 상기 플라스미드 pLGR34는 944bp인 phnA(전체 길이 1591bp), 전체 phnB(600bp) 유전자 및 1.7kb하류 서열을 포함하였다. 결실된 605bp인 phnA 및 405bp 상류는 PCR을 사용하여 프라이머 PHNA3(3'-GGTCTAGACGAACTGAGCGAGGAG-3'; 서열 185) 및 PHNA2(5'-GCCTGCAGGCGTTCTACCTG-3'; 서열 186)로 게놈성 PA14 DNA로부터 증폭시켰다. 상기 프라이머들은 피.아에루기노사 균주 PAO1으로부터 앞서 클로닝된 phnA 및 phnB 유전자를 기초로 한 것이다[Essar et al., J.Bacteriol.172:884-900, 1990, GenBank 수탁 번호 M33811]. 1010bp 증폭 서열을 pBs34B12의 PstI 부위에 서브 클로닝시켜 pBs34B12phnA를 제조하였다. 2.6kb 야생형 서열 유전자를 프라이머 PHNDEL1(5'-GGCTGCAGTGATTGACTGAGCGTCTGCTGGAGAACG-3'; 서열 187) 및 PHNDEL2(5'-GGGAAGCTTCGTCTAGAATCACGTGAACATGTTCC-3'; 서열 188)를 사용하는 PCR에 의해서 증폭된 1kb 절편(도 35)과 치환시켜 phnA, phnB 내 인-프레임 결실을 형성시켜 플라스미드 pBs34b12phndel을 제조하였다. phnAphnB 인프레임 결실을 포함하는 1.8kb XbaI 절편을 양성-수크로즈-선택 자살 벡터 pCVD442에 서브 클로닝시켰다[Donnenberg and Kaper, Infect.Immun. 59:4310-4317, 1990]. 결과로 형성된 pCVD34B12phndel을 사용하여 결함된 phnA, phnB 유전자들을 상동성 재조합으로 야생형 PA14게놈에 도입시켜 돌연 변이체 PA14ΔphnAphnB를 제조하였다. 원하는 결실을 포함하는 돌연 변이체를 증명하기 위하여 DNA 제한 및 부모 PA14 및 PA14ΔphnAphnB 균주들의 유도체를 사용하는 DNA 블럿 분석법을 수행하였다.

피.아에루기노사 및 관련 슈도모나스 균주들에서 페나진 합성을 촉매화하는 효소의 특성에 관하여 알려진 바가 거의 없었음에도 불구하고, 코리스메이트에서 안트라닐레이트로의 전환은 상기 경로에서 중요한 단계인 것으로 생각된다(도 35a). 피.아에루기노사 균주 PAO1에서, 상기 단계는 phnA 및 phnB 유전자들에 의해서 코드화되는 안트라닐레이트 합성 효소에 의해서 촉매화될 가능성이 가장 높다. 왜냐하면, 상기 유전자들에 돌연 변이가 발생하면 페나진 피오시아닌의 합성이 감소되기 때문이다[Essar et al.,J.Bacteriol.172:884-900, 1990]. PA14 로부터 상기 phnA 및 phnB 유전자를 클로닝시켜 이들 유전자에 1602bp 결실이 포함된 ΔphnAphnB 돌연 변이체를 제조하였다(도 35b). 중요한 것은, 상기 돌연 변이가 비극성으로 디자인되었기 때문에 phnA 및 phnB의 하류에 바로 인접해 있는 2개의 ORF 에는 영향을 미치지 않았다(하기 참조). ΔphnAphnB 돌연 변이체내 피오시아닌을 측정한 결과 단지 야생형 수준의 10%에 불과한 것으로 나타났으며, 이는 곧 phnA 및 phnB가 PAO1에서와 마찬가지로 균주 PA14에서도 피오시아닌 합성에 관여한다는 것을 확증해 주는 것이다. ΔphnAphnB 을 사용하여 수행한 검정법에 의하면 상기 균주는 급속 사멸시 상당히 감소되었음을 알 수 있었다. 도 35c에 나타낸 바와 같이, 벌레의 5% 미만이 상기 ΔphnAphnB 노출후 3시간 경과후 사멸되었던 반면에, 야생형 균주에 노출된 벌레들은 거의 100%가 사멸하였다. 상기 ΔphnAphnB 균주는 다른 페나진 돌연 변이체, 3E8과 유사한 방식으로 행동하였는데, 이를 본 실험의 약화된 돌연 변이체에 대한 대조구로 사용하였다.

급속 사멸 과정을 매개한 세균 인자들이 다른 숙주에서의 병원성과 관련이 있는지 여부를 관찰하기 위해서 상기 급속 사멸 돌연 변이체들을 아라비돕시스 잎 침윤 모델 및 피부 전체 두께에 화상을 입힌 마우스 모델에서 균력에 대하여 시험하였다(하기 참조). 5개의 급속 사멸 돌연 변이체를 이들의 병원성 정량 방법과 같이 아라비돕시스 잎에서 4일간 진행 경과에 따른 생장여부로 시험하였으며 피부 전체 두께에 화상을 입힌 마우스 모델에서도 수행하였다. 표 4 및 표 5에서 나타낸 바와 같이, 아라비돕시스 잎의 최대 생장 수준은 2개의 페나진 돌연 변이체, 즉 3E8 및 8C12에서는 감염후 4일째 되는날 상당히 저하되었다. 마우스 모델에서 상기 2개의 돌연 변이체들은 이들이 5×10⁵세포만큼 접종되었을 경우 야생형 균주보다 폐사율이 P∠0.05 정도로 상당히 저하되었다.3번째 페나진 돌연 변이체 1G2는 식물 모델 또는 마우스 모델에서 야생형 균주와 별 차이를 보이지 않았다.

hrpM 돌연 변이체, 36A4 및 mexA 돌연 변이체, 23A2는 모두 아라비돕시스 잎에서 쇠약해 졌는데, 이는 곧 상기 모델에서 병원성이 심각하게 결함되었음을 시사해 주는 것이다. 마우스 모델에서, 돌연 변이체 34A4는 극적인 효과를 가져와 시험된 도스량에서는 모델을 사멸시키지 않았다.이와는 반대로, 상기 mexA 돌연 변이체, 23A2는 단지 최소한으로만 영향을 미쳤다. 상기 결과들은 급속 사멸 스크리닝법이 식물 및 마우스 모델에서 병원성에 필요한 유전자를 동정하는데에 매우 효과적이며, 또한 페나진이 상기 2가지 숙주에서의 병원성 발현에 필요하다는 것을 말해주는 첫번째 생체내 증명 수단을 제공하는 것임을 말해주는 것이었다.

우리는 또한 phz 오페론의 조절자인, phzR을 동정하였다. 도 18e는 PA14phzR의 뉴클레오타이드 서열(서열 164) 및 예상 아미노산 서열의 일부(서열 165)를 나타내는 것이다.

