CN1309720A - 毒性相关核酸序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了细菌毒性多肽、编码这种多肽的核酸序列(例如DNA)、利用重组技术制备这种多肽的方法。本发明还提供利用这种多肽筛选抗菌性或抑菌性化合物的方法。
Description
发明背景
本发明涉及与微生物的致病性有关的核酸分子、基因和多肽。
病原体采用多种遗传策略来在其宿主中引起感染,并偶尔产生疾病。微生物致病性的表达依赖于复杂的遗传调节途径。对微生物致病性主旨的了解对于我们理解病原体的毒性机制以及开发新型的“抗毒或抗病原体”试剂来说是必不可少的,而后者又为我们对抗感染和疾病所必需。
在一个特殊实施例中,人的机会病原体---铜绿假单胞菌是一种广泛存在的革兰氏阴性杆菌,它可以从土壤、水和植物中分离(Palleroni,J.N.In:Bergey’s Manual of SystematicBacteriology,ed.J.G.Holt,Williams,Baltimore,MD,pp.141-172,1984)。已经有多种铜绿假单胞菌的毒力因子得到了描述,它们中的大多数,例如外毒素A、弹性蛋白酶和磷脂酶C,开始时都是在其细胞毒活性的基础上用生物化学的方法检测出来的(Fink,R.B.,Pseudomonas aeruginosa the Opportunist:Pathogenesisand Disease,Boca Raton,CRC Press Inc.,1993)。随后,对应于这些因子的基因或调节这些因子表达的基因被鉴定。总的来说,哺乳动物的细菌性病原体的多数致病性相关基因开始时都是使用生物试验检测出来的。与哺乳动物病原体不同,简单、系统的遗传策略已经常规用于在植物病原体中鉴定致病性相关的基因。在经过随机的转座子介导的诱变之后,成千上万的植物病原菌的突变克隆被单独接种到一个个的植物中,来确定它们是否含有一个能影响与宿主致病性相互作用的突变(Boucher等,J.Bacteriol.168:5626-5623,1987;Comai和Kosuge,J.Bacteriol.149:40-46,1982;Lindgren等,J.Bacteriol.168:512-522,1986;Rahme等,J.Bacteriol.173:575-586,1991;Willis等,Mol.Plant-Microbe Interact.3:149-156,1990)。难以使用全动物的哺乳动物致病性模型来进行比较实验,因为这需要使用大量的动物来进行致病性攻击。
发明简述
我们已经鉴定和分析了大量的核酸分子、多肽和小分子(例如吩嗪),它们都参与使一种病原体具有致病性和毒性。因此这个发现提供了一个药物筛选的基础,这种药物筛选的目的是评估和鉴定能够阻断一种病原体的致病性和毒性的“抗毒性”试剂(例如通过选择性地将病原体基因表达打开或关上)或能够灭活或抑制一种参与微生物致病性的多肽的活性的“抗毒性”试剂。靶向这些分子的药物作为这样的抗毒性试剂非常有用。
在一个方面,本发明描述了一种分离核酸分子,它含有与以下任何一种序列基本上相同的序列:BI48(SEQID NO:1),ORF2(SEQ ID NO:2),ORF3(SEQ ID NO:4),ORF602c(SEQ ID NO:6),ORF214(SEQ IDNO:8),ORF1242c(SEQ ID NO:10),ORF594(SEQ ID NO:12),ORF1040(SEQ IDNO:14),ORF1640c(SEQ ID NO:16),ORF2228c(SEQ ID NO:18),ORF2068c(SEQID NO:20),ORF1997(SEQ ID NO:22),ORF2558c(SEQ ID NO:24),ORF2929c(SEQ ID NO:26),ORF3965c(SEQ ID NO:28),ORF3218(SEQ ID NO:30),ORF3568(SEQ ID NO:32),ORF4506c(SEQ ID NO:34),ORF3973(SEQ IDNO:36),ORF4271(SEQ ID NO:38),ORF4698(SEQ ID NO:40),ORF5028(SEQ IDNO:42),ORF5080(SEQ ID NO:44),ORF6479c(SEQ ID NO:46),ORF5496(SEQID NO:48),ORF5840(SEQ ID NO:50),ORF5899(SEQ ID NO:52),ORF6325(SEQID NO:54),ORF7567c(SEQ ID NO:56),ORF7180(SEQ ID NO:58),ORF7501(SEQ ID NO:60),ORF7584(SEQ ID NO:62),ORF8208c(SEQ ID NO:64),ORF8109(SEQ ID NO:66),ORF9005c(SEQ ID NO:68),ORF8222(SEQ IDNO:70),ORF8755c(SEQ ID NO:72),ORF9431c(SEQ ID NO:74),ORF9158(SEQID NO:76),ORF10125c(SEQ ID NO:78),ORF9770(SEQ ID NO:80),ORF9991(SEQ ID NO:82),ORF10765c(SEQ ID NO:84),ORF10475(SEQ ID NO:86),ORF11095c(SEQ ID NO:88),ORF11264(SEQ ID NO:90),ORF11738(SEQ IDNO:92),ORF12348c(SEQ ID NO:94),ORF12314c(SEQ ID NO:96),ORF13156c(SEQ ID NO:98),ORF12795(SEQ ID NO:100),ORF13755c(SEQ ID NO:210),ORF13795c(SEQ ID NO:212),ORF14727c(SEQ ID NO:214),ORF13779(SEQ IDNO:216),ORF14293c(SEQ ID NO:218),ORFI4155(SEQ ID NO:220),ORF14360(SEQ ID NO:222),ORF15342c(SEQ ID NO:224),ORF15260c(SEQ ID NO:226),ORF14991(SEQ ID NO:228),ORF15590c(SEQ ID NO:230),ORF15675c(SEQ IDNO:232),ORF16405(SEQ ID NO:234),ORF16925(SEQ ID NO:236),ORF17793c(SEQ ID NO:238),ORF18548c(SEQ ID NO:240),ORF17875(SEQ ID NO:242),ORF18479(SEQ ID NO:244),ORF19027c(SEQ ID NO:246),ORF19305(SEQ IDNO:248),ORF19519(SEQ ID NO:250),ORF19544(SEQ ID NO:252),ORF20008(SEQ ID NO:254),ORF20623c(SEQ ID NO:256),ORF21210c(SEQ ID NO:258),ORF21493c(SEQ ID NO:260),ORF21333(SEQ ID NO:262),ORF22074c(SEQ IDNO:264),ORF21421(SEQ ID NO:266),ORF22608c(SEQ ID NO:268),ORF22626(SEQ ID NO:270),ORF23228(SEQ ID NO:272),ORF23367(SEQ ID NO:274),ORF25103c(SEQ ID NO:276),ORF23556(SEQ ID NO:278),ORF26191c(SEQ IDNO:280),ORF23751(SEQ ID NO:282),ORF24222(SEQ ID NO:284),ORF24368(SEQ ID NO:286),ORF24888c(SEQ ID NO:288),ORF25398c(SEQ ID NO:290),ORF25892c(SEQ ID NO:292),ORF25110(SEQ ID NO:294),ORF25510(SEQ IDNO:296),ORF26762c(SEQ ID NO:298),ORF26257(SEQ ID NO:300),ORF26844c(SEQ ID NO:302),ORF26486(SEQ ID NO:304),ORF26857c(SEQ ID NO:306),ORF27314c(SEQ ID NO:308),ORF27730c(SEQ ID NO:310),ORF26983(SEQ IDNO:312),ORF28068c(SEQ ID NO:314),ORF27522(SEQ ID NO:316),ORF28033c(SEQ ID NO:318),ORF29701c(SEQ ID NO:320),ORF28118(SEQ ID NO:322),ORF28129(SEQ ID NO:324),ORF29709c(SEQ ID NO:326),ORF29189(SEQ IDNO:328),ORF29382(SEQ ID NO:330),ORF30590c(SEQ ID NO:332),ORF29729(SEQ ID NO:334),ORF30221(SEQ ID NO:336),ORF30736c(SEQ ID NO:338),ORF30539(SEQ ID NO:340),ORF31247c(SEQ ID NO:342),ORF31539c(SEQ IDNO:346),ORF31222(SEQ ID NO:348),ORF31266(SEQ ID NO:350),ORF31661c(SEQ ID NO:352),ORF32061c(SEQ ID NO:354),ORF32072c(SEQ ID NO:356),ORF31784(SEQ ID NO:358),ORF32568c(SEQ ID NO:360),ORF33157c(SEQ IDNO:362),ORF32539(SEQ ID NO:364),ORF33705c(SEQ ID NO:366),ORF32832(SEQ ID NO:368),ORF33547c(SEQ ID NO:370),ORF33205(SEQ ID NO:372),ORF33512(SEQ ID NO:374),ORF33771(SEQ ID NO:376),ORF34385c(SEQ IDNO:378),ORF33988(SEQ ID NO:380),ORF34274(SEQ ID NO:382),ORF34726c(SEQ ID NO:384),ORF34916(SEQ ID NO:386),ORF35464c(SEQ ID NO:388),ORF35289(SEQ ID NO:390),ORF35410(SEQ ID NO:392),ORF35907c(SEQ IDNO:394),ORF35534(SEQ ID NO:396),ORF35930(SEQ ID NO:398),ORF36246(SEQ ID NO:400),ORF26640c(SEQ ID NO:402),ORF36739(SEQ ID NO:404),ORF37932c(SEQ ID NO:406),ORF38640c(SEQ ID NO:408),ORF39309c(SEQID NO:410),ORF38768(SEQ ID NO:412),ORF40047c(SEQ ID NO:414),ORF40560c(SEQ ID NO:416),ORF40238(SEQ ID NO:418),ORF40329(SEQ IDNO:420),ORF40709c(SEQ ID NO:422),ORF40507(SEQ ID NO:424),ORF41275c(SEQ ID NO:426),ORF42234c(SEQ ID NO:428),ORF41764c(SEQ ID NO:430),ORF41284(SEQ ID NO:432),ORF41598(SEQ ID NO:434),ORF42172c(SEQ IDNO:436),ORF42233c(SEQ ID NO:438),33A9(SEQ ID NO:102,189,190,191,192,193,194,195,196,197,and198),34B12(SEQ ID NO:104),34B12-ORF1(SEQID NO:105),34B12-ORF2(SEQ ID NO:106),36A4(SEQ ID NO:109),36A4 contig(SEQ ID NO:111),2342(SEQ ID NO:112),3E8 phn(-)(SEQ ID NO:114),3E8contigPAO1(SEQ ID NO:115),34H4(SEQ ID NO:118),33C7(SEQ ID NO:119),25al2.3(SEQ ID NO:120),8C12(SEQ ID NO:121),2A8 (SEQ ID NO:122),41A5(SEQ ID NO:123),50E12(SEQ ID NO:124),35A9(SEQ ID NO:125),pho23(SEQID NO:126),16G12(SEQ ID NO:127),25F1(SEQ ID NO:128),PA14 degP(SEQID NO:131),1126 contig(SEQ ID NO:135),contig 1344(SEQ ID NO:136),ORFA(SEQ ID NO:440),ORFB(SEQ ID NO:441),ORFC(SEQ ID NO:442),phzR(SEQID NO:164, 和 1G2(SEQ ID NO:137).优选地,分离核酸分子包含上述序列的任何一种或其片段,并来源于一种病原体(例如来源于一种细菌病原体如铜绿假单胞菌)。此外,本发明包括载体和细胞,它们每一个都至少含有一种本发明的分离核酸分子;并且本发明包括制备重组多肽的方法,这种方法包括提供用本发明的一种核酸分子转化的细胞,其定位使其可以在细胞中表达,在适合于表达该核酸分子的条件下培养转化细胞,并分离重组多肽。本发明进一步描述了这样表达本发明的分离核酸分子而制备的重组多肽,以及能特异性地识别与结合这样一种重组多肽的基本上纯的抗体。
在另一个方面,本发明描述了一种基本上纯的多肽,它包含与下列任何一种氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列:
ORF2(SEQ ID NO:3),ORF3(SEQ ID NO:5),ORF602c(SEQ ID NO:7),ORF214(SEQ ID NO:9),ORF1242c(SEQ ID NO:11),ORF594(SEQ ID NO:13),ORF1040(SEQ ID NO:15),ORF1640c(SEQ ID NO:17),ORF2228c(SEQ ID NO:19),ORF2068c(SEQ ID NO:21),ORF1997(SEQ IDNO:23),ORF2558c(SEQ ID NO:25),ORF2929c(SEQ ID NO:27),ORF3965c(SEQID NO:29),ORF3218(SEQ ID NO:31),ORF3568(SEQ ID NO:33),ORF4506c(SEQ ID NO:35),ORF3973(SEQ ID NO:37),ORF4271(SEQ ID NO:39),ORF4698(SEQ ID NO:41),ORF5028(SEQ ID NO:43),ORF5080(SEQ ID NO:45),ORF6479c(SEQ ID NO:47),ORF5496(SEQ ID NO:49),ORF5840(SEQ IDNO:51),ORF5899(SEQ ID NO:53),ORF6325(SEQ ID NO:55),ORF7567c(SEQID NO:57),ORF7180(SEQ ID NO:59),ORF7501(SEQ ID NO:61),ORF7584(SEQID NO:63),ORF8208c(SEQ ID NO:65),ORF8109(SEQ ID NO:67),ORF9005c(SEQ ID NO:69),ORF8222(SEQ ID NO:71),ORF8755c(SEQ ID NO:73),ORF9431c(SEQ ID NO:75),ORF9158(SEQ ID NO:77),ORF10125c(SEQ IDNO:79),ORF9770(SEQ ID NO:81),ORF9991(SEQ ID NO:83),ORF10765c(SEQID NO:85),ORF10475(SEQ ID NO:87),ORF11095c(SEQ ID NO:89),ORF11264(SEQ ID NO:91),ORF11738(SEQ ID NO:93),ORF12348c(SEQ ID NO:95),ORF12314c(SEQ ID NO:97),ORF13156c(SEQ ID NO:99),ORF12795(SEQ IDNO:101),ORF13755c(SEQ ID NO:211),ORF13795c(SEQ ID NO:213),ORF14727c(SEQ ID NO:215),ORF13779(SEQ ID NO:217),ORF14293c(SEQ IDNO:219),ORF14155(SEQ ID NO:221),ORF14360(SEQ ID NO:223),ORF15342c(SEQ ID NO:225),ORF15260c(SEQ ID NO:227),ORF14991(SEQ ID NO:229),ORF15590c(SEQ ID NO:231),ORF15675c(SEQ ID NO:233),ORF16405(SEQ IDNO:235),ORF16925(SEQ ID NO:237),ORF17793c(SEQ ID NO:239),ORF18548c(SEQ ID NO:241),ORF17875(SEQ ID NO:243),ORF18479(SEQ ID NO:245),ORF19027c(SEQ ID NO:247),ORF19305(SEQ ID NO:249),ORF19519(SEQ IDNO:251),ORF19544(SEQ ID NO:253),ORF20008(SEQ ID NO:255),ORF20623c(SEQ ID NO:257),ORF21210c(SEQ ID NO:259),ORF21493c(SEQ ID NO:261),ORF21333(SEQ ID NO:263),ORF22074c (SEQ ID NO:265),ORF21421(SEQ IDNO:267),ORF22608c(SEQ ID NO:269),ORF22626 (SEQ ID NO:271),ORF23228(SEQ ID NO:273),ORF23367(SEQ ID NO:275),ORF25103c(SEQ ID NO:277),ORF23556(SEQ ID NO:279),ORF26191c(SEQ ID NO:281),ORF23751(SEQ IDNO:283),ORF24222(SEQ ID NO:285),ORF24368(SEQ ID NO:287),ORF24888c(SEQ ID NO:289),ORF25398c(SEQ ID NO:291),ORF25892c(SEQ ID NO:293),ORF25110(SEQ ID NO:295),ORF25510(SEQ ID NO:297),ORF26762c(SEQ IDNO:299),ORF26257(SEQ ID NO:301),ORF26844c(SEQ ID NO:303),ORF26486(SEQ ID NO:305),ORF26857c(SEQ ID NO:307),ORF27314c(SEQ ID NO:309),ORF27730c(SEQ ID NO:311),ORF26983(SEQ ID NO:313),ORF28068c(SEQ IDNO:315),ORF27522(SEQ ID NO:317),ORF28033c(SEQ ID NO:319),ORF29701c(SEQ ID NO:321),ORF28118(SEQ ID NO:323),ORF28129(SEQ ID NO:325),ORF29709c(SEQ ID NO:327),ORF29189(SEQ ID NO:329),ORF29382(SEQ IDNO:331),ORF30590c(SEQ ID NO:333),ORF29729(SEQ ID NO:335),ORF30221(SEQ ID NO:337),ORF30736c(SEQ ID NO:339),ORF30539(SEQ ID NO:341),ORF31247c(SEQ ID NO:343),ORF30963c(SEQ ID NO:345),ORF31539c(SEQID NO:347),ORF31222(SEQ ID NO:349),ORF31266(SEQ ID NO:351),ORF31661c(SEQ ID NO:353),ORF32061c(SEQ ID NO:355),ORF32072c(SEQID NO:357),ORF31784(SEQ ID NO:359),ORF32568c(SEQ ID NO:361),ORF33157c(SEQ ID NO:363),ORF32530(SEQ ID NO:365),ORF33705c(SEQ IDNO:367),ORF32832(SEQ ID NO:369),ORF33547c(SEQ ID NO:371),ORF33205(SEQ ID NO:373),ORF33512(SEQ ID NO:375),ORF33771(SEQ ID NO:377),ORF34385c(SEQ ID NO:379),ORF33988(SEQ ID NO:381),ORF34274(SEQ IDNO:383),ORF34726c(SEQ ID NO:385),ORF34916(SEQ ID NO:387),ORF35464c(SEQ ID NO:389),ORF35289(SEQ ID NO:391),ORF35410(SEQ ID NO:393),ORF35907c(SEQ ID NO:395),ORF35534(SEQ ID NO:397),ORF35930(SEQ IDNO:399),ORF36246(SEQ ID NO:401),ORF26640c(SEQ ID NO:403),ORF36769(SEQ ID NO:405),ORF37932c(SEQ ID NO:407),ORF38640c(SEQ ID NO:409),ORF39309c(SEQ ID NO:411),ORF38768(SEQ ID NO:413),ORF40047c(SEQ IDNO:415),ORF40560c(SEQ ID NO:417),ORF40238(SEQ ID NO:419),ORF40329(SEQ ID NO:421),ORF40709c(SEQ ID NO:423),ORF40507(SEQ ID NO:425),ORF41275c(SEQ ID NO:427),ORF42234c(SEQ ID NO:429),ORF41764c(SEQID NO:431),ORF41284(SEQ ID NO:433),ORF41598(SEQ ID NO:435),ORF42172c(SEQ ID NO:437),ORF42233c(SEQ ID NO:439),33A9(SEQ IDNOS:103,199,200,201,202,203,204,205,206,207,and 208),34B12-ORF1(SEQID NO:107),34B12-ORF2(SEQ ID NO:108),36A4(SEQ ID NO:110),3E8phzA(SEQ ID NO:116),3E8phzB(SEQ ID NO:117),PhzR (SEQ ID NO:165),ORFA(SEQ ID NO:443),ORFB(SEQ ID NO:444),ORFC(SEQ ID NO:445),和 PA14degP (SEQ ID NO:132).优选地,基本上纯的多肽包含上述序列的任何一种或其片段,并来源于一种病原体(例如来源于一种细菌病原体如铜绿假单胞菌)。
在另一个相关方面,本发明描述了鉴定一种能降低致病性毒力因子(例如,在转录或转录后水平)的表达的化合物的方法,包括(a)提供一种能表达本发明的任何一种分离核酸分子的致病性细胞;并(b)将该致病性细胞与一种候选化合物作用,在与候选化合物作用后该核酸分子的表达降低就证明该化合物能降低一种致病性毒力因子的表达。在一个优选的实施方案中,用该致病性细胞感染一种哺乳动物(例如人)或一种植物。
