JP2023539454A - 免疫刺激細菌ベースのワクチン、治療薬およびｒｎａデリバリープラットフォーム - Google Patents

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gof
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ヒックス グリックマン，ローラ
ニコラス ピーターソン，ブレット
キーオ，ハイシン
チャールズ ミシェル イアネッロ，アレクサンドル
ディ サノス，クリストファー
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Actym Therapeutics Inc
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Abstract

提供されるのは、例えば、腫瘍微小環境における、特に腫瘍常在性骨髄性細胞における蓄積を増大させることによって、補体不活化に対する抵抗性を改善することによって、免疫細胞死を低減することによって、適応免疫を促進することによって、Ｔ細胞機能を増強することによって、例えば、毒性を低減し、抗腫瘍活性を改善するように改変されているゲノムを有する弱毒化免疫刺激細菌である。ワクチンとして使用するための、かつｍＲＮＡの送達のための、免疫刺激細菌も提供される。食細胞のコロニー形成の増大は、コードされる治療用産物の、腫瘍微小環境および腫瘍へのデリバリーを改善して、いくつかある経路の中でも特に、免疫刺激細菌の全身投与を可能にする。食細胞のコロニー形成の増大もまた、ワクチンとして使用するための直接組織投与のための免疫刺激細菌の使用を提供する。