페나진과 병원성 발현

급속 사멸법에서 감소된 PA14 돌연 변이체는 또한 색소 합성에도 영향을 미쳤다. 본원의 분자학적 분석에 의해서, 색소 합성 및 병원성 발현은 상호 관련성은 단순히 조절 인자에 의한 색소 발현 및 독소 생성의 합동 조절 작용에 기인하는 것이 아니라는 것을 밝힐 수 있었다. 우리는 페나진 생합성 유전자에 돌연 변이가 발생하면 균력이 감소된다는 것을 알아낸 대신에, 급속 사멸 과정에 있어서 독소인 페나진이 매우 깊이 관련되어 있음을 알 수 있었다. 슈도모나스에 특징적인 색을 부여하는 트리싸이클릭 색소 화합물인 페나진(Turner and Messenger, Adv.Microb.Physiol. 27:211-273, 1986)은 경쟁적 조건하 유기체의 생존률을 증가시키는 것으로 생각되는 2차 대사산물이다[Maplestone et al.,Gene 115:151-157, 1992]. PA14에 의하여 생산된 페나진 레파토리가 비공지의 것임에도 불구하고, 피.아에루기노사 균주 PAO1은 널리 특징화된 청록 색소 피오시아닌을 포함하여 6개 이상의 상이한 페나진을 생산한다. 피오시아닌을 포함하는 페나진은 몇몇종의 세균, 균류 및 원핵 생물에 대해서 항생제 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌으며, 그 활성의 수준은 이들의 산화 환원 활성에 기인하는 것이다. 이들의 활성이 고도로 감소된 상태에서, 페나진은 다양한 환원제 또는 과산화물 및 과산화수소 형성시 생성되는 분자성 산소의 존재하 산화-환원 순환을 진행하는 것으로 알려져 있다[Hassan and Fridovich, J.Bacteriol. 141:1556-163, 1980] 시험관내에서, 상기 세포독성이 약한 산소 라디칼은 철 촉매에 의해서 세포 독성이 강한 하이드록실 라디칼로 전환된다[Britigan et al.,J.Clin.Invest.90:2187-2196, 1992]. 페나진에 의해 반응성 산소가 형성되면, 시험관내 진핵 생물 세포에서 세포 독성 효과가 나타날 것이라 생각된다. 상기와 같은 효과들로서는 포유 동물 세포 호흡 억제, 모양체 조절 결함 및 예를 들어 염증 반응 자극, 임파구 증식 억제 및 항원에 대한 T 림파구 응답 억제등과 같은 면역 조절 효과의 결함등을 포함한다.

피.아에루기노사에서 페나진을 합성시키는 생합성 경로는 아직 정확하게 밝혀지지 않아서 페나진 합성이 결함된 PA14 돌연 변이체에 의해 차단된 경로에서의 단계를 동정해내는 것은 어려운 일이다. 그러나, 2개의 돌연 변이체, 3E8 및 6A6에 트랜스포손이 삽입되었을때 phzB와 상동성이 있는 유전자가 결함되었는데, 이는 슈도모나스 관련 균주, 피.플루오레센스, 및 피.아우레오패이션스에서의 페나진 합성과 관련이 있는 것으로 앞서 특징화되었다. 피.플루오레센스에서, phzB는 페나진-1-카복시산 합성과 관련된 7개의 유전자 오페론(phzA-G)의 일부라는 것을 알 수 있었다. 피.플루오레센스, 및 피.아우레오패이션스에 존재하는 상기 오페론을 비교한 결과, 상기 2개는 매우 상동성이 높았는데, 이는 페나진 합성 경로가 형광성 슈도모나스에서 보존되어 있다는 것을 시사하는 것이다[Mavrodi et al., J.Bacteriol. 180:2541-2548, 1998]. 피.아에루기노사에서 상기 phzA 및 phzB 유전자와 플랭킹되어 있는 DNA가 부분적으로 시퀀싱되었으나, 본원 발명의 분석법에 따르면 상기 지역은 피.플루오레센스 phzA-F 오페론과 보존적 구조(conserved structure)를 공유하고 있다는 것을 제시하고 있다. PA14 및 피.플루오레센스로부터 수득한 phzA 및 phzB 유전자의 예상 해독 산물은 각각 동일성을 68-74% 공유한다. 더욱이, phzA-F-유사성 유전자 함유 지역은 피.아에루기노사 균주 PAO1에 존재하며, 상기 유전자들의 예상 해독 산물은 이들의 피.플루오레센스 상동체(GenBank 수탁 번호 AF005404)와 69-85%의 동일성을 공유한다.피.플루오레센스 및 피.오레오패이션스내 phz 오페론의 역할로부터 추정해 보면, 급속 사멸시 PA14phzB 돌연 변이체 분리 균주의 결함은 페나진이 본 과정에 포함되어 있다는 사실을 강하게 시사하여 준다. 피오시아니을 포함하는 페나진이 급속 사멸시 매개체중의 하나라는 가설은 피.아에루기노사 균주 PA01에서 페나진 합성에 특별히 관여하는 것으로 앞서 밝혀진, 안트라닐레이트 합성 효소의 2개 서브 유닛을 코드화하는 phzA 및 phzB 유전자들의 비극성 결함을 통하여 추가로 시험되었다[Essar et al.,J.Bacteriol. 172:884-990, 1990]. 페나진 생합성에서의 역할과 마찬가지로, PA14의 phzA 및 phzB 유전자의 결실은 피오시아닌 합성을 고도로 감소시킨다. 더욱이, 상기 ΔphnAphnB 돌연 변이체는 급속 사멸시 손상되었는데, 이는 곧 상기 과정에서 페나진의 역할이 중요함을 나타내는 것이다.

병원성 발현시 페나진의 역할은 아라비돕시스 및 마우스에서도 관찰될 수 있다. phzB 유전자내에 삽입 서열을 포함하는 2개의 독립적인 돌연 변이체, 3E8 및 6A6의 병원성은 상기 아라비돕시스 잎 침윤 모델 및 전체 두께의 피부에 화상을 입힌 마우스 모델 모두에서 극적으로 감소되는데(표 4 및 표 5 참조), 이는 곧 페나진이 다원성 숙주 병원성 인자(multi-host pathogenesity factor)임을 시사하는 것이다. 본 연구 및 앞서 행해진 연구에서 동정된 다수의 기타 다원성 숙주 병원성 인자가 몇몇 다른 균력 인자의 생산에 관여하는 것이지, 주효 인자 또는 숙주와 직접적으로 상호 작용 하는 분자는 아니라는 사실은 주목할만한 사실로서 매우 흥미롭다(이하 설명). 따라서, 페나진은 우리가 동정한 공지의 다원성 숙주 병원성 인자 클래스를 대표하는 것이다. 페나진에 대해서 집중적으로 시험관내 분석이 수행되었음에도 불구하고, 이들 산물의 생리학적 중요성 및 피.아에루기노사 감염에서의 이들의 역할에 대해서 논쟁의 여지가 남아있으며 본 연구에 앞서서 이들의 생체내 역할에 대하여 밝혀진 바가 없기 때문에 이러한 발견 역시 중요한 의미를 갖는다.

급속 사멸 현상은 다중 인자성(multifactorial)

색소 발현 수준이 야생형 수준인 급속 사멸 돌연 변이체에 대한 분석 결과 페나진이 급속 사멸의 필수 매개체임에도 불구하고, 다른 인자들이 이 경로에 관여한다는 사실을 알 수 있었다. 23A2와 같은 돌연 변이체의 분자학적 분석 결과, 트랜스포손이 이전에 피.아에루기노사 균주 PAO1에서 동정된 바 있는 유전자로서 MexA, B, OprM의 3유전자 오페론의 일부인, MexA내에 삽입된다는 것이 밝혀졌다[Pool et al.,Mol.Microbiol. 10:529-544, 1993]. 이들 유전자 산물은 이들이 비-ATPase 광범위 특이성 유출 펌프(non-ATPase broad specificity efflux pump)로서 작용할 것으로 생각되는 세포질(MexA 및 MexB) 및 외부 막(OprM)에 위치한다. 상기 펌프는 피.아에루기노사에서의 다중-약품 내성 경로(multi-drug resistance process)에 관여하는 성질을 이용하여 최초로 동정되었기 때문에, 비록 이의 천연 기질에 대해서는 알려진 바 없다 하더라도 2차 대사 산물의 배출에 총괄적인 역할을 하는 것으로 생각된다[Poole, Antimicrob.Agents Chemother 34:453-456, 1994]. 급속 사멸 즉, 산재 가능한 독소(diffusible toxin)에 의해서 매개되는 경로에 있어서 mexA 돌연 변이체가 결함되는 것은 상기 경로에 관여하는 하나 이상의 인자가 배출되지 않기 때문일 것이다. 상기 mexA 돌연 변이체가 색소를 발현하기 때문에, 페나진은 상기 펌프에대한 기질이 아닐것으로 여겨진다. 더욱이 급속 사멸에서 이것이 결함되면, 상기 mexA 돌연 변이체는 마우스 모델에서 그 병원성이 경미한 정도로 감소하였으며 아라비돕시스 잎 침윤 모델에서는 심각할 정도로 약화되었다. 특이적 균력 인자의 배출 결함을 통하여 결함을 설명할 수 있었음에도 불구하고, 추가의 모델로써 상기 돌연 변이체 세균은 그들 자신을 세균 감염에 대응하여 생성되는 숙주 방어 인자로부터 보호할 수 없다는 것을 알 수 있다. 이러한 보호적 기능은 sap 유전자 즉, ATP 결합 카세트(ABC) 운반체와 관련된 단백질을 코드화하고 사람 병원체인 살모넬라 타이피뮤리움(Sallmonella typhymurium) 및 식물 병원체인 어위니아 크리산테미에서의 숙주 항미생물성 펩타이드에 대한 내성을 매개하는 유전자에 대하여 설명해 주는 것이다[Taylor, Plant Cell 10:873-875, 1998].