在另一个相关方面,本发明描述了鉴定能与一种多肽结合的化合物的方法,包括(a)将一种候选化合物与一种基本上纯的、包含本发明的任何一种氨基酸序列的多肽在允许结合作用发生的条件下作用;并(b)检测候选化合物与该多肽的结合。
此外,本发明描述了一种在哺乳动物中治疗致病性感染的方法,包括(a)鉴定带有一种致病性感染的哺乳动物;并(b)将治疗有效量的一种组合物给予该哺乳动物,所说的组合物能抑制一种由本发明的任何一种核酸分子编码的多肽的表达或活性。在优选的实施方案中,病原体是铜绿假单胞菌。
在另一个方面,本发明描述了一种在哺乳动物中治疗致病性感染的方法,包括(a)鉴定带有一种致病性感染的哺乳动物;并(b)将治疗有效量的一种组合物给予该哺乳动物,所说的组合物能结合并抑制一种由本发明的任何一种氨基酸序列编码的多肽。在优选的实施方案中,致病性感染是由铜绿假单胞菌引起的。
而且,本发明描述了鉴定能抑制一种假单胞菌细胞的毒性的化合物的方法,包括(a)提供一种假单胞菌细胞;(b)将该细胞与一种候选化合物作用;并(c)检测吩嗪的存在,当相对于未处理的对照培养物该吩嗪降低,就表明该化合物抑制该假单胞菌细胞的毒性。在优选的实施方案中,该细胞是铜绿假单胞菌;该细胞存在于一种细胞培养物中,吩嗪用光谱学来检测(例如绿脓素在520nm的吸收处进行检测)绿脓素一般按照任何标准方法例如这里介绍的方法进行检测。
“分离核酸分子”是指这样一种核酸(例如一种DNA),它不含在获得本发明的该核酸分子的有机体的天然基因组中位于该基因两翼的基因。因此该词包括,例如整合在载体中、自主复制的质粒或病毒中、或原核或真核细胞的基因组DNA中、或以不合其他序列的单独分子形式存在(例如,用PCR或限制酶切消化制备的一种cDNA或基因组或cDNA片段)的重组DNA。此外,该词包括这样一种RNA分子,它转录自一种DNA分子以及一种重组DNA,同时后者又是一种编码额外多肽序列的杂合基因的一部分。
“多肽”是指任何的氨基酸链,不管其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。
“基本上纯的多肽”是指这样一种本发明的多肽,它已从天然伴随它的组分中分离出来。通常,当在重量上60%不含天然与其相伴的蛋白和天然有机分子时,多肽就是基本上纯的。优选地,本发明的多肽制备物在重量上至少为75%纯、更优选至少为90%、最优选至少为99%。本发明的基本上纯的多肽可通过,例如从一种天然原料(例如一种病原体)中抽提、用编码这样一种多肽的重组核酸表达、或化学合成该蛋白的方法来获得。纯度可用任何合适的方法来测量,例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或用HPLC分析。
“基本上相同”是指一种多肽或核酸分子显示与一种参照氨基酸序列(例如这里介绍的任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如这里介绍的任何一种核酸序列)至少有25%的同一样。这样一种序列优选至少与用来比较的序列在氨基酸水平或核酸水平上至少有30%、40%、50%、60%、更优选为80%、最优选为90%或甚至95%的同一性。
序列的同一性通常使用序列分析软件(例如Genetics ComputerGroup,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,MadiSon WI 53705的Sequence AhalysisSoftware Package,或BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)进行测定。这种软件通过分配与不同取代、删除和/或其他修饰的同源程度来将相同或相似的序列匹配。保守取代通常包括下列各组中的取代:甘氨酸、丙氨酸;缬氨酸、并亮氨酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸;赖氨酸、精氨酸;和苯丙氨酸、酪氨酸。在一个确定同一性程度的方法实例中,可以使用一种BLAST程序,其中可能性分数在e-3和e-100之间,这表示一种密切相关的序列。
“转化细胞”是指这样一种细胞,在该细胞(或其亲本细胞)中已用重组DNA技术的方法导入了编码本发明的一种多肽的DNA分子(如这里使用的)。
“表达定位”是指DNA分子定位于与一种能指导该序列转录和翻译的DNA序列(即协助诸如本发明的一种重组多肽或RNA分子产生)连接。
“纯化的抗体”是指这样一种抗体,它在重量上至少为60%不含与其天然相伴的蛋白和天然有机分子。抗体制备物优选在重量上至少为75%纯、更优选至少为90%、最优选至少为99%。本发明的纯化抗体可以通过诸如使用本发明的一种重组制备的多肽进行亲和层析以及标准技术来获得。
“特异性结合”是指这样一种化合物或抗体,它能识别和结合本发明的一种多肽,但基本上不结合和识别在天然含有本发明的一种多肽的样品例如一种生物样品中的其他分子。
“来源自”是指分离形式或具有天然产生序列的序列(例如一种cDNA、基因组DNA、合成的、或其组合形式)。
“抑制一种病原体”是指一种候选化合物的减少、抑制、减弱、消除或阻碍一种病原体介导的疾病或一种感染在真核宿主有机体中发展或进行的能力。这种抑制在任何合适的致病性试验(例如这里介绍的试验)中与没有该候选化合物的症状相比,优选将致病性降低至少5%、更优选至少25%、最优选至少50%。在一个特殊实施例中,抑制可以通过在与候选化合物或抽提物作用的宿主有机体中监测致病症状来进行测定,相对于未与该化合物作用的宿主有机体中的致病性症状水平,症状水平的下降就表明了该化合物介导的对病原体的抑制。
“致病性毒力因子”是指这样一种细胞组分(例如一种蛋白如转录因子以及编码这样一种蛋白的基因),在没有该组分时,病原体不能在一种真核宿主有机体中引起疾病或感染。
本发明提供多种靶,这些靶可用于发展能特异性地阻断一种微生物的致病性的药物。此外,本发明的方法提供一种方便的方法,用来鉴定能安全地用于真核宿主有机体(即不会对该有机体的正常发育和生理产生有害影响的化合物)并有效地对抗致病性微生物(即通过抑制病原体的毒性)的化合物。此外,本发明的方法提供一种途径,用来高体积通量地、高敏感性地和低复杂性地分析事实上任何数量的具有抗毒性作用的化合物。这些方法施用起来也相对廉价,并且能分析在纯化的或粗制的抽提物形式中发现的微量的活性物质。
本发明的其他特征和优点将在发明详述和权利要求中表现。
发明详述
首先介绍附图。
附图
图1是显示了粘粒BI48的物理图谱和所鉴定的开放阅读框(ORFs)的方向的示意图。
图2显示了粘粒BI48的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图3显示了如下序列的核苷酸序列:
ORF2(SEQ ID NO:2),ORF3(SEQ ID NO:4),ORF602c(SEQ ID NO:6),ORF214(SEQ ID NO:8),ORF1242c(SEQ ID NO:10),ORF594(SEQ ID NO:12),ORF1040(SEQ ID NO:14),ORF1640c(SEQ ID NO:16),ORF2228c(SEQ ID NO:18),ORF2068c(SEQ ID NO:20),ORF1997(SEQ ID NO:22),ORF2558c(SEQ ID NO:24),ORF2929c(SEQ IDNO:26),ORF3965c(SEQ ID NO:28),ORF3218(SEQ ID NO:30),ORF3568(SEQID NO:32),ORF4506c(SEQ ID NO:34),ORF3973(SEQ ID NO:36),ORF4271(SEQ ID NO:38),ORF4698(SEQ ID NO:40),ORF5028(SEQ ID NO:42),ORF5080(SEQ ID NO:44),ORF6479c(SEQ ID NO:46),ORF5496(SEQ ID NO:48),ORF5840(SEQ ID NO:50),ORF5899(SEQ ID NO:52),ORF6325(SEQ ID NO:54),ORF7567c(SEQ ID NO:56),ORF7180(SEQ ID NO:58),ORF7501(SEQ IDNO:60),ORF7584(SEQ ID NO:62),ORF8208c(SEQ ID NO:64),ORF8109(SEQID NO:66),ORF9005c(SEQ ID NO:68),ORF8222(SEQ ID NO:70),ORF8755c(SEQ ID NO:72),ORF9431c(SEQ ID NO:74),ORF9158(SEQ ID NO:76),ORF10125c(SEQ ID NO:78),ORF9770(SEQ ID NO:80),ORF9991(SEQ IDNO:82),ORF10765c(SEQ ID NO:84),ORF10475(SEQ ID NO:86),ORF11095c(SEQ ID NO:88),ORF11264(SEQ ID NO:90),ORF11738(SEQ ID NO:92),ORF12348c(SEQ ID NO:94),ORF12314c(SEQ ID NO:96),ORF13156c(SEQ IDNO:98),ORF12795(SEQ ID NO:100),ORF13755c(SEQ ID NO:210),ORF13795c(SEQ ID NO:212),ORF14727c(SEQ ID NO:214),ORF13779(SEQ ID NO:216),ORF14293c(SEQ ID NO:218),ORF14155(SEQ ID NO:220),ORF14360(SEQ IDNO:222),ORF15342c(SEQ ID NO:224),ORF15260c(SEQ ID NO:226),ORF14991(SEQ ID NO:228),ORF15590c(SEQ ID NO:230),ORF15675c(SEQ ID NO:232),ORF16405(SEQ ID NO:234),ORF16925(SEQ ID NO:236),ORF17793c(SEQ IDNO:238),ORF18548c(SEQ ID NO:240),ORF17875(SEQ ID NO:242),ORF18479(SEQ ID NO:244),ORF19027c(SEQ ID NO:246),ORF19305(SEQ ID NO:248),ORF19519(SEQ ID NO:250),ORF19544(SEQ ID NO:252),ORF20008(SEQ IDNO:254),ORF20623c(SEQ ID NO:256),ORF21210c(SEQ ID NO:258),ORF21493c(SEQ ID NO:260),ORF21333(SEQ ID NO:262),ORF22074c(SEQ IDNO:264),ORF21421(SEQ ID NO:266),ORF22608c(SEQ ID NO:268),ORF22626(SEQ ID NO:270),ORF23228(SEQ ID NO:272),ORF23367(SEQ ID NO:274),ORF25103c(SEQ ID NO:276),ORF23556(SEQ ID NO:278),ORF26191c(SEQ IDNO:280),ORF23751(SEQ ID NO:282),ORF24222(SEQ ID NO:284),ORF24368(SEQ ID NO:286),ORF24888c(SEQ ID NO:288),ORF25398c(SEQ ID NO:290),ORF25892c(SEQ ID NO:292),ORF25110(SEQ ID NO:294),ORF25510(SEQ IDNO:296),ORF26762c(SEQ ID NO:298),ORF26257(SEQ ID NO:300),ORF26844c(SEQ ID NO:302),ORF26486(SEQ ID NO:304),ORF26857c(SEQ ID NO:306),ORF27314c(SEQ ID NO:308),ORF27730c(SEQ ID NO:310),ORF26983(SEQ IDNO:312),ORF28068c(SEQ ID NO:314),ORF27522(SEQ ID NO:316),ORF28033c(SEQ ID NO:318),ORF29701c(SEQ ID NO:320),ORF28118(SEQ ID NO:322),ORF28129(SEQ ID NO:324),ORF29709c(SEQ ID NO:326),ORF29189(SEQ IDNO:328),ORF29382(SEQ ID NO:330),ORF30590c(SEQ ID NO:332),ORF29729(SEQ ID NO:334),ORF30221(SEQ ID NO:336),ORF30736c(SEQ ID NO:338),ORF30539(SEQ ID NO:340),ORF31247c(SEQ ID NO:342),ORF31539c(SEQ IDNO:346),ORF31222(SEQ ID NO:348),ORF31266(SEQ ID NO:350),ORF31661c(SEQ ID NO:352),ORF32061c(SEQ ID NO:354),ORF32072c(SEQ ID NO:356),ORF31784(SEQ ID NO:358),ORF32568c(SEQ ID NO:360),ORF33157c(SEQ IDNO:362),ORF32539(SEQ ID NO:364),ORF33705c(SEQ ID NO:366),ORF32832(SEQ ID NO:368),ORF33547c(SEQ ID NO:370),ORF33205(SEQ ID NO:372),ORF33512(SEQ ID NO:374),ORF33771(SEQ ID NO:376),ORF34385c(SEQ IDNO:378),ORF33988(SEQ ID NO:380),ORF34274(SEQ ID NO:382),ORF34726c(SEQ ID NO:384),ORF34916(SEQ ID NO:386),ORF35464c(SEQ ID NO:388),ORF35289(SEQ ID NO:390),ORF35410(SEQ ID NO:392),ORF35907c(SEQ IDNO:394),ORF35534(SEQ ID NO:396),ORF35930(SEQ ID NO:398),ORF36246(SEQ ID NO:400),ORF26640c(SEQ ID NO:402),ORF36739(SEQ ID NO:404),ORF37932c(SEQ ID NO:406),ORF38640c(SEQ ID NO:408),ORF39309c(SEQID NO:410),ORF38768(SEQ ID NO:412),ORF40047c(SEQ ID NO:414),ORF40560c(SEQ ID NO:416),ORF40238(SEQ ID NO:418),ORF40329(SEQ IDNO:420),ORF40709c(SEQ ID NO:422),ORF40507(SEQ ID NO:424),ORF41275c(SEQ ID NO:426),ORF42234c(SEQ ID NO:428),ORF41764c(SEQ ID NO:430),ORF41284(SEQ ID NO:432),ORF41598(SEQ ID NO:434),ORF42172c(SEQ IDNO:436), 和 ORF42233c(SEQ ID NO:438).
图4显示了如下序列的推导的氨基酸序列:ORF2(SEQ ID NO:3),ORF3(SEQ ID NO:5),ORF602c(SEQ ID NO:7),ORF214(SEQ IDNO:9),ORF1242c(SEQ ID NO:11),ORF594(SEQ ID NO:I3),ORF1040(SEQ IDNO:15),ORF1640c(SEQ ID NO:17),ORF2228c(SEQ ID NO:19),ORF2068c(SEQID NO:21),ORF1997(SEQ ID NO:23),ORF2558c(SEQ ID NO:25),ORF2929c(SEQ ID NO:27),ORF3965c(SEQ ID NO:29),ORF3218(SEQ ID NO:31),ORF3568(SEQ ID NO:33),ORF4506c(SEQ ID NO:35),ORF3973(SEQ IDNO:37),ORF4271(SEQ ID NO:39),ORF4698(SEQ ID NO:41),ORF5028(SEQ IDNO:43),ORF5080(SEQ ID NO:45),ORF6479c(SEQ ID NO:47),ORF5496(SEQID NO:49),ORF5840(SEQ ID NO:51),ORF5899(SEQ ID NO:53),ORF6325(SEQID NO:55),ORF7567c(SEQ ID NO:57),ORF7180(SEQ ID NO:59),ORF7501(SEQ ID NO:61),ORF7584(SEQ ID NO:63),ORF8208c(SEQ ID NO:65),ORF8109(SEQ ID NO:67),ORF9005c(SEQ ID NO:69),ORF8222(SEQ IDNO:71),ORF8755c(SEQ ID NO:73),ORF9431c(SEQ ID NO:75),ORF9158(SEQID NO:77),ORF10125c(SEQ ID NO:79),ORF9770(SEQ ID NO:81),ORF9991(SEQ ID NO:83),ORF10765c(SEQ ID NO:85),ORF10475(SEQ ID NO:87),ORF11095c(SEQ ID NO:89),ORF11264(SEQ ID NO:91),ORF11738(SEQ IDNO:93),ORF12348c(SEQ ID NO:95),ORF12314c(SEQ ID NO:97),ORF13156c(SEQ ID NO:99),ORF12795(SEQ ID NO:101),ORF13755c(SEQ ID NO:211),ORF13795c(SEQ ID NO:213),ORF14727c(SEQ ID NO:215),ORF13779(SEQ IDNO:217),ORF14293c(SEQ ID NO:219),ORF14155(SEQ ID NO:221),ORF14360(SEQ ID NO:223),ORF15342c(SEQ ID NO:225),ORF15260c(SEQ ID NO:227),ORF14991(SEQ ID NO:229),ORF15590c(SEQ ID NO:231),ORF15675c(SEQ IDNO:233),ORF16405(SEQ ID NO:235),ORF16925(SEQ ID NO:237),ORF17793c(SEQ ID NO:239),ORF18548c(SEQ ID NO:241),ORF17875(SEQ ID NO:243),ORF18479(SEQ ID NO:245),ORF19027c(SEQ ID NO:247),ORF19305(SEQ IDNO:249),ORF19519(SEQ ID NO:251),ORF19544(SEQ ID NO:253),ORF20008(SEQ ID NO:255),ORF20623c(SEQ ID NO:257),ORF21210c(SEQ ID NO:259),ORF21493c(SEQ ID NO:261),ORF21333(SEQ ID NO:263),ORF22074c(SEQ IDNO:265),ORF21421(SEQ ID NO:267),ORF22608c(SEQ ID NO:269),ORF22626(SEQ ID NO:271),ORF23228(SEQ ID NO:273),ORF23367(SEQ ID NO:275),ORF25103c(SEQ ID NO:277),ORF23556(SEQ ID NO:279),ORF26191c(SEQ IDNO:281),ORF23751(SEQ ID NO:283),ORF24222(SEQ ID NO:285),ORF24368(SEQ ID NO:287),ORF24888c(SEQ ID NO:289),ORF25398c(SEQ ID NO:291),ORF25892c(SEQ ID NO:293),ORF25110(SEQ ID NO:295),ORF25510(SEQ IDNO:297),ORF26762c(SEQ ID NO:299),ORF26257(SEQ ID NO:301),ORF26844c(SEQ ID NO:303),ORF26486(SEQ ID NO:305),ORF26857c(SEQ ID NO:307),ORF27314c(SEQ ID NO:309),ORF27730c(SEQ ID NO:311),ORF26983(SEQ IDNO:313),ORF28068c(SEQ ID NO:315),ORF27522(SEQ ID NO:317),ORF28033c(SEQ ID NO:319),ORF29701c(SEQ ID NO:321),ORF28118(SEQ ID NO:323),ORF28129(SEQ ID NO:325),ORF29709c(SEQ ID NO:327),ORF29189(SEQ IDNO:329),ORF29382(SEQ ID NO:331),ORF30590c(SEQ ID NO:333),ORF29729(SEQ ID NO:335),ORF30221(SEQ ID NO:337),ORF30736c(SEQ ID NO:339),ORF30539(SEQ ID NO:341),ORF31247c(SEQ ID NO:343),ORF30963c(SEQ IDNO:345),ORF31539c(SEQ ID NO:347),ORF31222(SEQ ID NO:349),ORF31266(SEQ ID NO:351),ORF31661c(SEQ ID NO:353),ORF32061c(SEQ ID NO:355),ORF32072c(SEQ ID NO:357),ORF31784(SEQ ID NO:359),ORF32568c(SEQ IDNO:361),ORF33157c(SEQ ID NO:363),ORF32530(SEQ ID NO:365),ORF33705c(SEQ ID NO:367),ORF32832(SEQ ID NO:369),ORF33547c(SEQ ID NO:371),ORF33205(SEQ ID NO:373),ORF33512(SEQ ID NO:375),ORF33771(SEQ IDNO:377),ORF34385c(SEQ ID NO:379),ORF33988(SEQ ID NO:381),ORF34274(SEQ ID NO:383),ORF34726c(SEQ ID NO:385),ORF34916(SEQ ID NO:387),ORF35464c(SEQ ID NO:389),ORF35289(SEQ ID NO:391),ORF35410(SEQ IDNO:393),ORF35907c(SEQ ID NO:395),ORF35534(SEQ ID NO:397),ORF35930(SEQ ID NO:399),ORF36246(SEQ ID NO:401),ORF26640c(SEQ ID NO:403),ORF36769(SEQ ID NO:405),ORF37932c(SEQ ID NO:407),ORF38640c(SEQ IDNO:409),ORF39309c(SEQ ID NO:411),ORF38768(SEQ ID NO:413),ORF40047c(SEQ ID NO:415),ORF40560c(SEQ ID NO:417),ORF40238(SEQ ID NO:419),ORF40329(SEQ ID NO:421),ORF40709c(SEQ ID NO:423),ORF40507(SEQ IDNO:425),ORF41275c(SEQ ID NO:427),ORF42234c(SEQ ID NO:429),ORF41764c(SEQ ID NO:431),ORF41284(SEQ ID NO:433),ORF41598(SEQ IDNO:435),ORF42172c(SEQ ID NO:437), 和 ORF42233c(SEQID NO:439).