Description

関連出願
２０２０年８月１２日出願の米国仮出願第６３／０６４，８６９号（表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Laura Hix Glickman、Christopher D. Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、およびHaixing Kehoe）の優先権の利益を主張する。
また、２０２１年５月１３日出願の米国仮出願第６３／１８８，４４３号（表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Laura Hix Glickman、Christopher D. Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、およびHaixing Kehoe）の優先権の利益を主張する。
また、２０２１年５月１３日出願の米国特許出願第１７／３２０，２００号（表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORMS AND THEIR USE FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC PROTEINS」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Laura Hix Glickman、Christopher D. Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、Haixing Kehoe、Bret Nicholas Peterson、およびChingnam Cheung）の優先権の利益を主張する。
本出願は、２０２０年１１月１２日出願の同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６０３０７号（２０２１年５月２０日に国際公開第２０２１／０９７１４４号として公開）表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORMS AND THEIR USE FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC PRODUCTS」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Christopher D. Thanos、Laura Hix Glickman、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、Haixing Kehoe、Bret Nicholas Peterson、およびChingnam Cheung）に関する。
本出願は、２０２０年２月２７日出願の同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０２４０号（２０２０年９月３日に国際公開第２０２０／１７６８０９号として公開）および２０２０年３月１９日出願の同時係属中の米国特許出願第１６／８２４，５００号（２０２０年８月２７日に米国特許出願公開第２０２０／０２７０６１３Ａ１号として公開）（それぞれ表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS, TUMOR-RESIDENT IMMUNE CELLS, AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT」）出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Christopher D. Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble、Alexandre Charles Michel Iannello、およびHaixing Kehoe）に関する。
また、本出願は、２０１８年７月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４１７１３号（２０１９年１月１７日に国際公開第２０１９／０１４３９８号として公開）および２０１８年７月１１日出願の同時係属中の米国特許出願第１６／０３３，１８７号（２０１９年１月１７日に米国特許出願公開第２０１９／００１７０５０Ａ１号として公開）（それぞれ表題「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」）に関する。
また、本出願は、２０１９年７月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１４８９号（２０２０年１月１６日に国際公開第２０２０／０１４５４３号として公開）（表題「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」）に関する。
これらの出願の各々において提供される免疫刺激細菌は、本出願において記載されるように改変することができ、そのような細菌は、参照によって本明細書に組み込まれる。容認される場合、これらの出願の各々の主題は、その全体が参照によって組み込まれる。
電子的に提供される配列表の参照による組込み
配列表の電子バージョンが本明細書とともにファイルされており、この内容はその全体が参照によって組み込まれる。電子ファイルは、２０２１年８月１２日に作成した。サイズは８６８キロバイトであり、タイトルは1708SEQPC0.txtである。
発明の分野
提供されるのは、補体不活化に対する抵抗性を増大させることによって、免疫細胞死を低減することによって、適応免疫を促進することによって、およびＴ細胞機能を増強することによって、例えば、望ましくない炎症反応および毒性を低減し、ならびに抗腫瘍活性および／または免疫刺激活性を改善するように改変されているゲノムを有する弱毒化免疫刺激細菌である。抗がん用途のための食細胞のコロニー形成の増大は、コードされる治療用産物の、腫瘍微小環境および腫瘍へのデリバリーを改善して、いくつかある経路の中でも特に、免疫刺激細菌の全身投与を可能にする。ワクチンとして使用するために、適切な投与によって、細菌は、病原体によってコロニー形成された組織中を含み、食細胞にコロニー形成することができる。
抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、および抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント抗体の臨床的成功によって明示されるように、がん免疫治療の分野は大きく進歩してきた［例えば、Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3377-3383；Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363(8): 711-723；およびChen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391参照］。腫瘍は、著しく免疫抑制性の環境を進化してきた。腫瘍は、免疫監視を回避するように複数の機序を開始し、免疫を抑制するように抗腫瘍免疫細胞を再プログラムし、最新のがん治療に対する抵抗性を絶えず変異させる［例えば、Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8): 561-584参照］。免疫寛容を克服して、現在の免疫治療の自己免疫関連毒性から逃げながらこれを制限する免疫治療およびがん治療を設計することは、免疫腫瘍学の分野のチャレンジである。それゆえに、追加的かつ革新的な免疫治療および他の治療が必要である。
本明細書に提供されるのは、腫瘍に、特に腫瘍常在性免疫細胞に効果的にコロニー形成するそれらの能力によって、および抗腫瘍免疫応答をもたらすコードされているペイロードによってがん治療薬である免疫刺激細菌である。腫瘍および腫瘍微小環境にコロニー形成するそれらの能力のために、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境および腫瘍にＴ細胞浸潤が少ないか、または欠損している免疫砂漠（免疫排除）腫瘍を処置するために使用することができる。これらには、間質バリアを有する腫瘍が含まれる。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、免疫治療に耐性または非応答性であるいわゆる「冷たい（ｃｏｌｄ）」腫瘍を、「熱い（ｈｏｔ）」腫瘍に転換させることができる。
これらの免疫刺激細菌は、それらが鞭毛の排除によるなどＴＬＲ２／４／５が減弱されているように、ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－表現型であるように、ならびにｃｕｒｌｉ線毛の排除などの追加の突然変異があり、およびａｎｓＢ－表現型などの他の突然変異もあるように、本明細書に記載されるゲノム改変を含む。これらの細菌はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で増殖し得る。細菌のプラスミド（複数可）中でコードされているペイロードは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるものである。特に、これらの産物には、Ｉ型ＩＦＮの発現を構成的にさせる機能獲得型（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）突然変異を含む。これらの免疫刺激細菌はまた、ＩＬ－１５、特にＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体などのサイトカイン（単数または複数）をコードすることができ、腫瘍関連抗原および／または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体をコードすることができる。がん治療のために、細菌を全身投与することができる。
また本明細書に提供されるのは、筋内注射、吸入、および他のそのような直接経路によるなど、組織中への投与のためのワクチンとして使用および／または製剤化することができる免疫刺激細菌である。これらの細菌は、インビボで非複製性であるように設計されており、したがって、それらが活性チミジル酸シンターゼを発現しないようにｔｈｙＡ－などの栄養要求性を含み、またそれらは細菌において認識されるプロモーターの制御下でペイロードをコードする。それらがタンパク質ペイロードをワクチン接種された宿主に送達するように意図される場合には、コードされているペイロードは、それらが細菌宿主中で翻訳される配列を含むか、そのように設計されている。それらがＲＮＡを送達するように意図される場合には、コードされている核酸は、細菌のリボソームがそれらを翻訳することができないが、真核生物リボソームがそれらを翻訳することができるように設計されている。これは、例えば、コードされている核酸中にＩＲＥＳを含めることによって行うことができる。ワクチンのペイロードは、ウイルスもしくは細菌の病原体由来の抗原などの、免疫化抗原またはタンパク質をコードする核酸を含む。ペイロードはまた、産物、例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である、ＳＴＩＮＧ、特に改変ＳＴＩＮＧなど、および必要に応じて、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体などの免疫刺激タンパク質も含み得る。ワクチンは、好適な投与経路のために製剤化され、エアロゾルならびにエマルジョン、錠剤、および粉剤が含まれる。
提供されるのは、ゲノム改変を含有する免疫刺激細菌、および抗がん治療薬などの１つまたは複数の治療用産物をコードするプラスミドまたは関連する処置である。ゲノム改変は、腫瘍微小環境内に、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積する免疫刺激細菌をもたらし、そこでは、コードされる治療用産物が発現される。本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、対象において頑健な抗がん応答を刺激するか、誘導するか、またはもたらす補完産物の１つまたは複数をコードする。
抗腫瘍応答と抗ウイルス応答との間の免疫応答における類似性のために、本明細書に提供される免疫刺激細菌もまた、感染性疾患を処置するために使用することができる。免疫刺激細菌は、ウイルスもしくは細菌産物の阻害剤、またはウイルスもしくは細菌産物の発現の阻害剤、またはウイルスもしくは細菌抗原などの抗ウイルスもしくは抗菌治療薬をコードすることができる。免疫刺激細菌に由来の免疫応答および治療用抗病原体産物との組合せ、および免疫刺激タンパク質と他のそのような治療薬との組合せもまた、感染性疾患、特に慢性ウイルス感染症および潜在性ウイルス感染症などのウイルス感染と関連する疾患に対してワクチン接種するための、および／または処置するための治療用免疫刺激細菌を提供する。興味深いのは、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、麻疹ウイルス、および対象に慢性的に感染する他のそのようなウイルスによる感染症などの慢性ウイルス感染症である。免疫刺激細菌はまた、慢性インフルエンザ、口腔細菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、およびコロナウイルス、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－Ｃｏｖ）、ならびに重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による初期感染などの急性感染症の処置にも同様に使用することができる。また標的とされる病原性細菌には、例えば、大腸菌（Ｅｓｈｅｉｃｈｉａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）の菌種が挙げられる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ウイルス抗原などの病原体由来の抗原（単数または複数）をコードすることができ、感染症を予防するために、または既存の感染症を処置するためのワクチンとして使用される。抗原には、限定されないが、免疫防御応答を誘発させるために、または病原体に起因する疾患を回復させると当業者に既知であるあらゆるものが挙げられる。これらの免疫刺激細菌は、抗原提示細胞などの免疫細胞内に蓄積する能力によって、ウイルスなどの病原体に対するＴ細胞応答をプライムすることができる。例えば、本明細書に詳細に記載されるように、本明細書に提供される免疫刺激細菌の中には、Ｔ細胞の機能を抑制する酵素であるアスパラギナーゼＩＩが欠損しているものがある。本明細書に記載され、提供されている免疫刺激細菌のいずれかを使用することができる。例えば、細菌ゲノムを活性酵素の発現を排除するように改変することによるなど、アスパラギナーゼＩＩ活性を排除することが、抗原または抗原の組合せをコードするために使用され得ることが、本明細書に記載され、示されている。得られた細菌は、抗病原体の、例えば抗ウイルスのＴ細胞応答を促進する。病原体、細菌もしくはウイルスまたはその他に由来するものなどの抗原の発現と、抗原提示細胞などの免疫細胞に蓄積するための能力との組合せは、病原体による感染からの防御を提供する。例えば、免疫刺激細菌は、ウイルスのファミリー間またはウイルスのファミリーにわたって共有される必須ウイルスコアタンパク質からの抗原などのウイルス抗原をコードすることができる。例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２などのコロナウイルスの場合、ヌクレオカプシドおよび／または非構造Ｍタンパク質に由来する抗原は、高度に保存され、突然変異の少ないコアタンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強化することができ、それによって広範な汎コロナウイルス防御を提供し、効果的なワクチンおよび処置を提供する。免疫化および／または処置に使用される、このコロナウイルスおよびコロナウイルスファミリーに由来するタンパク質および抗原が知られており、例示的なものは本明細書に記載され、当業者に既知である。スパイクタンパク質、その部分、および改変スパイクタンパク質に加えて、他のタンパク質がこの目的のために同定されている。例えば、Cohen et al., (2021) Cell Reports Medicine 2:1000354を参照されたい。
免疫刺激細菌は、抗ウイルス治療薬または抗菌治療薬をコードすることができる。そのような治療薬としては、ウイルス遺伝子およびタンパク質（複製ならびに／またはパッケージングに必要なタンパク質など）の阻害剤が含まれ、または免疫刺激細菌は、ウイルスの標的細胞への侵入を容易にするか提供するウイルスの受容体（単数または複数）との結合または相互作用を防止する治療薬をコードすることができる。一部の実施形態において、コードされている、抗原または抗原タンパク質などの治療用タンパク質の発現は、原核生物プロモーターの制御下にあり得る。他の実施形態では、タンパク質は、真核生物プロモーターの制御下で発現することができる。プロモーターの選択は、それが、宿主中で翻訳されるｍＲＮＡのデリバリーのために本明細書に記載される投与の前などに細菌中で発現されるべきか、またはタンパク質が、デリバリーの後に、免疫細胞などの宿主細胞中で発現されるべきかに依存する。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ゲノム改変、例えば、機能的遺伝子産物が発現されないような、遺伝子のすべてまたは一部の向きの変化などの、不活性化されたコードされた産物をもたらす、欠失、破壊、および他の変更などを含む。提供される免疫刺激細菌の中には、結果として得られる細菌がｍｓｂＢ－／ｐｕｒＩ－であるように改変されるものがある。いくつかの実施形態では、細菌はｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－であり、それによって、ｍｓｂＢおよび／またはｐｕｒＩ遺伝子の少なくともコード部分の全長が欠失される。細菌のゲノムはまた、細菌が鞭毛を欠くように改変されてもよい。これは、鞭毛を通常発現する細菌において引き起こされる。そのような細菌において、例えば、サルモネラ属におけるｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子、または他の種におけるｆｌｉＣおよびｆｌｊＢと同等の遺伝子は、欠失され得るか、その他には機能的遺伝子産物が発現されないように改変され得る。また、細菌は、アデノシン栄養要求株であるように、かつ／またはｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であるように改変され得る。また、提供されるのは、免疫刺激細菌、およびこれを含有する医薬組成物であり、細菌は、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず、それによって細菌はａｎｓＢ－である。コードされているアスパラギナーゼ活性の排除は、Ｔ細胞生存率／活性を改善または保持する。ワクチンとして使用される不活性化または弱毒化細菌などの治療用細菌は、アスパラギナーゼ活性を除去するために細菌ゲノムを改変することによって改善することができる。例示的なそのようなワクチンには、結核に対して免疫化のために使用されるＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ））ワクチンおよび関連するワクチンがある。ＢＣＧワクチンは、可変的有効性を有することが知られており、アスパラギナーゼを除去することは、内在性細菌アスパラギナーゼがＴ細胞活性を阻害または低減するために、そのようなワクチンの有効性を改善することができる。
本明細書中で提供されるのは、真核生物プロモーターの制御下で、治療用産物または治療用産物の組合せをコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。細菌のゲノムは、改変、例えば、下記の中から選択される１つ、２つ、またはそれを超える改変を含有する：
ａ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、ペンタアシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）を生じさせるように改変され、
免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変され、それによって、細菌は、ペンタアシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）を生じさせるように改変され、かつ
ヘキサアシル化されたリポ多糖が、野生型細菌に比べて、１０分の１以下に、実質的に低減されるか、または不在となる、欠失または破壊；
ｂ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、ＴＬＲ４、および／またはＴＬＲ５による認識が弱められる、欠失または破壊；
ｃ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、ｃｕｒｌｉ線毛および／またはセルロースの合成を活性化しない、欠失または破壊；
ｄ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、分泌アスパラギナーゼの合成を活性化しない、欠失または破壊；
ｅ）遺伝子（単数もしくは複数）のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、プリン、アデノシン、および／またはＡＴＰについて栄養要求性となる、欠失または破壊；
ｆ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、鞭毛を失う、欠失または破壊；
ｇ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変される、欠失または破壊；
ｈ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌は、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変されて、腫瘍常在性骨髄性細胞内で複製できない、欠失または破壊；ならびに
ｉ）膜におけるリポタンパク質発現を低減するか、または無くす、ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢのいずれかまたは両方の欠失または破壊であって、それによって、コードされている治療タンパク質の発現が、腫瘍微小環境および／または腫瘍常在性免疫細胞内で増大する、欠失または破壊。
例えば、免疫刺激細菌は、ａ）、ｄ）、およびｆ）、または改変ｃ）およびｄ）、または改変ａ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、およびｆ）、または改変ａ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、およびｉ）、または改変ａ）、ｄ）、ｆ）、およびｉ）、または改変ｃ）、ｄ）、およびｉ）、または改変ｆ）およびｉ）、または改変ａ）～ｉ）、または改変ａ）、ｂ）、ｄ）、およびｆ）、または改変ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）、ならびに改変ａ）～ｉ）の他の組合せの、欠失、挿入、および置換を含む改変を含有する。欠失または破壊は、遺伝子の任意の改変を含み、それによって、活性遺伝子産物が発現されなくなる。
特に、提供されるのは、そのゲノムが、遺伝子（単数もしくは複数）のすべてまたは十分な部分の挿入を含む、欠失または破壊によって改変されている免疫刺激細菌であって、それによって、細菌は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５による認識が弱められる、免疫刺激細菌である。そのような細菌は、低い毒性を有し、腫瘍微小環境およびマクロファージなどの腫瘍常在性骨髄性細胞に蓄積し／コロニー形成する。これらの細菌は、治療用産物、特に、サイトカインなどの補完産物と、機能獲得型／構成的に活性なＳＴＩＮＧタンパク質、ＳＴＩＮＧキメラ、および機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異を含むキメラＳＴＩＮＧタンパク質を含む改変ＳＴＩＮＧポリペプチドとの組合せをコードするプラスミドを含有する。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（本明細書では、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５ｓｃ、またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、もしくはＩＬ－１５複合体とも称される）、またはＩＬ－１５、またはＩＬ－１２、または他の抗腫瘍免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインが挙げられる。この細菌は、抗腫瘍抗体などの他の産物をさらにコードすることができる。産物の組合せが本明細書に記載され、提供されている。抗腫瘍応答を刺激もしくは促進しおよび／または治療用産物を送達する産物の組合せが、開示される明細書全体を通して記載されており、それらは、細菌が低い毒性を有し、腫瘍、腫瘍微小環境、および／またはマクロファージなどの腫瘍常在性免疫細胞に効果的にコロニー形成するようにそのゲノムが改変されている免疫刺激細菌によって送達される。例示的なそのような細菌は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、および大腸菌などの種のものであり、これらは、それらが鞭毛を有さないように改変されており、例えば、細菌をｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－にさせることによって、ペンタアシル化リピドＡを有するリポ多糖（ＬＰＳ）を含有するように改変されている。この細菌は、さらに、Ｃｕｒｌｉ線毛の除去によって改変されてもよく、および／またはそれらがｃｓｇＤ－であるように細菌を改変することによるなど、セルロース産生およびバイオフィルム形成が低減もしくは除去されている。本明細書では、これらの改変を有する細菌が最大耐量（ＭＴＤ）を有さず、高い腫瘍コロニー形成を呈することが示されている。
すべての実施形態において、免疫刺激細菌はまた、鞭毛をコードする遺伝子の欠失または破壊を含み得、またはさらに含み得、それによって細菌は、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－など）であり、鞭毛を産生せず、野生型細菌は、鞭毛を有する。免疫刺激細菌は、プリンについて栄養要求性であり得、例えば、アデノシンについて栄養要求性であり、またはアデノシン、アデニン、および／もしくはＡＴＰについて栄養要求性である。また、免疫刺激細菌はｐｕｒＩ－であり得る。また、免疫刺激細菌はｐａｇＰ－であり得る。また、免疫刺激細菌は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－（ａｓｄ－）であり得、例えば、細菌は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする内因性遺伝子のすべてまたは一部の破壊または欠失によるａｓｄ－であり、それによって内因性ａｓｄは発現されない。細菌は、プラスミド上に、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）を、細菌プロモーターの制御下でコードし得る。また、免疫刺激細菌はｍｓｂＢ－であり得るか、またはｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－であり得る。例えば、免疫刺激細菌は、ａｓｄ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、およびｐａｇＰ－であり得、またはａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－など）、およびｐａｇＰ－であり得る。一部の実施形態において、免疫刺激細菌は、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－など）、およびｐａｇＰ－である。
提供されるのは、治療用産物を真核生物プロモーターの制御下でコードするか、または複数の産物を複数の真核生物プロモーターの制御下で、もしくは単一プロモーターの制御下でコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。免疫刺激細菌のゲノムは、遺伝子（単数もしくは複数）の十分な部分の欠失、または遺伝子（単数もしくは複数）の破壊によって改変されており、それによって細菌は、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－など）、およびｐａｇＰ－の１つまたは複数である。また、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ１（ＬｐｐＡ）およびＬｐｐ２（ＬｐｐＢ）をそれぞれコードする遺伝子ｌｐｐＡ（ｌｐｐ１）および／またはｌｐｐＢ（ｌｐｐ２）が欠失または破壊されて、コードされるリポタンパク質の発現を無くすか、または実質的に低減しているものを含む。特に、免疫刺激細菌は、ｌｐｐＡ－およびｌｐｐＢ－である。提供されるのは、抗がん治療薬を、または抗病原体治療薬を、真核生物調節配列の制御下でコードするプラスミドを含有し、ｌｐｐＡ－およびｌｐｐＢ－である免疫刺激細菌である。例えば、免疫刺激細菌は、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－など）、ｐａｇＰ－、ｌｐｐＡ－、および／またはｌｐｐＢ－であり得る。
本明細書中の実施形態において、治療用産物は、がん治療に用いられる抗がん治療薬または治療薬である。コードされる産物は、分泌シグナルをコードする核酸に作用可能に連結され得、それによって、発現されると、治療用産物は分泌され、例えば、腫瘍常在性免疫細胞から分泌される。
また、免疫刺激細菌はいずれも、サルモネラ属病原性島１（ＳＰＩ－１）侵入に関与する１つまたは複数の遺伝子またはオペロンが欠失または不活化され得、それによって免疫刺激細菌は、上皮細胞に侵入しないか、または感染しない。例えば、１つまたは複数の遺伝子／オペロンは、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰから選択される。
免疫刺激細菌内のプラスミドは、低いコピー数または中程度のコピー数で存在し得る。プラスミドは、中程度～低いコピー数の複製起点、例えば低いコピー数の複製起点を含有し得る。一部の実施形態において、プラスミドは、より高いコピー数で存在する。通常、中程度のコピー数は、１５０未満か、もしくは約１５０未満、かつ２０超もしくは約２０超であり、または２０もしくは２５～１５０である；低いコピー数は、２５未満、または２０未満、または約２５未満、または約２０未満のコピーである。特に、低～中程度のコピー数は、約１５０コピー未満、または１５０コピー未満である；低いコピー数は、約２５コピー未満、または２５コピー未満である。
コードされる治療用産物は、核酸およびタンパク質を含む。プラスミドは、２種以上の治療用産物をコードすることができる。例示的な産物は、以下に限定されないが、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、および共刺激受容体またはリガンドを含む。さらに例示的な組合せが、以下に記載される。一部の実施形態において、共刺激分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のための細胞質ドメインのすべてまたは一部を欠いており、それによって、切り詰められた分子は、欠失した細胞質ドメインまたはその部分が欠失していることに起因して、共刺激受容体結合を介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）することができるが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対抗調節シグナル伝達することができない。
コードされる治療用産物は、真核生物宿主によって認識される調節配列をコードする核酸、例えば、細菌を含む細胞またはプラスミドからの分泌を引き起こす分泌シグナルに作用可能に連結され得る。免疫刺激細菌が２種以上の産物をコードする実施形態において、各産物の発現は、別々のプロモーターの制御下にあり得る。これ以外にも、２種以上の産物が、単一プロモーターの制御下で発現され得、各産物が、例えば、治療用産物をコードするそれぞれの別々の発現を引き起こすように、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されている。例示的な２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａであり、これらは、単一プロモーターの制御下で発現される治療用産物の別々の発現を引き起こすように、治療用産物をコードする核酸の側面に位置し得る。治療用産物は、真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）ＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で発現される。これらは、ウイルスプロモーターであるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、または哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えば、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、伸長因子－１（ＥＦ－１）アルファプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＡＧＧプロモーター、アデノウイルス２もしくは５後期プロモーター、ＥＩＦ４Ａ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＣＤ６８プロモーターを含む。プラスミドはさらに、治療用産物の発現を制御するための他の真核生物調節配列、例えば、ＳＶ４０、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ＭＮＤ（脊髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター）、ニワトリベータ－グロブリン、およびｒｂＧｌｏｂ（ウサギグロブリン）遺伝子から選択されるターミネーターおよび／またはプロモーターを含み得る。他の調節配列は、ポリＡ尾部、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）を含む。
コードされる治療用産物は、本明細書中に、元の特許請求の範囲に記載されるあらゆるものを含み、例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現に至る細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはその変異体をコードする核酸がある。Ｉ型ＩＦＮは、インターフェロン－αおよびインターフェロン－βを含む。変異体は、対象において発現される場合に、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現に至るものを含む。これらは、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに細胞内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を必要としない機能獲得型（ＧＯＦ）変異体を含む。これらのタンパク質の例として、活性が増大した、またはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の構成的発現をもたらすＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＩＲＦ－８、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００、ならびにそれらの変異体から選択されるタンパク質がある。変異体は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、またはＭＤＡ５の変異体を含み、これらは、ウイルス感染の結果としてリン酸化されている１つまたは複数のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）残基が、アスパラギン酸（Ｄ）により置換されており、それによって、結果として生じる変異体は、構成的に、Ｉ型ＩＦＮ、および当業者に知られており、かつ／または本明細書中に記載されるあらゆるものを誘導するリン酸化模倣体である。変異体の例は、突然変異が以下のように選択されるものを含む：ａ）ＳＴＩＮＧにおいて、配列番号３０５～３０９を参照して：Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１つまたは複数；ｂ）ＭＤＡ５において、配列番号３１０を参照して：Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２Ｆ、およびＡ４５２Ｔの１つまたは複数；ｃ）ＲＩＧ－Ｉにおいて、配列番号３１１を参照して、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；ならびにｄ）ＩＲＦ－３において、配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ、例えば、配列番号３０５～３０９を参照して：Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１つまたは複数のアミノ置換を含有する変異体ＳＴＩＮＧ、ならびにそれらの保存的置換およびそれらの組合せ。
また、免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードし得る。当該タンパク質は、以下に限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子を含む。これらの例は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／もしくは持続性に関与するか、またはこれらを引き起こすか、もしくは強化するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＣＤ４７アンタゴニスト、デコイ受容体に結合する抗ＩＬ－６抗体またはＩＬ－６、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト、ならびに腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの１つまたは複数の中から選択されるタンパク質である。ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、４－１ＢＢ、および４－１ＢＢリガンドから選択される共刺激分子は、分子が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のための細胞質ドメイン、またはその部分を欠くように切り詰められ得る；免疫抑制逆シグナル伝達をなくすように欠失した細胞質ドメインもしくは部分的に欠失した、または切り詰められた細胞質ドメインに起因して、切り詰められた遺伝子産物は、共刺激受容体結合を介して、Ｔ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達することができるが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対抗調節シグナル伝達することができない。他のそのようなタンパク質は、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト、例えば抗ＴＧＦベータ抗体もしくはその断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体もしくはその断片、可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチド、またはＴＧＦ－ベータ結合デコイ受容体である。
プラスミドは、治療抗体またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ナノボディ、ダイアボディ断片、または単鎖抗体をコードし得る。例は、以下に限定されないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、またはＩＬ－６のアンタゴニストを含む。
プラスミドは、その発現が抗腫瘍活性または他の活性の増強をもたらす補完産物をコードすることができる。例えば、本明細書に記載される改変された、例えば構成的に活性なおよび／またはキメラＳＴＩＮＧタンパク質と、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）などのサイトカインとの組合せは、相乗的活性を有する。
本明細書に記載されるように、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、免疫応答、または免疫化、または免疫防御が望まれる抗原をコードすることによって、ワクチンとして使用することができる。本明細書の免疫刺激細菌は、ワクチンとして使用するために、または治療薬のデリバリーのために、ｍＲＮＡまたは他の形態などのＲＮＡを送達するために使用することができる。本明細書に記載されるように、細菌は、この細菌によって認識される細菌もしくは他の原核生物のプロモーターの制御下で、目的の産物、例えば、病原体由来の抗原などの治療用産物をコードするプラスミドを含有する。コードされている核酸カセットは、細菌リボソームによる翻訳をブロックするか、または阻害するか、または防止するが、ヒト細胞中に存在するものなどの真核生物リボソームによる翻訳を許容するか、または提供するか、または増強する調節配列もしくは他の配列を含む。細菌は、細菌をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での増殖にＤＡＰを必要とするａｓｄ－にするか、または増殖にチミジン一リン酸前駆体を必要とするが、それらがコードされているＲＮＡを産生するようにインビトロで培養することができるＴｈｙＡ－に変化させることによってなど、真核生物中で増殖または複製できないように改変される。当業者であれば、欠失、挿入、置換、転位によるなど、内在性遺伝子を改変することによって、または活性酵素が産生されないような任意のそのような改変によって、遺伝子または産物を不活性化することができる。サルモネラ属に由来の例示的なＴｈｙＡ遺伝子については、配列番号４６４を、およびコードされているタンパク質については配列番号４６５を参照されたい。免疫化のためのタンパク質および／または抗原をコードするＲＮＡは、プラスミド中でコードされているが、コードされている核酸は、細菌がこのＲＮＡを翻訳することができないような翻訳シグナル／配列を含む。結果として得られる細菌は、コードされているＲＮＡを宿主食細胞中に送達し、ここでは、ＲＮＡが宿主細胞リボソームによって翻訳される。ＴｈｙＡ－である免疫刺激細菌は、ゲノム改変を有しており、そのような挿入、欠失、置換、または他の変化は、ｄＵＭＰのｄＴＭＰ（ＤＮＡ生合成前駆体（ｄＴＴＰに対する前駆体））への還元メチル化を触媒するチミジル酸シンターゼの産生の不活性化または排除をもたらす。
他の栄養素および必須産物についてのΔＴｈｙＡ栄養要求性を、ａｓｄ不活性化／欠失の代わりに、またはこれに加えて導入することができる。増殖に必要な遺伝子もしくは遺伝子産物、例えば栄養素を産生する遺伝子の他の欠失または不活性化を、ａｓｄの代わりに、またはａｓｄに加えて使用することができ、例えばｔｈｙＡが挙げられる（例えば、Loessner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88を参照されたい）。そのような産物の産生のための細菌ゲノムの発現もしくは産生の除去または他の弱毒化突然変異は、投与後のインビボでの細菌細胞死の際に、コードされている高分子の放出をもたらす。Ａｓｄは、細菌細胞壁の合成のための必須酵素であり、ＴｈｙＡは、ＤＮＡ合成に必要とされる酵素である。それぞれの遺伝子の突然変異は、菌株をジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）またはチミジン一リン酸前駆体について栄養要求性する。補完基質の枯渇時に、そのような細菌はＤＡＰ飢餓死もしくはチミン飢餓死によって死滅し、細菌タンパク質およびプラスミドの放出をもたらす。Ａｓｄの不活性化または除去は、高分子の放出をもたらし、ＴｈｙＡ発現／活性の除去または不活性化（ΔＴｈｙＡ細菌を生じさせるための）は、チミジン飢餓時に、タンパク質およびプラスミドを含む高分子の放出をもたらさない（Leossner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88）。したがって、ΔＴｈｙＡは、細菌がその内容物を時期尚早に放出しないため、プラスミドの宿主細胞へのインビボデリバリーに有利である。本明細書に提供される細菌は、食細胞、例えば、細菌を摂取するマクロファージ、樹状細胞、単球および好中球などの骨髄性細胞に感染するか、その中に蓄積し、インタクトなΔＴｈｙＡ細菌は、標的化細胞の内部で治療用産物をコードしているプラスミドを放出する。
本明細書の細菌などの細菌は、それらが弱毒化されるようにゲノム改変されており、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、４、および５による応答が、そのようなゲノム改変を含まない細菌と比べて低減されており、必要に応じて、補体による不活性化を低減するためにｒｃｋ（補体殺傷抵抗性）をコードし、必要であれば、それらが組織常在性マクロファージなどの食細胞に主に、またはそのみに感染するように改変を含む。本明細書には、ＴＬＲ２、４、５による応答を低減させる改変の組合せなどのゲノム改変が、ヒト抗原提示細胞によるＩ型ＩＦＮの産生に必要であることが示されている。
提供されるのは、ゲノム改変を有し、それによって、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、４、および５による応答が、そのようなゲノム改変を含まない細菌と比べて低減されている細菌である。そのような改変には、ペンタアシル化ＬＰＳおよび鞭毛の除去をもたらすもの、例えば、鞭毛を欠いているｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－細菌、およびアスパラギナーゼＩＩを欠損しているか、または産生もしくは発現しないもの、例えば、ａｎｓＢ－であるものも挙げられる。細菌はまた、さらなるゲノム改変を含むことができ、例えば、それによって、細菌が必要な栄養素についてまたは因子について栄養要求性になる１つまたは複数の改変であり、それによって、細菌は真核生物宿主中で複製することができないが、栄養素が供給されるとき、または因子、例えば、それらを、チミジル酸シンターゼを産生もしくは発現できなくする（ΔＴｈｙＡ）ゲノム改変によるチミジンについての栄養要求性（ΔＴｈｙＡ）、またはＡｓｄについての栄養要求性が供給されるとき、インビトロで複製することができる。
これらの形質の一部またはすべてを組み合わせる本明細書に提供される細菌は、それらの意図した使用に応じて、抗がん産物、および抗原を含む治療用産物を発現するために使用される。がんを有する対象への投与のために、腫瘍常在性骨髄性細胞内に蓄積する細菌は、免疫応答の刺激をもたらす産物、および／または免疫抑制をもたらす産物などの抗がん治療薬をコードし、あるいは腫瘍を処置する産物をコードし、がんを処置するために相乗的に作用することができる産物の組合せをコードするものをコードする。食細胞内に蓄積するか、または食細胞に感染する本明細書に提供される細菌はまた、抗原を送達もしくはコードするか、またはＲＮＡを送達することによるワクチンとしてなど、がんを有していない対象に対しても使用することができる。様々な実施形態および特性と産物との組合せ、ならびに使用が、本明細書の開示の全体を通して記載されている。
一部の実施形態において、細菌は、産物をコードする核酸を含有するプラスミドを含むか、または産物をコードするＲＮＡを含み、核酸またはＲＮＡによってコードされている産物が、抗原配列または病原性ウイルス、細菌、もしくは寄生虫である病原体からの配列であるか、または腫瘍抗原であり、それによって、コードされている抗原の宿主中での発現の際に、宿主が、病原性ウイルス、細菌、寄生虫、または腫瘍抗原に対する免疫防御応答もしくは免疫応答を発揮するか、またはコードされた産物が、治療用産物であり；抗原配列（複数可）の発現が、抗原（複数可）をコードするＲＮＡが細菌中で産生されるように、原核生物プロモーターの制御下にあり；抗原をコードする核酸が、細菌リボソームによりコードされているＲＮＡの翻訳を阻害または防止するが、真核生物宿主リボソームによりコードされているＲＮＡの翻訳を阻害または防止しない調節配列を含み、それによって、翻訳が、細菌における転写から切り離されており、得られた細菌が、真核生物対象に投与されるとき、食細胞への感染について選択的であり、核酸を食細胞に送達させ、そこでＲＮＡが翻訳される。
ＲＮＡを産生するためにインビトロで培養される細菌は、投与の際に、食細胞に感染し、それらの内容物を送達するが、それらは生存することができず、および／または複製せず、それにより、ｍＲＮＡなどのＲＮＡを宿主細胞に提供し、宿主細胞はＲＮＡを翻訳して、免疫原性タンパク質または抗原などのコードされている産物を産生する。ＲＮＡは、一般的にはｍＲＮＡであるが、ＲＮＡの他の形態、ＲＮＡｉ、またはｅＲＮＡ（環状ＲＮＡ）などであってもよく、他の治療用形態であってもよい。この目的に使用される免疫刺激細菌は、送達されるＲＮＡの量を増大させるために、高いか、より高い（一般的に、１５０以上）コピー数でＲＮＡをコードするプラスミドを含むことができる。本明細書には、様々な実施形態が記載され、主張され、そして例示されている。ｍＲＮＡは、病原体タンパク質、病原体抗原、腫瘍抗原、腫瘍もしくは感染症の処置のための治療用産物、およびそれらの組合せをコードすることができる。ｍＲＮＡは、合成的であってもよく、例えば、免疫化のために設計されたものである（例えば、米国特許公開第２０１９０３５１０４０号、および免疫化または処置用のｍＲＮＡを記載するその他のものを参照されたい）。得られる細菌は、治療または免疫化のためのワクチンである。ペイロードは、アジュバントであり、免疫刺激タンパク質であり、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を誘導して、免疫化抗原／タンパク質と協力してＴ細胞を活性化させる産物を含み得る。
一部の実施形態において、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、ａ）腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質；ｂ）Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはＩ型ＩＦＮの発現を増大させる活性増大を有するその変異体、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすその変異体の１つまたは複数；およびｃ）抗がん抗体またはその抗原結合部分から選択される２種以上の治療タンパク質をコードするプラスミドを含有する。例えば、免疫刺激タンパク質は、共刺激分子であり得、これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に十分な細胞質ドメインまたはその部分を欠いているものであり、それによって、切り詰められた共刺激分子は、共刺激受容体結合を介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達することができるが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対抗調節シグナル伝達することができない。一部の実施形態において、免疫刺激細菌は、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、共刺激分子、および抗がん抗体またはその抗原結合部分から選択される少なくとも２つの治療用産物をコードし、これらは、単一プロモーターの制御下にあり得る。例えば、産物の少なくとも２つまたはすべてをコードする核酸の発現が、単一プロモーターの制御下にあり、各産物をコードする核酸は、２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されており、それによって、翻訳されると、各産物が別々に発現される。各産物をコードする核酸は、細胞からの発現される産物の分泌を指示する配列をコードする核酸に作用可能に連結され得る。
提供されるのは、２つ以上の治療用産物をコードする免疫刺激細菌であり、少なくとも１つの産物がａ）から選択され、少なくとも１つがｂ）から選択され、ａ）は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（本明細書では、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５複合体、または他のバリエーションと称される）、ＩＬ－１８、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／もしくは持続性に関与するか、またはこれらを引き起こすか、もしくは強化するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、ｂ）は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、またはＳＮＲＮＰ２００である。これらはまた、ＴＧＦベータ阻害抗体、ＴＧＦベータ結合デコイ受容体、抗ＩＬ６抗体、またはＩＬ－６結合デコイ受容体の１つまたは複数をコードし得る。
コードされる治療用産物の組合せの例として、治療用産物の以下の組合せ：ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－２およびＩＬ－２１；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）（Δｃｙｔは、細胞質ドメインの欠失である）；ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体のいずれかがある。
産物の他の組合せとしては、例えば、本明細書に提供されるような、ＩＬ－１５と機能獲得型突然変異（単数または複数）を有するＳＴＩＮＧキメラを含むＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体との組合せ、またはＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃと機能獲得型突然変異（単数または複数）を有するＳＴＩＮＧキメラを含むＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体との組合せが挙げられる。他の産物またはそれらの組合せとしては、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ（登録商標））；Ｂｉｔｅ（登録商標）とＳＴＩＮＧタンパク質、例えば、本明細書に記載されるような、改変ＧＯＦ ＳＴＩＮＧタンパク質またはＳＴＩＮＧキメラ；Ｂｉｔｅ（登録商標）とＩＬ－１５；ＢｉＴｅ（登録商標）とＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ；ＢｉＴｅ（登録商標）、ＩＬ－１５とＳＴＩＮＧタンパク質、例えば、改変ＧＯＦ ＳＴＩＮＧタンパク質またはＳＴＩＮＧキメラタンパク質；およびＢｉＴｅ（登録商標）と、ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃと、ＳＴＩＮＧタンパク質、例えば、改変ＧＯＦ ＳＴＩＮＧタンパク質またはＳＴＩＮＧキメラタンパク質が挙げられ、ＢｉＴｅ（登録商標）は、例えば、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＥＡ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ７４、葉酸受容体、ネクチン４、ＥｐｈＡ２、ＣＡ－ＩＸ、Ｂ７Ｈ３、シグレック－１５、Ｍｕｃ１、ルイスＹ抗原、および他のそのような腫瘍抗原／腫瘍標的を標的とする。
また、提供されるのは、腫瘍抗原（複数可）およびＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体もしくはＳＴＩＮＧキメラを含有する治療用組成物；腫瘍抗原（複数可）とＩＬ－１５の治療用組成物；腫瘍抗原（複数可）とＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの治療用組成物；腫瘍抗原（複数可）と、ＩＬ－１５と、ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体もしくはＳＴＩＮＧキメラの治療用組成物；および腫瘍抗原（複数可）とＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃと、ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体もしくはＳＴＩＮＧキメラの治療用組成物である。これらの産物は、免疫刺激細菌中でコードされ得る。腫瘍抗原は、本明細書に（例えば、実施例３５に）列挙もしくは記載されるあらゆるもの、または当該技術分野において既知であるあらゆるものであり得る。
産物の組合せは、抗原と免疫刺激タンパク質との組合せも含む。抗原は腫瘍抗原であり得るか、またはそれらは病原体抗原などの免疫化抗原であり得、病原体は、例えば、細菌、原生動物、ウイルス、およびプリオン、ならびに疾患および障害を引き起こす他のプリオン様粒子を含む。抗原には、本明細書に記載もしくは列挙されるあらゆるもの、または当該技術分野において既知であるあらゆるものが含まれる。組合せには、例えば、１つまたは複数の抗原とＩＦＮα２の組合せ；１つまたは複数の抗原とＩＦＮ－βの組合せ；１つまたは複数の抗原と、ＩＦＮα２と、ＩＦＮ－βの組合せ；１つまたは複数の抗原と、突然変異Ｓ３９６Ｄを有するＩＲＦ３ ＧＯＦ変異体の組合せ；および１つまたは複数の抗原と、ＩＦＮα２と、突然変異Ｓ３９６Ｄを有するＩＲＦ３ ＧＯＦ変異体の組合せが挙げられる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌中でコードされている他の産物および産物の組合せとしては、限定されないが、ＩＦＮα２と突然変異Ｓ３９６Ｄを有するＩＲＦ３ ＧＯＦ変異体の組合せ；ＩＦＮα２とＩＦＮ－βの組合せ；ＦＬＴ－３Ｌ（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド；例えば、配列番号４３６を参照されたい）；シアリダーゼ（例えば、配列番号４３５を参照されたい）；ＩＬ－１２ｐ７０のみのＩＬ－１２ｐ３５サブユニット；アズリン；例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、またはＦＬＴ－３Ｌなどの膜固定／結合サイトカインもしくは分子；またはＦＬＴ－３Ｌ；または、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、ＴＬ３８アゴニストが、ポリＵもしくはポリＵ／Ｇ、マイクロＲＮＡ、またはｍｉＲ－２１である）が挙げられる。
また、提供されるのは、改変非ヒトインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質、およびＳＴＩＮＧタンパク質キメラ、ならびに本明細書中に記載されるあらゆるものを含むデリバリー媒体、医薬組成物、これらのＳＴＩＮＧタンパク質をコードするか、または含有する細胞、およびそれらの使用、ならびにがんの処置方法である。特に、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、本明細書中に記載される改変非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、およびＳＴＩＮＧキメラをコードする。免疫刺激細菌によってコードされるこれらのＳＴＩＮＧタンパク質は、本明細書中で提供されており、全体を通して記載されている。本明細書中で提供されるのは、以下のものである：
改変非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質であり、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、ＮＦ－κＢ活性化がヒトＳＴＩＮＧタンパク質よりも低く、適宜、Ｉ型インターフェロン活性化活性が、野生型（ＷＴ）ヒトＳＴＩＮＧタンパク質と比較して、より高いものである。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、活性が増大するか、または細胞内核酸シグナル伝達の不在下で構成的に作用するような突然変異を含むように改変されている。突然変異は典型的に、ヒトのインターフェロノパシーにおいて出現するアミノ酸突然変異であり、例えばヒトＳＴＩＮＧについて先に記載したものである。対応する突然変異は、非ヒト種ＳＴＩＮＧタンパク質中に導入され、対応するアミノ酸残基が、アラインメントによって識別される。また、一部の実施形態において、ＳＴＩＮＧタンパク質のＣ末端尾部（ＣＴＴ）内のＴＲＡＦ６結合部位は欠失されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減している。
提供されるのは、改変ＳＴＩＮタンパク質、特に、キメラであるヒトＳＴＩＮＧタンパク質であり、ここでは、ヒトなどの１つの種由来のＳＴＩＮＧタンパク質中のＣＴＴ（Ｃ末端尾部）領域が、ヒトＳＴＩＮＧよりも低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性および／または高いＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有する別の種のＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣＴＴで置換されている。またこれらのキメラにおいては、ＴＲＡＦ６結合部位は、必要に応じて欠失されている。
改変ＳＴＩＮＧタンパク質はまた、本明細書の開示全体を通して記載されるような突然変異を含む。
また、提供されるのは、１～３のいずれかの改変ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、デリバリー媒体、例えば、免疫刺激細菌、本明細書に提供されるか、または当業者に知られているあらゆるものであり、例えば、エキソソーム、ナノ粒子、ミニ細胞、細胞、リポソーム、リソソーム、腫瘍溶解性ウイルス、ならびに他のウイルスベクターを含む。
また提供されるものは、ヒトＳＴＩＮＧと比較して、ＳＴＩＮＧタンパク質のＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減しており、必要に応じて、ヒトＳＴＩＮＧと比較して、Ｉ型インターフェロン刺激／シグナル伝達活性が増大した非ヒト種由来の無改変ＳＴＩＮＧをコードする、デリバリー媒体、例えば、免疫刺激細菌、本明細書に提供されるか、または当業者に知られているあらゆるものであり、例えば、エキソソーム、ナノ粒子、ミニ細胞、細胞、リポソーム、リソソーム、腫瘍溶解性ウイルス、ならびに他のウイルスベクターを含む。
また、提供されるものは、細胞（ヒトであれば、非接合子）、例えば、細胞療法に用いられる細胞、例えば、Ｔ細胞および幹細胞、ならびに本明細書に記載されるようなＳＴＩＮＧタンパク質を産生するのに用いられる細胞である。また、提供されるのは、ＳＴＩＮＧタンパク質、またはデリバリー媒体、または細胞、もしくはそれらの組合せを含有する医薬組成物である。
本明細書に記載されるようなあらゆる免疫刺激細菌を投与することによる、がんの処置および病原体またはがんに対するワクチン接種の使用ならびに方法が提供される。
ＮＦ－κＢ活性（シグナル伝達活性）、およびＳＴＩＮＧのＩ型インターフェロン刺激活性またはインターフェロン－β刺激活性を評価するアッセイおよび方法が、本明細書中に記載されており、また、当業者に知られている。方法の例は、de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175に記載されるものを含み、これは、とりわけ、ヒトを含む種々の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質のインターフェロン－βおよびＮＦ－κＢシグナル伝達活性を記載しており、それによって、ヒトＳＴＩＮＧよりもＮＦ－κＢ活性が低い、種々の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質、また、インターフェロン－β活性がヒトＳＴＩＮＧに匹敵するか、またはこれよりも高いものを識別する。de Oliveira Mann et al. (2019)は、種アラインメントを提供して、ＣＴＴドメインを含む、各種におけるＳＴＩＮＧのドメインを識別する［de Oliveira Mann et al. (2019)について、Supplemental Informationも参照］。
非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、以下に限定されないが、以下の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質であり得る：タスマニアンデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ；配列番号３４９）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ；配列番号３５９）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ；配列番号３６０）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ；配列番号３５６）、ダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ；配列番号３６１）、トキ（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ；配列番号３６２）、シーラカンス（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ；配列番号３６３～３６４）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ；配列番号３６５）、コウモリ（Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ；配列番号３６６）、マナティー（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ；配列番号３６７）、ギンザメ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ；配列番号３６８）、およびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；配列番号３６９）。これらの脊椎動物のＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒト細胞内で免疫シグナル伝達を容易に活性化する。このことは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物において共有されていることを示している［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、骨髄性細胞、例えば腫瘍常在性マクロファージおよび組織常在性マクロファージに感染し、少なくとも限られた時間、生存度を保持し、かつ／またはＩ型ＩＦＮおよび／もしくは他の免疫刺激産物の発現をもたらす治療用産物をコードするプラスミド、例えば、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、もしくは環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を必要としない機能獲得型（ＧＯＦ）変異体を送達する能力によって、Ｍ２表現型を有するマクロファージを、Ｍ１またはＭ１様の、免疫抑制特性が低減されているか、または除外されており、免疫刺激特性、抗腫瘍特性、または抗ウイルス特性が増強されているか、または加えられたマクロファージに変換することができることが、本明細書中で示されている。提供されるのは、治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌であり、ヒトマクロファージを含むマクロファージの、細菌による感染が、Ｍ２のマクロファージをＭ１表現型またはＭ１様の表現型マクロファージに変換する。提供されるのは、マクロファージでの発現が、Ｍ２マクロファージ、例えばヒトＭ２マクロファージからＭ１またはＭ１様の表現型への変換をもたらすか、またはこのように変換する治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。そのような特性を有する免疫刺激細菌は、本明細書中で提供される、腫瘍常在性（がんを患う対象内の）骨髄性細胞、および組織常在性骨髄性細胞の感染をもたらすゲノム改変を含有する細菌のあらゆるものを含む。これらのゲノム改変は、鞭毛を有しない細菌（野生型細菌は鞭毛を有する）をもたらすもの、および他のもの、例えばｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である細菌をもたらすものを含む。他の改変は、アスパラギナーゼ活性の排除をもたらすもの、例えば、骨髄性細胞に感染する細菌において、ａｎｓＢ－である細菌をもたらすことによって、Ｔ細胞活性を増強する改変、およびリポ多糖（ＬＰＳ）を変更する他の改変を含む。本明細書に提供されるこれらの免疫刺激性細菌は、免疫抑制性の貪食マクロファージを、ＣＤ８＋Ｔ細胞へのインサイチュ抗原交差提示が可能であり、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングするためにリンパ節への遊走が可能である免疫刺激性の貪食マクロファージに変換する。
含まれるのは、Ｍ２マクロファージのＭ１またはＭ１様表現型への変換を容易にするかもしくはもたらし、またはＭ２マクロファージをＭ１またはＭ１様表現型（Ｍ１マクロファージの一部またはすべての特性のプロファイルを有する）に変換する、マクロファージ内で治療用産物をコードする免疫刺激細菌である。治療用産物の例として、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現、特に構成的発現に至る細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるものがある。これは、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であり、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすために、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を必要としない、治療用産物の機能獲得型（ＧＯＦ）変異体を含み、例えば、本明細書に記載され提供されるように、変異体および非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、ＳＴＩＮＧキメラ、および機能獲得型突然変異を有するＳＴＩＮＧキメラがそうである。細菌は、本明細書中に記載されるように改変され得るあらゆるものを含み、本明細書中に記載される種、例えば、サルモネラ属種および株を含む。
また、提供されるのは、原核生物プロモーターに作用可能に連結された核酸を含む免疫刺激細菌であり、ここでは、核酸は、原核生物細胞による翻訳に必要な配列を失っているＲＮＡを含み、それによって、このＲＮＡは細菌内で産生されるが、タンパク質に翻訳されない。例えば、ＲＮＡは、シャイン・ダルガノ配列を失っており、および配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および／または翻訳リードスルー２Ａペプチドを含む。ＩＲＥＳ配列は、原核生物リボソームによる翻訳を防止するが、真核生物リボソームによる翻訳を提供する。細菌は、ポリシストロンコンストラクト由来の個別の産物を産生するために、２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａのうちの１つまたは複数である免疫刺激細菌を含む。
また、提供されるのは、ＲＮＡを、骨髄性細胞などの真核生物細胞に送達するためのデリバリー媒体であり得る本明細書に記載されるような免疫刺激細菌である。これらの細菌は、原核生物プロモーターに作用可能に連結された核酸を含み、この核酸および原核生物プロモーターは、一般的に、プラスミド上でコードされているが、一部の実施形態において、細菌ゲノム内でコードされ、この核酸は、細菌リボソームによる翻訳に必要な配列を失っているＲＮＡを含み、それによって、ＲＮＡは細菌内では産生され、ＲＮＡは、シャイン・ダルガノ配列を失っており、および配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）または翻訳リードスルー２Ａペプチドを含む。原核生物プロモーターは、治療用タンパク質（または非細菌タンパク質）をコードしている核酸に作用可能に連結されるとき、細菌プロモーターまたはファージプロモーター、例えば、バクテリオファージプロモーターであり得る。ファージプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼは、細菌ゲノム内に、または細菌における発現のためのプラスミド上でコードされ得る。例示的な原核生物プロモーターに、当業者に知られているあらゆるものが含まれ、限定されないが、その配列が、配列番号３９３～３９６、それぞれ：
attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtataatgcagcaag（配列番号３９３）
ttatgcttgacgctgcgtaaggtttttgttataatacaccaag（配列番号３９４）、または
attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtaaatgcagcaag（配列番号３９５）、または
gatcccggagttcatgcgtgatgcaatgaaagtgccgttctacttcggtgggacctcactgcttatcgttgttgtcgtgattatggactttatggctcaagtgcaaactctgatgatgtccagtcagtatgagtctgcattgaagaaggcgaacctgaaaggctacggccgttaattggtcgcctgagaagttacggagagtaaaaatgaaagttcgtgcttccgtcaagaaattatgccgtaactgcaaaatcgttaagcgtgatggtgtcatccgtgtgatttgcagtgccgagccgaagcataaacagcgccaaggctgattttttcgcatatttttcttgcaaagttgggttgagctggctagattagccagccaatcttttgtatgtctgtacgtttccatttgagtatcctgaaaacgggcttttcagcatggtacgtacatattaaatagtaggagtgcatagtggcccgtatagcaggcattaacattcctgatcagaaacacgccgtgatcgcgttaacttcgatctacggtgtcggcaagacccgttctaaagccatcctggctgcagcgggtatcgctgaaaatgttaagatcctctagatttaagaaggagatatacat（サルモネラ属ｒｐｓｍプロモーター；配列番号３９６）、
に記載されているプロモーターのすべてまたは十分な部分（作用可能に連結された核酸の転写を開始するのに十分な）を含む。
これらの免疫刺激細菌は、本明細書に記載されるようにゲノム改変を含み、それによって、細菌は組織常在性骨髄性細胞、および／または腫瘍常在性骨髄性細胞に感染するか、または腫瘍を有さない対象において、マクロファージなどの食細胞において感染する。細菌は細胞に感染して、ＲＮＡを送達し、これは、真核生物宿主細胞において翻訳される。例示的なそのような細菌は、鞭毛の生成に関与する遺伝子の欠失または破壊によるなど、鞭毛を欠くように改変されているものである。細菌は、ゲノム改変がないと、鞭毛を有する種および株である。
また、提供されるのは、コードされているタンパク質などの治療用産物が、薬物動態学的特性または薬力学的特性、例えば、延長された血清半減期などの改善された薬理学的特性を付与する部分に連結されている免疫刺激細菌である。それゆえに、提供されるのは、コードされる治療用産物が、Ｆｃドメイン、または半減期延長部分、例えばヒト血清アルブミンもしくはその部分を含む、免疫刺激細菌である。半減期延長形態または半減期延長方法の例として、ペグ化、グリコシル化の改変、シアリル化、ＰＡＳ化（約１００～２００残基長であるＰＡＳアミノ酸のポリマーによる改変）、ＥＬＰ化［例えば、Floss et al. (2010) Trends Biotechnol. 28(1): 37-45参照］、ＨＡＰ化（グリシンホモポリマーによる改変）、ヒト血清アルブミンへの融合、ＧＬＫへの融合、ＣＴＰへの融合、ＧＬＰ融合、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常断片（Ｆｃ）ドメインへの融合、トランスフェリンへの融合、非構成的ポリペプチド、例えばＸＴＥＮ［ｒＰＥＧとも称され、これは、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、およびＴを含有する、非正確な反復ペプチド配列の遺伝的融合である；例えば、Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27(12): 1186-1190参照］への融合、ならびにサイズを増大させるか、流体力学半径を増大させるか、荷電を変更するか、またはクリアランスではなくリサイクルのために受容体を標的とするような他の改変および融合、ならびにそのような改変および融合の組合せを含む。
また、提供されるのは、コードされる治療用産物が、Ｂ７タンパク質膜貫通ドメインを含み、または治療用産物が、内因性であるか、もしくはさらなるＧＰＩアンカーによってＧＰＩ固定されている免疫刺激細菌である。コードされる治療用産物は、コラーゲンへの融合を含み得る。
あらゆるすべての実施形態における免疫刺激細菌は、適切なあらゆる種であり得る。特定の遺伝子および遺伝子改変に言及する場合、遺伝子および改変は、例示的な種としてサルモネラ属を参照した遺伝子および改変に相当するものである。種および株の例は、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、およびエリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属の株を含む。例えば、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ）、リケッチア・シビリカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、エロモナス・ユークレノフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）。
本明細書に提供されるのは、ゲノム改変を含み、それによって、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５シグナル伝達が、ゲノム改変を含まない細菌と比べて低減されており、ここでは、
細菌が、さらなるゲノム改変を含むことができ、それによって、細菌は真核生物宿主中で複製することができないが、栄養素または因子が供給されるとき、インビトロで複製することができように、必要とされる栄養素または因子に栄養要求性であり、
細菌が、核酸を含有するプラスミドを含むか、または病原性ウイルス、細菌、または寄生虫に由来の抗原配列（単数または複数）をコードする、または腫瘍抗原をコードするＲＮＡを含み、それによって、宿主におけるコードされている抗原の発現の際に、宿主が病原性ウイルス、細菌、または寄生虫に対する免疫防御応答を発揮し、
抗原配列（複数可）の発現が、抗原（複数可）をコードするＲＮＡが細菌中で産生されるように、原核生物プロモーターの制御下にあり、
抗原をコードする核酸が、細菌リボソームによるコードされているＲＮＡの翻訳を阻害もしく防止するが、真核生物宿主リボソームによるコードされているＲＮＡの翻訳は阻害もしくは防止しない調節配列を含み、それによって翻訳が、細菌における転写から切り離されており、
得られる細菌が、真核生物対象に投与されるとき、食細胞に感染し、核酸を食細胞に送達し、そこでＲＮＡが翻訳される。
抗原配列（複数可）をコードする核酸は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み、それによって、宿主細胞の翻訳が容易になるかまたは増強され、細菌の翻訳が阻害または防止される。ＩＲＥＳは、血管内皮増殖因子および１型コラーゲン誘導性タンパク質（ＶＣＩＰ；例えば、配列番号４３４を参照されたい）であり得、抗原（複数可）をコードする核酸は、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳまたは細菌翻訳を阻害する他のＩＲＥＳを含み得る。ＩＲＥＳまたはＶＣＩＰ ＩＲＥＳは、プロモーターの３’であり、かつ抗原（複数可）コード配列の５’である位置でプラスミド中に含まれ得る。
病原体は、細菌もしくはウイルスであり得るか、またはコードされている抗原は、腫瘍抗原であり得る。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、慢性ウイルス感染症、および急性感染症を含むウイルス感染症もしくは細菌感染症を予防または処置するためのワクチンであり得る。感染症は、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バールウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、麻疹ウイルス、および対象に慢性的に感染するウイルスによる感染に由来し得る。感染性因子は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であり得る。
病原体は、大腸菌、ブドウ球菌属、シュードモナス属、またはポルフィロモナス属の種であり得るか、または病原体は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、または大腸菌であり得る。
これらの免疫刺激細菌中のプラスミドは、免疫刺激タンパク質または他のアジュバントをさらにコードし得るか、または免疫刺激タンパク質もしくは他の治療用タンパク質の組合せをコードし得る。免疫刺激タンパク質は、ＳＴＩＮＧタンパク質、例えば、機能獲得型突然変異を含むもの、またはキメラＳＴＩＮＧタンパク質であり得る。細菌は、治療用産物の組合せをコードするプラスミドを含み得る。免疫刺激タンパク質（複数可）および／または他の治療用タンパク質は、細菌によって認識される原核生物プロモーターの制御下で抗原とともに多シストロン性配列の一部としてプラスミド上でコードされ得るか、または免疫刺激タンパク質（複数可）および／または他の治療用タンパク質は、真核生物宿主によって認識される真核生物プロモーターの制御下でプラスミド上にコードされ得る。原核生物プロモーターは、細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーター（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｈａｇｅ）であり得、原核生物宿主は、ヒトであり得る。
免疫刺激細菌は、細菌をインビトロで培養することによって産生される原核生物プロモーターの制御下で発現される抗原（複数可）および任意の他のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み得る。免疫刺激細菌は、ゲノム改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っており、ペンタアシル化を有するＬＰＳを産生し、および／または細菌は、ａｓｄ－であり得、かつ／もしくはアデノシン栄養要求性、および／またはｃｓｇＤ－かつ／もしくはａｎｓＢ－であり得る。
細菌は、ＴＬＲ８アゴニストをコードする核酸を含み得る。
細菌は、ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であってもよく、および／または鞭毛を失ってもよく、および／またはａｓｄ－であってもよい。
細菌は、大腸菌、リステリア属、もしくはサルモネラ属の種または菌株であり得る。例えば、細菌は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株であってもよく、無改変サルモネラ属が野生型株であり、または弱毒化されている株である。免疫刺激細菌は、ＡＳＴ－１００株（ＶＮＰ２０００９もしくはＹＳ１６４６）に由来するか、またはＡＴＣＣ１４０２８株に由来するか、またはＡＴＣＣ１４０２８株の特定する特徴のすべてを有する株に由来することができる。
本明細書に記載されるように、免疫刺激細菌は、遺伝子における欠失、挿入、破壊、および他の改変のうちの１つまたは複数である、１つまたは複数のゲノム改変を含有することができ、それによって、遺伝子によってコードされている産物が産生されないか、または産生されると不活性である。
また、本明細書に提供されるのは、薬学的に許容される媒体中に本明細書に記載または提供される免疫刺激細菌のいずれかを含む医薬組成物である。医薬組成物は、ワクチンとして、例えば、液剤、粉末剤、または錠剤として製剤化され得る。また、提供されるのは、疾患または状態または感染症またはがんを処置もしくは予防する（発症のリスクを低減する）ための、細菌または医薬組成物の方法および使用、ならびにｍＲＮＡなどのＲＮＡを送達するための細菌の使用、および本明細書の細菌を投与することを含む、ＲＮＡを対象に送達する方法である。
また提供されるのは、産物（単数または複数）をコードするプラスミドを含む細菌であり、この産物（複数可）は、治療用産物（複数可）であり、細菌中のプラスミドは、細菌によって翻訳されないｍＲＮＡを産生するために産物（複数可）をコードする。
細菌は、本明細書中に記載される改変によって、弱毒化され得るか、または低い毒性もしくは非毒性にされ得る。細菌の例として、サルモネラ属の種、例えばネズミチフス菌株がある。本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、補体殺傷抵抗性（ｒｃｋ）をコードする遺伝子、例えばサルモネラ属ｒｃｋ遺伝子を内生的にコードかつ発現し、またはコードかつ発現するように改変されているものを含む。例えば、治療的大腸菌は、ｒｃｋをコードして全身投与され得るように改変されている。また、本明細書中で提供され、記載され、特許請求の範囲に示されるのは、特にヒトにおける、デリバリー媒体、細胞、医薬組成物、方法、使用、およびがんの処置である。また、提供されるのは、処置のための対象の選択のためのコンパニオン診断法および方法、ならびに処置をモニタリングする方法である。これらは、以下に、また特許請求の範囲において記載されており、これらは、それらの全体が本セクション中に組み込まれる。
図１Ａ～１Ｃは、プラスミドｐＡＴＩ－１．７５およびｐＡＴＩ－１．７６（それぞれ、図１Ａおよび１Ｂ）中の挿入断片を示す。図１Ｃは、シャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列が、真核細胞、例えば、骨髄性細胞において翻訳のためにコザック配列で置換されていることを示す。 同上。 同上。 図２は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ（配列番号３４９）タンパク質のアラインメントを示す。 図３は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびマーモセットＳＴＩＮＧ（配列番号３５９）タンパク質のアラインメントを示す。 図４は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびウシＳＴＩＮＧ（配列番号３６０）タンパク質のアラインメントを示す。 図５は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびネコＳＴＩＮＧ（配列番号３５６）タンパク質のアラインメントを示す。 図６は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびダチョウＳＴＩＮＧ（配列番号３６１）タンパク質のアラインメントを示す。 図７は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびトキＳＴＩＮＧ（配列番号３６２）タンパク質のアラインメントを示す。 図８は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびシーラカンスＳＴＩＮＧ（配列番号３６３）タンパク質のアラインメントを示す。 図９は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０６）およびゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ（配列番号３４８）タンパク質のアラインメントを示す。 図１０は、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３０５）およびイノシシＳＴＩＮＧ（配列番号３６５）タンパク質のアラインメントを示す。 図１１は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびコウモリＳＴＩＮＧ（配列番号３６６）タンパク質のアラインメントを示す。 図１２は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびマナティーＳＴＩＮＧ（配列番号３６７）タンパク質のアラインメントを示す。 図１３は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびギンザメＳＴＩＮＧ（配列番号３６８）タンパク質のアラインメントを示す。 図１４は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびマウスＳＴＩＮＧ（配列番号３６９）タンパク質のアラインメントを示す。
概略
Ａ．定義
Ｂ．がん治療のための免疫刺激細菌の概要
１．細菌がん免疫治療
２．腫瘍微小環境を標的とする先行治療
ａ．自家Ｔ細胞療法の限界
ｂ．ウイルスワクチンプラットフォーム
ｃ．細菌がん治療
ｉ．リステリア属
ｉｉ．サルモネラ属種
ｉｉｉ．ＶＮＰ２０００９
ｉｖ．野生型株
３．既存の細菌がん免疫治療の限界
Ｃ．治療指数を増大させ、腫瘍常在性骨髄性細胞内の蓄積を増大させるための免疫刺激細菌の改変および増強
１．ＬＰＳ生合成経路における遺伝子の欠失
ａ．ｍｓｂＢ欠失
ｂ．ｐａｇＰ欠失または不活性化
２．栄養要求性
ａ．ｐｕｒＩ欠失／破壊
ｂ．アデノシン栄養要求性
ｃ．チミジン栄養要求性
３．プラスミド維持およびデリバリー
ａ．ａｓｄ欠失
ｂ．ｅｎｄＡ欠失／破壊
４．フラゲリンノックアウト株
５．適応免疫を促進し、Ｔ細胞機能を増強する細菌操作
Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）欠失／破壊
６．ｃｕｒｌｉ線毛の産生に必要とされるサルモネラ属遺伝子の欠失／破壊
ｃｓｇＤ欠失
７．補体に対する抵抗性の改善
Ｒｃｋ発現
８．サルモネラ属および他のグラム陰性細菌におけるリポタンパク質発現に必要とされる遺伝子の欠失
９．抗腫瘍治療のためにゲノムが最適化されており、複数を含む治療用産物をコードする頑健な免疫刺激細菌
１０．真核生物宿主における発現のための、ｍＲＮＡおよび他の形態のＲＮＡを含むＲＮＡを送達するワクチンおよび細菌
１１．抗病原体処置およびワクチンとして使用するための、ならびに抗がん処置および／または予防のための、病原体由来のものおよび腫瘍由来のものも含む、特定の抗原に対する細菌ワクチン
１２．Ｍ２表現型マクロファージからＭ１およびＭ１様の表現型マクロファージへの変換
Ｄ．腫瘍微小環境において免疫応答を刺激する遺伝的ペイロードをコードする、増強した治療指数を有する免疫刺激細菌
１．免疫刺激タンパク質
ａ．サイトカインおよびケモカイン
ｂ．共刺激分子
２．免疫応答ならびに／またはＩ型ＩＦＮ、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、ＳＴＩＮＧキメラ、および改変型を刺激する構成的に活性なタンパク質
ａ．構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型突然変異
ｂ．構成的ＩＲＦ３発現および機能獲得型突然変異
ｃ．活性が増大しているかまたは構成的活性を有する非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびその変異体、ならびに活性が増大しているかまたは構成的活性を有するＳＴＩＮＧキメラおよびその変異体
ｄ．細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその構成的変異体として作用する他の遺伝子産物
ｉ．ＲＩＧ－Ｉ
ｉｉ．ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１
ｉｉｉ．ＩＲＦ７
ｅ．他のＩ型ＩＦＮ調節タンパク質
３．抗体および抗体断片
ａ．ＴＧＦ－β
ｂ．二重特異性ｓｃＦｖおよびＴ細胞エンゲージャー
ｃ．抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＣＴＬＡ－４抗体
ｉ．抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体
ｉｉ．抗ＣＴＬＡ－４抗体
ｄ．さらなる例示的なチェックポイント標的
４．免疫調節タンパク質の組合せは相乗効果および／または補完効果を有し得る
５．プロドラッグを活性化する分子
６．併用療法をもたらす免疫刺激細菌
Ｅ．抗ウイルス治療薬としてのおよび他の感染性病原体に対する治療薬としての免疫刺激細菌
Ｆ．細菌のデリバリーのための治療用産物をコードする例示的プラスミドの構築
１．タンパク質の異種発現のための構成的プロモーター
２．複数の治療用産物発現カセット
ａ．単一プロモーターコンストラクト
ｂ．二重／多重プロモーターコンストラクト
３．調節エレメント
ａ．転写後調節エレメント
ｂ．ポリアデニル化シグナル配列およびターミネーター
ｃ．エンハンサー
ｄ．分泌シグナル
ｅ．細菌の適応度の改善
４．複製起点およびプラスミドコピー数
５．ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧアイランド
６．プラスミド維持／選択成分
７．ＤＮＡ核標的化配列
Ｇ．例示的な細菌株およびワクチンならびに治療薬として使用するための作用機序
１．例示的な免疫刺激細菌－インサイチュがんワクチン接種の作用機序（ＭＯＡ）
２．末梢がんワクチン接種のための例示的な免疫刺激細菌および作用機序
３．病原体ワクチン接種のための例示的な免疫刺激細菌およびＭＯＡ
Ｈ．医薬品生成、組成物および製剤
１．製造
ａ．セルバンクの製造
ｂ．原体の製造
ｃ．薬物製品の製造
２．組成物
３．製剤
ａ．液剤、注射剤、乳濁剤
ｂ．乾燥熱安定性製剤
４．他の投与経路のための組成物
５．投薬量および投与
６．包装および製造品
Ｉ．処置の方法および使用
１．処置する患者を選択し処置をモニタリングするための診断法
ａ．患者選択
ｂ．免疫刺激細菌の活性を評価または検出するための診断法は処置の有効性を示す
２．腫瘍
３．投与
４．モニタリング
Ｊ．実施例
Ａ．定義
別段の定めがない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の開示の全体を通して参照されるすべての特許、特許出願、公開出願、ならびに刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト、および他の公開された素材は、特に明記しない限り、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書中の用語について複数の定義がある場合には、当該セクションのものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、当然、そのような識別子が変わって、インターネットに関する特定の情報が移り変わる場合があるが、等価の情報を、インターネットを検索することによって見出すことができる。その参照は、そのような情報の利用可能性および公的普及の証拠となる。
本明細書中で用いられる「治療細菌」は、対象、例えばヒトに投与されると、治療、例えば抗がん治療または抗腫瘍治療を達成する細菌である。
本明細書中で用いられる「免疫刺激細菌」は、対象中に導入された場合に、免疫特権組織および細胞、例えば腫瘍、腫瘍微小環境、ならびに腫瘍常在性免疫細胞において蓄積し、免疫刺激であるか、または免疫刺激をもたらす産物を複製かつ／もしくは発現する治療細菌である。例えば、免疫刺激細菌は、宿主内で、毒性もしくは病原性の低減によって、かつ／または毒性もしくは病原性を低減するコードされている産物によって、弱毒化される。というのも、免疫刺激細菌は、主に、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）などの免疫特権環境における以外は、産物を複製かつ／または発現することができない（または複製／産物発現が低減される）からである。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、産物（単数または複数）をコードするか、および／または産物を免疫刺激にする形質もしくは特性を示すように改変されている。免疫刺激細菌はまた、内在性産物（単数または複数）が発現されないように、ゲノム改変を含む。細菌は、そのような産物（複数可）を失っているということができる。当業者であれば、トランスポゾンの転位もしくは挿入、挿入、および遺伝子産物を除外する任意の他の変化を含む、欠失、破壊によって、遺伝子が不活性化され得ることを認識する。これは、トランスポゾンの転位もしくは封入を含む、挿入、欠失、および／または破壊によって達成することができる。不活性化される遺伝子の例としては、例えば、ｍｓｂＢ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、ｃｕｒｌｉ線毛をコードする遺伝子（複数可）、鞭毛をコードする遺伝子（それが不活性化されることによって、細菌は鞭毛を失う）、および本明細書に記載のかつ／または当業者に既知の他の改変が挙げられる。当業者はまた、様々な細菌種における対応する遺伝子が異なる名称を有し得ることも理解する。免疫刺激細菌中のコードされている産物、特性、および形質は、以下に限定されないが、例えば：免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子；細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、またはその機能獲得型のもしくは構成的に活性な変異体（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ）；ＲＮＡｉ、免疫チェックポイント、例えば、ＴＲＥＸ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、および／またはＰＤ－Ｌ１を標的とするか、破壊するか、または阻害するＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ；抗体およびその断片、例えば、抗免疫チェックポイント抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、またはＴＧＦ－β阻害抗体；他の抗体コンストラクト、例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）抗体）；ＴＧＦ－βに結合するデコイとしての機能を果たす可溶性ＴＧＦ－β受容体、またはＴＧＦ－βアンタゴナイジングポリペプチド；ならびにデコイ受容体に結合するＩＬ－６の少なくとも１つを含む。また、免疫刺激細菌は、免疫抑制性であるか、または免疫抑制経路内にある代謝物質、例えばアデノシンについて、細菌を栄養要求性にする改変を含み得る。
本明細書中で用いられる株名称ＶＮＰ２０００９（例えば、国際出願ＰＣＴ国際公開第９９／１３０５３号参照、また、米国特許第６，８６３，８９４号も参照）、ＹＳ１６４６、および４１．２．９は、互換的に用いられており、各々が、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に寄託されて、登録番号２０２１６５が割り当てられている株を指す。ＶＮＰ２０００９は、ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ内に欠失または他の改変を含有し、野生型ネズミチフス菌株ＡＴＣＣ ＃１４０２８から生成された、ネズミチフス菌の改変弱毒化株である。
本明細書中で用いられる株名称ＹＳ１４５６および８．７は、互換的に用いられており、各々が、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に寄託されて、登録番号２０２１６４を割り当てられている株を指す（米国特許第６，８６３，８９４号参照）。
本明細書中で用いられる、細菌が特定の株に「由来する」という記載は、そのような株が出発材料として機能し得、特定の細菌が生じるように改変され得ることを意味する。
本明細書中で用いられる「発現カセット」は、ペイロード、例えば治療用産物または他のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸に作用可能に連結された、遺伝子発現用の調節配列を含む核酸コンストラクトを指す。
本明細書中で用いられる２Ａペプチドは、真核生物細胞内での翻訳中のポリペプチドの切断を媒介する、１８～２２個のアミノ酸（ａａ）長のウイルスオリゴペプチドである。名称「２Ａ」は、ウイルスゲノムの特定の領域を指し、様々なウイルス２Ａが、通常、これらが由来したウイルスの後に命名されてきた。これらの例として、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）、Ｅ２Ａ（ウマ科鼻炎Ａウイルス）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ）、およびＴ２Ａ［ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ］がある。コード配列について、例えば、Liu et al. (2017) Scientific Reports 7:2193、図１参照。また、配列番号３２７～３３０参照。これらのペプチドは、一般に、ＤｘＥｘＮＰＧＰのコア配列モチーフを共有しており、多数のウイルスファミリーにおいて存在する。それらは、リボソームにペプチド結合させないことによって、ポリタンパク質をバラバラにする一助となる。２Ａペプチドは、複数のタンパク質が、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現されるマルチシストロン性／多シストロン性ベクターを提供する。本明細書での目的のために、２Ａペプチドは、天然に存在するもの、およびそれらのあらゆる改変型を含み、例えば、いずれも、複数（２つ以上）のオープンリーディングフレームを含む転写産物から転写され翻訳されることになる単一のポリペプチドをもたらす、本明細書中で開示されるものを含む、天然に存在するあらゆる２Ａペプチドと９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
本明細書中で用いられる「インターフェロノパシー」は、インターフェロンの発現を調節または誘導する経路に関与する遺伝子産物中の突然変異によるインターフェロンのアップレギュレーションと関連する障害を指す。産物の活性は、通常、メディエータ、例えば、細胞内ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはヌクレオチドによって調節される；タンパク質産物が変異する場合、活性は構成的である。Ｉ型インターフェロノパシーは、エカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）の重度の形態、およびより軽度の家族性凍傷状狼瘡（ＦＣＬ）を含む範囲の状態を含む。これらの特性を有する変異産物をコードする核酸分子は、例えば、正常な活性を有する、または本明細書中に記載される疾患関連機能獲得型突然変異体と比較してさらなる機能獲得がある対立遺伝子の産物と比較して、産物において機能獲得が生じる突然変異について選択することによって、インビトロで生成することができる。
本明細書中で用いられる「機能獲得型突然変異」は、突然変異を有していない同じタンパク質と比較して、タンパク質の活性を増大させるものである。例えば、タンパク質が受容体であるならば、リガンドに対する親和性が増大することとなる；タンパク質が酵素であるならば、構成的活性を含む活性が増大することとなる。特に、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉなどの産物に関して、構成的に活性な産物は、その活性化リガンド、例えばＳＴＩＮＧに対するｃＧＡＳの不在下で、および／または、Ｉ型インターフェロンの産生をもたらす、細胞質内核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチドかつ／もしくは環状ジヌクレオチドまたは他の核酸分子の不在下で活性であるものである。細胞質内のこれらの核酸分子は、ウイルスもしくは細菌の感染および／または放射もしくは他の曝露から生じ、そのような病原体に対する宿主中での免疫応答の活性化をもたらす。
本明細書中で用いられる「複製起点」は、染色体もしくはプラスミド上の、またはウイルス内の、複製が開始されるＤＮＡの配列である。細菌プラスミドおよび小ウイルスを含む小ＤＮＡについて、単一の起点で十分である。
複製起点は、ベクターコピー数を決定する。これは、選択される複製起点に依存する。例えば、発現ベクターが低コピー数プラスミドｐＢＲ３２２に由来するならば、コピー数は約１５～２０コピー／細胞であり、高コピー数プラスミドｐＵＣに由来するならば、５００～７００コピー／細胞であり得る。本明細書中で用いられる、細胞中のプラスミドの中程度のコピー数は、約１５０以下であり、低コピー数は、５～３０、例えば２０以下である。低～中程度のコピー数は、１５０コピー／細胞未満である。高コピー数は、１５０コピー／細胞超である。
本明細書中で用いられる「ＣｐＧモチーフ」は、中心ＣｐＧの側面（３’側および５’側）に位置する少なくとも１つの塩基によって囲まれる、非メチル化中心ＣｐＧ（ｐは、連続するＣヌクレオチドとＧヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指す）を含む塩基のパターンである。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、非メチル化ＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチドである。５’ＣＧ３’の少なくともＣは、メチル化されていない。
本明細書中で用いられる「ＲＩＧ－Ｉ結合配列」は、５’三リン酸（５’ｐｐｐ）構造を直接、またはポリ（ｄＡ－ｄＴ）配列からＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩによって合成されるものを指し、これは、ＲＩＧ－Ｉとの相互作用によって、ＲＩＧ－Ｉ経路を介してＩ型ＩＦＮを活性化することができる。ＲＮＡは、少なくとも４つのＡリボヌクレオチド（Ａ－Ａ－Ａ－Ａ）を含む；４、５、６、７、８、９、または１０個以上を含有することができる。ＲＩＧ－Ｉ結合配列は、ポリＡへの転写用の細菌内のプラスミド中に導入される。
本明細書中で用いられる「サイトカイン」は、細胞シグナル伝達において重要な、広くて曖昧なカテゴリーの小タンパク質（約５～２０ｋＤａ）である。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子を含む。サイトカインは、免疫応答において細胞間コミュニケーションを補助する細胞シグナリング分子であり、炎症、感染、および創傷の部位に向けた細胞の移動を刺激する。
本明細書中で用いられる「ケモカイン」は、ケモカイン受容体に結合する化学誘引性（走化性）サイトカインを指し、天然の源から単離されるタンパク質、および組換え手段によって、または化学合成によって合成的に製造されるタンパク質を含む。例示的なケモカインは、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＣＰ－２、ＧＲＯ－α、ＧＲＯ－β、ＧＲＯ－γ、ＥＮＡ－７８、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ ＩＩＩ、ＮＡＰ－２、ＬＡＰＦ－４、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１、ＰＦ４、ＳＤＦ－１α、ＳＤＦ－１β、ＳＤＦ－２、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＣＰ－５、ＭＩＰ－１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ－１β（ＣＣｌ４）、ＭＩＰ－１γ（ＣＣＬ９）、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－２α、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－４、ＭＩＰ－５、ＭＤＣ、ＨＣＣ－１、ＡＬＰ、ルングキン、Ｔｉｍ－１、エオタキシン－１、エオタキシン－２、Ｉ－３０９、ＳＣＹＡ１７、ＴＲＡＣ、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＤＣ－ＣＫ－１、リンホタクチン、およびフラクタルキン、ならびに当業者に知られている他のものを含むが、これらに限定されない。ケモカインは、炎症部位への免疫細胞の移動に、免疫細胞の成熟に、適応免疫応答の誘発に関与する。
本明細書中で用いられる「免疫刺激タンパク質」は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を示すか、または促進するタンパク質である。そのようなタンパク質の例として、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子、例えば、以下に限定されないが、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（本明細書では、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、ＩＬ－１５複合体、および本明細書に記載される他のバリエーションとも称される）、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の潜在的動員および／または持続性に関与する分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、細胞質ドメインが欠失している４－１ＢＢＬ（１ＢＢＬΔｃｙｔ）、または細胞質ドメインが部分的に欠失している（切り詰められた）４－１ＢＢＬ、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ならびに腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーがある。
免疫刺激タンパク質のうち、切り詰められた共刺激分子、例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌがあり、各々、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現について、完全または部分的な細胞質ドメイン欠失がある。これらの切り詰められた遺伝子産物、例えば細胞質ドメインの欠失または部分的欠失を有するものは、欠失した細胞質ドメインまたは切り詰められた細胞質ドメインに起因して、共刺激受容体結合を介して、Ｔ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達することができるが、ＡＰＣに対して対抗調節シグナル伝達することができないように切り詰められている。
本明細書中で用いられる「細胞質ドメイン欠失」は、タンパク質の細胞質ドメインまたは細胞内ドメインを含むアミノ酸残基のすべて、または一部における欠失であり、欠失は、共刺激受容体結合を介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達を引き起こすのに十分であり、ＡＰＣに対する対抗調節シグナル伝達を阻害するのに十分である。例えば、ヒト４－１ＢＢＬ（別名ＴＮＦＳＦ９）の細胞質ドメインは、配列番号３４２のアミノ酸残基１～２８を含む。ヒトＣＤ８０の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基２６４～２８８を含み；ヒトＣＤ８６の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基２６９～３２９を含み；ヒトＣＤ２７Ｌ（別名ＣＤ７０）の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基１～１７を含み；ヒトＢ７ＲＰ１（別名ＩＣＯＳＬＧまたはＩＣＯＳリガンド）の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基２７８～３０２を含み；ヒトＯＸ４０Ｌ（別名ＴＮＦＳＦ４またはＣＤ２５２）の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基１～２３を含む。
本明細書中で用いられる「デコイ受容体」は、効率的に、特定の成長因子またはサイトカインに特異的に結合することができるが、意図される受容体複合体にシグナル伝達するか、またはこれを活性化することが構造的にできない受容体である。デコイ受容体は、リガンドに結合して、その同族受容体に結合するのを妨げることによって、阻害剤としての機能を果たす。
例えば、ＴＧＦ－βファミリー受容体は、細胞表面セリン／トレオニンキナーゼ受容体Ｉ型（ＴβＲＩまたはＴＧＦβＲ１）およびＩＩ型（ＴβＲＩＩまたはＴＧＦβＲ２）（二量体化されたリガンドの不在下でヘテロマーの複合体を形成する）、ならびにＩＩＩ型受容体ベータグリカン（ＴβＲＩＩＩまたはＴＧＦβＲ３）を含む。ＴＧＦ－βの、その受容体への結合を妨げる、ＴＧＦ－βについての可溶性デコイ受容体は、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ、またはＴβＲＩＩＩ（βグリカン）の可溶性細胞外ドメイン（ＴＧＦ－β結合領域）を含み、これらは、他の分子、例えばＦｃドメインと融合することができる。加えて、ＢＡＭＢＩ（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびアクチビン膜結合阻害剤）は、Ｉ型受容体と構造的に関連しており、受容体活性化を阻害するデコイとしての機能を果たす。また、ＴＧＦβＲ２および膜貫通領域の細胞外ドメインを含むが、シグナル伝達に必要とされる細胞質ドメインを欠いている、ドミナントネガティブＴＧＦβＲ２（ＤＮ－ＴＧＦβＲ２）を、ＴＧＦ－βデコイ受容体として用いることができる（例えば、国際公開第２０１８／１３８００３号参照）。
本明細書中で用いられる共刺激分子アゴニストは、共刺激分子に結合するとすぐに、これを活性化するか、またはその活性を増大させる分子である。例えば、アゴニストはアゴニスト抗体であり得る。ＣＤ４０アゴニスト抗体の例は、ＣＰ－８７０，８９３、ダセツズマブ、ＡＤＣ－１０１３（ミタザリマブ）、およびＣｈｉ Ｌｏｂ ７／４を含む。
本明細書中で用いられる細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路は、Ｉ型インターフェロンの生成の原因となるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチドおよび／もしくは環状ジヌクレオチド、または他の核酸分子の存在によって開始されるものである。細胞内の核酸分子は、ウイルス、細菌、もしくは放射線の、または他のそのような曝露から発生し、宿主における免疫応答の活性化の原因となる。
本明細書中で用いられる「Ｉ型インターフェロン経路タンパク質」は、自然免疫応答を誘導するタンパク質である（Ｉ型インターフェロンの誘導等）。
本明細書中で用いられる「細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー」は、Ｉ型インターフェロン等の免疫応答メディエータの発現に導く細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質である。「細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー」は、Ｉ型インターフェロン経路タンパク質を含む。例えば、本明細書中に記載され、当業者に知られているように、細胞内ＤＮＡは、ｃＧＡＳによって感知されて、ｃＧＡＭＰおよび以降のＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３シグナル伝達の生成、およびＩ型ＩＦＮ生成の原因となる。また、細菌環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ、例えば細菌環状ジ－ＡＭＰ）がＳＴＩＮＧを活性化する。それゆえに、ＳＴＩＮＧはＩ型インターフェロンを誘導する免疫調節タンパク質である。５’－三リン酸ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが、ＲＩＧ－Ｉ、およびＭＤＡ－５単独またはＭＤＡ－５／ＬＧＰ２によって感知される。これにより、ミトコンドリアＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質）の重合が起こり、また、ＴＡＮＫ－結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）およびインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）が活性化する。そのような経路内のタンパク質は、免疫刺激タンパク質であり、自然免疫応答メディエータ、例えばＩ型インターフェロンの発現の原因となる。ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路内の免疫調節タンパク質は、活性が増大するように、または細胞質内核酸の不在下で構成的に作動するように改変されて、かつ／またはリガンドを活性化させ／刺激し、免疫応答、例えばＩ型インターフェロンの発現に至り得る。
本明細書中で用いられる、自然免疫タンパク質ＳＴＩＮＧの「カルボキシ末端尾部」または「Ｃ末端尾部」（ＣＴＴ）は、ＳＴＩＮＧタンパク質のＣ末端部分を指し、これは、野生型ＳＴＩＮＧタンパク質において、フレキシブルなリンカー領域によってｃＧＡＭＰ結合ドメインにつながれている。ＣＴＴは、ＩＲＦ３結合部位、ＴＢＫ１結合部位、およびＴＲＡＦ６結合部位を含む。ＳＴＩＮＧは、ＴＡＮＫ結合性キナーゼ１（ＴＢＫ１）によるＳＴＩＮＧタンパク質Ｃ末端尾部（ＣＴＴ）のリン酸化を介したインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）産生の誘導を促進する。ＳＴＩＮＧとＴＢＫ１との相互作用は、ＳＴＩＮＧのカルボキシ末端尾部（ＣＴＴ）内の８つのアミノ酸残基の進化的に保存された範囲によって媒介される。ＴＲＡＦ６は、ＳＴＩＮＧ上でのＫ６３結合ユビキチン鎖の形成を触媒して、転写因子ＮＦ－κＢの活性化および代替のＳＴＩＮＧ依存性遺伝子発現プログラムの誘導に至る。ＣＴＴ内のＴＲＡＦ６結合部位の欠失または破壊は、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を低減し得る。ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴ（またはその部分）の、ＮＦ－κＢ活性化が低い種のＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣＴＴ（またはその対応する部分）との置換により、結果として生じる改変ヒトＳＴＩＮＧタンパク質によって、ＮＦ－κＢ活性化が低下し得る。ＳＴＩＮＧ ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要とされる配列モチーフを含有する約４０アミノ酸の構造化されていない範囲である［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。ヒトＳＴＩＮＧ残基Ｓ３６６は、インターフェロンシグナル伝達を活性化する自然免疫アダプタータンパク質間で共有されるＬｘＩＳのモチーフの一部である主要なＴＢＫ１リン酸化部位として同定されている［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴは、ＴＢＫ１結合に必要とされる、残基Ｌ３７４を含む第２のＰｘＰＬＲモチーフを含有する；ＬｘＩＳ配列およびＰｘＰＬＲ配列は、脊椎動物のＳＴＩＮＧ対立遺伝子の間で保存されている［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。例示的なＳＴＩＮＧ ＣＴＴ配列、ならびにＩＲＦ３、ＴＢＫ１、およびＴＲＡＦ６結合部位を、以下の表に示す：
本明細書中で用いられる、「腫瘍常在性免疫細胞の細胞死をあまり誘導しない」または「免疫細胞の細胞死をあまり誘導しない」ように改変されている細菌は、改変のない細菌よりも毒性がないもの、または改変のない細菌と比較して病原性が低減されているものである。そのような改変の例として、食細胞のピロトーシスを無くすもの、および細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）プロファイルを変更するものがある。これらの改変は、フラゲリン遺伝子、ｐａｇＰ、またはＳＰＩ－１経路の１つまたは複数の成分、例えば、ｈｉｌＡ、ロッドタンパク質（例えばｐｒｇＪ）、ニードルタンパク質（例えばｐｒｇＩ）、およびＱｓｅＣの破壊または欠失を含む。
本明細書中で用いられる、「腫瘍常在性免疫細胞に優先的に感染するように改変されている」、または「免疫細胞に優先的に感染するように改変されている」細菌は、免疫細胞以外の細胞に感染する能力を低減する改変をゲノム中に有する。そのような改変の例は、３型分泌系もしくは４型分泌系、または非免疫細胞に侵入する細菌の能力に影響を与える他の遺伝子もしくは系を破壊する改変がある。例えば、改変として、ＳＰＩ－１成分の破壊／欠失を含み、これは、細胞、例えば上皮細胞の感染に必要とされるが、サルモネラ属による免疫細胞、例えば食細胞の感染に影響を与えない。
本明細書中で用いられる「改変」は、ポリペプチドのアミノ酸の配列、または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変に関し、アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入、および置換がそれぞれ挙げられる。ポリペプチドを改変する方法は、組換えＤＮＡ方法論を用いることによる等、当業者にとって常法である。
本明細書中で用いられる、細菌ゲノム、プラスミド、または遺伝子への改変は、核酸の欠失、置換、および挿入を含む。
本明細書中で用いられるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の翻訳を阻害し、それにより発現を阻害するために標的ｍＲＮＡ分子を中和することによって、遺伝子発現または翻訳を阻害する生物学的プロセスである。
本明細書中で用いられる、ＲＮＡｉを介して作動するＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現のサイレンシングによる阻害と称される。サイレンシング発現は、標的遺伝子の発現が低減されるか、抑制されるか、または阻害されることを意味する。
本明細書中で用いられる、ＲＮＡｉを介した遺伝子サイレンシングは、標的遺伝子の発現を阻害するか、抑制するか、破壊するか、または静まらせると言われている。標的遺伝子は、阻害ＲＮＡの配列に対応するヌクレオチドの配列を含有し、それによって阻害ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの発現を静まらせる。
本明細書中で用いられる、標的遺伝子を阻害すること、抑制すること、破壊すること、または静まらせることは、標的遺伝子の発現、例えば翻訳を変更し、それによって、標的遺伝子によってコードされる産物の活性または発現が低減されるプロセスを指す。低減は、完全ノックアウトまたは部分的ノックアウトを含み、それによって、本明細書中で提供される免疫刺激細菌および本明細書中の投与に関して、処置が達成される。
本明細書中で用いられる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、通常約２１ヌクレオチド長の、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの小片であり、各末端の３’突出部（２つのヌクレオチド）が用いられて、特定の配列にてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合してその分解を促進することによって、タンパク質の翻訳に「干渉する」ことができる。そうすることで、ｓｉＲＮＡは、その対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づく特定のタンパク質の産生を妨げる。当該プロセスは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれており、また、ｓｉＲＮＡサイレンシングまたはｓｉＲＮＡノックダウンとも称される。
本明細書中で用いられる、ショートヘアピンＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現を静まらせるのに用いることができる、タイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現は典型的に、プラスミドのデリバリーによって、またはウイルスベクターもしくは細菌ベクターを介して達成される。
本明細書中で用いられる腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍が存在する細胞環境であり、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来の炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む。存在する条件は、以下に限定されないが、腫瘍を示す、血管新生の増大、低酸素、低ｐＨ、ラクテート濃度の増大、ピルバート濃度の増大、間隙液圧の増大、および代謝物質または代謝の変更、例えばアデノシンのより高いレベルを含む。
本明細書中で用いられる、免疫砂漠腫瘍または免疫排除腫瘍は、Ｔ細胞に浸潤する腫瘍を欠損している腫瘍である。免疫砂漠腫瘍は、最小限のエフェクター免疫細胞が腫瘍に浸潤し、腫瘍に存在する免疫応答を失っている固形腫瘍である。砂漠腫瘍は腫瘍浸潤リンパ球を欠損しており、実質、間質、腫瘍周辺を含む腫瘍からＣＤ８＋Ｔ細胞は存在しない。
本明細書中で用いられる「バクトフェクション」は、遺伝子またはプラスミドＤＮＡの、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞中への細菌媒介移入を指す。
本明細書中で用いられるヒトＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、免疫系の活性を調節するインターフェロンタンパク質のサブグループである。すべてのＩ型ＩＦＮは、特定の細胞表面受容体複合体、例えばＩＦＮ－α受容体に結合する。Ｉ型インターフェロンは、とりわけ、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含む。骨髄性細胞は、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βの主要なプロデューサであり、これらは、自然免疫応答に主に関与する抗ウイルス活性を有する。ＩＦＮ－βの２つの型として、ＩＦＮ－β１（ＩＦＮＢ１）およびＩＦＮ－β３（ＩＦＮＢ３）がある。
本明細書中で用いられる、「Ｍ１マクロファージ表現型」および「Ｍ２マクロファージ表現型」は、マクロファージ表現型を分ける２つの広い群：Ｍ１（古典的活性化マクロファージ）およびＭ２（代替活性化マクロファージ）を指す。Ｍ１マクロファージの役割は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインを分泌すること、ポジティブ免疫応答に関与して、免疫モニターとして機能するように抗原を提示することである。産生される主要な炎症促進性サイトカインとして、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、およびＴＮＦ－アルファがある。Ｍ２マクロファージは主に、アルギナーゼ－Ｉ、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、および他の抗炎症サイトカインを分泌し、これらは、炎症を低減し、腫瘍増殖および免疫抑制機能に貢献する機能を有する。Ｍ１様の表現型のマクロファージは、炎症促進性サイトカインを分泌し、Ｍ２マクロファージの免疫抑制活性は有していない。Ｍ２マクロファージからＭ１またはＭ１様の表現型のマクロファージへの変換は、Ｍ２マクロファージを、免疫抑制性でないが、抗腫瘍応答に関与するものに変換する。Ｍ１またはＭ１様の表現型のマクロファージに変換されるＭ２マクロファージは、より炎症促進性のサイトカイン／ケモカインおよび受容体、例えばＣＤ８０およびＣＣＲ７、ならびにケモカイン、例えばＩＦＮγおよびＣＸＣＬ１０の分泌／発現を示す。Ｍ１表現型マーカーとしては、限定されないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ１６、およびＣＤ３２の１つまたは複数が挙げられる。また、Ｍ１マクロファージにおける一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現は、表現型マーカーとして機能することができる。ＣＤ１６３およびＣＤ２０６は、Ｍ２マクロファージの識別のための主要なマーカーである。また、Ｍ２－型細胞用の他の表面マーカーは、ＣＤ６８を含む。Ｍ２マーカーのいずれかの低減または排除、およびＭ１マクロファージを示すサイトカイン／ケモカインの増大が、Ｍ２表現型からＭ１またはＭ１様の表現型への変換を反映している。以下のセクション、およびＭ２からＭ１様またはＭ１表現型の変換に関する実施例は、誘導される例示的なサイトカインプロファイルおよびマーカーを説明している。
本明細書中で用いられる、核酸またはコードされるＲＮＡが遺伝子を標的とするという記載は、何らかの機序によって遺伝子の発現を阻害するか、抑制するか、または静まらせることを意味する。通常、そのような核酸は、標的遺伝子と相補的な少なくとも部分を含み、当該部分は、相補部分とのハイブリッドを形成するのに十分である。
本明細書中で用いられる、核酸またはポリペプチド配列に言及する場合の「欠失」は、配列、例えば標的ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または天然もしくは野生型の配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失を指す。
本明細書中で用いられる、核酸またはアミノ酸配列に言及する場合の「挿入」は、標的の、天然、野生型、または他の関連する配列内の１つもしくは複数のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の包含を説明する。ゆえに、野生型配列と比較した１つまたは複数の挿入を含有する核酸分子は、配列の線状長さ内に１つまたは複数のさらなるヌクレオチドを含有する。
本明細書中で用いられる、核酸およびアミノ酸配列への「付加」は、別の配列と比較したいずれかの末端上への、ヌクレオチドまたはアミノ酸の追加を説明する。
本明細書中で用いられる「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」は、天然の、標的、野生型、または他の核酸またはポリペプチド配列内の１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、分子の長さ（ヌクレオチドまたは残基の数で記載される）を変えることなく、代替のヌクレオチドまたはアミノ酸により置換することを指す。ゆえに、分子内の１つまたは複数の置換が、分子のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数を変えることはない。特定のポリペプチドと比較したアミノ酸置換を、ポリペプチド配列の長さに沿って、アミノ酸残基の数に換算して表すことができる。
本明細書中で用いられる、「に対応する位置にて」、またはヌクレオチドもしくはアミノ酸位置が、例えば配列表に示される、開示される配列内のヌクレオチドもしくはアミノ酸位置に「対応する」という記載は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばＧＡＰアルゴリズムを用いて同一性を最大にするような、開示される配列とのアラインメントにより同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。配列をアラインすることによって、当業者であれば、例えば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、対応する残基を同定することができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最も高いオーダーマッチが得られるようにアラインされる［例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；およびCarrillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math 48:1073)参照］。
本明細書中で用いられる配列のアラインメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２つ以上の配列をアラインするための相同性の使用を指す。典型的には、５０％以上の同一性によって関連する２つ以上の配列がアラインされる。アラインされる配列セットは、対応する位置にてアラインされる２つ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされる、ＲＮＡに由来する配列、例えばＥＳＴおよび他のｃＤＮＡをアラインすることを含み得る。関連するポリペプチドもしくは核酸分子、または変異体ポリペプチドもしくは核酸分子を、当業者に知られているあらゆる方法によってアラインすることができる。そのような方法は典型的に、マッチを最大にし、例えば、マニュアルアラインメントを用いる方法、ならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）および当業者に知られている他のものを用いる方法を含む。ポリペプチドまたは核酸の配列をアラインすることによって、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、相似の部分または位置を同定することができる。さらに、当業者であれば、保存されたアミノ酸またはヌクレオチド残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列との間で対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を見出すこともできる。また、対応する位置は、例えばタンパク質構造のコンピュータシミュレートアラインメントを用いる、構造アラインメントに基づくこともできる。他の例において、対応する領域を同定することができる。また、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列との間で対応するアミノ酸残基を見出すこともできる。
本明細書中で用いられる、ポリペプチド、例えば抗体の「特性」は、ポリペプチドによって示されるあらゆる特性を指し、以下に限定されないが、結合特異性、構造的立体配置または高次構造、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、構造的安定性、熱抵抗性、およびｐＨ条件に対する抵抗性を含む。特性の変化は、ポリペプチドの「活性」を変更することができる。例えば、抗体ポリペプチドの結合特異性の変化は、抗原に結合する能力、および／または種々の結合活性、例えば親和性もしくは結合力、またはポリペプチドのインビボ活性を変更することができる。
本明細書中で用いられる、ポリペプチド、例えば抗体の「活性」または「機能活性」は、ポリペプチドによって示されるあらゆる活性を指す。そのような活性は、実験に基づいて判定することができる。例示的な活性は、以下に限定されないが、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合、または二量体化、または酵素活性、例えばキナーゼ活性、またはタンパク質分解活性を介した、生体分子と相互作用する能力を含む。抗体（抗体断片を含む）について、活性は、以下に限定されないが、特定の抗原に特異的に結合する能力、抗原結合の親和性（例えば、高親和性または低親和性）、抗原結合の結合力（例えば、高結合力または低結合力）、結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、エフェクター機能、例えば抗原中和またはクリアランスを促進する能力、ウイルス中和、およびインビボ活性、例えば、病原体の感染もしくは侵入を妨げる、またはクリアランスを促進する、または体内の特定の組織もしくは体液もしくは細胞に侵入する能力を含む。活性は、認識されているアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラスモン共鳴、または結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）もしくは解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を測定する等価のアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡観察、細胞ベースのアッセイ、ならびに結合アッセイ（例えばパニングアッセイ）を用いて、インビトロまたはインビボ評価することができる。
本明細書中で用いられる「結合する」、「結合した」、またはその文法上の変形は、２つの分子が互いに近接している安定した関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）をもたらす、一方の分子の、もう一方の分子とのあらゆる引力相互作用への関与を指す。結合は、以下に限定されないが、非共有結合、共有結合（例えば、可逆的共有結合および不可逆的共有結合）を含み、分子、例えば、以下に限定されないが、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および小分子、例えば薬物を含む化合物間の相互作用を含む。
本明細書中で用いられる「抗体」は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片を指し、免疫グロブリン断片は、天然であるか、または部分的もしくは完全に合成的に、例えば組換えにより生成されるかを問わず、抗原結合部位を形成するのに、アセンブルされた場合に、抗原に特異的に結合するのに十分な免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域の少なくとも部分を含有するあらゆる断片を含む。それゆえに、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（抗体結合部位）に相同または実質的に相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖（ＨおよびＨ’と表され得る）および２つの軽鎖（ＬおよびＬ’と表され得る）を含有する抗体を指し、各重鎖は、全長免疫グロブリン重鎖、またはその、抗原結合部位を形成するのに十分な部分であり得（例えば、重鎖として、ＶＨ鎖、ＶＨ－ＣＨ１鎖、およびＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない）、各軽鎖は、全長軽鎖、またはその、抗原結合部位を形成するのに十分な部分であり得る（例えば、軽鎖として、ＶＬ鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない）。各重鎖（ＨおよびＨ’）は、１つの軽鎖（それぞれＬおよびＬ’）と対形成する。典型的には、抗体は、可変重（ＶＨ）鎖および／または可変軽（ＶＬ）鎖のすべてまたは少なくとも部分を最小限に含む。また、抗体は、定常領域のすべてまたは一部を含み得る。
本明細書中での目的のために、用語抗体は、全長抗体、およびその部分を含み、その部分は、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片等の抗体断片を含む。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または上述のいずれかの抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。また、抗体は、合成抗体、組換えにより生成された抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびイントラボディを含む。本明細書中で提供される抗体は、あらゆる免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、あらゆるサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のメンバーを含む。ヒト治療用の抗体は一般に、ヒト抗体であるか、またはヒト化されている。
本明細書中で用いられる「抗体断片（複数可）」は、（ｉ）可変重鎖および／もしくは軽鎖、または抗体の機能断片を含有し、Ｆｃ部分を欠いている一価の単一特異性抗体誘導体；ならびに（ｉｉ）ＢｉＴＥ（登録商標）抗体（タンデム型のｓｃＦｖ）、二重親和性リターゲティング抗体（ＤＡＲＴ）、他の二量体ならびに多量体抗体、ダイアボディ、および単鎖ダイアボディ（ｓｃＤＢ）を指す。ゆえに、抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ断片、ナノボディ（例えば、カメルス・バクトリアムス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｍｕｓ）、ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、またはアルパカ（Ｌａｍａ ｐａｃｃｏｓ）に由来する抗体参照）（例えば、米国特許第５，７５９，８０８号；およびStijlemans et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:1256-1261参照）、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂもしくはｓｄＡｂ）、最小認識単位、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体、およびＤＡＲＴ抗体、ならびに抗原に結合する他の抗体コンストラクトが挙げられる。典型的に、列挙される抗体断片は、分子量が６０ｋＤａ未満である。
本明細書中で用いられる「核酸」は、典型的にはホスホジエステル結合によって結合されている、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む少なくとも２つの連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を指す。また、用語「核酸」に含まれるのは、核酸のアナログ、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオアートＤＮＡ、ならびに他のそのようなアナログおよび誘導体、またはそれらの組合せである。また、核酸は、例えば、ヌクレオチドアナログ、またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミダート結合、ホスホロチオアート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含有するＤＮＡ誘導体およびＲＮＡ誘導体を含む。また、当該用語は、ヌクレオチドアナログ、ならびに一本鎖核酸（センスまたはアンチセンス）および二本鎖核酸から形成されるＲＮＡまたはＤＮＡの均等物、誘導体、変異体、およびアナログを含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについて、ウラシル塩基はウリジンである。
本明細書中で用いられる単離核酸分子は、核酸分子の天然の源において存在する他の核酸分子から分離されたものである。「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって生成される場合、他の細胞物質も培地も実質的にあり得ず、または化学的に合成される場合、化学前駆体も他の化学物質も実質的にあり得ない。本明細書中で提供される例示的な単離核酸分子は、本明細書中で提供される抗体または抗原結合断片をコードする単離核酸分子を含む。
本明細書中で用いられる、核酸配列、領域、要素、またはドメインに関する「作用可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作用可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸領域が互いに機能的に関連していることを意味する。これは並置を指し、それによって、そのように記載される成分は、意図される様式で機能するのを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターが転写または発現に影響を与えるならば、コード配列に作用可能に連結されている。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結され得、それによって核酸は、機能的融合タンパク質を発現するように転写され翻訳され得、リーダーペプチドは、融合ポリペプチドの分泌を引き起こす。一部の例において、第１のポリペプチド（例えばリーダーペプチド）をコードする核酸は、第２のポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結されており、核酸は、単一のｍＲＮＡ転写産物として転写されるが、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳は、発現されることになる２つのポリペプチドのうち１つが生じ得る。例えば、アンバー終止コドンが、第１のポリペプチドをコードする核酸と第２のポリペプチドをコードする核酸との間に、部分的なアンバーサプレッサー細胞中に導入された場合に、結果として生じる単一のｍＲＮＡ転写産物が、第１および第２のポリペプチドを含有する融合タンパク質を生成するように翻訳され得るか、または第１のポリペプチドのみを生成するように翻訳され得るように、位置決めされ得る。別の例において、プロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結され得、それによってプロモーターは、核酸の転写を調節または媒介する。
本明細書中で用いられる、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する「合成的な」は、組換え方法および／または化学合成方法によって生成される核酸分子または遺伝子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書中で用いられる、天然に存在するα－アミノ酸の残基は、ヒトにおいて、同族ｍＲＮＡコドンでチャージされるｔＲＮＡ分子の特定の認識によってタンパク質中に組み込まれる、自然界に見出される２０種のα－アミノ酸の残基である。
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」は、共有結合した２つ以上のアミノ酸を指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で互換的に用いられる。
本明細書中で用いられる「ペプチド」は、２～約４０アミノ酸長であるポリペプチドを指す。
本明細書中で用いられる「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含有する。本明細書中の目的のために、本明細書に提供される抗体および免疫刺激タンパク質内に含有されるアミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸（以下の表参照）、非天然のアミノ酸、およびアミノ酸アナログ（例えば、α－炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。本明細書中で用いられる、本明細書中で表示されるポリペプチドの種々のアミノ酸配列中に存在するアミノ酸は、周知の、３文字略語または１文字略語（以下の表参照）に従って識別される。種々の核酸分子および断片内に存在するヌクレオチドは、当該技術においてルーチン的に用いられる標準的な単文字表示により示される。
本明細書中で用いられる「アミノ酸残基」は、そのペプチド結合でのポリペプチドの化学消化（加水分解）により形成されるアミノ酸を指す。本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、通常、「Ｌ」異性体形態である。「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、あらゆるＬアミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、37 C.F.R.§§1.821-1.822に採択されている標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基の略語を、以下の表に示す：
対応表
式によって本明細書中で表されるアミノ酸残基のすべての配列は、アミノ末端の、カルボキシル末端への従来の方向の、左から右の向きを有する。フレーズ「アミノ酸残基」は、先の対応表において記載されるアミノ酸、ならびに改変アミノ酸、非天然のアミノ酸、および特殊なアミノ酸を含むと定義される。アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１つもしくは複数のアミノ酸残基のさらなる配列への、またはアミノ末端基、例えばＮＨ２への、またはカルボキシル末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示す。
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換が当業者に知られており、一般に、結果として生じる分子の生物活性を変更することなくなされ得る。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の単一のアミノ酸置換では、生物活性は実質的に変更されないことを認識する（例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224参照）。
そのような置換は、以下の表に示される例示的な置換に従ってなされ得る：
例示的な保存的アミノ酸置換
また、他の置換も許容可能であり、実験に基づいて、または他の知られている保存的置換もしくは非保存的置換に従って決定することができる。
本明細書中で用いられる「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチド内に存在する２０種のＬ－アミノ酸を指す。
本明細書中で用いられる用語「非天然のアミノ酸」は、天然のアミノ酸に類似した構造を有するが、天然のアミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されている有機化合物を指す。ゆえに、天然に存在しないアミノ酸の例は、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸のアナログを含み、アミノ酸のＤ－立体異性体を含むが、これに限定されない。例示的な非天然のアミノ酸は、当業者に知られており、２－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３－アミノアジピン酸（ｂＡａｄ）、β－アラニン／β－アミノプロピオン酸（Ｂａｌａ）、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－アミノ酪酸／ピペリジン酸（４Ａｂｕ）、６－アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２－アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３－アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２－アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’－ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ－エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ－エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、アロ－ヒドロキシリシン（Ａｈｙｌ）、３－ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４－ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロ－イソロイシン（Ａｉｌｅ）、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン（ＭｅＧｌｙ）、Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、６－Ｎ－メチルリシン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で用いられる、ＤＮＡコンストラクトは、自然界に見出されない様式で組み合わされ、並置されるＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖、または二本鎖の、線状または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒト操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書中で用いられるＤＮＡセグメントは、指定された属性を有するより大きなＤＮＡ分子の部分である。例えば、指定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’の方向に読まれる場合、指定されたポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする、より長いＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたはプラスミド断片の部分である。
本明細書中で用いられる用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、当該ポリヌクレオチドは、天然の源から単離することができ、インビトロで合成することができ、または天然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書中で、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）に換算して与えられる。用語ヌクレオチドは、文脈が容認する場合、一本鎖分子および二本鎖分子に用いられる。当該用語は、二本鎖分子に用いられる場合、全長を意味するのに用いられて、用語塩基対に等しいことが理解されるであろう。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は、長さがわずかに異なり得ること、それらの末端は少しずつずらして並べられ得る（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ことが認識されよう；ゆえに、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが、対形成され得るわけではない。そのような対形成されていない末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
本明細書中で用いられる、組換え方法による生成は、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための、分子生物学の周知の方法の使用を指す。
本明細書中で用いられる「異種核酸」は、発現される細胞によって通常インビボ生成されない産物（すなわち、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）をコードする核酸、あるいは転写、翻訳、または他の調節可能な生化学プロセスに影響を与えることによって、通常存在しない遺伝子座内にある、または内因性核酸、例えばＤＮＡの発現を変更するメディエータを媒介もしくはコードする核酸である。また、異種核酸、例えばＤＮＡは、外来核酸とも称される。当業者であれば、発現される細胞と異種であるか、または当該細胞の外来であると認識するか、または考えるであろうあらゆる核酸、例えばＤＮＡは、本明細書中で、異種核酸に含まれる；異種核酸は、内生的にも発現される、外因的に加えられる核酸を含む。異種核酸は、通常、導入されるが、別の細胞から得られた細胞に内因性でないか、あるいは合成的に調製されるか、あるいは天然に存在しないか、または発現が、調節配列、もしくは天然の調節配列と異なる配列の制御下にあるゲノム遺伝子座中に導入される。
本明細書中の異種核酸の例は、以下に限定されないが、ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路内のタンパク質、またはその機能獲得型変異体もしくは構成的に活性な変異体、あるいは腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子をコードする核酸を含む。また、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を与えるか、またはこれに貢献する他の産物、例えば、抗体およびその断片、ＢｉＴＥ（登録商標）、デコイ受容体、アンタゴナイジングポリペプチド、ならびにＲＮＡｉを含む。免疫刺激細菌において、異種核酸は一般に、導入されるプラスミド上にコードされるが、細菌のゲノム中に導入され得、例えば、細菌産物の発現を変更するプロモーターがある。異種核酸、例えばＤＮＡは、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの方法で媒介することができる核酸を含み、または異種核酸は、治療用産物の発現を、直接的または間接的に、何らかの方法で媒介する産物、例えばペプチドもしくはＲＮＡをコードすることができる。
本明細書中で用いられる細胞療法は、疾患または状態を処置するための、対象への細胞のデリバリーを含む。対象とは同種異系であり得るか、または自己由来であり得る細胞は、例えば、対象に導入された場合に産物を送達または発現するような、本明細書中に記載される、免疫刺激細菌による細胞の感染によって、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）改変される。
本明細書中で用いられる遺伝的治療は、そのような治療が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの特定の細胞、例えば標的細胞中への異種核酸、例えばＤＮＡの移入を含む。核酸、例えばＤＮＡは、異種核酸、例えばＤＮＡが発現されて、それによってコードされる治療用産物が生成されるように、選択された標的細胞中に導入される。また、遺伝的治療を用いて、欠陥遺伝子を置換する遺伝子産物、または導入される哺乳動物もしくは細胞によって生成される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達することができる。導入された核酸は、哺乳動物宿主において通常生成されない、または治療的に有効な量で、もしくは治療的に有用な時点にて生成されない治療化合物、例えば成長因子もしくはその阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えばその受容体をコードし得る。治療用産物をコードする異種核酸、例えばＤＮＡは、患っている宿主の細胞中への導入前に改変されて、その産物または発現を増強するように、またはそうならないように変更することができる。また、遺伝的治療は、遺伝子発現の阻害剤もしくはリプレッサ、または他の調節因子のデリバリーを含み得る。
本明細書中で用いられる「発現」は、ポリペプチドがポリヌクレオチドの転写および翻訳によって生成されるプロセスを指す。ポリペプチドの発現のレベルは、例えば、宿主細胞から生成されるポリペプチドの量を判定する方法を含む、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて評価することができる。そのような方法は、以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡによる細胞溶解液中でのポリペプチドの定量化、ゲル電気泳動後のクマシーブルー染色、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ、およびＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを含み得る。
本明細書中で用いられる「宿主細胞」は、ベクターを受け入れ、維持し、複製し、かつ／または増幅するのに用いられる細胞である。また、宿主細胞は、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するのに用いることができる。ベクター内に含有される核酸は、宿主細胞が分裂するときに複製され、それによって核酸が増幅する。
本明細書中で用いられる「ベクター」は、適切な宿主細胞中にベクターが形質転換された場合に１つまたは複数の異種タンパク質が発現され得る複製可能核酸である。ベクターへの言及には、典型的には制限消化およびライゲーションによって、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が導入され得るベクターが含まれる。また、ベクターへの言及には、ポリペプチド、例えば改変抗ＣＴＬＡ－４抗体をコードする核酸を含有するベクターが含まれる。ベクターは、核酸の増幅のために、または核酸によってコードされるポリペプチドの発現／提示のために、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中に導入するのに用いられる。ベクターは典型的に、エピソームのままであるが、ゲノムの染色体中への遺伝子またはその部分の組込みを引き起こすように設計され得る。また、意図されるのは、人工染色体、例えば、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体であるベクターである。そのような媒体の選択および使用は、当業者には周知である。また、ベクターは、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」を含む。ウイルスベクターは、細胞中に外来遺伝子を移す（媒体またはシャトルとして）ために、外来遺伝子に作用可能に連結されている、操作されたウイルスである。
本明細書中で用いられる「発現ベクター」は、調節配列と作用可能に連結されているＤＮＡを発現することができるベクターを含み、当該調節配列は、例えば、そのようなＤＮＡ断片の発現を引き起こすことができるプロモーター領域である。そのようなさらなるセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、適宜、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナル等を含むことができる。発現ベクターは通常、プラスミドＤＮＡもしくはウイルスＤＮＡに由来するか、または両方のエレメントを含有し得る。ゆえに、発現ベクターは、適切な宿主細胞中への導入により、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらす組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクト、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターを指す。適切な発現ベクターが、当業者に周知であり、真核生物細胞および／もしくは原核生物細胞において複製可能であるもの、ならびにエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれものを含む。
本明細書中で用いられる「一次配列」は、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列、または核酸分子中のヌクレオチドの配列を指す。
本明細書中で用いられる「配列同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの比較において同一であるか類似したアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性が、核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントによって判定されて、類似性または同一性の領域を識別することができる。本明細書中の目的のために、配列同一性が通常、アラインメントによって判定されて、同一の残基が識別される。アラインメントはローカルであっても、グローバルであってもよい。マッチ、ミスマッチ、およびギャップを、比較した配列間で同定することができる。ギャップは、同一であるか、または類似する文字がアラインされるように、アラインされた配列の残基間に挿入されるヌルアミノ酸またはヌルヌクレオチドである。通常、内部ギャップおよび末端ギャップが存在し得る。ギャップペナルティを用いる場合、配列同一性は、末端ギャップについてペナルティなしで（例えば、末端ギャップは、ペナルティを課されない）判定することができる。これ以外にも、配列同一性を、同一の位置の数／アラインした総配列の長さ×１００として、ギャップを考慮することなく判定することができる。
本明細書中で用いられる「グローバルアラインメント」は、始めから終わりまで、２つの配列をアラインし、各配列内の各文字を一回のみアラインするアラインメントである。類似性または同一性が配列間に存在するか否かを問わず、アラインメントが作成される。例えば、「グローバルアラインメント」に基づく５０％配列同一性は、各々１００ヌクレオチド長の比較される２つの配列の完全配列のアラインメントにおいて、残基の５０％が同じであることを意味する。また、グローバルアラインメントは、アラインされる配列の長さが同じでない場合でも、配列同一性を判定するのに用いることができることが理解される。配列の末端における差異は、「末端ギャップについてペナルティなし」が選択されない限り、配列同一性を判定するのに考慮されることとなる。通常、グローバルアラインメントは、全長のほとんどにわたって有意な類似性を共有する配列に用いられる。グローバルアラインメントを実行するための例示的なアルゴリズムとして、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む［Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453］。グローバルアラインメントを実行するための例示的なプログラムが、公的に利用可能であり、National Center for Biotechnology Information（NCBI）ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/）にて利用可能なＧｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.にて利用可能なプログラムを含む。
本明細書中で用いられる「ローカルアラインメント」は、２つの配列をアラインするが、類似性または同一性を共有する配列の部分しかアラインしないアラインメントである。それゆえに、ローカルアラインメントは、一方の配列のサブセグメントが、もう一方の配列内に存在するかを判定する。類似性がないならば、アラインメントは返されない。ローカルアラインメントアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴまたはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム［Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)］を含む。例えば、「ローカルアラインメント」に基づく５０％配列同一性は、任意の長さの２つの比較される配列の完全配列のアラインメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、類似性または同一性の当該領域において同じである残基を５０％有することを意味する。
本明細書中の目的のために、配列同一性は、各供給元によって確立されたデフォルトギャップペナルティで用いられる標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって判定され得る。ＧＡＰプログラムについてのデフォルトパラメータは、以下を含み得る：（１）Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載される、Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745-6763の単項比較マトリックス（同一性について１の値、および非同一性について０を含有する）、および重み付けした比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティ、および各ギャップにおける各記号についてさらなる０．１０のペナルティ；ならびに（３）末端ギャップについて、ペナルティなし。２つの任意の核酸分子が、ヌクレオチド配列を有するか、または２つの任意のポリペプチドが、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（または同一性パーセントを列挙する他の類似したバリエーション）「同一」であるアミノ酸配列を有するかが、ローカルアラインメントまたはグローバルアラインメントに基づく、知られているコンピュータアルゴリズムを用いて判定され得る（例えば、何十もの知られており、公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供しているwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software参照）。通常、本明細書中の目的のために、配列同一性は、グローバルアラインメントに基づくコンピュータアルゴリズム、例えばＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴから入手可能なNeedleman-Wunsch Global Sequence Alignmentツール（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome）；LAlign［William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357］、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.にて入手可能なＸｉａｏｑｕｉ Ｈｕａｎｇのプログラムを用いて判定される。典型的には、比較されるポリペプチドまたはヌクレオチドの各々の全長配列は、グローバルアラインメントにおける各配列の全長にわたってアラインされる。また、比較されることになる配列が実質的に同じ長さである場合も、ローカルアラインメントを用いることができる。
したがって、本明細書中で用いられる用語「同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間での比較またはアラインメントを表す。非限定的な一例において、「と少なくとも９０％同一の」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して９０％～１００％の同一性パーセントを指す。９０％以上のレベルでの同一性は、例示を目的とすれば、１００アミノ酸またはヌクレオチドの試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長と参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長とが比較されて、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおけるアミノ酸またはヌクレオチドの１０％（すなわち、１００中１０）以下が、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸またはヌクレオチドと異なるという事実を示す。類似した比較が、試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの間でなされ得る。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分配される点突然変異として表され得、または、例えば１０／１００といった許容可能な最大アミノ酸差異（おおよそ９０％の同一性）まで、様々な長さの１つまたは複数の位置においてクラスター化され得る。また、差異は、アミノ酸残基の欠失またはトランケーションに起因し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失と定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５～９０％を上回る相同性または同一性のレベルにて、結果は、設定されるプログラムおよびギャップパラメータから独立し得る；同一性のそのような高いレベルは、多くの場合ソフトウェアに依存することなく、容易に評価することができる。
本明細書中で用いられる「疾患または障害」は、以下に限定されないが、感染、後天性状態、および遺伝的状態、ならびに定義可能な病徴によって特徴付けられるものを含む原因または状態に起因する、生物における病的状態を指す。
本明細書中で用いられる、疾患または状態を患う対象を「処置する」ことは、対象の病徴が、部分的に、もしくは全体として軽減されるか、または処置の後に静的なままであることを意味する。
本明細書中で用いられる「処置」は、疾患または障害の病徴を寛解させるあらゆる作用を指す。処置は、予防処置、治療、および／または療法を包含する。また、処置は、本明細書中で提供されるあらゆる免疫刺激細菌または組成物のあらゆる医薬的使用を包含する。
本明細書中で用いられる「予防処置」は、潜在的疾患の予防、および／または病徴の、もしくは疾患の進行の悪化の予防を指す。
本明細書中で用いられる、「予防」または予防処置、およびその文法的に等しい形態は、疾患または状態を進行させるリスクまたは可能性が低減される方法を指す。
本明細書中で用いられる「薬学的に有効な剤」は、あらゆる治療剤または生物活性剤を含み、以下に限定されないが、例えば、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、ならびに小分子薬および治療タンパク質を含む従来の治療薬を含む。
本明細書中で用いられる「治療効果」は、疾患もしくは状態の病徴を変更するか、または典型的には改善するか、もしくは寛解させる、あるいは疾患または状態を治療する、対象の処置に起因する効果を意味する。
本明細書中で用いられる「治療的に有効な量」または「治療的に有効な用量」は、対象への投与の後に治療効果を生み出すのに少なくとも十分な化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物の量を指す。それゆえにこれは、疾患または障害の病徴を予防するか、治療するか、寛解させるか、抑制するか、または部分的に抑制するのに必須の量である。
本明細書中で用いられる「治療有効性」は、化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物が投与された対象において治療効果を生み出す、化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物の能力を指す。
本明細書中で用いられる「予防的に有効な量」または「予防的に有効な用量」は、対象に投与された場合に、例えば、疾患もしくは病徴の発症もしくは再発を予防するか、もしくは遅延させること、疾患もしくは病徴の発症もしくは再発の見込みを低減すること、またはウイルス感染の発生率を低減することといった、意図される予防的効果を有する化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物の量を指す。完全な予防効果は、１回用量の投与によって必ずしも生じるわけではなく、一連の用量の投与の後にのみ生じ得る。ゆえに、予防的に有効な量は、１回または複数回の投与で投与され得る。
本明細書中で用いられる、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の病徴の寛解は、組成物または治療薬の投与に起因し得るか、または当該投与と関連し得る、永続的であるか一時的であるかを問わない、病徴の長続きするか、または一過性のあらゆる軽減を指す。
本明細書中で用いられる「抗がん剤」または「抗がん治療薬」は、悪性細胞および組織に対して直接的または間接的に破壊的であるか、または毒性であるあらゆる剤または治療薬を指す。例えば、抗がん剤は、がん細胞を死滅させるか、またはさもなければ腫瘍もしくはがん細胞の増殖を阻害するか、もしくは損なう剤を含む。例示的な抗がん剤は、化学療法剤および免疫治療剤である。
本明細書中で用いられる「治療活性」は、治療用産物、例えば、ポリペプチド、核酸分子、および他の治療分子のインビボ活性を指す。通常、治療活性は、疾患または状態の処置と関連する活性である。
本明細書中で用いられる用語「対象」は、哺乳動物、例えばヒトを含む動物を指す。
本明細書中で用いられる患者は、ヒト対象を指す。
本明細書中で用いられる「動物」は、以下に限定されないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長類；げっ歯類、例えば、マウスおよびラット；家禽、例えばニワトリ；反芻動物、例えば、ヤギ、ウシ、シカ、およびヒツジ；ならびにブタおよび他の動物等のあらゆる動物を含む。非ヒト動物は、意図される動物としてヒトを除く。本明細書中で提供されるポリペプチドは、あらゆる源、動物、植物、原核生物、および菌類に由来する。ほとんどのポリペプチドは、哺乳動物起源を含む動物起源のものである。
本明細書中で用いられる「組成物」は、あらゆる混合物を指す。組成物として、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらのあらゆる組合せがあり得る。
本明細書中で用いられる「組合せ」は、２つ以上の項目間のあらゆる関連を指す。組合せは、２つ以上の別々の項目、例えば、２つの組成物または２つの集合、それらの混合物、例えば２つ以上の項目の単一の混合物、またはそれらのあらゆる変形物であり得る。組合せのエレメントは、通常、機能的に関連するか、または関係がある。
本明細書中で用いられる「併用療法」は、２種以上の異なる治療薬の投与を指す。異なる治療剤は、別々に、連続して、断続的に提供され投与され得、または単一の組成物により提供され得る。
本明細書中で用いられる「キット」は、パッケージされた組合せであり、他のエレメント、例えば追加的な試薬、およびその組合せまたはエレメントの使用説明書を、生物活性または特性の活性化、投与、診断、および評価を含むがこれらに限定されない目的のために含んでもよい。
本明細書中で用いられる「単位用量形態」は、ヒトおよび動物対象に適した、当該技術において知られるように、個々にパッケージされた、物理的に別々の単位を指す。
本明細書中で用いられる「単回投薬量製剤」は、直接投与用の製剤を指す。
本明細書中で用いられる「マルチドーズ型製剤」は、治療剤のいくつかの単回用量を提供するために、治療剤の複数回用量を含有し、直接投与され得る製剤を指す。用量は、分、時間、週、日、または月にわたって投与することができる。マルチドーズ型製剤は、用量調整、用量プール、および／または用量分割を可能にし得る。マルチドーズ型製剤は経時的に用いられるので、通常、微生物の増殖を妨げるための１つまたは複数の防腐剤を含有する。
本明細書中で用いられる「製造品」は、製造されて販売される産物である。本出願の全体を通して用いられる当該用語は、包装の物品内に含有される、本明細書中で提供されるあらゆる組成物を包含することが意図される。
本明細書中で用いられる「流体」は、流れることができるあらゆる組成物を指す。ゆえに、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。
本明細書中で用いられる、単離された、または精製されたポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、単離抗体またはその抗原結合断片）またはその生物学的に活性な部分（例えば、単離抗原結合断片）は、ポリペプチドもしくはタンパク質が由来する細胞もしくは組織から細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質が実質的にない、または化学的に合成された場合に化学前駆体もしくは他の化学物質から実質的に解放されている。調製物は、当業者によって純度を評価するために用いられる標準的な分析方法、例えば薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって判定される容易に検出可能な不純物がないように見えるならば、またはさらなる精製が、物理的特性および化学的特性、例えば、物質の酵素活性および生物学的活性を検出可能に変更しないほど十分に純粋であるならば、実質的に解放されていると判定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法が、当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合には、さらなる精製が、化合物の特定の活性を増大させるかもしれない。本明細書中で用いられる「細胞抽出物」または「溶解液」は、溶解した細胞または破壊された細胞から構成される調製物または画分を指す。
本明細書中で用いられる、「持続性ウイルス感染」は、ウイルスが除去されず、感染した個体の特定の細胞に残っているものを指す。持続性感染には、急速に死滅したり、宿主細胞に過剰な損傷を与えたりすることなく、無症状で増殖性の感染の段階が含まれる。潜在性感染、慢性感染、および遅発性感染と定義され得る３種の重複する持続性ウイルス－宿主相互作用がある。持続性ウイルス感染によって引き起こされる疾患には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ＡＩＤＳ関連症候群、慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎（慢性麻疹脳炎）、慢性パポバウイルス脳炎（進行性多巣性白質脳症）、海綿状脳症（プリオン病によって引き起こされる）、いくつかのヘルペスウイルスによって引き起こされる疾患およびいくつかの腫瘍形成がある。これらおよび他の感染症を引き起こすウイルスには、例えば、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、麻疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパポバウイルス、ヒトパルボウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、およびパルボウイルスがある。
本明細書中で用いられる「対照」は、試験パラメータにより処理されないこと、または血漿サンプルであるならば、注目する状態に冒されていない正常なボランティアに由来し得ること以外は、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを指す。また、対照は、内部対照であり得る。
本明細書中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと述べていない限り、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「免疫グロブリンドメイン」を含むポリペプチドへの言及は、免疫グロブリンドメインの１つまたは複数を有するポリペプチドを含む。
本明細書中で用いられる用語「または」は、選択肢のみに言及することが明示的に示されない限り、または選択肢が互いに相容れない限り、「および／または」を意味するのに用いられる。
本明細書中で用いられる範囲および量は、「約」特定の値または範囲と表され得る。また、「約」は、正確な量を含む。それゆえに、「約５つのアミノ酸」は、「約５つのアミノ酸」を、また「５つのアミノ酸」をも意味する。
本明細書中で用いられる「してもよい、適宜（ｏｐｔｉｏｎａｌまたはｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載される事象または状況が起こるか、または起こらないこと、ならびに記載が、前記事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。例えば、適宜変異体の部分は、当該部分が変異体または非変異体であることを意味する。
本明細書中で用いられる、あらゆる保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、特に明記しない限り、それらの一般的な使用、認識されている略語、またはＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに関するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ［Biochem. (1972) 11(9): 1726-1732参照］に従う。
限定するためではなく開示を明確にするために、詳細な説明を、続くサブセクションに分けている。
Ｂ．治療のための免疫刺激細菌の概要
細菌が抗がん活性を有するという認識は、１９世紀に遡る。そのころ、何人かの医師が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に感染した患者で腫瘍が後退するのを観察した。Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃｏｌｅｙは、細菌を末期がんの処置に利用する最初の研究を開始し、Ｓ．ピオゲネスおよびセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）で構成されるワクチンを開発した。これは、肉腫、癌腫、リンパ腫、および黒色腫を含めた様々ながんの処置に好成績で用いられた。それ以来、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、およびエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）を含めた、いくつかの細菌の種が、抗がんワクチンの源として研究されてきた（例えば、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ１９９９／０１３０５３号および第ＷＯ２００１／０２５３９９号：Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21；およびPawlek et al. (2003) Lancet Oncol. 4:548-556を参照）。
治療プラットフォームとして、細菌は、腫瘍溶解性ウイルスなどの他の療法に勝るいくつかの利点を有する。一部の細菌の種は、経口投与および全身（静脈内：ＩＶ）投与されるように操作することができ、それらは、インビトロおよびインビボで容易に増殖し、それらは、凍結乾燥された状態で保存および輸送することができる。細菌の染色体は、エクソンが無く、容易に操作することができ、極めて多数の株の完全なゲノムが完全に特徴付けられている（Felgner et al. (2016) mBio 7(5):e01220-16）。多くのタイプの細菌は、産生するのがウイルスより安価かつ簡単であり、操作された細菌は、宿主細胞ゲノムに永久に組み込まれないので、その適切なデリバリーは、ウイルスデリバリーよりも好都合であり得る。それらは、上皮細胞より骨髄性細胞を優先的に感染させ、それらは、必要に応じて、抗生物質で迅速に無くすことができ、このことが、それらを安全なものにしている。
これらの有利な特性を活用するために改変されている免疫刺激細菌を本明細書で提供する。本明細書で提供する細菌は、それらが腫瘍微小環境、特に腫瘍常在性免疫細胞（骨髄性細胞）、例えば、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、樹状細胞（ＤＣ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などを感染させ、その中で増えるように改変されており、高レベルの治療用タンパク質およびその組合せ、特に補完的な組合せを発現し、デリバリーするように設計されてもいる。本明細書に記載されるように、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、がんを予防および／または処置するためのワクチンとして、また細菌、ウイルス、寄生虫、および他の病原体を含む病原体に対するワクチンとして使用することができる。これらの使用は、本明細書に提供される免疫刺激細菌の腫瘍常在性マクロファージ内に蓄積する能力に依存し、また、筋内または吸入によってなど直接的に投与される場合には、持続性のある免疫応答および免疫を促進するために、食細胞内に蓄積する能力に依存する。がんの処置のための細菌の特性はまた、それらのワクチンとしての使用のために有利である。これらの特性は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４ならびに５の応答を低減するゲノム改変、ならびに他の改変、例えば、インビトロでの増殖を可能にするが、インビボでの増殖を低減もしくは排除する栄養要求性、またアデノシンなどの腫瘍微小環境中に蓄積された栄養素の免疫抑制効果を低減させ得る栄養要求性、ならびにＴ細胞を不活性化し得る、アスパラギナーゼなどの細菌酵素の免疫抑制効果を除去するゲノム改変に由来する。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、既存の細菌療法、また、細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、および先行の細菌療法よりも、優れている有利な特性を有する。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、任意の適した経路で投与することができるが、静脈内投与など、全身投与に適している。本明細書に示し、記載するように、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、主要な免疫経路を標的とすることができる。
提供されるのは、抗がん治療薬ならびに抗がんワクチンおよび病原体ワクチンとして、またＲＮＡデリバリー媒体として使用また適応することができる免疫刺激細菌である。特定の用途は、特定のゲノム改変およびペイロードに基づいて選択することができる。提供されるのは、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、完全または部分的な細胞質ドメイン欠失を有する、切り詰められた共刺激分子（受容体またはリガンド：例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）が含まれ、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの切り詰めまたは欠失により、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない、１つまたは複数の治療用産物をコードする遺伝的ペイロードを送達する免疫刺激細菌である。免疫刺激細菌は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を構成的に誘導するものおよび抗ウイルスタイプの免疫応答を刺激するもの、例えば、ＩＬ－１５、特にＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５複合体）として提供されるＩＬ－１５、およびＩ型ＩＦＮを構成的に誘導し、また望ましくない炎症応答を排除または低減するために低減されたＮＦ－κＢシグナル伝達を有するように改変され得る操作されたＳＴＩＮＧタンパク質を含む、複数の産物をコードすることができる。
免疫刺激細菌は、以下のものの１つまたは複数をコードおよび発現することができる：ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、またはＩ型ＩＦＮ経路タンパク質、例えば、機能獲得型の構成的に活性であるＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、もしくはＲＩＧ－Ｉ変異体（Ｉ型ＩＦＮを誘導する）など、ＴＧＦベータの阻害剤、例えば、ＴＧＦ－β阻害抗体、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、およびＴＧＦベータ結合性デコイ受容体など、抗体およびその断片、例えば、免疫チェックポイントを標的とするものなど、ならびに他の抗がん標的、例えば、ＶＥＧＦおよびＩＬ－６など、共刺激受容体／分子、例えば、細胞質ドメインが欠失しているか、切り詰められているか、もしくは別途に無くなっている４－１ＢＢＬを含めた４－１ＢＢＬなど、およびその他。免疫刺激細菌は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、完全なまたは部分的な細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）もコードおよび発現していてもよく、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失または切り詰めによりＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない。他のコードされている治療用産物には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーと称されるもの（ＢｉＴＥｓ（登録商標）という商標で販売）、例えば、本明細書で例示されるＤＬＬ３ Ｘ ＣＤ３エンゲージャーが含まれる。
そのような治療用産物および薬剤の組合せは、単一の治療用組成物中に発現させることができる。細菌ゲノムの改変のおかげで、免疫刺激細菌は、腫瘍特異性局在および濃縮を示し、そうでなければ、全身的に活性化された場合に毒性となる抗腫瘍免疫経路の活性化用の静脈内（ＩＶ）投与を提供する。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、安全であり、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍常在性免疫細胞、また直接投与によるなど、ワクチンとして投与されるとき食細胞も標的とするように、遺伝的に設計されている。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ゲノム改変および他の改変の組合せ、ならびにコードされている治療用産物を含み、それらは、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積し、毒性副作用なしか、または限られた毒性副作用で腫瘍および腫瘍微小環境で抗がん免疫刺激を誘導または促進する治療用産物、特に組合せをデリバリーするのに十分に長く持続する免疫刺激細菌を提供するように協調して機能する。全身性、例えば静脈内（ＩＶ）でデリバリーされるとき、免疫刺激細菌は、転移性病変に含めた腫瘍内で濃縮され、それらは、特に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、および樹状細胞（ＤＣ）を含めた腫瘍常在性骨髄性細胞への免疫ペイロードの効率的な遺伝子導入を提供し、それらは、強力な局所免疫応答を誘導して、腫瘍を破壊し、将来の再発に対してワクチン接種をし、治療が終わったとき、それらは、感染細胞による食作用および破壊などによって、自然に無くなるか、またはそれらは、１クールの抗生物質によって迅速に破壊することができる。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、設計されたプリン／アデノシン栄養要求性により、腫瘍微小環境でおよび／または腫瘍常在性免疫細胞で選択的蓄積を示し、貪食細胞の内部における複製不能を示す。血清補体によって不活性化を回避する免疫刺激細菌は、正常な組織への毒性を最小限にしながら、腫瘍微小環境内に直接的に高濃度の様々な免疫治療剤および治療用産物のデリバリーを可能にし、本明細書に提供されている。
例えば、セクションＣ．９．でさらに詳細に記載するように、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、本明細書に詳細に論じられるように、以下のゲノム改変：ＬＰＳ中のリピドＡを変え、ペンタアシル化（野生型リピドＡは、６～７本の脂肪酸鎖を有する）をもたらし、ＴＬＲ４親和性を低減する細菌をｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－にする改変；ｐｕｒＩ－などのアデノシン（ａｄｅｎｏｎｓｉｎｅ）／アデニン栄養要求体である改変；Ｔ細胞の質を改善するアスパラギナーゼＩＩ－（ａｎｓＢ－）である改変；鞭毛を失っている（フラゲリン欠損）改変；他の特性の中でもｃｕｒｌｉ線毛を除去するｃｓｇＤ－などのｃｕｒｌｉ線毛を産生する遺伝子／産物が欠損している改変、の１つまたは複数を含み、コードされている産物（複数可）が活性型で産生されないようにする、挿入、欠失、破壊、および任意の他の改変など、他のオプションのゲノム改変を含む。免疫刺激細菌は、真核生物プロモーターの制御下に１または複数の治療用産物、特に抗がん産物をコードするプラスミドを含む。これらの同じ改変および特性は、特に、吸入、および筋内（ＩＭ）注射、ならびにペイロードの食細胞へのデリバリーのための他の直接経路によるものなどの直接投与によって送達されるとき、それらを、がん治療薬およびがんワクチン、ならびに病原体ワクチンとして使用するために、ワクチンとしておよびＲＮＡのためのデリバリー媒体として有用なものにする。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ゲノム改変、例えば、機能的遺伝子産物（複数可）が発現されないような、欠失、破壊、および他の改変、例えば遺伝子のすべてまたは一部の向きの変化などのコードされている産物（複数可）の不活性化をもたらすゲノム改変を含む。免疫刺激細菌のうち、提供されるのは、結果として生じる細菌がｍｓｂＢ－／ｐｕｒＩ－であるように改変されているものである。一部の実施形態において、細菌は、ｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－であり、それによって、ｍｓｂＢ遺伝子および／またはｐｕｒＩ遺伝子の少なくともコード部分の全長が欠失される。また、細菌のゲノムは、細菌が鞭毛を欠くように改変され得る。これは、鞭毛を通常発現する細菌において引き起こされる。そのような細菌において、例えば、サルモネラ属におけるｆｌｉＣ／ｆｌｊＢ遺伝子、または他の種におけるｆｌｉＣ／ｆｌｊＢと同等の遺伝子は、欠失され得るか、その他には機能的遺伝子産物が発現されないように改変され得る。また、細菌は、アデノシン栄養要求株であるように、かつ／またはｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であるように改変され得る。また、提供されるのは、免疫刺激細菌、およびこれを含有する医薬組成物であり、細菌は、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず、それによって細菌はａｎｓＢ－である。コードされているアスパラギナーゼ活性の排除は、Ｔ細胞生存率／活性を改善または保持する。ワクチンとして使用される不活性化または弱毒化細菌などの治療用細菌は、アスパラギナーゼ活性を除去するためにゲノムを改変することによって改善することができる。例示的なそのようなワクチンには、結核に対して免疫化のために使用されるカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ワクチンおよび関連するワクチンがある。ＢＣＧワクチンは、可変的有効性を有することが知られており、アスパラギナーゼを除去することは、内在性細菌アスパラギナーゼがＴ細胞活性を阻害または低減するために、そのようなワクチンの有効性を改善することができる。
治療用産物（例えば構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体ならびに他の免疫調節性タンパク質および産物）を腫瘍常在性骨髄性細胞にデリバリーする本明細書に提供されている免疫刺激細菌は、適応免疫を促進し、Ｔ細胞機能を増強する。免疫刺激細菌は、自然免疫の促進および適応免疫の抑制によって特徴付けられる、細菌表現型から離れて、適応抗腫瘍表現型の方へ、免疫抑制腫瘍微小環境の完全なリモデリングをもたらす。本明細書で記載されるように、これらの特性およびペイロードは、細菌のワクチンおよびＲＮＡデリバリープラットフォームとしての用途にも利用することができる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、無改変細菌と比較して、またはＶＮＰ２０００９株と比較して、有意に大きな、少なくとも約１００，０００倍大きな腫瘍浸潤および濃縮を示すことができる。例えば、本明細書に提供される細菌は、ゲノム改変を含有し、それによって、それらは腫瘍内でマクロファージに感染し（およびワクチンとして投与されるとき、他の食細胞に感染し）、それらのペイロード、例えば、操作されたＳＴＩＮＧの組合せ（様々な操作されたＳＴＩＮＧタンパク質に関する論議全体を参照されたい）、例えば、Ｉ型ＩＦＮの誘導を構成的にするための、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇなどの機能獲得型突然変異を有するヒトＳＴＩＮＧ、およびヒトＳＴＩＮＧと比較してより低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する、タスマニアンデビル由来のＣＴＴなどの非ヒトＳＴＩＮＧ由来のＣＴＴ、ならびに様々な形態のＩＬ－１５、特にＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５複合体）を送達する。本明細書では、この組合せが相乗的効果を有し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を含む高度なＴ細胞、腫瘍の浸潤をもたらすことが示されている。この組合せは、多数の治療介入点で作用することによる包括的な免疫療法である。免疫刺激細菌は、腫瘍活性化マクロファージ（ＴＡＭ）によって消費され、プラスミドを宿主細胞中にデリバリーして、宿主細胞は、ＩＬ－１５および操作されたＳＴＩＮＧなどのコードされている産物を発現する。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍常在性免疫細胞によって消費され、免疫細胞および腫瘍微小環境内で発現され、産生される治療用産物をコードするプラスミドを含むそれらの内容物を送達して、抗腫瘍免疫を生じさせる。ａｓｄ－であり、宿主細胞の制御下での発現のためにプラスミド上でコードされている補完遺伝子を含まない細菌は、宿主細胞内で複製しない。欠失、挿入、転位、または不活性なまたは欠損している遺伝子産物をもたらす改変などのゲノム改変によって、増殖にチミンの補給を必要とし、ペイロードを食細胞に同様に送達するが、そのような細胞内では複製することができない、ｔｈｙＡ－である細菌が提供される。
１．細菌がん免疫治療
多くの固形腫瘍型は、それらを、承認されたチェックポイント療法、例えば抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、および抗ＰＤ－Ｌ１療法などに対して高度に難治性にする非常に免疫抑制的な微小環境を進化させてきた。腫瘍がそれによってチェックポイント療法に対する抵抗性を進化させてきた１つのメカニズムは、Ｔ細胞排除、非炎症性、または「冷たい腫瘍」と記載される、腫瘍内Ｔ細胞および腫瘍抗原交差提示樹状細胞（ＤＣ）のそれらの欠如を介したものである（Sharma et al. (2017) Cell 168(4):707-723）。その腫瘍がＴ細胞炎症性であり、チェックポイント免疫治療に反応する少数の患者については、患者が、しばしば重度の自己免疫性毒性を経験し、多くは、最終的に再発して、チェックポイント難治性になる（例えば、Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3377-3383；Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363(8):711-723；およびChen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391を参照）。腫瘍は、免疫監視を避けるための複数のメカニズムを開始し、免疫を抑制するように抗腫瘍免疫細胞を再プログラムし、抗腫瘍Ｔ細胞を排除および不活性化し、標的に向けられたがん治療に対して出現した抵抗性を発達させる（例えば、Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8):561-584を参照）。この問題を解決するには、これらの腫瘍に適切に炎症を起こし、長期にわたる腫瘍縮小をもたらすことができる抗腫瘍免疫を生じさせることができる免疫治療が必要である。加えて、腫瘍内療法は困難であり、転移性疾患セッティングにおいてかなり制限的となろう。個々の転移性病変それぞれに適切に炎症を起こし、免疫抑制の複数の経路を克服する全身投与される療法が必要である。腫瘍常在性免疫細胞を特異的に標的とし、かつ複数の相補的な遺伝的ペイロード／治療用産物を発現するそれらの能力のおかげで、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、これらの問題に対処するように設計されている。
２．腫瘍微小環境を標的とする先行治療
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的とし、かつ抗腫瘍免疫の促進を試みるいくつかの療法が開発されている。それぞれ、それ自体の困難および欠点を有し、それらは、本明細書で提供する免疫刺激細菌によって対処される。
ａ．自家Ｔ細胞療法の限界
高度に免疫抑制的な腫瘍微小環境にアクセスすること、および腫瘍に炎症を起こし、抗腫瘍免疫を促進する適切な免疫応答を誘導することを目的として、いくつかの全身投与される治療プラットフォームが臨床的に調査されている。これらのプラットフォームには、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が含まれ、これは、患者からＴ細胞を採取し、それらを再設計して、Ｔ細胞受容体を特定の腫瘍抗原に特異的な抗体Ｉｇ可変細胞外ドメインに融合させることによって産生される。これは、活性化されたＴ細胞の細胞溶解性特性とともに、抗体の抗原認識特性を細胞に与える（例えば、Sadelain et al. (2015) J. Clin. Invest. 125(9):3392-3400を参照）。ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔチサゲンレクルユーセル（商標Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標）の下にあるものなど）およびアキシカブタゲンシロロイセル（商標Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標）の下にあるものなど）のＦＤＡ承認など、この技術の見込みおよび可能性にもかかわらず、成功は、ＣＤ１９＋造血器腫瘍に限定されており、しかもそれは、致命的な免疫関係有害事象を伴った（例えば、Jackson et al. (2016) Nat. Rev. Clin. Oncol. 13(6):370-383を参照）。腫瘍は、ＣＤ１９抗原を含めた、固形腫瘍の標的腫瘍抗原を下方制御するように、急速に突然変異する可能性があり、それにより免疫エスケープを発達させる（例えば、Mardiana et al. (2019) Sci. Transl. Med. 11(495):eaaw2293を参照）。あり余る程の腫瘍特異性標的抗原があるわけではない。健常な組織で発現されない固形腫瘍標的は、ＣＡＲ－Ｔ療法の主要な障害である。それに加えて、ＣＡＲ－Ｔ療法は、腫瘍内への適切なＴ細胞浸潤に必要である十分なＴ細胞ケモカイン勾配の欠如による他の障害により、固形腫瘍微小環境にアクセスするのが妨げられている。加えて、一旦それらが腫瘍に浸潤したならば、それらは急速に不活性化される（例えば、Brown et al. (2019) Nat. Rev. Immunol. 19(2):73-74を参照）。ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性が大幅に向上し、有効性が固形腫瘍にまで拡大したとしても、これらの労働集約的な療法と関連する実現可能性および経費が、それらのより広範な採用をなお限定している。
ｂ．ウイルスワクチンプラットフォーム
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、腫瘍細胞溶解を誘導し、Ｔ細胞を腫瘍に動員し、免疫調節性タンパク質を産生するように腫瘍細胞が読むことができる遺伝材料をデリバリーする天然の特性および操作された特性を有する。例えば、タリモジーンラハーパレプベック（Ｔ－ＶＥＣ）と称される腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に投与される、抗黒色腫抗原およびサイトカインＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）をコードする改変された単純ヘルペスウイルスである。Ｔ－ＶＥＣは、転移性黒色腫用にＦＤＡ承認されている（例えば、Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21を参照）。Ｔ－ＶＥＣは、一部の黒色腫患者について臨床的ベネフィットを示しており、免疫チェックポイント抗体またはＩＬ－２およびインターフェロン－アルファなどのＦＤＡ承認されている全身サイトカインより免疫毒性が少ない（例えば、Kim et al. (2006) Cytokine Growth Factor Rev. 17(5):349-366；およびPaul et al. (2015) Gene 567(2):132-137を参照）。
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）には、抗がん治療としていくつかの限界がある。まず、腫瘍溶解性ウイルスは、血液中のヒト補体系によって急速に不活性化される。所望の治療効果を有するのに十分なウイルスを全身投与を介してデリバリーすることは、難しいと判明している。腫瘍内デリバリーは、転移性セッティング（病変が全身に広がっている状況）では制限的であり、ほとんどの固形腫瘍型（例えば、肺および内臓病変）について難治性であり、反復投与を制限する注射用の介入的誘導画像診断を必要とする。ウイルスは、商業規模の製造および保存には困難であり得る。ほとんどのＯＶベースのワクチン、中でも、パラミクソウイルス、レオウイルス、およびピコルナウイルスをベースにしたものなどは、同様の限界を有する（例えば、Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300を参照）。腫瘍溶解性ウイルスは、本質的に免疫原性であり、ヒト血液から急速に除去され、腫瘍内に入るＴ細胞は、より弱い腫瘍新抗原よりウイルス抗原との親和性がはるかに高い（例えば、Aleksic et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42(12):3174-3179を参照）。したがって、プラットフォームに関する認識されている技術上の制限に加えて、これまでのＯＶは、耐久的な抗腫瘍免疫を刺激する能力が制限されている（例えば、Kedl et al.(2003) Curr Opinion Immunol. 15:120-127;およびAleksic et al., (2012) Eur. J. Immunol. 42:3174-3179を参照されたく、これらは、ウイルス抗原に結合するＴＣＲが、がん関連抗原に結合するものよりも高いＨＬＡ－Ａ２親和性を有することを示している）。
ｃ．細菌がん治療
前臨床動物研究において、いくつかの細菌種は、遠位部位から注射したとき、固形腫瘍の中で優先的な複製を示している。これらは、限定されるものではないが、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属、およびエシェリキア属の種を含む。細菌の腫瘍ホーミング特性は、細菌感染に対する宿主の自然免疫応答と合わせて、抗腫瘍応答を媒介することができる。この腫瘍組織指向性は、様々な程度で腫瘍サイズを低減する。これらの細菌種の腫瘍指向性に寄与する一因子は、無酸素および低酸素環境中で複製する能力である。いくつかのこれらの天然に腫瘍指向性の細菌は、抗腫瘍応答の潜在力が増大するようにさらに操作されている（Zu et al. (2014) Crit. Rev. Microbiol. 40(3):225-235；およびFelgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078で概説されている）。動物実験における概念実証にもかかわらず、動物モデルには存在しないヒト血清中の補体因子が細菌を不活性化することができ、このことが、がんを処置する療法としてのそれらの使用を制限している。
経口投与または全身投与するために、細菌株は、それらが全身疾患および／または感染性ショックを引き起こさないが、効果的な腫瘍コロニー形成のために依然としていくらかのレベルの感染性および補体による不活性化に対する抵抗性を維持するように、弱毒化されている。クロストリジウム属（例えば、Dang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(26):15155-15160；米国特許出願公開第２０１７／００２０９３１号および第２０１５／０１４７３１５号；ならびに米国特許第７，３４４，７１０号および第３，９３６，３５４号を参照）、マイコバクテリウム属（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２２４１５１号および第２０１５／００７１８７３号を参照）、ビフィドバクテリウム属（例えば、Dang et al. (2001)；およびKimura et al. (1980) Cancer Res. 40:2061-2068を参照）、ラクトバチルス属（例えば、Dang et al. (2001)を参照）、リステリア・モノサイトゲネス（例えば、Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868；Starks et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427；および米国特許出願公開第２００６／００５１３８０号を参照）、および大腸菌（例えば、米国特許第９，３２０，７８７号を参照）を含めたいくつかの異なる細菌種が、抗がん治療用の可能性のある薬剤として研究されている。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍を処置するために開発された先行の細菌についての問題に対処するゲノム改変を含む。改変は、一般的に、遺伝子または遺伝子産物を不活性にするゲノム内の変化を含む。これは、遺伝子またはその一部を欠失することによって、または遺伝子を破壊することによって、または不活性な産物をもたらすあらゆる他のそのような変化によって行うことができる。ゲノム改変は、腫瘍微小環境内に細菌を向かわせるか、またはその中での蓄積を改善し、特に、細菌を、腫瘍常在性免疫細胞に優先的に、もしくは腫瘍常在性免疫細胞にのみ感染させ、健常な組織には感染させず、それによって、毒性を低減し、コードされている産物のデリバリーを改善するように設計されている。免疫刺激細菌は、その組合せを含めた治療用産物をデリバリーするようにも設計されており、腫瘍の免疫抑制性効果を無くし、宿主の抗腫瘍応答を増強し、抗腫瘍産物を提供するように設計されている。
ｉ．リステリア属
リステリア・モノサイトゲネスは、がんのマウスモデルにおいて、発現されている腫瘍抗原に対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングを誘導することができる生きている弱毒化細胞内細菌であり、細菌がんベクターとしても探索されている（例えば、Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868を参照）。プライムブーストアプローチで同種異系膵がんベースのＧＶＡＸワクチンとともに腫瘍抗原メソテリンを組み込んだリステリア菌ベースのワクチンの臨床試験において、ＧＶＡＸワクチン単独で処置された患者の生存期間中央値が３．９カ月であったのに対して、進行膵がんを有する患者では６．１カ月の生存期間中央値が認められた（例えば、Le et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33(12):1325-1333を参照）。しかし、これらの結果は、より大きな第２ｂ相研究では反復されなかった。このことは、ヒトにおいて末梢免疫監視を低親和性の腫瘍ネオアンチゲンへと破壊することの難しさを指摘している。Ｌ．モノサイトゲネスも、食作用の後に細菌が溶解されるための要件による、コードされている腫瘍抗原に対する免疫応答の制限を示した。食作用後の溶菌は、効率的なプラスミド移動の必要条件であるが、Ｌ．モノサイトゲネスでは、ヒトマクロファージ内で起こることが実証されていない。
ｉｉ．サルモネラ属種
サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（ネズミチフス菌）は、抗がん治療薬として用いるための細菌種で例である。ネズミチフス菌は、組織壊死、漏出性の腫瘍脈管構造からの栄養の入手可能性、および免疫抑制腫瘍微小環境内でそれらが生存する見込みの増大により、低酸素区域および壊死区域で優先的に増えるグラム陰性通性嫌気性菌である（例えば、Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-394を参照）。通性嫌気性菌として、ネズミチフス菌は、好気性および嫌気性条件下で増殖することができ、したがって、比較的に低酸素でない小さな腫瘍と比較的に低酸素である大きな腫瘍の両方でコロニー形成することができる。
糞口経路によるネズミチフス菌感染は、限局性胃腸感染を引き起こす。この細菌は、血流およびリンパ系に入ることもでき、その結果、全身組織、例えば、肝臓、脾臓、および肺などを感染させる。野生型ネズミチフス菌の全身投与は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を過剰に刺激し、サイトカインカスケードおよび感染性ショックをもたらす。これらは、無処置のままにした場合、致命的となる可能性がある。その結果、ネズミチフス菌などの病原性細菌株は、腫瘍組織に効果的にコロニー形成するそれらの能力を完全に抑制せずに、全身感染症を防ぐために弱毒化しなければならない。弱毒化は、しばしば、病原体パターン認識を介して免疫応答を誘発することができる細胞構造、例えば細菌の外膜などを突然変異させることによって、または栄養の補足の不在下で複製する細菌の能力を限定することによって達成される。
ネズミチフス菌は、マクロファージなどの骨髄系貪食細胞によって急速に取り入れられる細胞内病原体であるか、またはそのサルモネラ病原島１（ＳＰＩ－１）にコードされたＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ１）を介して上皮細胞などの非貪食細胞に直接的に侵入することができる。ひとたび細胞内に入れば、それは、ＳＰＩ－２調節を介して、サルモネラ含有液胞（ＳＣＶ）内で複製することができ、一部の上皮細胞の細胞質ゾル内に逃避することもできる（例えば、Agbor et al. (2011) Cell Microbiol. 13(12):1858-1869；およびGalan and Wolf-Watz (2006) Nature 444:567-573を参照）。ネズミチフス菌の遺伝子改変細菌株は、直接的な殺腫瘍効果を誘発し、かつ／または殺腫瘍分子をデリバリーする抗腫瘍剤として記載されている（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760；およびZhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652を参照）。
細菌性病原体を弱毒化するための様々な方法が当技術分野で知られている。栄養要求性突然変異は、例えば、細菌が必須栄養を合成できなくなるようにし、ａｒｏ、ｐｕｒ、ｇｕａ、ｔｈｙ、ｎａｄ、およびａｓｄなどの遺伝子の欠失／突然変異（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号を参照）が用いられる。これらの遺伝子を含む生合成経路によって産生される栄養は、宿主細胞内では利用できないことが多く、したがって、細菌の生存は困難である。例えば、サルモネラ属種および他の種の弱毒化は、糖分解を芳香族アミノ酸生合とつなげるシキミ酸経路の一部であるａｒｏＡ遺伝子の欠失または破壊によって達成することができる（例えば、Felgner et al. (2016) mBio 7(5):e01220-16を参照）。ａｒｏＡの欠失または破壊は、芳香族アミノ酸についての細菌の栄養要求性およびそれに続く弱毒化をもたらす（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、第２００３／０１７５２９７号、第２０１２／０００９１５３号、および第２０１６／０３６９２８２号；ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号および第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。同様に、ａｒｏＣおよびａｒｏＤを含めた、芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する他の酵素が、弱毒化を達成するために欠失させられている（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６９２８２号；および国際出願公開第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。例えば、ネズミチフス菌のＳＬ７２０７株は、芳香族アミノ酸栄養要求体（ａｒｏＡ－突然変異体）であり、Ａ１およびＡ１－Ｒ株は、ロイシンアルギニン栄養要求体である。
細菌を弱毒化する突然変異は、限定されるものではないが、ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡ、およびｌｐｘＴなど、リポ多糖（ＬＰＳ）の生合成を変える遺伝子の突然変異；ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌ、またはｐｈｌＡなど、自殺遺伝子を導入する突然変異；ｈｌｙおよびｃｌｙなど、細菌溶解遺伝子を導入する突然変異；ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃ、およびａｃｔなど、病原性因子をコードする遺伝子の突然変異；ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐ、およびｇｒｏＥＬなど、ストレス応答を改変する遺伝子の突然変異；ｍｉｎなど、細胞周期を破壊する遺伝子の突然変異；ならびにｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ、およびｏｍｐＲなど、調節機能を破壊または不活性化する遺伝子の突然変異も含む（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、第２００３／０１７０２７６号、および第２００７／０２９８０１２号；米国特許第６，１９０，６５７号；国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号；Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177；Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178；Frahm et al. (2015) mBio 6(2):e00254-15；Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038；ならびにKong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419を参照）。一般に、弱毒化突然変異は、病原性表現型への復帰をもたらすかもしれない自発的な代償的突然変異を防ぐ遺伝子欠失である。
安全性のためにネズミチフス菌を弱毒化する別の方法は、膜結合性センサーキナーゼ（ＰｈｏＱ）および細胞質転写調節因子（ＰｈｏＰ）で構成される典型的な細菌２成分調節系であるＰｈｏＰ／ＰｈｏＱオペロンシステムを用いることである（例えば、Miller, S. I. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5054-5058；およびGroisman, E. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7077-7081を参照）。ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱは、病原性に必要であり、その欠失は、マクロファージ内におけるこの細菌の生存を危うくし、マウスおよびヒトにおける著しい弱毒化をもたらす（例えば、Miller, S. I. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5054-5058；Groisman, E. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7077-7081；Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6:433-443；およびFields, P. I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5189-5193を参照）。ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ欠失株は、ワクチンデリバリー媒体として使用されている（例えば、Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6:433-443；Fields, P. I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5189-5193）；およびAngelakopoulos, H. and Hohmann, E. L. (2000) Infect. Immun. 68:2135-2141を参照）。しかし、本明細書に記載のように、ある菌株にとって、マクロファージ内での生存が制限されることは、その細菌がプラスミドを移そうとしていていないのであれば不利である。
これらの弱毒化細菌株は、静脈内投与（ＩＶ）されたとき、マウス、ブタ、およびサルで安全であることがわかっており（例えば、Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760；Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652；Tjuvajev J. et al. (2001) J. Control. Release 74:313-315；およびZheng, L. et al. (2000) Oncol. Res. 12:127-135を参照）、いくつかの生きている弱毒化サルモネラ属株は、ヒト臨床試験において、経口投与後に十分に忍容されることが示されている（例えば、Chatfield, S. N. et al. (1992) Biotechnology 10:888-892；DiPetrillo, M. D. et al. (1999) Vaccine 18:449-459；Hohmann, E. L. et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:1408-1414；およびSirard, J. C. et al. (1999) Immunol. Rev. 171:5-26を参照）。
治療用に弱毒化されているネズミチフス菌の他の株は、例えば、ロイシンアルギニン栄養要求株Ａ－１（例えば、Zhao et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(3):755-760；Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；米国特許第８，８２２，１９４号；および米国特許出願公開第２０１４／０１７８３４１号を参照）およびその派生株ＡＲ－１（例えば、Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；Kawaguchi et al. (2017) Oncotarget 8(12):19065-19073；Zhao et al. (2006) Cancer Res. 66(15):7647-7652；Zhao et al. (2012) Cell Cycle 11(1):187-193；Tome et al. (2013) Anticancer Research 33:97-102；Murakami et al. (2017) Oncotarget 8(5):8035-8042；Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882；およびBinder et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1(2):123-133を参照）；ａｒｏＡ－突然変異体ネズミチフス菌ＳＬ７２０７株（例えば、Guo et al. (2011) Gene Therapy 18:95-105；ならびに米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、第２０１６／０３６９２８２号、および第２０１６／０１８４４５６号を参照）、およびその偏性嫌気性派生株ＹＢ１（例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号；Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；およびLeschner et al. (2009) PLoS ONE 4(8):e6692を参照）；ａｒｏＡ－／ａｒｏＤ－突然変異体ネズミチフス菌ＢＲＤ５０９株、ＳＬ１３４４（野生型）株の派生株（例えば、Yoon et al. (2017) Eur. J. Cancer 70:48-61を参照）；ａｓｄ－／ｃｙａ－／ｃｒｐ－突然変異体ネズミチフス菌χ４５５０株（例えば、Sorenson et al. (2010) Biologics: Targets & Therapy 4:61-73を参照）ならびにｐｈｏＰ－／ｐｈｏＱ－ネズミチフス菌ＬＨ４３０株（例えば、国際出願公開第ＷＯ２００８／０９１３７５号参照）である。
しかし、弱毒化は、腫瘍常在性免疫細胞、腫瘍微小環境、および腫瘍細胞内で細菌が増える能力に影響を与える。この問題は、本明細書に解決される。本明細書に例示されるサルモネラ属株などの、免疫刺激細菌は、上記のもののうちのいくつかを含むことができるが、がん治療薬としての有用性を増強する本明細書に記載の他の改変および特性も有することができる改変のおかげで弱毒化されている。
ネズミチフス菌の弱毒化株は、食作用および分解の後にＤＮＡをデリバリーする生得的な能力を有する（例えば、Weiss, S. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293(1):95-106を参照）。それらは、遺伝子治療用のベクターとして用いられている。例えば、ネズミチフス菌株は、サイトカイン、血管新生抑制剤、毒素、およびプロドラッグ変換酵素をコードするものを含めた様々な遺伝子をデリバリーおよび発現するのに用いられている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２９８０１２号；Loeffler et al. (2008) Cancer Gene Ther. 15(12):787-794；Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883；Loeffler et al. (2008) J. Natl. Cancer Inst. 100:1113-1116；Clairmont, C. et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760；Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652；およびTjuvajev J. et al. (2001) J. Control. Release 74:313-315を参照）。
ネズミチフス菌は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サバイビン（ＳＶＮ）をデリバリーして、適応免疫をプライミングするように改変されている（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１８６４０１号；およびXu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270を参照）。ＳＶＮは、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）であり、細胞生存を延長し、細胞周期の制御を提供し、すべての固形腫瘍で過剰発現しており、正常な組織では発現が乏しい。この技術は、ＳＰＩ－２およびそのＩＩＩ型分泌装置を用いて、ＡＰＣの細胞質ゾルにＴＡＡをデリバリーし、次いで、ＡＰＣが活性化されて、ＴＡＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞および抗腫瘍免疫を誘導する（例えば、Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270を参照）。リステリアベースのＴＡＡワクチンと同様に、このアプローチは、マウスモデルで見込みがあることが示されているが、ヒトでは効果的な腫瘍抗原特異的なＴ細胞プライミングを示していない。
タンパク質をコードするＤＮＡのデリバリーに加えて、ネズミチフス菌は、がん治療用の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）をデリバリーするために用いられている。例えば、ネズミチフス菌は、例えば、免疫抑制遺伝子インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を標的とするものなど、特定のｓｈＲＮＡを発現するように改変されている。マウス黒色腫モデルにおけるＩＤＯ発現のサイレンシングは、腫瘍細胞死および好中球によるかなりの腫瘍浸潤をもたらした（例えば、Blache et al. (2012) Cancer Res. 72(24):6447-6456；国際出願公開第ＷＯ２００８／０９１３７５号；および米国特許第９，４５３，２２７号を参照）。このベクターとヒアルロニダーゼとの同時投与は、マウス膵管腺癌の処置において正の結果を示した（例えば、Manuel et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3(9):1096-1107；および米国特許出願公開第２０１６／０１８４４５６号を参照）別の研究では、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失によって弱毒化され、シグナル伝達および転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）特異的ｓｈＲＮＡを発現するネズミチフス菌株が腫瘍成長を阻害し、転移臓器の数を低減させ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの寿命を延長した（例えば、Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67(12):5859-5864を参照）。別の例では、ネズミチフス菌ＳＬ７２０７株が、β－カテニンをコードする遺伝子であるＣＴＮＮＢ１を標的とするｓｈＲＮＡのデリバリーのために用いられている（例えば、Guo et al. (2011) Gene Therapy 18:95-105；ならびに米国特許出願公開第２００９／０１２３４２６号および第２０１６／０３６９２８２号を参照）。ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９株は、ＳＴＡＴ３を標的とするｓｈＲＮＡのデリバリーのために用いられている（例えば、Manuel et al. (2011) Cancer Res. 71(12):4183-4191；米国特許出願公開第２００９／０２０８５３４号、第２０１４／０１８６４０１号、および第２０１６／０１８４４５６；ならびに国際出願公開第ＷＯ２００８／０９１３７５号、および第ＷＯ２０１２／１４９３６４号を参照）。ネズミチフス菌Ａ１－Ｒ株およびＶＮＰ２０００９株を用いて、オートファジー遺伝子Ａｔｇ５およびＢｅｃｌｉｎ１を標的とするｓｉＲＮＡｓが腫瘍細胞にデリバリーされている（例えば、Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882を参照）。
しかし、これらの株は、抗腫瘍免疫応答を効果的に刺激することもなく、また、治療用量のコードされている産物をデリバリーするために効果的に腫瘍にコロニー形成することもないことが見出されている。より効果的に抗腫瘍免疫応答を刺激するように、本明細書で提供する免疫刺激細菌など、そのような株を改善する必要がある。様々な細菌のさらなる改変および代替的な改変が、公開されている国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１９／０１４３９８号および米国公開第２０１９／００１７０５０Ａ１号に記載されている。これらの出版物の各々に記載され、本明細書にも記載されている細菌は、本明細書に記載のように、それらの免疫刺激特性および腫瘍標的特性をさらに改善するように改変することができる。
ｉｉｉ．ＶＮＰ２０００９（ＹＳ１６４６）
本明細書に記載の改変のための開始株として用いることができる治療用細菌の例は、ＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ＃２０２１６５、ＹＳ１６４６）と名付けられた株である。このウイルスは、臨床候補であった。ＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ＃２０２１６５、ＹＳ１６４６）は、安全性のため、ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ遺伝子の欠失によって、少なくとも５０，０００倍弱毒化されていた（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, pp. 47-59；およびLee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25を参照）。ｍｓｂＢ遺伝子の発現を妨げる欠失または破壊は、グラム陰性細菌外膜の主要成分であるリポ多糖のリピドＡドメインの組成を変える（例えば、Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41を参照）。これは、リポ多糖で誘発される敗血症性ショックを防止し、ＴＮＦαの潜在的に有害な産生を低減しながら、細菌株を弱毒化し、全身毒性を低減する（例えば、Dinarello, C.A. (1997) Chest 112(6 Suppl):321S-329S；およびLow et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41を参照）。ｐｕｒＩ遺伝子の発現を妨げる欠失または破壊は、細菌をプリンについて栄養要求性にし、これが、細菌をさらに弱毒化し、それらを腫瘍微小環境内に濃縮する（例えば、Pawelek et al. (1997) Cancer Res. 57:4537-4544；およびBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。本明細書に示すように、ＶＮＰ２０００９は、免疫抑制ヌクレオシドアデノシンについて栄養要求性でもある。アデノシンは、腫瘍内に病理学的に高いレベルで蓄積し、免疫抑制腫瘍微小環境に貢献する可能性がある（例えば、Peter Vaupel and Arnulf Mayer, Oxygen Transport to Tissue XXXVII, Advances in Experimental Medicine and Biology 876 chapter 22, pp. 177-183を参照）。
ＶＮＰ２０００９を同系またはヒト異種移植腫瘍を有するマウスに投与すると、細菌が、腫瘍の細胞外成分内で、３００～１０００：１を超える比率で優先的に増え、腫瘍増殖阻害および対照マウスとの比較における生存の延長を示した（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。ＶＮＰ２０００９は、動物モデルで良好な腫瘍ターゲティングおよび腫瘍成長抑制を示し、一方で、ごくわずかな毒性しか誘発しなかった（例えば、Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178；Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883；Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508；およびClairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。
ヒト転移性黒色腫の第１相臨床試験からの結果は、ＶＮＰ２０００９が比較的安全であり、十分に忍容されたが、非常に限られた抗腫瘍活性が観察されたことを明らかにした（例えば、e.g., Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照）。ＶＮＰ２０００９の使用は、転移性疾患の負荷に有意な変化をもたらさなかったが、それは、最大耐量（ＭＴＤ）で腫瘍コロニー形成のエビデンスを示した。何らかの抗腫瘍活性を引き起こすのに必要であろう、これより高い用量は、高レベルの炎症促進性サイトカインと相関した毒性のため、不可能であった。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ＶＮＰ２０００９株には無い多数の改善および利点を提供する。例示的な株については、ＶＮＰ２０００９株（ＹＳ１６４６）が、鞭毛を除外するものを含む、追加のゲノム改変の導入によってさらに改変される親株として使用される。この株は、ｐｕｒＩおよび／またはｍｓｂＢを完全に欠失することによっても改善される。他のゲノム改変には、ｃｕｒｌｉ線毛の排除または不活性化、および株をｔｈｙＡ－にすること（それにより、細菌は、インビボで複製せず）、および／またはアスパラギナーゼ活性を排除するためにａｎｓＢ－にすること（これは、Ｔ細胞を不活性化し、またはＴ細胞活性を低減する）が含まれる。これらのゲノム改変は、個々にそして一緒になって細菌の食細胞内の蓄積または食細胞に感染する能力を改善し、また宿主の抗ウイルスタイプの免疫応答を増大させる。免疫刺激細菌は、免疫系を刺激し、および／または免疫抑制を低減させる様々なペイロードを含むように改変され、治療用産物および免疫抗原ならびに産物を提供する。
免疫刺激細菌は、コードされている遺伝的ペイロードを腫瘍常在性骨髄性細胞に腫瘍特異的にデリバリーする。免疫刺激細菌は、遺伝子の欠失または破壊およびゲノムの他の改変などのゲノム改変のおかげで、例えば、鞭毛を無くすこと、ＬＰＳの改変、およびｃｕｒｌｉ線毛を無くすことのおかげで、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５媒介炎症の低減およびバイオフィルム形成の低減を示す。本明細書に示され記載されるように、ＴＬＲ２の排除、またＴＬＲ２／４／５の排除が媒介する活性および応答は、Ｉ型インターフェロン産生を促進もしくは増強し、かつ／またはこれらの受容体が活性化されるときに、あるいはＴＬＲ応答のおかげで生じるＩ型ＩＦＮのあらゆる低減または阻害を低下させる。免疫刺激細菌は、例えばＬ－アスパラギナーゼＩＩの発現をなくしたおかげで、Ｔ細胞機能および活性および効果を増強し、プラスミド維持を容易にし、提供し、可能にし、支持する。細菌は、骨髄性細胞、特に腫瘍常在性骨髄性細胞のみで、または実質的にそれのみで増え（またはそれを標的とし）、食作用の後に高度に効率的なプラスミドデリバリーを提供する。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境にコロニー形成し、かつ全身投与することができる。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ＶＮＰ２０００９と比較して少なくとも１５倍改善されたＬＤ５０を示す。したがって、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、必要に応じて、ＶＮＰ２０００９と比較してはるかに高い用量で毒性効果無しに投与することができる（例えば、投薬量および投与について記載している、セクションＦ．５．における下記の表を参照）。
鞭毛を無くすこと、ＬＰＳ改変、および他の改変を含めた、本明細書に記載のように改変された免疫刺激細菌は、骨髄性細胞、特に腫瘍常在性骨髄性細胞で優先的に増えるか、それを標的とすることが示され、本明細書に記載されている。実施例は、全身投与、例えば静脈内投与などに続いて、免疫刺激細菌が、そのような細胞で増えることを実証する。実施例は、細菌の細胞死に続く、免疫刺激細菌から腫瘍常在性骨髄性細胞内へのプラスミド移動および耐久的なタンパク質発現、ならびにそれによる、抗がん応答および表現型をもたらす産物を含めた治療用産物のデリバリーについても記載し、示す。
ｉｖ．野生型株
腫瘍におけるＶＮＰ２０００９の蓄積は、親株ＡＴＣＣ１４０２８固有の侵襲性、低酸素環境内で複製するその能力、および腫瘍の間質液に存在する高濃度のプリンを求める要件性を含めた因子の組合せから生じる。本明細書に記載のように、例えばＶＮＰ２０００９などの弱毒化株を開始細菌株として用いる必要はない。本明細書に記載の改変のおかげで、細菌は、無毒であるか、または弱毒化されている。親株であるＡＴＣＣ１４０２８または別の野生型株を開始株として用いられることができ、本明細書に記載されるように改変することができる。本明細書に記載されるように、本明細書に提供される免疫刺激細胞は、ゲノム改変のおかげで、腫瘍および腫瘍常在性免疫細胞に、また腫瘍常在性マクロファージにも浸潤し、コロニー形成する。腫瘍を有さない対象においてワクチンとして使用される場合、この細菌は、マクロファージなどの食細胞内に蓄積する。
３．先行の細菌がん免疫治療の限界
本明細書に示すように、また当該技術分野における知識に照らしても、ＴＬＲはＩ型ＩＦＮの誘導を阻害または防止する。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ＴＬＲ２／４／５応答／活性を低減または阻害または排除するための改変を含み、それにより、Ｉ型ＩＦＮの阻害を克服する。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、Ｉ型ＩＦＮの発現を増強させるか、またはＩ型ＩＦＮの誘導を構成的にする特性および／またはペイロードも含む。
対照的に、多くのクラスの免疫治療は、それらの安全性および有効性を制限する有意な限界、ならびに広範に使用される可能性が低い複雑なプラットフォームを有する。細菌、特に本明細書に提供されるものは、例えば腫瘍溶解性ウイルスと比較して、抗がん治療薬として用いる上で有利な特性を極めて多く有する。これらには、細菌を増やし、製造し、保存し、処置が完了したときに宿主から無くすことができる簡単さが含まれる。しかし、ウイルスもまた、宿主応答を含めた有利な特性を有する。細菌感染に対する応答は、自然炎症反応であり、それは抗がん治療薬にとって有利ではない。ウイルス感染に対する応答は、抗がん応答と類似している。これについて、以下の表にまとめる。
したがって、微生物抗がんプラットフォームとしての先行の細菌の限界は、抗がん経路への類似性がそれより高いウイルス感知経路と比較して、細菌を感知した場合、そして細胞内細菌を感知した場合でさえ、免疫系によって開始される特異的な免疫プログラムに由来する。ウイルスを認識する感知プログラムは、高度に効果的なワクチンおよび耐久的な適応免疫の生成を可能にする。しかし、細菌に対するワクチン接種では、限定的な成功しか得られていない。例えば、ＦＤＡ承認されているサルモネラ・チフィに対する腸チフスワクチンは、Ｓ．チフィが、高度に免疫原性であるＶｉ莢膜およびＯ：９抗原を含有するにもかかわらず、わずか５５％の有効性であり（例えば、Hart et al. (2016) PLoS ONE 11(1):e0145945を参照）、Ｌ．モノサイトゲネスおよびネズミチフス菌などの免疫原性がこれより低い細菌株では、そのようなものがなく、それらに対するワクチンも存在しない。
細菌およびウイルスは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られる保存された構造を含有し、それが、宿主の細胞パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって感知される。ＰＲＲによるＰＡＭＰの認識は、サイトカインおよびケモカインの誘導および特異的な免疫応答の開始をもたらす下流のシグナル伝達カスケードを誘発する（例えば、Iwasaki and Medzhitov (2010) Science 327(5963):291-295を参照）。ＰＡＭＰによる自然免疫系のエンゲージメントの仕方およびその感染病原体がどのようなタイプの感染病原体に由来するかによって、侵入している病原体と戦うために、適切な自然応答または適応応答が生成されるかどうかが決定される。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として知られている１クラスのＰＲＲが、細菌およびウイルス起源に由来するＰＡＭＰを認識し、細胞内の様々なコンパートメントに局在している。ＴＬＲは、リポ多糖（ＴＬＲ４）、リポタンパク質（ＴＬＲ２）、フラゲリン（ＴＬＲ５）、ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＴＬＲ９）、二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ３）、および一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）を含めた様々なリガンドを認識する（例えば、Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680；ならびにKawai and Akira (2005) Curr. Opin. Immunol. 17(4):338-344を参照）。ＤＮＡおよびＲＮＡベースのウイルスは、食作用の後に宿主の細胞質ゾルコンパートメントで感知するか、または細胞質ゾルで直接的に感知することができる。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）は、ウイルス起源または損傷した宿主細胞ＤＮＡの取り込みに由来する一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの宿主認識によって誘導されるシグネチャーサイトカインである。例えば、合成ｄｓＲＮＡアナログであるポリイノシン：ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、エンドソームＴＬＲ３のアゴニストであり、そのさらに安定なバージョンである、ｄｓＲＮＡのポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）という商標の下で販売されているものなど）が臨床開発された（例えば、Caskey et al. (2011) J. Exp. Med. 208(12):2357-2366を参照）。同様に、エンドソーム内の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８（ヒトでのみ）によって感知され、その既知の合成のリガンドであるレジキモドおよびイミキモドは、ＦＤＡ承認されている局所がん免疫治療である。
細胞質ゾルでは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）およびメラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）などのＲＮＡヘリカーゼによって感知され、それによりＩ型ＩＦＮの誘導がもたらされる（例えば、Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919を参照）。ｄｓＤＮＡの細胞質ゾルセンサーは、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）によって媒介される。ＳＴＩＮＧは、感染性病原体または異常な宿主細胞損傷に由来する細胞質ゾルｄｓＤＮＡを感知するための中心的メディエータであるＥＲ常在性アダプタータンパク質である（例えば、Barber (2011) Immunol. Rev. 243(1):99-108を参照）。ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）／インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）軸、およびＮＦ－κＢシグナル伝達軸を活性化し、ＩＦＮ－βならびに自然および適応免疫を強力に活性化する他の炎症促進性サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす（例えば、Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518を参照）。ＳＴＩＮＧを介した細胞質ゾルｄｓＤＮＡの感知は、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）を必要とする。ｃＧＡＳは、ｄｓＤＮＡに直接的に結合し、それに応答して、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）セカンドメッセンジャーである環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）を合成する宿主細胞ヌクレオチジルトランスフェラーゼであり、ｃＧＡＭＰがＳＴＩＮＧに結合して活性化する（例えば、Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791；およびWu et al. (2013) Science 339(6121):826-830を参照）。
ＳＴＩＮＧは、細胞内Ｌ．モノサイトゲネスから産生されるｃ－ジ－ＡＭＰ、またはネズミチフス菌由来のｃ－ジ－ＧＭＰなど、細菌由来のＣＤＮにも結合することができる。サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）は、細菌由来の標準的なＣＤＮには応答しないヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を活性化することができる非標準ＣＤＮを産生する。２個のプリンヌクレオシドが、３’－３’結合を有するリン酸架橋でつながれている細菌によって産生されるＣＤＮとは異なり、ｃＧＡＳによって合成されるｃＧＡＭＰ中のヌクレオチド内リン酸架橋は、非標準の２’－３’結合でつながれている。これらの２’－３’分子は、細菌の３’－３’ｃ－ジ－ＧＭＰより３００倍高い親和性でＳＴＩＮＧに結合し、したがって、より強力なＳＴＩＮＧの生理的リガンドである（例えば、Civril et al. (2013) Nature 498(7454):332-337；Diner et al. (2013) Cell Rep. 3(5):1355-1361；Gao et al. (2013) Sci. Signal 6(269):pl1；およびAblasser et al. (2013) Nature 503(7477):530-534を参照）。ヒトのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、細菌性病原体より優先的にウイルス病原体に応答するように進化したようである。
したがって、ＳＴＩＮＧおよびＲＩＧ－Ｉなど、ウイルスを感知するＰＲＲおよびＴＬＲは、効果的なＴ細胞媒介性適応免疫をもたらすＩ型ＩＦＮならびにサイトカインおよびケモカインを誘導する。腫瘍セッティングでは、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、ＣＸＣＬ１０などのＴ細胞輸送ケモカインを誘導する必要があり、腫瘍抗原のＤＣ交差提示を活性化して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞をプライミングする必要もある（例えば、Diamond et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):1989-2003；およびFuertes et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):2005-2016を参照）。
対照的に、ネズミチフス菌などの細菌の宿主監視は、主にＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５によって媒介される（例えば、Arpaia et al. (2011) Cell 144(5):675-688を参照）。これらのＴＬＲは、ＭｙＤ８８（骨髄分化一次応答タンパク質８８）およびＴＲＩＦ（Ｔｏｌｌ／インターロイキン－１受容体（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプター誘導インターフェロン－β）アダプター分子を介してシグナル伝達して、ＮＦ－κＢ依存的炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の誘導を媒介する（例えば、Pandey et al. (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7(1):a016246を参照）。ネズミチフス菌は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路を活性化し、カスパーゼ１の切断ならびにパイロトーシス細胞死をもたらす炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の誘導をもたらすことが示されている。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５のエンゲージメント、ならびにインフラマソーム活性化は、好中球およびマクロファージによる細菌の排除をもたらすケモカインおよびサイトカインを誘導する。ネズミチフス菌がＴ細胞によって排除されるという証拠は、限定されており、それに対して生じた抗体は、非中和抗体である（例えば、McSorley (2014) Immunol. Rev. 260(1):168-182を参照）。さらに、ネズミチフス菌は、Ｔ細胞機能を直接的に抑制する機序を有し、いかなる潜在的抗腫瘍Ｔ細胞応答が生じるのも妨害する（例えば、Kullas et al. (2012) Cell Host Microbe 12(6)791-798を参照）。結果として、ネズミチフス菌などの細菌がん治療は、好中球およびマクロファージによる動員および排除をもたらし、これらは、抗腫瘍適応免疫を生じさせるのに必要なＴ細胞ではない。これらの違いによって、先行の細菌抗がんワクチンが、それらが宿主腫瘍抗原を保持している場合でも、ヒトにおけるＴ細胞プライミングベクターとして有効でない理由を説明できることが本明細書に記載され示されている。ＴＬＲの多くがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を誘導することが報告されているが、このドグマは一次ヒト単球由来のマクロファージのＴＬＲ２／３／４／５／７に関して必ずしも正しいとは限らないことが本明細書で判明し記載されている。Ｉ型ＩＦＮに対する影響を評価するために、ＴＬＲアゴニストを使用して実験を実施した。結果は、ＩＦＮαで前処理しない限り、ＴＬＲ３およびＴＬＲ４アゴニストが、一次ヒト単球中でＩ型ＩＦＮを誘導しないことを示した。ＴＬＲ２をアゴナイズすると、ＩＦＮαで前処理したときでさえもＩ型ＩＦＮを誘導しない。実際には、ＴＬＲ２は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を阻害し得る。これは、細菌ベースの治療薬に関するこれまでに特定されていない問題である。
これらの問題は、本明細書で提供する免疫刺激細菌によって対処される問題の一部である。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、以前にはウイルス性治療薬によってのみ提供されていた有利な特性を有し、細菌性治療薬の有利な特性も保持するように操作されている。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、全身投与することができ、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞、および／または腫瘍微小環境に局在することができ、既存の全身免疫治療の自己免疫関連毒性も制限しながら、免疫抑制を克服し、抗腫瘍免疫を適切に活性化する。本明細書で提供する細菌は、腫瘍常在性免疫細胞に効果的に局在し、治療用抗がん産物をコードし、複数のそのような産物をコードすることができる。例えば、本明細書で提供する細菌は、相補的な治療用産物をコードすることができる。本明細書中に提供される免疫刺激細菌は、ＴＬＲ２、４および５の活性化を低減または排除するように改変される。その結果として、それらは、Ｉ型ＩＦＮの誘導を阻害しない。本明細書に提供されるそのような免疫刺激細菌は、Ｉ型ＩＦＮを誘導するペイロードをコードする。この所見は、本明細書中で供されるワクチンおよびデリバリー媒体が、ＴＬＲ２応答を排除または低減し、Ｉ型ＩＦＮを防止または阻害しないように設計されるように一般化される。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５の応答は、低減または排除され、それによって、Ｉ型ＩＦＮを阻害しないワクチンおよび他の免疫刺激治療薬を提供する。
効果的な適応免疫を誘導するウイルス様免疫応答を誘発しながら、細菌の有益な特性を保持するように操作された優れた微生物抗がん、ワクチン、ＲＮＡデリバリープラットフォームが本明細書に提供される。本明細書に記載のように、サルモネラ属および他の種の株などの細菌を、炎症作用が低減し、それゆえ毒性が減るように本明細書に記載されるように改変することができる。その結果、例えば、より高投薬量で投与することができる。当業者に知られており、かつ／または上記および本明細書に列挙されているサルモネラ属および細菌の他の種のこれらの株のいずれでも、本明細書に記載のように改変することができる。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境、腫瘍常在性免疫細胞、および腫瘍へのコロニー形成が増大するように改変されている。それらは、その毒性が低減し、腫瘍微小環境にそれらを向ける、アデノシン栄養要求性を含めた、他の特性を有するように操作されている。本明細書で提供する株は、それらが補体によって不活性化されないようにも操作されている。これらの特徴、特に食細胞へのコロニー形成／感染をもたらすものもまた、細菌をワクチンプラットフォームとしておよびＲＮＡデリバリー媒体として有用なものにする。それらは、選択されるペイロード、コードされている産物の発現に細菌または宿主細胞の転写／翻訳機構を使用するべきかどうかに依存して選択される調節配列、およびその中で産物が産生される宿主細胞または組織の遺伝子座によって、各使用に適応させることができる。
本明細書で提供する細菌の株は、治療用産物をデリバリーするように操作されている。本明細書の細菌株は、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子、ならびにＩ型ＩＦＮ発現を構成的に誘起または誘導することができる改変された機能獲得型細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーを含めた免疫刺激タンパク質、ならびに腫瘍微小環境内で抗腫瘍免疫応答を促進する他の治療用産物、限定されるものではないが、例えば、抗体およびその断片、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ（登録商標））、ＲＮＡｉ、およびこれらの相補的な組合せなどをデリバリーする。細菌株は、貪食細胞のパイロトーシスを低減し、それによって、より頑健な免疫応答を提供し、かつ／またはそれらが腫瘍、腫瘍微小環境、および腫瘍常在性免疫細胞内で、より効果的に増えるように、上皮細胞を感染／侵襲する能力を低減するか、もしくは無くすが、貪食細胞を感染／侵襲する能力を保持するゲノム改変も含む。細菌株は、また、ヒト血清中の補体因子による不活性化に抵抗性であるように改変されていてもよい。細菌株は、また、例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、Ｉ型ＩＦＮの構成的に活性な誘導物質、ならびに免疫チェックポイントに対する、およびまた、そのような他の標的に対するモノクローナル抗体（およびその断片）を、単独で、または組み合わせて含む治療用産物をコードするように改変されていてもよい。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、完全または部分的な細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（受容体またはリガンド：例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）をコードする遺伝的ペイロードをデリバリーする抗がん治療用産物であって、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失または切り詰めによりＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない、抗がん治療用産物が提供される。
細菌はまた、ＳＴＩＮＧおよびサイトカインなどの免疫刺激タンパク質（複数可）に加えて（またはそれに代えて）、腫瘍抗原、および病原体抗原もしくはタンパク質などの抗原をコードすることができる。
Ｃ．治療指数を増大させ、腫瘍常在性骨髄性細胞内の蓄積を増大させるための免疫刺激細菌の改変および増強
腫瘍常在性骨髄性細胞内の蓄積を増大させること、補体不活性化に対する抵抗性を改善させること、免疫細胞死を低減すること、適応免疫を促進すること、およびＴ細胞機能を増強することなどによって、例えば、毒性を低減し、抗腫瘍活性を改善する細菌ゲノムまたは免疫刺激細菌への改変を含めた増強が本明細書で提供される。改変は、サルモネラ属、特にネズミチフス菌に関して記載され、例示され、当業者ならば、リステリア属および大腸菌などの他の細菌種、ならびに他のサルモネラ属株で類似の増強／改変を引き起こし、同様の特性および／または効果を達成することができ、同じコードされているペイロードを発現することができるものと理解される。以下は、そのような増強／改変の例である。
１．ＬＰＳ生合成経路における遺伝子の欠失
グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）は、細菌膜の外葉の主要成分である。それは、リピドＡ、非反復性コアオリゴ糖、およびＯ抗原（またはＯ多糖）という３つの主要部分から構成されている。Ｏ抗原は、ＬＰＳの最も外部の部分であり、細菌の透過性に対する保護層として働くが、Ｏ抗原の糖組成は、株と株の間で広範に変化する。リピドＡおよびコアオリゴ糖は、それより変異幅が小さく、同じ種の複数の株の中で、より典型的に保存されている。リピドＡは、エンドトキシン活性を含有するＬＰＳの部分である。それは、典型的には、複数の脂肪酸で装飾された二糖である。これらの疎水性脂肪酸鎖が細菌膜中に入ってＬＰＳをつなぎ留めており、ＬＰＳの残部は、細胞表面から突出している。リピドＡドメインは、グラム陰性細菌の毒性の多くの原因となっている。典型的には、血液中のＬＰＳは、重大な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と認識されており、著明な炎症促進性応答を誘導する。ＬＰＳは、ＣＤ１４、ＭＤ２、およびＴＬＲ４を含む膜結合型受容体複合体のリガンドである。ＴＬＲ４は、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ経路を介してシグナル伝達して、ＮＦ－κＢ経路を刺激することができる膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６などの炎症促進性サイトカインの産生をもたらす。その帰結は、エンドトキシンショックでありえ、これは致命的であり得る。哺乳動物細胞の細胞質ゾル内にあるＬＰＳは、カスパーゼ４、５、および１１のＣＡＲＤドメイン（ＣＡＲＤ）と直接的に結合することができ、自己活性化およびパイロトーシス細胞死をもたらす（例えば、Hagar et al. (2015) Cell Research 25:149-150を参照）。リピドＡの組成およびリピドＡ変異体の毒素産生性については、十分に記述されている。例えば、一リン酸化リピドＡは、複数のリン酸基を有するリピドＡよりも炎症性が低い。リピドＡ上のアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に著明な影響を有し得る。大腸菌由来の標準的なリピドＡは、６本のアシル鎖を有し、このヘキサアシル化が強力に毒性である。ネズミチフス菌のリピドＡは、大腸菌のものと類似しており、それは、４本の第１ヒドロキシアシル鎖および２本の第２ヒドロキシアシル鎖を有するグルコサミン二糖である（例えば、Raetz et al. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71:635-700を参照）。
ａ．ｍｓｂＢ欠失
ネズミチフス菌のｍｓｂＢ遺伝子によってコードされているリピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼという酵素は、リポ多糖（ＬＰＳ）のリピドＡドメインへの末端ミリストイル基の付加を触媒する（例えば、Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41を参照）。したがって、ｍｓｂＢの欠失は、グラム陰性細菌の外膜の主要構成成分であるＬＰＳのリピドＡドメインのアシル組成を変える。例えば、ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９株におけるｍｓｂＢの欠失は、天然のヘキサアシル化リピドＡより毒性が低い、主にペンタアシル化されたリピドＡの産生をもたらし、毒性ショックの誘導の無い全身デリバリーが可能となる（例えば、Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25を参照）。この改変は、敗血症性ショックを誘導するＬＰＳの能力を有意に低減し、細菌株を弱毒化し、それゆえ、サルモネラベースの免疫治療の治療指数を増大させる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、第２００３／０１０９０２６号、第２００４／０２２９３３８号、第２００５／０２５５０８８号、および第２００７／０２９８０１２号を参照）。重要なことに、ｍｓｂＢ産物を発現しないｍｓｂＢ突然変異体は、本明細書で例示するように（例えば、実施例２を参照）、細胞内で複製することができないが、これは、サルモネラ属の病原性の要件である（例えば、Leung et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11470-11474を参照）。
置換、欠失、または挿入を含めた、ＬＰＳ発現を変える他のＬＰＳ突然変異を、病原性を激減させ、それによって、毒性の低下をもたらし、より高用量の投与を可能にする、サルモネラ属株を含めた本明細書で提供する細菌株に導入することができる。本明細書で例示されるように、ｍｓｂＢ－遺伝子座は、部分的に欠失されるか、または分断されるか、または転移され得る。それはまた、完全に欠失されてもよく、これにより株の増殖を改善することができる。
他の細菌種におけるリピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼの相同体またはオルソログをコードする対応遺伝子も、類似した結果を達成するように、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でミリストイル－アシルキャリアータンパク質依存的アシルトランスフェラーゼをコードするｌｐｘＭ；およびＳ．チフィでリピドＡアシルトランスフェラーゼをコードするｍｓｂＢを含む。
ｂ．ｐａｇＰ欠失または不活性化
上述のように、ネズミチフス菌のｍｓｂＢ突然変異体は、リピドＡの末端ミリストイル化を受けることができず、ヘキサアシル化されたリピドＡより有意に毒性が低い、主にペンタアシル化されたリピドＡを産生する。パルミチン酸によるリピドＡの改変は、リピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ（ＰａｇＰ）という酵素によって触媒される。ｐａｇＰ遺伝子の転写は、ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ系の制御下にあり、これは、マグネシウム濃度が低い状態、例えばＳＣＶ内の状態によって活性化される。したがって、ネズミチフス菌のリピドＡのアシル含有量は、変動的であり、野生型細菌では、それは、ヘキサアシル化またはペンタアシル化されたものであり得る。ネズミチフス菌がそのリピドＡをパルミトイル化する（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）能力は、ファゴリソソーム中に分泌される抗菌性ペプチドに対する抵抗性を増大させる。
野生型ネズミチフス菌では、ｐａｇＰの発現は、ヘプタアシル化されたリピドＡをもたらす。ｍｓｂＢ突然変異体（リピドＡの末端アシル鎖が付加できない突然変異体）では、ｐａｇＰの誘導がヘキサアシル化されたリピドＡをもたらす（例えば、Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038を参照）。ヘキサアシル化されたリピドＡは、最も炎症促進性であることが示されている。複数のグループが、例えばｐａｇＰを欠失または破壊して、ヘキサアシル化されたリピドＡのみの産生を可能にすることによって、この炎症促進性シグナルを活用しようとしているが（例えば、Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177；およびFelgner et al. (2018) Oncoimmunology 7(2):e1382791を参照）、これは、ＬＰＳのＴＮＦ－α媒介炎症促進性の性質により、乏しい抵抗性、および逆説的に、低下した適応免疫をもたらす可能性がある（例えば、Kocijancic et al. (2017) Oncotarget 8(30):49988-50001を参照）。
ＬＰＳは、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を誘導する強力なＴＬＲ４アゴニストである。１Ｅ９ ＣＦＵｓ／ｍ２でのＩ．Ｖ．ＶＮＰ２０００９臨床試験（例えば、Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照）における用量規制毒性は、２時間における血清中ＴＮＦ－αレベル＞１００，０００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－６レベル＞１０，０００ｐｇ／ｍｌで、サイトカイン媒介性であった（熱、低血圧）。ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢ欠失およびその発熱性の低減にもかかわらず、おそらくヘキサアシル化リピドＡの存在により、高用量では、ＬＰＳが依然として毒性であり得る。したがって、ヘキサアシル化リピドＡを産生することができず、ペンタアシル化リピドＡのみを産生し、その結果、炎症促進性サイトカインの誘導が低下している、ｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－株は、より高い用量でも忍容性が向上しており、１Ｅ９ ＣＦＵｓ／ｍ２以上でヒトで投与することが可能となる。より高い用量での投与は、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞、および腫瘍微小環境におけるさらなるコロニー形成をもたらし、免疫刺激細菌の治療有効性を増強する。結果として生じる、細菌の膜および構造の変化のため、全身投与の際に細菌が無くならないように、補体活性などの宿主免疫応答が変えられる。例えば、ｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－突然変異体株は、補体不活性化に対する抵抗性を増大させ、ヒト血清の安定性を増強していることが本明細書に示されている。
ペンタアシル化リピドＡを有するＬＰＳのみを産生することができ、ｍｓｂＢ遺伝子の欠失または破壊を含有し、さらに、ｐａｇＰの欠失または破壊によって改変されている、ネズミチフス菌の例示的な株など、生きている弱毒化サルモネラ属株によって例示される、免疫刺激細菌が本明細書に提供される。上に示したように、ｍｓｂＢ発現の欠失は、リピドＡの末端ミリストイル化を妨げ、一方、ｐａｇＰ発現の欠失は、パルミトイル化を妨げる。ＬＰＳペンタアシル化リピドＡを産生するように改変された株は、腫瘍微小環境内で免疫応答を刺激する異種の遺伝的ペイロードを発現するようにさらに改変されたとき、炎症促進性サイトカインレベルの低下、血液中の安定性の改善、補体結合に対する抵抗性、抗菌性ペプチドに対する感受性の増大、忍容性の増強、および抗腫瘍免疫の増大をもたらす。
他の細菌種でリピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ（ＰａｇＰ）の相同体およびオルソログをコードする対応する遺伝子も、類似した結果を達成するように、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌で脂質ＩＶＡパルミトイルトランスフェラーゼをコードするｐａｇＰ；およびＳ．チフィで抗菌性ペプチド抵抗性およびリピドＡアシル化タンパク質をコードするｐａｇＰを含む。
２．栄養要求性
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、それらを、１または複数の必須栄養素、例えば、プリン（例えば、アデニン）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン）、アミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸、アルギニン、およびロイシン）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、または当技術分野で知られており、記載されている他の栄養素などについて栄養要求性にすることによって、弱毒化することができる。
ａ．ｐｕｒＩ欠失／破壊
ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼは、ｐｕｒＩ遺伝子（ｐｕｒＭ遺伝子と同義）によってコードされている酵素であり、プリンの生合成経路に関与している。したがって、ｐｕｒＩ遺伝子の破壊または欠失または不活性化は、細菌をプリンについて栄養要求性にする。弱毒化されていることに加えて、ｐｕｒＩ－突然変異体は、腫瘍環境中に濃縮され、有意な抗腫瘍活性を有する（例えば、Pawelek et al. (1997) Cancer Research 57:4537-4544を参照）。このコロニー形成が、腫瘍の急速な細胞ターンオーバーの結果として腫瘍の間質液に存在するプリンが高濃度であることの結果であることが以前に記載された。ｐｕｒＩ－細菌はプリンを合成することができないので、それらは、外部ソースのアデニンを必要とし、これにより、プリンが豊富な腫瘍微小環境中でそれらの制限増殖がもたらされるであろうと考えられた（例えば、Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225を参照）。ＶＮＰ２０００９株は、ｐｕｒＩ遺伝子の欠失を含有すると最初に報告されたが（例えば、Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine Vol. 90, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, pp. 47-59を参照）、後で行われたＶＮＰ２０００９の全ゲノム解析は、ｐｕｒＩ遺伝子が欠失しているのではなく、染色体逆位によって破壊されていることを実証した（例えば、Broadway et al. (2014) Journal of Biotechnology 192:177-178を参照）。全遺伝子が、挿入配列によって挟まれたＶＮＰ２０００９染色体の２つの部分の中に含有されており、挿入配列の１つは、活性のトランスポザーゼを有する。ｐｕｒＩ遺伝子の破壊により、複製が腫瘍組織／微小環境に限定されるが、それは、依然として細胞内複製および病原性を可能にしている。本明細書に例示するように（実施例２参照）、ｍｓｂＢ遺伝子およびｐｕｒＩ遺伝子の各々の欠失または破壊が、腫瘍組織内の細胞外間隙に細菌の増殖を限定し、細胞内複製を防ぐのに必要である。組換えによる野生型へのいかなる可能な復帰変異も無くすために、これらの遺伝子のコーディング部分が完全に欠失している株が本明細書で提供される。本明細書で、そのような細菌はより効果的に増殖することが示されている。
ｐｕｒＩ遺伝子欠失または破壊の他に、例えば、ａｒｏ、ｇｕａ、ｔｈｙ、ｎａｄ、およびａｓｄなど遺伝子内の欠失／突然変異によって、栄養素栄養要求性を免疫刺激細菌に導入することができる。これらの遺伝子を含む生合成経路によって産生される栄養は、宿主細胞内では利用できないことが多く、したがって、細菌の生存は困難である。例えば、サルモネラ属および他の細菌種の弱毒化は、糖分解を芳香族アミノ酸生合とつなげるシキミ酸経路の一部であるａｒｏＡ遺伝子の欠失によって達成することができる（例えば、Felgner et al. (2016) mBio 7(5):e01220-16を参照）。ａｒｏＡの欠失は、芳香族アミノ酸についての細菌の栄養要求性およびそれに続く弱毒化をもたらす（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、第２００３／０１７５２９７号、第２０１２／０００９１５３号、および第２０１６／０３６９２８２号；ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号および第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。同様に、ａｒｏＣおよびａｒｏＤを含めた、芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する他の酵素が、弱毒化を達成するために欠失させられている（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６９２８２号；および国際出願公開第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。例えば、ネズミチフス菌のＳＬ７２０７株は、芳香族アミノ酸栄養要求体（ａｒｏＡ－突然変異体）であり、Ａ１およびＡ１－Ｒ株は、ロイシン－アルギニン栄養要求体であり、ＶＮＰ２０００９／ＹＳ１６４６は、プリン栄養要求体（ｐｕｒＩ－突然変異体）であり、ならびにｍｓｂＢ－である。本明細書に示されるように、ＶＮＰ２０００９／ＹＳ１６４６は、免疫抑制ヌクレオシドアデノシンについて、およびＡＴＰについて栄養要求性である（例えば、実施例１を参照）。本明細書に提供される株は、鞭毛を失っているものなどのＹＳ１６４６と表示される菌に由来する株を含み、ｐａｇＰ－であるか、またはペンタアシル化ＬＰＳを産生するように改変されており、例えば、細菌をｃｓｇＤ－にするゲノム改変によって、ｐｕｒＩおよび／ｍａｂＢの完全な欠失、ならびにｃｕｒｌｉ線毛の欠失を含む追加の改変、およびｔｈｙＡ－株などの増殖に様々な栄養素を必要とする追加の改変を含む。株はまた、株をａｎｓＢ－にして、それによりアスパラギンシンターゼを産生せず、これがＴ細胞を阻害することができるゲノム改変を有することもでき、それにより免疫刺激細菌のこの免疫抑制の様相を排除する。例示的な株には、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡのように表示されるものが含まれる。これらの表示はサルモネラ属遺伝子に言及しており、同様な改変を、他の細菌種、例えば、リステリア属、およびＮｉｓｓｌｅなどの大腸菌で行うことができる。
他の細菌種でホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ（ｐｕｒＩ）の相同体またはオルソログをコードする対応する遺伝子およびプリン合成に必要な他の遺伝子も、類似した結果を達成するように、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でホスホリボシルホルミルグリシンアミドシクロリガーゼをコードするｐｕｒＭ；Ｓ．チフィでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードするｐｕｒＭ；アデニロコハク酸シンセターゼをコードするｐｕｒＡ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩＩをコードするｐｕｒＱ、およびＬ．モノサイトゲネスでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼサブユニットｐｕｒＳをコードするｐｕｒＳ；ビフィドバクテリウム・ロンガムでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードするｐｕｒＭ（ＢＬ１１２２）；およびＡＩＲシンターゼをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５、およびクロストリジウム・ノービイでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５（ｐｕｒＭ）を含む。
ｂ．アデノシン栄養要求性
トリプトファンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）／アデノシン経路に由来する代謝物質が、腫瘍／腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中に免疫抑制性環境を形成する際の主要なドライバーである。アデノシンは、細胞の内部および外部に遊離型で存在し、免疫機能のエフェクターである。アデノシンは、Ｔ細胞受容体によって誘導されるＮＦ－κＢの活性化を低減し、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＦＮ－γを阻害する。アデノシンは、Ｔ細胞細胞傷害性を低減し、Ｔ細胞アネルギーを増大させ、Ｆｏｘｐ３＋またはＬａｇ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔ－ｒｅｇ細胞、Ｔ－ｒｅｇｓ、またはＴｒｅｇｓ）へのＴ細胞分化を増大させる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上では、アデノシンは、ＩＦＮ－γ産生を低減し、ＮＫ細胞細胞傷害性を抑制する。アデノシンは、好中性接着および血管外漏出を遮断し、食作用を低減し、過酸化物および一酸化窒素のレベルを減弱する。アデノシンは、マクロファージ上でのＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびＭＩＰ－１α（ＣＣＬ３）の発現も低減し、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ発現を減弱し、ＩＬ－１０およびＩＬ－６のレベルを増大させる。アデノシンの免疫調節活性は、腫瘍の細胞外間隙へのその放出および標的免疫細胞、がん細胞、または内皮細胞の表面のアデノシン受容体（ＡＤＲ）の活性化の後に生じる。腫瘍微小環境中の高アデノシンレベルは、局所的免疫抑制をもたらし、それが、がん細胞を無くす免疫系の能力を限定する。
腫瘍間質細胞上に発現され、死細胞または瀕死の細胞から産生されるＡＴＰまたはＡＤＰのホスホヒドリシスによって協働してアデノシンを産生する膜結合エクトエンザイムＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、別名ＮＴＰＤａｓｅ１）およびＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）の逐次活性によって、細胞外アデノシンが産生される。ＣＤ３９が細胞外ＡＴＰ（またはＡＤＰ）を５’－ＡＭＰに変換し、それが、ＣＤ７３によってアデノシンに変換される。腫瘍微小環境の低酸素条件下で、内皮細胞上のＣＤ３９およびＣＤ７３の発現が増大し、それによって、アデノシンのレベルが増大する。腫瘍低酸素は、酸素のデリバリーを障害する不十分な血液供給および無秩序な腫瘍脈管構造から生じる得る（例えば、Carroll and Ashcroft (2005) Expert. Rev. Mol. Med. 7(6), DOI: 10.1017/S1462399405009117を参照）。低酸素は、腫瘍微小環境中に生じ、アデノシンをＡＭＰに変換するアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）も阻害し、非常に高い細胞外アデノシン濃度をもたらす。低酸素腫瘍微小環境中のアデノシンの細胞外濃度は、１０～１００μＭと測定されており、これは、最高約０．１μＭという典型的な細胞外アデノシン濃度よりも約１００～１０００倍高い（例えば、Vaupel et al. (2016) Adv. Exp. Med. Biol. 876:177-183；およびAntonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。腫瘍の低酸素領域は、微小血管から遠いので、腫瘍の一部の領域ではアデノシンの局所濃度が他より高くなる可能性がある。
免疫系を阻害する効果を指示するために、アデノシンは、がん細胞の増殖、アポトーシス、および血管新生に対する効果によってがん細胞の成長および播種を制御することもできる。例えば、アデノシンは、主にＡ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の刺激を介して、血管新生を促進することができる。内皮細胞上の受容体の刺激は、内皮細胞上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）およびＥ－セレクチンの発現を調節し、血管完全性を維持し、血管成長を促進することができる（例えば、Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。アデノシンによる様々な細胞上のＡ２Ａ、Ａ２Ｂ、またはＡ３のうちの１つまたは複数の活性化は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、またはアンジオポエチン２などの血管新生促進因子の産生を刺激することができる（例えば、Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。
アデノシンは、がん細胞上の受容体との相互作用を介して腫瘍細胞増殖、アポトーシス、および転移を直接的に調節することもできる。例えば、研究により、Ａ１およびＡ２Ａ受容体の活性化は、一部の乳がん細胞株における腫瘍細胞増殖を促進し、Ａ２Ｂ受容体の活性化は、結腸がん細胞におけるがん成長促進特性を有することが示されている（例えば、Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。アデノシンは、がん細胞のアポトーシスを誘発することもでき、様々な研究は、この活性を、Ａ３を介した外因性アポトーシス経路またはＡ２ＡおよびＡ２Ｂを介した内因性アポトーシス経路の活性化と相関させている（例えば、Antonioli et al. (2013)を参照）。アデノシンは、細胞運動性、細胞外マトリックスへの接着、ならびに細胞付着タンパク質および受容体の発現を増大させて、細胞運動および運動性を促進することによって、腫瘍細胞遊走および転移を促進することができる。
刺激された免疫細胞、および損傷しているか、瀕死であるか、またはストレス下にある細胞から、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の細胞外放出が起こる。ＡＴＰのこの細胞外放出によって刺激されると、ＮＬＲファミリーパイリン領域含有３（ＮＬＲＰ３）インフラマソームがカスパーゼ１を活性化し、サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の分泌をもたらし、それらが、次いで、自然免疫応答および適応免疫応答を活性化する（例えば、Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358を参照）。ＡＴＰは、腫瘍組織中で、１００ｍＭ超の濃度まで蓄積することができ、一方、健常な組織中で見出されるＡＴＰのレベルは非常に低い（約１～５μＭ）（例えば、Song et al. (2016) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 310(2):C99-C114を参照）。ＡＴＰは、ＣＤ３９酵素およびＣＤ７３酵素によってアデノシンに異化される。活性化されたアデノシンは、ネガティブフィードバックメカニズムを介して、高度に免疫抑制的な代謝物質の働きをし、低酸素腫瘍微小環境中で、複数の免疫細胞型に対して多面的効果を有する（例えば、Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358を参照）。アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは、様々な免疫細胞上で発現され、アデノシンによって刺激されて、ｃＡＭＰによって媒介されるシグナル伝達の変化を促進し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の免疫抑制表現型をもたらす。その結果、ＣＤ７３などのエクトヌクレオチダーゼを過剰発現することが示されている、固形腫瘍などの病的組織では、アデノシンレベルがその正常濃度の１００倍超にまで蓄積し得る。アデノシンは、腫瘍血管新生および腫瘍形成を促進することも示されている。したがって、アデノシンについて栄養要求性である操作された細菌は、腫瘍ターゲティングおよびコロニー形成の増強を示すだろう。
チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）などの免疫刺激細菌は、例えば、ｔｓｘ遺伝子の欠失によって（例えば、Bucarey et al. (2005) Infection and Immunity 73(10):6210-6219を参照）、またはｐｕｒＤの欠失によって（例えば、Husseiny (2005) Infection and Immunity 73(3):1598-1605を参照）、アデノシンについて栄養要求性にすることができる。グラム陰性細菌イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）では、ｐｕｒＤ遺伝子ノックアウトが、アデノシンについて栄養要求性であることが示された（例えば、Park et al. (2007) FEMS Microbiol. Lett. 276:55-59を参照）。本明細書に例示されるように、ネズミチフス菌のＶＮＰ２０００９株は、そのｐｕｒＩ改変により、アデノシンについて栄養要求性であり、それゆえ、それをアデノシンについて栄養要求性にするためのさらなる改変は必要ない。それゆえ、本明細書で提供する免疫刺激細菌株の実施形態は、アデノシンについて栄養要求性である。そのような栄養要求性細菌は、腫瘍微小環境で選択的に複製し、その結果、腫瘍内における、投与された細菌の蓄積および複製をさらに増大し、腫瘍内および周辺のアデノシンのレベルを低減し、それによって、アデノシンの蓄積によって引き起こされた免疫抑制を低減するか、または無くす。本明細書で提供するそのような細菌の例は、アデノシン栄養要求性をもたらすｐｕｒＩ－／ｍｓｂＢ－突然変異を含有するネズミチフス菌の改変された株である。他の株および細菌については、ＶＮＰ２０００９でされているように、ｐｕｒＩ遺伝子を破壊することができ、あるいは、それは、ｐｕｒＩ遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含有することができ、これは、野生型遺伝子への復帰変異が存在できないことを確実にする。本明細書のどこかに記載のように、ＶＮＰ２０００９株では、ｐｕｒＩ遺伝子が逆位によって不活性化された。同様に、ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢ遺伝子は、完全には欠失されなかった。本明細書に例示のように、復帰変異のいかなるリスクも無くなるようにｐｕｒＩ遺伝子およびｍｓｂＢ遺伝子が完全に欠失されている株は、インビトロにおける培養物の成長によって評価した場合、優れた適応度を示す。
それらを、プリン（例えば、アデニン）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン）、アミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸、アルギニン、およびロイシン）、またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などの１または複数の必須栄養について栄養要求性にすることによって改変されている免疫刺激細菌が使用される。特に、ネズミチフス菌の株など、本明細書で提供する免疫刺激細菌の実施形態では、細菌が、アデノシンについて栄養要求性にされており、かつＡＴＰについて栄養要求性にされていてもよく、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で優先的に増える。それゆえ、本明細書に記載の免疫刺激細菌の株は、それらが成長のためにプリン、アデノシン、および／またはＡＴＰを必要とし、それらが、下で論じるように、これらの代謝物質を豊富に有するＴＭＥに優先的にコロニー形成するので、弱毒化されている。一部の腫瘍の腫瘍微小環境中のアデノシン蓄積が免疫抑制性であるので、アデノシン栄養要求性は、腫瘍微小環境に蓄積するアデノシンから免疫抑制をなくす。
ｃ．チミジン栄養要求性
ゲノム改変は、以下に述べる不活性化／欠失（セクション３を参照）に代えて、またはそれに加えて導入することができる。増殖に必要な遺伝子もしくは遺伝子産物、例えば栄養素を産生する遺伝子の他の欠失または不活性化は、例えば、ａｓｄ不活性化／欠失に代えて、またはそれに加えて使用され得る。これらには、例えば、細菌をｔｈｙＡ－にする改変が含まれる（例えば、Loessner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88を参照されたい）。ＴｈｙＡ－である免疫刺激細菌は、チミジル酸シンターゼの産生の不活性化または排除をもたらす、挿入、欠失、置換、転位、および／または他の変化などのゲノム改変を有する。チミジル酸シンターゼは、ｄＵＭＰのＤＮＡ生合成前駆体（ｄＴＴＰへの前駆体）であるｄＴＭＰへの還元メチル化を触媒する。
そのような産物の産生のための細菌ゲノムの発現もしくは産生の除去または弱毒化突然変異は、投与後のインビボでの細菌細胞死の際に、コードされている高分子の放出をもたらす。Ａｓｄは、以下で述べるように、細菌細胞壁の合成のための必須酵素であり、ＴｈｙＡは、ＤＮＡ合成に必要とされる酵素である。それぞれの遺伝子の突然変異は、菌株をジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）またはチミジン一リン酸前駆体について栄養要求性にする。補完基質の枯渇時に、そのような細菌はＤＡＰ飢餓死もしくはチミン飢餓死によって死滅し、細菌タンパク質およびプラスミドの放出をもたらす。Ａｓｄの不活性化または除去は、高分子の放出をもたらす。ＴｈｙＡ発現／活性の除去または不活性化（ΔＴｈｙＡ細菌、挿入、欠失および活性酵素を産生しないように他の改変を有するものを含むΔＴｈｙＡ細菌を生じさせるための）は、チミジン飢餓時に、タンパク質およびプラスミドを含む高分子の放出をもたらさない（Leossner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88）。
したがって、ΔＴｈｙＡ細菌は、その中で活性酵素が産生しないように改変されており、細菌がその内容物を時期尚早に放出しないため、例えばプラスミドの宿主細胞へのインビボデリバリーに有利である。本明細書に提供される細菌は、食細胞、例えば、細菌を摂取するマクロファージ、樹状細胞、単球および好中球などの骨髄性細胞に感染するか、その中に蓄積し、インタクトなΔＴｈｙＡ細菌は、標的化細胞の内部で治療用産物などのペイロードをコードしているプラスミドを、例えば、ＲＮＡの場合であれば発現を、タンパク質の場合であれば分泌もしくは提示のために放出する。したがって、細菌をｔｈｙＡ－にするゲノム改変は、特定の用途、例えば、免疫化、細胞上の提示、ＲＮＡのデリバリー、および他のそのような用途に対して利点を有する。
３．プラスミド維持およびデリバリー
ａ．ａｓｄ欠失
上述したように、細菌はｔｈｙＡ－にすることができ、それらは、それに代えてまたは加えてａｓｄ－にすることもできる。特定のゲノム改変の選択は、細菌の意図される用途に依存する。ｔｈｙＡの不活性化は、一部の用途に有利であり、他の用途には、細菌をａｓｄ－にすることが有利であり、特定の改変（複数可）を選択することは当業者の技量の範囲内である。細菌のａｓｄ遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする。ネズミチフス菌のａｓｄ－突然変異体は、細胞壁合成に必要であるジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）についての絶対的必要性を有し、ＤＡＰが枯渇した環境では溶解する。このＤＡＰ栄養要求性は、ａｓｄ遺伝子が細菌内のプラスミドでトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）補完される場合、抗生物質を使わずに、プラスミド選択およびインビボでのプラスミド安定性の維持に用いることができる。抗生物質ベースではないプラスミド選択系は、有利であり、１）有害症状が生じた場合に急速排除メカニズムとして投与される抗生物質の使用および２）通常は抗生物質の使用が避けられる場合における、抗生物質を用いない生産スケールアップを可能にする。ａｓｄ遺伝子相補性システムは、そのような抗生物質ベースではないプラスミド選択を提供する（例えば、Galan et al. (1990) Gene 94(1):29-35を参照）。腫瘍微小環境でプラスミドを維持するためのａｓｄ遺伝子相補性システムの使用は、免疫刺激タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子）；ＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３など、Ｉ型ＩＦＮを誘導する細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、およびその機能獲得型／構成的に活性な突然変異体；抗体およびその断片（例えば、チェックポイント阻害剤、または抗ＩＬ－６もしくは抗ＶＥＧＦ抗体）；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）という商標下で販売）；干渉ＲＮＡ；および本明細書にどこかで論じており、当技術分野で知られている他の治療用産物；ならびに以上の治療用産物のすべての相補的組合せなどの遺伝的ペイロード／治療用産物をコードするプラスミドをデリバリーするように操作されたネズミチフス菌の効力を増大すると予測される。
ネズミチフス菌のａｓｄ突然変異体に代わる代替の使用は、自己融解株（または自殺株）を産生するＤＡＰ栄養要求性を、宿主腫瘍に持続的にコロニー形成する能力が無い感染細胞に治療用産物／高分子をデリバリーするのに活用することである。ａｓｄ遺伝子の欠失は、インビトロまたはインビボで増殖するとき、細菌をＤＡＰについて栄養要求性にする。本明細書に記載されている例は、ＤＡＰについて栄養要求性であり、免疫調節性タンパク質のデリバリーに適したプラスミドを含有するが、ａｓｄ相補遺伝子を含有しないａｓｄ欠失株を提供し、インビボでの複製を欠く株をもたらす。この株は、ＤＡＰの存在下でインビトロで繁殖し、正常に成長し、次いで、ＤＡＰが存在しない哺乳動物宿主に免疫治療剤として投与される。自殺株は、宿主細胞に侵入することができるが、哺乳動物組織におけるＤＡＰの不在により複製することができず、自動的に溶解して、その細胞質ゾル含有物（例えば、プラスミドまたはタンパク質）をデリバリーする。
他の細菌種でアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の相同体またはオルソログをコードする対応する遺伝子も、類似した結果を達成するように欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ；Ｓ．チフィでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ（ＳＴＹ４２７１）；Ｌ．モノサイトゲネスでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ（ｌｍｏ１４３７）；ビフィドバクテリウム・ロンガムでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ（ＢＬ０４９２）；およびクロストリジウム・ノービイでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５（ａｓｄ）を含む。同様に、上述したように、ｔｈｙＡは、ａｓｄ改変の代わりにゲノム改変によって不活性化または排除され得る。上述したように、チミジル酸シンターゼの発現／活性の不活性化または排除は、チミジン飢餓時に、タンパク質およびプラスミドを含む抗分子の放出をもたらさない。
ｂ．ｅｎｄＡ欠失／破壊
ｅｎｄＡ遺伝子（例えば、配列番号２５０を参照）は、グラム陰性細菌のペリプラズムで二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の分解を媒介するエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＩ：例えば、配列番号２５１を参照）をコードする。ｅｎｄＡ遺伝子の突然変異は、プラスミドＤＮＡの収率増大を可能にするので、実験室大腸菌の最も一般的な株は、ｅｎｄＡ－である。この遺伝子は、種の間で保存されている。無傷のプラスミドＤＮＡデリバリーを容易にするため、操作された免疫刺激細菌のｅｎｄＡ遺伝子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を防ぐため、欠失しているか、突然変異している。そのような突然変異の例には、Ｅ２０８Ｋアミノ酸置換（例えば、Durfee et al. (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606を参照）または目的の種の対応する突然変異がある。ｅｎｄＡは、残基Ｅ２０８を含めて、サルモネラ属を含めた細菌種の間で保存されている。したがって、Ｅ２０８Ｋ突然変異は、サルモネラ属種を含めた他の種でエンドヌクレアーゼ活性を無くすのに用いることができる。当業者ならば、ｅｎｄＡ活性を無くす他の突然変異または欠失を導入することができる。この突然変異を引き起こすか、またはこの遺伝子を欠失させるか、または破壊して、本明細書の免疫刺激細菌における、例えばサルモネラ属における、ｅｎｄＡの活性を無くすと、無傷のプラスミドＤＮＡデリバリーの効率が増大し、それによって、プラスミド上にコードされている任意の１種、または２種、または３種以上の免疫調節性タンパク質／治療用産物の発現を増大し、抗腫瘍免疫応答および抗腫瘍有効性を増強する。
４．フラゲリンノックアウト株
鞭毛は、時計回りまたは反時計回りで回転することができるフックを介して回転のモーターに付いている長いフィラメントで構成され、移動の手段を提供する細菌表面の細胞小器官である。鞭毛、例えば、ネズミチフス菌の鞭毛は、胃腸管における粘膜層を通り抜ける運動性を媒介する能力により、走化性に、そして経口経路を介して感染を確立するために重要である。鞭毛は、インビトロでの腫瘍類円柱（ｔｕｍｏｒ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｓ）への走化性およびそのコロニー形成に必要であることが実証されており（例えば、Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209を参照）運動性は、腫瘍浸透に重要であることが示されているが（例えば、Toley and Forbes (2012) Integr. Biol. (Camb) 4(2):165-176を参照）、鞭毛は、細菌が静脈内に投与される場合、動物における腫瘍コロニー形成には必要ではない（例えば、Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456を参照）。各鞭毛フィラメントは、何万ものフラゲリンサブユニットで構成される。ネズミチフス菌染色体は、ｆｌｉＣとｆｌｊＢの２つの遺伝子を含有し、これらは、抗原的に異なるフラゲリン単量体をコードする。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの欠損突然変異体は、経口感染経路を介して投与された場合には非運動性かつ非病原性であるが、非経口的に投与された場合には病原性を維持する。
フラゲリンは、サルモネラ属の主要な炎症促進性決定因子であり（例えば、Zeng et al. (2003) J. Immunol. 171:3668-3674を参照）、細胞表面のＴＬＲ５によって、そして細胞質ゾル中のＮＬＣＲ４によって直接的に認識される（例えば、Lightfield et al. (2008) Nat. Immunol. 9(10):1171-1178を参照）。両経路とも、炎症促進性応答をもたらし、その結果、ＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－６を含めたサイトカインの分泌が起こる。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢによってコードされているフラゲリンより大きな炎症を誘導するビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）のフラゲリンＢを分泌するように細菌を操作することによりフラゲリンに対する炎症促進性応答を増大させることによって、サルモネラベースのがん免疫治療をより強力にする試みがなされている（例えば、Zheng et al. (2017) Sci. Transl. Med. 9(376):eaak9537を参照）。
本明細書において、ネズミチフス菌などのサルモネラ属細菌は、フラゲリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠き、ＴＬＲ５媒介炎症促進性シグナル伝達を低減するように操作されている。同様にして、鞭毛を含有する他の細菌を、鞭毛をなくすように、またサルモネラ属の例示された改変と実質的に同じ効果を有する他の改変を含むように操作することができる。例えば、本明細書に示されるように、ＴＮＦ－アルファ誘導の低減をもたらす、ｍｓｂＢおよび／またはｐａｇＰの欠失があるサルモネラ属株が、サルモネラ属においてｆｌｉＣおよびｆｌｊＢノックアウトにより達成され得る、鞭毛の削除と組み合わせられる。これは、他の効果の中でもＴＮＦ－アルファ誘導の低減とＴＬＲ５認識の低減とを併せ持つサルモネラ属株をもたらす。これらの細菌改変、すなわちｍｓｂＢ－、ｐａｇＰ－、ｆｌｉＣ－、およびｆｌｊＢ－を、免疫調節性タンパク質などの治療用産物をコードする、ＣｐＧを含有していてもよい免疫刺激プラスミドおよび産物の組合せと組み合わせることができる。生じる細菌は、炎症促進性シグナル伝達が低減しているが、頑健な抗腫瘍活性を有する。これらのゲノム改変は、本明細書にも記載されている他のゲノム改変と同様に組み合わせることができる。ワクチンの場合、コードされている産物は、免疫防御的または治療的な応答が意図される抗原およびタンパク質を含み得る。
例えば、本明細書で例示され、提供されるように、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの二重突然変異体は、ネズミチフス菌のａｓｄ欠失株であるＶＮＰ２０００９で構築した。ＶＮＰ２０００９は、ｐｕｒＩ／ｐｕｒＭの破壊により病原性について弱毒化されており、野生型リピドＡより毒素産生性が低いリピドＡサブユニットの産生をもたらすｍｓｂＢ遺伝子の改変（部分的な欠失）を含有する。これは、マウスモデルにおいて、静脈内投与の後、野生型リピドＡを有する株と比較して低減したＴＮＦ－α産生をもたらす。生じる株は、ＴＬＲ２／４シグナル伝達を低減するリピドＡの改変ならびにＴＬＲ５認識およびインフラマソーム誘導を低減するフラゲリンサブユニットの発現の欠失によって、細菌性炎症について弱毒化されている株の例である。
ネズミチフス菌などのサルモネラ属種を含めた特定の細菌種の病態形成には、サルモネラ病原島（ＳＰＩ）と称する一群の遺伝子が関与している。サルモネラ属は、宿主細胞の細胞質ゾルにエフェクタータンパク質を直接的に注入する針状構造を形成する、サルモネラ病原島１（ＳＰＩ－１）によってコードされている３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）を用いて、非貪食性腸上皮細胞に侵入する。これらのエフェクタータンパク質は、真核細胞細胞骨格の再編成を引き起こして、腸上皮の侵入を容易にし、炎症促進性サイトカインも誘導する。ＳＰＩ－１と称されるＳＰＩは、上皮細胞への侵入を媒介する。ＳＰＩ－１遺伝子は、限定されるものではないが、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰを含む。これらの遺伝子の１つまたは複数の欠失は、細菌が上皮細胞を感染する能力を低減するか、または無くすが、細菌が、貪食免疫細胞を含めた貪食細胞を感染させるか、またはそれらに侵入する能力には影響を及ぼさない。例えば、ｆｌｉＣ遺伝子とｆｌｊＢ遺伝子の両方の欠失は、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＦ、およびｓｏｐＢなどのＳＰＩ－１遺伝子の発現を有意に低減し、それによって非貪食細胞に侵入する能力を低減したことが実証された（例えば、Elhadad et al. (2015) Infect. Immun. 83(9):3355-3368を参照）。
サルモネラ属などの細菌では、ＳＰＩ－１ ３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）に加えて、フラゲリンが、マクロファージでパイロトーシスを誘発するのに必要であり、マクロファージＮＬＲＣ４インフラマソームによって検出される可能性がある。フラゲリンサブユニットの除去は、マクロファージのパイロトーシスを低減する。例えば、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの欠失を有するネズミチフス菌は、野生型株に比べて、ＩＬ－１β分泌が有意に低減しているが、細菌の細胞取り込みおよび細胞内複製は影響を受けないままである。これは、フラゲリンが、インフラマソーム活性化で有意な役割を果たしていることを示している。加えて、ｆｌｉＣを構成的に発現するように操作されたネズミチフス菌株は、マクロファージパイロトーシスを誘導することが見出された（例えば、Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447；Fink and Cookson (2007) Cellular Microbiology 9(11):2562-2570；およびWinter et al. (2015) Infect. Immun. 83(4):1546-1555を参照）。
本明細書における免疫刺激細菌のゲノムは、ネズミチフス菌におけるフラゲリン遺伝子ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠失させるか、突然変異させ、マクロファージなどの腫瘍常在性免疫細胞の細胞死の低減をもたらし、免疫刺激細菌の抗腫瘍免疫応答を増強するように改変されていてもよい。
ＬＰＳの改変と合わせて、フラゲリンサブユニットの欠失は、宿主における忍容性の増大を可能にし、取り込みを貪食細胞のみに限定し、それらのパイロトーシス細胞死を低減し、免疫刺激性応答を、ＴＭＥ、特に腫瘍常在性骨髄性細胞への免疫調節性タンパク質などの治療用産物のデリバリーへと方向付ける。生じる免疫刺激細菌は、抗腫瘍応答を誘発し、腫瘍に対する適応免疫応答を促進する。
他の細菌種でフラゲリンをコードする対応する遺伝子も類似した結果を達成するように欠失させることができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌で鞭毛フィラメント構造タンパク質をコードするｆｌｉＣ、および鞭毛基底小体タンパク質ＦｌｉＥをコードするｆｌｉＥ；Ｓ．チフィでフラゲリンをコードするｆｌｉＣ、および鞭毛基底小体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードするｆｌｇＢ；Ｌ．モノサイトゲネスでフラゲリンをコードするｆｌａＡ、鞭毛フック基盤体タンパク質ＦｌｉＥをコードするｆｌｉＥ、および鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードするｆｌｇＢ；ならびにクロストリジウム・ノービイでフラゲリンをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５、鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０（ｆｌｇＢ）、鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＣをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５（ｆｌｇＣ）、ならびに鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＧをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５（ｆｌｇＧ）を含む。
５．適応免疫を促進し、Ｔ細胞機能を増強する細菌操作
Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）欠失／破壊
Ｌ－アスパラギナーゼＩＩは、Ｌ型アスパラギンからアンモニアおよびアスパラギン酸への変換を触媒する酵素である。大腸菌およびネズミチフス菌などのいくつかの細菌株は、フルクトース－アスパラギンを炭素および窒素源として捕捉するのにＬ－アスパラギナーゼを利用する（例えば、Sabag-Daigle et al. (2018) Appl. Environ. Microbiol. 84(5):e01957-17を参照）。急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるものなど、悪性Ｔ細胞は、アスパラギンを合成する酵素をそれらが失っているので、アスパラギンを必要とする。Ｌ－アスパラギナーゼの投与は、１９７０年代初期以降、ＡＬＬのためのフロントライン治療とされてきた（例えば、Batool et al. (2016) Appl. Biochem. Biotechnol. 178(5):900-923を参照）。ネズミチフス菌によるＬ－アスパラギナーゼＩＩの産生は、それが直接的にＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の下方制御を誘導し、Ｔ細胞サイトカイン産生を低減し、腫瘍細胞溶解機能を阻害するので、Ｔ細胞抑制に必要かつ十分である（例えば、Kullas et al. (2012) Cell Host Microbe 12(6)791-798；およびvan der Velden et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(49):17769-17774を参照）。腫瘍微小環境におけるＴ細胞活性化中に生じるものなど、急速なクローン増殖条件下では、アスパラギンが必要とされ、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩによるその枯渇は、Ｔ細胞抑制をもたらす。したがって、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩは、Ｔ細胞抑制が治療のモダリティーであるがんの抗がん治療薬として用いられてきた。
抗がん治療薬としてのＬ－アスパラギナーゼの先行使用とは対照的に、本明細書で提供する免疫刺激細菌における、ならびに他の免疫刺激細菌および肺炎（ＴＢ）および他の疾患に対するワクチン接種で使用するためのＢＣＧワクチンなどの細菌ワクチンにおけるＬ－アスパラギナーゼ活性の除去は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を増強することが本明細書で示される。Ｌ－アスパラギナーゼ活性の除去は、活性酵素の発現をなくすように細菌ゲノムを改変することによって引き起こすことができる。改変には、生じるコードされている酵素が活性でないか、または発現されないか、またはなくなっているような、核酸の挿入、欠失、置換、および他の変化が含まれる。免疫刺激細菌におけるコードされている酵素の発現をなくすような、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子ａｎｓＢのすべてもしくは一部の欠失またはその破壊は、細菌によってコロニー形成された腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を増強することが本明細書で示される。Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ活性の阻害は、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩがそれにより産生されないような、免疫刺激細菌内のａｎｓＢ遺伝子のすべてまたは一部の欠失または中断／破壊によって達成される。したがって、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩが産生されないようにそのゲノムが改変されている免疫刺激細菌が提供される。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍常在性免疫細胞にコロニー形成して、抗腫瘍免疫応答を増強するために使用され、このような細菌ゲノム改変には、欠失、挿入、破壊、および／またはＬ－アスパラギナーゼＩＩの発現をなくす他の改変が含まれる。
本明細書で示すように、本明細書における免疫刺激細菌のゲノムは、ａｎｓＢを欠失させるか、もしくはそれを破壊するか、もしくはそれを別途に改変するか、またはコードされているＬ－アスパラギナーゼＩＩを不活性にするか、またはアスパラギナーゼをなくし、その結果、インビボでＴ細胞抑制を妨げ、抗腫瘍Ｔ細胞機能を増強するように改変することができる。ａｎｓＢが無傷である株は、その株と共局在しているＴ細胞における著明なＴ細胞免疫抑制を誘導することが本明細書で示される。ａｎｓＢが欠失している株は、免疫抑制を誘導せず、したがって、コードされている治療用産物を腫瘍にデリバリーするために細菌を用いる際の、当技術分野における別の問題を解決する。したがって、機能的なコードされた酵素がそれにより発現されないａｎｓＢ遺伝子の欠失または破壊と、腫瘍微小環境中および／または腫瘍常在性免疫細胞中の蓄積の増大をもたらす本明細書に記載の他の改変とを組み合わせた免疫刺激細菌は、優れた治療用免疫刺激細菌を提供する。
他の細菌種でＬ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）の相同体またはオルソログをコードする対応する遺伝子も、類似した結果を達成するように欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でＬ－アスパラギナーゼ２をコードするａｎｓＢ；Ｓ．チフィでＬ－アスパラギナーゼをコードするａｎｓＢ（ＳＴＹ３２５９）；Ｌ．モノサイトゲネスでアスパラギンシンセターゼをコードするａｎｓＢ（ｌｍｏ１６６３）；およびビフィドバクテリウム・ロンガムでＬ－アスパラギナーゼ前駆体をコードするＢＬ１１４２を含む。
６．ｃｕｒｌｉ線毛産生に必要とされるサルモネラ属遺伝子の欠失／破壊
細菌および真菌は、バイオフィルムと呼ばれる多細胞構造を形成することができる。細菌のバイオフィルムは、集合的に細胞外ポリマー物質として知られている分泌型および細胞壁結合型の多糖、糖タンパク質、および糖脂質、ならびに細胞外ＤＮＡの混合物中に包まれている。これらの細胞外高分子物質は、複数の侵襲、例えば洗浄剤、抗生物質、および抗菌性ペプチドなどから細菌を保護する。細菌のバイオフィルムは、表面のコロニー形成を可能にし、義装具、例えば注入ポートおよびカテーテルなどの重大な感染の原因である。バイオフィルムは、組織中にも、感染の過程で形成することがあり、それにより、細菌の持続期間および排出期間が増大し、抗生物質療法の実効性が限定される。バイオフィルム中の細菌の慢性的持続は、例えば胆嚢のＳ．チフィ感染における腫瘍発生の増大と関連している（例えば、Di Domenico et al. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887を参照）。
ｃｓｇＤ欠失
ネズミチフス菌などのサルモネラ属において、バイオフィルム形成は、ｃｓｇＤ遺伝子によって調節されており、ｃｓｇＤは、ｃｓｇＢＡＣオペロンを活性化し、ｃｕｒｌｉ線毛サブユニットＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの産生を増大させる（例えば、Zakikhany et al. (2010) Molecular Microbiology 77(3):771-786を参照）。ＣｓｇＡは、ＴＬＲ２によりＰＡＭＰとして認識され、ヒトマクロファージからのＩＬ－８の産生を誘導する（例えば、Tukel et al. (2005) Molecular Microbiology 58(1):289-304を参照）。また、ｃｓｇＤは、ジグアニル酸シクラーゼをコードするａｄｒＡ遺伝子を活性化することによりセルロース産生を間接的に増大させる。ａｄｒＡによって生成される小分子である環状ジグアノシン一リン酸（ｃ－ジ－ＧＭＰ）は、ほとんどすべての細菌種に存在する遍在的な二次メッセンジャーである。ｃ－ジ－ＧＭＰの増加は、セルロースシンターゼ遺伝子ｂｃｓＡの発現を増強し、これが次に、ｂｃｓＡＢＺＣおよびｂｃｓＥＦＧオペロンの刺激を介して、セルロース産生を増大させ、セルロースバイオフィルム形成をもたらす。その結果、ネズミチフス菌などの細菌は、宿主免疫細胞による食作用からの保護として固形腫瘍中でバイオフィルムを形成することができる。バイオフィルムを形成することができない、サルモネラ属突然変異体などの細菌突然変異体は、宿主貪食細胞によって、より急速に取り入れられ、より容易に感染腫瘍から排除される（例えば、Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233を参照）。貪食細胞内の細胞内局在のこの増大は、細胞外細菌の持続を低減することができ、本明細書に示するように、本明細書に記載の免疫調節性タンパク質および他の抗がん治療薬などの治療用産物のプラスミドデリバリーの実効性を増強することができる。ネズミチフス菌などの免疫刺激細菌がバイオフィルムを形成する能力の低減は、例えば、ｃｓｇＤ、ｃｓｇＡ、ｃｓｇＢ、ａｄｒＡ、ｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＺ、ｂｃｓＥ、ｂｃｓＦ、ｂｃｓＧ、ｄｓｂＡ、またはｄｓｂＢなど、バイオフィルム形成に関与する遺伝子の欠失または破壊を介して達成することができる（例えば、Anwar et al. (2014) PLoS ONE 9(8):e106095を参照）。
バイオフィルム形成を低減するように免疫刺激細菌を操作すると、腫瘍／組織からの排除率が増大し、それにより療法の忍容性が増大し、患者における義装具のコロニー形成が防止され、それによって、これらの株の治療効果が増大することが本明細書で示される。アデノシンミメティックは、ネズミチフス菌バイオフィルム形成を阻害することが知られており、これは、腫瘍微小環境中の高アデノシン濃度が、腫瘍関連のバイオフィルム形成に貢献し得ることを示している（例えば、Koopman et al. (2015) Antimicrob. Agents Chemother. 59:76-84を参照）。ｃｓｇＤ欠失免疫刺激細菌株は、腫瘍常在性骨髄性細胞内への細菌の取り込みが増大しているため、改善された抗腫瘍有効性を示すことが本明細書で示される。同様なゲノム改変は、大腸菌およびリステリア属などの他の細菌株においても行うことができ、このゲノム改変は、バイオフィルム形成および／またはｃｕｒｌｉ線毛産生を変更し、それにより、細菌は、腫瘍および腫瘍微小環境中に存在する血管系に良好に浸潤することができる。
他の細菌種における、ｃｓｇＤの相同体およびオルソログをコードする対応する遺伝子、ならびにｃｕｒｌｉ線毛およびバイオフィルム形成に必要とされる他の遺伝子も、類似した結果を達成するように欠失させるか、破壊するか、別途に改変することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でＤＮＡ結合転写二重調節因子ＣｓｇＤをコードするｃｓｇＤ；Ｓ．チフィで調節タンパク質ＣｓｇＤをコードするｃｓｇＤ（ＳＴＹ１１７９）；およびＬ．モノサイトゲネスで、バイオフィルム形成に関与するリステリア属セルロース結合タンパク質をコードするｌｃｐを含む。
細菌ゲノムの、例えば、細菌をｃｓｇＤ－にする遺伝子欠失または破壊による改変は、ｃｕｒｌｉ線毛および炎症性環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の１つまたは複数をなくすなどの変化をもたらし、セルロース分泌を取り除く。これは、炎症性および免疫抑制エレメントをなくし、リピドＡアシル化の変化を介してＴＬＲ４認識を妨げ、セルロース分泌と、それゆえ、潜在的バイオフィルム形成とをなくし、それによって、安全性および有効性を増大させる。
本明細書に記載のように、アデノシンについて栄養要求性となるように操作され；かつＬＰＳの改変および／またはフラゲリンの欠失により、炎症促進性サイトカインを誘導するそれらの能力が低減しており；かつ／またはＴ細胞機能を改善するようにＬ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず；かつ／またはバイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失または破壊を含有し；かつ／または抗生物質選択なしに、細胞あたりのプラスミドコピー数を、少なくとも低コピー数から中程度コピー数以上の相当数に維持するようにさらに改変されており、かつ治療用産物をコードする遺伝的発現カセットをデリバリーする、細菌株、例えばネズミチフス菌株などは、頑健な抗腫瘍免疫応答を促進する。プラスミドは、腫瘍微小環境中への、コードされている治療用産物の分泌を促進する調節配列を含む。
７．補体に対する抵抗性の改善
補体系は、ヒト宿主内のレクチン経路または代替経路（ＡＰ）カスケードを直接的に活性化する病原体の侵入に対する免疫防御の第一線である。補体系は、自然免疫応答において、細菌、ウイルス感染細胞、および寄生虫などの病原体を認識し、殺滅する機能を果たし、抗体媒介性免疫応答でも一役担う３０種を超える可溶性および細胞膜結合型のタンパク質を含む。補体カスケードの活性化は、外来微生物のオプソニン化および走化性ペプチドの放出をもたらし、最後に細菌細胞膜の破壊をもたらす。補体系（Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５）の３つの相同糖タンパク質が、補体機能における中心役割を果たし、他の補体成分と相互作用する。Ｃ３およびＣ４からそれぞれ生じるＣ３ｂおよびＣ４ｂは、補体カスケードの活性化を促進するコンバターゼの重要な成分である。Ｃ５の切断断片が、感染部位内への貪食細胞の遊走を誘導するＣ５ａ、ならびに膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成および溶菌を開始するＣ５ｂである（例えば、Ramu et al. (2007) FEBS Letters 581:1716-1720を参照）。
生き残るために、病原体は、補体活性化の有害な結果を防ぐ戦略を発達させた。例えば、外膜タンパク質のＡｉｌ／Ｌｏｍファミリーのメンバーは、補足依存的な殺滅からの保護をいくつかの病原細菌に提供する。エルシニア属種、例えば、Ｙ．エンテロコリチカおよびＹ．シュードツベルクローシスのＡｉｌ（付着浸潤遺伝子座）、サルモネラ属種のＲｃｋ（補体殺傷耐性）およびＰａｇＣ、ならびに大腸菌のＯｍｐＸを含めた、Ａｉｌ／Ｌｏｍファミリーのメンバーは、有意なアミノ酸配列類似性および同一性を共有し、類似した膜トポロジーを有する外膜タンパク質である。タンパク質のこのファミリーのメンバーが多様な機能を示す一方、Ｙ．エンテロコリチカおよびＹ．シュードツベルクローシスのＡｉｌ、ならびにＳ．エンテリカのＲｃｋを含めた、それらのうちいくつかは、少なくとも部分的に、細菌を補体媒介溶解から保護する機能を果たす（例えば、Bartra et al. (2008) Infection and Immunity 76:612-622を参照）。
補体を回避または緩和するのを助ける別の細菌産物は、サルモネラ属におけるＰｇｔＥ（外膜セリンプロテアーゼ）と称される表面プロテアーゼ、およびオムプチン（ｏｍｐｔｉｎ）ファミリーの他のメンバーである。Ｓ．エンテリカの表面プロテアーゼＰｇｔＥは、腸内細菌の外膜アスパラギン酸プロテアーゼのオムプチンファミリーに属する。ＰｇｔＥおよび他のオムプチンは、活性であるためにラフ型ＬＰＳを必要とするが、Ｏ抗原による立体阻害を受ける。ｐｇｔＥの発現は、マクロファージ内部におけるサルモネラ属の成長中に上方制御され、マクロファージから放出された細菌は、強いＰｇｔＥ媒介タンパク質分解活性を示す。ＰｇｔＥは、哺乳動物の血漿中酵素前駆体であるプラスミノゲンをタンパク分解性に活性化してプラスミンにし、プラスミンの主な生理的阻害剤であるα２抗プラスミン因子を不活性化し、ヒト細胞の細胞外マトリックスへの細菌接着を媒介する。このように、ＰｇｔＥは細胞外マトリックス成分の分解を媒介して、強力な局在性タンパク質分解活性を生じさせ、これにより、細胞外マトリックスを通り抜けるサルモネラ属の遊走を促進することができる。ＰｇｔＥは、アルファヘリックス抗菌ペプチドも分解し、これは、サルモネラ属の細胞内成長中に重要である可能性がある。エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のオムプチンであるＰｌａは、ＰｇｔＥの近いオルソログであり、ＰｇｔＥと機能を共有している。ＰｌａはＣ３を切断し、ＰｇｔＥは、補体成分Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、およびＣ５を切断することによって、サルモネラ属の血清抵抗性を増大する。ｐｇｔＥ遺伝子および他の細菌種由来のそのオルソログは、補体に対する抵抗性を増大させるための、本明細書における免疫刺激細菌に含めることができる。
ヒト血清中の補体の効果は、げっ歯類モデルで効果的に腫瘍にコロニー形成することが示されていたサルモネラ属ＶＮＰ２０００９株など、治療用免疫刺激細菌の失敗を説明することが本明細書で示される。ＶＮＰ２０００９の全身投与は、マウス腫瘍のコロニー形成をもたらしたが（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；およびBermudes et al. (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:219-33を参照）、ヒト患者におけるＶＮＰ２０００９の全身投与は、ごくわずかなコロニー形成しかもたらさなかった。進行黒色腫患者の第１相研究において、３０分の静脈内注入の後、ヒト腫瘍では、ごくわずかなＶＮＰ２０００９しか検出されなかった（Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:142-52参照）。さらに長い４時間にわたるＶＮＰ２０００９の注入を評価するフォローアップ研究に参加した患者も、腫瘍生検の後に、検出可能なＶＮＰ２０００９の不在を示した（Heimann et al. (2003) J. Immunother. 26:179-180参照）。腫瘍内投与の後、ＶＮＰ２０００９の派生株のコロニー形成が検出された（Nemunaitis et al. (2003) Cancer Gene Ther. 10:737-744参照）。ヒト腫瘍へのＶＮＰ２０００９の直接腫瘍内投与は、はるかに高い腫瘍コロニー形成をもたらした。これは、ヒト腫瘍に高レベルでコロニー形成することができること、およびマウスとヒトの間での腫瘍コロニー形成の相違は、全身投与後にのみ生じることを示している。
野生型ネズミチフス菌で起こることが以前には知られていなかったが、ＶＮＰ２０００９は、ヒト補体によって不活性化され、これが、ＶＮＰ２０００９の全身投与の際にヒトで観察された腫瘍コロニー形成の低さを説明することが本明細書で示され、記載されている。本明細書で提供する株は、補体に対する抵抗性を示す。それらの株は、Ｒｃｋおよび補体抵抗性または補体回避の媒介に関与する他のタンパク質、例えばエルシニア・エンテロコリチカのＡｉｌまたはネズミチフス菌のＰｇｔＥなどを発現するように改変されているか、またはそのようなタンパク質をそれらの株が天然に発現する場合、それらの株が、Ｒｃｋおよび／または他のそのようなタンパク質を過剰発現するように改変されていてもよい。Ｒｃｋは、大腸菌など、相同体が無い細菌に導入してもよい。
Ｒｃｋ発現
Ｒｃｋ（補体殺傷耐性）は、Ｓ．エンテリティディスおよびネズミチフス菌などのサルモネラ属種の大きな病原性プラスミドによってコードされている、上皮細胞への接着および侵入を誘導する１７ｋＤａの外膜タンパク質である。Ｒｃｋタンパク質は、Ｃ９重合およびその後の機能的膜侵襲複合体の構築を阻害することによって、Ｓ．エンテリカを補体から保護することが示されている。ｒｃｋ突然変異体は、野生型株に比べて、２～３倍の上皮細胞侵入の低減を示したが、野生型株でのｒｃｋ過剰発現は侵入の増大をもたらす。Ｒｃｋタンパク質は、受容体介在性の過程、局所的アクチンリモデリングの促進、ならびに弱い接着性および密接な接着性を有する膜伸展（ｗｅａｋ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）により細胞侵入を誘導する。したがって、サルモネラ属は、Ｔ３ＳＳ－１複合体に媒介されるトリガー（Ｔｒｉｇｇｅｒ）メカニズムおよびｒｃｋによって誘導されるジッパー（Ｚｉｐｐｅｒ）メカニズムという２つの異なったメカニズムにより細胞に侵入することができる（例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364を参照）。サルモネラ属病原性プラスミド上のｒｃｋの発現は、膜侵襲複合体の形成を妨げることによって、ヒト補体による中和に対する高レベルの抵抗性を与える。ｒｃｋを含有するネズミチフス菌病原性プラスミドを大腸菌の高度に血清感受性の株で発現させたとき、Ｒｃｋは、補体抵抗性を回復させることができた。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ヒト補体に対する抵抗性をもたらすようにＲｃｋを保持するか、またはＲｃｋが提供されている。大腸菌などの免疫刺激細菌は、細菌内のプラスミド上にｒｃｋをコードして、それによって補体に対する抵抗性をもたらすことによって改変することができることが本明細書で示される。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ｒｃｋを内因的にコードするか、または補体に対する抵抗性を増大するためにそれをコードするように改変することができる。補体に対する抵抗性を与えるための方法も提供される。例えば、米国特許出願公開第２０１８／０３２５９６３号および第２０１８／０２７３９５６号、ならびに米国特許第９，８８９，１６４号および第９，６８８，９６７号に記載の治療用大腸菌種を、その中の細菌を改変することによって、例えば、その中のプラスミド上にサルモネラ属ｒｃｋ遺伝子をコードする核酸を導入して、それによって補体に対する抵抗性を改善または提供することによって、改善することができる。補体に対して抵抗性である細菌を全身投与することができ、治療上有効であるのに十分な細菌が生き残ることができる。
サルモネラ属ｒｃｋ遺伝子をコードする核酸を、治療用大腸菌などの細菌に導入して、それによって補体抵抗性を与えるか、または増大させる。
同様に、他の細菌種由来の、ｒｃｋの他のオルソログおよび相同体を、免疫刺激細菌内で発現させることができる。例えば、Ａｉｌは、エルシニア・エンテロコリチカ由来のＲｃｋ相同体であり、これは、異種発現下で補体抵抗性を増強する。ＰｇｔＥは、異種発現下で補体抵抗性を増強することが同じく示されている、ネズミチフス菌の表面プロテアーゼである。
８．サルモネラ属および他のグラム陰性細菌におけるリポタンパク質発現に必要とされる遺伝子の欠失
ＬＰＳおよびブラウン（ムレイン）リポタンパク質（Ｌｐｐ）は、炎症および免疫応答の強力な刺激物質として機能する、グラム陰性腸内細菌の外膜の主要構成成分である。ブラウン（ムレイン）リポタンパク質（Ｌｐｐ）は、ネズミチフス菌の外膜で最も豊富な成分の１つであり、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－６、およびＩＬ－８（ヒト）などのＴＬＲ２誘導をもたらす。サルモネラ属の細菌染色体上に位置する、リポタンパク質遺伝子の２つの機能的コピー［ｌｐｐＡ（配列番号３８７）およびｌｐｐＢ（配列番号３８８）］が細菌の病原性に寄与する。ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子の欠失、ならびにリポタンパク質発現の除去は、病原性を低減し、炎症促進性サイトカイン産生を低減する（例えば、Sha et al. (2004) Infect. Immun. 72(7):3987-4003；およびFadl et al. (2005) Infect. Immun. 73(2):1081-1096を参照）。Ｌｐｐ遺伝子の欠失は、細胞の感染を低減し、それゆえ、コードされている治療用産物またはタンパク質のプラスミドデリバリーおよび発現を低減することが予測されるだろう。しかし、下記の実施例１８に示すように、これらの遺伝子の欠失が腫瘍コロニー形成を低減する一方、標的とされた細胞、すなわち、腫瘍常在性免疫細胞、特にマクロファージにデリバリーされるプラスミドの量は有意に増大した。したがって、これらの遺伝子（ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ）の欠失または破壊は、本明細書で示されるように、感染マクロファージ内で生き残る能力がないことにより、病原性の低減をもたらしたが、免疫刺激細菌のプラスミドデリバリーの増大をもたらし、それによって、標的とされた細胞、すなわち、腫瘍常在性免疫細胞、特にマクロファージにおいて、コードされた治療用遺伝子の発現を増大させた。
本明細書に提供される株は、ΔＦＬＧ（鞭毛を失っている）であり、かつ／またはΔｐａｇＰであり、かつ／またはΔａｎｓＢであり、かつ／またはΔｃｓｇＤである。さらに、これらの株は、ΔｐｕｒＩ（ΔｐｕｒＭ）、ΔｍｓｂＢ、およびΔａｓｄ（細菌ゲノム中で）のうちの１つまたは複数である。例示的な株は、ΔｐｕｒＩ（ΔｐｕｒＭ）、ΔｍｓｂＢ、ΔｐａｇＰ、ΔａｎｓＢ、Δａｓｄ、またはΔａｓｄに代えてΔＴｈｙＡである。株は、ｌｐｐＡ－および／またはｌｐｐＢ－、特にｌｐｐＡ－／ｌｐｐＢ－でもよい。プラスミドは、宿主に認識されるプロモーター（例えば、真核生物プロモーター、例えば、真核生物に由来するもの、および動物ウイルスに由来するものを含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター）。の制御下に治療用産物をコードするように改変されている。プラスミドは、本明細書のどこかに記載のように、インビボでの細菌複製を可能にするようにａｓｄをコードすることができ、他の有益な機能を有する核酸（ＣｐＧなど）をコードすることができ、遺伝子産物をコードすることができる。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、例えば鞭毛を無くすことによって、上皮細胞を感染させる能力を無くすように改変することができる。本明細書のどこかに記載のように、上皮細胞を感染させる能力を無くすことは、ＳＰＩ－１経路に関与する１つまたは複数の遺伝子の不活性化またはノックアウトを介して、ＳＰＩ－１依存的な侵入を不活性化することによって達成することもできる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰの１つまたは複数を含む。追加または代替として、免疫刺激細菌は、ｆｌｊＢ、ｆｌｉＣ、ｒｃｋ、ｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢ、およびｓｒｇＣ遺伝子のうちの１つまたは複数などの、ＳＰＩ－１に依存しない感染／侵入に関与する産物を不活性化する遺伝子ノックアウトまたは欠失を含有することができ、かつ／または免疫刺激細菌は、ｆｌｊＢ、ｆｌｉＣ、ｐｒｇＩ（針タンパク質）、およびｐｒｇＪ（ロッドタンパク質）を含めた、インフラマソームによって直接的に認識されるタンパク質をコードする遺伝子など、腫瘍常在性免疫細胞の細胞死を誘導する遺伝子の産物を不活性化するノックアウトまたは欠失を含有することができる。ｒｃｋ遺伝子は、それが細菌を補体による不活性化に対して防御するために、望ましい。ｒｃｋを内因的にコードしていない細菌を、異種ｒｃｋ遺伝子をコードするように改変することができる。
免疫刺激細菌は、適した細菌株に由来する。細菌株は、弱毒化株、または標準的な方法によって弱毒化されているか、または本明細書で提供する改変のおかげで、それらがコロニー形成する能力が、主に免疫特権が与えられている組織および器官、特に、固形腫瘍を含めた、腫瘍常在性免疫細胞、ＴＭＥ、および腫瘍細胞に限定されているという点で弱毒化されている菌株であってもよい。細菌は、限定されるものではないが、例えば、サルモネラ属、シゲラ属、リステリア属、大腸菌、およびビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）の株を含む。例えば、菌種は、シゲラ・ソネイ、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィ、ネズミチフス菌、サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびサルモネラ・エンテリティディスを含む。他の適した細菌種は、リケッチア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、エロモナス属、フランシセラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ菌、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、ビブリオ属、バチルス属、およびエリシペロスリクス属を含む。例えば、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹チフスリケッチア、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、エロモナス・ユークレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、ヒツジ偽結核菌、シトロバクター・フロインデイ、クラミジア・ニューモニエ、ヘモフィルス・ソムナス、ブルセラ・アボルタス、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・エルジノーサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブチリス、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ロシャリメア・クインターナ、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）。
本明細書で提供する免疫刺激細菌の例には、サルモネラ属の菌種がある。本明細書に記載の改変のための細菌の例には、サルモネラ属の野生型株、例えば、受託＃１４０２８としてアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されている菌株の特定する特徴のすべてを有する株などがある。ＹＳ１６４６株（ＡＴＣＣカタログ＃２０２１６５、ＶＮＰ２０００９とも称する：国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９９／１３０５３号も参照）など、ネズミチフス菌の操作された株は、ａｓｄ遺伝子ノックアウトを補完し、かつ抗生物質のないプラスミド維持を可能にするプラスミドで操作されている。次いで、株は、フラゲリン遺伝子を欠失させ、かつ／またはｐａｇＰを欠失させるように改変されている。鞭毛ノックアウトおよびｐａｇＰ欠失の組合せは、株を、ヒト血清補体に対して高度に抵抗性にする。株はまた、プリン、特にアデノシンについて栄養要求性にされており、ａｓｄ－かつｍｓｂＢ－である。例示されているように、ｐｕｒＩおよびｍｓｂＢを完全に欠失している株は、ＶＮＰ２０００９株より適合度が高く（例えば、速く成長する）、ＶＮＰ２０００９株では、これらの遺伝子が欠失しておらず、発現をなくすように改変されている。真核生物宿主内のインビボ複製用に、ａｓｄ遺伝子をプラスミド上に提供することができる。株は、それらの株が免疫抑制性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを産生するのを妨げ、腫瘍Ｔ細胞機能を改善する、ａｎｓＢ遺伝子内の改変、例えば、欠失、破壊、または他の改変なども有する。株は、例えばｃｓｇＤ欠失によって、バイオフィルム産生をなくすようにも改変されており、これにより、それらの株は、ｃｕｒｌｉ線毛、セルロース、およびｃ－ジ－ＧＭＰを産生することができなくなっており、その結果、望ましくない炎症反応が低減され、それらの株のバイオフィルム形成が妨げられている。
これらのゲノム欠失およびプラスミドは、本明細書のどこかに記載および例示されている。本明細書にどこかに記載され、かつ／または当業者に知られている免疫刺激タンパク質および他の産物などの治療用産物をコードする核酸ならばどれでも、プラスミド上に含めることができる。本明細書のどこかに記載のように、プラスミドは、一般に、低コピー数から中程度コピー数で存在する。治療用産物には、Ｉ型ＩＦＮ発現を構成的に誘起／誘導することができる細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの機能獲得型突然変異体、ならびに腫瘍微小環境中で抗腫瘍免疫応答を促進する他の免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子など、ならびに本明細書に記載されている他のそのような産物が含まれる。プラスミドは、免疫チェックポイントおよび他のがん標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、およびＴＧＦ－βなど、ならびに他の分子、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、またはＢｉＴＥｓ（登録商標）などを標的とする抗体およびその断片、例えば、単鎖抗体もコードすることができる。プラスミドは、ＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦベータ結合性デコイ受容体、およびＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニストもコードすることができる。
９．抗腫瘍療法用にゲノムが最適化されており、それらの複数を含む治療用産物をコードする頑健な免疫刺激細菌
本明細書に記載のように、栄養要求性アデノシンであるように操作されており、かつＬＰＳの改変および／またはフラゲリンの欠失により、それらが炎症促進性サイトカインを誘導する能力が低減しており、かつ／またはＬ－アスパラギナーゼＩＩ発現の欠失または除去によりＴ細胞機能を改善するように改変されており、かつ／またはバイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失または破壊により改変されており、かつ／またはｒｃｋ発現の増大により増強されたヒト血清中生存を示す細菌株、例えばネズミチフス菌株などは、免疫調節性タンパク質などの治療用産物をデリバリーし、頑健な抗腫瘍免疫応答を促進するようにさらに改変されている。
下の表は、サルモネラ属遺伝子を参照して、他の細菌種で対応する遺伝子が改変され得ることを理解した上で、細菌の遺伝子型／改変、それらの機能効果、および本明細書で達成される効果／利点のいくつかの概要を示す。
１０．真核生物宿主における発現のための、ｍＲＮＡおよび他の形態のＲＮＡを含むＲＮＡを送達するワクチンおよび細菌
ＲＮＡのデリバリー媒体としての免疫刺激細菌
提供されるのは、コードされている異種ＲＮＡを含有するか、またはコードされている異種ＲＮＡを発現する免疫刺激細菌であり、この細菌は真核生物宿主細胞に感染して、コードされているＲＮＡを宿主細胞の細胞質中に放出する（例えば、米国特許第７，３９０，６４６号を参照されたい）。ＲＮＡは治療用産物であり得るか、またはＲＮＡは、宿主細胞機構によって治療用産物に翻訳される。そのような産物には、Ｔ細胞応答、メモリＴ細胞、抗体などの免疫応答を誘導するための提示のための食細胞などの細胞内で発現することができる免疫刺激タンパク質および病原体由来抗原ならびに／または腫瘍抗原由来の抗原が含まれる。免疫化のために、細菌は、部位に、または病原体の天然に存在する経路と同じ経路を介して投与されることができ、例えば、呼吸器ウイルスに対しては吸入もしくは鼻腔投与で、胃腸病原体に対しては経口投与で、ウイルスに対しては筋内投与で、また全身経路で投与される。これは、長期間続く免疫を提供することができるインサイチュ免疫応答をもたらし得る。
本明細書に提供される免疫刺激細菌のいずれも、細菌が、インビトロ細胞培養中などのインビトロで、または細菌細胞の宿主真核生物細胞中への侵入後に、またはインビトロ細胞培養中と細菌細胞の宿主真核生物細胞中への侵入後の両方で、細菌細胞内の外来性もしくは異種ＲＮＡを産生するように、改変され得る。真核生物宿主細胞への感染後に、細菌は外来性ＲＮＡを宿主細胞の細胞質中に放出する。ＲＮＡは、細菌のプラスミド上でコードされていることができ、複数の治療用産物をコードすることができる。特に、送達されるＲＮＡの形態は、真核生物細胞の機構によって翻訳され得るあらゆるものである。これには、ｍＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｅＲＮＡ；米国特許第１０，９５３，０３３号を参照されたい）が含まれる。
提供されるのは、コードされている異種ＲＮＡを含有し、それを発現する免疫刺激細菌およびゲノム改変細菌であり、細菌が真核生物宿主細胞に感染するとき、ｍＲＮＡなどのコードされているＲＮＡは、宿主細胞の細胞質中に放出される。細菌は、本明細書に提供される免疫刺激細菌のいずれか、特に、それらが低減されたＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５シグナル伝達を有するようなゲノム改変を含むものを含む。細菌はまた、治療用産物または複数のそれらをコードすることができ、特に、サイトカインと、ＲＮＡがワクチン接種のための、または免疫刺激が有利である処置のための抗原もしくはタンパク質をコードしている場合にアジュバントとして作用し得る、本明細書に提供される改変ＳＴＩＮＧタンパク質を含むＳＴＩＮＧタンパク質が含まれる免疫刺激タンパク質をコードすることができる。
そのＲＮＡをコードする核酸は、それが細菌中で転写されるが、翻訳されないように改変される。これは、転写されたＲＮＡ産物が原核生物リボソームによって認識されないか、または翻訳されることができないように、核酸を設計することによって行うことができる。コードしている核酸は、転写物が、ヒトなどの宿主中に存在するものなどの真核生物リボソームによって認識され、かつ翻訳されるようにさらに設計される。これは、例えば、原核生物リボソームによっては認識されないが、真核生物リボソームによっては認識される配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸を含めることによって行うことができる。コードされているＲＮＡは、典型的にはｍＲＮＡであるが、治療用産物または免疫化抗原もしくはタンパク質に翻訳され得るＲＮＡの他の形態であってもよい。ＲＮＡの他の形態としては、環状ＲＮＡであるｅＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。ｅＲＮＡは、（ａ）抗原などのポリペプチドをコードする発現配列を含有し、（ｂ）原核生物リボソームによって認識されない配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および終結エレメントを含有し、（ｃ）ポリＡ配列、遊離３’末端、およびＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフを欠いている環状ポリリボヌクレオチドである（例えば、そのような環状ＲＮＡを記載する米国特許第１０，９５３，０３３号を参照されたい）。細菌は、転写されたＲＮＡがインビボで環化されるように改変される。
ＲＮＡは治療用産物であり得るか、またはＲＮＡは、宿主細胞機構によって治療用産物に翻訳される。ＲＮＡは、抗原をコードすることができ、それによって、宿主細胞中に送達されると、タンパク質にコードされ、抗原に対して、およびその抗原が由来する病原体または腫瘍に対して、宿主を免疫化する。核酸は、例えば、抗体および他の適応免疫応答が向けられる抗原の立体構造を安定化することによって、コードされている抗原が改変されて、免疫化のためのその特性を改善するように改変することができる。これは、例えば、コロナウイルス上のスパイクタンパク質に対して行われており、これにより、宿主細胞に結合する立体構造が安定化され、より頑健な抗体応答をもたらす。
本明細書に提供される免疫刺激細菌のいずれも、細菌が、インビトロ細胞培養中などのインビトロで、または細菌細胞の宿主真核生物細胞中への侵入後に、またはインビトロ細胞培養中と細菌細胞の宿主真核生物細胞中への侵入後の両方で、細菌細胞内の外来性もしくは異種ＲＮＡを産生するように、改変され得る。真核生物宿主細胞への感染後に、細菌は外来性ＲＮＡを宿主細胞の細胞質中に放出する。ＲＮＡは、細菌のプラスミド上でコードされていることができ、複数の治療用産物をコードし得る。
そのＲＮＡをコードする核酸は、細菌によって認識されるプロモーターに作用可能に連結されているか、または細菌は、細菌プロモーター、またはファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるバクテリオファージプロモーターなどのプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼをコードするように改変されている。ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり得るか、または真核生物宿主細胞中の発現のための調節配列を含有する他のＲＮＡ分子であり得る。プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。細菌は、コードされているＲＮＡの複数のコピーを含有することができ、これらは、ヒトなどの真核生物宿主中に導入されると、宿主細胞細胞質中に放出され、それがｍＲＮＡである場合、それは翻訳され得る。細菌の転写は、細菌の翻訳から切り離されており、それにより、遺伝子産物は転写されるが、翻訳されない。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ配列を含むよりはむしろ、ＲＮＡをコードする核酸は、開始コドンの上流のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）（ＳＤ）配列を失っており、これによって、ＲＮＡは細菌または古細菌リボソームによって翻訳され得ないが、真核生物リボソームによって翻訳され得る。ＲＮＡは、真核生物リボソームによって認識される開始コドンとともに、Ｋｏｚａｋ配列などの配列を含有することができる。シャイン・ダルガノ配列は、例えば、配列番号３８９～３９２を含む：
（例えば、parts.igem.org/File:RBSAlignedSpacing.pngを参照されたい）。ＲＮＡはまた、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有することができ、これは、原核生物リボソームによる翻訳をブロックまたは阻害する。したがって、ＲＮＡは、骨髄性細胞に感染するか、または感染している細菌中で産生され、それにより、ＲＮＡが骨髄性細胞に送達され、それがｍＲＮＡである場合、骨髄性細胞中で翻訳され、骨髄性細胞は、シャイン・ダルガノ配列、またはＩＲＥＳ、または他のそのような調節配列により、翻訳のためにＲＮＡを認識する。例えば、プロモーターと遺伝子配列との間にＩＲＥＳを挿入することで、転写が翻訳から切り離される。したがって、免疫刺激細菌は、ＲＮＡデリバリーシステムとして機能する。
複数の実施形態では、本明細書に提供される免疫刺激細菌などの細菌系は、遺伝的ペイロードを組織常在性および／または腫瘍常在性骨髄性細胞に送達するために使用される。これに関して、細菌はインビボで投与され、細菌は例えば、ａｓｄ－であり、補完ａｓｄ遺伝子カセットを含有するプラスミドを含まないため、それにより、それらは、インビボで複製することができない。細菌を増殖させるために、それらはインビトロで培養され、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）が培養培地に添加されて、機能ａｓｄ遺伝子の不在下での細菌複製を容易にする。これに関して、そのような免疫刺激細菌が投与されるとき、一度に比較的多量の核酸が組織常在性または腫瘍常在性骨髄性細胞に送達される。細菌のファゴサイトーシスおよび細胞内破壊後に、治療用産物（複数可）をコードするＲＮＡが、翻訳のために骨髄性細胞の細胞質中に放出され、治療用産物（複数可）を産生し、これらが骨髄性細胞から、感染細胞が腫瘍常在性骨髄細胞であるとき、腫瘍微小環境などの周囲の環境に分泌される。
インビトロで培養された細菌はＲＮＡをコードするが、ＲＮＡを翻訳するために必要とされるシャイン・ダルガノ配列などのシグナル／調節配列を欠いており、またはコードしている核酸は、原核生物リボソームによる翻訳はブロックするかまたは提供しないが、真核生物リボソームによって認識されるＩＲＥＳなどの配列を含有し、それにより、細菌はｍＲＮＡを産生するが、ｍＲＮＡを翻訳しない。細菌が組織常在性もしくは腫瘍常在性免疫細胞、特に組織常在性もしくは腫瘍常在性骨髄性細胞に感染するか、またはその中に蓄積するように、本明細書に記載されるように改変されている細菌は、ＲＮＡを骨髄性細胞に送達し、骨髄細胞でそれが翻訳される。病原体もしくは腫瘍に由来するような抗原をコードするＲＮＡ、および／または抗ウイルス治療薬をコードするＲＮＡを含む、あらゆるＲＮＡを送達することができ、これらは原核生物プロモーターの制御下で発現される。そのような用途では、プラスミドは、より高いコピー数（例えば、１５０コピー以上、例えば、２００、３００、４００、５００、またはそれ以上のコピー、例えば、５００～７００コピー）で存在することができ、それにより、大量のＲＮＡが産生され、骨髄性細胞に送達される。
また、本明細書に記載され例示され、上述されたように、コードしている配列および調節配列は、ＲＮＡが細菌内で産生されるが、コードしている核酸が細菌リボソームによる翻訳を阻害または妨げるが、それらが、真核生物宿主リボソームによって認識され、かつ／または真核生物宿主リボソームによる翻訳を増強させ、促進し、もしくは許容するように調製することができる。例えば、ｍＲＮＡは、原核生物プロモーターの制御下で転写される。ＩＲＥＳ配列は、転写物中に含まれ、これは原核生物細菌における翻訳をブロックするが、真核生物宿主細胞中に送達されると、真核生物リボソームによる翻訳を許容する。したがって、細菌は、不安定でないｍＲＮＡデリバリーシステムを提供する。細菌を大量に増殖させることができ、次いで、凍結乾燥もしくは凍結することができ、および／または室温で保存することができる。それらは錠剤、もしくは粉末剤に製剤化することができるか、または吸入用に微粉化することができる。
細菌は、ゲノム改変を含有するものを含み、それによって、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、４、および５による応答が、ゲノム改変を含まない細菌と比較して低減されている。これらの細菌は、必要に応じて、それらが必要な栄養素もしくは因子に対して栄養要求性であり、それによりそれらが真核生物宿主中で複製できないが、栄養素もしくは因子で補給されると、インビトロで複製することができるように、ゲノム改変を追加で含有する。これらはアデノシン生合成における欠損を含み、これは、アデノシンが蓄積する腫瘍および腫瘍微小環境を有するがんの対象の処置に使用されるとき、免疫抑制を低減させる付加された利点を有する。他の欠損としては、上記セクションで記載されて述べられ、以下に例示されるｔｈｙＡ－などのチミン合成欠損が含まれる。
細菌は、産物をコードする核酸を含有するプラスミドを含有し、または産物をコードするＲＮＡを含む。プラスミドは、低コピー数、中コピー数、または高コピー数で存在することができる。ＲＮＡを送達するために使用されるとき、プラスミドは、１５０コピーまたはそれ以上などの高コピー数で存在し得る。核酸またはＲＮＡによってコードされている産物は、病原性ウイルス、細菌、寄生虫に由来の抗原配列（単数または複数）、または腫瘍抗原であり、それによって、コードされている抗原の宿主内での発現時に、宿主は病原性ウイルス、細菌、もしくは寄生虫に対する、または腫瘍抗原に対する免疫防御応答または免疫化応答を発揮し、あるいは産物は宿主に送達される治療用産物である。抗原配列（複数可）の発現は、原核生物プロモーターの制御下にあり、それにより、抗原（複数可）をコードするＲＮＡは、細菌中で産生され、またＲＮＡデリバリーのために、抗原をコードする核酸は、細菌リボソームによるコードされているＲＮＡの翻訳を阻害または妨げるが、真核生物宿主リボソームによるコードされているＲＮＡの翻訳を阻害または妨げない調節配列を含み、それによって、翻訳は細菌における転写から切り離される。ゲノム改変のおかげで、得られる細菌は、真核生物対象に投与されるとき、食細胞への感染が選択的になり、核酸を食細胞中に送達し、そこでＲＮＡが翻訳される。
特に興味深いのは、細菌がマクロファージなどの食細胞に感染するように改変されている、本明細書に提供される免疫刺激細菌である。特に、サルモネラ属、リステリア属、および大腸菌などのあらゆる好適な種／属であり得る細菌は、それらがペンタアシル化リピドＡを有するＬＰＳを産生するように改変されている、鞭毛を欠くように改変されている、およびｃｕｒｌｉ線毛を欠くように改変されている、のうちの１つまたは複数もしくはすべてであるように改変されており、例えば、細菌はｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－、フラゲリン－、およびｃｓｇＤ－である（産物が産生されないか、産生されても、不活性であるように、特定の種におけるコードしている遺伝子または同等の遺伝子のそれぞれごとを改変することによって）。細菌はまた、例えば、それらをａｓｄ－にすることによっても改変され、それにより、細菌はＤＡＰなどの適切な栄養素を提供することによってインビトロで増殖することができるが、それらは真核生物宿主中では複製せず、ｍＲＮＡが真核生物細胞中に送達されると、最終的に死滅する。細菌はまた、本明細書に記載されるように、改変ＳＴＩＮＧタンパク質および／またはサイトカイン（本明細書の他の箇所で記載され列挙されるすべて）などの、追加のペイロードをコードすることができ、これらは宿主免疫系を刺激するように機能し、それにより、アジュバントして作用する。そのような産物は、本明細書の開示の全体を通して記載されるように、細菌中のプラスミド上でコードされ得、抗原をコードするｍＲＮＡを有する多シストロン性コンストラクト上にコードされ得、および／またはタンパク質への転写／翻訳のために真核生物プロモーターの制御下でコードされ得る。これらのタンパク質は、転写のために設計され得るか、または必要に応じて、それらが提示のために膜固定されるように改変され得る。大腸菌などの免疫刺激細菌は、それらが補体に対する抵抗性を増大させるために、ｒｃｋをコードしそれを発現するように改変され得る。
１１．抗病原体処置およびワクチンとして使用するための、ならびに抗がん処置および／または予防のための、病原体由来のものおよび腫瘍由来の抗原も含む、特定の抗原に対する細菌ワクチン
ワクチンは、疾患に罹患したり、障害やがんを発症したりすることを予防(リスクを軽減)し、または疾患、障害、またはがんの処置として、ならびにそれらの組合せとして使用することができる。本明細書に提供される免疫刺激細菌および他のワクチンは、これらの目的のために使用することができる。
抗腫瘍応答と抗ウイルス応答との間の免疫応答における類似性のために、本明細書に提供される免疫刺激細菌もまた、感染性疾患を処置するために使用することができる。細菌は、ウイルスもしくは細菌産物の阻害剤、またはウイルスもしくは細菌産物の発現の阻害剤、またはウイルスもしくは細菌抗原などの抗ウイルスもしくは抗菌治療薬をコードすることができる。免疫刺激細菌に由来の免疫応答および治療用抗病原体産物との組合せ、および免疫刺激タンパク質とコードされている免疫刺激タンパク質との組合せもまた、感染性疾患、特に慢性ウイルス感染症および潜在性ウイルス感染症などのウイルス感染と関連する疾患に対してワクチン接種するための、および／または処置するための治療用免疫刺激細菌を提供する。興味深いのは、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バールウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、麻疹ウイルス、および対象に慢性的に感染するウイルスによる感染症などの慢性ウイルス感染症である。免疫刺激細菌はまた、慢性インフルエンザおよびコロナウイルス、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－Ｃｏｖ）、ならびに重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による初期感染などの急性感染症の処置にも同様に使用することができる。免疫刺激細菌は、ウイルス抗原などの病原体由来の抗原をコードすることができ、感染症を予防するために、または既存の感染症を処置するためのワクチンとして使用される。免疫刺激細菌は、Ｔ細胞などの抗原提示細胞などの免疫細胞内に蓄積する能力によって、ウイルスに対するＴ細胞応答を促進することができる。例えば、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、アスパラギナーゼＩＩが欠損していており、これがＴ細胞の機能を増強させて、それにより抗ウイルス応答を促進する。ウイルス抗原、例えば、必須ウイルスタンパク質に由来する抗原、例えば、コロナウイルスの場合、抗体の中和をもたらすことができるヌクレオカプシド、Ｍおよび／またはＳタンパク質に由来する抗原の発現と、長寿命の循環し組織常在性のＣＤ８＋Ｔ細胞の増強との組合せは、効果的なワクチンおよび処置を提供する。
結核（ＴＢ）に対するカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ワクチンなどの不活化または弱毒化ワクチンなどの既存のワクチンの有効性は、アスパラギナーゼが発現されないようにゲノムを改変し、それによって、免疫抑制を排除することによって改善することができる。ＢＣＧワクチンの有効性は、低減されることが多い。これは、ワクチン細菌によって分泌されるアスパラギナーゼによるものであり、アスパラギナーゼはＴ細胞活性を減少させ、それにより免疫抑制効果を有することになる。これは、アスパラギナーゼ活性を低減または排除するように細菌を改変することによって軽減させることができる。本明細書の他の箇所で論じられるように、細菌に対するＴＬＲ２もしくはＴＬＲ２／４／５応答を低減または排除する他の改変は、ＴＬＲ２、もしくはＴＬＲ４、もしくはＴＬＲ５、または他のｔｏｌｌ様受容体の活性または細菌に対する応答によるＩ型ＩＦＮのあらゆる遮断または阻害を排除する。本明細書に記載されるように、ＴＬＲの細菌に対する応答はＩ型ＩＦＮをブロックまたは阻害し、これらのＴＬＲの応答を排除することによる本明細書の細菌の改変は、この望ましくない効果を除去する。
上記セクションで論じたように、免疫刺激細菌は、抗ウイルス治療薬もしくは抗菌治療薬、または免疫化のための抗原をコードすることができる。そのような治療薬としては、ウイルス遺伝子およびタンパク質（複製ならびに／またはパッケージングに必要なタンパク質など）の阻害剤が含まれ、または免疫刺激細菌は、ウイルスの標的細胞への侵入を容易にするまたは提供するウイルスの受容体（単数または複数）との結合または相互作用を防止する治療薬をコードすることができる。一部の実施形態において、治療用タンパク質は、原核生物プロモーターの制御下にあり得る。上記セクションで論じたように、細菌はＲＮＡを送達するものであり得る。
上述したように、細菌は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、および他の病原体などの病原体に対するワクチン接種のための、また抗腫瘍療法のためのｍＲＮＡを含む、ＲＮＡを送達するために使用することができる。細菌はまた、免疫刺激物質もしくは他の免疫系エンハンサー、または免疫抑制剤の阻害剤、例えば免疫チェックポイントタンパク質をコードすることができる。これらの例は、本明細書に提供される改変ＳＴＩＮＧタンパク質を含むＳＴＩＮＧタンパク質、サイトカイン、および他のそのような免疫刺激タンパク質である。腫瘍の処置のための、組み合わされたペイロードを含む本明細書に記載されるペイロードのいずれかもまた、細菌によってコードされ／送達され得る。抗腫瘍応答および抗ウイルス応答は、同様である。ワクチンの場合、免疫刺激ペイロードは、免疫応答を増強するためのアジュバントとして機能する。病原体抗原をコードする核酸は、原核生物プロモーターの制御下にあり、他のペイロードもまた、病原体抗原をコードする核酸を有する多シストロン性コンストラクトとして提供することができるか、またはそれらは抗腫瘍治療薬について本明細書で記載されるように、真核生物プロモーターの制御下でコードされ得る。
食細胞にペイロードを送達し、デリバリーのためにそれらの特性を改善する様々なゲノム改変を含有する、本明細書に提供されるものなどの細菌は、ＲＮＡを送達するために使用することができる。この細菌は、ＲＮＡが細菌の細胞質に送達され、Ｉ型ＩＦＮを刺激するためのアジュバントを含有するために、ナノ粒子および他のそのようなデリバリー媒体よりも優れた媒体である。ＲＮＡのデリバリー用の本明細書に提供される細菌の利点の中では：１）それらが「ＲＮＡなしに」ＲＮＡデリバリーを可能にすること－細菌デリバリー媒体は、複雑なＲＮＡ安定性／製造の必要性を回避する、２）それらが食細胞の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の直接標的化をもたらすこと、３）それらがＩ型ＩＦＮアジュバント活性を提供するペイロードの封入をもたらすこと、４）それらが、例えば、内在性ａｓｄ活性を不活性化して、それをプラスミド上でコードしないことによって細菌をａｓｄ－にすることによって、細菌が真核生物（ヒトなど）宿主中で複製しないようにゲノム改変を含有すること、および５）例えば、鞭毛を除去し、ＬＰＳを改変し、バイオフィルム形成を低減または排除し、ならびにアスパラギナーゼＩＩ活性の排除によって、ゲノム改変による不良なアジュバントである細菌産物の除去が可能であること、がある。これらの細菌の例は、ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－、およびフラゲリン－であるもの、必要に応じて、ａｎｓＢ－、およびｃｓｇＤ－で、ｐｕｒＩ遺伝子の完全な（クリーンな）欠失を伴うものである。媒体としての細菌もまた、迅速な操作および配置を可能にし；細菌が容易にスケーラブルであり、かつ製造が容易であり；複数の異なるＲＮＡを単一の細菌中にコードすることができ；細菌が安定で、それらを室温で保存することができ、それらを凍結乾燥することができ、それらは鼻腔内デリバリーまたは吸入によるデリバリー用に、ならびに静脈内デリバリー用に製剤化でき、送達の他の好適な経路用に製剤化できる。ＴＬＲ２活性の一部を保持することは、細菌をｃｓｇＤ－にするゲノム改変を含んでいるために、血管内皮細胞を漏出性にする。
抗がん治療用産物の腫瘍／腫瘍微小環境へのデリバリーのために、コードされている産物は、分泌のためのシグナルなどのトラフィッキングシグナルに作用可能に連結され得る。産物はまた、腫瘍常在性骨髄性細胞または他の食細胞の細胞表面などの細胞表面上の発現のために設計することができる。遺伝子産物は、それらが膜固定されるように改変され得る。例えば、ＩＬ－１２は、膜貫通ドメインをＣ末端に付加することによってそれが膜固定されるように本明細書中において改変されている。例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５およびＦＬＴ－３Ｌを含む他のタンパク質は、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーなどの他のそのようなアンカードメインを付加することによって同様に改変され得る。そのようなタンパク質を細菌が感染した細胞の膜に固定することは、それらが全身的に分泌されないが、腫瘍微小環境中で作用するように毒性を低減させる。特に、そのような産物およびそれらの組合せをコードする免疫刺激細菌は、例えば、ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であり、かつ鞭毛を有さない細菌をもたらす改変などのゲノム改変を有するものであり、それによって、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、４、および５による応答がゲノム改変なしの細菌と比較して低減されている。
１２．Ｍ２表現型マクロファージからＭ１およびＭ１様の表現型マクロファージへの変換
本明細書に記載のように、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、マクロファージ内で増え、かつ／またはそれを標的とする。マクロファージは、貪食免疫細胞であり、それらは、老化細胞およびアポトーシス細胞の排除、ならびに免疫関連複合体および病原体の食作用、ならびにホメオスタシスの維持において役割を果たす。マクロファージの表現型および機能は、微小環境によって極性化することができる。Ｍ１型（古典的に活性化された）マクロファージ、およびＭ２型（代替的に活性化された）マクロファージという２つの型がある。
Ｍ１マクロファージの役割は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインを分泌すること、抗原を提示すること、およびそれゆえ、陽性免疫応答に参加し、免疫モニターとして機能を果たすことである。Ｍ１マクロファージは、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、およびＴＮＦ－アルファを含めた、炎症促進性サイトカインを産生する。Ｍ２マクロファージは、アルギナーゼ１、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、および他の抗炎症性サイトカインを分泌し、それらは、炎症を低減し、腫瘍成長および免疫抑制性機能に寄与する機能を有する。したがって、がんならびに他のそのような疾患および障害の処置には、Ｍ１またはＭ１様の表現型が有利である。
Ｍ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージまたはＭ１様の表現型を有するマクロファージに変換することができる。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、マクロファージに感染し、Ｍ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換することができる。Ｍ１マクロファージの表現型マーカーには、ＣＤ８０（Ｂ７、Ｂ７．１、またはＢＢ１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られている）、ＣＤ６４（高親和性免疫グロブリンガンマＦｃ受容体Ｉとしても知られている）、ＣＤ１６、およびＣＤ３２（低親和性免疫グロブリンガンマＦｃ受容体ＩＩｂとしても知られている）が含まれる。Ｍ１マクロファージにおける一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現も、表現型マーカーとして働き得る。ＣＤ１６３およびＣＤ２０６は、Ｍ２マクロファージを同定するためのマーカーである。アルギナーゼ１（Ａｒｇ１）およびＤＥＣＴＩＮ－１も、Ｍ２マクロファージを同定するための理想的な表現型指標である。表現型変換は、これらのマーカー、および／またはそのようなマクロファージ表現型に特徴的である他のマーカーの発現によってモニターまたは評価することができる。
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、免疫抑制Ｍ２表現型と関連している。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、そのようなマクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型のマクロファージに変換することができる。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす治療用産物をコードする、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、そのような変換を引き起こすことができる。これは、本明細書で提供する免疫刺激細菌に特有の特性であり、マクロファージの感染をもたらすゲノム改変を含む細菌の能力を活用する。コードされている治療用産物には、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるもの、例えばＳＴＩＮＧ変異体（本明細書に詳細に記載されている）などが含まれる。コードしている免疫刺激細菌は、腫瘍常在性マクロファージの感染および治療用産物（複数可）の発現の際に、Ｍ１表現型（またはＭ１様の表現型）への感染されたマクロファージの変換を引き起こすことができる。マクロファージ表現型を変換するこの能力は、下記の実施例１２で実証および例示されている。マクロファージに感染し、ＳＴＩＮＧタンパク質を発現する、本明細書で提供する免疫刺激細菌による、改変されたＳＴＩＮＧタンパク質の発現は、Ｍ２マクロファージの表現型をＭ１様表現型に変換する。
鞭毛の排除およびＬＰＳ改変などの本明細書に記載されるゲノム改変を含む、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、感染されたＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに特徴的なサイトカインプロファイルの一部またはすべてを誘導するものに変換する。ヒト初代Ｍ２マクロファージで構成的なＩ型ＩＦＮ発現をもたらす変異体ＳＴＩＮＧタンパク質を発現する免疫刺激細菌は、これらの細胞を、Ｍ１様の（Ｍ１マクロファージに典型的な表現型マーカーおよび／または発現プロファイルを有する）Ｉ型ＩＦＮ産生細胞に変換する。
Ｄ．腫瘍微小環境において免疫応答を刺激する遺伝的ペイロードをコードする、増強した治療係数を有する免疫刺激細菌
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境内、および腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積するように改変され、そこで、コードされている治療用産物が真核生物プロモーターの制御下で発現される。細菌は、免疫系を刺激する産物および／または腫瘍の免疫抑制効果を後退もしくは緩和する産物を含む治療用産物、特に抗がん産物をコードする。本明細書に記載するように、細菌は、各産物の発現が別個のプロモーターの制御下にある、または産物の発現が１つのプロモーターの制御下にある、複数の産物をコードできる場合があり、発現カセットは別個の産物の発現をもたらす配列を含む場合があり、適切な場合には、コードされている産物の腫瘍微小環境内への分泌を保証するための調節配列を含む。免疫刺激細菌は、プラスミド上にコードされている治療用産物を発現する。先に述べたように、プラスミドは、１つの産物、または複数の産物をコードする場合がある。各産物は、異なる真核生物プロモーターの制御下で発現される場合があり、またはＴ２Ａ（配列番号３２７）、Ｐ２Ａ（配列番号３２８）、Ｅ２Ａ（配列番号３２９）、およびＦ２Ａ（配列番号３３０）などのコーディング部分の間に２Ａ自己切断ペプチドを含むことなどによって、コードされている複数の産物が単一のプロモーターの制御下で発現される場合がある。コードされている産物は、本明細書に記載されるものを含み、それらは、その活性が相補的な抗がん免疫刺激産物であり得る。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、さもなければ全身投与された場合に過度に有毒であろう複数の免疫調節産物またはペイロード（多重ペイロード）の組合せ投与を可能にする。多重ペイロードの例は、１つまたは複数のサイトカイン（複数可）、増大した活性を有するまたは構成的に活性であるＳＴＩＮＧまたはその変異体などの、Ｉ型ＩＦＮの発現を刺激または誘導するための免疫刺激タンパク質、および操作された４－１ＢＢＬ共刺激分子などの共刺激分子を含む。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、多重ペイロードまたは単剤ペイロードのＩＶ投薬後などに、治癒の提供を含む強い抗腫瘍効果を有する。免疫刺激細菌は、全身投与された場合、浸潤し、固形腫瘍、ＴＭＥ、および腫瘍常在性骨髄性細胞内に濃縮され、コードされている治療用産物がそこで発現され、次いで腫瘍微小環境に局所送達される。腫瘍常在性骨髄細胞によって飲み込まれると（ファゴサイトーシス）、細菌は、遺伝的ペイロードをコードするプラスミドを送達し、それは、異所性の、単一または多重ペイロードの発現を腫瘍特異的に可能にする。
１．免疫刺激タンパク質
本明細書における免疫刺激細菌は、抗腫瘍応答を促進、誘導、または増強する１つまたは複数の免疫刺激タンパク質をコードするように改変することができる。本明細書中に例示および記載されるように、コードする核酸がプラスミド上に配列される順序は、全体的な発現を改善することができ、遺伝子の完全な欠失や不活性化などのプラスミドへの改変は、タンパク質をコードするプラスミドを含有する細菌の適応度を改善することができる。
免疫刺激タンパク質（複数可）は、真核生物対象、特に、免疫刺激細菌を投与すべき対象、例えばヒトにおける発現のために、真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターの制御下で、細菌内のプラスミド上にコードされ得る。免疫刺激タンパク質（複数可）をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞における発現または輸送のための、例えば細胞表面での分泌または発現のための、他の調節シグナルを含み得る。
免疫刺激タンパク質は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）などの適切な環境内で、免疫刺激細菌が投与される対象による抗腫瘍応答を促進、またはそれに関与する、またはそれを増強することができるタンパク質である。免疫刺激タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子を含むが、それに限定されるわけではない。これらは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－３６γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、およびＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２などであるが、それに限定されるわけではないサイトカイン；ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１などであるが、それに限定されるわけではないケモカイン；ならびに／またはＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインが切り詰められているか、もしくは欠失している４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ２７およびＣＤ２７Ｌ）、およびＢ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー［例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、およびＩＣＯＳリガンド（Ｂ７ＲＰ１）］などであるが、それに限定されるわけではない共刺激分子を含む。
本明細書に提供される免疫刺激細菌内にコードさせるために、腫瘍の処置のために使用される、または抗腫瘍応答を促進するか、増強するか、もしくは別途に増大もしくは誘起することができる、当業者に公知の他のそのような免疫刺激タンパク質が企図されている。例えば、免疫刺激細菌は、ＡＰＣ上での発現のために完全または部分的細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌ）をコードする遺伝的ペイロードを送達することができ、その際、切り詰められた遺伝子産物は、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失または切り詰めにより、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない。本明細書の他の箇所に記載するように、例えば４－１ＢＢＬの、改変された、切り詰められた細胞質ドメインは、タンパク質の発現を増大させる、タンパク質ドメインの適切な配向性を保証するために、特定の残基を含有する。共刺激分子の細胞質ドメインの欠失（完全または部分）および改変は、免疫抑制逆シグナル伝達なしに共刺激分子の活性化を増強する。
ａ．サイトカインおよびケモカイン
一部の実施形態では、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ならびにＩＦＮ－βを含むが、それに限定されるわけではないサイトカインを発現して免疫系を刺激するように操作される。サイトカインは、腫瘍部位で免疫エフェクター細胞および間質細胞を刺激し、細胞傷害性細胞による腫瘍細胞の認識を増強する。一部の実施形態では、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１などのケモカインを発現させるように免疫刺激細菌を操作することができる。
ＩＬ－２
がんの処置のために承認された最初のサイトカインであったインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の成長の活性化および促進、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の生成、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の成長および増殖の促進、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の刺激、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の増殖および分化の促進を含むいくつかのメカニズムによる免疫系の活性化に意味付けられている。組換えＩＬ－２（ｒＩＬ－２）は、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）および転移性黒色腫の処置のためにＦＤＡから承認されている（例えば、Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166参照）。
ＩＬ－７
ＩＬ－２スーパーファミリーのメンバーであるＩＬ－７は、Ｔ細胞の生存、増殖および恒常性に意味付けられている。ＩＬ－７受容体における突然変異はＴ細胞の損失および重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）の発生をもたらすことが示されており、ＩＬ－７がＴ細胞の発生に演じる決定的な役割を強調している。ＩＬ－７は、休止ナイーブＴ細胞およびメモリＴ細胞に連続シグナルを提供し、リンパ球減少症の状態の間に蓄積してＴ細胞の増殖およびＴ細胞レパートリーの多様性の両方に増大をもたらす、恒常性サイトカインである。ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－７は、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞と比べてＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大増殖することに選択的である。組換えＩＬ－７は、ワクチン接種後の抗原特異的Ｔ細胞応答、およびマウスにおける養子細胞療法を増強することが示されている。ＩＬ－７はまた、造血幹細胞移植の化学療法後のＴ細胞回復を促進することに役割を演じ得る。進行悪性腫瘍を有する患者に対する初期相臨床試験は、組換えＩＬ－７が生物学的活性用量（すなわち、循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数が３～４倍に増大する用量）で忍容性良好であり、限られた毒性を有することを示している（例えば、Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。ＩＬ－７は、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、前立腺がん、および神経膠芽腫などの腫瘍に抗腫瘍効果を有することが示されており、ネズミモデルにおけるＩＬ－７のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与は、がん細胞の成長減少をもたらした。ＩＬ－７はまた、ラット神経膠腫におけるＩＦＮ－γの抗腫瘍効果を増強し、単球によるＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの産生を誘導し、それが黒色腫の成長阻害をもたらすことが示されている。その上、小児肉腫の処置後の組換えＩＬ－７の投与は、免疫回復の促進をもたらした（例えば、Lin et al. (2017) Anticancer Research 37:963-968を参照）。
ＩＬ－１２［ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）］
細胞媒介免疫を促進する生物活性ＩＬ－１２（ＩＬ－１２ｐ７０）は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットから構成されるヘテロ二量体である一方で、ＩＬ－１２ｐ４０単量体およびホモ二量体は、ＩＬ－１２アンタゴニストとして作用する。抗原提示細胞によって分泌されるＩＬ－１２は、ＮＫ細胞およびＴ細胞からのＩＦＮ－γの分泌を促進し、腫瘍血管新生を阻害し、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖をもたらし、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を増強し、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を促進する。ＩＬ－１２は、黒色腫、結腸癌、乳癌、および肉腫のネズミモデルにおいて抗腫瘍効果を表すことが示されている（例えば、Kalinski et al. (2001) Blood 97:3466-3469; Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166；およびLee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒα（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα）
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と構造的に類似しており、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の両方がＴ細胞の増殖および活性化のための初期刺激を提供するのに対し、ＩＬ－１５は、刺激されたＴ細胞を無くし、Ｔ細胞トレランスを誘導することをもたらす過程である、ＩＬ－２誘導アポトーシスを遮断し、メモリーＴ細胞応答を限定し、ＩＬ－２単独の治療有効性を潜在的に限定する。ＩＬ－１５はまた、長期抗腫瘍免疫を維持するためのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続を支援し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の直接活性化を介して前臨床ネズミモデルにおいて抗原非依存的に顕著な抗腫瘍活性を実証している。ＣＤ８＋Ｔ細胞に加えて、ＩＬ－１５は、エフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発生、増殖および活性化を担う（例えば、Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893；およびHan et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810を参照）。
Ｉｌ－ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体は、それが単量体ＩＬ－１５よりも長いインビボ安定性を有し、ＩＬ－１５と比べて免疫細胞に対して１０倍～１００倍より活性であるため、ＩＬ－１５の代わりに使用することができる。ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαは、ＮＫ細胞、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞ならびにＴ細胞の成熟、増殖および抗アポトーシス管理を刺激し、それは、活性化Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存および長寿命のＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉＴ細胞メモリ細胞の生成を促進する。臨床的には、ＩＬ－１５はＩＬ－２よりも優れており、それが免疫抑制性Ｔｒｅｇ上に位置するＩＬ－２Ｒアルファに結合せず、活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ）または広範囲の毛細血管漏出症候群を誘発しないためである。本明細書では、操作されたＳＴＩＮＧによって誘導されたＩ型インターフェロンと、ＣＤ８＋細胞機能を増強との間の相乗効果があることが示されている。骨髄性細胞媒介Ｔ細胞動員とＣＤ８＋Ｔ細胞機能の増強との相乗効果がある。それらは、ヒト樹状細胞（ＤＣ）を活性化し、抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導して、それにより抗がん免疫を誘導するために、相乗的に作用する。本明細書では、この組合せが動物モデルにおいて高い治癒率を誘導することが示されている。ネズミ直交性Ｔ細胞中の強力なＴ細胞浸潤は、腫瘍を排除し間質腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）バリアを破壊する。顕著なＴ細胞およびＮＫ動員が観察された。
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）は、単球および樹状細胞などの抗原提示細胞によって協調的に発現され、ＩＬ－１５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現されるＩＬ－１５ＲβγＣ受容体複合体にＩＬ－１５Ｒαによってトランスに提示される。可溶性ＩＬ－１５：ＩＬ１５－Ｒα（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα）複合体は、ＩＬ－１５ＲβγＣ複合体を介して免疫応答をモジュレーションすることが示されており、ＩＬ－１５の生物活性は、それをＩＬ－１５と可溶性ＩＬ－１５Ｒαとの予め形成した複合体として投与することによって５０倍に増大することが示されており、この複合体は、ＩＬ－１５単独と比較して半減期が増大している。ＩＬ－１５Ｒαとの予備会合によるＩＬ－１５の治療有効性におけるこの顕著な増大は、ネズミ腫瘍モデルにおいて実証されている（例えば、Han et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810を参照）。
ＩＬ－１８
ＩＬ－１８は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を誘導し、それらの毒性を増強する。ＩＬ－１８はまた、マクロファージを活性化し、Ｔｈ１ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の発生を刺激する。ＩＬ－１８は、いくつかの前臨床マウスモデルにおいて有望な抗腫瘍活性を示している。例えば、組換えＩＬ－１８（ｒＩＬ－１８）の投与は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および／またはＮＫ細胞媒介応答を介して同系マウスにおける黒色腫または肉腫の退縮をもたらした。他の研究は、ＩＬ－１８抗腫瘍効果がＩＦＮ－γによって媒介され、抗血管新生メカニズムを伴ったことを示した。ＩＬ－１８と他のサイトカイン、例えばＩＬ－１２と、または共刺激分子、例えばＣＤ８０との組合せは、ＩＬ－１８媒介抗腫瘍効果を増強する。進行固形腫瘍およびリンパ腫を有する患者における第Ｉ相臨床試験は、ＩＬ－１８の投与が安全であったこと、それが免疫調節活性ならびに患者における血清ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦレベルの増大、ならびに中程度の臨床応答をもたらしたことを示した。臨床試験は、ＩＬ－１８が他の抗がん治療剤、例えばモノクローナル抗体、細胞傷害性薬、またはワクチンと組み合わせることができることを示した（例えば、Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675;およびLee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。
ＩＬ－１８を発現するように操作されたネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の弱毒株が、全身投与後にいかなる毒作用も有さずに同系マウスにおける皮下（Ｓ．Ｃ．）腫瘍の成長または肺転移を阻害したことを見出した。この操作された細菌を用いた処置は、腫瘍へのＴ細胞、ＮＫ細胞および顆粒球の蓄積を誘導し、サイトカインの腫瘍内産生をもたらした（例えば、Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675を参照）。
ケモカイン
ケモカインは、傷害または炎症の区域への白血球の遊走を媒介する小型サイトカインのファミリーであって、免疫応答および炎症応答の媒介に関与する。ケモカインは、その配列内のシステイン残基の位置に基づき４つのサブファミリー、すなわちＸＣ－、ＣＣ－、ＣＸＣ－、およびＣＸ３Ｃ－ケモカインリガンド、またはＸＣＬ、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、およびＣＸ３ＣＬに分類される。ケモカインリガンドは、その同族受容体に結合し、免疫細胞の循環、ホーミングおよび保持を調節し、各ケモカインリガンド－受容体ペアは、ある特定の型の免疫細胞を選択的に調節する。異なるケモカインは、異なる白血球集団を誘引し、インビボで濃度勾配を形成し、誘引された免疫細胞は、勾配を通過してより高い濃度のケモカインに向けて移動する（例えば、Argyle D. and Kitamura、T. (2018) Front. Immunol. 9:2629;およびDubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335を参照）。ケモカインは、腫瘍内への免疫細胞の浸潤を増大させ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の腫瘍流入領域リンパ節への移動を容易にすることによって抗腫瘍免疫応答を改善することができ、それは、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞をプライミングする（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340を参照）。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１を含むが、それに限定されるわけではないケモカインをコードするように操作することができる。
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５は、高度の相同性を共有し、ヒトおよびマウスの両方において未熟ＤＣおよびＴ細胞を含むいくつかの細胞型の上のＣＣＲ５（ＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５）ならびにＣＣＲ１（ＣＣＬ３およびＣＣＬ５）に結合する。治療用Ｔ細胞は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５の腫瘍特異的分泌を介して自然免疫細胞の腫瘍部位への走化性を誘導することが示されている（例えば、Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335を参照）。
ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）応答の誘導によって、ＣＣＬ３が放出される。マウスのインビボおよびインビトロ研究は、ＣＣＬ３が好中球および単球の両方に対して走化性であることを指し示している。具体的には、ＣＣＬ３は、骨髄からの骨髄前駆細胞（ＭＰＣ）の動員を媒介することができ、ＭＰＣ調節効果および刺激効果を有する。ＣＣＬ３をトランスフェクションされたヒト卵巣癌細胞は、抗腫瘍応答の改善をもたらす腫瘍内のＴ細胞浸潤およびマクロファージの増強を示し、好中球のＣＣＬ３媒介走化性が腫瘍成長を抑制したことを指し示した。ＣＣＬ３によって動員された、腫瘍抗原ヒト黒色腫関連遺伝子（ＭＡＧＥ）－１をトランスフェクションされたＤＣは、マウス黒色腫モデルにおいて増大したリンパ球増殖、細胞溶解能、および生存、ならびに減少した腫瘍成長を含む優れた抗腫瘍効果を表した。ＣＣＬ３と、ＭＡＧＥ－１に対する抗原特異的プラットフォームとの組合せ使用はまた、胃がんの処置に使用されている。高免疫原性のネズミ結腸腫瘍、ＣＴ２６によるＣＣＬ３の産生は、インビボ腫瘍成長を減速した；この過程は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の、したがってＩＦＮγのＣＣＬ３依存性蓄積によって駆動され、結果として、ＣＸＣＬ９およびＣＸＬＣ１０の産生をもたらした（例えば、Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598;およびSchaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060を参照）。
ＣＣＬ３は、がんの処置のためのアジュバントとして使用されている。マウス肝細胞癌における高周波アブレーション後のＣＣＬ３活性変異体、ＥＣＩ３０１の投与は、腫瘍特異的応答を増大させ、このメカニズムは、ＣＣＲ１の発現に依存することがさらに示された。白血病／リンパ腫のモデルにおいてＣＣＬ３およびＩＬ－２または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をワクチン接種されたマウスが生存増大を表したことによって、ＣＣＬ３は、全身がんにおけるアジュバントとしても成功を示している（例えば、Schaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060を参照）。
ＣＣＬ３およびＣＣＬ４は、黒色腫および結腸がんにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を原発腫瘍部位に方向付けることに役割を演じる。ＣＣＬ４の腫瘍産生は、ＣＤ１０３＋ＤＣの蓄積をもたらし；ＷＮＴ／β－カテニン－依存経路によるＣＣＬ４の抑制は、黒色腫腫瘍のＣＤ１０３＋ＤＣ浸潤を防止した（例えば、Spranger et al. (2015) Nature 523(7559):231-235を参照）。ＣＣＬ３はまた、結腸がんのマウスモデルにおいて原発腫瘍部位へのＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増強することが示された（例えば、Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598を参照）。
ＣＣＬ３またはＣＣＬ５のそれらの受容体（ＣＣＲ１およびＣＣＲ５）への結合は、未熟ＤＣ、単球、ならびにメモリーおよびＴエフェクター細胞を循環から炎症部位または感染部位に移動させる。例えば、結腸直腸腫瘍におけるＣＣＬ５発現は、Ｔリンパ球の化学誘引および生存に寄与する。ＣＣＬ３およびＣＣＬ５は、いくつかの前臨床モデルにおいて腫瘍退縮および免疫を誘導するために単独で、または併用療法で使用されている。例えば研究は、ＣＣＬ３を発現するように遺伝子改変されたチャイニーズハムスター卵巣細胞の皮下注射が、腫瘍阻害および好中球浸潤をもたらしたことを示している。別の研究では、ＣＣＬ５を発現している組換え腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ－ＲＡＮＴＥＳ－Ｅ１Ａ）は、原発腫瘍の退縮をもたらし、乳癌ネズミモデルにおいて転移を遮断した（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340を参照）。
結腸直腸がんの橋渡し研究において、ＣＣＬ５は、マクロファージにおいて「抗ウイルス応答パターン」を誘導した。結腸直腸がんにおける肝転移の浸潤断端部でのリンパ球のＣＸＣＲ３媒介遊走の結果として、ＣＣＬ５が産生される。ＣＣＬ５受容体、ＣＣＲ５の遮断は、ＩＦＮおよび活性酸素種を産生しているマクロファージによって駆動される腫瘍死をもたらす。マクロファージが腫瘍微小環境内に存在する間、ＣＣＲ５の阻害は、Ｍ２表現型からＭ１表現型への表現型シフトを誘導する。ＣＣＲ５の遮断はまた、結腸直腸がん患者における臨床応答をもたらす（例えば、Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601を参照）。
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５は、リンパ系腫瘍、膀胱がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、または肝がんを含む状態を処置するために使用することができる（例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１５／０２３２８８０；および国際出願公開番号ＷＯ２０１５／０５９３０３、ＷＯ２０１７／０４３８１５、ＷＯ２０１７／１５６３４９およびＷＯ２０１８／１９１６５４を参照）。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１
ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、およびＣＸＣＬ１１（ＩＴＡＣ）は、ＩＦＮ－γの産生によって誘導される。これらのケモカインは、活性化Ｔ細胞上に優占的に発現されるＣＸＣＲ３と結合し、血管新生抑制と、白血球の動員および活性化との両方に機能する。結腸直腸がんにおける予後は、腫瘍浸潤Ｔ細胞、特にＴｈ１およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞と強く相関し；ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１の高い腫瘍内発現は、予後良好を指し示す。例えば、結腸がんを有する１６３人の患者の試料において、高レベルのＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１１を有する患者は、増大した術後生存を示し、高いＣＸＣ発現を有する患者は、有意に高い数のＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を有した。結腸直腸がん患者の肝転移では、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０レベルが浸潤断端部で増大し、エフェクターＴ細胞の密度と相関した。ＣＸＣＲ３に対するＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の作用を介するリンパ球遊走の刺激は、浸潤断端部でのＣＣＬ５の産生をもたらす（例えば、Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601；およびKistner et al. (2017) Oncotarget 8(52):89998-90012を参照）。
ＣＸＣＬ９は、インビボで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に対する化学誘引物質として機能し、末梢血リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴｈ１リンパ球を活性化した。ＣＸＣＬ９はまた、皮膚腫瘍のＴ細胞媒介抑制に重大である。例えば、全身性ＩＬ－２と組み合わせた場合に、ＣＸＣＬ９は、ＣＸＣＲ３＋単核細胞の腫瘍内浸潤の増大を介して腫瘍成長を阻害することが示されている。結腸癌のネズミモデルでは、ｈｕＫＳ１／４－ＩＬ－２融合タンパク質とＣＸＣＬ９遺伝子療法との組合せは、優れた抗腫瘍効果を達成し、化学誘引ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化を経由して寿命を延長した（例えば、Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335；およびRuehlmann et al. (2001) Cancer Res. 61(23):8498-8503を参照）。
活性化した単球、線維芽細胞、内皮細胞、およびケラチノサイトによって産生されるＣＸＣＬ１０は、活性化Ｔ細胞に対して走化性であり、インビボで血管新生の阻害剤として作用することができる。結腸直腸腫瘍におけるＣＸＣＬ１０の発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球の化学誘引およびより長い生存に寄与することが示されている。ＩＬ－１２などの免疫刺激サイトカインの投与は、ＣＸＣＬ１０によって生成される抗腫瘍効果を増強することが示されている。腫瘍細胞溶解液でプライミングされ、ＣＸＣＬ１０をトランスフェクションされた樹状細胞（ＤＣ）ワクチンは、マウスにおいて増大した免疫防御および有効性を有し；動物は、腫瘍負荷への抵抗性、腫瘍成長の減速、およびより長い生存期間を示した。ＣＸＣＬ１０－ムチン－ＧＰＩ融合タンパク質を使用するマウスにおけるインビボおよびインビトロ研究は、融合タンパク質で処置されなかった腫瘍と比較して高いレベルの動員ＮＫ細胞を有する腫瘍をもたらした。インターフェロン（形質細胞様樹状細胞によって産生され得る；これらの細胞は、原発性黒色腫病変と関連し、ＣＣＬ２０によって腫瘍部位に動員され得る）は、腫瘍ＤＣサブセット、例えば、ＣＤ１０３＋ＤＣに作用することができ、このことは、マウス黒色腫モデルにおいてＣＸＣＬ９／１０を産生することが示されており、ヒト疾患においてＣＸＣＬ９／１０と関連している。ＣＸＣＬ１０はまた、原発性黒色腫試料と比べてヒト転移性黒色腫試料中で高い発現を示している。治療的に、アジュバントＩＦＮ－α黒色腫療法は、ＣＸＣＬ１０の産生をアップレギュレーションするのに対し、化学療法剤シスプラチンは、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を誘導する（例えば、Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335; Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271; Li et al. (2007) Scand. J. Immunol. 65(1):8-13；およびMuenchmeier et al. (2013) PLoS One 8(8):e72749を参照）。
ＣＸＣＬ１０／１１およびＣＸＣＲ３の発現は、基底細胞癌（ＢＣＣ）に由来するヒトケラチノサイトにおいて立証されている。ＣＸＣＬ１１はまた、ヒト基底細胞癌において免疫抑制性のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を促進するのみならず、ケラチノサイトの増殖を増強することができ、それにより、いかなる浸潤性ＣＸＣＲ３＋エフェクターＴ細胞の抗腫瘍活性も低減され得る（例えば、Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271を参照）。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１は、がんを処置するために腫瘍溶解性ウイルスにコードされ得る（例えば、米国特許公開番号第２０１５／０２３２８８０号；および国際出願公開番号ＷＯ２０１５／０５９３０３を参照）。ＣＸＣＬ１０遺伝子をコードするシュードタイプ化腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子操作細菌もまた、がんを処置するために使用することができる（例えば、国際出願公開番号ＷＯ２０１８／００６００５およびＷＯ２０１８／１２９４０４を参照）。
ｂ．共刺激分子
共刺激分子は、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強し、共刺激経路は、腫瘍細胞によって阻害されて腫瘍形成を促進する。本明細書における免疫刺激細菌を操作して、共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバー（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２７リガンド、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、Ｆａｓ受容体、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＴＮＦ－Ｒ、ＨＶＥＭ、およびＲＡＮＫ）、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド（Ｂ７ＲＰ１）、およびＣＤ２８などを発現させることができる。その上、免疫刺激細菌は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のために、全部または部分的（完全な、または切り詰められた、または細胞で発現されるときに適切な配向性を保証するために改変された）細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）をコードし、発現し得る。完全欠失を含む、切り詰められた細胞質ドメインを有する遺伝子産物は、共刺激受容体のエンゲージメントを介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達を提供し、細胞質ドメインの切り詰めまたは欠失（または本明細書に別途記載するような改変）により、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない。切り詰めは、シグナル伝達を提供するために、および改変された共刺激分子がＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できないために十分である。本明細書に記載される共刺激分子の細胞質ドメインの完全または部分欠失は、免疫抑制逆シグナル伝達なしに共刺激分子の活性化を増強する。細胞質ドメインの部分欠失（または切り詰め）は、共刺激分子の発現にも、発現された共刺激分子の配向性にも影響せずにこれらの効果を達成するために十分な欠失である。
共刺激分子を改変して、挿入、欠失、および／または置換を含む細胞質ドメイン内のアミノ酸への改変によって免疫抑制性の細胞内／逆シグナル伝達を無くすかまたは低減することもできる。特に、共刺激分子は、細胞質ドメインリン酸化部位の改変によって、例えば置換によって改変される。例えば、適切な１つまたは複数の座位の１つまたは複数のＳｅｒ残基を、例えばヒト４－１ＢＢＬについてＳｅｒ５およびＳｅｒ８を、逆シグナル伝達を低減するかまたは無くす残基により置換することである。
本明細書における免疫刺激細菌はまた、共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ）に対するアゴニスト抗体を発現して抗腫瘍免疫応答を増強するように操作することができる。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド（ＴＮＦＳＦ）およびその受容体（ＴＮＦＲＳＦ）は、腫瘍および免疫エフェクター細胞の増殖、分化、活性化および生存に関与する。このファミリーのメンバーは、アポトーシスを誘導するＣＤ３０、Ｆａｓ－Ｌ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、およびＴＮＦ－Ｒ、ならびにＢおよびＴ細胞免疫応答を調節するＣＤ２７、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ－Ｌ、および４－１ＢＢＬを含む。他のメンバーは、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を含む。本明細書における免疫刺激細菌によるＴＮＦＳＦおよびＴＮＦＲＳＦの発現は、抗腫瘍免疫応答を増強することができる。例えば、ネズミ腫瘍における４－１ＢＢＬの発現が免疫原性を増強すること、およびＯＸ４０Ｌの発現増大を有する樹状細胞（ＤＣ）の腫瘍内注射が、ネズミモデルにおいて腫瘍拒絶をもたらし得ることが示されている。研究は、組換えＧＩＴＲを発現しているアデノウイルスのＢ１６黒色腫細胞内への注射がＴ細胞浸潤を促進し、腫瘍容量を低減することも示している。４－１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲなどの分子に対する刺激抗体を免疫刺激細菌によってコードさせて、免疫系を刺激することもできる。例えば、アゴニスト抗４－１ＢＢモノクローナル抗体が抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することが示されており、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体が移植可能腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を増大させることが示されている。その上、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体は、抗腫瘍応答および免疫を増強することが示されている（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340；およびPeggs et al. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157:9-19を参照）。
ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ４０は、ＡＰＣおよびＢ細胞によって発現されるのに対し、そのリガンド、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、活性化Ｔ細胞によって発現される。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用は、サイトカインを産生して、Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞死をもたらすようにＢ細胞を刺激する。研究は、抗腫瘍免疫応答が障害され、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ、または樹状細胞上のＣＤ４０の発現低減を有することを示している。ＣＤ４０は、いくつかのＢ細胞腫瘍、例えば濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病などの表面に発現され、それとＣＤ４０Ｌとの相互作用は、ＣＤ４０＋腫瘍細胞におけるＢ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子の発現を増大させるのみならず、それらの抗原提示能を増強することが示されている。多発性骨髄腫のネズミモデルにおけるＣＤ４０Ｌのトランスジェニック発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、局所および全身抗腫瘍免疫応答、ならびに腫瘍成長の低減をもたらした。抗ＣＤ４０アゴニスト抗体はまた、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導した（例えば、Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39; Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207；およびMurugaiyan et al. (2007) J. Immunol. 178:2047-2055を参照）。
４－１ＢＢおよび４－１ＢＢＬ
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、主としてＴ細胞およびＮＫ細胞によって発現される誘導性共刺激受容体であり；それは、ＤＣ、Ｂ細胞、および単球を含むＡＰＣ上に発現されるそのリガンド４－１ＢＢＬと結合して、免疫細胞の増殖および活性化をトリガーする。４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞のより長く、より広範な応答をもたらす。抗４－１ＢＢアゴニストおよび４－１ＢＢＬ融合タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔｈ１および腫瘍特異的ＣＴＬ活性によって媒介される、例えば肉腫およびマスト細胞腫に対する、免疫媒介抗腫瘍活性を増大させることが示されている（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340；およびMarin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39を参照）。４－１ＢＢＬは、その細胞質シグナル伝達ドメインによって負の調節を受ける。マクロファージ上の４－１ＢＢＬがＴ細胞にライゲーションする後期に、４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの逆シグナル伝達は、結合するために４－１ＢＢＬの表面転位を誘導して、ＴＬＲ４とシグナル伝達複合体を形成する。これは、適応免疫応答の免疫抑制をもたらすＴＬＲ４のＬＰＳ活性化と同様に、高レベルのＴＮＦ－αを誘導する（例えば、Ma et al. (2013) Sci. Signaling 295(6):1-11を参照）。本明細書に記載されるような４－１ＢＢＬの細胞質ドメインの欠失は、免疫抑制逆信号伝達なしに４－１ＢＢＬの活性化を増強する。
ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌ
ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、活性化エフェクターＴ細胞上に発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるのに対し、そのリガンド、ＯＸ４０Ｌは、ＴＬＲアゴニストおよびＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌシグナル伝達による活性化後に、ＤＣ、Ｂ細胞およびマクロファージを含むＡＰＣ上に発現される。ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化、増強、増殖および生存のみならず、ＮＫ細胞機能のモジュレーションおよびＴｒｅｇの抑制活性の阻害をもたらす。ＯＸ４０を経由するシグナル伝達はまた、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＦＮ－γ）の分泌をもたらし、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞応答をブーストする。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による腫瘍抗原の認識は、予後改善と相関している、ＴＩＬによるＯＸ４０の発現増大をもたらす。研究は、黒色腫、肉腫、結腸癌、および乳がんのネズミモデルにおいて抗ＯＸ４０アゴニスト抗体またはＦｃ－ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質を用いた処置が腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の増強および生存増大をもたらすのに対し、腫瘍細胞ワクチンに組み込まれたＦｃ－ＯＸ４０Ｌは、後続の乳癌細胞による誘発からマウスを防御したことを実証している（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340;およびMarin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39を参照）。
Ｂ７－ＣＤ２８ファミリー
ＣＤ２８は、抗原提示細胞上に発現される共刺激分子であるＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）に対する受容体として作用する、Ｔ細胞の表面に発現される共刺激分子である。ＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化および生存に、およびＴ細胞アネルギーの予防に必要とされ、ＩＬ－６などのインターロイキンの産生をもたらす。
最適なＴ細胞プライミングは、２つのシグナル、すなわち（１）ＭＨＣ提示抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識、および（２）Ｔ細胞ＣＤ２８と、ＡＰＣ上に発現されるＢ７－１（ＣＤ８０）またはＢ７－２（ＣＤ８６）とのライゲーションに起因する共刺激シグナルを必要とする。Ｔ細胞の活性化後に、ＣＴＬＡ－４受容体が誘導され、それは次いで、Ｂ７－１リガンドおよびＢ７－２リガンドとの結合をＣＤ２８と競合して打ち負かす。腫瘍細胞による抗原提示は、それがＢ７－１／ＣＤ８０およびＢ７－２／ＣＤ８６などの共刺激分子の発現を失っていることにより不十分であり、その結果、Ｔ細胞受容体複合体を活性化できない。結果として、腫瘍細胞表面でのこれらの分子のアップレギュレーションは、それらの免疫原性を増強することができる。固形腫瘍および血液悪性腫瘍の免疫療法は、Ｂ７によって、例えば、Ｂ７の腫瘍細胞発現または可溶性Ｂ７－免疫グロブリン融合タンパク質を介してうまく誘導されている。ＩＣＡＭ－３およびＬＦＡ－３などの他の共刺激リガンドと組み合わせたＢ７のウイルス媒介腫瘍発現は、慢性リンパ性白血病および転移性黒色腫の処置のための前臨床試験および臨床試験において成功している。その上、可溶性Ｂ７融合タンパク質は、単剤免疫療法としての固形腫瘍の免疫療法における有望な結果を実証している（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340;およびDotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207を参照）。
２．免疫応答ならびに／またはＩ型ＩＦＮ、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、ＳＴＩＮＧキメラ、および改変型を刺激する構成的に活性なタンパク質
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ；インターフェロン１型とも称される）は、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含み、抗ウイルス、抗腫瘍、および免疫調節活性を有する多彩な（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）サイトカインである。ＩＦＮ－βは、大部分の細胞型によって産生され；ＩＦＮ－αは、主として造血細胞、特に形質細胞様樹状細胞によって産生される。Ｉ型ＩＦＮは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）による病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の感知後に産生される。それらは、病原体、主にウイルス性病原体に対する自然免疫応答に関与し、抗原提示を促進し、樹状細胞（ＤＣ）成熟を媒介し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージを活性化し、高親和性抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答ならびに免疫記憶の発生を促進することによって適応免疫系を活性化する、強力な免疫調節薬である。
Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍に対して抗増殖効果およびアポトーシス促進効果を表し、腫瘍の新生血管構造に対して抗血管新生効果を有する。それらは、腫瘍細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導し、腫瘍細胞の免疫原性を増大させ、それらに対する細胞傷害性を活性化する。Ｉ型ＩＦＮは、がんおよびウイルス感染の処置のための治療として使用されている。例えば、ＩＦＮ－α（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）／Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）－Ａの商標で販売）は、ヘアリー細胞白血病、悪性黒色腫、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、および濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置のために承認されており；全身免疫毒性のため使用が限られるものの、これは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、腎細胞癌、神経内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、非濾胞性非ホジキンリンパ腫、デスモイド腫瘍、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫の処置にも使用される（例えば、Ivashkiv and Donlin (2014) Nat. Rev. Immunol. 14(1):36-49；Kalliolias and Ivashkiv (2010) Arthritis Research & Therapy 12(Suppl 1):S1；およびLee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。
本明細書における免疫刺激細菌が設計されて誘起する免疫応答の中に、腫瘍および腫瘍微小環境内のＩ型インターフェロンの発現がある。Ｉ型インターフェロンを誘導または誘起することは、がんの処置のための抗腫瘍免疫を提供する。
ａ．構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型突然変異
Ｉ型ＩＦＮ、炎症性サイトカインおよびケモカインの誘導は、ウイルス病原体による感染を予防または阻害する免疫応答を開始するために必要である。この応答はまた、抗腫瘍剤として有効であり得る。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質をコードする。これらのタンパク質の中に、免疫応答調節薬の過剰産生を伴う様々な疾患または障害を有する個体中に存在するものがある。例えば、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症性サイトカインの過剰産生もしくは過度の産生、または負調節の欠損は、炎症性疾患および自己免疫疾患などの望ましくない効果をもたらし得る。Ｉ型ＩＦＮの過剰産生を伴う障害、一般的に慢性のものは、インターフェロン症と称される（例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118；およびKonno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123を参照）。Ｉ型インターフェロン症に関連する障害および臨床表現型は、アイカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）、小児期発症ＳＴＩＮＧ関連血管症（ＳＡＶＩ）、シングルトン・マートン症候群（ＳＭＳ）、非定型ＳＭＳ、家族性凍瘡状狼瘡（ＦＣＬ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、両側性線条体壊死（ＢＳＮ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、遺伝性対側性色素異常症（ＤＳＨ）、痙性不全対麻痺（ＳＰ）、Ｘ連鎖網状色素性障害（ＸＬＰＤＲ）、プロテアソーム関連自己炎症症候群（ＰＲＡＡＳ）、頭蓋内石灰化（ＩＣＣ）、メンデル遺伝子型マイコバクテリア易感染症（ＭＳＭＤ）、および脊椎内軟骨異形成症（ＳＰＥＮＣＤ）を含む（例えば、Rodero et al. (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527-2538を参照）。これらの表現型は、Ｉ型ＩＦＮの誘導に関与する産物の構成的活性をもたらす遺伝子における突然変異を伴う、特定の遺伝子型に関連する。
インターフェロンシグナル伝達の持続的活性化は、１）細胞内ＤＮＡの増大をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＴＲＥＸ１およびＳＡＭＨＤ１における突然変異）、または細胞内ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの増大をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、およびＰＯＬＡ１における突然変異）；２）細胞質ゾル中の自己核酸ＲＮＡ種のＲＮＡ編集および異常感知における障害をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＡＤＡＲ１における突然変異）；３）細胞内ＩＦＮシグナル伝達経路の構成的活性化／細胞内核酸リガンドの感度増大をもたらす機能獲得型突然変異（例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＳＴＩＮＧにおける突然変異）；４）小胞体ストレス応答の妨害によって引き起こされるＭＡＶＳを介する異常ＲＮＡシグナル伝達をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＳＫＩＶ２Ｌにおける突然変異）；５）制御されないＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）産生をもたらす、ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ１／２）シグナル伝達を限定することを担う分子における機能喪失型突然変異（例えば、ＵＳＰ１８およびＩＳＧ１５における突然変異）；６）未知のメカニズムによるＩＦＮシグナル伝達の増大をもたらすプロテアソーム機能不全（例えば、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＢ４およびＰＳＭＢ８における突然変異）；ならびに７）Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達をもたらすメカニズムが不明確なままである、ＴＲＡＰ／ＡＣＰ５およびＣ１ｑにおける機能喪失型突然変異に起因し得る（例えば、Rodero et al. (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527-2538を参照）。
機能獲得（ＧＯＦ）をもたらす突然変異が、本明細書における目的である。コードされているタンパク質の構成的活性化、および／または内因性リガンドへの感度増強もしくは親和性もしくは結合の増大と関連する突然変異が、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５およびＲＩＧ－Ｉにおいて公知である。ＳＴＩＮＧにおけるＧＯＦ突然変異は、例えば、ＳＡＶＩおよびＦＣＬと連鎖し；ＭＤＡ５におけるＧＯＦ突然変異は、ＡＧＳおよびＳＭＳと連鎖し；ＲＩＧ－ＩにおけるＧＯＦ突然変異は、非定型ＳＭＳと連鎖する。
ＴＭＥＭ１７３ ＳＴＩＮＧ対立遺伝子
インターフェロン遺伝子の刺激物質（ＳＴＩＮＧ）は、約７ｋｂ長の遺伝子である膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）遺伝子によってコードされている。ヒトＴＭＥＭ１７３遺伝子は、対立遺伝子の顕著な不均一性および集団層別化によって特徴付けられる。最も多く見られるヒトＴＭＥＭ１７３対立遺伝子は、Ｒ２３２と称される（残基２３２に存在するアミノ酸を参照；例えば、様々なヒトＴＭＥＭ１７３対立遺伝子の配列に記載される配列番号３０５～３０９を参照のこと）。アメリカ人集団の半分よりも多くは、Ｒ２３２／Ｒ２３２ではない。２番目に多く見られる対立遺伝子はＲ７１Ｈ－Ｇ２３０Ａ－Ｒ２９３Ｑ（ＨＡＱ）である。他の多く見られる対立遺伝子は、ＡＱ（Ｇ２３０Ａ－Ｒ２９３Ｑ）、Ｑ（Ｑ２９３）およびＲ２３２Ｈ（Ｇｌｅｎ Ｂａｒｂｅｒによって最初に特定され、データベース中に収載された参照ＳＴＩＮＧ対立遺伝子にちなんでＲＥＦと名付けられた）を含む。
Ｒ２３２／Ｒ２３２は、ヨーロッパ人に最も多く見られる遺伝子型であるのに対し、ＨＡＱ／Ｒ２３２は、東アジア人に最も多く見られる遺伝子型である。アフリカ人はＨＡＱ／ＨＡＱ遺伝子型を有さず、Ｑ対立遺伝子を有し、アフリカ人の約４％は、他の民族集団に存在しないＡＱ／ＡＱである（例えば、Patel and Jin (2018) Genes & Immunity、doi:10.1038/s41435-018-0029-9を参照）。ＲＥＦ、ＡＱおよびＱ対立遺伝子は、３’３’ ｃ－ジ－ＧＭＰなどの細菌由来ＣＤＮに高度に不応性である（例えば、Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030を参照）。
ＳＴＩＮＧ機能獲得型突然変異
ＳＴＩＮＧに関する遺伝子、ＴＭＥＭ１７３における遺伝性およびデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）のいくつかの活性化突然変異または機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異は、希少自己炎症性疾患ＳＡＶＩ（小児期発症ＳＴＩＮＧ関連血管症）に連鎖している。ＳＡＶＩは、常染色体優性疾患であり、全身炎症、間質性肺疾患、皮膚血管炎、および再発性細菌感染によって特徴付けられる。デノボのＴＭＥＭ１７３突然変異を有するＳＡＶＩは、典型的には、早発（＜８週間）および重症表現型によって特徴付けられるのに対し、家族性突然変異は、遅発（ティーンエイジ～成人）およびより軽度の臨床症状をもたらす。遺伝性ＴＭＥＭ１７３活性化突然変異は、Ｇ１６６ＥおよびＶ１５５Ｍを含む一方で、デノボ突然変異は、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｃ２０６Ｙ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８１ＱおよびＳ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌを含む（例えば、Patel and Jin (2019) Genes & Immunity 20:82-89を参照）。特定された他の活性化ＴＭＥＭ１７３突然変異は、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１６Ｑ、およびＲ３７５Ａを含む（例えば、米国出願公報番号第２０１８／０３１１３４３号を参照）。ＴＭＥＭ１７３における別の機能獲得型突然変異は、高度に構成的活性なＳＴＩＮＧをもたらすＲ２８４Ｓであって、活性化ＣＤＮの非存在下で自然免疫シグナル伝達をトリガーし、炎症性サイトカインの慢性産生をもたらすことが見出されたＲ２８４Ｓである（例えば、Konno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123を参照）。
ＴＭＥＭ１７３突然変異、例えば、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５ＭおよびＶ１４７Ｌ、ならびに／または下の表に記載される突然変異のいずれかは、単独で、またはこれらおよび任意の他のそのような突然変異との任意の組合せで、例えばＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇで、構成的に活性で、リガンド刺激を必要としないかまたはリガンド刺激に高感受性の機能獲得型ＳＴＩＮＧをもたらし、ＳＴＩＮＧ－インターフェロン経路の慢性活性化に導く。これは実証されている（例えば、Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518を参照）。突然変異ＴＭＥＭ１７３（置換Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍの各々、および機能喪失型突然変異体Ｖ１５５Ｒを有する）、および非突然変異ＴＭＥＭ１７３のコンストラクトを、ＳＴＩＮＧ陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ＳＴＩＮＧリガンド、ｃＧＡＭＰを用いて刺激した。Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５ＭおよびＶ１４７Ｌ突然変異体をトランスフェクションされた細胞は、高度に上昇したＩＦＮＢ１（ＩＦＮ－βをコードする遺伝子）レポーター活性を表し、それは、ＳＴＩＮＧリガンドｃＧＡＭＰを用いた刺激によってあまりブーストされなかった。機能喪失型突然変異体（Ｖ１５５Ｒ）、非突然変異ＴＭＥＭ１７３、または対照プラスミドをトランスフェクションされた細胞は、顕著なベースライン活性化を有さなかった。ｃＧＡＭＰを用いた刺激は、非突然変異ＴＭＥＭ１７３を有する細胞において用量依存的な応答をもたらし、機能喪失型突然変異体を発現している細胞において最高のｃＧＡＭＰ濃度でのみ、最小の応答をもたらした（例えば、Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518を参照）。これらの結果は、活性化ＴＭＥＭ１７３突然変異が、ｃＧＡＭＰによる刺激の非存在下であってもＳＴＩＮＧの構成的活性化をもたらすことを示している。
Ｇ２０７Ｅは、脱毛症、光線過敏症、甲状腺機能不全、およびＳＡＶＩの特徴を引き起こす別の機能獲得型ＳＴＩＮＧ突然変異である。Ｇ２０７Ｅ突然変異は、ＨＥＫ細胞における炎症関連経路の構成的活性化のみならず、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における異常なインターフェロンシグネチャーおよびインフラマソーム活性化を引き起こす。Ｒ２３２またはＨ２３２対立遺伝子およびＧＯＦ突然変異Ｇ２０７Ｅを有するＳＴＩＮＧ変異体を使用して、ＣＤＮを用いた刺激後に、Ｒ２３２＋Ｇ２０７Ｅ変異体がＩＦＮ－βおよびＳＴＡＴ１／２経路において活性のわずかな増大をもたらしたのに対し、Ｈ２３２＋Ｇ２０７Ｅ変異体では、ＩＦＮ－βレベルは一定のままであり、ＳＴＡＴ１／２が活性低下を示したことが示された。両方の変異体は、刺激後に類似のＳＴＡＴ３およびＮＦ－κＢ経路の活性化を示した。これらの結果は、２３２位の残基ＲがｃＧＡＭＰの結合およびＩＦＮ誘導に重要であることを示し、Ｇ２０７Ｅ突然変異体が、ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の構成的活性化およびＮＦ－κＢ経路のリガンド依存性過剰活性化をもたらすことを示す。Ｒ２３２対立遺伝子およびＧ２０７Ｅ突然変異を有する患者は、より重症の疾患を有し；この多型は、突然変異体ＳＴＩＮＧの構成的活性化を増強し、下流の標的、例えばＩＦＮ、ＩＬ１－βおよびＩＬ－１８などの過剰発現をもたらした（例えば、Keskitalo et al. (2018)を参照、doi.org/10.1101/394353から入手可能）。
ネズミＳＴＩＮＧ（配列番号３６９）中の６７アミノ酸を個別または群のいずれかで突然変異させ（Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518を参照）、環状ジ－ＧＭＰ（ｃ－ジ－ＧＭＰ）の結合および／またはＩＦＮ誘導に関与するアミノ酸を特定した。特定された突然変異体の中には、ＩＦＮを低レベルのトランスフェクションで自然に誘導し、ｃ－ジ－ＧＭＰに応答しなかった、過剰活性突然変異体Ｒ１９６Ａ／Ｄ２０４Ａ、Ｓ２７１Ａ／Ｑ２７２Ａ、Ｒ３０９Ａ／Ｅ３１５Ａ、Ｅ３１５Ａ、Ｅ３１５Ｎ、Ｅ３１５Ｑ、およびＳ２７１Ａ（配列番号３０５～３０９に示されるヒトＳＴＩＮＧの配列を参照して、それぞれＲ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、およびＳ２７２Ａに対応する）、ならびに過剰発現された場合にＩＦＮを誘導したが、ｃ－ジ－ＧＭＰに応答しなかった、突然変異体Ｒ３７４Ａ、Ｒ２９２Ａ／Ｔ２９３Ａ／Ｅ２９５Ａ／Ｅ２９９Ａ、Ｄ２３０Ａ、Ｒ２３１Ａ、Ｋ２３５Ａ、Ｑ２７２Ａ、Ｓ３５７Ａ／Ｅ３５９Ａ／Ｓ３６５Ａ、Ｄ２３０Ａ／Ｒ２３１Ａ／Ｋ２３５Ａ／Ｒ２３７Ａ、およびＲ２３７Ａ（配列番号３０５～３０９に示されるヒトＳＴＩＮＧを参照して、それぞれＲ３７５Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ（ヒトＳＴＩＮＧにＥ２９９の相当物はない）、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、およびＲ２３８Ａに対応する）があった。一部のヒトＳＴＩＮＧ突然変異がｃ－ジ－ＧＭＰなどの細菌によって産生される３’３’ＣＤＮに対して低い親和性を有することが、後に発見されたので、これらの対立遺伝子はまだ、内因性ＣＤＮ、２’３’ｃ－ジ－ＧＡＭＰに応答し得る（例えば、Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030を参照）。
機能獲得型突然変異を有するこれらのタンパク質をコードする、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、これらのタンパク質の構成的活性化を活用して、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症性サイトカインの産生を増大させる。機能獲得型突然変異を有するＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、および／またはＲＩＧ－Ｉをコードする腫瘍標的化免疫刺激細菌は、本明細書に提供される。免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境におけるＩ型ＩＦＮ媒介性のサイトカインおよびケモカインの産生を増大させ、抗腫瘍免疫応答を増強し、免疫刺激細菌の治療有効性を改善する。ＳＴＩＮＧをコードする遺伝子は、ＴＭＥＭ１７３と称され、ＭＤＡ５をコードする遺伝子はＩＦＩＨ１であり、ＲＩＧ－Ｉをコードする遺伝子はＤＤＸ５８である。各遺伝子について多数の対立遺伝子、および対立遺伝子のいずれかを有する遺伝子中に存在し得る公知の突然変異があり、機能獲得型または構成的活性化をもたらす。下に記載された突然変異は、単独で存在する可能性も、また任意の組合せで使用される可能性もある。機能獲得をもたらす他の突然変異は、日常的なスクリーニング／突然変異プロトコールによって特定することができる。下の表は、ＳＴＩＮＧ／ＴＭＥＭ１７３（配列番号３０５～３０９）、ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１（配列番号３１０）、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８（配列番号３１１）、ＩＲＦ３（配列番号３１２）、およびＩＲＦ７（配列番号３１３）の各々における例示的な機能獲得型突然変異を記載する。他の突然変異、例えば、１つまたは複数のリン酸化部位の欠失または置換、例えばＳＴＩＮＧにおけるＳ３２４／Ｌ３２５／Ｓ３２６→Ｓ３２４Ａ／Ｌ３２５／Ｓ３２６Ａ、およびＳＴＩＮＧまたはそのようなシグナル伝達を採用する他のタンパク質における核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達を低減するためにリン酸化部位を無くすための他の置換も導入することができる。
もたらされるタンパク質は、本明細書に提供される免疫刺激細菌にコードされ得る。タンパク質は、免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされている。
野生型ＳＴＩＮＧをコードする核酸を投与することは、免疫応答を誘導し得る；腫瘍標的化免疫刺激細菌内の、本明細書に提供される構成的活性を有する機能獲得型ＳＴＩＮＧ突然変異体の投与は、より効力が高い免疫応答およびより有効な抗がん治療をもたらす。構成的に活性なＳＴＩＮＧ、または他のそのような改変ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、例えば、本明細書に提供されるＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３、またはＩＲＦ７の機能獲得型突然変異体の腫瘍標的化投与による増強した免疫応答は、治療的により有効な抗がん処置を提供する。例えば、本明細書に記載するように、免疫刺激細菌が上皮細胞に感染しないが、腫瘍常在性免疫細胞を含む食細胞に感染する能力を保持するようにそれらを改変することは、免疫刺激細菌を腫瘍微小環境に効果的に標的化し、治療効率を改善し、望ましくない全身免疫応答を防止する。これらの腫瘍標的化細菌は、例えば、リガンド刺激の非存在下であっても、構成的に活性な機能獲得型ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３、またはＩＲＦ７突然変異体をコードするように操作され、強力なＩ型ＩＦＮ応答を提供して、腫瘍微小環境における抗がん免疫応答を改善する。
したがって、例えば、構成的に活性化されたＳＴＩＮＧの投与は、がんの免疫療法処置のためのＳＴＩＮＧシグナル伝達をブーストするための代替手段を提供することができる。ある特定の実施形態では、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ２７２Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｆ２７９Ｌ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｓ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、およびＲ３７５Ａより選択される機能獲得型突然変異のみならず、その保存的突然変異を有するＳＴＩＮＧ／ＴＭＥＭ１７３（配列番号３０５～３０９）をコードするように、本明細書に提供される腫瘍標的化免疫刺激細菌を改変することができる。加えて、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４ＧなどのＳＴＩＮＧ機能獲得型突然変異の組合せは、単一の突然変異対応物と比較して、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を顕著に増加させる。これらの突然変異は、ＳＴＩＮＧの構成的活性をもたらす。
例示的な機能獲得型突然変異体の表
I型IFNの持続性発現をもたらす機能獲得型突然変異