본 스크리닝을 통하여 검정된 두번째 돌연 변이체, 36A4는 이.콜라이 MdoH와 상동성이며 mdoGH 오페론의 일부인 유전자내에 트랜스포손 삽입물을 포함한다. 이.콜라이에서 상기 오페론 산물은 막 유래 올리고당(membrane derived oligosaccharide;MDO) 또는 선형 세포질성 글루칸의 합성에 관여한다[Loubens et al.,Mol.Microbiol. 10:329-340, 1993]. 유사한 위치인, hrpM은 식물 병원체인 슈도모나스 시린가에 pv.시린가에에 존재하며[Mukhopadhay et al.,J.Bacteriol. 170:5479-5488, 1998], 상기 위치내에서 숙수 식물에서의 질병 증상의 발생 및 비-숙주 식물에서의 고감수성 응답을 모두 파괴시키는 돌연 변이체로부터 최초로 동정되었다[Anderson and Mills, Phytopath.75:104-108, 1985]. 세포질성 글루칸은 또한 광범위한 그램-음성 세균에서 발견되었는데, 이들이 가지고 있는 기능은 다양면서도 아직 확실히 밝혀진 바는 없다. 피.시린가에에 존재하는 필수 균력 인자에 더하여, 다른 기능으로서는 고삼투성 환경에 대한 적응력 및 리조비움(Rhizobium) 및 아그로박테리움(Agrobacterium)종에 의해서 진핵 생물 숙주를 인식하도록 하는 세포 신호(cell signaling)를 포함한다[Kennedy, In:Escherichia and Sallmonella, F.C.Neidardt, ed,American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.,pp. 1064-1071, 1996]. 그러나, 살모넬라 및 클렙시엘라(Klepsiella)와 같은 몇몇 동물성 병원체의 세포질에 존재함에도 불구하고, mdoH-유사 위치가 돌연 변이된 피.아에루기노사의 병원성이 마우스 모델에서 현저하게 감소되었다는 것을 밝힌 본 연구가 행하여진 이후에 상기 세포질성 글루칸이 동물 숙주 감염에서 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다.

b:10³의 세균을 접종한 후 4일째 되는날에 측정한 잎 1㎠당의 CFU 즉, 세균의 수(4-5개의 시료의 평균). 상기 4-5개의 시료의 평균값으로 돌연 변이체의 병원성의 약함을 정의한다. 잎 1㎠당의 평균 CFU 즉, 평균 세균 수의 2개의 표준 편차가 동일 실험군에서의 야생형에 비하여 낮은 경우, 돌연 변이체는 병원성이 약한 것으로 정의된다.

c:접종된 벌레들의 50%를 사멸시키는데에 소요되는 평균 시간(3개의 복사본으로부터 측정한 LT₅₀)의 2개의 표준 편차가 동일 실험내 부모 UCBPP-PA14의 LT₅₀보다 낮은 돌연 변이체는 선충류에서 병원성이 약화된(-) 것으로 간주되며; LT₅₀의 계산 방법은 '재료 및 방법'편 참조.

d:6주된 수컷 ARK/J 근친계 마우스(Jackson Laboratory)로서, 체중은 20-30g이며 Steven et al., J.of Burn Care andRehabil.15:232-235, 1994 에 기술된 바와 같이 5×10⁵세포로 접종시켰다. 폐혈증으로 죽은 동물의 수를 10일 동안 매일 모니터하였다.

e:독립적으로 분리된 2개의 다른 gacA 돌연 변이체는 ID9(rpn9) 및 33D11(rpn10). 돌연 변이체 rpn9은 마우스로 시험한 결과 폐사율이 50%였다.

f:선충류에 대해서만 시험된 경우.

g:페나진-결함 돌연 변이체.

h:급속 사멸에서 결함이 발생한 돌연 변이체로서, 슬로우 킬링에서는 영향을 받지 않음.

(▲식물 및 마우스에서의 PA14 급속 사멸 병원성)

a:103의 세균으로 감염시킨후 5일 경과되었을 때의 잎 1㎠당의 CFU 즉, 세균의 수. 수치는 4-5개의 시료의 평균을 나타내는 것이다. 세균수의 평균값의 2개의 표준 편차가 동일 실험군내 야생형보다 낮은 경우의 돌연 변이체를 병원성이 약한 것으로 정의한다.

b:체중은 20-30g이며 5×10⁵세포로 접종시킨, 6주된 수컷 ARK/J 근친계 마우스(Jackson Laboratory). (n)은 주사된 마우스의 총수. 폐혈증으로 죽은 마우스의 수는 7일 동안 매일 모니터하였다.

c:3E8 및 6A6은 독립적으로 발생한 돌연 변이체로서 정확히 동일한 위치에 TnphoA가 삽입된 것이다. 표시된 숫자들은 3E8로부터 얻어진 값이다. 6A6에서도 유사한 결과가 얻어졌다(데이터는 나타내지 않았음).

추가 균력 유전자의 분리

본원에 기술된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 기초로 하여, 당 업계에 널리 공지된 전략 및 기술을 통해서 균력 인자의 추가의 코드화 서열을 분리할 수 있다. 임의의 병원성 세포가 이러한 균력 인자를 분자학적으로 클로닝하는데에 핵산 근원(nucleic acid source)으로 사용될 수 있으며, 상기 서열들은 병원성-관련 구조, 특성 또는 활성을 나타내는 단백질을 코드화하는 것으로서 동정된다.

핵산 혼성화 스크린 기술과 같은 종래의 스크린 방법과 함께 이러한 분리 기술의 하나의 특정 실시예에 있어서, 본원에 기술된 임의의 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다. 이러한 혼성화 기술 및 스크린 방법은 당 업계의 숙련자들에게 넝리 공지되어 있으며, 예를 들어 Benton과 Davis(Science 196:180, 1977); Grunstein과 Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel외 다수 공저(Current Protocols in Molecular Biology, Willey Interscience, New York, 1997); Berger and Kimmel(상동); 및 Sambrook외 다수 공저, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기술되어 있다. 하나의 특정 실시예에서, 33A9 서열의 전체 또는 일부(본원에 기술됨)는 상기 33A9 유전자에 대한 서열 동일성을 갖는 유전자용 재조합 식물 DNA 라이브러리를 스크린하는 프로브로 사용된다(도 5 및 6a-b). 혼성화 서열은 표준 방법에 따른 플라크 또는 콜로니 혼성화법에 의하여 검출된다.

이와는 달리, 상기 33A9 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 사용하여, 퇴행성 올리고뉴클레오타이드 프로브(degenerate oligonucleotide probe)(즉, 주어진 아미노산 서열에 대한 모든 가능한 코드화 서열의 혼합물)를 포함하는 33A9-특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브를 용이하게 디자인 할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 33A9 단백질의 33A9 서열(도 5 및 도 6a-b;서열 102 및 서열 103)의 임의의 적당한 부분 및 DNA 사슬의 서열을 기초로 한다. 이와 같은 프로브를 디자인 및 제조하는 일반적인 방법은 예를 들어 Ausubel et al.(상동), 및 Berger와 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York에 기술되어 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 33A9 상보적 서열에 혼성화될 수 있는 프로브 또는 예를 들어 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 전략과 같은 다양한 증폭 기술에 대한 프라이머로서 사용하는 방법을 통해서 33A9 유전자를 분리하는데에 유용하다. 원한다면, 상이하며 검출 가능한-라벨로 라벨링된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 재조합 DNA 라이브러리 스크린에 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리들은 당 업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 Ausbel외 다수(상동) 저서에 기술된 방법에 따라서 제조될 수 있으며 또는 상업적으로 시판되고 있는 소스(source)로부터 수득할 수도 있다.

