CN1278864A - 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有一种遗传修饰的msbB基因的突变沙门氏菌,该突变沙门氏菌具有靶向实体瘤的能力。本发明还涉及含有一种遗传修饰的msbB基因以及在生物合成途径基因如purI基因中有一种遗传修饰的沙门氏菌。本发明进一步涉及将该突变沙门氏菌用于实体瘤的生长抑制和/或体积减小的用途。

Description

减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌
本申请是1997年9月10日提交的申请系列号No．08／926，636的部分继续申请，该申请在此全文引入作为参考。
1．发明领域
本发明涉及一种沙门氏菌基因的分离，该基因在被遗传破坏时，能同时降低由这种生物引起的毒性和败血症休克，并提高其对促进这种细菌消除的试剂如螯合剂的敏感性。本发明提供这种基因的序列和对其进行遗传破坏的方法，并介绍使用在该基因中有破坏的肿瘤靶向细菌来抑制癌症(包括但不限于黑素瘤、结肠癌和其他实体瘤)生长的例子。本发明还提供该基因遗传破坏与一种营养缺陷型基因破坏的组合。
2．发明背景
第2部分或本申请的其他部分对任何参考文献的引用或注明并不意味着这些参考文献是本发明的现有技术。
实体瘤癌症的化学疗法中的一个主要难题是，传递足够浓度的治疗试剂例如药物来消除肿瘤细胞，同时减少对正常细胞的损伤。因此，许多实验室的研究都针对生物传递系统的设计，例如用来将药物、药物前体转化酶、和／或基因靶向转移至肿瘤细胞的抗体、细胞因子、和病毒。Houghton和Colt，癌症诊断和治疗的新视角1：65-70；de Palazzo，et a1．，1992a，细胞免疫142：338-347；dePalazzo et al．，1992b，癌症研究52：5713-5719；Weiner，et a1．，1993a，免疫治疗杂志13：110-116；Weiner et a1．，1993b，免疫学杂志151：2877-2886；Adams et al．，1993，癌症研究53：4026-4034；Fanger et al．，1990，FASEB J．4：2846-2849；Fangeret al．，1991，今日免疫学12：51-54；Segal，et al．，1991，纽约科学院年评636：288-294；Segal et al．，1992，免疫生物学185：390-402；Wunderlich et al．，1992；Intl．J．Clin．Lab．Res．22：17-20；George et al．，1994，免疫学杂志152：1802-1811；Hustonet al．，1993，Intl．Rev．Immunol．10：195-217；Stafford et al．，1993，癌症研究53：4026-4034；Haber et al．，1992，纽约科学院年评667：365-381；Feloner and Rhodes，1991，自然349：351-352；Sarver and Rossi，1993，艾滋病研究与人类逆转录病毒9：483-487；Levine and Friedmann，1993，美国儿童病学杂志147：1167-1176；Friedmann，1993，分子遗传医学3：1-32；Gilboaand Smith，1994，遗传学趋势10：139-144；Saito et al．，1994，癌症研究54：3516-3520；Li et al．，1994，血液83：3403-3408；Vieweg et al．，1994，癌症研究54：1760-1765；Lin et al．，1994，科学265：666-669；Lu et al．，1994，人类基因治疗5：203-298；Gansbacher et al．，1992，血液80：2817-2815；Gastl et al．，1992，癌症研究52：6229-6236．
2．1细菌感染和癌症
关于细菌和癌症，一篇历史综述揭示了大量的临床观察，这些临床病例报告，在患有细菌感染的病人体内，肿瘤萎缩了。Nauts et al．，1953，Acta Medica．Scandinavica 145：1-1-2，(Suppl．276)陈述道：
通过注射细菌产物来治疗癌症基于以下事实，200多年来，已经观察到肿瘤在急性感染主要是链球菌感染后萎缩。如果这些病例不是过于晚期，并且感染足够严重和持久，肿瘤将完全消失，病人将不会再复发。
Shear，1950，J．A．M．A．142：383-390(Shear)观察到，在Boston儿童医院中，未经治疗而自发缓解的白血病例中，75％发生在急性细菌感染事件之后。Shear提出了以下问题：
病原性和非病原性生物是自然控制恶性疾病的显微病灶之一吗?在控制感染性疾病取得进步的过程中，我们是否正在解除癌症的一种自然控制?
随后来自大量研究实验室的证据指出，至少某些抗癌效应是通过刺激宿主免疫系统介导的，导致对癌细胞免疫排斥的增强。例如，革兰氏阴性细菌如沙门氏菌释放脂多糖(LPS)内毒素会激发宿主免疫系统的细胞如巨噬细胞释放肿瘤坏死因子---TNF，Christ et al．，1995，Science 268：80-83。TNF水平的升高接着引发细胞因子介导的级联反应，最终导致肿瘤细胞的死亡。关于这一点，Carswell et al．，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72：3666-3669，证明，用细菌卡介苗(BCG)注射小鼠能提高TNF的血清水平，并且TNF阳性血清能导致小鼠中肉瘤Meth A和其他移植肿瘤的坏死。而且，Klimpelet al．，1990，免疫学杂志145：711-717，显示，体外感染志贺氏菌或沙门氏菌的成纤维细胞对TNF的敏感性提高。
由于上面介绍的这些观察结果，用注射BCG来为癌症病人进行免疫接种目前正用于某些癌症的治疗过程。见，Sosnowski，1994，Compr．Ther．20：695-701；Barth and Morton，1995，Cancer 75(Suppl．2)：726-734；Friberg，1993，Med．Oncol．Tumor．Pharmacother．10：31-36的对BCG疗法的综述。
2．寄生物和癌细胞
虽然寄生物的天然生物特异性和进化上的适应性已经被认识了一段时间，并且已有人建议将它们的特殊系统用作新治疗方法的模型，但很少有报告或建议真正将寄生物用作载体。
Lee et al．，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：1847-1851(Lee et al．)和Jone et al．，1992，Infect．Immun．60：2475-2480(Jones et al．)分离了伤寒沙门氏菌的突变体，这类突变体能在体外以比野生型菌株大得多的数量入侵HEp-2细胞(人表皮样癌)。“高侵袭性”突变体是在细菌的有氧生长条件下分离的，这种条件通常抑制野生型菌株侵入HEp-2动物细胞的能力。但是，Lee等人和Jone等人并没有提出使用这种突变体作为治疗载体，也没有提出，通过筛选与机体的正常细胞相比优先感染黑素瘤或其他癌细胞的突变体，来分离肿瘤特异性的细菌。没有肿瘤特异性或其他形式的减毒，像Lee等人和Jones等人介绍的这种高侵袭性伤寒沙门氏菌很可能是泛侵袭性的，在癌症病人中将导致广泛的感染。
2．3 肿瘤靶向的细菌
已经证明，遗传工程改造的沙门氏菌能够靶向肿瘤，具有抗肿瘤活性，并可用于将效应基因如单纯疱疹胸苷激酶(HSV TK)传递至实体瘤(Pawelek et al．，W0 96／40238)。体内使用细菌明显要考虑的两个因素是它们的毒性和诱导肿瘤坏死因子α(TNFα)介导的败血症休克的能力。因为TNFα介导的败血症休克是与细菌有关的考虑中首要的东西之一，能减少这种形式免疫应答的修饰将十分有用，因为TNFα水平将不再变得有毒性，而更有效浓度和／或持续时间的治疗载体将可以使用。
2．4 修饰的细菌类脂A
对肿瘤靶向细菌的脂类组分进行修饰，通过产生TNFα诱导产量降低来改变免疫应答，这是由Pawelek等人提出的(Pawelek等，WO96／40238)。Pawelek等提供了从红细菌中分离负责单磷酰类脂A(MLA)产生的基因的方法。MLA的作用是败血症的一种拮抗物。Pawelek等还提出类脂A生物合成途径中遗传修饰的使用，包括firA突变，firA编码类脂A生物合成的第三个酶---UDP-3-O(R-30羟基豆蔻酰)-葡糖胺N-乙酰转移酶(Kelley等，1993，J．Biol．Chem．268：19866-19874)。Pawelek等人显示，firA基因中的突变诱导低水平的TNFα。但是这些作者没有提出修饰类脂A分子中豆蔻酸部分的酶。而且，Pawelek等人并没有提出，对细菌脂类成分的修饰将改变它们对特定试剂如螯合剂的敏感性。
在大肠杆菌中，负责类脂A末端豆蔻酰化的msbB(mlt)基因已被鉴定(Engel et al．，1992，J．Bacteriol．174：6394-6403；Karow and Georgopoulos 1992，J．Bacteriol．174：702-710；Somerville et al．，1996，J．Clin．Invest．97：359-365)。该基因的遗传破坏将导致稳定的、不受环境影响的突变，这种突变可降低TNFα的诱导(Somerville et al．，1996，J．Clin．Invest．97：359-365)。但是，这些参考文献并没有提出，肿瘤靶向的沙门氏菌载体中msbB基因的破坏将产生这样一种细菌，它具有较低毒性，并对螯合剂更加敏感。
与细菌用作基因传递载体有关的难题集中在，细菌普遍具有直接杀伤正常哺乳动物细胞的能力，并且它们具有通过TNFα过分刺激免疫系统的能力，这种对免疫系统的过分刺激对宿主具有毒性效果(Bone，1992 JAMA 268：3452-3455；Dinarello et al．，1993 JAMA269：1829-1835)。除了这些因素，对抗生素的抗性使得对付人体中细菌的存在大大复杂化(TschapE，1996，D T W Dtsch TierarztlWochenschr 1996 103：273-7；Ramos et al．，1996，Enferm Infec．Microbiol．Clin．14：345-51)。
Hone和Powell，WO 97／18837(“Home and Powell”)公开了制备具有非致热原类脂A或LPS的革兰氏阴性菌的方法。虽然Hone和Powell泛泛地断言，在多种基因包括msbB、kdsA、kdsB、kdtA和htrB等等中的条件突变，可被引入大范围的、不同种类的革兰氏阴性菌中，包括大肠杆菌、各种志贺氏菌、各种沙门氏菌等等，但所举的惟一突变的例子是将一个htrB突变引入大肠杆菌中。而且，虽然Hone和Powell提出了在msbB基因中有一个突变的非致热原沙门氏菌的治疗用途，但却没有如何完成这种用途的介绍。而且，Hone和Powell仅提出将非致热原细菌用于疫苗目的。
疫苗载体的目标与本申请的肿瘤靶向载体有明显的不同。因此，疫苗载体的要求与肿瘤靶向载体也明显不同。疫苗载体的目的是引发一种免疫应答。一种优选的细菌活疫苗应具有免疫原性，使它能引发保护性免疫；但疫苗不能在体内过量生长，因为这样会导致有害反应。根据Hone和Powell的技术，一种合适的细菌疫苗载体是温度敏感型的，在机体温度的正常生理范围内没有复制能力。
相反，优选的肿瘤靶向寄生性载体，例如但不限于沙门氏菌，能被机体的正常组织安全地耐受，使免疫原性受到限制，而载体靶向肿瘤并在其中自由复制。因此，在正常机体温度下复制最小的疫苗载体将不适合用作肿瘤靶向载体。
肿瘤特异性沙门氏菌株的优选特性包括：1)血清抗性，允许寄生物在寻找肿瘤的过程中穿过血管系统和淋巴系统，2)兼性厌氧，即能在厌氧或有氧条件生长，使之能在含氧量低的大的坏死性肿瘤中以及含氧量较高的小的转移性肿瘤中增殖，3)对宿主的防御能力敏感，这样可限制其在正常组织中的复制，但在肿瘤中不受限制，因为肿瘤中的宿主防御能力已被损坏，4)毒性降低，这样可提高对宿主防御的敏感性，寄生物能被宿主耐受，但不限制其在肿瘤中复制，5)针对肿瘤细胞的侵袭能力，有助于肿瘤靶向和抗瘤活性，6)运动性，有助于穿透肿瘤，7)抗生素敏感，用于在治疗中控制和在治疗后清除(例如对氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、环丙沙星敏感)，并缺少抗生素抗性标记，诸如那些用于菌株构建的抗性标记，以及8)较低的原养型回复率，有助于在接受个体中的安全性。
