JP2023509964A - 真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成および真核生物への送達のための微生物システム - Google Patents

Abstract

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの産生および真核細胞への送達のための細菌システム。該システムは、侵襲性非病原性細菌を利用して、機能的ｍＲＮＡカーゴを産生し、真核細胞に送達する。加えて該システムは、細菌を利用して、下流での適用のために細菌細胞から抽出され得る機能的ｍＲＮＡを産生する。該細菌は、ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの原核生物発現カセットを含有し；ｍＲＮＡは、真核生物宿主細胞内で翻訳を媒介する、細菌で転写されたポリＡ配列と、５’キャップまたはシュードキャップエレメント、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントと、を含有する。治療性ｍＲＮＡ機能の例としては、抗体をコードする遺伝子材料、ワクチン抗原、および宿主内の欠損遺伝子を提供することが挙げられるが、これらに限定されない。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月１１日出願の米国仮出願第６２／９５９，９７６号および２０２０年１１月２５日出願の米国仮出願第６３／１１８，５９３号の利益を主張するものである。

発明の分野
本発明は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の生成に関する。より具体的には本発明は、真核生物宿主細胞への送達およびタンパク質への即時翻訳のための、細菌送達ビヒクルとしてさらに利用され得る細菌内でｍＲＮＡを産生するための原核生物発現システムに関する。

発明の背景
細胞は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を利用して、細胞のＤＮＡ内にコードされた情報をタンパク質に翻訳する。ｍＲＮＡは、任意のタンパク質をコードし得るため、この核酸は、治療的に使用される潜在性を有する。そのような１つのシナリオにおいて、外因性ｍＲＮＡが、宿主細胞に送達されて、広範囲の治療適用において機能し得る酵素、抗体、および抗原をはじめとする１種または複数のタンパク質に翻訳される。しかし外因性ｍＲＮＡは、安全で、効率的に、そしてタンパク質への翻訳が可能な分子として送達されなければならない。現在、適正なプロセシングのために、宿主ゲノムへの組み込みを行わずに完全に翻訳可能なｍＲＮＡの産生と、安全かつ有効な送達との両方を包含するシステムは、存在しない。ｍＲＮＡは、微生物システムを利用して生成することもできる。このシナリオでは、外因性ｍＲＮＡが、真核細胞内部での広範囲の治療適用および非治療適用において機能し得る酵素、抗体、および抗原をはじめとするタンパク質への下流の翻訳のために、細菌細胞の内部で生成されて細菌細胞から回収される。しかし、外因的に生成された（即ち、細菌で生成された）ｍＲＮＡは、タンパク質への真核生物翻訳が可能な分子でなければならない。現在、試験管内の転写後プロセシングまたは適正なプロセシングのための宿主ゲノムへの組み込みを行わない、細菌細胞内部での真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの産生を包含する完全なシステムは、存在しない。本明細書では、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核細胞内部でのタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を支援する５’－および３’－末端の必要とされるエレメントを含有するｍＲＮＡを意味する。

発明の概要
本発明は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのスケーラブルな微生物バイオマニュファクチャリング（生成または産生とも称される）と、所望なら幾つかの例で、次の真核細胞への真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの細胞内送達と、に向けた細菌システムを提供する。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの産生および真核細胞への送達の組み合わせのために、システムは、侵襲性の非病原性細菌を利用してｍＲＮＡカーゴを産生し、真核細胞に送達する。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの微生物生成の場合、システムは、非病原性細菌を利用して、真核細胞内で機能性になる形態で抽出され得るｍＲＮＡを産生する。細菌は、染色体またはプラスミド上でｍＲＮＡをコード化する少なくとも１つの原核生物発現カセットを含有し；ｍＲＮＡは、細菌により転写されたポリＡ配列と、真核生物宿主細胞におけるリボソーム動員および翻訳を媒介する５’キャップまたはシュードキャップエレメント、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントと、を含有する。治療性ｍＲＮＡの機能の例としては、抗体をコードする遺伝子材料および宿主内の欠損遺伝子を提供することが挙げられるが、これに限定されない。細菌細胞内でのｍＲＮＡの発現を駆動する本発明のシステムで用いられるプロモータは、細菌内のみで動作可能であり、真核細胞内では動作可能でない。このシステムにより産生および／または送達されるｍＲＮＡ転写産物は、細菌からの抽出の際、または細菌に媒介された送達の際、真核生物宿主細胞内で翻訳可能になるため、追加的な転写後プロセシングを行わずにタンパク質に翻訳され得る。これは、ｍＲＮＡ製造のより合理化された方法と、ｍＲＮＡが臨床適用のために用いられる場合の臨床効果までの時間の短縮と、を促す。ｍＲＮＡが研究中の一般的適用に用いられる非治療性ｍＲＮＡ機能の例としては、ポリペプチドへのインビトロ翻訳のために遺伝子材料を提供することが挙げられるが、これに限定されない。

特定の実施形態において、本発明は、治療適用に利用され得るｍＲＮＡを提供する。しかし本発明は、産生されるｍＲＮＡ、そして特定の実施形態では送達されるｍＲＮＡの性質に依存しない。本発明者らが作製しているのは治療性ｍＲＮＡそのものではなく、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡである。例えば産生および送達されたｍＲＮＡは、治療目的のものであってもよく、または細胞内の特別なｍＲＮＡの効果、もしくはそのｍＲＮＡから発現されたポリペプチドの効果を確定することなど、インビトロ研究を意図したものであってもよい。

第一の態様において、本発明は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するための細菌システムを提供する。該システムは、細菌細胞内のみで動作可能なプロモータを必要とする少なくとも１種の原核生物発現カセットを有する細菌を含むことができ、該原核生物発現カセットは、少なくとも１種のｍＲＮＡ分子をコードし、該ｍＲＮＡ分子は、真核細胞内でのタンパク質への翻訳のための真核生物翻訳可能エレメントを含有する。原核生物発現カセットの発現を駆動するために用いられるプロモータは一般に、真核細胞内で機能的でないものであろう。その後、ｍＲＮＡ分子は、原核生物ＲＮＡポリメラーゼにより転写され得る。第一の態様の本発明の状況において、細菌は、細菌の染色体上の配列からの真核生物翻訳可能エレメントを含有する少なくとも１種のｍＲＮＡ分子を発現するように操作される。細菌は、真核生物翻訳可能エレメントを含有する少なくとも１種のｍＲＮＡ分子を発現するように設計された少なくとも１種のプラスミド（ベクターとも称される）で形質転換される。標的真核細胞は、分裂または非分裂細胞を含む動物または植物細胞であり得る。第一の態様のｍＲＮＡ分子は、真核生物リボソーム動員が可能な５’キャップまたはシュードキャップ様エレメントと、ポリＡテールを含有する３’末端と、を有していて、細菌細胞内で生成された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子をもたらすであろう。タンパク質への翻訳のための真核生物翻訳可能エレメントとしては、ウイルスまたは真核細胞の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントが挙げられる。特定の実施形態において、コードされたｍＲＮＡ分子は、細菌により転写されたポリＡ領域と、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを介して真核生物宿主細胞内での翻訳開始を媒介する５’シュードキャップエレメントと、を有する。細菌が、プラスミドを介するなどで、ｍＲＮＡ分子上でのポリＡテールの安定化のためにポリＡ結合タンパク質を含むことが、さらに企図される。ポリＡ領域は、１～５００のＡを含有し得る。特定の実施形態において、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性菌である。第一の態様で定義された組成物は、疾患の予防のために治療において薬品中で、または研究適用で、使用され得る。第一の態様で定義された組成物は、医薬的に許容できる配合物中に含まれ得る。

第二の態様において、本発明は、原核生物発現カセットを提供する。原核生物発現カセットは、細菌細胞内で動作可能な原核生物プロモータを含む。原核生物発現カセットは、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子をコードし、該ｍＲＮＡ分子は、真核細胞の細胞質への送達の際にタンパク質への翻訳に必要となるエレメントを含有する。特定の実施形態において、カセットはさらに、細胞進入メディエータおよびエンドソーム放出メディエータをコードする。細胞進入メディエータは、インベーシンタンパク質（例えば、ｉｎｖ遺伝子によりコードされた）またはその断片もしくは結合ドメインであり得、エンドソーム放出メディエータは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）（例えば、ｈｌｙＡ遺伝子）であり得る。ウイルスＩＲＥＳエレメントなどのＩＲＥＳエレメントは、リボソーム動員を促すために、ｍＲＮＡのための配列およびｍＲＮＡ配列に対して５’側の領域に含まれ得る。特定の実施形態において、発現カセットは、真核生物リボソーム動員が可能なキャップまたはキャップ様エレメントを含有する５’末端と、細菌細胞内で生成された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子をもたらすポリＡテールを含有する３’末端と、を有する。ポリＡ領域は、１～約５００のＡを含有し得る。第二の態様の原核生物発現カセットは、侵襲性非病原性細菌に含まれ得る。

様々な態様のｍＲＮＡは、非限定的に、抗体もしくは抗体断片をコードする遺伝子材料を提供すること、または宿主内の欠損遺伝子を動員する遺伝子材料を提供すること、をはじめとする機能を有する治療性ｍＲＮＡであり得る。得られた転写ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の環状立体配座を促進するエレメントで転写され得る。

更なる態様および実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、バイオマニュファクチャリングシステムで生成されて、下流の適用のために回収される。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、転写の際に細菌内で環状化され得る。例えばバクテリオファージＴ４並べ替え（ｐｅｒｍｕｔｅｄ）イントロン－エクソン（ＰＩＥ）法が、ｍＲＮＡの環状化を促進するために用いられ得る。グループＩイントロン自己スプライシングを通して、２つのエクソンのスプライシングおよびライゲーションが起こり、真核細胞内部で理論上翻訳され得る環状ＲＮＡ生成物を形成する。環状の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、幾つかの例において、３’ポリＡ配列で転写されてもよい。環状の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ立体配座は、幾つかの例において、５’および３’末端がＲＮａｓｅに接近不能であり、それによりｍＲＮＡ分子の分解を予防し、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの安定性を増進することにおいて有利であることを約束し得る。本発明は、５’キャップ／シュードキャップおよび３’ポリＡテールを有する直鎖状真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを転写し得る細菌、または環状真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを転写し得る細菌のどちらかを提供する。環状ｍＲＮＡが５‘末端上のウイルスＩＲＥＳエレメントを有し、ポリＡテールを有する、または有さない細菌の内部で作製されることが、本明細書で実験的に実証される。