图5显示了编码由33A9序列编码的一种蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO:102)。
图6A显示了由33A9序列编码的一种蛋白质的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:103)。
图6B显示了在33A9序列中鉴定的几种ORF---1-10的核苷酸序列(SEQ ID NO:189、190、191、192、193、194、195、196、197和198)以及它们相应的氨基酸序列(ORFs1-10;SEQ ID NOS:199、200、201、202、203、204、205、206、207和208)。
图7显示了34B12 EcoRⅠ片段的物理图谱,该图谱确定了三个ORFs的位置:ORF1(L-S)、ORF2和ORF1S。还显示了含有ORF1(L-S)(SEQ ID NOS:105和107)、ORF2(SEQ ID NOS:106和108)和ORF1-S(SEQ DI NOS:208和209)的对应于pho34B12插入子(SEQID NO:104)的核苷酸序列。
图8显示了图7中描述的ORF1(L-S)(SEQ ID NO:107)的推导的氨基酸序列。
图9显示了图7中描述的ORF2(SEQ ID NO:108)的推导的氨基酸序列。
图10显示了对应于36A4插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO:109)。
图11显示了由36A4序列编码的多肽的推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:110)。由36A4序列编码的推测的多肽与丁香假单胞菌的hrpM基因具有同源性(Loubens et al.Mol.Microbiol.10:329-340,1993)。
图12显示了使用36A4核苷酸序列确定的毗连群2507的核苷酸序列(SEQ ID NO:111)。
图13显示了对应于23A2插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO:112)。
图14A显示了由23A2序列编码的多肽的推导的氨基酸序列(SEQID NO:113)。由23A2序列推测的多肽与铜绿假单胞菌(菌株CD10)中的一种已知蛋白---mexA基因同源。该基因是还含有两种其他基因---mexB和orpM的一个操纵子的一部分(Poole等,Mol.Microbiol.10:529-544,1993);GenBank登记号:L11616。
图14B显示了PA14 mexA和mexB的核苷酸序列(SEQ ID NO:148)和推测的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS:149和150)。
图15显示了使用3E8序列标记确定的PA01吩嗪操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO:114)。
图16A显示了3E8序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:115)。
图16B显示了3E8序列标记两翼的核苷酸序列(SEQ ID NO:160)。
图17显示了推导的3E8 PHZA氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
图18A显示了推导的3E8 PHZB氨基酸序列(SEQ ID NO:117)。
图18B显示了推导的3E8 PHZA的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
图18C显示了推导的3E8 PHZB的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
图18D显示了推导的3E8 PHZC的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
图18E显示了PA14phzR的核苷酸序列(SEQ ID NO:164)和推导的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:165)。
图19显示了34H4序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:118)。
图20显示了33C7序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:119)。
图21显示了25a12.3序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:120)。
图22显示了8C12序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:121)。
图23显示了2A8序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:122)。
图24A分别显示了41A5、50E12、35A9、pho23、16G12和25F1TnphoA序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:123、124、125、126、127和128)。
图24B显示了PA14pho15的核苷酸序列(SEQ ID NO:166)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:167)。
图24C显示了编码YgdPpa(SEQ ID NO:169)和PtsPpa(SEQ IDNO:170)的PA14 50E12的核苷酸序列(SEQ ID NO:168)。
图24D显示了编码mtrRpa(SEQ ID NO:172)的PA14 35A9的核苷酸序列(SEQ ID NO:171)。
图24E显示了编码ORFT(SEQ ID NO:174)、ORFU(SEQ ID NO:175)和DjlApa(SEQ ID NO:176)的PA14 25F1的核苷酸序列(SEQID NO:173)。
图25分别显示了PA01和PA14的铜绿假单胞菌的phnA和phnB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)。
图26显示了PHNA的推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:130)。
图27显示了PA14 degP基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:131)。
图28显示了PA14 degP基因的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:132)。
图29显示了铜绿假单胞菌菌株8830的algD基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:133)。
图30显示了铜绿假单胞菌菌株8830的algD基因的推导的氨基酸序列(SEQID NO:134)。
图31显示了使用25A12确定的1126毗连群的核苷酸序列(SEQ IDNO:135)。
图32显示了使用33C7确定的1344毗连群(SEQ ID NO:136)的物理图谱,它显示了三个确定的ORFs:ORFA(SEQ ID NO:440)、ORFB(SEQ ID NO:441)和ORFC(SEQ ID NO:442)。还显示了分别由这些ORF编码的ORFA(SEQ ID NO:443)、ORFB(SEQ ID NO:444)和ORFC(SEQ ID NO:445)的氨基酸序列。
图33显示了1G2序列标记的核苷酸序列(SEQ ID NO:137)。
图34A-D是使用新小杆线虫(C.elegans)慢致死试验的4个TnphoA突变体的蠕虫致病表型互补的显示图。
图34A是如下内容的显示图:非致病表型的突变体12A1(空心菱形)可以用在菌株12A1(pKDT17)(空心圆圈)中位于组成型lacZ启动子的反式控制下的、来自PA01的1asR基因完全互补成野生型PA14水平(实心方块)。重组的lasR突变体---PA14 lasR-G(空心方块)与12A1(空心菱形)一样是非致病性的。还显示了由使用1日龄的成虫的一个试验所获得的结果。
图34B是pho15的延迟致死表型的互补的显示图。菌株pho15(pEcdsbA)(空心菱形)和pho15(pPAdsbA)携带了位于组成型lacZ启动子控制之下的分别来自大肠杆菌和铜绿假单胞菌的dsbA基因。
图34C是如下内容的显示图:25F1的延迟致死表型分别只被携带了含有orf338和orf338-orf224-djlApa的质粒的菌株25F1(pORF338)和25F1(p3-ORFs)部分保留。
图34D是50E12被orf159-ptsPpa操纵子互补的显示图。菌株50e12(pUCP18)如同突变体12A1一样,即使经过63小时也不能杀死蠕虫。两种表达假定的orf159-ptsPpa操纵子的菌株---50E12(pMT205-1ac)和50E12(pMT206-nat)能够杀死新小杆线虫(C.elegans)。在50E12(pMT205-lac)中,orf159-ptsPpa的转录在组成型lacZ启动子的控制之下,而在50E12(pMT206-nat)中,操纵子由其天然启动子控制。
每个数据点代表3-4个重复的平均值±SD。除非另外说明,在实验中使用同步的L4蠕虫。对于每一个互补分析,至少进行两次独立的实验。
图35A是显示邻氨基苯甲酸合成酶复合物的示意图,该复合物由phnA和phnB基因编码,它催化分支酸转变为邻氨基苯甲酸。邻氨基苯甲酸在铜绿假单胞菌菌株PA01中是绿脓素合成的前体(Essar等,J.Bacteriol.172:884-900,1990)。双箭头表示参与导致邻氨基苯甲酸转变为绿脓素的多个未确定的步骤。
图35B显示在phnA和phnB基因中框内删除1602 bp而产生ΔphnAphnB突变体的示意图。
图35C是ΔphnAphnB突变体对新小杆线虫快速致死的影响的显示图。快速致死实验使用野生型PA14菌株、TnphoA突变体3E8或ΔphnAphnB菌株进行。在开始暴露于细菌3小时后监测蠕虫的死亡,并将在ΔphnAphnB菌株中所见的快速致死缺陷与另一种吩嗪突变体---3E8进行比较。
毒力因子的鉴定和表征
如同这里所介绍的,植物被用作一种体内致病模型,来鉴定人机会病原体---铜绿假单胞菌的毒力因子。在选择弱致病性突变体的植物叶试验中鉴定的9个铜绿假单胞菌菌株UCBPP-PA14的TnphoA突变衍生物中,9个突变衍生物也都在小鼠烧伤试验中显示明显降低的致病性,这说明铜绿假单胞菌在感染两种宿主时使用许多共同策略。这9个突变体中有7个在以前不知道的基因中含有TnphoA插入。这些结果证明,一种人类细菌病原体的另一种非脊椎动物的宿主可以用于一种高通量的体内筛选,用于鉴定参与哺乳动物致病的新型细菌毒力因子。这些实验性实施例是用来说明而不是限制本发明的范围。
这些实验使用下列技术来进行。
菌株、生长条件和质粒。铜绿假单胞菌菌株UCBPP-PA14是一种人临床分离株,它被用于这些鉴定新型毒性相关基因的实验中(Ausubel等,筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs08/411,560,08/852,927,和08/962,750.Rahme等,Science 268:1899-1902,1995),铜绿假单胞菌菌株PAK(Ishimoto和Lory,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1954-1957,1989)和PA01(Holloway等,Microbiol.Rev.43:73-102,1979)已在许多实验室中进行了广泛的研究。Luria Bertani肉汤和琼脂被用于在37℃培养铜绿假单胞菌和大肠杆菌菌株。基本培养基(M9)也被用于培养铜绿假单胞菌。
转座子诱变。UCBPP-PA14的转座子介导的诱变使用大肠杆菌SM10λpir中自杀质粒pRT731上携带的TnphoA来进行(Taylor等,J.Bacteriol.171:1870-1878,1989)。在这种培养基中生长的供体和受体细胞一起铺于Luria Bertani琼脂平板,并在37℃温育8至10小时,并接着铺于含有利福平(100ug/ml)(用来针对大肠杆菌供体进行选择)和卡那霉素(200ug/ml)(用来选择含有TnphoA的铜绿假单胞菌细胞)的Luria Bertani平板。将能在利福平和卡那霉素培养基上生长的克隆复制至含有氨苄青霉素(300ug/ml)的Luria Bertani;氨苄青霉素抗性克隆就表明pRT731整合进UCBPP-PA14的基因组,将它们弃去。
碱性磷酸酶活性。将二千五百(2500)个原养型UCBPP-PA14TnphoA突变体在含有40ug/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(XP)的蛋白胨葡萄糖琼脂平板上进行选择(Ostroff等,J.Bacteriol.172:5915-5923,1990)。选用蛋白胨培养基是因为它能抑制内源性蓝-绿色素绿脓素和黄色荧光色素绿脓菌荧光素的产生,从而能够观察到由phoA+突变体产生的周质碱性磷酸酶对XP进行去磷酸化而产生的蓝色。
培养条件和突变体分离策略。将在L肉汤中在37℃培养至饱和的铜绿假单胞菌菌株在10mM MgSO4中洗涤,并重悬于10mM MgSO4中,使其光密度为0.2(OD600=0.2),并按1∶100和1∶1000稀释(分别相当于约106和105cfu/ml的细菌密度)。使用一只自动移液器将约10ml的稀释细胞接种到在温室(26℃)中在MetroMix盆栽土壤中生长的约12周龄的莴苣植物(Romain或Great lake变种)的茎中。将茎用0.1%的漂白粉洗涤,并置于含有一张Whatman滤纸(Whatman#1)的15cm直径的培养皿中,滤纸预先用10mM MgSO4浸润。每个莴苣叶的中脉用三种不同的将要检测的能产生TnphoA的铜绿假单胞菌突变体进行接种,使用野生型的UCBPP-PA14作为对照。在实验过程中,将平板放置在一个培养箱内,参数为28-30℃和90-100%的相对湿度。每天监测症状,共进行5天。
在拟南芥叶浸润模型中,将按上面方法培养和洗涤的铜绿假单胞菌按1∶100在10mM MgSO4中进行稀释(相当于103/cm2叶盘面积的细菌密度),并按对丁香假单胞菌浸润的介绍注射到6周龄的拟南芥植物的叶中(Ausubel等,筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927,和08/962,750;Rahme等,science 268:1899-1902,1995;Dong等,Plant Cell 3:61-72,1991)。接种条件和症状的监测与莴苣实验相同。收集含有细菌的叶细胞间液,并按介绍确定细菌的数量(Rahme等,Science 268:1899-1902,1995;Dong等,Plant Cell 3:61-72,1991)。每个样品使用两个叶盘,共采用4个不同的样品。使用10mM MgSO4接种的对照植物显示无症状发展。
小鼠致死研究。按前面的介绍在重量为25至30gm之间的雄性AKR/J小鼠的伸出的腹部皮肤制造一个5%总表面积的烧伤(Ausubel等,筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs08/411,560,08/852,927,和08/962,750;Rahme等,science 268:1899-1902,1995:Stevens,J.Burn Care Rehabil.15:232-23,1994)。烧伤后,立即向小鼠注射5×103或5×105的铜绿假单胞菌细胞,并每天监测死于败血症的动物数目,共进行10天。MassachusettsGeneral Hospital的动物研究分委会对该动物研究方法进行了评价和认可。使用Yates’校正的x2检验和Fisher’s精确检验确定了致死数据的统计学意义。各组间的差别在P≤0.05时被认为是有统计学意义。
TnphoA突变体的DNA操作、分子克隆和序列分析。铜绿假单胞菌的染色体DNA用酚抽提法进行分离(Storm和Lory,J.Bacteriol.165:367-372,1986),DNA印迹和杂交研究按Ausuber等(CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley,New York,1996)的介绍进行。
寡核苷酸5’-AATATCGCCCTGAGCAGC-3’(LGR1)(SEQ ID NO:138)和5’-AATACACTCACTATGCGCTG-3’(LGR2)(SEQ ID NO:139)对应于TnphoA的相反链上5’末端的序列。寡核苷酸5’-CCATCTCATCAGAGGGTA-3’(LGR3)(SEQ ID NO:140)和5’-CGTTACCATGTTAGGAGGTC-3’(LGR4)(SEQ ID NO:141)对应于TnphoA的相反链上3’末端的序列。LGR1+LGR2或LGR3+LGR4被用来按介绍通过反向PCR(IPCR)扩增与TnphoA插入位点相邻的DNA序列(Ochman等,1993,方法和应用指南,eds.Innis,M.A.,States,D.J.,1990)。将大小范围在350至650碱基对之间的扩增DNA片段克隆到pBlueScript SK+/-中,方法是在亚克隆到pBlueScript SK+/-的EcoRV位点之前,将IPCR产物的末端补平。为测定IPCR扩增产物的序列,使用Sequenase 2.0试剂盒(U.S.BiochEmical,Inc.)进行双链DNA测序。使用BLASTX程序(Gish和States,Nat.GenEt.3:266-272,1993)将所获得的序列在National Center forBiotechnology Information(NCBI)与非丰余肽序列数据库进行比较。
从UCBPP-PA14基因组文库中分离含有对应于pho34B12突变的基因的野生型克隆及DNA操作。由UCBPP-PA14 TnphoA突变体pho34B12突变体制备的IPCR产物使用一种随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)进行标记,并用作探针在一个pJSR1中的UCBPP-PA14染色体DNA的基因组文库中(Rahme等,Science 268:1899-1902,1995)筛选含有对应于pho34B12突变的基因的克隆。在对应于phoA34B12突变的粘粒克隆pLGR34B12中鉴定了一个3.7kb的EcoRⅠ片段,在将载体和片段的末端补平后,将该片段亚克隆到pRR54(Roberts等,J.Bacteriol.172:6204-6216)的EcoRⅠ位点,构建成pLGRE34812。将同一片段(将其平末端化)亚克隆到pCVD(Donnenberg和Kaper,Infect.Immun.59:4310-4317,1991)的SmaⅠ位点,构建成pLGR34。pLGR被用于按介绍使用一种野生型拷贝取代突变的pho34B12基因(Donnenberg和Kaper,Infect.Immun.59:4310-4317,1991)。还将该3.7kb的EcoRⅠ片段亚克隆到pBlueScript SK+/-的EcoRⅠ位点,构建成pBSR34B12,并用于DNA分析。
