JP2002500001A

JP2002500001A - 低下した毒性を有する遺伝子改変腫瘍標的化細菌

Info

Publication number: JP2002500001A
Application number: JP2000510842A
Authority: JP
Inventors: バーミューズ、デイビッド; ロー、ケネス、ビー．; イッテンソーン、マーティナ
Original assignee: ヴァイオンファーマシューティカルズ、インコーポレーテッド; イエールユニバーシティー
Priority date: 1997-09-10
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 2002-01-08
Also published as: US7354592B2; EP1012232A1; AU9380798A; EP1012232A4; IL134936A0; CN1253551C; CA2302866C; AU749695B2; EP1012232B1; WO1999013053A1; US6863894B2; CN1278864A; US20050255088A1; BR9812079A; NZ503376A; US20030109026A1; CA2302866A1; HK1033956A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子改変したmsbB遺伝子を有する突然変異サルモネラ（Salmonella）種に関するものであり、この突然変異サルモネラは、固形腫瘍(solid tumor)を標的化することができる。本発明はまた、遺伝子改変したmsbB遺伝子、ならびにpurI遺伝子のような生合成経路遺伝子における遺伝子改変を含むサルモネラ種に関する。本発明はさらに、固形腫瘍の増殖抑制および／または固形腫瘍の体積の減少のための該突然変異サルモネラの治療目的での使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、出願番号第08/926,636号（1997年９月10日出願）の一部継続出願で
あり、その全開示内容は引用によりその全体を本明細書に組み入れる。

【０００２】１．発明の分野本発明は、遺伝子破壊されると、サルモネラ(Salmonella)生物体によって引き
起こされる毒性および敗血症ショックの両方を低減し、かつSalmonellaの根絶を
促進する薬剤（agent）（例えばキレート化剤）に対する感受性を増大させるSal
monellaの遺伝子の単離に関する。この遺伝子のヌクレオチド配列およびその遺伝子破壊の手段が提供され、癌（例えば、黒色腫、結腸癌および他の固形腫瘍、
しかしこれらに限定されない）の増殖を抑制するための、この遺伝子が破壊され
ている腫瘍標的化細菌の使用例が記載されている。本発明はまた、栄養要求性遺
伝子の破壊と組合せたこの遺伝子の遺伝子破壊を提供する。

【０００３】２．発明の背景本願の第２節またはあらゆる節におけるいずれの参考文献の引用および認定も
、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めよう
とするものではない。

【０００４】固形腫瘍性癌(solid tumor cancers)の化学療法における主な問題は、治療薬剤（例えば薬物）を、腫瘍細胞を根絶させると同時に正常細胞の損傷を最小限に
抑えるのに十分な濃度で送達することである。したがって、多くの研究施設にお
ける研究は、生物学的送達システムの設計に向けられており、そのような生物学
的送達システムとしては抗体、サイトカイン、ならびに腫瘍細胞への薬物、プロ
ドラッグ変換酵素および／または遺伝子の標的化送達のためのウイルスが含まれ
る。HoughtonおよびClot, 1993, New Perspectives in Cancer Diagnosis and M
anagement 1:65-70；de Palazzoら, 1992a, Cell. Immunol. 142:338-347；de P
alazzoら, 1992b, Cancer Res. 52:5713-5719；Weinerら, 1993a, J. Immunothe
rapy 13:110-116；Weinerら, 1993b, J. Immunol. 151:2877-2886；Adamsら, 19
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, Cancer Res. 52:6229-6236。

【０００５】2.1 細菌感染症および癌細菌および癌については、歴史的な検討から、細菌感染症に罹患している患者
においては癌が後退することが報告されている幾つかの臨床的知見が明らかにな
っている。Nautsら, 1953, Acta Medica. Scandinavica 145:1-102（増補276）では、次のように述べられている。

【０００６】「細菌産物を注射することによる癌の治療は、200年間以上にわたり、急性感染症（主に連鎖球菌性の感染症）に罹った後で新生物が後退することが観察され
ている、という事実に基づくものである。これらの症例がそれほど進行しておら
ず、かつその感染症が十分に重症であるか持続している場合、腫瘍は完全に消滅
し、患者は再発しないままであった。」

【０００７】 Shear, 1950, J. A.M.A. 142:383-390（Shear）は、ボストン市内のChildren'
s Hospitalにおいて、未処置の白血病における自然寛解の75％が細菌感染症の急
性エピソードの後で起こることを確認した。Shearは次のような疑問を投げかけている。

【０００８】「病原性または非病原性生物が悪性疾患の微視的な病巣の自然調節の１つなの
か、そして、感染性疾患の調節の進行過程で、癌の自然調節の1つを取除いているのか？」

【０００９】その後幾つかの研究所で得られた証拠から、抗癌効果の少なくとも幾つかが宿
主免疫系の刺激によって媒介され、その結果、癌細胞の免疫拒絶が増強されるこ
とが示された。例えば、グラム陰性細菌（例えばSalmonella）によるリポ多糖（
LPS）内毒素の放出は、宿主免疫系の細胞（例えばマクロファージ）による腫瘍壊死因子（TNF）の放出の引き金となる（Christら, 1995, Science 268:80-83）
。そして次に上昇したTNFレベルが、腫瘍細胞の死滅において最高に達するサイトカイン媒介反応のカスケードを始動させる。これに関して、Carswellら, 1975
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3666-3669は、カルメット‐ゲラン(Calmette
-Guerin)棹菌（BCG）を注射したマウスではTNFの血清中レベルが増大すること、
およびTNF陽性血清がマウス内の肉腫Meth Aおよび他の移植腫瘍の壊死を引き起こすことを実証した。さらに、Klimpelら, 1990, J. Immunol. 145:711-717は、
in vitroでShigellaまたはSalmonellaに感染させた繊維芽細胞がTNFに対する感受性を高めることを示した。

【００１０】そのような上記の知見のために、幾つかの癌治療プロトコルにおいてBCG注射による癌患者の免疫化が現在用いられている。BCG治療についての概説についてはSosnowski, 1994, Compr. Ther. 20:695-701；BarthおよびMorton, 1995, Can
cer 75 （追補２）：726-734；Friberg, 1993, Med. Oncol. Tumor. Pharmacoth
er. 10:31-36を参照されたい。

【００１１】2.2 寄生生物および癌細胞寄生生物の生来の生物特異性(biospecificity)および進化学的適合性は長い間
認識されており、新しい治療手法のためのモデルとしてのそれらの特殊化した系
の使用が示唆されてはいるが、ベクターとしての寄生生物の実際の使用について
、または実際の使用の提案についての報告はほとんどない。

【００１２】 Leeら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1847-1851（Leeら）およびJon
esら, 1992, Infect. Immun. 60:2475-2480（Jonesら）は、in vitroで野性株系
よりも有意に多い数でHEp-2（ヒト類表皮癌）細胞に浸潤（invade）できるSalmo
nella typhimuriumの突然変異体を単離した。この「高浸潤性(hyperinvasive)」
突然変異体は、この細胞の好気的増殖条件下で単離され、この条件下では通常は
野生型株のHEp-2動物細胞へ浸潤する能力は抑制される。しかし、LeeらおよびJo
nesらは、そのような突然変異体を治療用ベクターとして使用することも、身体の正常細胞よりも黒色腫または他の癌に対して感染性を示す突然変異体の選択に
よる腫瘍特異的細菌の単離も示唆してはいなかった。腫瘍特異性または他の形態
の弱毒化がないために、LeeらおよびJonesらが記載しているそのような高浸潤性
Salmonella typhimuriumは汎浸潤性（pan-invasive）であり、癌患者において広
範囲な感染を引き起こすであろう。

【００１３】2.3 腫瘍標的化細菌遺伝子操作したSalmonellaは腫瘍を標的化でき、抗腫瘍活性を有し、かつ単純
ヘルペスチミジンキナーゼ(HSV TK)のようなエフェクター遺伝子を固形腫瘍へと
送達するのに有用であることが証明されている（Pawelekら, WO96/40238）。細菌のin vivoでの使用についての２つの重要な検討点は、その細菌の毒性および腫瘍壊死因子α（TNFα）媒介敗血症ショックを引き起こす能力である。TNF-α 媒介敗血症ショックは、主な問題の中でも、細菌と関連していることから、この
形態の免疫応答を低下させる改変は有用となるであろう。何故ならば、TNFαレベルは毒性とはならないであろうし、この治療用ベクターのより有効な濃度およ
び／または持続期間が利用できるかもれないからである。

【００１４】2.4 改変細菌性リピドＡ TNFα産生の誘発の低下によって、免疫応答を変化させる腫瘍標的化細菌の脂質組成が改変されることが、Pawelekら,(Pawelekら, WO96/40238)により示唆された。Pawelekらは、モノホスホリルリピドＡ（MLA）産生に関与するRhodobacte
r由来の遺伝子を単離するための方法を提供した。MLAは敗血症ショックに対する
アンタゴニストとして作用する。Pawelekらはまた、リピドＡ生合成における第3
の酵素UDP-3-O（R-30ヒドロキシルミリストリル）-グルコサミンN-アシルトラン
スフェラーゼ（Kelleyら, 1993, J. Biol. Chem. 268:19866-19874）をコードす
る突然変異firAを含む、リピドＡ生合成経路における遺伝子改変の使用も示唆し
た。Pawelekらは、このfirA遺伝子における突然変異が低レベルのTNFαを誘導す
ることを示した。しかし、これらの著者は、リピドＡ分子のミリスチン酸（myri
state）部分を修飾する酵素は示唆していなかった。さらに、Pawelekらは、細菌
の脂質含量を変えることにより該細菌の特定の薬剤（例えばキレート化剤）に対
する感受性を変化させることは示唆していなかった。

【００１５】大腸菌（Escherichia coli）においては、リピドＡの末端ミリスチル化（myri
stalization）に関与する遺伝子msbB（mlt）が同定されている（Engelら, 1992,
J. Bacteriol. 174:6394-6403；KarowおよびGeorgopoulos, 1992, J. Bacterio
l. 174:702-710；Somervilleら, 1996, J. Clin. Invest. 97:359-365）。この遺伝子の遺伝子破壊により、TNFα誘発を低下させる安定な非条件突然変異が起こる（Somervilleら, 1996, J. Clin. Invest. 97:359-365）。しかし、これらの参考文献は、腫瘍標的化Salmonellaベクター内のmsbB遺伝子の破壊により、毒
性がほとんどなく、かつキレート化剤に対してより感受性の細菌が生じることは
示唆していなかった。

【００１６】細菌の遺伝子送達用ベクターとしての使用に伴う問題は、細菌が一般に、正常
な哺乳動物細胞を直接死滅させる能力、ならびにTNFαを介して免疫系を過剰刺激する能力を持つことに集中しており、これらは宿主とって毒性となる結果を有
し得る（Bone, 1992, JAMA 268:3452-3455；Dinarelloら, 1993, JAMA 269:1829
-1835）。これらの要因に加えて、抗生物質に対する耐性が、ヒト体内での細菌の存在のコピー化を非常に複雑にし得る（Tschape, 1996, D T W Dtsch Tierarz
tl Wochenschr 1996, 103:273-7；Ramosら, 1996, Enferm Infec. Microbiol. C
lin. 14:345-51）。

【００１７】 HoneおよびPowellのWO97/18837（「HoneおよびPowell」）は、非発熱性リピド
ＡまたはLPSを含むグラム陰性細菌を作製する方法を開示している。HoneおよびP
owellは、簡単に言えば、msbB、kdsA、kdsB、kdtAおよびhtrBなどを含む多数の遺伝子の条件突然変異を非常に様々なグラム陰性細菌（例えば大腸菌、Shigella
種、Salmonella種など）に導入できることを主張しており、例示されている唯一
の突然変異は、大腸菌に導入されたhtrB突然変異である。さらに、HoneおよびPo
wellは、msbB遺伝子が突然変異している非発熱性Salmonellaの治療目的での使用
を提案しているが、そのような使用をどのようにして達成するのかについての実
施可能な記載はない。さらに、HoneおよびPowellは、ワクチンの目的のためだけ
に非発熱性細菌を使用することを提案している。