第三の態様において、本発明は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステムを提供する。第三の態様のシステムは、５’シュードキャップエレメントと、ポリペプチドをコードする核酸配列と、ポリＡテールと、を含む真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの発現カセットを有するように操作された細菌を含むことができ、この場合の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写は、原核生物プロモータの制御下にある。５’シュードキャップエレメントは、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。有利な実施形態において、ＩＲＥＳは、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＩＲＥＳ、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）ＩＲＥＳまたは表１～３に列挙されたＩＲＥＳである。さらなる有利な実施形態において、細菌は、少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作された非病原性細菌である。

細菌が真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを転写するように操作され得、該ｍＲＮＡが転写の際に上記細菌内で環状化される。

第四の態様において、本発明は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステムを提供する。該システムは、少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作され、ＩＲＥＳと、ポリペプチドをコードする核酸配列と、ポリＡテールと、を含む真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの発現カセットを有する、非病原性細菌を含み得る。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写は、原核生物プロモータの制御下にあり得る。

第五の態様において、本発明は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するための追加的システムを提供し、第五の態様のシステムは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列を含む少なくとも１つの発現カセットを有する細菌を含むことができ、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列の転写は、真核細胞内で不活性であるプロモータの制御下にあり、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子は、真核細胞内でポリペプチドの翻訳を可能にする真核生物由来配列エレメントを含む。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列は、細菌の染色体上にあるように操作され得る。あるいは発現カセットは、真核生物翻訳可能エレメントを含有する少なくとも１つのｍＲＮＡ分子をコードする配列を含むプラスミドであり得る。

発現カセットは、真核生物リボソーム動員が可能な５’キャップまたはシュードキャップ様エレメントを含む５’末端と、ポリＡテールを含有する３’末端と、を有する真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列を有して、細菌細胞内で生成された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子をもたらすことができる。タンパク質への翻訳のための真核生物翻訳可能エレメントは、ウイルスまたは真核細胞の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントであり得る。有利な実施形態において、ウイルスまたは真核細胞の内部リボソーム進入（ＩＲＥＳ）エレメントは、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＩＲＥＳおよび豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）ＩＲＥＳからなる群から選択される。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列が、ポリＡ領域をコードする配列と、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを介して真核生物宿主細胞内で翻訳開始を媒介することが可能な５’シュードキャップエレメントをコードする配列と、を含む、請求項７に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。ポリＡ領域は、１～５００のＡを含有し得る。

第六の態様において、本発明は、細菌の染色体からの真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列を有する操作された細菌を含む真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するための追加的システムを提供し、該真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写は、真核細胞内で不活性であるプロモータの制御下にあり、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列は、５’ＩＲＥＳおよび３’ポリＡテールをコードする。プロモータは、原核生物プロモータであり得る。細菌は、非病原性侵襲性細菌であり得る。非病原性細菌は、細菌への進入または細菌エンドソームからの放出を促すための少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作され得る。

第七の態様において、本発明は、コロナウイルススパイクポリペプチドまたはその断片のための、５’ＩＲＥＳをコードする配列と、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列と、を含む少なくとも１つの発現カセットを有する細菌を含むスパイクタンパク質をコードする真核生物翻訳可能ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（または他のコロナウイルス）ｍＲＮＡを産生するためのシステムを提供し、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列の転写は、真核生物内で不活性であるプロモータの制御下にある。細菌は、非病原性侵襲性細菌であり得る。非病原性細菌は、細菌への進入または細菌エンドソームからの放出を促すための少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作され得る。侵襲因子は、ｉｎｖまたはｈｌｙＡ遺伝子によりコードされる。プロモータは、原核生物プロモータであり得る。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための現行のワクチンの幾つかは、対象へのｍＲＮＡの投与を利用する。大量のｍＲＮＡを生成することの難しさ、ｍＲＮＡを有するワクチン組成物の貯蔵および取り扱い、ならびにｍＲＮＡを送達するために用いられる送達ビヒクルをはじめとし、数多くの欠点がそのようなワクチンに存在する。本発明は、大量のｍＲＮＡを産生するために用いられ得るシステムを提供する。加えてそのシステムは、現行のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンの厳重な取り扱い要件を有さない。さらに生成システムは同時に、送達ビヒクル、単に送達として役立ち、毒性を低減することができる。

第七の態様において、本発明は、ウイルスポリペプチドまたはその断片のための、５’ＩＲＥＳと、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡと、をコードする配列を含む少なくとも１つの発現カセットを有する細菌を含む真核生物翻訳可能ウイルス抗原ｍＲＮＡを産生および送達するためのシステムを提供し、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列の転写は、真核細胞内で不活性であるプロモータの制御下にある。真核生物翻訳可能ウイルス抗原ｍＲＮＡを産生および送達するためのシステムは、表２に列挙されたもののうちの抗原であり得る。

更なる態様において、本発明は、対象における疾患を処置または予防するための方法を提供する。該方法は、上記の様々な態様に記載されたものなどの組成物を投与するステップを含み得る。該組成物は、筋肉内もしくは鼻内投与により、または以下に開示される様々な経路により送達され得る。

本発明はさらに、以下の実施例に開示されるような真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生し得る細菌を作製するための方法を提供する。手短に述べると、真核生物翻訳可能ウイルス抗原ｍＲＮＡへの転写に望ましい核酸配列が、シュードキャップエレメントおよびポリＡテールをコードする発現カセット中にクローニングされ得る。有利な実施形態において、該細菌は、１種または複数の侵襲因子を発現するように操作された非病原性細菌であり得る。

本発明をより完全に理解するためには、以下の詳細な記載を添付の図面と関連づけて参照しなければならない。

真核生物リボソームをＲＮＡに動員することが可能な細菌転写５’エレメント（この例ではＩＲＥＳエレメント）と、３’ポリＡ配列と、を有するｍＲＮＡを示した図である。 ｍＲＮＡ生成および送達システムのためのプラスミド設計を示した図であり；この実施形態は、５’キャップのように機能するウイルスＩＲＥＳエレメントと、３’ポリＡ配列と、が表されている。 細菌システムが真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生し、吸入またはエアロゾル化送達を介してマウスに送達するために用いられる、本発明の考えられる治療適用を表した図である。 細菌転写真核生物翻訳可能ｍＲＮＡにおけるＣｒＰＶ ＩＲＥＳエレメント（１０４ｂｐ）およびｍａｍｍＣｈ遺伝子（６９９ｂｐ）コード配列の存在を検証したＰＣＲ産物でのアガロースゲルの画像である。 Ｎｅｘｃｅｌｏｍ ＣｅｌｉｇｏのＲＦＰチャンネルで画像化された原核生物または真核生物ＲＢＳを有するＲＦＰを発現するように形質転換された細菌を示した３枚１組の画像である。細菌が原核生物ＲＢＳの存在下でＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎを発現する場合、細菌のみで赤色蛍光を示すが、ｍａｍｍＣｈ配列がＣｒＰＶ真核生物ＩＲＥＳ配列の下流にある場合、または陰性対照としてのスクランブルプラスミドを担う場合、細菌が赤色蛍光を示さないことを実証している。 Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｉｇｏの明視野およびＲＦＰチャンネルで画像化された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを発現する細菌と共にインキュベートされたＡ５４９肺上皮細胞を示した６枚１組の画像である。スクランブル陰性対照配列を発現する細菌で処置されたＡ５４９細胞が、赤色蛍光を示さないが、ＣｒＰＶ真核生物ＩＲＥＳ配列の下流のｍａｍｍＣｈ配列を発現する細菌で処置されたＡ５４９細胞が、ロバストな赤色蛍光シグナルを示すことを実証している。

好ましい実施形態の詳細な記載
本発明は、細菌細胞内での真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成のための原核生物発現システムに関し、該真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、細菌内部に蓄積され、該真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、細菌細胞から回収されるか、または次の真核細胞への送達のために細菌細胞内に残留し、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核細胞の内部でタンパク質に翻訳され得る。本発明は追加的に、疾患の処置および予防に関する。より具体的には本発明は、真核生物宿主細胞への送達およびタンパク質への即時翻訳のための細菌送達ビヒクル内でｍＲＮＡを産生するための原核生物発現システムに関する。

本発明は、ｍＲＮＡ生成および送達システムを提供し、特定の実施形態において、それは侵襲性非病原性細菌細胞を利用して、真核細胞内での翻訳のためにｍＲＮＡを産生し、そして幾つかの例では送達することができる。細菌細胞は、そのｍＲＮＡと、細菌細胞内でｍＲＮＡをキャッピングまたはシュードキャッピングし、ポリアデニル化するためのメカニズムまたは配列と、をコードする原核生物発現カセットを含有し得る。翻訳可能ｍＲＮＡは、原核生物プロモータの制御下であってもプラスミドから、または細菌の染色体上の配列からコード化され得る。真核細胞への送達が望ましくない場合、該システムは、シュードキャップおよびポリＡ配列を有するｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを産生するために非侵襲性または侵襲性細菌細胞を利用し得る。

非翻訳可能ＲＮＡのインビトロ産生は、確立されているが、そこでは非翻訳可能ＲＮＡが、細菌内で転写されるか、または化学的アプローチを利用して、もしくは必要となる成分および酵素を用いて試験管内で合成される。このＲＮＡ形態は、本明細書で「５’キャップ」と称される５’末端の７－メチルグアノシンヌクレオチド、および本明細書で「ポリＡテール」と称される３’末端のアデニン塩基のみを含有する配列など、真核生物翻訳に必要となる５’および３’エレメントを含有しない。それゆえＲＮＡは、酵素で外因性キャッピングおよびテーリングすることにより、ｍＲＮＡにさらにプロセシングされなければならない、またはこのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡは、真核生物宿主ゲノムに組み込まれ、真核細胞により転写され、宿主細胞の自然なキャッピングおよびテーリングメカニズムを利用して内因性キャッピングおよびテーリングされなければならない。５’キャップおよび３’ポリＡテールは、ｍＲＮＡ安定性、リボソーム動員、およびタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳に必要とされる。５’キャップ構造は、リボソーム会合を媒介し、ｍＲＮＡ転写産物をタンパク質に翻訳するのに必要な細胞機構および成分を物理的にまとめる。ポリＡテールは、細胞質内の酵素分解からｍＲＮＡを保護して、核からのｍＲＮＡの出口である転写終結を支援し、タンパク質への翻訳に必要である。５’キャップおよび３’ポリＡテールは両者とも、翻訳前のＲＮａｓｅによる分解からｍＲＮＡを保護し、細胞内での転写産物の安定性を改善する。機能的な翻訳可能（完全に処置され、キャッピングおよびテーリングされた）ｍＲＮＡのインビトロ産生は、５’キャップおよび３’ポリＡテールを含有するｍＲＮＡを産生し、その後、別々にプロセシングするために含まれる多段階工程の複雑さによって制限される。５’キャップおよび３’ポリＡテールを付加してｍＲＮＡを機能的かつ翻訳可能にするための真核細胞によるｍＲＮＡのインビボプロセシングもまた、ｍＲＮＡが宿主ゲノムに組み込まれた場合に、オフターゲット効果および有害作用の潜在性により制約される。現行の多段階手順は、下流の商品化および製造、ならびに研究または臨床現場での一般的適用を大きく制限している。