상기 논의된 바와 같이, 서열-특이적 올리고뉴클레오타이드는 또한 증폭 클로닝 전략, 예를 들어 PCR에서 프라이머로서도 사용될 수 있다. PCR 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있는데, 예를 들어 PCR Technology, Erlich, ed., Stockton Press, London, 1989; PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, Inc., New York, 1990; 및 Ausubel et al.(상동)에 기술되어 있다. 프라이머는 증폭된 산물을 적당한 벡터에 클로닝시킬 수 있도록 임의로 디자인될 수 있는데, 예를 들어 증폭된 절편의 5' 말단 및 3' 말단의 적당한 제한 부위(본원에 기술됨)를 포함하도록 디자인될 수 있다. 원한다면, 뉴클레오타이드 서열은 PCR "RACE" 기술 또는 "cDNA 말단의 급속 증폭 기술(Rapid Amplification of cDNA Ends)"(Innis 외 다수 공저(상동) 참조)을 사용하여 분리될 수 있다. 상기 방법에 의해서, 원하는 서열을 기초로 한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 3'-〉5' 방향으로 삽입되어 오버랩 PCR 절편(overlapping PCR fragment)을 생성시키는데에 사용될 수 있다. 상기 오버랩핑된 3'-말단 및 5'-말단 RACE 산물은 합체되어 원형 전체 길이 cDNA를 생성할 수 있다. 상기 방법은 Innis 외다수 공저(상동); 및 Frohman외 다수 공저, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:8998, 1998에 기술되어 있다.

예를 들어 서열 태그와 같은 부분 균력 서열 역시 전체 길이 서열을 동정하는데에 뿐만 아니라 이전에 동정되지 않은 관련 균력 유전자를 동정하는 데이터베이스 스크린에 혼성화 프로브로서 사용된다. 예를 들어, 36A4, 25A12 및 33C7 서열은 증폭되어 각각의 인접 서열(contig) 2507, 1126 및 1344로 포위될 수 있다.

기능 상보성 검정법(functional complementation assay) 및 유전자와 이의 산물의 서열을 비교하는 방법을 포함하는 --이에 한정되는 것은 아니지만-- 다양한 종래의 방법들을 통하여 병원성 폴리펩타이드와 서열과의 관련성을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 예를 들어, 코드화된 산물의 기능성 또는 면역성과 같은 상기 유전자 산물의 활성 역시 본원에 기술된 임의의 기술에 의하여 평가될 수 있다.

적당한 서열이 일단 동정되면, 표준적 방법에 따라서 클로닝될 수 있으며, 예를 들어, 상기 병원체의 균력을 감소시키는 화합물을 스크린하는데에 사용될 수 있다.

폴리펩타이드 발현

일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드-코드화 핵산 분자 또는 적당한 발현 비히클내의 이들의 절편의 전부 또는 일부로 적당한 숙주 세포를 형질 전환시켜 생산될 수 있다.

분자 생물학 분야의 숙련자들은 재조합 단백질 제공시 다양한 발현 시스템중 임의의 것을 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 사용된 정확한 숙주 세포는 본 발명에서 중요하지 않다. 본 발명의 폴리펩타이드는 원핵 세포 숙주(예를 들어, 이.콜라이) 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 싸카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 예를 들어 Sf21과 같은 곤충 세포 또는 예를 들어, NIH 3T3, HeLa와 같은 포유 동물 세포, 또는 바람직하게는 COS 세포)에서 생산될 수 있다. 이러한 세포들은 다양한 범위의 소스로부터 얻을 수 있다[예를 들어, American Type Culture Collection, Rockland, MD; 또한 Ausubel외 다수 공저(상동) 참조]. 형질 전환 또는 트랜스팩션 방법 및 발현 벡터의 선택은 선택된 숙주 시스템에 의존할 것이다. 형질 전환 또는 트랜스팩션 방법에 관해서는 예를 들어, Ausubel외 다수 공저(상동)에 기술되어 있으며; 발현 비히클은 Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels et al., 1985, 부록, 1987)에 기술되어 있다.

폴리펩타이드 생산용 세균성 발현 시스템의 하나의 구체예는 이.콜라이 pET 발현 시스템(Novagen, Inc., Madison, WI)이다. 이 발현 시스템에 더하여, 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 pET 벡터에 발현 가능한 방향으로 삽입하였다. 이러한 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자는 T7 조절 신호의 조절하에 있기 때문에, 상기 폴리펩타이드는 숙주 세포내에서 T7 RNA 중합 효소 발현을 유도함으로써 발현될 수 있다. 이는 통상적으로 IPTG 유도 응답에서 T7 RNA 중합 효소를 발현시키는 숙주 균주를 사용하면 이루어질 수 있다. 일단 생산되면, 이후 재조합 폴리펩타이드는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, 당 업계에 공지된 표준 방법에 따라서 분리될 수 있다.

기타의 폴리펩타이드 생산용 세균 발현 시스템으로서는 pGEX 발현 시스템(Pharmacia)이 있다. 상기 시스템에서는 기능성 유전자 산물을 신속하게 정제 및 회수 가능한 융합 단백질로서 유전자 또는 유전자 절편을 고도로 발현시키도록 디자인된 GST 유전자 융합 시스템을 사용한다. 원하는 단백질은 쉬스토소마 자포니큠(Schistosoma japonicum)으로 부터 수득한 글루타치온 S-전이 효소의 카복실 말단에 융합되어 클루타치온 세파로즈 4B(Glutathione Sepharose 4B)를 사용하여친화 크로마토그래피에 의해서 세균 용균물로부터 용이하게 정제된다. 융합 단백질은 온화한 조건하에서 글루타치온으로 용리시켜 회수할 수 있다. 상기 융합 단백질로부터 글루타치온 S-전이 효소 도메인을 절단하는 것은 상기 도메인의 부위-특이적 단백질 분해 효소 상류에 대한 인식 부위가 존재하는 경우 촉진된다. 예를 들어, pGEX-2T 플라스미드내에서 발현된 단백질은 트롬빈으로 절단될 수 있으며; pGEX-3X에서 발현된 단백질은 Xa 인자로 절단될 수 있다.

본 발명의 재조합 폴리펩타이드가 일단 발현되면, 이는 예를 들어, 친화 크로마토그래피를 사용하여 분리될 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 폴리펩타이드에 대하여 증가된 항체(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 생산된)는 컬럼에 부착되어 상기 재조합 단백질을 분리하는 데에 사용될 수 있다. 표준적인 방법을 통하여, 상기 친화 크로마토그래피 수행후 폴리펩타이드-함유 세포를 용균 및 분획시킬 수 있다[Ausubel 외 다수 공저(상동)].

일단 분리되면, 원하는 경우 상기 재조합 단백질은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의하여 추가로 정제될 수 있다[Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elseiver, 1980 참조].

본 발명의 폴리펩타이드, 구체적으로 짧은 펩타이드 절편은 또한 화학 합성법으로 제조될 수 있다[예를 들어 Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, IL].

폴리펩타이드 발현 및 정제에 있어서의 일반적인 기술은 또한 유용한 펩타이드 절편 또는 이의 유사 물질을 분리 및 생산하는데에 사용될 수 있다[본원에 기술됨].

항체

항체를 생산하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 코드화 서열이 글루타치온 S-전이 효소(GST)에 C-말단에 융합되어 발현될 수 있다[Smith et al., Gene67:31-40, 1988]. 상기 융합 단백질은 글루타치온-세파로즈 비드상에서 정제될 수 있는데, 여기서 상기 단백질은 글루타치온으로 용리 되어 트롬빈으로 (조작된 절단 부위에서) 절단한후 토끼의 면역화에 필요한 정도로 정제된다. 1차 면역화는 Freund의 완전 애쥬반트로 수행되며, 이후 Freund의 불완전 애쥬반트로 다시 면역화된다. 항체 역가는 GST 융합 단백질의 트롬빈-절단 단백질 절편을 사용하는 웨스턴 블럿(Western blot) 및 면역 침강 분석법(immunoprecipitation)을 통하여 모니터된다. 면역 혈청은 CNBr-Sepharose-커플링된 단백질을 사용하여 친화 정제된다. 항혈청 트ㄱ이성은 관련성이 없는 GST 단백질 팬널을 사용하여 결정된다.