【００１８】ワクチンベクターの目的は、本願で権利請求する腫瘍標的化ベクターとは大き
く異なる。つまり、ワクチンベクターには、腫瘍標的化ベクターとは全く異なる
要件がある。ワクチンベクターは、免疫応答を誘起することを目的とするもので
ある。好ましい生細菌ワクチンは、防御的免疫性を誘起するように免疫原性でな
ければならない。しかし、このワクチンはin vivoで過度に増殖できてはならない。そうした過度の増殖は有害な反応を引き起こすであろう。HoneおよびPowell
の教示に従えば、好適な細菌ワクチンベクターは温度感受性であり、通常の生理
学的体温範囲において最も低い複製能を有する。

【００１９】これに対して、好ましい腫瘍標的化寄生生物ベクター（例えばSalmonella、し
かしこれに限定されない）は、病原性が制限されるように、身体の正常組織によ
って安全に寛容され、さらに、該ベクターは腫瘍を標的化し、その内部で自由に
複製する。したがって、通常の体温で最低に複製するワクチンベクターは、腫瘍
標的化ベクターとしての使用には不適切である。

【００２０】腫瘍特異的Salmonella株の好ましい特性としては、（１）血清耐性（これは、
寄生生物が腫瘍を探す過程で血管系およびリンパ系を通過できるようにする）、
（２）通性嫌気性生物的性質(facultative anaerobiasis)（すなわち、嫌気性ま
たは好気性条件下で増殖して、低酸素性である大きな壊死性腫瘍内およびより好
気性であり得る小さな転移性腫瘍内での増幅を可能にする能力）、（３）宿主の
防御能に対する感受性（これは、正常組織内での複製は制限するが、宿主の防御
能が損なわれている可能性がある腫瘍内では制限しない）、（４）毒性の弱毒化
（これにより、宿主防御に対する感受性が増大し得るし、そして寄生生物は宿主
によって寛容されるが腫瘍内での複製は制限されない）、（５）腫瘍細胞への浸
潤能（腫瘍の標的化および抗腫瘍活性に役立つ）、（６）運動性（腫瘍全体にわ
たる透過に役立つ）、（７）処置の間に調節するため、および処置後に除去する
のための抗生物質感受性（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、ゲン
タマイシン、シプロフロキサチンに対する感受性）、ならびに抗生物質耐性マー
カー（例えば、株の構築に用いるようなもの）がないこと、および（８）表現型
の低い復帰変異速度（レシピエント個体に対する安全性に役立つ）、が挙げられ
る。

【００２１】３．発明の概要本発明は、腫瘍標的化細菌の安全性を、例えばリピドＡ分子の遺伝子改変によ
り、増強するための手段を提供する。本発明の改変腫瘍標的化細菌は、野生型細
菌よりも低いTNFαを誘導するものであり、正常な哺乳動物細胞を直接死滅させる能力もしくは全身的疾患を引き起こす能力が野生型株と比べて低下している。
本発明の改変腫瘍標的化細菌は、TNFαおよび全身的疾患をほとんど誘導しないという形態でのより低い毒性のために、増大した治療効率を有する（すなわち、
より有効な投与量の細菌を、長期間にわたって用いることが可能になる）。

【００２２】本発明は、細菌（例えばサルモネラ（Salmonella））におけるmsbB遺伝子の遺
伝子破壊のための組成物および方法を提供するものであり、それにより、野生型
と比べて低いTNFα誘起能および低い毒性を有する細菌（例えばサルモネラ（Sal
monella））が得られる。１つの実施形態において、本発明は、msbB遺伝子の遺伝子破壊物を選択するための改善された方法を提供する。さらに、この遺伝子改
変細菌は、野生型msbB遺伝子を有する細菌と比べてキレート剤に対して高い感受
性を有する。好ましい実施形態において、腫瘍組織に対して侵襲性の高い破壊さ
れたmsbB遺伝子を有するサルモネラ（Salmonella）は腫瘍内で複製可能であり、
そして、肉腫、癌腫、リンパ腫もしくは他の固形腫瘍性癌（例えば、生殖細胞系
の腫瘍および中枢神経系の腫瘍）の増殖の抑制および／またはそれらの腫瘍容積
を減少させるのに有用である。このような肉腫、癌腫、リンパ腫もしくは他の固
形腫瘍性癌としては、乳癌、前立腺癌、頚癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、
甲状腺癌、星状細胞腫、神経膠腫、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌および黒色腫
が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２３】本発明の実施形態において、細菌は他の手段によって弱毒化されており、その
ような手段としては生合成経路の突然変異（これは栄養要求性をもたらす）が挙
げられるが、これに限定されない。１つの具体的な実施形態では、この生合成経
路の突然変異はpurI遺伝子の遺伝子破壊である。別の実施形態では、細菌はプロ
ドラッグ変換酵素を発現するものであり、そのような酵素としては、HSV-TK、シ
トシンデアミナーゼ（CD）およびp450オキシドレダクターゼが挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【００２４】本発明はまた、治療の終了および治療後の除去において利用するための、増強
された感受性のための手段を提供する。本発明の１つの実施形態によれば、遺伝
子改変したリピドＡを有する腫瘍標的化細菌はまた、特定の薬剤（例えば、キレ
ート剤）に対して増強された感受性を有する。このように腫瘍標的化細菌を改変
することはさらに有利である。この理由は、それが、キレート剤のような抗生物
質様効果を有する薬剤により該細菌を除去する能力を増大させるからである。そ
のようなキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリ
コール-ビス（β-アミノエチルエーテル）N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）およびクエ
ン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、外因性の
手段により細菌を除去する能力を増大させるための改変、例えば遺伝子改変細菌
がその野生型のものよりも高い感受性を示す薬剤の投与、は有用である。

【００２５】本発明はさらに、msbB遺伝子および栄養要求性遺伝子の両方において欠失変異
を含むサルモネラ（Salmonella）株を提供する。具体的な実施形態において、こ
の栄養要求性欠失変異は、purI遺伝子に影響を及ぼす。好ましい実施形態では、
これらの突然変異は、該株の安全性を増大させることにつながる。別の好ましい
実施形態では、該株はまた、本明細書中に記載の、該株の有効性は増大させるが
その安全性にとっては必須でない他の突然変異も担持する。

【００２６】４．定義本明細書において、サルモネラ（Salmonella）は、サルモネラ・ティフィ（Sa
lmonella typhi）、サルモネラ・コレラエスイス（Salmonella choleraesuis）、およびサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）を含むす
べてのサルモネラ（Salmonella）種を包含する。サルモネラ（Salmonella）の血
清型もまた本発明に包含され、例えば、サルモネラ・エンテリティディス（Salm
onella enteritidis）の亜群であるティフィムリウム（typhimurium）（一般にサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）と呼ばれる）がある
。

【００２７】弱毒化：弱毒化は、微生物またはベクターの毒性を弱くする修飾である。弱毒
化の最終結果は、微生物またはベクターを患者に投与すると、毒性のリスクなら
びに他の副作用が低下することである。毒性：毒性は、正常な細胞を死滅させる能力または敗血症ショック（以下の具
体的な定義を参照）を誘発する能力を含む、疾患を引き起こす一般的能力を示す
相対的な用語である。敗血症ショック：敗血症ショックは、TNFαにより開始される複合サイトカインカスケードによる、内蔵の不全状態である。微生物またはベクターがTNFαを誘発する相対的能力は、敗血症ショックを誘導する相対的能力を示す１つの尺度
として使用される。キレート化剤感受性：キレート化剤感受性は、細菌増殖が影響を受ける有効濃
度、または回収可能なコロニー形成単位（c.f.u.）で測定する時、細菌の生存能
力が低下する有効な濃度として定義される。本発明は、以下の詳細な説明、具体的な実施態様中の例示的実施例および添付
の図面を参照することにより、さらに詳細に理解される。

【００２８】６．発明の詳細な説明本発明は、正常な形で存在する時、TNFα誘導、一般的な毒性、マクロファージ内での生存、および細菌の根絶を促進するいくつかの物質に対する非感受性に
寄与する、サルモネラ（Salmonella）の遺伝子（すなわち、msbB）の単離に基づ
く。本発明は、遺伝子産物の正常な機能の破壊を引き起こす遺伝子の遺伝子修飾
、および治療用途の腫瘍を標的化する細菌（サルモネラ（Salmonella）を含む）
への遺伝子修飾の取り込みに関する。好適な実施形態において、この細菌は、ms
bB遺伝子の遺伝子修飾ならびに栄養要求性を引き起こす生合成経路の遺伝子（例
えば、purI遺伝子）の遺伝子修飾を有する。

【００２９】好適な実施形態において、遺伝子修飾した細菌は、固形腫瘍のサイズの低下お
よび／または増殖阻害のために、ヒトを含む動物で使用される。さらなる好適な実施形態において、本発明に有用な細菌は、固形腫瘍細胞への
付着および浸透への選択性を示し、正常な組織より腫瘍組織中で増殖する傾向を
示す。これらの細菌には、特に限定されないが、癌細胞または新生物細胞と正常
な細胞／組織とを区別する自然の能力を有するサルモネラ（Salmonella）がある
。

【００３０】あるいは、本発明に有用な腫瘍細胞特異的細菌は、PawelekらのWO96/40238に記載の方法を使用する腫瘍標的化能力について選択されるか、および／または改
良される。Pawelekらは、１つまたはそれ以上の感染サイクルを使用して、あらかじめ選択した標的細胞、好ましくは固形腫瘍細胞をin vitroでまたは固形腫瘍
をin vivoでサイクリングして、腫瘍細胞特異的細菌を単離する方法を記載している。

【００３１】6.1 毒性に関与する遺伝子の単離／同定大腸菌（E. coli）遺伝子であるmsbBは、脂質Ａのミリスチン酸化に関与することが証明されている（Somervilleら、1996, J. Clin. Invest. 97:359-365）。大腸菌（E. coli）msbB遺伝子およびmsbB遺伝子をコードするDNA配列の染色体
構築が報告されている（Engelら、1992, J. Bacteriol. 174:6394-6403；Karow とGeorgopoulos、1992, J. Bacteriol. 174:702-710；Somervilleら、1996, J.
Clin. Invest. 97:359-365）。

【００３２】本発明に示すように、msbB遺伝子は、大腸菌（E. coli）以外の細菌株から、当該分野で公知の低ストリンジェンシーのDNA／DNAハイブリダイゼーション法を
使用して単離することができる（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989）。サルモネラ（Salmonella）種を含む（しか
し、特に限定されない）細菌のmsbB遺伝子の単離の例については、前記第7.1節を参照されたい。細菌DNAライブラリーは、大腸菌（E. coli）の³²P標識msbB遺伝子とプローブ結合することができる。ハイブリダイズするクローンは、既知の
大腸菌（E. coli）msbB遺伝子に類似のDNA配列を含有するなら、正しいと判定さ
れる。

【００３３】6.1.1 サルモネラ（Salmonella）msbBの遺伝子改変本発明の１つの実施形態は、msbB遺伝子中に遺伝子改変を有する細菌株である
組成物を提供する。好適な実施形態において、細菌はサルモネラ（Salmonella）
種である。破壊または欠失の形の遺伝子改変は、当業者に公知のいくつかの方法
（抗生物質耐性マーカーを使用する相同組換えを含む）により行うことができる
。これらの方法は、制限エンドヌクレアーゼを使用するプラスミドベースのクロ
ーン化したmsbB遺伝子の破壊を用い、その結果遺伝子の一部またはすべてが破壊
されるか排除され、そのため正常な転写および翻訳が妨害され、その欠失、破壊
または他の改変の領域に、表現型選択のために抗生物質耐性マーカーが挿入され
る。線状化DNAをサルモネラ（Salmonella）中に形質転換し、抗生物質耐性を有する細菌を、遺伝子改変の証拠についてさらに調べる。遺伝子改変を調べる方法
には、PCR分析およびサザンブロッティングがある。サルモネラ（Salmonella）m
sbB遺伝子の遺伝子破壊の例については、第7.2節を参照。