歴史的にｍＲＮＡは、タンパク質への翻訳に必要なエレメントを含有するように、合成的に作製され、化学的に修飾される。これらの合成ｍＲＮＡは、典型的には、リポソーム、ナノ粒子を介する、またはコンジュゲートとして、という３つの一般的方法の１つで送達される。しかしこれらの送達方法は、免疫原性効果、短い半減期、毒性上昇（ネイキッドｍＲＮＡに比較して）ほかの根深い制限を有する［Ｋａｃｚｍａｒｅｋ ｅｔ ａｌ． “Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： ｆｒｏｍ ｃｏｎｃｅｐｔ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅａｌｉｔｙ，“ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ． ９：１－１６ （２０１７）]。これらの送達法に関連する別の難題は、細胞膜を横断することに関連する制約のために、大きな負電荷ｍＲＮＡ分子を標的真核細胞に送達できないことである。加えてｍＲＮＡ送達のための現行法は、特異的組織、細胞型、および体内の場所の標的化が可能でない。この欠陥は、全身投与が必要になることを意味し、それにより特異的に標的組織または体内の場所に送達する場合に必要となるのと同じ用量を実現するためにより多くのｍＲＮＡを必要とする結果、処置コストが上昇することに加え、毒性および免疫原性により問題を悪化させる可能性を意味する。幾つかのｍＲＮＡは、ウイルスベクターを介して送達されてきた［Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．“ｍＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｄｅｌｉｖｅｒ ａ ｈｏｐｅｆｕｌ ｍｅｓｓａｇｅ，” Ｎａｎｏｔｏｄａｙ ２３：１６－３９（２０１８）］。ウイルスベクターはまた、免疫原性および挿入変異の問題も有し、ヒトの臨床使用で重要となるＧＭＰ条件下で生成することが困難である。ウイルスベクターはまた、免疫原性であり得、患者における有害な抗体反応を刺激し得る。

送達の制限にかかわらず、複数のｍＲＮＡ治療薬が、現在、ヒト使用のために利用可能である。一例は、頭頸部癌の処置に用いられるｐ５３腫瘍タンパク質をコードするウイルスベクター／送達ビヒクルのＧｅｎｄｉｃｉｎｅ（登録商標）である。第二の例は、リポタンパク質リパーゼをコードし、リポタンパク質リパーゼに欠損がある患者においてタンパク質置換に用いられるウイルスベクター／送達ビヒクルのＧｌｙｂｅｒａ（登録商標）である。両方のウイルスベクターは、真核生物遺伝子調節エレメントを含有するウイルスベクター送達ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡ治療薬の真核生物転写に依存しており、つまりウイルスベクターは、予め作製された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを宿主細胞に送達することができないことになる。文献で時々用いられる用語「ベクター」が、リポソーム、ウイルスベクターまたは細菌送達ビヒクルなどの送達ビヒクルを指し得ることに留意されたい。本明細書で概して用いられる通り、本発明の細菌は、用語「ベクター」のより伝統的見地に対応する、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、バクテリオファージ、または任意の染色体外エレメントなどの染色体と異なった形で自己複製可能なベクター内の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位を含有してもよい。

当該分野には大きな利点が存在し、ＲＮＡ治療薬のターゲットは豊富であるが、ロバストなｍＲＮＡ産生および非免疫原性で非毒性の効率的送達のための包括的で自己完結型のシステムは、依然として確立されていない。ｍＲＮＡは、タンパク質置換およびワクチン処置などの適用に大きな潜在性を有するが、非免疫原性で、組織特異性があり、非組み込み型で、自身の遺伝子発現機能を利用して翻訳可能なｍＲＮＡ分子を産生することが可能である送達メカニズムを欠くことが、当該分野を著しく制限している。ｍＲＮＡは、治療薬として使用される場合の有効性を実証されたが、追加的ｍＲＮＡ薬を臨床にもたらすために、改善された送達手段が確立されなければならない。送達前に真核生物翻訳に適し、送達の直後、さもなければ産生されたｍＲＮＡが研究用または治療適用に用いられる時に、真核生物宿主細胞によりタンパク質に翻訳され得るような５’キャップまたはシュードキャップエレメントおよび３’ポリＡテールを有するｍＲＮＡ種の生成などのｍＲＮＡ産生のための完全なシステムとして機能する能力が、現行の最新技術には欠如している。加えて、現行のアプローチ（例えば、ウイルスベクター）は、翻訳前にｍＲＮＡプロセシング（転写）のための宿主ゲノムへの組み込みを必要とし、その結果、免疫関連の悪影響および潜在的に有害なゲノム不安定化をもたらすことが多いため、ｍＲＮＡ治療薬の最新技術は、安全性のリスクを有する。

本発明は、真核細胞に送達されると翻訳可能になる５’キャップおよび３’ポリアデニル化のあるｍＲＮＡの生成またはバイオマニュファクチャリングのための新規な細菌システムを提供する。幾つかの例において、この細菌システムは追加的に、リガンド特異性受容体標的化を介して特異的細胞および組織への標的化された送達を提供し得る。該システムはまた、真核細胞ゲノム組み込みを行わずに受容体介在性エンドサイトーシスを介して任意の真核細胞（分裂および非分裂）によりｍＲＮＡ分子の細胞内取り込みを行うためのメカニズムを提供し、それにより宿主ゲノムへの組み込みの際に挿入変異により引き起こされる腫瘍形成をはじめとする潜在的な併発問題が軽減される。本発明は、概して核酸の送達のための細菌プラットフォームに基づいて構築しており、専ら原核生物プロモータの制御下の細菌細胞内で起こる真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ産生の新規手段を包含し、そのため細菌細胞内で転写された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、必要とされる５’および３’エレメントで転写され、それにより真核細胞への送達前に翻訳可能になる。

他のｍＲＮＡ生成および送達方法に比較して、細菌介在性ｍＲＮＡ生成および送達システムのこのシステムには数多くの利点がある。より有意義な利点の詳細および幾つかを、以下に議論する。

自己完結型システム：細菌細胞は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成と、所望なら真核細胞への真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの送達の両方について多機能である。これらの細菌細胞は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ生成の部位として役立ち、特異的真核生物宿主細胞および組織への完全に翻訳可能なｍＲＮＡのための送達ビヒクルとしても役立ち得る。所望の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成は、本明細書に記載された原核生物プロモータの制御下で該当するｍＲＮＡをコードするプラスミドを用いるなど、細菌細胞を形質転換することにより実現され得る。形質転換された細菌はまた、送達ビヒクルとしても機能することができ、その場合の細菌は、自然に侵襲性の細菌株、またはプラスミドもしくは細菌の染色体上に侵襲因子を含むことにより侵襲性になるように操作された細菌株である。細菌細胞は、スケーラブルなバイオマニュファクチャリングのための媒体において効率的複製が可能である。これは、複雑で高価な多段階製造アプローチを必要とする他のｍＲＮＡ送達システムと対照的である。異なる真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする細菌株を、必要に応じてグリセロール中で容易に凍結して、後の回復のために生存を維持することもできる。

急速に効果的：本発明の新規な細菌送達システムは、真核生物宿主ゲノム組み込みまたはさらなるｍＲＮＡプロセシングを行わずに所望の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ送達事象を急速に実現し、それによりタンパク質への急速な翻訳を支援し、送達される真核生物宿主細胞において非特異的効果を排除する。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、完全に機能的な形態で送達されるため、真核細胞内でのプロセシングを必要とせず、細胞が送達された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを即座に翻訳し得るため、臨床効果までの時間が短縮される。

非免疫原性：細菌送達ビヒクルは、Ｒ型リポ多糖表現型により抗原提示細胞認識を回避し、インビボデータから、このシステムが宿主において自然もしくは適応免疫反応、または任意の他のサイトカインカスケードを誘導しないことが示される。非免疫原性の性質において、本発明のビヒクルは、自然および適応免疫反応を刺激して潜在的に抗体生成につながり得るナノ粒子、リポソームおよびウイルスベクターをはじめとする他の送達ビヒクルと明確に異なる。

非組み込み型：完全なｍＲＮＡ分子の転写は、専ら原核生物プロモータにより制御される。このことは、ｍＲＮＡが細菌細胞により真核生物翻訳可能ｍＲＮＡとして完全に転写されることを意味している。この特色は、真核生物宿主ゲノムへのＤＮＡ組み込みの必要性を防止し、ｍＲＮＡ生成物の制御された送達を提供し、異常な宿主ゲノム組み込みによる望まない副作用のリスクを排除する。

高度に安定性：該送達システムは、血清、プロテアーゼまたはヌクレアーゼへの暴露により阻害されず、細菌ビヒクルおよび真核生物翻訳可能ｍＲＮＡカーゴが標的部位に達するまで、それらを安定状態に保持することが可能である。他の非ウイルスベクターと異なり、該細菌送達ビヒクルは、貪食クリアランスにより排除されず、追加的に安定性に寄与する。ネイキッドｍＲＮＡは、短い半減期を有し、ヌクレアーゼによる分解を受け易い。本発明のシステムは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡカーゴが標的真核細胞内部の目的地に達するまで、細菌細胞により提供された安全な環境のおかげでネイキッドｍＲＮＡの送達よりロバストである。細菌送達ビヒクルは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが標的真核細胞に達する前に、それを分解から遮断する。送達前の５’キャップまたはシュードキャップおよび３’ポリＡテールの存在は、送達後の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ転写産物をさらに安定化し、真核生物宿主細胞内でのタンパク質への急速な翻訳の確率を上昇させる。

大きな送達容量：本発明の送達システムは、脂質ナノ粒子（脂質ナノ粒子あたりのｍＲＮＡ分子 １：１）および所望なら複数の異なるｍＲＮＡに比較して、多量の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ（例えば、細菌細胞あたりのｍＲＮＡ分子 ＞１００：１）を効果的に産生および送達し得る。例えば、各部分集団が異なる真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする細菌の部分集団を複数の含む、細菌のカクテル／集団を作り出すことができる。細菌が、１つより多くの原核生物発現カセットを含むことにより１つより多くの真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成するように操作され得ることが、さらに企図される。その上、それらのｍＲＮＡは、異なるプロモータの制御下におくことができ、プロモータを強度に基づいて選択して、細菌内の相対的真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ生成レベルをあつらえることができる。例えば、高濃度が望ましい場合には、強力な原核生物プロモータが、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成するのに用いられ得、低減された量の転写産物が望ましい場合には、より弱いプロモータが、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写を制御するのに用いられ得る。ｍＲＮＡの濃度は、プラスミドのコピー数、染色体の位置、原核生物プロモータの強度、および細菌増殖に割り当てられた時間に基づいて調整され得る。このシステムは、細菌ビヒクルの効果的な細胞内在化のために受容体介在性エンドサイトーシスを利用し、エンドソープ穿孔および真核生物の細胞質、即ちタンパク質翻訳部位へのｍＲＮＡの放出を促す。

対費用効果のある生成：この細菌システムは、ｍＲＮＡの従来の酵素合成、および完全にプロセシングされた（５’キャップおよび３’ポリＡテールのある）ｍＲＮＡ分子を生成しない他の生物生成システムの両方に比較して、より対費用効果のある製造方法を提供する真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための生物生成（バイオマニュファクチャリング）システムを表す。この細菌ｍＲＮＡ生成様式は、合成ＲＮＡを生成し、合成５’キャップを付加し、類似のｍＲＮＡ生成物を酵素的にポリアデニル化する、少なくとも３つのステップを必要とする他のシステムと対照的に、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成するための効率的なワンステップ方法を表す。この理由で、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのバイオマニュファクチャリングのための本発明の細菌システムを利用することで、より短時間、より少ない供給源（試薬、機器、マンパワー）を必要とし、複数の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ配列を同時に生成することを許容し、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのより大規模な生成を可能にすることにより、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成するより発達した効率的かつ対費用効果のある手段を提示する。

本発明は、数多くの理由で最新技術を発展させ、その多くを以下に議論する。

第一に本発明は、単にＲＮＡの産生を可能にすることと対照的に、自己完結型システムで真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの発現および送達の両方を完遂し、その後、細菌で産生されたＲＮＡの単離後に標的細胞内または試験管内などで、５’キャップおよび３’ポリＡテールをＲＮＡ分子に付加する第二の独立したステップを必要とすることができるシステムを提供する。

第二に、本発明のシステムは、原核生物プロモータ、したがって細菌ポリメラーゼを利用することのみで動作可能になる原核生物発現カセットを利用し、細胞質に送達すると即座に真核生物宿主細胞の中で、該宿主細胞により即翻訳可能である完全に機能的なｍＲＮＡ（５’キャップおよび３’ポリアデニル化ｍＲＮＡ）を産生する。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成は、細菌送達ビヒクル（細菌細胞）内で起こり、それにより合成および送達の工程を簡略化および合理化する。重要なこととして、本発明のシステムは、原核生物発現カセットを利用してｍＲＮＡ発現を駆動するため、真核生物宿主細胞ゲノムへの異常な組み込みのリスクも軽減する。これは、宿主細胞への送達の際に、送達された発現カセットが宿主ゲノムに組み込まれ、ｍＲＮＡが真核細胞により転写され、続いてタンパク質に翻訳されるように、真核生物ポリメラーゼによってのみ認識される真核生物プロモータを利用してｍＲＮＡを発現する真核生物発現カセットを送達する細菌を利用するシステムと対照的である。本発明のシステムは、ｍＲＮＡ転写および翻訳可能ｍＲＮＡへのプロセッシングを完遂し、その全てが、細菌細胞の内部である。これは、本発明のシステムを用いたｍＲＮＡ生成の一過性の性質に寄与する１つの特色であり、有限量のｍＲＮＡを提供することが望ましい状況（即ち、患者へのオフターゲット効果を低減するため）およびｍＲＮＡの長期生成が必須であり得ない、または所望であり得ない状況で、大きな価値を有し得る。

第三に本発明は、宿主細胞翻訳システムを利用して真核生物宿主細胞内でのポリペプチドへの翻訳のために真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子を産生し、送達し得る。これは、予め作製されたタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗原、酵素、抗体）を真核生物宿主細胞に直接送達するシステムと異なる。本発明は、既にタンパク質形態であれば送達され得るよりも高いタンパク質濃度で生成を案内し得る、より多くの真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子を作製および送達し得る。加えて真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを真核生物宿主細胞に送達することは、宿主細胞にタンパク質を産生させ、タンパク質が適正にフォールディングされること（タンパク質機能に必要）をさらに確実にするが、タンパク質を真核細胞に送達することは、真核細胞への送達の前に、送達されるタンパク質が既に適正にフォールディングされている必要がある。タンパク質フォールディング、メチル化、およびリン酸化などの機能を促す真核生物翻訳後プロセシングメカニズムは多くの場合、原核生物メカニズムと異なり、試験管内での複製を困難にし得る。

本発明は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生および送達する細菌細胞の非組み込み型および非免疫原性の性質のおかげで、他の技術に比較して有意に安全である。これらの特色はさらに、毒性の潜在性を低減する。細菌が特異的組織型、例えば目、生殖器官、肺、筋肉、および他の上皮に関連する特異的細胞への受容体介在性エンドサイトーシスを介した細菌取り込みを促す侵襲因子を発現する本発明により与えられる組織特異性送達は、全身投与を介してｍＲＮＡを送達するシステムより優れる。この自己完結型細菌送達システムは、細菌細胞内でカノニカル真核生物５’キャップ（本明細書では「シュードキャップ」と称される）および３’ポリＡテールと機能的に同等であるエレメントを含有する所望の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成し、次に細菌は、この完全に機能的なｍＲＮＡを真核生物宿主生物体内の特異的組織に細胞内で送達し得る。それゆえこのシステムは、インビトロ適用に関連するだけでなく、インビボ適用にも関連し、そこで真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、意図した治療効果を誘導し得るポリペプチドに即座にプロセシングされ得る。細菌送達ビヒクル内でのプロセシングされた真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのパッケージングはまた、投与の際の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡへの保護を提供し、こうして濃度要件を調整して、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの治療効果を効率的に最大にする。

実施例１：ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードする真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを発現する侵襲性細菌の産生
コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）からの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを、一緒になってポリＡテールを含むおよそ６０のアデノシン（Ａ）残基の配列に融合された哺乳動物コドン最適化ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍａｍｍＣｈ）コード配列の上流で、ｐＳｉＶＥＣ２プラスミド中にクローニングすることにより、ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、真核細胞により翻訳可能であると予測される真核生物翻訳可能ｍＲＮＡとして転写される機能的真核生物ｍＲＮＡ分子を一緒になって含む、ＩＲＥＳエレメントと、ｍａｍｍＣｈコード配列と、ポリＡテールと、を含むＲＮＡ分子をコードする。ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａを大腸菌（ＦＥＣ２１）に形質転換して、菌株ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａを産生した。ＦＥＣ２１細菌を追加的に、それぞれインベーシン－および受容体－介在性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）およびＬＬＯ介在性エンドソーム放出のためにｉｎｖおよびｈｌｙＡ遺伝子の組み込みを介して真核細胞に侵襲性になるように操作した。ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａを形質転換されたＦＥ２１細胞を、選択のために適切な抗生物質を含有する脳心臓滲出物（ＢＨＩ）寒天に播種した。得られたクローンを、ＰＣＲを介してスクリーニングして、ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａの存在を確認し、ＣｒＰＶ ＩＲＥＳエレメント（１０４塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ産物）およびｍａｍｍＣｈコード配列（６９９ｂｐのＰＣＲ産物）を増幅した（図４）。ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａの単一クローンを、２０％グリセロール中、－８０℃で凍結した。この原液からの１つの凍結アリコートを、プレート計数（ｐｌａｔｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）のために解凍した。手短に述べると、１ｍＬアリコートを５０００×ｇで５分間遠心分離し、細胞をＢＨＩ １ｍＬに再懸濁させた。得られた細菌懸濁液を系列希釈し、抗生物質を含有するＢＨＩ寒天に三重測定として播種した。各希釈のコロニーカウントを平均し、全体的なコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬを計算し、ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａの原液の生存濃度を表した。このシステムは、定量された生存接種原液を全ての今後のアッセイで直接利用させた。

細菌発現ｍＲＮＡの真核生物翻訳をテストするために、標準の侵襲アッセイを用いた。ヒト肺胞基底上皮細胞（Ａ５４９）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００ｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃での５％ＣＯ_２インキュベーションにより維持した。侵襲性細菌（ｉｎｖおよびｈｌｙＡをコードする）は、非限定的にＡ５４９細胞をはじめとする哺乳動物細胞に、ＲＭＥを介して進入し、それにより細菌によりコードおよび発現されたカーゴを送達することができる。侵襲アッセイは、以下のステップを含む。

Ａ５４９細胞を、壁面の黒い２４ウェルプレートに固定濃度で播種した。細菌侵襲の当日、３種の細菌原液を解凍した：１）ＦＥＣ１９／ｐＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（細菌リボソーム結合部位を有するＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ蛍光タンパク質をコードするプラスミドを担う非侵襲性陽性対照株）；２）ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿Ｓｃｒａｍｂｌｅ（非翻訳可能および非コード化スクランブル配列をコードするプラスミドを担う侵襲性陰性対照株）；３）ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａ（真核生物ＣｒＰＶ ＩＲＥＳリボソーム結合部位の制御下にあるポリアデニル化ｍａｍｍＣｈ ｍＲＮＡをコードするプラスミドを担う侵襲性株）。細菌をその後、以下の通り侵襲アッセイのために調製した：グリセロール中で凍結され計数された原液を－８０℃から解凍し、５０００×ｇで５分間遠心分離した。細菌ペレットを、ＤＭＥＭ（－）（血清および抗生物質不含、高グルコース）で最終濃度２．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで再懸濁させた。ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａ細胞を、２種の追加的最終濃度１．２５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬおよび５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで再懸濁させた。Ａ５４９細胞をＤＭＥＭ（－）で洗浄して抗生物質を除去し、各細菌懸濁液０．５ｍＬと共に２時間インキュベートし（３７℃および５％ＣＯ_２）、続いてＤＭＥＭ（－）で５回すすいで、未結合の細菌細胞を除去した。この処置の２４時間後に、ＲＦＰチャンネル（励起５３１／発光６２９）のＮｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｉｇｏ装置を用いて細胞を画像化して、それぞれＦＥＣ１９／ｐＥ２ＣｒｉｍｓｏｎおよびＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－ＡのためにＥ２ＣｒｉｍｓｏｎまたはｍａｍｍＣｈを表す赤色蛍光を検出し、そして明視野で画像化して、細胞密度を観察した。

図５は、細菌が原核生物ＲＢＳの存在下のＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、即ちＦＥＣ１９／ｐＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎを発現する場合には、細菌のみで赤色蛍光を示すが（Ａ）、ｍａｍｍＣｈ配列がＣｒＰＶ真核生物ＩＲＥＳ配列（即ち、ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａ）の下流にある場合、細菌は赤色蛍光をし得さないこと（Ｂ）を実証している。スクランブルプラスミド（ｐＳｉＶＥＣ２＿Ｓｃｒａｍｂｌｅ）を担う細菌は、赤色蛍光を示さない（Ｃ）。全てのパネルで、スケールバーは、５００μｍを表す。各パネルの右上の隅も、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｉｇｏ装置においてＲＦＰチャンネルで良好に測定された試料の平均蛍光強度を表し、Ｅ２－ＣｒｉｍｓｏｎフルオロフォアからのＲＦＰシグナルの存在と、ＳｃｒａｍｂｌｅおよびｍａｍｍＣｈからの検出可能なＲＦＰの非存在と、が確認された。

実施例６は、ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿Ｓｃｒａｍｂｌｅで処置されたＡ５４９細胞が赤色蛍光を示さないが［明視野（Ａ）、赤色蛍光チャンネル（Ｂ）、マージ（Ｃ）］、ＦＥＣ２１／ｐＳｉＶＥＣ２＿ＣｒＰＶ－ｍａｍｍＣｈ－Ａで処置されたＡ５４９細胞がロバストな赤色蛍光シグナルを示すこと［明視野（Ｄ）、赤色蛍光チャンネル（Ｅ）、赤色蛍光シグナルおよびＡ５４９細胞の共局在を確認したマージ］を実証している。全てのパネルで、スケールバーは、５００μｍを表す。

まとめると、これらの結果から、細菌細胞による細菌発現ｍＲＮＡ分子（真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ）の送達と、続く真核生物翻訳を実証している。

実施例２：真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子の細菌転写および哺乳動物細胞への送達
５’－ＩＲＥＳエレメント、遺伝子コード配列および３’ポリＡテールを含有するｍＲＮＡの転写の成功が、標準の侵襲アッセイおよび分子検出技術を利用して実証された。

一緒になってポリＡテールを含むおよそ６０アデノシン（Ａ）の残基の配列に融合された野生型ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）コード配列の上流のｐＳｉＶＥＣ２プラスミド中にＩＲＥＳエレメントをクローニングすることにより、４種のプラスミド変異体（表４）を構築した。得られたプラスミドは、真核細胞により翻訳可能であると予測された機能性真核生物ｍＲＮＡ分子を一緒になって含む、ＩＲＥＳエレメントと、ｌｕｃコード配列と、ポリＡテールと、を含むＲＮＡ分子をコードする。４種のプラスミドのそれぞれは、別個に大腸菌（ＦＥＣ２１）に形質転換され、それぞれインベーシン－および受容体－介在性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）と、ＬＬＯ－介在性エンドソーム放出のためのｉｎｖおよびｈｌｙＡ遺伝子の組み込みを介して真核細胞に侵襲性になるように操作された。形質転換されたＦＥＣ２１を、選択のために適当な抗生物質を含有するＢＨＩ寒天に播種した。得られたクローンを、ＰＣＲを介してスクリーニングして、ＩＲＥＳエレメント（表４に列挙された生成物サイズ）およびｌｕｃ遺伝子（５１３ｂｐ生成物）の両方の存在を確認した。「ｐＳＩＶＥＣ２＿ｃｉｒｃＣｒＰＶ－ｌｕｃＡ」構築物を追加的ＰＣＲによりスクリーニングして、リボザイムが指向したｍＲＮＡ環状化のためのリボザイムが指向したスプライス部位のためのスプライスジャンクションに及ぶプライマーを利用して環状を確認し、環状ｍＲＮＡおよび直鎖状でないｍＲＮＡのためのアンプリコンを生成することのみ予測され、評価されたそのような全ての構築物は、２１６ｂｐのＰＣＲ産物について陽性とテストされた。培養物を各菌株の２つの単離されたコロニーそれぞれから調製し、適当な抗生物質と共にＢＨＩ培地中、３７℃で後期対数増殖期（ＯＤ_６００ ０．８～１．０）まで増殖させた。

ＲＮＡを表５に列挙された細菌から抽出し、細菌細胞内の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ種の転写成功を実証した。手短に述べると、およそ５×１０^８ＣＦＵの各細菌培養物を、１ｍｍジルコニアビーズおよびＢｉｏＳｐｅｃ ＢｅａｄＢｅａｔｅｒを用いて均質化した。総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、製造業者の推奨プロトコルに従って抽出した。得られたＲＮＡ抽出物を、次のステップに記載された逆転写およびＰＣＲまで、－８０℃で凍結した。

標準の侵襲アッセイもまた、哺乳動物細胞への真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ転写産物の細菌送達を実証するために用いた。ヒトＡ５４９細胞を実施例１に記載された通り培養し、６ウェルプレートに固定濃度で播種した。上記のＲＮＡ抽出で用いられたものと同じ細菌培養物を、およそ２．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬに調製し、１ｍＬをＡ５４９細胞と共に２時間インキュベートし（３７℃および５％ＣＯ２）、続いてＤＭＥＭ（－）で５回すすぎ、未結合の細菌細胞を除去した。１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む、実施例１に詳述された通り補充された完全ＤＭＥＭを添加して、任意の残った細胞外細菌を殺傷し、さらに２時間インキュベートした。Ａ５４９細胞をＤＭＥＭ（－）でさらに３回洗浄し、その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素７５０μＬで剥離した。ＲＮＡ抽出は、全細胞容量を利用して先に記載された通り実施した。

全てのＲＮＡ試料濃度および純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光法により測定し、ＲＮＡ １μｇを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＭＶ逆転写酵素を用いた二重測定の逆転写（ＲＴ）反応に用い、ランダムヘキサマーまたはオリゴ（ｄＴ）プライマーでプライミングした。ランダムヘキサマープライマーは、全ての細菌および真核生物ＲＮＡ転写産物のＲＴを可能にすると予測された。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、ポリＡテールまたはカノニカル真核生物ｍＲＮＡ、場合によってはＡ５４９細胞によって生成された内因性ｍＲＮＡを含有する細菌転写産物のＲＴのみを可能にすると予測されるため、原核生物ＲＮＡが存在しないポリＡ配列の存在を必要とする。

ＲＴに続いて、得られたｃＤＮＡの固定量をＰＣＲにより増幅し、その後、２％アガロースゲルで電気泳動して、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの必要なエレメントのそれぞれを検出した。表５に要約されたＰＣＲ結果から、評価された異なるＩＲＥＳエレメントおよび遺伝子コード配列（ｌｕｃ）のそれぞれをはじめとする成分全てが存在したことが確認され、ポリＡテールの存在が、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いたＲＴにより検証された。

要約すると、結果から、１）本発明に記載された設計を有する細菌細胞の内部の環状真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ立体配座の転写、２）真核生物翻訳に必要とされるエレメントを含むシュードキャップおよび３’ポリＡ配列として作用する５’ＩＲＥＳエレメントを含有するＲＮＡの細菌転写の成功、ならびに３）真核細胞への、細菌で産生された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ（直鎖状および環状の両方）の検出可能な量の送達の成功、が実証される。

請求項の用語集
出願全体を通して用いられる用語「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、他に明確に断りがなければ、それらが、参照された成分またはステップの「少なくとも１つ」、「少なくとも第一の」、「１つまたは複数」または「複数」を意味するという意味で用いられる。例えば用語「細胞」は、その混合物をはじめとする複数の細胞を包含する。

用語「および／または」は、本明細書で用いられればどこでも、「および」、「または」および「前記用語により連結された要素のあらゆる他の組み合わせ」の意味を包含する。

本明細書で用いられる用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。

本開示の広い範囲を表す数値範囲およびパラメータは、近似であるが、具体的実施例に表された数値は、可能な限り精密に報告されている。しかし、任意の数値は本質的に、各テスト測定で見出された標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有する。さらに、変動する範囲の数値範囲が、本明細書で表される場合、列挙された値を含むこれらの値の任意の組み合わせが用いられ得ることが、企図される。

本明細書、特に特許請求の範囲で用いられる用語「含む」は、生成物、組成物および方法が参照された成分またはステップを含むがそれ以外を除外しないことを意味する。生成物、組成物および方法を定義するために用いられる場合の「から本質的になる」は、任意の本質的意義のある他の成分またはステップを除外することを意味する。したがって列挙された成分から本質的になる組成物は、微量の混入物および医薬的に許容できる担体を除外しない。「からなる」は、他の成分またはステップの微量要素以外を除外することを意味する。

本発明の方法を実践するためのキットが、さらに提供される。「キット」は、少なくとも１種の試薬、例えば本発明のｐＨバッファーを含む任意の製造品（例えば、パッケージまたはコンテナ）を意図する。キットは、本発明の方法を実施するための単位として販売促進、流通、または販売されてもよい。加えてキットは、キットおよびその使用のための方法を記載した添付文書を含有してもよい。あらゆるキット試薬が、密封コンテナまたはパウチなどの外部環境から保護されたコンテナの中で提供されてもよい。

有利な実施形態において、キットのコンテナは、医薬的に許容できる担体をさらに含んでいてもよい。キットは、滅菌希釈剤をさらに含んでいてもよく、それは好ましくは別の追加的コンテナに貯蔵されている。別の実施形態において、キットは、対象における疾患を処置および／または予防するための方法として、ｐＨバッファーおよび抗病原剤の併用処置の利用をむけた印刷物の使用説明書を含む添付文書をさらに含む。キットはまた、追加的抗病原剤（例えば、アマンタジン、リマンタジンおよびオセルタミビル）、そのような薬剤の効果を増強する薬剤、または処置の有効性もしくは忍容性を開園する他の化合物を含む追加的コンテナを含んでいてもよい。

本発明において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する能力を有する用語「細菌」は、細菌が培地で培養された時に、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが採取され得る程度に、細菌の細胞内で真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを発現および蓄積する能力を有する細菌を指す。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する能力を有する細菌は、異種真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを細菌細胞内に定量可能な量で蓄積し得る細菌であってもよい。一実施形態において、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）、他のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、または修飾ＲＮＡを分解し得る他の酵素、例えばＰＮＰａｓｅの活性が低減または排除されるように、細菌株が修飾されてもよい。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する能力を有する細菌はまた、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを細菌細胞内に１ピコグラム／Ｌ以上、１ｍｇ／Ｌ培養物以上、２ｍｇ／Ｌ培養物以上、５ｍｇ／Ｌ培養物以上、１０ｍｇ／Ｌ培養物以上、２０ｍｇ／Ｌ培養物以上、５０ｍｇ／Ｌ培養物以上、または１００ｍｇ／Ｌ培養物以上の量で蓄積し得る細菌であってもよい。

本明細書で用いられる用語「細菌（単数）」または「細菌（複数）」は、任意のグラム陽性またはグラム陰性菌を意味するものとする。一実施形態において、コリネ型細菌が、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する菌株として用いられ得る。コリネ型細菌の例としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、または同様の属に属する細菌が挙げられる。幾つかの例において、コリネバクテリウム属は、コリネバクテリウム・グルタミカムである。加えて、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成のために用いられる細菌は、一般に安全と見なされる（ＧＲＡＳ）微生物であり得る。

本発明の一実施形態において、それぞれが真核生物翻訳可能ｍＲＮＡに対応する１種または複数の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）が、細菌により生成されてもよい。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが、外因性ＲＮＡおよび／または真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する細菌株内で自然に見出されるＲＮＡ以外のＲＮＡである限り、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの配列は、限定されない。代わりまたは追加として、ＲＮＡは、５’キャップまたは５’シュードキャップおよび３’ポリＡテールを含有するように転写されよう。したがって真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する細菌株内で自然に見出されるＲＮＡではなく、代わりに人の産物であろう。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの様々な条件、適用、および使用目的に従って細菌内部での生成のために適宜、選択され得る。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、例えば修飾されずに自然に存在する（しかし、不自然に作製されて、プラスミドおよび／または細菌内へのクローニングなどを通して存在する）ＲＮＡ、その修飾ＲＮＡ、または人工的に設計されたＲＮＡであってもよい。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、例えばウイルスに由来するＲＮＡ、微生物に由来するＲＮＡ、動物に由来するＲＮＡ、植物に由来するＲＮＡ、または真菌に由来するＲＮＡであってもよい。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株などのコロナウイルスに関連するタンパク質抗原をコードするＲＮＡであってもよい。

ｍＲＮＡが細菌抗原をコードするが、細菌抗原またはその断片をコードする配列と共に５’キャップまたはシュードキャップ（即ち、ＩＲＥＳエレメント）および３’ポリＡ配列を有する配列を含み得ることが、さらに企図される。そのためこれは、細菌ポリペプチドをコードする非天然由来の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡであろう。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、例えば酵素、受容体、トランスポータ、抗体、構造タンパク質およびレギュレータなどの幾つかの機能を有するタンパク質をコードするもの、ならびにそれ自体は機能を有さないタンパク質をコードするものであってもよい。ちなみに、本明細書で参照される用語「タンパク質」は、オリゴペプチドおよびポリペプチドなどのいわゆるペプチドを包含する。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの長さは、限定されない。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの長さは、例えば１０ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、もしくは１００ヌクレオチド以上、もしくは１００００ヌクレオチド以上であってもよく、または１００００ヌクレオチド以下、５０００ヌクレオチド以下、２０００ヌクレオチド以下、１０００ヌクレオチド以下、もしくは５００ヌクレオチド以下であってもよく、またはそれらの組み合わせとして定義された範囲であってもよい。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡであり、例えば直鎖状または環状（即ち、共有結合で閉鎖された）立体配座のＲＮＡの一分子であってもよい。

本発明の一実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、転写の際に細菌内で環状化される。例えばバクテリオファージＴ４並べ替えイントロン－エクソン（ＰＩＥ）法が、ｍＲＮＡの環状化を促進するために用いられ得る。グループＩイントロンを通して、自己スプライシング、スプライシング、そしてその後、２つのエクソンのライゲーションが起こり、環状ＲＮＡ生成物を形成し、それが真核細胞内部で理論上翻訳され得る。環状のｍＲＮＡは、幾つかの例において、３’ポリＡ配列が転写されてもよい。環状のｍＲＮＡ立体配座は、幾つかの例において、５’および３’末端がＲＮａｓｅに接近不能であり、それによりｍＲＮＡ分子の分解を予防し、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの安定性を増進することにおいて有利であることを約束し得る。

本発明において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの原核生物翻訳開始を阻害することが、幾つかの例において重要になり得る。原核生物翻訳を阻害する方法としては、細菌リボソーム結合部位（ＲＢＳ）としての単位として認識された任意の配列を排除すること；イプシロン配列エレメント（ＵＵＡＡＣＵＵＵＡ）、翻訳エンハンサー、または同様のものを排除すること；Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と同一である、さもなければそれとして認識された、真核生物翻訳可能ＲＮＡカセットの上流の配列を欠失または変異させること：または真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの原核生物翻訳を予防する任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。

より具体的には、リボソームに結合してコードされたタンパク質へのＲＮＡの翻訳を開始するのに必要となる機能的な原核生物リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の非存在により、形成された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが細菌細胞内で翻訳されないように、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ転写産物からのタンパク質の形成は、好ましくは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを転写するために用いられるベクターにおいて、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列または同様の能力で機能する他の配列をはじめとする細菌リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を部分的または完全に欠失または突然変異させることにより予防され得る。細菌において、コンセンサスＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列は、ＡＧＧＡＧＧであることが知られている。大腸菌において、該配列は、ＡＧＧＡＧＧＵ、または原核生物翻訳開始において同様の機能を果たすその変異体であることが知られている。他の細菌種（例えば、コリネバクテリウム属）において、コンセンサスから変化した配列もまた、翻訳開始において同様の機能を果たし得る。

別の実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核細胞において翻訳されるべきｍＲＮＡであるため、真核生物翻訳可能ＲＮＡを転写するために用いられるベクターは、真核細胞内でリボソーム結合に必要なＫｏｚａｋ配列を包含し得る。

用語「真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位」は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが転写され得るように構成された遺伝子構築物（例えば、ベクター）を指す。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位は、原核生物内で機能するプロモータ配列と、５’から３’の方向に真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、を含有する。プロモータ配列は単に、「プロモータ」とも称される。

本発明の別の実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位は、真核生物内で機能するプロモータ配列と、５’から３’の方向に真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、環状化ＲＮＡ転写産物の形成を促進し得る追加的なヌクレオチド配列（例えば、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ発現単位の上流および下流に含まれるバクテリオファージＴ４ ＰＩＥ配列）と、を含有する。プロモータとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｈ１、ＰＧＫ１、ＥＦ１ａ、およびＵ６を挙げることができるが、これらに限定されない。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの「発現」または「発現すること」という用語は、細菌細胞による真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写を指す。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、「真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする遺伝子」または「真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ遺伝子」とも称される。一実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが、原核生物プロモータの制御下で発現されるように、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ遺伝子は、前記プロモータの下流に存在する。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの発現単位はまた、細菌内で真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを発現するのに効果的な調節配列（複数可）を含有してもよく；そのような配列としては、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（例えば、－３５および－１０配列）が挙げられるが、これらに限定されず、調節配列（複数可）が機能し得るように、適当な位置（複数可）にある特異的ＲＮＡポリメラーゼシグマサブユニット、ＵＰエレメント（ＲＮＡポリメラーゼアルファサブユニットと相互作用する配列）、オペレータ配列、およびターミネータ配列に特異性があっても、または特異性がなくてもよい。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの発現単位は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写パターンなどの様々な条件に従って適宜、設計され得る。

幾つかの例において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が真核生物翻訳のためにコドン最適化されることが、望ましくなり得る。

個々の遺伝子に関連する真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを、例えばクローニングまたはヌクレオチド合成により、プロモータの下流でのライゲーションの前に得ることができる。

本発明の一実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ遺伝子を発現するためのプロモータは、細菌内で機能する。「細菌内で機能するプロモータ」は、細菌内でプロモータ活性、即ち転写促進活性を示すプロモータを指す。プロモータは、細菌に由来するプロモータ、または異種プロモータであってもよい。プロモータは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ遺伝子のネイティブプロモータまたは別の遺伝子のプロモータであってもよい。プロモータは、遺伝子発現のための誘導型プロモータまたは構成型プロモータであってもよい。

本発明の別の実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが、真核細胞に発現される場合、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする遺伝子を発現するためのプロモータは、真核生物宿主内で機能するプロモータ（例えば、真核生物プロモータ）であってもよい。

一実施形態において、本発明の細菌は、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、バクテリオファージもしくは任意の染色体外エレメントなどの染色体と異なった形で自己複製可能なベクター内の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位を含有してもよく、または発現単位は、染色体内に組み込まれてもよい。言い換えれば、本発明の細菌は、例えばベクター上に真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位を有していてもよく、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位を含有するベクターを有していてもよい。本発明の細菌は、例えば細菌染色体上にも真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位を有していてよい。ベクターは、好ましくはベクター維持のため、そして形質転換体の選択のために、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性補足遺伝子、または抗生物質非依存性メカニズムなどのマーカを含有する。ベクター維持のためのメカニズムは、例えばミクロシンＶまたは他のバクテリオシンベースのベクター選択など、バクテリオシンを利用して完遂されてもよい。

本発明の細菌は、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位の１つまたは複数のコピーを有していてもよい。本発明の細菌により保有された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位のコピー数は、１コピー／細胞のように少なくても（例えば、細菌染色体への組み込みとして）、もしくは２０００コピー／細胞より多くてもよく（例えば、コピー数を改変するために様々な複製起源のプラスミド内にクローニングすることによる）、またはそれらの矛盾しない組み合わせとして定義された範囲であってもよい。本発明の細菌は、細胞あたりの真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのために、１種類／発現単位の型、または１を超える種類／発現単位の型を有していてもよい。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのための発現単位のコピー数および種類／型はまた、それぞれ真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ遺伝子のコピー数および種類／型と読まれてもよい。本発明の細菌が、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡのために２つ以上の発現単位を有する場合、それらの発現単位が本発明の細菌により宿されれば充分であり、それにより真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが生成される。言い換えれば、全ての前記発現単位は、単一発現ベクター上に、または染色体上に宿されてもよい。あるいはそれらの発現単位は、複数の発現ベクター上に別個に、または単一もしくは複数の発現ベクターおよび染色体上に別個に宿されてもよい。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが、細菌細胞内で転写および蓄積されるように、本発明の細菌は、そのような条件下で培養され得る。例えば細菌は、栄養豊富な増殖培地（例えば、脳心臓滲出物培地）中、３７℃でインキュベートされて、指数増殖期まで培養され得、インキュベーション期間を通して真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが構成的に転写され、各細菌細胞内に連続で蓄積される。

真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの発現および蓄積は、例えばＰＣＲもしくはヌクレオチド配列決定などの分子的方法により、または試料としての細菌細胞抽出物を電気泳動に適用し、続いて真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの分子量に対応するバンドを検出することにより、確認され得る。

用語「細胞から回収された」もまた、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する細菌から抽出されることを意味する。幾つかの例において、ｍＲＮＡ回収手順の前に、ＲＮＡ保護試薬で細菌培養ブロスを処置して、細菌内部のｍＲＮＡを安定化し、ｍＲＮＡ安定化を促進することが、望ましくなり得る。ＲＮＡ保護試薬は、外因的に生成されて細菌に添加されてもよく、またはそれは、細菌そのものにより生成されてもよい。

ＩＲＥＳエレメント（５’キャップの代わり）およびポリＡテールを含有する真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、そのような化合物の分離および精製に用いられる適当な方法により細菌細胞から回収され得る。本発明の好ましい実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、標的真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを細菌細胞内の内因性ＲＮＡから分離することにより、細菌細胞から得られる。

そのような回収方法の例としては、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、遠心分離、エタノール沈殿、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および電気泳動の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、例えば細菌細胞を超音波で破壊することができ、遠心分離または同様のものにより破壊された細胞懸濁液から細菌を除去することにより、上清を得ることができ、イオン交換樹脂法または類似の方法により真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを上清から回収することができる。回収された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、遊離化合物、その塩、またはその混合物であってもよい。加えて、回収された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡはまた、タンパク質などの高分子量化合物との複合体であってもよい。即ち本発明において、用語「真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ」は、他に断りがなければ、遊離形態、その塩、それとタンパク質などの高分子量化合物との複合体、またはその混合物である真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを指してもよい。塩の例としては、例えばアンモニウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。

一実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを得るステップは、細菌細胞のリボソームＲＮＡを欠失するステップを含み、より好ましくは細菌細胞のリボソームＲＮＡは、固相に固定された相補性オリゴヌクレオチドでのリボソームＲＮＡの捕捉ハイブリダイゼーションにより欠失される。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを得る別の例は、ＲＮａｓｅ Ｈに基づく酵素欠失法による。

本発明の好ましい実施形態において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、相補性核酸配列でのハイブリダイゼーションにより得られる。

本発明の具体的実施形態において、相補性核酸配列は、固体マトリックス上に固定される。

本発明の一実施形態において、回収された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、下流での適用のために貯蔵され得る。貯蔵配合物は、例えば安定化剤または賦形剤を含んで、または含まずに凍結乾燥またはフリーズドライされた生成物を包含し得る。

回収された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡに加え、例えば細菌細胞、培地の成分、水分、および細菌の代謝副生物のような成分を含有してもよい。真核生物翻訳可能ｍＲＮＡはまた、所望の程度に精製されてもよい。回収された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの純度は、例えば３０％（ｗ／ｗ）以上、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、または９５％（ｗ／ｗ）以上であってもよい。

本発明において、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを生成する細菌は、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、バクテリオファージまたは細菌染色体（ベクターとも称される）上に真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの発現カセットを含有し；真核生物翻訳可能ｍＲＮＡは、真核生物宿主細胞内での翻訳を媒介する細菌転写ポリＡ領域、および５’キャップまたはシュードキャップエレメント、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含有してもよい。可能なＩＲＥＳエレメントの例は、表１、２および３に見出される。追加的なＩＲＥＳエレメントとしては、真核生物リボソームの動員および翻訳開始に効果的であるが、原核生物内では最小限に効果的である任意のＩＲＥＳエレメントが挙げられる。

特別なＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ中に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質中に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質中に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ；「非コード化」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードしてもよい。「タンパク質コード化配列」または特別なタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適当な調節配列の制御下に置かれると、インビトロまたはインビボで、ｍＲＮＡに転写される（ＤＮＡの場合）核酸配列およびポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）の開始コドンおよび３’末端（Ｃ末端）の翻訳終止ノンセンスコドンにより決定される。コード配列としては、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸を挙げることができるが、これらに限定されない。転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置するであろう。

本明細書で用いられる「プロモータ」または「プロモータ配列」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合させること、および下流（３’方向）のコード配列または非コード配列の転写を開始すること、が可能なＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモータ配列は、転写開始部位により３’末端で結合され、バックグランドを超える検出可能なレベルで転写を開始することが必要となる塩基またはエレメントの最小数を含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモータ配列内では、転写開始部位に加え、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが、見出されるであろう。誘導型プロモータをはじめとする様々なプロモータを用いて、本開示に記載された通りベクターを駆動してもよい。

プロモータは、構成的に活性のプロモータ（即ち、構成的に活性（「オン」）状態であるプロモータ）であってもよく、それは、誘導型プロモータ（即ち、活性（「オン」）または不活性（「オフ」）状態が外部刺激（例えば、個々の温度、化合物、またはタンパク質の存在）により制御されるプロモータ）であってもよい。

微生物、例えば細菌または細菌治療性粒子（ＢＴＰ）を参照する場合に、本明細書で用いられる用語「侵襲性」は、少なくとも１つの分子、例えばＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、または真核生物ｍＲＮＡを標的細胞に送達することが可能な微生物を指す。侵襲性微生物は、細胞膜を移行し、それにより前記細胞の細胞質に進入し、その内容物、例えばＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡの少なくとも幾つかを標的細胞に送達することが可能な微生物であり得る。標的細胞への少なくとも１つの分子の送達工程は、好ましくは侵襲装置を有意に改変しない。

本明細書で用いられる用語「生物界間」は、細菌（または別の侵襲性微生物）を利用して核酸を産生し、宿主ゲノム組み込みを行わずにプロセシングするために標的組織内で核酸を細胞内に（即ち、界を越えて：原核生物から真核生物へ、または門を越えて：無脊椎動物から脊椎動物へ）送達する送達システムを指す。

侵襲性微生物としては、細胞膜、例えば真核細胞膜を移行すること、および細胞質に進入することなど、少なくとも１つの分子を標的細胞に送達させることが自然に可能な微生物、ならびに自然に侵襲性でなく、侵襲性になるように修飾されている、例えば遺伝子修飾されている微生物が挙げられる。別の好ましい実施形態において、細菌またはＢＴＰを「進入因子」または「細胞質標的化因子」とも称される「侵襲因子」に連結することにより、自然に侵襲性でない微生物を侵襲性になるように修飾することができる。本明細書で用いられる「侵襲因子」は、非侵襲性細菌またはＢＴＰにより発現された場合に細菌またはＢＴＰを侵襲性にする因子、例えばタンパク質またはタンパク質群である。本明細書で用いられる「侵襲因子」は、「細胞質標的遺伝子」によりコードされる。侵襲性微生物は一般に、当該技術分野において、例えば米国特許出願公開第２０１００１８９６９１ Ａ１号および同第２０１０００９２４３８ Ａ１号、ならびにＸｉａｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４， ６９７－７０２（２００６）に記載されている。その文書のそれぞれは、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。

好ましい実施形態において、侵襲性微生物は、本出願の実施例に教示された通り大腸菌である。しかし、追加的な微生物が遺伝子編集カーゴの送達のために生物界間送達ビヒクルとして実施するように潜在的に適合され得ることが、企図される。これらの非毒性および侵襲性の細菌およびＢＴＰは、侵襲特性を呈するか、または侵襲特性を呈するように修飾され、様々なメカニズムを通して宿主細胞に侵入し得る。特化されたリソゾーム内で通常は細菌またはＢＴＰの破壊をもたらす、専門的な貪食細胞による細菌またはＢＴＰの取り込みとは対照的に、侵襲性細菌またはＢＴＰ菌株は、非貪食性宿主細胞を侵襲する能力を有する。そのような細胞内細菌の天然由来の例は、エルシニア属、リケッチア属、レジオネラ属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、ヘリコバクター属、コクシエラ属、クラミジア属、ネイセリア属、ブルコルデリア属、ボルデテラ属、ボレリア属、リステリア属、シゲラ属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ポルフィロモナス属、トレポネーマ属、およびビブリオ属であるが、この特性はまた、侵襲性関連遺伝子の導入を通してプロバイオティクスをはじめとする大腸菌、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、またはビフィドバクテリウム属などの他の細菌またはＢＴＰに導入され得る（Ｐ． Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ， Ｓ． Ｇｏｕｓｓａｒｄ， Ｃ． Ｇｒｉｌｌｏｔ－Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ， Ｃ．Ｒ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｐａｒｉｓ ３１８， １２０７（１９９５））。生物界間送達ビヒクルとしての使用のための候補として追加的細菌種を評価する場合に考慮される、または取り組まれる因子としては、候補物質の病原性またはその欠如、標的細胞についての候補細菌のトロピズム、あるいは細菌が遺伝子編集カーゴを標的細胞の内部に送達するように操作され得る度合い、および候補細菌が宿主の自然免疫を惹起することにより提供する任意の相乗効果が挙げられる。

本明細書で用いられる用語「完全に機能的なｍＲＮＡ」または「機能的ｍＲＮＡ」は、真核生物リボソームがｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳するように、３’転写ポリＡ領域と、５’キャップまたはシュードキャップエレメント、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントと、を含有するＲＮＡ分子を指す。

本明細書で用いられる用語「真核生物翻訳可能エレメント」は、細菌により転写されたポリＡ配列と、真核生物宿主細胞内でのリボソーム動員および翻訳を媒介する５’キャップまたはシュードキャップエレメント、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントと、を含有するｍＲＮＡを指す。先に表された利点、および前述の記載から明白となった利点は、効率的に達成される。本発明の範囲を逸脱することなく、特定の変更が上記構成の中でなされ得るが、前述の記載に含有された、または添付の図面に示された全ての事柄は、例示と解釈され、限定の意味はないものとする。

これらの改善された生物界間ＮＡ送達ビヒクルを投与する方法としては、局所作用のための鼻腔への鼻内投与、上気道および下気道を標的とするためのエアロゾル化、バッカル送達のための口腔での吸収、ＧＩ吸着のための摂取、性器粘膜上皮に届けるための適用、および眼科送達のための外用薬投与が挙げられる。これらの改善された送達ビヒクルは、広範囲の種（ヒト、トリ、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ）において広範囲の疾患（感染性、アレルギー性、癌性、および免疫性）を予防および／または処置するために用いられ得る。

本発明の化合物に関係する用語「投与」およびその変形例（例えば、化合物を「投与すること」）は、化合物を、処置を必要とする対象の臓器系に導入することを意味する。本発明の化合物は、１種または複数の他の活性剤（例えば、細胞障害剤ほか）と組み合わせて提供される場合、「投与」およびその変形例は、それぞれ該化合物および他の薬剤の同時および連続導入を包含すると理解される。

「対象」は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、獣医学的対象）などの任意の多細胞脊椎動物生物体である。一例において、対象は、生命を脅かす、または生活の質を損なう感染または他の状態を有することが知られている、またはそれが疑われている。

本明細書で用いられる用語「処置すること」および「処置」は、症状の重症度および／もしくは頻度の低減を実行するため、症状および／もしくはその根底にある原因を排除するため、そして／または損傷の改善もしくは修復を促すための、有害な状態、障害、または疾患に見舞われた臨床症状のある対象への本発明の薬剤または配合物（例えば、細菌）の投与を指す。

用語「予防すること」および「予防」は、個々の有害な状態、障害、または疾患を受け易く、このため症状の出現および／またはその根底の原因の予防に関係する、臨床症状のある個体への薬剤または組成物の投与を指す。

ｍＲＮＡを含有する侵襲性細菌は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、口内、鼻内、眼内、直腸内、膣内、骨内、経口、浸漬、および尿道内接種経路により対象に導入され得る。対象に投与される本発明の侵襲性細菌の量は、対象の種、および処置される疾患または状態に応じて変動するであろう。例えば投与量は、約１０^３～１０^１１生存生物体／対象、好ましくは約１０^５～１０^９生存生物体／対象であり得る。本発明の侵襲性細菌またはＢＴＰは一般に、医薬的に許容できる担体および／または希釈剤と一緒に投与される。

当業者は、過度に実験を行うことなく、対象に投与する本発明の組成物の１つの適当な容量を容易に決定することができる。典型的には医師は、個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、それは、用いられる具体的化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用期間、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物併用、特別な状態の重症度、ならびに個体が受けている治療をはじめとする種々の因子に依存するであろう。本明細書で開示された投与量は、平均的な例示である。もちろん、より高い、またはより低い投与量範囲に値する個々の例もあり得、それは、本発明の範囲内である。

吸入投与の場合、本発明による使用のための医薬組成物は、簡便には、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体の使用により、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレープレゼンテーション（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形態で送達される。加圧エアロゾルの場合、弁を提供して計量された量で送達することにより、投与量単位が決定されてもよい。吸入器またはインサフレーター中での使用のための、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジが、組成物、例えば細菌と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末ミックスを含有して、配合されてもよい。

医薬組成物は、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による、非経口投与のために配合されてもよい。注射用の配合剤は、追加の防腐剤と共に単位投与剤形で、例えばアンプルまたは反復投与用コンテナの中で提供されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有してもよい。あるいは有効成分は、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水での構成のために粉末形態であってもよい。

導入されるｍＲＮＡを含有する侵襲性細菌を用いて、対象から得られた細胞などのインビトロで培養された動物細胞を感染させることができる。これらのインビトロ感染細胞はその後、動物、例えば細胞が最初に得られた対象の静脈内、筋肉内、皮内もしくは腹腔内に、または細胞を宿主組織に進入させる任意の接種経路に、導入され得る。ＲＮＡを個々の細胞に送達する場合、投与される生存生物体の投与量は、約０．１～１０^６、好ましくは約１０^２～１０^４細菌／細胞の範囲内の感染多重度であろう。本発明のさらに別の実施形態において、細菌はまた、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を細胞、例えば動物細胞に送達することができ、その後にタンパク質が回収または精製され得る。例えばタンパク質は、組織培養細胞内で生成され得る。

６つの表が、以下に提示されている。

表１は、考えられる非ヒト真核生物ＩＲＥＳエレメントの例を提供している。所与の遺伝子記号により示された遺伝子は、前記遺伝子のＲＮＡ転写産物の翻訳を制御する関連の特異的ＩＲＥＳ配列をコードすることが知られている。ＩＲＥＳエレメントは、文献により完全に議論されている［例えば、Ａ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅｓ． Ｉｎ： Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｆ ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｎｅｗ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｈａｕｐｐａｕｇｅ， ＮＹ： Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ； ｐｐ．１３３－１６６（２００７）； Ｍｏｋｒｅｊｓ Ｍ， Ｖｏｐａｌｅｎｓｋｙ Ｖ， Ｋｏｌｅｎａｔｙ Ｏ， Ｍａｓｅｋ Ｔ， Ｆｅｋｅｔｏｖａ Ｚ， Ｓｅｋｙｒｏｖａ Ｐ， Ｓｋａｌｏｕｄｏｖａ Ｂ， Ｋｒｉｚ Ｖ， Ｐｏｓｐｉｓｅｋ Ｍ． ＩＲＥＳｉｔｅ： ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ＩＲＥＳ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（ｗｗｗ．ｉｒｅｓｉｔｅ．ｏｒｇ）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００６ Ｊａｎ １；３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２５－３０． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｊ０８１． ＰＭＩＤ： １６３８１８２９； ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ１３４７４４４を参照されたい］。

表２は、考えられるウイルスＩＲＥＳエレメントの例を提供している。所与のウイルス記号により示されたウイルスは、前記ウイルスのＲＮＡ転写産物の翻訳を制御する１つの関連する特異的ＩＲＥＳ配列をコードすることが知られている。

表３は、考えられるヒトＩＲＥＳエレメントの例を提供している。遺伝子記号により示された遺伝子は、ＲＮＡの５’末端のＩＲＥＳ配列をコードする。

表６は、選択されたウイルスＩＲＥＳ配列のための配列を提供している。３つのウイルスＩＲＥＳエレメントと、ＲＮＡを環状化させる配列を含む、ＣｒＰＶウイルスＩＲＥＳを環状転写産物と共に用いるための追加的（任意の）配列と、が含まれる。

本出願で引用された全ての参考資料は、矛盾のない程度まで、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

先に表された利点、および前述の記載から明白となった利点が、効率的に達成されることが分かっており、本発明の範囲を逸脱することなく、特定の変更が上記構成の中でなされ得るため、前述の記載に含有される、または添付の図面に示された全ての事柄は、例示と解釈され、限定の意味はないものとする。

以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載された本発明の遺伝子的および特異的特色の全て、ならびに言語に関して、それらの間に含まれると言われる本発明の範囲の全ての言及を網羅することも、理解されなければならない。ここに、本発明を記載した。

配列は全て、５‘から３’に向かって列挙されている。

Claims (27)

1. ５’シュードキャップエレメントと、ポリペプチドをコードする核酸配列と、ポリＡテールと、を含む真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの発現カセットを有するように操作された細菌を含む、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステムであって、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写が、原核生物プロモータの制御下にある、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
2. 前記５’シュードキャップエレメントが、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）である、請求項１に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
3. 前記ＩＲＥＳが、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＩＲＥＳ、および豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）ＩＲＥＳまたは表１～３に列挙されたＩＲＥＳからなる群から選択されるＩＲＥＳである、請求項１に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
4. 前記細菌が、少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作された非病原性細菌である、請求項１に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
5. 前記細菌が、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを転写するように操作されており、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡが、転写の際に前記細菌内で環状化される、請求項１に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
6. 少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作され、ＩＲＥＳと、ポリペプチドをコードする核酸配列と、ポリＡテールと、を含む真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの発現カセットを有する、非病原性細菌を含む、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステムであって、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写が、原核生物プロモータの制御下にある、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
7. 真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列を含む少なくとも１つの発現カセットを有する細菌を含む、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステムであって、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする前記配列の転写が、真核細胞内で不活性であるプロモータの制御下にあり、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子が、真核細胞内でポリペプチドの翻訳を可能にする真核生物由来配列エレメントを含む、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
8. 前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする前記配列が、前記細菌の染色体上にあるように操作される、請求項７に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
9. 前記発現カセットが、真核生物翻訳可能エレメントを含有する少なくとも１つのｍＲＮＡ分子をコードする配列を含むプラスミドである、請求項７に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
10. 前記発現カセットが、真核生物リボソーム動員が可能な５’キャップまたはシュードキャップ様エレメントを含む５’末端と、ポリＡテールを含有する３’末端と、を有する真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列を含み、前記細菌細胞内で生成された真核生物翻訳可能ｍＲＮＡ分子をもたらす、請求項７に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
11. タンパク質への翻訳のための前記真核生物翻訳可能エレメントが、ウイルスまたは非ウイルスの真核細胞内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含む、請求項７に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
12. 前記ウイルスまたは非ウイルスの真核細胞内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントが、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）ＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＩＲＥＳ、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）ＩＲＥＳまたは表１～３に列挙されたＩＲＥＳからなる群から選択される、請求項１１に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
13. 真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする前記配列が、ポリＡ領域をコードする配列と、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを介して真核生物宿主細胞内で翻訳開始を媒介することが可能な５’シュードキャップエレメントをコードする配列と、を含む、請求項７に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
14. 前記ポリＡ領域が、１～５００のＡを含有する、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記細菌の染色体からの真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列を有する操作された細菌を含む、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステムであって、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの転写が、真核細胞内で不活性であるプロモータの制御下にあり、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする前記配列が、５’ＩＲＥＳおよび３’ポリＡテールをコードする、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
16. 前記プロモータが、原核生物プロモータである、請求項１５に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
17. 前記細菌が、非病原性侵襲性細菌である、請求項１５に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
18. 前記細菌が、真核細胞への進入または真核細胞エンドソームからの放出を促すための少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作された非病原性細菌である、請求項１５に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
19. コロナウイルスポリペプチドまたはその断片のための、５’ＩＲＥＳをコードする配列と、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする配列と、を含む少なくとも１つの発現カセットを有する細菌を含むウイルスタンパク質をコードする真核生物翻訳可能ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（または他のコロナウイルス）ｍＲＮＡを産生するためのシステムであって、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする前記配列の転写が、真核生物内で不活性であるプロモータの制御下にある、真核生物翻訳可能ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（または他のコロナウイルス）ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
20. 前記細菌が、非病原性侵襲性細菌である、請求項１９に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
21. 前記細菌が、真核細胞への進入または真核細胞エンドソームからの放出を促すための少なくとも１種の侵襲因子を有するように操作された非病原性細菌である、請求項１９に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
22. 前記侵襲因子が、ｉｎｖまたはｈｌｙＡ遺伝子によりコードされる、請求項１９に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
23. 前記プロモータが、原核生物プロモータである、請求項１５に記載の真核生物翻訳可能ｍＲＮＡを産生するためのシステム。
24. ウイルスポリペプチドまたはその断片のための、５’ＩＲＥＳと、真核生物翻訳可能ｍＲＮＡと、をコードする配列を含む少なくとも１つの発現カセットを有する細菌を含む、真核生物翻訳可能ウイルスポリペプチドｍＲＮＡを産生および送達するためのシステムであって、前記真核生物翻訳可能ｍＲＮＡをコードする前記配列の転写が、真核細胞内で不活性であるプロモータの制御下にある、真核生物翻訳可能ウイルスポリペプチドｍＲＮＡを産生および送達するためのシステム。
25. 前記ウイルスが、表２に列挙されたウイルスである、請求項２４に記載の真核生物翻訳可能ウイルスポリペプチドｍＲＮＡを産生および送達するためのシステム。
26. 対象における疾患を処置または予防するための方法であって、請求項４に記載のシステムを含む組成物を前記宿主に投与するステップを含む、方法。
27. 前記組成物が、筋肉内もしくは鼻内投与により送達される、請求項２６に記載の方法。

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