GST 융합 단백질에 대한 임의의 또는 부속된 면역원으로서 본 발명의 폴리펩타이드의 상대적으로 유일한 면역원성 지역에 대응하는 펩타이드가 생성되어 도입된 C-말단 리신을 통하여 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin;KLH)과 커플링될 수 있다. 이와 유사하게 상기 각각의 펩타이드에 대한 항혈청은 BSA에 접합된 펩타이드상에서 친화 정제되어 펩타이드 접합체를 사용하는 ELISA 및 웨스턴 블럿으로, 그리고 GST 융합 단백질로서 발현되는 폴리펩타이드를 사용하는 웨스턴 블럿 및 면역 침강법으로써 특이성이 시험될 수 있다.

이와는 달리, 본 발명의 폴리펩타이드중 임의의 하나에 결합하는 단클론 항체는 표준적 림프 잡종 세포종(hybridoma) 기술에 따라 제조된다[Kohler et al.,Nature 256:495, 1975; Kohler et al.,Eur.J.Immunol. 6:511, 1976; Kohler et al.,Eur.J.Immunol. 6:292, 1976; Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981; Ausubel et al., 상동]. 일단 생산되면, 단클론 항체도 웨스턴 블럿 및 면역 침강 분석법으로 특이적 인식성에 대하여 시험된다[Ausubel et al., 상동]. 본 발명의 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체는 본 발명에 유용할 것으로 생각된다;이러한 항체들은 예를 들어, 면역 검정법에 사용될 수 있다. 상기된 본 발명의 폴리펩타이드 및 파지 출현 라이브러리(phage display library)를 사용하여 다른 단클론 항체가 제조될 수 있다[Vaughan et al., Nature Biotech 14:309-314, 1996].

바람직하게, 본 발명의 항체는 일반적으로 보존성 지역으로 외부에 존재하고 항원성인 것으로 보이며 극성 잔기의 출현 빈도수가 높은 표본인 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하여 제조된다. 하나의 특정 실시예에서, 이러한 절편들은 표준적인 PCR 기술에 의하여 생산되어 pGEX 발현 벡터로 클로닝된다[Ausubel et al., 상동]. 융합 단백질들은 이.콜라이에서 발현되어 Ausubel외 다수 공저, (상동)에 기술된 바와 같이 글루타치온 아가로즈 친화 매트릭스를 사용하여 정제된다. 항혈청에 대한 잠재적인 문제점 즉, 낮은 친화성 또는 낮은 특이성으로 인한 문제점을 최소화하기 위한 시도에 있어서, 이러한 2개 또는 3개의 융합체가 각각의 단백질에 대하여 생성되며, 각 융합체는 2마리 이상의 토끼에 주입된다. 바람직하게는 3 이상의 효능 촉진제를 포함하여 연속적으로 주입시킴으로써 항혈청이 증가하게 된다.

본원에 기술된 폴리펩타이드중 임의의 것에 대한 항체가 세균 감염을 치료하는데에 사용될 수 있다.

스크린 검정법

상기 논의된 바와 같이, 병원성과 관련이 있으므로 유기체의 균력을 감소시키는 화합물을 스크리닝하는데에 사용될 수 있는 피.아에루기노사에 대한 다수의 균력 인자 및 다른 미생물 병원체를 동정하였다. 예를 들어, 본 발명은 폴리펩타이드의 작용 또는 핵산 서열의 유전자 발현을 촉진시키거나(작동약) 또는 억제시키는(길항약) 물질을 동정하는 화합물을 스크린하는 방법을 제공한다. 스크린 방법에는 고처리량 기술을 포함할 수 있다.

이러한 스크린 검정법에는 임의의 수의 방법들이 유용하다. 하나의 연구 방법에서는, 후보 화합물이 본 발명의 핵산 서열중 하나를 발현시키는 병원성 세포 배양 배양액에 다양한 농도로 첨가된다. 이후 예를 들어, 혼성화 프로브로서 임의의 핵산 분자로부터 제조된 적당한 절편을 사용하는 표준적인 노던 블럿 분석법(Northern blot analysis)(Ausubel et al.,(상동))을 이용하여 유전자 발현을 측정한다. 후보 화합물 존재시의 유전자 발현 수준은 상기 후보 화합물 분자가 존재하지 않는 대조구 배양 배양액에서 측정한 수준과 비교된다. 병원성 인자의 발현 감소를 촉진하는 화합물이 본 발명에 유용할 것으로 생각되며; 이러한 분자는 예를 들어, 감염성 유기체의 병원성을 공격하는 치료제로서 사용될 수 있다.

원한다면, 상기 후보 화합물의 효과는 동일한 일반적인 연구 방법 및 병원성 인자에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 또는 면역 침강법과 같은 표준적인 면역학적 기술을 사용하여 폴리펩타이드 발현 수준에 대해서 임의로 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역 검정법은 병원성 유기체내에서 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 발현을 검출하거나 또는 모니터하는데에 사용될 수 있다. 이와 같은 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 다클론 또는 단클론 항체(상기된 바와 같이 생산된)가 임의의 표준적 면역 검정법 방식(예를 들어, ELISA, 웨스턴 블럿 또는 RIA 검정법)에 사용되어 병원성 폴리펩타이드의 수준을 측정할 수 있게 해준다. 병원성 폴리펩타이드의 발현 감소를 촉진시키는 화합물이 특히 유용하다. 다시 말해서, 이러한 화합물은 예를 들어, 감염성 유기체의 병원성을 공격하는 치료제로서 사용될 수 있다.

이와는 달리, 또는 이에 더하여, 후보 화합물은 본 발명의 병원성 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하거나 이를 억제하는 성질에 대하여 스크린될 수 있다. 이와 같은 후보 화합물의 효능은 병원성 폴리펩타이드와 상호 작용하는 능력에 의존한다. 이와 같은 상호 작용은 임의의 표준적 결합 기술 및 기능 검정법을 사용하여 용이하게 검정될 수 있다[예를 들어 Ausubel 외 다수 공저, 상동]. 예를 들어, 후보 화합물은 본 발명의 폴리펩타이드와의 상호 작용 또는 결합에 대하여 생체내에서 시험될 수 있으며 이들의 병원성을 조절하는 능력은 임의의 표준적 검정법으로 검정될 수 있다[본원에 기술됨].

하나의 특정 실시예에서, 병원성 폴리펩타이드에 결합하는 후보 화합물은 크로마토그래피를 기초로 한 기술을 사용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드는 표준적인 기술을 사용하여 상기 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 세포로 부터 정제될 수 있으며(예를 들어, 상기된 바와 같이) 또한 컬럼상에 고정될 수 있다. 이후 후보 화합물 용액이 상기 컬럼을 통과하면, 병원성 폴리펩타이드에 특이적인 화합물은 이들 화합물이 병원성 폴리펩타이드 에 결합되어 상기 컬럼에 고정되는 능력을 기초로 하여 동정된다. 상기 화합물을 분리하는데에 있어서, 비특이적으로 결합된 분자는 상기 컬럼을 세척함으로써 제거되고, 원하는 화합물은 이후 상기 컬럼으로부터 방출되어 수집된다. 이 방법(또는 임의의 다른 적당한 방법)으로 분리된 화합물은 원하는 경우, (예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서) 추가로 정제될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 후보 화합물들은 (예를 들어, 본원에 기술된 방법과 같이) 병원체의 균력을 약화시키는 능력에 대해서도 시험될 수 있다. 본 연구 방법에 의하여 분리된 화합물들은 또한 예를 들어, 병원성 감염, 질병 또는 이들 모두의 발생을 억제하거나 또는 치료하는 치료제로 사용될 수 있다. 병원성 폴리펩타이드에 대하여 친화도 상수가 10mM 이하로 결합하는 성질로서 동정된 화합물이 특히 본 발명에 유용할 것으로 생각된다.