3．发明简述
本发明提供一种提高肿瘤靶向细菌安全性的方法，例如通过类脂A分子的遗传修饰。本发明的修饰的肿瘤靶向细菌诱导的TNFα少于野生型细菌，并且与野生型细菌相比，直接杀死正常哺乳动物细胞或引起全身性疾病的能力降低。本发明的修饰的肿瘤靶向细菌具有提高的治疗效果，即由于其诱导的TNFα和全身性疾病较少，毒性低，可以使用更为有效的剂量的细菌和更长的时间。
本发明提供在细菌如沙门氏菌中进行msbB基因的遗传破坏的组合物和方法，这种破坏导致细菌如沙门氏菌与野生型细菌相比，具有较低的TNFα诱导能力和毒性。在一个实施方案中，本发明提供筛选msbB基因的遗传破坏的改进方法。此外，与携带野生型msbB基因的细菌相比，遗传修饰的细菌对螯合剂的敏感性升高。在一个优选实施方案中，具有一种被破坏的msbB基因的沙门氏菌对肿瘤组织具有高侵袭性，它能够在肿瘤中复制，并可用于抑制肉瘤、癌、淋巴瘤或其他实体瘤癌症如生殖系肿瘤和中枢神经系统瘤的生长和／或减少肿瘤体积，所述癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星型细胞瘤、神经蚀质瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和黑素瘤。
在本发明的一个实施方案中，细菌用其他方法减毒，包括但不限于导致营养缺陷型的生物合成途径突变。在一个具体实施方案中，这种生物合成途径突变是一种purⅠ基因的遗传破坏。在另一个实施方案中，细菌表达药物前体转化酶，包括但不限于HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)和p450氧化还原酶。
本发明还提供用于终止治疗和治疗终止后增加敏感性的方法。根据本发明的一个实施方案，带有遗传修饰的类脂A的肿瘤靶向细菌对特定试剂如螯合剂的敏感性也增加。用这种方法对肿瘤靶向细菌进行修饰有更进一步的优越性，因为这增加了用有抗生素样效果的试剂如螯合剂去除细菌的能力，这种螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和柠檬酸钠。因此，通过外源方法增加消除细菌的能力的修饰将非常有用，所述外源方法如给予一种遗传修饰的细菌比相应的野生型菌株对其更为敏感的试剂。
本发明进一步提供一种在msbB基因及一种营养缺陷型基因两者中都有删除突变的沙门氏菌株。在一个具体实施方案中，该营养缺陷型删除突变影响purⅠ基因。在一个优选实施方案中，这些突变导致菌株的安全性提高。在另一个优选的实施方案中，菌株还携带这里介绍的其他突变，这些突变可提高菌株的效率，而对其安全性则无关紧要。
4．定义
用于此处，沙门氏菌包括所有种类的沙门氏菌，包括：伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。此处也包括沙门氏菌的各血清型，例如鼠伤寒，它是肠炎沙门氏菌的一个亚类，通常被称为鼠伤寒沙门氏菌。
“减毒”：减毒是一种使微生物或载体具有较低病原性的修饰。减毒的最终结果是，当微生物或载体接种给予病人时，毒性以及其他副作用的危险降低。
毒性：毒性是一个有相对含义的词，用来描述导致疾病的一般能力，包括杀死正常细胞的能力或诱发败血症休克的能力(见下面的专门定义)。
败血症休克：败血症休克是一种由复杂的细胞因子级联反应造成的体内器官衰竭症状，它主要由TNFα引发。一种微生物或载体诱导TNFα的相对能力被用作一种测量指标，来说明其诱导败血症休克的相对能力。
螯合剂敏感性：螯合剂敏感性被定义为，细菌繁殖受到影响的有效浓度，或细菌存活性被降低的浓度，细菌存活性可用复苏的菌落形成单位(c．f．u．)来确定。
5．附图简述
本发明可参考下面的详细介绍、具体实施方案的说明性实施例以及附图来更全面理解。
图1。沙门氏菌野生型(WT)14028的msbB基因的全DNA序列(SEQID NO：1)以及推导的编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图2A-2C。用克隆的沙门氏菌WT 14028 msbB基因制备的敲除结构物。克隆基因用SphⅠ和MluⅠ酶切来去掉大约一半的msbB编码序列，然后将来自AatⅡ和AvaⅠ酶切的pBR322的四环素抗性基因(TET)，在用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行平端化后，插入该基因。A=敲除结构物。B=沙门氏菌msbB的染色体拷贝。C=同源重组后沙门氏菌msbB的被破坏的染色体拷贝。图中还显示了起始密码子(ATG)、终止密码子(TAA)以及AseⅠ、BamHⅠ、SphⅠ、MluⅠ和EcoRⅤ的酶切位点。图中还标出了产生野生型或破坏的msbB的不同大小PGR产物的两条引物，P1和P2。
图3A-3C。染色体上被破坏的沙门氏菌WT 14028 msbB的Southern印迹分析。
A)使用四环素基因为探针进行的Southern印迹，证明它在质粒结构物和两个克隆中存在，在WT 14028细菌中不存在。B)使用32-P标记的、来自克隆的msbB的AseⅠ／BamHⅠ片段为探针，用相似凝胶进行的Southern印迹。AseⅠ酶的切点在msbB的上游，在野生型中BamHⅠ在一个位置切割，但在四环素基因中，它在第二个位置上切割，这将产生一个更高分子量的产物。泳道1(K0)显示敲除结构物中该条带的位置，与此相比较的是泳道2(WT)中的WT 14028。泳道3和4显示具有更高分子量产物的克隆YS8211和YS861。C)使用32-P标记的、来自克隆的msbB的mluⅠ片段为探针，用相似凝胶进行的Southern印迹。详见正文章节7．2。
图4。活的沙门氏菌WT 14028在小鼠中的TNFα诱导。野生型或msbB-破坏菌株按溶于0．1cc磷酸缓冲盐水中的1×108活菌的剂量经静脉注射于Balb／c小鼠的尾静脉中。条形图用误差条表明TNFα的诱导。与沙门氏菌WT 14028相比，克隆YS8211诱导32％的TNFα。
图5。Sinclair猪对活的沙门氏菌WT 14028和msbB-克隆YS8212的TNFα应答。在静脉导入1×109c．f．u．沙门氏菌WT 14028和YS82121．5和6．0小时后，测量TNFα水平。在1．5小时，msbB删除突变型与野生型相比，TNFα应答明显低(p≤0．011)。
图6A-6B。来自WT14028和msbB-克隆YS8212的LPS诱导的呼吸水平改变。Sinclair猪用A)5ug／kg的纯化LPS或B)500ug／kg的纯化LPS注射，并测量呼吸速率。500ug／kg来自沙门氏菌WT 14028的LPS能提高呼吸速率，比正常情况下提高4倍，而在msbB-LPS处理的动物中呼吸速率的提高则少于2倍。
图7。活的沙门氏菌WT14028对人单核细胞的TNFα诱导。将分离自外周血的人单核细胞用c．f．u．数量不断增加的沙门氏菌处理。在1．0×105c．f．u．时，WT14028诱导的TNFα浓度比由多种msbB-克隆即YS8211、YS8212、YS8658和YS1170诱导的要高3倍。
图8。人单核细胞的TNFα产生。分离自外周血的人单核细胞用数量不断增加的纯化LPS处理。少至1纳克的来自野生型的LPS就足以诱导可以测量的TNFα应答，并在10ng达到最高。与此相对，100ug的来自每种msbB-克隆的LPS都不足以诱导任何应答。因此，在10ngLPS水平，沙门氏菌WT14028诱导的TNFα浓度至少比独立的msbB敲除即YS7216和YS8211及其衍生物即YS1170、YS8644、YS1604、YS8212、YS8658、YS1601、YS1629诱导的TNFα浓度高105倍。
图9A-9B。分别注射了2×107或1×109活菌的小鼠和Sinclair猪的存活。A)WT14028在4天内杀死所有的小鼠，而msbB-克隆YS862处理的小鼠在20天后有90％存活。B)与此相似，WT14028在3天内杀死所有的猪，而msbB-克隆YS8212处理的猪在20天后100％存活。
图10。msbB-沙门氏菌YS8211在B16F10黑素瘤肿瘤中的生物分布。在5天内，肿瘤中的msbB-沙门氏菌与肝脏中的比例超过1000∶1。
图11。msbB-沙门氏菌的肿瘤抑制作用。将B16F10黑素瘤肿瘤移植到C57BL／6小鼠的体侧，并让其生长至第8天。小鼠不接受细菌(对照)或接受msbB-菌株YS8211、YS8212、YS7216、YS1629处理。两种菌株---YS8211和YS1629能明显抑制肿瘤的发展，而菌株YS7216和YS8212则不能。
图12A-12B。WT14028和msbB破坏的细菌对螯合剂的敏感性。在存在或不存在1mM EDTA(图12A)的条件下，或者在存在或不存在10mM柠檬酸钠(图12B)的条件下，在无氯化钠的LB培养基(LB-zero)中，培养野生型和msbB破坏型沙门氏菌克隆YS8211和YS862。以时间为变量测量0D600并作图。与msbB-菌株相比，msbB+菌株显示几乎不被EDTA或柠檬酸钠抑制，而msbB-菌株显示在EDTA或柠檬酸钠处理3小时后，生长几乎完全停止。
图13A-13B。msbB-细菌在鼠巨噬细胞中的存活。以鼠骨髓来源的巨噬细胞(图13A)和一种小鼠巨噬细胞系---J774(图13B)作为宿主，用于细菌内在化和按时间进行定量。数据以原始c．f．u．的百分数形式表示。
图14。使用携带第二个版本的msbB-(msbB2(△)ampRsacB+)的阳性选择性自杀载体pCV0442，进行msbB1(△)：：tet至tets的转化。
图15。由野生型鼠伤寒沙门氏菌衍生出菌株YS1456的示意图。详见正文章节8．1。
图16。由野生型鼠伤寒沙门氏菌衍生出菌株YS1646的示意图。详见正文章节8．2。
图17。YS1646剂量对B16-B10小鼠黑素瘤生长的影响。
图18。致死感染后，YS1646诱导的死亡率的抗生素抑制作用。
6．发明详述
本发明基于一种沙门氏菌基因即msbB的分离，这种基因在以正常形式存在时，其作用为TNFα的诱导、一般毒性、巨噬细胞内存活，以及对特定试剂不敏感，这些特定试剂能促进细菌的消除。本发明涉及该基因的遗传修饰以及将遗传修饰导入肿瘤靶向细菌包括沙门氏菌来用于治疗，这种修饰导致该基因产物的正常功能被破坏。在一个优选实施方案中，细菌在msbB基因中有一种遗传修饰，并在一个生物合成途径中的一个基因例如purⅠ基因中带有一种遗传修饰，后者产生一种营养缺陷型菌株。
在一个优选实施方案中，遗传修饰的细菌被用于动物包括人体中实体瘤的体积减小和／或生长抑制。
在另一个优选实施方案中，对本发明来说有用的细菌显示，相对于正常组织，它们优先粘附至或穿透到特定的实体瘤癌症细胞中，或在肿瘤组织中增殖的倾向提高。这些细菌包括但不限于沙门氏菌，它们具有区分癌症或赘生细胞组织与正常细胞／组织的天然能力。
此外，对本发明来说有用的肿瘤细胞特异性的细菌，可以按照Pawelek等，W0 96／40238介绍的方法，依肿瘤靶向能力选择或改进，该文献在此引入作为参考。Pawelek等人介绍了分离肿瘤特异性细菌的方法，即使用一次或多次感染循环，将一种微生物循环通过预先选择的靶细胞，优选使用体外的实体瘤细胞，或者在体内通过实体瘤。
6．1一种参与毒性的基因的分离／鉴定
大肠杆菌基因msbB已被显示参与类脂A的豆蔻酰化(Somervilleet al．，1996，J．Clin．Invest．97：359-365)。大肠杆菌msbB基因的染色体组成和编码msbB基因的DNA序列已有介绍(Engel，etal．，1992，J．Bacteriol．174：6394-6403；Karow andGeorgopoulos，1992，J．Bacteriol．174：702-710；Somerville etal．，1996，J．Clin．Invest．97：359-365)。
如本发明所示，msb基因可以使用本领域的技术人员熟知的低严紧性DNA／DNA杂交技术(Sambrook et al．，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Press，1989)，从非大肠杆菌的细菌菌株中分离。分离细菌包括但不限于沙门氏菌各种类的msbB基因的一个说明性的实施例，见下文章节7．1。一个细菌DNA文库可用32P标记的来自大肠杆菌的msbB基因作为探针进行杂交。对杂交克隆进行测定，如果它们含有与已知的大肠杆菌msbB基因相似的DNA序列，它们就是正确的。
6．1．1沙门氏菌msbB的遗传改变
本发明的一个实施方案提供了一种组合物，它是在msbB基因中带有一种遗传改变的细菌菌株。在一个优选实施方案中，该细菌是沙门氏菌。破坏或删除形式的遗传改变可用本领域的技术人员熟知的几种方法来完成，包括使用一种抗生素抗性标记来进行同源重组。这些方法涉及以质粒为基础的克隆的msbB基因的破坏，使用能使部分或全部该基因被破坏或去除的限制内切酶，或使用能使正常的转录和翻译被干扰的限制内切酶，并将一种用于表型筛选的抗生素标记插入到该删除、破坏或其他改变区域。将线性化的DNA转化至沙门氏菌中，进一步检查携带抗生素抗性的细菌来证明遗传改变。检查遗传改变的方法包括PCR分析和Southern印迹。沙门氏菌msbB基因遗传破坏的说明性实施例参见章节7．2。
在本发明的另一个实施例中，msbB-／抗生素抗性标记可被转染进一种新的细菌菌株。章节7．2中提供了一个说明性的实施例。噬菌体P22和一种msbB-沙门氏菌克隆可在一种无盐LB中培养，上清中的新噬菌体可用来感染一种新的沙门氏菌菌株。
本发明的另一个实施方案还提供一种沙门氏菌，它以超过一种的方式被减毒，例如类脂A产生途径中的一种突变如这里介绍的msbB突变，以及一种或多种对一种或多种营养物质或代谢产物的营养缺陷型突变，例如Bochner，1980，J．Bacteriol．143：926-933介绍的尿嘧啶生物合成、嘌呤生物合成和精氨酸生物合成途径的突变，该文献在此引入作为参考。在一个优选实施方案中，msbB沙门氏菌在肿瘤中集聚的能力被具有一种或多种导种营养缺陷型菌株的msbB-沙门氏菌保留。在本发明的该实施方案的一个更优选的模式中，能选择性靶向肿瘤并表达一种药物前体转化酶的细菌载体对尿嘧啶、芳香族氨基酸、异亮氨酸、缬氨酸营养缺陷，并合成一种改变的类脂A。在一个特别优选的实施方案中，msbB-沙门氏菌还含有一种生物合成途径基因purⅠ的遗传修饰，导致与野生型相比该菌株的毒性降低。一个说明性的实施例在章节7和8中提供。
6．1．2带有被破坏msbB的沙门氏菌的特征
这里介绍的msbB-沙门氏菌的一个特征是，诱导一种TNFα应答的能力与野生型细菌载体相比降低。全菌和分离或纯化的脂多糖(LPS)都能引发一种TNFα应答。在本发明的一个实施方案中，与野生型沙门氏菌株相比，msbB-沙门氏菌诱导的TNFα表达为约5％至约40％(用另一种方式表述，msbB-沙门氏菌诱导的TNFα表达为野生型沙门氏菌如WT14028诱导水平的约5％至40％)。在本发明的一个优选实施方案中，msbB-沙门氏菌诱导的TNFα表达是一种野生型沙门氏菌诱导水平的约10％至35％。在本发明的一个实施方案中，来自msbB-沙门氏菌的纯化LPS诱导的TNFα表达水平低于或等于纯化自野生型沙门氏菌的LPS诱导水平的0．001％。全菌或分离或纯化的LPS诱导的TNFα应答可以用商业化的试验系统如用酶联免疫试验(ELISA)在体外或体内进行评估。说明性的实施例见下文章节7．3．1和7．3．2。以每c．f．u．或ug／kg为基础的TNFα产生的比较，被用来确定相对活性。以每单位为基础的TNFα水平较低，说明TNFα诱导量的减少。
毒性降低
这里介绍的msbB-沙门氏菌的另一个特征是，与野生型细菌载体相比，对宿主癌症病人的毒性降低。野生型沙门氏菌在某些情况下显示能引起明显的进行性疾病。使用动物模型可确定正常野生型活沙门氏菌和活msbB-沙门氏菌的急性致死性。一个说明性的实施例见章节7．4和章节9，表Ⅲ。对一种固定接种量的动物存活的比较，被用来确定相对毒性。具有较高存活率的菌株具有降低的毒性。
巨噬细胞中的存活性降低
这里介绍的msbB-沙门氏菌的另一个特征是，与野生型细菌的存活性相比，在巨噬细胞中的存活性降低。野生型沙门氏菌(例如ATCC14028)以它们能在巨噬细胞中存活而著称(Baumler，et al．，1994，Infect．Immun．62：1623-1630；Buchmeier and Heffron 1989，Infect．Immun．57：1-7；Buchmeier and Heffron 1990，Science 248：730-732；Buchmeier et al．，1993，Mol．Microbiol．7：933-936；Fields et al．，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：5189-93；Fields et al．，1989，Science 243：1059-62；Fierer et al．，1993，Infect．Immun．61：5231-5236；Lindgren et al．，1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 3197-4201；Miller et al．，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：5054-5058；Sizemore et al．，1997，Infect．Immun．65：309-312)。
巨噬细胞中生存时间的比较可以使用一种体外细胞培养试验来进行。相对于时间的较低数量的c．f．u．．表明在巨噬细胞中的存活性降低。说明性的实施例见下文章节8。如同那里所显示的，使用庆大霉素为基础的内在化试验和骨髓来源的鼠巨噬细胞或小鼠巨噬细胞系J774，确定了WT 14028和msbB-克隆YS8211的存活性比较。在本发明的一个实施方案中，产生的存活率是野生型菌株的约50％至约30％，优选为约30％至约10％，更优选为约10％至1％。
敏感性增加
这里介绍的msbB-沙门氏菌的一个实施方案的另一个特征是，肿瘤靶向细菌对特殊化学试剂的敏感性增加，这对体内给药后用于协助细菌的去除非常有优势。细菌对广泛的抗生素种类敏感。但是，我们惊奇地发现，本发明所包括的某些沙门氏菌msbB-突变体对通常不被认为是抗菌试剂的特定化合物敏感。具体地说，特定的msbB-沙门氏菌突变体比WT 14028对螯合剂更敏感。
以前对msbB-大肠杆菌的介绍并没有提出对这样的螯合剂的敏感性提高。相反，这样的报告包括对去污剂如脱氧胆酸的抗性增加(Karow and Georgopoulos 1992 J．Bacteriol．174：702-710)。
为确定对化学试剂的敏感性，正常野生型细菌和msbB-细菌在存在或不存在螯合剂如EDTA、EGTA或柠檬酸钠的情况下培养，并对其生长进行比较。生长比较用光密度的函数表示，即msbB-菌株在存在一种试剂时的光密度比该菌在没有试剂时生长的光密度低，就表明其敏感性。而且，在存在一种试剂时，msbB-菌株生长的光密度与msbB+在存在试剂时生长的光密度相比较低，就说明是msbB突变导致敏感性。一个说明性的实施例见下文章节7．7。在本发明的一个实施方案中，在约0．25 mM EDTA至约0．5 mM EDTA时msbB-沙门氏菌的生长发生90％的抑制(与野生型沙门氏菌的生长比较)，优选在约0．25mMEDTA至约0．5mM EDTA时发生99％的抑制，更优选在约0．25mM EDTA至约0．5mM EDTA时发生大于99％的抑制。在相似浓度的EGTA时也观察到了相似范围的生长抑制。
msbB突变体的衍生物
在无盐Luria肉汤(LB)中生长时，本发明的msbB-突变体是稳定的，即产生较少的衍生物(见下文的定义)。msbB-突变体在修改的LB(每升含10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml 1N CaCl2、及2ml1N MgS04，用1N NaOH调至pH7)中连续培养时也维持稳定的突变体。
相反，在普通LB中生长时，msbB-突变体提高衍生物的产生。用于此处，“衍生物”的意思是msbB-突变体的自发性变异体，其特征是与原来的msbB-突变体相比，毒性、肿瘤抑制活性和／或对螯合剂的敏感性的水平不同。与原来的msbB-突变体相比，衍生物的毒性、肿瘤抑制活性和对螯合剂的敏感性的水平可能更高、相同或较低。
msbB-菌株的衍生物在未修改的LB上比原来的msbB-菌株生长更快。此外，衍生物可通过其在MacConkey琼脂(一种含有胆盐的琼脂)上的生长能力和通过它们对螯合剂如EGTA和EDTA的抗性来识别。衍生物可按本领域的技术人员熟知的方法在-70℃冷冻保藏或冻干稳定保藏(Cryz et al．，1990，《新生代疫苗》M．M．Levine(ed．)，MarcelDekker，New York pp．921-932；Adams，1996，《分子医学方法：疫苗规程》，Robinson et al．(eds)，hUMANA Press，New Jersey，pp．167-185；Griffiths，Id．pp．269-288．)。
毒性通过评估造成一半动物死亡的给药剂量(LD50)来确定。衍生物的LD50的比较可用来评价其相对毒性。与其msbB-亲本相比，一种自发衍生物的LD50降低，就说明其毒性增加。在一个说明性的实施例中，生长较快的衍生物可显示与其相应的原始突变菌株相同水平的毒性、更高水平的毒性或较低水平的毒性(见章节9，表Ⅲ)。在另一个实施例中，一种衍生物诱导TNFα的能力与原始突变菌株相同(见章节7．3，图7)。
在一个说明性的实施例中，衍生物可比其相应的原始突变菌株抑制肿瘤生长的能力高或低(见章节7．6，图11)。章节7．6中证明，原来的msbB-突变体---YS8211能明显抑制肿瘤生长，而该克隆的一个衍生物---YS8212具有较低的肿瘤生长抑制活性。相反，与亲本msbB-克隆YS7216相比，衍生物YS1629显示提高的肿瘤生长抑制活性。
如果一种衍生物比其亲本突变体具有更高的毒性，但与野生型相比，诱导较低水平的TNFα，即诱导水平为野生型诱导的约5％至40％，它就可进一步被修饰来含有一种或多种突变成为营养缺陷型。在一个说明性的实施例中，YS1170衍生物被突变来使之成为一种或多种芳香族氨基酸的营养缺陷型如aroA，这样就能减少毒性，并且根据本发明将更加有用。在另一个说明性的实施例中，purⅠ基因(参与嘌呤生物合成)的遗传修饰产生了比亲本菌株毒性低的沙门氏菌株(见章节7和8)。
在本发明的方法中使用一种衍生物之前，应对衍生物进行评价，确定其毒性、诱导TNFα的能力、抑制肿瘤生长的能力和对螯合剂的敏感性。6．2将带有被破坏的msbB的沙门氏菌用于肿瘤靶向和体内治疗实体瘤
根据本发明，msbB-突变体沙门氏菌优选应用于在一种动物包括患有实体瘤癌症的病人中产生肿瘤生长抑制应答或减小肿瘤体积的方法。为进行此类应用，msbB-突变体沙门氏菌优选具有肿瘤靶向能力或优选针对肿瘤细胞／组织而不是正常细胞／组织。此外，msbB-突变体沙门氏菌优选具有抑制或减少肿瘤生长的能力，和／或具有传递一种能抑制或减少肿瘤生长的基因或基因产物的能力。肿瘤靶向能力可用多种本领域的技术人员熟知的方法进行评价，包括但不限于癌症动物模型。
例如，使用B16F10黑素瘤皮下动物模型，对带有一种msbB-修饰的沙门氏菌进行了分析，以确定它们是否具有肿瘤靶向能力。肿瘤对肝脏的阳性比例表明，遗传修饰的沙门氏菌具有肿瘤靶向能力。一个说明性的实施例见章节7．5。
使用多种标准的体内模型中的任何一种，例如B16F10黑素瘤皮下动物模型，可对带有msbB-修饰的沙门氏菌进行分析，以确定它们是否具有抗肿瘤活性。在一个说明性而不是限制性的实施例中，肿瘤被移植到小鼠的体侧，并生长至第8天，然后用细菌菌株经腹膜内进行注射。监测肿瘤体积随时间的变化。如果肿瘤在细菌携带组中比在未处理的肿瘤携带动物中小，就确定抗肿瘤活性存在。一个说明性的实施例见下文章节7．6。
用于体内治疗的本发明的沙门氏菌进行了遗传修饰，使之在对一种宿主给药时，细菌对宿主具有较低毒性，并且容易从宿主系统中清除。这种沙门氏菌是超感染的、减毒的、和对一种肿瘤靶细胞具有特异性。在一个更优选的实施方案中，这种沙门氏菌可对具有抗生素样活性的螯合剂具有敏感性。
此外，用于本发明的方法的沙门氏菌能编码“自杀基因”，例如药物前体转化酶或其他基因，这些基因由沙门氏菌在靶肿瘤中或附近表达和分泌。Pawelek等的WO96／40238在34-45页的表2中提供了一个药物前体转化酶的说明性的名单，这些酶可由沙门氏菌msbB-突变体分泌或表达来用于本发明的方法。表2和35-43页在此引入作为参考。这种基因可处于组成型、诱导型或细胞种类特异型启动子的控制之下。其他对本发明的方法中有用的突变沙门氏菌有用的启动子等，见Pawelek等的35-43页，该文在此引入作为参考。在一个优选的实施方案中，一种自杀基因仅在沙门氏菌已经侵入靶肿瘤细胞的胞质后才被表达和分泌，由于自杀基因在肿瘤位置表达，因而使产生的效应局限。
在一个优选的实施方案中，给予宿主的沙门氏菌能表达HSV TK基因。当同时进行TK基因的表达和将9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤给予宿主时，9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤在微生物的周质中磷酸化，微生物的周质对核苷酸三磷酸来说可以自由地通过。磷酸化的9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤是一种有毒的错误DNA前体，它易于从微生物的周质中穿过，并进入宿主的细胞质和核，在那里它整合进宿主细胞DNA，因而导致宿主细胞的死亡。
本发明的抑制一种实体瘤生长或减小其体积的方法包括，给予一个患有一种实体瘤的病人有效剂量的一种分离的突变沙门氏菌，该菌含有一个遗传修饰的msbB基因，所说的突变体在体内给药时能靶向实体瘤。该msbB-突变沙门氏菌还可表达一种如上面介绍的自杀基因。
此外，在一个实施方案中，分析了分离的沙门氏菌对螯合剂的敏感性，以确保在成功治疗后或如果病人由于给予该分离沙门氏菌而产生并发症时，容易从病人的机体中清除该沙门氏菌。这样，如果使用的沙门氏菌对一种螯合剂敏感，在抗肿瘤效果达到后，就可给予约0．25mM至1．0mM的螯合剂如EGTA、EDTA或柠檬酸钠来帮助清除沙门氏菌。
在对一个患者进行给药时，例如对一种动物进行兽医方面的应用或对人进行临床方面的应用时，沙门氏菌突变体可单独使用，或与任何生理载剂如水、一种含水溶液、常规盐水或其他生理上可接受的赋形剂一起组合使用。在通常情况下，剂量范围为约1．0 c．f．u．／kg至约1×1010c．f．u．／kg；可选用的范围有：约1．0 c．f．u．／kg至约1×108c．f．u．／kg；约1×102c．f．u．／kg至约1×108c．f．u．／kg；约1×104c．f．u．／kg至约1x108c．f．u．／kg。
本发明的沙门氏菌突变体可通过多种途径进行给药，包括但不限于：口、局部、注射(包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、肿瘤内即直接注射进肿瘤)等。
下面的实施例系列是说明性的，而不是为了限制本发明的范围。7．实施例：通过对沙门氏菌msbB基因的破坏，引起毒性丧失、TNFα
刺激减少、以及对螯合剂的敏感性增加
7．1沙门氏菌msbB基因的分离及组成
首先构建一个沙门氏菌的基因组DNA文库。将野生型鼠伤寒沙门氏菌(ATCC菌株14028)培养过夜，按Sambrook等的方法(MolecularCloning：A Laboratory Manual 2nd．，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，1989)提取基因组DNA。使用Sau3A的时间限制酶切，制备范围为2至10kb的限制性内切酶消化片段，并用琼脂糖凝胶电泳进行选择。将这些片段连接进pBluescript SK-，并转化进大肠杆菌DH5α。对克隆进行随机分析显示，DNA插入≥87％，平均大小为5．1kb。文库由1．4×104独立克隆组成。为减少大肠杆菌来源的msbB探针与大肠杆菌中100％同源的染色体基因杂交，按下述方法从培养皿中收集整个文库：使用磷酸缓冲盐溶液洗涤，并用一个玻棒取出克隆，对所获得的细菌群体进行大量质粒制备，产生一个扩增的沙门氏菌文库质粒混合物。然后将此质粒混合物转化进沙门氏菌LT2YS5010，这样就可消除大肠杆菌背景。
一种针对msbB同源物的探针用一个大肠杆菌msbB基因的克隆来制备(Karow and Georgopoulos 1992 J．Bacteriol．174：702-710)：用BglⅡ／HincⅡ消化大肠杆菌，并分离对应于一个编码序列部分的600bp片段。该片段用α32P-CTP标记，并在低严谨条件下用作探针与沙门氏菌文库杂交，这种低严紧条件为6X SSC、0．1％ SDS、2X Denhardts、0．5％脱脂奶粉、55℃过夜。将显示强杂交性的克隆纯化，提取质粒，并进行限制酶切和在用于菌落杂交的相同条件下进行原位凝胶杂交(Ehtesham and Hasnain 1991 BioTechniques 11：718-721)。进一步的限制酶消化显示了一个能与探针强杂交的1．5kb片段的DNA，使用荧光染料终止热循环测序仪在耶鲁大学BoyerCenter对该DNA片段进行了测序。序列分析显示，该1．5kb片段含有一个msbB同源物，这个同源片段明显缺少对应的大肠杆菌基因的起始甲硫氨酸。使用EcoRⅠ／XbaⅠ限制酶切并与文库再次杂交，制备了一个含有该克隆的5’区域的探针。沙门氏菌msbB基因的全部核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)见图1。该可能的沙门氏菌msbB与大肠杆菌msbB的DNA同源性为75％。蛋白同源性是98％，这证明该克隆沙门氏菌基因是一种真正的msbB。
7．2沙门氏菌msbB的遗传改变
使用克隆的沙门氏菌msbB基因构建了一个敲除结构物。用SphⅠ和MluⅠ酶切该克隆基因，从而切除大约一半的msbB编码序列，将用AatⅡ和AvaⅠ从pBR322中切下的四环素抗性基因，在用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平末端化后，插入其中(图2A-2C)。敲除破坏用同源重组方法来完成(Russell et al．，1989，J．Bacteriol．171：2609)；用SacⅠ和KpnⅠ将该结构物线性化，凝胶纯化，并用电转化转染至沙门氏菌LT2 YS501。来自转化过程的细菌首先在四环素平板上进行选择，接着用氨苄青霉素抗性来检查是否有携带质粒的非染色体整合的污染物，并用标准的质粒小量制备方法检查是否有质粒存在(Titus，D．E．ed．Promega Protocols and Applications Guide，Promega Corp，1991)。对具有四环素抗性但没有质粒的细菌克隆随后进行以PCR为基础的分析，分析它们的msbB基因的结构。PCR所用的引物能产生一段包括四环素基因插入的片段，其中上游引物为GTTGACTGGGAAGGTCTGGAG(SEQ ID NO：3)，它对应于碱基586-606，下游引物为CTGACCGCGCTCTATCGCGG(SEQ ID NO：4)，它对应于碱基1465-1485。野生型沙门氏菌msbB+产生一种约900碱基对的产物，而具有四环素插入的破坏的基因产生大约1850碱基对的产物。获得了数个只产生较大PCR产物的克隆，这说明msbB基因的破坏已经发生。
Southern印迹分析被用来证明沙门氏菌msbB的染色体拷贝遭到破坏。将以质粒为基础的敲除结构物(K0)与由野生型和可能的破坏msbB克隆YS82、YS86、YS8211和YS861制备的基因组DNA进行比较。将DNA用AseⅠ／BamHⅠ双酶切，用琼脂糖凝胶电泳在0．9％或1．2％的琼脂糖上分离。YS821和YS861的结果示于图3A-3C。相似的凝胶按三个独立的标准进行比较：3A)以32P标记的四环素基因片段为探针时，四环素基因的存在；3B)以来自克隆的msbB的32P标记的AseⅠ／BamHⅠ片段为探针时的限制酶切片段的长度；3C)为破坏msbB基因而去除的msbB mluⅠ片段及插入的四环素基因的存在或无(图3A-3C)。因为为了破坏msbB基因和插入四环素基因，mluⅠ片段已被去除，因此我们预计该探针将与野生型杂交(图3C，泳道2WT)，但不与敲除结构物(泳道1 K0)或克隆(泳道3和4，YS8211和YS821)杂交，从而证明msbB基因的遗传改变。每个被检测的克隆都显示所有预期的msbB基因被删除(敲除)的标准。这些数据进一步证明，msbB以一个单拷贝存在于野生型沙门氏菌中，因为在用一个标记的来自克隆的DNA的寡核苷酸为探针时，没有观察到其他杂交带。
在证明了msbB突变之后，制备了含有msbB-突变的其他菌株。使用的沙门氏菌株包括WT14028和YS72(来自WT14028的pur- xyl-高侵袭性突变体；Pawelek等，WO96／40238)。P22转导被用来以YS82为供体产生YS8211(msbB：：tet)和以YS86为供体产生YS861和YS862(msbB1：：tet)；它们均以WT14028为受体。通过转导以YS82为供体制备了YS7216(来自YS72的msbB1：tet)。本发明包括数种衍生物，包括但不限于YS8211(YS8212、YS1170)、YS862(YS8644、YS8658)和YS7216(YS1601、YS1604、YS1629)的衍生物。在一个优选实施方案中，自发性的衍生物在Luria琼脂上比WT 14028或由转导产生的msbB-克隆生长得快一些。msbB+菌株在LB肉汤或含有1．5％琼脂的LB平板上在37℃培养。msbB-菌株在每升含有10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml 1N CaCl2和2ml 1N MgSO4用1N NaOH调至pH7的修改的LB中培养。为转导msbBl：：tet，使用了含有4mg／L四环素的无NaCl的LB。液体培养物以225rpm振荡培养。为进行肿瘤靶向试验，细胞在LB中按1∶100稀释，生长至OD600=0．8至1．0，在磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤，并重悬于PBS。7．2．1一种通过蔗糖预选择来选择msbB遗传改变的改进方法
我们发现了一种通过蔗糖预选择来选择msbB遗传改变的改进方法。这种预选择方法以选择保留了sacB基因的克隆为基础。sacB基因负责将蔗糖转化为一种有毒的化学物质---果聚糖，而果聚糖对宿主细胞具有致死作用，因此可以用来选择重组子。只有那些sacB基因被删除的菌株才能在含有蔗糖的培养基中存活，并因此含有蔗糖抗性特性sucr。如下文所述，预选择保留了sacB基因的克隆，能省去常规蔗糖选择中稀释和比较蔗糖(+)和蔗糖(-)的必要。
蔗糖酶系统的常规选择过程：
使用大肠杆菌SM10λpir作为一种供体，该菌携带了一种含有msbB(△)bla和sacB基因的质粒。编码β-内酰胺酶的bla基因提供对氨苄青霉素的抗性。在常规选择过程中，使用常规杂交技术将供体菌株与一种沙门氏菌株杂交，以将含有msbB(△)bla sacB的质粒导入后者。因为沙门氏菌株含有第二个抗生素抗性标记(如链霉素抗性)，因此接着可以用氨苄青霉素和链霉素对重组沙门氏菌克隆进行双抗性选择。为检测单个克隆的消除，将每个克隆的稀释物涂布于缺少蔗糖的LB或含有5％蔗糖的LB。只有那些sacB基因被删除或改变的菌株才能在蔗糖上存活。蔗糖(+)或蔗糖(-)平板上的克隆数目的比较，表明了消除的细菌细胞的比例。接着进一步检测蔗糖抗性克隆对氨苄青霉素和四环素的敏感性。Tets和amps表明在部分msbB基因区域交换时sacB和bla基因被切除。然后用PCR证明msbB同种型在tetsamps克隆中存在。
用于蔗糖酶系统的预选择方法
常规蔗糖酶过程中的一种改变允许通过预选择保留了sacB基因的克隆来筛选更多数量的克隆。这种预选择省去了在大数量的克隆中检测和比较蔗糖(+)和蔗糖(-)的必要。在上面介绍的结合程序后，将克隆(此阶段不纯)直接铺于含有5％蔗糖的LB平板，并在30℃培养。所获得的不纯的克隆继续生长，而蔗糖上的存活者增加。从蔗糖抗性菌落中寻找那些显示一种“模糊”边缘的形态变异菌落，然后将它们稀释并铺于蔗糖(+)或蔗糖(-)平板。然后按上面的介绍检测菌落对四环素和氨苄青霉素的敏感性，并用PCR证实msbB同种型。这种改进方法被用来制备菌株，用于msbB(△)bla sacB染色体元件的P22转导。然后这些菌株被用来制备YS1456和YS1646菌株，它们代表了本发明的新型msbB突变体的优选实施方案(见图15和16)。
7．3沙门氏菌msbB的破坏减少TNFα的诱导
7．3．1小鼠中的TNFα诱导
WT14028和msbB-克隆YS8211首先在LB培养基中在37℃在225rpm振荡培养至饱和。然后将这些细菌菌株按1∶100稀释，转移至新鲜LB中，在37℃在225rpm振荡培养至OD600=1．0。将细菌在磷酸缓冲盐中稀释，并用1．0×108c．f．u．(约5×109／kg)注射进Balb／c小鼠的尾静脉中(n=4／菌株)，以PBS作为阴性对照。1．5小时后，用心脏穿刺收集三个重复的血清样品，离心去除细胞内含物，使用Biosource International Cytoscreen ELISA平板分析TNFα，用Molecular Devices Emax微量板读数仪读数。
结果示于图4，并以野生型沙门氏菌诱导的TNFα水平的百分比的形式表示。
如图4中所证明的，YS8211诱导的TNFα明显少于WT14028。因此，如图4所示，msbB-菌株诱导的TNFα为野生型msbB+菌株诱导水平的约33％(即低3倍)。
7．3．2在猪中的TNFα诱导
一种msbB-沙门氏菌株---YS8212和WT14028首先在LB培养基中在37℃在225rpm振荡培养至饱和。然后将这些细菌菌株按1∶1000稀释，转移至新鲜LB中，在37℃在225rpm振荡培养至OD600=0．8。细菌用磷酸缓冲盐洗涤，并用1．0×109c．f．u．(约1×108／kg)注射进Sinclair猪的耳静脉中(n=6／菌株)。1．5和6．0小时后，收集血清，离心去除细胞内含物，冷冻以备后面的分析。使用Genzyme PredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度计读数。
结果示于图5，以每毫升血清的TNFα皮克数表示。
如图5中所证明的，在第90分钟，msbB-菌株诱导的TNFα水平明显低于沙门氏菌WT14028。
7．3．3沙门氏菌LPS在猪中诱导的呼吸作用
来自沙门氏菌WT14028和msbB-克隆---YS8212的脂多糖(LPS)按Galanos等介绍的程序制备(1969，Eur．J．Biochem．9：245-249)。简而言之，LPS从已经生长到OD600为1．0的细菌中提取。离心沉淀细菌，用蒸馏水洗涤两次，并在-20℃冷冻。在70℃在振荡水浴锅中使用18．3ml H2O∶15ml酚的混合物抽提来纯化LPS。将混合物在冰上冷却，在20，000xg离心15分钟，取出水相。加入NaCl至0．05M和2倍体积的乙醇，并在冰上温育，然后用2000xg离心10分钟，使LPS从水相中沉淀。将沉淀在0．05M NaCl中重新溶解后，再次沉淀，并将沉淀冷冻干燥。将LPS溶于无菌蒸馏水中，按5ug／kg或500ug／kg LPS注射进用异氟烷麻醉的Sinclair猪的耳静脉中。1．5和6．0小时后，测定和记录呼吸速率。
结果示于图6，并以在0时间时的呼吸的百分比来表示。
如图6所证明的，与接受来自msbB-菌株的LPS的猪相比，接受野生型LPS的猪的呼吸明显要高。因此，沙门氏菌中msbB基因的破坏在类脂A中产生了修饰，这导致其提高呼吸的能力降低。
7．3．4在人单核细胞中的TNFα诱导
人单核细胞用离心通过Isolymph(Pharmacia)的方法从外周血中制备，并使之粘附于含有RPMI1640的24孔板中。沙门氏菌WT14028和几种msbB-14028菌株YS8211、YS8212、YS8658和YS1170首先在LB培养基中在37℃在225rpm振荡培养至饱和。然后将这些细菌菌株按1∶100稀释，转移至新鲜LB中，在37℃在225rpm振荡培养至OD600=0．8。将细菌加入细胞培养孔中，2，0小时后收集培养物，离心去除细胞内容物，。使用Genzyme Predicta ELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度计读数。
结果示于图7，并以每毫升血清的TNFα皮克数表示。
如图7中所证明的，msbB-菌株诱导的TNFα明显少于野生型菌株。
7．3．5沙门氏菌msbB-LPS在人单核细胞中的TNFα的诱导人单核细胞用离心通过Isolymph(Pharmacia)的方法从外周血中制备，并使之粘附于含有RPMI1640的24孔板中。野生型和多种msbB-突变的沙门氏菌(即YS8211、YS8212、YS8658和YS1170)的脂多糖(LPS)按Galanos等介绍的程序制备(1969，Eur．J．Biochem．9：245-249)(简要介绍见章节7．3．3)。将LPS溶于蒸馏水，将数量范围为0．001至100ng／ml的LPS加入细胞培养孔中。15小时后收集培养基，离心去除细胞内容物，使用Genzyme Predicta ELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度计读数。
结果示于图8，并以每毫升TNFα的皮克数表示。
如图8中所证明的，纯化自msbB-菌株的LPS诱导的TNFα明显少于来自野生型菌株的LPS。
7．4沙门氏菌msbB的破坏降低毒性
7．4．1在小鼠中
野生型沙门氏菌14028及其msbB-沙门氏菌克隆YS862在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。按1∶10的比例将细菌在磷酸缓冲盐(PBS)中稀释，并用2×107c．f．u．皮下注射进携带B16F10黑素瘤的C57BL小鼠中，每天或间隔2至4天检查存活。
结果示于图9A，并以存活百分比的形式表示。
如图9A中所示，WT14028在4天内杀死所有的小鼠，而msbB突变株经过20天后有90％小鼠存活，这证明msbB-突变株的毒性明显降低。
7．4．2在猪中
野生型沙门氏菌14028及其msbB-沙门氏菌克隆YS8212在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。细菌用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤，并用1．0×109c．f．u．注射进Sinclair猪的耳静脉中(n=4／菌株)，每天或间隔2至4天检查存活。
结果示于图9B，并以存活百分比的形式表示。
如图9B中所示，WT14028在3天内杀死所有的猪，而msbB-突变株经过20天后有100％小鼠存活，这证明毒性明显降低。
7．5 msbB-克隆的肿瘤靶向性
使用B16F10黑素瘤皮下动物模型，对带有msbB-修饰的沙门氏菌WTl4028进行分析，以确定它们是否具有肿瘤靶向能力。msbB-克隆YS8211在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。按每份2．0×106c．f．u．经静脉注射进C57BL／6小鼠中，这些小鼠在细菌感染前16天预先用2×105B16黑素瘤细胞进行了移植。在细菌感染后2天和5天，处死小鼠，通过匀浆和系列稀释涂平板来分析肿瘤和肝脏中细菌的存在。
结果示于图10，并以c．f．u．细菌／克组织的方式表示。如图10中所证明的，在第2天发现肿瘤对肝脏的一个阳性比例(700∶1)，在第5天提高到2000∶1的阳性比例。因此，msbB-突变株保持了靶向实体癌瘤的能力。
7．6带有破坏的msbB的沙门氏菌用于体内抗肿瘤活性
鼠伤寒沙门氏菌msbB-克隆YS8211、YS8212、YS7216和YS1629以及WT14028(对照)在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。按每份2．0×106c．f．u．腹膜内注射进C57BL／6小鼠中，这些小鼠在细菌感染前8天预先用2×105B16黑素瘤细胞进行了移植。检测不同时间的肿瘤体积。
结果示于图11。两种菌株---YS8211和YS1629显示明显的肿瘤萎缩，即肿瘤生长抑制。
7．7对螯合剂的敏感性提高
为分析细菌菌株对螯合剂的敏感性，将带有或没有msbB突变的细菌在存在或没有1mM EDTA或10mM柠檬酸钠的无氯化钠LuriaBroth(LB)中培养。每种菌株的过夜培养物按1∶100在新鲜培养基中稀释，并在37℃在250rpm振荡培养。对生长的影响用分光光度计在OD600读数来确定。
WT14028和msbB-克隆YS8211在存在或没有1mM EDTA时培养(图12A)。EDTA不抑制WT14028的生长。相反，msbB-克隆在EDTA存在3小时后，生长近似于完全停止。
WT14028和msbB-克隆YS862在存在或没有10mM柠檬酸钠时培养(图12B)。与msbB-相比，msbB+WT14028菌株显示几乎不被柠檬酸钠抑制，msbB-在存在柠檬酸钠3小时后显示生长几乎完全停止。
因此，msbB-沙门氏菌突变株显示对螯合剂敏感，这可促进细菌的清除，是一种类似抗生素效果的特征。预期这种特征对使用msbB-沙门氏菌突变株进行体内治疗是有利的。
为进一步分析沙门氏菌菌株对螯合剂的敏感性，将超侵袭性pur菌株YS72、其msbB-菌株YS7216以及YS7216的一个衍生物---YS1629在存在浓度不断提高的EDTA时培养。将YS72、其msbB-菌株YS7216和其快速生长衍生物YS1629的新鲜培养物在含有0、0．25、0．5、1．0或2．0mM EDTA的新鲜无盐LB培养基中按1∶100稀释，37℃在225rpm振荡培养4小时，通过在LB平板上系列稀释涂布确定c．f．u．(表Ⅰ)。msbB-菌株YS7216在EDTA浓度大于0．25mM时获得大于99％的抑制，其衍生物YS1629在浓度0．50 mM时获得大于90％的抑制，在浓度2．0mM时获得大于99％的抑制。相反，虽然YS72克隆对EDTA显示一些敏感性，但即使在2．0mM时也没有90％水平的抑制。
表Ⅰ
菌株   无EDTA的                            c．f．u．+EDTA(％抑制)
    c．f．u． [0．25 mM] [0．5 mM] [1．0 mM] [2．0 mM]
YS72 3．0×109   2．4×109{20％}  1．5×109{50％} 7．3×108{75％}  4．8×108{84％}
YS7216  6．3×109     2．1×106{99．6％} 1．1×106{99．8％} 3．2x106{99．4％} 4．3×106(99．3％}
YS1629  1．3×109 6．0×108{54％} 1．0×108{92％} 2．9×107{97％} 7．5×106{99．4％}
7．8细菌在巨噬细胞中的存活
为确定msbB-沙门氏菌对巨噬细胞的敏感性，使用了两种类型的巨噬细胞：(A)获自C57BL／6小鼠的股骨和胫骨的骨髓来源的巨噬细胞，这种细胞在加入来自LADMAC细胞系的培养上清时能够繁殖，因为LADMAC细胞能分泌巨噬细胞集落刺激因子(Sklar et al．，1985．J．Cell．Physiol．125：403-412)；和(B)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的J774细胞(一种鼠巨噬细胞系)。所使用的沙门氏菌株是WT14028及其msbB-衍生物YS8211和YS1170。细菌培养至对数生长后期OD600=0．8，在一个24孔培养皿中，用1×106细菌感染哺乳动物细胞汇合层30分钟，然后用培养基洗涤并加入50ug／ml庆大霉素，以除去细胞外细菌(Elsinghorst，1994，Methods Enzymol．236：405-420)。用0．01％脱氧胆酸取出细胞层，并系列稀释涂平板，记录细菌数目，并以最初时间的c．f．u．的百分数形式表示。
结果示于表13，并以相对于时间的c．f．u．百分数形式表示。msbB-菌株显示在巨噬细胞中的存活明显较低。
7．9 msbB衍生物的LD50
msbB-菌株的自发衍生物YS8211和YS7216按照生长速度提高的特征从没有修改的LB培养基上的体外培养物中选择。将这些细菌培养至OD600为0．8，用c．f．u范围为1×102至1×108的细菌注射进C57BL／6小鼠的尾静脉中。在第3天测定急性致死活性，按Welkos和O'Brien介绍的方法(Methods in Enzymology 235：29-39，1994)确定LD50。结果示于表Ⅱ。因此，虽然所有的msbB-菌株诱导TNFα的能力都降低(见章节7．3．5)，但结果证明，菌株YS1170明显比其他msbB-菌株的毒性低，因此不是所有的msbB-菌株都能用来同时提供TNFα诱导减少和毒性降低。
表Ⅱ菌株      LD50WT 14028  1×103YS8211    4×106YS8212    3．9×107YS1629    1×107YS1170    1×107
8．msbB突变组合一种生物合成途径突变
为了评价营养缺陷型突变的兼容性(这可通过测量靶向肿瘤和在肿瘤中复制能力的保留来进行)，制备msbB突变与营养缺陷型突变的组合。msbB+菌株在LB肉汤或含有1．5％琼脂的LB平板上在37℃培养。msbB-菌株在每升含10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml 1N CaCl2、及2ml 1N MgSO4、用1N NaOH调至pH7的修改的LB中培养。为进行msbB1：：tet转导，使用无NaCl的LB，并加入4mg／l的四环素。液体培养物用225rpm振荡培养。将msbBl：：tet转导进营养缺陷型菌株，以产生YS1604(msbB-、pur-、超侵袭性)、YS7232(msbB-、purI-、超侵袭性)、YS7244(msbB-、purI-、aroA-、超侵袭性)、YS1482(msbB-、purI-、purA-)。为进行肿瘤靶向实验，细胞在LB中1∶100稀释，培养至OD600=0．8至1．0，在磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤，重悬于PBS，并用2×106注射进C57BL／6小鼠的尾静脉中。在第7天，切下肿瘤，进行称量，并匀浆化，将其系列稀释后涂于如上介绍的修改的LB平板，确定c．f．u．。
结果示于表Ⅲ，并以c．f．u．／克肿瘤组织的形式表示。一些菌株---YS8211、YS1604和YS7232在肿瘤中显示高水平的c．f．u．，而YS7244和YS1482则低约500至5000倍。
表Ⅲ
菌株 遗传标记 c．f．u．／克肿瘤组织
YS8211 msbB- 3×109
YS1604  msbB-、pur-、超侵袭性 9×109
YS7232  msbB-、purⅠ-、超侵袭性 9×109
YS7244  msbB-、purⅠ-、aroA-、超侵袭性 5×105
YS1482  msbB、purⅠ-、purA- 6×106
8．1在msbB和purⅠ中含有删除的YS1456菌株的制备从野生型鼠伤寒沙门氏菌中制备沙门氏菌株YS1456的过程概述于图15。用能提供四环素抗性的purⅠ1757：：Tn10转导野生型鼠伤寒沙门氏菌，产生了菌株YS1451。
然后对YS1451菌株进行Bochner选择，以获得四环素敏感的菌株，并导入tets基因和导入一个purⅠ删除(Bochner et al．，1980，J．Bacteriol．143：926-933)，从而产生菌株YS1452。菌株1452为tets和purⅠ-。然后以菌株YS8211(msbB：：tet)为供体，通过P22用msbBl：：tet转导菌株YS1452。所获得的菌株YS1453开始时对10mM乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)敏感，接着自发转变为一种EGTA抗性表型。一种这样的转变菌株---表示为YS1454，通过将YS1453在EGTA(在Luria琼脂中2mM)上铺板进行选择。
然后用msbB2(△)bla sacB染色体元件转导菌株YS1454，以选择氨苄青霉素抗性。这个转导过程引入了表示为msbB2(△)的第二个版本的破坏msbB基因以及bla和sacB基因。bla基因负责β-内酰胺酶的转录，β-内酰胺酶能代谢氨苄青霉素，并被用于选择氨苄青霉素抗性的转导子。sacB基因负责将蔗糖转化为一种有毒的化合物---果聚糖，而果聚糖对宿主细胞具有致死作用，它可随后用于选择失去sacB或在sacB中有突变的重组子(见章节7．2．1的使用蔗糖的改进的预选择方法)。bla和sacB基因的存在允许对ampr和sucs菌株(表示为菌株YS1455)进行选择，后者同时含有msbBl：：tet和msbB2(△)基因。
然后将菌株YS1455铺于Luria Bertani(LB)蔗糖，以选择sucrampstets衍生物，来去除msbBl：：tet，并保留抗生素活性。该衍生物表示为YS1456。
总的来说，YS1456在purⅠ和msbB中带有删除突变。它还是tetsamps和EGTAr。
8．2在msbB和purⅠ中含有删除的YS1646菌株的制备
从野生型鼠伤寒沙门氏菌(野生型菌株ATCC14028)中制备沙门氏菌株YS1456的过程概述于图15。野生型鼠伤寒沙门氏菌用亚硝基胍和紫外线(UV)诱变，并选择在黑素瘤细胞中有超侵袭性的菌株。抗性菌株表示为YS72，它被证实具有肿瘤超侵袭性、pur-和xyl-特性(Pawelek et al．，1997，Cancer Res 57：4537-4544)。
为了用一个purⅠ删除在菌株YS72中置换染色体purⅠ基因，用purⅠ1757：：Tn10基因转导菌株YS72，purⅠ1757：：Tn10基因能提供四环素抗性。purⅠ1757：：Tn10基因的供体是沙门氏菌株TT11(purⅠ1757：：Tn10)。原始供体菌株获自沙门氏菌遗传保藏中心(Dept．of Biological Science，Univ．Calgary，Calgary，Alberta，Canada T2N 1N4)。转导用噬菌体P22(突变体HT105／1 int-201)进行。在四环素上选择后获得了转导子，表示为YS1641。
然后对YS1641菌株进行Bochner选择，以去除四环素基因，并引入一个purⅠ删除(Bochner et al．，1980，J．Bacteriol．143：926-933)，从而产生菌株YS1642。菌株1642为tets和purⅠ-。选择的tet-删除菌株可进一步用tet基因转导进行遗传修饰(如msbB基因破坏，见下一段)。由于purⅠ(△)，因此菌株YS1642对嘌呤有严格的要求，并且所显示的转变为purⅠ+的频率低于每1010细胞中1个。
然后以菌株YS8211(msbB：：tet)为供体，通过P22用msbB1：：tet转导菌株YS1642。msbB基因的DNA序列示于图1。msbB1：：tet中的tet基因提供对5mg／L四环素的抗性。这样获得的菌株为YS1643。
菌株YS1643开始时对10mM乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)敏感，它可自发转变为一种EGTA抗性表型。一种这样的转变菌株---表示为YS1644，通过将YS1643在EGTA(在Luria琼脂中2mM)上铺板进行选择。
然后用msbB2(△)bla sacB染色体元件转导菌株YS1644。这个转导过程引入了表示为msbB2(△)的第二个版本的破坏msbB基因以及bla和sacB基因。bla基因负责β-内酰胺酶的转录，β-内酰胺酶能代谢氨苄青霉素，并被用于选择转导子。sacB基因负责将蔗糖转化为一种有毒的化合物---果聚糖，而果聚糖对宿主细胞具有致死作用，该基因可用来选择重组子。bla和sacB基因的存在允许对ampr和sucs菌株(表示为菌株YS1645)进行选择，后者同时含有msbBl：：tet和msbB2(△)基因。
将菌株YS1645铺于Luria Bertani(LB)蔗糖，以选择sucrampstets衍生物，来去除msbB：：tet，并保留抗生素活性(即一个带有msbBl：：tet bla sacB删除的衍生物)。该衍生物表示为YS1646。
总的来说，YS1646在purⅠ和msbB中带有删除突变。它还是tets、amps和EGTAr。
8．3用YS1646菌株抑制肿瘤生长
静脉(Ⅳ)给予一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒株---YS1646，可产生在肿瘤中的选择性繁殖，并伴随着肿瘤生长的抑制(见图17和表Ⅳ)。
在所有情况下，使用一种阶段性的肿瘤模型，其中在肿瘤细胞接种后和YS1646给药前，使肿瘤建立。YS1646在肿瘤中繁殖的能力的一个结果是，确定了一个在有效剂量范围内的简单剂量应答关系，其中由低剂量的YS1646引起的肿瘤抑制的程度接近较高剂量产生的肿瘤抑制水平。这说明，即使在低剂量时也可以达到明显的临床效果，只要细菌能够到达肿瘤并在肿瘤中积累。低于1×102的剂量给出了不一致的结果，这可能是由于YS1646到达和在肿瘤中定居的能力与动物清除YS1646的能力之间竞争而引起的。
YS1646的效果在预先移植了B16-F10黑素瘤的小鼠中进行了评价。在此研究中，一个单一Ⅳ剂量的YS1646在104、105或106c．f．u．／鼠时，与对照处理相比，能明显减小肿瘤体积，并且肿瘤大小减小的程度是剂量依赖型。用最高剂量的YS1646观察到的效果优于使用阳性对照CYTOXANTM(也称为环磷酰胺)的效果，而中等剂量的YS1646的效果与CYTOXANTM相当。应当注意，YS1646产生的效果是由一个单独的Ⅳ剂量诱导的，而CYTOXANTM诱导的效果是由多次Ⅳ剂量产生的(每周给药，共3周)。在1×104至1×106c．f．u．／鼠的给药剂量范围内，对相对于剂量的YS1646抑制肿瘤生长的能力进行了检测。每个剂量组包括10只荷瘤动物，这些动物在用细菌给药前随机分组。在第7天用细菌对小鼠进行给药，并在第10、13、17、20和24天测量肿瘤的体积。为进行比较，用CYTOXANTM(环磷酰胺)按一个剂量200mg／kg每周一次进行给药，也在第7天开始给药。在第24天每组的平均肿瘤体积示于表Ⅳ。
表Ⅳ
接种剂量(cfu／鼠) 平均肿瘤体积(mm3)±S．D．     T／C 抑制百分比
    0  4728±804     0
    104 1011±375     0．214     78
    105     560±176     0．118     88
    106     279±91     0．059     94
在用Wilcoxon符号秩检验分析或用双侧t检验进行分析时，在各组之间观察到的差异都被认为是明显的。如表Ⅳ所示，在YS1646剂量增加时，能观察到肿瘤抑制增强。按照Drug Evaluation Branch0f the Division of Cancer Treatment，National Cancer Institute(Bethesda，MD)(Vendett，J．M．，Preclinical drug evaluation：rationale and methods，Semin．Oncol．8：349-361；1981)的定义，所有的剂量都被发现有明显的肿瘤抑制活性(T／C比平均小至42％)。并且1×105 cfu／鼠的剂量所给出的结果相当于或优于环磷酰胺。在YS1646剂量与肿瘤抑制之间没有观察到一个线性关系，因为YS1646具有优先在肿瘤中的能力，这导致在低剂量时比预期的能力强。经静脉注射一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒菌株---YS1646，导致在肿瘤中的选择性繁殖，并伴随着肿瘤生长的抑制。当接种剂量在1×104至1×106cfu／鼠之间时，能够得到一个肿瘤生长抑制的剂量应答，其肿瘤生长抑制的范围是78％至94％。在两个最高接种剂量时，肿瘤生长抑制的水平相当于或优于环磷酰胺最佳处理时达到的水平。
8．4毒性
在剂量为1×106cfu／鼠时，YS1646没有引起致死性，这与其亲本野生型菌株ATCC14028相对，后者在1×102cfu／鼠的剂量时，导致100％的死亡。这说明YS1646的毒性比亲本野生型菌株低10，000倍。在剂量为104至106cfu／鼠时就能观察到抗肿瘤效应，而直到剂量＞106cfu／鼠时也没有观察到致死性。导致死亡的剂量比诱导抗肿瘤效应的剂量高1至100倍(见图18)。
8．5致死感染后YS1646诱导死亡的抗生素抑制
氨苄青霉素和环丙沙星抑制YS1646感染的能力，可通过确定抗生素阻止接种了5×106cfu(等于LD50)的C57BL／6小鼠死亡的能力来评价。
按下面的处理类别进行分组：1)未处理对照，2)氨苄青霉素处理，3)环丙沙星处理，以及4)环丙沙星和氨苄青霉素处理。抗生素处理在细菌给药后第3天开始，每天观察动物的表现和死亡，直至第14天。这里所示的结果证明，抗生素的使用能抑制致死性细菌感染后的死亡(见图18)。
9．微生物的保藏
下面的微生物已于1997年9月9日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd．，Manassas，VA 20110-2209进行了保藏，并被给予了所示的保藏编号：
微生物    ATCC编号
YS8211    202026
YS1629    202025
YS1170    202024
下面的微生物已于1998年8月25日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd．，Manassas，VA 20110-2209进行了保藏，并被给予了所示的保藏编号：
微生物    ATCC编号
YS1646    202165
YS1456    202164
这里宣布和介绍的本发明包括但不限于保藏的微生物实施方案不是用具体的实施方案来限制其范围，之所以在这里公开是因为，这些实施方案是为了说明本发明的几个方面。事实上，除了这里显示和介绍的内容，按前面的介绍对本发明进行各种修改，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种修改也被包含在所附的权利要求的范围内。
这里引用了大量参考文献，这些引入的全部公开物均全文引入作为参考。
序列表<110> VION  PHARMACEUTICALS，INC.
  YALE UNIVERSITY<120> 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌<130> 8002-042<140> PCT／US98／<141> 1998-09-09<160> 4<170> PatentIn Ver．2．0<210> 1<211> 2019<212> DNA<213> 沙门氏菌<220><221> CDS<222> (244)．．(1212)<400> lgatcaaccag caagccgtta accctctgac agcaaaattg ccgcgcacgg aaggtctgac  60ggggtcagat cgtcgtgaat acctggcaca ggtgaaagag gttctgccgc aactgcgctt 120cgattaacaa atgcgctgac agagccggta cgcgatgtgt gccggctttt ttgttttgtg 180tgagacgcag acgtcgctac actattcaca attccttttc gcgtcagcag accctggaaa 240agc atg gaa acc aaa aaa aat aat agt gag tat atc cct gaa ttc gaa   288
Met Glu Thr Lys Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Pro Glu Phe Glu
  1              5                    10                  15aaa tcc ttt cgc tat cca cag tat tgg ggc gcc tgg ttg ggc gcg gcg   336Lys Ser Phe Arg Tyr Pro Gln Tyr Trp Gly Ala Trp Leu Gly Ala Ala20                  25                 30gca atg gcg ggg arc gca tta aca ccg gca tca ttc cgc gac cct ttg   384Ala Met Ala Gly Ile Ala Leu Thr Pro Ala Ser Phe Arg Asp Pro Leu35                  40                 45ctg gcg acg ctg ggg cgt ttt gcc gga cgg ctg ggg aag agt tct cgt   432Leu Ala Thr Leu Gly Arg Phe Ala Gly Arg Leu Gly Lys Ser Ser Arg50                  55                  60cgc cgg gcg cta att aat ctg tcg ttg tgc ttt ccg cag cgt agc gaa   480Arg Arg Ala Leu Ile Asn Leu Ser Leu Cys Phe Pro Gln Arg Ser Glu65                   70                  75gct gag cgc gaa gcg att gtc gat gag atg ttc gcc acc gcg cca cag   528Ala Glu Arg Glu Ala Ile Val Asp Glu Met Phe Ala Thr Ala Pro Gln80                  85                  90                  95gca atg gcg atg atg gct gag ttg gcg atg cgc ggt ccg aaa aaa att   576Ala Met Ala Met Met Ala Glu Leu Ala Met Arg Gly Pro Lys Lys Ile100                 105                 110caa cag cgt gtt gac tgg gaa ggt ctg gag att arc gag gag atg cgt   624Gln Gln Arg Val Asp Trp Glu Gly Leu Glu Ile Ile Glu Glu Met Arg115                 120                 125cgt aac gac gaa aaa gtc att ttt crc gta ccg cat ggc tgg ggc gtc   672Arg Asn Asp Glu Lys Val Ile Phe Leu Val Pro His Gly Trp Gly Val130                 135                 140gac att cca gcc atg ctg atg gcc tct cag ggg caa aaa atg gcg gcg   720Asp Ile Pro Ala Met Leu Met Ala Ser Gln Gly Gln Lys Met Ala Ala145                 150                 155atg ttt cat aat cag ggt aat ccg gtt ttt gac tat atc tgg aac aca   768Met Phe His Asn Gln Gly Asn Pro Val Phe Asp Tyr Ile Trp Asn Thr160                 165                 170                 175gtg cgt cgg cgt ttc ggc gga cgt ttg cat gcg cgt aat gac ggg att   816Val Arg Arg Arg Phe Gly Gly Arg Leu His Ala Arg Asn Asp Gly Ile180                 185                 190aaa ccc ttt att cag tct gtt cgt cag ggc tac tgg ggt tac tac ctg   864Lys Pro Phe Ile Gln Ser Val Arg Gln Gly Tyr Trp Gly Tyr Tyr Leu195                  200                205ccg gac cag gat cac ggc ccg gag cat agt gaa ttc gtt gat ttc ttt   912Pro Asp Gln Asp His Gly Pro Glu His Ser Glu Phe Val Asp Phe Phe210                 215                 220gcg aca tac aaa gcg acg ctg cct gca att ggt cgg ctg atg aaa gtg   960Ala Thr Tyr Lys Ala Thr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Leu Met Lys Val225                 230                 235tgc cgc gca cgc gtg ata ccg ctt ttc ccg gtg tat aat ggt aaa acg   1008Cys Arg Ala Arg Val Ile Pro Leu Phe Pro Val Tyr Asn Gly Lys Thr240                 245                  250                255cat cgc ctg act atc cag att cgc ccg cca atg gac gat ctg ctc acg   1056His Arg Leu Thr Ile Gln Ile Arg Pro Pro Met Asp Asp Leu Leu Thr260             265                     270gct gac gac cac act atc gcc aga cgg atg aac gaa gag gtc gaa att   1104Ala Asp Asp His Thr Ile Ala Arg Arg Met Asn Glu Glu Val Glu Ile275                 280                 285ttt gtc ggc ccg cat ccg gaa cag tac acc tgg atc ctg aag ctg ctc   1152Phe Val Gly Pro His Pro Glu Gln Tyr Thr Trp Ile Leu Lys Leu Leu290                 295                 300aaa acc cgc aag cca ggc gag att cag ccg tat aag cgt aaa gat ctt   1200Lys Thr Arg Lys Pro Gly Glu Ile Gln Pro Tyr Lys Arg Lys Asp Ieu305                 310                 315tat ccc atc aaa taaataaagc ctctcgtaag agaggcttta tgctgacaaa       1252Tyr Pro Ile Lys320ccctgtacta cctgatgaac aggcgtgggg gagttttact caacggtcaa aatacgcgtg 1312gtattggttg aaccgacggt gctcatgaca tcgccctggg tcacgataac caggtcgccg 1372gaaaccagat accctttatc gcgcagcaga ttaacagctt catgtgccgc gacaacgcca 1432tcagccgcgc tatcaaaatg caccggcgtt actccgcgat agagcgcggt caggttcagc 1492gtgcgttcat ggcgcgacat ggcgaaaatc ggcaggccgg agctgatacg ggaagtcatt 1552agcgcggtac gaccggattc cgtcatggtg atgatcgcgg taacgccttt cagatggttt 1612gccgcataca ctgcagacat ggcaatggct tcttcaacgt tgtcgaactg cacgtcgaga 1672cggtgtttag acacattgat gctggggatt ttttctgcgc ccaggcacac gcgcgccatt 1732gcggcaacgg tttcagaagg atactgaccg gctgcggttt cggcagacag cataaccgca 1792tccgtgccat ccaggacggc gttcgccacg tccatcactt ccgcacgggt cggcatcggg 1852ttggtgatca tcgactccat catttgcgtt gcggtgatga ctgcgcggtt tagctgacgc 1912gcacggcgaa tcagcgcttt ctggatacca accagctccg gatcgccgat ttcaacgccc 1972agatcgccac gtgcgaccat cacaacgtca gaggccagaa tgatatc               2019<210> 2<211> 323<212> PRT<213> 沙门氏菌<400> 2Met Glu Thr Lys Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Pro Glu Phe Glu Lys1               5                  10                  15Ser Phe Arg Tyr Pro Gln Tyr Trp Gly Ala Trp Leu Gly Ala Ala Ala
         20                  25                  30Met Ala Gly Ile Ala Leu Thr Pro Ala Set Phe Arg Asp Pro Leu Leu
     35                  40                  45Ala Thr Leu Gly Arg Phe Ala Gly Arg Leu Gly Lys Ser Ser Arg Arg
 50                  55                  60Arg Ala Leu Ile Asn Leu Ser Leu Cys Phe Pro Gln Arg Ser Glu Ala65                  70                  75                  80Glu Arg Glu Ala Ile Val Asp Glu Met Phe Ala Thr ALa Pro Gln Ala
             85                  90                  95Met Ala Met Met Ala Glu Leu Ala Met Arg Gly Pro Lys Lys Ile Gln
        100                 105             110Gln Arg Val Asp Trp Glu Gly Leu Glu Ile Ile Glu Glu Met Arg Arg
    115                 120                 125Asn Asp Glu Lys Val Ile Phe Leu Val Pro His Gly Trp Gly Val Asp
130                 135                 140Ile Pro Ala Met Leu Met Ala Ser Gln Gly Gln Lys Met Ala Ala Met145                 150                 155                 160Phe His Asn Gln Gly Asn Pro Val Phe Asp Tyr Ile Trp Asn Thr Val
            165                 170                 175Arg Arg Arg Phe Gly Gly Arg Leu His Ala Arg Asn Asp Gly Ile Lys
        180                 185                 190Pro Phe Ile Gln Ser Val Arg Gln Gly Tyr Trp Gly Tyr Tyr Leu Pro
    195                 200                 205Asp Gln Asp His Gly Pro Glu His Ser Glu Phe Val Asp Phe Phe Ala
2l0                     215                     220Thr Tyr Lys Ala Thr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Leu Met Lys Val Cys225                 230                 235                 240Arg Ala Arg Val Ile Pro Leu Phe Pro Val Tyr Asn Gly Lys Thr His
            245                 250                 255Arg Leu Thr Ile Gln Ile Arg Pro Pro Met Asp Asp Leu Leu Thr Ala
        260             265                     270Asp Asp His Thr Ile Ala Arg Arg Met Asn Glu Glu Val Glu Ile Phe
    275                 280                 285Val Gly Pro His Pro Glu Gln Tyr Thr Trp Ile Leu Lys Leu Leu Lys
290                 295                 300Thr Arg Lys Pro Gly Glu Ile Gln Pro Tyr Lys Arg Lys Asp Leu Tyr305                 310                 315                 320Pro Ile Lys<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400> 3gttgactggg aaggtctgga g<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400> 4ctgaccgcgc tctatcgcgg

Claims (37)

1．含有一种遗传修饰的msbB基因的突变沙门氏菌，其中突变的沙门氏菌在体内给药时能靶向一种实体瘤。
2．权利要求1的突变沙门氏菌，它被命名为YS1629，并且其ATCC保藏号为No．202025；或它被命名为YS1170，并且其ATCC保藏号为No．202024；或它被命名为YS8211，并且其ATCC保藏号为No．202026。
3．权利要求1的突变沙门氏菌，它选自：伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。
4．权利要求1的突变沙门氏菌，它表达一种改变的类脂A分子。
5．权利要求1的突变沙门氏菌，它诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约5％至约40％。
6．权利要求1的突变沙门氏菌，它诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约10％至约35％。
7．从权利要求1的突变沙门氏菌纯化的脂多糖，它诱导的TNFα表达少于或等于野生型沙门氏菌诱导水平的0．001％。
8．权利要求1的突变沙门氏菌，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制其约90％的生长。
9．权利要求1的突变沙门氏菌，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制其约99％的生长。
10．权利要求1的突变沙门氏菌，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制超过其99％的生长。
11．权利要求8、9或10的突变沙门氏菌，其中螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和柠檬酸钠。
12．权利要求1的突变沙门氏菌，它在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约50％至约30％。
13．权利要求1的突变沙门氏菌，它在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约30％至约10％。
14．权利要求1的突变沙门氏菌，它在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约10％至约1％。
15．一种抑制实体瘤癌症生长或减小其体积的方法，包括使用有效剂量的权利要求1的突变沙门氏菌对患有一种实体瘤癌症的病人进行给药。
16．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌选自选自：伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。
17．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌表达一种改变的类脂A分子。
18．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约5％至约40％。
19．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约10％至约35％。
20．权利要求15的方法，其中从突变沙门氏菌纯化的脂多糖诱导的TNFα表达少于或等于野生型沙门氏菌诱导水平的0．001％。
21．权利要求15的方法，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制约90％的突变沙门氏菌的生长。
22．权利要求15的方法，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制约99％的突变沙门氏菌的生长。
23．权利要求15的方法，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制超过99％的突变沙门氏菌的生长。
24．权利要求21、22或23的方法，其中螯合剂选自EDTA、EGTA和柠檬酸钠。
25．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约50％至约30％。
26．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约30％至约10％。
27．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约10％至约1％。
28．权利要求15的方法，其中实体瘤癌症是黑素瘤。
29．权利要求15的方法，其中实体瘤癌症是结肠癌。
30．权利要求15的方法，其中实体瘤癌症选自肺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌。
31．一种药物组合物，它包括能有效抑制一种实体瘤癌症生长或减少其体积的一定量权利要求1的突变沙门氏菌；以及一种可药用的载体。
32．一种突变沙门氏菌，它包含一种遗传修饰的msbB基因和一种遗传修饰的purⅠ基因，其中该突变沙门氏菌在体内给药时能够靶向一种实体瘤。
33．权利要求32的突变沙门氏菌，其中遗传修饰是一种删除突变。
34．权利要求32的突变沙门氏菌，它被命名为YS1646，并且其ATCC保藏号为No．202165；或它被命名为YS1456，并且其ATCC保藏号为No．202164。
35．一种突变沙门氏菌，它包含一种遗传修饰的msbB基因和一种遗传修饰的生物合成途径基因，其中生物合成途径突变提供降低的毒性。
36．一种抑制实体瘤癌症生长或减小其体积的方法，包括包括使用有效剂量的权利要求32的突变沙门氏菌对患有一种实体瘤癌症的病人进行给药。
37．一种选择细菌遗传改变的改进方法，其中的改进包括选择一种表型变异体，当它在一种含有蔗糖的培养基上生长时，产生边缘模糊或粗糙的菌落。
CNB98811030XA 1997-09-10 1998-09-09 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌 Expired - Fee Related CN1253551C (zh)

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WO (1) WO1999013053A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7354592B2 (en) 1997-09-10 2008-04-08 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US7452531B2 (en) 1999-10-04 2008-11-18 Vion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
CN100435850C (zh) * 2004-03-22 2008-11-26 中国医学科学院血液学研究所 具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物
US7514089B2 (en) 1997-09-10 2009-04-07 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
CN103656684A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用
CN104471057A (zh) * 2012-05-04 2015-03-25 香港大学 经修饰的细菌和它们用于治疗癌症或肿瘤的用途

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4723041A (en) * 1985-09-24 1988-02-02 Catalytica Associates Olefin oxidation catalyst system
US4720474A (en) * 1985-09-24 1988-01-19 Catalytica Associates Olefin oxidation catalyst system
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
CA2386806A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 Vion Pharmaceuticals, Inc. Non-invasive tumor imaging by tumor-targeted bacteria
JP2004500042A (ja) * 1999-10-04 2004-01-08 ヴァイオン　ファーマシューティカルズ、インコーポレーテッド エフェクター分子の腫瘍標的送達のための組成物および方法
CA2388918A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 Entremed, Inc. Methods for administration of therapeutic agents on an antiangiogenic schedule
CA2342040C (en) * 2000-09-21 2012-07-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anaerobic bacterium as a drug for cancer gene therapy
US20030194798A1 (en) 2001-05-24 2003-10-16 Surber Mark W. Minicell compositions and methods
US7396822B2 (en) 2001-05-24 2008-07-08 Vaxiion Therapeutics, Inc. Immunogenic minicells and methods of use
WO2003063593A1 (en) * 2002-01-28 2003-08-07 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering tumor-targetted bacteria and an immunomodulatory agent
EP1654364A4 (en) * 2003-08-13 2008-02-13 Novartis Vaccines & Diagnostic CURRENT HOST CELL RELEASE COMPRISING POLYNUCLEOTIDES ENCODING IMMUNOGENS
US20070298012A1 (en) * 2003-12-16 2007-12-27 Ivan King Compositions and Methods for Tumor-Targeted Delivery of Effector Molecules
NZ586338A (en) * 2004-06-07 2012-02-24 Qu Biolog Inc Bacterial compositions for the treatment of cancer
DK2088193T3 (da) 2004-11-24 2011-02-28 Anaeropharma Science Inc Ny shuttle-vektor
CN101155911B (zh) * 2005-04-08 2015-08-26 阿内罗药物科学株式会社 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法
TW200819540A (en) 2006-07-11 2008-05-01 Genelux Corp Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US7998461B2 (en) * 2007-11-15 2011-08-16 University Of Massachusetts Salmonella cancer therapeutics and related therapeutic methods
US8357486B2 (en) 2008-01-11 2013-01-22 Genelux Corporation Methods and compositions for detection of bacteria and treatment of diseases and disorders
US8647642B2 (en) * 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
WO2010062982A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 Vion Pharmaceuticals, Inc. Tumor-targeting co2-resistant salmonella
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
WO2010141143A2 (en) * 2009-04-21 2010-12-09 Vivocure, Inc. Engineered avirulent bacteria strains and use in medical treatments
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
WO2012008860A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Auckland Uniservices Limited Bacterial nitroreductase enzymes and methods relating thereto
US10005820B2 (en) 2011-02-15 2018-06-26 Vaxiion Therapeutics, Llc Therapeutic compositions and methods for antibody and Fc-containing targeting molecule-based targeted delivery of bioactive molecules by bacterial minicells
EP2764119A2 (en) 2011-10-05 2014-08-13 Genelux Corporation Method for detecting replication or colonization of a biological therapeutic
WO2013128288A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Thelial Technologies S.A. Monomeric bacterial actin adp-ribosyltransferases as cancer chemotherapeutics
US9265804B2 (en) 2013-01-02 2016-02-23 Decoy Biosystems, Inc. Compositions and methods for treatment of cancer using bacteria
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
JP7097438B2 (ja) * 2017-07-11 2022-07-07 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用
AU2019301699B2 (en) * 2018-07-11 2023-11-02 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020047161A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020132980A1 (zh) * 2018-12-26 2020-07-02 深圳先进技术研究院 细菌-光热纳米颗粒复合物及制备方法和应用
CN113748124A (zh) 2019-02-27 2021-12-03 阿克蒂姆治疗有限公司 工程化以定植肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境的免疫刺激性细菌
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
JP2023501539A (ja) 2019-11-12 2023-01-18 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 免疫刺激細菌デリバリープラットフォーム、および治療用産物のデリバリーのためのその使用
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
JP2023539454A (ja) 2020-08-12 2023-09-14 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 免疫刺激細菌ベースのワクチン、治療薬およびｒｎａデリバリープラットフォーム
CA3235418A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment
CN117305155A (zh) * 2023-08-28 2023-12-29 江苏省家禽科学研究所 一种抑制沙门氏菌毒力因子的方法

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US29043A (en) * 1860-07-10 Improvement in cultivators
JPS57142256A (en) 1981-02-25 1982-09-02 Kao Corp Sanitary napkin
US4436727A (en) * 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
EP0350973B1 (de) * 1983-09-26 1997-11-05 Udo Dr. Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
CA1321962C (en) 1985-03-20 1993-09-07 Aizo Matsushiro Dental caries preventive preparations and method for preparing said preparations
JPH0696538B2 (ja) 1985-12-19 1994-11-30 株式会社アドバンス 抗発癌剤
JPS62298657A (ja) 1986-06-16 1987-12-25 Diesel Kiki Co Ltd 燃料噴射弁
JPH0761950B2 (ja) 1986-10-17 1995-07-05 塩野義製薬株式会社 抗腫瘍剤
DE3735381A1 (de) 1987-03-31 1989-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen
GB8730037D0 (en) 1987-12-23 1988-02-03 Wellcome Found Vaccines
JPH01180830A (ja) 1988-01-11 1989-07-18 Kayaku:Kk 抗腫瘍剤
EP0338679A3 (en) 1988-03-24 1991-03-06 Genentech, Inc. Tumour necrosis factor in the treatment of bladder cancer
JPH0284172A (ja) 1988-07-21 1990-03-26 Smithkline Beckman Corp 異種遺伝子の発現能を有し、組換え型ワクチンとして有用なサルモネラ形質転換体
GB8912330D0 (en) 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
JPH0376580A (ja) * 1989-08-17 1991-04-02 Japan Tobacco Inc 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法
WO1991006317A1 (en) 1989-11-03 1991-05-16 Washington University Cross-protective salmonella vaccines
US5830702A (en) * 1990-10-31 1998-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Live, recombinant listeria monocytogenes and production of cytotoxic T-cell response
US5695983A (en) 1990-12-18 1997-12-09 The General Hospital Corporation Salmonella vaccines
ATE190660T1 (de) 1990-12-18 2000-04-15 Gen Hospital Corp Verbesserte impfstoffe
WO1992015689A1 (en) 1991-03-05 1992-09-17 The Wellcome Foundation Limited Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria
IL101410A0 (en) 1992-03-29 1992-11-15 Era Masis Ltd Formulation for the treatment of cancer
IL101409A0 (en) * 1992-03-29 1992-11-15 Era Masis Ltd Method for the early diagnosis of cancer
CA2146242A1 (en) 1993-08-25 1995-03-02 Kazuo Ichihara Heart function restorative
JPH09504518A (ja) 1993-10-06 1997-05-06 アメリカ合衆国 負の選択マーカーおよびサイトカインをコード化する遺伝子を用いる腫瘍細胞の遺伝子転換による腫瘍の治療
IT1270123B (it) 1994-10-05 1997-04-28 Dompe Spa Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia
US6051237A (en) * 1994-11-08 2000-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Specific immunotherapy of cancer using a live recombinant bacterial vaccine vector
US6150170A (en) * 1998-05-03 2000-11-21 University Of Maryland At Baltimore Method for introducing and expressing genes in animal cells, and live invasive bacterial vectors for use in the same
US5877159A (en) * 1995-05-03 1999-03-02 University Of Maryland At Baltimore Method for introducing and expressing genes in animal cells and live invasive bacterial vectors for use in the same
US5705151A (en) * 1995-05-18 1998-01-06 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Gene therapy for T cell regulation
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
WO1997008955A1 (en) 1995-09-06 1997-03-13 Department Of The Army, Us Government Bacterial delivery system
US5824538A (en) * 1995-09-06 1998-10-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell
GB9521568D0 (en) * 1995-10-20 1995-12-20 Lynxvale Ltd Delivery of biologically active polypeptides
CA2237581A1 (en) 1995-11-14 1997-05-22 The General Hospital Corporation Salmonella secreted proteins and uses thereof
US5997881A (en) * 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
US6887483B2 (en) 1995-12-01 2005-05-03 University Of Iowa Research Foundation Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
WO1997025061A1 (en) 1996-01-09 1997-07-17 Bristol-Myers Squibb Company De-myristolated lipopolysaccharide of gram-negative bacteria
US6025417A (en) 1996-02-28 2000-02-15 Biotechnology Research & Development Corp. Biodegradable polyester compositions with natural polymers and articles thereof
ATE229805T1 (de) 1996-05-10 2003-01-15 Upjohn Co Topische verabreichung von premafloxacin zur behandlung von systemischen bakteriellen erkrankungen
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
WO1998033923A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT msbB or htrB GENES
US6435591B1 (en) 1997-03-11 2002-08-20 Autoliv Development Ab Device for avoiding whiplash injuries
US6410012B1 (en) * 1997-03-28 2002-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Antimicrobial mediated bacterial DNA delivery
US6537558B2 (en) * 1997-03-31 2003-03-25 Megan Health, Inc. Methods of producing and using virulence attenuated poxR mutant bacteria
US6306387B1 (en) 1997-05-29 2001-10-23 The Research Foundation Of State University Of New York Antigen delivery system
NZ503376A (en) 1997-09-10 2002-10-25 Vion Pharmaceuticals Inc Genetically modified Salmonella sp having a modified msbB gene useful for treating tumours
US6080849A (en) * 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6593592B1 (en) * 1999-01-29 2003-07-15 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Semiconductor device having thin film transistors
US6962696B1 (en) * 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
JP2004500042A (ja) 1999-10-04 2004-01-08 ヴァイオン　ファーマシューティカルズ、インコーポレーテッド エフェクター分子の腫瘍標的送達のための組成物および方法
EP1281767A3 (en) * 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7354592B2 (en) 1997-09-10 2008-04-08 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US7514089B2 (en) 1997-09-10 2009-04-07 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US7452531B2 (en) 1999-10-04 2008-11-18 Vion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
CN100435850C (zh) * 2004-03-22 2008-11-26 中国医学科学院血液学研究所 具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物
CN104471057A (zh) * 2012-05-04 2015-03-25 香港大学 经修饰的细菌和它们用于治疗癌症或肿瘤的用途
CN104471057B (zh) * 2012-05-04 2017-10-27 香港大学 经修饰的细菌和它们用于治疗癌症或肿瘤的用途
CN103656684A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用
CN103656684B (zh) * 2013-12-03 2016-02-24 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US7354592B2 (en) 2008-04-08
EP1012232A1 (en) 2000-06-28
AU9380798A (en) 1999-03-29
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JP2002500001A (ja) 2002-01-08
US6863894B2 (en) 2005-03-08
US20050255088A1 (en) 2005-11-17
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NZ503376A (en) 2002-10-25
US20030109026A1 (en) 2003-06-12
CA2302866A1 (en) 1999-03-18
HK1033956A1 (en) 2001-10-05

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