一个对应于pho34B12插入子的1,659碱基对序列在相反的链上含有两个重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2),将该序列提交给GenBank,并获得登录号AF031571。ORF1为1,148bp(核苷酸361至1509),ORF2为1,022bp(核苷酸1458至436)。两个ORF的重叠是从核苷酸436至1458。ORF1在核苷酸751含有第二个可能的翻译起始位点,相当于一个758bp的编码区。寡核苷酸引物5’-CGCATCGTCGAAACGCTGGCGGCC-3’(SEQ ID NO:142)和5’-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3’(SEQ ID NO:143)被用来从含有ORF1的pBSR34B12中扩增一个1100bp的片段。因为在ORF1中存在两个可能的起始位点,寡核苷酸引物5’-TGCGCAACGATACGCCGTTGCCGACGATC-3’(SEQ ID NO:144)和5’-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3’(Reg3)(SEQ ID NO:145)也被用来从含有ORF1的pBSR34B12中扩增一个1659bp的片段。寡核苷酸引物5’-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3’(SEQ ID NO:146)和5’-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3’(SEQ ID NO:147)被用来从含有ORF2的pBSR34B12中扩增一个1302 bp的片段。所有引物组合都被设计来含有每种ORF的假定上游调节元件。将所获得的PCR产物(1100、1659和1302bp)克隆到pCR2.1中,分别构建成pLE15、pLE1和pLE2。将所有三种PCR产物亚克隆到pRR54中,分别构建成pRRLE15、pRRLE1和pRRLE2。
TnphoA突变体的酶活性。将在LB培养基中培养18小时的铜绿假单胞菌菌株用于酶活性分析。蛋白水解活性和弹性蛋白水解活性按前面介绍的方法进行测定(Toder等,Mol.Microbiol.5:2003-2010,1991)。绿脓素的量按介绍进行测定(Essar等,J.Bact.172:884-900)。在补加了5%绵羊红细胞的含有胰胨豆胨琼脂(BBL)的平板上温育后,检测溶血活性(Ostroff和Vasil,J.Bacteriol.169:4957-4601)。
一种非极性GacA突变的制备。通过将一个来自粘粒pLGR43(Rahme等,Science 268:1899-1902)的含有gacA基因的3.5kb的PstⅠ片段使用BamHⅠ接头克隆到自杀载体pEGBR(Akerley等,Cell80:611-620,1995)的单一BamHⅠ酶切位点,在UC BPP-PA14中构建了一个非极性的gacA突变。然后将来自pUC18K(Menard等,J.Bacteriol.175:5899-5906,1993)的含有卡那霉素抗性基因盒的一个Klenow末端补平的950bp的EcoRⅠ-HincⅡ片段克隆到gacA中的单一BamHⅠ酶切位点(补平),这样使转录维持,并且gacA下游部分的翻译在卡那霉素基因盒的3’端重新开始。所获得的结构物SW7-4在gacA基因内部含有转录方向的该卡那霉素基因盒,SW7-4被用于通过同源重组将破坏的gacA基因标记交换到野生型UCBPP-PA14的基因组中。
铜绿假单胞菌毒力因子的分离和鉴定。使用上面介绍的方法,用转座子TnphoA对铜绿假单胞菌UCBPP-PA14的基因组进行诱变,使用莴苣茎试验在2500个原养型突变体中筛选被破坏的致病性。该莴苣试验允许在一个单个的莴苣茎上检测数个突变体。有趣的是,我们发现莴苣不仅对UCPBB-PA14的感染易感,还对已经得到很好研究的铜绿假单胞菌菌株PAK(Ishimoto和Lory,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1954-1957,1989)和PAO1(Hollow等,Microbiol.Rev.43:73,1979)易感。后两种菌株都能在莴苣叶上增殖,并显示与UCBPP-PA14相似的疾病症状,其特征是感染4-5天后出现水浸润,接着腐烂。在感染后期,所有三种菌株都侵入莴苣叶的整个中脉,导致组织的完全浸软和萎缩。
如同表1中所概述的,我们在2500个被筛选的原养型中鉴定了9个UCBPP-PA14的能产生TnphoA的突变体,与野生型菌株相比,它们在莴苣茎上表现出没有、微弱或中等的腐烂症状。
表1
菌株 | 在拟南芥叶上生长a | 在拟南芥叶上显示的症状b | %小鼠死亡c | 基因 | |
5×103 | 5×105 | ||||
PA14 | 5.5×107 | 严重 | 53 | 100 | |
33C7 | 8.3×104 | 无 | 0 | 0 | 未知d |
1D7 | 7.5×105 | 弱 | 0 | 50 | gacA |
25A12 | 1.7×106 | 弱 | 11 | 87 | 未知 |
33A9 | 5.1×106 | 中等 | 0 | 0 | 未知 |
25F1 | 1.5×104 | 中等 | 0 | 20 | 未知 |
34H4 | 3.8×106 | 中等 | 0 | 33 | 未知 |
pho34B12 | 4.0×106 | 中等 | 0 | 56 | 未知 |
pho15 | 3.9×104 | 中等 | 0 | 62 | dsbA |
16612 | 2.3×105 | 中等 | 20 | 100 | 未知 |
a4个不同的样品均使用两个叶盘/样品来进行。用10mM MgSO4接种的对照植物在实验过程中显示无症状。三个独立的实验给出了相似的结果。
b感染4至5天后观察到的结果。无,无症状;退绿,接种位点的周围退绿;弱,接种位点周围的组织局部水浸透和退绿;中等,接种位点周围中等强度的水浸透和退绿,并且组织大部分松软;严重,整个叶出现严重的松软腐烂,其特征是在感染2至3天后,接种位点周围出现水浸透反应圈和退绿。
c所有的动物实验均使用8-10个动物/实验进行两次。独立实验显示相似的死亡率百分数。小鼠用约5×103或5×105细胞注射。
dBLASTX分析没有获得有明显同源性的编码蛋白。
用任何突变体都没有观察到叶的严重浸软。将一个含有TnphoA的卡那霉素抗性基因的1542碱基对的BglⅠ-BamHⅠ片段(Taylor等,J.Bact.171:1870-1878,1989)用作探针,DNA印迹分析显示,9个突变体每个都含有一个单一的TnphoA插入。9个UCBPP-PA14TnphoA突变体中有两个---pho34B1和pho15能表达碱性磷酸酶活性,这说明含有这些TnphoA插入的基因编码跨膜或分泌型的蛋白(Taylor等,J.Bact.171:1870-1878,1989;Manoil和Beckwith,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5117,1985)。
通过测量它们在拟南芥叶上在4天中的生长速率,对这9个TnphoA突变体进行了进一步的检测,作为致病性的定量测定(Rahme等,Science 268:1899-1902,1995;Dong等,Plant Cell 3:61-72,1991)。虽然在加富和基本培养基中,与野生型菌株相比,没有突变体在其生长速率上显示任何明显的差别,但所有9个突变体在拟南芥叶上的生长速率比野生型菌株低。表1列出了每个突变体在感染4天后达到的最高生长水平。对所有9个突变体来说,较少的严重症状形成反映了叶中细菌数目的减少。所有突变体除了33C7都显示弱的或中等的腐烂以及伴随不同程度退绿(变黄)的水浸润症状(表1)。但有趣的是,如表1中的概述,单个突变体的增殖并不与它们表现出的症状的严重程度直接相关。例如,虽然突变体25A12(图1)的生长水平与突变体33A9(图5和图6A-B)、pho34B12(图7、8和9)以及34H4(图19)相似,只是野生型UCBPP-PA14的十分之一,但突变体25A12显示非常弱的症状。与此类似,突变体33C7(图20)、pho15(图24B)和25F1(图24A)都能达到相似的最高生长水平(比野生型的生长约低103倍),但只有突变体33C7不产生任何疾病症状(表1)。在10个突变体中观察到的症状程度与增殖水平之间的差异,说明这些突变体可能在参与植物感染过程不同阶段的基因中携带插入子。
9个在植物叶试验中显示较低致病性的产TnphoA突变体各自的致病性,都在一个全厚皮肤热烧伤小鼠模型中进行了测定(Rahme等,Science 268:1899-1902,1995;Stevens,J.Burn Care Rehabil.15:232-23,1994)。如表1中所示,所有9个突变体在两种剂量时都与野生型有明显的差异(P≤0.05),除了25A12和16G12(图24A)在5×105细胞的较高剂量时与野生型没有明显的差异。除了表1中所示的数据,突变体33A9即使在5×106的高剂量时也不会致死。
我们使用DNA印迹分析和DNA序列分析来测定在9个致病性较低的突变体中TnphoA是否插入到了已知基因中。DNA印迹分析显示,突变体1D7含有一个插入到gacA基因(Laville等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1562-1566,1992;Gaffney等,Mol.Plant-MicrobeInteract.7:455-463,1994)的TnphoA,我们在前面已经介绍,gacA是铜绿假单胞菌在植物和动物中的一个重要致病因子(Ausubel等,筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs08/411,560,08/852,927,和08/962,750.Rahme等,Scienee 268:4927-4931,1995)。使用程序BLASTX进行的计算机分析显示,当将对应于其他7个TnphoA插入的DNA序列按所有可能的阅读框翻译时,没有发现与任何已知的基因有明显的相似性(表1)。
我们进行各种生化试验来将9个致病性较低的UCBPP-PA14突变体分类,分类的基础是它们是否在以前已知的主要毒力因子和/或代谢途径中带有缺陷。所有突变体都被测试了蛋白酶、弹性蛋白酶和磷酸酶活性以及它们分泌次级代谢产物绿脓素的能力(Toder等,Mol.Microbiol.5:2003-2010,1991;Essar等,J.Bact.172:884-900;Ostroff和Vasil,J.Bacteriol.169:45974601,1987)。绿脓素是一种氧化还原活性的吩嗪化合物,它可被大多数铜绿假单胞菌的临床株外泌,通过产生活性氧中间物杀死哺乳动物细胞和细菌细胞,它被认为是铜绿假单胞菌的一种毒力因子(Hassett等,Infect.Immun.60:328-336,1992;Kanthakumar等,Infect.Immun.61:2848-2853,1993;Miller等,Infect.Immun.64:182,1996)。突变体33C7、33A9、34H4、25F1和16G12没有在任何所用的生化试验中显示缺陷。突变体pho34B12显示在血琼脂平板上的溶血活性降低、弹性蛋白酶活性降低(约50%)以及没有可检测到的绿脓素产生。突变体pho15显示仅有痕量的弹性蛋白酶活性,与野生型相比蛋白酶活性降低(60-70%)。突变体25A12显示弹性蛋白酶活性减低50%。最后,在gacA中含有一个插入的突变体1D7显示,与野生型相比其绿脓素水平降低(约50%)。除了突变体1D7,第二个独立的gac::TnphoA突变体---突变体33D11在我们的植物筛选中被鉴定。后一突变体也在绿脓素产生上显示相似的降低,并在植物和小鼠中毒力降低。
根据突变体的DNA序列分析和生化试验,突变体1D7和pho34B12中被TnphoA靶向插入的基因被选择来作进一步的分析。如上文所讨论的,1D7在gacA中含有一个插入,我们在前面已经介绍,gacA编码一种铜绿假单胞菌的毒力因子(Rahme等,Science 268:1899-1902,1995)。最近,一种gacA样的基因也显示是鼠伤寒沙门氏菌的一种重要毒力因子(Johnston等,Mol.Microbiol.22:715,1996)。但两种gacA::TnphoA插入(1D7和33D11)、我们以前构建的gacA插入突变体(Ausubel等,筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927,和08/962,750.Rahme等,Science 268:1899-1902,1995)、以及一个独立构建的能影响数种已知毒力因子产生的铜绿假单胞菌gacA突变体(Hassett等,Infect.Immun.60:328-336,1992)都至少对一种基因---紧接着gacA下游的一种大肠杆菌uvrC基因的同源物产生极性作用(Rahme等,Science 268:1899-1902,1995;Laville等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1562-1566,1992;Reimmann等,Mol.Microbiol.24:309-319,1997)。为提供明确的证据来说明,这里介绍的gacA突变体的致病表型丧失是由于gacA开放阅读框本身的破坏,而不是gacA下游一个基因的极性作用,我们使用一个编码卡那霉素抗性的基因盒在UCBPP-PA14中构建了一个非极性的gacA突变体。重要的是,该非极性gacA突变体在小鼠试验(50%致死)和拟南芥试验(4天后长至3×106cfu/cm2)中显示与gacA::TnphoA突变体(1D7)相同的致病水平降低,但不显示极性gacA突变体的极度UV敏感性。和1D7一样,与野生型相比,非极性的gacA突变体也外泌较低水平的绿脓素(50%)。
根据以下原因,突变体pho34B12被选择来进行进一步的分析。首先,pho34B12中的插入直接位于铜绿假单胞菌绿脓素生物合成基因phnA和phnB的下游(Essar等,J.Bact.172:884-900,1990),插入在铜绿假单胞菌基因组的一个以前没有分析的区域内。第二,pho34B12插入导致了多种表型,包括弹性蛋白酶活性和溶血活性降低,这说明pho34B12的TnphoA插入所处的基因可能编码不同致病因子的一个调节子。
为排除这样一种可能性,即pho34B12中的第二个突变而不是TnphoA插入导致了致病表型的丧失,我们通过同源重组用相应的野生型基因置换了pho34B12::TnphoA突变。这导致在植物和动物中致病性缺陷的回复,以及溶血活性和弹性蛋白酶活性和绿脓素产生回复到野生型的水平(下文表2)。
表2a
菌株 | 在拟南芥叶上生长 | 在拟南芥叶上显示的症状 | %小鼠死亡5×105 | %绿脓素 |
PA14 | 5.5×107 | 严重 | 100 | 100 |
pho34B12 | 4.0×106 | 中等 | 56 | ≤1 |
pho34B12重组成野生型 | 3.9×107 | 严重 | 100 | 120 |
pho34B12+pLGRE34B12 | 6.1×105 | 中等 | 0 | 600 |
pho34B12+pRRLE2 | 7.0×105 | 中等 | 13 | 40 |
pho34B12+pRRLE1 | 5.0×105 | 中等 | 13 | 1400 |
pho34B12+pRRLE15 | 1.0×105 | 中等 | 22 | 1360 |
a表格内条目的解释见表1。
表2中的这些结果显示,pho34B12中的TnphoA插入是该菌多种表型包括致病表型丧失的原因。在pho34B12::TnphoA插入后面的终止密码子的下游500bp内没有可能的ORFs存在,这个事实说明,TnphoA不太可能对负责突变体pho34B12的下游基因产生极性作用。用一个含有3.7kb插入子(该插入子包括pho34B12和部分phnAB区)对pho34B12进行遗传互补分析可导致弹性蛋白酶和溶血活性回复到野生型水平,并可产生10倍过量表达的绿脓素(表2)。但是pho34B12在拟南芥和小鼠中破坏的致病性不能被pLGRE34B12互补(表2),很可能是因为多个拷贝的相当于pho34B12的野生型基因的存在。
进一步的DNA序列分析显示,含有pho34B12突变的区域编码两个几乎完全重叠但以相反方向转录的开放阅读框(ORFs)(ORF1和ORF2)。而且,ORF1具有两个潜在的甲硫氨酸起始密码子(命名为ORF1-S和ORF1-L)。由ORF1-s和ORF1-L编码的预计的蛋白以与phnA和phnB相同的方向转录,它们和phoA基因都含有一个共有基元,该基元相当于在多种原核生物膜脂蛋白中发现的一种脂结合位点(Hayashi和Wu,J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471,1990)。这些膜脂蛋白与一个前体信号肽一起合成,这就为pho34B12插入的Pho+表型提供了一种解释(Hayashi和Wu,J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471,1990)。由ORF2编码的预计的蛋白含有N末端的“螺旋-转角-螺旋”DNA结合基元,这个基元与在转录调节子LysR家族中发现的“螺旋-转角-螺旋”基元相似(Henikoff等,Proc.Natl.Acad.sci.USA 85:6602-6606,1988;Viale等,J.Bacteriol.173:5224-5229,1991)。这个家族的蛋白包括参与哺乳动物和植物致病的调节子(Finlay和Falkow,Microbiol.and Mol.Biol.Rev.61:136-169,1997)。两个有功能的、几乎完全重叠的ORFs的存在在细菌基因组中是不常见的。
为确定pho34B12区域中编码的ORFs哪一个是有功能的,我们使用含有对应于ORF1-S、ORF1-L和ORF2的PCR产物的质粒进行另外的互补分析(图7)。能合成ORF2编码的蛋白的质粒(pRRLE2)能使绿脓素的产量和弹性蛋白酶活性回复到野生型水平的20-40%。与此类似,这个互补菌株的溶血活性被部分回复。用分别相当于ORF1-S和ORF1-L的质粒对pho34B12进行互补,也能回复溶血、绿脓素和弹性蛋白酶活性。但有趣的是,质粒pRRLE1和pRRLE15的存在能产生10倍高产量的绿脓素和2倍高水平的弹性蛋白酶活性。无论pRRLE1、pRRLE15还是pRRLE2都不能互补突变体pho34B12在植物或动物中的致病性丧失表型(表2)。对该区域的进一步分析包括位点特异性诱变将进一步阐明三个ORFs中哪一个是在植物和动物中致病所必需的。
上面列出的结果证明,以前未知的在哺乳动物致病性中起明显作用的铜绿假单胞菌毒力因子(基因)可以很方便地通过在随机的铜绿假单胞菌突变体中筛选在植物中显示致病性减弱的突变体来鉴定。这与我们以前的研究一致,在以前的研究中我们证明,至少三种铜绿假单胞菌基因编码参与植物和动物致病性的毒性因子(Ausubel等,筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927,和08/962,750.Rahme等,Science 268:1899-1902,1995)。在另一方面,我们未曾预料到,我们分离的在植物中有较低致病性的9个突变体也都在小鼠中具有较低致病性。这个结果最简单的解释是,铜绿假单胞菌在植物和动物中的致病性都利用一套基本上重叠的基因,这些基因可被认为是基本的毒力基因。另一个可能的解释是,某些已鉴定的基因可能编码控制不同效应分子的调节蛋白(即pho34B12),它们的一些亚类可能对植物或动物具有特异性。我们也未预料到在该研究中鉴定的突变体大多数(9个中有7个)会对应于以前不知道的基因。使用泊松分布,根据铜绿假单胞菌的5.9Mb大小的基因组和平均基因大小为1.1kb,我们计算出,检测2500个突变体代表在试验中检测每种基因的95%可能性所需要检测的总数目的25%。因此,由于我们对铜绿假单胞菌毒力突变体的筛选并不接近饱和,有可能很多其他的在致病性中起重要作用的铜绿假单胞菌基因等待发现。
重要的是,至少在我们的模型中鉴定出的在植物致病性中起重要作用的两个以前已知的毒力因子(基因),不仅在小鼠烧伤模型中对铜绿假单胞菌来说是重要的毒力因子,而且在其他革兰氏阴性病原体中也被描述为重要的毒力因子。后面这些致病因子(基因)包括dsbA和gacA(Shevehik等,Mol.Microbiol.16:745-753,1995;Peek和Taylor,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6210-6214,1992;Watarai等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4927-4931,1995;Johnston等,Mol.Microbiol.22:715,1996)。这说明在铜绿假单胞菌中鉴定的以前未知的因子,很多都通常与革兰氏阴性致病性有关。