【００３４】本発明の別の実施形態において、msbB^-／抗生物質耐性マーカーは、新しい細菌株中に形質導入することができる。例を、第7.2節に示す。バクテリオファージP22およびサルモネラ（Salmonella）msbB^-クローンは、ゼロ塩Luriaブロス（z
ero salt Luria broth）中で増殖させることができ、上清中の新しいファージを
使用して、新しいサルモネラ（Salmonella）株に感染させることができる。本発明のさらに別の実施形態は、２つ以上の方法（例えば、本明細書に記載の
msbB突然変異のような脂質Ａ産生経路の突然変異、および１つまたはそれ以上の
栄養物質または代謝物に対する栄養要求性の１つまたはそれ以上の突然変異、例
えば、Bochner, 1980, J. Bacteriol. 143:926-933（参照することにより本明細
書の一部とする）に記載のようなウラシル生合成、プリン生合成、およびアルギ
ニン生合成）で弱毒化されるサルモネラ（Salmonella）を提供する。好適な実施
形態において、msbB^-サルモネラ（Salmonella）が腫瘍内で蓄積する能力は、栄養要求性株を生成する１つまたはそれ以上の突然変異を有するmsbB^-サルモネラ（Salmonella）により保持される。本発明のこの実施形態のより好適な面におい
て、腫瘍を選択的に標的化しプロドラッグ変換酵素を発現する細菌ベクターは、
ウラシル、芳香族アミノ酸、イソロイシン、およびバリンに対して栄養要求性で
あり、改変された脂質Ａを合成する。具体的な好適な実施形態において、msbB^- サルモネラ（Salmonella）はまた、生合成経路遺伝子であるpurIの遺伝子修飾を
含有し、野生型と比較してこの株の毒性を低下させる。例を第７節と８節に示す
。

【００３５】6.1.2 破壊されたmsbBを有するサルモネラ（Salmonella）の特徴本明細書に記載のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）の特徴は、野生型細菌ベクターに比較して、TNFα応答を誘導する能力の低下である。細菌全体および単離または精製されたリポ多糖（LPS）は、TNFα応答を誘発する。本発明の実施形態
において、msbB^-サルモネラ（Salmonella）は、野生型サルモネラ（Salmonella ）種に比較して約５パーセント〜約40パーセントでTNFα発現を誘導する（すなわち、msbB^-サルモネラ（Salmonella）は、野生型サルモネラ（Salmonella）、例えばWT 14028により誘導されるレベルの約５パーセント〜約40パーセントでTN
Fα発現を誘導する）。本発明の好適な実施形態において、msbB^-サルモネラ（Sa
lmonella）は、野生型サルモネラ（Salmonella）種により誘導されるレベルの約
10パーセント〜約35パーセントでTNFα発現を誘導する。本発明の実施形態において、msbB^-サルモネラ（Salmonella）から精製したLPSは、野生型サルモネラ（
Salmonella）種から精製したLPSにより誘導されるレベルの0.001パーセント未満
であるかまたは0.001パーセントと同等のレベルでTNFα発現を誘導する。全細菌
または単離もしくは精製したLPSにより誘導されるTNFα応答は、酵素結合免疫吸
着測定法（ELISA）のような市販のアッセイ系を使用して、in vitroまたはin vi
voで評価することができる。例については、第7.3.1節と7.3.2節（前述）を参照
されたい。c.f.u.当りまたはmg/kgベース当りのTNFα産生の比較は、相対活性を
測定するのに使用される。単位ベース当りでTNFαレベルが低いことは、TNFα産
生の誘導が低下していることを示す。

【００３６】毒性の低下本明細書に記載のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）の別の特徴は、野生型細菌ベクターに比較して、宿主癌患者に対する毒性が低下していることである。野生
型サルモネラ（Salmonella）は、ある条件下で、顕著な進行性疾患を引き起こす
能力を示すことがある。急性致死率は、動物モデルを使用して通常の野生型の生
きたサルモネラ（Salmonella）と生きたmsbB^-サルモネラ（Salmonella）について測定することができる。例については、第7.4節と第９節、表IIIを参照された
い。一定の接種量について動物の生存率を比較して、相対的毒性が測定される。
生存率が高い株は、毒性が低下している。

【００３７】マクロファージ内の生存率の低下本明細書に記載のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）の別の特徴は、野生型細菌の生存率と比較して、マクロファージ細胞内の生存率の低下である。野生型サル
モネラ（Salmonella）（例えば、ATCC14028）は、マクロファージ内で生存できることが特徴である（Baumlerら、1994, Infect. Immun. 62:1623-1630；Buchme
ierおよびHeffron 1989, Infect. Immun. 57:1-7；BuchmeierおよびHeffron 199
0, Science 248:730-732；Buchmeierら、1993, Mol. Microbiol. 7:933-936；Fi
eldsら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5189-93；Fieldsら、1989, Sci
ence 243:1059-62；Fiererら、1993, Infect. Immun. 61:5231-5236；Lindgren ら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3197-4201；Millerら、1989, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86:5054-5058；Sizemoreら、1997, Infect. Immun. 65:309
-312）。

【００３８】 in vitro細胞培養アッセイを使用して、マクロファージ内での生存時間を比較
することができる。経時的なc.f.u.数の低下は、マクロファージ内の生存率の低
下を示す。例については第８節（前述）を参照されたい。本明細書に記載のよう
に、ゲンタマイシンベースのインターナリゼーションアッセイ、および骨髄由来
のマウスマクロファージまたはマウスマクロファージ細胞系J774を使用して、WT
14028とmsbB^-クローンYS8211の生存率を比較することができる。本発明の実施形態において、生存率は、野生型株の生存率の約50パーセント〜約30パーセント
；好適には約30パーセント〜約10パーセント；さらに好適には約10パーセント〜
約１パーセントである。

【００３９】感受性の上昇本明細書に記載のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）の１つの実施形態の他の特徴は、特定の化学物質に対する、腫瘍標的化細菌の感受性の上昇であり、これは
、in vivo投与後に細菌の排除を促進するのに有用である。細菌は、広範なクラスの抗生物質に感受性がある。しかし驚くべきことに、本発明により包含される
いくつかのサルモネラ（Salmonella）msbB^-突然変異体は、通常抗生物質ではないとみなされる化学物質に対して感受性であることが発見された。特にいくつか
のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）突然変異体は、キレート化剤に対してWT 1402
8よりも感受性が高い。 msbB^-大腸菌（E. coli）の従来の説明は、このようなキレート化剤に対する感
受性の上昇を示唆していない。それどころか、デオキシコール酸のような界面活
性剤に対する耐性の上昇を報告している（KarowとGeorgopoulos 1992 J. Bacter
iol. 174:702-710）。

【００４０】化学物質に対する感受性を測定するために、キレート化剤（例えば、EDTA、EG
TAまたはクエン酸ナトリウム）の存在下または非存在下での増殖について、通常
の野生型細菌とmsbB^-細菌を比較する。増殖の比較は、光学密度の関数として測定され、すなわち或る物質の非存在下で増殖したmsbB^-株より、その存在下で増殖したmsbB^-株の光学密度が低いことは、感受性を示す。さらにある物質の存在下で増殖したmsbB⁺株に比較して、その存在下で増殖したmsbB^-株の光学密度が低
いことは、特にmsbB突然変異による感受性を示す。例については、第7.7節（後述）を参照されたい。本発明の実施形態において、msbB^-サルモネラ（Salmonell
a）の90パーセント増殖阻害（野生型サルモネラ（Salmonella）種と比較して）が、約0.25mM EDTA〜約0.5mM EDTAで起き、好適には約99パーセント阻害が、約0
.25mM EDTA〜約0.5mM EDTAで起き、さらに好適には99パーセントを超える阻害が
、約0.25mM EDTA〜約0.5mM EDTAで起きる。同様の範囲の増殖阻害は、EGTAの同様の濃度で観察される。

【００４１】msbB突然変異体の誘導体ゼロ塩を含有するLuriaブロス（LB）中で増殖させると、本発明のmsbB^-突然変
異体は安定であり、すなわちほとんど誘導体を産生しない（後述）。改変LB（１
リットル当たり10ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、２mlの１Ｎ CaCl₂、およ
び２mlの１Ｎ MgSO₄、１Ｎ NaOHを使用してpH７に調整する）でのmsbB^-突然変異
体の継続的増殖はまた、安定な突然変異体を維持する。これに対して、通常のLB中で増殖すると、msbB^-突然変異体は誘導体を生成することがある。本明細書において「誘導体」とは、元来のmsbB^-突然変異体と比較して、異なるレベルの毒性、腫瘍阻害活性、および／またはキレート化剤に対
する感受性を特徴とするmsbB^-突然変異体の自然の変種を意味する。誘導体の毒性のレベル、腫瘍阻害活性、およびキレート化剤に対する感受性は、元来のmsbB
^-突然変異体と比較して大きいか、等しいか、または小さい。

【００４２】 msbB^-株の誘導体は、非改変LB上で元来のmsbB^-株より速く増殖する。さらに誘
導体は、MacConkey寒天（胆汁酸塩を含有する寒天）上で増殖する能力、およびキレート化剤（例えば、EGTAおよびEDTA）に対する耐性により認識することがで
きる。誘導体は、当該分野で周知の方法に従って−70℃での低温保存または凍結
乾燥により安定に保存することができる（Cryzら、1990、New Generation Vacci
nes中, M.M. Levine（編）、Marcel Dekker, New York pp. 921-932；Adams, 19
96、Methods in Molecular Medicine: Vaccine Protocols中、Robinsonら（編）
、Humana Press, New Jersey, pp. 167-185；Griffiths, 同上、pp. 269-288）。

【００４３】毒性は、動物の半分が死滅する用量（LD₅₀）を評価することにより決定される
。誘導体のLD₅₀を比較して、相対的毒性を評価することができる。msbB^-親株と比較して天然誘導体のLD₅₀が低下していることは、毒性の上昇を示す。例えば、
増殖の速い誘導体は、元来の変異株（第９節、表IIIを参照）と比較して、同程度の毒性もしくは程度の高い毒性、または低レベルの毒性を示す。別の例では、
TNFαを誘導する誘導体の能力は、元来の変異株（第7.3節、図７を参照）と同じ
である。

【００４４】例では、誘導体は、元来の各変異株より強くまたは弱く腫瘍増殖を阻害する（
第7.6節、図11を参照）。元来のmsbB^-突然変異体YS8211は、腫瘍増殖を強く阻害
し、このクローンの誘導体であるYS8212は腫瘍増殖阻害活性が弱いことが、第7.
6節で証明されている。これに対して誘導体YS1629は、その親msbB^-クローンであ
るYS7216より、腫瘍増殖阻害活性が上昇している。野生型と比較して、すなわち野生型サルモネラ（Salmonella）に誘導されるレ
ベルの約５パーセント〜約40パーセントのレベルで、親突然変異体より毒性であ
るがTNFαの誘導レベルはより低い誘導体は、栄養要求性に対して１つまたはそれ以上の突然変異を含有するようにさらに修飾することができる。例では、YS11
70誘導体は、１つまたはそれ以上の芳香族アミノ酸（例えば、aroA）について栄
養要求性になるように突然変異され、従って毒性が小さくなり、本発明の方法に
従って有用である。さらなる例では、purI遺伝子（プリン生合成に関与）の遺伝
子修飾により、親株より毒性が小さいサルモネラ（Salmonella）株が得られる（
第７節と８節を参照）。本発明の方法の誘導体を使用する前に、誘導体を評価して、その毒性レベル、
TNFα誘導能力、腫瘍増殖阻害能力、およびキレート化剤に対する感受性を決定する。

【００４５】6.2 腫瘍標的化および固形腫瘍のin vivo治療のための破壊されたmsbBを有するサルモネラ（Salmonella）の使用本発明において、msbB^-突然変異サルモネラ（Salmonella）は、固形腫瘍を有するヒトを含む動物の腫瘍増殖阻害応答または腫瘍サイズの低下を生成させるた
めの方法で、有利に使用される。そのような応用において、msbB^-突然変異サルモネラ（Salmonella）は、腫瘍標的化能力すなわち正常細胞／組織より好ましく
は腫瘍細胞／組織を標的化することが利点である。さらに、msbB^-突然変異サルモネラ（Salmonella）が、腫瘍増殖を遅延または低下させ、および／または腫瘍
増殖を遅延または低下させる遺伝子または遺伝子産物を送達することが利点であ
る。腫瘍標的化能力は、当業者に公知の種々の方法（特に限定されないが、癌動
物モデルを含む）により評価することができる。例えば、msbB^-修飾を有するサルモネラ（Salmonella）を評価して、B16F10黒色腫皮下動物モデルを使用して腫瘍標的化能力を有するかどうかを決定すること
ができる。腫瘍対肝臓の比が正であることは、遺伝子修飾したサルモネラ（Salm
onella）が腫瘍標的化能力を有することを意味する。例としては、第7.5節を参照されたい。

【００４６】 msbB^-修飾を有するサルモネラ（Salmonella）を測定して、多くの標準的in vi
voモデルのいずれか（例えば、B16F10黒色腫皮下動物モデル）を使用して、これ
らが抗腫瘍活性を有するかどうか決定することができる。例えば、特に限定され
ないが、腫瘍をマウスのわき腹に移植し、８日目まで進行させ、次に細菌株を腹
腔内投与する。腫瘍のサイズを経時的に追跡する。未処理の腫瘍含有動物より細
菌含有群で腫瘍が小さい場合は、抗腫瘍活性が存在すると決定する。例えば、第
7.6節（後述）を参照されたい。 in vivo治療のための本発明のサルモネラ（Salmonella）を遺伝子修飾して、宿主に投与した時、宿主への細菌の毒性が小さくかつ宿主系から排除し易いよう
にする。サルモネラ（Salmonella）は重複感染性（super-infective）であり、弱毒化され、標的腫瘍細胞に対して特異的である。さらに好適な実施形態におい
て、サルモネラ（Salmonella）は、抗生物質様活性を有するキレート化剤に対し
て感受性でもよい。

【００４７】さらに、本発明の方法で使用されるサルモネラ（Salmonella）は、標的腫瘍内
またはその近くでサルモネラ（Salmonella）により発現されかつ分泌されるプロ
ドラッグ変換酵素または他の遺伝子のような「自殺遺伝子」をコードすることが
できる。PawelekらのWO96/40238の34〜35頁の表２は、本発明の方法で使用されるmsbB^-突然変異体サルモネラ（Salmonella）により有用に分泌され発現されるプロドラッグ変換酵素の例のリストを示す。表２および32〜35頁は、参考として
本明細書中に組み入れる。この遺伝子は、構成性、誘導性または細胞型特異的プ
ロモーターの制御下にあってもよい。本発明の方法の突然変異体サルモネラ（Sa
lmonella）に有用なさらなるプロモーターについては、Pawelekらの35〜43頁（参考として本明細書中に組み入れる）を参照されたい。好適な実施形態において
、自殺遺伝子は、サルモネラ（Salmonella）が標的腫瘍細胞の細胞質に侵入した
時のみ発現かつ分泌され、従って腫瘍の標的部位への自殺遺伝子の発現のために
、作用が限定される。

【００４８】好適な実施形態において、宿主に投与されるサルモネラ（Salmonella）は、HS
V TK遺伝子を発現する。TK遺伝子の発現と宿主へのガンシクロビル（ganciclovi
r）の投与を同時に行うことで、ガンシクロビルは、ヌクレオチド３リン酸が自由に浸透する微生物の周辺細胞質でリン酸化さる。毒性擬DNA前駆体であるリン酸化されたガンシクロビルは、容易に微生物の周辺細胞質を通過して細胞質およ
び宿主細胞の核に達し、そこで宿主細胞DNA中に取り込まれ、宿主細胞の死滅を引き起こす。固形腫瘍の増殖を阻害またはそのサイズを低下させる本発明の方法は、遺伝子
修飾したmsbB遺伝子を含む単離した突然変異体サルモネラ（Salmonella）種の有
効量を、固形腫瘍を有する患者に投与することを含んでなり、該突然変異体はin
vivoで投与された時、固形腫瘍を標的化することができる。msbB^-突然変異サル
モネラ（Salmonella）はまた、前記のように自殺遺伝子を発現することができる
。

【００４９】さらにある実施形態において、単離したサルモネラ（Salmonella）は、キレー
ト化剤に対する感受性について分析して、治療が成功した後にまたは単離したサ
ルモネラ（Salmonella）の投与により患者が合併症を経験するなら、患者の体か
らサルモネラ（Salmonella）を排除することを簡単にする。すなわちキレート化
剤に感受性のサルモネラ（Salmonella）が使用されるなら、約0.25mM〜約1.0mM のキレート化剤（例えばEGTA、EDTAまたはクエン酸ナトリウム）を投与して、抗
腫瘍作用が達成された後にサルモネラ（Salmonella）の排除を助ける。患者に（例えば、獣医的用途で動物に、または臨床的用途でヒトに）投与した
時、突然変異サルモネラ（Salmonella）は単独で使用するか、または任意の生理
学的担体（例えば、水、水溶液、通常の食塩水、または他の生理学的に許容され
る賦形剤）と組合せてもよい。一般に用量は、約1.0c.f.u./kg〜約１×10¹⁰c.f.
u./kg；場合により約1.0c.f.u./kg〜約１×10⁸c.f.u./kg；場合により約1×10²c
.f.u./kg〜約１×10⁸c.f.u./kg；場合により約1×10⁴c.f.u./kg〜約１×10⁸c.f.
u./kgの範囲である。

【００５０】本発明の突然変異サルモネラ（Salmonella）は、いくつかの経路で投与され、
特に限定されないが、経口、局所的、注射（特に限定されないが、静脈内、腹腔
内、皮下、筋肉内、腫瘍内（すなわち、腫瘍への直接注射））により投与するこ
とができる。以下の一連の例は例示のためであり、決して本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００５１】７．実施例：サルモネラ（Salmonella）msbBの破壊による毒性の喪失、TNFα刺激の低下、およびキレート化剤感受性の上昇 7.1 サルモネラ（Salmonella）msbB遺伝子の単離と組成まずサルモネラ（Salmonella）ゲノムDNAライブラリーを構築した。野生型サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）（ATCC 14028株）を一
晩増殖させ、Sambrookらの方法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第
２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989）に従ってゲノムDNAを抽出した。Sau3Aでの時間制限消化により２〜10kBの範囲のサ
イズ選択した制限エンドヌクレアーゼ消化断片を作成し、アガロースゲル電気泳
動により選択した。これらの断片をpBluescript SK-に連結し、大腸菌（E. coli
）DH5αに形質転換した。クローンのランダム解析により、平均サイズが5.1 Kb のDNAインサートが≧87％で得られた。このライブラリーは、1.4×10⁴個の独立したクローンからなっていた。大腸菌（E. coli）起源のmsbBプローブのハイブリダイゼーションを低下させるために、大腸菌（E. coli）中の100％相同的な染
色体遺伝子に、リン酸緩衝化生理食塩水を注ぎ、ガラス棒でコロニーをはがして
シャーレから全ライブラリーを採取し、得られた細菌集団を大規模プラスミド単
離を行って、増幅したサルモネラ（Salmonella）ライブラリープラスミドプール
を得た。次に、このプラスミドプールをサルモネラ（Salmonella）LT2 YS5010に
形質転換し、こうして大腸菌（E. coli）バックグランドを排除した。

【００５２】大腸菌（E. coli）msbB遺伝子（KarowとGeorgopoulos 1992 J. Bacteriol. 17
4:702-710）のクローンを使用して、BglII/HincIIによる大腸菌（E. coli）の消
化およびコード配列の一部に対応する600 bp断片の単離により、msbBホモログの
プローブを作成した。この断片をα³²Ｐ-dCTPを使用して標識し、これを使用して、６×SSC、0.1％SDS、２×デンハルツ、0.5％脱脂粉乳からなる低ストリンジ
ェンシー条件下で55℃で一晩、サルモネラ（Salmonella）ライブラリーをプロー
ブ化した。強くハイブリダイズするコロニーを精製し、プラスミドを抽出し、制
限酵素消化し、コロニーハイブリダイゼーションと同じ条件下でin situゲルハイブリダイゼーションさせた（EhteshamとHasnain 1991 BioTechniques 11:718-
721）。さらなる制限酵素消化により、プローブに強くハイブリダイズする1.5 k
BのDNA断片が得られ、これを蛍光色素停止サーマルサイクラー配列決定法を使用
して、Yale大学Boyer Centerで配列決定した。配列解析により、1.5 kbの断片は
、大腸菌（E. coli）遺伝子のものに対応する開始メチオニンが明らかに欠如したmsbBホモログを含有することが明らかになった。EcoR1/XbaIをを使用して制限
酵素消化を行い、再度ライブラリーにハイブリダイズさせて、このクローンの5'
領域からなるプローブを作成した。サルモネラ（Salmonella）msbB遺伝子の完全
なヌクレオチド配列（配列番号１）とコードされるタンパク質の推定アミノ酸配
列（配列番号２）を図１に示す。推定サルモネラ（Salmonella）msbBと大腸菌（
E. coli）msbBのDNA相同性は75％である。タンパク質相同性は98％であり、クロ
ーン化したサルモネラ（Salmonella）遺伝子が真のmsbBであることを証明してい
た。

【００５３】7.2 サルモネラ（Salmonella）msbBの遺伝子改変クローン化サルモネラ（Salmonella）msbB遺伝子を使用してノックアウト構築
物を作成した。クローン化遺伝子をSphIとMluIで切断し、こうしてmsbBコード配
列の約半分を除去し、AatIIとAvaIで切断したpBR322からのテトラサイクリン耐性遺伝子を、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用して平滑末端化した後に、挿入した（図2A-2C）。相同組換え法（Russellら、1989, J. Bacteriol. 171:
2609）によりノックアウト破壊を行なった；構築物をSacIとKpnIで線状化し、ゲ
ル精製し、電気穿孔法によりサルモネラ（Salmonella）LT2 YS501にトランスフェクトした。形質転換プロトコールからの細菌をまずテトラサイクリンプレート
上で選択し、次にアンピシリン耐性により、プラスミドを含有する非染色体組み
込み汚染物質の存在について試験し、標準的プラスミドミニプレップ（Titus, D
. E.編、Promega Protocols and Applications Guide, Promega Corp, 1991）に
より測定してプラスミドの存在について試験した。テトラサイクリン耐性であっ
たがプラスミドが欠如した細菌コロニーを、そのmsbB遺伝子の構造をPCRベースの解析に付した。PCRでは、テトラサイクリン遺伝子を挿入した領域を含む断片を生成するプライマーを使用し、前進プライマーは、塩基586〜606に対応する G
TTGACTGGGAAGGTCTGGAG（配列番号３）と、塩基1465〜1485に対応する逆プライマ
ーCTGACCGCGCTCTATCGCGG（配列番号４）であった。野生型サルモネラ（Salmonel
la）msbB＋は、約900塩基対生成物を与え、テトラサイクリンインサートを有する破壊した遺伝子は、約1850塩基対生成物を与えた。いくつかのクローンが得ら
れ、そこでは大きなPCR産物のみが産生され、これはmsbB遺伝子中の破壊が起きたことを示していた。

【００５４】サザンブロット解析を使用して、サルモネラ（Salmonella）msbBの染色体コピ
ーの破壊を確認した。プラスミドベースのノックアウト構築物（KO）を、野生型
および推定の破壊msbBクローンであるYS82、YS86、YS8211、およびYS861からのゲノムDNAと比較した。DNAをAseI/BamHIで２重消化し、0.9％または1.2％アガロ
ースでアガロースゲル電気泳動して分離した。YS8211とYS861の結果を図3A-3Cに
示す。同様のゲルを、３つの異なる基準に付した：3A）³²Ｐテトラサイクリン遺
伝子断片とプローブ結合した時テトラサイクリン遺伝子の存在、3B）クローン化
msbBから得られた³²Ｐ標識AseI/BamH1断片とプローブ結合したした時、制限断片
長、および3C）msbB遺伝子を破壊するためおよびテトラサイクリン遺伝子を挿入
するために除去したmsbB mluI断片の有無（図3A-3C）。msbB遺伝子を破壊するた
めおよびテトラサイクリン遺伝子を挿入するためにmluI断片を除去したため、こ
のプローブは野生型図3C（レーン２ WT）とプローブ結合するが、ノックアウト
構築物（レーン１ KO）、またはクローン（レーン３と４ YS8211とYS821）とはプローブ結合しないと予測され、従ってmsbB遺伝子の遺伝子改変を確認してい
た。試験した各クローンは、msbB遺伝子欠失（ノックアウト）の予測される基準
のすべてを示した。これらのデータは、クローン化DNAから得られた標識オリゴヌクレオチドとプローブ結合した時、他のハイブリダイズするバンドは観察され
なかったため、msbBが野生型サルモネラ（Salmonella）中で単一のコピーとして
存在することを確認している。

【００５５】 msbB突然変異を確認した後、msbB^-突然変異を含有するさらなる株を作成した。使用したサルモネラ（Salmonella）株は、WT 14028とYS72（WT 14028からのpu
r^-xy1^-超侵入性突然変異体；Pawelekら、WO96/40238）を含有した。P22形質導入
を使用して、YS82をドナーとして使用してYS8211（msbB::tet）を作成し、YS86 をドナーとしてYS861とYS862を作成した。YS82をドナーとして使用して、YS7216
（YS72からのmsbB1::tet）を作成した。いくつかの酵母は本発明により包含され
、特に限定されないがYS8211の誘導体（YS8212、YS1170）、YS862の誘導体（YS8
644、YS8658）、およびYS7216の誘導体（YS1601、YS1604、YS1629）を含む。好適な実施形態において、天然の誘導体は、形質導入により作成した野生型14028 またはmsbB^-クローンと比較してLuria寒天上で幾分速く増殖する。msbB＋株をLB
ブロスまたは1.5％寒天を含有するLBプレート上で37℃で増殖させた。msbB^-株は
、１リットル中10ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、２mlの１Ｎ CaCl₂、および２
mlの１Ｎ MgSO₄（１Ｎ NaOHを使用してpH７に調整する）を含有する改変LB中で増殖させた。msbB1::tetを形質導入するために、４mg/lのテトラサイクリンを含
むがNaClが欠如したLBを使用した。液体培養物を225rpmで振盪した。腫瘍標的化
実験のために、LBで細胞を１：100希釈し、OD₆₀₀＝0.8〜1.0になるまで増殖させ
、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、PBS中に再懸濁した。

【００５６】7.2.1 ショ糖で前選択してmsbB遺伝子改変を選択するための改良法ショ糖で前選択してmsbB遺伝子改変を選択するための改良法が見出された。こ
の前選択法は、sacB遺伝子を保持するコロニーの選択に基づく。sacB遺伝子は、
毒性化学物質であるレバン（これは宿主細胞に対して致死的であり、従って組み
換え体の選択に使用することができる）へのショ糖の変換に関与する。sacB遺伝
子の欠失を受ける株のみが、ショ糖含有培地上で生存することができ、従ってシ
ョ糖耐性特性 suc^rを有する。後述するように、sacB遺伝子を保持するコロニーの前選択は、希釈と、通常のショ糖選択で行われるようなショ糖⁽⁺⁾対ショ糖^(-)
コロニーの比較の必要性を排除した。

【００５７】ショ糖系の通常の選択法 msbB(Δ)blaとsacB遺伝子を有するプラスミドを有する大腸菌（E. coli）SM10
λpirをドナーとして使用した。ベータラクタマーゼのbla遺伝子は、アンピシリ
ン耐性を与える。通常の選択法では、ドナー株を、標準的接合法を使用して、ms
bB(Δ)bla sacBを有するプラスミドを導入すべきサルモネラ（Salmonella）株と
接合した。サルモネラ（Salmonella）株は第２の抗生物質耐性マーカー（例えば
、ストレプトマイシン耐性）を含有したため、次に組換えサルモネラ（Salmonel
la）クローンを、アンピシリンとストレプトマイシンに対する２重耐性について
選択した。個々のクローンの変化(resolution)を調べるために、各クローンの希
釈物を、ショ糖の無いLBまたは５％ショ糖含有LB上にまいた。sacB遺伝子の欠失
または改変を受けた株のみが、ショ糖上で生存することができる。ショ糖⁽⁺⁾またはショ糖^(-)プレート上でのクローンの数を比較して、変化を受けた細菌細胞の割合を示す。次にショ糖耐性コロニーを、アンピシリンとテトラサイクリンに
対する感受性について試験した。Tet^Sとamp^Sは、部分的msbB遺伝子領域を有する
クロスオーバーの間のsacBとbla遺伝子の切り出しを示す。次にPCRを使用して、
tet^S amp^S クローン中に存在するmsbBアイソフォームを確認した。

【００５８】ショ糖系の前選択プロトコール：通常のショ糖プロトコールを変化させると、sacB遺伝子を保持するコロニーを
前選択することにより、より多数のコロニーのスクリーニングが可能になった。
この前選択法は、多数のコロニーからのショ糖⁽⁺⁾対ショ糖^(-)の試験と比較の必
要性を排除した。前記の結合操作後、コロニー（この段階では純粋ではない）を
直接、５％ショ糖を含有するLBプレートに方眼状に広げ、30℃で増殖させた。得
られた不純コロニー（これは増殖し続けた）は、ショ糖上での生存物を与えた。
ショ糖耐性コロニーのうち、次に「毛羽状の縁(fuzzy edges)」を有する表現型の変化を示すものを希釈し、ショ糖（＋）またはショ糖（−）プレート上にまい
た。次に前記のようにテトラサイクリンとアンピシリンに対する感受性を試験し
、PCRによりmsbBアイソフォームを確認した。この改良法を使用して、msbB(Δ)b
la sacB染色体成分のP22ファージ形質導入のための株を作成した。次にこれらの
株を使用して、YS1456株とYS1646株を作成した。これらは、本発明の新規msbB突
然変異体の好適な実施形態である（図15と16を参照）。

【００５９】7.3 サルモネラ（Salmonella）msbBの破壊はTNFα誘導を低減させる 7.3.1 マウスでのTNFα誘導 WT 14028とmsbB^-クローンであるYS8211をまず、LB培地中37℃で225rpmで振盪しながら飽和するまで増殖させた。次にこれらの細菌株の１：100希釈物を新鮮なLBに移し、37℃で225rpmで振盪しながらOD₆₀₀＝1.0になるまで増殖させた。細
菌をPBSで希釈し、PBSを陰性対照として使用して、1.0×10⁸c.f.u.（約５×10⁹c
.f.u./kg）をBalb/cマウス（ｎ＝４／株）の尾静脈に注射した。1.5時間後、心臓穿刺により３重試料で血清を採取し、遠心分離して細胞含有物を除去し、Bios
ource International Cytoscreen ELISAプレートを使用して、TNFαについて分析し、これをMolecular Devices Emaxマイクロタイタープレートリーダーで読ん
だ。結果は図４に示し、野生型サルモネラ（Salmonella）により誘導されるTNFα のレベルのパーセントとして表示する。図４に示すように、YS8211はWT 14028よりTNFαの誘導が有意に弱かった。すなわち図４に示すように、msbB^-株はTNFαを野生型msbB⁺株の約33％（すなわち、３倍小さい）誘導した。

【００６０】7.3.2. ブタでのTNFα誘導サルモネラ（Salmonella）のmsbB^-株であるYS8212とWT 14028をまず、LB培地中で37℃で振盪しながら225rpmで飽和するまで増殖させた。次にこれらの細菌株
の１：100希釈物を新鮮なLBに移し、37℃で225rpmで振盪してOD₆₀₀＝0.8になるまで増殖させた。細菌をPBSで洗浄し、1.0×10⁹c.f.u.（約１×10⁸c.f.u./kg）をSinclairブタ（ｎ＝６／株）の耳静脈に注射した。1.5時間と６時間後、血清を採取し、遠心分離して細胞含有物を除去し、後の分析のために凍結した。TNF αの分析には、Genzyme Predicta ELISAプレートを使用し、これをGilson分光光
度計で読んだ。結果は図５に示し、TNFαピコグラム／ml血清として表示する。図５に示すように、90分で、msbB^-株により誘導されるTNFαのレベルは、サル
モネラ（Salmonella）WT 14028に誘導されるものより有意に弱かった。

【００６１】7.3.3 ブタのサルモネラ（Salmonella）LPS誘導性(LPS-induced)呼吸 Galanosらが記載した方法（1969 Eur. J. Biochem. 9:245-249）を使用して、
サルモネラ（Salmonella）WT 14028とmsbB^-クローンであるYS8212からリポ多糖（LPS）を調製した。簡単に説明すると、OD₆₀₀が1.0になるまで増殖させた細菌からLPSを抽出した。この細菌を遠心分離してペレット化し、蒸留水で２回洗浄し、−20℃で凍結した。18.3mlのH2O：15mlのフェノールの混合物で振盪水浴で7
0℃で１時間抽出してLPSを精製した。この混合物を氷冷し、20,000×ｇで15分遠
心分離し、水層を除去した。NaClを0.05Ｍになるように添加し、２部のエタノー
ルを添加し、氷上でインキュベートし、次に2000×ｇで10分遠心分離して、LPS を水層から沈殿させた。ペレットを0.05ＭのNaClに再溶解した後沈殿を繰り返し
、ペレットを凍結乾燥した。LPSを無菌蒸留水に溶解し、５μg/kgまたは500μg/
kgのLPSを、イソフルランで麻酔したSinclairブタの耳静脈に注射した。1.5時間
および6.0時間後に、呼吸速度を測定し記録した。結果は図６に示し、時間０での呼吸（ｔ₀）のパーセントとして表示する。図６に示すように、野生型LPSを投与したブタは、msbB^-株のLPSを投与したブタと比較して、呼吸は有意に高かった。すなわちサルモネラ（Salmonella）での
msbB遺伝子の破壊は、脂質Ａを修飾させ、これは、呼吸を上昇させる能力を低下
させる。

【００６２】7.3.4 ヒト単球中のTNFα誘導末梢血をIsolymph（Pharmacia）で遠心分離してヒト単球を調製し、RPMI1640 を含有する24ウェルプレートに接着させた。ますサルモネラ（Salmonella）WT 1
4028といくつかのmsbB^-14028株（YS8211、YS8212、YS8658、およびYS1170）を、
LB培地中で37℃で225rpmで振盪して飽和するまで増殖させた。次にこれらの細菌
株の１：100希釈物を新鮮なLBに移し、225rpmで振盪してOD₆₀₀＝0.8になるまで増殖させた。細菌を細胞培養ウェルに添加し、2.0時間後に培地を採取し、遠心分離して細胞含有物を除去し、Genzyme Predicta ELISAプレートを使用してTNF αについて解析し、これをGilson分光光度計を使用して読んだ。データは図７に示し、TNFαピコグラム／ml血清として表示する。図７に示すように、msbB^-株は、野生型株よりもTNFα誘導が有意に低かった。

【００６３】7.3.5 ヒト単球中のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）LPS TNFα誘導末梢血をIsolymph（Pharmacia）で遠心分離してヒト単球を調製し、RPMI1640 を含有する24ウェルプレートに接着させた。Galanosらが記載した方法（1969 Eu
r. J. Biochem. 9:245-249）（簡単な説明については第7.3.3節を参照）を使用して、野生型といくつかのmsbB^-突然変異体サルモネラ（Salmonella）（YS8211 、YS8212、YS8658、およびYS1170）のリポ多糖（LPS）を調製した。LPSを、無菌
蒸留水に溶解し、0.001〜100ng/mlの範囲のLPSを細胞培養ウェルに加えた。15時
間後、培地を採取し、遠心分離して細胞含有物を除去し、Genzyme Predicta ELI
SAプレートを使用してTNFαについて解析し、これをGilson分光光度計を使用して読んだ。データは図８に示し、TNFαピコグラム／ml血清として表示する。図８に示すように、msbB^-株から精製したLPSは、野生型株からのLPSよりもTNF
α誘導が有意に低かった。

【００６４】7.4 サルモネラ（Salmonella）msbBの破壊は毒性を低下させる 7.4.1 マウスの場合野生型サルモネラ（Salmonella）14028の培養物とmsbB^-サルモネラ（Salmonel
la）クローン（YS862）の培養物を、塩化ナトリウムを含まないLB培地中で37℃ で250rpmで振盪してOD₆₀₀＝0.8になるまで増殖させた。細菌を１：10の比でリン
酸緩衝化生理食塩水（PBS）に希釈し、２×10⁷c.f.u.相当量を、B16F10黒色腫を
有するC57BL/6マウス中に腹腔内投与した。毎日または２〜４日間隔で生存率を測定した。結果は図9Aに示し、生存パーセントで表す。図9Aに示すように、WT 14028は４日ですべてのマウスを死滅させ、msbB^-突然変異体では、マウスの90％は20日後も生存しており、msbB^-突然変異体による大幅な毒性の低下を証明している。

【００６５】7.4.2 ブタの場合 WT14028の培養物とそのmsbB^-サルモネラ（Salmonella）クローン（YS8212）の
培養物を、塩化ナトリウムを含まないLB培地中で37℃で250rpmで振盪してOD₆₀₀ ＝0.8になるまで増殖させた。細菌をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、1.0×10
⁹を、Sinclairブタの耳静脈に注射した（ｎ＝４／株）。毎日または２〜４日間隔で生存率を測定した。結果は図9Bに示し、生存パーセントで表す。図9Bに示すように、WT 14028は３日ですべてのブタを死滅させ、msbB^-突然変異体では、マウスの100％は20日後も生存しており、大幅な毒性の低下を証明している。

【００６６】7.5 msbB^-クローンの腫瘍標的化 msbB^-修飾を有するサルモネラ（Salmonella）WT 14028をアッセイして、B16F1
0黒色腫皮下動物モデルを使用して腫瘍標的化能力を有するかどうかを調べた。m
sbB^-クローンであるYS8211を、塩化ナトリウムを含まないLB培地中で37℃で250r
pmで振盪してOD₆₀₀＝0.8になるまで増殖させた。2.0×10⁶c.f.u.のアリコートを
、細菌を感染させる16日前に２×10⁵のB16黒色腫細胞を移植したC57BL/6マウスに静脈内注射した。細菌感染の２日後と５日後に、マウスを屠殺し、連続希釈物
をホモジネートし、まいて、細菌の存在について腫瘍と肝臓をアッセイした。結果を図10に示し、c.f.u.細菌／ｇ組織で表す。図10に示すように、２日目に
腫瘍対肝臓の比（700：１）が正であることが見出され、５日目に2000：１の正の比まで増加した。すなわちmsbB^-突然変異体は、固形癌腫瘍を標的化する能力を維持した。

【００６７】7.6 in vivoの抗腫瘍活性のための破壊したmsbBを有するサルモネラ（Salmonell a）の使用サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）14028msbB^-クロー
ンであるYS8211、YS8212、YS7216、YS1629、およびWT 14028（対照）を、塩化ナ
トリウムを含まないLB培地中で37℃で250rpmで振盪してOD₆₀₀＝0.8になるまで増
殖させた。2.0×10⁶c.f.u.のアリコートを、細菌を感染させる８日前に２×10⁵ のB16黒色腫細胞を移植したC57BL/6マウスに腹腔内投与した。腫瘍サイズを経時
的に測定した。結果は図11に示す。２つの株（YS8211とYS1629）は、顕著な腫瘍抑制（すなわ
ち、腫瘍増殖阻害）を示した。

【００６８】7.7 キレート化剤に対する感受性の上昇キレート化剤に対する細菌株の感受性を評価するために、msbB突然変異のある
または無い細菌を、塩化ナトリウムを含まないLuriaブロス（LB）中の１mM EDTA
または10mMクエン酸ナトリウムの存在下または非存在下で増殖させた。各細菌株
の一晩培養物を新鮮な培地で１：100希釈し、37℃で250rpmで振盪して増殖させた。増殖に及ぼす作用を、ＯＤ₆₀₀の分光光度計の読み値で調べた。 WT 14028とmsbB^-クローンYS8211を、１mM EDTAの存在下または非存在下で増殖
させた（図12A）。EDTAはWT 14028の増殖を阻害しなかった。これに対してmsbB^-
クローンは、EDTAの存在下で３時間後に増殖のほとんど完全な停止を示した。 WT 14028とmsbB^-クローンYS862を10mMクエン酸ナトリウムの存在下および非存
在下で増殖させた（図12B）。msbB^-株がクエン酸ナトリウムの存在下で３時間後
に増殖のほとんど完全な停止を示したのと比較して、msbB⁺WT 14028株は、クエン酸ナトリウムによる阻害はほとんど示さなかった。

【００６９】すなわち、msbB^-サルモネラ（Salmonella）突然変異体は、細菌の排除を促進するキレート化剤に対する感受性を示し、これは抗生物質作用に似た特徴である
。そのような特徴は、in vivo治療法のためのmsbB^-サルモネラ（Salmonella）突
然変異体の使用に有効である。キレート化剤に対するサルモネラ（Salmonella）株の感受性をさらに評価する
ために、超侵入性pur株YS72、そのmsbB^-株YS7216、およびYS7216の誘導体である
YS1629を、増加する濃度のEDTAの存在下で増殖させた。YS72、そのmsbB^-株YS721
6およびより速く増殖する誘導体YS1629の新鮮な培養物を、０、0.25、0.5、1.0 または2.0mM EDTAを含有する新鮮なゼロ塩LB培地中で１：100希釈し、37℃で225
rpmで４時間増殖させ、連続希釈物をLBプレート上にまいてc.f.u.を測定した（表Ｉ）。0.25mMを超えるEDTA濃度でmsbB^-株YS7216について99％を超える阻害が達成され、誘導体YS1629は、0.5mMで90％以上阻害され、2.0mMでは99％以上阻害
された。これに対して、YS72クローンはEDTAに対してある程度感受性を示したが
、2.0mMでも90％レベルは阻害されなかった。

【００７０】

【表１】表Ｉ．株 c.f.u.EDTA無し c.f.u.＋EDTA（阻害％） [0.25mM] [0.5mM] [1.0mM] [2.0mM] YS72 3.0×10⁹ 2.4×10⁹ 1.5×10⁹ 7.3×10⁸ 4.8×10⁸ (20%) (50%) (75%) (84%) YS7216 6.3×10⁸ 2.1×10⁶ 1.1×10⁶ 3.2×10⁶ 4.3×10⁶ (99.6%) (99.8%) (99.4%) (99.3%) YS1629 1.3×10⁹ 6.0×10⁸ 1.0×10⁸ 2.9×10⁷ 7.5×10⁶ (54%) (92%) (97%) (99.4%)

【００７１】7.8 マクロファージ内の細菌の生存マクロファージに対するmsbB^-サルモネラ（Salmonella）の感受性を測定するために、２種類のマクロファージを使用した：(A) C57BL/6マウスの大腿骨と脛骨から得られた骨髄由来のマクロファージ、これをマクロファージコロニー刺激
因子（Sklarら、1985. J. Celll Physiol. 125:403-412）を分泌するLADMAC細胞
系からの上清を添加して複製させたものと、(B) アメリカンタイプカルチャーコ
レクション（ATCC）から得られたJ774細胞（マウスマクロファージ細胞系）。使
用したサルモネラ（Salmonella）株はWT 14028とそのmsbB^-誘導体YS8211とYS117
0である。細菌を後期対数期OD₆₀₀＝0.8まで増殖させ、１×10⁶個を24ウェルプレ
ート内の哺乳動物細胞のコンフルエントな層に３０分感染させ、培地で洗浄して
細胞外細菌を除去し、50μg/mlゲンタマイシン（Elsinghorst, 1994, Methods E
nzymol. 236:405-420）を添加した。0.01％デオキシコール酸を使用して取り出した細胞層の連続希釈物をまいて、細菌を計数し、経時的に初期c.f.u.のパーセ
ントとして表した。結果は図13に示し、時間当たりのc.f.u.パーセントとして表す。msbB^-株は、マクロファージ内で非常にわずかしか生存しない。

【００７２】7.9 msbB誘導体のLD50 msbB^-株の自然の誘導体YS8211とYS7216を、上昇増殖特性に基づき、非改変LB 培地上のin vitro培養物から選択した。これらの細菌株をOD₆₀₀が0.8になるまで
増殖させ、１×10²〜１×10⁸の範囲のc.f.u.をC57BL/6マウスの尾静脈に静脈内注射した。３日目に急性の致死を調べ、WelkosとO'Brien（Methods in Enzymolo
gy 235:29-39, 1994）に記載のようにLD₅₀を測定した。結果を表IIに示す。すな
わち、msbB^-株はTNFαを誘導する能力が低下している（第7.3.5節を参照）が、結果は、YS1170株が他のmsbB^-株より弱毒化の程度は有意に小さく、従って必ずしもすべてのmsbB^-株が、TNFα誘導の低下と毒性の低下を提供するのに有用なわ
けではないことを証明している。

【００７３】

【表２】表II 株 LD₅₀ WT 14028 １×10³ YS8211 ４×10⁶ YS8212 3.9×10⁷ YS1629 １×10⁷ YS1170 １×10⁶

【００７４】８．生合成経路突然変異と組合せたmsbB^-突然変異腫瘍を標的化しこの中で複製できる能力の保持により測定する時、栄養要求性
突然変異との適合性を評価するために、msbB^-突然変異と栄養要求性突然変異との組合せを作成した。msbB⁺株を、LBブロスまたは1.5％寒天を含有するLBプレー
トで37℃で増殖させた。msbB^-株を、１リットル中10ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、２mlの１Ｎ CaCl₂、および２mlの１Ｎ MgSO₄（１Ｎ NaOHを使用してpH７に調整する）を含有する改変LB中で増殖させた。msbB1::tetを形質導入するため
に、４mg/lのテトラサイクリンを含むNaClが欠如したLBを使用した。液体培養物
を225rpmで振盪した。msbB1::tetを栄養要求性株に形質導入して、YS1604（msbB
^-、pur^-、超侵入性）、YS7232（msbB^-、purI^-、超侵入性）、YS7244（msbB^-、pu
rI^-、aroA^-、超侵入性）、YS1482（msbB^-、purI^-、purA^-）を作成した。腫瘍標的化実験のために、LBで細胞を１：100希釈し、OD₆₀₀＝0.8〜1.0になるまで増殖
させ、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、PBS中に再懸濁し、２×10⁶個をC57BL/6マウスの尾静脈に注射した。７日目に腫瘍を切り出し、重量を測定し、ホモジネートし、連続希釈物を前記改変LBにまいてc.f.u.を測定した。結果は表IIIに示し、c.f.u.／ｇ腫瘍組織で表す。一部の株（YS8211、YS1604 、およびYS7232）は、腫瘍内で高レベルのc.f.u.を示すが、YS7244とYS1482は、
約500〜5000倍低い。

【００７５】

【表３】表III 株遺伝子マーカー c.f.u.／ｇ腫瘍組織 YS8211 msbB^- ３×10⁹ YS1604 msbB^-、pur^-、超侵入性９×10⁹ YS7232 msbB^-、purI^-、超侵入性９×10⁹ YS7244 msbB^-、purI^-、aroA^-、超侵入性５×10⁵ YS1482 msbB^-、purI^-、purA^- ６×10⁶

【００７６】8.1 msbBとpurI中に欠失を含むYS1456株の作成野生型サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からのサル
モネラ（Salmonella）株YS1456の作成を、図15に略述する。野生型サルモネラ・
ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）を、テトラサイクリン耐性を与え
るpurI 1757::Tn10で形質導入して、YS1451株を得た。次にYS1451株にBochner選択を行い、この株をtet感受性にし、tet^S遺伝子を導
入し、purI欠失を導入して（Bochnerら、1980, J. Bacteriol. 143:926-933）、
YS1452株を得た。YS1452株はtet^SでpurI^-であった。次に1452株を、YS8211株（m
sbB::tet）をドナーとして使用してバクテリオファージP22を介してmsbB1::tet で形質導入した。得られた株YS1453は、最初10mMエチレングリコールビス（（ｂ
−アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）に対して感受性であり、自
然にEGTA耐性表現型に復帰変異した。YS1453をEGTA（Luria寒天中２mM）にまいて、そのような復帰変異体の１つ（YS1454と呼ぶ）を選択した。次にYS1454株をmsbB2(Δ)bla sacB染色体成分で形質導入してアンピシリン耐性について選択する。この形質導入プロセスにより第２の破壊msbB遺伝子（msbB
2(Δ)と呼ぶ）をblaおよびsacB遺伝子とともに得た。bla遺伝子は酵素β−ラクタマーゼの転写に関与し、これはアンピシリンを代謝し、これを使用してアンピ
シリン耐性形質導入体を選択した。sacB遺伝子は、ショ糖から毒性化学物質レバ
ン（これは宿主細胞に致死的である）への変換に関与し、次にこれを使用して、
sacBに突然変異を喪失しているかまたはこれを有する組み換え体を選択した（シ
ョ糖を用いる改良した前選択法については第7.2.1節を参照）。blaとsacB遺伝子
の存在は、amp^rとsuc^S株（YS1455株と呼ぶ）の選択を可能にし、これはmsbB1::t
etとmsbB2(Δ)遺伝子の両方を含有した。次にYS1455株をLuria Bertani（LB）ショ糖上にまいて、suc^r amp^S tet^S誘導体を選択して、msbB1::tetを除去し、抗生物質感受性を復帰させた。この誘導体
をYS1456株と呼んだ。要約するとYS1456は、purIとmsbBに欠失突然変異を有する。これはまたtet^S a
mp^SおよびEGTA^rである。

【００７７】8.2 msbBとpurIの欠失を有するYS1456株の作成野生型サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）（野生型株
ATCC14028）からのサルモネラ（Salmonella）YS1456株の作成を図16に略述する。野生型サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）をニトロソ
グアニジンと紫外線（UV）で突然変異させ、黒色腫細胞中の超侵入性について選
択した。耐性株（YS72と呼ぶ）は、腫瘍超侵入性pur^-とxyl^-特性を有することが
確認された（Pawelekら、1997, Caner Res 57:4537-4544）。 YS72株中の染色体purI遺伝子をpurI欠失で置換するために、YS72株をpurI 175
7::Tn10で形質導入し、これはテトラサイクリン耐性を与えた。purI 1757::Tn10
遺伝子のドナーは、サルモネラ（Salmonella）TT11株であった（purI 1757::Tn1
0）。このドナー株は元々Salmonella Genetic Stock Center（Dept. of Biologi
cal Science, Univ. Calgary, Calgary, Alverta, canada T2N 1N4）から得た。
形質導入は、バクテリオファージP22（突然変異体HT105/1 int-201）を使用して
行なった。形質導入体（YS1641と呼ぶ）を、以下のテトラサイクリン選択により
単離した。

【００７８】次にYS1641株をBochner選択してtet遺伝子を除去し、purI遺伝子欠失を導入（
Bochner, 1980, J. Bacteriol. 143:926-933）して、YS1642株を得た。YS1642株
はtet^SかつpurI^-であった。tet^-欠失株の選択により、tet遺伝子形質導入を使用
して、さらなる遺伝子修飾（例えば、msbB遺伝子破壊、次の段落を参照）が可能
になった。YS1642株は、purI(Δ)による厳しいプリン要求性を持ち、10¹⁰個の細
胞に１つ未満の頻度でpurI⁺に復帰変異することが証明されている。次にYS1642株を、YS8211株（msbB::tet）をドナーとして使用して、バクテリオファージP22を介してmsbB1::tetで形質導入した。msbB遺伝子のDNA配列を図１
に示す。msbB1::tet遺伝子中のtet遺伝子は、５mg/Lのテトラサイクリンに対する耐性を与える。こうして得られた株はYS1643である。 YS1643株は、最初10mMエチレングリコールビス（（ｂ−アミノエチルエーテル
)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）に対して感受性であり、自然にEGTA耐性表現型に復
帰変異した。YS1643をEGTA（Luria寒天中２mM）にまいて、そのような復帰変異体の１つ（YS1644と呼ぶ）を選択した。

【００７９】次にYS1644株をmsbB2(Δ)bla sacB染色体成分で形質導入した。この形質導入プロセスにより第２の破壊msbB遺伝子（msbB2(Δ)と呼ぶ）をblaおよびsacB遺伝
子とともに得た。bla遺伝子は酵素β−ラクタマーゼの転写に関与し、これはアンピシリンを代謝し、次にこれを使用して形質導入体を選択した。sacB遺伝子は
、ショ糖から毒性化学物質レバン（これは宿主細胞に致死的である）への変換に
関与し、これを使用して、組み換え体を選択した。blaとsacB遺伝子の存在は、a
mp^rとsuc^S株（YS1645株と呼ぶ）の選択を可能にし、これはmsbB1::tetとmsbB2( Δ)遺伝子の両方を含有した。 YS1645株をLuria Bertani（LB）ショ糖上にまいて、suc^r amp^S tet^S誘導体を選択して、msbB::tet遺伝子を除去し、抗生物質感受性（すなわち、msbB1::tet
bla sacBの欠失を有する誘導体）を復帰させた。この誘導体をYS1646と呼んだ。要約するとYS1646は、purIとmsbBに欠失突然変異を有する。これはまたtet^S a
mp^SおよびEGTA^rである。

【００８０】8.3 YS1646株による腫瘍増殖の阻害サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）の弱毒化株である
YS1646の静脈内（IV）投与により、腫瘍内で選択的複製され、同時に腫瘍増殖が
阻害された（図17と表IVを参照）。すべての例で、ステージ分類した腫瘍モデルを使用し、ここで腫瘍は、腫瘍細
胞接種後でYS1646投与前に樹立させた。腫瘍内でYS1646が複製する能力の結果と
して、有効投与量範囲にわたってわずかな用量応答関係が得られ、低用量のYS16
46が与える腫瘍阻害の程度は、より高用量で得られる腫瘍阻害のレベルに近づい
た。これは、低用量でも細菌が腫瘍に到達し該腫瘍内で蓄積される限りは、顕著
な臨床的効果が得られることを示していた。１×10²cfu／マウス未満の用量では
、一貫しない結果が得られ、これはおそらくYS1646が腫瘍に到達しコロニーを形
成する能力と、動物がYS1646を排除する能力との競合のためであろう。 YS1646の効果を、あらかじめB16-F10黒色腫を移植したマウスで評価した。この試験で、10⁴、10⁵、または10⁶cfu／マウスのYS1646の単回IV投与は、対照処理
と比較すると腫瘍サイズを大幅に低下させ、腫瘍サイズ低下の程度は用量に比例
していた。最大用量のYS1646で観察された効果は、陽性対照であるCYTOXAN（登録商標）（シクロホスアミドとも呼ばれる）より優れており、中用量のYS1646の
効果はCYTOXAN（登録商標）と等しかった。YS1646により誘導される効果は単回のIV投与で誘導され、CYTOXAN（登録商標）により誘導される効果は複数回のIV 投与（３週間毎週投与）であることは注意すべき重要な点である。用量の関数と
して腫瘍増殖を阻害するYS1646の能力を、１×10⁴〜１×10⁶cfu／マウスの投与量範囲で調べた。各投与群は、10匹の担癌動物からなり、これらは細菌投与前に
ランダム化した。７日目にマウスに細菌を投与し、10、13、17、20、および24日
目に腫瘍のサイズを測定した。比較のためにCYTOXAN（登録商標）（シクロホスアミド）を200mg/kgの用量で、７日目から始めて週１回投与した。24日目の各群
の平均腫瘍サイズを、表IVに示す。

【００８１】

【表４】表IV 接種用量平均腫瘍サイズ T/C 阻害パーセント (cfu/マウス) (mm³)±S.D. 0 4728±804 - 0 10⁴ 1011±375 0.214 78 10⁵ 560±176 0.118 88 10⁶ 279±91 0.059 94

【００８２】 Wilcoxon符号順位検定分析または両側ｔ検定により解析して、群間で観察され
た差を有意と見なした。表IVに示すように、YS1646の用量を増加させると腫瘍阻
害の上昇が観察された。National Cancer Institute（Bethesda、メリーランド州）のthe Drug Evaluation Branch of the Division of Cancer Treatment（Va
ndetti, J. M., Preclinical drug evaluation: rationale and methods, Semin
. Oncol. 8:349-361;1981）で定義されるように、すべての用量は有意な抗腫瘍活性（T/Cが42％以下）を与え、１×10⁵cfu／マウスの用量は、シクロホスファミドと等しいかまたはこれ以上の結果を与えた。YS1646が腫瘍内で選択的に複製
できる能力のために、YS1646用量と腫瘍阻害の間に１次相関は観察されず、この
ためより低い用量でも予想以上の力価が得られた。サルモネラ・ティフィムリウ
ム（Salmonella typhimurium）の弱毒化株であるYS1646の静脈内投与により、腫
瘍内で選択的に複製され、同時に腫瘍増殖が阻害された。１×10⁴〜１×10⁶cfu ／マウスの接種用量の間で、腫瘍増殖の阻害について用量応答が得られ、腫瘍増
殖の78％〜94％阻害の範囲であった。最も高い２つの接種用量では、腫瘍増殖阻
害の程度は、シクロホスファミドを用いる最適処理により得られるものと同程度
かまたはそれ以上であった。

【００８３】8.4 毒性１×10⁶cfu／マウスの用量で、YS1646は致死作用を示さないが、これに対して
親野生型株ATCC14028は１×10²cfu／マウスの用量で100％の死亡を引き起こす。
これは、YS1646が親野生型株より毒性が10,000倍以上低いことを示している。10
⁴〜10⁶cfu／マウスの用量で抗腫瘍作用が観察され、致死作用は＞10⁶cfu／マウスまで観察されなかった。用量誘導性の死亡率は、抗腫瘍作用を誘導する用量よ
り１〜100倍以上であった（図18を参照）。

【００８４】8.5 YS1646の抗生物質抑制は致死的感染後の死亡を誘導したアンピシリンとシプロフォキサシンがYS1646による感染を抑制する能力を、５
×10⁶cfu（LD₅₀相当）を接種したC57BL/6マウスの死亡を防ぐ抗生物質の能力を測定することにより評価した。群を以下の処理群に分類した：1)未処理対照、2)アンピシリン処理、3)シプロ
フロキサシン処理、および4)シクロフロキサシンとアンピシリン処理。細菌投与
の３日後に抗生物質治療を開始し、マウスの外観と死亡について14日間観察した
。本明細書に示す結果は、抗生物質の使用は、致死的細菌感染後の死亡を抑制す
ることができることを証明している（図18を参照）。

【００８５】９．微生物の寄託以下の微生物は1997年９月９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（
ATCC）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209）に寄託し、記載の受託番号を割り当てられている：微生物 ATCC受託番号 YS8211 202026 YS1629 202025 YS1170 202024 以下の微生物は1998年８月25日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（A
TCC）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209）に寄託し、記載の
受託番号を割り当てられている：微生物 ATCC受託番号 YS1646 202165 YS1456 202164

【００８６】本明細書中に開示された寄託微生物の実施形態は、本発明のいくつかの態様を
例示するものであって、これらは決して、特許請求し本明細書に記載した本発明
の範囲を限定するものではない。実際に、前記説明から、本明細書に記載したも
の以外に種々の変更が当業者には明らかである。そのような変更もまた、添付の
請求の範囲に含まれるものと考えられる。本明細書で引用した多くの文献の全開示内容は、参照することにより本明細書
の一部とする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【００００】

【図１】サルモネラ（Salmonella）野生型（WT）14028 msbB遺伝子（配列番号１）の完
全なDNA配列、およびコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）。

【図２】クローン化サルモネラ（Salmonella）WT 14028 msbB遺伝子を使用して作成したノックアウト構築物。クローン化遺伝子をSphIとMluIで切断し、msbBコード配
列の約半分を除去し、AatIIとAvaIで切断したpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子（TET）を、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用して平滑末端化し
た後、挿入した。Ａ＝ノックアウト構築物。Ｂ＝msbBのサルモネラ（Salmonella
）染色体コピー。Ｃ＝相同組換え後のmsbBのサルモネラ（Salmonella）破壊染色
体コピー。開始コドン（ATG）と停止コドン（TAA）、および制限酵素部位AseI、
BamHI、SphI、MluIおよびEcoRVを示す。野生型または破壊したmsbBの２つの異な
るサイズのPCR産物を生成する２つのプライマーP1とP2の位置を示す。

【図３】染色体を破壊したサルモネラ（Salmonella）WT 14028 msbBのサザンブロット解析。A)プラスミド構築物内および２つのクローン中における存在、およびWT 1
4028細菌中における欠如を示す、テトラサイクリン遺伝子でプローブ化したサザ
ンブロット。B)クローン化msbB由来の³²P標識したAseI/BamH1断片でプローブ化した同様のゲルのサザンブロット。AseI酵素はmsbBの上流を切断し、BamH1は野生型の１つの位置およびテトラサイクリン遺伝子中の第２の位置で切断し高分子
量産物を生じる。レーン１（KO）は、ノックアウト構築物中のバンドの位置を示
し、レーン２（WT）中のWT 14028と比較している。レーン３と４は、高分子量産
物を有するクローンYS8211とYS861を示す。C)クローン化msbB由来の³²P標識した
MluI断片でプローブ化した同様のゲルのサザンブロット。詳細は第7.2節本文を参照。

【図４】マウスでの生きたサルモネラ（Salmonella）WT 14028によるTNFα誘導。野生型またはmsbB^-破壊株の0.1mlのリン酸緩衝化生理食塩水中の１×10⁸個の生きた細菌を、Balb/cマウスの尾静脈中に静脈内注射した。棒グラフは、TNFα誘導を誤差棒とともに示す。クローンYS8211は、サルモネラ（Salmonella）WT 14028と
比較してTNFαを32％誘導する。

【図５】生きたサルモネラ（Salmonella）WT 14028およびmsbB^-クローンYS8212に対するSinclairブタによるTNFα応答。TNFαレベルは、１×10⁹c.f.u.サルモネラ（S
almonella）WT 14028およびYS8212の静脈内導入後1.5時間と６時間後に測定した
。msbB欠失突然変異体では野生型に比較して、1.5時間後にTNFα応答は有意に（
ｐ≦0.011）低かった。

【図６】 WT 14028とmsbB^-クローンYS8212からのLPSにより誘導される呼吸系レベルの変
化。Sinclairブタに、A)５μg/kgの精製LPS、またはB)500μg/kgの精製LPSを注射し、呼吸速度を測定した。サルモネラ（Salmonella）WT 14028からの500μg/k
gのLPSは、呼吸速度を通常の４倍以上に上げ、msbB^-のLPS処理したブタの呼吸速
度は、２倍未満であった。

【図７】ヒト単球中の生きたサルモネラ（Salmonella）WT 14028によるTNFα誘導。末梢血から単離したヒト単球を、増加する量のサルモネラ（Salmonella）c.f.u.に
暴露した。1.0×10⁵c.f.u.で、WT 14028により誘導されるTNFαの濃度は、いくつかのmsbB^-クローン（すなわち、YS8211、YS8212、YS8658、およびYS1170）により誘導されるものより３倍以上高かった。

【図８】ヒト単球によるTNFα産生。末梢血から単離したヒト単球を、増加する量の精製LPSに暴露した。測定可能なTNFα応答を誘発するのに、野生型からのLPSの１ナノグラムという低い濃度で充分であり、最高は10ngであった。これに対して、
いくつかのmsbB^-クローンのそれぞれからの100μgのLPSは、応答を生成するのに
は十分ではなかった。すなわち10ngのLPSでは、サルモネラ（Salmonella）WT 14
028により誘導されるTNFαの濃度は、独立のmsbBノックアウト（すなわち、YS72
16とYS8211）および誘導体（すなわち、YS1170、YS8624、YS1604、YS8212、YS86
58、YS1601、YS1629）により誘導されるTNFαの濃度より、少なくとも10⁵倍高か
った。

【図９】生きた細菌をそれぞれ２×10⁷個または１×10⁹個注射したマウスとSinclairブ
タの生存。A)WT 14028は４日ですべてのマウスを死滅させ、msbB^-クローンYS862
では、20日後でも90％のマウスは生きていた。B)同様にWT 14028は３日ですべて
のブタを死滅させ、msbB^-クローンYS8212では、20日後でも100％のブタは生きて
いた。

【図１０】 B16F10黒色腫中のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）YS8211の生体分布。５日目に、腫瘍内と肝臓内のmsbB^-サルモネラ（Salmonella）の比は、1000：１を超えていた。

【図１１】 msbB^-サルモネラ（Salmonella）による腫瘍抑制。C57BL/6マウスのわき腹にB1
6F10黒色腫を移植し、８日目まで進行させた。マウスには、細菌を投与しない（
対照）か、またはmsbB^-株YS8211、YS8212、YS7216、YS1629を投与した。２つの株（YS8211とYS1629）が腫瘍進行を有意に抑制し、YS7216株とYS8212株は抑制し
なかった。

【図１２】キレート化剤に対するWT 14028とmsbB破壊した細菌の感受性。野生型とmsbB破
壊したサルモネラ（Salmonella）クローンYS8212とYS862を、１mMのEDTAの存在下もしくは非存在下（図12A）または10mMのクエン酸ナトリウムの存在下もしくは非存在下（図12B）で、塩化ナトリウムが欠如したLBブロス（LB−ゼロ）中で増殖させた。ＯＤ₆₀₀を測定し、時間の関数としてプロットした。msbB⁺株は、ED
TAまたはクエン酸ナトリウムによる阻害をほとんど示さず、msbB^-株は、EDTAまたはクエン酸ナトリウムの３時間後に、ほとんど完全な増殖停止を示した。

【図１３】マウスマクロファージ内でのmsbB^-細菌の生存。マウス骨髄由来マクロファージ（図13A）とマウスマクロファージ細胞系J774（図13B）を、細菌インターナリ
ゼーションの宿主として使用し、経時的に測定した。データは、初期c.f.u.のパ
ーセントとして示す。

【図１４】 msbB^-の第２のバージョン（msbB2(Δ)amp^RsacB⁺）を有する陽性選択自殺ベクターpCVD442を使用する、msbB1(Δ)::tetからtet^Sへの変換。

【図１５】野生型サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からのYS14
56株の誘導の略図。詳細は第8.1節の本文を参照。

【図１６】野生型サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からのYS16
46株の誘導の略図。詳細は第8.2節の本文を参照。

【図１７】 B16-B10マウス黒色腫増殖に及ぼすYS1646用量の影響。

【図１８】致死感染後のYS1646誘導死滅の抗生物質による抑制。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:42）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バーミューズ、デイビッドアメリカ合衆国 06492 コネチカット州、ウォーリングフォード、ノースメインストリート 524 (72)発明者ロー、ケネス、ビー．アメリカ合衆国 06437 コネチカット州、ギルフォード、ウェストレイクアベニュー 1211 (72)発明者イッテンソーン、マーティナアメリカ合衆国 06511 コネチカット州、ニューヘイブン、ウィローストリート 320 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 CA09 DA05 GA11 GA14 GA25 HA13 HA14 4B065 AA46X AA46Y AB01 AC20 BA02 BA03 BA16 BA25 CA44 4C085 AA26 BA24 BB12 CC03 DD22 DD62 EE07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 in vivoで投与した場合に固形腫瘍を標的化することができる、遺伝子改変したmsbB遺伝子を含む突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項２】 YS1629と命名されかつATCC受託番号がNo.202025であるか、Y
S1170と命名されかつATCC受託番号がNo.202024であるか、またはYS8211と命名さ
れかつATCC受託番号がNo.202026である、請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項３】サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・
コレラエスイス（Salmonella choleraesuis）およびサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）からなる群から選ばれる、請求項１に記載の
突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項４】改変リピドＡ分子を発現する、請求項１に記載の突然変異サ
ルモネラ（Salmonella）種。
【請求項５】野生型サルモネラ（Salmonella）種によって誘導されるTNF α発現の約５％から約40％のTNFα発現を誘導する、請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項６】野生型サルモネラ（Salmonella）種によって誘導されるTNF α発現の約10％から約35％のTNFα発現を誘導する、請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項７】野生型サルモネラ（Salmonella）種によって誘導されるTNF α発現の0.001％以下のTNFα発現を誘導する請求項１に記載の突然変異サルモネ
ラ（Salmonella）種から精製したリポ多糖類。
【請求項８】キレート剤により野生型サルモネラ（Salmonella）種の増殖
と比較して約90％増殖が抑制される、請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Sa
lmonella）種。
【請求項９】キレート剤により野生型サルモネラ（Salmonella）種の増殖
と比較して約99％増殖が抑制される、請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Sa
lmonella）種。
【請求項１０】キレート剤により野生型サルモネラ（Salmonella）種の増
殖と比較して99％より高く増殖が抑制される、請求項１に記載の突然変異サルモ
ネラ（Salmonella）種。
【請求項１１】前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチ
レングリコール-ビス（β-アミノエチルエーテル）N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）お
よびクエン酸ナトリウムからなる群から選ばれる、請求項８、９または10に記載
の突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項１２】マクロファージ内で野生型サルモネラ（Salmonella）種の
生存レベルの約50％から約30％で生存する、請求項１に記載の突然変異サルモネ
ラ（Salmonella）種。
【請求項１３】マクロファージ内で野生型サルモネラ（Salmonella）種の
生存レベルの約30％から約10％で生存する、請求項１に記載の突然変異サルモネ
ラ（Salmonella）種。
【請求項１４】マクロファージ内で野生型サルモネラ（Salmonella）種の
生存レベルの約10％から約１％で生存する、請求項１に記載の突然変異サルモネ
ラ（Salmonella）種。
【請求項１５】有効量の請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Salmonel
la）種を固形腫瘍性癌を有する患者に投与することを含んでなる、固形腫瘍性癌
の増殖を抑制するか、または固形腫瘍性癌の体積を減少させる方法。
【請求項１６】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）がサルモネラ・テ
ィフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・コレラエスイス（Salmonella chole
raesuis）およびサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）からなる群から選ばれる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）が改変リピドＡ分
子を発現する、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）が、野生型サルモ
ネラ（Salmonella）種によって誘導されるTNFα発現の約５％から約40％のTNFα
発現を誘導する、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）が、野生型サルモ
ネラ（Salmonella）種によって誘導されるTNFα発現の約10％から約35％のTNFα
発現を誘導する、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）から精製したリポ
多糖類が、野生型サルモネラ（Salmonella）種によって誘導されるTNFα発現の0
.001％以下のTNFα発現を誘導する、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）の増殖がキレート
剤により野生型サルモネラ（Salmonella）種の増殖と比較して約90％だけ抑制さ
れる、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）の増殖がキレート
剤により野生型サルモネラ（Salmonella）種の増殖と比較して約99％だけ抑制さ
れる、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）の増殖がキレート
剤により野生型サルモネラ（Salmonella）種の増殖と比較して99％より高く抑制
される、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】前記キレート剤がEDTA、EGTAおよびクエン酸ナトリウムか
らなる群から選ばれる、請求項21、22または23に記載の方法。
【請求項２５】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）が、マクロファー
ジ内で野生型サルモネラ（Salmonella）種の生存レベルの約50％から約30％で生
存する、請求項15に記載の方法。
【請求項２６】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）が、マクロファー
ジ内で野生型サルモネラ（Salmonella）種の生存レベルの約30％から約10％で生
存する、請求項15に記載の方法。
【請求項２７】前記突然変異サルモネラ（Salmonella）が、マクロファー
ジ内で野生型サルモネラ（Salmonella）種の生存レベルの約10％から約１％で生
存する、請求項15に記載の方法。
【請求項２８】前記固形腫瘍性癌が黒色腫である、請求項15に記載の方法
。
【請求項２９】前記固形腫瘍性癌が結腸癌である、請求項15に記載の方法
。
【請求項３０】前記固形腫瘍性癌が肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌およ
び乳癌からなる群から選ばれる、請求項15に記載の方法。。
【請求項３１】固形腫瘍性癌の増殖を抑制するかまたは固形腫瘍性癌の体
積を減少させるのに有効な量の請求項１に記載の突然変異サルモネラ（Salmonel
la）と；製薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項３２】遺伝子改変したmsbB遺伝子と遺伝子改変したpurI遺伝子と
を含む突然変異サルモネラ（Salmonella）種であって、in vivoで投与した場合に固形腫瘍を標的化することができる前記突然変異サルモネラ（Salmonella）種
。
【請求項３３】前記遺伝子改変が欠失変異である、請求項32に記載の突然
変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項３４】 YS1646と命名されかつATCC受託番号がNo.202165であるか、またはYS1456と命名されかつATCC受託番号がNo.202164である、請求項32に記載の突然変異サルモネラ（Salmonella）種。
【請求項３５】遺伝子改変したmsbB遺伝子と、遺伝子改変した生合成経路
遺伝子とを含む突然変異サルモネラ（Salmonella）種であって、該生合成経路の
突然変異が弱毒化した毒性をもたらす前記突然変異サルモネラ（Salmonella）種
。
【請求項３６】有効量の請求項32に記載の突然変異サルモネラ（Salmonel
la）種を固形腫瘍性癌を有する患者に投与することを含んでなる、固形腫瘍性癌
の増殖を抑制するか、または固形腫瘍性癌の体積を減少させる方法。
【請求項３７】細菌の遺伝子改変体を選択するための改善された方法であ
って、該改善が、ショ糖含有培地で増殖させた場合にコロニーを形成する表現型
変異体を選択することを含み、そこにおいて、該突然変異コロニーの縁が毛羽状
またはざらざら状である、前記方法。