配列番号３０５～３０９のいずれかに示されるように、ヒトＳＴＩＮＧの配列を参照したアミノ酸残基Ｒ１９７、Ｄ２０５、Ｒ３１０、Ｒ２９３、Ｔ２９４、Ｅ２９６、Ｓ２７２、Ｑ２７３、Ｅ３１６、Ｄ２３１、Ｒ２３２、Ｋ２３６、Ｓ３５８、Ｅ３６０、Ｓ３６６、およびＲ２３８は、それぞれ、配列番号３６９に示されるように、ネズミＳＴＩＮＧの配列を参照したアミノ酸残基Ｒ１９６、Ｄ２０４、Ｒ３０９、Ｒ２９２、Ｔ２９３、Ｅ２９５、Ｓ２７１、Ｑ２７２、Ｅ３１５、Ｄ２３０、Ｒ２３１、Ｋ２３５、Ｓ３５７、Ｅ３５９、Ｓ３６５、およびＲ２３７に対応する。置換の各々の保存的置換えも含まれる（例えば、各アミノ酸について例示的な保存的突然変異を記載している、定義のセクションの表を参照）。
ｂ．構成的ＩＲＦ３発現および機能獲得型突然変異
ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３、またはＩＲＦ－３）およびＩＲＦ７（またはＩＲＦ－７）は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の重要な活性化因子である。ウイルス誘導Ｃ末端リン酸化（ＴＢＫ１による）の後に、活性化ＩＲＦ３およびＩＲＦ７は、ホモ二量体を形成し、細胞質から核へと転位し、ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）に結合してＩ型ＩＦＮ応答を誘導する。ＩＲＦ３は、刺激されていない細胞内で構成的に発現され、不活性細胞質形態として存在するのに対し、ＩＲＦ７は、細胞内で構成的に発現されず、ＩＦＮ、リポ多糖、およびウイルス感染によって誘導される。ＩＲＦ３の過剰発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子のウイルス媒介発現を有意に増大させ、抗ウイルス状態の誘導をもたらす。ＩＲＦ３の活性化はまた、ウイルス感染後にＣＣ－ケモカインＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）の転写をアップレギュレーションすることが示されている（例えば、Lin et al. (1999) Mol. Cell Biol. 19(4):2465-2474を参照）。
ＩＲＦ３のＣ末端ドメインにおける残基Ｓ３８５、Ｓ３８６、Ｓ３９６、Ｓ３９８、Ｓ４０２、Ｔ４０４、およびＳ４０５は、ウイルス感染後にリン酸化され、ＩＲＦ３の活性化をもたらすコンフォメーション変化を誘導する。ＩＲＦ３の活性化は、ウイルス感染だけでなく、リポ多糖（ＬＰＳ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）によっても誘導される。ＩＲＦ３のＣ末端クラスター中でリン酸化され得る７つの残基のうち、単一の点変異、Ｓ３９６Ｄは、ＩＲＦ３の構成的活性型の生成に十分である。ＩＲＦ３（Ｓ３９６Ｄ）は、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－β、およびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化を野生型ＩＲＦ３と比較してそれぞれ１３、１４、および１１倍増強する。別の突然変異体、ＩＲＦ３（Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ）は、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－β、およびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化を野生型ＩＲＦ３と比較してそれぞれ１３、１２、および１２倍増強する。ＩＲＦ３の別の構成的活性突然変異体は、３９６、３９８、４０２、４０４、および４０５位のセリンまたはトレオニン残基がリン酸化模倣アスパラギン酸残基によって置換されているＩＲＦ３（５Ｄ）［ＩＲＦ３（Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄ）］である。Ｉ型インターフェロンの誘導などの免疫応答メディエータの構成的活性をもたらす類似の機能獲得型突然変異は、免疫応答シグナル伝達経路内の他のタンパク質、例えばＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、およびＳＴＩＮＧにおけるセリン残基をリン酸化模倣アスパラギン酸に突然変異させることによって達成することができる。
ＩＲＦ３（５Ｄ）は、構成的ＤＮＡ結合およびトランス活性化活性、二量体形成、転写コアクチベーターｐ３００（ＥＰ３００、またはＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００とも呼ばれる）／ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質、またはＣＲＥＢＢＰとしても知られる）との会合、および核局在を表す。そのトランス活性化活性は、ウイルス感染によってさらに誘導されない。ＩＲＦ３（５Ｄ）は、ＩＦＮ－βおよびＩＳＧ－１５の遺伝子発現の非常に強力な活性化因子であり；ＩＲＦ３（５Ｄ）は、単独でＩＦＮ－β発現をウイルス感染と同じほど強く刺激し、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－β、およびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化を野生型ＩＲＦ３と比較してそれぞれ９倍、５．５倍、および８倍増強する（例えば、Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327; Lin et al. (1998) Mol. Cell Biol. 18(5):2986-2996；およびServant et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(11):9441-9447を参照）。Ｓ３８５、Ｓ３８６、Ｓ３９６、Ｓ３９８、Ｓ４０２、Ｔ４０４、およびＳ４０５位のいずれかを、単独でまたは組み合わせて突然変異させて、本明細書に提供される免疫刺激細菌内に構成的に活性なＩＲＦ３突然変異体を産生することができる。
ｃ．活性が増大しているかまたは構成的活性を有する非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびその変異体、ならびに活性が増大しているかまたは構成的活性を有するＳＴＩＮＧキメラおよびその変異体
上述のように、細胞内二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、転写因子インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）を活性化する小胞体（ＥＲ）常在性アダプタータンパク質ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激物質）を経由してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を刺激する。ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）／ＩＲＦ３軸は、Ｉ型ＩＦＮの誘導、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫を活性化するための樹状細胞（ＤＣ）の活性化および腫瘍抗原の交差提示をもたらす。ＳＴＩＮＧシグナル伝達はまた、活性化Ｂ細胞（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達軸の核因子カッパ軽鎖エンハンサーを活性化し、炎症促進応答をもたらすが、抗腫瘍免疫に必要とされるＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらさない。
２’３’ｃＧＡＭＰを認識すると、ＳＴＩＮＧは小胞体からゴルジ装置を通過して転位し、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の動員ならびに転写因子ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの活性化を可能にする。ＳＴＩＮＧのカルボキシル末端尾部（Ｃ末端尾部またはＣＴＴ）領域は、ＴＢＫ１を活性化し、ＩＲＦ３のリン酸化を刺激するために必要かつ十分であり；それは、ＮＦ－κＢシグナル伝達にも関与する。ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧのリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要とされる配列モチーフを含有する約４０アミノ酸の構造不定のストレッチである。ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの下流シグナル伝達は、脊椎動物種の間で保存されているＳＴＩＮＧのＣ末端尾部（ＣＴＴ）内の特定の配列モチーフに起因する。ＩＲＦ３結合モジュール、ＴＢＫ１結合モジュールおよびＴＲＡＦ６結合モジュールを含む、ＣＴＴ内のモジュラーモチーフは、細胞シグナル伝達および免疫応答の強度および特異性を制御する。
種、およびＳＴＩＮＧのＣＴＴの別個のエレメントのそれぞれの特徴に依存して、ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの下流の応答が影響される場合があり、時には相反する。ＳＴＩＮＧのＣＴＴエレメントは、２つのシグナル伝達経路の間の均衡を指示し、きめ細かく調整し、異なる生物学的応答をもたらす。ヒトおよびマウス免疫細胞において、例えば、ＳＴＩＮＧ依存性ＩＲＦ３活性化は、主にＩ型インターフェロン応答をもたらす。ヒト細胞におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達はまた、ＴＲＡＦ６動員を介してカノニカルＮＦ－κＢ経路および可能性があることに非カノニカルＮＦ－κＢ経路を経由して炎症促進応答を駆動する。ヒトＳＴＩＮＧ残基Ｓ３６６（例えば、配列番号３０５－３０９参照）は、ＣＴＴ内のＬｘＩＳモチーフの部分である一次ＴＢＫ１リン酸化部位であり、それは、ＩＲＦ３の結合に必要とされるのに対し、残基Ｌ３７４を含む第２のＰｘＰＬＲモチーフは、ＴＢＫ１の結合に必要とされる。ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲモチーフは、すべての脊椎動物ＳＴＩＮＧ対立遺伝子において高度に保存されている。他の種では、ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、主にＮＦ－κＢシグナル伝達軸の活性化をもたらす。例えば、ＮＦ－κＢシグナル伝達の過剰活性化に応答性であるゼブラフィッシュＣＴＴは、ヒトおよび他の哺乳動物ＳＴＩＮＧ対立遺伝子に存在しないＣ最末端で高度に保存されたＰｘＥｘｘＤモチーフによる伸長を含有し；このモチーフは、腫瘍壊死因子受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）結合部位と類似性を共有する。ヒトＳＴＩＮＧシグナル伝達におけるＴＲＡＦ６の役割が可欠であるのに対し、ＴＲＡＦ６の動員は、ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ誘導ＮＦ－κＢ活性化に不可欠である。ヒトＳＴＩＮＧがゼブラフィッシュＳＴＩＮＧのＣＴＴモジュールＤＰＶＥＴＴＤＹを含有するように操作されたヒト－ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧキメラは、ＮＦ－κＢ活性化の１００倍よりも大きい活性化を誘導したが、これは、増強したＮＦ－κＢシグナル活性化を指示するためにこの領域が必要かつ十分であることを指し示している。ゼブラフィッシュＣＴＴの付加はまた、増大したＳＴＩＮＧインターフェロン応答をもたらした（de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175を参照）。
本明細書では、ＩＲＦ３とＮＦ－κＢシグナル伝達との間の均衡における種間差を活用して、低減したＮＦ－κＢシグナル伝達を有し、かつ／または増大したＩＲＦ３シグナル伝達を有してもよい改変ＳＴＩＮＧタンパク質を産生する。それにより、ＴＭＥにＳＴＩＮＧタンパク質が送達され、そこで発現されたとき、もたらされる応答は、無改変ＳＴＩＮＧタンパク質と比較して増大した抗腫瘍／抗ウイルス応答である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるまたは当業者に公知の免疫刺激細菌のいずれかを含むデリバリー媒体内のみならず、腫瘍溶解性ベクターを含むウイルスベクター、ミニセル（ｍｉｎｉｃｅｌｌ）、エキソソーム、リポソームなどの他のデリバリー媒体内に、ならびに細胞療法に使用され、細菌および腫瘍溶解性ベクターなどの媒体を送達するために使用されるＴ細胞などの細胞内に、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低いかまたは無い種からのＳＴＩＮＧタンパク質が提供される。
非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、以下の種からのＳＴＩＮＧタンパク質であり得るが、それに限定されるわけではない：タスマニアンデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ；配列番号３４９）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ；配列番号３５９）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ；配列番号３６０）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ；配列番号３５６）、ダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ；配列番号３６１）、トキ（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ；配列番号３６２）、シーラカンス（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ；配列番号３６３～３６４）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ；配列番号３６５）、コウモリ（Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ；配列番号３６６）、マナティー（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ；配列番号３６７）、ギンザメ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ；配列番号３６８）、およびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；配列番号３６９）。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒト細胞における免疫シグナル伝達を容易に活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子メカニズムが脊椎動物において共通であることを指し示している（de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175を参照）。
他の実施形態では、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、上記のヒトＳＴＩＮＧ内の座位に対応する非ヒトＳＴＩＮＧ内の対応する座位に、構成的ＳＴＩＮＧ活性化および機能獲得型突然変異のいずれかを含有する（様々な種における例示的なアライメントおよび対応する突然変異を提供する、下記の実施例１７を参照；図１～１３も参照）。
他の実施形態では、ＳＴＩＮＧタンパク質のキメラが提供される。キメラでは、ＮＦ－κＢシグナル伝達／活性を与えるかまたはそれに関与する第１の種のＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴ領域またはその部分（複数可）は、そのＳＴＩＮＧタンパク質がより低いまたは非常に小さいヒト未満のＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する第２の種からの対応するＣＴＴまたはその部分（複数可）と置換される。一般的に、第１の種はヒトであり、ＣＴＴまたはその部分（複数可）の置換は、ずっと低いＮＦ－κＢ活性を有するタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、およびギンザメなどの種のＳＴＩＮＧからのものである。それにより、これは、抗腫瘍活性に重要なＩ型インターフェロンを誘導するＳＴＩＮＧタンパク質であって、抗腫瘍療法に望ましくないＮＦ－κＢ活性が限られているかまたは無いＳＴＩＮＧタンパク質をもたらす。キメラは、対応する座位にヒト構成的ＳＴＩＮＧ活性化および機能獲得型突然変異をさらに含んで、Ｉ型インターフェロン活性を増大させる、または構成的にすることができる。すべての実施形態では、ＴＲＡＦ６結合モチーフを欠失させて、抗腫瘍治療に望ましくない活性をさらに減少させるかまたは無くすことができる。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、キメラ、および突然変異体は、本明細書に記載される、または当業者に公知のいずれかなどの、腫瘍溶解性ウイルスベクター、細胞、例えば細胞療法に使用される幹細胞およびＴ細胞、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積し、コードされているタンパク質を腫瘍微小環境および腫瘍に送達するエキソソーム、ミニセル、リポソーム、および本明細書に提供される免疫刺激細菌を含む、デリバリー媒体中に提供される。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、改変ＳＴＩＮＧタンパク質、およびＳＴＩＮＧキメラは、本明細書に記載される腫瘍の処置のための治療薬として使用するため、または当業者に公知の他の方法に使用するためのものである。ＳＴＩＮＧタンパク質、デリバリー媒体、およびコードしている核酸を含有する医薬組成物もまた提供される。
ｄ．細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその構成的変異体として作用する他の遺伝子産物
細胞内核酸を感知する、またはそれと相互作用する他の遺伝子産物は、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）およびＭＤＡ５（黒色腫分化関連タンパク質５）を含むＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）である。ＲＬＲは、細菌によって分泌される、ウイルスｄｓＲＮＡおよび核酸の細胞質センサーであり、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、およびＬＧＰ２（遺伝学および生理学研究室２）を含む。ウイルスｄｓＲＮＡ、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５などのリガンドが結合した際に、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達アダプタータンパク質、またはＭＡＶＳを活性化し、それが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を動員して、ミトコンドリア外膜にシグナル伝達複合体を集合させる。下流のシグナル伝達成分が、ＴＲＡＦによってさらに動員され、ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＩＲＦ７、ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー）、およびＡＰ－１（アクチベータータンパク質１）のリン酸化および活性化をもたらす。結果として、ＩＦＮ、炎症性サイトカイン、および病原体排除に関与する他の遺伝子の発現が誘導される（例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。ＳＴＩＮＧのように、機能獲得型突然変異によるＭＤＡ５およびＲＩＧ－Ｉの構成的活性化は、Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらし、それを、免疫刺激細菌における抗腫瘍免疫応答を増強するために活かすことができる。
ｉ．ＲＩＧ－Ｉ
ＤＤＸ５８（ＤＥＸＤ／Ｈ－ボックスヘリカーゼ５８）としても知られるレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）は、その構成的活性化がインターフェロン症、例えば非定型スミス・マゲニス症候群の発生に連鎖している別のタンパク質である。ＲＩＧ－Ｉは、ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１のように、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーのメンバーであり、ウイルスｄｓＲＮＡの検出に機能する９２５残基の細胞内パターン認識受容体である。ＲＩＧ－Ｉは、Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮならびに炎症性サイトカインの発現を促進する独立した経路を通過してウイルスＲＮＡに対する自然免疫応答を開始する（例えば、Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274;およびLu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。
歯の異常の特徴を有さないが、緑内障、大動脈石灰化、および骨格異常を含む可変性の表現型を有する、非定型スミス・マゲニス症候群は、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）をコードするＤＥＸＤ／Ｈ－ボックスヘリカーゼ５８遺伝子（ＤＤＸ５８）における突然変異によって引き起こされることが見出されている。特に、ＤＤＸ５８における突然変異Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆは、ＲＩＧ－Ｉに機能獲得を引き起こすと特定された。突然変異ＤＤＸ５８の量の増大は、ＮＦ－κＢレポーター遺伝子活性の基礎レベルにおける有意な増大と関連し、この活性は、ｄｓＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）を用いた刺激によってさらに増大した。ＲＩＧ－Ｉ突然変異はまた、基礎ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞およびポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の両方における基礎レベルのＩＲＦ３のリン酸化および二量体化を誘導し、ＩＦＮＢ１、インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）、およびケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）の発現増大をもたらした。これらの結果は、突然変異ＤＤＸ５８／ＲＩＧ－Ｉが構成的活性化をもたらし、ＩＦＮ活性およびＩＦＮ刺激遺伝子発現の増大をもたらすことを指し示している（例えば、Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274；およびLu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆなどであるがそれに限定されるわけではない機能獲得型突然変異を単独および組合せで有するＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８（例えば、配列番号３１１参照）をコードするように、本明細書に提供される腫瘍標的化免疫刺激細菌を改変することができる。
ｉｉ．ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１
別のインターフェロン症遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ様ファミリーの細胞質ＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡ受容体のメンバーである、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）としても知られるヘリカーゼＣドメイン含有ＩＦＮ誘導性タンパク質１（ＩＦＩＨ１）である。ＩＦＩＨ１によってコードされているＭＤＡ５は、細胞質内のウイルス二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および分泌性細菌核酸を感知し、アダプター分子、ＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質）を経由するＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化する、アミノ酸１，０２５個の細胞質パターン認識受容体である。ＭＡＶＳは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を動員し、これは今度は、下流のシグナル伝達成分を動員し、ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＩＲＦ７、ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞核因子カッパ軽鎖エンハンサー）、およびＡＰ－１（アクチベータータンパク質１）のリン酸化および活性化をもたらす。これは、ＩＦＮ、炎症性サイトカイン、および病原体の排除に関与する他の遺伝子の発現ももたらす（例えば、Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282; Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509；およびLu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。
機能獲得型（ＧＯＦ）ＩＦＩＨ１変異体は、血管の顕著な炎症によって特徴付けられるアイカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）およびシングルトン・マートン症候群（ＳＭＳ）を含む自己免疫障害を有する対象に存在する。ＡＧＳは、特に脳および皮膚を冒す炎症性疾患であり、インターフェロン誘導転写物のアップレギュレーションによって特徴付けられる。ＡＧＳは、典型的には、ＤＮＡエキソヌクレアーゼＴＲＥＸ１、ＲＮアーゼＨ２エンドヌクレアーゼ複合体、デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼＳＡＭＨＤ１、および二本鎖ＲＮＡ編集酵素ＡＤＡＲ１の３つの非対立遺伝子成分をコードする遺伝子のいずれかにおける突然変異により発生する。ＡＧＳを有する一部の患者は、これらの遺伝子のいずれにも突然変異を有さないが、ＩＦＩＨ１にＧＯＦ突然変異を有し、これは、この遺伝子がＡＧＳにも意味付けられることを指し示している。シングルトン・マートン症候群は、血管（例えば、石灰化）、歯（例えば、早期発症歯周炎、歯根吸収）、および骨（例えば、骨減少症、先端骨溶解症、骨粗鬆症）における異常によって特徴付けられる常染色体優性障害である。インターフェロンシグネチャー遺伝子は、シングルトン・マートン症候群の患者においてアップレギュレーションされ、これはＩＦＩＨ１におけるＧＯＦ突然変異と連鎖した（例えば、Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509；およびRutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282を参照）。
野生型ＩＦＩＨ１、およびＡＧＳ患者において特定された６つのＩＦＩＨ１ ＧＯＦ突然変異体（Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ３３７Ｇ、Ｒ７７９Ｃ、Ｇ４９５Ｒ、Ｄ３９３Ｖ）のＩＦＮ－βレポーター刺激活性を、低レベルの内因性ウイルスＲＮＡ受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において比較した。長鎖（＞１ｋｂ）ｄｓＲＮＡアナログであるポリイノシンポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］が結合した際に野生型ＩＦＩＨ１が誘導されたが、短鎖１６２ｂｐのｄｓＲＮＡによっては誘導されず、外因性ＲＮＡの非存在下で最小の活性を有した。ＩＦＩＨ１突然変異体は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答する強いシグナル伝達に加えて、短鎖１６２ｂｐのｄｓＲＮＡに応答するＩＦＮシグナル伝達の顕著な誘導を示した。突然変異体はまた、外因性リガンドの非存在下で４～１０倍高いレベルのベースラインシグナル伝達活性を表した（Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509）。
別の機能獲得型ＩＦＩＨ１突然変異、Ｒ８２２Ｑが、Ｉ型ＩＦＮ産生をトリガーし、早期動脈石灰化のみならず、歯の炎症および吸収をもたらすことによってシングルトン・マートン症候群を引き起こすと特定された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（最低レベルの内因性ＩＦＩＨ１発現を有する）を使用して、野生型およびＲ８２２Ｑ ＭＤＡ５を過剰発現させた。野生型ＩＦＩＨ１の発現は、ＩＦＮＢ１（インターフェロン、ベータ１、線維芽細胞）の発現増大を用量依存的にもたらした一方で、突然変異ＩＦＩＨ１は、約２０倍大きいＩＦＮＢ１発現をもたらした。ｄｓＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）を用いた刺激後に、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１は、野生型ＩＦＩＨ１よりも高いレベルのＩＦＮＢ１発現をもたらし、これは、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１が非自己ｄｓＲＮＡに過剰活性であることを指し示している。シングルトン・マートン症候群患者からの全血試料中にＩＦＩ２７、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＲＳＧ１５、ＲＳＡＤ２、およびＳＩＧＬＥＣ１などのインターフェロンシグネチャー遺伝子のより高い発現もあり、これは、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１によるＩＦＮＢ１の発現レベルがより高いことと一致した（例えば、Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282を参照）。
ＩＦＩＨ１の別のＧＯＦ突然変異、Ａ４８９Ｔを有する患者に観察されるインターフェロンシグネチャーは、Ｉ型インターフェロン症を指し示し；ＩＦＩＨ１ Ａ４８９Ｔは、増大したインターフェロン産生ならびに凍瘡状狼瘡、ＡＧＳおよびＳＭＳに類似する表現型に関連する（例えば、Bursztejn et al. (2015) Br. J. Dermatol. 173(6):1505-1513を参照）。Ａ４８９Ｔ変異体は、長鎖ｄｓＲＮＡアナログ、ポリ（Ｉ：Ｃ）を用いた刺激後だけでなく、短鎖ｄｓＲＮＡを用いた刺激後にもＩＦＮ誘導をもたらした。ＩＦＩＨ１、Ｔ３３１ＩおよびＴ３３１Ｒにおける２つの追加的な機能獲得型突然変異が、ＩＦＮ誘導転写物の有意なアップレギュレーションを提示したＳＭＳ表現型を有する患者において特定された。Ｔ３３１ＩおよびＴ３３１Ｒ変異体は、ＭＤＡ５の観察された構成的活性化と一致して、外因性ｄｓＲＮＡリガンドの非存在下であってもＩＦＮ－βの発現増大をもたらした（例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。
Ａ９４６Ｔは、Ｉ型ＩＦＮの産生増大をもたらし、炎症を促進し、自己免疫のリスクを増大させる、ＩＦＩＨ１の別のＧＯＦ突然変異である。ＩＦＩＨ１におけるＡ９４６Ｔ突然変異は、ＳＴＩＮＧにおけるＴＭＥＭ１７３ Ｒ２３２対立遺伝子およびＧ２０７Ｅ ＧＯＦ突然変異と組み合わせた場合に相加的作用をもたらし、ＳＡＶＩに類似する特徴を有する重症早期発症表現型をもたらす（例えば、Keskitalo et al. (2018)を参照、前刷りはdoi.org/10.1101/394353から入手可能）。Ｇ８２１Ｓは、マウスモデルにおいて自然発生狼瘡様自己免疫症状をもたらすことが示されている、ＩＦＩＨ１におけるＧＯＦ突然変異であるのに対し（例えば、Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282を参照）、ＡＧＳを有する個体において特定されたＩＦＩＨ１ミスセンス突然変異Ａ４５２Ｔ、Ｒ７７９ＨおよびＬ３７２Ｆは、Ｉ型インターフェロンの過剰産生を引き起こすことが示された（例えば、Oda et al. (2014) Am. J. Hum. Genet. 95:121-125を参照）。
Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ｒ３３７Ｇ、Ｌ３７２Ｆ、Ｄ３９３Ｖ、Ａ４５２Ｔ、Ａ４８９Ｔ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｇ８２１Ｓ、Ｒ８２２Ｑ、およびＡ９４６Ｔから選択される機能獲得型突然変異を単独または任意の組合せで有するＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１をコードするように、本明細書に提供される腫瘍標的化免疫刺激細菌を改変することができる（例えば、配列番号３１０を参照）。
ｉｉｉ．ＩＲＦ７
構成的活性型のＩＲＦ７（またはＩＲＦ－７）は、ＩＲＦ７（Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）、ＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）、およびＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄ）を含む、異なるＣ末端セリンがリン酸化模倣Ａｓｐによって置き換えられた突然変異体を含む。ＩＲＦ７（Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）は、ＩＦＮＡおよびＲＡＮＴＥＳ遺伝子の発現に関する強力なトランスアクチベーターであって、ウイルス感染の非存在下であっても遺伝子発現を刺激する。ＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）、およびＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄ）は、ＩＲＦ７（Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）のトランス活性化活性をさらに増強しないが、３つの突然変異体すべてのトランス活性化活性は、ウイルス感染によってさらに刺激される。未感染細胞内の核に局在する突然変異体ＩＲＦ７（Δ２４７－４６７）は、ＩＲＦ７の非常に強力な構成型であり；これは、未刺激細胞およびウイルス感染細胞において野生型ＩＲＦ７よりも転写を１５００倍よりも高く活性化する（例えば、Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327を参照）。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、残基４７５～４７７、４７９、４８３、および４８７に置換を有するもの、ならびにアミノ酸欠失を有するものを含む、構成的に活性なＩＲＦ７突然変異体をコードし、発現し得る。免疫刺激細菌は、ヒトを含む哺乳動物宿主によって認識されるプロモーターおよび任意の他の所望の調節シグナルの制御下でプラスミド上にこれらのタンパク質をコードする。
ｅ．他のＩ型ＩＦＮ調節タンパク質
構成的Ｉ型ＩＦＮ発現を生成するために、Ｉ型ＩＦＮ応答を活性化するＤＮＡ／ＲＮＡの認識に関与する他のタンパク質を突然変異させることができる。無改変および／または改変タンパク質は、タンパク質を腫瘍微小環境、例えば腫瘍常在性免疫細胞に送達して、Ｉ型ＩＦＮの発現を増大させるために使用するために、本明細書に提供される免疫刺激細菌内にコードされ得る。
これらのタンパク質は、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９（ＤＤＸ９）、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００と呼ばれるタンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。

機能獲得型変異体は、スクリーニングおよび／または突然変異誘発などによって産生され得る。部位特異的突然変異誘発をインビトロで行って、より高いレベルおよび／または構成的Ｉ型ＩＦＮ発現をもたらす活性増強を有する突然変異を特定することができる。無傷のゲノムＤＮＡを、自己免疫症状および自己炎症症状を経験している血縁関係のない患者、および健康な個体から得て、その発現がＩ型ＩＦＮの発現増大または構成的発現をもたらす他の産物についてスクリーニングし、それを特定することができる。全エキソームシークエンシングを行うことができ、イントロンおよびエクソンを分析することができ、それにより、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現に関連する経路における、突然変異を有するタンパク質が特定される。突然変異の特定後、特定された突然変異（複数可）を有するおよび有さない完全長遺伝子をコードしているｃＤＮＡ分子が、Ｉ型インターフェロンの発現を測定するレポーター細胞系にトランスフェクションされる。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βについてのプロモーターの制御下に置かれるレポーター細胞系を生成することができる。構成的に活性な機能獲得型突然変異体は、ＩＦＮ－βの発現を促進するのに対し、未刺激野生型タンパク質は促進しないであろう。刺激は、ウイルス感染、細菌感染、細菌核酸、ＬＰＳ、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、またはタンパク質のリガンド（例えば、ＣＤＮ）の外因性レベルを増大させることによる場合がある。特定されたタンパク質はまた、対象における目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するものを含む。免疫応答は、（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること；（ｉｉ）ＮＦ－κＢ経路のシグナル伝達を刺激すること；（ｉｉｉ）炎症応答を刺激すること；（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；（ｖ）樹状細胞の発生、活性、または動員を刺激すること；（ｖｉ）その発現が免疫応答を増強する産物を指し示す任意の他の応答；および（ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）の任意の組合せのうち１つまたは複数によって特徴付けられる細胞性免疫応答または液性免疫応答を含む。
３．抗体および抗体断片
抗体操作における進歩は、特に製造、組織透過、および使用の容易さに関して、従来のモノクローナル抗体を超える多くの改善を有する組換え抗体断片の創出をもたらしている。これらの例は、一般的に（Ｇ４Ｓ）３配列であるフレキシブルなペプチドリンカーによって一緒につながった抗体結合部位の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単鎖断片可変部（ｓｃＦｖ）である（例えば、Weisser et al. (2009) Biotechnol. Adv. 27(4):502-520を参照）。他の例は、ｓｃＦｖのＶＨドメインがＦｃ領域に連結されているｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片、ならびに当業者に既知である抗体の二量体および多量体および他の組合せと形態を含む。抗体断片および他のコンストラクトは、本明細書において例示されるようにプラスミド上にコードされ、送達され得る方法で、免疫刺激細菌による抗原の標的化を可能にする。標的化すべき抗原の例は、下記の実施例に記載されるもの、および以下および本明細書の別の箇所に記載される他の例示的な標的を含む腫瘍抗原が挙げられる。立体構造または構造における変化の際に形成されるネオアンチゲンのような当業者に既知のあらゆる標的抗原が含まれる。
ａ．ＴＧＦ－β
形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）は、胚形成、創傷治癒、血管新生、および免疫調節に数多くの役割を有する多彩なサイトカインである。それは、哺乳動物細胞において３つのアイソフォーム、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３として存在する；ＴＧＦ－β１が免疫細胞内に最も支配的である（例えば、Esebanmen et al. (2017) Immunol. Res. 65:987-994を参照）。ＴＧＦ－βの免疫抑制剤としての役割は、ほぼ間違いなくその最も優位の機能である。腫瘍微小環境内の潜在型からのその活性化は、特に、ＤＣおよびそれが抗原特異的Ｔ細胞を寛容化する能力に顕著な免疫抑制効果を有する。ＴＧＦ－βはまた、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞を免疫抑制性Ｔｒｅｇに直接的に変換することができ、腫瘍トレランスをさらに促進する（例えば、Travis et al. (2014) Annu. Rev. Immunol. 32:51-82を参照）。その腫瘍特異的免疫抑制性機能に基づき、ならびにその公知のがん細胞成長および転移促進特性にかかわらず、ＴＧＦ－βの阻害は、がん治療の標的である。高レベルのＴＧＦ－βシグナル伝達は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含むいくつかのヒト腫瘍型で実証されている（例えば、Colak et al. (2017) Trends Cancer 3(1):56-71を参照）。ＴＧＦ－βの全身阻害は、許容できない自己免疫毒性をもたらす可能性があり、その阻害は、腫瘍微小環境に局在すべきである。これを遂行する一方法は、ＴＧＦ－βと結合するためのデコイとして作用する可溶性ＴＧＦ－β受容体を創出することである（例えば、Zhang et al. (2008) J. Immunol. 181:3690-3697を参照）。このように、本明細書に提供されるＴＧＦ－β受容体デコイを含有する腫瘍標的化免疫刺激細菌は、ＴＧＦ－βと結合し、腫瘍微小環境からそれを排除し、それにより、腫瘍の免疫トレランスを破壊し、抗腫瘍免疫を刺激することができる。
ＴＧＦ－ベータ結合性デコイ受容体に加えて、ＴＧＦ－βと結合し、腫瘍微小環境からそれを排除または低減し、それにより、腫瘍の免疫トレランスを破壊し、抗腫瘍免疫を刺激することができる他のＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストが含まれる。そのようなＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストには、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチドが含まれる。
腫瘍微小環境内、腫瘍内、特に、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積する免疫刺激細菌であって、例えば、ＴＧＦ－ベータ結合性デコイ受容体（ＴＧＦ－β受容体デコイ）、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦベータアンタゴニストポリペプチドを含むＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストをコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌が、本明細書に提供される。抗体断片は、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃなどであるが、それに限定されるわけではない、当技術分野において公知の、または本明細書に記載される、任意のものを含み得る。
ｂ．二重特異性ｓｃＦｖおよびＴ細胞エンゲージャー（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）
ｓｃＦｖの使用は、多くの場合に、長いリンカーによって一緒につながった１つまたは複数のｓｃＦｖ断片（二重特異性、三重特異性など）の使用により、標的への結合価を増大させることによって改善されている。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）の商標で入手可能）コンストラクトは、がん免疫療法で利用される人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスであって、一方のｓｃＦｖが細胞傷害性Ｔ細胞の表面でＣＤ３と結合し、他方が特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合するように、２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を連結することによって形成される。したがって、ＢｉＴＥ（登録商標）は、Ｔ細胞を腫瘍細胞に標的化し、ＭＨＣクラスＩまたは共刺激分子に依存せずに、Ｔ細胞活性化、サイトカイン産生、および腫瘍細胞細胞傷害性を刺激する。腫瘍抗原ＥｐＣＡＭ、およびＣＤ３に対し、悪性腹水の処置に使用されるカツマキソマブ、ならびに再発、難治性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の処置のために使用される、ＣＤ１９およびＣＤ３に対するＢｉＴＥ（登録商標）抗体であるブリナツモマブを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））の２つの例が、ＦＤＡによって承認されている（例えば、Ahamadi-Fesharaki et al. (2019) Mol. Ther. Oncolytics 14:38-56を参照）。他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、デルタ様リガンド３（ＤＤＬ３）、および黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）を含む他の抗原を標的化する。本明細書において例示されるように、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体はまた、免疫刺激細菌によるデリバリー後にプラスミドから発現され得る。
ｃ．抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＣＴＬＡ－４抗体
ｉ．抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、免疫応答の負の調節に関与する免疫阻害受容体である。その同族リガンド、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現され、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合した際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能の喪失をもたらし、Ｔ細胞トレランスを誘導する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ある特定のヒトがんにおいて腫瘍の侵襲性および生存低減と関連することが多い（例えば、Gao et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(3):971-979を参照）。
抗ＰＤ－１（例えば、ペムブロリズマブ、およびニボルマブ）および抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブ）抗体などの、免疫チェックポイントを遮断するように設計された抗体は、Ｔ細胞アネルギーを防止し、免疫トレランスを破壊することができる。しかし、処置された患者のごくわずかが臨床的利益を表し、それを表す患者は、自己免疫関連毒性を提示することが多い（例えば、Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373(16):1490-1492；およびTopalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366(26):2443-2454参照）。毒性を獲得する以外に、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１療法は抵抗性をもたらすことが多く、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）の併用は、臨床試験において限られた成功を示し、顕著な相加毒性を有する。毒性を制限し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断の効力を増強するために、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に対する抗体または抗体断片、例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ、ならびに当技術分野において公知のおよび／または本明細書に記載されるその他をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌は、免疫細胞の活性化と相乗作用して抗腫瘍免疫を増強する。
ｉｉ．抗ＣＴＬＡ－４抗体
ＣＤ１５２（分化クラスター１５２）としても知られるＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答をダウンレギュレーションする、別の免疫阻害受容体である。ＣＴＬＡ－４は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、またはＴｒｅｇ）において構成的に発現され、それらの阻害機能に寄与するが、活性化後にだけ従来のＴ細胞においてアップレギュレーションされる。ＣＴＬＡ－４は、阻害シグナルをＴ細胞に伝達することによって免疫チェックポイントとして機能する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８と相同であり、両方の分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ８０（Ｂ７－１またはＢ７．１としても知られる）およびＣＤ８６（Ｂ７－２またはＢ７．２としても知られる）リガンドに結合する。ＣＴＬＡ－４のこれらのリガンドへの結合は、阻害シグナルをＴ細胞に伝達する一方で、ＣＤ２８の結合は刺激シグナルを伝達する。
Ｔ細胞の活性化後、ＣＴＬＡ－４受容体が誘導され、それは次いでＡＰＣ表面のＣＤ８０およびＣＤ８６リガンドとの結合をＴ細胞上のＣＤ２８受容体と競合して打ち負かす。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０およびＣＤ８６にＣＤ２８よりも大きな親和性およびアビディティーで結合することで、ＣＴＬＡ－４はそのリガンドをＣＤ２８と競合して打ち負かすことができ、Ｔ細胞への阻害シグナルの伝達および免疫阻害応答がもたらされる。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ－４の発現増大をもたらす。
最適なＴ細胞プライミングは、Ｔ細胞ＣＤ２８とＣＤ８０および／またはＣＤ８６とのライゲーションに起因する共刺激シグナルを必要とする。したがって、これらのリガンドへの結合からＣＴＬＡ－４を遮断することは、Ｔ細胞プライミングを増強し、抗腫瘍免疫応答の誘導を可能にする。
一部の実施形態では、本明細書に提供される免疫刺激細菌株は、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（例えば、例示的なヒト抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ断片についての配列について、同時係属中のＰＣＴ出願国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６０３０７号を参照；実施例２５も参照）などであるが、それに限定されるわけではない、その断片を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体をコードするプラスミドを含有する。
ｄ．さらなる例示的なチェックポイント標的
それらに対するｓｃＦｖ、または任意の他の組換え抗体断片が調製され得るかまたは本明細書において例示される、例示的な免疫チェックポイント標的は、下の表に記載されるものを含むが、それに限定されるわけではない。
４．免疫調節タンパク質の組合せは相乗効果および／または補完効果を有し得る
サイトカインは、抗腫瘍免疫応答の強力なモジュレーターである。サイトカインの組合せは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および骨髄細胞（樹状細胞およびマクロファージを含む）を伴う異なる免疫区画に顕著な相乗効果を有することが知られている。サイトカインは、樹状細胞による抗原プライミング、自然免疫細胞および抗原特異的Ｔ細胞の生存および増殖、ならびにＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害活性に主な役割を演じることが知られている。サイトカイン組合せは、生物学的応答を最大化し、抗腫瘍免疫を増強するように適切に選ばれなければならない。例えば、肝炎のネズミモデルにおいて、ＩＦＮ－α単独は、ウイルス感染細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能を増強することが見出されたのに対し、ＩＬ－１５単独は、活性化リンパ球の増殖を増強した。一緒になると、それらは、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染を最大限に抑制した（例えば、Di Scala et al. (2016) J. Virol. 90(19):8563-8574を参照）。別の例では、サイトカインＩＬ－１５＋ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５＋ＩＬ－２１の組合せは、ヒトＮＫおよびＴ細胞からのＩＦＮ－γの産生を増強することができた（例えば、Strengell et al. (2003) J. Immunol. 170(11):5464-5469を参照）。別の例では、ＩＬ－２＋ＩＬ－１８は、相乗的にＩＦＮ－γ産生を増強し、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫリンパ球の細胞溶解機能を増大させた（例えば、Son et al. (2001) Cancer Res. 61(3):884-888を参照）。その上、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８は、ヒトＴ細胞からのＩＦＮ－γの抗原－ＣＤ３ Ｔ細胞ライゲーションに非依存的な産生を相乗的に促進することが見出された（例えば、Tominaga et al. (2000) Int. Immunol. 12(2):151-160を参照）。サイトカインの組合せは、Ｔ細胞機能の強力なエンハンサーであるが、ＦＤＡ承認抗がんサイトカインは、全身投与には毒性が高すぎ、したがって、使用されることが稀であり、全身投与されるサイトカインの組合せは、毒性を複雑にするだけである（例えば、Conlon et al. (2019) J. Interferon Cytokine Res. 39(1):6-21を参照）。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、これらの問題を解決する。サイトカインの組合せ、ならびに／または本明細書に述べるＩ型インターフェロンの誘導物質などの他の治療用産物、および共刺激分子、ケモカイン、および抗体およびその断片を含むその他との組合せの腫瘍特異的デリバリーを可能にする免疫調節タンパク質などの複数の治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌が提供される。これらの免疫刺激細菌は、サイトカインおよび他の治療用産物の直接ＩＶ投与に関連する全身毒性および薬物動態（ＰＫ）の不利な点なしに強力で相乗的な免疫活性化を達成する。
本明細書に提供される免疫刺激細菌内のプラスミドにコードされ得る治療用産物の組合せは、例えば、２つ以上のサイトカイン；１つまたは複数のサイトカインおよびＩ型ＩＦＮの誘導物質（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、および構成的に活性なそのＧＯＦ変異体）、および／または共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬおよび４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）；ＴＧＦ－βデコイ受容体および１つまたは複数のサイトカイン；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩ型ＩＦＮの誘導物質；ＴＧＦ－βデコイ受容体、１つもしくは複数のサイトカイン、および／またはＩ型ＩＦＮの誘導物質、および／または共刺激分子；抗体（例えば、ＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイントに対するもの）および１つまたは複数のサイトカイン；抗体およびＩ型ＩＦＮの誘導物質；抗体、１つもしくは複数のサイトカイン、および／またはＩ型ＩＦＮの誘導物質、および／または共刺激分子；共刺激分子アゴニスト（例えば、ＣＤ４０アゴニスト）および１つまたは複数のサイトカイン；共刺激分子アゴニストおよびＩ型ＩＦＮの誘導物質；ならびに共刺激分子アゴニスト、１つもしくは複数のサイトカイン、および／またはＩ型ＩＦＮの誘導物質、および／または共刺激分子を含むが、それに限定されるわけではない。
下に述べるように、多重治療用産物発現カセットは、単一プロモーターコンストラクトおよび／または二重／多重プロモーターコンストラクトのみならず、転写後調節エレメント、および他の調節エレメント、例えば、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、シグナルペプチドなどを含み得る。核酸配列は、タンパク質の発現を増大させるためにコドン最適化することができ、一般的に真核生物プロモーターの制御下である。特定のコンストラクトおよびその詳細は、本明細書に別途記載されている。
本明細書に提供される免疫刺激細菌の中に、免疫刺激タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子）、ならびに／または腫瘍微小環境内の免疫応答を増大させる機能獲得型突然変異を有する遺伝子産物（例えば、Ｉ型ＩＦＮを誘導する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー）、ならびに／または抗体およびその断片、ならびに／またはＴＧＦ－βおよび／もしくはＩＬ－６デコイ受容体などの抗腫瘍応答を増強する他の治療用産物、ならびに／またはＴＧＦ－β拮抗ポリペプチドをコードするプラスミドを含有するものである。サイトカイン、機能獲得型産物／Ｉ型ＩＦＮ経路タンパク質、ならびに／またはケモカイン、ならびに／または共刺激分子、ならびに／または抗体およびその断片、例えば、本明細書に述べる単鎖抗体、ならびに他の治療用産物をコードするこれらの免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境、腫瘍、および腫瘍常在性免疫細胞に優先的に浸潤する免疫刺激細菌を含む。免疫刺激細菌はまた、腫瘍常在性免疫細胞に、より少ない細胞死を誘導するようにゲノムが改変されたものを含み、その際、免疫刺激細菌は、腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積して、標的細胞における多重遺伝的ペイロードの高レベルの異所性発現を達成し、治療用産物／免疫調節タンパク質を腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に送達して、腫瘍に対する免疫応答を刺激する。特に、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、アデノシン栄養要求性、ｃｓｇＤ－、ｐａｇＰ－、ｍｓｂＢ－、フラジェリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐｕｒＩ－、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ならびに本明細書に記載される、あるいは腫瘍微小環境および／もしくは腫瘍常在性骨髄細胞への標的化もしくはその中での蓄積を改善すること、または安全性および耐容性（より高い用量を許容すること）を改善する、免疫抑制性のサイトカインプロファイルを低減する、Ｔ細胞の品質および機能を改善する、健康な組織における複製を限定する、バイオフィルムを無くす、および抗腫瘍免疫応答を改善する、または本明細書に別途述べる望ましく有利な特性のいずれかを与えることが知られている任意の他の改変を含むが、それに限定されるわけではない、本明細書に記載される最大約８つまたは８つの改変を含む。
免疫刺激細菌はさらに、特定の腫瘍に対する応答を増強するために、対象の腫瘍からの腫瘍抗原などの他の治療用産物をコードし得る。サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、および機能獲得型Ｉ型ＩＦＮ経路産物（複数可）などの治療用産物をコードするように、本明細書に提供される、上記および下記の免疫刺激細菌のいずれかを改変することができる。治療用産物は、宿主によって認識されるプロモーター、およびヒト、または他の動物、または哺乳動物の対象などの真核生物において認識される任意の他の所望の調節配列の制御下でプラスミドにコードされている。一般的に、産物をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。その上、改変のための本明細書に記載される細菌のいずれか、例えば、サルモネラ属、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、大腸菌、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、リステリア属、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびエリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）の菌株、またはその弱毒化株、もしくはその改変株のいずれかは、宿主によって認識されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で治療用産物（複数可）をコードしている核酸を含有するプラスミドを導入すること、またはその核酸を細菌内のプラスミド上にコードさせることによって、改変することができる。治療用産物は、感染した対象の細胞内で発現される。免疫刺激細菌は、腫瘍、ＴＭＥおよび／または腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積するか、またはそれに優先的に感染するように改変された、本明細書に記載されるものを含む。例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ－ベータ、および／または本明細書に述べる他の治療用産物の発現または構成的発現をもたらす機能獲得型産物をコードしている免疫刺激細菌は、上皮細胞に感染する能力が低減しているかもしくはその能力を有さないようにさらに改変されるが、腫瘍常在性免疫細胞を含む食細胞に感染することができ、かつ／または免疫刺激細菌は、感染した食細胞を死滅させないように改変される。
本明細書に記載するように、ＳＰＩ－１経路および鞭毛に関連する遺伝子は、食細胞（免疫細胞）中のインフラマソームを活性化して、ピロトーシスをトリガーする。ＳＰＩ－１遺伝子および鞭毛をコードしている遺伝子をノックアウトすることは、食細胞のピロトーシスを減少させるかまたは無くし、また、上皮細胞の感染も無くし、食細胞の感染増大をもたらす。真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるものによって制御され、本明細書に述べる他の真核生物調節シグナルを含むプラスミド上にコードされている遺伝的ペイロード／治療用産物を中で発現する食細胞、特に腫瘍常在性免疫細胞、例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、および樹状細胞（ＤＣ）などに蓄積する免疫刺激細菌が提供される。発現される治療用産物は、免疫応答を誘起するもの、例えば、腫瘍微小環境内の宿主応答を増大させるＩ型インターフェロンを増大または誘導する経路を経由するものなどを含む。免疫刺激細菌はまた、本明細書に述べる免疫刺激タンパク質、例えばＩＬ－２および／もしくは他のサイトカイン、ならびに／または他の免疫刺激タンパク質および治療用産物をコードし、腫瘍微小環境内で免疫応答をさらに増強し得る。
免疫刺激細菌は、細胞の細胞質ゾル中で核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチド、および他のそのような分子などに曝露された場合に免疫応答を誘起する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーと称される産物をコードし得る。本明細書における免疫刺激細菌は、免疫応答を構成的に誘起し、細胞質ゾル中のＤＮＡ／ＲＮＡの存在を必要としない、改変治療用産物をコードする。その例は、Ｉ型インターフェロン発現を誘導する経路の成分である。本明細書において企図される治療用産物は、構成的活性または活性増大を有する、これらの細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの改変型（すなわち、機能獲得型産物）を含み、それにより、Ｉ型インターフェロン（複数可）は、細胞の細胞質ゾル中のヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチド、および他のそのようなリガンドの非存在下で発現または産生される。細胞内、特に、腫瘍常在性免疫細胞を含む腫瘍細胞内でのこれらの改変産物の発現は、腫瘍微小環境内のインターフェロン－βを含むＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらす。これらの機能獲得型産物を発現する免疫刺激細菌は、腫瘍細胞／ＴＭＥ／腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積するかまたはそれに優先的に感染するので、治療用産物は、腫瘍微小環境内に発現され、腫瘍微小環境内の免疫応答の増大をもたらす。
免疫刺激細菌および他の媒体中にコードされ得る例示的な遺伝子産物は、細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡを認識し、Ｉ型インターフェロン産生を活性化する、自然経路を感知するまたはそれに関与するタンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。Ｉ型インターフェロンを活性化する、自然ＤＮＡ／ＲＮＡ認識に関与するタンパク質は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１／ＲＩＰＫ１、Ｓｅｃ５／ＥＸＯＣ２、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２／ＤＨＸ５８、ＤＤＸ３／ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＸ９／ＤＤＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５／ＤＤＸ１５、ＤＨＸ３３／ＤＤＸ３３、ＤＨＸ３６／ＤＤＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、それに限定されるわけではない。構成的Ｉ型インターフェロン発現をもたらすこれらのタンパク質のいずれかにおける機能獲得型突然変異は公知であるか、または特定することができ、突然変異体は、食細胞の感染、または腫瘍細胞への標的化および結合によるなどして、免疫刺激細菌によって腫瘍微小環境に送達することができる。
機能獲得型突然変異は、構成的Ｉ型インターフェロンの発現に起因する障害を有する個体から特定されたものを含む。機能獲得型産物の例は、インターフェロン症を有する対象に存在するものである。上述のように、スクリーニングによって突然変異を特定して、同様に機能獲得型産物を生成することができる。
治療用産物をコードする核酸をさらに改変して、発現のための特性を改善することができる。改変は、例えば哺乳動物対象、特にヒト対象における転写効率を増大させるためのコドン最適化、例えばＧＣ含量またはＣｐＧジヌクレオチド含量の低減、潜在スプライシング部位の除去、ＣｐＧアイランドを付加または除去（全般的に除去）すること、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列の置換、ならびに転写効率を増大させるためのＴＡＴＡボックスおよび／または末端シグナルの置換を含む。コドンは、コドン使用頻度のバイアスを変更すること、ＧＣ含量を減少させること、ｍＲＮＡの二次構造を減少させること、未熟なＰｏｌｙＡ部位を除去すること、ＲＮＡ不安定性モチーフ（ＡＲＥ）を除去すること、ｍＲＮＡの安定自由エネルギーを低減すること、内部カイ部位およびリボソーム結合部位を改変すること、ならびにＲＮＡの二次構造を低減することによって翻訳効率を増大させるために最適化することができる。発現を改善するため、および細菌適応度を維持または増強するための追加的な改変が、免疫刺激細菌内に組み込まれている。これらは、下の節に記載されており、下の実施例に詳述され、例示されている。
上記のように、一本鎖および二本鎖ＲＮＡの、環状ジ－ヌクレオチド（ＣＤＮ）、および核酸の他のそのような形態などの細胞内核酸の宿主認識によって媒介されるＩ型インターフェロン誘導経路は、Ｉ型ＩＦＮを誘導する。細胞質ゾル中の一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの宿主認識によって媒介されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）非依存性Ｉ型ＩＦＮ経路もある。これらは、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）を含むＲＮＡヘリカーゼによって、ＩＲＦ３転写因子のＩＦＮ－βプロモーター刺激物質１（ＩＰＳ－１）アダプタータンパク質媒介リン酸化を経由して感知され、ＩＦＮ－βの誘導をもたらす（例えば、Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919を参照）。本明細書に述べるように、これらの経路におけるタンパク質を改変することができ、またはＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含むＩ型インターフェロン（インターフェロン１型とも称される）の構成的発現をもたらす変異体として存在することができる。そのようなタンパク質の例は、本明細書に提供されるものを含む、本明細書に記載される、改変ＳＴＩＮＧタンパク質である。これらには、改変非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびヒトＳＴＩＮＧタンパク質を含む、インターフェロンが誘導の非存在下で発現されるようにＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらす突然変異を有する改変ＳＴＩＮＧタンパク質、ならびにまたＣ末端尾部（ＣＴＴ）部分が第２の種からのＳＴＩＮＧタンパク質からのＣＴＴ部分により置換されたものなどのキメラＳＴＩＮＧタンパク質であり（ここでは、第２の種のＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性よりも低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有するが、ＣＴＴ内のＴＲＡＦ６結合部位は必要に応じて欠失している）、および１つまたは複数の機能獲得型突然変異をさらに含むキメラＳＴＩＮＧタンパク質が含まれる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた治療法は、チェックポイント阻害剤療法を含む任意の他の抗がん治療、ならびに上述および本明細書の別途述べるように他のがん処置および化学療法と組み合わせることができる。
５．プロドラッグを活性化する分子
本明細書に提供される免疫刺激細菌内のプラスミドは、酵素的切断によって活性化される治療用産物、例えば化学療法プロドラッグを含むプロドラッグ、特に毒素の一部分の切断などによって活性化する、酵素などの分子をコードする核酸を含み得る。結果として、不活性なプロドラッグは、全身投与することができ、不活性である。プラスミドによってコードされている、酵素などの活性化分子は、本明細書に提供される免疫刺激細菌のデリバリー後に腫瘍微小環境内で発現され、それにより、不活性なプロドラッグが腫瘍微小環境内で活性化され、そこでそれはその抗腫瘍効果を発揮する。ある特定のヌクレオシド、および毒素コンジュゲートを含む、そのようなプロドラッグの多数の例がある。多数のそのようなプロドラッグおよび酵素は公知である（例えば、Malekshah et al., (2016) Curr. Pharmacol. Rep. 2(6):299-308を参照）。これらは、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）のプロドラッグ、オキサザホスホリン（ｏｘａｚａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎｅｓ）、白金薬物、および酵素、例えばデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、ホスホリラーゼ、チトクロムＰ４５０酵素、ならびにその他多数を含む。
６．併用療法をもたらす免疫刺激細菌
本明細書における免疫刺激細菌を使用して、１つよりも多い治療用産物、特に抗がん治療のためのものを提供することができる。一般に産物は、抗腫瘍免疫応答を増強およびリプログラムするための相補的産物である。免疫刺激細菌は、本明細書に記載されるゲノム改変のおかげで、特に、ａｓｄ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－など）、ｐａｇＰ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、アデノシン栄養要求性、ｍｓｂＢ－、ａｎｓＢ－、および本明細書に別途記載されるまたは当業者に公知の任意の他の改変のいくつかまたは全部の組合せのおかげで、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内に蓄積し、腫瘍常在性免疫細胞（骨髄細胞）に感染する。免疫刺激細菌は、宿主によって認識される１つまたは複数のプロモーター、およびヒト、または他の動物、または哺乳動物の対象などの真核生物において認識される任意の他の所望の調節配列の制御下で相補的治療用産物をコードしているプラスミドを含有して、コードされている産物の発現および産物の分泌も引き起こす。免疫刺激細菌は、ＴＭＥ内に、特に骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、および樹状細胞（ＤＣ）を含む腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積し、コードされている治療用産物がそこで発現され、次いで腫瘍微小環境内に分泌されて、抗腫瘍効果を達成する。産物の適切な組合せによって、様々な産物と宿主免疫系との相互作用のおかげで、抗腫瘍効果を増強することができる。
本明細書に別途述べるように、単一のプロモーターおよびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有して治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌は、ｃａｐ非依存的なウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用により、または２Ａペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ）の翻訳リードスルーおよびその後の同等発現される共タンパク質への自己切断によって、２つ（以上）のタンパク質を発現させることができる。あるいは、遺伝的ペイロード／治療用産物は、各タンパク質が別々のプロモーターの制御下で発現される二重または多重プロモーターコンストラクトを使用して発現させることができる。３つ以上のタンパク質を発現させるための単一および二重／多重プロモーターコンストラクトの組合せもまた、プラスミド上に含まれ得る。一般的に、治療用産物をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。例えば、プロモーターは、ＥＦ－１α、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵＢＣ、ＣＢＡ、ＰＧＫ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＥＩＦ４１Ａ、ＣＡＧ、ＣＤ６８、および合成ＭＮＤプロモーターを含むが、それに限定されるわけではない。プラスミドは、コードされている治療用産物の発現および／または分泌を増強または増大することができる他の調節エレメント、例えば、転写後調節エレメント（ＰＲＥ；例えば、ＷＰＲＥ、ＨＰＲＥ）、ポリアデニル化シグナル配列、ターミネーター、エンハンサー、分泌シグナル（シグナルペプチド／配列、リーダーペプチド／配列としても知られる）、ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、および本明細書に別途記載される、または当業者に公知の他の調節エレメントを含有し得る。
プラスミド上にコードされている遺伝的ペイロードまたは治療用産物は、免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子など；Ｉ型ＩＦＮおよびその機能獲得型の／構成的に活性な突然変異体／変異体を誘導する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー；抗体およびその断片；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］；ＴＧＦ－β、またはＴＧＦ－β拮抗ポリペプチドとの結合についてのデコイとして作用する可溶性ＴＧＦ－β受容体；ＩＬ－６結合デコイ受容体；干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）；ならびに下述の、および本明細書に別途述べられる、および当技術分野において公知の、他の治療用産物；ならびに前記治療用産物の全部の相補的組合せを含む。一部の実施形態では、サイトカインは、膜アンカーモチーフ、例えば膜貫通ドメイン、およびコラーゲン結合ドメインとともに免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされ得る。
プラスミド上にコードされ得るサイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子を含む免疫刺激タンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／または持続に関与するかまたはそれを引き起こすもしくは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、細胞質ドメインに欠失を有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ならびに腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーを含むが、それに限定されるわけではない。免疫刺激タンパク質はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のために、細胞質ドメイン欠失を有する、切り詰められた共刺激分子、例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１およびＯＸ４０Ｌなどを含み、そこで切り詰められた遺伝子産物は、共刺激受容体のエンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失により、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない。
Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導または活性化する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーは、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、およびＩＲＦ７、ならびにその機能獲得型（ＧＯＦ）または構成的に活性な変異体を含むが、それに限定されるわけではない。ＤＮＡ／ＲＮＡの認識に関与する他のタンパク質であって、構成的Ｉ型ＩＦＮ発現を生成するために突然変異させることができ、プラスミド上にコードされ得る、Ｉ型ＩＦＮ応答を活性化する他のタンパク質は、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、それに限定されるわけではない。
本明細書における免疫刺激細菌によって送達されるプラスミド上にコードされ得るかまたは抗腫瘍応答を増強または増大する細菌と同時投与され得る他の治療用産物は、抗体およびその断片、例えば、ＴＧＦ－β阻害抗体；抗ＩＬ－６抗体；チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４に対する抗体；ならびにＶＥＧＦ、ＣＤ７３、ＣＤ３８、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、メソセリン、およびＢＣＭＡに対する抗体またはその阻害剤を含むが、それに限定されるわけではない。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］、ＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦ－ベータ結合性デコイ受容体、およびＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストもまた、プラスミド上での発現、または本明細書における免疫刺激細菌との同時投与のために企図されている。これらの抗体、阻害剤、またはデコイ受容体のいずれかは、本明細書における免疫刺激細菌と同時投与することができる。一部の実施形態では、ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ）－リボースポリメラーゼ）阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤および／または化学療法もまた、単独または任意の組合せで上記の治療用産物のいずれかと同時投与することができる。
本明細書における免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされ得る治療用産物の相補的組合せの例は、
ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－２およびＩＬ－２１；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ならびにＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体と；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体と；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体と
を含むが、それに限定されるわけではない。
下の表は、免疫刺激細菌内のプラスミド中にコードされ得る例示的な産物および、実施例で述べて、実証されるＩＬ－１５またはＩＬ－１５複合体の組合せの相乗効果を含む、そのような産物のいくつかの効果／特徴を記載するものである。

*DC = 樹状細胞
上記の相補的組合せのいずれかでは、ＴＧＦ－βデコイ受容体をＴＧＦ－β拮抗ポリペプチドにより置換することができる。上述のように、ＴＧＦ－βデコイ受容体は、ＴＧＦ－βと結合してそれを排除するためのデコイとして作用するいずれかであるかまたはＴＧＦ－β拮抗ポリペプチド（例えば、抗ＴＧＦ－ベータ抗体もしくは抗体断片、および抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体もしくは抗体断片）である。Ｉ型ＩＦＮの産生を誘導または活性化するＳＴＩＮＧタンパク質または他のＤＮＡ／ＲＮＡセンサーは、ＧＯＦ／構成的活性変異体の場合があるかまたは本明細書に記載および提供される改変ＳＴＩＮＧポリペプチドおよびキメラＳＴＩＮＧポリペプチドを含む野生型タンパク質の場合がある。上記の相補的組合せのいずれかはまた、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗メソセリン抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、およびその抗体断片のみならず、ＰＡＲＰ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、または化学療法、およびその組合せのうち任意の１つまたは複数と組み合わせて投与され得る。
本明細書に提供されるプラスミドおよび免疫刺激細菌は、治療的ペイロードの組合せをコードする。これらは、上の表に記載される産物のいずれかまたはすべてをコードしている核酸の組合せを含む。相補的ペイロードの組合せを評価したが、例示的な組合せおよびそれらの効果を実施例に記載する。抗原特異的Ｔ細胞の活性化に対する、および骨髄細胞による、抗腫瘍Ｔ細胞の動員に関与する主なケモカインであるＣＸＣＬ１０の分泌に対する、ペイロードの様々な組合せの効果を評価した。例えば、ペイロードの組合せは、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）によるＣＸＣＬ１０の強い分泌を誘導することができる。ＩＬ－３６γをＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴと組み合わせることは、ＢＭＤＣによるＣＸＣＬ１０およびＩＦＮ－γのより高い分泌をもたらした。多くの組合せは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（例えば、４－１ＢＢの発現）の活性化、およびＩＦＮ－γの分泌を誘導する。特定のサイトカイン組合せはＴ細胞を活性化できる。例えば、ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋ＩＦＮ－α２；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋抗４－１ＢＢアゴニスト抗体；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－３６γ；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－２１；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－２１＋ＩＬ－３６γ；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－３６γ＋ＩＦＮ－α２；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－３６γ＋抗４－１ＢＢアゴニスト抗体；ＩＬ－１５＋ＩＬ－３６γ＋ＩＦＮ－α２；およびＩＬ－１５＋ＩＬ－３６γ＋抗４－１ＢＢアゴニスト抗体の組合せは、Ｔ細胞から高レベルのＩＦＮ－γの分泌をもたらすが、分泌されるＩＬ－６は比較的低レベルであり、したがってそれらは、腫瘍微小環境内の抗腫瘍免疫の誘導のための最適なＴ細胞活性化に理想的な組合せとなる。
その上、サイトカイン（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－３６γ）と４－１ＢＢエンゲージメントとのいくつかの組合せは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞について抗ＣＤ３εアゴニスト抗体によるＴＣＲ刺激を行っておよび行わずに高レベルのＩＦＮ－γを分泌するようにＴ細胞を活性化する。本明細書に記載されるＳＴＩＮＧ変異体のみならず、ＩＬ－１２は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的活性化を増大させることができる。データはまた、結腸直腸癌のマウス（ｍｕ）モデルにおいて、ＩＬ－１５、または４－１ＢＢＬΔｃｙｔ＋ＩＬ－１２の組合せを発現している免疫刺激細菌株が、４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）またはＩＬ－１２単独を発現している同じ株よりも腫瘍成長阻害を強力に阻害するが、高い完全奏効率（治癒率５０％）をもたらしたことを示した。他の組合せも試験し、それらがインビボで強力な抗腫瘍活性を有することを示した。
ペイロードの組合せは、共刺激分子、例えば、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、もしくは４－１ＢＢＬポリペプチド、またはその細胞質欠失もしくは切り詰め変異体の１つ、および／または本明細書において記載および例示されるその改変型；あるいは抗免疫チェックポイント抗体またはその断片、例えば抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（それぞれ実施例２５ならびに配列番号４２８および４２９を参照）；１つまたは複数のサイトカイン／ケモカイン、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－α２、およびＣＸＣＬ１０；ＴＧＦ－β結合性デコイ受容体および他のＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと融合したヒト可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｈｕ ｓＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ；配列番号４３７）、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチド；ならびに本明細書に記載および例示されるＳＴＩＮＧタンパク質または改変および／もしくはキメラＳＴＩＮＧタンパク質のうち１つまたは複数を含み得る。
ペイロード／産物／ポリペプチドは、単一のプロモーター（すなわち、単一プロモーターシステム）、および必要に応じて他の調節配列の制御下でポリシストロンコンストラクトとしてコードされている場合があり、２Ａポリペプチドまたは個別の産物の翻訳をもたらす他のそのようなポリペプチドも含み得る。ペイロードはまた、それぞれ異なるプロモーターの制御下で２つの別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するプラスミド上に発現され得る（すなわち、二重プロモーターシステム）。プラスミド上にコードされている順序で、ポリシストロンコンストラクト中にコードされている２Ａペプチドを含む、ペイロードの例示的な組合せは、下の表に示される。この表は、２Ａペプチドを含むが、他のそのようなペプチドは置換される場合があり、および／または産物は別々にコードされる場合がある。
産物の例示的な組合せおよびプラスミド上の例示的な順序


*4-1BBL=細胞膜に対して正しい配向性を保持するために残りの細胞質ドメインをより大きく陽性にするために細胞質切り詰めおよび残基改変を有する改変4-1BBL。
**キメラSTING =タスマニアンデビルCTTおよび置換R284G/N154Sを有するSTING 。
sTGFβRIIFc# =II型受容体ベータグリカン。
産物の他の組合せが企図される（上述され実施例で示されたものを参照）。他のそのような関心のある組合せには、改変ＳＴＩＮＧタンパク質とサイトカインとの組合せ、例えば、キメラＳＴＩＮＧ、例えば、タスマニアンデビルＣＴＴを有するヒトキメラ、および特に、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇなどの１つまたは複数の機能獲得型突然変異を有するものが含まれる。本明細書で述べる補完的な組合せは、相乗効果を提供することができる。例えば、実施例に示されるキメラＳＴＩＮＧポリペプチドとＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）との組合せは、相乗的に作用して、抗腫瘍効果を改善する。
本明細書に提供される免疫刺激細菌の性質、例えば、腫瘍常在性骨髄細胞内およびＴＭＥ内での蓄積など、および発現され得る産物／ペイロードの組合せは、がん免疫サイクルをカバーするように選択することができる。サイクル中の各工程、ならびに免疫刺激細菌およびペイロードの役割は、以下のように要約される：
１）がん細胞抗原の放出 － 免疫刺激細菌が腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積する；
２）がん抗原提示 － 本明細書に提供される免疫刺激細菌は、免疫刺激物質、例えばＳＴＩＮＧポリペプチドおよびその変異体、ならびにＩＬ－１２をコードおよび発現し、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含むＩ型インターフェロンの発現をもたらす；
３）プライミングおよび活性化 － 免疫刺激細菌は、ＳＴＩＮＧポリペプチドおよびその変異体、ならびに共刺激タンパク質、例えば４－１ＢＢＬ、およびＩＬ－１２をコードする；
４）Ｔ細胞の腫瘍への輸送 － コードされているＳＴＩＮＧ変異体が発現され、結果としてのＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βの発現をもたらす；
５）腫瘍へのＴ細胞の浸潤 － 免疫抑制性骨髄細胞の血管漏出および再分極；
６）Ｔ細胞によるがん細胞認識 － Ｉ型ＩＦＮ、およびＩＦＮγ、およびＭＨＣのアップレギュレーション；ならびに
７）がん細胞の殺滅－Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ－γの放出、および可溶性ＴＧＦ－βデコイ受容体の発現を誘導する、コードされているサイトカイン／ケモカイン、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）、ＩＬ－２１、および／またはＩＬ－３６γなどの組合せ。
当業者は、本明細書における開示およびその知識に基づき、免疫活性化効果および／または免疫抑制効果を有して、本明細書に提供される免疫刺激細菌の抗腫瘍活性を増強する、ポリシストロンコンストラクト上にコードされている場合の他の産物ペイロードの組合せおよび産物の他の順序を特定することができる。
Ｅ．抗ウイルス治療薬としてのおよび他の感染性病原体に対する治療薬としての免疫刺激細菌
宿主免疫応答の免疫抑制は、多くの感染性疾患において、特に持続性ウイルス感染において、ならびに腫瘍免疫抑制において役割を果たす。持続性感染では、ウイルスは感染した個体の特定の細胞に残ったままである。持続性のウイルス－宿主相互作用にはいくつかのタイプがあり、潜在性感染、慢性感染、および遅発性感染がそれである。潜在性感染では、再発性疾患のエピソード間に検出可能な感染性ウイルスはなく、慢性感染では、一次感染後に感染性ウイルスが継続して存在しており、慢性または再発性疾患がある。遅発性感染は、長期間の潜伏期間、その後の進行性疾患を特徴とする。持続性感染中に、ウイルスゲノムは細胞内ＤＮＡに安定して組み込まれ得るか、またはエピソームで維持され得る。持続性感染は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹ウイルス、パポバウイルス、プリオン、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型が含まれる）、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、天然痘ウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、黄熱病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、およびパピローマウイルスが挙げられるが、これらに限定されない多くのウイルスまたは感染性因子によって生じる。
細菌は、ワクチンおよび他の抗病原体治療薬のためのデリバリー媒体として使用されており、細菌ベクターにとって異物であるペプチドに対する免疫応答を誘発させるためのワクチンとして使用されている。例えば、ＶＥＧＦＲ２をコードするプラスミドを含有するチフス菌ＴＹ２１ａ株は、ヒトにおいてＶＥＧＦＲ２特異的Ｔ細胞応答を誘導する（例えば、Schmitz-Winnenthal et al. (2016) Journal of Clinical Oncology 34(15_suppl):3091-3091, DOI: 10.1200/JCO.2016.34.15_suppl.3091を参照されたい）。しかしながら、細菌をワクチン媒体として使用する以前のアプローチは、限られた臨床的な成功を収めたにすぎない。ＦＤＡが承認した細菌ベースのワクチンのみが、他の細菌性疾患に対して使用されており、ヒトにおいて抗腫瘍または抗ウイルス免疫を効果的に誘導していない。上述したように、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、これらの問題に対処する。
抗ウイルスワクチンが働く１つの方法は、エンベロープウイルスの表面糖タンパク質に特異的である抗体を誘導する抗原、または非エンベロープウイルスのカプシドタンパク質に特異的である抗原を送達することによる。抗体は、適応免疫の主要な要素であり、防御レベルで予め存在し、ウイルス病原体への再曝露中に存在または誘導されるように設計される。既存の抗体は、自然免疫の速度で作用するが、より特異性が高く、より高い活性性および標的化機能を備えている。免疫化のための免疫学的目標は、耐久性のある保護抗体応答の誘導である。保護抗体応答は、一般に、それらが中和し感染を阻害するときに最も効果的である。中和は、３つの主なメカニズムによって生じ得る。第１のメカニズムのウイルスの凝集または固定化は、ウイルスが標的細胞に到達することを妨げることによって感染性接種物質を低減させる。第２のメカニズムは、受容体結合ドメインをブロックすることにより、ウイルスの標的細胞への付着を直接ブロックする抗体を伴う。第３のメカニズムの中和は、ウイルスの細胞への侵入を妨げることによって、または融合阻害を通して脱殻する（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）ことによって、ウイルスの標的細胞への付着後に生じ得る。中和抗体は、オリゴマー表面タンパク質を本来の状態、または融合プロセスが完了する前に一時的に存在する中間形態で認識する必要がある。これらのエピトープは、一般に、立体構造的であり、多くの場合、四次構造エピトープであり、ウイルスタンパク質の単量体形態上には存在しないことが多い。
抗体は、ワクチン誘導防御免疫の主要メカニズムとして認識されるが、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答もまた、ウイルス感染を制御するためにも、疾患の重症度を制限するためにも重要である（Graham (2013) Immunol. Rev. 255(1):230-242を参照されたい）。抗体媒介エフェクターメカニズムは、感染を予防するためのものであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介エフェクターメカニズムは、ウイルス感染細胞を認識して、それを除去するためのものである。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、骨髄性細胞に感染するため、免疫刺激細菌は、Ｔ細胞に対する抗原提示を増強させ、Ｔ細胞媒介応答を誘導することができる。抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、哺乳動物細胞の細胞質タンパク質のための提示経路にある主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）との複合体で細胞表面上に提示される抗原との相互作用によって活性化される、ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブグループである。抗原は、細菌性病原体によって合成されるか、または細菌ワクチンが抗原を細胞質中に放出し、ＣＴＬによって細胞性免疫応答を誘発させる。この活性化の後に、ＣＴＬは、ＭＨＣ Ｉとの複合体で関連する抗原ペプチドを発現する感染細胞に向けられる。抗原はまた、ＡＰＣ（抗原提示細胞）上のＭＨＣクラスＩＩ分子によって、抗体のＢ細胞産生を促進することができるＣＤ４＋ヘルパー細胞に直接提示され得る。
先行の細菌ワクチンおよび抗病原体戦略の限界は、これらがアジュバントとしての細菌感知経路に依存していることであり、これは、本明細書に記載されるように、強力な適応抗ウイルスまたは抗腫瘍免疫をもたらさない。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、これらの限界に対処する。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、有効な抗ウイルワクチン接種、および抗腫瘍処置にもつながる強力なウイルス感知免疫経路に関して、ウイルス抗原を含む異種タンパク質、および他の抗ウイルス治療薬のプライミングを提供する。本明細書に詳述するように、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、細菌ＴＬＲ感知経路の多くを欠いており、抗ウイルス経路を保持しながら、自然な抗菌応答への免疫の方向を排除する。ウイルス感染中に、ならびにがんを有する対象において、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、レチノイン酸誘導遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）、および細胞質内ＤＮＡセンサーを含む自然免疫シグナル伝達経路は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）および炎症促進性サイトカインなどの抗ウイルス分子の合成のために活性化される。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ゲノム改変のおかげで、またＳＴＩＮＧタンパク質ならびに改変ＳＴＩＮＧタンパク質、サイトカイン、およびケモカインなどのコードされている治療用カーゴ（複数可）のおかげで、そのような経路を刺激するように設計されている。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、有利には、ゲノム改変のおかげで、および任意選択のコードされている治療用産物のおかげで、宿主免疫応答を本質的に抗ウイルス性に方向付けることができる。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、述べたように、骨髄性細胞に感染して、抗原、抗体、および他のコードされている治療薬などのコードされている抗病原体治療用産物を送達し、免疫刺激タンパク質などの追加の産物をコードして、宿主の免疫応答を増強させ得る。したがって、免疫刺激細菌は、様々な攻撃を病原体に対して提供し得る。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍を有する対象において、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積する。腫瘍を有さない対象においては、細菌は、主に、真核生物機構が読み取ることができるプラスミドを伝達するのに非常に有能である細胞である貪食抗原提示細胞（ＡＰＣ）に感染するか、または貪食抗原提示細胞にだけ感染し、タンパク質をそれらの自然な状況で産生する。プラスミドは、例えば、様々な抗原および他の抗ウイルス治療薬を含む、単一または複数の異種タンパク質をコードし、また抗ウイルス免疫感知経路を誘導する単一または多重免疫ペイロードをコードすることもできる。その結果、適切なＡＰＣ活性化およびＴ細胞の抗原プライミングをもたらし、抑制性骨髄性細胞が適応免疫を妨げる慢性感染環境であっても、耐久性のある体液性および細胞性抗ウイルス免疫につながる。
したがって、本明細書に提供されるのは、タンパク質抗原ならびに抗体、および病原体に対するワクチン接種のための、または持続性ウイルス感染を含む結果として生じた感染の処置のための他の治療薬を送達する免疫刺激細菌である。病原体には、細菌、原生動物、ウイルス、およびプリオン、ならびに疾患および障害を引き起こす他のプリオン様粒子が含まれる。免疫刺激細菌の中で、そのような細菌の例は、ネズミチフス菌などのサルモネラ属の株／種である。免疫刺激細菌は、細菌または真核生物プロモーターの制御下で抗病原体産物をコードすることができる。プロモーターは、構成的であり得るか、または誘導性であり得る。プロモーター、および他の調節配列の選択は、特定の産物、産物の発現のタイミング、細菌の用途、例えば、それらが既存の感染の処置のためのものであるか、またはワクチン接種のためのものであるか、を含む因子に依存する。一般にａｓｄ－である細菌は、プラスミド上でａｓｄをコードして、抗生物質選択カセットのいかなる必要もなく、細菌による宿主細胞の感染時に複製を可能にすることができる。これにより細菌はインビボで複製できる。別の方法として、自殺システムを用いて、ペイロード（すなわち、治療用産物）を組織常在性骨髄性細胞に送達することができる。これに関して、細菌は、補完ａｓｄ遺伝子カセットを含有するプラスミドを欠くａｓｄ－株を使用して、インビボで投与される。インビトロでは、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）が添加され、機能ａｓｄ遺伝子の不在化での細菌の複製を容易にする（そのような細菌はインビボでは成長することができない）。細菌のファゴサイトーシスおよび細胞内破壊後に、一度に比較的多量の細菌核酸が組織常在性骨髄性細胞に送達される。
サルモネラ属を含む本明細書に提供される免疫刺激細菌は、感染した生物体中で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む骨髄性細胞を特異的に標的化する。ＡＰＣは、リンパ節、脾臓、および肝臓に移動することができ、発現された抗原のリンパ節常在性Ｔ細胞への提示を提供する。細菌は、樹状細胞によって取り込まれることができ、次いで、樹状細胞は、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩによって提示経路に抗原を発現し、今度は特異的Ｔ細胞応答を開始させる。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ワクチンとして使用されるとき、これらの経路を利用することができるか、またはインフルエンザウイルス、エボラウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ならびに本明細書に記載される、かつ／または当業者に既知である他のものなどの病原体に対して防御するために、ウイルス抗原および／または他のタンパク質をコードするために利用することができる。標的は、コロナウイルスのスパイクタンパク質（例えば、配列番号４３８を参照）、およびポルフィロモナス・ジンジバリスのジンジパインプロテアーゼ（例えば、配列番号４４２～４４７を参照されたい）、特に、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２２７７株からのリシン－ジンジパインプロテアーゼ（ＫｇｐまたはＬｙｓ－ジンジパイン）（例えば、配列番号４４４を参照されたい）、および８３株、ＦＤＣ３８１株、およびＨＧ６６株を含むポルフィロモナス・ジンジバリスの他の株からのリシン－ジンジパイン（例えば、それぞれ配列番号４４５～４４７を参照されたい）などのタンパク質を含む。細菌病原体には、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ブドウ球菌属、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、およびシュードモナス属の種、特に薬物耐性種および株が含まれる。当業者であれば、標的に対する抗原を容易に特定することができる。抗腫瘍用途には、腫瘍抗原（例えば、例示的な腫瘍抗原についての実施例を参照されたい）、およびプロテアーゼ、逆転写酵素（ＲＮＡウイルスのための）、およびＤＮＡポリメラーゼ、ならびに他の複製酵素が標的であり得る。病原性細菌の例示的な種には、大腸菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、および肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、２０１９年に発生した新型コロナウイルス感染症（ＣＩＶＩＤ－１９）のパンデミックの原因病原体である新規なベータ－コロナウイルスである。コロナウイルスビリオンは、宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体に結合し、宿主とウイルス膜の融合を介しての侵入を媒介する自己表面スパイク（Ｓ）糖タンパク質を含有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＡＣＥ２受容体への結合は、スパイクタンパク質の、準安定な前融合立体配座から、膜融合を容易にする高度に安定な融合後立体配座へのより大きな立体配座再配置を引き起こす。スパイクタンパク質が細胞付着および侵入を媒介するために、スパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルスのライフサイクルに不可欠であり、中和抗体の主な標的であり、重要なワクチン抗原である（例えば、Hsieh et al. (2020) Science 369:1501-1505を参照されたい）。
最良または良好なＣＤ８＋を引き出すＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ウイルスタンパク質は、以下を含む（Cohen et al. (2021) Cell. Rep. Med. 2:100354を参照されたい）：
スパイクタンパク質のＳ１サブユニット中の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ；例えば、配列番号４４０を参照されたい）は、ＡＣＥ２と直接相互作用する。Ｓタンパク質の準安定な前融合立体配座は、「レイイング（ｌａｙｉｎｇ）型またはダウン型」と呼ばれてもよく、一方ＡＣＥ２の実現可能な立体配座への立体配座再配置は「アップ型またはスタンディング（ｓｔａｎｄｉｎｇ）型」と呼ばれてもよい。「ダウン型」および「アップ型」のポーズは、ＲＢＤの立体配座再配置に基づいて区別され；ダウン型からアップ型への再配置は受容体結合を容易にするが、一方アップ型からダウン型への再配置は、ウイルスが免疫監視を回避するのを助ける（例えば、Shah et al. (2020) Computational and Structural Biotechnology Journal 18:3401-3414を参照されたい）。
ＡＣＥ２受容体への結合に続いて、膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）による切断がある。ＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２の両方とも、気道、肺、および鼻腔／口腔粘膜で、ならびに腸内で多量に発現される。Ｓタンパク質における自然発生突然変異は、中国で（Ｈ４９Ｙ）、ヨーロッパで（Ｖ３６７ＦおよびＤ６１４Ｇ）で、そして米国で（Ｇ４７６ＳおよびＶ４８３Ａ）で特定され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞侵入に対するそれらの影響について研究されており、ＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２を発現する細胞において、Ｇ４７６Ｓ突然変異は、細胞侵入の減少をもたらし、Ｖ４８３Ａ突然変異は、細胞侵入に対して影響を及ぼさないが、一方、Ｄ６１４Ｇ、Ｖ３６７Ｆ、およびＨ４９Ｙ突然変異は、野生型Ｓタンパク質のものと比べて細胞侵入の増強をもたらす。Ｄ６１４Ｇ突然変異は、野生型Ｓタンパク質と比べて３．５倍高いレベルの侵入活性、およびヒト小気道上皮細胞にも見られる影響を示す。Ｄ６１４Ｇ突然変異もまた、ＡＣＥ２受容体に対する結合親和性の増加をもたらす。さらに、Ｄ６１４Ｇ変異体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和感受性を維持し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者血清は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＤ６１４Ｇ突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方を効果的に中和することができた（例えば、Ozono et al. (2021) Nature Communications 12:848を参照されたい）。Ｓタンパク質は、三量体として存在し、構造分析は、Ｄ６１４Ｇ突然変異が、Ｓ三量体を安定化させ、したがって、Ｓ三量体の早期解離を防止する（例えば、Zhang et al. (2021) Science 372:525-530を参照されたい）。Ｖ３６７Ｆ突然変異はまた、２０１９年１２月に武漢で最初に単離されたような参照株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１と比較して、ＡＣＥ２に対するより高い結合親和性を示し、これはＲＢＤ構造の安定化によるものであり得る。ウイルス分離株はまた、Ｖ３６７ＦおよびＤ６１４Ｇ突然変異の両方を用いて同定されている。系統解析は、Ｖ３６７Ｆ突然変異がＤ６１４Ｇ突然変異とともに進化し、感染力の増加の相乗的効果を示唆している（例えば、Ou et al. (2021) bioRvix, doi:10.1101/2020.03.15.991844を参照されたい）。
Ｎ５０１Ｙ突然変異は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統で、英国において（Ｂ．１．１．７、または２０Ｂ／５０１Ｙ．ｖ１）および南アフリカ（Ｂ．１．３５１、または２０Ｃ／５０１Ｙ．ｖ２）において自然に出現しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤ上のヒトＡＣＥ２結合部位で発生している。分子動力学シミュレーションは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤにおけるＮ５０１が、ヒトＡＣＥ２の疎水性残基に近接しており、したがって、親水性N501の疎水性残基への突然変異はＳタンパク質とヒトＡＣＥ２との間の相互作用を改善し得ることを明らかにしている。実験的スクリーンは、Ｎ５０１のＶ、Ｆ、Ｗ、またはＹへの突然変異が、ＲＢＤのヒトＡＣＥ２との結合を増強することができることを示唆している。これらの結果はインビトロ研究で検証されており、突然変異Ｎ５０１Ｙ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｗ、およびＮ５０１Ｖがスパイクタンパク質のＲＢＤとヒトＡＣＥ２との間の結合親和性の増強をもたらすことを示している（例えば、Luan et al. (2021) FEBS Letters, doi:10.1002/1873-3468.14076を参照されたい）。
「ＨｅｘａＰｒｏ」と表示される、プロリン置換Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、およびＶ９８７Ｐを有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ変異体スパイクタンパク質の突然変異（例えば、Hsieh et al. (2020) Science 369:1501-1505を参照されたい）は、その親コンストラクトと比較して、増加した発現レベルおよび安定性を示した。ＨｅｘａＰｒｏ突然変異の高収率および安定性の増加は、サブユニットワクチンの工業的生産を可能にするはずであり、それはまた、核酸分子当たりより多くの抗原を生産し、有効性を改善し、および／または必要とされる投与量を低減させることによって、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡベースのワクチンを改善することもできる（例えば、Hsieh et al. (2020) Science 369:1501-1505を参照されたい）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、その発現および／またはそのＡＣＥ２受容体への結合を増強もしくは改善することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質中の他の突然変異には、例えば、Ｖ４１７Ｋ（例えば、Shah et al. (2020) Computational and Structural Biotechnology Journal 18:3402-3414を参照）；Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｔ、およびＱ４９８Ｙ、ならびに残基Ｎ４３９／Ｒ４２６、Ｌ４５２／Ｒ４２６、Ｔ４７０／Ｎ４５７、Ｅ４８４／Ｐ４７０、Ｑ４９８／Ｙ４８４およびＮ５０１／Ｔ４８７における突然変異（Verkhivker et al. (2021) bioRxiv preprint; doi: 10.1101/2021.02.21.432165を参照）；ならびにＷ４３６ＲおよびＤ３６４Ｙ（例えばOu et al. (2021) bioRvix, doi:10.1101/2020.03.15.991844;および米国特許第１０，９７３，９０８号を参照）が含まれる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、ワクチンとして使用される場合、またはウイルス抗原および／もしくは他のタンパク質をコードして、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などの病原体に対して防御するために使用される場合、完全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質（例えば、配列番号４３８を参照されたい）をコードすることができるか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号４４０を参照されたい）の完全長受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードできるか、または免疫応答を誘導もしくは引き起こすのに、および／または対象をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して免疫化もしくはワクチン接種し、または防御するのに十分であるスパイクタンパク質ＲＢＤの一部をコードすることができる。免疫刺激細菌はまた、スパイクタンパク質またはＲＢＤもしくはその一部の発現を増加もしくは増強し、および／またはスパイクタンパク質またはＲＢＤ、もしくはその一部のＡＣＥ２受容体への結合を増加もしくは増強する、スパイクタンパク質またはその一部、例えばＲＢＤまたはその一部に突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の突然変異をコードすることができる。スパイクタンパク質またはスパイクタンパク質ＲＢＤ突然変異には、Ｖ３６７Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｇ４７６Ｓ、Ｖ４８３Ａ、Ｈ４９Ｙ、Ｎ５０１Ｙ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｗ、Ｎ５０１Ｖ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｖ４１７Ｋ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｗ４３６ＲおよびＤ３６４Ｙを含むもの、ならびにスパイクタンパク質またはその一部の残基Ｎ４３９／Ｒ４２６、Ｌ４５２／Ｒ４２６、Ｔ４７０／Ｎ４５７、Ｅ４８４／Ｐ４７０、Ｑ４９８／Ｙ４８４およびＮ５０１／Ｔ４８７に相当する残基において突然変異を含むものが挙げられるが、これらに限定されない、本明細書に記載され、当該技術分野において既知のあらゆるものが含まれる。免疫刺激細菌は、例えば、米国特許第１０，９７３，９０８号および同第１０，７０２，６００号に記載される、抗原配列またはスパイクタンパク質もしくはＲＢＤ（それらの一部を含む）の改変形態のいずれかをコードすることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンとして使用することができる。免疫刺激細菌はまた、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにおいて、またはＭｏｄｅｒｎａ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにおいて利用されるｍＲＮＡを送達するために、ワクチンとして使用することができ、ここでは
１）世界保健機関が公表したＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン中のｍＲＮＡの配列は、５’キャッピング構造、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｓ糖タンパク質の伸長シグナル配列、突然変異Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含有する完全長スパイク（Ｓ）糖タンパク質配列をコードする核酸、ならびにポリ（Ａ）テールを含み、以下の配列を含む：
ここでΨ＝１－メチル－３’－シュードウリジリルであり、配列は以下の特徴を有する：

また、５’キャッピング構造の構造は、下記の通りである：
また、ｍ１Ψ＝１－メチル－３’－シュードウリジリルの構造は、下記の通りである：
；ならびに
２）Ｍｏｄｅｒｎａ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの配列は、例えば、github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies%20of%20putative%20SARS-CoV2-spike-encoding%20mRNA%20sequences%20for%20vaccines%20BNT-162b2%20and%20mRNA-1273.docx.pdf.から入手可能である。
あるいは、github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies%20of%20putative%20SARS-CoV2-spike-encoding%20mRNA%20sequences%20for%20vaccines%20BNT-162b2%20and%20mRNA-1273.docx.pdfから入手可能であるようなＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにおけるｍＲＮＡについての配列を使用することができる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌はまた、ダニ媒介性ならびに他の昆虫媒介性疾患、およびプリオンならびに熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などのマラリア病原体などの他の感染性因子、ならびに細菌性およびウイルス性の病原体に対して防御し、かつ／またはそれらを処置するために、抗原をコードすることもできる。免疫刺激細菌はまた、マラリア原虫、クロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、およびリステリア属を含む、細菌性および原生動物の病原体に対するワクチンとしても使用することができる。サルモネラ属および他の細菌は、ワクチンとして使用されており、任意のそのような既知のワクチンは、本明細書に提供される免疫刺激細菌中で抗原（複数可）をコードさせることによって改善することができる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、病原体、特にウイルス性病原体に対して免疫または免疫応答を誘導し、効果的な抗体およびＴ細胞応答をもたらすことができる。サルモネラ属の細菌などの免疫刺激細菌は、それらが骨髄性細胞に主に、またはそれのみに感染し、抗原および抗体などの治療用産物、ならびに抗ウイルス免疫応答を刺激または誘導する追加の免疫刺激産物をコードするプラスミドを送達するようなゲノム改変を含む。免疫刺激細菌は、これらの抗原提示細胞に感染し、ここで、コードされている治療用産物（複数可）が発現される。
免疫刺激細菌は、抗原をコードすることができ、これにより、ウイルスもしくは細菌または他の病原体を、それが細胞に感染する前に認識する抗体を含む抗体を産生する宿主の免疫系をもたらす。抗ウイルス剤として使用するための免疫刺激細菌は、抗原をコードすることができるだけではなく、それらは宿主の抗ウイルス応答を増強させるために、抗体および免疫刺激タンパク質もコードすることができる。ワクチンとして使用するために、免疫刺激細菌は、抗原および他の異種タンパク質をコードすることによって、免疫をもたらすか、または疾患の重症度の低下をもたらし、あるいは持続性ウイルス感染の再発を予防する。コードされている抗体には、その一本鎖形態、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、および他のそのような構造が含まれる。抗ウイルス免疫応答を増強または促進する、ＳＴＩＮＧなどのコードしている免疫刺激タンパク質（本明細書に記載される）に由来するものを含む、細菌の免疫刺激特性、また、Ｔ細胞応答を増強させるアスパラギナーゼＩＩの発現を除去または低減させる改変などの細菌のゲノム改変は、Ｉ型ＩＦＮの活性化を含む、頑健な抗病原体治療薬をもたらす。上で述べたように、結核のためのＢＣＧワクチンなどの不活化病原体ワクチンは、アスパラギナーゼ活性を不活性化または排除するように病原体を改変することによって改善することができる。アスパラギナーゼは、ワクチンに対する免疫応答を低減または阻害する場合があり、アスパラギナーゼの活性を排除または低減することは、ＢＣＧワクチンなどのワクチンの有効性を改善することができる。
Ｆ．細菌デリバリーのための治療用産物をコードする例示的プラスミドの構築
本明細書の免疫刺激細菌は、抗腫瘍応答を促進または誘導または増強する１または複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）の治療用産物、例えば免疫調節性タンパク質をコードするように改変することができる。治療用産物は、真核生物の対象、特に、免疫刺激細菌が投与されることになる対象、例えばヒトにおける発現のために、真核生物プロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターの制御下で、細菌中のプラスミド上にコードされ得る。治療用産物をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞における発現または輸送のための、例えば、細胞表面上での分泌または発現ための他の調節シグナルを含むことができる。免疫刺激タンパク質は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）などの適切な環境において、免疫刺激細菌が投与される対象において抗腫瘍応答を促進する、または抗腫瘍応答に関与する、または抗腫瘍応答を増強することができるものである。免疫刺激タンパク質としては、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子が挙げられる。これらには、サイトカイン、例えば、限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱したＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βに結合できないように改変されているＩＬ－２；ケモカイン、例えば、限定されないが、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１；Ｔ細胞の動員および／もしくは持続に関与しているか、もしくはそれを引き起こすかもしくは増強するタンパク質；ならびに／または共刺激分子、例えば、限定されないが、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインが欠失している４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、およびＢ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバーが挙げられる。当業者に既知である、腫瘍の処置に使用される、または抗腫瘍応答を促進する、増強する、もしくはそうでなければ増大する、もしくは誘起する他のそのような免疫刺激タンパク質は、本明細書で提供される免疫刺激細菌においてコードするために企図される。
本明細書の免疫刺激細菌によってコードされている他の治療用産物としては、Ｉ型インターフェロン産生を誘導または活性化する細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、例えば、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７、ならびにそれらの機能獲得型の構成的に活性な変異体、および本明細書に記載されるようなキメラＳＴＩＮＧポリペプチドが挙げられる。例えば、構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体には、突然変異Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｃ２０６Ｙ、Ｒ２８１Ｑおよび／またはＲ２８４Ｇ、ならびにそれらの組合せ、例えばＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを有するもの、ならびに本明細書に記載の、および当技術分野で既知の他のものが含まれ、一方で、構成的に活性なＩＲＦ３変異体としては、突然変異Ｓ３９６Ｄ、Ｓ３９８Ｄ、Ｓ４０２Ｄ、Ｔ４０４Ｄおよび／またはＳ４０５Ｄを有するもの、ならびに本明細書に記載の、および当技術分野で既知の他のものが挙げられる。本明細書の免疫刺激細菌によってコードされている他の治療用産物には、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、合成抗体、組換えで生成した抗体、多重特異性抗体（例えば、２重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体およびイントラボディまたは上記のいずれかの抗原結合性断片を含めた抗体および抗体断片が含まれる。抗体は、免疫チェックポイント、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ１および２，ＣＴＮＮＢ１（β－カテニン）、ＳＩＲＰα、ＶＩＳＴＡならびにＴＲＥＸ－１、ならびに当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の他のものに対して向けられるもの、または他の標的、例えば、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３およびＩＬ－６、ならびにその阻害が抗腫瘍応答を改善する他のそのような標的に対して向けられるものでもよい。免疫刺激細菌は、免疫チェックポイント、例えばＴＲＥＸ１、およびその阻害、抑制または破壊が抗腫瘍応答を改善する他の標的に対するＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）をコードすることもできる。
一部の実施形態では、本明細書の免疫刺激細菌は、免疫系を刺激化するために、限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２［ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）］、ＩＬ－１５（およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５／ＩＬ－Ｒα））、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＦＮ－アルファならびにおよびＩＦＮ－ベータを含めた１または複数のサイトカインをコードするように操作されている。サイトカインは、腫瘍部位においてエフェクター細胞および間質細胞を刺激化し、細胞傷害性細胞による腫瘍細胞認識を増強する。一部の実施形態では、免疫刺激細菌は、ケモカイン、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１などの１つまたは複数をコードするように操作され得る。免疫刺激細菌の抗腫瘍有効性を増強するために、治療用産物のいずれかの相補的組合せがコードされ、腫瘍微小環境に送達され得る。これらの改変、およびそれらをコードする免疫刺激細菌は上述され、以下に例示される。
１．タンパク質の異種発現のための構成的プロモーター
本明細書で提供されるプラスミドは、治療用産物、例えば、哺乳動物対象で発現された場合に、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードするように設計されており；免疫刺激タンパク質または他の治療用産物は、真核生物プロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩ）によって認識されるプロモーターの制御下にある、細菌中のプラスミド上にコードされている。一般に、プロモーターは構成的プロモーター、例えば、後期真核生物ウイルスプロモーターである。例示的プロモーターとしては、限定されないが、数ある中でも、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターおよびその派生的プロモーターＣＡＧＧまたはＣＡＧ、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有し、負の制御領域が欠失した、改変されたＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）、真核生物開始因子４Ａ－Ｉ（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ならびにＧＡＰＤＨプロモーターが挙げられる（例えば、Powell et al. (2015) Discov. Med. 19(102):49-57を参照されたい）。ＣＡＧプロモーターは、（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；（Ａ）プロモーター、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロン；ならびに（Ｇ）ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライス受容体からなる。ＭＮＤは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有し、負の制御領域が欠失した、改変されたＭｏＭｕＬＶ［モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーターである（マウス白血病ウイルス由来ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位の置き換え（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ））；例えば、Li et al. (2010) J. Neurosci. Methods 189:56-64）を参照されたい。
これらのプロモーターの２つ以上は、プラスミド上の複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にコードされ得る。限定されないがＣＭＶを含めて、ある特定のプロモーターは、複数のｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）部位を含む。これらのエレメントを含むプラスミド、例えば、細菌の破壊後に細胞質ゾルに放出される、ネズミチフス菌内に含まれるプラスミドが細胞質ゾルに放出される場合、プラスミドは、ＣＲＥＢ媒介性宿主微小管機構を使用して効率的に核にシャトルされる（例えば、Bai et al. (2017) Biosci. Rep. 37(6):BSR20160616を参照されたい）。
プラスミドは、例えばａｓｄの発現のための細菌プロモーターおよび治療用産物の発現のための真核生物プロモーターを含めて、多重プロモーターを含むことができる。治療用産物の発現を改善するため、ならびに細菌の増殖および適応度を改善するために、プロモーターおよび他の調節配列の様々な構成が評価された。例えば、試験した構成の中で、プラスミド上の真核生物発現カセットの配向性を逆にすること、および１つまたは複数の細菌ターミネーターを含むことが、コードされているペイロードの発現の効率を高めることができ、かつ細菌の適応度を改善することができる。
２．複数の治療用産物発現カセット
ａ．単一プロモーターコンストラクト
同じ細胞における、単一コンストラクトからの複数の遺伝子の発現は、いくつかのタンパク質の共発現が、所望の生物学的効果、例えば抗腫瘍応答を誘発するのに必要とされる場合に、達成することができ、かつ有利である。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、単一プロモーターの制御下にある２つのコード配列を分離するために使用されたが、第１のタンパク質と比較して第２のタンパク質の発現レベルが低減している可能性があり、特定の場合に、例えば、パッケージング能力が小さいウイルスを使用する場合に、ＩＲＥＳ配列の長さが禁制的である可能性がある。リボソームスキッピングイベントを媒介する、２Ａペプチドとして知られる短い（約１８～２２アミノ酸長）ウイルス由来ペプチド配列の発見によって、単一ｍＲＮＡから同様のレベルで複数の個別のペプチド産物を産生することが可能になる。２Ａペプチドコード配列は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子間に含まれる（例えば、Daniels et al. (2014) PLoS One 9(6):e100637を参照されたい）。
ＩＲＥＳエレメントおよび２Ａペプチドは、１つの転写物における複数の遺伝子の共発現のために、異なるメカニズムを使用する。例えば、１つのｍＲＮＡで複数の遺伝子を発現させるためにＩＲＥＳエレメントを使用する場合、プロモーターの直接下流の遺伝子は標準のキャップ依存性メカニズムによって翻訳され、ＩＲＥＳエレメントの下流のものはキャップ非依存性メカニズムによって翻訳され、これは、キャップ依存性メカニズムよりも翻訳効率が低く、不均衡な発現をもたらし、ＩＲＥＳに駆動される遺伝子の発現がより低くなる（例えば、Chng et al. (2015) mAbs 7(2):403-412を参照されたい）。これに反して、２Ａで連結された遺伝子は、１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で翻訳される。２Ａ配列によって分離されているタンパク質の切断は、非通常性のプロセスで同時翻訳で起こり、この場合、２ＡペプチドのＣ末端のグリシンおよびプロリンの間でペプチド結合が形成されないことが多い（すなわち、ペプチド結合が「スキップされる」）。これにもかかわらず、翻訳は進行し、２つの別々のタンパク質が等量で産生される。２Ａペプチド配列のおよそ２０アミノ酸をコードするより短いストレッチは、結合スキッピングを引き起こすのに十分である。しかし、結合スキッピングが起こらない場合、その後に切断されない融合タンパク質が生成される（例えば、Daniels et al. (2014) PLoS One 9(6):e100637を参照されたい）。
限定されないが、数ある中でも、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ（例えば、配列番号３２７を参照されたい）、ブタテッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ（例えば、配列番号３２８を参照されたい）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来のＥ２Ａ（例えば、配列番号３２９を参照されたい）、および口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ（例えば、配列番号３３０を参照されたい）を含めて、これらの２Ａペプチド多くは記載されている。異なる研究が、様々な２Ａペプチドの矛盾する切断効率を報告しており、２Ａペプチドの切断効率は、発現されるタンパク質の性質、２Ａ配列に隣接する遺伝子の順序、使用される２Ａペプチドの長さ、および上流タンパク質と２Ａペプチドの間のリンカーに影響を及ぼされ得る。切断効率および増強されたタンパク質発現は、上流のウイルス切断配列、例えば、限定されないが、ペプチドフューリン切断配列、ＲＲＫＲを使用して、および２Ａの直前にＧＳＧおよびＳＧＳペプチドリンカー、Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＵＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）または３×Ｆｌａｇエピトープタグを挿入することによって改善することができることが多い（例えば、Chng et al. (2015) mAbs 7(2):403-412を参照されたい）。
単一プロモーターおよびＯＲＦとともに、治療用産物、例えば免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドを含む本明細書の免疫刺激細菌は、キャップ非依存性であるウイルス配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、または２Ａペプチドの翻訳リードスルー、およびその後の等しく発現される共タンパク質への自己切断を通して、２種以上のタンパク質を発現することができる。プラスミドは、本明細書において以下および他の箇所で述べるように、他の調節エレメントを含むことができる。例えば、例示的コンストラクト（実施例１４を参照されたい）はＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２ ＣＯ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＦＮ－α２－ＷＰＲＥであり、この場合、ＣＭＶプロモーターおよびＴ２Ａペプチドを使用して、コドン最適化されたマウスＩＬ－２がマウスＩＦＮ－α２とともに共発現される。さらに、発現を増強するために、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。例えば、第３の治療用産物がプラスミドによって発現される場合、２Ａ配列は、第１のプロモーター、例えばＣＭＶの制御下で発現される最初の２つのタンパク質に隣接し、第３のタンパク質は、第２のプロモーター、例えばＥＦ－１αの制御下でコードされている。そのようなコンストラクトの例は、ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５ｓｃ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ＋ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－１８－ＷＰＲＥであり、この場合、Ｔ２Ａを使用して、ネズミ１５Ｒα／ＩＬ－１５ｓｃと置換Ｒ２８３ＧまたはＮ１５３Ｓ／Ｒ２８３Ｇを有するネズミＳＴＩＮＧ（ヒトＳＴＩＮＧでは、それぞれＲ２８４ＧまたはＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇに相当する）とがＣＭＶプロモーターの制御下で共発現され、ネズミＩＬ－１８がＥＦ－１αプロモーターの制御下で個別に発現される。この例示的コンストラクトは、発現の増強のためにＷＰＲＥも含む。
本明細書に記載されるように、免疫刺激細菌は、コードされている抗原（複数可）が、細菌中での転写のために細菌プロモーターの制御下で発現されるが、細菌中での翻訳を妨げるが、ヒトなどの真核生物宿主中での翻訳を可能にするＩＲＥＳなどの調節配列を含む、ワクチンとして使用することができる。そのような抗原をコードする核酸コンストラクトは、任意選択で、追加の免疫系／応答増強タンパク質、例えば、ＳＴＩＮＧタンパク質、および／またはサイトカイン、および／または事実上アジュバントとして作用する他の組合せをコードすることができる。
ｂ．二重／多重プロモーターコンストラクト
あるいは、遺伝子ペイロード／治療用産物は、二重または多重プロモーターコンストラクトを使用して発現させることができ、この場合、各タンパク質は個別のプロモーターの制御下で発現される。したがって、組み合わせて発現される治療用産物、例えば免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドは、多重プロモーターを含むことができ、それぞれが適切な停止コドンプロセシングを有する個々のインタクトなＯＲＦを制御する（すなわち、二重／多重プロモーターコンストラクト）；または複数のタンパク質を、２Ａペプチドを使用して単一ＯＲＦで発現させることができる（すなわち、単一プロモーターコンストラクト）；またはプラスミドは、上記のように、３種以上タンパク質を発現させるために、単一プロモーターコンストラクトと二重／多重プロモーターコンストラクトの混合物を含むことができる。
３．調節エレメント
ａ．転写後調節エレメント
単一プラスミドからの単一および複数の治療用産物／免疫調節性タンパク質の発現を増強するために、目的のタンパク質の転写および翻訳を増強する調節エレメント用いることができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（ＷＰＲＥ）は、ＯＲＦの３’非翻訳領域に挿入された場合に、発現レベルを数倍増強することができる（例えば、Zufferey et al. (1999) J. Virol. 73(4):2886-2892を参照されたい）。同様に、限定されないが、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）を含めて、他のそのようなエレメントも発現を増強することができる。単一プラスミド上の複数のタンパク質の発現を改善するために、これらの組合せを複数のＯＲＦの３’末端で使用することができる。
ＷＰＲＥおよびＨＰＲＥ ＰＲＥは、核からのｍＲＮＡ移行を促進することによって細胞質ｍＲＮＡの蓄積を増大することができ、転写後プロセシングおよび安定性を増強することができる、ヘパドナウイルスのシス作用性ＲＮＡエレメントである。
ｂ．ポリアデニル化シグナル配列およびターミネーター
タンパク質発現を増強することができるプラスミド上の他のエレメントとしては、ポリアデニル化シグナル配列およびターミネーターが挙げられる。ポリアデニル化は、ｍＲＮＡ転写物の３’末端へのポリ（Ａ）テールの転写後付加であり、これは、翻訳のための成熟ｍＲＮＡを産生するプロセスの一部である。ポリアデニル化シグナル配列は核外移行、ｍＲＮＡの安定性および効率的な翻訳に重要である。ターミネーターは、転写物の末端を規定し、遊離３’末端を作出し、転写装置からの新しく合成されたｍＲＮＡの放出を開始する配列である。次いで遊離３’末端は、ポリ（Ａ）テールの付加に利用可能である。ターミネーターは転写される遺伝子の下流に見出され、典型的には、任意の３’調節エレメント、例えば、ポリアデニル化またはポリ（Ａ）シグナルの直後に存在する。発現プラスミドにおいて一般に使用される哺乳動物ターミネーターとしては、配列モチーフＡＡＵＡＡＡを含み、ポリアデニル化と終結の両方を促進する、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨまたはｂＧＨ）およびウサギベータ－グロビン（ｒｂＧｌｏｂ）のポリＡ配列が挙げられる。
ＯＲＦの３’末端に設置される場合に、シミアンウイルス４０ポリＡ（ＳＶ４０ｐＡ）またはウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨｐＡ）シグナルなどの配列は、インビトロとインビボの両方で数倍の発現増大をもたらす（例えば、Powell et al. (2015) Discov. Med. 19(102):49-57を参照されたい）。これらのおよび他のそのようなエレメントは、単一プラスミドから発現される免疫調節性タンパク質を含めて、複数の治療用産物の発現および翻訳をさらに増強することができる。
ｃ．エンハンサー
プロモーターおよびエンハンサーはプラスミド中のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に見出され、協力して転写の速度を決定する。エンハンサーは、ＤＮＡをループ化するために、アクチベータータンパク質に結合し、特定のプロモーターを開始複合体に連れて行き、このようにして、転写の速度を高める配列である。これらは、影響を与えるプロモーターに隣接していてもよく、または該プロモーターから離れていてもよく、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、ＳＶ４０および合成エンハンサー、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変されたＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーターであるＭＮＤプロモーターを含む。本明細書の免疫刺激細菌は、プラスミド上にコードされている治療用産物／タンパク質の発現を増強するために、エンハンサーを含むことができるプラスミドを含む。
ｄ．分泌シグナル
シグナル配列もしくはシグナルペプチド、リーダー配列もしくはペプチド、または局在シグナルもしくは局在配列としても知られる分泌シグナルは、分泌されることになる新しく合成されたタンパク質のＮ末端にある短いペプチドである。シグナルペプチドは、細胞がタンパク質を通常細胞膜に移動させるのを促進する。タンパク質分泌の効率はシグナルペプチドによって強く決定される。したがって、本明細書の免疫刺激細菌は、コードされている治療用産物の発現または分泌を容易にするおよび／または増大するために、シグナルペプチド／分泌シグナルペプチドを含むことができるプラスミドを含む。
ｅ．細菌の適応度の改善
治療用産物をコードする免疫刺激細菌中のプラスミドは、細菌遺伝子の発現のために、および複雑な多シストロン性真核生物ペイロードの発現のためにも提供される遺伝子および調節エレメントを含む。そのような進化的に分岐した生物の間の転換は、原核生物および真核生物で適切に機能するための課題をもたらす。細菌がインビトロで培養され、次いで、真核生物の対象に投与され、がん対象において、プラスミドが細胞に、特に腫瘍常在性骨髄性細胞に送達され、ペイロードが発現され、プロセッシングを受け、輸送される。大きな真核生物遺伝子および調節配列と組み合わされた、細菌中の真核生物プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターからの転写漏出性は、低い注射ストック生存率およびブロス培養における増殖速度の低減として顕在化する、細菌の適応度の低減をもたらす可能性がある。
４．複製起点およびプラスミドコピー数
プラスミドは、複製起点によって細菌内で維持される、自律的に複製する染色体外の環状二本鎖ＤＮＡ分子である。コピー数は、プラスミドの安定性に影響を与える。高コピー数は、一般に、ランダムな分配が細胞分裂で起こる場合に、プラスミドのより大きな安定性をもたらす。高コピー数のプラスミドは、一般に増殖速度を低下させ、したがって、プラスミドが少ない細菌細胞がより速く増殖するので、これが培養で優位を占めることをおそらく可能にする。これは、高コピー数で存在する場合に細菌に対して毒性を持つ可能性がある、プラスミド上のある特定の遺伝子の発現を制限する、遺伝子減弱および遺伝子投薬ストラテジーを使用して、改良され得る。複製起点は、プラスミドの適合性、すなわち、同じ細菌細胞内の別のプラスミドとともに複製する能力も決定する。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌細胞中に共存することができず；これは、同じ適合性群に属すると言われる。同じ適合性群からの第２のプラスミドの形態で新しい起点を導入することは、内在プラスミドの複製の結果を模倣する。したがって、２種のプラスミドが異なる細胞に分離して、複製前の正確なコピー数の作出の後まで、いかなるさらなる複製も防止される。
多数の細菌性複製起点は当業者に既知である。起点は、所望のコピー数を達成するように選択することができる。複製起点は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介したプラスミド複製の開始部位として認識される配列を含む（例えば、del Solar et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2):434-464を参照されたい）。異なる複製起点によって、各細胞内でプラスミドコピーレベルが変動し、細胞あたり１～数１００コピーの範囲になり得る。一般に使用される細菌プラスミド複製起点としては、限定されないが、非常に高いコピーの誘導体、例えばｐＵＣ、およびより低いコピーの誘導体、例えばｐＢＲ３２２を有する、ｐＭＢ１に由来する起点、ならびに低コピー数を有する、ＣｏｌＥ１、ｐ１５ＡおよびｐＳＣ１０１ならびに他の起点が挙げられる。そのような起点は当業者に周知である。例えば、ｐＵＣ１９起点は細胞あたり５００～７００コピーのコピー数をもたらす。ｐＢＲ３２２起点は、細胞あたり１５～２０コピーの既知のコピー数を有する。これらの起点は単一塩基対しか異ならない。ＣｏｌＥ１起点のコピー数は１５～２０であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどの誘導体は３００～５００の範囲のコピー数を有し得る。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４中にあるｐ１５Ａ起点は、例えば、およそ１０のコピー数をもたらす。ｐＳＣ１０１起点はおよそ５のコピー数を与える。複製起点を得ることができる他の低コピー数ベクターとしては、例えば、ｐＷＳＫ２９、ｐＷＫＳ３０、ｐＷＳＫ１２９およびｐＷＫＳ１３０が挙げられる（例えば、Wang et al. (1991) Gene 100:195-199を参照されたい）。中程度～低コピー数は１５０未満または１００未満である。低コピー数は２０、２５または３０未満である。一般に、中程度コピー数未満は１５０コピー未満であり、低コピー数未満は約２５コピー未満または２５コピー未満であり、一般に、コピー数は、調製物中の細菌あたりのプラスミドの平均コピーを指す。当業者は、低、中程度または高コピー数を有するプラスミドを特定することができる。例えば、コピー数が高いかまたは低いかを実験的に決定する１つの方法は、ミニプレップを行うことである。高コピープラスミドは、１ｍｌのＬＢ培養あたり３～５μｇの間のＤＮＡをもたらすはずであり；低コピープラスミドは、ｍｌのＬＢ培養あたり０．２～１μｇの間のＤＮＡをもたらすであろう。複製起点の特定および複製起点の配列を含めて、細菌プラスミドの配列は周知である（例えば、snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/を参照されたい）。例示的複製起点およびそれらのプラスミドコピー数を以下の表に概説する。
高コピープラスミドはインビトロにおけるタンパク質の異種発現のために選択され、染色体の遺伝子と比較して遺伝子投薬量が増大するので、タンパク質の比収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｙｉｅｌｄｓ）が高くなり、治療用細菌については、コードされている治療薬の治療投薬量がより高くなる。しかし、本明細書では、例えばネズミチフス菌による、治療用産物（例えば、免疫調節性タンパク質）をコードするプラスミドのデリバリーについては、一部の実施形態では、高コピープラスミドが有利である場合があることが示される。
発現される分子が生物に対して毒性を持つ場合、細菌が高コピープラスミドを維持するための要件が問題になり得る。これらのプラスミドを維持するための代謝要件は、インビボでの複製適応度のかなりの犠牲を伴う可能性がある。治療用産物のデリバリーのための最適なプラスミドコピー数は、プラスミドを送達するように操作された菌株の減弱のメカニズムに依存し得る。必要であれば、当業者は、本明細書における本開示を考慮して、細菌の特定の免疫刺激性種および菌株に対して適切なコピー数を選択することができる。
コードされている産物が細菌中で発現されるワクチンとして、および／またはＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）を送達するために使用するために、プラスミドは、産生されるＲＮＡまたはｍＲＮＡの量を増大させるために、より高いか高いコピー数（１５０を超える）であり得る。
５．ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧアイランド
非メチル化シチジン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフは、細菌のゲノムＤＮＡで広く認められるが、脊椎動物のゲノムＤＮＡではそうではない。病原ＤＮＡおよびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は宿主防御メカニズムを活性化し、自然免疫応答および獲得免疫応答をもたらす。非メチル化ＣｐＧモチーフは、中央の非メチル化ＣＧジヌクレオチド＋隣接領域を含む。ヒトでは、４つの異なるクラスのＣｐＧ ＯＤＮが、構造の違い、およびこれらが誘導する免疫応答の性質に基づいて特定されている。Ｋ型ＯＤＮ（Ｂ型とも称される）は、典型的にはホスホロチオエート骨格上に１～５個のＣｐＧモチーフを含む。Ｄ型ＯＤＮ（Ａ型とも称される）は混合ホスホジエステル／ホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造の形成を可能にするパリンドローム配列が隣接する単一ＣｐＧモチーフならびに３’および５’末端のポリＧモチーフを有する。Ｃ型ＯＤＮはホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造または二量体を形成することができる複数のパリンドロームＣｐＧモチーフを含む。Ｐ型ＣｐＧ ＯＤＮはホスホロチオエート骨格を有し、そのＧＣリッチ３’末端でヘアピンを形成することができる二重パリンドロームを有する複数のＣｐＧモチーフを含む（例えば、Scheiermann et al. (2014) Vaccine 32(48):6377-6389を参照されたい）。本明細書において、ＣｐＧはプラスミドＤＮＡ中にコードされており；これはモチーフとして導入され得るか、または遺伝子中に導入され得る。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を感知し、病原体に対する自然免疫を活性化するための重要な受容体である（例えば、Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680を参照されたい）。ＴＬＲ９は、哺乳動物ＤＮＡ中に天然に存在しない、原核生物のＤＮＡ中の低メチル化ＣｐＧモチーフを認識する（例えば、McKelvey et al. (2011) J. Autoimmun. 36:76-86を参照されたい）。ＣｐＧモチーフの認識は、免疫細胞サブセットにおけるエンドソーム中への病原体のファゴサイトーシスの際に、自然免疫および適応免疫を活性化する。
ＣｐＧアイランドまたはモチーフを含むプラスミドを保有する免疫刺激細菌、例えばサルモネラ属種、例えばネズミチフス菌株が本明細書で提供される。これらの細菌は、ＴＬＲ９を活性化することができる。本明細書で例示されるように、低メチル化ＣｐＧアイランドを含む細菌プラスミドは、プラスミド上にコードされている治療用産物、例えば免疫刺激タンパク質とＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３および他の細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの構成的に活性な変異体とを組み合わせて、相乗的または増強された抗腫瘍活性を有し得る、自然および適応抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。例えば、ａｓｄ遺伝子（例えば、配列番号４８を参照されたい）は高頻度の低メチル化ＣｐＧアイランドをコードする。ＣｐＧモチーフは、免疫刺激細菌において、本明細書に記載されるかまたは本明細書の説明から明らかである治療用産物のいずれかと組み合わせて含まれて、それによって、処置される対象において抗腫瘍免疫応答を増強または改善することができる。
免疫刺激性ＣｐＧは、遺伝子産物をコードする、典型的に細菌遺伝子由来の核酸を含むことによって、およびさらに、ＣｐＧモチーフをコードする核酸を付加することによって、プラスミド中に含むことができる。本明細書のプラスミドはＣｐＧモチーフを含むことができる。例示的ＣｐＧモチーフは既知である（例えば、米国特許第８，２３２，２５９号、第８，４２６，３７５号および第８，２４１，８４４号を参照されたい）。これらには、例えば、１０から１００、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、または１０から７５塩基対長であり、一般式：（ＣｐＧ）ｎ（式中、ｎは反復の数である）を有する合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドが含まれる。一般に、少なくとも１つまたは２つの反復が使用され；非ＣＧ塩基は散在し得る。当業者は、ＴＬＲ、特にＴＬＲ９をモジュレートすることによって免疫応答を誘導するためのＣｐＧモチーフの一般的な使用に非常に精通している。
６．プラスミド維持／選択成分
実験室環境におけるプラスミドの維持は、通常、プラスミド上に抗生物質耐性遺伝子を含み、増殖培地において抗生物質を使用することによって保障される。上記のように、プラスミド上の機能的ａｓｄ遺伝子で補完されるａｓｄ欠失突然変異体の使用によって、抗生物質を使用しないで、インビトロでプラスミド選択が可能になり、インビボでプラスミド維持が可能になる。ａｓｄ遺伝子補完システムはそのような選択／維持を提供する（例えば、Galan et al. (1990) Gene 94(1):29-35を参照されたい）。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにａｓｄ遺伝子補完システムを使用することによって、治療用産物、例えば免疫刺激タンパク質、構成的に活性な細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、抗体、抗体断片または本明細書で論じられる他のそのような産物をコードするプラスミドを送達するように操作されたネズミチフス菌および他の免疫刺激細菌株の効力が高められる。
７．ＤＮＡ核標的化配列
ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、例えばＳＶ４０ ＤＴＳは、核膜孔複合体を通したＤＮＡ配列の移動を媒介する。この輸送のメカニズムは、核局在化配列を含むＤＮＡ結合タンパク質の結合に依存していることが報告されている。核輸送および発現を増大させるためにプラスミド上にＤＴＳを含むことが示され（例えば、Dean, D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res. 253(2):713-722を参照されたい）、これは、ネズミチフス菌によって送達されるプラスミドからの遺伝子発現を増大するために使用された（例えば、Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419を参照されたい）。
Ｒｈｏ非依存性またはクラスＩ転写ターミネーター、例えば、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子のＴ１ターミネーターは、転写伸長複合体の解離を引き起こす二次構造を形成するＤＮＡ配列を含む。ネズミチフス菌の転写装置による異種タンパク質の発現を防止するために、転写ターミネーターがプラスミド中に含まれる。これによって、治療用産物の発現が宿主細胞転写装置に限られることが保証される。
本明細書に記載のがん治療として、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌の形質転換に使用されるプラスミドは、以下の属性のすべてまたはいくつかを含む：１）タンパク質の異種発現のための１または複数の構成的プロモーター；２）１または複数のヒト免疫調節性発現カセット；３）細菌性複製起点および最適化されたプラスミドコピー数；４）免疫刺激性ＣｐＧアイランド；５）プラスミド維持および選択のためのａｓｄ遺伝子選択マーカー；６）ＤＮＡ核標的化配列；ならびに７）転写ターミネーター。
Ｇ．ワクチンおよび治療薬として使用するための例示的な細菌株および作用機序
全体にわたって記載されるように、提供されるのは、抗がん治療薬として、病原体に対するワクチンとして使用するための、および治療用産物として使用することができるか、または翻訳されて、様々な使用のための免疫刺激産物、抗原、およびそれらの組合せを提供することができるＲＮＡのためのデリバリー媒体として使用するためにそれらの特性を改善するゲノム改変を含有する免疫刺激細菌である。免疫刺激細菌は、抗がん治療薬として、ワクチンに使用するために、およびＲＮＡデリバリープラットフォームに使用するためにそれらの特性を改善し、また細菌の炎症特性を低減する、またこれらの用途のための細菌に特性を増強させるか、またはそれとともに作用するペイロード産物の組合せを含むペイロードも含む、全体にわたって述べられたゲノム改変を含む。ペイロードおよびゲノム改変は、本明細書の開示全体にわたって述べられ記載されており、以下の実施例に例示されている。以下は、特にワクチンとして使用するために有利である例示的な細菌、ゲノム改変およびペイロードの組合せを述べる。全体わたる開示は、がん治療薬として、ならびにがんおよび他の疾患や状態の処置に使用するために一般的に適切な免疫刺激または調節に有用である治療薬として使用するための特性、ペイロード、および改変を記載する。
当業者であれば、同様な効果および結果を達成するために、大腸菌およびリステリア属などの他の細菌種および株において同様なゲノム改変をもたらすことができると理解される。さらに、上記で述べたように、非サルモネラ属種は、補体に対する抵抗性を増大させるために、サルモネラ属に由来のｒｃｋ遺伝子などのｒｃｋ遺伝子をコードするように改変することができる。
ワクチン接種については、本明細書に提供される細菌の使用および一般的作用機序は、抗原または産物に対するインサイチュ免疫応答を生成するための投与、特に、筋内注射、吸入、皮内投与、膣内投与、および他の経路によるなどの直接組織投与を含み、これは病原体に対するか、がんに対する予防（免疫防御応答を生み出すための免疫化）もしくは処置のためのものであり得る。細菌は耐久的な適応抗ウイルス免疫を誘導する。細菌は、選択される経路に対して適切に製剤化される。これは、必要に応じて、例えば、エアロゾル剤、錠剤、乳剤、粉末剤のような製剤を含み得る。そのように製剤化されて投与された細菌は、ファゴサイトーシスによって、組織常在性食細胞中に取り込まれる。これらの目的のために、細菌は、それらがインビボでは複製しないが、それらのペイロードを組織常在性食細胞性抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの細胞中に送達するように改変される。コードされている産物は、例えば、提示用抗原、Ｉ型ＩＦＮを誘導するＳＴＩＮＧを含む。コードされている産物は、リンパ節に遊走することができ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋プライミングを介して抗体をもたらし、ＡＰＣは、抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングおよび活性化を提示し、これがＩＦＮガンマを刺激し、またウイルス感染細胞の直接的死滅に関与し；マクロファージが感染細胞にアポトーシス食作用を及ぼし、それによって、エピトープ拡大させ、これがさらなるＴ細胞活性化をもたらす。
１．例示的な免疫刺激細菌－インサイチュがんワクチン接種作用機序（ＭＯＡ）
本明細書に提供される免疫刺激細菌の中には、マクロファージなどの腫瘍常在性骨髄性細胞中に蓄積するように設計されている免疫刺激細菌がある。これらの細菌は、抗ウイルス性／抗腫瘍免疫応答を誘導する免疫刺激タンパク質およびそれらの組合せをコードするプラスミドを含有する。ゲノム改変は、鞭毛の除去、LPSの変更、およびｃｕｒｌｉ線毛の除去を含む。これらの改変または同様な効果を有する細菌株における改変は、ＴＬＲ２／４／５応答／シグナル伝達を低減し、腫瘍微小環境および骨髄性細胞中の蓄積をもたらす。他の改変には、細菌をインビボで増殖不能にするａｓｄ－またはＴｈｙＡ－などの栄養要求性、および上昇したアデノシンを有することができ、免疫抑制的である細菌をアデノシンに対して栄養要求性にして、それらの腫瘍微小環境中の蓄積を増大させるｐｕｒＩ－を含むなどの他の栄養要求性、ならびにＴ細胞を阻害し得るアスパラギナーゼを排除または不活性化するためのゲノム改変が含まれる。これらの細菌改変の一部またはすべての組合せは、腫瘍微小環境および腫瘍内のマクロファージ中に蓄積する細菌をもたらす。例示的なそのような免疫刺激細菌は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ株と表示される株である。この株は、例えば、インサイチュがん抗原ワクチン接種に使用することができ、ここでは、株は、ＣＭＶプロモーターなどの真核生物プロモーターの制御下で発現される、ＳＴＩＮＧ、ｅＳＴＩＮＧ（本明細書に提供されるもの、特に、Ｉ型インターフェロンを構成的に誘導するものなどの操作されたＳＴＩＮＧを指す）、ＩＬ－１５（またはＩＬ－１５受容体複合体）＋ｅＳＴＩＮＧ、およびペイロードの他のＩ型ＩＦＮ産生組合せのいずれかを発現するプラスミドを含有する。プラスミドは、さらに、完全長腫瘍抗原またはペプチド抗原断片のオープンリーディングフレームをコードする配列を含有する。投与の経路はＩＶであり、それによって、株は腫瘍に運ばれ、腫瘍常在性マクロファージによって取り込まれ、核へのプラスミド移行およびペイロードの発現をもたらす。Ｉ型ＩＦＮの存在下では、マクロファージは、がん抗原を腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞プライミング、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングするためのリンパ節への移送のために処理および提示する。プライミングされ活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、プライミングされた抗原を保有する腫瘍細胞を排除し、腫瘍の再発を防止するために腫瘍が除去された後に、長寿命の組織常在性メモリＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに循環メモリＴ細胞を誘導する。
２．末梢がんワクチン接種のための例示的な免疫刺激細菌および作用機序
追加のチミジン栄養要求性を含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／△ｔｈｙＡ株は、末梢がん抗原ワクチン接種に使用される。この株は、チミジン栄養補給の不在下では増殖することができず、四肢への筋内注射によるなどの投与時には、例えば、腕のＩＭ注射後に組織常在性マクロファージによって食作用を受ける。株は、ＳＴＩＮＧ、ｅＳＴＩＮＧ、ＩＬ－１５＋ｅＳＴＩＮＧ、または他のＩ型ＩＦＮを産生する組合せ、ならびに細菌プロモーターおよびＩＲＥＳ配列または真核生物プロモーターのいずれかに由来する完全長腫瘍抗原もしくはペプチドからの配列をコードするプラスミドを含有する。細菌プロモーター含有株の場合、次いで、細菌がこれらのコードされているペイロードのＲＮＡを転写し、組織常在性マクロファージによるファゴサイトーシスおよび破壊の際に、それらを送達する。真核生物プロモーター含有株の場合、食細胞がＲＮＡを転写する。結果として生じたｍＲＮＡはタンパク質に翻訳され、コードされている抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングのために、Ｉ型ＩＦＮの存在下でマクロファージによって提示される。がん抗原でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は循環して、外科的な腫瘍切除後に残っているものなどのがん性細胞を排除する。このような株はまた、特定のがんを発症するリスクを低減させるための、例えば、腫瘍形成につながり得る家族性の遺伝的突然変異に対するワクチン接種のための、予防ワクチンとしても使用される。
３．病原体ワクチン接種のための例示的な免疫刺激細菌および作用機序（ＭＯＡ）
また提供されるのは、追加の栄養要求性を含む細菌株、例えばｔｈｙＡ－株である。例示的なそのようなものには、追加のチミジン栄養要求性を有する、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡ株が含まれる。そのような株は、チミジン補給の不在下では増殖できない。これらの株は、病原体に対するワクチン接種に使用することができる。それらは、特定の病原体による感染が自然に生じる経路によって投与される。感染が自然に生じる部位（単数または複数）に応じて、筋内、鼻腔内、吸入、または経口送達、もしくはこれらの組合せによるなどの投与後、それらは組織常在性マクロファージから除去され、プラスミドを残す。これらの株は、免疫刺激タンパク質またはそれらの組合せ、例えば、ＳＴＩＮＧ、操作されたＳＴＩＮＧ（ｅＳＴＩＮＧ）、ＩＬ－１５＋ｅＳＴＩＮＧ、または他のＩ型ＩＦＮを産生するタンパク質またはタンパク質の組合せをコードし、ならびにまた細菌プロモーターの転写制御下にあるが、真核生物リボソームによる翻訳のためのＩＲＥＳなどの真核生物配列を含む、抗原および／またはペプチドの病原体配列をコードするプラスミドを含有する。細菌はこれらのペイロードをコードするＲＮＡを産生し、投与後、組織常在性マクロファージによるファゴサイトーシスおよび破壊の際に、コードされているｍＲＮＡを送達する。ｍＲＮＡは、真核生物宿主細胞によってタンパク質に翻訳され、抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングのために、Ｉ型ＩＦＮの存在下でマクロファージによって提示される。Ｉ型ＩＦＮは、ＳＴＩＮＧまたは改変ＳＴＩＮＧなどのコードされている免疫刺激タンパク質によっては刺激される。さらに、細菌は、細菌の転写および翻訳のための細菌プロモーターおよび配列を含むプロモーターを使用して、Ｉ型ＩＦＮおよび病原体抗原をタンパク質として提供することができる。次いで、マクロファージは、組織内でＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングし、ならびにリンパ節に移送して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングする。次いで、プライミングされ活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、巡回するメモリＴ細胞として循環し、ならびに元の組織に戻って、組織常在性メモリＣＤ８＋Ｔ細胞として残る。次いで、プライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞活性化を誘導し、高力価の持続性のある中和抗体を産生する。このワクチン接種戦略は、天然痘、ポリオ、麻疹、鶏痘、および疾患が自然に発生する組織に投与されるその他の弱毒化生ワクチンを模倣している。
Ｈ．医薬品生成、組成物および製剤
製造方法、ならびに本明細書で提供される免疫刺激細菌のいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤または添加剤を含む医薬組成物および製剤が、本明細書で提供される。医薬組成物は、疾患、例えば、過剰増殖性の疾患または状態、例えば、腫瘍またはがんの処置で使用することができる。免疫刺激細菌は、単剤療法として投与することができ、またはさらなる薬剤もしくは処置との併用療法で投与することができる。併用療法としては、免疫刺激細菌および／または本明細書で提供される他のデリバリー媒体との、任意の他の抗がん治療または処置、例えば、限定されないが、免疫治療、例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法およびチェックポイント阻害剤、放射線照射、手術、化学療法剤、例えば、ヌクレオシドアナログおよび白金化合物、ならびに細胞療法との組合せ療法（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ）が挙げられる。組成物は、単回投薬量の投与のために、または多回投薬量の投与のために製剤化することができる。薬剤は、直接投与のために製剤化することができる。組成物は、液体または乾燥製剤として提供することができる。
１．製造
ａ．セルバンクの製造
本明細書に記載の免疫治療薬の活性成分が操作された自己複製細菌からなるので、選択された組成は、長期保存のために、および原体（ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の製造のための出発材料として維持される一連のセルバンクにおいて、増やされる。セルバンクは、Code of Federal Regulations (CFR) 21 part 211、または他の関連する規制当局に従って、適切な製造施設において、現行適正製造基準（ｃＧＭＰ）の下で生成される。免疫治療薬の活性薬剤が生きている細菌であるので、本明細書に記載の産物は、定義によれば、非滅菌であり、最終的に滅菌することができない。汚染を防止するために、製造プロセス全体を通して無菌手順が確実に使用されることに注意を払わなければならない。したがって、すべての原材料および溶液は、製造プロセスで使用する前に滅菌されなければならない。
マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、出発材料中に夾雑物が存在しないことを確実にするために、選択された細菌株の連続的系列単一コロニー単離（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｓｅｒｉａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）によって生成される。滅菌した培地（複合培地、例えば、ＬＢもしくはＭＳＢ、または限定培地、例えば、適切な栄養素が補充されたＭ９であり得る）を含む滅菌した培養容器に単一ウェル単離細菌コロニーを接種し、例えば、振盪しながら３７℃でインキュベートすることによって、細菌を複製させる。次いで、凍結保護剤（複数可）を含む溶液中に懸濁することによって、凍結保存のための細菌を調製する。
凍結保護剤の例としては、以下が挙げられる：タンパク質、例えば、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリン；例えば、単糖類（例えば、ガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど）およびこれらの非還元誘導体（例えば、メチルグルコシド）、二糖類（例えば、トレハロース、ショ糖など）、シクロデキストリン、ならびに多糖類（例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど）を含めた炭水化物；アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン、アラニン、アルギニンまたはヒスチジン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなど）；メチルアミン、例えばベタイン；ポリオール、例えば、三価または高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；界面活性物質、例えば、プルロニック（登録商標）；または有機硫黄化合物、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ならびにこれらの組合せ。凍結保存溶液は、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム）、ならびに／または緩衝剤、例えば、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および当業者に既知の他のそのような緩衝剤も含むことができる溶液中に１または複数の凍結保護剤を含むことができる。
凍結保存溶液中の細菌の懸濁液は、濃縮された凍結保護剤（複数可）を培養材料に添加して、凍結解凍プロセス中に細菌の生存率を保つ終濃度（例えば、０．５％～２０％終濃度のグリセロール）にすることか、または細菌を回収し（例えば、遠心分離による）、適切な終濃度の凍結保護剤を含む凍結保存溶液中に懸濁することかのいずれかによって、得ることができる。次いで、凍結条件下で完全な閉鎖を維持することができる容器閉鎖システム（例えば、ブチルストッパーおよびクリンプシール）を用いて、凍結保存溶液中の細菌の懸濁液を適切な滅菌したバイアル（プラスチックまたはガラス）中にいっぱいに入れる。次いで、マスターセルバンクのバイアルを凍結する（速度制御フリーザーによって緩徐に、またはフリーザー中に直接入れることによって急速に）。次いで、長期の生存率を保つ温度（例えば、－６０℃以下）でＭＣＢを凍結保存する。適切な当局による規則に従って同一性、純度、および活性を保証するために、解凍したマスターセルバンク材料を徹底的に特徴付ける。
ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）は、マスターセルバンクとほぼ同じ方法で生成され、出発材料はＭＣＢに由来する。ＭＣＢ材料は、滅菌した培地を含む発酵容器中に直接移し、上記のように増やすことができる。次いで、細菌を凍結保存溶液中に懸濁し、容器中にいっぱいに入れ、密閉し、－２０℃以下で凍結する。複数のＷＣＢをＭＣＢ材料から生成することができ、ＷＣＢ材料は、さらなるセルバンク（例えば、製造業者のワーキングセルバンク（ＭＷＣＢ））を作製するのに使用することができる。ＷＣＢを凍結保存し、同一性、純度、および活性を保証するために特徴付ける。ＷＣＢ材料は、典型的には、操作された細菌などの生物製剤の原体の生成で使用される出発材料である。
ｂ．原体の製造
原体は、上記のように、ｃＧＭＰの下で無菌のプロセスを使用して製造される。ワーキングセルバンク材料は、ｃＧＭＰの下での原体の製造のための出発材料として典型的には使用されるが、他のセルバンクを使用してもよい（例えば、ＭＣＢまたはＭＷＣＢ）。細菌細胞ベース療法を含めて、すべての細胞療法の生成のために、無菌処理が使用される。セルバンクからの細菌は発酵によって増やされ；これは、前培養（例えば、振盪フラスコ中）の生成によって、または発酵槽の直接接種によって達成することができる。発酵は、使い捨てでもよいし、再利用可能でもよい滅菌したバイオリアクターまたはフラスコ中で成し遂げられる。細菌は、濃縮（例えば、遠心分離、連続遠心分離または接線流濾過による）によって回収される。濃縮された細菌は、培地を緩衝剤と交換すること（例えば、透析濾過による）によって、培地成分および細菌代謝物から精製される。バルク薬物製品は製剤化され、中間体として保たれる（例えば、凍結もしくは乾燥による）か、または薬物製品に直接処理される。原体は、同一性、強度、純度、効力および品質について試験される。
ｃ．薬物製品の製造
薬物製品は、その最終的な容器中に含まれる活性物質の最終的な製剤と定義される。薬物製品は、ｃＧＭＰの下で無菌プロセスを使用して製造される。薬物製品は原体から生成される。原体は解凍されるか、または必要ならば再構成され、次いで、適切な標的強度で製剤化される。薬物製品の活性成分は生きている操作された細菌であるので、強度は、懸濁液内に含まれるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数によって決定される。バルク産物は、以下に記載のように、保存および使用に適切な最終的な製剤に希釈される。容器は満たされ、容器閉鎖システムで密閉され、薬物製品は標識される。薬物製品は安定性を保つのに適切な温度で保存され、同一性、強度、純度、効力および品質について試験され、これが指定の承認基準を満たす場合、ヒト使用のために発売される。
２．組成物
薬学的に許容される組成物は、規制当局または他の当局の許可を考慮して調製され、ならびに／または動物およびヒトで使用するための一般に認識される薬局方に従って調製される。組成物は、溶液剤、懸濁剤、粉末剤または持続性放出製剤として調製することができる。典型的には、化合物は、当技術分野で周知の技法および手順を使用して医薬組成物に製剤化される（例えば、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, page 126を参照されたい）。製剤は投与様式に適するべきである。
組成物は、筋内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内、皮下、腫瘍内、硬膜外、経鼻、経口、膣、直腸、局所、局部、耳、吸入、頬側（例えば、舌下）および経皮投与を含めた当業者に既知の任意の経路による、または任意の適切な経路による投与のために、製剤化することができる。他の投与様式も企図される。投与は、処置の場所に応じて、局部、局所または全身的であり得る。処置を必要としている領域への局部投与は、例えば、限定されないが、手術中の局部注入、例えば創傷被覆材と併せた手術後の局所的適用によって、注射によってカテーテルによって、坐剤によって、または埋植によって達成することができる。組成物は、連続して、断続的に、または同じ組成物中で、他の生理活性物質とともに投与することもできる。投与は、制御放出製剤を含めた制御放出システム、および例えばポンプによるデバイス制御放出も含むことができる。
任意の所与の場合における最も適切な経路は、様々な因子、例えば、疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度および使用される特定の組成物に依存する。医薬組成物は、各投与経路に適切な剤形で製剤化することができる。特に、組成物は、全身的、局部、腹腔内、経口または直接投与のための任意の適切な医薬調製物に製剤化することができる。例えば、組成物は、皮下、筋内、腫瘍内、静脈内または皮内投与のために製剤化することができる。投与方法は、分解性プロセス、例えば、抗原性応答および免疫原性応答を介する免疫学的介入への活性薬剤の曝露を低下させるために用いることができる。そのような方法の例としては、処置部位での局部投与または持続注入が挙げられる。
免疫刺激細菌は、適切な医薬調製物、例えば、経口投与のための溶液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続性放出製剤またはエリキシル剤、ならびに経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器に製剤化することができる。典型的には、化合物は、当技術分野で周知の技法および手順を使用して医薬組成物に製剤化される（例えば、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, page 126を参照されたい）。一般に、製剤の様式は投与経路の関数である。組成物は、乾燥（凍結乾燥もしくは他の形態のガラス化）または液体形態に製剤化することができる。組成物が乾燥形態で提供される場合、適切な緩衝剤、例えば、滅菌した食塩水を添加することによって、使用直前にこれを再構成することができる。
３．製剤
ａ．液剤、注射剤、乳濁剤
製剤は、一般に、投与経路に適するように作製される。一般に、皮下、筋内、腫瘍内、静脈内または皮内のいずれかの注射または注入によって特徴付けられる非経口投与が本明細書で企図される。非経口投与のための細菌の調製物としては、すぐに注射できる状態の懸濁剤（直接投与）、使用前に解凍される凍結懸濁剤、使用直前に再懸濁溶液とすぐに混ぜ合わせることができる状態の乾燥可溶性生成物、例えば凍結乾燥粉末剤、および乳濁剤が挙げられる。後で使用するための単位用量の保存のために、乾燥熱安定性製剤、例えば凍結乾燥製剤を使用することができる。
医薬調製物は、凍結液体形態、例えば懸濁剤の形態であってもよい。凍結液体形態で提供される場合、薬物製品は、使用前に解凍され、かつ治療有効濃度に希釈される濃縮調製物として提供することができる。
医薬調製物は、使用するために解凍または希釈を必要としない剤形で提供することもできる。そのような液体調製物は、適宜、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトール、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステルまたは分画植物油）；および微生物治療薬での使用に適した防腐剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。医薬調製物は、使用前に水または他の滅菌した適切な媒体で再構成するために、乾燥形態、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥で提供することができる。
適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロースまたはグリセロールである。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。静脈内に投与される場合、適切な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、および静脈内水分補給に使用される他の緩衝溶液が挙げられる。腫瘍内投与については、増粘剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、油乳濁液、ならびにこれらの混合物を含む溶液が、注射物質（ｉｎｊｅｃｔａｎｔ）の局在化を維持するのに適切であり得る。
医薬組成物は、担体または他の賦形剤を含むことができる。例えば、本明細書で提供される医薬組成物は、希釈剤、アジュバント、抗粘着剤、結合剤、コーティング剤、フィラー、香料、色素、潤滑剤、流動促進剤、防腐剤、界面活性剤もしくは吸着剤およびこれらの組合せ、または改変された治療用細菌が投与される媒体のいずれか１つまたは複数を含むことができる。例えば、非経口調製物で使用される薬学的に許容される担体または賦形剤としては、水性媒体、非水性媒体、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が挙げられる。液体調製物を含めて、製剤は、薬学的に許容される添加剤または賦形剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。
医薬組成物は、担体、例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または組成物が投与される媒体を含むことができる。適切な医薬品担体の例は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、一般に精製された形態または部分的に精製された形態の治療有効量の化合物または薬剤を適切な量の担体とともに含む。そのような医薬品担体は、石油、動物、野菜または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油およびゴマ油を含めて、滅菌した液体、例えば、水および油であり得る。水は典型的な担体である。特に注射用溶液のための液体担体として、食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を用いることもできる。組成物は、活性成分とともに以下のものを含むことができる：希釈剤、例えば、ラクトース、ショ糖、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えばデンプン、天然ゴム、例えばアカシアゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者に既知の他のそのような結合剤。適切な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールが挙げられる。例えば、適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。組成物は、所望ならば、他の少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度増強剤ならびに他のそのような薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなども含むことができる。
非経口調製物で使用される薬学的に許容される担体としては、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が挙げられる。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液ならびにデキストロースおよび乳酸化リンガーの注射液が挙げられる。非水性非経口媒体としては、野菜起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびピーナッツ油が挙げられる。等張剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸およびクエン酸が挙げられる。抗酸化剤としては硫酸水素ナトリウムが挙げられる。局所麻酔薬としては塩酸プロカインが挙げられる。懸濁および分散剤としては、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、例えば、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖またはキレート剤、例えばＥＤＴＡを含むことができる。医薬品担体は、水混和性媒体のためのポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含む。非抗微生物防腐剤を含むことができる。
医薬組成物は、他の少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度増強剤ならびに他のそのような薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなども含むことができる。一定レベルの投薬量が維持されるような徐放性または持続性放出システムの埋植（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照されたい）も本明細書で企図される。そのような非経口組成物に含まれる活性化合物のパーセンテージは、それらの特定の性質ならびに化合物の活性および対象の要求に非常に依存している。
ｂ．乾燥熱安定性製剤
細菌を乾燥させることができる。乾燥熱安定性製剤、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末およびガラス化ガラスは、溶液剤、乳濁剤および他の混合物としての投与のために再構成することができる。乾燥熱安定性製剤は、上記の懸濁剤などの液体製剤のいずれかから調製することができる。医薬調製物は、使用前に水または他の適切な媒体で再構成するために、凍結乾燥またはガラス化形態で提供することができる。
熱安定性製剤は、滅菌した溶液で乾燥化合物を再構成することによる投与のために調製される。溶液は、活性物質または粉末から調製された再構成された溶液の安定性または他の薬理学的属性を改善する賦形剤を含むことができる。熱安定性製剤は、賦形剤、例えば、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、ショ糖または他の適切な薬剤を適切な緩衝剤、例えば、クエン酸、ナトリウムもしくはリン酸カリウムまたは当業者に既知の他のそのような緩衝剤中に溶解することによって調製される。次いで、原体が得られた混合物に添加され、それが混合するまで撹拌される。得られた混合物は乾燥するためにバイアル中に配分される。各バイアルは、バイアルあたり１×１０５～１×１０１１ＣＦＵを含む単回投薬量を含む。乾燥後、生成物のバイアルは、水分または夾雑物が密閉バイアル中への進入するのを防止する容器閉鎖システムで密閉される。乾燥生成物は、－２０℃、４℃または室温などの適切な条件下で保存することができる。水または緩衝液を用いたこの乾燥製剤の再構成は、非経口投与で使用するための製剤を提供する。正確な量は、処置される適応症および選択される化合物に依存する。そのような量は、経験的に決定することができる。
４．他の投与経路のための組成物
処置される状態に応じて、非経口に加えて他の投与経路、例えば、局所的適用、経皮パッチならびに経口および直腸投与も本明細書で企図される。上記の懸濁剤および粉末剤は経口的に投与することができ、または経口投与のために再構成することができる。直腸投与のための医薬品剤形は、直腸坐剤、カプセル剤ならびに全身作用のための錠剤およびゲルカプセ剤である。直腸坐剤は、体温で融けるか柔らかくなり、１または複数の薬理学的または治療的に活性な成分を放出する、直腸へ挿入するための固形物を含む。直腸坐剤で薬学的に許容される物質は、基剤または媒体および融点を上げるための薬剤である。基剤の例としては、ココアバター（カカオ脂）、グリセリン－ゼラチン、ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標）（ポリエチレングリコール）ならびに脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリドの適切な混合物が挙げられる。様々な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤としては、鯨蝋およびワックスが挙げられる。直腸坐剤は、圧縮方法または成形のいずれかによって調製することができる。直腸坐剤の典型的な重量は約２～３グラムである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、経口投与のための製剤と同じ薬学的に許容される物質を使用して、かつ経口投与のための製剤と同じ方法によって製造される。直腸投与に適した製剤は、単位用量坐剤として提供することができる。これらは、原体を１または複数の従来の固体担体、例えばココアバターと混合し、次いで得られた混合物を形づくることによって、調製することができる。
経口投与については、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。
頬側（舌下）投与に適した製剤としては、例えば、香味基剤、通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガント中に活性化合物を含むロゼンジ剤；ならびに不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴム中に化合物を含む香錠が挙げられる。
局所混合物は、局部および全身投与について記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液であり得、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、乳濁剤、溶液剤、エリキシル剤、ローション剤、懸濁剤、チンキ剤、ペースト剤、フォーム剤、エアロゾル剤、洗浄剤、スプレー剤、坐剤、包帯、皮膚パッチ剤または局所投与に適した任意の他の製剤として製剤化される。
組成物は、例えば吸入による局所的適用のためのエアロゾル剤として製剤化することができる（例えば、肺疾患の処置に有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾル剤を記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号および第４，３６４，９２３号を参照されたい）。気道への投与のためのこれらの製剤は、ネブライザーのためのエアロゾル剤または溶液剤の形態でもよく、または単独であるかまたはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた吹送（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）のための超微粒粉末でもよい。そのような場合、製剤の粒子は、典型的には、５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径を有する。
化合物は、局部または局所的適用するために、例えば、ゲル剤、クリーム剤およびローション剤の形態で、皮膚および眼内などの粘膜に局所的適用するために、ならびに眼に適用するために、または嚢内もしくは髄腔内適用のために、製剤化することができる。局所投与は、経皮デリバリーのために企図され、同様に眼もしくは粘膜への投与のために、または吸入療法のために企図される。単独であるかまたは他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた活性化合物の点鼻液も投与することができる。
経皮投与に適した製剤が提供される。これは、任意の適切な形式、例えば、長時間にわたってレシピエントの表皮と密接に接触したままであるように適合された個別のパッチ剤で提供することができる。そのようなパッチ剤は、活性化合物に関して例えば０．１～０．２Ｍ濃度の適宜緩衝化された水溶液中に活性化合物を含む。経皮投与に適した製剤は、イオン導入法によって送達することもでき（例えば、Tyle, P. (1986) Pharmaceutical Research 3(6):318-326を参照されたい）、典型的には、活性化合物の適宜緩衝化された水溶液の形態をとることができる。
医薬組成物は、制御放出製剤および／またはデリバリーデバイスによって投与することもできる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第３，６３０，２００号；第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第４，００８，７１９号；第４，７６９，０２７号；第５，０５９，５９５号；第５，０７３，５４３号；第５，１２０，５４８号；第５，５９１，７６７号；第５，６３９，４７６号；第５，６７４，５３３号；および第５，７３３，５６６号を参照されたい）。
５．投薬量および投与
組成物は、単回投薬量または多回投薬量の投与のための医薬組成物として製剤化することができる。処置される患者に対して望ましくない副作用無しに治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で免疫刺激細菌を含むことができる。例えば、薬学的に活性な化合物の濃度は、注射が所望の薬理学的作用をもたらすのに有効な量を提供するように調整される。治療有効濃度は、既知のインビトロおよびインビボシステムで、例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で既知のアッセイを使用することによって、免疫刺激細菌を試験することによって、経験的に決定することができる。例えば、標準的な臨床的技法を用いることができる。最適な投薬量範囲を特定するのを支援するために、インビトロアッセイおよび動物モデルを用いることができる。経験的に決定することができる正確な用量は、患者または動物の年齢、体重、体表面積および状態、投与される特定の免疫刺激細菌、投与経路、処置される疾患のタイプ、ならびに疾患の重篤度に依存し得る。
したがって、正確な投薬量および処置の継続期間は、処置を受ける疾患の関数であり、既知の試験プロトコールを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データからの外挿によって、経験的に決定することができることが理解されよう。濃度および投薬量の値は、軽減される状態の重症度によっても変動し得る。任意の特定の対象について、個体の要求（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｎｅｅｄ）、および組成物を投与する者または組成物の投与を監督する者の専門的判断に従って、特定の投薬量レジメンが、経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載の濃度範囲は例示的なものに過ぎず、組成物およびそれを含む組合せの範囲または使用を限定することを意図しないことをさらに理解されたい。組成物は、１時間ごと、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与することができる。一般に、投薬量レジメンは毒性を制限するように選択される。毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓もしくは他の組織の機能障害が理由で、投薬量を下げるために、どのようにして、およびいつ療法を終了する、中断するまたは調整するかを主治医は知っているであろうことに留意されたい。逆に、主治医は、臨床応答が十分でない場合、どのようにして、およびいつより高いレベルに処置を調整する（有毒な副作用は起こらないようにする）かも知っているであろう。
免疫刺激細菌は、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で組成物に含まれる。例えば、量は、過剰増殖性の疾患または状態、例えばがんの処置において治療効果を達成するもの、またはワクチンとして効果的な、もしくはｍＲＮＡを送達するのに効果的な量である。例示的用量は約１×１０９ＣＦＵ／ｍ２であり得るが、投与の経路に依存する。以下の表に示すように、および上記のように、より高い用量を投与することができる。マウスモデルにおける実験からの以下のデータは、本明細書に記載のゲノム改変を有する菌株は、ＶＮＰ２０００９株と比較して少なくとも約１５倍有意に改善された忍容性を有し、したがって、より多い量で投与することができることを示す。
本明細書に記載され提供される免疫刺激細菌は、静脈内（ＩＶ）、鼻腔／鼻腔内投与によるなどの粘膜を介して、および肺への吸入によるなどが挙げられるが、これらに限定されない好適な経路で投与することができる。これは、細菌が、例えば重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を含む細菌性およびウイルス性病原体などの病原体に対するワクチンとして使用される実施形態において、特に有利である。細菌は、錠剤、粉末剤、または液剤、もしくは他の好適な製剤として提供されることができ、それらは、製剤に応じて、冷凍保存され、冷蔵保存され、または室温で保存される。したがって、ｍＲＮＡを提供する細菌は、様々な経路を介して投与されることができ、便利に保存および製剤化され得る。
薬学的および治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的には、単位剤形または多回剤形で製剤化され、投与される。各単位用量は、必要とされる医薬品担体、媒体または希釈剤とともに、所望の治療効果をもたらすのに十分である、治療的に活性な化合物の予め決定された分量を含む。単位剤形としては、限定されないが、適切な分量の化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、非経口懸濁剤、経口溶液剤または懸濁剤および水中油形乳剤が挙げられる。単位投与形態は、バイアル、アンプルおよびシリンジ、または個々に包装された錠剤もしくはカプセル剤中に含まれ得る。単位投与形態は、その分数量または倍数量で投与することができる。多回投与形態は、分離された単位投与形態で投与される、単一容器中に包装されている複数の同一の単位剤形である。多回投与形態の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルが挙げられる。したがって、多回投与形態は、包装中で分離されていない多数の単位用量である。一般に、０．００５％～１００％の範囲で活性成分を含み、残りが非毒性の担体から構成される剤形または組成物を調製することができる。医薬組成物は、各投与経路に適切な剤形に製剤化することができる。
単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針がついているシリンジ中に包装される。薬学的に活性な化合物を含む液体溶液または再構成粉末調製物の容量は、処置される疾患および包装用に選択される特定の製造品の関数である。非経口投与のためのすべての調製物は、当技術分野で既知であり、実施されるように、滅菌されなければならない。
示されるように、本明細書で提供される組成物は、限定されないが、皮下、筋内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内、硬膜外、膣、直腸、局部、耳もしくは経皮投与、または任意の投与経路を含めて、当業者に既知の任意の経路のために製剤化することができる。そのような経路に適する製剤は当業者に既知である。組成物は、連続して、断続的に、または同じ組成物中で、他の生理活性物質とともに投与することもできる。
医薬組成物は、制御放出製剤および／またはデリバリーデバイスによって投与することができる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第３，６３０，２００号；第３，８４５，７７０号；第３，８４７，７７０号；第３，９１６，８９９号；第４，００８，７１９号；第４，６８７，６６０号；第４，７６９，０２７号；第５，０５９，５９５号；第５，０７３，５４３号；第５，１２０，５４８号；第５，３５４，５５６号；第５，５９１，７６７号；第５，６３９，４７６号；第５，６７４，５３３号；および第５，７３３，５６６号を参照されたい）。様々なデリバリーシステムが既知であり、選択された組成物を投与するのに使用することができ、本明細書における使用が企図され、そのような粒子は容易に作製することができる。
６．包装および製造品
包装材料、本明細書で提供される任意の医薬組成物、および組成物が本明細書に記載の疾患または状態の処置に使用されることを示す標識を含む製造品も提供される。例えば、標識は、処置が腫瘍のため、またはがんのためであることを示すことができる。
本明細書に記載の免疫刺激細菌と別の治療剤の組合せも製造品中に包装することができる。一例では、製造品は免疫刺激細菌組成物を含む医薬組成物を含み、さらなる薬剤または処置を含まない。他の例では、製造品は、別のさらな治療剤、例えば、異なる抗がん剤を含む。この例では、薬剤は、製造品として包装するために、一緒にまたは個別に提供することができる。
本明細書で提供される製造品は包装材料を含む。医薬製品を包装するための包装材料は当業者に周知である。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３２３，９０７号、第５，０５２，５５８号および第５，０３３，２５２号を参照されたい。医薬品の包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、ボトル、管、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤ならびに投与および処置の目的の様式に適した任意の包装材料が挙げられる。製造品の例は、単一チャンバー容器および二重チャンバー容器を含めた容器である。容器としては、限定されないが、管、ボトルおよびシリンジが挙げられる。容器は、静脈内投与のための針をさらに含むことができる。
包装の選択は、薬剤、およびそのような組成物が一緒に包装されるかまたは個別に包装されるかどうかに依存する。一般に、包装用品（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）はその中に含まれる組成物と非反応性である。他の例では、一部の成分を混合物として包装することができる。他の例では、すべての成分が個別に包装される。したがって、例えば、投与の直前に混合すると一緒に直接投与することができる個別の組成物として成分を包装することができる。あるいは、個別に投与するための個別の組成物として成分を包装することができる。
選択された組成物は、それらの製造品を含めて、キットとして提供することができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物および製造品として提供される投与のための物品を含むことができる。組成物は、投与のための物品中に含むことができるか、または後で加えるために個別に提供することができる。キットは、適宜、投薬量、投与レジメンを含む適用のための使用説明書、および投与様式に関する使用説明書を含むことができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物および診断のための物品も含むことができる。
Ｉ． 処置の方法および使用
本明細書に提供される方法は、がんなどの、そのような細菌の投与によって症状を寛解または軽減できる疾患または状態を有する対象を処置するために、免疫刺激細菌を投与または使用する方法を含む。特定の例では、疾患または状態は腫瘍またはがんである。本明細書で提供される細菌は、上記セクションで述べられたように、ワクチンおよび他のそのような用途として使用することができる。そのような場合、細菌は、抗がん剤としての使用を参照して記載されたように、このセクションで述べているように細菌を投与するだけでなく、様々な病原体の自然な侵入経路を模倣する他の経路によっても投与することができる。例えば、上記のセクションで述べたように、呼吸器ウイルスなどのウイルスに対するワクチン接種のために、それらは鼻または肺への吸入によって投与することができる。これらの細菌は、鼻、食道、肺などの投与された組織でＴ細胞応答および免疫応答を誘導し、インサイチュ免疫応答を促進し、抗原に特異的なメモリＴ細胞、ならびにＢ細胞をもたらし、長期的な応答を提供する。
その上、抗がん剤または抗ヒアルロナン剤などの、処置のために１つまたは複数の追加的な薬剤を用いる併用療法の方法も提供される。細菌は、非経口、全身、外用、および局所、例えば、腫瘍内、静脈内、直腸、経口、筋肉内、粘膜、および他の経路を含むが、それに限定されるわけではない任意の適切な経路によって投与することができる。本明細書に記載される細菌の改変が原因で、全身投与に関連する問題が解決される。各投与経路に適切な製剤が提供される。当業者は、適切なレジメンおよび用量を確立し、投与経路を選択することができる。
１．処置する患者を選択し処置をモニタリングするための診断法
ａ．患者選択
バイオマーカーは、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた治療法に応答する可能性が高い患者を特定するために使用することができる。例えば、アデノシンシグネチャーおよび骨髄シグネチャーは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現パネルによって評価することができ、腫瘍のＴ細胞浸潤は、腫瘍部位での宿主免疫応答を測定することによって初期結腸がん患者の再発リスクを予測するために使用されるインビトロ診断検査であるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）検査によって評価することができる。腫瘍または体液が免疫応答性または免疫応答を示す患者は、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた処置に応答する可能性がより高い。
他のバイオマーカーは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＴＮＡＰ（組織非特異的アルカリホスファターゼ）、ＣＤ３８、ＣＤ６８、ＰＤ－Ｌ１、およびＦｏｘＰ３を含む。例えば、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いて処置できる腫瘍は、排除されたＴ細胞であり、高レベルのプリン／アデノシンを表し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的化療法に非応答性である。
様々なＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現パネルを用いて決定することができる遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）は、例えば、腫瘍の「アデノシンシグネチャー」を特定するために分析することができる。高濃度のアデノシンは、数ある中で結腸直腸癌（ＣＲＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および膵がんを含むある特定の腫瘍に見出される。本明細書における免疫刺激細菌は、プリン／アデノシンが豊富な腫瘍微小環境内に蓄積し、複製するので、高濃度のプリン／アデノシンを表す腫瘍を有する患者は、治療法に応答する可能性が高い。したがって、「アデノシンシグネチャー」を発現する腫瘍の特定を使用して、治療法に対する患者の応答を予測することができる。その上、本明細書における免疫刺激細菌は、腫瘍常在性骨髄細胞内に優先的に蓄積し、それに感染する。したがって、「骨髄シグネチャー」を使用して、免疫刺激細菌を用いた治療法に対する患者の応答を予測することもできる。例えば、「アデノシンシグネチャー」は、腎細胞癌（ＲＣＣ）患者におけるアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）単剤療法に対する応答不良と関連する「骨髄シグネチャー」とほぼ同一であることが示されており、これは、抗ＰＤ－Ｌ１療法からの腫瘍の逃避にアデノシンが果たす役割を指し示す（例えば、McDermott et al. (2018) Nature Medicine 24:749-757を参照）。腫瘍－骨髄および腫瘍－アデノシンＮａｎｏＳｔｒｉｎｇシグネチャーパネルは利用可能であり、患者の選択のために使用することができる。
マクロファージは、例えば、トリプルネガティブ乳がんにおいて、固形腫瘍内へのＴ細胞浸潤を限定し、その機能を抑制する（例えば、Keren et al. (2018) Cell 174:1373-1387を参照）。ＣＲＣなどのある特定のがんでは、マクロファージは、腫瘍内免疫集団を支配し、Ｔ細胞の排除を促進し、結果として、腫瘍関連マクロファージはＣＲＣにおける予後不良と関連する（例えば、Bindea et al. (2013) Immunity 39:782-795を参照）。がんに浸潤し、がんを取り囲む免疫細胞に基づき、がん患者の予後を推定する方法、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）を使用して、Ｔ細胞排除またはＴ細胞浸潤を測定することができる。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）は、がんの分類に宿主免疫応答の影響を組み込み、予後予測精度を改善する。これは、腫瘍の中心および周辺で２つのＴリンパ球集団（ＣＤ３／ＣＤ８、ＣＤ３／ＣＤ４５ＲＯ、またはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ）の密度を測定し、両方の領域で両方の細胞型の低い密度が見出された場合の０（Ｉ０）から、両方の領域で高い密度が見出された場合の免疫スコア４（Ｉ４）までの範囲のスコアを提供する。Ｔリンパ球の低浸潤は、高リスクと相関する低いＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）をもたらすのに対し、Ｔリンパ球の高浸潤は、低リスクと相関する高いＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）をもたらす。したがって、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）は、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた治療法に応答する患者を特定するための前向きバイオマーカーとして評価することができる。例えば、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、コールド腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）におけるＴ細胞浸潤を誘導するので、Ｔ細胞不足／非炎症腫瘍を処置することができる。そのような腫瘍は、チェックポイント阻害が不応性である、アンメットニーズの高い集団を表す。
細胞外アデノシンは、一緒になって死細胞または瀕死細胞から産生されるＡＴＰまたはＡＤＰのリン加水分解によってアデノシンを産生する、腫瘍間質細胞上に発現される膜関連エクト酵素、ＣＤ３９（エクト－ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、またはＮＴＰＤアーゼ１）およびＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）の順次活性によって産生される。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰ（またはＡＤＰ）を５’－ＡＭＰに変換し、それは、ＣＤ７３によってアデノシンに変換される。内皮細胞上のＣＤ３９およびＣＤ７３の発現は、腫瘍微小環境の低酸素状態下で増大し、それにより、アデノシンのレベルを増大させる。したがって、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いて標的化できるアデノシンが豊富な腫瘍を指し示すバイオマーカーとして使用することができる。
環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られるＣＤ３８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂリンパ球、およびナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞の表面に見出される糖タンパク質である。細胞活性化のマーカーであるＣＤ３８の損失は、免疫応答の障害と関連し、白血病、骨髄腫、および固形腫瘍と連鎖している。その上、ＣＤ３８の発現増大は、慢性リンパ性白血病における予後不良の診断マーカーであり、疾患進行の増大と関連する。ＣＤ３８はまた、多発性骨髄腫の処置のために承認されているダラツムマブ［Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）］についての標的として使用される。ＣＤ６８は、単球、循環マクロファージ、および組織マクロファージ（例えば、クッパー細胞、ミクログリア）によって高度に発現される。ＦｏｘＰ３は、免疫系の応答に関与し、免疫抑制性である制御性Ｔ細胞（またはＴｒｅｇ）の発生および機能における調節物質として作用する。がんにおいて、過剰の制御性Ｔ細胞活性は、免疫系ががん細胞を破壊することを防止することができる。したがって、ＣＤ３８、ＣＤ６８、およびＦｏｘＰ３はまた、本明細書における免疫刺激細菌を用いた治療法に応答する可能性が高い患者を選択するためのバイオマーカーとして使用することができる。
ｂ．免疫刺激細菌の活性を評価または検出するための診断は処置の有効性を示す
バイオマーカーを使用して、処置後に免疫刺激細菌をモニタリングすることができる。バイオマーカーは、腫瘍試料中および／または体液試料中、例えば、血液、血漿、尿、唾液、および他の液体中に存在する。検証済みの末梢血バイオマーカーを使用して、処置の前および途中に患者の免疫状態を評価して、処置の有効性と相関する免疫状態における変化が決定される。抗腫瘍免疫応答の状態への変化またはその増大は、免疫刺激細菌を用いた処置が効果を有していることを指し示す。例えば、用量漸増試験および拡大試験における本明細書に提供される免疫刺激細菌の免疫調節活性を評価することができる。バイオマーカーの検討は、疾患（例えば、腫瘍）状態およびその処置に関係する予後因子および予測因子を明らかにし、それは、処置をモニタリングすることを助けることができる。腫瘍微小環境を評価することは、例えば、免疫療法に対する腫瘍応答のメカニズムへの洞察を提供する。免疫刺激細菌の免疫調節活性を検出するための血清バイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ９、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、炎症性血清サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１／ＣＣＬ１）、およびＩＬ－１８結合タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、例えば免疫療法に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および腫瘍への輸送に必要なケモカインである。ニボルマブ、抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤の第３相試験において、以前に処置された転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）を有する患者の処置について、投与された用量にかかわらず、大部分の患者に共通であった免疫薬力学効果が特定された。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術［Ｍｙｒｉａｄ（登録商標）Ｒｕｌｅｓ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＲＢＭ）］に基づくマルチプレックスパネルを使用して、ＩＦＮ－γ調節血清ケモカインＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の評価を行い、結果は、増大したＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０血清レベルのみならず、腫瘍における増大した転写が臨床応答と相関したことを実証した。ニボルマブを用いた処置後のケモカインレベルにおけるベースラインからの増大の中央値は、末梢血中でＣＸＣＬ９について１０１％、およびＣＸＣＬ１０について３７％であった（例えば、Choueiri et al. (2016) Clin. Cancer Res. 22(22):5461-5471を参照）。その上、ＭＫ－１４５４ ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｍｅｒｃｋ）を用いた進行固形腫瘍またはリンパ腫を有する患者の処置は、腫瘍内投薬後の血清ＣＸＣＬ１０における用量依存性増大をもたらした（例えば、Harrington et al. ESMO Annual Meeting (2018)を参照）。
ＩＦＮ－βの血清レベルにおける用量依存性増大が、ＡＤＵ－Ｓ１００ ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）の腫瘍内投薬後に観察された（例えば、Meric-Bernstam et al. ASCO Annual Meeting (2019)を参照）。その上、ＶＮＰ２０００９の静脈内投与は、炎症性サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１２の血清レベルにおける用量依存性増大を誘導した（例えば、Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照）。
ＩＬ－１８は、細胞内細菌、真菌およびウイルスに対する防御免疫応答に関与し、肺がん、乳がん、肉腫、および黒色腫の前臨床モデルにおいて抗腫瘍活性を実証している。ＩＬ－１８の生物活性は、ＩＦＮ－γを経由して誘導されるＩＬ－１８結合性タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）による負のフィードバックループにおいてモジュレーションされる。したがって、ＩＬ－１８ＢＰの血清レベルは、臨床ＩＦＮ－γ活性を予測する。進行がんを有する患者への組換えヒトＩＬ－１８（ｒｈＩＬ－１８）の静脈内投与は、ＩＬ－１８結合性タンパク質の血清濃度の用量依存的な増大のみならず、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、および可溶性Ｆａｓリガンドにおける増大をもたらした（例えば、Robertson et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(14):4265-4273を参照）。その上、尿および血清中のＩＬ－１８ＢＰのレベルは、前立腺がんを有する患者における腫瘍状態と相関することが観察された；前立腺がんを有する例と有さない例との間で尿ＩＬ－１８ＢＰレベルに有意差が見出され、増大した血清ＩＬ－１８ＢＰレベルは、前立腺がんグリーソンスコアが増大することと相関し、前立腺がん細胞からのＩＬ－１８ＢＰ分泌の上昇が、免疫サーベイランスを逃避しようとするがんによる試みを指し示し得ることを実証している（例えば、Fujita et al. (2011) Int. J. Cancer 129(2):424-432を参照）。したがって、ＩＬ－１８ＢＰを腫瘍免疫応答についてのバイオマーカーとして使用することができる。
２．腫瘍
本明細書に提供される免疫刺激細菌、組合せ、使用、および方法は、肺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、胃がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝がん、膵がん、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんを含むがん、特に固形腫瘍を含む、すべての腫瘍型を処置するために適用することができる。方法はまた、血液がんを処置するために使用することができる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌、組成物、組合せ、使用、および方法による処置に供される腫瘍およびがんは、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、膵臓、消化管、中枢および末梢神経系、腎系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、関節、脂肪組織を含む結合組織系、ならびに血管壁を含む循環系を起源とするものを含むが、それに限定されるわけではない。本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いて処置することができる腫瘍の例は、癌腫、神経膠腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、腺癌、腺肉腫、および腺腫を含む。そのような腫瘍は、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部、または肝臓を含む身体の事実上すべての部分に存在し得る。
骨格系の腫瘍は、例えば、肉腫および芽細胞腫、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、および軟骨芽細胞腫を含む。筋肉および心臓の腫瘍は、骨格筋および平滑筋の両方の腫瘍、例えば、平滑筋腫（平滑筋の良性腫瘍）、平滑筋肉腫、横紋筋腫（骨格筋の良性腫瘍）、横紋筋肉腫、および心臓肉腫を含む。消化管の腫瘍は、例えば、口、食道、胃、小腸、および結腸の腫瘍、ならびに結腸直腸腫瘍のみならず、消化管分泌臓器、例えば唾液腺、肝臓、膵臓、および胆道の腫瘍を含む。中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍は、脳、網膜、および脊髄の腫瘍を含み、また、関連する結合組織、骨、血管、または神経組織を起源とし得る。末梢神経系の腫瘍の処置もまた企図される。末梢神経系の腫瘍は、悪性末梢神経鞘腫を含む。腎臓系の腫瘍は、腎臓の腫瘍、例えば、腎細胞癌のみならず、尿管および膀胱の腫瘍を含む。生殖器系の腫瘍は、子宮頸部、子宮、卵巣、前立腺、精巣、および関連する分泌腺の腫瘍を含む。免疫系の腫瘍は、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方を含む血液ベースの腫瘍および固形腫瘍を含む。呼吸器系の腫瘍は、鼻道、気管支、および肺の腫瘍を含む。乳房の腫瘍は、例えば、小葉癌および腺管癌の両方を含む。
免疫刺激細菌によって処置できる腫瘍および本明細書に提供される方法の他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、消化管および腎臓の癌腫および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫（多形膠芽腫など）、および平滑筋肉腫を含む。本明細書に提供されるように処置できる他のがんの例は、リンパ腫、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患を含むが、それに限定されるわけではない。そのようながんの例は、血液悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病／リンパ腫、およびＴ細胞急性リンパ性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄新生物、例えば、成熟を伴う急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害；中枢神経系の腫瘍、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、髄芽腫、上衣腫、および網膜芽腫；頭頸部固形腫瘍（例えば、鼻咽頭がん、唾液腺癌、および食道がん）、肺（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）、消化器系（例えば、消化器がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒまたはｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胆管または胆道のがん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、および肛門癌）、生殖器系（例えば、睾丸がん、陰茎がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、外陰がん、子宮頸がん、卵巣がん、および子宮内膜がん）、皮膚（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮がん、日光角化症、および皮膚黒色腫）、肝臓（例えば、肝がん、肝癌、肝細胞がん、および肝細胞腫）、骨（例えば、破骨細胞腫、および溶骨性骨がん）、追加的な組織および臓器（例えば、膵がん、膀胱がん、腎臓がんまたは腎がん、甲状腺がん、乳がん、腹膜がん、およびカポジ肉腫）、血管系の腫瘍（例えば、血管肉腫および血管周皮腫）、ウィルムス腫瘍、網膜芽腫、骨肉腫、およびユーイング肉腫を含む。
３．投与
本明細書における使用および方法を実施する場合、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍を有するもしくは新生細胞を有する対象、または免疫処置すべき対象を含む対象に投与することができる。免疫刺激細菌を投与するために適した状態を有する対象を診断すること、対象の免疫適格性を決定すること、対象を免疫処置すること、化学療法剤を用いて対象を処置すること、放射線を用いて対象を処置すること、または対象を外科的に処置することを含むが、それに限定されるわけではない１つまたは複数の工程は、対象への免疫刺激細菌の投与前、投与と同時、または投与後に行うことができる。
担腫瘍対象に免疫刺激細菌を治療目的で投与することを含む実施形態について、対象は、典型的には、以前に新生物状態と診断されている。診断方法はまた、新生物状態の型を決定すること、新生物状態のステージを決定すること、対象における１つもしくは複数の腫瘍のサイズを決定すること、対象のリンパ節中の転移性細胞もしくは新生細胞の存在もしくは非存在を決定すること、または対象における転移の存在を決定することを含み得る。
対象に免疫刺激細菌を投与するための治療方法の一部の実施形態は、原発腫瘍のサイズまたは新生物性疾患のステージを決定する工程を含む場合がある。そして、原発腫瘍のサイズが閾値容量以上の場合、または新生物性疾患のステージが閾値ステージ以上の場合、免疫刺激細菌が対象に投与される。類似の実施形態では、原発腫瘍のサイズが閾値容量未満の場合、または新生物性疾患のステージが閾値ステージ以下の場合、免疫刺激細菌は、対象にまだ投与されず；そのような方法は、腫瘍サイズまたは新生物性疾患のステージが閾値量に達するまで対象をモニタリングし、次いで、対象に免疫刺激細菌を投与することを含み得る。閾値サイズは、腫瘍の成長速度、免疫刺激細菌が腫瘍に感染する能力、および対象の免疫適格性を含むいくつかの要因に応じて変動し得る。一般的に、閾値サイズは、免疫刺激細菌が宿主の免疫系によって完全には排除されずに腫瘍内または腫瘍近くで蓄積および複製するために十分なサイズであり、典型的には、宿主が腫瘍細胞に対する免疫応答を開始するために十分長い時間、典型的には約１週間以上、約１０日以上、または約２週間以上、細菌感染を持続させるために十分なサイズでもある。例示的な閾値ステージは、最低ステージ（例えば、ステージＩもしくは等価物）を超える任意のステージ、または原発腫瘍が閾値サイズよりも大きな任意のステージ、または転移性細胞が検出される任意のステージである。
免疫刺激細菌が腫瘍または転移に侵入することを投与様式が可能にするならば、対象に微生物を投与する任意の様式を使用することができる。投与様式は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、外用、腫瘍内、多穿刺、吸入、鼻腔内、経口、体腔内（例えば、カテーテルを介して膀胱に投与すること、または坐剤もしくは浣腸により腸に投与すること）、耳内、直腸、および眼内投与を含み得るが、それに限定されるわけではない。
当業者は、対象および細菌と適合性の任意の投与様式であって、細菌が腫瘍および／または転移に到達することをもたらす可能性も高い投与様式を選択することができる。投与経路は、当業者によって、疾患の性質、腫瘍の種類、および医薬組成物中に含有される特定の細菌を含む多様な要因のいずれかにより選択され得る。標的部位への投与は、例えば、弾道デリバリーによって、もしくはコロイド分散系として行うことができ、または全身投与は動脈内注射によって行うことができる。
投薬量レジメンは多様な方法および量のいずれであってもよく、当業者が公知の臨床因子により決定することができる。免疫刺激が処置を引き起こす疾患または障害を処置するために、単回用量が治療的に有効であり得る。そのような刺激の例は、特異的免疫応答および非特異的免疫応答の一方または両方、特異的応答および非特異的応答の両方、自然応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、およびサイトカイン発現を含むが、それに限定されるわけではない免疫応答である。
医術において公知のように、対象のための投薬量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫適格性、および全身の健康状態、投与すべき特定の細菌、投与の期間および経路、疾患の種類およびステージ、例えば腫瘍サイズ、および同時投与される他の化合物、例えば薬物を含む多数の要因に依存し得る。上記要因に加えて、そのようなレベルは、当業者によって決定され得るように細菌の感染力および細菌の性質によって影響される場合がある。本方法では、細菌の適切な最小投薬量レベルは、細菌が腫瘍内または転移内で生存、成長、および複製するために十分なレベルであり得る。６５ｋｇのヒトに細菌を投与するための例示的な最低レベルは、少なくとも約５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）、少なくとも約１×１０７ＣＦＵ、少なくとも約５×１０７ＣＦＵ、少なくとも約１×１０８ＣＦＵ、または少なくとも約１×１０９ＣＦＵを含み得る。本方法では、細菌のおよその最大投薬量レベルは、宿主に有毒でないレベル、３×以上の脾腫を起こさないレベル、または約１日後、もしくは約３日後、もしくは約７日後に正常組織または臓器にコロニーもプラークももたらさないレベルであり得る。６５ｋｇのヒトに細菌を投与するための例示的な最高レベルは、約５×１０１１ＣＦＵ以下、約１×１０１１ＣＦＵ以下、約５×１０１０ＣＦＵ以下、約１×１０１０ＣＦＵ以下、または約１×１０９ＣＦＵ以下を含み得る。
本明細書に提供される方法および使用は、対象への免疫刺激細菌の単回投与、または対象への免疫刺激細菌の複数回投与、または他の抗腫瘍療法および／もしくは処置との併用療法を含むその他の多様なレジメンを含み得る。これらは、例えば、細胞療法、例えば改変免疫細胞の投与；ＣＡＲ－Ｔ療法；ＣＲＩＳＰＲ療法；チェックポイント阻害剤、例えば抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ－４抗体、ならびに他のそのような免疫療法）；化学療法化合物、例えばヌクレオシドアナログ；外科手術；および放射線療法を含む。他のがん治療はまた、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＧＦ－βもしくは抗ＩＬ－６抗体、またはその断片、がんワクチン、および腫瘍溶解性ウイルスを含む。
一部の実施形態では、単回投与は、腫瘍内に免疫刺激細菌を樹立するために十分であり、そこで、細菌はコロニー形成することができ、対象において抗腫瘍応答を引き起こすまたは増強することができる。他の実施形態では、本明細書における方法に使用するために提供される免疫刺激細菌は、時間が離れた、典型的には少なくとも１日離れた、異なる機会に投与することができる。別々の投与は、腫瘍または転移に細菌を送達する可能性を増大させることができ、その際、以前の投与は、腫瘍または転移に細菌を送達することに無効であった場合がある。実施形態では、別々の投与は、細菌のコロニー形成／増殖が起こり得る腫瘍または転移上の位置を増大させることができ、また、腫瘍中に蓄積した細菌の力価を別途増大させることができ、それにより、宿主の抗腫瘍免疫応答の誘起または増強を増大させることができる。
別々の投与が行われる場合、各投与は、他の投与の投薬量と比べて同じまたは異なる投薬量であり得る。一実施形態では、すべての投与の投薬量は、同じである。他の実施形態では、第１の投薬量は、１つまたは複数のその後の投薬量よりも大きな、例えば、その後の投薬量よりも少なくとも１０×大きな、少なくとも１００×大きな、または少なくとも１０００×大きな投薬量であり得る。第１の投薬量が１つまたは複数のその後の投薬量よりも大きい、別々の投与方法の一例では、すべてのその後の投薬量は、第１の投与と比べて同じ、より少ない量であり得る。
別々の投与は、２、３、４、５、または６回の投与を含む、２回以上の任意の回数の投与を含み得る。当業者は、治療方法をモニタリングするための当技術分野において公知の方法、および本明細書に提供される他のモニタリング方法により、１つまたは複数の追加的な投与を行うための投与回数または投与する望ましさを容易に決定することができる。したがって、本明細書に提供される方法は、対象に免疫刺激細菌の１回または複数回の投与を提供し、モニタリングの結果に基づき、１つまたは複数の追加的な投与を提供するかどうかを決める方法を含み、その際、投与回数は、対象をモニタリングすることによって決定することができる。１つまたは複数の追加的な投与を提供するかどうかを決めることは、腫瘍成長または腫瘍成長阻害の指標、新しい転移または転移の阻害の出現、対象の抗細菌抗体力価、対象の抗腫瘍抗体力価、対象の健康全般、および対象の体重を含むが、それに限定されるわけではない多様なモニタリング結果に基づき得る。
投与同士の間の期間は、多様な期間のいずれかであり得る。投与の間の期間は、投与回数、対象が免疫応答を開始する期間、対象が正常組織から細菌を浄化する期間、または腫瘍もしくは転移内の細菌のコロニー形成／増殖の期間に関して記載されるような、モニタリング工程を含む多様な要因のいずれかの関数であり得る。一例では、期間は、対象が免疫応答を開始する期間の関数である場合があり；例えば期間は、対象が免疫応答を開始する期間よりも長い、例えば、約１週間より長い、約１０日より長い、約２週間より長い、または約１カ月より長い場合がある。別の例では、期間は、対象が免疫応答を開始する期間より短い、例えば約１週間未満、約１０日未満、約２週間未満、または約１カ月未満の場合がある。別の例では、期間は、腫瘍または転移内の細菌のコロニー形成／増殖の期間の関数である場合があり；例えば期間は、検出可能なマーカーを発現している微生物の投与後、例えば約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１カ月後の腫瘍または転移内に検出可能なシグナルが生じる時間よりも長い場合がある。
本明細書に使用される方法はまた、本明細書に提供される免疫刺激細菌を含有する懸濁物および他の製剤などの組成物を投与することによって行うことができる。そのような組成物は、本明細書に提供される、または当業者に公知の、細菌および薬学的に許容される賦形剤または媒体を含有する。
上述のように、本明細書に提供される使用および方法はまた、免疫刺激細菌を対象に投与することに加えて、１つまたは複数の治療用化合物、例えば抗腫瘍化合物または他のがん治療薬を対象に投与することを含み得る。治療用化合物は、腫瘍治療効果のために独立して、または免疫刺激細菌とともに作用し得る。独立して作用し得る治療用化合物は、免疫刺激細菌が腫瘍内に蓄積する、腫瘍内で複製する、および対象において抗腫瘍免疫応答を引き起こすまたは増強する能力を低減せずに、腫瘍成長を阻害する、転移の成長および／もしくは形成を阻害する、腫瘍もしくは転移のサイズを減少させる、または腫瘍もしくは転移を無くすことができる多様な公知の化学療法化合物のいずれかを含む。そのような化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アンドロゲン薬、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗アドレナリン薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン［Ｆａｒｅｓｔｏｎ（登録商標）］を含む抗エストロゲン薬；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；アジリジン、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、およびウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルメラミン；葉酸補充剤（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えばフォリン酸；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；白金アナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えばアルギニンデアミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、および５－ＦＵ；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、およびそのアルブミネート型（すなわち、ｎａｂ－パクリタキセルおよびｎａｂ－ドセタキセル）；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばＲＦＳ－２０００；チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えばＴｏｍｕｄｅｘ（登録商標）；ならびにアセグラトンを含む追加的な化学療法剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デホスファミド；デメコルチン；ジアジクオン；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；エフロルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；およびトポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカンを含むが、それに限定されるわけではない。上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も使用することができる。
免疫刺激細菌とともに作用する治療用化合物は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、チェックポイント遺伝子（複数可）の発現を阻害、抑制、もしくは破壊するＲＮＡｉ分子、他の標的に対する１つもしくは複数のチェックポイント阻害剤抗体もしくはその断片、または細菌のコロニー形成／増殖をさらに増強することができる化合物などの、コードされている治療用産物の発現を増大させることによって細菌の免疫応答誘発特性を増大させる化合物を含む。例えば、遺伝子発現変更化合物は、プラスミド上にコードされている外因性遺伝子などの、細菌内で遺伝子の転写を誘導または増大させ、それにより、免疫応答を誘発することができる。ＩＰＴＧおよびＲＵ４８６を含む、遺伝子発現を変更することができる多種多様な化合物のいずれかは、当技術分野において公知である。発現をアップレギュレーションできる例示的な遺伝子は、毒素、プロドラッグを抗腫瘍薬物に変換することができる酵素、サイトカイン、転写調節タンパク質、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムを含む、タンパク質およびＲＮＡ分子をコードするものを含む。他の実施形態では、細菌のコロニー形成／増殖または免疫応答誘発特性を増大させる免疫刺激細菌とともに作用することができる治療用化合物は、細菌にコードされている遺伝子産物とともに相互作用することができる化合物であり、そのような相互作用は、腫瘍細胞の殺滅増大、または対象における抗腫瘍免疫応答の増大をもたらし得る。細菌によりコードされている遺伝子産物と相互作用することができる治療用化合物は、例えばその対象に投与された形態でほとんどまたは全く毒性も他の生物活性も有さないプロドラッグまたは他の化合物を含み得るが、細菌によりコードされている遺伝子産物と相互作用した後、化合物は、細胞傷害性、アポトーシスを誘導する能力、または免疫応答をトリガーする能力を含むが、それに限定されるわけではない、腫瘍細胞死をもたらす特性を発生することができる。ガンシクロビル、５－フルオロウラシル、６－メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン－ドキソルビシン、４－［（２－クロロエチル）（２－メスルオキシエチル（ｍｅｓｕｌｏｘｙｅｔｈｙｌ））アミノ］ベンゾイル－Ｌ－グルタミン酸、アセトアミノフェン、インドール－３－酢酸、ＣＢ１９５４、７－エチル－１０－［４－（１－ピペリジノ）－１－ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン、ビス－（２－クロロエチル）アミノ－４－ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、１－クロロメチル－５－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－ベンズ［ｅ］インドール、エピルビシン－グルクロニド、５’－デオキシ５－フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、およびリナマリンを含む、多様なプロドラッグ様物質が当技術分野において公知である。
４．モニタリング
本明細書に提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および／または対象に投与された免疫刺激細菌をモニタリングする１つまたは複数の工程をさらに含むことができる。腫瘍サイズをモニタリングすること、転移の存在および／またはサイズをモニタリングすること、対象のリンパ節をモニタリングすること、対象の体重または血液もしくは尿のマーカーを含む他の健康指標をモニタリングすること、抗細菌抗体の力価をモニタリングすること、検出可能な遺伝子産物の細菌発現をモニタリングすること、および対象の腫瘍、組織、または臓器中の細菌力価を直接モニタリングすることを含むが、それに限定されるわけではない、多様なモニタリング工程のいずれかが、本明細書に提供される方法に含まれ得る。
モニタリングの目的は、単に対象の健康状態、もしくは対象の治療的処置の進行を評価するための場合もあり、また、同じもしくは異なる免疫刺激細菌のさらなる投与が正当化されるかどうかを決定するため、または化合物が治療方法の有効性を増大させるように作用できる、もしくは化合物が対象に投与された細菌の病原性を減少させるように作用できる対象に、化合物をいつ投与すべきか、もしくは投与すべきかどうかを決定するための場合もある。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、細菌により発現される１つまたは複数の遺伝子をモニタリングすることを含み得る。本明細書に提供されるもの、または当技術分野において別途公知のものなどの細菌は、検出可能なタンパク質を含むが、それに限定されるわけではない１つまたは複数の検出可能な遺伝子産物を発現することができる。
本明細書に提供されるように、細菌において発現される検出可能な遺伝子産物の測定は、対象に存在する細菌のレベルの正確な決定を提供することができる。本明細書にさらに提供されるように、検出可能な遺伝子産物の、例えば、断層撮影法を含むイメージング法による位置の測定は、対象における細菌の位置を決定することができる。したがって、検出可能な細菌遺伝子産物をモニタリングすることを含む、本明細書に提供される方法を使用して、対象の１つもしくは複数の臓器内もしくは組織内の細菌の存在もしくは非存在、および／または対象の腫瘍内もしくは転移内の細菌の存在もしくは非存在を決定することができる。さらに、検出可能な細菌遺伝子産物をモニタリングすることを含む本明細書に提供される方法を使用して、１つまたは複数の臓器、組織、腫瘍、または転移に存在する細菌の力価を決定することができる。対象における細菌の位置および／または力価をモニタリングすることを含む方法は、正常組織および臓器の細菌感染、特に感染レベルが、細菌の病原性を指し示すことができるので、細菌の病原性を決定するために使用することができる。対象における免疫刺激細菌の位置および／または力価をモニタリングすることを含む方法は、複数の時点で行うことができ、したがって、対象の１つまたは複数の臓器内または組織内の細菌複製速度を含む、対象における細菌の複製速度を決定することができ；したがって、細菌遺伝子産物をモニタリングすることを含む方法は、細菌の複製適格性を決定するために使用することができる。本明細書に提供される方法を使用して、多様な臓器または組織、および腫瘍内または転移内に存在する免疫刺激細菌の量を定量することもでき、したがって、対象における細菌の優先的蓄積の程度を指し示すことができる；したがって、細菌遺伝子産物のモニタリングは、細菌が、正常な組織内または臓器内よりも腫瘍内または転移内に蓄積する能力を決定する方法に使用することができる。本明細書に提供される方法に使用される免疫刺激細菌は腫瘍全体に蓄積することができるか、または腫瘍内の複数の部位に蓄積することができ、転移内にも蓄積することができるので、細菌遺伝子産物をモニタリングするための本明細書に提供される方法を使用して、対象に存在する腫瘍のサイズまたは転移の数を決定することができる。腫瘍内または転移内の細菌遺伝子産物のそのような存在を一連の時間にわたりモニタリングすることを用いて、腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生、または転移の消失を含む、腫瘍または転移における変化を評価することができ、それを使用して、腫瘍の成長もしくは縮小の速度、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度、または腫瘍の成長もしくは縮小の速度変化、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度変化を決定することもできる。したがって、細菌遺伝子産物をモニタリングすることは、腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度、あるいは腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度変化を決定することによって、対象における新生物性疾患をモニタリングするために、または新生物性疾患の処置の有効性を決定するために使用することができる。
多様な検出可能タンパク質のいずれかは、モニタリングによって検出することができ、その例は、多様な蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）のいずれか、多様なルシフェラーゼ、トランスフェリン、もしくは他の鉄結合タンパク質のいずれか；または受容体、結合性タンパク質、および抗体であり、その際、受容体、結合性タンパク質または抗体と特異的に結合する化合物は、検出可能な薬剤の場合も、また、検出可能な物質（例えば、放射性核種またはイメージング剤）でラベルされている場合もある。
腫瘍および／または転移のサイズは、外部評価法、または断層撮影もしくは磁気イメージング法を含む、当技術分野において公知の多様な方法のいずれかによってモニタリングすることができる。当技術分野において公知の方法に加えて、本明細書に提供される方法、例えば、細菌遺伝子発現のモニタリングは、腫瘍および／または転移のサイズをモニタリングするために使用することができる。
いくつかの時点にわたりサイズをモニタリングすることは、腫瘍または転移のサイズにおける増大または減少に関する情報を提供することができ、対象における追加的な腫瘍および／または転移の存在に関する情報も提供することができる。いくつかの時点にわたり腫瘍サイズをモニタリングすることは、対象における新生物性疾患の処置の有効性を含む、対象における新生物性疾患の発生に関する情報を提供することができる。
本明細書に提供される方法はまた、対象への免疫刺激細菌の投与に応答して産生される抗体を含む、対象における抗体力価をモニタリングすることを含み得る。本明細書に提供される方法において投与される細菌は、内因性細菌抗原の免疫応答を誘発することができる。本明細書に提供される方法において投与される細菌はまた、細菌によって発現される外因性遺伝子に対する免疫応答を誘発することができる。本明細書に提供される方法において投与される細菌はまた、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発することができる。細菌抗原、細菌により発現される外因性遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体の力価をモニタリングすることを使用して、細菌の毒性をモニタリングする、処置方法の有効性をモニタリングする、または産生および／もしくは回収のための遺伝子産物（複数可）もしくは抗体のレベルをモニタリングすることができる。
抗体力価のモニタリングを使用して、細菌の毒性をモニタリングすることができる。細菌に対する抗体力価は、対象への細菌の投与後の期間にわたり変動する場合があり、その際、いくつかの特定の時点で、低い抗（細菌抗原）抗体力価は、より低い毒性を指し示すことができるのに対し、他の時点で、高い抗（細菌抗原）抗体力価は、より高い毒性を指し示すことができる。本明細書に提供される方法に使用される細菌は、免疫原性であり得、したがって、対象に細菌を投与した後すぐに免疫応答を誘発することができる。一般的に、対象の免疫系が強い免疫応答を開始することができる免疫刺激細菌は、対象の免疫系がすべての正常な臓器または組織から細菌を排除することができる場合に低い毒性を有する細菌であり得る。したがって、一部の実施形態では、対象に細菌を投与した後すぐの、細菌抗原に対する高い抗体力価は、細菌の低い毒性を指し示し得る。
他の実施形態では、抗体力価をモニタリングすることを使用して、処置方法の有効性をモニタリングすることができる。本明細書に提供される方法では、抗（腫瘍抗原）抗体力価などの抗体力価は、治療方法、例えば、新生物性疾患を処置するための治療方法の有効性を指し示すことができる。本明細書に提供される治療方法は、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすまたは増強することを含み得る。したがって、抗（腫瘍抗原）抗体力価をモニタリングすることによって、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすかまたは増強することへの治療方法の有効性をモニタリングすることが可能である。
他の実施形態では、抗体力価をモニタリングすることは、産生および／または回収のために遺伝子産物（複数可）または抗体のレベルをモニタリングするために使用され得る。本明細書に提供されるように、方法は、腫瘍内、腫瘍微小環境内、および／または腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積している微生物内で外因性遺伝子を発現することによって、タンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物を産生するために使用することができる。タンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物に対する抗体力価をモニタリングすることは、腫瘍蓄積微生物によるタンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物の産生レベルを指し示すことができ、また、そのようなタンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物に特異的な抗体のレベルを直接指し示すこともできる。
本明細書に提供される方法はまた、対象の健康をモニタリングする方法を含み得る。本明細書に提供される方法の一部は、新生物性疾患治療方法を含む治療方法である。対象の健康をモニタリングすることを使用して、当技術分野において公知のように、治療方法の有効性を決定することができる。本明細書に提供される方法はまた、本明細書に提供される免疫刺激細菌を対象に投与する工程を含み得る。対象の健康をモニタリングすることを使用して、対象に投与される免疫刺激細菌の病原性を決定することができる。疾患、例えば新生物性疾患、感染性疾患、または免疫関連疾患をモニタリングするための多様な健康診断方法のいずれかを、当技術分野において公知のようにモニタリングすることができる。例えば、対象の体重、血圧、脈拍、呼吸、色、温度、または他の観察可能な状態は、対象の健康を指し示すことができる。加えて、対象からの試料中の１つまたは複数の成分の存在、または非存在、またはレベルは、対象の健康を指し示すことができる。典型的な試料は、血液および尿試料を含む場合があり、その際、１つまたは複数の成分の存在、または非存在、またはレベルは、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断検査を行うことによって決定することができる。対象の健康を指し示す例示的な成分は、白血球数、ヘマトクリット、およびｃ反応性タンパク質濃度を含むが、それに限定されるわけではない。
本明細書に提供される方法は、治療法をモニタリングすることを含む場合があり、その際、治療的判断は、モニタリングの結果に基づき得る。本明細書に提供される治療方法は、対象に免疫刺激細菌を投与することを含む場合があり、その際、細菌は、腫瘍内、腫瘍微小環境内、もしくは腫瘍常在性免疫細胞内、および／または転移内に優先的に蓄積する場合があり、その際、細菌は、抗腫瘍免疫応答を引き起こすまたは増強することができる。そのような治療方法は、特定の免疫刺激細菌の複数回投与、第２の免疫刺激細菌の投与、または治療用化合物の投与を含む多様な工程を含み得る。対象に投与するための免疫刺激細菌または化合物の量、タイミング、または型の決定は、対象をモニタリングすることからの１つまたは複数の結果に基づき得る。例えば、対象における抗体力価を使用して、免疫刺激細菌および適宜、化合物を投与することが望ましいかどうか、投与すべき細菌および／または化合物の量、ならびに投与すべき細菌および／または化合物の型を決定することができ、その際、例えば低い抗体力価は、追加的な免疫刺激細菌、異なる免疫刺激細菌、および／または治療用化合物、例えば細菌の遺伝子発現を誘導する化合物、もしくは免疫刺激細菌に依存せずに有効な治療用化合物を投与する望ましさを指し示すことができる。
別の例では、対象の全体的な健康状態を使用して、免疫刺激細菌および適宜、化合物を投与することが望ましいかどうか、投与すべき細菌および／または化合物の量、ならびに投与すべき細菌および／または化合物の型を決定することができ、その際、例えば、対象が健康であることを決定することは、追加的な細菌、異なる細菌、または治療用化合物、例えば細菌遺伝子／遺伝的ペイロード／治療用産物の発現を誘導する化合物を投与する望ましさを指し示すことができる。別の例では、細菌により発現される検出可能な遺伝子産物をモニタリングすることを使用して、免疫刺激細菌および適宜、化合物を投与することが望ましいかどうか、投与すべき細菌および／または化合物の量、ならびに投与すべき細菌および／または化合物の型を決定することができ、その際、例えば、対象が健康であることを決定することは、追加的な細菌、異なる細菌、または治療用化合物、例えば細菌遺伝子／遺伝的ペイロード／治療用産物の発現を誘導する化合物を投与する望ましさを指し示すことができる。そのようなモニタリング方法を使用して、治療方法が有効かどうか、治療方法が対象に病原性かどうか、細菌が腫瘍または転移内に蓄積したかどうか、および細菌が正常な組織または臓器内に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような決定に基づき、さらなる治療方法の望ましさおよび形態を導出することができる。
別の例では、モニタリングは、免疫刺激細菌が対象の腫瘍または転移内に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような決定の際に、追加的な細菌、異なる免疫刺激細菌、および適宜、化合物を対象にさらに投与するために決定を行うことができる。
Ｊ．実施例
以下の実施例は説明の目的のためのみに含まれており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
［実施例１］
ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の栄養要求性株
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株ＹＳ１６４６はアデノシンに対して栄養要求性である
本明細書で提供する株はアデノシンに対して栄養要求性になるように操作されている。結果として、これらの株は正常組織の低いアデノシン濃度では複製することができないので、インビボで弱毒化し、コロニー形成は主としてアデノシンレベルが高い固形腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中で起こる。サルモネラ株ＹＳ１６４６は野生型株ＡＴＣＣ １４０２８の誘導体であり、ｐｕｒＩ遺伝子（ｐｕｒＭと同義）の破壊によってプリンに対して栄養要求性になるように操作されている（例えばLow et al. (2004) Methods Mol. Med. 90:47-60を参照）。ＹＳ１６４６の全ゲノムの引き続く解析によって、ｐｕｒＩ遺伝子は事実上欠失していないが、その代わりに染色体の逆転によって破壊されており（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnol. 192:177-178を参照）、全遺伝子は、挿入配列に隣接するＹＳ１６４６染色体の２つの部分（その１つが活性トランスポサーゼを有している）の中に依然として含まれていることが実証された。染色体のリエンゲージメントによって破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子への復帰の可能性を未解決のままにしている。ＹＳ１６４６のプリン栄養要求性はインビトロで１４０を超える連続継代の後でも安定であることが既に実証されているが、復帰速度は明らかでない（例えばClairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。
株ＹＳ１６４６はアデノシンが提供されれば最小培地中で複製することができる一方、野生型の親株ＡＴＣＣ １４０２８はアデノシンが添加されていない最小培地中で増殖することができることが、本明細書で示されている。株ＹＳ１６４６を溶原性ブロス（ＬＢ）培地中で一夜増殖させ、Ｍ９最小培地で洗浄し、アデノシンを含まないかまたは増大するアデノシンの濃度を含むＭ９最小培地中に希釈した。増殖は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、３７℃で１５分ごとにＯＤ６００を読み取ることによって測定した。
結果は、すべてのアデノシンの濃度で増殖することができた野生型株（ＡＴＣＣ １４０２８）とは異なり、株ＹＳ１６４６のみはアデノシンが１１～３００マイクロモルの範囲の濃度で提供された場合に複製することができ、Ｍ９単独または１３０ナノモルのアデノシンが添加されたＭ９中では完全に複製不能であることを示した。これらのデータは、ｐｕｒＩ突然変異体(mutant)は腫瘍の微小環境中で見出されるアデノシンの濃度で複製することができるが、正常組織中で見出される濃度では複製できないことを実証している。本明細書で例示した操作されたアデノシン栄養要求性株には、ｐｕｒＩオープンリーディングフレームの全部または一部が染色体から欠失して野生型への復帰を防止する株が含まれる。そのような遺伝子欠失は、以下に記載するラムダレッドシステムを含む当業者には既知の任意の方法によって達成することができる。
サルモネラ株ＹＳ１６４６はＡＴＰに対して栄養要求性である
プリンおよびアデノシンに対する栄養要求性に加えて、ｐｕｒＩ欠失株がＡＴＰも捕捉することができるか否かを判定した。ＡＴＰは死滅する腫瘍細胞からの漏れによって腫瘍微小環境中に高いレベルで集積する。株ＹＳ１６４６はＡＴＰが提供されれば最小培地中で複製することができるが、ＡＴＰが添加されなければ増殖することができないことが本明細書において示される。これを実証するため、株ＹＳ１６４６をＬＢ培地中で一夜増殖させ、Ｍ９最小培地で洗浄し、ＡＴＰを含まないかまたは増大する濃度のＡＴＰ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＭ９最小培地中に希釈した。増殖は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、３７℃で１５分ごとにＯＤ６００を読み取って測定した。結果は、株ＹＳ１６４６はＡＴＰが０．０１２ｍＭの濃度で提供されれば複製することができるが、Ｍ９単独では複製することができないことを実証した。
［実施例２］
細胞内複製の欠陥はｍｓｂＢ突然変異(mutation)に帰せられる
ＹＳ１６４６株は、複製を高濃度のプリン、アデノシン、またはＡＴＰを含む部位に限定するｐｕｒＩにおける突然変異、およびＴＬＲ４媒介炎症促進性シグナル伝達を低減するようにリポ多糖（ＬＰＳ）表面コートを変化させるｍｓｂＢにおける突然変異を含む。野生型サルモネラとは異なり、株ＹＳ１６４６はマクロファージ中では複製できないことも確立されている。これらの遺伝的突然変異のいずれが野生型株ＡＴＣＣ １４０２８の中にその表現型を与えるために関与しているかを決定するための実験を実施した。
このアッセイでは、マウスＲＡＷマクロファージ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）を、ｐｕｒＩ、ｍｓｂＢ、またはその両方の欠失を含む野生型サルモネラ株に、細胞あたり約５細菌の感染多重度（ＭＯＩ）で３０分、感染させ、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞外細菌を死滅させるためにゲンタマイシンを含む培地を加えた。ゲンタマイシンは細胞膜を通過できないので、細胞内細菌はゲンタマイシンによって死滅しない。感染後の種々の時点で細胞の単層を水による浸透圧ショックによって溶解し、細胞溶解物を希釈し、ＬＢ寒天上に播種して生存するコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。
下表に示すように、ｐｕｒＩ－突然変異のみを含む野生型サルモネラ株は、それでも複製することができた。これは、腫瘍微小環境に対する高度の特異性を達成しながら、ｐｕｒＩ欠失単独で忍容性の中程度の改善しか観察されなかった理由を説明している。ｍｓｂＢ－突然変異のみを含む株、ならびにｐｕｒＩ－およびｍｓｂＢ－突然変異を含む株は複製することができず、４８時間以内に細胞から急速に消失した。

［実施例３］
サルモネラａｓｄ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
株ＹＳ１６４６Δａｓｄを調製した。これは、ａｓｄ遺伝子の欠失を有するように操作された株ＹＳ１６４６（これはＡＴＣＣから購入可能、カタログ＃２０２１６５）から誘導された弱毒化ネズミチフス菌株である。この実施例では、ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６Δａｓｄを、以下に記載するようにDatsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］の方法の改変を使用して操作した。
株ＹＳ１６４６へのラムダレッドヘルパープラスミドの導入
ＹＳ１６４６株は、ＬＢ中で培養物を増殖させて１００倍に濃縮し、次いで氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄することによって、以前に記載された（Sambrook J. (1998) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)のように、エレクトロコンピテントになるように調製した。エレクトロコンピテントな株を、以下の設定、すなわち２．５ｋＶ、１８６オーム、および５０μＦで、０．２ｃｍの間隙のキュベットを使用して、ラムダレッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６（配列番号２１８）とともに電気穿孔した。ｐＫＤ４６を有するトランスフォーマントを、アンピシリンおよび１ｍＭのＬ－アラビノースを含む５ｍＬのＳＯＣ培地中、３０℃で増殖させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。次いで株ＹＳ１６４６について上に記載したように、ラムダレッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６を含むＹＳ１６４６クローンをエレクトロコンピテントにした。
ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットの構築
ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットを設計するために、株ＹＳ１６４６のゲノム由来のａｓｄ遺伝子(Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178)を使用した。ａｓｄ遺伝子の左手領域および右手領域にそれぞれ相同の２０４および２０３塩基対（ｂｐ）を含むプラスミドを、ＤＨ５－アルファコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングした。次いでａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットを、プライマーａｓｄ－１およびａｓｄ－２（表１を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製した。
ａｓｄ遺伝子の欠失
プラスミドｐＫＤ４６を有するＹＳ１６４６株を、ゲル精製した線状ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットとともに電気穿孔した。電気穿孔した細胞をＳＯＣ培地中に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天プレート上に播種した。この工程の間に、ラムダレッドリコンビナーゼが染色体ａｓｄ遺伝子のｋａｎカセットによる相同組換え（染色体ａｓｄ遺伝子の上流および下流の相同隣接配列の存在による）を誘起し、ａｓｄ遺伝子の染色体コピーのノックアウトが起こる。選択されたカナマイシン耐性クローン中の破壊されたａｓｄ遺伝子の存在を、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム由来のプライマー（プライマーａｓｄ－３）およびマルチクローニング部位由来のプライマー（プライマーｓｃＦｖ－３）（表１を参照）を用いるＰＣＲ増幅によって確認した。ＤＡＰの栄養要求性を実証するため、ＤＡＰの添加ありと添加なしとで、コロニーもＬＢプレート上に複製播種した。ａｓｄ遺伝子が欠失したすべてのクローンはＤＡＰの添加なしでは増殖できず、ＤＡＰに対する栄養要求性が実証された。
カナマイシン遺伝子カセットの除去
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えシステムを使用することによって、ｋａｎ選択可能なマーカーを除去した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ遺伝子ＫａｎＲ突然変異体を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドであるｐＪＷ１６８（配列番号２２４）によって形質転換した。ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した。続いて４２℃における増殖によってｐＪＷ１６８を無くした。選択したクローンを、カナマイシンありおよびなしのＬＢ寒天プレートに複製播種することによって、ｋａｎの喪失について試験し、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム由来のプライマー（プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４、プライマー配列については表１を参照）を使用するＰＣＲ検証によって確認した。
機能性ａｓｄ欠失突然変異体株ＹＳ１６４６Δａｓｄ（ＡＳＴ－１０１とも命名）の確認
Δａｓｄ突然変異体はＬＢ寒天プレート上、３７℃では増殖できなかったが、５０μｇ／ｍＬのジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含むＬＢプレート上では増殖できた。Δａｓｄ突然変異体の増殖速度をＬＢ液体培地中で評価した。これは液体ＬＢ中では増殖できなかったが、６００ｎＭにおける吸光度の測定によって判定されたように、５０μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加したＬＢ中では増殖することができた。
ａｓｄ遺伝子欠失後の株ＹＳ１６４６Δａｓｄにおけるａｓｄ遺伝子座配列の配列確認
ａｓｄ遺伝子欠失株を、プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４（表１を参照）を使用するＤＮＡ配列決定によって検証した。ａｓｄ遺伝子座に隣接する領域のシーケンシングを実施し、ａｓｄ遺伝子がＹＳ１６４６染色体から欠失していることが配列より確認された。
プラスミドからのａｓｄの発現によるａｓｄ欠失の相補性
プラスミドｐＡＴＩＵ６（配列番号２２５）を化学合成し、組み立てた。プラスミドは下記の特徴を有していた。複製の起点の高いコピー（ｐＵＣ１９）、短いヘアピンの発現を推進するためのＵ６プロモーター、引き続いて除去されるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に隣接するアンピシリン耐性遺伝子、および開始コドンの上流の８５塩基対の配列を含むａｓｄ遺伝子（配列番号２４６）。このベクターの中に、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによる制限酵素消化、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５－アルファ細胞へのライゲーションおよびクローニングによって、マウスＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを導入した。得られたプラスミドをｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１と命名した。
免疫刺激細菌株へのプラスミドの電気穿孔
免疫刺激タンパク質および機能性ａｓｄ遺伝子をコードする発現カセットを含む選択されたプラスミドを、ＢＴＸ（登録商標）ＥＣＭ６００エレクトロポレーターにより、０．２ｃｍギャップのキュベットを使用し（ＢＴＸ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、以下の設定、すなわち２．５ｋＶ、１８６オーム、および５０μＦで、ａｓｄ遺伝子を失っているネズミチフス菌株に電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、５０μＭのジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を添加した１ｍＬのＳＯＣに加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＤＡＰを含まない寒天プレートに散布して、機能性ａｓｄ遺伝子を有するプラスミドを受容した株を選択した。単一コロニーを単離した後、無菌の溶原性ブロス（ＬＢ）のフラスコにネズミチフス菌の単一ウェルの単離されたコロニーを接種し、２５０ＲＰＭで撹拌しながら３７℃でインキュベートすることによって、細胞バンクを産生した。培養物が定常相にまで増殖した後、１０％のグリセロールを含むＰＢＳで細菌を洗浄し、－６０℃未満で凍結したアリコートで保存した。
プラスミドｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１を大腸菌中で増幅し、電気穿孔によってＹＳ１６４６Δａｓｄ株への形質転換およびＬＢ Ａｍｐプレート上でのクローン選択のために精製して、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１を産生した。ｐＡＴＩＵ６由来のプラスミドを補完したＹＳ１６４６Δａｓｄ突然変異体は、ＤＡＰの不在下のＬＢ寒天上および液体培地中で増殖することができた。
引き続く反復実験で、ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１由来のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。これはｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いてゲル精製によってＡｍｐＲ遺伝子を除去することによって達成された。カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子は、プライマーＡＰＲ－００１およびＡＰＲ－００２（それぞれ配列番号２２６および配列番号２２７）を使用するＰＣＲおよびそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる消化、およびゲル精製し消化したｐＡＴＩＵ６プラスミドへのライゲーションによって増幅した。
引き続く反復実験で、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ)ならびにプライマーＡＰＲ－００３（配列番号２２８）およびＡＰＲ－００４（配列番号２２９)を使用して、ｐＵＣ１９複製の起点でｐＡＴＩＫａｎプラスミドに単一点変異を導入して、１４８位のヌクレオチドＴをＣに変更した。この突然変異によって、複製の起点が複製の起点のコピー数が少ないｐＢＲ３２２の複製の起点と相同になり、プラスミドのコピー数が減少する。
ａｓｄ補完システムを使用してインビボで実証されたプラスミドの維持
本実施例では、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスを、ＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを発現するプラスミドを含む株ＹＳ１６４６（ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１）、または機能性ａｓｄ遺伝子およびＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを含むプラスミドを含むＹＳ１６４６のａｓｄ欠損株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１）で処置した。
ＣＴ２６（結腸腫瘍＃２６）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＮ－ニトロ－Ｎ－メチルウレタン（ＮＭＵ）に曝露することに起源する腫瘍モデルであり、侵襲性で未分化かつチェックポイント難治性のヒト結腸直腸癌を反復する転移性の高い癌腫をもたらす（例えばCastle et al. (2014) BMC Genomics 15(1):190を参照）。側腹部の皮下に移植した場合には、結腸における同所性移植とは対照的に、腫瘍の免疫表現型ははるかに免疫抑制性かつチェックポイント難治性である。腫瘍は主としてＴ細胞の浸潤を失っている一方、骨髄性細胞、例えばマクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に富んでいる（例えばZhao et al. (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787参照）。このモデルはヒトのマイクロサテライトステーブル（ＭＳＳ）結腸直腸がんによく類似しているので、これは本明細書で提供する治療用アプローチを評価するための理想的なモデルである。
この実験のため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス３匹）の右側腹部皮下（ＳＣ）にＣＴ２６（ＡＴＣＣより購入）腫瘍細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）。８日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、３用量の５×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株、または親ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１株を、８日目、１５日目、および２３日目に静脈内（ＩＶ）注射した。プラスミドは例示的な治療用製剤としてｓｈＴＲＥＸ１をコードしており、他の任意の所望の治療用製剤を置換してもよい。
体重および腫瘍は週に２回測定した。腫瘍測定は電子キャリパー（Ｆｏｗｌｅｒ、Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用して実施した。腫瘍体積は改変した楕円公式［１／２（長さ×幅２）］を使用して計算した。マウスは腫瘍サイズが体重の２０％を超えたときまたは壊死を生じたときにＩＡＣＵＣの規制に従って安楽死させた。
最後のサルモネラ注射の１２日後に腫瘍をホモジナイズし、ホモジネートを段階希釈して、存在するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を計数するためにＬＢ寒天プレートに、またはカナマイシン耐性コロニーの数を計数するためにカナマイシン含有ＬＢプレートに、播種した。
結果は、ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１がｓｈＲＮＡプラスミドを維持する選択圧を有していなかったことを実証し、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）コロニーのパーセントが１０％未満であったことから、プラスミドの顕著な喪失を実証した。プラスミドの維持のためにａｓｄ遺伝子補完システムを用いた株、すなわちＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１は、ほぼ同一の数のカナマイシン耐性およびカナマイシン感受性のＣＦＵを有していた。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子補完システムが、マウスの腫瘍微小環境に関連するプラスミドを維持するために十分であることを実証している。
ａｓｄ補完システムを使用する抗腫瘍有効性の増強
ａｓｄ補完システムは、プラスミドの喪失を防止し、インビボにおけるネズミチフス菌株による治療用製剤のデリバリーの抗腫瘍有効性を増強するために設計されている。これを試験するため、ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１）、または機能性ａｓｄ遺伝子カセットを含むスクランブル対照（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ）のマウス結腸癌モデルにおける抗腫瘍有効性を、ａｓｄ遺伝子カセットを失っており、したがってプラスミド維持の機構を有しないプラスミドであるプラスミドｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１を含む株ＹＳ１６４６（ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１）と比較した。ｓｈＴＲＥＸ１は、例示的な治療用製剤である。
この実験のため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス８匹）の右側腹部のＳＣにＣＴ２６細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１、またはＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１を、８日目および１８日目に２回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１株は、経時的にプラスミドの喪失を示したにも関わらず、ＰＢＳと比較して増強された腫瘍制御を示した［２８日目における腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）７０％］。ａｓｄ遺伝子補完システムおよびｓｈＴＲＥＸ１を有するプラスミドを含むΔａｓｄ株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１）は、ＰＢＳと比較して優れた腫瘍成長阻害を示した（ＴＧＩ ８２％、ｐ＝０．００２、２５日目）。これらのデータは、ａｓｄ補完システムを使用してプラスミドの喪失を防止することおよびｓｈＴＲＥＸ１のデリバリーによって、ａｓｄ補完遺伝子システムのないプラスミドを含むＹＳ１６４６と比較して改善された能力が達成されることを実証している。すなわち、ａｓｄ補完システムを有する株は優れた抗がん治療薬である。
［実施例４］
ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子の欠失によるネズミチフス菌のフラゲリンノックアウト
株の操作および特徴解析
本明細書の実施例では、両方のフラゲリンサブユニットを除去するため、ａｓｄ遺伝子欠失を含む生存弱毒化ネズミチフス菌ＹＳ１６４６株をさらに操作してｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子を欠失させた。これにより、炎症促進性ＴＬＲ５活性化が無くなり、炎症促進性シグナル伝達が低減されて抗腫瘍適応免疫が改善される。
ｆｌｉＣ遺伝子の欠失
本実施例では、前の実施例で詳細に記載したように、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ株の染色体からｆｌｉＣを欠失させた。簡単に述べると、ｆｌｉＣ遺伝子に隣接する相同配列の２２４塩基および２４５塩基を含む合成ｆｌｉＣ遺伝子相同性アーム配列を、ｐＳＬ０１４７と呼ばれるプラスミド（配列番号２３０）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１４７にクローニングし、ｆｌｉＣ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｆｌｉｃ－１（配列番号２３２）およびｆｌｉｃ－２（配列番号２３３）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、次いで温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔した細胞をＳＯＣ＋ＤＡＰ培地中に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天プレートに播種した。コロニーを選択し、プライマーｆｌｉｃ－３（配列番号２３４）およびｆｌｉｃ－４（配列番号２３５）を使用するＰＣＲによって、ノックアウト断片の挿入についてスクリーニングした。次いで選択されたカナマイシン耐性株を４２℃で培養し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングすることによって、ｐＫＤ４６をキュアした。次いでＣｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド（ｐＪＷ１６８）の電気穿孔によってカナマイシン耐性マーカーをキュアし、ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した。続いて培養物を４２℃で増殖させることによってｐＪＷ１６８を排除した。次いで破壊部位に隣接するプライマー（ｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４）を使用するＰＣＲによるカナマイシンマーカーの喪失およびアガロースゲル上の電気泳動による運動性の評価について、選択されたｆｌｉＣノックアウトクローンを試験した。
ｆｌｊＢ遺伝子の欠失
次いで上記の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ株からｆｌｊＢ遺伝子を欠失させた。ｆｌｊＢ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２４９塩基および２１３塩基を含む合成ｆｌｊＢ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０１４８と呼ばれるプラスミド（配列番号２３１）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１４８にクローニングし、ｆｌｊＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｆｌｊｂ－１（配列番号２３６）およびｆｌｊｂ－２（配列番号２３７）（表１を参照）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製して、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容温度での増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。それぞれプライマーｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４、またはｆｌｊｂ－３（配列番号２３８）およびｆｌｊｂ－４（配列番号２３９）を使用するＰＣＲによってｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子ノックアウト配列を増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。株ＹＳ１６４６のこの突然変異誘導体を、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢ、または短縮してＹＳ１６４６／Δａｓｄ／ΔＦＬＧと命名した。
操作されたネズミチフス菌のフラゲリンノックアウト株のインビトロ特徴解析
本明細書でＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧと称する、ｆｌｉＣとｆｌｊＢとの両方の欠失を有するＹＳ１６４６由来ａｓｄ－突然変異体を、１０マイクロリッターの一夜培養物をスイミンブプレート（０．３％の寒天および５０ｍｇ／ｍＬのＤＡＰを含むＬＢ）にスポットすることによって、遊泳運動性について評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ株については運動性が観察された一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株については、運動性は明らかでなかった。次いでＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ａｓｄ遺伝子を含むプラスミドとともに電気穿孔し、ＤＡＰの不在下におけるその増殖速度を評価した。ａｓｄを補完したプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は、添加のＤＡＰが存在しないＬＢ中で複製することができ、ａｓｄを補完したプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ株と同程度の速度で増殖した。これらのデータは、フラゲリンの排除はインビトロにおけるネズミチフス菌の適合性を低下させないことを実証している。
鞭毛の排除はマウスマクロファージにおけるピロトーシスを低下させる
５×１０５個のマウスＲＡＷマクロファージ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）を、いずれもａｓｄ補完プラスミドを有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ株に、ゲンタマイシン保護アッセイにおいてほぼ１００のＭＯＩで感染させた。感染の２４時間後に培養上清を収集し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ．）を使用して、マクロファージ細胞の死のマーカーとしてのラクテート脱水素酵素の放出について評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ株は７５％の最大ＬＤＨ放出を誘起した一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は５４％の最大ＬＤＨ放出を誘起し、フラゲリン遺伝子の欠失が感染したマクロファージのネズミチフス菌誘起ピロトーシスを低減することが実証された。
鞭毛を欠失した突然変異体は感染したヒト単球におけるピロトーシスの低減を導く
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株ではマクロファージにおける細胞死を惹起する能力が低減していることを実証するため、ＴＨＰ－１ヒトマクロファージ細胞（ＡＴＣＣカタログ＃２０２１６５）を、ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６およびプラスミドの維持を保証する機能性ａｓｄ遺伝子をコードするプラスミドを含むΔａｓｄ株を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧに感染させた。ＤＭＥＭおよび１０％のＦＢＳを含む９６ウェルのディッシュに、５×１０４個の細胞を入れた。細胞をネズミチフス菌の洗浄したログ相の培養物に細胞あたり１００ＣＦＵのＭＯＩで１時間、感染させ、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞外細菌を死滅させるための５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび単球をマクロファージ表現型に転換するための５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγを含む培地に培地を交換した。２４時間後、ＴＨＰ－１細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて染色し、発光を定量するためのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ＭＲプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する発光細胞生存アッセイを使用して、生存細胞のパーセンテージを決定した。ＹＳ１６４６株を感染させた細胞はわずか３８％の生存率しかなかった一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を感染させた細胞は５１％の生存率を有し、フラゲリン遺伝子の欠失が、極めて高く超生理学的なＭＯＩにも関わらず、ヒトマクロファージの細胞死をあまり誘起しないことが示された。
全身投与の後の腫瘍のコロニー形成に鞭毛は必要でない
結腸癌のマウスモデルにおいて投与されたフラゲリンノックアウト株の影響を評価するため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＣＴ２６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を接種した。１０日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、単一用量の３×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株をＩＶ注射した。腫瘍移植後３５日目にマウスを安楽死させ、腫瘍をホモジナイズしてＬＢプレートに播種し、腫瘍組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計数した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株は、腫瘍組織１ｇあたり平均５．９×１０７ＣＦＵで腫瘍にコロニー形成した一方、鞭毛を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株は平均１．１×１０８ＣＦＵ／ｇ腫瘍組織とほぼ２倍に増加した腫瘍にコロニー形成した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株の脾臓コロニー形成は平均１．５×１０３ＣＦＵ／ｇ脾臓組織と計算された一方、鞭毛を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株の脾臓コロニー形成は平均１．２×１０３ＣＦＵ／ｇ脾臓組織とやや低かった。
これらのデータは、鞭毛が存在しないことはＩＶ投与後の腫瘍のコロニー形成に負に影響しないだけでなく、鞭毛が無傷の株と比較して腫瘍のコロニー形成を増強することを実証している。重要なことに、鞭毛の欠失は脾臓のコロニー形成をわずかに低減させ、腫瘍と脾臓の比を１０万倍にする。これらのデータは、当技術からの予想と異なり、鞭毛は腫瘍のコロニー形成に必要でないだけでなく、それを無くすことによって脾臓のコロニー形成を低減しつつ腫瘍のコロニー形成を増強することを実証している。
鞭毛を欠失した株はマウスにおいて抗腫瘍活性の増強を示す
結腸癌のマウスモデルにおいて投与されたフラゲリンノックアウト株の影響を評価するため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＣＴ２６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、単一用量の３×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、またはＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。マウスはキャリパー測定によって腫瘍成長についてモニターした。
結果は、鞭毛を作ることができないＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株が親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株と比較して増強された腫瘍制御（ＴＧＩ ２７％、２４日目）およびＰＢＳ対照と比較して有意な腫瘍制御（ＴＧＩ ７３％、ｐ＝０．０４、２４日目）を示したことを実証した。これらのデータは、鞭毛が腫瘍のコロニー形成に必要でないだけでなく、その喪失が抗腫瘍有効性を増強し得ることを実証している。
鞭毛を欠失した株はマウス腫瘍モデルにおいて適応免疫の増強を示す
免疫応答に対するフラゲリン欠失の影響、およびｓｈＲＮＡの腫瘍骨髄性細胞デリバリーからＳＴＩＮＧチェックポイント遺伝子ＴＲＥＸ１へのＳＴＩＮＧ活性化が適応性I型ＩＦＮ免疫シグネチャーを促進するかを評価した。結腸癌のＣＴ２６マウスモデルを用い、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＣＴ２６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、腫瘍移植の１１日後に５×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株、またはスクランブルしたプラスミド対照株であるＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲをＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
投薬の７日後にヘパリンナトリウムをコートした管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にマウスから採血した。次いで凝固していない血液を同体積のＰＢＳで希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｍ細胞分離試薬（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を使用して全血の相間層から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。単離したＰＢＭＣを、１３００ＲＰＭ、室温で３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで洗浄し、フロー緩衝液中に再懸濁した。Ｖ底９６ウェルプレートに１ウェルあたり百万個のＰＢＭＣを播種した。細胞を１３００ＲＰＭ、室温（ＲＴ）で３分、遠心分離し、蛍光色素コンジュゲートＡＨ１ペプチド：ＭＨＣクラスＩテトラマー（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）および細胞表面フローサイトメトリー抗体ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５クローンＭ１／６９（すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含む１００μＬのフロー緩衝液中で、室温、暗所で４５分再懸濁した。４５分後に、１２００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いでＤＡＰＩ（４’，６－ジアミノ－２－インドール、生死染色）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に細胞を再懸濁し、直ちにＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
以下の細胞型を総生存細胞のパーセンテージとして計数した：ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋好中球（エクスビボ機能性アッセイによるさらなる表現型決定が必要であろうが、おそらくＭＤＳＣ）、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＴ２６腫瘍拒絶抗原ｇｐ７０（ＡＨ１）、すなわちマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）関連細胞表面抗原のエンベロープ遺伝子の産物を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞（例えばCastle et al. (2014) BMC Genomics 15(1):190を参照）。
下表にまとめた結果は、非特異的なスクランブルしたｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ株が、ＰＢＳ（ｐ＝０．０２）、鞭毛が無傷のＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株（ｐ＝０．０２）、および最低レベルの循環好中球を有する鞭毛を欠失した株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１（ｐ＝０．０１）と比較して有意に増加した好中球の典型的な抗菌免疫プロファイルを誘発することを示している。同様に、細菌によって誘起されたマクロファージも、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ株において、ＰＢＳ（ｐ＝０．０１）、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株（ｐ＝０．０１）、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株（ｐ＝０．０１）と比較して有意に上昇した。すなわち、Ｉ型ＩＦＮ誘起ペイロードを有する両方の株は、正常な抗菌免疫応答を上書きすることができ、そのため好中球およびマクロファージによって細菌感染が消失し、適応Ｔ細胞媒介免疫が誘起されない。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体の循環レベルはすべての群にわたって同様である一方、鞭毛を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株はＰＢＳと比較して有意（ｐ＝０．０４）に増加したＡＨ１テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを実証した。
これらのデータは、腫瘍常在性骨髄性細胞にウイルス様Ｉ型ＩＦＮ誘起プラスミドを送達するように細菌を操作することの実現可能性を実証している。これは、ウイルス性が高く細菌性が低い免疫プロファイルに向けての免疫応答の劇的な再プログラミングをもたらす。鞭毛の欠失は、細菌によって動員される好中球およびマクロファージから有意に増加した腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞への転換をさらに増強した。すなわち、細菌性のＴＬＲ５媒介炎症を無くすことによって、適応免疫を増強することができる。

SD = 標準偏差
鞭毛を欠失した株はインビボにおいて食細胞性骨髄免疫細胞コンパートメントに制限される
文献によれば、ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ株は、非食細胞性細胞へのＳＰＩ－１に媒介された進入に関連する多くの下流遺伝子の抑制を示す。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株も非食細胞性細胞取り込みを欠いているかを決定するため、細菌性ｒｐｓＭプロモーターの下にｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）を構成的に発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ＭＣ３８皮下側腹部腫瘍を有するマウスにＩＶ投与した。
ＭＣ３８（マウス結腸腺癌＃３８）モデルは、突然変異生成を使用するＣＴ２６モデルと同様に、しかしジメチルヒドラジンを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統において誘導した（例えばCorbett et al. (1975) Cancer Res. 35(9):2434-2439参照）。ＣＴ２６と同様に、皮下移植は結腸に同所移植した場合より多くのＴ細胞が除外され、免疫抑制性腫瘍微小環境がもたらされた（例えばZhao et al. (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787を参照）。ＭＣ３８はＣＴ２６よりも高い変異の負荷およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって検出できる同様のウイルス由来ｇｐ７０抗原（ｐ１５Ｅ）を有しているが、これは拒絶抗原とはみなされない。ＭＣ３８の変異体(variant)はチェックポイント療法に部分的に関与していることが見出されているが、細胞系の大部分の変異体は、本明細書で使用されるＭＣ３８細胞を含めて、チェックポイント難治性でありＴ細胞が除外されていると考えられる（例えばMariathasan et al. (2018) Nature 555:544-548を参照）。
この実験のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。３４日目に、定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに１×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株をＩＶ注射した。ＩＶ投薬の７日後に腫瘍を切除し、２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１０％のＦＢＳと１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。ナイロンメッシュを５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。ナイロンメッシュを５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳで洗浄し、濾過された細胞を１０００ＲＰＭで７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
フローサイトメトリー染色のため、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに１００μＬの単一細胞懸濁液を播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬで加え、細胞を氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞を蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５クローンＭ１／６９（すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後に、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
結果は、腫瘍浸潤性単球の７．２７％が腫瘍微小環境において鞭毛欠失ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んだことを実証した。同様に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）集団の８．９６％および腫瘍浸潤性樹状細胞（ＤＣ）の３．３３％が鞭毛欠失ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んだ。対照的に、間質細胞および腫瘍細胞に対応するＣＤ４５－集団の中では、わずか０．０７６％がｍＣｈｅｒｒｙ発現について陽性を示した（バックグラウンド染色の０．０６７％と比較して）。これらのデータは、鞭毛およびＳＰＩ－１に対するその下流のシグナル伝達インパクトが上皮細胞の感染力を可能にするために必要であること、ならびにその欠如が細菌の取り込みを腫瘍微小環境の食細胞性免疫細胞コンパートメント（すなわち、腫瘍常在性免疫／骨髄性細胞）のみに制限していることを実証している。
鞭毛の欠失は、適応免疫を抑制するＴＬＲ５誘起炎症性サイトカインの排除、マクロファージのピロトーシスの低減、ならびに腫瘍常在性食細胞性細胞に取り込みが限局している場合の全身投与における腫瘍特異性富化の維持（または増強）を含む多数の利点を免疫刺激ネズミチフス菌株に与えている。
［実施例５］
サルモネラｐａｇＰ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
本実施例では、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ｐａｇＰを欠失するようにさらに改変した。ｐａｇＰ遺伝子はネズミチフス菌の感染ライフサイクルの間に誘起され、リピドＡをパルミチン酸塩で改変する酵素（リピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ）をコードする。野生型ネズミチフス菌では、ｐａｇＰの発現は、ヘプタアシル化されるリピドＡ分子をもたらす。リピドＡの末端アシル鎖が付加できないｍｓｂＢ－突然変異体では、ｐａｇＰの発現はヘキサアシル化されたリピドＡ分子をもたらす。ヘキサアシル化リピドＡを有するＬＰＳは高度に炎症促進性であり、ＴＬＲ４に高い親和性を有することが示されている（野生型で見出されたヘプタアシル化リピドＡはＴＬＲ４に対して最大の親和性を有する）。本実施例では、ｐａｇＰおよびｍｓｂＢが欠失した株はペンタアシル化リピドＡのみを産生することができ、ＴＬＲ４に対する低い親和性による低い炎症促進性サイトカイン、忍容性の増強、および免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドを送達するように細菌を操作した場合の適応免疫の増大が可能になる。
ΔｐａｇＰ株の構築
先行する実施例に記載した方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株からｐａｇＰ遺伝子を欠失させた。ｐａｇＰ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２０３塩基および２７９塩基を含む合成のｐａｇＰ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０１９１と呼ばれるプラスミド（配列番号３３１）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１９１にクローニングし、ｐａｇＰ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｐａｇｐ－１（配列番号３１５）およびｐａｇｐ－２（配列番号３１６）（表１を参照）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製して、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度での増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーｐａｇｐ－３（配列番号３１７）およびｐａｇｐ－４（配列番号３１８）を使用するＰＣＲによってｐａｇＰ遺伝子ノックアウト配列を増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られたＹＳ１６４６の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰと命名した。
ｐａｇＰ欠失突然変異体はペンタアシル化リピドＡを有するＬＰＳを有し、炎症性サイトカインの低減を誘起する
Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000))および上記のように、ラムダ誘導Ｒｅｄ組換えシステムを使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ株からｐａｇＰ遺伝子も欠失させて、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰを生成した。次いでこの株を、欠失したａｓｄ遺伝子を補完し、インビボにおけるプラスミドの維持を保証する機能性ａｓｄ遺伝子を含むプラスミドとともに電気穿孔した。次いでこの株からリピドＡを抽出し、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）によって評価し、野生型ネズミチフス菌株ＡＴＣＣ １４０２８、ＹＳ１６４６株（これはｍｓｂＢおよびｐｕｒＩが欠失している）、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ株由来のリピドＡと比較した。野生型サルモネラは、機能性ｍｓｂＢ遺伝子の存在による、それぞれのヘプタアシル化種とヘキサアシル化種とに対応する質量２０３４の小さなリピドＡのピークおよび質量１７９６の大きなピークを有していた。ｍｓｂＢ欠失株であるＹＳ１６４６およびＹＳ１６４６Δａｓｄは、ヘキサアシル化およびペンタアシル化リピドＡの混合物に対応する１８２８および１５８５の大きなピークを有していた。ｍｓｂＢおよびｐａｇＰが欠失した株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰは、ペンタアシル化リピドＡに対応する質量１５８５の単一ピークのみを有していた。これらのデータは、ｐａｇＰの欠失がリピドＡのパルミトイル化を防止し、それによりリピドＡを単一のペンタアシル化種に限定することを実証している。
ΔｐａｇＰ突然変異体株由来のペンタアシル化リピドＡを含むＬＰＳがＴＬＲ４シグナル伝達を低減するかを決定するために、野生型株、ＹＳ１６４６株またはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株由来の４μｇの精製されたＬＰＳを、ＴＨＰ－１ヒト単球細胞(ＡＴＣＣカタログ＃ＴＩＢ－２０２)に加え、２４時間後に、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、炎症性サイトカインの存在について上清を評価した。結果は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株由来のＬＰＳが野生型ＬＰＳと比較して２５％の量のＴＮＦαを誘起し、野生型ＬＰＳより７分の１少ないＩＬ－６を誘起したことを示した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株由来のＬＰＳは株１６４６より２２分の１少ないＩＬ－６を誘起し、ΔｐａｇＰ突然変異体由来のペンタアシル化ＬＰＳ種の炎症性がヒト細胞において有意に低いことが実証され、ΔｐａｇＰ突然変異体がヒトにおいてより良く忍容され得ることが示された。
ｐａｇＰの欠失は初代ヒトＭ２マクロファージにおいて有意に少ないＩＬ－６を誘起する
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株が初代ヒトＭ２マクロファージから炎症性が低く用量制限的なＩＬ－６も誘発することを実証するため、この株を評価し、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧおよび親ＹＳ１６４６株と比較した。ヒトドナー由来のＭ２マクロファージは、Ｔ細胞を除外した固形腫瘍において高度に富化された免疫抑制性表現型を代表している。健康なヒトドナーから単離して凍結したヒトＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１倍の非必須アミノ酸＋５％のヒトＡＢ血清）中で解凍し、室温、８００ＲＰＭで１０分、遠心分離することによって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。次いで単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）および１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中に再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５）を最終体積７５０μＬで２４ウェルプレートに播種した。播種の２日後、細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）、サイトカイン１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を４８時間、加えた。６日目に細胞培養培地を完全に吸引し、サイトカインを含まない新鮮な完全培地単独、またはＭＯＩ ２０でネズミチフス菌株のログ相培養物を含む培地に交換した。細胞を１時間感染させ、次いでＰＢＳで洗浄し、細胞外細菌を死滅させるために５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む新鮮な培地に培地を交換した。次いでウェルを洗浄し、新鮮な培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。４８時間後に上清を収穫し、ヒトＩＬ－６サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してメーカーの使用説明書に従ってサイトカインについてアッセイした。
結果は、親株ＹＳ１６４６に感染したヒト初代Ｍ２マクロファージからの分泌されたＩＬ－６のレベルが平均１４８３９±９２６ｐｇ／ｍＬであった一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株由来のＩＬ－６のレベルが２０７５±７２３ｐｇ／ｍＬで有意に低かった（ｐ＝０．００４）ことを実証した。このことは、鞭毛の欠失およびＴＬＲ５シグナル伝達の排除がＩＬ－６の誘起に及ぼす影響をさらに確認している。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ｐａｇＰ株は３３２±１００ｐｇ／ｍＬと最小のＩＬ－６レベルを誘発し、この改変されたＬＰＳコーティングがＴＬＲ４を刺激する能力の低下、およびその結果としての炎症性ＩＬ－６の産生の劇的な低下を実証している。
鞭毛とｐａｇＰの欠失の組合せはマウスにおける忍容性を顕著に増強する
上記の改変された株が親株ＹＳ１６４６より弱毒化しているかを決定するため、メディアン致死用量（ＬＤ５０）の研究を行った。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）に、３ｅ５～３ｅ７ＣＦＵの用量範囲の株ＹＳ１６４６、または誘導株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰを静脈内注射した。株ＹＳ１６４６とは異なり、誘導株は全身投与された場合に顕著な毒性を示すＦＤＡ承認のサイトカインであるマウスＩＬ－２をコードするプラスミドも有していた。
株ＹＳ１６４６のＬＤ５０は４．４×１０６ＣＦＵ（２回の研究の平均）であることが見出され、以前に公開されたＹＳ１６４６のＬＤ５０の報告と一致し、野生型ネズミチフス菌と比較して１０００倍を超える改善であった（例えばClairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株のＬＤ５０は２．０７×１０７ＣＦＵと決定され、株ＹＳ１６４６と比較して４．５分の１未満への病原性の低減が示された。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株のＬＤ５０は１．３９×１０６ＣＦＵと決定され、株１６４６と比較して少なくとも３．２分の１への病原性の低減が示された。これは、この株がまだ高度に炎症性の鞭毛を有していることを考慮すれば予想されることである。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株では投与した最大用量でマウスが死亡しなかったため、ＬＤ５０は確定できなかったが、６．２×１０７ＣＦＵより大きかった。したがって、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株は親ＹＳ１６４６株と比較して１４分の１以下への病原性の低減を示す。これらのデータは、上記の遺伝子改変が臨床的ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９としても知られている）の病原性を低減させ、したがってヒトにおける忍容性の増大をもたらすことを実証している。
ＶＮＰ２０００９（例えばToso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照)の第Ｉ相臨床試験において、試験した２つの最高用量、すなわち３×１０８ＣＦＵ／ｍ２（３３％存在）および１×１０９ＣＦＵ／ｍ２（５０％存在）において患者の腫瘍に部分的にのみ細菌が存在することが観察され、腫瘍のコロニー形成を達成するにはＶＮ２０００９の忍容用量が低すぎることを示している。上記の改変によって株の忍容性を改善することにより、必要であれば１４倍を超える高い用量を投与することができ、その腫瘍がコロニー形成する患者のパーセンテージが改善され、腫瘍あたりの治療用コロニー形成のレベルが増加され、それによりＶＮＰ２０００９で観察された問題が解決される。
鞭毛とｐａｇＰとの欠失の組合せはマウスにおける抗ネズミチフス菌抗体の生成を顕著に制限する
上記の３×１０６ＣＦＵ投薬群から生存したマウス（ＹＳ１６４６投薬群のＮ＝４を除いてＮ＝５）をＩＶ投薬後４０日間保持し、その時点で採血して血清を採取して、改変した流動基準抗体タイタリングシステムによってネズミチフス菌に対する抗体価を評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株の一夜培養物を洗浄し、フローサイトメトリー用固定緩衝液で固定した。以前処置したマウスおよびナイーブな対照マウスの血清を９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＳによる連続希釈を実施した。次に１×１０６ＣＦＵを含む２５μＬのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ培養物を血清に加え、室温（ＲＴ）で２５分インキュベートした。次いで４０００ＲＰＭで５分遠心分離することによって細菌をＰＢＳにて２回洗浄した。最後の洗浄の後、二次ヤギ抗マウスＦｃ ＡＦ４８８抗体（ストックから４００倍希釈）を含むＰＢＳ中に細菌を再懸濁し、室温で遮光下に２５分インキュベートした。次いで４０００ＲＰＭで５分遠心分離することによって細菌をＰＢＳにて３回洗浄した。最後の洗浄の後、細菌をＰＢＳ中に再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してデータを取得し、ＭＦＩ ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
フローサイトメトリーの結果を評価するため、すべての群の中でシグナルを有する最大の希釈倍率を選択し（血清希釈１２５０倍）、対応する平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をプロットした。無染色で得られたＭＦＩがＭＦＩ １０００であり、これがヤギ抗マウスＦｃ ＡＦ４８８抗体のみにて染色されるバックグラウンドであるので、これを検出限界（ＬＯＤ）として選択した。したがって、１０００より大きなＭＦＩを陽性シグナルとみなし、ＭＦＩ値を有していてもこの値と同じかそれより低いものはすべて陰性の結果とみなした。
このアッセイの結果より、３×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６株で処置したマウスから抗ネズミチフス菌血清抗体の高いＭＦＩ価(ＭＦＩ ２９１９６．３±２０７３０)が明らかになり、ＹＳ１６４６が血清抗体（これは非中和性である）を生成できるという以前公開されたデータと一致した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株で処置したマウスでは検出された抗体は少なく（ＭＦＩ １１２５７±９２９０）、これは鞭毛由来のアジュバント活性の欠如によるものであり得る。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株で処置したマウスでは、株ＹＳ１６４６と比較して有意に少ない抗体（ＭＦＩ ４４９４±３８６１)が生成し（ｐ＝０．０３３）、これはＬＰＳ表面コーティングの変更によるものであり得る。血清抗体において最も有意な減少は、数匹のマウスが１０００未満のＭＦＩ価を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ処置群で示され（ＭＦＩ １９３０±２４４５）、血清抗体について陰性とみなされた（株ＹＳ１６４６に対してｐ＝０．０２１）。したがって、鞭毛とｐａｇＰ遺伝子との欠失の組合せは、安全性の改善と免疫原性の顕著な低減とを可能にし、これはヒトにおける高いＣＦＵの繰り返し投薬を可能にすることになる。
ｐａｇＰおよび鞭毛が欠失した株およびそれらの組合せは、株ＹＳ１６４６と比較してヒト血清中における有意により高い生存能力を示す
株ＹＳ１６４６は全身投与の後でヒトにおいて限定された腫瘍のコロニー形成を示す。本明細書において株ＹＳ１６４６はヒト血液中の補体因子によって不活化されることが示されている。これを実証するため、株ＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂを、細菌の表面を改変するさらなる変異を含む本明細書で提供する例示的な免疫刺激細菌と比較した。これらの例示的な改変株は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰであった。これら３つの株、ならびにＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂ培養物を、プールしたマウス血液またはプールした健康なヒトドナー（ｎ＝３）からの血清と、または熱不活化（ＨＩ）した血清と、３７℃で３時間インキュベートした。血清とのインキュベーションの後、細菌を連続希釈してＬＢ寒天プレートに播種し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。
マウス血清中ではすべての株は１００％生存したままであり、補体活性化に対して完全に耐性であった。ヒト血清中では、すべての株は熱不活化血清中で１００％生存した。大腸菌Ｄ１０Ｂ株は全ヒト血清中で３時間後に完全に排除された。全ヒト血清中では、ＹＳ１６４６株はわずかに６．３７％の生存コロニーを示し、ＹＳ１６４６臨床株の腫瘍のコロニー形成がヒト血液中における補体不活化によって限定されていることが示された。ヒト血清との３時間のインキュベーションの後で、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株については３１．４７％の生存コロニーが残存し、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株については７２．９％の生存コロニーが残存していた。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株の組合せは、ヒト血清中で補体に対して完全に耐性であった。
これらのデータは、株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）が全身投与された場合に極めて低い腫瘍のコロニー形成を有している理由を説明する。株ＹＳ１６４６はヒト血清中で補体不活化に極めて感受性であるが、マウス血清中ではそうでないことが本明細書で示されている。これらのデータは、ヒトでは限定された腫瘍のコロニー形成が観察された一方、マウス腫瘍は高いレベルでコロニー形成した理由を説明する。ｆｌｊＢ／ｆｌｉＣもしくはｐａｇＰの欠失、またはこれらの突然変異の組合せは、部分的にまたは完全にこの表現型を救済する。すなわち、ヒト血清中でＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株において観察された安定性の増強は、ヒト腫瘍のコロニー形成の増大を提供する。
［実施例６］
サルモネラａｎｓＢ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
本実施例では、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株を、細菌のＬ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子であるａｎｓＢを欠失させるようにさらに改変した。Ｔ細胞の存在下におけるネズミチフス菌によるＬ－アスパラギナーゼＩＩの分泌は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の低下および細胞傷害性サイトカインの産生の障害によってＴ細胞の機能を直接障害することが示されている。結果として、細菌由来のアスパラギナーゼが急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を処置するために数十年にわたって成功裡に使用されてきた。細菌ゲノムからのａｎｓＢの欠失はＬ－アスパラギナーゼＩＩを産生するネズミチフス菌株の能力を無くし、それにより細菌にコロニー形成された腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を増強する。
ΔａｎｓＢ株の構築
先行する実施例に記載した方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株からａｎｓＢ遺伝子を欠失させた。ａｎｓＢ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２３６塩基および２５１塩基を含む合成ａｎｓＢ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０２３０と呼ばれるプラスミド（配列番号３３２）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０２３０にクローニングし、ａｎｓＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーａｎｓｂ－１（配列番号３１９）およびａｎｓｂ－２（配列番号３２０）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーａｎｓｂ－３（配列番号３２１）およびａｎｓｂ－４（配列番号３２２）を使用するＰＣＲによってａｎｓＢ遺伝子ノックアウト配列を増幅し（表１を参照）、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られたＹＳ１６４６の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢと命名した。
ａｎｓＢの欠失はインビトロにおけるアスパラギナーゼ活性を無くす
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株のＬ－アスパラギナーゼＩＩ産生が少ないかを決定するため、この株の培養物をａｎｓＢが無傷のＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株とともにＬＢ中で増殖させ、定常相に到達させた。この時点で培養物からの５０μＬの馴化培地のアスパラギナーゼ活性を、比色アスパラギナーゼアッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してメーカーの使用説明書に従って解析した。４０分のインキュベーションの後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により５７０ｎｍの吸光波長により吸光度単位を読み取った。
１．９５の吸光度を示した組換えＬ－アスパラギナーゼＩＩ陽性対照と比較して、ａｎｓＢが無傷のＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株の吸光度は０．８２であった。しかしＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失は、０．１０９の吸光度で検出されるアスパラギナーゼ活性のバックグラウンドレベルを生じた。これらのデータは、ΔａｎｓＢの突然変異がアスパラギナーゼ活性を完全に無くすことを確認している。
ａｎｓＢの欠失はインビトロの共培養アッセイにおいてＴ細胞の機能を回復させる
Ｔ細胞に対するＬ－アスパラギナーゼＩＩの活性の低下の影響についてａｎｓＢ欠失株を機能的に特徴解析するため、脾臓由来の精製したＴ細胞との培養における株感染したマウス初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を使用する共培養アッセイを確立した。このアッセイのため、健康なＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を単離して解離し、マウスＴ細胞単離キット(ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を使用してメーカーの使用説明書に従って脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離したＴ細胞から１ウェルあたり２ｅ５個の細胞を、５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５－２Ｃ１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予めコートした平底９６ウェルプレートに加えた。定常相まで増殖させたＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ培養物由来の馴化したＬＢ培地を０．４５μＭのナイロンメッシュで濾過し、共刺激のためのアゴニストである１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体の添加ありまたはなしで、Ｔ細胞に加えた。２０Ｕ／ｍＬの組換えアスパラギナーゼを含む対照群および正常培養培地をアッセイにおける対照として用いた。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後２４時間に、１００μＬの共培養上清をウェルから収穫し、マウスＴｈ１特異的サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を実施した。同時にＴ細胞を収穫し、フローサイトメトリーによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の表面Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の発現、ならびにＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２の細胞内染色について解析した。
結果から、マクロファージに感染させるために使用され、続いてＴ細胞と共培養された、ａｎｓＢが無傷の株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ）が高度のＴ細胞免疫抑制を誘起することが確認された。このことは、培地対照および２０Ｕ／ｍＬの濃度の組換えアスパラギナーゼの陽性対照と比較して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞におけるＴＣＲβの表面発現の顕著な下方制御によって示された（下表を参照）。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失は、親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株と比較して、ＣＤ４＋（ｐ＝０．００４）およびＣＤ８＋（ｐ＝０．００２）の両方のＴ細胞におけるＴＣＲβの表面発現を有意に回復させた。

SD = 標準偏差
共培養後２４時間におけるＴ細胞からのサイトカインの分泌を、Ｔ細胞の細胞溶解機能のマーカーとして測定した。下表に示すように、Ｔ細胞によるサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２の産生は、培地対照と比較してＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株による処理の後で顕著に低く、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失によって有意に回復した［ＩＦＮγ（ｐ＝０．０５）、ＴＮＦα（ｐ＝０．０１２）、およびＩＬ－２（ｐ＝０．００６）］。これらのデータは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失が、親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株と比較してＴ細胞の細胞溶解機能を有意に回復することを示している。

SD = 標準偏差
ａｎｓＢの欠失はインビボで腫瘍に存在するＴ細胞のＴＣＲβの発現を回復する
インビトロの共培養アッセイにおいて、ａｎｓＢの発現は、フローサイトメトリーによるＴ細胞上のＴＣＲβの下方制御を含むＴ細胞機能に対する免疫抑制効果を示した。これがインビボでも同様に起こるかを評価するため、結腸直腸がんのＭＣ３８マウスモデルを利用した。
この実験のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス４匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。１７日目に、定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに１×１０７ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株をＩＶ注射した。ＩＶ投薬の７日後に腫瘍を切除し、２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０を含む１０％のＦＢＳ）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳでナイロンメッシュを１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳでナイロンメッシュを洗浄し、次いで濾過された細胞を１０００ＲＰＭで７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
フローサイトメトリー染色のため、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに１００μＬの単一細胞懸濁液を播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬで加え、細胞を氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＴＣＲβ ＰＥクローンＨ５７－５９７；およびＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５、すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）およびＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に細胞を再懸濁し、氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後に、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
下表に示すように、コロニー形成した親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株との腫瘍内における相互作用に続く腫瘍浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴＣＲβの表面発現についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ａｎｓＢ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株より有意に低く（ｐ＝０．０４２）、後者はＰＢＳ対照処置マウスさえよりも高かった。

MFI = 平均蛍光強度; AVG = 平均; SD = 標準偏差
総合して、これらのデータにより、免疫抑制性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩの細菌産生によるＴ細胞機能の回復のためにａｎｓＢ遺伝子を欠失させる必要があることが確認され、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失に伴って観察されたＴ細胞機能の増強が実証される。
［実施例７］
サルモネラｃｓｇＤ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株を、ネズミチフス菌のｃｕｒｌｉ線毛の形成、セルロースの産生、およびｃ－ｄｉ－ＧＭＰの産生を制御するマスター遺伝子であるｃｓｇＤを欠失するようにさらに改変した。ｃｓｇＤ遺伝子の欠失は、セルロース媒介バイオフィルム形成の可能性を無くし、炎症促進性シグナル伝達を低減し、宿主の食細胞性細胞による取り込みを増強する。それにより、細胞内局在化のこの増大は、プラスミドデリバリーおよび免疫調節性タンパク質産生の有効性を増強する。
ΔｃｓｇＤ株の構築
先行する実施例に記載した方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株からｃｓｇＤ遺伝子を欠失させた。ｃｓｇＤ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２０７塩基および２０９塩基を含む合成ｃｓｇＤ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０１９６と呼ばれるプラスミド（配列番号３３３）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１９６にクローニングし、ｃｓｇＤ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｃｓｇｄ－１（配列番号３２３）およびｃｓｇｄ－２（配列番号３２４）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製して、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーｃｓｇｄ－３（配列番号３２５）およびｃｓｇｄ－４（配列番号３２６）を使用するＰＣＲによってｃｓｇＤ遺伝子ノックアウト配列を増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた親株ＹＳ１６４６の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと命名した。
ｃｓｇＤ欠失株はコンゴーレッドプレート上でＲＤＡＲコロニーを形成できない
コンゴーレッドプレート上での増殖の後でＲｏｕｇｈ Ｄｒｙ Ａｎｄ Ｒｅｄ（ＲＤＡＲ）コロニーを形成する能力は、細菌バイオフィルム形成のよくバリデートされたアッセイである。ラフで乾燥したテキスチャーはセルロースの産生によって生じ、赤色はｃｕｒｌｉ線毛の表面構造による色素の集積による。このアッセイのため、コンゴーレッド寒天プレート上でのインキュベーションの後、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株のＲＤＡＲ表現型を形成する能力をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株と比較した。
コンゴーレッド寒天プレートをソイトン（１０ｇ／Ｌ）および酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）とともに調製し（ＮａＣｌなしの改変ＬＢ）、コンゴーレッド（４０ｍｇ／Ｌ）およびクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０（２０ｍｇ／Ｌ）を補完した。５μＬの定常相細菌培養液をコンゴーレッドプレート上にスポットし、３７℃で１６時間インキュベートし、次いで３０℃に移してさらに１２０時間インキュベートした。コロニー形態および色の視覚解析を実施し、毎日記録して、ＲＤＡＲコロニー形態型の存在または不在を確認した。
２つの株の間のコロニー形態型を比較すると、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は平滑な表現型を有し、コロニーは色素を欠いていた。比較して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株はまだｃｓｇＤ遺伝子を含んでおり、古典的なラフで乾燥した外観、および色素取り込みの明らかな証拠を呈していた。すなわち、機能性アッセイにより、ΔｃｓｇＤ株はｃｕｒｌｉ線毛およびセルロースの産生を失っているので、バイオフィルムを形成できないことが確認される。
ｃｓｇＤ欠失株はトリプルネガティブ乳がんの高度難治性マウスモデルにおいて優れた抗腫瘍有効性を示す
免疫刺激細菌療法が腫瘍にコロニー形成するが限定的な有効性しか示さないモデルにおけるｃｓｇＤ欠失の影響を評価した。これは、腫瘍常在性骨髄性細胞中への取り込みを制限し、それにより治療的有用性を制限することができる細菌産生セルロースの存在を示し得る。（例えばCrull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233を参照）。ヒトのトリプルネガティブ乳がんの代表的なモデルである治療困難なＥＭＴ６モデルを利用した（例えばYu et al. (2018) PLoS ONE 13(11):e0206223を参照）。ＥＭＴ６腫瘍細胞が側腹部皮下とは異なって乳腺脂肪体に同所投与された場合、モデルはＴ細胞を排除して高度に転移性で、かつ承認されたすべてのチェックポイント抗体を含む免疫治療に高度に難治性である（例えばMariathasan et al. (2018) Nature 554: 544-548を参照）。
この実験のため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の左乳腺脂肪体にＥＭＴ６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２７５５）を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）。１３日齢で定着した乳腺腫瘍（約５５ｍｍ３の容量）を有するマウスに、単一用量の１×１０７ＣＦＵのｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。細菌株は構成的に活性なマウスＳＴＩＮＧ（ＥＦ－１α ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）をコードするプラスミドを含んでいた。
ＰＢＳ処置マウスの腫瘍は均一に増殖し、３５日目に最大腫瘍体積（１１９９．０±２９８．１ｍｍ３）に達した。ｃｓｇＤが無傷の株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢで処置したマウスはこのモデルにおいて抗腫瘍有効性の証拠を示さず、これも３５日目に最大腫瘍体積（１６８９．１±５３７．０）に達した。これらの腫瘍のエクスビボＬＢ播種より、すべての腫瘍がコロニー形成することが明らかになった。しかし、ｃｓｇＤ欠失株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤでは、５匹中３匹のマウスでその原発およびいずれの転移疾患でも完全な治癒がもたらされた（６０日以上）。全腫瘍成長阻止（ＴＧＩ）は４５．７％であり、他の２つの残った腫瘍のうち１つは最終的に増殖する前に部分奏効した。２つの細菌株は同じプラスミドペイロードを含んでいたが、１つだけが有意な抗腫瘍有効性を示した。すなわち、最も難治性で高度に転移性の同系腫瘍モデルの１つである同所性ＥＭＴ６において、ｃｓｇＤが欠失した株は全身的抗腫瘍有効性を誘起し、６０％の完全奏効をもたらすことができた。
ｃｓｇＤ欠失株はインビボで増強された細胞内取り込みを示す
ｃｓｇＤ欠失株が、腫瘍常在性骨髄性細胞中への細菌のより大きな取り込みによる有効性の改善を示すかを決定するため、エクスビボゲンタマイシン保護アッセイを実施した（例えば、Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233を参照）。この実験のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス４匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに、１７日目に１×１０７ＣＦＵのｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株（Ｎ＝１２）、または親ＹＳ１６４６株（Ｎ＝４）をＩＶ注射した。ＩＶ投薬の７日後に腫瘍を切除し、秤量し、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０ｍｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを添加したＲＰＭＩ中で細切し、３７℃で振盪しながら３０分インキュベートして、単一細胞懸濁液を生成した。３０分後に、７０ｍｍのフィルターに懸濁液を通し、回収した体積を同一の別の２つの試料に分割した。細胞外細菌を死滅させるために、対になった試料のそれぞれ１つにゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２００ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、試料を振盪しながら３７℃で９０分インキュベートした。次いで細胞懸濁液を洗浄し、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘで溶解して、ＣＦＵを計数するためにＬＢ寒天プレートに播種した。
結果は、ゲンタマイシン処理がないＹＳ１６４６処理腫瘍からのＣＦＵ（１１９２５±１９８５９ＣＦＵ）と比較して、ゲンタマイシン処理は腫瘍から検出される極めて少ないＣＦＵ（５１±４５ＣＦＵ）をもたらしたことを示している。これは、これらの腫瘍における細菌は主として細胞外に存在しており、したがってゲンタマイシンによる排除に感受性であることを示している。ｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ処置群においては、よくコロニー形成した腫瘍から予想されるように、非ゲンタマイシン処理腫瘍は高いＣＦＵを生じ、ゲンタマイシンによる処理は、より少なく、親ＹＳ１６４６株処理腫瘍よりはるかに多いＣＦＵ（１２７６±２４１０ＣＦＵ)を生じた。これは、細胞内に存在し、したがってゲンタマイシンから保護されているｃｓｇＤ欠失細菌によるところが大きい。これらのデータは、ｃｓｇＤの欠失が細菌の細胞内取り込みを改善し、それによりインビボにおける免疫調節性タンパク質のプラスミドデリバリーが増強され得ることを実証している。
［実施例８］
ｐＡＴＩ－１．７５およびｐＡＴＩ－１．７６ベクターの構築
以下の特徴、すなわちｐＢＲ３２２複製の起点、ａｓｄ遺伝子、キュアリングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接されるカナマイシン耐性遺伝子、および発現カセットの挿入のための多重クローニング部位を有するプラスミドを設計して合成した。発現カセットは、真核性プロモーター、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、転写後制御エレメント、およびポリアデニル化シグナルを含む、種々の構造で組み立てられた多重エレメントからなっている。
例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー配列の直接下流にコードされたＣＭＶ最初期コアプロモーター、およびヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）のためのコアプロモーターが含まれる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には、それぞれがタンパク質に翻訳され、２Ａ配列の挿入によって区別できるポリペプチドに分離され得る１つまたは複数の配列が含まれ、それにより真核性リボソームは２Ａ配列の中のＧｌｙとＰｒｏ残基との間にペプチド結合を挿入することができない。２Ａ配列の例としては、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）カプシドタンパク質由来のＴ２Ａペプチド（例えば、配列番号３２７を参照されたい）、およびブタテスコウイルス［ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ）］由来のＰ２Ａペプチド（例えば、配列番号３２８を参照されたい）がある。上流のフューリン切断部位（ＲＲＫＲ）およびその他のエンハンサーエレメントが上流に置かれて、発現したタンパク質を分離する切断を容易にする。
転写後制御エレメント（ＰＲＥ）の例には、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ、配列番号３４６）およびＢ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ、配列番号３４７）が含まれ、これらは細胞質へのｍＲＮＡ核エクスポートを促進することによって遺伝子の細胞質ｍＲＮＡの蓄積を増大し、３’末端のプロセッシングおよび安定性を増強する。ポリアデニル化シグナル配列の例には、ＳＶ４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ポリＡまたはＳＶ４０ｐＡ）シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡまたはｂＧＨｐＡ）シグナルが含まれ、これらはいずれも転写終結を促進するように働き、ＲＮＡ切断複合体によって認識される配列モチーフを含む３’制御エレメントである。
図１Ａ～Ｃは、ｐＡＴＩ－１．７５およびｐＡＴＩ－１．７６（それぞれ図１Ａおよび１Ｂ）プラスミド挿入断片を示す。図１Ｃは、シャイン・ダルガノ配列が、真核細胞、例えば、骨髄性細胞において翻訳のためにコザック配列で置換されていることを示す。このような配列および構成を有するプラスミドを、細菌宿主によって翻訳され得ないが、真核生物においてはインビボで翻訳され得るＲＮＡを送達するように細菌を設計する実施形態において使用できる。
［実施例９］
設計された異種タンパク質発現プラスミドはヒト細胞からの機能性タンパク質の産生を誘起する
ヒト細胞において確立されたサイトカインの最適発現
免疫刺激サイトカインがヒト細胞中で設計されたプラスミドから発現できることを例証するため、ＥＦ－１αプロモーターの制御下にサイトカインのパネルをｐＡＴＩ－１．７５プラスミドにクローニングした。サイトカインには、それだけに限らないが、マウスＩＬ－２（ｍｕＩＬ－２）、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－２３、およびヒトＩＬ－２（ｈｕＩＬ－２）が含まれる。ＩＬ－１５単一鎖に融合したｍｕＩＬ－１５受容体α（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）については、ＥＦ－１αおよびＣＭＶのプロモーターを試験した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルのプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１ウェルあたり２００，０００細胞にて、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一夜播種して８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、サイトカインプラスミドＤＮＡそれぞれ２００ｎｇを無血清培地中で希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、トランスフェクトしていないウェルを陰性対照とした（二重測定）。トランスフェクション後２４時間で各試料から細胞培養上清を収集し、各サイトカインに特異的なＥＬＩＳＡによってタンパク質発現について評価した。
ｍｕＩＬ－２コンストラクトを、マウスＩＬ－２ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でメーカーの使用説明書に従って評価し、コドン最適化したｍｕＩＬ－２のさらなるバージョン（ｍｕＩＬ－２ ＣＯ）も評価した。未希釈の上清中の濃度を試験し、ｍｕＩＬ－２コンストラクトについては平均１６８０ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２、ｍｕＩＬ－２ ＣＯコンストラクトについては１８１２ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２が得られた。これらのデータはコンストラクトの機能性を確認し、収率はコドン最適化によって改善され得ることを実証した。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０コンストラクトをマウスＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でメーカーのプロトコールに従って評価した。上清を未希釈で添加すると、平均４００ｐｇ／ｍＬの分泌されたｍｕＩＬ－１２ｐ７０が測定されたが、これは直線範囲の外であった。上清を５倍に希釈すると、平均１０５ｐｇ／ｍＬの分泌されたｍｕＩＬ－１２ｐ７０が検出された。ｍｕＩＬ－２３プラスミドについては、マウスＩＬ－２３ ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してキットの使用説明書に従ってタンパク質の検出を実施した。上清を未希釈で添加すると、平均９６６ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２３が検出された。ヒトＩＬ－２プラスミドについては、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してキットの使用説明書に従ってタンパク質の検出を行った。上清を未希釈で添加すると、平均１４２２ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２が検出された。
ＥＦ－１αまたはＣＭＶプロモーターのいずれかを使用して発現したｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについては、キットの使用説明書に従ってマウスＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を使用した。未希釈で添加すると、ＥＦ－１αプロモーターを用いたｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃプラスミドは平均１３１ｐｇ／ｍＬを生じた一方、ＣＭＶプロモーターを用いたｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃプラスミドは平均２８９ｐｇ／ｍＬを生じた。
これらのデータは、ヒト細胞中におけるマウスとヒトとの両方の免疫調節性サイトカインをコードするプラスミド発現コンストラクトを妥当とするものである。さらに、これらのデータは、コドン最適化およびＣＭＶ等のプロモーターの使用によってタンパク質の発現を増強できることを示している。
転写後制御エレメントはサイトカインの発現を増強する
ＯＲＦの３’末端に付加された転写後制御エレメント（ＰＲＥ）がヒト細胞中における免疫刺激サイトカインの発現を増強するかを決定するため、ＥＦ－１αプロモーターの制御下におけるｈｕＩＬ－２の発現を、ｐＡＴＩ－１．７５プラスミド中のウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）の添加ありまたはなしで試験した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルのプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１ウェルあたり２００，０００細胞にて、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一夜播種して８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、サイトカインプラスミドＤＮＡそれぞれ２００ｎｇを無血清培地中で希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、トランスフェクトしていないウェルを陰性対照とした（二重測定）。トランスフェクション後２４時間にて各試料から細胞培養上清を収集し、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってメーカーの使用説明書に従って活性について評価した。上清は未希釈で添加するか、または５倍希釈した。
結果は、上清を未希釈で添加した場合には、平均１５４０ｐｇ／ｍＬを分泌したＷＰＲＥなしのｈｕＩＬ－２コンストラクトと比較して、ＷＰＲＥありのｈｕＩＬ－２コンストラクトは３．６倍に増加した５５１１ｐｇ／ｍＬを分泌したことを実証した。５倍希釈した上清では、非ＷＰＲＥ ｈｕＩＬ－２コンストラクトは３１５ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を分泌した一方、ＷＰＲＥありのｈｕＩＬ－２コンストラクトは４．６倍に増加した１４４１ｐｇ／ｍＬを分泌した。すなわち、それだけに限らないがＷＰＲＥによって例証される３’転写後制御エレメントの付加は、ヒト細胞中におけるタンパク質の発現を有意に改善することができる。
プロモーターの最適化および転写後制御エレメントは初代Ｍ２マクロファージにおけるサイトカインの産生を増強する
ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ等のサイトカインの発現はＣＭＶプロモーターの使用によってヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で増強される一方、サイトカインの発現が、Ｔ細胞が除外されたヒト固形腫瘍における主要なマクロファージ表現型であるドナー由来の初代ヒトＭ２マクロファージ中で同様に増強できるかを決定した。さらに、ＷＰＲＥ等の転写後制御エレメントがこれらの細胞中における発現を増強できるかを決定した。
タンパク質の発現が改善され得るかを決定するため、プロモーターＥＦ－１αおよびＣＭＶをｍｕＩＬ－２の発現の制御について試験し、ＷＰＲＥをｈｕＩＬ－２の発現について試験した。健康なヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを完全培地(ＲＰＭＩ－１６４０＋１倍の非必須アミノ酸＋５％ ヒトＡＢ血清)中で解凍し、室温、８００ＲＰＭにて１０分の遠心分離によって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。単離した単球を、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含むＲＰＭＩ培地中で６日間培養してＭ２マクロファージを生成した。このため、単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中で再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５）を２４ウェルプレートに播種して最終体積７５０μＬとした。播種の２日後に細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目に細胞培養培地を完全に吸引し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ）によるトランスフェクションのために、サイトカインを含まない新鮮な完全培地に交換した。
Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤによるトランスフェクションは、メーカーの使用説明書に従って実施した。簡単に述べると、ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－２コンストラクト、ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２コンストラクト、ＥＦ－１α－ｈｕＩＬ－２コンストラクト、またはＥＦ－１α－ｈｕＩＬ－２＋ＷＰＲＥコンストラクトを含む５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ならびにトランスフェクトしていない対照を提供された緩衝液で希釈し、０．２μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合して、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間にて上清を収穫し、マウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用し、キットの使用説明書に従って、サイトカインについてアッセイした。
結果は、ＥＦ－１αプロモーターの制御下にｍｕＩＬ－２コンストラクトでトランスフェクトされた初代ヒトＭ２マクロファージから収穫した未希釈上清からのｍｕＩＬ－２の発現が、平均５９．７ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２の分泌をもたらしたことを実証した。ＣＭＶプロモーターによるｍｕＩＬ－２コンストラクトはほぼ５倍に増加した平均２７５ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２を生じた。ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡについては、ＷＰＲＥを失っているプラスミドでトランスフェクトした細胞由来の未希釈上清は平均１７０ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を生じた。ＷＰＲＥを含むｈｕＩＬ－２コンストラクトは、平均２１９ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を生じた。これらのデータは、ＣＭＶ等のプロモーター、およびＷＰＲＥ等の転写後制御エレメントが、初代ヒトＭ２マクロファージを含む多種の細胞型におけるサイトカインの発現を有意に改善し得ることを確認している。
ヒト細胞から発現した共刺激性受容体リガンド４－１ＢＢＬ
４－１ＢＢＬ等の共刺激性分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現したとき、Ｔ細胞上で発現した４－１ＢＢと連携して最適のＴ細胞機能を促進することができる。４－１ＢＢＬはその細胞質シグナル伝達ドメインによって負に制御されている。Ｔ細胞へのマクロファージの４－１ＢＢＬライゲーションの後期では、４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの逆進シグナル伝達が４－１ＢＢＬの表面転座を誘起してＴＬＲ４に結合し、これとシグナル伝達複合体を形成する。これは、ＴＬＲ４のＬＰＳによる活性化と同程度の高レベルのＴＮＦ－αを誘起し、これが適応性免疫応答の免疫抑制をもたらす（例えばMa et al. (2013) Sci. Signal. 6(295):ra87を参照）。
本実施例では、マウス４－１ＢＢＬをコードする配列をｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。Ｔ細胞を最大に連携させるため、細胞質ドメイン（配列番号３４４のアミノ酸残基１～８２に対応）を欠失させることによって、４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの逆進シグナル伝達を無くし、ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔを生成させた。ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔがヒト細胞の表面上で機能的に発現し得るかを決定するため、ＨＥＫ－２９３Ｔを利用した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルのプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１ウェルあたり２００，０００細胞にて、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一夜播種して８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔをコードする２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを無血清培地中で希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、トランスフェクトしていないウェルを陰性対照とした（二重測定）。４８時間後に１３００ＲＰＭにて３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＰＥコンジュゲートマウス抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＤＡＰＩ（生死染色）にて染色した。３０分後、１３００ＲＰＭにて３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
生存細胞のパーセンテージとして、トランスフェクトしていない対照細胞はマウス４－１ＢＢＬの陽性染色率１４．６％を示した。比較として、ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔをコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞の９３．４％は４－１ＢＢＬの表面発現について陽性であった。これらのデータは、ヒト細胞の表面上に高レベルで４－１ＢＢＬを発現するために、ｐＡＴＩ－１．７５プラスミドを効果的に使用し得ることを実証している。
ヒト細胞から発現した可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ
全ＴＧＦβ受容体ＩＩの細胞質および膜貫通部分を除去することによって、可溶性マウスＴＧＦβ受容体ＩＩ変異体を設計した。さらに、検出のためにＦＬＡＧまたはＦｃタグのいずれかを付加した。ＣＭＶプロモーターおよび３’ＷＰＲＥの制御下に、これらの変異体をｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。配列はＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした６ウェルのプレートに１．５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１日前に播種して、８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、３μｇのＤＮＡを無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。４８時間のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集した。いくつかの上清は１０ｋＤａのスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清についてマウスＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による直接ＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡデータを４５０ｎｍにおける吸光度とともに下表に提供する。
これらのコンストラクトの機能性をＴ細胞アッセイにおいて試験した。磁気単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスＴ細胞を脾臓から収穫した。Ｔ細胞を、可溶性受容体ありまたはなしで、種々の濃度のマウスＴＧＦベータにて、抗マウスＣＤ３ε抗体とインキュベートした。マウスＴＨ１ ＣＢＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ４、ＣＤ８、４－１ＢＢ、およびＣＤ６９のフローサイトメトリー標識を使用して、Ｔ細胞の活性化を定量した。
これらのデータは、免疫刺激細菌によるヒト等の真核細胞へのデリバリーのために操作されたプラスミドから異種分子、例えばＦｃドメインに融合した細胞外受容体を発現する能力を実証している。
ヒト細胞からのＣＤ３×ＣＤ１９二特異性Ｔ細胞エンゲージャーの発現
ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むＣＤ３×ＣＤ１９二特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］を、ＣＭＶプロモーターの制御下に３’ＷＰＲＥとともにｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。配列はＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした６ウェルのプレートに１．５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１日前に播種して、８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、３μｇのＤＮＡを無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。４８時間のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集した。いくつかの上清は１０ｋＤａのスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において濃縮した。
このコンストラクトの機能性を、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）へのＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（登録商標）の結合によって試験した。Ｂｉｔｅ（登録商標）は、フローサイトメトリーにより抗ＦＬＡＧ－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して検出した。それぞれの条件について５０，０００個の細胞の１つのウェルを操作した。ＡＰＣ陽性事象の平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびＡＰＣ陽性としてゲーティングした細胞の数を下表に提供する。
さらに、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞の共培養においてこのコンストラクトを試験した。ＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（登録商標）ありまたはなしで細胞をインキュベートし、ＢｉＴＥ（登録商標）の添加後６時間および２４時間で発光（ＮＦＡＴ活性化に起因するＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性に対応）を検出した。このアッセイの発光の読み取り値を下表に提供する。
これらのデータは、本明細書の免疫刺激細菌によって送達され得る操作されたプラスミドからヒト等の真核細胞中においてｓｃＦｖ、代替の抗体コンストラクト、および二特異性Ｔ細胞エンゲージャー等の異種分子を発現する能力を実証している。
［実施例１０］
免疫刺激細菌株はヒト細胞中で効率的にプラスミドを送達し、サイトカインを発現させる
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株はヒト単球における感染に続いて機能性ＩＬ－２タンパク質の発現を誘起する
上記のように、ａｓｄ遺伝子が欠失したネズミチフス菌のＹＳ１６４６株からフラゲリン遺伝子であるｆｌｊＢおよびｆｌｉＣを欠失させて、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを生成させた。この株をＥＦ－１αプロモーターおよびマウスサイトカインＩＬ－２（ｍｕＩＬ－2)を有する発現カセットを含むプラスミドとともに電気穿孔した。さらに、無関係のサイトカインのための対照として、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、マウスＩＬ－１５δをコードする発現プラスミドとともに電気穿孔した。さらなるコンストラクトを、ＣＭＶプロモーターを使用して創成した。
発現プラスミドを含むこれらの株がヒト単球に感染し、マウスＩＬ－２の産生を誘起することができるかを決定するため、ＲＰＭＩ１６４０［Ｇｉｂｃｏ（商標）］＋１０％ Ｎｕ－Ｓｅｒｕｍ（商標）［Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）］中、５０，０００細胞／ウェルで、ＴＨＰ－１ヒト単球細胞を感染の１日前に播種した。細胞をＲＰＭＩ中１時間、ＭＯＩ ５０にて種々の株に感染させ、次いでＰＢＳにて３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁した。４８時間後に９６ウェルプレートから上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってマウスＩＬ－２の濃度について評価した。
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ＩＬ－１５δ対照ウェルにおいて検出されたｍｕＩＬ－２の濃度は予想されたように極めて低く（６．５２ｐｇ／ｍＬ）、おそらく内因性ヒトＩＬ－２受容体へのいくらかの交差反応性を反映している。対照的に、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株は平均３５．１ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２を誘起した。これらのデータは、ヒト単球におけるネズミチフス菌免疫調節性プラットフォーム株からのＩＬ－２等の機能性異種タンパク質の発現および分泌の実現可能性を実証している。
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株およびｐａｇＰ欠失株は初代ヒトＭ２マクロファージにおいて、トランスフェクトしたｍｕＩＬ－２ ＤＮＡと比較して増強されたＩＬ－２発現を示す
初代ヒトＭ２マクロファージにおけるｍｕＩＬ－２の発現について、トランスフェクション（すなわちプラスミドＤＮＡの直接移送）とバクトフェクション（すなわち本明細書の免疫刺激細菌株によるプラスミドＤＮＡの移送）との相対的効率を比較した。健康なヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１×非必須アミノ酸＋５％ ヒトＡＢ血清)中で解凍し、室温、８００ＲＰＭにて１０分の遠心分離によって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中で再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。次いで単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中に再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５)を最終体積７５０μＬとして２４ウェルプレートに播種した。播種の２日後に細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目に細胞培養培地を完全に吸引し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ）によるトランスフェクションのために、サイトカインを含まない新鮮な完全培地に交換した。
Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤによるトランスフェクションを、キットの使用説明書に従って実施した。簡単に述べると、ＥＦ－１αプロモーターの制御下（ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－２）もしくはＣＭＶプロモーターの制御下（ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２）にｍｕＩＬ－２をコードするコンストラクト由来のプラスミドＤＮＡまたはトランスフェクトしていない対照５００ｎｇを提供された緩衝液で希釈して０．２μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を、単球を含む２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。さらなる細胞のウェルを、ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－２コンストラクトを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株、またはＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２コンストラクトを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株にＲＰＭＩ中１時間、ＭＯＩ ４５０にて感染させ、次いでＰＢＳにて３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。
２４時間後に、β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）（Ｑｉａｇｅｎ）を含む３５０μＬの緩衝液ＲＬＴにて細胞を溶解し、以下の改変を行ったＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するための、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するゲノムＤＮＡ排除ステップがキット内に含まれていた。総ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度も、Ａ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。ＲＮＡは、逆転写を実施するまで凍結解凍せずに－８０℃にて保存した。ｃＤＮＡの合成は、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って、０．４～１μｇの鋳型ＲＮＡを使用して３０μＬの反応において実施した。
ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって実施した。マウスＩＬ－２のためのＳＹＢＲ（登録商標）プライマー(アッセイＩＤ：ｑＭｍｕＣＥＤ００６０９７８)は、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）はｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的熱サイクリングプログラムは、９５℃、３０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、５秒と６０℃、３０秒との４０サイクルからなっていた。各プレートのプライマーの各組について鋳型なしの対照による反応が含まれていた。すべての試料は二重測定を行い、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量はＧａｐｄｈ（グリセルアルデヒド－３－ホスフェート脱水素酵素）参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アッセイＩＤ：ｑＭｍｕＣＥＤ００２７４９７）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的（ｍｕ－ＩＬ２）と参照（Ｇａｐｄｈ）遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは処置のΔＣｑ値を非処置対照のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。倍数増加は２＾－ΔΔＣｑとして計算した。トランスフェクトしていない／感染していない対照に対する倍数増加を下表に示す。
結果は、トランスフェクションまたはバクトフェクションのいずれにおいても、ＣＭＶプロモーターが初代ヒトＭ２マクロファージにおいてＥＦ－１αプロモーターと比較してｍｕＩＬ－２の優れた発現を示したことを示している。現在利用可能な最も効率的な試薬を使用するトランスフェクションによって最高レベルのｍｕＩＬ－２発現が生じる一方、バクトフェクションも高発現レベルのｍｕＩＬ－２を誘発し、本明細書で提供する細菌プラットフォームによる異種遺伝子移送の高い有効性が示された。
［実施例１１］
細菌株はインビボで免疫調節性プラスミドを効率的に送達し、強力な抗腫瘍活性を示す
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株は結腸直腸癌のマウスモデルにおいて毒性なしに強力な腫瘍阻止を誘起する
ｍｕＩＬ－２発現プラスミドを含むネズミチフス菌株がさらなる毒性なしに抗腫瘍有効性を誘起できることを実証するため、ｍｕＩＬ－２プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、皮下側腹部ＭＣ３８結腸直腸腺癌モデルにおける安全性および有効性についてＰＢＳ対照と比較した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株、またはＰＢＳ媒体対照を１１日目にＩＶ注射した。腫瘍測定および体重を、週２回記録した。
結果から、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株が、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（ＴＧＩ ７６．７％、Ｐ＝０．００５、２１日目）を示し、ＰＢＳマウスを安楽死させた移植後４０日目まで腫瘍がよく制御されていることが明らかになった。治療はさらなる株の弱毒化がなくても、よく忍容され、初期の体重損失は一過性であり、４０日目のＰＢＳ対照と比較して体重はわずかに３．４％減少したのみであった。すなわち、ｍｕＩＬ－２を発現する免疫刺激株は、結腸直腸癌のモデルにおいて安全かつ非毒性の様式で腫瘍成長阻害を強力に阻害する。
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株はインビボでＩＬ－２の腫瘍特異的産生を誘起する
デリバリーの腫瘍特異的な性質を確認するため、脾臓に関連する腫瘍ｍｕＩＬ－２の発現のレベルを決定した。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株、またはＰＢＳ媒体対照を１０日目にＩＶ注射した。腫瘍移植後３１日目に腫瘍および脾臓を切除し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒおよび２ｍＬのＰＢＳ中のＭ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）分子セッティングを使用して腫瘍抽出物のために処理した。ホモジネートを１３００ＲＰＭで１０分、遠心分離し、上清を収集して、ｍｕＩＬ－２ ＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してメーカーの使用説明書に従ってアッセイした。結果はｍｕＩＬ－２のｐｇ／ｍＬとして定量し、組織１ｇあたりに標準化した。
ＰＢＳ対照腫瘍は腫瘍中のバックグラウンドレベルのｍｕＩＬ－２を示し、腫瘍組織１ｇあたり平均１３４ｐｇ／ｍＬであった。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２で処置した腫瘍は腫瘍組織１ｇあたりはるかに高い平均３８９．９ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２を生じ、腫瘍常在性骨髄性細胞におけるプラスミドデリバリーによるｍｕＩＬ－２レベルの上昇を検出する能力を実証した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株を注射したマウスの脾臓中のｍｕＩＬ－２のレベルは組織１ｇあたり平均６．６ｐｇ／ｍＬであり、これはＰＢＳ対照中よりも低かった。腫瘍に対するこの特異性により、腫瘍を標的としていない従来のサイトカイン療法よりはるかに安全な様式での免疫調節性レベルのＩＬ－２のデリバリーが可能になる。
マウス共刺激性受容体リガンド４－１ＢＢＬをコードするプラスミドを含む弱毒化した細菌株はインビボで治癒効果を示す
４－１ＢＢＬ等の共刺激性分子の腫瘍特異的デリバリーが抗腫瘍有効性を増強するかを決定するため、ＣＭＶプロモーターの制御下に４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）（上記）をコードするプラスミドを含み、３’ＷＰＲＥを含む細菌株を、結腸直腸腺癌のＭＣ３８マウスモデルで評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ＣＭＶ－４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）－ＷＰＲＥプラスミドを含む１×１０７ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ、またはＰＢＳ媒体対照を１０日目にＩＶ注射した。
治療はよく忍容され、初期体重損失はわずか２．２％で、これは３日後には完全に回復した。ＰＢＳと比較して、４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）療法は高度に効果的で治癒的であった（ＴＧＩ ９０．７％、完全奏効（ＧＲ）６０％、３０日目）。これらのデータは、共刺激性分子をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌を腫瘍特異的に送達することの有効性および安全性を実証している。
［実施例１２］
構成的Ｉ型インターフェロン産生を促進する遺伝子における機能獲得型突然変異の特定
病因が未知の重篤な自己炎症性状態および血管障害を提示する対象の例が生じ、しばしば突然変異から誘導される。これらの状態の原因は特定されており、また特定され得る。そのような病変の突然変異による根拠を特定するステップは下記の通りである。ステップ１では、症状を経験している患者および健康な個体から無傷のゲノムＤＮＡを得る。全ゲノムシーケンシングを実施し、イントロンおよびエクソンを解析する。遺伝子の解析、およびＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現に関連する経路における産物の突然変異の特定を実施する。この解析から、コードされたタンパク質の構成的機能活性化およびそれに続くI型ＩＦＮの永続的な発現をもたらすことが知られている遺伝子において突然変異を発見する。
突然変異の特定の後、特定した突然変異を含みおよび含まない、完全長の遺伝子をコードするｃＤＮＡをＩ型ＩＦＮの発現を測定するレポーター細胞系にトランスフェクトする。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βのプロモーターの制御下にある場合に、レポーター細胞系を生成することができる。構成的に活性な機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異体はＩＦＮ－βの発現を促進する一方、刺激されていない野生型（ＷＴ）のタンパク質は促進しない。既知のＳＴＩＮＧ ＳＡＶＩ（幼児期に発症するＳＴＩＮＧ関連血管障害）突然変異体の場合、ＩＦＮ－βのＷＴ ＳＴＩＮＧ刺激はＷＴ ＳＴＩＮＧを直接活性化するために、増加する外因性レベルのｃＧＡＭＰの付加を必要とする。構成的に活性な突然変異は、ｃＧＡＭＰに依存しない様式でＩＦＮ－βの発現を刺激する。ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、およびＩＲＦ７のそれぞれにおける例示的な機能獲得型突然変異は下の実施例１５で説明しており、本明細書の別の箇所で論じる。機能獲得型突然変異が対象において特定されることができるか、またはインビトロの突然変異およびスクリーニングによって産生されることができるそのような他の遺伝子には、それだけに限らないが、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００が含まれる。
ヒト細胞における機能性構成的I型ＩＦＮ突然変異体の発現
ヒトＳＴＩＮＧ（対立遺伝子Ｒ２３２）およびＩＲＦ－３機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異体（下表を参照）をｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングし、ＰＣＲによって配列を確認した。ＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３ ＧＯＦ発現プラスミドがヒト細胞中で機能性Ｉ型ＩＦＮを誘起できるかを決定するため、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してプラスミドを評価した。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ここでＩＳＲＥのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。Ｉ型インターフェロンの活性は、Ｉ型ＩＦＮによって刺激された細胞培養上清中のＳＥＡＰの産生をモニタリングすることによって評価することができる。
ＧＯＦ突然変異体のそれぞれによるＩ型ＩＦＮの相対的産生を試験するため、ポリ－Ｌ－リシンでコートしたプレートに１×１０５個の２９３Ｔ－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１日前に播種して、２４ウェルプレートで８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、ＳＴＩＮＧ野生型（ＷＴ）およびＩＲＦ３ ＷＴ対照を含むＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３ ＧＯＦ突然変異体のパネルをコードする２００ｎｇのプラスミド、およびヒト細胞中で非機能性であることが文献で報告されている陰性対照ＳＴＩＮＧ突然変異体［ＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｒ陰性対照（ＮＣ）］を無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。一夜のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集し、１０μＬの細胞培養上清を５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。これをＳＥＡＰの測定に使用する。Ｉ型インターフェロンの活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光波長にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。
下表に示すように、すべてのＧＯＦ突然変異体は、Ｉ型ＩＦＮ活性を誘起しなかった野生型および陰性対照と比較して、ヒト細胞中でＳＴＩＮＧリガンド非依存的にＩ型ＩＦＮ活性を誘起することができた。最高レベルのＩ型ＩＦＮ誘起は、ヒトＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ変異体およびヒトＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄリン酸化模倣変異体によって観察された。これらのデータは、ＧＯＦ突然変異体をコードするプラスミドの、Ｉ型ＩＦＮをｃＧＡＭＰ非依存的に誘起することができる機能性の構成的に活性なＳＴＩＮＧおよび構成的に活性なリン酸化模倣ＩＲＦ３を産生する能力を支持している。
構成的に活性な型ＩＦＮ突然変異体をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株の感染はヒトＭ２マクロファージをＩ型ＩＦＮ産生Ｍ１マクロファージに変換する
構成的に活性なＩ型ＩＦＮ ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株に感染した初代ヒトＭ２マクロファージがＩ型ＩＦＮおよび下流のケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０としても知られている）のプロデューサに変換され得るかを決定した。
健康なヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１×非必須アミノ酸＋５％ ヒトＡＢ血清）中で解凍し、８００ＲＰＭ、室温で１０分の遠心分離によって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。初代ヒトＭ２マクロファージを生成するために、単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中に再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５）を最終体積７５０μＬにて２４ウェルプレートに播種した。播種の２日後、細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目に、細胞培養培地を完全に吸引し、サイトカインを含まない新鮮な完全培地に交換した。以下の株、すなわち野生型（ＷＴ）ヒト（ｈｕ）ＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ変異体をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ＷＴ ｈｕＩＲＦ３をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ｈｕＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄ変異体をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；またはプラスミド対照を含む株によってＭＯＩ ４５０にてＲＰＭＩ中１時間、二重測定ウェルを感染させた。次に細胞をＰＢＳにて３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００ μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。対照として、臨床用化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログであるＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を細胞に１０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。
２４時間後にβ－ＭＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む３５０μＬの緩衝液ＲＬＴにて細胞を溶解し、以下の改変を加えたＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するゲノムＤＮＡ排除ステップを含ませた。総ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度もＡ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。ＲＮＡは逆転写を実施するまで凍結解凍せずに－８０℃にて保存した。ｃＤＮＡの合成は、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って０．４～１μｇの鋳型ＲＮＡから３０μＬの反応において実施した。
ｑＰＣＲはＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって実施した。ｈｕＣＸＣＬ１０（ｑＨｓａＣＥＤ００４６６１９）、ｈｕＩＲＦ３（ｑＨｓａＣＩＤ００１３１２２）、ｈｕＳＴＩＮＧ（ｑＨｓａＣＩＤ００１０５６５）、およびｈｕＩＦＮβ１（ｑＨｓａＣＥＤ００４６８５１）のためのＳＹＢＲ（登録商標）プライマーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）は、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的熱サイクリングプログラムは、９５℃、３０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、５秒と６０℃、３０秒との４０サイクルからなっていた。鋳型なしの対照による反応が各プレートのプライマーの各組に含まれていた。すべての試料は二重測定で操作し、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量はＧａｐｄｈ参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ｑＭｍｕＣＥＤ００２７４９７）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的と参照遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは処置のΔＣｑ値を非処置対照のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。倍数増加は２＾－ΔΔＣｑとして計算した。値を二重測定ウェルの平均として下表に示す。
下表に示すように、プラスミド対照の感染と比較して、ＷＴ ｈｕＳＴＩＮＧおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧの株は高レベルのＳＴＩＮＧ発現を誘起し、これはプラスミド対照または小分子のＳＴＩＮＧアゴニストと比較して有意に高かった。同様に、ＷＴ ｈｕＩＲＦ３およびｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄをコードするプラスミドを含む株は高レベルのＩＲＦ３発現を誘起し、これはプラスミド対照または小分子のＳＴＩＮＧアゴニストより有意に高かった。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ変異体をコードするプラスミドを含む細菌株は、ＷＴ ｈｕＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含む株と比較して、ＩＦＮβおよびＣＸＣＬ１０のはるかに高い発現を誘起した。これは、構成的に活性なＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドを含む株がヒト初代免疫抑制性Ｍ２マクロファージをＩ型ＩＦＮ産生 Ｍ１細胞に転換する能力を実証している。ＷＴ ｈｕＩＲＦ３およびｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄをコードするプラスミドを含む株は両方ともより多いかまたは同程度のレベルのＩＦＮβを誘起した一方、これらはｈｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８４Ｇ変異体より少ないＣＸＣＬ１０を誘起した。

ND = データなし
これらのデータは、ヒト初代Ｍ２マクロファージにおける構成的に活性なＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮ変異体の発現およびこれらの細胞のＩ型ＩＦＮ産生 Ｍ１様細胞への変換を実証している。
［実施例１３］
構成的Ｉ型ＩＦＮ変異体をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌は結腸直腸がんのマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍免疫性を示す
ヒトＧＯＦ ＳＴＩＮＧ突然変異体はマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を示す
構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体をコードする発現プラスミドを含む免疫刺激細菌株が抗腫瘍有効性を誘起することを実証するため、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ（両方のフラゲリン遺伝子ｆｌｊＢおよびｆｌｉＣのノックアウトを有する）を、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターの後ろに対立遺伝子Ｒ２３２およびＧＯＦ突然変異Ｖ１５５Ｍを有するヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍ）のための発現カセットを含むプラスミドとともに電気穿孔して、株ＹＳ１６４６単独およびＰＢＳ媒体対照と比較した。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍをコードする遺伝子を、ＤＮＡ合成を使用して生成し、ｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧ変異体がマウスにおいて抗腫瘍活性を示し得るかを評価するため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍを株ＹＳ１６４６とともに、またはＰＢＳ対照とともに８日目にＩＶ注射した。
結果は、以前公開されたデータと一致して、ＹＳ１６４６親株が抗腫瘍療法としては弱い効果しかなく、治癒的でなかった［ＴＧＩ ３５％、ｐ＝ＮＳ（有意でない）、２８日目］ことを示した。しかし、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含むより弱毒化された株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍは、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍制御を誘発し（ＴＧＩ ６０％、ｐ＜０．０５、２８日目）、２０％の治癒率を有していた。すなわち、構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体を送達する免疫刺激細菌株は腫瘍成長を強力に阻害し、結腸直腸腺癌のモデルにおいて治癒効果を示す。
マウスのリン酸化模倣ＩＲＦ３はインビボで治癒効果を示す
リン酸化模倣ヒトＩＲＦ３変異体のマウスバージョンを設計し、ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄと命名して、結腸直腸腺癌のマウスモデルにおいて評価した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターの後ろにＧＯＦ突然変異Ｓ３８８Ｄを有するマウスＩＲＦ３のための発現カセット（ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄ）を含むプラスミドとともに電気穿孔して、ＰＢＳ媒体対照と比較した。ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄをコードする遺伝子を、ＤＮＡ合成を使用して生成し、ｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ＥＦ－１α－ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄを１０日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
治療は極めてよく忍容され、初期体重減少の最低はわずか０．３％であった。ＰＢＳと比較して、ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄ ＧＯＦ突然変異体をコードするプラスミドを含む細菌株は高度に効果的であり、治癒的であった（ＴＧＩ ８１．８％、ＣＲ ６０％、４２日目）。これらのデータは、構成的に活性なＩ型ＩＦＮ誘起性変異体を腫瘍特異的に送達することの有効性および安全性を実証している。
マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体は強力かつ治癒的な抗腫瘍活性を示す
ヒト患者にて発見されたヒトＳＴＩＮＧ変異体のマウスオルソログのパネルを設計した。これらのオルソログはヒト変異体と１コドンだけ異なり、ＥＦ－１αプロモーターの制御下にｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングして、以下の突然変異体の組、とりわけｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５４Ｍ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８０Ｑ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６Ｌ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ、およびｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙを得た。ＳＴＩＮＧ変異体を、マウス腺癌のＭＣ３８モデルにおいて抗腫瘍有効性について評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５４Ｍ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８０Ｑ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６Ｌ、またはｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇの発現を推進するＥＦ－１αを有するプラスミド、またはスクランブルしたｓｈＲＮＡプラスミド対照を含む５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを１０日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
本実験では、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ ＥＦ－１α－ｓｈＳＣＲ（スクランブルしたプラスミド対照)はＰＢＳ対照と比較して抗腫瘍有効性を示し（ＴＧＩ ７３％、２６日目）、これは歴史的に示されているＹＳ１６４６親株よりはるかに強力であった。これはプラスミドそれ自体の上の本質的に免疫刺激性のエレメント、例えばＣｐＧｓおよびＲＮＡｉ刺激性エレメントによるものであろう。しかし、この療法は群の中で最も忍容性が低く、最低９．９％の体重減少を示し、これは研究の最後の終了時でのみ解消した。対照的に、構成的に活性なマウスＳＴＩＮＧ突然変異体は一過性で数日以内に解消する、より少ない体重減少をもたらした。これらの変異体の相対的抗腫瘍有効性は活性における相違を明らかにし、２つの変異体、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３ＳおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇのみがプラスミド対照に対して治癒効果および増強された有効性を示した。
フォローアップ研究において、マウスＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ変異体をＲ２８３ＧおよびＮ１５３Ｓ変異体とともに試験し、その抗腫瘍有効性を比較した。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ、またはｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙの発現を推進するＥＦ－１αを有するプラスミドを含む５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを９日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。以前と同様に、ＳＴＩＮＧ変異体はよく忍容され、一時的な体重減少のみが観察されたが、迅速に解消した。これは小分子ＳＴＩＮＧアゴニストにおいても観察されたので、おそらくオンターゲット療法によるものであろう。２つの構成的に活性なマウスＳＴＩＮＧ変異体、すなわちｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３ＳおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇの有効性は以前の研究とほぼ同一であったが、明らかでない理由で体重減少ははるかに少なかった。ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ変異体も高度に効果的であったが、治癒的ではなかった。
これらの研究からのＳＴＩＮＧによって治癒したマウスを、最初の腫瘍移植後４０日で反対側の側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を再チャレンジした。すべての腫瘍が増殖したナイーブマウス（Ｎ＝５）と比較して、ＳＴＩＮＧで治癒したマウスのすべてが腫瘍を拒絶し、適応免疫の関与を示した。
これらのデータは、結腸直腸癌のマウスモデルにおけるヒト構成的活性ＳＴＩＮＧ変異体のマウスバージョンの安全性および有効性を妥当とし、他のＳＴＩＮＧ変異体と比較して増強された有効性を有する変異体の小さなサブセットを明らかにしている。これらの高度に活性な変異体はまた、防御免疫を誘発し、Ｉ型インターフェロンの腫瘍特異的産生の有効性を実証している。
マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体はＩＶ投薬に続いて有意な腫瘍リモデリングを示す
次に、構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体をコードするプラスミドを含む細菌株がＩＶ投薬に続いて腫瘍微小環境（ＴＭＥ）をリモデルする能力において相違を示すかを決定した。これを試験するため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５４Ｍ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８０Ｑ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６Ｌ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇの発現を推進するＥＦ－１αを有するプラスミドまたはプラスミド対照を含む５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを８日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
腫瘍移植後２８日目に、腫瘍を解析のために切除した。腫瘍を２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分、インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。ナイロンメッシュを５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０にて１０％ ＦＢＳとともにナイロンメッシュを洗浄し、濾過された細胞を１０００ＲＰＭにて７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
種々のＧＯＦ ｍｕＳＴＩＮＧ突然変異体をコードするプラスミドを含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧの投与に続く、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、好中球、単球、樹状細胞（ＤＣ）、Ｍ１マクロファージ、およびＭ２マクロファージを含む生きた腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定した。フローサイトメトリー染色のため、１００μＬの単一細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートのウェルに播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標），ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬにて加え、暗所、氷上にて３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４ ＦＩＴＣ クローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１ クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣ クローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７ クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０ クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥ クローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５ クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７ クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５ クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５ クローンＭ１／６９；すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、暗所、氷上にて３０分インキュベートした。３０分後、細胞を１３００ＲＰＭにて３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
下表に示すように、ＥＦ－１αプラスミド制御を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は、おそらくプラスミド上の免疫刺激エレメントにより、いくつかのＣＤ８＋Ｔ細胞の動員にも関わらず圧倒的に高い好中球浸潤を示した。対照的に、様々なｍｕＳＴＩＮＧ変異体は特有の腫瘍浸潤性免疫細胞シグネチャーを有しており、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６ＬおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ等のいくつかはＰＢＳ対照よりも少ない免疫抑制性好中球をもたらした。最も好ましい免疫プロファイルは、多数のＣＤ４＋Ｔｈ１細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびに少数の好中球とともにｍｕＴＩＮＧ Ｒ２８３ＧおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ突然変異体を投与したマウスの腫瘍において観察され、適応免疫応答を生成するための高度に好ましい条件を示している。さらに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３ＧおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ突然変異体はＰＢＳと比較して有意に高いｐ１５ｅ腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍中に有していた。以下に示すように、これらの傾向は総細胞計数においても反復された。すなわち、腫瘍常在性骨髄性細胞への構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体のデリバリーは、適応性抗腫瘍表現型に向かい、細菌性表現型から離れる免疫抑制性腫瘍微小環境の完全なリモデリングをもたらし、これは先天性免疫の促進および適応性免疫の抑制によって特徴付けられる。
生存している腫瘍浸潤性白血球(TIL)の%
総細胞計数

［実施例１４］
コンビナトリアルプラスミド発現カセットを使用する多数の免疫調節性タンパク質の発現
マルチモジュラープラスミド発現カセットはヒト細胞中で多数の免疫調節性タンパク質を産生する能力を示す
ＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮ誘起性変異体およびサイトカインをコードする核酸の組合せを、ＣＭＶおよびＥＦ－１αプロモーターの制御下に別の２つのＯＲＦを使用し（二元プロモーター系）、またはＯＲＦ中のＴ２Ａ配列および１つのプロモーターを使用して（単一プロモーター系）、ｐＡＴＩ－１．７５ベクター中にクローニングした。コンストラクトは、３’ＷＰＲＥもしくはＨＰＲＥ等の転写後制御エレメント（ＰＲＥ）、および／またはＳＶ４０もしくはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル等のポリアデニル化シグナル配列も適宜含んでいた。調製したコンストラクトには、サイトカインｍｕＩＬ－２、コドン最適化されたｍｕ－ＩＬ－２（ｍｕＩＬ－２ ＣＯ）、ｍｕＩＬ－２１、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、ｍｕＩＬ－１８、およびｍｕＩＦＮ－α２、ならびにそれらの組合せ；突然変異Ｒ２８３Ｇを有するｍｕＳＴＩＮＧ変異体；ならびに／または細胞質ドメインが欠失したマウス共刺激分子４－１ＢＢＬ（ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）をコードするコンストラクトが含まれていた。配列はＰＣＲによって確認した。
ＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮ誘起性変異体を含む組合せプラスミドがヒト細胞中で機能性Ｉ型ＩＦＮを誘起できるかを決定するため、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してプラスミドを評価した。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ここでＩＳＲＥのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。Ｉ型インターフェロンの活性は、Ｉ型ＩＦＮによって刺激された細胞培養上清中のＳＥＡＰの産生をモニタリングすることによって評価することができる。さらに、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによって相対的サイトカイン濃度を評価した。
Ｉ型ＩＦＮおよび共発現するサイトカインの相対産生を試験するため、ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに２×１０５個の２９３Ｔ－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１日前に播種して、８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、ＧＯＦ変異体のパネル、サイトカイン、および共刺激分子を単独または種々の組合せでコードする５００ｎｇのプラスミドを無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。一夜のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集し、２０μＬの細胞培養上清を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロンの活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光波長にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。ｍｕＩＬ－２コンストラクトはマウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、メーカーの使用説明書に従ってｍｕＩＬ－２の発現について評価した。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０コンストラクトはマウスＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、メーカーの推奨に従って評価した。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについては、マウスＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をキットの使用説明書に従って使用した。ＩＦＮ－α２はＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧレポーター細胞系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して測定した。マウスＩＬ－１８およびマウスＩＬ－２１はＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって測定した。
下表に示すように、分泌された機能性タンパク質の存在を検出するために実施したアッセイによって、多数の組合せペイロードの高度の発現が示された。これらには、サイトカインの組合せ、ならびにＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体との、および／または共刺激性ペイロードとの組合せが含まれている。これらのデータは、単一の発現カセットから多数の免疫調節性タンパク質を発現する本明細書で提供するプラットフォームの能力を妥当とするものである。


構成的に活性なＩ型ＩＦＮ誘起性変異体は特有のサイトカインおよびケモカインのプロファイルを有する
上記のように試験したヒトＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体のパネルを用いたＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクション実験から収穫した上清を、ヒト抗ウイルスＣＢＡパネル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、メーカーのプロトコールに従って、下流シグナル伝達の相違について評価した。それぞれのトランスフェクションは二重で実施し、サイトカインレベルを測定した。２回の測定の平均を計算した。平均サイトカイン分泌における倍数増加を、平均サイトカイン分泌を１．００と設定したトランスフェクトしていないウェルと比較して計算した。
下表に示すように、低レベルのヒトＩＬ－１２ｐ７０が細胞内で産生された。しかし、リン酸化模倣ＩＲＦ３変異体（ｈｕＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄ）を含むいくつかのヒトＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体は、いくつかの構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体と同様に、Ｉ型ＩＦＮ－α２および／またはＩＦＮ－βの産生を誘起した。これらのＧＯＦ変異体のいくつかは高レベルの分泌されたＣＸＣＬ１０を産生し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境中に動員するこれらの発現された変異体の能力を実証している。ＣＸＣＬ１０発現の最高レベルは、突然変異Ｒ２８４Ｇを有するｈｕＳＴＩＮＧ変異体の発現に続いて観察された。
これらのデータは、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０等の機能性の下流のサイトカインおよびケモカインの誘導のためのＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体を含む多重プラスミド発現コンストラクトの使用を妥当とするものである。これらの変異体はすべて特有のシグネチャーを有しており、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、特にｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇに相当）は最高レベルのＣＸＣＬ１０分泌を誘起した。
免疫細胞共培養アッセイは免疫調節性標的の最適な組合せを特定する
Ｔ細胞の動員および活性化を誘発するサイトカインの最適な組合せを決定するため、マクロファージとＴ細胞の共培養アッセイとにおいてパネルを試験した。２４ウェルプレートを使用し、上記（実施例６を参照）のように、ゴールデンチケット（ＳＴＩＮＧ欠失）マウス初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を生成した。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、各ウェルに適切なＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。コンストラクトには、ｍｕＩＬ－２ ＣＯ、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ、ｍｕＩＬ－２ ＣＯ＋ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、およびｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ＋ｍｕＩＬ－１８をコードするコンストラクトが含まれていた。
トランスフェクションの２４時間後に、フローサイトメトリー系サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）のためにウェルから１００μＬの細胞培養上清を収穫した。並行して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから２つの脾臓を切除し、マウスＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用説明書に従って脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。次いで１ウェルあたり２００，０００個の単離したＴ細胞を、１ウェルあたり０．５μｇ／ｍＬの最終濃度のＣＤ３ε抗体（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）ありまたはなしで、トランスフェクトした細胞に加えた。トランスフェクトした細胞へのＴ細胞の添加の２４時間または４８時間後に、フローサイトメトリー系サイトカインビーズアレイのために１００μＬの共培養上清をウェルから収穫した。トランスフェクトした骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）および骨髄マクロファージ／Ｔ細胞共培養からの上清を、それぞれマウス抗ウイルスおよびマウスＴｈ１特異的サイトカインビーズアレイを使用してサイトカイン含量について分析した。
下表に示すように、ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３ＧをコードするプラスミドのみがマクロファージからＣＸＣＬ１０産生を誘発した一方、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０をコードするプラスミドは単独でまたは他のタンパク質との組合せで、共培養Ｔ細胞から最高レベルのＩＦＮγを誘発し、これはＣＤ３ε刺激に起因するバックグラウンド量より大きかった。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１８＋ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇの組合せは、マクロファージからのＣＸＣＬ１０の産生および共培養したＴ細胞からのＩＦＮγの産生の両方を誘起することができた。
これらのデータは、単一のプラスミドから多数の免疫調節性ペイロードを発現することの実現可能性ならびにこれらの組合せの相乗的活性を実証している。
コンビナトリアル免疫治療は結腸直腸腺癌のマウスモデルにおける増強された抗腫瘍活性を示す
サイトカインの組合せの腫瘍特異的デリバリーが抗腫瘍有効性を増強するかを決定するため、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１８、およびｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇの組合せをコードするコンストラクト（ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１８＋ＥＦ－１α－ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ－ＷＰＲＥ）を、結腸直腸腺癌のＭＣ３８マウスモデルで評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１８、およびｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇの組合せをコードするプラスミド（ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１８＋ＥＦ－１α－ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ－ＷＰＲＥ）を含む１×１０７ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ、またはＰＢＳ媒体対照を１０日目にＩＶ注射した。
併用療法は極めてよく忍容され、初期体重減少はわずか３．６％であり、これは３日後に完全に回復した。これは、これらのサイトカイン（ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８）の全身投与で観察された毒性とは顕著に対照的である。ＰＢＳ対照と比較して、併用療法は高度に効果的かつ治癒的であった（ＴＧＩ ９２．３％、治癒率 ６０％、３０日目）。これらのデータは、本明細書に記載した免疫刺激細菌株を使用してサイトカインの組合せを腫瘍特異的に送達することの有効性および安全性を実証している。
［実施例１５］
ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、およびその他のインターフェロン経路遺伝子における改善された機能獲得型突然変異を特定するためのタンパク質操作スクリーニング
構成的に活性でインターフェロン血症を促進する機能獲得型（ＧＯＦ）アミノ酸突然変異体がヒトから特定される。遺伝子中の特定の位置にあるアミノ酸コドンを変化させる単一塩基対のヌクレオチドの変化によって、多くのＧＯＦ突然変異が生じる。例えばＳＴＩＮＧにおいては、ｃ．４３９Ｇ→Ｃにおける突然変異によってＶ１４７Ｌ突然変異が生じ、ｃ．４６１Ａ→Ｇにおける突然変異によってＮ１５４Ｓが生じ、ｃ．４６３Ｇ→Ａにおける突然変異によってＶ１５５Ｍが生じる。スクリーニングの目的は、高レベルのＩ型インターフェロンの発現をもたらす構成的に活性な突然変異体を特定することであった。ヒト患者で突然変異した場合にインターフェロン血症を促進することが知られている部位における設計された突然変異は、より多くのアミノ酸置換を試験することを可能にする。本実施例では、設計されたアミノ酸による部位指向性変異生成が既知の突然変異の場所で実施され（インターフェロン血症を促進する遺伝子中の突然変異を列挙した下表を参照）、高レベルのＩ型インターフェロンの発現をもたらす増強された活性を有する突然変異が特定される。

配列番号３０５～３０９で表されるヒトＳＴＩＮＧの配列に関連するアミノ酸残基Ｒ１９７、Ｄ２０５、Ｒ３１０、Ｒ２９３、Ｔ２９４、Ｅ２９６、Ｓ２７２、Ｑ２７３、Ｅ３１６、Ｄ２３１、Ｒ２３２、Ｋ２３６、Ｓ３５８、Ｅ３６０、Ｓ３６６、およびＲ２３８は、配列番号３６９で表されるマウスＳＴＩＮＧの配列に関連するアミノ酸残基それぞれＲ１９６、Ｄ２０４、Ｒ３０９、Ｒ２９２、Ｔ２９３、Ｅ２９５、Ｓ２７１、Ｑ２７２、Ｅ３１５、Ｄ２３０、Ｒ２３１、Ｋ２３５、Ｓ３５７、Ｅ３５９、Ｓ３６５、およびＲ２３７に対応する。
ＰＣＲプライマーは、遺伝子の相同のｃＤＮＡ配列を有する５’および３’末端に隣接する設計された置換とともに生成される。設計された突然変異を組み込むＰＣＲ産物を生成するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはその他の同様の市販のキットが使用される。ＰＣＲ増幅されたプラスミドはＤｐｎＩで処理され、次いでコンピテントな大腸菌細胞に電気穿孔される。個別のクローンが単離され、プラスミドミニプレップが実施され、所望の突然変異の配列同一性が確認される。次いでより大きな規模のプラスミド調製が実施され（Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔを使用）、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にＤＮＡがトランスフェクトされる。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下にあって分泌型ルシフェラーゼであるＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼを発現し、ここでＩＦＮ－βのコード配列はノックイン技術の使用によってＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼＯＲＦに置き換えられている。次いで構成的に活性化された突然変異体が特定され、ＩＦＮ－βプロモーターによって誘起されるルシフェラーゼ活性の発現の測定によってランク付けされる。
［実施例１６］
ネズミチフス菌における欠失に対応する不活化欠失を有する種々の種の免疫刺激細菌
上の実施例は、免疫が存在している骨髄性細胞および腫瘍微小環境におけるネズミチフス菌への標的化およびその蓄積を増大し、治療用産物／ペイロードを腫瘍に送達し、他の細胞型に感染する細菌の能力を無くすことによって細菌の毒性を低減する、ネズミチフス菌のゲノムへの例示的な改変を記載している。これらの遺伝子改変は同様に、以下に記載するような他の種における対応する遺伝子の欠失等によって、他の細菌株および種に導入することができる。
大腸菌
ｌｐｘＭ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＥ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、およびｃｓｇＤ遺伝子のインフレーム染色体欠失は、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］によって記載された組換え方法に基づく手法を使用して連続的に大腸菌株で作製される。大腸菌中の遺伝子は下記の通りである。
１）ｌｐｘＭ：ミリストイル－アシルキャリアータンパク質依存性アシルトランスフェラーゼをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４５１４３］；
２）ｐｕｒＭ：ホスホリボシルホルミルグリシンアミドシクロ－リガーゼをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９４６９７５］；
３）ａｓｄ：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７９３９］；
４）ｆｌｉＣ：鞭毛フィラメント構造タンパク質をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４９１０１］；
５）ｆｌｉＥ：鞭毛基底体タンパク質ＦｌｉＥをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６４４６］；
６）ｐａｇＰ：リピドＩＶＡパルミトイルトランスフェラーゼをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６３６０］；
７）ａｎｓＢ：Ｌ－アスパラギナーゼ２をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７４５４］；
８）ｃｓｇＤ：ＤＮＡ－結合転写二元レギュレーターＣｓｇＤをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４９１１９］；および
９）ｒｐｓＭ：３０ＳリボソーマルサブユニットプロテインＳ１３（プロモーター）をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７７９１］
簡単に述べると、特定の染色体配列が、相同性アームに隣接される選択可能な抗生物質耐性マーカーに置き換えられ、続いてｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによって除去される。各標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、抗生物質耐性遺伝子の反対側においてプラスミドベクターにクローニングされる。抗生物質耐性遺伝子および隣接する５’および３’相同性アームを含む遺伝子欠失カセットがＰＣＲ増幅され、ゲル精製され、電気穿孔によって大腸菌株に導入される。電気穿孔された細胞が回収され、抗生物質プレートでトランスフォーマントが選択される。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを使用して抗生物質マーカーがキュアされる。ここで抗生物質耐性クローンはｃｒｅ発現温度依存性プラスミドによって形質転換される。コロニーが３０℃で選択し、続いて４２℃における連続継代によって排除され、次いで抗生物質耐性の喪失によってスクリーニングされる。コロニーＰＣＲおよび配列解析によって、抗生物質感受性クローンが遺伝子欠失について確認される。
ヒト補体に対する耐性の増大または大腸菌の耐性化
大腸菌ΔｌｐｘＭ／ΔｐｕｒＭ／Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｉＥ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株におけるネズミチフス菌ｒｃｋ（補体殺傷耐性）遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ホモログａｉｌ（付着浸潤遺伝子座）、またはネズミチフス菌ｐｇｔＥ（外膜セリンプロテアーゼ）遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上の大腸菌またはネズミチフス菌のｒｐｓＭ等の構成的プロモーターから下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ｌｐｘＭ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＥ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、またはｃｓｇＤ遺伝子座のいずれかにおける）によって、達成される。
サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）
ｍｓｂＢ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、およびｃｓｇＤ遺伝子のインフレーム染色体欠失を、大腸菌系株について上記した手法を使用してサルモネラ・チフィ株において連続的に作製する。
サルモネラ・チフィΔｍｓｂＢ／ΔｐｕｒＭ／Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｇＢ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株におけるネズミチフス菌ｒｃｋ（補体殺傷耐性）遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはネズミチフス菌ｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上のネズミチフス菌またはサルモネラ・チフィのｒｐｓＭ等の構成的プロモーターの下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ｍｓｂＢ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、またはｃｓｇＤ遺伝子座のいずれかにおける）によって達成される。サルモネラ・チフィ中の遺伝子は以下の通りである：
１）ｍｓｂＢ（ＳＴＹ２０９７）：リピドＡアシルトランスフェラーゼをコードする［サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４８４４０］；
２）ｐｕｒＭ（ＳＴＹ２７４０）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４９０５４］；
３）ａｓｄ（ＳＴＹ４２７１）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２５０４８８］；
４）ｆｌｉＣ（ＳＴＹ２１６７）：フラゲリンをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４８５０７］；
５）ｆｌｇＢ（ＳＴＹ１２１３）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４７６１７］；
６）ｐａｇＰ（ＳＴＹ０６７７）：抗微生物ペプチド耐性およびリピドＡアシル化タンパク質をコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４７１３７］；
７）ａｎｓＢ（ＳＴＹ３２５９）：Ｌ－アスパラギナーゼをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４９５４１］；
８）ｃｓｇＤ（ＳＴＹ１１７９）：制御タンパク質ＣｓｇＤをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４７５８５]；および
９）ｒｐｓＭ（ＳＴＹ４３８０）：３０Ｓリボソーマルサブユニットタンパク質Ｓ１３（プロモーター）をコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２５０５９４］
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）
リステリア・モノサイトゲネスのｐｕｒＡ、ｐｕｒＱ、ｐｕｒＳ、ａｓｄ、ｆｌａＡ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、およびａｎｓＢ遺伝子のインフレーム染色体欠失は、抗生物質耐性を与え、低温（３０℃）での複製を可能にするが高温（４３℃）では複製することができない、ｐＫＳＶ７等の温度感受性シャトルベクターを使用する対立遺伝子交換手法によって達成される。それぞれの標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、ｐＫＳＶ７ベクターにタンデムにおいてクローニングされる。これはレシピエントであるリステリア・モノサイトゲネスに形質転換され、抗生物質を含む寒天プレートに播種することによって選択される。プラスミドの染色体統合は、選択下における４２℃での抗生物質耐性トランスフォーマントの連続継代によって誘起される。引き続く逐次的な３０℃での株の二次培養によって、その中でプラスミドが第２のクロスオーバー事象によって切除されて元の野生型遺伝子への復帰または５’および３’隣接配列相同性アームの組込みを生じ、標的とした欠失突然変異体を生成する細胞のサブ集団がもたらされる。抗生物質感受性クローンはこのステップにおいてコロニーＰＣＲおよび配列解析によってスクリーニングされる。
補体耐性を増大させるため、リステリア・モノサイトゲネスΔｐｕｒＡ／ΔｐｕｒＱ／ΔｐｕｒＳ／Δａｓｄ／ΔｆｌａＡ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｇＢ／ΔａｎｓＢ株におけるネズミチフス菌ｒｃｋ(補体殺傷耐性)遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはネズミチフス菌ｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド(ａｓｄ相補性システム適合性の)上のＰｈｙｐｅｒまたはＰｈｅｌｐｅｒ等の構成的プロモーターの下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ｐｕｒＡ、ｐｕｒＱ、ｐｕｒＳ、ａｓｄ、ｆｌａＡ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、またはａｎｓＢ遺伝子座のいずれかにおける)によって、達成される。リステリア・モノサイトゲネス中の遺伝子は以下の通りである：
１）ｐｕｒＡ（ｌｍｏ００５５）：アデニロスクシネートシンセターゼをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ９８６０６９］；
２）ｐｕｒＱ（ｌｍｏ１７６９）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩＩをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５９７２］；
３）ｐｕｒＳ（ｌｍｏ１７７１）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ サブユニットＰｕｒＳをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５９７０］；
４）ａｓｄ（ｌｍｏ１４３７）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８６４９２］；
５）ｆｌａＡ（ｌｍｏ０６９０）：フラゲリンをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８７１６７］；
６）ｆｌｉＥ（ｌｍｏ０７１２）：鞭毛性フック基底体タンパク質ＦｌｉＥをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５０６２］；
７）ｆｌｇＢ（ｌｍｏ０７１０）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９８５０５９］；および
８）ａｎｓＢ（ｌｍｏ１６６３）：アスパラギンシンセターゼをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５６６３］
遺伝子ｍｓｂＢおよびｐａｇＰは、グラム陽性細菌であるリステリア・モノサイトゲネスには存在しない。ＣｓｇＤもリステリア・モノサイトゲネスには存在しない。その代わり、リステリアは、バイオフィルムの形成に関与するリステリアセルロース結合タンパク質をコードするｌｃｐを発現する。これも欠失させることができる。
ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）
ビフィドバクテリウム・ロングムにおけるＢＬ１１２２（ｐｕｒＭ）、ＢＬ０４９２（ａｓｄ）、およびＢＬ１１４２(Ｌ－アスパラギナーゼ前駆体をコードする)のインフレーム染色体欠失は、不適合性プラスミドベクターシステムを使用する対立遺伝子交換手法によって達成される。ここではプラスミド複製遺伝子ｒｅｐＡを失ったｐＢＳ４２３－ΔｒｅｐＡ等の条件付き複製ベクターが最初にゲノムに組み込まれ、抗生物質耐性が提供される。続いてｒｅｐＡ遺伝子をコードするｐＴＢＲ１０１－ＣＭ等の第２のプラスミドが形質転換され、最初のインテグラントの切除のために選択する第２のクロスオーバー事象を容易にする。それぞれの標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、ｒｅｐＡを失った条件付き複製ベクターにタンデムでクローニングされ、ビフィドバクテリウム・ロングムΔＢＬ１１２２／ΔＢＬ０４９２／ΔＢＬ１１４２株に形質転換される。クロスオーバー組換え事象は相同性アーム配列にて生じることができ、成功したプラスミドインテグラントが選択されて抗生物質プレート上で単離される。次いでインテグラントがｒｅｐＡの機能性コピーをコードする不適合プラスミドによって形質転換され、これが第２のクロスオーバー事象およびｒｅｐＡ欠損プラスミドの切除を容易にする。ｒｅｐＡ欠損プラスミドはプラスミドの不適合性のために続けて失われる。ゲノム欠失はコロニーＰＣＲおよび配列解析によって確認され、残ったプラスミドは除去選択および引き続くＲｉｆ処理によってキュアされる。
ビフィドバクテリウム・ロングムΔＢＬ１１２２／ΔＢＬ０４９２／ΔＢＬ１１４２株におけるネズミチフス菌ｒｃｋ(補体殺傷耐性)遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはネズミチフス菌ｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上のＰｇａｐ等の強力な構成的プロモーターの下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ＢＬ１１２２、ＢＬ０４９２、またはＢＬ１１４２遺伝子座のいずれかにおける）によって達成される。ビフィドバクテリウム・ロングムの遺伝子は下記の通りである：
１）ｐｕｒＭ（ＢＬ１１２２）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジン シクロ－リガーゼをコードする［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２２６６９］；
２）ａｓｄ（ＢＬ０４９２）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３０８９］；
３）ＢＬ１１４２：Ｌ－アスパラギナーゼ前駆体（Ｎｔｎ＿アスパラギナーゼ＿２＿様；ＮＴＮヒドロラーゼスーパーファミリーの２型Ｌ－アスパラギナーゼ様酵素）をコードする［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３１２０］；および
４）ＢＬ１３６３ ｇａｐ（プロモーター）［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２２８２８］
ビフィドバクテリウム・ロングムは非運動性でフラゲリンを失っており、グラム陽性でｍｓｂＢおよびｐａｇＰを失っている。ａｎｓＢ遺伝子は存在するが、アスパルテートからのフマレートの形成を触媒するアスパルテートアンモニアリアーゼをコードする（ａｓｐＡ／ａｎｓＢ）［ＢＬ０３３８、ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３２５９］。
クロストリジウム・ノヴィイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）
クロストリジウムにおけるＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５（ａｓｄ）；フラゲリン遺伝子ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５；ならびに鞭毛性基底体ロッドタンパク質遺伝子ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０（ｆｌｇＢ）、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５（ｆｌｇＣ）、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５（ｆｌｇＧ）のインフレーム染色体欠失は、トキシン－アンチトキシン系を含むカウンターセレクション法を必要とする対立遺伝子交換手法によって達成することができ、これは誘起可能なプロモーターおよび大腸菌ｍＲＮＡインターフェラーゼｍａｚＦ等の毒性遺伝子を必要とする。それぞれの標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、対立遺伝子交換カウンターセレクション含有ベクター中のｆｒｔ隣接抗生物質耐性カセットの反対側の配置においてクローニングされ、クロストリジウム・ノヴィイ中に形質転換される。ｍａｚＦ遺伝子は対立遺伝子交換交換ベクター上の誘起可能なｌａｃプロモーターの制御下でコードされており、ラクトース添加寒天プレート上の増殖による二重クロスオーバー事象の選択を可能にする。ゲノム欠失は、コロニーＰＣＲおよび配列解析によって確認される。次いでＦｌｐ－ｆｒｔ組換えを使用して染色体から抗生物質耐性カセットをキュアすることができる。
クロストリジウム・ノヴィイΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５株におけるネズミチフス菌ｒｃｋ(補体殺傷耐性)遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはネズミチフス菌ｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上のＰｔｈｌ、Ｐｐｔｂ、またはその他の変異体等の強力な構成的プロモーターから下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５、またはＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５遺伝子座のいずれかにおける）によって達成される。クロストリジウム・ノヴィイの遺伝子は下記の通りである：
１）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５：ＡＩＲシンターゼをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４１５８３］；
２）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジン シクロ－リガーゼをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０６６９］；
３）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５（ａｓｄ）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４１７６２］；
４）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４１７０３］；
５）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５３９９８４］；
６）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５３９８８６］；
７）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５３９６９９］；
８）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０（ｆｌｇＢ）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０６３７］；
９）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５（ｆｌｇＣ）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＣをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０１４３］；および
１０）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５（ｆｌｇＧ）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＧをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０２４５］
クロストリジウム・ノヴィイはグラム陽性であり、ｍｓｂＢおよびｐａｇＰを失っている。
［実施例１７］
ヒトＳＴＩＮＧより強いＩ型ＩＦＮシグナル伝達および／または弱いＮＦ－κＢシグナル伝達を誘起する脊椎動物ＳＴＩＮＧ変異体を発現するように改変された免疫刺激細菌
ＳＴＩＮＧシグナル伝達は２つのシグナル伝達経路を活性化する。第１はＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）／ＩＲＦ３アクシスであり、Ｉ型ＩＦＮの誘起、ならびに樹状細胞（ＤＣ）の活性化および腫瘍抗原の交差提示をもたらし、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫を活性化する。第２は活性化されたＢ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達アクシスであり、炎症促進性応答をもたらすが、抗腫瘍免疫に必要なＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらさない。細菌に基づくがん免疫治療は、Ｉ型ＩＦＮを誘起して腫瘍抗原交差提示および恒久的な抗腫瘍免疫を促進するために必要なＣＤ８＋Ｔ細胞を動員し活性化する能力に限界がある。したがって、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を誘起および／または増大し、かつ低減したＮＦ－κＢシグナル伝達を有し、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫の誘起を増大し、細菌の治療有効性を増強する免疫刺激細菌が本明細書で提供される。上記の免疫刺激細菌は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を野生型ＳＴＩＮＧと比較して増大させることができるか、またはＩ型ＩＦＮの発現を構成的にすることができるＳＴＩＮＧの機能獲得型突然変異体である改変されたＳＴＩＮＧタンパク質をコードする。本実施例（およびまた詳細な説明に記載された）では、ＳＴＩＮＧタンパク質はＮＦ－κＢシグナル伝達活性を低減しまたは無くし、Ｉ型ＩＦＮを誘起する能力を保持するように改変され、および／または増大したもしくは構成的なＩ型ＩＦＮの発現のために改変される。これは、抗腫瘍免疫を誘起し、通常では細菌病原体による感染に起因するＮＦ－κＢシグナル伝達を誘起しない（または誘起が少ない）免疫刺激細菌をもたらす。
種々の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質は、様々なレベルのＩ型ＩＦＮおよびＮＫ－κＢシグナル伝達活性を呈する。例えば、ヒトおよびマウスの細胞におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達は、強いＩ型ＩＦＮ応答および弱い炎症促進性ＮＦ－κＢ応答をもたらす。サケおよびゼブラフィッシュ等の条鰭魚類におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達は対照的に、一次的にＮＦ－κＢに推進される応答の強固な活性化を示し、これはＩＲＦ－３によって推進される（すなわちＩ型ＩＦＮ誘起性の）応答と比較して１００倍を超えて大きい。タスマニアンデビル等の他の種では、ＳＴＩＮＧシグナル伝達はＩ型ＩＦＮ応答をもたらすが、本質的にＮＦ－κＢ応答をもたらさない。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、随伴するＮＦ－κＢ応答の誘起なしにＩ型ＩＦＮ応答を誘起するＳＴＩＮＧの能力を活用するためにタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ等の非ヒト種由来のＳＴＩＮＧをコードしている。本明細書に記載したように、これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質はまた、Ｉ型ＩＦＮ応答を増大するか、またはこれを構成的にする突然変異によって改変される。ヒトＳＴＩＮＧにおいてこの効果を有する特定された突然変異が非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質に導入される。対応する残基はアラインメントによって特定される。
ＳＴＩＮＧのＣ末端鎖(tail)（ＣＴＴ）が１つの種、例えばヒトにおいて、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性をほとんどまたは全く示さない第２（例えば非ヒト）の種のＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣＴＴに置き換えられるキメラも提供される。ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧのリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要な配列モチーフを含むほぼ４０アミノ酸の無構造の並びである。これはＩ型ＩＦＮとＮＦ－κＢのシグナル伝達との間のバランスを変化させることによって、下流の免疫を形づくることができる。これはＩＲＦ３、ＴＢＫ１、およびＴＲＡＦ６結合モジュールを含むＣＴＴにおける独立のモジュールを通して制御される。例えば、ヒトＳＴＩＮＧの残基Ｓ３６６（例えば配列番号３０５～３０９を参照）は、ＩＲＦ３の結合のために必要なＣＴＴにおけるＬｘＩＳモチーフの一部である一次ＴＢＫ１リン酸化部位であり、一方、残基Ｌ３７４を含む第２のＰｘＰＬＲモチーフはＴＢＫ１の結合のために必要である。ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲモチーフはすべての脊椎動物ＳＴＩＮＧ対立遺伝子において高度に保存されている。ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴを例えばタスマニアンデビルのＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えると、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘起するがＮＦ－κＢ応答を誘起しないＳＴＩＮＧ変異体が産生される。
本実施例では、免疫刺激細菌が、野生型（ＷＴ）ヒトＳＴＩＮＧ（例えば配列番号３０５～３０９を参照）と比較して増大したＩ型ＩＦＮシグナル伝達および／または低減されたＮＦ－κＢシグナル伝達を有するＳＴＩＮＧ変異体を発現するように操作される。ＳＴＩＮＧ変異体は非ヒト脊椎動物、例えば哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、または魚類の種由来であってよい。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が誘導される種には、それだけに限らないが、タスマニアンデビル［サルコフィルス・ハリシイ（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ）；配列番号３４９］、マーモセット［カリスリックス・ジャクス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）；配列番号３５９］、ウシ［ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）；配列番号３６０］、ネコ［フェリス・カツス（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）；配列番号３５６］,ダチョウ［ストルチオ・カメルス・オーストラリス（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）；配列番号３６１］,トキ［ニッポニア・ニッポン（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ）；配列番号３６２］、シーラカンス［ラチメリア・チャルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ）；配列番号３６３～３６４］、イノシシ［スス・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）；配列番号３６５］、コウモリ［ロウセツス・エジプチアクス（Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ）；配列番号３６６］、マナティー［トリケクス・マナツス・ラチロストリス（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ）；配列番号３６７］、ギンザメ［カロリンクス・ミリイ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ）；配列番号３６８］、およびマウス［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；配列番号３６９］が含まれる。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質はヒト細胞中で免疫シグナル伝達を容易に活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物において共有されていることを示している（例えばde Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175を参照）。これらの種由来のＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトＳＴＩＮＧより少ないＮＦ－κＢシグナル活性化および／またはこれより多いＩ型ＩＦＮシグナル活性化を誘起する（例えばde Oliveira Mann et al. (2019), Fig. 1Aを参照）。様々な非ヒト種由来の野生型または改変されたＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトおよび非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質のキメラと同様に、本明細書の免疫刺激細菌によって発現することができる。
種々の非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、非ヒトＳＴＩＮＧがヒトＳＴＩＮＧより低いＮＦ－κＢ活性化を有し、より高いＩ型インターフェロン活性化を有してもよいように改変される。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、細胞質核酸リガンド（例えばＣＤＮ）の不在下にＩ型ＩＦＮ活性が増大するか構成的に作用するような突然変異を含むように改変される。突然変異は、典型的にはヒトにおけるインターフェロン血症に付随する機能獲得型突然変異等のアミノ酸の突然変異である。対応する突然変異が非ヒト種のＳＴＩＮＧタンパク質に導入され、ここで対応するアミノ酸残基がアラインメントによって特定される。例えば、突然変異には、それだけに限らないが、配列番号３０５～３０９で表されるヒトＳＴＩＮＧの配列を参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａが含まれる。他の種由来のＳＴＩＮＧにおける対応する突然変異を下表に列挙する。得られる非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の変異体には、これらの突然変異の１つまたは複数が含まれ、ＣＴＴの置換およびＴＲＡＦ６結合部位の欠失が含まれてもよい。
ＳＴＩＮＧ変異体には、ホスホリル化部位におけるアミノ酸セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるリン酸化模倣である１つまたは複数の置換が含まれ、それにより増大したまたは構成的な活性がもたらされる。その他の突然変異には、ＳＴＩＮＧにおける３２４～３２６ ＳＬＳ→ＡＬＡ等のリン酸化部位の欠失または置換、およびリン酸化部位を無くしてＳＴＩＮＧにおけるＮＦ－κＢシグナル伝達を低減させるその他の置換が含まれる。さらに、ヒトＳＴＩＮＧの他の種由来のＳＴＩＮＧによるキメラも提供され、ここではヒトＳＴＩＮＧのＣ末端鎖（ＣＴＴ）が、より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性および／またはより高いＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有する別の種由来のＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられている。変異体ＳＴＩＮＧタンパク質は、ＮＦ－κＢシグナル伝達を低減させるためにＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位に欠失を含んでもよい。


例えば、改変されたＳＴＩＮＧ変異体には、突然変異Ｃ２０６Ｙ（配列番号３５０）またはＲ２８４Ｇ（配列番号３５１）を有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられる変異体（配列番号３５２）、突然変異Ｃ２０６Ｙ（配列番号３５３）またはＲ２８４Ｇ（配列番号３５４）を有し、ＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられるヒトＳＴＩＮＧ、ＴＲＡＦ６結合ドメイン［残基３７７～３７９（ＤＦＳ）に対応］に欠失を有する野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３５５）、突然変異Ｃ２０５Ｙ（配列番号３５７）またはＲ２８３Ｇ（配列番号３５８）を有するネコＳＴＩＮＧ、およびその他のそのような改変されたＳＴＩＮＧ変異体が含まれる。
ＳＴＩＮＧ突然変異のための対応するアミノ酸残基を決定するため、種々の非ヒト種由来の野生型ＳＴＩＮＧタンパク質の配列をそれぞれ野生型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の配列［配列番号３０５（Ｒ２３２対立遺伝子）または配列番号３０６（Ｈ２３２対立遺伝子）の対立遺伝子変異体の］とアラインさせた。アラインメントは、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｋａｌｉｇｎ／から入手可能のＫａｌｉｇｎ配列アラインメントツール、またはｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／から入手可能のＥＭＢＯＳＳニードル配列アラインメントツールを使用して実施した。図２～１４に、それぞれタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、トキ、シーラカンス、ゼブラフィッシュ、イノシシ、コウモリ、マナティー、ギンザメ、およびマウス種由来のＳＴＩＮＧタンパク質と比較したヒトＳＴＩＮＧの例示的な配列アラインメントを図示する。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッド変異体は樹状細胞において有意に増強されたＩ型インターフェロンとＮＦ－κＢ活性との比を示す
マウスにおいて最大レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞ケモカインＣＸＣＬ１０を誘発する最適のＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体を決定するため、ＳＴＩＮＧ突然変異体のパネルをマウス初代骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）において試験した。これらには、構成的に活性なヒトＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙ（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ；配列番号３５０）またはＲ２８４Ｇ（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ；配列番号３５１）を有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ、構成的ＧＯＦ突然変異体Ｃ２０５Ｙ（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ）またはＲ２８３Ｇ（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）を有するマウスＳＴＩＮＧ、構成的ＧＯＦ突然変異体Ｃ２０５Ｙ（ｃａｔＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ；配列番号３５７）またはＲ２８３Ｇ（ｃａｔＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ；配列番号３５８）を有するネコＳＴＩＮＧ、ならびにヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３７０）のＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ（配列番号３７１）のＣＴＴに置き換えられ、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ ｔａｚＣＴＴ、例えば配列番号３５２を参照）、またはヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ ｔａｚＣＴＴ、例えば配列番号３５３を参照）もしくはＲ２８４Ｇ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ、例えば配列番号３５４を参照)を含む変異体が含まれていた。構成的なＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ）またはＲ２８４Ｇ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）を有するヒトＳＴＩＮＧ変異体も含まれていた。
これらを試験するため、マウス骨髄を単離して１．５ｍＬのエッペンドルフ管に流し込み、１２００ＲＰＭで５分遠心分離して、骨髄性細胞を収集した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、次いで２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中で９６ウェルのＴＣ処理したプレートに播種した。２日ごとに培地の半分を新鮮な完全培地に交換した。６日後、非付着細胞をウェルからピペットで除き、トランスフェクションのためにＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中、１ウェルあたり１ｅ５細胞で９６ウェルプレートに再播種した。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤを使用し、メーカーの使用説明書に従って細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のパネルからの２００ｎｇのプラスミドＤＮＡならびにトランスフェクトしていない対照を、提供された緩衝液で希釈して０．０８μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合し、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定で）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。４８時間で上清を収穫して、フローサイトメトリーに基づくサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用してメーカーのプロトコールに従ってマウスＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）についてアッセイした。
下表に示すように、マウスＣＸＣＬ１０の最大の発現を誘起したコンストラクトは、ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含み、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴによる置換を含むヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）であった。ＣＸＣＬ１０の２番目に大きい発現は、ＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙを含むヒトＳＴＩＮＧ変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ）およびヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含むタスマニアンデビルＳＴＩＮＧコンストラクト（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）によって誘起された。ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６ＹおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）は、対応するマウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体（それぞれｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５ＹおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）より強力であり、これらは初代マウス樹状細胞において同じＧＯＦ突然変異を含むネコＳＴＩＮＧ突然変異体（それぞれｃａｔＳＴＩＮＧ Ｃ２０５ＹおよびｃａｔＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）よりも弱かった。
これらのデータは、タスマニアンデビル等の他の種から得られたＳＴＩＮＧタンパク質を構成的なＧＯＦヒトＳＴＩＮＧ突然変異と組み合わせて、強力なＴ細胞動員ケモカインを誘発することができることを実証している。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッド変異体はヒト単球において有意に増強されたＩ型インターフェロンとＮＦ－κＢ活性との比を示す
他の種由来のＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッド変異体を使用してＳＴＩＮＧ誘起I型インターフェロンとＮＦ－κＢのシグナル伝達との比を変化させることができることを実証するため、ヒト単球細胞系においてパネルを試験した。パネルには、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ）および構成的ヒトＧＯＦ突然変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するｈｕＳＴＩＮＧ突然変異体、野生型タスマニアンデビルＳＴＩＮＧ（ｔａｚＳＴＩＮＧ）および構成的ＧＯＦ突然変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するｔａｚＳＴＩＮＧ突然変異体、野生型ネコＳＴＩＮＧおよび構成的ＧＯＦ突然変異Ｃ２０５またはＲ２８３Ｇを有するネコＳＴＩＮＧ突然変異体、構成的ＧＯＦ突然変異Ｃ２０５ＹまたはＲ２８３Ｇを有するマウスＳＴＩＮＧ突然変異体、およびヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられ、野生型ヒトＳＴＩＮＧまたはヒトＧＯＦ ＳＴＩＮＧ突然変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを含む変異体が含まれていた。ＴＲＡＦ６結合ドメインに欠失を有する野生型ヒトＳＴＩＮＧ（残基３７７～３７９、ＤＦＳに対応、例えば配列番号３５５を参照）および野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧも含まれていた。
この実験のため、内因性ＳＴＩＮＧを失うように、また内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下にあって分泌型ルシフェラーゼであるＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼを発現するように変更されたＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）ＫＯ ＳＴＩＮＧ細胞を利用した。次いで構成的に活性なＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体を特定し、ＩＦＮ－βプロモーターによって誘起されるルシフェラーゼ活性の発現の測定によってランク付けした。これらの細胞は、内因性ＮＦ－κＢプロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）も発現し、ここでＮＦ－κＢのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体によって誘起されるＮＦ－κＢの活性は、細胞上清中のＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価することができる。
この実験のため、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤを使用し、メーカーの使用説明書に従ってＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）ＫＯ ＳＴＩＮＧ細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のパネル由来の２００ｎｇのプラスミドＤＮＡならびにトランスフェクトしていない対照を提供された緩衝液にて希釈し、０．０８μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合して室温で１５分インキュベートし、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定）、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。さらに、野生型ＳＴＩＮＧ変異体をＳＴＩＮＧアゴニストである３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（ＣＤＮ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（臨床用化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログ）ありまたはなしで処理し、これを１０μｇ／ｍＬで２４時間のインキュベーションの後に細胞に加えた。４８時間で上清を収穫し、メーカーのプロトコールに従ってＮＦ－κＢ－ＳＥＡＰおよびＩＦＮ－Ｌｕｃｉａレポーターシグナルについてアッセイした。簡単に述べると、１０μＬの細胞培養上清を５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（これはＳＥＡＰの測定に使用する）に加えた。ＮＦ－κＢの活性化は、ＮＦ－κＢ誘起ＳＥＡＰ活性をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で６５０ｎｍの吸光（Ａｂｓ）波長を測定することによって決定した。ＩＦＮ－ＬｕｃｉａからのＩ型インターフェロンの活性を測定するため、１０μＬの細胞培養上清を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３照度計を使用して定量される光シグナルを発するルシフェラーゼ反応のコエレンテラジン基質を含む５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）に加え、相対的光単位（ＲＬＵ）として表した。
下表に示すように、最大のI型ＩＦＮ応答は、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられ、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含む変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）から、ならびにＣＤＮ ＳＴＩＮＧアゴニストを含む野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ（ｚｆＳＴＩＮＧ ＷＴ＋ＣＤＮ）から観察された。しかし、極めて高いＮＦ－κＢシグナル伝達を有していた野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧと異なり、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体は高いＩ型ＩＦＮシグナル伝達とはるかに低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性とを有していた。より高いI型ＩＦＮとより低いＮＦ－κＢシグナル伝達との最良の比は、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含むタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ変異体（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）で見出された。

SD = 標準偏差
これらのデータは、ヒト単球において免疫抑制性ＮＦ－κＢ活性を最小化しながら有益なＩ型インターフェロン活性を増強するために、タスマニアンデビル由来のＳＴＩＮＧタンパク質等の非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質を使用し、これらをヒト構成的機能獲得型ＳＴＩＮＧ突然変異と組み合わせることをさらに実証している。
［実施例１８］
ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子の欠失によるネズミチフス菌リポタンパク質のノックアウト
膜表面リポタンパク質を除去するため、Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ遺伝子欠失を含む生存弱毒化ネズミチフス菌ＹＳ１６４６株を、ｌｐｐＡ（配列番号３８７）およびｌｐｐＢ（配列番号３８８）遺伝子を欠失するように操作した。これにより炎症促進性ＴＬＲ２活性化が低減し、これが免疫抑制性サイトカインを低減し、抗腫瘍適応免疫を改善する。以下に示すように、これは腫瘍におけるプラスミドデリバリーおよびコードされたタンパク質発現も増強する。
株の操作および特徴解析
ｌｐｐＡ遺伝子の欠失
上に詳細に記載したように、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株の染色体からｌｐｐＡ遺伝子を欠失させた。ｌｐｐＡ遺伝子に隣接する左手および右手の配列のそれぞれ２３１塩基および２００塩基を含む合成のｌｐｐＡ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１４８（配列番号２３１）と呼ばれるプラスミドにクローニングした。ｌｐｐＡ遺伝子の配列を配列番号３８７に示す。遺伝子配列を使用して、ＰＣＲ増幅のために適切なプライマーを設計した。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１４８にクローニングし、次いでｌｐｐＡ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｌｐｐＡ－１およびｌｐｐＡ－２によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、次いで温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔した細胞をＳＯＣ＋ＤＡＰ培地中に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天プレートに播種した。コロニーを選択し、プライマーｌｐｐＡ－３およびｌｐｐＡ－４を使用するＰＣＲによってノックアウト断片の挿入についてスクリーニングした。次いで選択したカナマイシン耐性株を４２℃で培養し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングすることによって、ｐＫＤ４６をキュアした。次いでＣｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド（ｐＪＷ１６８）の電気穿孔によってカナマイシン耐性マーカーをキュアし、ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した。続いて培養物を４２℃で増殖させることによって、ｐＪＷ１６８を無くした。次いで選択したｌｐｐＡノックアウトクローンを、破壊部位に隣接するプライマー（ｌｐｐＡ－３およびｌｐｐＡ－４）を使用してＰＣＲによってカナマイシンマーカーの喪失について試験し、電気泳動における移動性の評価をアガロースゲルにて実施した。株ＹＳ１６４６のこの突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡと命名した。
ｌｐｐＢ遺伝子の欠失
次いで上記の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡ株においてｌｐｐＢ遺伝子を欠失させた。ｌｐｐＢ遺伝子に隣接する左手および右手の配列のそれぞれ２２４塩基および２３１塩基を含む合成のｌｐｐＢ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１４８（配列番号２３１）と呼ばれるプラスミドにクローニングした。ｌｐｐＢ遺伝子の配列を配列番号３８８に示す。遺伝子配列を使用して、ＰＣＲ増幅のために適切なプライマーを設計した。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１４８にクローニングし、ｌｐｐＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｌｐｐＢ－５およびｌｐｐＢ－６によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡに電気穿孔によって導入した。次いでカナマイシン耐性遺伝子を、上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってキュアし、温度感受性プラスミドを非許容的温度での増殖によってキュアした。ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子ノックアウト配列を、それぞれｌｐｐＡ－３およびｌｐｐＡ－４ならびにｌｐｐＢ－７およびｌｐｐＢ－８と命名したプライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。株ＹＳ１６４６のこの突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢと命名し、またはニックネームをＹＳ１６４６ΔｌｐｐＡＢとした。
操作したネズミチフス菌リポタンパク質ノックアウト株のインビトロ特徴解析
ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢの欠失を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株を、ＬＢ中の一夜培養による増殖について評価した。増殖はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、３７℃で１５分ごとにＯＤ６００を読み取って測定した。結果は、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢがＬＢ中で親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株と同程度の増殖速度にて複製できることを実証した。これらの結果は、リポタンパク質の排除がインビトロでネズミチフス菌の適合性を低下させないことを実証している。
リポタンパク質の欠失は全身投与後のプラスミドの腫瘍へのデリバリーを増強する
ＴＬＲ２は血管内皮細胞において発現され、ＴＬＲ２の活性化は血管の透過性を増強するので、腫瘍コロニー形成に対するΔｌｐｐＡＢ改変および引き続くＴＬＲ２アゴニスムの低減の影響を評価した。ペイロードの発現に対する効果も評価した。以下に示すように、全身投与後、腫瘍のコロニー形成はやや低下したが、プラスミドデリバリーおよびコードされた遺伝子の発現は有意に増大した。
トリプルネガティブ乳がんのマウスモデルにおけるリポタンパク質ノックアウト株の影響を実証するため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス４匹）の４番目の乳腺脂肪体に、ＥＭＴ６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を同所接種した。１０日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、それぞれ分泌される［ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）］ルシフェラーゼタンパク質［ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）ルシフェラーゼ、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ］をＣＭＶプロモーターの制御下にコードするプラスミドを含む単一用量の１×１０７ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株をＩＶ注射した。ＩＶ投薬後７日目にマウスを安楽死させ、腫瘍をホモジナイズしてＬＢプレートに播種し、腫瘍組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は腫瘍組織１ｇあたり平均３．３×１０６ＣＦＵで腫瘍にコロニー形成した一方、リポタンパク質を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株は平均１．１８×１０６ＣＦＵ／ｇ腫瘍組織と、約２分の１に減少した腫瘍にコロニー形成した。
腫瘍へのプラスミドデリバリー、およびそれに続く異種遺伝子発現およびタンパク質分泌を測定するため、ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性を測定した。このため、ホモジナイズした腫瘍をＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ／Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の読み取りを使用してルシフェラーゼ活性について評価した。親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は平均発光相対光単位（ＲＬＵ）４４８２．６を誘起した一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株はほぼ１０倍に増大した平均３３，９２６．６ＲＬＵを誘起した。これらのデータは、腫瘍のコロニー形成を改善し、ペイロードの発現を増強するリポタンパク質欠失株の能力を実証している。
これらのデータは、リポタンパク質の欠失がＩＶ投薬の後で腫瘍のコロニー形成をやや低減させる一方、腫瘍におけるプラスミドデリバリーおよびペイロードの発現を有意に増強することを明らかにしている。これらのデータは、これらの遺伝子の欠失がコロニー形成を低下させるという当技術からの予想と逆に、リポタンパク質の欠失が腫瘍微小環境中で、および腫瘍中で、プラスミドデリバリーおよびタンパク質の発現を増強することを実証している。
［実施例１９］
サルモネラ完全ｐｕｒＩクリーン欠失遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）のｐｕｒＩ遺伝子は欠失しなかった。これは１６．６ｋｂｐ(キロ塩基対)のゲノム逆転事象をもたらすトランスポゾン（Ｔｎ１０）の挿入によって破壊し、それにより引き続いてゲノム中に２つの挿入配列（ＩＳ）エレメントを、１つはｐｕｒＩ（ｐｕｒＭ）遺伝子の中に、他はａｃｒＤ遺伝子の３’末端に直接隣接する遺伝子間領域における１６．６ｋｂｐ上流に、組み込んだ。２つのＩＳエレメントの間の領域は逆転されており、ｙｆｆＢ、ＤＣ５１＿２５６８、ｕｐｐ、ｕｒａＡ、ｙｆｇＥ、ｙｆｇＤ、ＤＣ５１＿２５７３、ｐｅｒＭ、ｐｕｒＣ、およびその他を含む１８個の遺伝子を含んでいる。遺伝子間領域における挿入配列エレメントは完全に機能的なトランスポサーゼをコードしている（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。治療株におけるこのようなトランスポゾンの存在は、潜在的な遺伝的安定性の懸念を提示する。これらの要素は、ヒト療法としての株の開発のために株から除去された。染色体のリエンゲージメントによって破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子への復帰の可能性を未解決のままにしている。
株ＹＳ１６４６のｍｓｂＢ遺伝子も完全には欠失しなかったが、ｐｙｋＡ遺伝子（ピルベートキナーゼをコードする）の伸長をもたらし、最後の５アミノ酸のコドンを１３個の新たなコドンに置き換える、遺伝子操作された５１１ｂｐ（９７２ｂｐの遺伝子の）の欠失によって破壊した（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤを改変して、ｐｕｒＩ遺伝子の残りの部分および株ＹＳ１６４６中に存在する２つのトランスポゾン関連挿入配列エレメントを欠失させた。ｐｕｒＩの完全ノックアウトを有する得られた細菌細胞は、親ＹＳ１６４６株におけるように遺伝子が破壊によって不活化されている細胞よりも、高い生存力を有することを以下に示す。
Ａ．ｐｕｒＩ遺伝子断片およびトランスポゾン関連挿入配列エレメントの欠失
ｙｆｆＢとｐｕｒＮ遺伝子との間に位置し、１）Broadway et. al (2014)によって得られた配列においてＤＣ５１＿２５８６と注記された１，２０９ｂｐのトランスポゾン挿入配列エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００７８０４およびＣＰ００８７４５を参照）、および２）残りの８９１ｂｐのｐｕｒＩ遺伝子断片（本明細書で大きなｐｕｒＩ遺伝子断片と称する）のうち７４０ｂｐを含む第１の領域を、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)を参照］の方法の改変を使用して欠失の標的とした。８９１ｂｐ（大きい）のｐｕｒＩ遺伝子断片のうち小さな１５１ｂｐの部分は、隣接する下流の遺伝子ｐｕｒＮへの影響を避けるためにそのままとした。ＤＣ５１＿２５８６挿入配列エレメントおよびｐｕｒＩ遺伝子断片のそれぞれ左手および右手領域に相同性の２８４および２６２ｂｐを含有するプラスミド、ｐＳＬ０１６５を、ＤＨ５－ａｌｐｈａコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングし、得られたベクターをｐＳＬ０１７４と命名した。次いでＤＣ５１＿２５８６挿入配列エレメントおよび大きなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウトカセットを、プライマーｐｕｒｍ－１およびｐｕｒｍ－２（それぞれ配列番号４１９および４２０、以下の表２を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。ＤＣ５１＿２５８６挿入配列エレメントおよび大きなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウト配列を、プライマーｐｕｒｍ－３およびｐｕｒｍ－４（それぞれ配列番号４２１および４２２、表２を参照）を使用するＰＣＲによって確認し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）と命名した。
ａｃｒＤとＤＣ５１＿２５６８遺伝子との間に位置し、１）Broadway et. al (2014)によって得られた配列においてＤＣ５１＿２５６６と注記された１，２０９ｂｐのトランスポゾン挿入配列エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００７８０４およびＣＰ００８７４５を参照）、および２）残りの２３１ｂｐのｐｕｒＩ遺伝子断片（本明細書で小さなｐｕｒＩ遺伝子断片と称する）を含む第２の領域を、Datsenko and Wanner[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)を参照］の方法の改変を使用して欠失の標的とした。ＤＣ５１＿２５６６挿入配列エレメントおよび小さなｐｕｒＩ遺伝子断片のそれぞれ左手および右手の領域との相同性を有する２４１および２６５ｂｐを含むプラスミドｐＳＬ０２１０を、ＤＨ５－ａｌｐｈａコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングし、得られたベクターをｐＳＬ０２１２と命名した。次いでＤＣ５１＿２５６６挿入配列エレメントおよび小さなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウトカセットを、プライマーａｃｒｄ－１およびｐｕｒｍ－５（それぞれ配列番号４２５および４２３、表２を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）に電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。ＤＣ５１＿２５６６挿入配列エレメントおよび小さなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウト配列は、プライマーｐｕｒｍ－６およびａｃｒｄ－３（それぞれ配列番号４２４および４２６、表２を参照）を使用するＰＣＲによって確認し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）の得られた突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｆｕｌｌ ｃｌｅａｎ）あるいはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩと命名した。

Fwd= フォワード; Rev = リバース; KO = ノックアウト
プラスミド情報
Ｂ．株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩは増強された注射用ストック細胞の生存能力を呈する
残りのｐｕｒＩ遺伝子配列断片およびトランスポゾン関連挿入配列エレメントの欠失の、細菌のインビトロ適合性に対する効果を評価するため、同じプラスミドを有する完全ｐｕｒＩ遺伝子欠失（Ｆ－ΔｐｕｒＩ）ありおよびなしのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株の細胞生存能力を比較した。
プラスミドＡＤＮ－６５７（ｐＡＴＩ１．７６ ＣＭＶ ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＿Ｔ２Ａ＿ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡ）またはプラスミドＡＤＮ－７５０（ｐＡＴＩ２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＿Ｔ２Ａ＿ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡ）のいずれかを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩの株の細胞生存力と、同じプラスミド（ＡＤＮ－６５７およびＡＤＮ－７５０）を発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株の細胞生存力を、凍結された注射ストックのための培養プロセッシング後の生存ＣＦＵを直接比較することによって評価した。プラスミドＡＤＮ－６５７は、マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃと、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧとのＣＴＴとの置換およびＧＯＦ突然変異Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）を有する改変ヒトＳＴＩＮＧキメラとをコードする。２つのペイロードは、Ｔ２Ａペプチドを含むバイシストロニックコンストラクトからＣＭＶプロモーターの制御下で発現される。コンストラクトはまた、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ｂＧＨｐＡ）も含む。プラスミドＡＤＮ－７５０は、ヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよび同じ改変ヒトＳＴＩＮＧキメラをコードし、これでは２つのペイロードの発現がＣＭＶプロモーターの制御下にあり、単一プロモーターシステムは、血管内皮増殖因子として知られる内因性ヒトＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）、両ペイロードをコードする核酸の上流に位置する１型コラーゲン誘起可能タンパク質（ＶＣＩＰ；配列番号４３４）ならびに２つのＯＲＦの間に位置するＴ２Ａペプチド配列を使用して達成される。
この実験のため、等価のＯＤ６００ｎｍ光学密度（ＯＤ）値の一夜定常相培養物１００μｌを使用して、通気キャップを有する２５０ｍｌのバッフル付き振盪フラスコに２５ｍｌの４ＸＹＴ培地を接種し、培養物を（２２５ＲＰＭにて）振盪しながら３７℃でほぼ６時間インキュベートした。等価のＯＤ６００ｎｍ値の定常相において培養物を収穫し、２回洗浄し、ＯＤ６００ｎｍ＝２に調節し、分注し、－８０℃で凍結した。翌日、各株の２つのアリコートを解凍してＯＤ６００ｎｍ値を測定し、株を寒天プレート上にプレーティングして、力価および生存率を決定した。生存率％はＯＤ６００ｎｍとＣＦＵ／ｍｌとの比から決定した。
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ－（ＡＤＮ－６５７）注射用ストックは、７７％生存可能であると決定されたが、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－６５７）注射用ストックは、６２％生存可能であると決定された。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ－（ＡＤＮ－７５０）注射用ストックは、７２％生存可能であると決定されたが、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－７５０）注射用ストックは、６３％生存可能であると決定された。
これらのデータは、親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと比較した、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩの同様または増強された適合性プロファイルを実証する。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩは、凍結注射用ストック調製の後で増強された生存率を呈し、ゲノム欠失が潜在的な遺伝子不安定性の問題を軽減するだけでなく、細胞の生存率の増大として見られる代謝上の利益を提供することを示している。
Ｃ．株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ親株と比較して、ブロス培地において同様の増殖特徴を呈する
残りのｐｕｒＩ遺伝子配列断片およびトランスポゾン関連挿入配列エレメントの欠失の細菌株のインビトロ適合性に対する効果を評価するため、プラスミドＡＤＮ－６５７（ｐＡＴＩ１．７６ ＣＭＶ ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＿Ｔ２Ａ＿ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡ）またはプラスミドＡＤＮ－７５０（ｐＡＴＩ２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＿Ｔ２Ａ＿ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡ）のいずれかを発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩの株と、同じプラスミド（ＡＤＮ－６５７およびＡＤＮ－７５０）を発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株の間でブロス培地成長を比較した。凍結注射用ストックを室温で解凍し、ＰＢＳで希釈することによって１×１０７ ＣＦＵ／ｍＬに対して正規化した。正規化試料１０μＬを使用して、技術的４連測定にて３００μＬのＬＢ培地を透明な平底９６ウェルプレートに接種した（１×１０５ ＣＦＵ／ウェル）。プレートを振盪しながら３７℃でインキュベートし、１６時間の経過にわたって１５分間隔にてＯＤ６００ｎｍ値をモニターした。ＯＤ６００ｎｍ値をプロットして増殖曲線を構築し、増殖のログ相の勾配を計算して各株についての倍加時間を決定した。
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ－（ＡＤＮ－６５７）、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－６５７）、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ－（ＡＤＮ－７５０）およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－７５０）の各々が、匹敵する増殖プロファイルをもたらし、定常相で同様の細胞密度に到達した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ－（ＡＤＮ－６５７）は、７７分の倍加時間を有し、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－６５７）は、６２分の倍加時間を有し、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ－（ＡＤＮ－７５０）は、７２分の倍加時間を有し、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－７５０）は、６３分の倍加時間を有していた。これらのデータは、親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと比較して、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩの同様の適合性プロファイルを実証する。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩは、親株と比較して、ブロス培地でわずかに増大した倍加時間を呈したが、同様の増殖曲線プロファイルおよび定常相細胞密度をもたらした。
［実施例２０］
遺伝子改変された株は、全ヒト血液において、および初代ヒトマクロファージにおいて炎症を低減する
免疫刺激細菌株の種々の変異体、株ＡＴＣＣ＃１４０２８（野生型（ＷＴ）ネズミチフス菌）、ＹＳ１６４６、ＹＳ１６４６Δａｓｄ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩおよび大腸菌株ＮＥＢ ５－アルファの投与に起因する炎症プロファイルを評価するために、ルシフェラーゼＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）をコードするプラスミド（ＣＭＶ ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））を有する各々を、ヒト血液とともに３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションは、２００μｌの血液および５ｘ１０３ ＣＦＵの細菌とともに９６ウェル形式で実施した。感染後２時間で、血液を３００相対遠心力（ｒｃｆ）で５分間遠心分離し、血清を、ヒト抗ウイルス性サイトカインビーズアレイ分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によってメーカーの使用説明書に従ってサイトカインプロファイル分析のために単離した。
種々の株ととものインキュベーション後のヒト血液から放出されたサイトカインのレベルの分析は、株ＹＳ１６４６ととものインキュベーションが、ＷＴ株ＡＴＣＣ１４０２８ととものインキュベーションと比較して、炎症性サイトカインＩＬ－６およびＴＮＦ－αのレベルの低減をもたらすことを示した。さらなるゲノム改変は、ヒト血液から放出された炎症性サイトカインのレベルをさらに低減した。

STDEV = 標準偏差
ネズミチフス菌などの細菌においてゲノム改変が、初代ヒト骨髄性細胞の感染の際に炎症にどのように影響を及ぼすかを決定するために、ヒトＭ２マクロファージのバクトフェクションを実施した。初代ヒト単球を、１００ｎｇ／ｍｌのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５日間分化させた。６日目に、細胞に１５０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦおよび６０ｎｇ／ｍｌのｈｕＩＬ－４を含有する追加の培地を４８時間補給して、Ｍ２マクロファージを生成した。次いで細胞に、４ＸＹＴ培地で３７℃にて一夜増殖させた定常相細菌株（上記の株）を１０のＭＯＩで感染させた。細胞に細菌を接種し、５００ｒｃｆで５分間遠心分離し、続いて、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを有する新鮮なＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地中でインキュベートした。上清を感染後０、２、６、２４および４８時間で収穫した。サイトカイン測定を、ＭＥＳＯスケール分析によってメーカーの使用説明書に従って実施した。
下表にまとめた結果は、感染後２４時間で、株ＹＳ１６４６、ＹＳ１６４６ΔａｓｄおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧに感染したマクロファージが最高レベルのＩＬ－６を放出し、ＷＴ細菌（株ＡＴＣＣ１４０２８）はより少ないＩＬ－６を誘導したことを示す。連続ゲノム改変は、ＩＬ－６分泌のレベルの低下をもたらし、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤは、ＩＬ－６の最低レベルを誘発する。ＴＮＦ－αを用いて同様の傾向が観察された。

［実施例２１］
ｃｓｇＤ欠失株は、ヒト血管内皮細胞において血管漏出を誘発する
血管漏出を促進する能力は、腫瘍脈管構造中への細菌の侵入を容易にするための、およびより大きな腫瘍コロニー形成を促進するための有利な特徴である。この例では、ΔｃｓｇＤ株がこの特徴を有することが示されている。
親株ＹＳ１６４６を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において自然免疫センシングを活性化する能力について、およびその後の内皮単層透過性における増大を刺激する能力について派生株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと比較した。これは、インビトロ血管透過性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＣＭ６４２）を使用して評価した。各々、分泌型ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）（ＥＦ－１α ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））をコードするプラスミドを含有する、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株を使用した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、メーカーの使用説明書に従って９６ウェルプレートチャンバー中で半透性コラーゲンコーティングメンブレンインサート上に５ｘ１０５個細胞／ウェルの濃度で播種した。内皮単層形成が確認されるまでコンフルエンシーを毎日モニタリングし、メンブレン孔を効率的に閉鎖すると決定された（播種後９６時間）。
細菌株を、通気キャップ５０ｍＬコニカルバイアルにおいて、３ｍＬの４ＸＹＴ培地（ＴＥＫＮＯＶＡ、カタログ番号２Ｙ１０８５）中で、振盪しながら３７℃で一夜増殖させて定常相とし、翌日ペレットにし、ＰＢＳに再懸濁することによって調製した。細菌試料をＯＤ６００ｎｍによって２．５×１０８ ＣＦＵ／ｍＬの濃度に対して正規化し、１００μＬの容量でＨＵＶＥＣインサートウェルに添加して、５０のＭＯＩを達成した。プレートを５００ｒｃｆで５分間遠心して、ＣＦＵのＨＵＶＥＣとの関わりを同期化し、次いでプレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いでインサートウェルにゲンタマイシンを２００μｇ／ｍＬの最終濃度に添加した。バクトフェクションの２４時間後に、インサート中の培地を収集し（サイトカイン分析のために保存し）、７５μＬのフルオレセインイソチオシアネート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン、１：４０希釈の）を添加し、混合物を暗所、室温で２０分間インキュベートした。レシーバートレイから培地を収集し、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの吸光波長でＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒで分析し、１：４０のＦＩＴＣ－デキストラン溶液を陽性対照として直接流した。
バクトフェクションの２４時間後、ＦＩＴＣ－デキストラン溶液ととものインキュベーション後に、操作された弱毒化したネズミチフス菌株を用いて処理されなかったウェル（すなわち、培地単独）は、極めて低い蛍光値（３５）をもたらし、コンフルエンシーを示し、透過性の破壊をほとんど示さなかった。親のＹＳ１６４６処理ウェルは、最大量のＦＩＴＣ－デキストランがメンブレンを通過することを許容し（蛍光＝１５５）、最強の自然免疫刺激および血管透過性の増大を示し、一方で操作された弱毒化ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤは、ＦＩＴＣ－デキストランが通過することをあまり許容しなかった（それぞれ、蛍光＝８４および９１）が、血管透過性を促進する能力を依然として維持した。
この効果がＨＵＶＥＣから放出されたサイトカイン、特に、ＩＬ－６に依存しているか否かを試験するために、感染の６時間後にＨＵＶＥＣ上清でヒト抗ウイルス性サイトカインビーズアレイ分析（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をメーカーの使用説明書に従って実施した。親のＹＳ１６４６株に感染したＨＵＶＥＣは、非感染対照（２７．１９ｐｇ／ｍＬ）と比較して極めて高いＩＬ－６レベル（１７６９．２ｐｇ／ｍＬ）を示した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株は、低レベルのＩＬ－６（５４３．３ｐｇ／ｍＬ）を誘起し、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株を用いた場合に最低量のＩＬ－６が観察された（２７２．８ｐｇ／ｍＬ）。したがって、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、血管漏出を誘発する炎症性サイトカインのより低いレベルをもたらすが、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株よりも高いレベルの漏出を実証した。したがって、血管漏出を促進する能力は、腫瘍脈管構造への細菌の侵入を容易にするための、およびより大きな腫瘍コロニー形成を促進するための重要な特徴である。本明細書において記載され、提供される株は、この特徴を有する。
［実施例２２］
ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体は、初代ヒトＭ２マクロファージにおけるＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）対ＩＬ－６比の増大およびＩＦＮ－β対ＩＬ－６比の増大を実証する
ヒトＭ２マクロファージにおける下流サイトカインシグナル伝達に対する種々のＳＴＩＮＧ機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異体（ＧＯＦ突然変異を有するキメラＳＴＩＮＧタンパク質を含む）の効果を決定するために、ＧＯＦ突然変異体を、上記の実施例８に記載されるｐＡＴＩ－１．７５（ｐＡＴＩ１．７５とも称される）ベクター中にクローニングし、次いでこれを発現のためにヒトＭ２マクロファージにトランスフェクトし、分泌された（発現された）サイトカインについて細胞上清をアッセイした。
健常なヒトドナーから単離した凍結ヒト単球を完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中で解凍し、室温で６００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した。単球を１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１０を含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。次いで単球（ウェルあたり８ｅ５～１ｅ６個細胞）を２４ウェルプレートに播種し、最終容量を７５０μＬとした。３日後、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１０を含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）７５０μＬを各ウェルに添加し、プレートをさらに４日間インキュベートした。７日目に、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ ＧｍｂＨ）をメーカーの使用説明書に従って使用して細胞をトランスフェクトした。５００ｎｇの、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のパネルならびにトランスフェクトしていない対照からのプラスミドＤＮＡを、提供された緩衝液で希釈し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、室温で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（三重測定）、プレートを３７℃にて５％ ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、上清を収穫し、フローサイトメトリーベースのヒト抗ウイルス性サイトカインビーズアレイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をメーカーのプロトコールに従って使用してヒトＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）およびＩＬ－６についてアッセイした。３実験の平均を計算し、ＩＰ－１０濃度をＩＬ－６濃度によって除することによってＩＰ－１０対ＩＬ－６の比を計算した。
下表にまとめた結果は、ＩＰ－１０対ＩＬ－６の最高比をもたらしたＳＴＩＮＧ変異体は、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体（すなわち、ＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴとの置換およびＧＯＦ突然変異Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを有する改変ヒトＳＴＩＮＧを含有するキメラＳＴＩＮＧタンパク質）であることを示す。ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ のＣＴＴとの置換を含有するＳＴＩＮＧ変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ ｔａｚＣＴＴ）は、同じ突然変異を有する対応する完全ヒトＳＴＩＮＧ変異体よりも高いＩＰ－１０対ＩＬ－６の比を呈し、抗腫瘍応答の改善を実証した。
STING変異体をコードするプラスミドによるM2マクロファージのトランスフェクションに続くIP-10とIL-6タンパク質発現との比
種々のＳＴＩＮＧ変異体の発現後のヒトＭ２マクロファージにおけるＩＦＮ－β対ＩＬ－６遺伝子発現の比を評価した。健常なヒトドナーから単離した凍結ヒト単球を完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中で解凍し、室温で６００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した。単球を２００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含有するＲＰＭＩ－１６４０＋１Ｘ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）＋５％ヒトＡＢ血清に再懸濁した。次いで単球（ウェルあたり８ｅ５～１ｅ６個細胞）を２４ウェルプレートに播種し、最終容量を７５０μＬとした。３日後、２００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含有する５％ヒトＡＢ血清＋ＮＥＡＡを有するＲＰＭＩ ７５０μＬを各ウェルに添加し、プレートをさらに４日間インキュベートした。７日目に、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬をメーカーの使用説明書に従って使用して細胞をトランスフェクトした。５００ｎｇの、改変されたキメラＳＴＩＮＧタンパク質を含むＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のパネルならびにトランスフェクトしていない対照からのプラスミドＤＮＡを提供された緩衝液で希釈し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、室温で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。陽性対照として、臨床化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログであるＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で細胞に添加した。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（三重測定で）、プレートを３７℃にてＣＯ２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。
トランスフェクションの４８時間後、ｑＰＣＲのために細胞を収穫し、３５０μＬの、ベータ－メルカプトエタノール（Ｑｉａｇｅｎ）を有する緩衝液ＲＬＴ溶解緩衝液を用いて溶解した。ＲＮＡ抽出を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを以下の改変を加えて使用して実施した。キットには、全ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するゲノムＤＮＡ排除工程が含まれていた。総ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度も、Ａ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。ＲＮＡは逆転写を実施するまで凍結解凍せずに－８０℃にて保存した。
ｃＤＮＡの合成は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＲＴ－ｑＰＣＲのためのｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って０．５～１μｇの鋳型ＲＮＡから２０μＬの反応において実施した。ｑＰＣＲはＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて実施した。ヒトＩＦＮβ１（ｈｕＩＦＮβ１；アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＥＰ００５４１１２；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の、およびｈｕＩＬ－６（アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＥＰ００５１９３９；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のプライマーをｑＰＣＲに使用した。ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒｍｉｘまたはｉＱ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のいずれかを使用して、プロトコールごとにｑＰＣＲ反応（２０μＬ）を実施した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的な熱サイクリングプログラムは、９５℃、１５０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、１５秒と６０℃、５５秒との３９サイクルからなっていた。標的ｍＲＮＡの定量は、アクチン参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＥＰ００３６２８０）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的（ｈｕＩＦＮβまたはｈｕＩＬ－６）と参照（アクチン）遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは、処置（トランスフェクション）のΔＣｑ値を非処置（すなわち、トランスフェクトしていない）対照のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。ＩＦＮβ ΔΔＣｑ対ＩＬ－６ ΔΔＣｑの比を下表に示す。
下表にまとめた結果は、スクリーニングしたＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のすべてのうち、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体が、免疫刺激性ＩＦＮ－β対炎症性ＩＬ－６発現の最高の比をもたらすことを示す。さらに、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴとの置換を含有するキメラＳＴＩＮＧコンストラクト（例えば、ｈｕＳＴＩＮＧ ｔａｚＣＴＴ）は、全般的に、同じＧＯＦ突然変異（複数可）を含む対応する完全ヒトＳＴＩＮＧコンストラクトよりも高いＩＦＮ－β対ＩＬ－６発現の比を誘起した。
ＩＦＮ－βの発現の増大は、ＩＲＦ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の増大を示し、免疫刺激性であり、有益であるが、一方で、ＩＬ－６発現の減少は、ＮＦ－κＢシグナル伝達の低減を示し、炎症性であり、抗腫瘍応答に寄与しない。ＩＦＮ－β対ＩＬ－６発現のより高い比は、抗腫瘍／抗ウイルス型応答の増大および炎症促進反応の減少を示す。したがって、ＳＴＩＮＧタンパク質におけるＣＴＴの置換ならびに機能獲得型突然変異は、ＳＴＩＮＧタンパク質の抗腫瘍活性を、ひいては、免疫刺激性細菌を増大する。
STING変異体によるM2マクロファージのトランスフェクションに続くIFN-βとIL-6遺伝子発現との比

［実施例２３］
ＩＬ－１５受容体－αおよびＩＬ－１５単鎖融合タンパク質の設計
ヒトタンパク質またはマウスタンパク質を含有する融合タンパク質を調製した。マウスタンパク質は、マウスモデルにおいて使用するためのものであり、ヒトタンパク質は、ヒト治療薬として使用されるべき免疫刺激性細菌におけるコーディングのためのものである。
ヒトＩＬ－１５単鎖（ｓｃ）に融合されたヒトＩＬ－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）を、以下のとおりに設計した。ＩＬ－１５－Ｒαのリーダー配列およびｓｕｓｈｉドメイン（およびＩＬ－１５Ｒαの追加の１３アミノ酸残基；例えば、Bouchaud et al. (2008) J. Mol. Biol. 382(1):1-12を参照されたい）に対応するヒトＩＬ－１５Ｒα（配列番号４０１）のアミノ酸残基１～１０８を、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの４つの反復（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）を有するＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーとインフレームで加えた。完全成熟ヒトＩＬ－１５ｓｃに対応し、リーダー配列またはプロペプチドを含まず、配列番号４０３のアミノ酸残基４８～１６２に対応するポリペプチド配列をリンカーの後ろに加えた。得られたヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ融合タンパク質の配列（配列番号４０４）は以下の通りである：
ここで、ヒトＩＬ－１５Ｒαの残基１～１０８に対応する残基には下線が引かれており、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは太字であり、ヒトＩＬ－１５の残基４８～１６２に対応する残基には二重下線が引かれている。
同様に、マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ融合タンパク質（配列番号４０７）を、マウスＩＬ－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）タンパク質の一部分の、マウスＩＬ－１５単鎖（ｓｃ）タンパク質の一部分への融合によって調製した。ＩＬ－１５－Ｒαのリーダー配列およびｓｕｓｈｉドメインを含む、マウスＩＬ－１５Ｒαのアミノ酸残基１～１３２（配列番号４０５）を、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーとインフレームで加えた。完全成熟マウスＩＬ－１５ｓｃに対応し、リーダー配列またはプロペプチドを含まず、配列番号４０６のアミノ酸残基４９～１６２に対応するポリペプチド配列を、リンカーの後ろに加えた。マウスモデル実験のために使用した、得られたマウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ融合タンパク質（配列番号４０７）の配列は以下の通りである：
ここで、マウスＩＬ－１５Ｒαの残基１～１３２に対応する残基には下線が引かれており、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは太字であり、マウスＩＬ－１５の残基４９～１６２に対応する残基には二重下線が引かれている。
［実施例２４］
ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃは、結腸直腸癌のマウスモデルにおける腫瘍再チャレンジから治癒効果および保護を誘起する
この実施例は、ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ融合タンパク質（本明細書においてＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαとも称される）をコードする免疫刺激性細菌が単剤療法としての抗腫瘍有効性を誘導することを実証する。これを実証するために、マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ）をコードするプラスミドを含有するネズミチフス菌株を調製した。皮下（ＳＣ）側腹部ＭＣ３８結腸直腸腺癌モデルにおいて安全性および有効性について、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株（すなわち、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ；マウスモデルにおいて実施された実験のためにマウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃを使用した）を、ＰＢＳ対照に対して比較した。この研究のために、６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（群あたり５匹のマウス）にＭＣ３８細胞（１００μＬのＰＢＳ中、５×１０５個細胞）を右側腹部にＳＣ接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、２×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ株をまたはＰＢＳ媒体対照を８日目に静脈内（ＩＶ）注射した。腫瘍測定および体重を、週２回記録した。
結果は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ株が、単回ＩＶ注射後に５０％治癒（４／８対ＰＢＳの０／８、ｐ＝０．００５、２１日目）を実証したことを示した。腫瘍移植の６６日後に（ＩＶ投薬後５７日目）、治癒したマウス（Ｎ＝４）に反対側の側腹部に５×１０５個のＭＣ３８細胞を再移植し、腫瘍増殖をナイーブな、週齢を一致させたマウスに対して比較した（Ｎ＝５）。再移植後３０日目までに、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃを用いて治癒した群中のすべてのマウスは、腫瘍がないままであったが、ナイーブ群のすべてのマウスは、最大腫瘍容量に到達した。これらのデータは、免疫刺激性細菌、例えば、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃによるＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ融合タンパク質のデリバリーの強力な、治癒的効果を実証し、また結腸直腸癌のモデルにおける耐久性保護的免疫記憶の誘導を実証する。
［実施例２５］
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖと比較してＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４およびＣＤ８６／ＣＴＬＡ－４相互作用の優れた封鎖を示す
イピリムマブのアミノ酸配列を使用して、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的なｓｃＦｖ－Ｆｃ（核酸およびタンパク質の配列についてそれぞれ配列番号４２７および４２８を参照）を設計した。イピリムマブはヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する完全にヒトのＩｇＧ１κモノクローナル抗体であり（例えば米国特許出願公開第２００２／００８６０１４号および米国特許第６，９８４，７２０号において１０Ｄ１と命名された抗体を参照）、ＣＴＬＡ－４‘のＣＤ８０（Ｂ７．１またはＢ７－１としても知られている）およびＣＤ８６（Ｂ７．２またはＢ７－２としても知られている）との免疫阻害性相互作用をブロックする。
イピリムマブｓｃＦｖ抗体断片（配列番号４２９を参照）を生成するため、イピリムマブの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を２０アミノ酸長さのグリシン－セリン（ＧＳ）リンカー［ＧＧＧＧＳ）４］に連結した。ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片（配列番号４２８を参照）を生成するため、イピリムマブｓｃＦｖの可変重鎖を、ヒンジ領域の遊離のシステインのセリンへの突然変異（配列番号４２８の２７２位における）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃに連結した。リーダー配列（ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ；配列番号４２８の残基１～２０に対応)は、ヒト免疫グロブリンカッパ可変３～２０（ＩＧＫＶ３－２０）タンパク質の配列から誘導した。配列はＧｅｎＳｃｒｉｐ ＧｅｎＳｍａｒｔ（商標）Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツールを使用してコドン最適化した。
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの中和能力を、抗体断片のそれぞれのＣＴＬＡ－４とそのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用をブロックする能力を測定する競合的ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ(ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分を欠く)の中和能力と比較した。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、適正な試薬：ＤＮＡ比にて、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ抗体断片コンストラクトをコードする３μｇのＤＮＡによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含まない培養上清を収穫し、濾過し、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片の封鎖活性を評価する競合的ＥＬＩＳＡに使用した。
競合的ＥＬＩＳＡのため、高タンパク質結合性９６ウェルプレートを濃度１００ｎｇ／ｍｌのマウスＣＤ８０またはＣＤ８６組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を一夜、４℃でコートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて１回洗浄し、ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて室温で、１時間ブロックした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて１回洗浄した。抗ＣＴＬＡ－４抗体断片のそれぞれを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清を１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＣＴＬＡ－４－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合してウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１抗体をウェルに加え(Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、検出試薬［３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］をウェルに加えた。硫酸（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて酵素反応を停止し、光学密度を４５０ｎｍで読み取った。
競合的ＥＬＩＳＡの結果を下表にまとめる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－ＦｃはＣＴＬＡ－４のＣＤ８６への結合を７５．５％ブロックし、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０への結合を４０．６％ブロックした一方、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖはＣＴＬＡ－４のＣＤ８６への結合を３２．５％ブロックし、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０への結合を７％ブロックした。両方の抗体断片にてより高度のＣＤ８６／ＣＴＬＡ－４ブロッキング活性（ＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４ブロッキング活性と比較して）が観察され、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃにて抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖと比較した場合、優れた中和活性が観察された。
競合的ELISA結果
９Ｄ９クローン由来の抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（配列番号４３０）および抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号４３１）も、対応するヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体断片について上記で論じたように調製した。ｓｃＦｖは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを介して連結されたＩｇＫリーダーマウス配列とクローン９Ｄ９由来のＶＬおよびＶＨドメインとを含む。ｓｃＦｖ－ＦｃはＶＨドメインに連結されたマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃも含む。
本明細書で提供する免疫刺激細菌の中には、本明細書で提供する抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ抗体断片および抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体およびその断片をプラスミド上でコードする免疫刺激細菌、ならびに他の治療用産物をコードする核酸分子との組合せが含まれる。
［実施例２６］
コードされた治療用産物の高レベルのマルチプレックス発現のための最適化された発現カセット
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）として知られるエレメントは、リボソーム結合を増強することおよび５’ｍＲＮＡキャップを模倣することによるｍＲＮＡの安定化によってタンパク質翻訳を促進できる。ウイルスおよび哺乳動物細胞由来のＩＲＥＳエレメントは周知である。これらのうち、血管内皮増殖因子として知られる内因性ヒトＩＲＥＳおよび１型コラーゲン誘起可能タンパク質（ＶＣＩＰ）はこれまで、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼをコードするバイシストロニックベクターからの発現を増強すると実証され、下流遺伝子（すなわち、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳの後ろにコードされた）であったウミシイタケルシフェラーゼは、第２のプロモーターを必要とせずインビトロおよびインビボで発現された（例えば、Licursi et al. (2011) Gene Therape 18(6):631-636を参照されたい）。
バイシストロニックおよびポリシストロニックコンストラクトが２Ａペプチドを含有する、ヒトもしくはマウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴまたはヒトもしくはマウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴおよび抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの組合せを含有するプラスミドを、単一発現(expresser)制御に対する各コードされるペイロード／産物の発現について試験した。さらに、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳを含有する組合せコンストラクトも試験した。
内因性ＳＴＩＮＧを含有せず、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下に配置された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ＩＳＲＥのコード配列がノックイン技術を使用してＳＥＡＰ ＯＲＦによって置換されている、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。したがって、ＳＴＩＮＧ活性は、Ｉ型ＩＦＮによって誘導されたＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価できる。２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞はまた、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に配置されたＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ、分泌型ルシフェラーゼも発現し、ＩＦＮ－βのコード配列は、ノックイン技術を使用してＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼＯＲＦによって置換されている。これによって、ＩＦＮ－βの発現をモニタリングすることによってＳＴＩＮＧ活性の評価が可能となる。これらの細胞を使用して、ＩＳＲＥ誘導性ＳＥＡＰ産生および／またはＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼのＩＦＮ－β依存性発現をモニタリングすることによって、ＳＴＩＮＧ活性を評価できる。２つのレポータータンパク質、ＳＥＡＰおよびＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼは、標準的なアッセイおよび検出試薬、例えば、それぞれ、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）およびＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して細胞上清において測定できる。
細胞を、ウェルあたり２００，０００個細胞でポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベートして、８０％コンフルエンシーを達成した。翌日、３００ｎｇの各プラスミドＤＮＡおよび４０ｎｇのＣＭＶ－ＧＦＰベクター（すなわち、ＣＭＶプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質をコードするベクター）を無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、非トランスフェクトウェルは、陰性対照として働いた（二連測定で）。各サンプルからの細胞培養上清は、トランスフェクションの４８時間後に収集した。
ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体のＳＴＩＮＧ活性を、ＩＳＲＥ－ＳＥＡＰおよびＩＦＮ－β－Ｌｕｃｉａ（商標）レポーターシステムを使用して評価した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性（ＳＴＩＮＧによって誘起される）は、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激ＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価した。２０μＬの細胞培養上清を、ＳＥＡＰを測定するために使用する１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＭＥＴＥＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光波長にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性（ＳＴＩＮＧによって誘起される）はまた、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ産生をモニタリングすることによって評価した。２０μＬの細胞培養上清を、５０μＬの、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定するために使用されるＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、発光設定でＩＦＮβ誘起Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定することによって決定した。
細胞培養上清はまた、ヒトまたはマウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの発現について（実施例２３を参照されたい）、およびヒトまたはマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現について（実施例２５を参照されたい）評価した。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについて、マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）をキット使用説明書によって使用した。ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについては、ヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ ＥＬＩＳＡ （Ｒ＆Ｄ）をキット使用説明書によって使用した。ヒトおよびマウスＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる直接ＥＬＩＳＡを、抗ヒトＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞の細胞培養上清で実施して、これらのタンパク質の発現レベルを測定した。
ＧＦＰ産生をフローサイトメトリーによって検出し、トランスフェクションを互いに対して正規化するために使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄した。次いで細胞をＤＡＰＩ（死滅／生存染色）を有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで再懸濁した。フローサイトメトリーデータは、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
下表に示すように、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体を含有するすべてのコンストラクトは、ＩＳＲＥ－ＳＥＡＰレポーター活性およびＩＦＮβ－Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼレポーター活性を呈した。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せの発現のためにＶＣＩＰ ＩＲＥＳおよびＴ２Ａｐぺプチドを含有する、２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴと呼ばれるコンストラクトは、ＧＦＰ同時トランスフェクションによって正規化された場合に最高発現レベルのｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃをもたらす。同様に、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せの発現のためにＶＣＩＰ ＩＲＥＳおよびＴ２Ａペプチドを含有する、２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴと呼ばれるコンストラクトは、ＧＦＰ同時トランスフェクションによって正規化された場合に最高発現レベルのｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃをもたらす。１．７６ ＣＭＶ ｍｕ抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃと呼ばれるコンストラクトは、ＧＦＰ同時トランスフェクションによって正規化された場合に、マウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの最高レベルの発現をもたらし、１．７６ ＣＭＶ ｈｕ 抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃと呼ばれるコンストラクトは、ヒト抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの最高レベルの発現をもたらす。
HEK293T STING Null細胞における、GFP同時トランスフェクションによって正規化した、STING活性、IL-15Rα-IL-15c濃度および抗CTLA-4 scFv-Fc濃度の測定




SD = 標準偏差
*NA = 該当なし
［実施例２７］
ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せをコードする発現プラスミド
ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの最高発現を有するプラスミド（複数可）を同定するために、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよび／もしくはｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴを、異なる２Ａペプチド（例えば、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）および／もしくは異なる転写後調節エレメント（例えば、ＨＰＲＥまたはＷＰＲＥ）および／もしくは異なるポリ（Ａ）テール（例えば、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）（ｂＧＨｐＡ）またはサルウイルス４０ポリ（Ａ）（ＳＶ４０ｐＡ））とともにコードする核酸分子を含有する、ならびに／またはＶＣＩＰ ＩＲＥＳを含有するプラスミドをクローニングした。さらに、一部のコンストラクトでは、ＲＲＫＲおよびＲＡＫＲを含む短いペプチドスペーサーおよび種々の長さの他のスペーサーが、第１のペイロード（すなわち、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）をコードする核酸の後ろ、および２Ａペプチドをコードする核酸の前にコードされる。ＲＲＫＲおよびＲＡＫＲは、設計されたフューリンプロテアーゼ切断部位であり、２Ａペプチド配列の適切なプロセシングを促進する位置に配置された。プラスミドは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩＳＧ／ＫＩ－ＩＦＮβ）細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）におけるトランスフェクションによって発現および機能性についてまず評価した。
内因性ＳＴＩＮＧを含有せず、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下に配置された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ＩＳＲＥのコード配列がノックイン技術を使用してＳＥＡＰ ＯＲＦによって置換されている、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞（ＩＳＧ－ＳＥＡＰ／ＫＩ－［ＩＦＮ－β］Ｌｕｃｉａ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。上記で論じられたように、２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞はまた、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に配置されたＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ、分泌型ルシフェラーゼも発現し、ＩＦＮ－βのコード配列は、ノックイン技術を使用してＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼＯＲＦによって置換されている。細胞を、ウェルあたり２００，０００個細胞でポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベートして、８０％コンフルエンシーを達成した。翌日、３００ｎｇの各プラスミドＤＮＡおよび４０ｎｇのＣＭＶ－ＧＦＰベクターを無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、非トランスフェクトウェルは、陰性対照として働いた（二連測定で）。各サンプルからの細胞培養上清は、分析のためにトランスフェクションの４８時間後に収集した。
ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ改変ＳＴＩＮＧタンパク質のＳＴＩＮＧ活性を、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ（ＩＳＧ－ＳＥＡＰ／ＫＩ－［ＩＦＮ－β］Ｌｕｃｉａ）レポーター細胞株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて評価した。これらの細胞を使用して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性（ＳＴＩＮＧによって誘起される）は、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ産生をモニタリングすることによって評価される。ＩＦＮβ誘導は、ＩＦＮβ－Ｌｕｃｉａレポーターを用いて測定される。２０μＬの細胞培養上清を、５０μＬの、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定するために使用されるＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、発光設定でＩＦＮβ誘起Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定することによって決定した。細胞培養上清はまた、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によってキットの使用説明書によってヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの発現について評価した。
ＧＦＰをフローサイトメトリーによって検出し、ＧＦＰの発現レベル（蛍光によって測定されたような）を使用して、トランスフェクションを互いに対して正規化した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄した。次いで細胞をＤＡＰＩ（死滅／生存染色）を有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで再懸濁した。フローサイトメトリーデータは、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
２つの下表に示されるように、２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれるプラスミドコンストラクトは、ＩＦＮβ－Ｌｕｃｉａ（商標）レポーターからの最高の正規化された発光値（第１の下表を参照されたい）およびまた、ＥＬＩＳＡによって決定されたような発現されたｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの最高の正規化された濃度（第２の下表を参照されたい）をもたらした。
第１の下表に示すように、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃのみ（およびＳＴＩＮＧ変異体なし）をコードするコンストラクトは、予測されるように、ＳＴＩＮＧ誘起Ｉ型ＩＦＮ活性を示さない。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴのみをコードするコンストラクトは、高レベルのＳＴＩＮＧ誘起Ｉ型ＩＦＮ活性を示す。両方のペイロードをコードするコンストラクトについては、Ｐ２ＡペプチドのＷＰＲＥとの組合せは、Ｔ２ＡおよびＰ２ＡのＨＰＲＥとの組合せまたはＴ２ＡのＷＰＲＥとの組合せよりも高いレベルのＳＴＩＮＧ活性（すなわち、より高いレベルのＳＴＩＮＧの発現）をもたらす。さらに、ｂＧＨポリ（Ａ）テールを含有するコンストラクトを用いた場合に、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールよりも高いレベルのＳＴＩＮＧ活性が観察された。短いペプチドスペーサー、例えば、ＲＡＫＲまたはＲＲＫＲの付加によって、ＳＴＩＮＧ活性のレベルが、これらのスペーサーを含有しない同じコンストラクトと比較してわずかに増大される。ある特定のコンストラクト、例えば、２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡ；２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｐ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡ；２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＷＰＲＥ ｂＧＨｐＡ；２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＷＰＲＥ ＳＶ４０ｐＡ；および２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ ＲＡＫＲ－Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれるものでは、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳの付加によって、ＳＴＩＮＧ活性のレベルが、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳを含有しない同じコンストラクトと比較して増大される。
第２の下表に示すように、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの発現レベルは、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールよりもｂＧＨポリ（Ａ）テールを含有するコンストラクトからより高く、一般に、ＷＰＲＥを含有するコンストラクトは、ＨＰＲＥを含有する同じコンストラクトよりも高いｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの発現レベルをもたらす。ＣＭＶ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡをコードするコンストラクトにおける、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃをコードする核酸配列の後ろへのＲＡＫＲ短いペプチドスペーサーの付加は、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの発現レベルを増大した。２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｐ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ＳＶ４０ｐＡと呼ばれるものを除くすべてのコンストラクトにおいて、コンストラクトの上流のＶＣＩＰ ＩＲＥＳの付加（２Ａペプチドに加えた）は、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの有意に増大した発現をもたらす。例えば、１．７６ ＣＭＶ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ ＶＣＩＰ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれるコンストラクトにおける、２Ａペプチドの、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳとの置換は、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの同様の発現レベルをもたらす。例えば、１．７６ ＣＭＶ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃより長いスペーサーＶＣＩＰ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれるコンストラクトにおける、２ＡペプチドのＶＣＩＰ ＩＲＥＳとの置換およびｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃをコードする核酸とＶＣＩＰ ＩＲＥＳの間へのより長いスペーサーの付加は、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの有意に増大した発現レベルをもたらす。コンストラクト中のスペーサー配列は、第１のＯＲＦの停止コドンと、第２のＯＲＦの上流のＶＣＩＰ ＩＲＥＳの間に配置される核酸配列である。例えば、下表において「新規スペーサー」と呼ばれるスペーサーは、配列ＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＣ（配列番号４０８）を有し、下表において「より長いスペーサー」と呼ばれるスペーサーは、配列
TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC（配列番号４０９）
を有する。
これらの結果は、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳの付加は、一般に、バイシストロニックコンストラクト上にコードされる第１のペイロードの発現レベルを増大し、ある特定のコンストラクト中の第２のペイロードの発現レベルを増大することを示す。
トランスフェクトしたHEK293T STING Null細胞における、IFNβ-Lucia(商標)レポーターからの発光レベルによって測定され、GFP同時トランスフェクションによって正規化したようなSTING誘導I型IFN活性


SD = 標準偏差
*新規スペーサー = ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
**より長いスペーサー = TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
トランスフェクトしたHEK293T STING Null細胞における、ELISAによって測定され、GFP同時トランスフェクションによって正規化したような、発現されたhuIL-15Rα-IL-15scの濃度


*新規スペーサー = ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
**より長いスペーサー = TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
異なるｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴコンストラクトによってヒトＭ２マクロファージにおいて誘起された下流ＩＦＮ－βシグナル伝達の相違を決定した。ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴをコードする核酸を、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳありおよびなしでベクター中にクローニングし、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃまたはｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴコード配列のいずれかの開始コドンの前に配置した。
健常なヒトドナーから単離した凍結ヒト単球を完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中で解凍し、室温で６００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した。単球を１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦを含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。次いで単球（ウェルあたり５ｅ５個細胞）を２４ウェルプレートに播種し、最終容量を５００μＬとした。５日後、３００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋６０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４＋６０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１０を含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２５０μＬを各ウェルに添加し、細胞をさらに２日間インキュベートした。７日目に、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドトランスフェクション試薬をメーカーの使用説明書に従って使用して細胞をトランスフェクトした。７５０ｎｇの、種々のプラスミドコンストラクトのパネルならびに「ＤＮＡなし」対照（ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードする）からのプラスミドＤＮＡを、提供された緩衝液で希釈し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、混合物を室温で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（三重測定）、プレートを３７℃にて５％ ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。４８時間で、細胞培養上清を収穫し、ヒトサイトカインパネルＵ－Ｐｌｅｘアッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をメーカーのプロトコールに従って使用してＩＦＮ－βについてアッセイした。３実験の平均を計算し、ＤＮＡなし対照からのバックグラウンドシグナルを差し引いて、正味のＩＦＮ－β発現レベルを計算した。
下表にまとめた結果は、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃのみをコードする（ＳＴＩＮＧなし）コンストラクトがトランスフェクトされたヒトＭ２マクロファージにおいてＩＦＮ－β発現を全く誘起しないことを示す。トランスフェクトされたヒトＭ２マクロファージにおいて最高レベルのＩＦＮ－β発現をもたらすコンストラクトは、ｐＡＴＩ２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれるコンストラクトである。このコンストラクト（ｐＡＴＩ２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれる）は、ｐＡＴＩ１．７６骨格を有し、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳを全く有さない、またはｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃのＯＲＦとｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの間にＶＣＩＰ ＩＲＥＳを有する（すなわち、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳが２Ａ配列と置き換わっている場合）コンストラクトよりも高いレベルのＩＦＮ－β発現をもたらす。ｐＡＴＩ２．１ ＣＭＶ ＶＣＩＰ ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ Ｔ２Ａ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡと呼ばれるコンストラクトは、Ｔ２Ａ配列の代わりにＰ２Ａ配列を含有する対応するコンストラクトと比較して、より高いＩＦＮ－βシグナルをもたらす。これらの結果は、２つのＯＲＦの上流にＶＣＩＰ ＩＲＥＳを、および２つのＯＲＦの間に２Ａ配列、特に、Ｔ２Ａを含有するバイシストロニックコンストラクトは、第２のコードされるペイロード（この場合には、改変ＳＴＩＮＧタンパク質）のより高い発現レベルをもたらすことを示す。
種々のコンストラクトによるヒトM2マクロファージのトランスフェクションに続くIFN-βタンパク質発現の正味のシグナル

*新規スペーサー = ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
**より長いスペーサー = TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
［実施例２８］
プラスミドデリバリーを改善する方法としてのホスホリパーゼＤの発現
その病態形成の一部として、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウムは、骨髄性細胞によって貪食され、病原性プログラムを活性化して、ファゴソームをサルモネラ菌含有液胞（ＳＣＶ）へと変更する。プラスミド上にコードされる遺伝子の異所発現には、ＳＣＶから核へのプラスミドの転位置が必要であるが、この転位置事象の機序はまだわかっていない。この実施例は、操作された免疫刺激性細菌からのプラスミド移動を改善するための操作アプローチを提供する。
発疹チフスリケッチアは、宿主サイトゾルに接近し、複製するためにファゴソームコンパートメントから脱出しなくてはならないグラム陰性細胞内病原体である。これまでの研究によって、分泌された発疹チフスリケッチア病原性因子、ホスホリパーゼＤ（Ｐｌｄ）をサルモネラ菌にクローニングして、ＳＣＶからの脱出を容易にすることができることが示されている（例えば、Whitworth et al. (2005) Infection and Immunity 73(10):6668-6673）。Ｐｌｄ（配列番号４３３）をコードするｐｌｄ遺伝子（配列番号４３２）が、ＳＣＶにおいて誘導されるｓｓａＧプロモーターの制御下に配置されて（例えば、Walthers et al. (2007) Molecular Microbiology 65(2):477-493を参照されたい）、細菌が貪食細胞中に送達された後の高発現を確実にした。この細菌発現カセットを、ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）およびＥＦ１α－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）と呼ばれる２つのＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポータープラスミドの骨格中にクローニングし、ヒトマクロファージにおいてプラスミドデリバリーを評価した。
感染細胞へのプラスミドデリバリーを測定するために、初代ヒト単球を、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５日間分化させた。６日目に、細胞に１５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび６０ｎｇ／ｍｌのｈｕＩＬ－４を含有する追加の培地を４８時間補給した。次いで、ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）＋ｐｌｄ、ＥＦ１α－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）またはＥＦ１α－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）＋ｐｌｄプラスミドの１つを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ細菌の定常相株を用いて、細胞をバクトフェクションした。細菌株を１００のＭＯＩ（多重感染度）で、４ＸＹＴ培地中３７℃で一夜増殖させた。感染細胞を５００ｒｃｆで５分間遠心分離し、次いで、３７℃で１時間インキュベートし、その後、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する新鮮なＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地中でインキュベートして、あらゆる細胞外細菌を排除した。感染の２４時間および４８時間後に、細胞上清を収穫し、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）ルシフェラーゼ量を測定した。細胞をまた、ＰＢＳ中、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘを用いて溶解し、プレーティングし、細胞内に残ったコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を数え上げた。
下表にまとめた結果は、ｐｌｄをコードする群（すなわち、ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ＋ｐｌｄプラスミド）から発現されたＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）のレベルは、ＣＭＶプロモーターの制御下に配置された場合に、感染の２４時間後で、ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼプラスミド単独から発現されたＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）のレベルよりも多く、この差は、感染の４８時間後に大きくなったことを示す。
ｐｌｄをコードする操作された免疫刺激性細菌を用いる細胞のバクトフェクションも、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）がＥＦ－１αプロモーターの制御下に配置された場合に、ｐｌｄを含まない対応する感染よりも高い発光レベルをもたらした。この効果は、ＣＭＶプロモーターを有する群において観察されたものよりも低く、これは、一部のｐｌｄ発現が、ＣＭＶプロモーターからの漏出によって増強されることを示す。
Pldをコードするプラスミド対Pldをコードしないものを含有する細菌株によって感染したヒトマクロファージの細胞上清におけるルシフェラーゼ発現レベルの比較

hpi = 感染後時間; SD = 標準偏差; RLUs = 相対光単位。
結果はまた、感染の２４および４８時間後に（ｈｐｉ）細胞内に残ったＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）＋ｐｌｄコード株のＣＦＵの数が、ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼプラスミド単独を有する細菌のＣＦＵ数よりも速い速度で減少したことを示し、これは、同一細胞内の各株の異なる運命を示す。
異なる時点で細胞の内側に残るCFU
細菌プラスミド中にホスホリパーゼＤをコードすることが、同じプラスミド上にコードされる免疫調節性ペイロードのデリバリーを増強するか否かを決定するために、ＲＡＷ－Ｄｕａｌ（商標）ＴＬＲ４－ＫＯ細胞（ＳＴＩＮＧを発現する；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に、ｐｌｄをコードする核酸ありおよびなしのプラスミドを含有する細菌株を感染させた。ＲＡＷ－Ｄｕａｌ（商標）ＴＬＲ４－ＫＯ細胞は、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）の制御下にＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼレポーターをコードする。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中で培養し、ウェル中に播種し、一夜接着させた。ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴをコードし、ｓｓａＧプロモーターの制御下にｐｌｄをコードする核酸を有する、または有さないプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株を使用して、上記のようにバクトフェクションを実施した。非感染細胞および５μｇ／ｍｌのＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰを用いて処理した非感染細胞を、それぞれ、陰性および陽性対照として使用した。感染の４８時間後、細胞上清を収穫し、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、発現されたＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼのレベルを測定した。
下表に示される結果は、ヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびＳＴＩＮＧ突然変異体ポリペプチドもコードするプラスミドから、感染の際にｐｌｄが発現された場合には、ＩＳＲＥ活性（Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ発現によって測定されるような）は、ｐｌｄ発現の不在下よりも高かったことを示す。ＩＳＲＥ活性は、ＳＴＩＮＧ誘起Ｉ型ＩＦＮ活性の尺度であり、したがって、ＳＴＩＮＧ変異体をコードするプラスミドのデリバリーを、および細胞におけるＳＴＩＮＧ変異体の発現を示す。ホスホリパーゼＤ（ｐｌｄ）の発現は、したがって、免疫調節性ペイロードもコードするプラスミドのデリバリーを増強する。
免疫刺激性細菌による免疫調節性ペイロードの組合せをコードするプラスミドのデリバリーに対するpld発現の効果

STDEV = 標準偏差
［実施例２９］
マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せおよびマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃとのその組合せは、骨髄性細胞からのＣＸＣＬ１０の分泌を誘起し、Ｔ細胞の活性化を誘起する
Ｔ細胞および骨髄性細胞の活性化および機能に対する免疫調節性ペイロードおよびその組合せの発現の影響を評価した。この実施例は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に対する（ＣＤ２５発現およびＩＦＮ－γ分泌の点で）、および骨髄性細胞による抗腫瘍Ｔ細胞の補充に関与する重要なケモカインであるＣＸＣＬ１０の分泌に対する、本明細書において提供される免疫刺激性細菌による種々の免疫調節性ペイロードの組合せのデリバリーの影響を記載し、実証する。分泌されたサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－βおよびＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）のレベルを、保護的抗腫瘍免疫の相関物として測定し、ＣＤ２５細胞表面発現をＴ細胞活性化のマーカーとしてモニタリングした。これは、マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ペイロードの種々の組合せをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトすること、トランスフェクトされた樹状細胞を、自己マウスＴ細胞とともに共培養することおよび次いで得られたサイトカイン同定することによって評価した。
免疫調節性ペイロード／タンパク質をコードするプラスミドは、単一ペイロードをコードするものならびにペイロードの組合せをコードするものを含んでいた。例えば、下表に示されるように、コードされるペイロードは、マウス（ｍｕ）ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体として、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１５複合体およびＩＬ－１５ｃｐｌｅｘとしても称される）；マウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（クローン９Ｄ９）；およびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ（ＧＯＦ突然変異Ｎ１５４ＳおよびＲ２８４ＧならびにヒトＳＴＩＮＧのＣ末端テール（ＣＴＴ）のタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴとの置換を有するヒトＳＴＩＮＧを含有するキメラタンパク質）；およびそれらの組合せを含んでいた。
ペイロードの組合せは、タンパク質が同一プロモーターの制御下でコードされるように、Ｔ２Ａおよび／またはＰ２Ａペプチドを使用して単一プラスミド上で発現される２つまたは３つのペイロードを含んでいた。ペイロードの組合せは、１）マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびヒトＳＴＩＮＧＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；ならびに２）マウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびヒトＳＴＩＮＧＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴを含んでいた。
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＳＴＩＮＧ欠損しているゴールデンチケットマウスから分化させ、細胞を、調査されたペイロードの種々の組合せをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞上清を収穫して、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＵ－Ｐｌｅｘアッセイプラットフォームを使用し、メーカーのプロトコールに従ってＢＭＤＣ培養上清中の分泌されたＣＸＣＬ１０のレベルを測定した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を測定するため、トランスフェクトしたＢＭＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（Ｈ－２Ｋｂ）制限ペプチドエピトープであるニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７－２６４）ペプチドでパルス処理した。Ｒａｇ１－／－ＯＴ－Ｉマウスから単離され、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ－２Ｋｂによって提示されるＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する脾臓Ｔ細胞を、共培養のためにＢＭＤＣに加えた。２４時間のＢＭＤＣ／Ｔ細胞共培養後、上清を収穫し、分泌されたＩＦＮ－γのレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のＵ－Ｐｌｅｘアッセイプラットフォームをメーカーのプロトコールに従って使用して測定した。
共培養された細胞も収穫し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートマウス抗ＣＤ２５抗体（クローンＰＣ６１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色して、ＣＤ２５ Ｔ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定した。
結果は下表にまとめられており、これは、トランスフェクトされたＢＭＤＣとともの共培養後の、種々の単一および組合せのペイロードをコードするプラスミドを用いるトランスフェクションに応じてＢＭＤＣによって分泌されたＣＸＣＬ１０のレベルならびにＣＤ８＋ Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮ－γのレベルおよびＴ細胞活性化のレベル（ＣＤ２５発現の点で）を示す。
結果は、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ単独が、ＢＭＤＣによる極めて高レベルのＣＸＣＬ１０分泌を誘起することを示す。マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃの、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴとの、またはマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ＋マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せも、ＢＭＤＣによる高レベルのＣＸＣＬ１０分泌を誘起する。
結果はまた、ヒトＴ細胞による高レベルのＩＦＮ－γの分泌を誘起する、およびＴ細胞の活性化（ＣＤ２５発現）を誘起する、コードされるペイロードの例示的組合せを示す。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せを用いて、効果の増大が観察された。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の活性化の増大およびＣＤ２５の発現をもたらす。これらの結果は、ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよび機能獲得型突然変異（単数または複数）を有し、ＮＦ－κＢシグナル伝達を低減するためのＣＴＴ置換を有する改変ＳＴＩＮＧキメラの組合せの腫瘍微小環境へのデリバリーが、有利な抗腫瘍免疫応答を増大し、望ましくない炎症反応を低減することを示す。

SEM = 平均の標準誤差
腫瘍常在性骨髄性細胞における、および／または腫瘍微小環境におけるペイロードの発現のための、本明細書において提供される免疫刺激性細菌による、または他のデリバリー媒体、例えば、腫瘍溶解性ウイルスまたはベクターによる、コードされるペイロードのこの組合せのデリバリーは、処置された対象における抗腫瘍応答の増大を提供する。以下の実施例においても示されるように、サイトカインと、キメラを含む機能獲得型突然変異を有する改変ＳＴＩＮＧタンパク質との組合せは、処置された対象において追加の有利な抗腫瘍応答をもたらす。
［実施例３０］
小分子ＳＴＩＮＧアゴニストと組み合わせたヒト組換えＩＬ－１５は、骨髄性細胞からのＣＸＣＬ１０の分泌を誘起し、Ｔ細胞の活性化を誘起する
この実施例はＴ細胞および骨髄性細胞の活性化および機能に対するヒト免疫調節性ペイロードおよびその組合せの発現の影響を示す。分泌されたサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γおよびＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）のレベルを、保護的抗腫瘍免疫の指標として測定した。この実施例は、骨髄性細胞による、抗腫瘍Ｔ細胞の補充に関与するケモカインであるＣＸＣＬ１０の分泌に対する、および抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌に対する、組換え単量体ヒトＩＬ－１５サイトカインおよび２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）、小分子ＳＴＩＮＧ（ｓｍＳＴＩＮＧ）アゴニストの影響を記載し、実証する。ｓｍＳＴＩＮＧアゴニストは、小胞体常在性ＳＴＩＮＧによるその認識に続いて、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を誘起するとわかっている環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）は、３’３’－サイクリックＡＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ）の２’３’－ビスホスホロチオエートアナログのＲｐ，Ｒｐ－異性体である。２’－５’、３’－５’混合結合の存在のためにＳＴＩＮＧに対してｃ－ｄｉ－ＡＭＰよりも高い親和性を有する。このアナログは、それを、宿主細胞中に、または全身循環中に存在するホスホジエステラーゼによる分解から保護するために、２つのホスホロチオエートジエステル結合を含有する。２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）は、関連細胞においてＩ型ＩＦＮおよびＣＸＣＬ１０産生を強力に誘起する。
ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏｄＤＣ）および自己ヒトＴ細胞を、小分子（ｓｍＳＴＩＮＧ）アゴニストおよび組換えＩＬ－１５とともに共培養し、得られた分泌されたサイトカインを同定した。ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏｄＤＣ）を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）樹状細胞培養キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの使用説明書に従って使用して６日間、ネガティブ単離した単球から分化させた。６日の分化後、ＭｏｄＤＣをヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）およびインフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）（ヒトＣＤ８Ｔ細胞のための拡大されたＣＥＦペプチドプール、ＭＡＢＴＥＣＨ）からの３２のＭＨＣクラスＩ制限ウイルスペプチドのプールでパルス処理し、その後、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を加え、２．５ｎＭの組換えヒトＩＬ－１５および／または５μｇ／ｍｌのｓｍＳＴＩＮＧを用いて処置した。樹状細胞をウイルスペプチドでパルス処理することは、樹状細胞にその細胞表面にウイルス抗原を提示させ、抗原特異的Ｔ細胞がＩＦＮ－ガンマを産生するように刺激する。４８時間のＭｏｄＤＣＴ細胞共培養後、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のＵ－Ｐｌｅｘアッセイプラットフォームをメーカーのプロトコールに従って使用して、細胞培養上清において分泌されたＩＦＮ－γおよびＣＸＣＬ１０のレベルを測定した。
下表にまとめた結果は、抗原特異的刺激の際のヒト樹状細胞によるＣＸＣＬ１０の分泌に対するＳＴＩＮＧ活性化およびヒトＩＬ－１５活性の相加作用を示す。結果はまた、ＳＴＩＮＧ活性化と、サイトカイン、例えば、ヒトＩＬ－１５との組合せが、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を相乗的に活性化し、活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞による高レベルのＩＦＮ－γ分泌を誘起することを示す。

SEM = 平均の標準誤差
［実施例３１］
機能獲得型ＳＴＩＮＧ変異体およびサイトカインの組合せは、抗腫瘍免疫応答を増強する
ヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せは、骨髄性細胞からのＩＦＮ－βの分泌を誘起しＴ細胞の活性化を誘起する
この実施例は、ヒトＴ細胞および樹状細胞の活性化および機能に対する、ＴＭＥにおける、および／または腫瘍常在性骨髄性細胞における発現のために送達される、コードされたヒト免疫調節性ペイロードおよびその組合せの影響を実証する。樹状細胞およびＴ細胞、例えば、それぞれＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－βによって分泌されるサイトカインのレベルを、保護的抗腫瘍免疫の相関物として測定した。この実施例は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に対する（ＩＦＮ－γ分泌によって実証されるような）、および抗腫瘍免疫応答に関与する重要な因子であるＩＦＮ－βの分泌に対する、例えば、本明細書において例示される免疫刺激性細菌による、および／または本明細書に記載される他のデリバリー媒体による、腫瘍微小環境への種々の免疫調節性ペイロードの組合せのデリバリーの影響を記載し、実証する。これは、ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏｄＤＣ）にペイロードの種々の組合せをコードするプラスミドをトランスフェクトすること、トランスフェクトされた樹状細胞を自己ヒトＴ細胞と共培養することおよび結果として分泌されたサイトカインを同定することによって達成された。免疫調節性ペイロード／タンパク質をコードするプラスミドは、単一ペイロードをコードするものおよびペイロードの組合せをコードするものを含んでいた。例えば、下表に示されるように、コードされるペイロードは、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ単独、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ単独およびｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃとｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せを含んでいた。
ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏｄＤＣ）を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）樹状細胞培養キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの使用説明書に従って使用して６日間、ネガティブ単離した単球から分化させた。６日の分化後、ＭｏｄＤＣに種々の調査されたペイロードおよびその組合せをコードするプラスミドを、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、ＭｏｄＤＣをヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）およびインフルエンザウイルス （Ｆｌｕ）（ヒトＣＤ８Ｔ細胞のための拡大されたＣＥＦペプチドプール、ＭＡＢＴＥＣＨ）からの３２のＭＨＣクラスＩ制限ウイルスペプチドのプールでパルス処理し、その後、細胞培養物に自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を加えた。トランスフェクトされた樹状細胞もヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）逆転写酵素由来の無関係のペプチドでパルス処理しＴ細胞のペプチド刺激の陰性対照として使用した。ＨＩＶ－１ネガティブドナー由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞を使用した。４８時間のＭｏｄＤＣ／Ｔ細胞共培養後、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のＵ－Ｐｌｅｘアッセイプラットフォームをメーカーのプロトコールに従って使用して、細胞培養上清においてＴ細胞によって分泌されたＩＦＮ－γのレベルを測定した。
別個の実験では、ＭｏｄＤＣに種々の調査されたペイロードおよびその組合せをコードするプラスミドを、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用してトランスフェクトし、４８時間培養した。トランスフェクションの４８時間後にトランスフェクトされたＭｏｄＤＣから細胞培養上清を収穫し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のＵ－Ｐｌｅｘアッセイプラットフォームをメーカーのプロトコールに従って使用して、分泌されたＩＦＮ－βのレベルを測定した。ヒト樹状細胞によるＩＦＮ－βの分泌に対する、コードされたペイロードの影響を分析するために、研究中のすべての他の群からプラスミド対照群（ベータ－アクチン）について測定されたＩＦＮ－βの濃度を差し引き、コードされたペイロードの活性のみに起因する正味のＩＦＮ－β濃度を提供した。
下表にまとめた結果は、ヒト樹状細胞によるＩＦＮ－βの分泌に対する、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ活性の組合せの相乗作用を示す。結果はまた、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および活性化Ｔ細胞からの高レベルの分泌されたＩＦＮ－γの誘起に対する、少なくとも相加的である、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組み合わされた効果を示す。

SEM = 平均の標準誤差
次の実施例では、コードされたペイロードの組み合わされた効果が、がんのマウスモデルにおいて観察された治癒によって証明されるような、相乗的結果につながることを示す。
［実施例３２］
ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴおよびマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの組合せは、トリプルネガティブ乳がんの高度難治性マウスモデルにおいて優れた抗腫瘍有効性を実証する
これまでの実施例（実施例３１）において観察された相互作用がこの実施例においてさらに示され、ペイロードの組合せが治癒の達成において相乗的に作用することを示す。種々のペイロードの組合せを、ＣＰＩ（免疫チェックポイント阻害剤）難治性トリプルネガティブ乳がんの同所性のＴ細胞排除された、転移性モデルにおけるインビボ有効性について評価した。この実験のために、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス８匹）の左乳腺脂肪体にＥＭＴ６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２７５５（商標））を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、１×１０６細胞）。７日齢で定着した乳腺腫瘍（約６５ｍｍ３の容積）を有するマウスに、単一用量の１×１０７ＣＦＵの種々のペイロードをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株を単独で、または１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブの毎週の腹膜内（ＩＰ）注射と組み合わせてＩＶ注射した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴもしくはｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ＋ｍｕ抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするプラスミドまたはβ－アクチンをコードする対照プラスミドを含有しており、ＰＢＳ対照を用いる処置と比較した。
結果は下表にまとめられている。ＰＢＳ処置マウスにおける腫瘍は、一様に増殖し、３１日目に最大腫瘍容量に到達した。対照β－アクチンプラスミドを用いるマウスの処置は、抗腫瘍有効性の多くのエビデンスを実証せず（５％腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）、２／８治癒）、ＩＰ抗ＰＤ－Ｌ１単独を用いる処置も実証しなかった（１７．９％ ＴＧＩ、１／８治癒）。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴをコードするプラスミドを含有する細菌株を用いてＩＶ処置されたマウスは、単剤療法有効性（５９．８％ ＴＧＩ、３／８治癒）を実証し、これは、ＩＰ 抗ＰＤ－Ｌ１の組合せを用いた場合に改善した（７７．３％ ＴＧＩ、５／８治癒）。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ＋ｍｕ抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの組合せも有意な単剤療法有効性を実証した（６２．４％ ＴＧＩ、４／８治癒）。
治療用ペイロードの組合せは、極めて良好に忍容され、この研究の間にマウスは体重減少しなかった。これらのデータは、チェックポイント阻害剤難治性トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の同所性、Ｔ細胞排除された、転移性モデルにおける、ＩＶ投与された、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せ単独、またはＩＰ投与された抗ＰＤ－Ｌ１を用いて増強された、およびｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ＋ｍｕ抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃをコードする免疫刺激性細菌のインビボ効力を実証する。
腫瘍成長阻害に対する、およびチェックポイント阻害剤不応性トリプルネガティブ乳がんを有するマウスの治癒率に対する、IP抗PD-L1を添加した、および添加しない免疫刺激性細菌によって送達された、コードされるペイロードの組合せの効果
より高用量のｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ併用療法の有効性を評価するために、また個々に投与されたｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの有効性との比較のためにフォローアップ研究を実施した。７日齢の定着した乳腺腫瘍を有するマウスに、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴまたはその組合せをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株を、３ｅ７ ＣＦＵの用量で静脈内に（ＩＶ）投与し、ＰＢＳ対照と比較した。ＰＢＳ処置マウスにおける腫瘍は、一様に増殖し、３１日目に最大腫瘍容量に到達した。下表に示されるように、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃまたはｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ単独をコードするプラスミドを含有する細菌株を用いて処置されたマウスは、各々２／１０治癒を実証したのに対し、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せは、７／１０治癒をもたらした。
これらのデータは、完全奏効を促進するためのサイトカインと改変ＳＴＩＮＧタンパク質の組合せ、例えば、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せの相乗的効力を示す。これらの結果は、乳がんの高度難治性モデルにおいて達成されたので特に重大であり、組合せの一般的な抗腫瘍治療効力を強調する。これらの結果は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ融合タンパク質と、ＳＴＩＮＧタンパク質、特に、高度に活性なＳＴＩＮＧタンパク質、例えば、機能獲得型の構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体または低減されたＮＦ－κＢシグナル伝達を有するようにさらに改変されている機能獲得型の構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体の組合せの相乗的抗腫瘍効力を示す。
次いでｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ組合せ処置群（上記の）からの治癒したマウスを、同所性ＥＭＴ６腫瘍再チャレンジ研究において、およびＣＤ８＋Ｔ細胞依存的に耐久性抗腫瘍免疫を促進する能力について評価した。この研究のために、２０匹の治癒したマウスを、各１０匹のマウスの２群に分け、腫瘍再チャレンジの３日前および１日前（それぞれ最初の腫瘍移植後５６日目および５８日目）に各マウスに１００μｇの抗ＣＤ８β抗体（ＣＤ８α＋樹状細胞を枯渇しない）または１００μｇのＩｇＧアイソタイプ対照のいずれかのＩＰ注射を与えた。腫瘍再チャレンジ前にマウスを出血させて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇を確認し、アイソタイプ対照について平均循環ＣＤ８＋Ｔ細胞が５．７２％であり、抗ＣＤ８β抗体について０．４８％であると決定した。次いで、１ｅ６ ＥＭＴ６腫瘍細胞を用いて反対側の乳腺脂肪体に同所性にマウスに再チャレンジし、ナイーブな週齢を一致させた対照マウスと比較した（Ｎ＝１０）。ナイーブ群からのマウスはすべて、３０日までに最大腫瘍容量に腫瘍を増殖させた。抗ＣＤ８β抗体枯渇群からの再チャレンジされたマウスは、ナイーブマウスよりもいっそうより攻撃的に腫瘍を増殖させたが、ＩｇＧアイソタイプ抗体対照群からの１０匹の再チャレンジされたマウスすべて（すなわち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇していないマウス）が、腫瘍再チャレンジから保護された。これらのデータは、免疫刺激性細菌、例えば、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ細菌の株において送達された場合などの、サイトカインと、改変された機能獲得型の構成的に活性なＳＴＩＮＧタンパク質変異体の組合せの有意な耐久性の抗腫瘍有効性を実証する。治療用ペイロード／タンパク質の組合せは、細菌のＩＶ投与後に高い治癒率を誘導し、マウスはＣＤ８＋Ｔ細胞依存的に腫瘍再チャレンジから保護される。
［実施例３３］
ＤＬＬ３ｘＣＤ３ Ｔ細胞リダイレクト抗体（ＴＣＲＡ）設計
Ｔ細胞リダイレクト抗体（ＴＣＲＡ）またはＴ細胞リダイレクト二重特異性抗体（ＴＲＢＡ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）機能非依存性Ｔ細胞ベースの免疫療法であり、これでは分化のクラスター３（ＣＤ３）のイプシロン（ε）ドメイン、ＴＣＲ複合体の成分が１つの結合ドメインによって標的化され、第２の結合ドメインが腫瘍細胞表面抗原を標的とする。ＴＣＲＡには、例えば、ペプチドリンカーによって一緒に連結される２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合タンパク質である、操作された抗体ベースの免疫療法である、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（商標ＢｉＴＥｓ（登録商標）の下で販売されている）が含まれる。
ＴＣＲＡは、腫瘍細胞表面抗原へ、およびＴ細胞上のＣＤ３へ同時に結合し、Ｔ細胞の細胞溶解性活性を標的化された腫瘍細胞に選択的に向けることによって、ＭＨＣ非依存的に、またＴＣＲ融合非依存的にＴ細胞と腫瘍細胞の間の細胞溶解性シナプスの形成を誘起する。細胞溶解性シナプスの形成後、Ｔ細胞は、細胞傷害性タンパク質、例えば、パーフォリンおよびグランザイム（例えば、グランザイムＢ）を放出し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす。Ｔ細胞の活性化は、サイトカインの放出をもたらし、他の免疫細胞を関与させ、より広い抗腫瘍免疫応答を誘起する。これは、炎症を起こしていない（またはコールド）腫瘍環境の炎症を起こした（またはホット）なものへの変換をもたらしＴ細胞の浸潤および増殖ならびに腫瘍細胞の死滅をもたらす。元々のＢｉＴＥ（登録商標）抗体は短い半減期を有し、後の世代のＢｉＴＥ（登録商標）抗体は、Ｆｃへの融合のために長期半減期を有する（例えば、Hipp et al. (2020) Clin. Cancer Res. 26:5258-5268；およびStrohl, W. R. and Naso, M. (2019) Antibodies 8:41を参照されたい）。
デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）は、胚発達の際にＮｏｔｃｈシグナル伝達において役割を果たす阻害性Ｎｏｔｃｈ経路リガンドである。ＤＬＬ３は、正常組織において胚発達の際に細胞内で発現され、胎児脳において最高発現されるが、成体正常組織には存在しない。ＤＬＬ３は、ある特定の腫瘍、例えば、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および他の高悪性度神経内分泌腫瘍において過剰発現され、これでは、細胞内に発現される代わりに、細胞表面に逃れるため、抗体ベースの治療薬を用いるターゲッティングに適したものになる（例えば、Hipp et al. (2020) Clin. Cancer Res. 26:5258-5268を参照されたい）。ＤＬＬ３はまた、黒色腫、多形神経膠芽腫、小細胞膀胱がん、転移性去勢抵抗性前立腺がんおよび神経内分泌肺腫瘍を含む神経内分泌起源の他の腫瘍の種類において発現され（例えば、Owen et al. (2019) Journal of Hematology & Oncology 12:61を参照されたい)、したがって、ＴＣＲＡベースの療法の有用な標的である。
ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＴＣＲＡ（それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列について配列番号４１０および４１１；Hipp et al. (2020) Clin. Cancer Res. 26:5258-5268も参照されたい）を抗ＤＬＬ３クローンｈＳＣ１６．５６抗体（例えば、国際出願公開番号ＷＯ２０１３／１２６７４６を参照されたい）の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ、ＶＬおよびＶＨ）ならびに抗ＣＤ３εクローン１４５－２Ｃ１１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能）の軽鎖および重鎖可変領域から調製した。
コンストラクトは、ＴＣＲＡの分泌のためにｐＳｅｃＴａｇ２ベクター由来のマウスＩｇＧκリーダー／シグナル配列（配列番号４１１の残基１～２１に対応する；例えば、ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇを参照されたい）を含んでいた。抗ＤＬＬ３ ＶＨドメイン（配列番号４１１の残基２２～１３９に対応する）を、１５アミノ酸長の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号４１１の残基１４０～１５４に対応する）を介して抗ＤＬＬ３ ＶＬドメイン（配列番号４１１の残基１５５～２６１に対応する）に連結し、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖを形成した。５アミノ酸長のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー（配列番号４１１の残基２６２～２６６に対応する）を、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの間に挿入した。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、第２の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号４１１の残基３８３～３９７に対応する）を介して、抗ＣＤ３ ＶＬドメイン（配列番号４１１の残基３９８～５０４に対応する）に連結された抗ＣＤ３ ＶＨドメイン（配列番号４１１の残基２６７～３８２に対応する）を含有する。このコンストラクトは、抗ＤＬＬ３および抗ＣＤ３抗体の重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖可変ドメインが分子において現れる順序を示すために、ＤＬＬ３ＨＬ ｘ ＣＤ３ＨＬと呼ばれる。検出のために（ＤＬＬ３ＨＬ ｘ ＣＤ３ＨＬ－ＦＬＡＧ ＴＣＲＡと呼ばれる、ＦＬＡＧタグ標識されたＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＴＣＲＡのために、配列番号４１３を参照されたい）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号４１２）をこのコンストラクトのＣ末端の末端に付加できる。
ＤＬＬ３ＬＨ ｘ ＣＤ３ＨＬ ＴＣＲＡと呼ばれる別のＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＴＣＲＡコンストラクト（それぞれ、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列については配列番号４１４および４１５を参照されたい）をＤＬＬ３ＨＬ ｘ ＣＤ３ＨＬ コンストラクトと同様に構築したが、命名が暗示するように、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖは、抗ＤＬＬ３ ＶＨドメインのＮ末端に配置された抗ＤＬＬ３ ＶＬドメインを含有する。ＴＣＲＡの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ部分、ＧＳリンカーおよび分泌のためのリーダー配列はすべて、ＤＬＬ３ＨＬ ｘ ＣＤ３ＨＬコンストラクトについて上記で記載された通りである。ＤＬＬ３ＬＨ ｘ ＣＤ３ＨＬ－ＦＬＡＧ ＴＣＲＡと呼ばれる、ＤＬＬ３ＬＨ ｘ ＣＤ３ＨＬ ＴＣＲＡ コンストラクトのＦＬＡＧタグ標識されたバージョン（それぞれ、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列については配列番号４１６および４１７を参照されたい）も構築した。
［実施例３４］
標的結合、コンジュゲーションおよび細胞傷害性についてのＴ細胞リダイレクト抗体（ＴＣＲＡ）の評価
ＣＤ（分化のクラスター）抗原、例えば、ＣＤ１９およびＣＤ３に対して向けられた抗体は、抗がん標的である。ある特定のＣＤ抗原の発現は、特定の系統のリンパ球造血系細胞に制限されている。リンパ系特異的抗原に対する抗体は、治療薬として開発されている。ＣＤ１９は、Ｂ細胞で発現され、脱落せず、すべてのリンパ腫細胞に均一に発現され、幹細胞には存在しないため、有用な標的である。ＣＤ３は、３つの鎖：ＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γを含有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一部としてＴ細胞で発現される。固定化抗ＣＤ３抗体などによるＴ細胞上でのＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与と同様であるＴ細胞活性化をもたらすが、そのクローンの通常の特異性とは独立している。ＣＤ１９およびＣＤ３抗原の各々に対する二重特異性抗体は、ＭＨＣ非依存的に、Ｔ細胞プレ刺激または同時刺激を必要とせずに、Ｔ細胞細胞傷害性をＣＤ－１９陽性細胞（例えば、リンパ腫細胞）に向けて再標的化する。したがって、このような分子は、耐久性Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫の誘起において、また抗がん治療薬として特に有用である。
ＭＴ１０３と呼ばれる抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３ ＴＣＲＡのＦＬＡＧ－タグ変異体配列（配列番号４１８；失効した米国特許第７，１１２，３２４号も参照されたい）を、ｐＡＴＩ１．７５と呼ばれるベクター（上記の）中にクローニングした。ＭＴ１０３ ＴＣＲＡコンストラクトは、リーダー配列（配列番号４１８の残基１～１９に対応する）と、それに続くＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号４１８の残基２０～２７に対応する）および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖに連結された抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含有する。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号４１８の残基１３９～１５３に対応する）を介して抗ＣＤ１９ ＶＨドメイン（配列番号４１８の残基１５４～２７７に対応する）に連結された抗ＣＤ１９ ＶＬドメイン（配列番号４１８の残基２８～１３８に対応する）を含有する。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号４１８の残基２７８～２８２に対応する）を介して抗ＣＤ３ ｓｃＦｖに連結される。抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、ペプチドリンカー（ＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤ；配列番号４１８の残基４０１～４１９に対応する）を介して、抗ＣＤ３ ＶＬドメイン（配列番号４１８の残基４２０～５２５に対応する）に連結された抗ＣＤ３ ＶＨドメイン（配列番号４１８の残基２３８～４０１に対応する）を含有する。コンストラクトはまた、Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ６；配列番号４１８の残基５２６～５３１に対応する）も含む。
ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、ウェルあたり１．５ｅ６個細胞でポリ－Ｌ－リシンでコートした６ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベートして、８０％コンフルエンシーを達成した。翌日、３０００ｎｇのＭＴ１０３プラスミドＤＮＡを無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、細胞をトランスフェクトし、非トランスフェクトウェルは陰性対照として働く（二連測定で）。各サンプルからの細胞培養上清は、トランスフェクションの４８時間後に収集した。上清は、ニートを維持するか、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ４ｍＬ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して濃縮した。
発現されたＭＴ１０３（ＣＤ１９ｘＣＤ３）ＴＣＲＡの機能性を確認するために、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣから購入した）およびＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用するフローサイトメトリー実験を実施した。Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ１９を高度に発現するヒトリンパ芽球細胞であり、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ３を発現するヒトＴリンパ球である。２００，０００個のＲａｊｉ細胞および２００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を各々、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで洗浄した。次いで、発現されたＴＣＲＡを含有するニートまたは濃縮細胞培養上清のいずれか５０μＬを細胞に加え、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で３０分間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに再懸濁し、ＡＰＣ標識抗ＦＬＡＧタグ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色した。ＡＰＣ標識抗ＦＬＡＧタグ抗体は、Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ１９および／またはＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に結合する任意のＭＴ１０３ ＴＣＲＡ（ＦＬＡＧタグを含有する）を標識するために加えられる。３０分のインキュベーション後、細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄し、次いでＤＡＰＩ（死滅／生存染色）を有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで再懸濁した。フローサイトメトリーを実施して、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＭＴ１０３ ＴＣＲＡのＲａｊｉ細胞上のＣＤ１９への結合および／またはＴＣＲＡのＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合のいずれも検出した。各サンプルについて５０，０００事象を獲得した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
下表に示されるように、ニートまたは濃縮ＭＴ１０３含有細胞培養上清のいずれかとともにインキュベートした、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞から検出されたＡＰＣの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）は、非トランスフェクト細胞培養上清とともにインキュベートした細胞から検出されたＭＦＩよりもはるかに高く、ＭＴ１０３ ＴＣＲＡは、ＣＤ１９－およびＣＤ３－発現細胞に結合するということを示す。
MT103 (CD19xCD3) TCRAで処理された細胞のフローサイトメトリーデータ
さらに、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＭＴ１０３ ＴＣＲＡコンストラクトを、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞の共培養において試験した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴレポーター細胞株は、ＮＦＡＴ誘起可能Ｌｕｃｉａ（商標）コンストラクトを含有し、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼの発現は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子；転写因子）コンセンサス転写応答エレメントの６コピーに融合されたＩＳＧ５４最小プロモーターによって駆動される。従って、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞を使用して、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによってＮＦＡＴ活性化を研究できる；Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼのレベルは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ検出試薬を用いて細胞培養上清において測定できる。この実験では、ＭＴ１０３ ＴＣＲＡのＣＤ１９－発現Ｒａｊｉ細胞およびＣＤ３－発現Ｊｕｒｋａｔ細胞両方への結合が、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞）を活性化し、ＮＦＡＴ誘起可能Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ分泌をもたらし、これを測定して、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化のレベルを決定できる。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ウェルあたり５ｅ４個細胞で９６ウェル組織培養プレートに播種した。Ｒａｊｉ細胞を、それぞれ１：２または１：１のエフェクター：標的（Ｊｕｒｋａｔ：Ｒａｊｉ）比のために、ウェルあたり１ｅ５または５ｅ４個細胞のいずれかで播種した。共培養した細胞を、ニートまたは濃縮ＭＴ１０３含有細胞培養上清ありおよびなしでインキュベートした。ニートまたは濃縮上清の１０倍、１００倍および１０００倍希釈を調製し、共培養物とともにインキュベートした。共培養物へのＴＣＲＡの添加の６時間および２４時間後に、誘起されたＮＦＡＴレポーターに起因する発光（すなわち、分泌されたＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性）を検出した。
結果を下表にまとめ、これは、ＭＴ１０３ ＴＣＲＡの活性が、ＭＴ１０３を添加していない対照試料と比較した、およびＲａｊｉ（標的）細胞との共培養物を含まない対照試料と比較した、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴレポーター細胞株からの発光の増大をもたらすことを示す。ＮＦＡＴ誘起可能Ｌｕｃｉａ（商標）レポーターコンストラクトに起因する発光は、ＭＴ１０３の希釈につれて用量依存的に減少する。予測されるように、インキュベーション時間が長いほど（２４時間対６時間）より多い発光が得られ、これは、Ｔ細胞活性化の増大を示す。
種々の濃度のMT103で、種々のエフェクター:標的比で処理されたJurkatおよびRaji細胞の共培養物からのニートLucia(商標)レポーター

SD = 標準偏差
ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞；すなわち、腫瘍細胞）の共培養を使用して細胞傷害性アッセイを実施した。ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離し、ＲＰＭＩ＋２％ ＦＢＳに再懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。それぞれ１０：１または５：１のエフェクター：標的（Ｔ細胞：Ｒａｊｉ細胞）比のために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞をウェルあたり１ｅ５個細胞、またはウェルあたり５ｅ４個細胞で播種し、Ｒａｊｉ細胞をウェルあたり１０，０００個細胞で播種した。濃縮またはニートＭＴ１０３含有上清をＲＰＭＩ＋２％ ＦＢＳで１０倍、１００倍および１０００倍希釈し、次いで、各上清サンプル５０μＬを共培養物に加えた。共培養インキュベーションの５時間後に上清を収集し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、メーカーの使用説明書によって分析した。メーカーの使用説明書に従って細胞傷害性％を計算した。
下表に示されるように、ＭＴ１０３の量（濃度）が多いほど、より高い細胞傷害性％が得られる。細胞傷害性％は、ＭＴ１０３含有上清が１０倍、１００倍および１０００倍希釈されるにつれ、用量依存的に低下する。
CD8+ T細胞およびさまざまな濃度のMT103との共培養におけるRaji細胞の溶解(細胞傷害性%)

SD = 標準偏差; NA = 該当なし
［実施例３５］
発現プラスミドにおいてコードされる腫瘍関連抗原の免疫刺激性細菌デリバリー
この実施例は、免疫刺激性細菌によって送達され得る例示的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を記載する。操作された免疫刺激性細菌を用いて処置すると、腫瘍常在性骨髄性細胞、例えば、マクロファージおよび樹状細胞への腫瘍関連抗原のデリバリーによって、抗原特異的Ｔ細胞の誘起および活性化が可能となり、抗腫瘍応答をもたらす。
免疫刺激性細菌においてプラスミドによってコードされる腫瘍関連抗原の中には、癌胎児性または癌ウイルス性として分類されるものがある。抗原の一部は、腫瘍によって過剰発現されるか、または腫瘍において蓄積する。抗原には、系統によって制限されるもの、突然変異したもの、または翻訳後に変更されているものが含まれる。これらのカテゴリー各々における腫瘍関連抗原の限定されない例およびその関連する癌の種類（適応症）を以下の表に示す。





［実施例３６］
細菌由来ＲＮＡデリバリーからの真核細胞における異所性タンパク質合成
詳細な説明に記載されるように、プラスミドＤＮＡデリバリーに加えて、免疫刺激性細菌を使用して、細菌由来ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを、感染した骨髄性細胞中に直接送達できる。ＲＮＡの直接デリバリーは、真核細胞の転写および翻訳機構ならびにプラスミドＤＮＡの宿主細胞核への適切な輸送に依存するプラスミドＤＮＡデリバリーを不必要にする。ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの直接デリバリーは、宿主輸送および転写プロセスを迂回し、タンパク質産生のために真核細胞の翻訳機構にのみ依存する。細菌由来ＲＮＡのデリバリーには、細菌における外来タンパク質の問題になる翻訳を防ぐために細菌翻訳から細菌転写を切り離すことが必要である。多数の真核生物のタンパク質は、適切なフォールディング条件、小胞体、ジスルフィド結合を含む適切な翻訳後改変およびフォールディングのための宿主シャペロンを必要とする複雑なタンパク質である。細菌における外来タンパク質の過剰発現は、株適合性を低減し、倍加時間を減少させ、株安定性を低減することができる。
ｍＲＮＡデリバリーが免疫刺激性細菌を用いる処置の際に生じることを実証するために、一連のプラスミドを、介在する脳心筋炎ウイルス配列内リボソーム進入部位（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ）の存在下および不在下で、ｍｕ４－１ＢＢＬ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１２ｐ７０ ＨＰＲＥ ｂＧＨｐＡの発現を駆動する真核生物または細菌いずれかのプロモーターを用いて操作した。細菌では非機能性であるＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、原核生物の翻訳を低減し、真核生物の翻訳を増強する。細菌において機能するジシストロウイルス科（Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス由来のただ１つの既知真核生物ＩＲＥＳがある（例えば、Colussi et al. (2015) Nature 519(7541):110-113を参照されたい）。したがって、一般に、ＩＲＥＳエレメントは、細菌において機能しない。調節配列からの細菌発現を蛍光によって迅速に評価できるように、プロモーター－ＩＲＥＳ（またはプロモーター－コザック）の組合せも、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーター遺伝子（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）中にクローニングした。
蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の細菌発現を測定するために、細菌株の一夜培養物をＰＢＳで洗浄し、ＯＤ６００によって０．１に正規化した。どの細菌培養についても、ｍＣｈｅｒｒｙ発現のパーセンテージをＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。バクトフェクション後の異所性遺伝子発現のレベルを、感染した初代ヒトＭ２マクロファージおよびＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の共培養システムを使用して測定した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞は、ＩＬ－１２受容体ならびにＩＬ－１２シグナル伝達経路中の遺伝子およびＳＴＡＴ４誘起可能ＳＥＡＰレポーター遺伝子を発現するＨＥＫ２９３細胞である。ＩＬ－１２の、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞の表面上のＩＬ－１２受容体への結合は、シグナル伝達カスケードを引き起こし、ＳＴＡＴ－４の活性化およびその後のＳＥＡＰの生成につながる。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞の上清におけるＳＥＡＰの検出は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を使用して容易に評価できる。したがって、これらのレポーター細胞を使用して、ＩＬ－１２の発現を測定する。
初代ヒト単球を、１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを含有するＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地で３日間分化させ、次いで、２００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４および２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０を含有する追加の培地をさらに４日間補給した。次いで細胞に、４ＸＹＴ培地で３７℃にて一夜増殖させた定常相免疫刺激性細菌に５０のＭＯＩで感染させた。細胞に細菌を接種し、５００ｒｃｆで５分間遠心分離し、続いて、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを有する新鮮なＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地中でインキュベートして、細胞外細菌を除去した。次いで、感染したマクロファージをＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞と２．５：１（マクロファージ対ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞）の比で共培養した。感染後４８時間で、５μｌの細胞培養上清を、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液（ＳＥＡＰを検出する）とともに３７℃でインキュベートし、発色させた。したがって、感染したマクロファージによるＩＬ－１２の発現は、ＩＬ－１２のその細胞表面上のＩＬ－１２受容体への結合の際にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞によって産生されるＳＥＡＰレベルを上清において測定することによって評価する。
下表にまとめた結果は、感染した対照（ＥＦ－１α－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ）が初代ヒトＭ２マクロファージにおいてＩＬ－１２発現のベースラインレベルを刺激することおよび細菌におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現からの蛍光がほとんどないことを示す。ＣＭＶ－コザック対は、バクトフェクション後のより高レベルのＩＬ－１２発現ならびにより高レベルのｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を駆動する。これは、細菌においてＣＭＶプロモーターから生じる低レベルの細菌「漏出」に起因し得る。試験した２つの細菌プロモーター、ｒｐｓＭおよびＭＴＬは、コザック配列と対を形成すると、ＣＭＶプロモーターよりも低いが、ＥＦ－１α－ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ対照よりも高い、初代ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１２発現のレベルを誘起するが、両プロモーターは細菌において高レベルのｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を駆動する。これらの結果は、細菌プロモーターは真核生物宿主において非機能性であるので、ｍＲＮＡデリバリーが生じていることを示す。ＩＬ－１２レポータータンパク質の発現のレベルは、細菌プロモーターがＩＲＥＳとカップリングされる場合よりも高く、送達されたｍＲＮＡからのタンパク質発現が真核生物のＩＲＥＳの存在によって翻訳レベルで増強されることを示す。ＩＲＥＳの存在はまた、細菌におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現の量を低減し、ＲＮＡの二次構造が、細菌プロモーターとカップリングされる場合でさえ発現を阻害することを示す。
プロモーターから下流および開始コドンの前にコンストラクト中にＩＲＥＳを含めることによって、細菌における翻訳が阻害され、妨げられ、その結果、細菌はｍＲＮＡのデリバリー物質として働く。本出願において提供される免疫刺激性細菌などの細菌は、宿主細胞、例えば、組織常在性マクロファージ（例えば、腫瘍常在性骨髄性細胞）に感染し、コードされるＲＮＡを宿主細胞中に送達するように設計される。細菌は、インビトロで増殖させることができるが、宿主、例えば、ヒトへ導入されると増殖しないように、栄養要求性、例えば、ａｓｄ－であり得る。細菌はその内容物を宿主細胞に送達するが、複製しない。
細菌は、細菌翻訳を妨げる、または阻害するＩＲＥＳまたは他のこのような調節配列の存在のために、細菌によるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの産生をもたらすコードされたＲＮＡを産生するようにインビトロで培養される。真核生物の宿主細胞、例えば、ヒトマクロファージが細菌に感染すると、ＲＮＡが翻訳され、コードされた産物、例えば、抗原などが産生される。
細菌は多量で容易に培養でき、次いで、保存および／または散剤、錠剤もしくは注射用液体として製剤化もしくは提供できるので、細菌はＲＮＡデリバリーのための有利な容器である。それらは、静脈内および鼻もしくは肺を通る粘膜によってを含む任意の適した経路によって投与できる。それらは極めて安定しており、大きな安定した量のＲＮＡを提供する。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのデリバリーのために使用される場合に、例えば、ワクチンとして、またはウイルス抗原および／もしくは病原体、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）から保護する他のタンパク質をコードするために使用される場合に、全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（例えば、配列番号４３８を参照されたい）をコードできる、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の全長受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号４４０を参照されたい）をコードできる、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、免疫応答を誘起する、もしくは引き起こす、および／または対象を免疫化する、もしくはワクチン接種する、もしくは保護するのに十分である、スパイクタンパク質ＲＢＤの一部分（例えば、配列番号４４１を参照されたい）をコードできる。免疫刺激性細菌はまた、スパイクタンパク質もしくはＲＢＤもしくはその一部分の発現を増大もしくは増強する、および／またはスパイクタンパク質もしくはＲＢＤもしくはその一部分のＡＣＥ２受容体への結合を増大もしくは増強する、スパイクタンパク質またはその一部分、例えば、ＲＢＤまたはその一部分中に突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の突然変異体をコードするｍＲＮＡを送達できる。
スパイクタンパク質またはスパイクタンパク質ＲＢＤ突然変異体には、以下に限定されないが、突然変異Ｖ３６７Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｇ４７６Ｓ、Ｖ４８３Ａ、Ｈ４９Ｙ、Ｎ５０１Ｙ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｗ、Ｎ５０１Ｖ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｖ４１７Ｋ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｗ４３６ＲおよびＤ３６４Ｙを含むものならびにスパイクタンパク質の残基Ｎ４３９／Ｒ４２６、Ｌ４５２／Ｒ４２６、Ｔ４７０／Ｎ４５７、Ｅ４８４／Ｐ４７０、Ｑ４９８／Ｙ４８４およびＮ５０１／Ｔ４８７に対応する残基に突然変異を含むものまたはその一部分を含む、本明細書において記載される、当技術分野で公知のいずれをも含まれる。免疫刺激性細菌は、例えば、米国特許第１０，９７３，９０８号および同１０，７０２，６００号に記載されるような、その部分を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＲＢＤの抗原配列または改変形態のいずれかをコードするｍＲＮＡを送達することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンとして使用できる。免疫刺激性細菌はまた、本明細書において別の場所に記載されるように、ワクチンとして／ｍＲＮＡデリバリーのために使用して、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン中の、およびＭｏｄｅｒｎａ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン中のｍＲＮＡを送達できる。抗原として使用するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質には、例えば、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドおよびＭタンパク質およびそれらの抗原部分が含まれる。免疫刺激性細菌を使用して、汎用インフルエンザ抗原、例えば、様々なインフルエンザ株、例えば、インフルエンザＡ型株（Ｈ１およびＨ３）およびインフルエンザＢ型株由来のＨＡタンパク質に対する抗体を誘発するインフルエンザワクチンを送達できる。他の組合せとして、ＨＡエピトープの反復パターン、例えば、ＦｌｕｓＭｏｓ－ｖ１が挙げられる。例えば、キメラ血球凝集素ベースの汎用インフルエンザワクチンを提供する、Nachbaguer et al. (2021) Nature Medicine 27:106-114を参照されたい。
［実施例３７］
ヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴを含有する免疫調節性株は、自発性マウス腫瘍にコロニー形成する
これまでに弱毒化サルモネラ菌株ＹＳ１６４６は、４Ｔ１マウス乳房移植モデルにおいて腫瘍にコロニー形成できる（平均腫瘍サイズ４００ｍｍ３、平均ＣＦＵ／ｇ＝１０８）が、自発性ＢＡＬＢ－ＮｅｕＴ乳房腫瘍モデルには有意に低くしかコロニー形成できない（平均腫瘍サイズ４００ｍｍ３、平均ＣＦＵ／ｇ＝１０３；例えば、Drees et al. (2015) J. Cancer 6(9):843-848を参照されたい）ということが報告されている。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、移植された腫瘍と比較して自発性腫瘍にコロニー形成することにおいて同様の欠陥を有さないということを示すために、同所性に移植された乳がんのＥＭＴ６マウスモデルから腫瘍を収集し、自発性ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ乳がんモデルから収集された腫瘍と比較した。ＥＭＴ６モデルについては、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹のマウス）の４番目の乳腺脂肪体に、ＥＭＴ６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、１×１０６細胞）を同所接種した。７日で定着した側腹部腫瘍（５６ｍｍ３の平均腫瘍サイズ）を有するマウスに、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株の３×１０７ＣＦＵの単回用量をＩＶ注射した。ＩＶ投薬後４日目に、マウスを安楽死させ、腫瘍をホモジナイズしてＬＢプレートにプレーティングし、腫瘍組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、腫瘍組織１ｇあたり平均１．７×１０７ＣＦＵで腫瘍にコロニー形成した。
乳がんの自発性モデルのために、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスに、最大腫瘍の容量が２７２ｍｍ３の平均と測定された時点で、同一細菌株の３×１０７ＣＦＵをＩＶ注射した。ＩＶ投薬後６日目に腫瘍を収集した。腫瘍をホモジナイズし、ＬＢプレート上にプレーティングし、腫瘍組織１グラムあたりのＣＦＵを計数した。収集したすべての腫瘍は、様々な腫瘍重量（０．０５ｇ～０．３６ｇ、Ｎ＝７）にもかかわらず良好にコロニー形成されるとわかり、平均２．８９×１０６ＣＦＵ／ｇであった。これらのデータは、親のＹＳ１６４６株とは異なり、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せをコードするプラスミドを含有する免疫調節性ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、移植されたＥＭＴ６腫瘍に匹敵するレベルで自発性ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ腫瘍にコロニー形成できたことを実証する（Ｐ＝０．１８、ＮＳ）。
移植された腫瘍とは異なり、自発性腫瘍は、ヒト腫瘍により匹敵する脈管構造を有するので、これらのデータは、免疫刺激性細菌が、進行がん患者の第Ｉ相臨床試験において報告された親のＹＳ１６４６株よりも高い率／レベルでヒト腫瘍にコロニー形成することを示す（例えば、Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照されたい）。
［実施例３８］
ヒトＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴをコードするプラスミドまたはＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）ルシフェラーゼ対照プラスミドを含有する免疫調節性細菌株は、非ヒト霊長類において良好に忍容される
第Ｉ相ヒト臨床試験において、親のＹＳ１６４６株の最大耐量（ＭＴＤ）は、３×１０８ＣＦＵ／ｍ２であることおよび用量制限毒性（ＤＬＴ）用量は１×１０９ＣＦＵ／ｍ２であること（例えば、Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照されたい）が報告された。これらの用量では、毒性および有害事象、例えば、発熱、低血圧症、血小板減少症、貧血、嘔吐、下痢、悪心おおび低リン血症は、ＴＮＦ－α（およそ５００，０００ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ－６（およそ５００，０００ｐｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１β（およそ２００ｐｇ／ｍＬ）を含む、ＩＶ投薬後４時間で測定された炎症性サイトカインの極めて高い血清レベルに起因していた。別個の研究では、株ＹＳ１６４６をカニクイザルを使用する非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究において評価した。この研究では、１×１０９ＣＦＵ／サルがＭＴＤであるとわかった（ヒト等価用量（ＨＥＤ）＝４×１０９ＣＦＵ／ｍ２）が、１×１０１０ＣＦＵ／サルの用量は、忍容されないと考えられた（ＨＥＤ＝４×１０１０ＣＦＵ／ｍ２）。最高用量でのＤＬＴは肝臓関連の有害事象（ＡＥ）に起因し、血清サイトカインは測定されなかった（例えば、Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25を参照されたい）。ＮＨＰが、株ＹＳ１６４６をヒトよりも良好に忍容し、ヒトＭＴＤよりも１対数高いＭＴＤ値を有するので、サルのサイトカインレベルは、ヒトにおいて測定されるものよりもおよそ１対数低いということが推測され得る。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌、例えば、鞭毛を欠く、およびｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である株のＭＴＤおよび血清サイトカインプロファイルを決定するために、ＮＨＰにおいて、忍容性研究を実施した。この研究では、１５匹のこれまで未処置の２４～５０カ月の範囲の齢の雄のカニクイザルを利用した。ＮＨＰに、ｈｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの組合せをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ株（上記で論じられた）を、３×１０８ＣＦＵ／サル、１×１０９ＣＦＵ／サルまたは３×１０９ＣＦＵ／サル（投薬群あたり３匹のＮＨＰ）の用量でＩＶ投与した、またはＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）ルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株を、３×１０８ＣＦＵ／サル（群あたり３匹のＮＨＰ）の用量でＩＶ投与し、生理食塩水媒体対照群（Ｎ＝３）に対して比較した。投薬前、投薬後４時間および投薬後２４時間にＮＨＰを出血させ、血清サイトカインレベルを、サルサイトカインＵ－Ｐｌｅｘパネル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をメーカーのプロトコールに従って使用して測定した。
下表にまとめた結果は、細菌株は、試験したすべての用量レベルで良好に忍容されたことを示し、生理食塩水（ＰＢＳ）対照群と有意に異なった臨床所見は報告されなかった。したがって、この研究では、ＭＴＤを確立できなかった。血清サイトカインレベルは、全体的に、特に、株ＹＳ１６４６を用いたヒト臨床試験において用量制限毒性（ＤＬＴ）の起因であったサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α（４．６ｐｇ／ｍＬの平均濃度）、ＩＬ－６（３７６．９ｐｇ／ｍＬの平均濃度）およびＩＬ－１β（０．８８ｐｇ／ｍＬの平均濃度）を含む、３×１０９ＣＦＵ／サル用量群（ＨＥＤ＝１．２×１０１０ＣＦＵ／ｍ２）でＩＶ投薬後４時間で測定されたサイトカインについて極めて低かった。ＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０（１０，５４９．６ｐｇ／ｍＬの平均濃度）およびＭＣＰ－１／ＣＣＬ２（６２４７．７ｐｇ／ｍＬの平均濃度）の血清サイトカインレベルのみは、最高用量レベル群において、投薬後４時間で高く、投薬後２４時間で上昇したままであった。これらの分析物は、毒性と関連しておらず、より好都合な免疫プロファイルを示している可能性がある。要するに、ペイロードをコードするプラスミドを含有するものを含む本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、ＮＨＰにおいて極めて良好に忍容される。したがって、これらのデータからヒトにおいて免疫刺激細菌株の高レベルの忍容性があるであろうと推測され得る。
投与前の血清サイトカインレベル


SD = 標準偏差
血清サイトカインレベル、投与後4時間


SD = 標準偏差
血清サイトカインレベル、投与後24時間


SD = 標準偏差
［実施例３９］
チミジン栄養要求株
ネズミチフス菌必須遺伝子ｔｈｙＡは、ＤＮＡ合成における重要な酵素であるチミジル酸シンターゼをコードする。この遺伝子の欠失または突然変異は、株をチミジンに対して栄養要求性にする。補完基質が欠乏すると細菌細胞死が起こり、チミジン飢餓の際にｔｈｙＡ突然変異体から高分子が放出されないことが実証されており（Loessner et al., FEMS Microbiol Lett. 265(1): 81-88 (2006)）、ＰＡＭＰの潜在的な放出とその後の先天性炎症反応の活性化を低減する。インビボで複製不可能であり、補充されるチミジンがなければ迅速に死亡するチミジン栄養要求株を生成するために、ｔｈｙＡを株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩから欠失させた。
ｔｈｙＡ遺伝子（配列番号４６４；ＤＣ５１＿３０７８）を含有する６９０ｂｐの領域を、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)）の改変を使用する欠失の標的とした。ｔｈｙＡ遺伝子を破壊するために、オーバーラップＰＣＲによってｔｈｙＡ遺伝子ノックアウトカセットを構築した。このカセットは、２つのＩ－ＳｃｅＩ切断部位が隣接するカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）カセットならびに組換えを容易にするための５’末端（３４５ｂｐ）および３’末端（３３２ｂｐ）両方の相同領域を含有する。ＫａｎＲカセットのすぐ５’に、ＫａｎＲカセットの３’の７５ｂｐに対して完全に相同である７５ｂｐのＤＮＡ配列がある。この反復エレメント（ｔｈｙＡ ＭＨＡ）は、ＫａｎＲカセットの切除の際に瘢痕のない欠失を残す。
具体的には、下表の配列を参照して、ＹＳ１６４６からプライマーｔｈｙａ－１およびｔｈｙａ－２を使用してｔｈｙＡ左相同性アーム配列を増幅し、プライマーｔｈｙａ－１を使用してＫａｎＲカセットとＰＣＲオーバーラップさせ、ＹＳ１６４６からプライマーｔｈｙａ－３およびｔｈｙａ－４を使用してｓｃＦｖ－ｔｈｙＡ右相同性アーム配列を増幅し、ｔｈｙＡ ＭＨＡ（プライマーｌｏｘｐ－４およびｔｈｙａ－４を使用して供給業者（ＩＤＴ）から合成ｇＢｌｏｃｋ遺伝子断片として調製された）とＰＣＲオーバーラップさせた。
表3: thyA遺伝子KO相同性アーム長さ情報
表4: thyA KOプライマー配列情報

>thyA MHA gBlock断片
注記:I-SceIを使用するKan遺伝子除去の際のラムダレッド組換え工程のために、thyA KO中程度相同性アーム(ggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccgGGTACCggcaagTAGGGATAACAGGGTAATgttaTCTGCAgaccaaggacccagattatgcagcaacacgtttcctgaggaaccatgaaacagtatttagaactgatgcaaaaagtgctggatgaaggcacacagtgaaattgaaggctatgatccgcac;配列番号479)を使用した。
次いでプライマーｔｈｙａ－１およびｔｈｙａ－４を使用するオーバーラップＰＣＲによって全長ｔｈｙＡ遺伝子ノックアウトカセットを構築し（上記の表を参照されたい）、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＳＬ０３０４を保持する株 ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ中に電気穿孔によって導入した。次いで、以前に記載されたYang and Yang （Applied and Environmental Microbiology, 80: 3826-3834 (2014)）ようにＩ－ＳｃｅＩ／ラムダレッド媒介性組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーｔｈｙａ－５およびｔｈｙａ－６（表２）を使用するＰＣＲによってｔｈｙＡ遺伝子断片ノックアウト配列を確認し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた、親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩの突然変異体誘導体は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡと呼ばれる。
チミジン欠失株を、２５０μｇ／ｍＬのチミジンを補給したＤａｓＧｉｐ発酵系において６時間増殖させ、培養材料を続いて注射用ストック用に処理した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡを、２５０μｇ／ｍＬのチミジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ１８９５－１Ｇ）および５０μｇ／ｍＬのジアミノピメリン酸の存在下で培養して、エレクトロコンピテント細胞を生成した。プラスミドＡＤＮ－８６、ＡＤＮ－８７０またはＡＤＮ－８７２（下表を参照されたい）でＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡを形質転換して、それぞれ株ＳＴＳＴ－３２１、ＳＴＳＴ－３２６およびＳＴＳＴ－３２８を生成した。チミジン補給なしで、プラスミドＡＤＮ－８３８を有するＣＲＳＴ－２０００、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩと並行して、記載されたプラスミド（下表を参照されたい）を含有するＳＴＳＴ－３２１、ＳＴＳＴ－３２６およびＳＴＳＴ－３２８と呼ばれるＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡ株を、２５０μｇ／ｍＬのチミジンの存在下で６時間１ＬスケールでＤａｓＧｉｐ発酵システムにおいて増殖させた。
発酵培養物を発酵を通じてＯＤ６００について分析した。チミジン欠失株の増殖は、ＣＲＳＴ－２０００対照に匹敵すると観察された。
チミジン栄養要求性を確認するために、株ＳＴＳＴ－３２１、ＳＴＳＴ－３２６およびＳＴＳＴ－３２８の増殖を２５０μｇ／ｍＬのチミジン補給ありまたはなしの培地において対照ＣＲＳＴ－２０００と比較して評価した。注射用ストックを室温で解凍し、透明底９６ウェルプレート中の三連測定ウェルにおいて２．５μＬを使用して２５０μＬ培地＋／－チミジンに接種し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）においてＯＤ６００によって３７℃で振盪しながら増殖を１２時間評価した。チミジン欠失株を、２５０μｇ／ｍＬのチミジン補給ありまたはなしの培養液で増殖させ、１２時間の経過にわたって１５分間隔にてＯＤ６００をモニターした。
結果は、ＳＴＳＴ－３２１、ＳＴＳＴ－３２６およびＳＴＳＴ－３２８について、チミジン補給なしでは増殖が観察されなかったが、ＣＲＳＴ－２０００は定常相への頑強な増殖を実証したことを示す。２５０μｇ／ｍＬのチミジン補給ありでは、ＳＴＳＴ－３２１、ＳＴＳＴ－３２６およびＳＴＳＴ－３２８は定常相へ増殖し、ＣＲＳＴ－２０００と同様の増殖プロファイルを有し、チミジンに対する正確な、制御された栄養要求性を実証した。
［実施例４０］
ＩＲＦ３、ＩＦＮα２およびＩＦＮ－β発現カセットの最適化された発現
バイシストロニックコンストラクトがＴ２Ａペプチドを含有する、ヒトＩＲＦ３ Ｓ３９６ＤまたはマウスＩＲＦ３ Ｓ３８８ＤまたはヒトもしくはマウスＩＦＮα２またはヒトもしくはマウスＩＦＮ－βの組合せを含有するプラスミドを、単一発現（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ）制御に対する各コードされるペイロード／産物の発現について試験した。
内因性ＳＴＩＮＧを含有せず、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下に配置された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ＩＳＲＥのコード配列がノックイン技術を使用してＳＥＡＰ ＯＲＦによって置換されている、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。したがって、ＳＴＩＮＧ活性は、Ｉ型ＩＦＮによって誘導されたＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価される。２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞はまた、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に配置されたＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ、分泌型ルシフェラーゼも発現し、ＩＦＮ－βのコード配列は、ノックイン技術を使用してＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼＯＲＦによって置換されている。これによって、ＩＦＮ－βの発現をモニタリングすることによってＳＴＩＮＧ活性の評価が可能となる。これらの細胞を使用して、ＩＳＲＥ誘導性ＳＥＡＰ産生および／またはＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼのＩＦＮ－β依存性発現をモニタリングすることによって、ＳＴＩＮＧ活性を評価できる。２つのレポータータンパク質、ＳＥＡＰおよびＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼは、標準的なアッセイおよび検出試薬、例えば、それぞれ、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）およびＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して細胞上清において測定できる。
細胞を、ウェルあたり２００，０００個細胞でポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベートして、８０％コンフルエンシーを達成した。翌日、３００ｎｇの各プラスミドＤＮＡおよび４０ｎｇのＣＭＶ－ＧＦＰベクター（すなわち、ＣＭＶプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質をコードするベクター）を無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、非トランスフェクトウェルは、陰性対照として働いた（二連測定で）。各サンプルからの細胞培養上清は、トランスフェクションの４８時間後に収集した。
ＩＳＲＥ－ＳＥＡＰおよびＩＦＮ－β－Ｌｕｃｉａ（商標）レポーターシステムを使用してコンストラクトの活性を評価した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性は、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激ＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価した。２０μＬの細胞培養上清を、ＳＥＡＰを測定するために使用する１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光波長にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性はまた、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ産生をモニタリングすることによって評価した。２０μＬの細胞培養上清を、５０μＬの、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定するために使用されるＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、発光設定でＩＦＮβ誘起Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定することによって決定した。
Ａ．ＢＭＤＣにおけるマウスＩＲＦ３、ＩＦＮα２およびＩＦＮｂのトランスフェクションに起因するサイトカイン
マウスＩＲＦ３ Ｓ３８８Ｄ、マウスＩＦＮα２、マウスＩＦＮ－βを含有する、種々の単一発現プラスミドおよび組合せプラスミドを、ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴプラスミドに対して比較した。発現結果を下表に提供する。ヒトコンストラクトならびにｍＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ｍＩＲＦ３ Ｓ３８８ＤおよびｍＩＲＦ３ Ｓ３８８Ｄ Ｔ２Ａ ｍＩＦＮα２のすべてにおいて、ＩＳＲＥ－ＳＥＡＰレポーター活性は、ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴよりも高い。ＩＦＮβ－Ｌｕｃｉａレポーター活性は、リン酸化模倣（ｐｈｏｓｈｐｍｉｍｅｔｉｃ）ｈＩＲＦ３単独、ｈＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ｈＩＲＦ３ Ｓ３８８ＤおよびｈＩＲＦ３ Ｓ３８８Ｄ Ｔ２Ａ ｈＩＦＮα２についてｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴよりも高い。これらの結果は、個々のＩ型ＩＦＮ シグナル伝達成分ならびに構成的Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達成分の組合せを発現することによって、高レベルのＩ型ＩＦＮ産生が誘起され得ることを実証する。
トランスフェクション効率によって正規化した、マウスおよびヒトIRF3、IFNα2およびIFN-β発現

Ｂ．バイシストロニックコンストラクトがＴ２Ａペプチドを含有する、ヒトＩＲＦ３ Ｓ３９６ＤもしくはマウスＩＲＦ３ Ｓ３８８ＤまたはヒトもしくはマウスＩＦＮα２またはヒトもしくはマウスＩＦＮ－βの組合せおよびそれらの組合せを含有するプラスミドを、マウス初代骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるトランスフェクションによる発現について試験した。
これらを試験するために、ゴールデンチケットマウス骨髄を単離し、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に流し込み、１２００ＲＰＭで５分遠心分離して、骨髄性細胞を収集した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、次いで２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中で９６ウェルのＴＣ処理したプレートに播種した。４日後、非付着細胞をウェルからピペットで除き、トランスフェクションのためにＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中、１ウェルあたり２ｅ５細胞で９６ウェルプレートに再播種した。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤを使用し、メーカーの使用説明書に従って細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、３００ｎｇのプラスミドＤＮＡならびに「ＤＮＡなし」対照を、提供された緩衝液で希釈して０．０８μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合し、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定で）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。４８時間で上清を収穫して、フローサイトメトリーに基づくサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用してメーカーのプロトコールに従ってマウスＩＦＮα、ＩＦＮ－β、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）およびＩＬ－６についてアッセイした。
マウスＩＲＦ３ Ｓ３８８Ｄ、マウスＩＦＮα２、マウスＩＦＮ－βをコードする、種々の単一発現プラスミドおよび組合せプラスミドを、ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴプラスミドに対して比較した。下表に示されるように、コンストラクトｍＩＦＮα２、ｍＩＦＮ－βおよびｍＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ｍＩＦＮ－βを用いるトランスフェクションは、ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴよりも高いレベルのＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを有していた。ｍＩＦＮ－βおよびｍＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ｍＩＦＮ－βコンストラクトは、ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴよりも高いレベルのＣＸＣＬ１０を有していた。ｍＩＲＦ３ Ｓ３８８Ｄ、ｍＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ｍＩＲＦ３ Ｓ３８８ＤおよびｍＩＲＦ３ Ｓ３８８Ｄ Ｔ２Ａ ｍＩＦＮα２コンストラクトはすべて、ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴよりも低いＩＬ－６レベルを有していた。これらのデータは、単独でおよび組み合わせて、発現されるＩ型ＩＦＮ成分の複数の組合せによってＩ型ＩＦＮシグナル伝達を誘起し、炎症性ＩＬ－６を最小にしか誘導しない能力を実証する。ＩＦＮ－β単独の発現は、試験された標的すべてのより高いＩ型ＩＦＮ活性を誘起する。
BMDCにおけるマウスIRF3、IFNα2およびIFN-βのトランスフェクションに起因するサイトカイン
Ｃ．マウスＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ＩＦＮ－βは、マウス同所性乳がんモデルにおいてインビボで発現される
この実験のために、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の左乳腺脂肪体にＥＭＴ６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２７５５）（ＰＢＳ １００μＬ中、１×１０６細胞）を播種した。９日齢で定着した乳腺腫瘍（約１００ｍｍ３の容積）を有するマウスに、単一用量の２×１０７ＣＦＵのｍＩＦＮα２ Ｔ２Ａ ｍＩＦＮ－βをコードするバイシストロニックプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）株をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
腫瘍特異的ペイロードデリバリーを評価するために、アクチンに対する腫瘍ｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－β発現のレベルを決定した。ＩＶ注射後４日目に、腫瘍を切除し、１．２ｍＬのＲＬＴプラス溶解緩衝液中でＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡ抽出のために処理した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーの使用説明書に従って使用するＲＮＡ単離のために、ホモジネートを収集した。全ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各サンプルの純度もＡ２６０／Ａ２３０吸収率から評価した。ｃＤＮＡの合成は、２０μＬの反応物中でＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｇＤＮＡ Ｃｌｅａｒ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）をメーカーの使用説明書に従って使用して０．５～１μｇの鋳型ＲＮＡから実施した。ｑＰＣＲをＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて実施した。ｍＩＦＮα２（ｑＭｍｕＣＥＰ００４３６２９）、ｍＩＦＮβ１（ｑＭｍｕＣＥＰ００５８８７０）のためのＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）プローブアッセイは、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）は、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒｍｉｘまたはｉＱ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のいずれかを使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的な熱サイクリングプログラムは、９５℃、１５０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、１５秒と６０℃、５５秒との３９サイクルからなっていた。標的ｍＲＮＡの定量は、アクチン参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ｑＭｍｕＣＥＰ００３９５８９）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的と参照遺伝子との差として計算した。
値を５匹のマウスの平均（ＰＢＳ群）または３匹のマウスの平均（ｍＩＦＮα２＋ｍＩＦＮ－β群）として下表に示す。ＰＢＳ対照群と比較して、ｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－βをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）株は、ＥＭＴ６腫瘍においてｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－β遺伝子の発現を有意に増大した。
腫瘍へのプラスミドデリバリーおよびその後の異種遺伝子発現およびタンパク質分泌を測定するために、これらの腫瘍においてｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－βタンパク質の量を測定した。このために、ホモジナイズした腫瘍から溶解物を収穫し、タンパク質発現について、フローサイトメトリーベースのサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して、メーカーのプロトコールに従って評価した。
下表に示されるように、ｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－βをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）株は、ＰＢＳ対照腫瘍と比較して腫瘍１グラムあたりの高レベルのｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－βタンパク質を実証し、ＩＶ投与後腫瘍中へのｍＩＦＮα２およびｍＩＦＮ－βの強力なデリバリーを実証した。

［実施例４１］
マウスおよびヒト細胞における膜結合ヒトおよびマウスＩＬ－１２の発現
マウス膜結合ＩＬ－１２ｐ７０（配列番号４６６）を、マウスＩＬ－１２ｐ４０（配列番号３９９の残基３００９～４０１０）と、それに続く１５アミノ酸のリンカー（配列番号４８０；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）およびＩＬ－１２ｐ３５（配列番号３９９の残基４０５６～４６３４）を用いて構築した。マウスＣＤ８０の膜貫通および細胞質部分（配列番号４８１；ＰＰＥＤＰＰＤＳＫＮＴＬＶＬＦＧＡＧＦＧＡＶＩＴＶＶＶＩＶＶＩＩＫＣＦＣＫＨＲＳＣＦＲＲＮＥＡＳＲＥＴＮＮＳＬＴＦＧＰＥＥＡＬＡＥＱＴＶＦＬ）がこの配列に続く。ヒト膜結合ＩＬ－１２ｐ７０（配列番号４６７）を、ヒトＩＬ－１２ｐ４０（配列番号４８２；MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS）とそれに続く１５アミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号４８０）およびヒトＩＬ－１２ｐ３５（RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS、配列番号４８３）を用いて構築した。
ヒトＣＤ８０の膜貫通および細胞質部分（配列番号４８４；ＤＮＬＬＰＳＷＡＩＴＬＩＳＶＮＧＩＦＶＩＣＣＬＴＹＣＦＡＰＲＣＲＥＲＲＲＮＥＲＬＲＲＥＳＶＲＰＶ）がこの配列に続く。
ＨＥＫ細胞を、ウェルあたり２００，０００個細胞でポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベートして、８０％コンフルエンシーを達成した。翌日、３００ｎｇの各プラスミドＤＮＡおよび４０ｎｇのＣＭＶ－ＧＦＰベクター（すなわち、ＣＭＶプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質をコードするベクター）を無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、非トランスフェクトウェルは、陰性対照として働いた（二連測定で）。各サンプルからの細胞培養上清は、トランスフェクションの４８時間後に収集した。
コンストラクトの活性は、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞の、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）細胞との共培養を使用して評価した。トランスフェクションの２４時間後、５ｅ４個のＨＥＫ細胞を剥離し、９６ウェルＴＣプレートに播種した。さらに、５ｅ４個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を同一ウェルに播種した。トランスフェクションの４８時間後、各サンプルから細胞培養上清をトランスフェクションの４８時間後に収集した。ヒトおよびマウスＩＬ－１２生理活性を、その受容体へのＩＬ－１２結合の下流のＳＴＡＴ－４経路の活性化を測定するＳＥＡＰレポーターを測定することによって決定した。ＩＬ－１２生理活性は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光波長にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。
コンストラクトの発現結果は、下表に提供する。マウスおよびヒト膜結合ＩＬ－１２ｐ７０の各々は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞においてＳＴＡＴ４－ＳＥＡＰレポーターを、少なくとも可溶性マウスおよびヒトＩＬ－１２ｐ７０と同程度に活性化し、それによって、コンストラクトの機能性が確認された。
トランスフェクション効率によって正規化した、マウスおよびヒト膜結合型IL-12p70発現
膜結合ＩＬ－１２ｐ７０コンストラクトを、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞の表面での発現についてフローサイトメトリーによって試験した。上記と同じ条件を使用してマウスまたはヒトＩＬ－１２ｐ７０でトランスフェクトされたＨＥＫ野生型細胞を、トランスフェクションの４８時間後に収穫した。細胞をＰＢＳによって剥離し、Ｖ底９６ウェルプレートのウェル中に播種した。細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１回洗浄した。次いで細胞を、５０μＬの、１：１０希釈した抗ヒトＩＬ－１２ｐ７０ ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または１：１０希釈した抗マウスＩＬ－１２ｐ７０ ＡＰＣ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）のいずれかを含有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに再懸濁し、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１：６０００希釈したＤＡＰＩに再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。非トランスフェクト細胞の１．６７％のみがＡＰＣ陽性であったが、膜結合ヒトＩＬ－１２ｐ７０は、４０．４％陽性であり、膜結合マウスＩＬ－１２ｐ７０は、５９．９％であった。したがって、これらの膜結合ＩＬ－１２コンストラクトは、ヒト細胞において良好に発現される。
ヒトまたはマウス膜結合ＩＬ－１２ｐ７０を含有するプラスミドを、マウス初代骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるトランスフェクションによる発現について試験した。野生型マウス骨髄を単離し、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に流し込み、１２００ＲＰＭで５分遠心分離して、骨髄性細胞を収集した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、次いで２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中で９６ウェルのＴＣ処理したプレートに播種した。３日目に、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含む追加のＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳを細胞に加えた。６日後、非付着細胞をウェルからピペットで除き、トランスフェクションのためにＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中、１ウェルあたり２ｅ５細胞で９６ウェルプレートに再播種した。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬を使用し、メーカーの使用説明書に従って細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、３００ｎｇのプラスミドＤＮＡならびに「ＤＮＡなし」（トランスフェクション試薬のみ）対照を、提供された緩衝液で希釈して０．０８μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定で）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。トランスフェクション後４８時間で細胞を収穫して、フローサイトメトリーを使用してＩＬ－１２表面発現についてアッセイした。
細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１回洗浄した。次いで細胞を、５０μＬの、１：１０希釈した抗ヒトＩＬ－１２ｐ７０ ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または１：１０希釈した抗マウスＩＬ－１２ｐ７０ ＡＰＣ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、１：２００希釈したＣＤ１１ｂ ＰＥ、１：２００希釈したクラスＩＩ ＡＰＣ－Ｃｙ７のいずれかを含有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに再懸濁し、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１：６０００希釈したＤＡＰＩ染色に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。樹状細胞集団では、非トランスフェクト細胞の０．２０５％±０．０２１％およびＶＣＩＰ ＩＲＥＳ ＣＭＶ ＮａｎｏＬｕｃがトランスフェクトされた細胞の０．６８５％±０．２６２％のみがＡＰＣ陽性であったが、膜結合ヒトＩＬ－１２ｐ７０は、６．１４％±１．２７％陽性であり、膜結合マウスＩＬ－１２ｐ７０は、２．６４％±０．８７％陽性であった。これらの結果は、膜結合ＩＬ－１２コンストラクトがバックグラウンドを上回ってマウス骨髄樹状細胞の表面で検出されたことを示す。
マウス膜結合ＩＬ－１２ｐ７０を含有するプラスミドも、マウス初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）におけるトランスフェクションによる発現について試験した。野生型マウス骨髄を単離し、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に流し込み、１２００ＲＰＭで５分遠心分離して、骨髄性細胞を収集した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、次いで２０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中で２４ウェルのＴＣ処理したプレートに播種した。３日後、培地を吸引し、２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補充した。細胞をＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬を使用し、メーカーの使用説明書に従って細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、７５０ｎｇのプラスミドＤＮＡならびに「ＤＮＡなし」対照を、提供された緩衝液で希釈し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定で）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。トランスフェクション後４８時間で細胞を収穫して、フローサイトメトリーを使用してＩＬ－１２表面発現のために剥離した。
細胞を１０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて剥離し、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１回洗浄した。次いで細胞を、５０μＬの、１：１０希釈した抗ヒトＩＬ－１２ｐ７０ ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または１：１０希釈した抗マウスＩＬ－１２ｐ７０ ＡＰＣ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、１：２００希釈したＣＤ１１ｂ ＰＥ、１：２００希釈したクラスＩＩ ＡＰＣ－Ｃｙ７のいずれかを含有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに再懸濁し、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１：６０００希釈したＤＡＰＩに再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。非トランスフェクト細胞の０．０１％±０．００３％およびＶＣＩＰ ＩＲＥＳ ＣＭＶ ＮａｎｏＬｕｃがトランスフェクトされた細胞の０．３６％±０．０２８％のみがＡＰＣ陽性であったが、膜結合マウスＩＬ－１２ｐ７０は、１．９４５％±０．１０６％であった。したがって、これらの膜結合ＩＬ－１２コンストラクトは、バックグラウンドを上回ってマウス骨髄マクロファージの表面で検出された。
［実施例４２］
ヒト細胞からのＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの発現
小細胞肺がんにおいて選択的に発現されるデルタ様リガンド３と、ＣＤ３＋Ｔ細胞を標的とし、ＦＬＡＧタグを含有するＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（商標ＢｉＴＥ（登録商標）の下で販売されている）は、抗ＤＬＬ３抗体ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６のアミノ酸配列を使用して設計された。例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１７／０３１４５８ Ａ２を参照されたい。このＢｉＴＥコンストラクトの抗ＣＤ３アームは、クローン１４５－２Ｃ１１から設計された。これらの抗体は、ＣＭＶプロモーターの制御下にｐＡＴＩ－１．７６ベクター中にクローニングされ、３’ＨＰＲＥを有する完全マウス配列である。ヒト投与のために、抗体を必要に応じてヒト化してもよい。配列は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって確認された。得られたコンストラクトの配列は以下の通りである：
ＳＣ１６．５６ ＤＬＬ３ＨＬｘＣＤ３ＨＬ（配列番号４８５）
コンストラクトは、配列番号４８５および以下に示されるように、以下の順序で、マウスＩｇＧＫリーダー、ＳＣ１６．５６ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、ＳＣ１６．５６ ＶＬ、５アミノ酸のリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＬおよびＦｌａｇタグを含む：
ＳＣ１６．５６ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ（配列番号４８６）
コンストラクトは、配列番号４８６および以下に示されるように、以下の順序で、マウスＩｇＧＫリーダー、ＳＣ１６．５６ ＶＬ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、ＳＣ１６．５６ ＶＨ、５アミノ酸のリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＬおよびＦｌａｇタグを含む：
ＳＣ１６．１５ ＤＬＬ３ＨＬｘＣＤ３ＨＬ（配列番号４８７）
コンストラクトは、配列番号４８７および以下に示されるように、以下の順序で、マウスＩｇＧＫリーダー、ＳＣ１６．１５ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、ＳＣ１６．１５ ＶＬ、５アミノ酸のリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＬおよびＦｌａｇタグを含む：
ＳＣ１６．１５ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ（配列番号４８８）
コンストラクトは、配列番号４８８および以下に示されるように、以下の順序で、マウスＩｇＧＫリーダー、ＳＣ１６．１５ ＶＬ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、ＳＣ１６．１５ ＶＨ、５アミノ酸のリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＬおよびＦｌａｇタグを含む：
ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＨＬｘＣＤ３ＨＬ（配列番号４８９）
コンストラクトは、配列番号４８９および以下に示されるように、以下の順序で、マウスＩｇＧＫリーダー、ＳＣ１６．３４ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、ＳＣ１６．３４ ＶＬ、５アミノ酸のリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＬおよびＦｌａｇタグを含む：
ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ（配列番号４９０）
コンストラクトは、配列番号４９０および以下に示されるように、以下の順序で、マウスＩｇＧＫリーダー、ＳＣ１６．３４ ＶＬ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、ＳＣ１６．３４ ＶＨ、５アミノ酸のリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＨ、１５アミノ酸のＧＳリンカー、１４５－２Ｃ１１ ＶＬおよびＦｌａｇタグを含む：
１．５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リシンでコートした６ウェルプレートに１日前にプレーティングし、８０％コンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの当日に、３μｇのＤＮＡを無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。４８時間のインキュベーション後、各サンプルから細胞培養上清を収集した。いくつかの上清は１０ｋＤａのスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において濃縮した。
ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥをコードするプラスミドでトランスフェクトされたこれらの細胞の機能性は、表面にＤＬＬ３を有するＳＨＰ７７細胞（ＡＴＣＣ）への、細胞上のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの結合によって実証された。５００，０００個のＳＨＰ７７細胞をＶ底９６ウェルプレートのウェル中に播種した。細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１回洗浄した。細胞を、５０μＬの、非トランスフェクト細胞またはＢｉＴＥでトランスフェクトされた細胞のいずれかに対応する濃縮ＨＥＫ上清を含有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに再懸濁した。３０分後、細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄した。次いで細胞を、５０μＬの、１：１００希釈の抗Ｆｌａｇビオチン（Ｓｉｇｍａ）または１：２００希釈のプロテインＬビオチン（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）のいずれかを含有するＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄した。続いて、細胞を１：２００希釈のストレプトアビジンＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。
細胞を、１３００ＲＰＭで３分間遠心分離することによってＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで１：６０００希釈したＤＡＰＩに再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
下表は、ＢｉＴＥで染色され、プロテインＬまたは抗Ｆｌａｇ抗体のいずれかによって検出された細胞に対応するＡＰＣ陽性としてゲーティングした陽性細胞のパーセントを提供する。ＳＣ１６．５６ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ、ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＨＬｘＣＤ３ＨＬおよびＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ ＢｉＴＥはすべて、ＳＨＰ７７細胞で同様の検出を有するが、他のＢｉＴＥは検出されない。したがって、ＳＣ１６．５６ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ、ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＨＬｘＣＤ３ＨＬおよびＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬは、ＤＬＬ３に結合する。
DLL3xCD3二重特異性T細胞エンゲージャーDLL SHP77細胞を発現する細胞の結合
発現されたＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーをまた、ＥＬＩＳＡを用いてＤＬＬ３への、およびＣＤ３への結合について評価した。このＥＬＩＳＡは、同一アッセイでＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する正しくフォールディングされたＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを検出するように開発された。ヒトＤＬＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で高タンパク質結合９６ウェルプレート上に４℃で一夜コーティングした。次いで、ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄し、ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて室温で、１時間ブロックした。次いで、ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄した。ウェルにＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清を加え、室温で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、ウェルにヒトＩｇＧ ＦｃコンジュゲートＣＤ３ｅを加え（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、室温で１時間インキュベートした。再度ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒト抗体を１時間のインキュベーションのために加えた。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、ウェルに検出試薬（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。硫酸（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で酵素反応を停止し、４５０ｎｍで光学密度を読み取った。
下表は、４５０ｎｍの吸光度として示されるこのＥＬＩＳＡの結果を提供する。ＳＣ１６．５６ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ、ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＨＬｘＣＤ３ＨＬおよびＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬ ＢｉＴＥ 抗体のすべてが検出され、これらのＢｉＴＥ抗体が十分に機能性であることを示す。ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬは、このＥＬＩＳＡにおいて最高の結合を有するが、このアッセイでは細胞上清が使用されたので、この結果が、他の３種の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーと比較して、この二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのより高い濃度のためか、その標的に対するより高い親和性のためかを区別することはできない。別個の実験では、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製し、このＥＬＩＳＡで実行した。ＳＣ１６．３４ ＤＬＬ３ＬＨｘＣＤ３ＨＬは、バックグラウンドを上回るＥＬＩＳＡシグナルを示す唯一精製されたＢｉＴＥであった。
ELISAによるBiTE結合

［実施例４３］
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４およびＣＤ８６／ＣＴＬＡ－４相互作用の封鎖を実証し、ヒトＳＴＩＮＧＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴと同時発現する
ヒトＣＴＬＡ－４に特異的なｓｃＦｖ－Ｆｃ（それぞれ、核酸およびタンパク質配列については配列番号４２７および４２８を参照されたい）を、イピリムマブのアミノ酸配列を使用して設計した。イピリムマブは、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する完全にヒトのＩｇＧ１κモノクローナル抗体であり（例えば、米国特許公開第２００２／００８６０１４号および米国特許第６，９８４，７２０号において１０Ｄ１と命名される抗体を参照されたい）、ＣＤ８０（Ｂ７．１またはＢ７－１としても知られる）およびＣＤ８６（Ｂ７．２またはＢ７－２としても知られる）とのＣＴＬＡ－４’免疫阻害性相互作用をブロックする。
イピリムマブｓｃＦｖ抗体断片（配列番号４２９を参照）を生成するため、イピリムマブの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を２０アミノ酸長さのグリシン－セリン（ＧＳ）リンカー［ＧＧＧＧＳ）４］に連結した。ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片（配列番号４２８を参照）を生成するため、イピリムマブｓｃＦｖの可変重鎖を、ヒンジ領域の遊離のシステインのセリンへの突然変異（配列番号４２８の２７２位における）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃに連結した。リーダー配列（ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ；配列番号４２８の残基１～２０に対応）は、ヒト免疫グロブリンカッパ可変３～２０（ＩＧＫＶ３－２０）タンパク質の配列から誘導した。配列はＧｅｎＳｃｒｉｐ ＧｅｎＳｍａｒｔ（商標）Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツールを使用してヒトのためにコドン最適化した。（ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣ）；配列は、配列番号４９１に示されている。
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの中和能力を、抗体断片のＣＴＬＡ－４とそのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用をブロックする能力を測定する競合的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、適正な試薬：ＤＮＡ比にて、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片コンストラクトをコードする３マイクログラムのＤＮＡによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含まない培養上清を収穫し、濾過し、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片の封鎖活性を評価する競合的ＥＬＩＳＡに使用した。
競合的ＥＬＩＳＡのため、高タンパク質結合性９６ウェルプレートを濃度１００ｎｇ／ｍｌのヒトＣＤ８０またはＣＤ８６組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を一夜、４℃でコートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて３回洗浄し、ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて室温で、１時間ブロックした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄した。抗ＣＴＬＡ－４抗体断片のそれぞれを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清を１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＣＴＬＡ－４－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合してウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１抗体をウェルに加え（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、検出試薬［３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］をウェルに加えた。硫酸（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて酵素反応を停止し、光学密度を４５０ｎｍで読み取った。
競合的ＥＬＩＳＡの結果を下表にまとめる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－ＦｃはＣＴＬＡ－４のＣＤ８６への結合を９４．１４％ブロックし、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０への結合を８３．４６％ブロックした。ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４ブロッキング活性と比較して、より高い程度のＣＤ８６／ＣＴＬＡ－４ブロッキング活性を有していた。
競合的ELISA結果
ヒト抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号４２７）を、血管内皮増殖因子および１型コラーゲン誘起可能タンパク質（ＶＣＩＰ）ＩＲＥＳを含有するか、含有しないｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴを有する発現ベクター中にクローニングした。内因性ＳＴＩＮＧを含有せず、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下に配置された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ＩＳＲＥのコード配列がノックイン技術を使用してＳＥＡＰ ＯＲＦによって置換されている、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。したがって、ＳＴＩＮＧ活性は、Ｉ型ＩＦＮによって誘導されたＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価される。２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞はまた、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に配置されたＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ、分泌型ルシフェラーゼも発現し、ＩＦＮ－βのコード配列は、ノックイン技術を使用してＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼＯＲＦによって置換されている。これによって、ＩＦＮ－βの発現をモニタリングすることによってＳＴＩＮＧ活性の評価が可能となる。これらの細胞を使用して、ＩＳＲＥ誘導性ＳＥＡＰ産生および／またはＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼのＩＦＮ－β依存性発現をモニタリングすることによって、ＳＴＩＮＧ活性を評価できる。２つのレポータータンパク質、ＳＥＡＰおよびＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼは、標準的なアッセイおよび検出試薬、例えば、それぞれ、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）およびＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して細胞上清において測定できる。
細胞を、ウェルあたり２００，０００個細胞でポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベートして、８０％コンフルエンシーを達成した。翌日、３００ｎｇの各プラスミドＤＮＡおよび４０ｎｇのＣＭＶ－ＧＦＰベクター（すなわち、ＣＭＶプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質をコードするベクター）を無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、非トランスフェクトウェルは、陰性対照として働いた（二連測定で）。各サンプルからの細胞培養上清は、トランスフェクションの４８時間後に収集した。
ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体のＳＴＩＮＧ活性を、ＩＳＲＥ－ＳＥＡＰおよびＩＦＮ－β－Ｌｕｃｉａ（商標）レポーターシステムを使用して評価した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性（ＳＴＩＮＧによって誘起される）は、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激ＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価した。２０μＬの細胞培養上清を、ＳＥＡＰを測定するために使用する１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光波長にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性（ＳＴＩＮＧによって誘起される）はまた、細胞上清においてＩ型ＩＦＮ刺激Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ産生をモニタリングすることによって評価した。２０μＬの細胞培養上清を、５０μＬの、Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定するために使用されるＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、発光設定でＩＦＮβ誘起Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定することによって決定した。
細胞培養上清はまた、ヒトＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現について評価した。ヒトＣＴＬＡ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で高タンパク質結合９６ウェルプレート上に４℃で一夜コーティングした。次いで、ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄し、ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて室温で、１時間ブロックした。次いで、ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄した。ウェルに抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ－Ｆｃを含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清を加え、室温で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒト抗体を１時間のインキュベーションのために加えた。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、ウェルに検出試薬（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。硫酸（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で酵素反応を停止し、４５０ｎｍで光学密度を読み取った。
ヒト抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ＋ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴコンストラクトの発現結果を以下に示す。両ペイロードを含有するコンストラクトは、各タンパク質の発現を保持した。ヒト抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｔ２Ａ ｈＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴコンストラクトは、ＶＣＩＰ ＩＲＥＳを有さずにより良好なＳＴＩＮＧ活性を有していた。ＶＣＩＰ ＩＲＥＳを有さないコンストラクトからのＥＬＩＳＡによる抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現はより高く、個々の標的が発現の改善のために特有のエレメントを必要とする場合があることを実証する。
トランスフェクション効率によって正規化した、ヒト抗CTLA4 scFv-Fc + STING発現

［実施例４４］
マクロファージの細菌株感染によって、ＭＨＣ－Ｉ分子による免疫原性ペプチドの提示が可能となる
この実施例は、本明細書において提供される細菌は、ｍＲＮＡデリバリーまたはプラスミドＤＮＡデリバリーのいずれかを用いて抗原提示細胞をバクトフェクトし、得られた発現産物は、抗原提示細胞によって提示されることを示す。この実証のために使用された抗ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ－２Ｋｂ抗体は、ＩＣ２１細胞の表面にＭＨＣ－Ｉ（Ｈ－２Ｋｂ）によって提示される場合にのみオボアルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号４９２］ペプチドに特異的に結合する。これは、本明細書において提示されるワクチン株、例えば、ＳＴＩＮＧ＋ＩＬ－１５受容体複合体＋がん抗原をコードするものが、免疫砂漠腫瘍を処置できる、またネオアジュバント設定でがんワクチンとして使用できる可能性がある、また予防接種のために病原性抗原を提示するプラットフォームとして使用できる、また病原体感染、例えば、ＭＲＳＡ、慢性ウイルス性肝炎感染、慢性ｐ．ジンジバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ＨＩＶおよび他の慢性感染症ならびに急性感染などの処置として使用できることを実証する。
上記の実証では、この実施例における実験は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと呼ばれる例示的株による抗原提示細胞の感染が、どのようにＣＤ８＋Ｔ細胞に対する主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）による免疫原性ペプチドの提示をもたらすかを示す。真核生物のＣＭＶプロモーターおよび原核生物のＭＴＬプロモーター下にニワトリオボアルブミンをコードし、それに続いて脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する、または有さないＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ 株を生成した。ニワトリオボアルブミンは、モデル抗原であり、ニワトリオボアルブミン由来の免疫優性ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、抗原提示細胞の表面でのマウスＨ－２Ｋｂ ＭＨＣ－Ｉ分子によるその提示についてモニタリングした。マウス腹膜マクロファージ細胞株ＩＣ２１（ＡＴＣＣ）をアッセイにおいて抗原提示細胞として使用した。
９６ウェル平底プレートのウェルあたり５００００個のＩＣ２１細胞を１００μｌのＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳ中で播種し、３７℃および５％ ＣＯ２インキュベーター中で一夜静置した。翌日、ＩＣ２１細胞にＣＭＶまたはＭＴＬプロモーターの制御下にニワトリオボアルブミンをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株を感染させた。細菌株を培養細胞に加え、プレートを室温にて５００ｇで５分間遠心分離した。次いで細胞を３７℃で１時間インキュベートし、ゲンタマイシンを含有する培養培地を５０μｇ／ｍｌの終濃度に加えた。感染細胞を３７℃および５％ ＣＯ２インキュベーター中で７時間静置した。感染の７時間後、ＰＢＳ １０ｍＭ ＥＤＴＡを使用してＩＣ２１細胞を剥離し、抗マウスＦ４／８０ ＡＰＣコンジュゲート抗体および抗ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ－２Ｋｂ ＰＥコンジュゲート抗体（両方ともＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）を用いて染色し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターを使用してデータを獲得した。
抗ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ－２Ｋｂ抗体は、ＩＣ２１細胞の表面にＭＨＣ－Ｉ（Ｈ－２Ｋｂ）によって提示される場合にのみオボアルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに特異的に結合する。感染７時間後のＩＣ２１細胞によるＨ－２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ提示の平均蛍光強度を測定した。結果を下表に示し、これは、非感染細胞を上回るオボアルブミンをコードする株を用いて処置された群において観察された正味の平均蛍光強度（正味のＭＦＩ）を示す。

*SEM =平均の標準誤差
この実施例は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤなどの株の、送達されると抗原提示細胞によって処理され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して提示されて、病原体もしくはがん細胞と関連する、またはそれに由来する抗原に対してＴ細胞特異的応答を開始する抗原を送達する能力を示す。
改変は当業者には明らかであるので、本発明は添付した請求項の範囲によってのみ限定されることが意図されている。

Claims (393)

  1. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、細菌がゲノム改変を含み、それによって、細菌が、活性チミジル酸シンターゼを産生せず、増殖のための補給を必要とする、免疫刺激細菌。
  2. 増殖のための補給が、チミン、チミン誘導体、チミジン、チミジン誘導体、チミン前駆体（複数可）、チミジン前駆体（複数可）、またはチミジン一リン酸前駆体（複数可）を含む、請求項１に記載の免疫刺激細菌。
  3. 細菌が、ＴＬＲ２、および必要に応じてＴＬＲ４ならびに／またはＴＬＲ５の活性化を低減もしくは排除するゲノム改変を含む、請求項１または請求項２に記載の免疫刺激細菌。
  4. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    細菌が、ゲノム改変を含み、それによって、細菌が、活性アスパラギナーゼを分泌せず、
    細菌が、ＴＬＲ２、および必要に応じてＴＬＲ４ならびに／またはＴＬＲ５の活性を低減もしくは排除するゲノム改変を含む、免疫刺激細菌。
  5. 免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子ａｎｓＢのすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊または改変によって改変されており、それによって、細菌がａｎｓＢ－であり、かつ活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現しない、請求項１～４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  6. ＴＬＲ２の活性化を低減または排除するゲノム改変（複数可）を含み、それによって、Ｉ型ＩＦＮの誘導がＴＬＲ２によって阻害されない、免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌が、ゲノム改変（複数可）を含み、それによって、それがインビボでは複製することができないが、栄養補給した状態でインビトロで増殖されるとき、複製することができ、
    ゲノム改変（複数可）が、チミジル酸シンターゼを排除もしくは不活性化し、それによって、細菌がｔｈｙＡ－である免疫刺激細菌。
  7. ＴＬＲ２の活性化を低減もしくは排除するゲノム改変（複数可）を含み、それによって、Ｉ型ＩＦＮの誘導がＴＬＲ２によって阻害されない、免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌が、インターフェロンをコードするか、またはＩ型インターフェロンを構成的に誘導する改変ＳＴＩＮＧタンパク質をコードし、かつ病原体または腫瘍からの抗原もしくはタンパク質をコードするプラスミドを含む、免疫刺激細菌。
  8. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが、遺伝子（単数もしくは複数）のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変され、それによって、細菌が、ペンタアシル化リピドＡを有するリポ多糖（ＬＰＳ）を生じるように改変されており、
    ヘキサアシル化リピドＡを有するリポ多糖が、野生型細菌と比べて少なくとも１０倍実質的に低減されているか、または不在であり、
    細菌のゲノムが、必須栄養素について栄養要求性であるように改変されており、
    細菌のゲノムが改変されており、それによって、細菌それ自体が、感染免疫細胞中でＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の誘導を阻害または防止せず、ならびに
    細菌のゲノムが改変されており、それによって、それが活性アスパラギナーゼおよび／もしくはチミジル酸シンターゼをコードまたは産生しない、免疫刺激細菌。
  9. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが、遺伝子（単数もしくは複数）のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変され、それによって、細菌が、ペンタアシル化リピドＡを有するリポ多糖（ＬＰＳ）を生じるように改変されており、
    ヘキサアシル化リピドＡを有するリポ多糖が、野生型細菌と比べて少なくとも１０倍実質的に低減されているか、または不在であり、
    細菌のゲノムが改変されており、それによって、それが活性チミジル酸シンターゼを産生せず、それによって、細菌がｔｈｙＡ－である、免疫刺激細菌。
  10. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが、遺伝子（単数もしくは複数）のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変され、それによって、細菌が、鞭毛を失っており、
    無改変免疫刺激細菌が、鞭毛を有し、および
    細菌のゲノムが改変されており、それによって、それが活性チミジル酸シンターゼを産生しない、免疫刺激細菌。
  11. ゲノム改変が、欠失、挿入、および／または置換を含み、それによって、細菌がｔｈｙＡ－である、請求項９または請求項１０に記載の免疫刺激細菌。
  12. ゲノムが、細菌がｃｕｒｌｉ線毛を失うように改変される、請求項１～１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  13. 細菌が、ＴＬＲ４および／もしくはＴＬＲ５の活性化を低減または排除するゲノム改変を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  14. ゲノム改変が、鞭毛を有さない細菌をもたらし、細菌の野生型が鞭毛を有する、請求項１～１３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  15. 細菌が、ｃｕｒｌｉ線毛を産生しない、請求項１～１４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  16. ゲノム改変が、ペンタアシル化リポ多糖をもたらす、請求項１～１５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  17. 鞭毛を失い、かつｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である、請求項１～１６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  18. ＴＬＲ２の活性化を低減または排除するゲノム改変を含み、それによって、Ｉ型ＩＦＮの誘導が、ＴＬＲ２によって阻害されない、免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌が、真核生物宿主中でインビボで複製することができ、
    免疫刺激細菌が、腫瘍関連抗原をコードするか、または腫瘍抗原とＳＴＩＮＧタンパク質とをコードするか、または腫瘍関連抗原とインターフェロンアルファとをコードするか、または腫瘍関連抗原とインターフェロンベータとをコードするプラスミドを含む、免疫刺激細菌。
  19. 細菌が、無改変のヒトＳＴＩＮＧタンパク質と比べてＩ型インターフェロンの誘導が増加した、改変されたＳＴＩＮＧタンパク質であるＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、請求項１～１８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  20. 改変されたＳＴＩＮＧタンパク質が、請求項４０６～４３１のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項１９に記載の免疫刺激細菌。
  21. 改変されたＳＴＩＮＧタンパク質が、置換Ｍ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを含む、請求項２０に記載の免疫刺激細菌。
  22. プラスミド中にコードされている治療用産物が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるか、またはコードされている生成物が、インターフェロン－アルファであるか、もしくはインターフェロン－ベータであるか、またはコードされている産物が、ＩＦＮ－アルファおよびＩＦＮ－ベータの両方である、請求項１～２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  23. Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である治療用産物が、ＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項２２に記載の免疫刺激細菌。
  24. プラスミドが、病原体もしくは腫瘍からの抗原、エピトープ（複数可）、またはタンパク質をコードする、請求項１～２３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  25. 異種タンパク質の組合せをコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが、遺伝子（単数もしくは複数）のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変され、それによって、細菌が、ＴＬＲ２、および必要に応じてＴＬＲ４とＴＬＲ５との一方または両方による認識が減弱しており、
    １つの産物が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であり、
    抗原、それからのエピトープ（単数または複数）である第２の産物が、抗原であるか、または病原体もしくは腫瘍に対する免疫化のためのタンパク質である、免疫刺激細菌。
  26. 細菌のゲノムが改変されており、それによって、細菌がｃｕｒｌｉ線毛を有さない、請求項２５に記載の免疫刺激細菌。
  27. 原核生物プロモーターに作用可能に連結された核酸を含む免疫刺激細菌であって、
    核酸が、原核生物による翻訳に必要な配列を失っているＲＮＡをコードし、それによって、ＲＮＡが、細菌中で産生され、
    コードされているＲＮＡが、シャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を失っており、および／もしくは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み、ならびに／または翻訳リードスルー２Ａペプチドを含む、免疫刺激細菌。
  28. 原核生物プロモーターに作用可能に連結された核酸を含む免疫刺激細菌であって、核酸が、原核生物による翻訳に必要な配列を失っているＲＮＡを含む、免疫刺激細菌。
  29. ＲＮＡが、シャイン・ダルガノ配列を失っている、請求項２８に記載の免疫刺激細菌。
  30. ２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａのうちの１つまたは複数である、請求項２７～２９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  31. 治療用産物をコードする核酸が、原核生物プロモーターに作用可能に連結されており、
    核酸が、原核生物による翻訳に必要な配列を失っているＲＮＡをコードし、それによって、ＲＮＡが、細菌中で産生され、
    ＲＮＡが、シャイン・ダルガノ配列を失っており、および配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または翻訳リードスルー２Ａペプチドを含む、請求項１～３０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  32. 原核生物プロモーターが、細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターである、請求項２７～３１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  33. プロモーターが、バクテリオファージプロモーターである、請求項３２に記載の免疫刺激細菌。
  34. ファージＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項３２または請求項３３に記載の免疫刺激細菌。
  35. プロモーターが、配列番号３９３～３９６、それぞれ：
    attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtataatgcagcaag、または
    ttatgcttgacgctgcgtaaggtttttgttataatacaccaag、または
    attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtaaatgcagcaag、または
    gatcccggagttcatgcgtgatgcaatgaaagtgccgttctacttcggtgggacctcactgcttatcgttgttgtcgtgattatggactttatggctcaagtgcaaactctgatgatgtccagtcagtatgagtctgcattgaagaaggcgaacctgaaaggctacggccgttaattggtcgcctgagaagttacggagagtaaaaatgaaagttcgtgcttccgtcaagaaattatgccgtaactgcaaaatcgttaagcgtgatggtgtcatccgtgtgatttgcagtgccgagccgaagcataaacagcgccaaggctgattttttcgcatatttttcttgcaaagttgggttgagctggctagattagccagccaatcttttgtatgtctgtacgtttccatttgagtatcctgaaaacgggcttttcagcatggtacgtacatattaaatagtaggagtgcatagtggcccgtatagcaggcattaacattcctgatcagaaacacgccgtgatcgcgttaacttcgatctacggtgtcggcaagacccgttctaaagccatcctggctgcagcgggtatcgctgaaaatgttaagatcctctagatttaagaaggagatatacat（サルモネラ属ｒｐｓｍプロモーター）のいずれかを含むプロモーターから選択される、請求項３２に記載の免疫刺激細菌。
  36. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が組織常在骨髄性細胞に感染し、上皮細胞には感染しない、請求項２７～３５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  37. 細菌が、鞭毛を失い、
    ゲノム改変を伴わない細菌が、鞭毛を含む、請求項３６に記載の免疫刺激細菌。
  38. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、細菌によるマクロファージの感染が、ヒトＭ２マクロファージをＭ１またはＭ１様表現型マクロファージに変換する、免疫刺激細菌。
  39. 治療用産物が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である、請求項３８に記載の免疫刺激細菌。
  40. Ｉ型ＩＦＮの発現が構成的である、請求項３９に記載の免疫刺激細菌。
  41. 治療用産物が、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である治療用産物の機能獲得型（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＧＯＦ）変異体であり、変異体ＧＯＦ生成物が、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすために、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを必要としない、請求項３９または請求項４０に記載の免疫刺激細菌。
  42. 産物が変異体ＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項３９～４１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  43. 細菌による感染が、ヒトＭ２マクロファージをＭ１様のＩ型ＩＦＮ産生細胞に変換する、請求項３８～４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  44. 鞭毛を失っており、野生型細菌が鞭毛を有し、ｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である、請求項１～４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  45. サルモネラ菌株である、請求項４４に記載の免疫刺激細菌。
  46. 治療用産物が、抗がん治療薬である、請求項１～４５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  47. 治療用産物が、抗ウイルス治療薬または抗病原性細菌治療薬である、請求項１～４５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  48. 抗ウイルス治療薬が、ウイルス酵素を阻害するか、またはウイルス複製を阻害する、請求項４７に記載の免疫刺激細菌。
  49. 治療薬が、その発現がウイルスに対する免疫防御応答をもたらすウイルス抗原である抗ウイルス治療薬であり、または抗ウイルス治療薬が、ウイルス抗原に結合するか、またはそれと相互作用し、それによってウイルスが阻害もしくはブロックされるか、または抗ウイルス免疫をもたらす抗体である、請求項４７に記載の免疫刺激細菌。
  50. 治療薬が、その発現が細菌性病原体に対する免疫防御応答をもたらす細菌抗原である抗菌治療薬であり、または抗菌治療薬が、細菌抗原に結合するか、またはそれと相互作用し、それによって病原性細菌が阻害もしくはブロックされるか、または抗病原性細菌免疫をもたらす抗体である、請求項４７に記載の免疫刺激細菌。
  51. 持続性感染を引き起こすウイルスまたは感染性因子を処置するための抗ウイルス治療薬をコードする、請求項４７～５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  52. 抗ウイルス治療薬が、ウイルス抗原または抗原のエピトープであり、抗原が、ウイルス表面タンパク質、またはウイルスヌクレオカプシドタンパク質、またはウイルス非構造タンパク質、またはウイルスオープンリーディングフレームタンパク質を含む、請求項４７～４９および５１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  53. ウイルスまたは感染性因子が、慢性感染症を引き起こす、請求項５１に記載の免疫刺激細菌。
  54. ウイルスまたは感染性因子が、潜在性感染症を引き起こす、請求項５１に記載の免疫刺激細菌。
  55. ウイルスまたは感染性因子が、遅発性感染症を引き起こす、請求項５１に記載の免疫刺激細菌。
  56. ウイルスまたは感染性因子が、Ｔ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹ウイルス、パポバウイルス、プリオン、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、コロナウイルス、天然痘ウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、黄熱病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、およびパピローマウイルスの中から選択される、請求項５１に記載の免疫刺激細菌。
  57. ウイルスが、ＨＩＶであるか、または肝炎ウイルスである、請求項５１に記載の免疫刺激細菌。
  58. 感染性因子が、プリオンまたは原生動物である、請求項５１に記載の免疫刺激細菌。
  59. 治療用産物が、宿主中で免疫応答を引き起こすのに十分なウイルス表面抗原またはその一部である、請求項４７～５８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  60. 治療用産物が、ウイルス遺伝子の発現または複製を妨げる、請求項５１～５９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  61. 細菌が、免疫刺激タンパク質をコードする、請求項１～６０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  62. 免疫刺激タンパク質が、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質、改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激受容体もしくはリガンドである、請求項６１に記載の免疫刺激細菌。
  63. 細菌がゲノム改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っている、請求項１～６２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  64. 細菌がゲノム改変を含み、それによって、細菌がｐａｇＰ－またはｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である、請求項１～６３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  65. 細菌が、細菌ゲノム改変を含み、それによって、それが、アスパラギナーゼを発現しないか、または分泌アスパラギナーゼの合成を活性化せず、および／または
    免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子ａｎｓＢのすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌がａｎｓＢ－であり、かつ活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現しない、請求項１～６４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  66. 腫瘍および／または腫瘍微小環境にコロニー形成する抗がん治療薬であり、それによって、ａｎｓＢ－表現型が、活性アスパラギナーゼの産生を低減もしくは排除する、請求項６５に記載の免疫刺激細菌。
  67. 原核生物プロモーターに作用可能に連結された核酸を含む免疫刺激細菌であって、
    核酸が、原核生物による翻訳に必要な配列を失っているＲＮＡを含み、それによって、ＲＮＡが、細菌中で産生されるが、細菌によって翻訳されることができず、
    細菌が、ゲノム改変を有し、それによって、感染が骨髄性細胞に限定され、
    ＲＮＡが、治療用産物をコードするか、または治療用産物である、免疫刺激細菌。
  68. 骨髄性細胞に主に、またはそれのみに感染する免疫刺激細菌を含み、原核生物プロモーターの制御下で細菌によってコードされているＲＮＡを含むＲＮＡデリバリーシステムであって、
    ＲＮＡが、細菌による翻訳に必要な調節配列を失っており、
    ＲＮＡが、治療用産物をコードするか、または治療用産物である、ＲＮＡデリバリーシステム。
  69. 転写されたＲＮＡが、シャイン・ダルガノ配列を失っている、請求項６７に記載の免疫刺激細菌または請求項６８に記載のＲＮＡデリバリーシステム。
  70. 転写されたＲＮＡが、シャイン・ダルガノ配列を失っており、コザックコンセンサス配列を含む、請求項６７に記載の免疫刺激細菌または請求項６８に記載のＲＮＡデリバリーシステム。
  71. コザックコンセンサス配列が、ＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号３９７）である、請求項７０に記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  72. 細菌が、鞭毛を失い、ゲノム改変を含有し、それによって、それがｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である、請求項６７～７０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  73. 治療用産物をコードするか、または治療用産物であるＲＮＡが、プラスミド上でコードされている、請求項６７～７２のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  74. ＲＮＡをコードする核酸が、誘導的である原核生物プロモーターに作用可能に連結している、請求項６７～７３のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  75. ＲＮＡをコードする核酸が、構成的である原核生物プロモーターに作用可能に連結している、請求項６７～７３のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  76. ＲＮＡをコードする核酸が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項６７～７５のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  77. 免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子ａｎｓＢのすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌がａｎｓＢ－であり、かつ活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現しない、請求項１～７６のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  78. 免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子ａｎｓＢのすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって、および遺伝子ｃｓｇＤのすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって、改変されており、それによって、細菌がａｎｓＢ－であり、かつ活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず、ならびにｃｓｇＤ－であり、かつｃｕｒｌｉ線毛の合成を活性化しない、請求項１～７７のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  79. 細菌ゲノムが、鞭毛をコードする遺伝子のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊さらに含み、それによって、細菌がフラゲリン－であり、鞭毛を産生せず、野生型細菌が、鞭毛を有する、請求項１～７８のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  80. 細菌のゲノムが、遺伝子ｃｓｇＤのすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によってさらに改変されており、それによって、細菌が、ｃｓｇＤ－であるか、またはゲノム中に別のもしくは追加の改変を有し、それによって、バイオフィルム形成が損なわれる、請求項７９に記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  81. 細菌のゲノムが、遺伝子のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によってさらに改変されており、それによって、細菌がｃｓｇＤ－／ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である、請求項７９に記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  82. 細菌が、ゲノムの改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っている、請求項６９～８１のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはＲＮＡデリバリーシステム。
  83. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っており、ｌｐｐＡ－／ｌｐｐＢ－であり、ｃｓｇＤ－であってもよい、免疫刺激細菌。
  84. 細菌がプリンについて栄養要求性である、請求項１～８３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  85. 細菌が、アデノシンについて栄養要求性であるか、またはアデノシン、アデニン、およびＡＴＰについて栄養要求性である、請求項１～８３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  86. 細菌がｐｕｒＩ－である、請求項１～８５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  87. 細菌がｐａｇＰ－である、請求項１～８６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  88. 細菌が、ａｓｄ－であるか、またはｔｈｙＡ－であるか、またはその両方である、請求項１～８７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  89. アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素－（ａｓｄ－）であり、細菌が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードする内在性遺伝子のすべてもしくは一部分の破壊または欠失によってａｓｄ－であり、それによって、内在性ａｓｄが発現されないか、または機能性酵素が産生されず、あるいは内在性遺伝子（単数または複数）のすべてもしくは一部分の破壊または欠失によってｔｈｙＡ－であり、それによって、内在性チミジル酸シンターゼが発現されないか、または機能性酵素が産生されない、請求項１～８８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  90. アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素－（ａｓｄ－）である免疫刺激細菌であって、
    細菌が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードする内在性遺伝子のすべてもしくは一部分の破壊または欠失によってａｓｄ－であり、それによって、内在性ａｓｄが発現されないか、または機能性酵素が産生されず、かつ
    細菌が、内在性遺伝子（単数または複数）のすべてもしくは一部分の破壊または欠失によってｔｈｙＡ－であり、それによって、内在性チミジル酸シンターゼが発現されないか、または機能性酵素が産生されない、免疫刺激細菌。
  91. 無改変細菌が、サルモネラ細菌である、請求項９０に記載の免疫刺激細菌。
  92. 細菌プロモーターの制御下に、プラスミド上にアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードする、請求項１～９１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  93. 細菌がｍｓｂＢ－である、請求項１～９２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  94. ａｓｄ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、かつｐａｇＰ－である、請求項１～９３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  95. ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－およびｐａｇＰ－であるか、またはｔｈｙＡ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－およびｐａｇＰである、請求項１～９４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  96. ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－およびｐａｇＰ－であるか、またはａｎｓＢ－、ｔｈｙＡ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－およびｐａｇＰ－である、請求項１～９５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  97. コードされている治療用産物が、抗がん治療薬である、請求項１～９６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  98. プラスミドが、改変されたＳＴＩＮＧおよびＩＬ－１５またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体をコードし、ＳＴＩＮＧが、ｃＧＡＳおよび／または任意のＳＴＩＮＧリガンドの不在下でＩ型ＩＦＮを構成的に誘導する、請求項１～９７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  99. 細菌が、ａｎｓＢ－、ｔｈｙＡ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－およびｐａｇＰ－である、請求項１～９８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  100. 治療用産物をコードする核酸が、分泌シグナルをコードする核酸に作用可能に連結しており、それによって、発現されると、治療用産物が分泌される、請求項１～９９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  101. コードされている治療用産物が抗ウイルス産物である、請求項１～１００のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  102. コードされている治療用産物がウイルス抗原である、請求項１～１００のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  103. コードされている治療用産物が抗ウイルス抗体である、請求項１００～１０２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  104. コードされている治療用産物が、抗ウイルス産物であり、
    選択されるウイルスが、慢性感染症または遅発性感染症を引き起こすものである、請求項１００～１０３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  105. コードされている治療用産物が、抗ウイルス産物であり、
    選択されるウイルスが、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、およびレトロウイルスの中から選択される、請求項１００～１０４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  106. プラスミドのコピー数が、１５０より大きい、請求項１～１０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  107. プラスミドのコピー数が１５０コピーもしくはそれ未満であるか、または１５０以下である、請求項１～１０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  108. プラスミドが低コピー数で存在し、低コピー数が、２５未満もしくは２０未満、または約２５未満もしくは約２０コピー未満である、請求項１～１０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  109. コードされている治療用産物が、核酸またはタンパク質である、請求項１～１０８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  110. コードされている治療用産物がタンパク質である、請求項１０９に記載の免疫刺激細菌。
  111. プラスミドが２種以上の治療用産物をコードする、請求項１～１１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  112. プラスミド上にコードされている治療用産物が抗がん処置である、請求項１０９～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  113. プラスミド上のコードされている治療用産物（複数可）が、抗ウイルス処置（複数可）である、請求項１０９～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  114. 細菌が、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、および共刺激受容体または分子の中から選択される、請求項１１２または請求項１１３に記載の免疫刺激細菌。
  115. 共刺激分子が細胞質ドメインを失っている、請求項１１４に記載の免疫刺激細菌。
  116. 治療用産物の１つまたは複数をコードする核酸が、細菌を含む細胞から治療用産物を分泌するためのシグナルをコードする核酸を含む、請求項１～１１５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  117. プラスミド上で産物をコードしている核酸が、真核生物宿主によって認識される調節配列に作用可能に連結されている、請求項１～１１６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  118. 免疫刺激細菌が２種以上の産物をコードし、各産物の発現が、個別のプロモーターの制御下にあるか、またはすべての発現が、単一プロモーターの制御下にあり、コードされている各治療用産物の別個の翻訳を引き起こすように、各産物が、２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されている、請求項１～１１７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  119. 単一プロモーターの制御下で発現される治療用産物の個別の発現を引き起こすように、核酸がＴ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａペプチドをコードする、請求項１１８に記載の免疫刺激細菌。
  120. 真核生物プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項１～１１９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  121. プロモーターが、ウイルスプロモーターまたは哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１２０に記載の免疫刺激細菌。
  122. プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、およびアデノウイルスプロモーターの中から選択されるウイルスプロモーターである、請求項１２１に記載の免疫刺激細菌。
  123. プラスミド上にコードされている治療用産物または異種タンパク質の１つまたは複数の発現を制御するプロモーターが、伸長因子１（ＥＦ－１）アルファプロモーター、またはＭＮＤプロモーター、またはＵＢＣプロモーター、またはＰＧＫプロモーター、またはＣＡＧプロモーターである、請求項１～１２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  124. プラスミド上にコードされている治療用産物または異種タンパク質の１つまたは複数の発現を制御するプロモーターが、ＥＦ－１アルファ、アデノウイルス２または５後期、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＥＩＦ４Ａ１、ＣＡＧ、またはＣＤ６８プロモーターである、請求項１～１２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  125. プラスミド上にコードされている治療用産物または異種タンパク質の１つまたは複数の発現を制御するプロモーターが、後期プロモーターであるウイルスプロモーターである、請求項１～１２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  126. プラスミドが、治療用産物（複数可）の発現を制御するために、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、ＭＮＤ、ニワトリベータグロブリン、およびｒｂＧｌｏｂ（ウサギグロブリン）遺伝子の中から選択される、ターミネーターおよび／またはプロモーター（複数可）を含む調節配列を含む、請求項１～１２５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  127. コードされている治療用産物が、プラスミドを含有する細胞から分泌するためのシグナル配列に作用可能に連結されている、請求項１～１２６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  128. 治療用産物をコードするプラスミドが、エンハンサー、プロモーター、治療用産物または異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテールを含むコンストラクトを含む、請求項１～１２７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  129. プラスミドが、エンハンサー、プロモーター、ＩＲＥＳ、治療用産物または異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテールを含むコンストラクトを含む、請求項１～１２８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  130. プラスミドが、エンハンサー、プロモーター、ＩＲＥＳ、局在化配列、治療用産物または異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ポリＡテールを含むコンストラクトを含む、請求項１～１２９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  131. 治療用産物または異種タンパク質をコードするプラスミド上のコンストラクトがウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）を含む、請求項１３０に記載の免疫刺激細菌。
  132. プラスミドが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である治療用産物、または治療用産物の変異体をコードする核酸を含有する、請求項１～１３１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  133. 無改変型の治療用産物が、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、もしくは環状ジヌクレオチドを直接的もしくは間接的に感知するか、またはそれと相互作用して、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導し、変異体タンパク質が、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを感知するか、またはそれと相互作用すること無しに、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導する、請求項１３２に記載の免疫刺激細菌。
  134. 治療用産物が、対象内で発現されたときに、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現をもたらす変異体である、請求項１３２に記載の免疫刺激細菌。
  135. 治療用産物が、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを必要としない機能獲得型（ＧＯＦ）変異体である、請求項１３２に記載の免疫刺激細菌。
  136. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＩＲＦ－８、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００の中から選択される、請求項１～１３５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  137. 治療用産物が、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００の中から選択される、請求項１～１３５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  138. 治療用産物が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の増加した活性を有するか、またはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の構成的発現をもたらす変異体である、請求項１３２～１３７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  139. プラスミドが、ヒトでインターフェロン症を促進するか、または引き起こすタンパク質の機能獲得型の構成的に活性な変異体をコードする、請求項１～１３８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  140. 治療用産物が、タンパク質中のリン酸化部位を無くし、それによって活性化Ｂ細胞の核因子カッパ－軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達を低減する突然変異を含む変異体である、請求項１３２～１３９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  141. Ｉ型ＩＦＮを誘導する治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、もしくはＭＤＡ５であるか、またはＩ型ＩＦＮを誘導する治療用産物が、ＩＲＦ－５、もしくはＩＲＦ－８である、請求項１３２～１４０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  142. Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導する治療用産物が、活性増大または構成的活性を有するその変異体であり、
    治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－８、またはＭＤＡ５である、
    請求項１３２～１４１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  143. 治療用産物が、Ｉ型ＩＦＮの発現増大をもたらす機能獲得型突然変異を含むＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－８、またはＭＤＡ５の変異体である、請求項１３２～１４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  144. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－８、またはＭＤＡ５の変異体であって、ウイルス感染の結果としてリン酸化される１つまたは複数のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されており、それによって、生じる変異体が、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するリン酸化模倣体となっている、変異体である、請求項１３２～１４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  145. 治療用産物が、配列番号３１２を参照して、位置３９６、３９８、４０２、４０４、および４０５の残基で１つまたは複数の置換を有するＩＲＦ－３であり、
    前記残基がアスパラギン酸残基で置換されている、
    請求項１３２～１４４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  146. ＩＲＦ－３が、配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ置換を含む、請求項１４５に記載の免疫刺激細菌。
  147. ＩＲＦ－３が、配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄ置換を含む、請求項１４５に記載の免疫刺激細菌。
  148. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－８、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００の中から選択される、請求項１３２～１４７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  149. 細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡを感知する治療用産物が、変異体ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、またはＩＲＦ－３であり、
    無改変ＳＴＩＮＧが配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有し、無改変ＭＤＡ５が配列番号３１０に記載の配列を有し、無改変ＲＩＧ－Ｉが配列番号３１１に記載の配列を有し、無改変ＩＲＦ－３が配列番号３１２に記載の配列を有する、
    請求項１３２～１４８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  150. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、およびＲＩＧ－Ｉの中から選択され、かつＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－８、またはＲＩＧ－Ｉを構成的に活性にする機能獲得型突然変異を含み、それによって、Ｉ型ＩＦＮの発現が構成的である、請求項１３２～１４９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  151. 突然変異が、以下：
    ａ）ＳＴＩＮＧ中、配列番号３０５～３０９を参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１つまたは複数；
    ｂ）ＭＤＡ５中、配列番号３１０を参照して、Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２Ｆ、およびＡ４５２Ｔの１つまたは複数；
    ｃ）ＲＩＧ－Ｉ中、配列番号３１１を参照して、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；ならびに
    ｄ）ＩＲＦ－３中、配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ
    のように選択される、請求項１４９または請求項１５０に記載の免疫刺激細菌。
  152. 治療用産物が、配列番号３０５～３０９を参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａ、ならびにその保存的置換の中から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する変異体ＳＴＩＮＧである、請求項１３２～１５１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  153. Ｉ型ＩＦＮがインターフェロンαまたはインターフェロンβである、請求項１１４および１３２～１５２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  154. 二重特異性抗体をコードする、請求項１～１５３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  155. 二重特異性抗体が、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１５４に記載の免疫刺激細菌。
  156. プラスミドが、ＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体をコードする、請求項１～１５５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  157. 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体が、抗ＤＬＬ３抗体の重鎖および軽鎖ならびに抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖を含む、請求項１５６に記載の免疫刺激細菌。
  158. 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体が、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．３４、およびＳＣ１６．５６と表示されるコンストラクト中でコードされているものの中から選択され、それらが、ＤＬＬ３およびＣＤ３の各々に結合する抗体の可変重鎖および可変軽鎖をコードし、それらの配列が、配列番号４８５～４９０に記載されているか、またはそのヒト化変異体、および、それに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体である、請求項１５６または１５７に記載の免疫刺激細菌。
  159. 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体が、下記のａ）～ｆ）：
    ａ）配列番号４８７のアミノ酸残基１５４～２６０、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含む軽鎖、
    ｂ）配列番号４８７のアミノ酸残基２２～１３８として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含む重鎖、
    ｃ）配列番号４８９のアミノ酸残基１５５～２６１として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含む軽鎖、
    ｄ）配列番号４８９のアミノ酸残基２２～１３９として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含む重鎖、
    ｅ）重鎖および軽鎖であって、
    軽鎖が、配列番号４８５のアミノ酸残基１５５～２６１として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含み、
    重鎖が、配列番号４８５のアミノ酸残基２２～１３９として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含む、重鎖および軽鎖、ならびに
    ｆ）抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖であって、
    抗ＣＤ３抗体の軽鎖が、配列番号４８５のアミノ酸残基３９８～５０４として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含み、
    抗ＣＤ３抗体の重鎖が、配列番号４８５のアミノ酸残基２６７～３８２として記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体を含む、抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖、の組合せを含み、それによって、得られたコンストラクトが、ＤＬＬ３およびＣＤ３の各々に結合することができる、請求項１５７または請求項１５８に記載の免疫刺激細菌。
  160. コードされている二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体コンストラクトが、リーダー配列を含む、請求項１５６～１５９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  161. リーダー配列が、ＩｇＧＫリーダー配列である、請求項１６０に記載の免疫刺激細菌。
  162. 二重特異性抗体が、１つまたは複数の軽鎖と重鎖とを連結するＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含み、
    Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体の抗ＤＬＬ３と抗ＣＤ３部分とを連結する、請求項１５６～１６１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  163. リンカーが、配列番号４８５の残基３８３～３９７として記載されるアミノ酸の配列を含む、請求項１６２に記載の免疫刺激細菌。
  164. 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体が、ｆｌａｇタグを含む、請求項１５６～１６３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  165. ｆｌａｇタグが、配列番号４８５の残基５０５～５１２として記載されるアミノ酸の配列を含む、請求項１６４に記載の免疫刺激細菌。
  166. リーダー配列をコードする核酸コンストラクト、抗ＤＬＬ抗体の重鎖および軽鎖、ならびに抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖、および必要に応じて１つまたは複数のペプチドリンカー、および必要に応じてｆｌａｇタグを含む、請求項１５６～１６５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  167. コードされている二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体コンストラクトが、配列番号４８５～４９１のいずれかに記載されるアミノ酸残基の配列、またはそのヒト化変異体、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体、およびそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１５６～１６６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  168. プラスミドが、腫瘍関連抗原をコードする、請求項１～１６７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  169. Ｉ型インターフェロンを構成的に誘導する改変されたＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、請求項１～１６８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  170. ＳＴＩＮＧタンパク質が、置換Ｎ１５４Ｓ、またはＲ２８４Ｇ、またはＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを含む、請求項１６９に記載の免疫刺激細菌。
  171. プラスミドが、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体をコードする、請求項１～１７０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  172. プラスミドが、改変されたＳＴＩＮＧ、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、腫瘍関連抗原、およびまたは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体の組合せをコードする、請求項１～１７１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  173. プラスミドが、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードし、免疫刺激タンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／または持続に関与しているか、またはそれを引き起こすか、もしくは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＣＤ４７アンタゴニスト、抗ＩＬ－６抗体またはＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、ならびに腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの１つまたは複数の中から選択される、請求項１～１７２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  174. 免疫刺激タンパク質が、必要に応じて切り詰められており、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するために細胞質ドメインを失っているＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、および４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）の中から選択される共刺激分子であり、
    切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、欠失された細胞質ドメインにより、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対抗調節シグナル伝達できない、請求項１７３に記載の免疫刺激細菌。
  175. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、サイトカインまたはケモカインである、請求項１７３または請求項１７４に記載の免疫刺激細菌。
  176. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、共刺激分子またはその細胞質ドメイン欠失型である、請求項１７３～１７５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  177. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２４Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌの中から選択される、請求項１７６に記載の免疫刺激細菌。
  178. プラスミドが、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニストである治療用産物をコードする、請求項１～１７７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  179. 治療用産物が抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１～１７８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  180. 抗体またはその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ナノボディ、ダイアボディ断片、および単鎖抗体の中から選択される抗原結合性断片である、請求項１７９に記載の免疫刺激細菌。
  181. 抗体またはその抗原結合性断片が、ヒト化されているか、ヒトのものである、請求項１７９または請求項１８０に記載の免疫刺激細菌。
  182. 抗体またはその抗原結合性断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２４、またはＩＬ－６のアンタゴニストである、請求項１７９～１８１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  183. プラスミドが、
    ａ）腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質；
    ｂ）Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはＩ型ＩＦＮの発現を増やす活性増大を有するその変異体、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすその変異体の１つまたは複数；および
    ｃ）抗がん抗体またはその抗原結合性部分
    の中から選択される２種以上の治療用産物をコードする、請求項１～１８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  184. 免疫刺激タンパク質が、細胞質ドメインまたは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に十分なその部分を失っている共刺激分子であり、それによって、切り詰められた共刺激分子が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対抗調節シグナル伝達できない、請求項１８３に記載の免疫刺激細菌。
  185. 単一プロモーターの制御下で、２種以上の治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    治療用産物が、
    ａ）腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質；
    ｂ）Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはＩ型ＩＦＮの発現を増やす活性増大を有するその変異体、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすその変異体の１つまたは複数；および
    ｃ）抗がん抗体またはその抗原結合性部分
    の中から選択され、
    コードしている核酸がＩＲＥＳ配列または２Ａペプチドによって分離されており、各産物をコードしている各核酸が、シグナル配列をコードする核酸に作用可能に連結されていてもよく、それによって、コードされているｍＲＮＡの翻訳の際に、各産物が、細菌および／またはプラスミドを含む細胞から個別に発現および分泌される、免疫刺激細菌。
  186. 免疫刺激タンパク質が、細胞質ドメインまたは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に十分なその部分を失っている共刺激分子であり、それによって、切り詰められた共刺激分子が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対抗調節シグナル伝達できない、請求項１８５に記載の免疫刺激細菌。
  187. プラスミドが、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、共刺激分子、および抗がん抗体またはその抗原結合性部分の中から選択される少なくとも２種の治療用産物をコードする、請求項１～１８６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  188. サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、共刺激分子、および抗がん抗体もしくはその抗原結合部分の中から選択される少なくとも２つの治療用産物をコードし、ならびに抗原もしくは抗原タンパク質もコードするプラスミドを含む、請求項１～１８７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  189. 抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１８８に記載の免疫刺激細菌。
  190. 腫瘍関連抗原が、腫瘍胎児抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、腫瘍ウイルス抗原（ｏｎｃｏｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、過剰発現／蓄積抗原、がん精巣抗原、線状限定抗原（ｌｉｎｅａｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、変異抗原、翻訳後変更抗原、またはイディオタイプ抗原である、請求項１８９に記載の免疫刺激細菌。
  191. 腫瘍関連抗原が、以下の抗原：



    の中から選択される、請求項１９０に記載の免疫刺激細菌。
  192. 抗がん治療薬である、請求項１～１９１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  193. コードされているペイロードが、真核生物プロモーターの制御下で発現される、請求項１９２に記載の免疫刺激細菌。
  194. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が、フラゲリン－、ａｓｄ－、ｍｓｂＢ－、ｐａｇＰ－、およびｃｓｇＤ－であるか、またはａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、およびｐａｇＰ－である、請求項１～１９３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  195. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が、ｔｈｙＡ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、およびｐａｇＰ－である、請求項１９４に記載の免疫刺激細菌。
  196. がんもしくは病原体からの感染を処置または予防するためのワクチンである、請求項１～１９５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  197. コードされているペイロードが、原核生物プロモーターの制御下で発現され、ペイロードをコードする核酸が、真核生物リボソームによって認識されるが、細菌リボソームによっては認識されない翻訳調節シグナルを含む、請求項１９６に記載の免疫刺激細菌。
  198. 免疫刺激細菌中のプラスミドが、病原体からの抗原またはタンパク質もしくはそのエピトープをコードする、請求項１～１９７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  199. 病原体が、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バールウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、および麻疹ウイルスによる感染症などの慢性ウイルス感染症を引き起こすか、または対象に慢性的に感染するウイルスもしくは病原体であるか、または慢性インフルエンザもしくはコロナウイルス、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による初期感染などの急性感染症を引き起こす病原体である、請求項１９８に記載の免疫刺激細菌。
  200. プラスミドが、抗体の中和、および長寿命の循環する組織常在性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増強をもたらし得る、例えば、コロナウイルスの場合、ヌクレオカプシド、Ｍおよび／またはＳタンパク質からの抗原などの必須ウイルスタンパク質からの抗原などの病原体またはそのエピトープもしくはそのエピトープの組合せからの抗原をコードする、請求項１９９に記載の免疫刺激細菌。
  201. 抗原、エピトープ、または抗原タンパク質をコードする核酸が、細菌によって認識される原核生物プロモーターに作用可能に連結しており、エンコーディング配列が、真核生物リボソームによって認識される翻訳のための調節配列を含んであり、それによって、細菌が、コードされているＲＮＡを翻訳することができないか、またはエンコーディング配列が細菌リボソームによって認識されるシャイン・ダルガノ配列を含まず、そのためコードされているｍＲＮＡが翻訳されず、ｍＲＮＡが、細菌が送達される真核生物宿主細胞に送達される、請求項１９８～２００のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  202. プラスミドが、単一のプロモーターの制御下で２つ以上の治療用産物をコードし、
    産物の少なくとも２つまたはすべてをコードする核酸の発現が、単一のプロモーターの制御下にあり、各産物をコードする核酸が、２Ａポリペプチドをコードする核酸によって分離されており、それによって、翻訳時に、各産物が別々に発現される、請求項１～２０１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  203. 治療用産物の１つまたは複数をコードする核酸が、発現された産物の分泌を指示する配列をコードする核酸に作用可能に連結されている、請求項１９８～２０２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  204. 治療用産物が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に関する細胞質ドメイン欠失を有する共刺激分子であり、
    切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメイン欠失によりＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない、
    請求項１～２０３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  205. 細胞質ドメインを失っている共刺激分子が、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ２４Ｌ、またはＯＸ４０Ｌである、請求項２０４に記載の免疫刺激細菌。
  206. ２種以上の治療用産物をコードし、少なくとも１つの産物がａ）から選択され、少なくとも１つがｂ）から選択され、
    ａ）が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体（ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）、ＩＬ－１８、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／もしくは持続に関与するか、またはそれを引き起こすか、もしくは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、あるいは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、
    ｂ）が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＩＲＦ－８、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、またはＳＮＲＮＰ２００である、
    請求項１～２０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  207. ＴＧＦベータ阻害抗体、ＴＧＦベータ結合性デコイ受容体、抗ＩＬ－６抗体、およびＩＬ－６結合性デコイ受容体の１つまたは複数をコードするか、またはさらにコードする、請求項１～２０６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  208. 治療用産物の以下の組合せ：
    ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、およびΔｃｙｔが細胞質ドメインの欠失である４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    腫瘍関連抗原；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、の１つまたは複数をコードする、請求項１～２０７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  209. 腫瘍関連抗原をさらにコードする、請求項２０８に記載の免疫刺激細菌。
  210. ＳＴＩＮＧ機能獲得型（ＧＯＦ）変異体が、請求項１４９～１５３に記載されたいずれかの中から選択される、請求項２０８または請求項２０９に記載の免疫刺激細菌。
  211. 治療用産物の以下の組合せ：
    ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、およびΔｃｙｔが細胞質ドメインの欠失である４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；＊＊
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
    ＢｉＴｅが、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＥＡ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ７４、葉酸受容体、ネクチン４、ＥｐｈＡ２、ＣＡ－ＩＸ、Ｂ７Ｈ３、シグレック－１５、Ｍｕｃ１、またはルイスＹ抗原を標的とする、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ）＋ＳＴＩＮＧタンパク質、ＢｉＴｅ＋ＩＬ－１５、ＢｉＴｅ＋ＩＬ－１５＋ＳＴＩＮＧタンパク質；
    腫瘍抗原（複数可）＋ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体；
    腫瘍抗原（複数可）およびＩＬ－１５の治療用組成物；
    腫瘍抗原（複数可）＋ＩＬ－１５＋ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体の治療用組成物；
    １つまたは複数の抗原およびＩＦＮ；
    １つまたは複数の抗原およびＩＦＮα；
    １つまたは複数の抗原、およびＩＦＮα２またはＩＦＮα１～１６；
    １つまたは複数の抗原およびＩＦＮα１～１６のいずれか；
    １つまたは複数の抗原およびＩＦＮ－β；
    １つまたは複数の抗原、ＩＦＮα２、およびＩＦＮβ；
    １つまたは複数の抗原および突然変異Ｓ３９６Ｄを含むＩＲＦ３ ＧＯＦ変異体；
    １つまたは複数の抗原、ＩＦＮα２もしくはＩＦＮα１～１６、および突然変異Ｓ３９６Ｄを含むＩＲＦ３ ＧＯＦ変異体；
    ＩＦＮアルファ２＋ＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄ；
    ＩＦＮα１～１６＋ＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄ；
    ＩＦＮアルファ２＋ＩＦＮ－ベータ；
    ＩＦＮα１～１６＋ＩＦＮ－ベータ
    単独でまたは他の免疫刺激タンパク質と組み合わせた、ＦＬＴ－３Ｌ、またはシアリダーゼ、またはＩＬ－１２ｐ３５、またはアズリン、または膜アンカー固定ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＦＬＴ－３Ｌ；ならびに
    単独でまたは免疫刺激タンパク質のいずれかと組み合わせた、アゴニストが、ポリＵもしくはポリＵ／Ｇ、マイクロＲＮＡ、またはｍｉＲ－２１である、ＴＬＲ８アゴニスト、の１つまたは複数をコードする免疫刺激細菌または細胞。
  212. 腫瘍関連抗原をさらにコードする、請求項２０２～２１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  213. プラスミドが、請求項１９１に記載されるような腫瘍関連抗原をコードする、請求項１～２１２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  214. コードされている治療用産物が、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１～２１３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  215. 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーが、デルタ様リガンド（ＤＬＬ３）およびＣＤ３に結合する、請求項２１４に記載の免疫刺激細菌。
  216. サイトカインまたは改変されたもしくは変異体ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、請求項１～２１５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  217. ＳＴＩＮＧタンパク質が、請求項４０６～４３６のいずれかに記載のＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項２１５に記載の免疫刺激細菌。
  218. サイトカインが、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、またはＩＬ－１５、またはＩＬ－１２である、請求項２１５または請求項２１６に記載の免疫刺激細菌。
  219. サイトカインが、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、またはＩＬ－１５である、請求項２１５～２１８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  220. ＳＴＩＮＧタンパク質が、タスマニアンデビルからのＣＴＴを有するヒトＳＴＩＮＧタンパク質を含むキメラＳＴＩＮＧタンパク質であるか、またはタスマニアンデビルからのＣＴＴを含み、かつ１つまたは複数の機能獲得型突然変異を有するヒトＳＴＩＮＧタンパク質を含むキメラＳＴＩＮＧである、請求項２１５～２１９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  221. ＳＴＩＮＧタンパク質が、Ｎ１５４Ｓ、またはＲ２８４Ｇ、またはＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇである機能獲得型突然変異を含む、請求項２１５～２２０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  222. ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体が、請求項４０５～４３０のいずれかに記載のいずれかの中から選択される、請求項２１４～２２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌または細胞。
  223. コードされている治療用産物が、Ｆｃドメインを含む、請求項１～１９１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  224. コードされている治療用産物が、Ｂ７タンパク質膜貫通ドメインを含む、請求項１～２２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  225. コードされている治療用産物が、腫瘍関連抗原である、請求項１～２２４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  226. コードされている産物が、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体である、請求項１～２２５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  227. コードされている治療用産物がＧＰＩアンカーで固定されている、請求項１～２２６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  228. コードされている治療用産物が、ヒト血清アルブミン、またはコードされている産物の血清中半減期を増大させるその誘導体を含む、請求項１～２２７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  229. コードされている治療用産物がコラーゲンとの融合体を含む、請求項１～２２８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  230. ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ、またはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／Ｆ－ΔｐｕｒＩ／ΔｔｈｙＡと表示される菌株である、請求項１～２２９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  231. ゲノム改変を含むゲノム改変された細菌であって、
    それによって、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、４、および５による応答が、ゲノム改変を含まない細菌と比べて低減されており、
    細菌が、さらなるゲノム改変を含み、それによって、それが真核生物宿主中では複製することができないが、栄養素または因子が補給されると、インビトロで複製することができるように、必要な栄養素または因子について栄養要求性であり、
    細菌が、産物をコードする核酸を含有するプラスミドを含むか、または産物をコードするＲＮＡを含み、
    核酸またはＲＮＡによってコードされている産物が、抗原配列または病原性ウイルス、細菌、もしくは寄生虫である病原体からの配列であるか、または腫瘍抗原であり、それによって、コードされている抗原の宿主中での発現の際に、宿主が、病原性ウイルス、細菌、寄生虫、または腫瘍抗原に対する免疫防御応答もしくは免疫応答を発揮するか、または産物が、治療用産物であり、
    抗原配列（複数可）の発現が、抗原（複数可）をコードするＲＮＡが細菌中で産生されるように、原核生物プロモーターの制御下にあり、
    抗原をコードする核酸が、細菌リボソームによりコードされているＲＮＡの翻訳を阻害または防止するが、真核生物宿主リボソームによりコードされているＲＮＡの翻訳を阻害または防止しない調節配列を含み、それによって、翻訳が、細菌における転写から切り離されており、
    得られた細菌が、真核生物対象に投与されるとき、食細胞への感染について選択的であり、核酸を食細胞に送達させ、そこでＲＮＡが翻訳される、ゲノム改変された細菌。
  232. 抗原配列（複数可）をコードする核酸が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み、それによって、宿主細胞の翻訳が容易になるかまたは増強され、細菌の翻訳が阻害または防止される、請求項２３１に記載の細菌。
  233. ＩＲＥＳが、血管内皮増殖因子および１型コラーゲン誘導性タンパク質（ＶＣＩＰ）ＩＲＥＳである、請求項２３２に記載の細菌。
  234. 抗原（複数可）をコードする核酸が、細菌における翻訳を阻害または低減させ、真核生物宿主における翻訳を必要に応じて促進または増強させるＶＣＩＰまたは他のＩＲＥＳを含む、請求項２３２または請求項２３３に記載の細菌。
  235. ＩＲＥＳまたはＶＣＩＰのＩＲＥＳが、プロモーターの３’であり、かつ抗原（複数可）コーディング配列の５’である位置で、プラスミド中に含まれる、請求項２３２～２３３のいずれかに記載の細菌。
  236. ＶＣＩＰのＩＲＥＳの配列が、配列番号４３４に記載されている、請求項２３３～２３５のいずれかに記載の細菌。
  237. 病原体が、細菌またはウイルスである、請求項２３１～２３６のいずれかに記載の細菌。
  238. コードされている抗原が、腫瘍抗原である、請求項２３１～２３７のいずれかに記載の細菌。
  239. 細菌が、ウイルス感染症もしくは細菌感染症を予防または処置するためのワクチンである、請求項２３１～２３８のいずれかに記載の細菌。
  240. 病原体が、慢性ウイルス感染症を引き起こすウイルスの中から選択される、請求項２３６に記載の細菌。
  241. 感染症が、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バールウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、麻疹ウイルス、および対象に慢性的に感染する他のウイルスによる感染症の中から選択される、請求項２４０に記載の細菌。
  242. 感染症が、急性感染症である、請求項２３９～２４１のいずれかに記載の細菌。
  243. 感染症が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症である、請求項２４２に記載の細菌。
  244. 病原体が、大腸菌、ブドウ球菌属、シュードモナス属、アクチノバクテリア、古細菌、マイコバクテリア、またはポルフィロモナス属の種である、請求項２３１～２４３のいずれかに記載の細菌。
  245. 病原体が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、または大腸菌、もしくはヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）である、請求項２３１～２４３のいずれかに記載の細菌。
  246. 細菌中のプラスミドが、免疫刺激タンパク質または他のアジュバントをさらにコードする、請求項２３１～２４５に記載の細菌。
  247. プラスミドが、免疫刺激タンパク質または他の治療用タンパク質の組合せをコードする、請求項２４６に記載の細菌。
  248. 免疫刺激タンパク質が、ＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項２４７に記載の細菌。
  249. ＳＴＩＮＧタンパク質が、機能獲得型突然変異を含み、および／またはキメラＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項２４８に記載の細菌。
  250. ＳＴＩＮＧタンパク質が、請求項４０６～４３６のいずれかに記載のＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項２４８または請求項２４９に記載の細菌。
  251. 治療用産物の組合せをコードするプラスミドを含む、請求項２３１～２５０のいずれかに記載の細菌。
  252. 請求項１～２５１のいずれかに記載されるような免疫刺激細菌である、請求項２５０に記載の細菌。
  253. 免疫刺激タンパク質（複数可）および／または他の治療用タンパク質が、細菌によって認識される原核生物プロモーターの制御下で抗原の発現を伴う多シストロン性配列の一部としてプラスミド内でコードされ、
    免疫刺激タンパク質（複数可）および／または他の治療用タンパク質が、真核生物宿主によって認識される真核生物プロモーターの制御下でプラスミド上にコードされる、請求項２３１～２５２のいずれかに記載の細菌。
  254. 細菌をインビトロで培養することによって産生される原核生物プロモーターの制御下で発現される抗原（複数可）および任意の他のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、請求項２３１～２５３のいずれかに記載の細菌。
  255. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っており、ペンタアシル化リピドＡを有するＬＰＳを産生する、請求項２３１～２５４のいずれかに記載の細菌。
  256. ａｓｄ－もしくはｔｈｙＡ－であるか、またはその両方である、請求項２３１～２５５のいずれかに記載の細菌。
  257. アデノシン栄養要求株およびｃｓｇＤ－の一方または両方であり、必要に応じてａｎｓＢ－である、請求項２３１～２５６のいずれかに記載の細菌。
  258. ＴＬＲ８アゴニストをコードする核酸を含む、請求項２３１～２５７のいずれかに記載の細菌。
  259. ＴＬＲ８アゴニストが、ポリＵ、ポリＵ／Ｇ、マイクロＲＮＡ、またはｍｉＲ－２１である、請求項２５８に記載の細菌。
  260. ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であり、鞭毛を失っており、ａｓｄ－もしくはｔｈｙＡ－であるか、またはａｓｄ－およびｔｈｙＡ－の両方である、請求項２３１～２５９のいずれかに記載の細菌。
  261. 大腸菌、リステリア属、マイコバクテリア、もしくはサルモネラ属の種または菌株である、請求項１～２６０のいずれかに記載の細菌。
  262. サルモネラ属の菌株である、請求項１～２６１のいずれかに記載の細菌。
  263. ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株である、請求項２６２に記載の細菌。
  264. 無改変サルモネラ属が野生型株であり、または無改変サルモネラ菌株が弱毒化されている、請求項２６２または請求項２６３に記載の細菌。
  265. ＶＮＰ２０００９もしくはＹＳ１６４６に由来するか、またはＡＴＣＣ１４０２８株に由来するか、またはＡＴＣＣ１４０２８株の特定する特徴のすべてを有する株に由来する、請求項１～２６４のいずれかに記載の細菌。
  266. ゲノム改変が、遺伝子における欠失、挿入、破壊、および他の改変のうちの１つまたは複数であり、それによって、遺伝子によってコードされている産物が産生されないか、または産生されると不活性である、請求項２３１～２６５のいずれかに記載の細菌。
  267. 原核生物プロモーターが、細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターである、請求項２３１～２６６のいずれかに記載の細菌。
  268. 真核生物宿主がヒトである、請求項２３１～２６７のいずれかに記載の細菌。
  269. 対象において適応免疫応答を誘発させるための量で、対象への投与のための媒体中に請求項１～２６８のいずれかに記載の細菌を含む、ワクチン。
  270. エアロゾル剤として、または粉末剤として、または錠剤として、または坐剤として製剤化されている、請求項２６９に記載のワクチン。
  271. 経口投与用、経鼻投与用、吸入投与用、直腸投与用、膣内投与用、眼内投与用、頭蓋内投与用、皮内投与用、または筋内投与用に製剤化されている、請求項２６９または請求項２７０に記載のワクチン。
  272. 鼻腔または肺吸入用に製剤化されたウイルス由来のタンパク質またはコロナウイルスのウイルス由来のタンパク質からの抗原をコードする核酸を含むワクチンであって、ワクチンが、ＴＲＬ２を十分に活性化せず、それによって、ワクチンがＩ型ＩＦＮを誘導する、ワクチン。
  273. ウイルスがコロナウイルスである、請求項２７２に記載のワクチン。
  274. ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２であるコロナウイルスである、請求項２７３に記載のワクチン。
  275. Ｉ型ＩＦＮを減少または阻害するのに十分なＴＬＲ４および／またはＴＲＬ５も活性化しない、請求項２７２～２７４のいずれかに記載のワクチン。
  276. 病原体もしくは腫瘍に由来する抗原またはタンパク質またはエピトープをコードする核酸を含むワクチンであって、
    ワクチンが、病原体もしくは腫瘍に対する免疫応答を誘発させ、
    病原体が、肺および／または鼻咽頭を含む呼吸器系に感染する呼吸器病原体であり、
    腫瘍が、肺腫瘍であり、
    ワクチンが、鼻腔または肺を通しての吸入用に製剤化されており、
    ワクチンが、免疫抑制性の貪食マクロファージを、ＣＤ８＋Ｔ細胞へのインサイチュ抗原交差提示が可能であり、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングするためにリンパ節への遊走が可能である免疫刺激性の貪食マクロファージに変換するために、核酸を貪食マクロファージに送達する、ワクチン。
  277. Ｉ型ＩＦＮを減少または阻害するほど十分にＴＬＲ４および／またはＴＲＬ５応答も活性化しない、請求項２７６に記載のワクチン。
  278. Ｉ型ＩＦＮを減少または阻害するほど十分にＴＬＲ２／４／５を活性化しない、請求項２７６または請求項２７７に記載のワクチン。
  279. ワクチンが、ウイルスに対して免疫応答を誘発する、請求項２７２～２７８のいずれかに記載のワクチン。
  280. 病原体がウイルスである、請求項２７９に記載のワクチン。
  281. 病原体がＲＮＡウイルスである、請求項２６９～２８０に記載のワクチン。
  282. ウイルスが、コロナウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項２８１に記載のワクチン。
  283. ウイルスがコロナウイルスである、請求項２８２に記載のワクチン。
  284. ウイルスがＳＡＲＳウイルスである、請求項２８３に記載のワクチン。
  285. ウイルスがＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ウイルスである、請求項２８４に記載のワクチン。
  286. 抗原、タンパク質、またはエピトープが、ウイルス抗原、タンパク質、またはエピトープである、請求項２６９～２８５に記載のワクチン。
  287. タンパク質が、カプシドまたは核タンパク質である、請求項２８６に記載のワクチン。
  288. ウイルスがＳＡＲＳ－ＣＯＶ２であり、タンパク質またはエピトープがＳ１、Ｓ２、エンベロープ（Ｅ）、メンブレン（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ７ｂ、およびＯＲＦ８で表示されるか、またはコードされるタンパク質であるか、またはそれに由来する、請求項２６９～２８７のいずれかに記載のワクチン。
  289. ウイルスがＳＡＲＳ－ＣＯＶ２であり、タンパク質またはエピトープが、スパイクタンパク質であるか、またはそれに由来する、請求項２６９～２８８のいずれかに記載のワクチン。
  290. タンパク質または抗原をコードするｍＲＮＡを含む、請求項２６９～２８９のいずれかに記載のワクチン。
  291. ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡの安定性またはコードされているタンパク質もしくは抗原もしくはエピトープの安定性を増加させるように改変されている、請求項２９０に記載のワクチン。
  292. ｍＲＮＡが改変ウイルスタンパク質をコードしており、改変が、タンパク質の構造を変更して、宿主細胞タンパク質との相互作用を変更する、請求項２９０に記載のワクチン。
  293. 病原体に由来する抗原もしくはタンパク質をコードするか、腫瘍抗原をコードする核酸を含むデリバリー媒体である、請求項２６９～２９２のいずれかに記載のワクチン。
  294. 免疫刺激細菌を含み、細菌がゲノム改変を含んでおり、それによって、細菌が、ペンタアシル化リポ多糖（ＬＰＳ）を有し、鞭毛を失っており、野生型細菌が鞭毛を有している、請求項２６９～２９３のいずれかに記載のワクチン。
  295. 免疫刺激細菌がゲノム改変（複数可）を有しており、それによって、細菌がｃｕｒｌｉ線毛を産生しない、請求項２９４に記載のワクチン。
  296. 免疫刺激細菌が、病原体に対する抗原または腫瘍抗原をコードするプラスミドを含む、請求項２９４または請求項２９５に記載のワクチン。
  297. プラスミドが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である治療用産物をコードする、請求項２９６に記載のワクチン。
  298. 産物が、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉまたは機能獲得型突然変異を含むその改変型であり、それによって、Ｉ型インターフェロンの発現が構成的である、請求項２９７に記載のワクチン。
  299. 弱毒化細菌であるか、またはグラム陰性細菌であるか、またはグラム陽性細菌である、請求項１～２９８のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  300. 細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、大腸菌、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、エロモナス属、フランシセラ属、コレラ、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ菌、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、エリシペロスリクス属もしくは古細菌の菌株、または先行リストの細菌株のいずれかのその弱毒化株もしくはその改変株である、請求項１～２９９のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  301. 細菌が、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、発疹チフスリケッチア、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、エロモナス・ユークレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、ヒツジ偽結核菌、シトロバクター・フロインデイ、クラミジア・ニューモニエ、ヘモフィルス・ソムナス、ブルセラ・アボルタス、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、結核菌、黄色ブドウ球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・エルジノーサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブチリス、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ロシャリメア・クインターナ、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）である、請求項１～２９９のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  302. サルモネラ属の菌株である、請求項１～３０１のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  303. ネズミチフス菌株である、請求項３０２に記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  304. 無改変サルモネラ属が野生型株である、請求項３０２または請求項３０３に記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  305. 無改変サルモネラ属株が弱毒化されている、請求項３０２または請求項３０３に記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  306. ＶＮＰ２０００９もしくはＹＳ１６４６に由来するか、またはＡＴＣＣ１４０２８株に由来するか、またはＡＴＣＣ１４０２８株の特定する特徴のすべてを有する株に由来する、請求項１～３０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  307. ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－およびｐａｇＰ－であるか、またはａｎｓＢ－、ｔｈｙＡ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、およびｐａｇＰ－である、請求項３０１～３０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  308. 細菌が、補体殺傷抵抗性（ｒｃｋ）遺伝子をコードし、発現する、請求項１～３０７のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  309. ｒｃｋ遺伝子がサルモネラ属ｒｃｋ遺伝子である、請求項３０８に記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  310. 大腸菌株である、請求項３０８または請求項３０９に記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  311. 薬学的に許容される媒体中に、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチンの細菌を含む、医薬組成物。
  312. 全身投与用に製剤化されている、請求項３１１に記載の医薬組成物。
  313. 非経口投与用、または静脈内投与用、または筋内投与用、または腫瘍内投与用、または腹腔内投与用、または経口投与用、または直腸投与用、または膣内投与用、または眼内投与用、または皮内投与用、または頭蓋内投与用、または粘膜投与用、または口腔もしくは鼻腔への吸入による投与用に製剤化されている、請求項３１１または請求項３１２に記載の医薬組成物。
  314. 対象内に固形腫瘍または血液系腫瘍を含むがんの処置の方法であって、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌、細菌もしくはワクチン、または請求項３１１～３１３のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  315. 請求項２６９～２９８のいずれかに記載のワクチンを投与することを含む、免疫化の方法。
  316. 対象内に固形腫瘍または血液系腫瘍を含むがんの処置のための、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌、細菌、ウイルス、もしくはワクチン、または請求項３１１～３１３のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  317. 対象内に固形腫瘍または血液系腫瘍を含むがんの処置もしくはそれに対する免疫化に、または病原体に対する免疫化に使用するための、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌、細菌、またはウイルス、もしくはワクチン、または請求項３１１～３１３のいずれかに記載の医薬組成物。
  318. 対象がヒトである、請求項３１４～３１７のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、または医薬組成物、またはワクチン。
  319. 対象が、固形腫瘍を含むか、または血液系腫瘍を含むがんを有する、請求項３１４～３１８のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、または医薬組成物、またはワクチン。
  320. 処置が、第２の抗がん剤または処置が投与される併用療法を含む、請求項３１４～３１９のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、医薬組成物、またはワクチン。
  321. 第２の抗がん剤または処置が、免疫刺激細菌、または医薬組成物の前に、またはそれと同時に、またはその後に、またはそれと間欠的に投与される、請求項３２０に記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  322. 第２の抗がん剤または処置が、免疫治療である、請求項３２０または請求項３２１に記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  323. 免疫刺激細菌、または医薬組成物またはワクチンの投与が、非経口投与である、請求項３１４～３２２のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  324. 免疫刺激細菌、または医薬組成物またはワクチンの投与が、経口投与、または直腸投与であるか、または肺および／もしくは鼻へのエアロゾルによるか、または粘膜投与、または頭蓋内投与、または皮内投与、または腫瘍内投与である、請求項３１４～３２２のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  325. 免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物の投与が、静脈内投与、筋内投与、鼻腔内投与、または皮下投与である、請求項３１４～３２４のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  326. がんが、白血病；リンパ腫；胃がん；ならびに乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部、および肝臓のがんの中から選択される、請求項３１４～３２５のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、医薬組成物、またはワクチン。
  327. 免疫治療が、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与を含む、請求項３１４～３２６のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  328. 免疫刺激細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、リステリア属、または大腸菌種である、請求項３１４～３２７のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  329. 免疫刺激細菌が、サルモネラ属種である、請求項３１４～３２８のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  330. 免疫刺激細菌が、ネズミチフス菌株である、請求項３１４～３２９のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  331. 免疫刺激細菌の投与が腹腔内投与または腫瘍内投与による、請求項３１４～３３０のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  332. 対象が転移性がんを有する、請求項３１４～３３１のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  333. 第２の抗がん処置を投与することを含み、第２の処置が、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＩＬ－６、抗シグレック１５、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ７３、および抗ＣＤ３８抗体中から選択される、請求項３１４～３３２のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  334. 第２の抗がん処置またはさらなる抗がん処置を投与することを含み、第２の処置またはさらなる処置が、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、化学療法剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗Ｈｅｒ２抗体、抗メソテリン抗体、および抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体の中から選択される、請求項３１４～３３３のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、ワクチン、または医薬組成物。
  335. ウイルス感染症または別の感染性病原体による感染症の処置の方法であって、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチンを投与することを含み、免疫刺激細菌またはワクチンが、ウイルスまたは病原体に由来する抗原、タンパク質、またはそのエピトープを含むか、またはコードする、方法。
  336. 免疫刺激細菌が、細菌によって認識されるプロモーターの制御下で抗原、タンパク質またはそのエピトープをコードし、免疫刺激細菌がゲノム改変（複数可）を含み、それによって、それがインビボで複製しない、請求項３３５に記載の方法。
  337. ウイルス感染症または別の感染性因子による感染症の処置で使用するための、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌もしくはワクチン、または請求項３３５および３３６に記載の方法。
  338. ウイルスまたは他の感染性因子による感染症を予防（そのリスクを低減する）ための免疫化の方法であって、免疫化用量の請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチンを投与することを含み、免疫刺激細菌によってコードされている産物が、抗ウイルスもしくは抗病原体治療薬、または抗原、エピトープ、またはタンパク質である、方法。
  339. 免疫刺激細菌によって産生されコードされているものが、抗ウイルスもしくは抗病原体治療薬または抗原、エピトープ、またはタンパク質である、ウイルスまたは他の感染性因子による感染症に対して防御し、その重症度を低減させ、またはそのリスクを低減させるために免疫化で使用するための、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  340. 感染性因子がウイルスである、請求項３３５～３３９のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチンまたは方法。
  341. 免疫刺激細菌が、細菌中に存在するポリメラーゼによって認識されるプロモーターに作用可能に連結されたＲＮＡをコードするプラスミドを含み、真核生物宿主細胞の感染時に、ＲＮＡが真核生物宿主の細胞質中に放出される、請求項１～３４０のいずれかに記載の免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物、または方法、または使用。
  342. 真核生物宿主の細胞質中に放出されたＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項３４１に記載の免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物、または方法、または使用。
  343. プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項３４１または請求項３４２に記載の免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物、または方法、または使用。
  344. 免疫刺激細胞が、プロモーターを認識するポリメラーゼもコードする、請求項３４１～３４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物、または方法、または使用。
  345. ポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項３４１～３４４のいずれかに記載の免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物、または方法、または使用。
  346. 免疫刺激細菌が、ａｓｄ－であるか、またはｔｈｙＡ－であるか、またはその両方である、請求項３４１～３４５のいずれかに記載の免疫刺激細菌、またはワクチン、または医薬組成物、または方法、または使用。
  347. 細菌が、ウイルスまたは腫瘍由来の抗がんもしくは抗ウイルス治療用産物、または抗原、タンパク質、またはエピトープもしくはそれらの組合せをコードする、腫瘍またはウイルス感染症の処置で使用するための、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチン。
  348. がんまたはウイルス感染症の処置の方法であって、請求項６８～８０のいずれかに記載のＲＮＡデリバリーシステムを、または腫瘍関連抗原もしくはウイルス抗原、タンパク質またはエピトープをコードする請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはワクチンを、がんおよび／またはウイルス感染症を有する対象に投与することを含む、方法。
  349. Ｍ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換する方法であって、請求項３８～８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌を、抗ウイルスもしくは抗腫瘍免疫応答を増強することによって処置される状態、疾患、または障害を有する対象に投与することを含む、方法。
  350. 抗ウイルスもしくは抗腫瘍免疫応答を増強することによって処置される状態、疾患、または障害を有する対象内でＭ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換するための、請求項３８～８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌の使用、または請求項３８～８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  351. 疾患、障害、または状態が、がんおよび／またはウイルスもしくは他の病原体の感染症である、請求項３４９に記載の方法または請求項３５０に記載の使用もしくは細菌。
  352. 治療用産物をコードするＲＮＡを送達する方法であって、疾患、状態、または障害の処置のために、請求項１６～２５のいずれかに記載の免疫刺激細菌を投与することを含む、方法。
  353. 疾患、状態、または障害の処置のために治療用産物をコードするＲＮＡの送達で使用するための、請求項６８～８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌の使用、または請求項６８～８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  354. 疾患、障害、または状態が、がんおよび／またはウイルスもしくは他の病原体の感染症である、請求項３５２に記載の方法または請求項３５３に記載の使用もしくは細菌。
  355. 薬学的に許容される媒体中に、請求項２３１～３１０のいずれかに記載の細菌を含む、医薬組成物
  356. ワクチンとして、液剤、粉末剤、または錠剤として製剤化されている、請求項３５５に記載の医薬組成物。
  357. 疾患または状態または感染症またはがんを処置もしくは予防する（発症のリスクを低減する）ことで使用するための、請求項２３１～３１３、３５５、および３５６のいずれかに記載の細菌または医薬組成物。
  358. 疾患または状態または感染症またはがんを処置もしくは予防する（発症のリスクを低減する）方法であって、請求項２３１～３１３、３５５、および３５６のいずれかに記載の細菌または医薬組成物を投与することを含む、方法。
  359. 請求項２３１～３１０および３５５～３５７のいずれかに記載の細菌または医薬組成物を投与することを含む、ＲＮＡを送達する方法。
  360. ＲＮＡを送達することで使用するための、請求項２３１～３１０および３５５～３５７のいずれかに記載の細菌。
  361. ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項３５９に記載の方法または請求項３６０に記載の細菌。
  362. 産物が治療用産物であり、細菌中のプラスミドが、細菌によって翻訳されないｍＲＮＡを産生するために産物をコードする、請求項２３１～３１０および３５５～３５７のいずれかに記載の細菌。
  363. 対象にＲＮＡを送達する方法であって、請求項３６２に記載の細菌を投与することを含む、方法。
  364. ＲＮＡを対象に送達することで使用するための、請求項３６２に記載の細菌。
  365. ＲＮＡを対象に送達することで使用するための細菌であって、異種産物をコードするプラスミドを含み、
    異種産物をコードする核酸が、細菌によって認識されるプロモーターに連結しており、
    産物をコードする核酸が、細菌によって認識されない翻訳用の真核生物配列を含み、それによって、細菌がＲＮＡを産生するが、ＲＮＡを翻訳しない、細菌。
  366. ＲＮＡをコードする核酸が、治療用産物をコードする、請求項１～３１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌である請求項３６５に記載の細菌。
  367. 細菌が、抗原またはタンパク質に対する免疫応答を誘発させるために、病原体また腫瘍に由来する抗原またはタンパク質をコードする、請求項３６５または請求項３６６に記載の細菌。
  368. 非ヒト種由来の改変されたインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質であって、非ヒトＳＴＩＮＧが、ヒトＳＴＩＮＧと比較して低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し、ヒトＳＴＩＮＧと比較して高いＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路シグナル伝達活性を有してもよいものであり、
    非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が改変されて、その活性が増大するか、または細胞質内核酸の非存在下に構成的に作用するような突然変異を含み、
    突然変異がアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換であり、
    ＳＴＩＮＧタンパク質が、ＴＲＡＦ６結合部位の欠失または破壊を有してもよい、
    改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  369. 非ヒト種由来の改変されたインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質、またはキメラヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびその改変体であって、コードされているＳＴＩＮＧタンパク質の構成的な活性化および／もしくは感受性の増強、または内在性リガンドに対する親和性または結合の増大をもたらす機能獲得（ＧＯＦ）を伴う１つまたは複数の突然変異を含み、それによって、ＳＴＩＮＧタンパク質が、アミノ酸の挿入、欠失、および置換の１つまたは複数によって改変されており、
    ＳＴＩＮＧタンパク質が、ＩＦＮ－ベータシグナル伝達活性、およびヒトＳＴＩＮＧと比較して減弱した活性化Ｂ細胞の核因子カッパ－軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達活性を有し、
    突然変異が、ＳＴＩＮＧ活性の増大またはＩＦＮ－ベータ産生の誘導における構成的な活性をもたらす、
    改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  370. ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有するか、または配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそのヒト対立遺伝子変異体である、請求項３６８または請求項３６９に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  371. ＳＴＩＮＧタンパク質が、第１の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質中のＣ末端テール（ＣＴＴ）領域の、第２の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴによる置換を含むキメラであり、
    第２の種のＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し、
    ＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位が欠失していてもよい、
    請求項３６８～３７０のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  372. 突然変異が、自己炎症性疾患であるＳＴＩＮＧ関連血管炎（ＳＡＶＩ）と関連するものに対応する任意のものである、請求項３６８～３７１のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  373. キメラである改変されたインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質であって、第１の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質中のＣＴＴ（Ｃ末端テール）領域の、第２の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴによる置換を含み、
    第２の種のＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し、
    ＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位が欠失していてもよい、
    改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  374. ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有するか、または配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそのヒト対立遺伝子変異体である、請求項３６８～３７３のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  375. 第１の種がヒトであり、第２の種が、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメの中から選択される、請求項３６８～３７３のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  376. Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の活性の少なくともまたは少なくとも約３０％である、請求項３６８～３７５のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  377. ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧ ＮＦ－κＢシグナル伝達活性の３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満である、請求項３６８～３７６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  378. 非ヒト種または第２の種が、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメの中から選択される、請求項３６８～３７７のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  379. ＳＴＩＮＧの改変が、ヒトＳＴＩＮＧへの参照およびそれとのアラインメントによって、インターフェロン症で起こる突然変異に対応する突然変異であり、アラインメントするヒトＳＴＩＮＧ配列が配列番号３０５～３０９に記載されている、請求項３６８～３７８のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  380. ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して低減したＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有するＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣ末端テール（ＣＴＴ）による、ＣＴＴの置換を含む、請求項３６８～３７９のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  381. 置換する側のＣＴＴが、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメＳＴＩＮＧタンパク質由来である、請求項３８０に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  382. 置換する側のＣＴＴが、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメＳＴＩＮＧタンパク質由来であり、それがヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴを置換する、請求項３８０に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  383. 置換する側のＣＴＴが以下の種の中から選択され、以下の配列：
    タスマニアンデビル RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF 配列番号３７１、
    マーモセット EEEEVTVGSLKTSEVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRSDLF 配列番号３７２、
    ウシ EREVTMGSTETSVMPGSSVLSQEPELLISGLEKPLPLRSDVF 配列番号３７３、
    ネコ EREVTVGSVGTSMVRNPSVLSQEPNLLISGMEQPLPLRTDVF 配列番号３７４、
    ダチョウ RQEEYTVCDGTLCSTDLSLQISESDLPQPLRSDCL 配列番号３７５、
    イノシシ EREVTMGSAETSVVPTSSTLSQEPELLISGMEQPLPLRSDIF 配列番号３７６、
    コウモリ EKEEVTVGTVGTYEAPGSSTLHQEPELLISGMDQPLPLRTDIF 配列番号３７７、
    マナティー EREEVTVGSVGTSVVPSPSSPSTSSLSQEPKLLISGMEQPLPLRTDVF 配列番号３７８、
    トキ CHEEYTVYEGNQPHNPSTTLHSTELNLQISESDLPQPLRSDCF 配列番号３７９、
    シーラカンス
    （変異体１） QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKRQVC 配列番号３８０、
    シーラカンス
    （変異体２） QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKSGF 配列番号３８１、
    ギンザメ LTEYPVAEPSNANETDCMSSEPHLMISDDPKPLRSYCP 配列番号３８３、および
    マウス EKEEVTMNAPMTSVAPPPSVLSQEPRLLISGMDQPLPLRTDLI 配列番号３８４、
    またはこれらの配列それぞれと少なくとも９８％の配列同一性を有するそれらの対立遺伝子変異体
    を有する、請求項３８１または請求項３８２に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  384. ヒトＣＴＴが、配列EKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS（配列番号３７０）を含むか、それと少なくとも９８％の配列同一性を有する対立遺伝子変異体である、請求項３８２または請求項３８３に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  385. 改変されたＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ由来のＣＴＴで置換されているキメラである、請求項３７３～３８４のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  386. タスマニアンデビルＳＴＩＮＧ由来のＣ末端テール（ＣＴＴ）が配列RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF（配列番号３７１）を含むか、それと少なくとも９８％の配列同一性を有する対立遺伝子変異体である、請求項３８５に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  387. ＴＲＡＦ６結合部位の欠失または破壊を含む、請求項３６８～３８６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  388. ＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧタンパク質であり、ＴＲＡＦ６結合部位がＣ末端にアミノ酸残基ＤＦＳを含む、請求項３８７に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  389. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達活性を増大させるか、または活性を細胞質内核酸の非存在下で構成的にする改変を含む、請求項３６８～３８８のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  390. 改変が、ヒトＳＴＩＮＧへの参照およびそれとのアラインメントによって、インターフェロン症で起こる突然変異に対応し、ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有する、請求項３８９に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  391. 改変が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のヒトＳＴＩＮＧの配列を参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａの１つまたは複数に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換である、請求項３６８～３９０のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  392. 配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のヒトＳＴＩＮＧの配列を参照して、Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇに対応する置換を含む、請求項３９１に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  393. タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項３９２に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
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