또 다른 연구 방법에서, 상기 후보 화합물의 슈도모나스 세포의 균력을 억제하는 능력은 화합물이 페나진(예를 들어, 피오시아닌) 합성에 미치는 영향을 모니터함으로써 스크린된다. 하나의 방법에 따르면, 후보 화합물은 병원성 세포 배양 배양액에 다양한 농도로첨가된다. 이후 피오시아닌은 임의의 표준적인 방법 예를 들어, 산성 용액에서 이의 520㎚에서의 흡광도를 모니터하여 측정될 수 있다[Essar et al., J.Bacteriol. 172:884, 1990]. 정량을 위하여 액체 배양액에서의 피오시아닌 합성을 최대화하기 위해서, 세포들은 100μM의 FeCl₃를 가하여 개질된 KA 발효액에서 배양될 수 있다[King et al., J.Lab.Clin.Med. 44:301, 1954]. 후보 화합물 존재하에서의 피오시아닌 합성 수준은 상기 후보 분자가 존재하지 않는 대조구 배양 배양액에서 측정된 수준과 비교된다. 피오시아닌의 발현 감소를 촉진시키는 화합물이 본 발명에 유용할 것으로 생각되며; 이러한 분자는 예를 들어, 감염성 유기체의 병원성을 공격하는 치료제로서 사용될 수 있다. 유사한 기술이 피오루빈, 애루기노스틴 A, 믹신 및 투베르마이신 A를 포함하는(이에 한정되는 것은 아니지만) 다른 적당한 페나진을 스크린하는데에 사용될 수 있다. 다른 페나진에 대해서는 Tuner와 Messenger 공저(Advances In Microbial Physiology 27:211-1275, 1986), Sorensen과 Joseph 공저(Pseudomonas aeruginosa as an Opportunistic Pathogen, Campa, M., ed., Plenum Press, N.Y., 1993), Ingram과 Blackwood 공저(Advances in Applied Microbiology 13:267, 1970) 및 Gerber 저(CRC Handbook of Microbiology, Laskin, A.I., and Lechevaller, eds., 2nd edition, vol.5, Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 1984, pp. 573-576)에 기술되어 있다.

유력한 길항약에는 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드와 결합함으로써 이의 활성을 억제하는 유기 분자, 펩타이드, 펩타이드 유사 물질, 폴리펩타이드 및 항체를 포함한다. 유력한 길항약에는 상기 폴리펩타이드의 결합 부위에 결합하거나 또는 여기를 점유하고 있어서 정상적인 생물 활성을 억제하도록 세포 결합 분자와 결합하지 못하게 방해하는 작은 분자들도 포함한다. 다른 유력한 길항약에는 안티센스 분자도 포함한다.

본원에 제공된 각각의 DNA 서열은 항병원성 화합물(예를 들어, 항생제)의 발견 및 개발에도 사용될 수 있다. 코드화된 단백질이 발현됨에 따라, 상기 단백질은 항균성 약물 스크린용 타겟으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 코드화된 단백질의 아미노 말단 지역을 코드화하는 DNA 서열 또는 샤인-달가노(Shine-Delgarno) 서열 또는 각각의 mRNA의 기타 해독 촉진 서열이 원하는 코드화 서열의 발현을 조절하기 위한 안티센스 서열을 구성하는데에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 병원체 및 감염에 대하여 영향력 있는 포유 동물 숙주 사이의 물리적 상호 작용을 방해하는 본 발명의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 억제자의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 분자들은 세균이 포유 동물의 세포 외부 매트릭스 단백질에 부착하여 콜로니화되는 것을 방지하는 데에 사용될 수 있고; 세균이 세포 외부 매트릭스 단백질에 손상을 입히는 것을 방지하는데에 사용될 수 있으며; 포유 동물 세포에 침입하는 것을 차단시키는 데에 사용될 수 있거나; 또는 병원성 발현의 정상적인 진행을 방해하는데에 사용될 수도 있다.

본 발명의 작동약 및 길항약은 예를 들어, 다양한 세균성 감염을 치료 및 억제하는데에 사용될 수 있다.

이와는 달리, 상기 검정법중 임의의 방법으로 동정된 화합물은 임의의 표준적 동물 모델(예를 들어, 본원에 기술된 마우스 화상 검정법과 같은 경우)에 있어서의 병원성 감염의 발병을 방지하는데에 유용한 것으로 확인될 수 있으며, 성공적인 경우 항병원성 치료제(예를 들어, 항생제)로서 사용될 수 있다.

시험 화합물 및 추출물

일반적으로, 병원성 균력을 감소시킬 수 있는 화합물은 당 업계에 공지된 방법에 따라서 천연 산물 또는 합성(또는 반합성) 추출물 또는 화학적 라이브러리로부터 동정된다. 약품 발견 및 개발 분야에서의 숙련자들은 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 소스는 본 발명의 스크린 방법에 중요하지 않다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 사실상 임의의 화학 추출물 또는 화합물이 본원에 기술된 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 추출물 또는 화합물의 예로서는 (이에 한정되는 것은 아니지만) 식물-, 균류-, 원핵 세포- 또는 동물-유래 추출물, 발효액, 및 합성 화합물 및 상기 화합물에 대한 개질성 화합물을 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 당-, 지질-, 펩타이드-, 및 핵산-유래 화합물을 포함하는 임의의 화학적 화합물의 랜덤한(random) 또는 편향된(directed) 합성물(예를 들어, 반-합성물(semi-synthesis) 또는 전체 합성물(total synthesis))을 합성하는데에 유용한 다수의 방법이 존재한다. 합성 화합물 라이브러리는 Brandon Associates(Merrimack, NH) 및 Aldrich Chemical(Milwaukee, WI)로부터 상업적으로 시판되고 있다. 이와는 달리, 세균성, 균류성, 식물성 및 동물 추출물성의 천연 화합물 라이브러리는 Biotics(Sussex, UK), Xenova(Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft. Pierce, FL) 및 PharmaMar, U.S.A.(Cambridge, MA)를 포함하는 다수의 소스로부터 상업적으로 시판되고 있다. 더욱이, 천연 및 합성 된 라이브러리가 생산될 수 있으며, 원하는 경우, 당 업계에 공지된 방법 예를 들어 표준적 추출법 및 분획법에 따라서 생산될 수 있다. 뿐만 아니라, 원하는 경우, 표준적인 화학적, 물리적 또는 생화학적 방법을 사용하여 임의의 라이브러리 또는 화합물이 용이하게 개질된다.

더욱이, 약품 발견 또는 개발 업계의 숙련자들은 이들의 항병원 활성에 대하여 이미 공지되어 있는 복제 해제(dereplication)(예를 들어, 분류학적 복제 해제, 생물학적 복제 해제 및 화학적 복제 해제 또는 이들의 임의의 조합)방법 또는 실험 재료의 복제물(replicates) 또는 반복물(repeats)을 제거하는 방법이 가능하다면 언제든지 사용되어야 한다는 사실을 알고 있다.

크루드한 추출물은 항병원 활성 또는 항균력 활성 또는 결합 활성을 갖는 것으로 밝혀 졌을 뿐만 아니라, 상기 관찰된 효과에 대하여 영향력 있는 화학적 구성 성분을 분리하는데에 양성 리드 추출물을 분획시킬 필요가 있는 것이 밝혀 졌다. 그러므로, 상기 추출, 분획화 및 정제 과정의 목적은 항병원 활성을 갖는 크루드한 추출물내에 존재하는 화학 성분을 주의 깊게 특징화 및 동정하는 것이다. 이와 같은 이질성 추출물의 분획화 및 정제 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 원한다면, 병원성 치료에 유용한 제제인 것으로 여겨지는 화합물은 당 업계에 공지된 방법에 따라서 화학적으로 개질된다.