这个研究可得出得另一个重要结论是,我们发展的高通量的体内筛选方法可以导致与明显的生化缺陷没有关系的致病因子的鉴定。突变体33C7、33A9、34H4、25F1和16G12显示在数种已知的铜绿假单胞菌的致病因子中没有可检测到的缺陷,并且重要的是,突变体33C7和33A9在小鼠模型中最弱。而且,即使突变体pho34B12和25A12的确显示已知毒力因子的产生减少,但这些突变所对应的基因以前没有被鉴定,这很可能是因为这些突变体中的生化缺陷在一个简单的高通量筛选中不能被有效地鉴定。这证明了我们对致病表型丧失进行筛选的敏感性。
在过去的几年中,其他鉴定细菌致病因子的高通量筛选已经有介绍。IVET(体内表达技术)能鉴定在致病过程中特异性激活的启动子(Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10434-10439,1996;Mahan等,Science 259:686-688,1993),STM(信号标志转座子技术)能鉴定在一种宿主中生存所需的基因(Hensel,Science 268:400-403,1995),以及DFI(差别荧光诱导)利用绿色荧光蛋白和荧光激活的细胞分选来鉴别在特殊环境或在特殊宿主细胞类型中活化的基因(Valdivia和Falkow,Mol.Microbiol.22:367-378,1996)。这些方法可以与我们在本发明中介绍的方法互补,并且每种方法都有其优点和缺点。我们的筛选方法在非脊椎动物宿主中的一个优点是,它可直接测定致病性,而IVET和DFI方法测量致病性相关基因的表达。不像STM方法,它鉴别其功能不能被用于接种的细菌突变体混合物反式互补的基因,本发明的筛选方法在非脊椎动物中涉及单独检测每个突变克隆。
其他毒力靶
33A9核酸序列(图5和6A-B)也在一种被命名为BI48的粘粒克隆中得到鉴定(图1)。该粘粒被全分子测序,其核酸序列示于图2。使用标准的数据分析,鉴定了几个其他开放阅读框的核苷酸序列和推导的氨基酸序列(图3和4)。该分析的概述示于表3。同上面介绍的序列一样,在图3和4中发现的任何一种序列都可用于筛选能降低一种病原体的毒力的化合物(例如使用上面介绍的方法)。
从菌株PA14的pBI48粘粒中所获得的序列显示,33A9位于菌毛基因簇上游约5kb处(图1,表3)。该基因簇含有pilS/pilR基因,已知它们参与菌毛形成的调节。而且,33A9上游序列的分析没有显示与以前鉴定的序列具有任何同源性,因而表明33A9周围的整个区域可能是一个致病岛。图3(orf19544)、图4(orf19544)、图5、图6A和图6B显示了33A9的核苷酸序列以及鉴定的ORFs。
此外,对从pBI48粘粒克隆获得的序列进行分析表明,在33A9下游约2kb处存在一个序列,它显示与tRNA序列有很高的同源性(ORF22626,图1)。因为对tRNA序列上游序列的分析没有显示与数据库中存在的序列有任何同源性,并且因为tRNA序列代表着DNA插入的“热点”,我们推测tRNA序列代表PA14中存在的致病岛插入的右边界。如图1所示,代表插入外源DNA片段的区域大小大约是25kb。假定的致病岛上游边界的确定有助于确定插入DNA片段的准确大小。而且,对33A9区域的分析还说明,存在超过一种的在蛋白水平上与整合酶和转座酶同源的序列(分别为ORF21421和ORF8109)。最后,我们的数据显示,33A9位点存在于数种高致病性的铜绿假单胞菌临床分离株中,并且不存在于PA01中,后者是一种致病性较低的铜绿假单胞菌菌株。
对从pBI48粘粒获得的序列数据进行的分析还表明,在33A9两翼存在两种序列,它们含有参与细胞粘附的识别基元。对分别位于33A9上游和下游的ORF11738(2436 bp)和ORF23228(2565 bp)进行的序列分析表明,在这两个开放阅读框中存在RGD基元。RGD三肽序列是一种特征性的真核细胞识别基元,能结合宿主细胞表面的整合素,并且被发现参与细菌粘附。通过模仿宿主分子,含有这些RGD基元的细菌粘附素能够在需要启动细胞-细胞粘附的宿主中产生应答。
对这两种含RGD的ORFs在33A9和野生型菌株PA14中的表达进行了评价。转录水平通过使用一种对应于ORF11738和ORF23228的一个内部区域的放射标记的DNA探针进行杂交来测定。从突变体33A9中的两个ORFs获得的数据显示,与野生型PA14相比转录水平降低,这说明ORF11738和ORF23228编码的基因都受33A9调节。这些数据显示,33A9是一种起重要作用的多基因调节子,负责调节参与细菌粘附到宿主细胞表面的基因的表达。
表3
ORF | 起点 | 终止 | 长度 | Blastn | BlastP | 基元 | 终止子 | SD序列 |
244c | 244 | 35 | 210 | |||||
602c | 602 | 42 | 561 | 730 | ||||
214 | 214 | 792 | 579 | |||||
594 | 594 | 3734 | 3141 | 接合转移prtn | ATP/GTP结合 | 730 | ||
1205C | 1205 | 987 | 219 | |||||
1640C | 1640 | 1206 | 435 | |||||
1615C | 1615 | 1439 | 177 | rev转录酶 | ||||
2929c | 2929 | 2288 | 642 | 粘附素前体 | ||||
3994c | 3994 | 3818 | 177 | 外膜蛋白 | ||||
4506C | 4506 | 3862 | 645 | 脂蛋白 | 4442 | |||
4901c | 4901 | 4668 | 234 | atp-dep.rna螺旋酶 | 4726 | |||
10475 | 10475 | 10828 | 354 | unk.mycobacterium | ||||
11738 | 11738 | 14173 | 2436 | mycobact.unk. | ATP/GTP结合 | |||
14155 | 14155 | 16101 | 1947 | DNA螺旋酶 | ATP/GTP结合 | 15915 | ||
21421 | 21421 | 22761 | 1341 | 几种P.a.基因 | 整合酶 | 22982 | 21464 | |
22505 | 22505 | 22657 | 153 | t-RNAs,oprL, | 异戊二烯化 | |||
23228 | 23228 | 26197 | 2970 | atp dep.蛋白酶 | 锌蛋白酶 | |||
26191c | 26191 | 23612 | 2580 | clp蛋白酶, | ClpB | ATP/GTP结合 | 23603 | |
26844c | 26844 | 26332 | 513 | ClpB | ||||
26486 | 26486 | 27160 | 675 | 膜糖蛋白 | ||||
26857c | 26857 | 26516 | 342 | 病毒核抗原 | ||||
28068c | 28068 | 27055 | 1014 | PilS | yabO(推测) | |||
28118 | 28118 | 29188 | 1071 | PilS | 脂蛋白 | |||
29382 | 29382 | 31172 | 1791 | PilS | 31186 | |||
31247c | 31247 | 30591 | 657 | FAB蛋白 | ||||
31222 | 31222 | 32523 | 1302 | AlgB,PilR | sigma54反应区 | 31518 | ||
32568c | 32568 | 32065 | 504 | tonB(Fe受体) | 32567 | |||
33705c | 33705 | 32569 | 1137 | PilR,D-AA脱氢酶 | 32567;32609 | 33678 | ||
34274 | 34274 | 34915 | 642 | 菌毛蛋白 | Ntermmrthyl(菌毛蛋白) | |||
34916 | 34916 | 35449 | 534 | 菌毛蛋白前体信号肽 | ||||
36246 | 36246 | 36875 | 630 | 菌毛基因} | pilx,pily1 | |||
41284 | 41284 | 42234 | 951 | 糖运输 | 41175;41170 | |||
42236c | 42236 | 41185 | 1052 | LYTB |
此外,使用植物和AuSubel等介绍的(筛选适用于防止感染或致病的化合物的方法,分别提交于1995年3月25日,1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927,和08/962,750.)线虫筛选试验(慢或快致死试验),几种其他的铜绿假单胞菌突变菌株被鉴定为具有较低的毒性。这些研究中所用的慢和快致死试验在下面进行介绍。
慢致死试验。在进行慢致死试验时,将10ul细菌的过夜培养物铺于NG平板(由NGM琼脂修改,NGM由Sulston和Hodgkin介绍(In:线虫新小杆线虫,W.B.Wood,ed.,Cold Spring Harbor,NY:ColdSpring Harbor Laboratory,188,pp.587-606):(使用0.35%蛋白胨取代0.25%),并在37℃温育24小时。在室温下(23-25℃)放置8-24小时后,在每个平板(直径3.5cm)中用40-50个雌雄同体的L4新小杆线虫Bristol株接种,为进行统计学处理,每个试验进行3-4个重复。平板在25℃温育,每4-6小时监测线虫死亡的数量。当用睫毛触动时不再运动和不能显示咽泵动作时,线虫被认为死亡。对于每批试验的突变体,P14和大肠杆菌OP50用作阳性和阴性对照。任何因固定到平板壁上而死亡的线虫都在分析时被排除。为测定LT50s,用数据进行作图(被杀死的线虫的百分数对与待测菌株作用后的时间(小时))。使用计算机程序SYSTAT5.2.1时,一种曲线形式:杀死百分数=A+(1-A)/)1+exp(B-Gxlog(作用后的小时数))能与数据拟合,其中A表示在OP50对照实验中死亡的线虫部分,B和G是为拟合曲线而变化的参数。一旦B和G被测定,LT50就可用公式LT50=exp(B/G)×(1-2xA)^(1/G)进行计算。
在发展这种筛选时,我们利用两个观察结果。首先,杀死线虫所需的时间越长,产生的子代就越多。第二,幼虫早期阶段对铜绿假单胞菌的杀伤作用明显具有较高的抵抗力。这使我们能够设计方便和非常敏感的试验,来鉴定在其致病能力中只有轻微破坏的TnphoA突变体。这些减毒突变体在杀死线虫时的效率较低,存活个体的后代产量能有效地将即使一个微弱的缺陷“放大”成可方便地观察到的表型。这样,在含有减毒的PA14::TnphoA突变体的平板上,由开始时接种的雌雄同体,可以获得成百的线虫。在用非致病性突变体接种的平板上,5天后可见到上千的线虫,并且细菌菌苔被完全消耗,而在用野生型菌株接种的平板上,只能发现没有或很少的活的线虫。将在初步筛选中鉴定的假定的非致病性活减毒突变体进行再检测,并用来进行毒力试验,来测定新小杆线虫杀伤的动力学。
快致死试验。快致死试验与慢致死试验一样,可用于鉴定致病微生物的毒力因子。此外,该试验可用于鉴定能够抑制致病性或增加机体对病原体抗性的治疗物。在优选的实施方案中,快致死试验使用对一种化合物例如毒素如秋水仙素具有增加的穿透性的线虫株来进行。具有这种增加的穿透性的线虫的例子包括但不限于在P-糖蛋白如PGP-1、PGP-3或MRP-1中具有突变的动物。这种突变的线虫在快致死试验中非常有用,因为由于其膜穿透性增加,它们对毒素的敏感性增加。这个特征使试验中对毒性化合物的完全敏感和完全抵抗的差别提高。快致死试验也可按下面的介绍通过提高培养基的渗透摩尔浓度来进行。
这里使用的快致死试验条件如下:将5ul在Kings B中过夜培养的PA14培养物铺于含有蛋白胨-葡萄糖(PG)(1%Bacto-Peptone、1%NaCl、1%葡萄糖、1.7%Bacto-Agar)的平板(直径3.5cm)。因为快致死的效率被发现依赖于渗透摩尔浓度,我们加入0.15M山梨糖醇对PG培养基进行修改。将细菌培养物铺板后,平板在37℃温育24小时,然后在室温放置8-12小时。将15至20只线虫置于试验平板,然后将其置于25℃温育。每个独立试验包括3-4个重复。依时间监测线虫的死亡,当线虫按上面的介绍不能对触动应答时就被认为死亡。大肠杆菌菌株DH5α在快致死试验中用作对照。
对这些菌株以及上面鉴定的菌株的分析表明,它们可分为以下几种不同的类型:一些突变体在植物和线虫中都具有较低的致病性,而其他则是在植物或线虫中但不是二者中致病性降低。如下细菌突变体被定义为在植物中具有较低致病性,在渗入后(DPI)第4天,在相同的实验条件下最大平均滴度(来自5个叶样品)比野生型低两个标准差。野生型对照是必需的,因为4个DPI后野生型达到的最高水平在各实验中有数量级上的差别,这是由植物防御应答上的生长条件中的微小差别造成的。与此类似,如果杀死50%的喂饲的线虫所需的平均时间(来自3个重复的LT50)比在相同实验中的野生型PA14低两个标准差,该突变体就被认为是在线虫上的致病性降低。
一般来说,在植物中具有降低的致病性的突变菌株包括16G12、25A12、33A9和33C7,在线虫中具有降低的致病性的突变菌株包括35A9、44B1、1G2、8C12和2A8,在植物和线虫中都具有降低的致病性的突变菌株包括25F1、41A5、50E12、pho15、12A1、pho23、34B12、34H4、3E8、23A2和36A4。表4和表5(下文)概述了这些突变菌株的致病性表型。对因插入突变而具有降低的致病性的这些菌株进行序列分析。表4和表5中概述的DNA序列分析显示,新型和已知的基因都能在我们的筛选试验中鉴定。来自50E12和41C1的序列都显示与以前介绍的在大肠杆菌中功能未知的开放阅读框(ORFs)具有很高的同源性。突变体35A9鉴定了一个淋病耐瑟氏球菌(SwissProtP39897)mtrR的同源物。突变体25F1鉴定了一个操纵子,该操纵子编码3个与微温着色菌的orfT、MPK和DjlAEC相同的蛋白。来自48D9、35H7和12A1的序列分别对应于lEmA、gacA和1asR基因。在突变体41A5和44B1中被破坏的序列不与GenBank中登记的任何序列具有明显的同源性。(44B1序列标记只有148bp,并且在PA01数据库中没有对应于44Bl插入的序列得到鉴定)。因此,这些序列鉴定了其他的毒力因子。从这些实验获得的核苷酸序列和氨基酸序列示于图10、11、12、13、14A、14B、15、16A、16B、17、18A、18B、18C、18D和18E以及图22、23、24A、24B、24C、24D、24E、25、26、27和28。
我们还对TnphoA突变体41A5、50E12、41C1、35A9、48D9、12A1、44B1和35H7进行了一套标准的生化检测,来评估是否在已知的对哺乳动物致病性中起重要作用的毒力因子中含有缺陷。这些检测包括:一种对H2O2敏感的标准平板试验以及对细胞外蛋白酶、弹性蛋白酶、磷脂酶C和绿脓素的标准定量分析。例外的情况如下,大多数PA14TnphoA突变体与亲本PA14菌株没有生化水平的差异。突变体12A1显示弹性蛋白酶和蛋白酶活性降低,但过量产生绿脓素。突变体50E12产生比PA14高3倍水平的绿脓素。突变体41A5只有约70%的野生型水平的蛋白酶活性。
使用慢致死试验鉴定的这些突变体的各自的DNA序列分析和生化分析的详细介绍在下面各节中展示。
突变体12A1。12A1中的phoA插入子插入在前面介绍的铜绿假单胞菌PA01的lasR基因的154密码子处。12A1的表型与其他已知的lasR突变体一样是多型性的,包括弹性蛋白酶和蛋白酶的产生减少。此外,12A1在稳定期产生比亲本PA14菌株多2-3倍的绿脓素。而且,表达GFP的lasR突变体(PA14lasR::GFP19-1)不能在线虫消化道维持其自身,因为在喂饲48小时后在新小杆线虫的肠道中只能检查到非常少的荧光。
图34显示,当铜绿假单胞菌PA01的lasR基因在组成型的lacZ启动子的反式控制之下在菌株12A1(pKDT17)中表达时,12A1的线虫慢致死缺陷表型能够被完全回复。弹性蛋白酶的产生也被发现在12A1(pKDT17)中回复到野生型水平,但不过量产生绿脓素。因为不希望绿脓素过量产生表型,我们通过标记转换,用一个庆大霉素盒插入PA14基因组破坏lasR基因,构建了一种新的lasR突变体---lasR::Gm。该lasR::Gm突变体与12A1一样没有致病性(图34A),但产生正常水平的绿脓素,这说明12A1可能携带第二个突变,后一突变导致绿脓素产生的上调。这个结果还说明,在稳定期中绿脓素产生的上调与致病性减弱表型无关。
突变体pho15。pho15中的dsbA基因破坏被发现对其非致病性表型负责。图24B显示了PA14pho15的核苷酸序列(SEQ ID NO:166)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:167).pho15在新小杆线虫中致病性缺陷表型也被发现能在pho15背景中被反式的组成型表达的大肠杆菌dsbAEc基因或PA14dsbAPa完全回复(图34B)。为进行这些实验,大肠杆菌dsbAEc基因按下面的方法克隆到pUC18中。将PCR扩增的大肠杆菌dsbA基因克隆到pBAD18的KpnⅠ和XbaⅠ位点构建成pCH3。这使大肠杆菌dsbA基因置于大肠杆菌阿拉伯糖启动子的控制之下。将含有大肠杆菌dsbA基因的700bp的KpnⅠ/SphⅠ片段克隆到pUC18的KpnⅠ/SphⅠ位点,产生pEcdsbA,使大肠杆菌dsbA基因置于组成型大肠杆菌lacZ启动子的控制之下。pEcdsbA接着被用来转化PA14和pho15,分别构建菌株PA14(pEcdsbA)和pho15(pEcdsbA)。
PA14dsbAPa按下述方法构建。根据PA01的dsbA序列(GenBank登记号U84726),引物TMW8(5’-GCACTGATCGCTGCGTAGCACGGC-3’;SEQID NO:177)和TMW9(5’-TGACGTAGCCGGAACGCAGGCTGC-3’;SEQ ID NO:178)被用来扩增一个1126bp的片段,该片段含有来自PA14基因组DNA的dsbA基因加上dsbA基因翻译起始位点上游的176bp.使用TA克隆试剂盒(Invitrogen),该片段被克隆到pCR2.1载体中,产生pCRdsbA。含有dsbA的SacⅠ/XbaⅠ片段被克隆到SacⅠ/XbaⅠ消化的pUCP18中,构建成pPAdsbA,使dsbA的转录置于组成型lacZ启动子的控制之下。菌株pho15(PadsbA)通过用pPAdsbAPa转化pho15来构建。
突变体25F1。在25F1中,TnphoA被发现插入在一个假定基因(orf338)的100密码子处,该基因编码一个338氨基酸的蛋白,它是一个推测的3基因操纵子的第一个基因。推测的下游基因(orf224和orf252)分别编码224和252个氨基酸的蛋白。GAP分析显示,orf338与微温着色菌的orfT有28.5%的同一性(37.7%的相似性)(GenBank登记号U58313)。ORF224的BLASTP与来自真核生物、古细菌、蓝细菌和分枝菌属的甘露糖-I-磷酸鸟苷酸转移酶(MPG;EC2.7.7.13)相同,但不与蛋白细菌---铜绿假单胞菌的近亲相同。还不清楚ORF224是否是一种有功能的MGP,因为所有已知的MPGs都由359-388个氨基酸残基组成,而ORF224只由224个氨基酸残基组成。ORF252与大肠杆菌DjlAEc同源。DjlAEc被认为在多种膜蛋白的正确装配、活性和/或维持中起重要作用,包括两组分的组氨酸激酶信号传导系统。
为检测orf338是否是对在线虫中致病性降低负责的基因,我们比较了单独携带orf338的菌株---25F1(pORF338)与野生型PA14和单独携带载体的25F1的杀伤动力学。25F1(pORF338)按下列方法构建。
使用引物F2327(5’-CGAGGAATCCAGTCGAGGTG-3’;SEQ ID NO:179)和R4180(5’-GCAAGATGCAGCCGAGAGTAG-3’;SEQ ID NO:180)从PA14的基因组DNA中扩增含有482 bp的上游启动子、整个的orf338和一个剪短的orf224的1.8kb的PCR片段。将产物克隆到载体pCR2.1(TA Cloning,Invitrogen)中,构建质粒pMT403C-R。将来自pMT403C-R的含有PCR产物的SacⅠ/XbaⅠ片段克隆到pUCP18的SacⅠ/XbaⅠ位点,构建pORF338,使off338置于其天然启动子的控制之下。25F1用pORF338转化,产生菌株25F1(pORF338)。
此外,一个含有整个操纵子(orf338、orf224和djlApa)的菌株按如下方法构建。使用引物RIF3115(5’-GTCAGAATTCTCAGCTTGACGTTGTTGCCC-3’;SEQ ID NO:181)和RIR6757(5’-GTCAGAATTCGACTTCTATTACCGCGACGCC-3’;SEQ ID NO:182),采用PCR策略扩增一个含有orf338、orf224和djlAPa及其上游转录序列的3.6kb的基因组片段。引物中存在EcoRⅠ位点(划线),但在基因组序列中没有。对PCR产物进行双链测序,以确定菌株PA14中的orf338、orf224和djlAPa的序列。将PCR EcoRⅠ消化产物克隆到pUCP18的EcoRⅠ位点,并通过限制消化确定插入方向。在质粒p3-ORFs中,orf338、orf224和djlAPa在其天然启动子的控制之下,然后用p3-ORFs转化25F1,产生菌株25F1(p3-ORFs)。
如图34C中所示,菌株25F1(pORF338)不能完全互补慢致死表型。而含有完整操纵子(orf338、orf224和djlAPa)的菌株25F1(p3-ORFs)也只显示突变表型的部分互补。这个结果说明,TnphoA对致病性表型负责,部分互补可能是基因剂量的结果。菌株25F1(p3-ORFs)与菌株25F1(pORF338)相比达到的较高死亡进一步说明,下游基因---orf224和/或djlAPa也可能在PA14的毒性中起作用。
图24E显示了编码ORFT(SEQ DI NO:174)、ORFU(SEQ ID NO:175)和DjlAPa(SEQ ID NO:176)的PA1425F1的核苷酸序列(SEQID NO:173)。
突变体50E12。50E12中的TnphoA插入子插入在一个推测的759氨基酸蛋白的39密码子位置,该蛋白与大肠杆菌的PtsPEc蛋白43%相同(54%相似)。根据序列分析,推测ptsPEc编码酶INtr,INtr是一种738氨基酸的蛋白,它含有一个N末端的Nif-A结构域和一个C末端的酶Ⅰ结构域;后者在磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统中起作用。据认为Nif-A结构域起信号传导功能,或者直接感应小分子信号,或者从NifL样蛋白接受信号。两种机制都可以调节酶Ⅰ结构域的催化活性,后者又被认为能磷酸化NPr(氮相关HPr),并因而调节RpoN依赖的操纵子的转录。PA14 ptsPpa同源物紧接着的上游是开放阅读框(orf159),推测它编码一个159氨基酸的蛋白,并且似乎与ptsPPa共转录。图24C显示了编码YgdPPa(SEQ ID NO:169)和PtsPPa(SEQ ID NO:170)的PA14 50E12的核苷酸序列(SEQ ID NO:168)。ORF159与YgdP蛋白有62.3-64.8%的相同,YgdP蛋白是在流感嗜血菌(GenBank登记号Q57045)和大肠杆菌(GenBank登记号Q46930)中发现的功能未知的蛋白。这些蛋白与幽门螺杆菌和杆状巴尔通氏体中的入侵蛋白A密切相关。杆状巴尔通氏体的入侵蛋白A(SwissProt登记号P35640)由ailA编码,当ailA与ailB基因相邻存在但独立转录时,能够使大肠杆菌具有侵入人红细胞的能力。
对于50E12的互补,检测了两个菌株:50E12(pMT206-lac)和50E12(pMT206-nat)。菌株50E12(pMT206-lac)携带质粒pMT206-lac,其中orf159和ptsPPa的转录在组成型lacZ启动子的控制之下。对于菌株50E12(pMT206-nat),orf159和ptsPPa的转录只在它们的天然启动子控制之下。这些菌株都按下列方法构建。
从铜绿假单胞菌PA14的基因组DNA中使用如下引物扩增一个在其两端均有EcoRI位点的4.3kb的PCR片段:RIF1698(5’-GTCAGAATTCGATGTTCCAGTCCCAGATCCC-3’;SEQ ID NO:183)和RIR6002(5’-GTCAGAATTCCAGTAGACCACCGCCGAGAG-3’;SEQ ID NO:184)。将该片段克隆到pUCP18的EcoRⅠ位点,产生pMT206-lac和pMT206-nat,它们用限制消化来证实。在pMT206-lac中,orf159和ptsPPa的转录在组成型lacZ启动子和其天然启动子的控制之下。在pMT206-nat中,orf159和ptsPPa的转录只在它们的天然启动子控制之下。
如图34D所示,两种菌株都部分互补突变表型,这些互补菌株杀死100%线虫所需的时间比野生型菌株长。在鼠烧伤试验中观察到了部分互补:用5×105的来自菌株50E12(pMT206-nat)的细菌感染后,小鼠的死亡率为39%,当分别用野生型菌株和50E12感染时,相比较的死亡率为100%和0%。这些结果表明,假定的orf159-ptsPPa操纵子参与铜绿假单胞菌在线虫和小鼠中的致病性。
突变体35A9。在35A9中,TnphoA插入子位于一个假定的210氨基酸蛋白中(由orf210编码),该蛋白与淋病耐瑟氏球菌的MtrRNg蛋白最为密切相关(31.5%相同),后者属于含有细菌转录调节蛋白的螺旋-转角-螺旋的TetR家族。ORF210与三个基因相邻但分别转录,这三个基因与铜绿假单胞菌的能量依赖的流出(EDE)系统的组分同源。对来自PA01的序列进行分析显示,这四个基因一起组成了铜绿假单胞菌的一种新的能量依赖的流出(EDE)系统。以前介绍的铜绿假单胞菌的其他EDE系统是mexR、mexA-mexB-oprK系统、nfxB、mexC-mexD-oprJ系统和nfxC、mexE-mexF-oprN系统。图24D显示了编码mtrRpa(SEQ ID NO:172)的PA14 35A9的核苷酸序列(SEQ IDNO:171)。
突变体37H7和1D7。对来自突变体37H7的IPCR产物进行分析显示,在214个氨基酸的GacA蛋白的188密码子处有一个TnphoA插入。DNA印迹分析显示,1D7也在gacA基因中含有一个插入。
突变体48D9。TnphoA插入在925个氨基酸的LemA同源物的491密码子和492密码子之间,LemA同源物是传感蛋白激酶,属于一个细菌双组分调节蛋白家族。丁香假单胞菌中LemA的识别应答调节蛋白是GacA,并且GacA+LemA已经显示能影响多种毒力因子的表达。
突变体41C1。在突变体41C1中,TnphoA插入在假定的大肠杆菌膜内在蛋白的AefA同源物(SwissPort P77338)中。它是30-40kDUPF0003蛋白家族(PROSITE PDOC00959)的一个成员。除了大肠杆菌,它还存在于集胞蓝细菌菌株PCC6803和詹氏甲烷球菌中。
此外,菌株pho34B12、3E8、8C12、1G2、35A9和23A2也被发现具有吩嗪减少的突变表型。而且,pho34B12、3E8、8C12和1G2突变体被发现色素的产生减少。另外一个突变体---6A6也被鉴定为色素减少。铜绿假单胞菌菌株的特征性颜色已经被归因于被总称为吩嗪的一组三环的次级代谢物,其中分析最多的是蓝绿色素---绿脓素(1-羟基-5-甲基-吩嗪)。为检测细菌突变体中的色素减少是否至少部分因为绿脓素的减少,对野生型PA14以及用快致死试验获得的所有突变体中的这种色素的水平进行定量。该分析的结果显示,具有色素减少表型的pho34B12、3E8、8C12、1G2和6A6突变体的绿脓素产生也减少,其水平在野生型菌株的10至50%之间。其他突变体---13C9、23A2和36A4具有与野生型菌株相当的绿脓素水平。
此外,3E8中被TnphoA突变破坏的序列被发现能预测一种蛋白,该蛋白与来自荧光假单胞菌的phzB基因同源,它是参与次级代谢产物---吩嗪产生的一个操纵子的部分(GenBank登记号L48616)。phzB基因在致金色假单胞菌中也有一个同源物,被称为phzY(GenBank登记号AF007801)。使用序列标记,在铜绿假单胞菌数据库中鉴定了一个含有该区域的粘粒(1G2503),该粘粒同时含有phzA和phzB基因以及其他被认为在吩嗪生物合成中起作用的基因---pcnC和D基因(GenBank登记号AF005404)。检测这些菌株中的四个---34B12、3E8、23A12和35A9在小鼠烧伤试验中的致病性。令人惊奇的是,这些实验显示,吩嗪缺陷的菌株具有降低的致病性,这说明被TnphoA插入破坏的基因是哺乳动物毒力因子。这些菌株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列包括序列标记示于图7-9、13、14A、14B、15、16A、16B、17、18A、18B、18C、18D、18E、22、24A、24B、24C、24D、24E和33。此外,图25和26分别显示了铜绿假单胞菌的phnA和phnB的核苷酸序列和推导的PHNA的氨基酸序列。
对每种使用快致死试验(上面介绍)鉴定的突变体进行DNA序列和生化分析的详细介绍在下面各节中展示。
突变体36A4、23A2和13C9。从所有三个能够产生野生型水平的绿脓素的突变体中获得的DNA序列标记都与假单胞菌中已知的基因具有同源性。突变体36A4在与hrpM同源的一个基因中含有TnphoA插入,hrpM以前被鉴定为在植物病原体丁香假单胞菌中控制致病性的一个位点(Mills和Mukhopadhyay,In:假单胞菌:生物转化、致病性和进化技术,S.Silver,A.M.Chakrabarty,B.Iglewiski和S.Kaplan,eds.美国微生物协会,1990,pp.47-57,Mukhopadhyay等,J.Bacteriol.170:5479-5488,1988);GenBank登记号140793)。该位点还与大肠杆菌mdoH基因具有同源性,mdoH基因编码一种参与周质葡聚糖生物合成的一种酶(Loubens等,Mol.Microbiol.10:329-340,1993;GenBank登记号X64197)。在突变体23A2中,TnphoA插入子插入在以前在铜绿假单胞菌PA01菌株中被鉴定为mexA的基因中(Poole等,Mol.Microbiol.10:529-544,1993;GenBank登记号L11616)。mexA的产物被推测是一种细胞质-膜-相关的脂蛋白,可能与包含在同一操纵子中的其他两个基因的产物---mexB和oprM一起作用,作为一种具有广谱底物特异性的非ATP酶的流出泵(Li等,Antimicrob.Agents.Chemother.39:1948-1953,1995)。第三个突变体13C9在色素产生上是野生型,对它两翼的DNA进行序列分析显示,它对应于另一个铜绿假单胞菌菌株PA01中以前已知的基因---orp(GenBank登记号U54794),Orp或磷脂酶C的渗透压保护剂依赖的调节蛋白被鉴定为一种控制致病因子PlcH表达的因子,PlcH是铜绿假单胞菌产生的磷脂酶C的两种异构体中的一种(Sage等,Mol.Microbiol.23:43-56,1997)。
突变体1G2和8C12。对两种无色素的突变体1G2和8C12进行的分子分析显示,它们在新的基因中含有插入,虽然1G2插入两翼的DNA含有组氨酸传感蛋白激酶的一个特征性基元。该基因在PA01基因组数据库中不存在。尽管8C12序列标记在PA01数据库中鉴定到了同源基因,但在此基因中没有发现明显的基元。
突变体3E8和6A6。两个突变体---3E8和6A6在相同的基因中含有TnphoA插入,这个基因与以前在荧光假单胞菌菌株2-79中鉴定的phzB基因(GenBank登记号AF007801)和在致金色假单胞菌中鉴定的phzY(GenBank登记号L48616)具有同源性。这两种突变体在完全相同的位置含有TnphoA插入,但它们是独立的分离株,因为它们获自两个不同的突变文库。虽然phzB和phzY不含一致的序列基元,但它们存在于已知在荧光假单胞菌和致金色假单胞菌中调节吩嗪-1-羧化酶(PCA)产生的操纵子中(Mavrode等,J.Bacteriol.180:2541-2548,1998)。
突变体pho34A12。最后一个无色素突变体pho34B12中TnphoA插入子两翼的DNA如前所述,以前已被克隆并且显示是一个新的位点。有趣的是,该插入紧靠着在铜绿假单胞菌PA01菌株中鉴定的吩嗪生物合成基因---phnA和phnB的下游(Essar等,J.Bacteriol.172:884-900,1990)。
吩嗪是快速杀死新小杆线虫所必需
快致死筛选中产色素和不产色素突变体的分离说明,快致死过程涉及一个以上的因子。但是,对3E8和6A6突变体(在已知调节吩嗪产生的操纵子中含有插入)的分子分析强烈地说明,吩嗪代表一类介导快致死的毒素。为直接验证这个假说,我们制备了一个另外的突变体---ΔphnA phnB,并按下述方法进行研究。
吩嗪生物合成基因phnA和phnB(Essar等,J.Bacteriol.172:884-900,1990)在PA14中位于前面分析的pho34812 TnphoA插入的上游(GenBank登记号AF031571)。将对应于该区域的野生型序列的一个3.7kb的EcoRⅠ片段(来自质粒pLGR34)亚克隆到pBluescript SK/+中,产生Bs34B12。该质粒含有944bp的phnA(全长为1591bp)、整个phnB(600bp)基因和1.7kb的下游序列。缺失的605bp的phnA和405bp上游使用如下寡核苷酸引物用PCR从PA14基因组DNA中扩增:PHNA3(5’-GGTCTAGACGAACTGAGCGAGGAG-3’;SEQ ID NO:185)和PHNA2(5’-GCCTGCAGGCGTTCTACCTG-3’;SEQ ID NO:186)。引物以以前从铜绿假单胞菌菌株PA01中克隆的phnA和phnB的序列为基础(Essar等,J.Bacteriol.172:884-900,1990,GenBank登记号M33811)。将1010bp的扩增序列亚克隆到pBs34B13的PstⅠ位点,产生结构物pBs34B12phnA。通过PCR使用引物PHNDEL1(5’-GGCTGCAGTGATTGACTGAGCGTCTGCTGGAGAACG-3’;SEQ ID NO:187)和PHNDEL2(5’-GGGAAGCTTCGTCTAGAATCACGTGAACATGTTCC-3’:SEQ IDNO:188)扩增一个1kb的片段,用此片段取代2.6kb的上述基因的野生型序列,在phnA、phnB中产生一个框内删除,产生质粒pBs34b12phndel。将含有phnAphnB框内删除的1.8kb的XbaⅠ片段亚克隆到阳性蔗糖选择自杀载体pCVD442中(Donnenberg和Kaper,Infect.Immun.59:4310-4317,1991)。所产生的结构物---pCVD34B12phndel被用来将破坏的phnA、phnB基因通过同源重组引入野生型PA14基因组中,产生突变体PA14ΔphnAphnB。使用来自亲本PA14和衍生的PA14ΔphnAphnB菌株的DNA进行DNA限制酶切分析和DNA印迹分析,以验证突变体含有所需的删除。
虽然对在铜绿假单胞菌和相关的假单胞菌中催化吩嗪形成的酶的本质知道的很少,但从分枝酸转变为邻氨基苯甲酸被认为是该途径的一个关键步骤(图35A)。在铜绿假单胞菌PA01中,该步骤很可能由phnA和phnB基因编码的邻氨基苯甲酸合成酶催化,因为这些基因中的突变导致吩嗪绿脓素的产量降低(Essar等,J.Bacteriol.172:884-900,1990)。从PA14中克隆了phnA和phnB基因,并且制备了一个在这些基因中含有一个1602bp删除的ΔphnAphnB突变体(图35B)。重要的是,该突变被设计为非极性的,并因而不会影响显示直接位于phnA和phnB下游的两个ORFs(上文)。对ΔphnAphnB突变体中的绿脓素的测量显示,它只产生10%的野生型水平,这证明phnA和phnB在菌株PA14中和在PA01中一样,参与绿脓素的产生。使用ΔphnAphnB进行的试验表明,该菌株的快致死能力被严重降低。如图35C所示,在接触ΔphnAphnB 3小时后,少于5%的线虫死亡,与此相对,接触野生型菌株后,几乎100%的线虫死亡。ΔphnAphnB菌株的行为方式类似于另一种吩嗪突变体3E8,它在此实验中用作减毒突变体对照。这些结果证明,吩嗪为新小杆线虫快致死所必需。
为发现介导快致死的细菌因子是否与在其他宿主中的致病性相关,我们检测了快致死突变体在拟南芥叶渗入模型以及小鼠全厚度皮肤烧伤模型中的毒性(上文)。我们检测了5个快致死突变体在拟南芥叶上在4天内的生长,作为它们的致病性的定量检测,并且在小鼠全厚度皮肤烧伤模型中也进行检测。如表4和5所示,2个吩嗪突变体3E8和8C12在拟南芥叶上在感染后第4天的最大生长水平明显较低。在小鼠模型中,这两个突变体导致比野生型菌株明显较低的死亡率,其P<0.05,使用的接种量为5×105细胞。第三个吩嗪突变体1G2在植物和小鼠模型中都与野生型菌株没有明显的差别。
hrpM突变体36A4和mexA突变体23A2在拟南芥上的生长都被严重削弱,这表明在此模型中致病性有严重缺陷。在小鼠模型中,突变体36A4得到了一个令人惊奇的结果,在检测的剂量上不导致死亡。相反,mexA突变体23A2仅受到轻微影响。这些结果证明,快致死筛选在鉴定植物和小鼠致病性所需的基因时非常有效,并且更进一步首次提供了体内的证明,即吩嗪为在这两种宿主中的致病性所必需。
我们还注意到,我们已经鉴定了phz操纵子的一个调节子---phzR。图18E显示了PA14 phzR的核苷酸序列(SEQ ID NO:164)和推导的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:165)。
吩嗪和致病性
使快致死能力降低的PA14突变也影响色素合成。我们的分子分析表明,色素产生和致病性之间的关系不是简单地因为调节因子对色素和毒素产生的协同调节。相反,我们发现,吩嗪生物合成基因中突变能降低毒力,这强烈地暗示吩嗪在快致死过程中是毒素。吩嗪是三环的色素化合物,它赋予假单胞菌特征性颜色(Turner和Messenger,Adv.Microb.Physiol.27:211-273),它被认为是提高有机体在竞争环境中生存能力的次级代谢产物(Maplestone等,Gene 115:151-157,1992)。虽然PA14产生的吩嗪的所有组分还不清楚,但铜绿假单胞菌PA01至少产生6种不同的吩嗪,包括已经研究得很清楚的蓝绿色素---绿脓素。吩嗪包括绿脓素已被证明对多种细菌、真菌和原生动物具有抗生素作用,这可归功于它们的氧化还原活性特性。在其高反应性的还原状态时,据介绍吩嗪能在不同的还原试剂或分子氧存在时进行氧化还原循环,导致超氧化物和过氧化氢形成(Hassan和Fridovich,J.Bacteriol.141:1556-163,1980)。在体外,这些中等细胞毒性的氧自由基可以通过铁催化剂转变成高细胞毒性的羟基(Britigan等,J.Clin.Invest.90:2187-2196,1992)。吩嗪导致的活性氧成分的形成还被认为是在体外真核细胞上观察到的细胞毒作用的原因。这些作用包括抑制哺乳动物细胞呼吸、破坏纤毛搏动、以及免疫调节作用如刺激炎症应答、抑制淋巴细胞增殖和改变T淋巴细胞对抗原的应答。