약학적 치료법 및 식물 예방 보호제

본 발명은 병원체의 병원성 또는 균력을 억제할 수 있는 화합물(펩타이드, 작은 분자성 억제자 및 이의 유사 물질을 포함)을 동정하는 간단한 방법을 제공한다. 따라서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 의학적 또는 농업적 가치가 발견된 화학 물질은 약물, 식물 예방 보호제 또는 현존하는 항병원성 화합물을 합리적인 약물 디자인에 의해서 구조적으로 개질시키기 위한 정보로서 유용하다. 이와 같은 방법들은 여기에 한정되는 것은 아니지만, 세균, 바이러스, 균류, 환형 동물, 선충류, 편형 동물 및 원생 동물을 포함하는 다양한 병원체에 영향을 미치는 화합물을 스크린하는데에 유용하다. 병원성 세균의 예로서는 -이에 한정되는 것은 아니지만- 애어로박터(Aerobacter), 애어로모나스(Aeromonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 바실러스(Bacillus), 박테로이드(Bacteroid), 바르토넬라(Bartonella), 보르텔라(Bortella), 브루셀라(Brucella), 칼림마토박테리움(Calymmatobacterium ), 캄필로박터(Campylobacter), 시트로박터(Citrobacter), 클로스티리디움(Clostridium), 코르니에박테리움(Cornyebacterium), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리치아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 헤모필러스(Hemophilus), 하프니아(Harfnia), 헬리코박터(Helicobacter), 크렙시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 모르가넬라(Morganella), 모락셀라(Moraxella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 크산토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio) 및 예르시니아(Yersinia)를 포함한다.

치료제 용도로서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 동정된 조성물 또는 제제는 예를 들어, 생리적 식염수와 같은 약제학상 허용 가능한 완충액에 제형되어 전신에 투여될 수 있다. 상기 치료는 직접적으로, 예를 들어서 동물을 병원성 폴리펩타이드와 관련된 생물학적 사건을 파괴, 억압, 약화 또는 중화시키는 길항제로 동물을 치료함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 투여 경로로서는 상기 약물을 연속적이고 지속적인 수준으로 환자에 투여할 수 있는 수준으로 제공하는 예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 피부 내부에 주사하는 방법을 포함한다.

사람 환자 또는 동물의 치료에는 치료 유효량의 항병원성 제제를 생리학적으로 허용 가능한 담체에 넣은 것을 사용하여 수행될 수 있다.적당한 담체 또는 이들의 제형물은 예를 들어 E.W.Martin저, Remingston's Pharmaceutical Sciences에 기술되어 있다. 투여될 상기 항병원성 제제(예를 들어, 항생제)의 양은 투여 방식, 환자의 나이 및 체중 그리고 질병의 형태 및 강도에 따라서 다양하다. 일반적으로 투여량은 비록 어떤 경우에는 상기 화합물에 대한 특이성이 증가하기 때문에 감소될 필요가 있을지라도, 다른 미생물 질병의 치료에 사용되는 제제에 사용되는 것들의 범위내 일 것이다. 화합물은 미생물 증식을 억제하는 만큼의 도스양으로 투여된다. 예를 들어, 전신 투여시 화합물은 통상적으로 체중 1kg당 0.1ng-10g 투여된다.

농업적 용도에 있어서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 동정된 화합물 또는 제제는 식물의 잎에 도포되거나 또는 분말 형태로 적용되는 화학 물질로서 사용될 수 있다. 통상적으로, 감염을 방지하기 위해서 이러한 제제들은 병원체 침입에 앞서서 식물의 표면에 투여된다. 식재 이후 종자, 구근, 뿌리, 괴경 및 구경도 이들에 의해서 운반되어 왔거나 또는 이들이 식재되는 토양에 존재하는 병원체를 억제시킴으로써 병원체의 공격을 방지하기 위하여 처리된다. 야채, 관상용 식물, 관목 또는 나무들 또한 다양한 미생물 병원체를 억제하기 위하여 화학적 훈증 소독제로 처리된다. 상기 처리는 바람직하게는 식재하기 수일 또는 수주 이전에 행해진다. 상기 화학 물질은 예를 들어 트랙터와 같은 기계화된 경로 또는 손으로 직접 투여된다. 뿐만 아니라, 상기 검정법의 방법을 사용하여 동정된 화학 물질은 소독제로서 사용될 수 있다.

다른 구체예

일반적으로, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 분리될 수 있으며 본 발명의 핵산 서열을 사용한 PCR 증폭 또는 상동성 스크린법에 의해서 용이하게 분리되는 임의의 핵산 서열을 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 병원 활성(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 검정된)을 파괴하지 않는 방법으로 변형된 폴리펩타이드를 포함한다.

이러한 변화로서는 임의의 돌연 변이, 결실, 삽입 또는 해독후 변형을 포함할 수 있으며, 또는 큰 융합 단백질의 하나의 성분으로서의 본 발명에 따른 임의의 폴리펩타이드 함유물을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 포함된 폴리펩타이드들은 그들의 병원성을 상실하였다.

그러므로, 다른 구체예에서, 본 발명은 실질적으로 본 발명의 폴리펩타이드와 동일한 임의의 단백질을 포함한다. 이러한 상동체로서는 기타 실질적으로 순수한 자연 발생 폴리펩타이드 및 대립 형질 변이체; 자연 돌연 변이체; 유도성 돌연 변이체; 고도로 엄격한 조건, 또는 조금은 바람직하지 않지만, 엄격성이 조금 떨어지는 조건하에서(예를 들어, 40℃, 2×SSC에서 40 뉴클레오타이드 이상의 길이의 프로브로 세척) 본 발명의 핵산 서열중 임의의 하나에 혼성화되는 DNA에 의해서 코드화되는 단백질; 및 본 발명의 항혈청에 의하여 특ㅈ이적으로 결합되는 단백질을 포함한다.

본 발명은 또한 임의의 자연 발생적 폴리펩타이드를 포함한다. 상동체는 본 발명의 자연 발생적 폴리펩타이드와 아미노산 서열, 해독후 변형 또는 두가지 모두의 차이로써 구별될 수 있다. 본 발명의 상동체는 일반적으로 본 발명의 자연 발생적 아미노산 서열의 전부 또는 일부와 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 95% 이상 또는 심지어는 99%정도로 동일성을 갖는다. 서열 길이의 차이는 15 아미노산 잔기 이상, 바람직하게는 25 아미노산 잔기 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 35 아미노산 잔기 이상이다. 또는, 동일성 정도를 결정하는 표준적인 연구 방법에 있어서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있는데, 이때의 확률은 e^-3내지 e^-100으로서 이는 곧 서열이 매우 가깝게 관련되어 있음을 시사하는 것이다. 변형으로서는 생체내 및 시험관내 폴리펩타이드의 화학적 유도화, 예를 들어 아세틸화, 카복실화, 인산화 또는 당화를 포함하며; 이러한 변형은 폴리펩타이드 합성 또는 프로세싱 또는 분리된 변형 효소로 이후의 처리가 행해지는 동안에 발생할 수 있다. 유사체는 또한 1차 서열에 변화를 주어 본 발명의 자연 발생적 폴리펩타이드와 상이하게 만들 수도 있다. 이들로서는 천연의 그리고 유도성의 유전학적 변이체를 포함한다[예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), CSH Press, 1989, 또는 Ausubel외 다수 공저, (상동)에 기술된 바와 같은, 광선 조사 또는 에탄메틸설페이트에 노출시키거나 또는 부위-특이적 돌연 변이 유발에 의해서 랜덤하게 돌연 변이 유발된 결과 유도된 변이체]. 또한 고리화된 펩타이드, 분자, 및 D-아미노산 또는 예를 들어 β또는 γ아미노산과 같은, 비자연 발생적 또는 합성 아미노산과 같은 L-아미노산 이외의 잔기를 포함하는 유사체를 포함한다.

전체 길이의 폴리펩타이드에 더하여, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드중의 임의의 하나의 절편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "절편"이란 용어는 5개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 인접하는 아미노산, 바람직하게는 30개 이상의 인접하는 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 인접하는 아미노산, 및 가장 바람직하게는 60-80 또는 그 이상의 인접 아미노산을 의미한다. 본 발명의 절편은 당 업계의 숙련자들에 공지된 방법에 의하여 생성될 수 있으며 또는 보통의 단백질 프로세싱(예를 들어, 생물학적 활성에 필요치 않는 원래의 폴리펩타이드로부터 아미노산을 분리하는 과정 또는 선택적 mRNA 스플라이싱(alternative mRNA splicing) 또는 선택적 단백질 프로세싱(alternative protein splicing) 과정으로부터 수득될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산 서열의 특이적 검출을 촉진하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 본원에 기술된 핵산 서열 또는 이들의 절편은 종래의 조건하에서 표준적인 혼성화 기술로써 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 프로브로서 사용될 수 있다. 핵산 서열 코드화 서열과 혼성화되는 서열 또는 이의 상보성은 본 발명에 유용할 것으로 생각된다. 본 발명의 핵산 서열의 코드화 서열에 혼성화되는 서열 및 이의 상보성 그리고 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 서열 또한 본 발명에 유용할 것으로 생각된다. 본원에 사용된 "절편"이란 용어는 이것이 핵산 서열에 적용되었을 경우에는, 5개 이상의 인접한 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10개 이상의 인접한 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 20개 내지 30개의 인접한 뉴클레오타이드, 그리고 가장 바람직하게는 40개 내지 80개 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오타이드를 의미한다. 핵산 서열 절편은 당 업계의 숙련자들에게 공지된 방법에 의해서 생성될 수 있다.

본 발명은 개체, 구체적으로 사람에 있어서의 면역학적 응답을 유도하는 방법을 추가로 제공하는데, 여기서 상기 개체를 예를 들어, 본 발명의 임의의 폴리펩타이드(또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 융합 단백질)로 접종하여 감염, 특히 세균 감염(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사 감염)으로부터 상기 개체를보호하는 항체를 생산하고/또는 T 세포 면역 응답을 유도하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 면역 응답을 유도하기 위하여 상기 개체에 핵산 벡터를 전달하여 본원에 기술된 폴리펩타이드(또는 이들의 절편 또는 융합체) 발현을 초래하는 개체에서 면역 응답을 유도하는 방법을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 서열을 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 숙주의 백신 접종에 대한 항원으로서 사용되어 세균의 침입을 에를 들어, 페나진 합성을 차단함으로써 보호하는 특이 항체를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명은 면역원성 재조합 폴리펩타이드 및 적당한 담체를 포함하는 백신 제형을 포함한다.

본 발명은 또한 조성물(예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 프로브), 폴리펩타이드, 항체 및 병원성 조건을 진단하는 방법을 제공한다.

본원 명세서에 언급된 모든 공개 문헌 및 특허 출원은 각각의 독립적인 공개 문헌 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고 문헌으로서 개시되어 있는 것과 같이 본원에 참고 문헌으로서 동일한 정도로 첨부되어 있다.

기타 구체예는 본 청구 범위내에 포함된다.

Claims (43)

1. 서열 252와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
2. 제 1항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열 252에 나타낸 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
3. 서열 105와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
4. 제 3항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열 105에 나타낸 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
5. 서열 106과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
6. 제 5항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열 106에 나타낸 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
7. 서열 253의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드.
8. 제 7항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 253에 나타낸 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드.
9. 서열 107의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드.
10. 제 9항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 107에 나타낸 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드.
11. 서열 108의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드.
12. 제 11항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 108에 나타낸 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드.
13. 병원성 균력 인자(pathogenic virulence factor)의 발현을 감소시킬 수 있는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법이

    (a)제 1항의 핵산 분자를 발현하는 병원성 세포(pathogenic cell)를 제공하는 단계; 및

    (b)상기 병원성 세포를 후보 화합물(candidate compound)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 후보 화합물과의 접촉후 상기 핵산 분자의 발현이 감소되는 것은 병원성 균력 인자의 발현을 감소시키는 화합물임을 동정하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 병원성 세포가 포유 동물을 감염시키는 방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 병원성 세포가 식물을 감염시키는 방법.
16. 병원성 균력 인자(pathogenic virulence factor)의 발현을 감소시킬 수 있는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법이

    (a)제 3항의 핵산 분자를 발현하는 병원성 세포(pathogenic cell)를 제공하는 단계; 및

    (b)상기 병원성 세포를 후보 화합물(candidate compound)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 후보 화합물과의 접촉후 상기 핵산 분자의 발현이 감소되는 것은 병원성 균력 인자의 발현을 감소시키는 화합물임을 동정하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 병원성 세포가 포유 동물을 감염시키는 방법.
18. 제 16항에 있어서, 상기 병원성 세포가 식물을 감염시키는 방법.
19. 병원성 균력 인자(pathogenic virulence factor)의 발현을 감소시킬 수 있는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법이

    (a)제 5항의 핵산 분자를 발현하는 병원성 세포(pathogenic cell)를 제공하는 단계; 및

    (b)상기 병원성 세포를 후보 화합물(candidate compound)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 후보 화합물과의 접촉후 상기 핵산 분자의 발현이 감소되는 것은 병원성 균력 인자의 발현을 감소시키는 화합물임을 동정하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 병원성 세포가 포유 동물을 감염시키는 방법.
21. 제 19항에 있어서, 상기 병원성 세포가 식물을 감염시키는 방법.
22. 폴리펩타이드에 결합하는 화합물을 동정하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)후보 화합물을 결합 가능한 조건하에서 제 7항의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

    (b)상기 후보 화합물과 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
23. 폴리펩타이드에 결합하는 화합물을 동정하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)후보 화합물을 결합 가능한 조건하에서 제 9항의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

    (b)상기 후보 화합물과 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
24. 폴리펩타이드에 결합하는 화합물을 동정하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)후보 화합물을 결합 가능한 조건하에서 제 11항의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

    (b)상기 후보 화합물과 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
25. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)상기 병원체내에서의 제 1항의 핵산 분자에 의하여 코드화되는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 억제하는 치료 유효량의 조성물을 상기 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
26. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)상기 병원체내에서의 제 1항의 핵산 분자에 의하여 코드화되는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 억제하는 치료 유효량의 조성물을 상기 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 병원체가 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)인 방법.
28. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)상기 포유 동물에 상기 병원체에서 제 5항의 핵산 분자에 의하여 코드화되는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 억제하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
29. 제 28항에 있어서, 상기 병원체가 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)인 방법.
30. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)제 5항의 아미노산 서열에 의하여 코드화된 폴리펩타이드에 결합하여 억제시키는 치료 유효량의 조성물을 상기 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 상기 병원체가 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)인 방법.
32. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)상기 포유 동물에 상기 병원체에서 제 7항의 핵산 분자에 의하여 코드화되는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 억제하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
33. 제 32항에 있어서, 상기 병원체 감염이 슈도모나스 아에루기노사에 의하여 유발되는 방법.
34. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)상기 포유 동물에 상기 병원체에서 제 9항의 핵산 분자에 의하여 코드화되는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 억제하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
35. 제 34항에 있어서, 상기 병원체 감염이 슈도모나스 아에루기노사에 의하여 유발된 방법.
36. 포유 동물의 병원성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이

    (a)병원성 감염된 포유 동물을 동정하는 단계; 및

    (b)상기 포유 동물에 제 11항의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드에 결합하여 억제시키는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
37. 제 36항에 있어서, 상기 병원체 감염이 슈도모나스 아에루기노사에 의하여 유발된 방법.
38. 슈도모나스 세포의 균력(virulence)을 억제하는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법이

    (a)슈도모나스(Pseudomonas) 세포를 제공하는 단계;

    (b)상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및

    (c)페나진의 존재를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 비처리 대조구 세포(untreated control cell)에 비해서 페나진이 감소된 것은 상기 화합물이 상기 슈도모나스 세포의 균력을 억제하는 화합물임을 시사해 주는 방법
39. 제 38항에 있어서, 상기 세포가 슈도모나스 아에루기노사인 방법.
40. 제 38항에 있어서, 상기 페나진이 분광법(spectroscopy)에 의해서 검출되는 방법.
41. 제 38항에 있어서, 상기 페나진이 피오시아닌(pyocyanin)인 방법.
42. 제 41항에 있어서, 상기 피오시아닌이 520㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 검출되는 방법.
43. 제 38항에 있어서, 상기 세포가 세포 배양액내에 존재하는 방법.