由于导致铜绿假单胞菌中吩嗪产生的生物合成途径知道的很少,这使得鉴定在吩嗪产生途径中被PA14突变缺陷阻断的步骤非常困难。但是,在两个突变体3E8和6A6中,转座子插入破坏了一个与phzB同源的基因,phzB以前已被分析为在相关的假单胞菌---荧光假单胞菌和致金色假单胞菌中参与吩嗪产生。在荧光假单胞菌中,phzB显示是参与吩嗪-1-羧酸产生的7基因操纵子(phzA-G)中的一个部分。对荧光假单胞菌和致金色假单胞菌中该操纵子进行比较显示,二者具有很高的同源性,这说明导致吩嗪产生的途径在产荧光的假单胞菌中是保守的(Mavrodi等,J.Bacteriol.180:2541-2548,1998)。虽然在铜绿假单胞菌菌株PA14中,phzA和phzB基因两翼的DNA只进行了部分测序,我们的分析说明,这个区域与荧光假单胞菌phzA-F操纵子共有一个保守结构。PA14和荧光假单胞菌的phzA和phzB基因的推导的翻译产物分别具有68和74%的同一性。此外,在铜绿假单胞菌菌株PA01中存在一个含有phzA-F样基因的区域,这些基因的推测的翻译产物显示与其荧光假单胞菌同源物具有69至85%的同一性(GenBank登记号AF005404)。根据由phz操纵子在荧光假单胞菌和致金色假单胞菌中的作用进行的推断,快致死缺陷型的PA14 phzB突变体的分离强烈地说明,吩嗪参与此过程。吩嗪包括绿脓素是快致死的介导因子之一,这一假说通过非极性破坏基因phnA和phnB进行了进一步的检验,这两种基因编码一种邻氨基苯甲酸合成酶的两个亚基,邻氨基苯甲酸合成酶以前已经显示在铜绿假单胞菌PA01中特异性参与吩嗪合成(Essar等,J.Bacteriol.172:884-900,1990)。与在吩嗪生物合成中的作用相一致,在PA14中删除phnA和phnB基因严重降低了绿脓素的产生。而且,ΔphnAphnB突变体在快致死中有缺陷,这证明吩嗪在此过程中的重要作用。
吩嗪在致病性中的作用也在拟南芥和小鼠中进行了检测。两个在phzB基因含有插入的独立突变体3E8和6A6在拟南芥叶渗入模型以及小鼠全厚度皮肤烧伤模型中致病性都明显降低(表4和5),这说明吩嗪是多宿主致病因子。有趣的是,我们注意到,在此研究和我们以前的研究中鉴定的其他多宿主致病因子,多数可能参与几种其他毒力因子的产生,并且不是直接与宿主作用的效应蛋白或分子(上文介绍)。这样,吩嗪代表了我们已经鉴别的仅知的一类多宿主致病性效应分子。这些发现也非常有意义,因为尽管对吩嗪已进行广泛的体外分析,但它们产生的生理意义和它们在铜绿假单胞菌感染中的作用仍然受到争论,在本研究之前,它们的作用没有体内证明。
快致死是多因子的
对能产生野生型水平的色素的快致死突变体进行的分析显示,虽然吩嗪是快致死的必需介导物质,但还有其他因子参与此过程。对这样一种突变体23A2进行的分子分析表明,转座子插入到以前在铜绿假单胞菌菌株PA01中被鉴定为MexA的基因中,该基因是3基因操纵子MexA、B、OprM的一个部分(Poole等,Mol.Microbiol.10:529-544,1993)。这些基因的产物定位于细胞质(MexA、MexB)和外膜(OprM),在那里,它们被推测以一种非ATP酶广谱特异性的流出泵的形式起作用(Li等,Antimicrob.Agents Chemother.39:1948-1953,1995)。最初被鉴定是因为它在铜绿假单胞菌的多药物抗性过程中起作用,该泵被认为在次级代谢产物的输出中起一种通用的作用,虽然它的天然底物仍不知道(Poole,Antimicrob.AgentsChemother.34:453-456,1994)。快致死是一个由扩散的毒素介导的过程,mexA突变体在快致死中的缺陷很可能是因为参与该过程的一种或多种因子的外排的缺少。因为mexA突变体是产色的,吩嗪不可能是泵的底物。除了在快致死中有缺陷,mexA突变体在小鼠模型中的致病性轻微降低,在拟南芥叶渗入模型中致病性严重减弱。虽然特异性的毒力因子的外排缺乏可以解释这些缺陷,另外一个模型是,mexA突变体细菌不能保护其自身抵抗应答于细菌感染而产生的宿主防御因子。这样一种保护功能已在sap基因中得到证明,sap基因编码与ATP结合盒(ABC)转运子有关的蛋白,在人病原体鼠伤寒沙门氏菌以及植物病原体菊欧文氏菌中介导对宿主的抗微生物肽的抗性(Taylor,Plant Cell 10:873-875,1998)。
筛选中所获得的第二个突变体---36A4,在一个与大肠杆菌MdoH同源的基因中含有一个转座子插入,MdoH是MdoGH操纵子的一个部分。在大肠杆菌中,该操纵子的产物参与膜衍生的寡糖(MDO)或线形的周质葡聚糖的合成(Loubens等,Mol.Microbiol.10:329-340,1993)。在植物病原体丁香假单胞菌丁香致病变种中存在一个相似的位点,称为hrpM(Mukhopadhyay等,J.Bacteriol.170:5479-5488,1988),最初被鉴定是因为该位点中的突变造成在宿主植物上的疾病症状的发展以及在非宿主植物中的超敏应答被消除(Anderson和Mills,Phytopath.75:104-108,1985)。尽管对它们的功能了解的很少,周质葡聚糖已在广泛的革兰氏阴性菌中被发现,并且各不相同。在丁香假单胞菌中除了是基本的毒力因子外,其他的功能包括适应高渗透压环境和细胞信号传导,后者导致根瘤菌和农杆菌对真核宿主的识别(Kennedy,In:大肠杆菌和沙门氏菌,F.C.Neidardt ed,美国微生物协会出版,Washington,D.C.,pp1064-1071,1996)。但是,尽管在几种动物病原体如沙门氏菌和克雷伯氏菌的周质中存在,直到本研究显示在mdoH样位点中带有突变的铜绿假单胞菌在小鼠模型中致病性严重降低之前,周质葡聚糖还没有被显示在动物宿主感染中起作用。
表4铜绿假单胞菌菌株UCBPP-PA14突变体在不同宿主的致病性概述
致病表型 | |||
菌株分离号 菌株名称 在拟南芥叶上的生长b | 杀死新小杆线虫的能力 | %小鼠死亡率5×105d | 基因 |
PA14 PA14 5.5×107rep(在植物中的致病性降低) | ++ | 100 | |
16G12 rep1 2.3×10549H2 rep2 1.2×10625A12 rep3 1.7×10633A9 rep4 5.1×10633C7 rep5 8.4×105 | ++++ | 100637500 | 无匹配未测序无匹配无匹配无匹配 |
ren(在线虫中的致病性降低) | |||
35A93 ren1 5.7×10744B1 ren2 5.4×1071G2f,g,h NT8C12f,g,h NT2A8f,h NT | ----- | 5556NTNTNT | mtrR无匹配无匹配无匹配无匹配 |
rpn(在植物和线虫中的致病性降低) | |||
25F1 rpn1 1.5×10435H7e rpn2 1.2×10441A5 rpn3 1.3×10441C1 rpn4 2.4×10550E12 rpn5 2.0×105pho15 rpn6 3.9×10412A1 rpn7 1.7×106pho23 rpn8 6.4×10434B12g,h rpn11 4.0×10434H4 rpn12 3.8×1063E8g,h rpn13 1×10623A2h rpn14 1.7×10536A4h rpn15 4×104 | ------------- | 20NTc10085062505505012.5710 | orfTgacA无匹配aefAptsPdsbAlasR无匹配phnB的dst*无匹配phzBmexAhrpN |
bCFU/cm2,用103细菌接种4天后单位叶面积上的细菌数目:4至5个样品的平均值。当平均值来自4-5个样品时,突变体被认为是致病性较低。当平均CFU/cm2叶面积上的细菌数目比在同样实验条件下的野生型低2个标准差时,突变体被认为是致病性较低。
c如果杀死50%的用其喂饲的线虫所需的平均时间(来自三个重复的LT50)比相同实验条件下的亲本UCBPP-PA14的LT50少2个标准差,该突变体被认为是在线虫中的致病性减弱(-);有关LT50的计算,见材料与方法。
d6周龄的雄性ARK/J近交系小鼠(来自Jackson Laboratories),重量在20至30mg之间,按Stevens等,J.of Burn Care and Rehabil.15:232-235,1994的介绍用5×105细胞进行注射。每天监测因败血症而死亡的动物数目,共10天。
e两个其他的独立分离的gacA突变体是1D7(rpn9)和33D11(rpn10)。突变体rpn9在小鼠中进行了检测,显示50%的死亡率。
f只在线虫中检测。
g吩嗪缺陷的突变体。
h在快致死中缺陷的突变体,不影响慢致死
dst*=下游
表5PA14快致死突变体在植物和小鼠中的致病性
菌株PA141G23E8c,6468Cl223A236A4 | 在拟南芥叶上的生长a7×1083×1073×1055×1051.2×1042×104 | %小鼠死亡率(n)5×105b100(>16)100(8)18(16)63(8)85(16)0(16) | 基因无匹配,含有组氨酸激酶基元phzB无匹配mexAhrpM |
aCFU/cm2,用103细菌接种5天后单位叶面积上的细菌数目。数值代表4至5个样品的平均值。当细菌数目的平均值比在同样实验条件下的野生型低2个标准差时,突变体就被认为是致病性较低。
b6周龄的雄性ARK/J近交系小鼠(来自Jackson Laboratories),重量在20至30mg之间,用5×105细胞进行注射。(n)是接受注射小鼠的总数。每天监测因败血症而死亡的小鼠数目,共7天。
c3E8和6A6是独立制备的突变体,它们在完全相同的位点上含有一个TnphoA插入。报告的数目是用3E8获得的。用6A6获得了相似的结果(数据未显示)。
分离另外的毒力基因
根据这里介绍的核苷酸和氨基酸序列,使用本领域熟知的标准策略和技术,就可以分离另外的毒力因子的编码序列。任何致病细胞都可以用作分子克隆这样一种毒力基因的核酸来源,当基因编码一个显示与致病性有关的结构、特性或活性的蛋白时,这些序列就可被鉴定。
在这种分离技术的一个特殊实施例中,与核酸杂交筛选的传统筛选技术一起,这里介绍的任何一种核苷酸序列都可以使用。这种杂交技术和筛选方法对本领域的技术人员来说是熟知的,并且在诸如Benton和Davis(Science 196:180,1977);Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961,1975);Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,1997);Berger和Kimmel(上文);以及Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York中有介绍。在一个特殊实施例中,33A9序列(本文所述)的全部或部分可用作一种探针,来在一个重组植物DNA文库中筛选与33A9基因序列相同的基因(图5和6A-B)。杂交序列通过空斑或菌落杂交按照标准的方法进行检测。
另外,使用33A9多肽的全部或部分氨基酸序列,可以方便地设计33A9特异性的寡核苷酸探针,包括简并寡核苷酸探针(即针对一种给定氨基酸序列的全部可能的编码序列的混合物)。这些寡核苷酸可以根据两条DNA链中任意一条的序列和33A9蛋白的33A9序列的任何合适的部分(图5和图6A-B;分别为SEQ ID NO:102和103)。在诸如Ausubel等(上文)和Berger和Kimmel,分子克隆技术指导,1987,Academic Press,New York中提供了设计和制备这种探针的一般方法。这些寡核苷酸可用于分离33A9基因,既可以根据它们能与33A9互补序列杂交的能力将它们用作探针,也可以用作引物而用于各种扩增技术,例如聚合酶链反应(PCR)克隆策略。如果需要,可以使用不同的、可检测标记的寡核苷酸探针的组合来对一个重组DNA文库进行筛选。这种文库可按照本领域熟知的方法进行制备,例如Ausubel等介绍的方法,或从商业途径获得。
如上文所讨论的,序列特异的寡核苷酸也可以被用作引物而用于扩增克隆策略,例如PCR。PCR方法在本领域是熟知的,并在诸如:PCR技术,Erlich,ed.Stockton Press,London,1989;PCR方法:方法和应用指南,Innis等,eds.,Academic Press,Inc.,New York,1990;以及AuSubel等(上文)中有介绍。也可以选择性地将引物设计来允许将扩增产物克隆到一种合适的载体中,例如在扩增片段的5’和3’末端包含合适的限制酶切位点(如这里所介绍的)。如果需要,核苷酸序列可以使用PCR“RACE”技术或cDNA末端的快速扩增(见诸如Innis等(上文))来分离。通过这种方法,根据一种所需序列设计的寡核苷酸引物在3’和5’方向定向,并被用来产生重叠的PGR片段。这些重叠的3’-和5’-末端RACE产物组合起来,产生一个完整的全长cDNA。该方法在Innis等(上文)和Frohman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998,1988中介绍。
部分的毒力序列例如序列标记也可用作杂交探针来鉴定全长的序列以及在数据库中筛选以前未鉴定的相关毒力基因。例如36A4、25A12和33C7的序列被扩展为分别包含毗连群2507、1126和1344的序列。
证明一种序列与致病性多肽相关可以通过多种传统的方法来完成,这些方法包括但不限于功能互补试验和基因及其表达产物的序列比较。此外,基因产物的活性可按照这里介绍的任何一种技术来进行评估,例如其编码产物的功能或免疫特性。
一旦一种合适的序列被鉴定,就按照标准技术将其克隆,并可用于诸如筛选能降低病原体毒力的化合物。
多肽表达
一般来说,本发明的多肽可通过如下方法来产生,即用位于合适表达载体中的多肽编码核酸分子或其片段的全部或部分转化一种合适的宿主细胞。
分子生物学领域的技术人员应当理解,多种表达系统中的任何一种都可用来提供重组蛋白。使用精确的宿主细胞不是本发明的关键。本发明的一种多肽可以在一种原核宿主(如大肠杆菌)或一种真核宿主(如啤酒酵母、昆虫细胞如Sf21细胞或哺乳动物细胞如NIH3T3、HeLa或更优选COS细胞)中生产。这种细胞可从广泛的来源获得(例如美国典型培养物包藏中心,Rockland,MD;也见Ausubel等,上文)。转化或转染的方法以及表达载体的选择依赖于所选择的宿主系统。转化和转染方法在诸如Ausubel等(上文)中介绍;表达载体可以从诸如克隆载体:实验室手册(P.H.Pouwels等,1985,Supp.1987)提供的载体中选择。
一个用于多肽生产的特殊细菌表达系统是大肠杆菌pET表达系统(Novagen,Inc.,MadiSon,WI)。根据该表达系统,将编码一种多肽的DNA按照设计来允许表达的方向插入pET载体。因为编码这样一种多肽的基因位于T7调节信号的控制之下,该多肽的表达可以通过在宿主细胞中诱导T7 RNA聚合酶的表达来完成。这通常使用对IPTG应答而表达T7 RNA聚合酶的宿主菌株来完成。一旦生产后,重组多肽接着按照本领域熟知的标准方法进行分离,如这里介绍的方法。
另一种用于多肽生产的细菌表达系统是pGEX表达系统(Pharmacia)。该系统使用一种GST基因融合系统,它是设计来以融合蛋白的形式高水平表达基因或基因片段,并且表达产物可快速纯化和功能复性。目标蛋白与来自Schistosoma japonicum的谷胱甘肽S转移酶的羧基端融合,并可方便地使用谷胱甘肽Sepharose 4B通过亲和层析从细菌裂解物中纯化。融合蛋白可以用谷胱甘肽洗脱,在温和条件下复性。从融合蛋白中切下谷胱甘肽S转移酶结构域可以利用此结构域上游存在的位点特异性蛋白酶的识别位点来完成。例如,在pGEX-2T质粒中表达的蛋白可以用凝血酶切割,在pGEX-3X中表达的蛋白可以用Xa因子切割。
一旦本发明的重组多肽表达后,就可进行分离,例如使用亲和层析。在一个实施例中,可以将一个针对本发明的多肽而制备的抗体(例如按这里介绍的方法制备)吸附到柱上,并用于分离重组多肽。在上亲和层析前裂解和分级分离含有多肽的细胞,这可使用标准的方法来进行(见诸如Ausubel等,上文)。
一旦分离后,在需要时,重组蛋白就可进行进一步纯化,例如使用高效液相色谱(见诸如Fisher,生物化学和分子生物学中的实验室技术,eds.,Work和Burdon,Elsevier,1980)。
本发明的多肽,特别是短肽片段,也可以用化学合成的方法生产(例如使用固相肽合成,2nd,ed.,1984,The pierce Chemicai Co.,Rockford,IL中介绍的方法)。
这些多肽表达和纯化的通用技术也可用来生产和分离有用的多肽片段或类似物(这里介绍)。
抗体
为制备抗体,本发明的多肽的编码序列可以以与谷胱甘肽S转移酶(GST)C末端融合的方式表达(Smith等,Gene 67:31-40,1988)。融合蛋白在谷胱甘肽-Sepharose珠上纯化,用谷胱甘肽洗脱,用凝血酶切割(在遗传工程切割位点),并纯化至免疫兔所需的纯度。初次免疫使用福氏完全佐剂进行,后续免疫使用福氏不完全佐剂。抗体滴度使用GST融合蛋白的凝血酶切割的蛋白片段通过Western印迹和免疫沉淀分析来监测。免疫血清使用CNBr-Sepharose偶联蛋白进行亲和纯化。抗血清特异性使用一组不相关的GST蛋白来测定。
作为GST融合蛋白的替代或辅助的免疫原,可以制备对应于本发明的多肽的相对独特的免疫原区域的肽,并通过一个引入的C末端赖氨酸将其与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。针对每种这样的多肽的抗血清在与BSA接合的肽上进行相似的亲和纯化,并使用肽接合物在ELISA和Western印迹中进行特异性检验,以及使用以GST融合蛋白形式表达的多肽进行Western印迹和免疫沉淀。
此外,能够特异性地结合本发明的任何一种多肽的单克隆抗体可按照标准的杂交瘤技术进行制备(见诸如Kohler等,Nature 256:495,1975;Kohler等,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等,In单克隆抗体和T细胞杂交瘤,Elsevier,NY,1981;Ausubel等,上文)。在制备后,单克隆抗体同样用Western印迹或免疫沉淀分析检验特异性识别能力(使用Ausubel等上文中介绍的方法)。能特异性识别本发明的多肽的抗体被认为在本发明中有用,这种抗体可用于例如免疫分析中。另外,单克隆抗体可以使用上面介绍的本发明的多肽和噬菌体文库进行制备(Vaughan等,Nature Biotech 14:309-314,1996)。
本发明的抗体优选使用本发明的多肽的片段来制备,这种片段位于通常保守的区域之外,并且看来具有抗原性,其特征是诸如具有高频率的带电荷的残基。在一个特殊实施例中,这种片段通过标准的PCR技术制备并克隆到pGEX表达载体(AuSubel等,上文)中。融合蛋白在大肠杆菌中表达并按照Ausubel等(上文)的介绍使用一种谷胱甘肽琼脂糖基质进行纯化。为尽量减少抗血清的低亲和性和特异性的潜在困难,对每种蛋白制备两种或三种这样的融合物,并将每种融合物注射到至少两只兔中。进行系列注射,优选包括至少三次加强注射,来产生抗体。
针对这里介绍的任何多肽的抗体可用于治疗细菌感染。
筛选试验
如上文所讨论的,我们已经鉴定了多种参与致病性和因而可以用于筛选能降低该有机体以及其他微生物病原体的毒性的化合物的铜绿假单胞菌毒力因子。例如,本发明提供了筛选化合物的方法,来鉴定能增强(刺激剂)和阻断(拮抗剂)本发明的多肽的活性或核酸序列的基因表达的化合物。筛选方法可使用高通量的技术。
任何数量的方法可以用于进行这种筛选。按照一个方法,候选化合物按不同的浓度加入到表达本发明的一种核苷酸序列的致病细胞的培养基中。然后测量基因的表达,例如通过标准的Northern印迹分析(Ausubel等,上文),使用从核酸分子制备的任何合适的片段作为杂交探针。将在存在候选化合物时的基因表达水平与在没有候选分子的对照培养基中测量到的水平进行比较。能够引起致病因子的表达减少的化合物就被认为在本发明中有用,这样一种分子可以用作,例如一种治疗药物,来对抗一种感染有机体的致病性。
此外,在需要时,候选化合物的效果可以使用相同的通用方法和标准的免疫技术在多肽产生的水平上进行测量,例如使用一种对致病因子特异的抗体进行Western印迹或免疫沉淀。例如,免疫试验可以用来检测或监测在病原有机体中至少一种本发明的多肽的表达。能够结合这样一种多肽的多克隆或单克隆抗体(按上面介绍的方法制备)可以在任何标准的免疫试验程序(例如ELISA、Western印迹或RIA试验中使用,来测量致病性多肽的水平。能引起致病性多肽表达减少的化合物被认为是特别有用的。同样,这样一种分子可以用作,例如一种治疗药物,来对抗感染有机体的致病性。
此外或另外,可以在候选化合物中筛选能特异性结合并抑制本发明的致病性多肽的化合物。这样一种候选化合物的效果依赖于它与致病性多肽相互作用的能力。这种相互作用可方便地使用任何数量的标准结合技术和功能试验进行分离(例如Ausubel等上文中介绍的方法)。例如,一种候选化合物可在体外检测其与本发明的一种多肽的相互作用和结合的能力,并且它调节致病性的能力可以使用任何标准试验进行分析(例如这里介绍的试验)。
在一个特殊实施例中,一种能结合致病性多肽的候选化合物可以使用基于色谱的技术来鉴定。例如,本发明的一种重组多肽可以用标准的技术从遗传工程改造来表达该多肽的细胞(例如上文所介绍的)中纯化,并可以固定到一个柱上。然后将候选化合物的溶液经过该柱,对致病多肽具有特异性的化合物就可以根据它与致病性多肽结合的能力得到鉴别,并固定在柱上。为分离该化合物,洗涤柱以去除非特异性结合分子,然后使所需的化合物从柱上释放,并进行收集。在需要时,用这种方法(或其他合适的方法)分离的化合物可进一步纯化(例如通过高效液相色谱)。此外,可以测试这些候选化合物使一种病原体毒力降低的能力(例如按这里的介绍)。用这种方法分离的化合物也可以用作,例如一种治疗药物,来治疗或预防病原体感染、疾病或两者的发生。被鉴定为能与致病多肽结合并且亲和常数小于或等于10mM的化合物被认为在本发明中特别有用。
在另一种方法中,通过监测化合物对一种吩嗪(如绿脓素)产生的影响,来在候选化合物中筛选能抑制假单胞菌细胞的毒性的化合物。根据一种方法,候选化合物按不同的浓度加入到致病细胞的培养基中,然后按照任何标准方法测量绿脓素,例如监测其在酸性溶液中在520nm的吸收(Essar等,J.Bacteriol.172:884,1990)。为使用于测量的液体培养中的绿脓素产量最大,细胞可培养在通过加入100uM FeCl3而修改的KA肉汤中(King等,J.Lab.Clin.Med.44:301,1954)。将存在候选化合物时的绿脓素产生水平与没有候选分子的对照培养基中测量的水平进行比较。能引起绿脓素表达减少的化合物被认为是在本发明中有用,这样一种分子可以用作,例如一种治疗药物,来对抗一种感染性有机体的致病性。相似的技术可以用来对其他合适的吩嗪进行筛选,包括但不限于脓玉红素、铜绿菌素A、堆粘菌素和结核霉素A。其他吩嗪在Turner和Messenger(AdvancesIn Microbial Physilolgy 27:211-1275,1986)、Sorensen和Joseph(In:铜绿假单胞菌是一种机会致病菌,Campa,M.ed.,Plenum Press,N.Y.,1993)、Ingram和Blackwood(Advances in AppliedMicrobiology 13:267,1970)和Gerber(In:CRC Handbook ofMicrobiology,Laskin,A.I.和Lechevalier,eds.,2ndedition,Vol.5,Chemical Rubber Co.,Cleveland,Ohio,1984,pp.573-576)中介绍。
潜在的拮抗剂包括能结合本发明的一种核酸序列或多肽并因而抑制或消除其活性的有机分子、肽、肽模拟物、多肽和抗体。潜在的拮抗剂还包括能结合和占据多肽的结合位点并因而抑制其与细胞结合分子结合从而抑制其正常生物活性的小分子。其他的潜在拮抗剂包括反义分子。
这里提供的每种DNA序列也可用于发现和发展抗病化合物(例如抗生素)。表达的编码蛋白可以用作一种筛选抗菌药物的靶。此外,编码所编码蛋白的氨基端区域或SD序列或相应mRNA的其他翻译促进序列的DNA序列可以用来构建反义序列,来控制所需编码序列的表达。
本发明还提供使用本发明的多肽、多核苷酸或抑制剂来干扰病原体和哺乳动物宿主之间导致感染的最初的物理相互作用。特别是本发明的分子可以用于阻止:细菌在哺乳动物细胞外基质蛋白、在伤口中的细胞外基质蛋白上的粘附和定居;阻断对哺乳动物细胞的侵入;或阻止致病的正常过程。
本发明的拮抗剂和激活剂可用于,例如抑制和治疗多种细菌感染。
另外非必须地,在上面介绍的任何试验中鉴定的化合物可以被证明为能用于在任何标准动物模型(例如这里介绍的小鼠烧伤试验)致病性感染的发展中提供保护,并且如果能成功的话,它们可以用作抗病原体药物(例如抗生素)。
待测化合物和抽提物
总的来说,能降低病原体毒力的化合物是按照本领域熟知的方法从大的天然产物或合成的(或半合成的)抽提物的文库中或化学文库中鉴定的。药物发现和开发领域的技术人员应当理解,待测抽提物或化合物的准确来源对本发明的筛选方法来说不是关键。因此,事实上任何数量的化学抽提物或化合物都能使用这里介绍的方法进行筛选。这种抽提物或化合物的例子包括但不限于植物、真菌、原核生物或动物来源的抽提物、发酵肉汤、合成化合物以及已有化合物的修饰物。大量的方法也都可以用来制备任何数量的化合物的随机或定向合成物(例如半合成或全合成),这些化合物包括但不限于以多糖、脂、肽和核酸为基础的化合物。合成化合物文库可从Bandon Associates(Merrimack,NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)购买。此外,细菌、真菌、植物和动物抽提物形式的天然化合物文库可从多个来源购买,包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce,FL)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,MA)。另外,在需要时,天然和合成产生的文库可按照本领域熟知的标准方法来产生,例如使用标准的抽提和分级分离方法。而且,在需要时,任何文库或化合物可使用标准的化学、物理或生化方法方便地修饰。
此外,药物发现和开发领域的技术人员很容易理解,用来对已经知道其致病活性的化合物进行去复制(例如分类去复制、生物去复制或化学去复制,或它们的任何组合)或消除复制或重复的方法,在任何可能的时候,都可以应用。
当发现一种粗抽提物具有抗病或抗毒活性或结合活性时,需要对产生阳性的抽提物进行进一步的分级分离,来分离导致所观察到的效果的化学组分。这样,抽提、分级分离和纯化过程的目标是在具有抗病活性的粗抽提物中仔细分析和鉴定一种化学实体。这种异质抽提物的分级分离和纯化的方法在本领域是熟知的。在需要时,显示是一种对致病性治疗有用的试剂的化合物可按照本领域熟知的方法进行化学修饰。
药物治疗剂和植物保护剂
本发明提供一种简单的方法来鉴别能抑制一种病原体的致病性或毒性的化合物(包括肽、小分子抑制物和模拟物)。因此,使用这里介绍的方法而被发现具有医学或农业价值的一种化学实体,可以用作药物、植物保护剂,或用作对已有的抗病化合物进行结构修饰的信息,例如通过合理的药物设计。这种方法可用于筛选对多种病原体包括但不限于细菌、病毒、真菌、环节动物、线虫、扁形动物和原生动物有效的化合物。致病细菌的例子包括但不限于气杆菌、气单胞菌、不动杆菌、农杆菌、芽孢杆菌、拟杆菌、巴尔通氏体、Bortella、布鲁氏菌、鞘杆菌、弯曲杆菌、柠檬酸杆菌、梭菌、棒杆菌、肠杆菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血菌、哈夫尼菌、螺杆菌、克雷伯氏菌、军团菌、李斯特氏菌、摩根氏菌、莫拉氏菌、变形菌、普罗威登氏菌、假单胞菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、密螺旋体、黄单胞菌、孤菌和耶尔森氏菌。
为用于治疗,使用这里介绍的方法鉴定的组合物或药剂可以系统给药,例如配制在一种可药用的缓冲液如生理盐水中。治疗可直接完成,例如用能够破坏、抑制、减弱或中和与致病肽有关的生物事件的拮抗剂处理动物。给药的优选途径包括诸如能在患者中提供连续稳定水平的药物的皮内、静脉、腹膜内、肌肉或皮下注射。对人类患者或其他动物的治疗可以使用存在于一种生理接受的载剂中的治疗有效量的抗病试剂。合适的载剂及其配制在诸如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences中介绍。用于给药的抗病试剂(例如一种抗生素)的数量根据给药方式、患者的年龄和体重以及疾病的种类和疾病的范围而各不相同。虽然由于化合物的特异性提高,在特定场合需要较低的剂量,但一般来说,剂量在那些用于治疗其他微生物疾病时所用的其他药剂的剂量范围内。化合物给药的剂量为能抑制微生物的增殖。例如,对于系统给药,一种化合物通常给药的范围为0.1ng-10ng/kg体重。
为在农业中使用,使用这里介绍的方法鉴定的组合物或药剂可以用作喷洒或粉尘化学剂施用于植物的叶面。这种药剂通常在病原体之前给药于植物表面以防止感染。也可以在种植后处理种子、鳞茎、根、块茎和球茎,通过控制它们携带的或种植地点的土壤中存在的病原体,来防止病原体袭击。准备种植蔬菜、观赏植物、灌木或树木的土壤也可以用化学熏蒸剂进行处理,来控制多种微生物病原体。处理优选在种植前几天或几周进行。化合物可通过机械途径例如拖拉机也可以通过手工操作进行施用。此外,使用试验方法鉴定的化合物可以用作消毒剂。
其他实施方案
总的来说,本发明包括可以按这里的介绍进行分离的核酸序列或使用本发明的核酸序列通过同源筛选或PCR扩增能方便地分离的任何核酸序列。本发明还包括能通过不消除其致病活性(进行试验,例如按这里的介绍)的方法进行修饰的多肽。这种改变包括特定的突变、删除、插入或翻译后修饰,或可包括将本发明的多肽包含在一个较大的融合蛋白中,成为一个组分。本发明还包括失去了其致病性的多肽。
这样,在其他实施方案中,本发明包括基本上与本发明的多肽相同的任何蛋白。这种同源物包括其他基本上纯的天然产生的多肽以及等位突变体、天然突变体、诱导突变体、由能在高严谨条件下或较差一些---在低严谨条件下(例如在40℃用2x SSC洗涤,探针长度至少40个核苷酸)与本发明的任何一种核酸序列杂交的DNA编码的蛋白、以及能被本发明的抗血清特异性结合的蛋白。
本发明进一步包括本发明的任何天然产生的多肽的类似物。类似物与本发明的天然产生的多肽的差别在于氨基酸差异、翻译后修饰或两者。本发明的类似物通常显示与本发明的天然产生的氨基酸序列的全部或部分至少有85%的同一性,更优选为90%,最优选为95%甚至99%。进行比较的序列的长度至少为15个氨基酸残基,优选为至少25个氨基酸残基,更优选超过35个氨基酸残基。同样,在一个测定同一性的方法举例中,可以使用一种BLAST程序,其中可能分数在e-3和e-100之间,这表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内或体外化学衍生,例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化,这种修饰可在多肽合成、加工过程中或用分离的修饰酶处理后发生。类似物与本发明的天然产生的多肽的差别还可在于一级序列中的改变。这包括遗传变异,自然和诱导的(例如,按照Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆:实验室手册(2版),CHS Press,1989或Ausubel等,上文中介绍的通过辐射或暴露于乙烷甲基硫酸进行随机突变或进行位点特异性诱变)。还包括环肽、分子和含有L-氨基酸以外的残基如D-氨基酸或非天然产生的或合成氨基酸如β或γ氨基酸的类似物。
除了全长的多肽,本发明还包括本发明的任何一种多肽的片段。用于此处,“片段“一词是指至少5个连续氨基酸,优选至少20个连续氨基酸,更优选至少30个连续氨基酸,更优选至少50个连续氨基酸,最优选至少60至80个或更多的连续氨基酸。本发明的片段可以通过本领域的技术人员熟知的方法制备,或通过普通的蛋白加工产生(例如,从新生多肽中去除不是生物活性必需的氨基酸,或通过另外的mRNA剪接或另外的蛋白加工事件去除氨基酸)。
而且,本发明包括能帮助特异性检测本发明的任何核酸序列的核苷酸序列。这样,例如,这里介绍的核酸序列或其片段可用作探针,通过标准的杂交技术在常规条件下与核苷酸序列杂交。能与一种编码序列的核酸序列或其互补序列杂交的序列被认为是在本发明中有用。能与本发明的一种核酸序列的编码序列或其互补序列杂交的序列和编码本发明的一种多肽的序列也被认为在本发明中有用。用于此处,“片段”一词在用于核酸序列时,是指至少5个连续氨基酸,优选至少10个连续氨基酸,更优选至少20至30个连续氨基酸,最优选至少40至80个或更多的连续氨基酸。核酸序列的片段可通过本领域的技术人员熟知的方法制备。
本发明进一步提供在个体特别是人体中诱导一种免疫应答的方法,该方法包括用例如本发明的任何多肽(或其片段或类似物,或融合蛋白)接种该个体,产生一种抗体和/或T细胞免疫应答,来保护个体免于感染,尤其是细菌感染(例如铜绿假单胞菌感染)。本发明进一步包括在个体中诱导一种免疫应答的方法,它包括将一种核酸载体转移进个体,指导这里介绍的多肽(或其片段或融合蛋白)表达,来诱导免疫应答。
本发明还包括包含本发明的多肽或核酸序列的疫苗组合物。例如,本发明的多肽可以用作一种抗原,来在宿主中接种后产生特异性的抗体,这种抗体能针对细菌侵袭提供保护,例如,通过阻断吩嗪的产生。因此,本发明包括一种疫苗制剂,它包括本发明的一种免疫原性多肽以及一种合适的载剂。
本发明进一步提供用于诊断致病情况的组合物(例如核苷酸序列探针)、多肽、抗体和方法。
本申请书中提到的所有出版物和专利申请,在此都各自独立并具体地引入作为参考。
其他的实施方案在权利要求的范围内。
Claims (43)
1.一种分离核酸分子,它包含一个与SEQ ID NO:252基本上相同的序列。
2.权利要求1的分离核酸分子,其中所说的核酸分子包含示于SEQ ID NO:252的序列。
3.一种分离核酸分子,它包含一个与SEQ ID NO:105基本上相同的序列。
4.权利要求3的分离核酸分子,其中所说的核酸分子包含示于SEQ ID NO:105的序列。
5.一种分离核酸分子,它包含一个与SEQ ID NO:106基本上相同的序列。
6.权利要求5的分离核酸分子,其中所说的核酸分子包含示于SEQ ID NO:106的序列。
7.一种基本上纯的多肽,它含有一个与SEQ ID NO:253的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
8.权利要求7的基本上纯的多肽,其中所说的氨基酸序列包含示于SEQ ID NO:253的序列。
9.一种基本上纯的多肽,它含有一个与SEQ ID NO:107的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
10.权利要求9的基本上纯的多肽,其中所说的氨基酸序列包含示于SEQ ID NO:107的序列。
11.一种基本上纯的多肽,它含有一个与SEQ ID NO:108的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
12.权利要求11的基本上纯的多肽,其中所说的氨基酸序列包含示于SEQ ID NO:108的序列。
13.鉴定能降低致病毒力因子表达的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)提供一种能表达权利要求1的一种核酸分子的致病细胞;并
(b)将所说的致病细胞与一种候选化合物接触,在与所说的候选化合物接触后所说的核酸分子的表达降低,就鉴定了能降低一种致病毒力因子表达的化合物。
14.权利要求13的方法,其中所说的致病细胞感染一种哺乳动物。
15.权利要求13的方法,其中所说的致病细胞感染一种植物。
16.鉴定能降低致病毒力因子表达的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)提供一种能表达权利要求3的核酸分子的致病细胞;并
(b)将所说的致病细胞与一种候选化合物接触,在与所说的候选化合物接触后所说的核酸分子的表达降低,就鉴定了一种能降低致病毒力因子表达的化合物。
17.权利要求16的方法,其中所说的致病细胞感染一种哺乳动物。
18.权利要求17的方法,其中所说的致病细胞感染一种植物。
19.鉴定能降低致病毒力因子表达的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)提供一种能表达权利要求5的核酸分子的致病细胞;并
(b)将所说的致病细胞与一种候选化合物接触,在与所说的候选化合物接触后所说的核酸分子的表达降低,就鉴定了一种能降低致病毒力因子表达的化合物。
20.权利要求19的方法,其中所说的致病细胞感染一种哺乳动物。
21.权利要求19的方法,其中所说的致病细胞感染一种植物。
22.鉴定能结合一种多肽的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)将候选化合物与含有权利要求7的氨基酸序列的基本上纯的多肽在允许结合的条件下接触;并
(b)检测候选化合物与多肽的结合。
23.鉴定能结合一种多肽的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)将候选化合物与含有权利要求9的氨基酸序列的基本上纯的多肽在允许结合的条件下接触;并
(b)检测候选化合物与多肽的结合。
24.鉴定能结合一种多肽的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)将候选化合物与含有权利要求11的氨基酸序列的基本上纯的多肽在允许结合的条件下接触;并
(b)检测候选化合物与多肽的结合。
25.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能抑制在所说的病原体中由权利要求1的核酸分子编码的多肽的表达或活性的组合物给药于所说的哺乳动物。
26.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能抑制在所说的病原体中由权利要求3的核酸分子编码的多肽的表达或活性的组合物给药于所说的哺乳动物。
27.权利要求26的方法,其中所说的病原体是铜绿假单胞菌。
28.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能抑制在所说的病原体中由权利要求5的核酸分子编码的多肽的表达或活性的组合物给药于所说的哺乳动物。
29.权利要求28的方法,其中所说的病原体是铜绿假单胞菌。
30.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能结合和抑制由权利要求5的氨基酸序列编码的多肽的组合物给药于所说的哺乳动物。
31.权利要求30的方法,其中所说的病原体是铜绿假单胞菌。
32.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能结合和抑制由权利要求7的氨基酸序列编码的多肽的组合物给药于所说的哺乳动物。
33.权利要求32的方法,其中所说的致病性感染由铜绿假单胞菌引起。
34.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能结合和抑制由权利要求9的氨基酸序列编码的多肽的组合物给药于所说的哺乳动物。
35.权利要求34的方法,其中所说的致病性感染由铜绿假单胞菌引起。
36.一种治疗哺乳动物中致病性感染的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)确定具有致病性感染的哺乳动物,并;
(b)将一种治疗有效量的、能结合和抑制含有权利要求11的氨基酸序列的基本上纯的多肽的组合物给药于所说的哺乳动物。
37.权利要求36的方法,其中所说的致病性感染由铜绿假单胞菌引起。
38.一种鉴定能抑制假单胞菌细胞的毒性的化合物的方法,所说的方法包括以下步骤:
(a)提供一种假单胞菌细胞;
(b)将所说的细胞与候选化合物接触,并
(c)检测一种吩嗪的存在,其中所说的吩嗪与未处理的对照细胞相比减少,就说明该化合物能抑制所说的假单胞菌细胞的毒性。
39.权利要求38的方法,其中所说的细胞是铜绿假单胞菌。
40.权利要求38的方法,其中所说的吩嗪用光谱学进行检测。
41.权利要求38的方法,其中所说的吩嗪是绿脓素。
42.权利要求41的方法,其中所说的绿脓素用测量在520nm处的吸收来检测。
43.权利要求38的方法,其中所说的细胞存在于一种细胞培养物中。
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |