JP2023501539A - 免疫刺激細菌デリバリープラットフォーム、および治療用産物のデリバリーのためのその使用 - Google Patents

免疫刺激細菌デリバリープラットフォーム、および治療用産物のデリバリーのためのその使用 Download PDF

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Abstract

提供されるのは、例えば、腫瘍微小環境における、特に腫瘍常在性骨髄性細胞における蓄積を増大させることによって、補体不活化に対する抵抗性を改善することによって、免疫細胞死を低減することによって、適応免疫を促進することによって、Ｔ細胞機能を増強することによって、例えば、毒性を低減し、抗腫瘍活性を改善するように改変されているゲノムを有する弱毒化免疫刺激細菌である。食細胞のコロニー形成の増大は、コードされる治療用産物の、腫瘍微小環境および腫瘍へのデリバリーを改善して、いくつかある経路の中でも特に、免疫刺激細菌の全身投与を可能にする。

Description

関連出願
２０２０年３月１６日出願の同時係属中の米国仮出願第６２／９９０，４０４号（表題「TUMOR-SPECIFIC IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Laura Hix Glickman、Christopher D. Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、およびHaixing Kehoe）の優先権の利益を主張する。
また、２０２０年１月１６日出願の同時係属中の米国仮出願第６２／９６２，１６２号（表題「TUMOR-SPECIFIC IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Laura Hix Glickman、Christopher D. Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、およびHaixing Kehoe）の優先権の利益を主張する。
また、２０１９年１１月１２日出願の同時係属中の米国仮出願第６２／９３４，５０３号（表題「TUMOR-SPECIFIC IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Laura Hix Glickman、Christopher D. Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、およびHaixing Kehoe）の優先権の利益を主張する。
本出願は、２０２０年２月２７日出願の同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０２４０号（表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS, TUMOR-RESIDENT IMMUNE CELLS, AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Christopher D. Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble、Alexandre Charles Michel Iannello、およびHaixing Kehoe）に関する。
また、本出願は、２０２０年１月１６日出願の同時係属中の米国仮出願第６２／９６２，１４０号（表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS, TUMOR-RESIDENT IMMUNE CELLS, AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Christopher D. Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble、Alexandre Charles Michel Iannello、およびHaixing Kehoe）に関する。
また、本出願は、２０１９年１１月１２日出願の同時係属中の米国仮出願第６２／９３４，４７８号（表題「IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT」、出願人Actym Therapeutics, Inc.、ならびに発明者Christopher D. Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble、およびAlexandre Charles Michel Iannello）に関する。
また、本出願は、２０１８年７月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４１７１３号（２０１９年１月１７日に国際公開第２０１９／０１４３９８号として公開）および２０１８年７月１１日出願の同時係属中の米国特許出願第１６／０３３，１８７号（２０１９年１月１７日に米国特許出願公開第２０１９／００１７０５０ Ａ１号として公開）（それぞれ表題「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」）に関し、これらの出願はそれぞれ、２０１７年７月１１日出願の米国仮出願第６２／５３１，３２７号および２０１８年３月２６日出願の米国仮出願第６２／６４８，３８０号の優先権を主張する。容認される場合、これらの出願の各々の主題は、その全体が参照によって組み込まれる。
また、本出願は、２０１９年７月１１日出願の同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１４８９号（２０２０年１月１６日に国際公開第２０２０／０１４５４３号として公開）および２０１９年７月２３日出願の同時係属中の米国特許出願第１６／５２０，１５５号（それぞれ表題「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」）に関し、これらの出願はそれぞれ、２０１９年１月８日出願の米国仮出願第６２／７８９，９８３号および２０１９年４月３日出願の米国仮出願第６２／８２８，９９０号の優先権を主張する。
また、本出願は、２０１９年２月２７日出願の米国仮出願第６２／８１１，５２１号および２０１９年４月３日出願の米国特許出願第６２／８２８，９９０号に関する。
これらの出願の各々において提供される免疫刺激細菌は、本出願において記載されるように改変することができ、そのような細菌は、参照によって本明細書に組み込まれる。容認される場合、これらの出願の各々の主題は、その全体が参照によって組み込まれる。
電子的に提供される配列表の参照による組込み
配列表の電子バージョンが本明細書と共にファイルされており、この内容はその全体が参照によって組み込まれる。電子ファイルは、２０２０年１１月１１日に作成した。サイズは６８７キロバイトであり、タイトルは1707SEQPC1.txtである。修正された配列リストが本明細書と共に電子的にファイルされており、この内容はその全体が参照によって組み込まれる。電子ファイルは、２０２１年３月２６日に作成した。サイズは６８７キロバイトであり、タイトルは1707SEQPC2.txtである。
発明の分野
提供されるのは、例えば、腫瘍微小環境における、特に腫瘍常在性骨髄性細胞（ｔｕｍｏｒ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ）における蓄積を増大させることによって、補体不活化に対する抵抗性を改善することによって、免疫細胞死を低減することによって、適応免疫を促進することによって、Ｔ細胞機能を増強することによって、例えば、毒性を低減し、抗腫瘍活性を改善するように改変されているゲノムを有する弱毒化免疫刺激細菌である。食細胞のコロニー形成の増大は、コードされる治療用産物の、腫瘍微小環境および腫瘍へのデリバリーを改善して、いくつかある経路の中でも特に、免疫刺激細菌の全身投与を可能にする。
抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、および抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント抗体の臨床的成功によって明示されるように、がん免疫治療の分野は大きく進歩してきた［例えば、Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3377-3383；Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363(8): 711-723；およびChen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391参照］。腫瘍は、著しく免疫抑制性の環境を進化してきた。腫瘍は、免疫監視を回避するように複数の機序を開始し、免疫を抑制するように抗腫瘍免疫細胞を再プログラムし、最新のがん治療に対する抵抗性を絶えず変異させる［例えば、Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8): 561-584参照］。免疫寛容を克服して、現在の免疫治療の自己免疫関連毒性から逃げながらこれを制限する免疫治療およびがん治療を設計することは、免疫腫瘍学の分野のチャレンジである。それゆえに、追加的かつ革新的な免疫治療および他の治療が必要である。
提供されるのは、ゲノム改変を含有する免疫刺激細菌、および１つまたは複数の治療用産物、例えば、抗がん治療剤または関連する処置剤をコードするプラスミドである。ゲノム改変は、腫瘍微小環境内に、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積する免疫刺激細菌をもたらし、そこでは、コードされる治療用産物が発現される。本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、対象において頑健な抗がん応答を刺激するか、誘導するか、またはもたらす補完産物の１つまたは複数をコードする。
本明細書中で提供されるのは、真核生物プロモーターの制御下で、治療用産物または治療用産物の組合せをコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。細菌のゲノムは、改変、例えば、
ａ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、ペンタアシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）を生じさせるように改変され、
免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてもしくは十分な部分の欠失もしくは破壊によって改変され、それによって、細菌は、ペンタアシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）を生じさせるように改変され、かつ／または
ヘキサアシル化されたリポ多糖が、野生型細菌に比べて、１０分の１以下に、実質的に低減されるか、もしくは不在となる、欠失または破壊または不活化；
ｂ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５による認識が弱められる、欠失または破壊または不活化；
ｃ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、ｃｕｒｌｉ線毛および／またはセルロースの合成を活性化しない、欠失または破壊または不活化；
ｄ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、分泌アスパラギナーゼの合成を活性化しない、欠失または破壊または不活化；
ｅ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、プリン、アデノシン、またはＡＴＰについて栄養要求性となる、欠失または破壊または不活化；
ｆ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、鞭毛を失う、欠失または破壊または不活化；
ｇ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変される、欠失または破壊または不活化；
ｈ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊または不活化であって、それによって、細菌は、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変されて、腫瘍常在性骨髄性細胞内で複製できない、欠失または破壊または不活化；ならびに
ｉ）膜におけるリポタンパク質発現を低減するか、または無くす、ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢのいずれかまたは両方の欠失または破壊または不活化であって、それによって、コードされている治療タンパク質の発現が、腫瘍微小環境および／または腫瘍常在性免疫細胞内で増大する、欠失または破壊または不活化
の中から選択される１つ、２つ、またはそれを超える改変を含有する。
例えば、免疫刺激細菌は、ａ）、ｄ）、およびｆ）、または改変ｃ）およびｄ）、または改変ａ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、およびｆ）、または改変ａ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、およびｉ）、または改変ａ）、ｄ）、ｆ）、およびｉ）、または改変ｃ）、ｄ）、およびｉ）、または改変ｆ）およびｉ）、または改変ａ）～ｉ）、または改変ａ）、ｂ）、ｄ）、およびｆ）、または改変ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）、ならびにａ）～ｉ）の他の組合せの、欠失、挿入、および置換を含む改変を含有する。
すべての実施形態において、免疫刺激細菌はまた、鞭毛をコードする遺伝子の欠失または破壊を含み得、またはさらに含み得、それによって細菌は、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）であり、鞭毛を産生せず、野生型細菌は、鞭毛を有する。免疫刺激細菌は、プリンについて栄養要求性であり得、例えば、アデノシンについて栄養要求性であり、またはアデノシン、アデニン、および／もしくはＡＴＰについて栄養要求性である。また、免疫刺激細菌はｐｕｒＩ－であり得る。また、免疫刺激細菌はｐａｇＰ－であり得る。また、免疫刺激細菌は、ａｓｄ－（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－）であり得、例えば、細菌は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする内因性遺伝子のすべてまたは一部の破壊または欠失によるａｓｄ－であり、それによって内因性ａｓｄは発現されない。細菌は、プラスミド上に、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）を、細菌プロモーターの制御下でコードし得る。また、免疫刺激細菌はｍｓｂＢ－であり得るか、またはｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－であり得る。例えば、免疫刺激細菌は、ａｓｄ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、およびｐａｇＰ－であり得、またはａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、およびｐａｇＰ－であり得る。一部の実施形態において、免疫刺激細菌は、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、およびｐａｇＰ－である。
提供されるのは、治療用産物を真核生物プロモーターの制御下でコードするか、または複数の産物を複数の真核生物プロモーターもしくは単一プロモーターの制御下でコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。免疫刺激細菌のゲノムは、遺伝子の十分な部分の欠失、または遺伝子の破壊によって改変されており、それによって細菌は、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、およびｐａｇＰ－の１つまたは複数である。また、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ１（ＬｐｐＡ）およびＬｐｐ２（ＬｐｐＢ）をそれぞれコードする遺伝子ｌｐｐＡ（ｌｐｐ１）および／またはｌｐｐＢ（ｌｐｐ２）が欠失または破壊されて、コードされるリポタンパク質の発現を無くすか、または実質的に低減しているものを含む。特に、細菌は、ｌｐｐＡ－およびｌｐｐＢ－である。提供されるのは、抗がん治療薬を、真核生物調節配列の制御下でコードするプラスミドを含有し、ｌｐｐＡ－およびｌｐｐＢ－である免疫刺激細菌である。例えば、免疫刺激細菌は、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐａｇＰ－、ｌｐｐＡ－、およびｌｐｐＢ－であり得る。
本明細書中の実施形態において、治療用産物は、がん治療に用いられる抗がん治療薬または治療薬である。コードされる産物は、分泌シグナルをコードする核酸に作用可能に連結され得、それによって、発現されると、治療用産物は分泌され、例えば、腫瘍常在性免疫細胞から分泌される。
また、免疫刺激細菌はいずれも、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属病原性島１（ＳＰＩ－１）侵入に関与する１つまたは複数の遺伝子またはオペロンが欠失または不活化され得、それによって免疫刺激細菌は、上皮細胞に侵入しないか、または感染しない。例えば、１つまたは複数の遺伝子／オペロンは、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰから選択される。
免疫刺激細菌内のプラスミドは、低いコピー数または中程度のコピー数で存在し得る。プラスミドは、中程度～低いコピー数の複製起点、例えば低いコピー数の複製起点を含有し得る。一部の実施形態において、プラスミドは、より高いコピー数で存在する。通常、中程度のコピー数は、１５０未満か、もしくは約１５０未満、かつ２０超もしくは約２０超であり、または２０もしくは２５～１５０である；低いコピー数は、２５未満、または２０未満、または約２５未満、または約２０未満のコピーである。特に、低～中程度のコピー数は、約１５０コピー未満、または１５０コピー未満である；低いコピー数は、約２５コピー未満、または２５コピー未満である。
提供されるのは、コードされる産物の発現用の細胞またはプラスミド中に導入されるように設計されている、タンパク質等の産物をコードする核酸分子である核酸コンストラクトである。コンストラクトは、多シストロン性配列として複数の抗がん産物を単一プロモーターの制御下でコードする核酸を含有する。プロモーターは、真核生物プロモーターであり得る。他の真核生物調節配列、例えばエンハンサー、タンパク質輸送シグナルをコードする核酸、例えば分泌シグナル、他の調節配列、例えば、コンストラクト上の細菌プロモーターからリードスルーを妨げる細菌ターミネーターを含むターミネーター、ならびに産物をコードする核酸オープンリーディングフレームおよび／または遺伝子のエレメントの特定の立体配置および順序が提供され、本明細書中に記載される。コンストラクトにおいて、多シストロン性配列は、多シストロン性コンストラクトによってコードされる別々の産物の発現をもたらすシグナルまたはコードされるシグナル、例えばペプチドを含み得る。そのようなペプチドの例として、ウイルスペプチドの２Ａファミリーがある。コンストラクトは、各産物をコードする各オープンリーディングフレーム間のそのようなペプチドまたは他のシグナルを含む。２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａの１つまたは複数を含む。
抗がん産物に含まれるのは、がんの処置に用いられるあらゆるもの、または対象において抗がん応答を促進、補助、刺激、もしくは助長するあらゆるものである。通常、抗がん産物はタンパク質である。コードされる産物は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する１つまたは複数の免疫刺激タンパク質を含む。例示的なコードされる産物として、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質があり、例えば、以下の１つまたは複数から選択されるいずれかである：ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の補充／持続性に関与するか、またはこれを引き起こすか、もしくは強化するタンパク質、共刺激タンパク質、例えばＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）［細胞における正確な配向性（すなわち、細胞質内の細胞質ドメイン）を促進する改変があってもよい、免疫抑制逆シグナル伝達（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を無くすように欠失されているか、または切り詰められた細胞質ドメインである共刺激タンパク質の形態を含む］；Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＣＤ４７アンタゴニスト、抗ＩＬ－６抗体またはデコイ受容体に結合するＩＬ－６、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト（可溶性のＴＧＦ－ベータ受容体およびＴＧＦ－ベータアンタゴニストを含む）、および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバー。
産物の他のものは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の潜在的な補充および／または持続性に関与する分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、細胞質ドメインが欠失している（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、または細胞質ドメインが部分的に欠失している４－１ＢＢＬ（細胞質ドメインは、免疫抑制逆シグナル伝達を無くすように欠失しているか、または切り詰められている）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーのうちの１つまたは複数から選択される、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質を含む。例えば、コンストラクトは、細胞質ドメインが欠失したか、もしくは部分的に欠失した、または細胞質ドメインが部分的に欠失し、アミノ酸改変を含んでもよく、それによって、結果として生じる４－１ＢＢＬは、細胞内で発現されると、適切な向きを仮定する、４－１ＢＢＬをコードする核酸を含有し得る［細胞質ドメインが切り詰められた例示的な改変４－１ＢＢＬ変異体を提供する配列番号３８９～３９２および以下の詳細な説明を参照。そこでは、残基が、正に荷電する残基（すなわち、ＫおよびＬ）により置換されて、細胞内で発現される場合に適切な配向を与える］。細胞質ドメインは、免疫抑制逆シグナル伝達を無くすか、または低減するほど十分に切り詰められている。それゆえに、細胞質ドメインが欠失しているか、もしくは部分的に欠失している４－１ＢＢＬ、または細胞質ドメインがトランケートかつ改変されている改変４－１ＢＢＬをコードする核酸を含有するコンストラクトが提供され、４－１ＢＢＬの配列は、配列番号３８９～３９２に示されており、以下の詳細な説明および実施例において配列を例示した。また、コンストラクトは、以下の産物および産物の組合せ：
ＩＬ－１２、またはＩＬ－１５、またはＩＬ１２ｐ７０、またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体の１つまたは複数；
サイトカインおよびＳＴＩＮＧ経路アゴニスト；
サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、および共刺激分子または免疫チェックポイント阻害剤；
サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、およびＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト；
サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、および共刺激分子（受容体またはリガンド）または免疫チェックポイント阻害剤、
のいずれかをコードする核酸を含有し得、
ＳＴＩＮＧ経路アゴニストは、ＳＴＩＮＧ経路の活性化を介して、Ｉ型インターフェロン発現を増大させるあらゆる産物である。例として、本明細書中で詳述される、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）ポリペプチド、またはその変異体もしくはそのキメラをコードするコンストラクトがある。コンストラクトの１つとして、以下の組合せ：
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＩＬ－１５およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬおよびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニストおよびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＩＬ－１２およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１５、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１５、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２、
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１２、
４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
４－１ＢＢＬおよびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
ＩＬ－１５およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
ＩＬ－１２およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ならびに
ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト
から選択される治療用産物の組合せをコードするものがあり、
抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃであり；
ＳＴＩＮＧポリペプチドは、野生型ＳＴＩＮＧ、または変異体ＳＴＩＮＧポリペプチド、またはキメラＳＴＩＮＧポリペプチド、および、例えば、機能獲得を与えるアミノ酸置換を有するキメラＳＴＩＮＧタンパク質を含み；
４－１ＢＢＬは、細胞質ドメインが欠失している４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインが改変された４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインが切り詰められた４－１ＢＢＬ、または細胞質ドメインが切り詰められ、改変された４－１ＢＢＬである。
他のコンストラクトとして、
ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；
ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ機能獲得型（ＧＯＦ）変異体；
ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）（Δｃｙｔは、細胞質ドメインの欠失である）；
ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；
ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチドおよびＩＬ－１２ｐ７０；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＴＧＦ－βデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに
ＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体
から選択される治療用産物の組合せをコードするものを含み、
４－１ＢＢＬは、細胞質ドメインが欠失している４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、細胞質ドメインが改変された４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインが切り詰められた４－１ＢＢＬ、または細胞質ドメインが切り詰められ、改変された４－１ＢＢＬであり、
抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃである。
ＳＴＩＮＧポリペプチドの例として、ＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現をもたらすように改変されているか、またはヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性よりも低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する様々な種由来のＣ末端尾部を有するヒトＳＴＩＮＧポリペプチドを含むキメラポリペプチドであり、例えば、ＣＴＴ内のＴＲＡＦ６結合部位が欠失されていてもよく、ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載される配列を有するものがある。コードされる産物の特定の組合せは、コードされる治療タンパク質が、ＩＬ－１２ｐ７０、ならびにタスマニアンデビル由来のＣＴＴ、およびＩ型インターフェロンの発現増大もしくは構成的発現をもたらすアミノ酸置換を有するキメラヒトＳＴＩＮＧポリペプチドを含むか、またはＩ型インターフェロンの発現増大もしくは構成的発現をもたらすアミノ酸置換を有するＳＴＩＮＧポリペプチドであり、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現をもたらす突然変異が、機能獲得型突然変異であるものを含む。例として、詳細な説明において記載される置換を有するＳＴＩＮＧタンパク質またはポリペプチドがあり、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド内のアミノ置換は、アラインメントについて、ヒトＳＴＩＮＧタンパク質を示す配列番号３０５～３０９のいずれかを参照して、Ｒ２８４ＧまたはＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇと一致する。これらのコンストラクトは、加えて、ＩＬ－３６γおよび／または免疫チェックポイント阻害剤抗体をコードし得る。本明細書中に記載される抗体は、その抗原結合部分、および抗体の種々の形態のいずれか、例えば、以下に限定されないがｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ（一般にＩｇＧ Ｆｃ）を含み、Ｆｃの存在は、２つの鎖を有するように、結果として生じる産物を多量体化する。標的とされる免疫チェックポイントは、以下に限定されないが、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を含み、その抗体形態は、ｓｃＦＶおよびｓｃＦＶ－Ｆｃの２本鎖ポリペプチドを含む。
提供されるのは、先で、本明細書中の開示の全体を通して記載されるコンストラクトを含有するプラスミドである。プラスミドは、コンストラクトが真核生物転写調節配列に作用可能に連結されている細菌のプラスミドを含む。
提供されるのは、組成物、例えば医薬組成物であり、これは、組成物中に唯一の抗がんタンパク質としてコンストラクトまたはプラスミドによってコードされる抗がんタンパク質産物の混合物を含有する。それゆえに、このうち提供されるのは、治療タンパク質の補完的な組合せを含有する組成物であり；混合物は、剤の固有の組合せを含む。組合せは、本明細書中で提供され、記載される剤の組合せを含む。
また、提供されるのは、あらゆるコンストラクトおよび／またはプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。コンストラクトおよびプラスミドは、先で、以下で考察されるあらゆるものを含む、本明細書中で提供されるあらゆる免疫刺激細菌内に提供され得るか、またはさもなければ免疫刺激細菌中に導入され得る。また、コンストラクトおよびプラスミドは、当該技術において知られている適切な細菌、例えば、国際公開第２０２０／１７２４６１号および国際公開第２０２０／１７２４６２号、ならびに米国特許第１０，４４９，２３７号、米国特許第１０，２８６，０５１号、および米国特許第９，６１６，１１４等の刊行物内に記載される細菌中に導入され得る。
本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、ゲノム改変、例えば、機能的遺伝子産物が発現されないような、欠失、破壊、および改変、例えば遺伝子のすべてまたは一部の向きの変化を含む。免疫刺激細菌のうち、提供されるのは、結果として生じる細菌がｍｓｂＢ－／ｐｕｒＩ－であるように改変されているものである。一部の実施形態において、細菌は、ｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－であり、それによって、ｍｓｂＢ－遺伝子および／またはｐｕｒＩ－遺伝子の少なくともコード部分の全長が欠失される。また、細菌のゲノムは、細菌が鞭毛を欠くように改変され得る。これは、鞭毛を通常発現する細菌において引き起こされる。そのような細菌において、例えば、サルモネラ属における遺伝子、または他の種におけるｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－と同等の遺伝子は、欠失され得るか、その他には機能的遺伝子産物が発現されないように改変され得る。また、細菌は、アデノシン要求株であるように、かつ／またはｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であるように改変され得る。また、提供されるのは、免疫刺激細菌、およびこれを含有する医薬組成物であり、細菌は、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず、それによって細菌はａｎｓＢ－である。
提供されるのは、治療用産物を真核生物プロモーターの制御下でコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌であり、免疫刺激細菌のゲノムは、遺伝子のすべての、または十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって細菌は、分泌されるアスパラギナーゼの合成を活性化しない。そのような細菌の例として、アスパラギナーゼが遺伝子ａｎｓＢによってコードされるＬ－アスパラギナーゼＩＩであるものがある。
ｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－である親株ＶＮＰ２０００９において、遺伝子は完全に欠失されていないことが本明細書中で示される。提供される免疫刺激細菌において、細菌のゲノムは、ｍｓｂＢ－遺伝子およびｐｕｒＩ－遺伝子の少なくともコード部分の全長が欠失されるように改変されている。当該株は、より適合し、より速く、かつ／または親株よりも増殖する。本明細書中のすべての実施形態において、細菌は、天然のａｓｄ遺伝子産物が不活性であるか、または発現されないように改変され得る。株を生産するのを補助するために、ａｓｄ遺伝子は、プラスミド上に、原核生物プロモーター、例えば誘導性プロモーターの制御下でコードされる。
実施形態において、株は、鞭毛を欠く細菌が、ｐａｇＰ－、ａｎｓＢ－、およびｃｓｇＤ－であるような改変を含む。また、細菌は、ｐｕｒＩ－およびａｓｄ－である。ゆえに、提供されるのは、既にｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－であり、かつ／または他の改変を有する改変親株、特にＬＰＳを改変する、Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤでもある株を含む株である。また、株は、アデノシン要求株またはアデノシンおよびアデニン要求株であり得る。
コードされる治療用産物は、核酸およびタンパク質を含む。プラスミドは、２種以上の治療用産物をコードすることができる。例示的な産物は、以下に限定されないが、サイトカイン、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を構成的に誘導するタンパク質、および共刺激受容体またはリガンドを含む。さらに例示的な組合せが、以下に記載される。一部の実施形態において、共刺激分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のための細胞質ドメインのすべてまたは部分を欠いており、それによって、切り詰められた分子は、改変細胞質ドメインまたはその部分が欠失しているか、または切り詰められているか、またはさもなければ改変されていることに起因して、共刺激受容体結合を介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）することができるが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）にカウンター調節シグナル伝達することができない。他の産物は、治療タンパク質を活性化する酵素、例えばプロドラッグを活性化するものを含む。本明細書中に、以下に記載されるように、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、頑健な抗がん応答を提供するように組み合わされている治療用産物の組合せを含む抗がん治療剤をコードしている。コードされるタンパク質として、先で、以下に記載される各産物、および異なるクラス由来の産物の組合せがある。含まれるのは、共刺激タンパク質、例えば４－１ＢＢＬ、特に、免疫抑制逆シグナル伝達を無くすように細胞質ドメインが切り詰められているか、または欠失しており、細胞内で発現される場合に、結果として生じるタンパク質が細胞膜内で正確に向きを定められるのを確実にするあらゆる補償的突然変異を有するものである。他の産物は、Ｉ型インターフェロンの構成的発現を誘導するか、または生じさせるＳＴＩＮＧ経路アゴニストを含む。当該産物は、ＳＴＩＮＧタンパク質、特に、本明細書中で提供され、記載される改変ＳＴＩＮＧタンパク質およびキメラＳＴＩＮＧタンパク質を含む。１つまたは複数のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｌ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、およびその他、例えば、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γもまた、プラスミド上にコードされている。共刺激産物に加えて、ＳＴＩＮＧ経路アゴニストタンパク質、例えばＳＴＩＮＧ、サイトカイン、抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含むチェックポイント阻害剤抗体が、プラスミド上にコードされ得る。抗体として、ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖｓ－Ｆｃ ２本鎖形態、ならびに他の形態もあり得る。加えて、産物の中でも、ＴＧＦ－ベータアンタゴニストおよびＴＧＦ－ベータ受容体デコイを含み得る。
コードされる治療用産物は、真核生物宿主によって認識される調節配列をコードする核酸、例えば、細菌を含む細胞またはプラスミドからの分泌を引き起こす分泌シグナルに作用可能に連結され得る。免疫刺激細菌が２種以上の産物をコードする実施形態において、各産物の発現は、別々のプロモーターの制御下にあり得る。これ以外にも、２種以上の産物が、単一プロモーターの制御下で発現され得、各産物が、例えば、治療用産物をコードするそれぞれの別々の発現を引き起こすように、内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されている。例示的な２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａであり、これらは、単一プロモーターの制御下で発現される治療用産物の別々の発現を引き起こすように、治療用産物をコードする核酸の側面に位置し得る。治療用産物は、真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で発現される。これらは、ウイルスプロモーターであるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、または哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えば、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、伸長因子－１（ＥＦ－１）アルファプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＡＧＧプロモーター、アデノウイルス２もしくは５後期プロモーター、ＥＩＦ４Ａ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＣＤ６８プロモーターを含む。プラスミドはさらに、治療用産物の発現を制御するための他の真核生物調節配列、例えば、ＳＶ４０、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨまたはｂＧＨ）、ＭＮＤ（脊髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター）、ニワトリベータ－グロブリン、およびｒｂＧｌｏｂ（ウサギグロブリン）遺伝子から選択されるターミネーターおよび／またはプロモーターを含み得る。他の調節配列は、ポリＡ尾部、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）を含む。追加的な調節要素、例えば、細菌プロモーターからのリードスルーを低減するか、または無くすための、本明細書中に記載される適切な遺伝子座内に挿入される細菌ターミネーターを含み得る。
コードされる治療用産物は、本明細書中に、元の特許請求の範囲に記載されるあらゆるものを含み、例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現に至る細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはその変異体をコードする核酸がある。Ｉ型ＩＦＮは、インターフェロン－αおよびインターフェロン－βを含む。変異体は、対象において発現される場合に、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現に至るものを含む。これらは、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに細胞内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを必要としない機能獲得型（ＧＯＦ）変異体を含む。これらのタンパク質の例として、活性が増大した、またはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の構成的発現をもたらすＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００、ならびにそれらの変異体から選択されるタンパク質がある。変異体は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、またはＭＤＡ５の変異体を含み、これらは、ウイルス感染の結果としてリン酸化されている１つまたは複数のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）残基が、アスパラギン酸（Ｄ）により置換されており、それによって、結果として生じる変異体は、構成的に、Ｉ型ＩＦＮ、および当業者に知られており、かつ／または本明細書中に記載されるあらゆるものを誘導するリン酸化模倣体である。変異体の例は、突然変異が以下のように選択されるものを含む：ａ）ＳＴＩＮＧにおいて、配列番号３０５～３０９を参照して：Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１つまたは複数；ｂ）ＭＤＡ５において、配列番号３１０を参照して：Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２Ｆ、およびＡ４５２Ｔの１つまたは複数；ｃ）ＲＩＧ－Ｉにおいて、配列番号３１１を参照して、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；ならびにｄ）ＩＲＦ－３において、配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ、例えば、配列番号３０５～３０９を参照して：Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１つまたは複数のアミノ置換を含有する変異体ＳＴＩＮＧ、ならびにそれらの保存的置換およびそれらの組合せ。
また、免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードし得る。当該タンパク質は、以下に限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子を含む。これらの例として：ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／もしくは持続性に関与するか、またはこれらを引き起こすか、もしくは強化するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＣＤ４７アンタゴニスト、デコイ受容体に結合する抗ＩＬ－６抗体またはＩＬ－６、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト、ならびに腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの１つまたは複数から選択されるタンパク質がある。ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、４－１ＢＢ、および４－１ＢＢリガンドから選択される共刺激分子は、分子が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のための細胞質ドメイン（またはその部分）を欠くように切り詰められ得る；免疫抑制逆シグナル伝達を無くすように欠失した細胞質ドメインもしくは部分的に欠失した、または切り詰められた細胞質ドメインに起因して、切り詰められた遺伝子産物は、共刺激受容体結合を介して、Ｔ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達することができるが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）にカウンター調節シグナル伝達することができない。他のそのようなタンパク質として、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト、例えば抗ＴＧＦベータ抗体もしくは抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体もしくは抗体断片、可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチド、またはＴＧＦ－ベータ結合デコイ受容体がある。
プラスミドは、治療抗体またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ナノボディ、ダイアボディ断片、または単鎖抗体をコードし得る。例は、以下に限定されないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、またはＩＬ－６のアンタゴニストを含む。
一部の実施形態において、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、ａ）腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質；ｂ）Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはＩ型ＩＦＮの発現を増大させる活性増大を有するその変異体、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすその変異体の１つまたは複数；およびｃ）抗がん抗体またはその抗原結合部分から選択される２種以上の治療タンパク質をコードするプラスミドを含有する。例えば、免疫刺激タンパク質は、共刺激分子であり得、これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に十分な細胞質ドメインまたはその部分を欠いているものであり、それによって、切り詰められた共刺激分子は、共刺激受容体結合を介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達することができるが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）にカウンター調節シグナル伝達することができない。一部の実施形態において、免疫刺激細菌は、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、共刺激分子、および抗がん抗体またはその抗原結合部分から選択される少なくとも２つの治療用産物をコードし、これらは、単一プロモーターの制御下にあり得る。例えば、産物の少なくとも２つまたはすべてをコードする核酸の発現が、単一プロモーターの制御下にあり、各産物をコードする核酸は、２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されており、それによって、翻訳されると、各産物が別々に発現される。各産物をコードする核酸は、細胞からの発現される産物の分泌を指示する配列をコードする核酸に作用可能に連結され得る。
提供されるのは、２種以上の治療用産物をコードする免疫刺激細菌であり、少なくとも１つの産物がａ）から選択され、少なくとも１つがｂ）から選択され、ａ）は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／もしくは持続性に関与するか、またはこれらを引き起こすか、もしくは強化するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、ｂ）は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、またはＳＮＲＮＰ２００である。これはまた、ＴＧＦベータ阻害抗体、ＴＧＦベータ結合デコイ受容体、抗ＩＬ６抗体、およびＩＬ－６結合デコイ受容体の１つまたは複数をコードし得る。
コードされる治療用産物の組合せの例として、治療用産物の以下の組合せ：ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－２およびＩＬ－２１；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ［４－１ＢＢＬΔｃｙｔ（Δｃｙｔは、細胞質ドメインの欠失である）、および切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃ）を含む］；ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ、および切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ、および切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）、ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよび４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体のいずれかがある。
４－１ＢＢＬを含むすべての組合せにおいて、４－１ＢＢＬ分子は、全長タンパク質（例えば、ヒトおよびマウス４－１ＢＢＬについて、それぞれ配列番号３８９および３９３参照）；細胞質ドメインが欠失された４－１ＢＢＬ変異体（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ；例えば、ヒトおよびマウス４－１ＢＢＬΔｃｙｔについて、それぞれ配列番号３９０および３９４参照）；細胞質ドメインが切り詰められた（すなわち、完全には欠失されていない）４－１ＢＢＬ変異体（４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃ；例えば、例示的なヒトおよびマウス４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃ変異体について、配列番号３９１～３９２および配列番号３９５～３９６参照）；または細胞質ドメインが改変された４－１ＢＢＬ分子［リン酸化部位としての機能を果たす１つまたは複数のＳｅｒ残基（例えば、ヒト４－１ＢＢＬについて、配列番号３８９に関して、Ｓｅｒ５およびＳｅｒ８）が、逆シグナル伝達を低減し、または除外する残基により、適切な遺伝子座にて置換されている］であり得る。加えて、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含むすべての組合せは、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片、例えば抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（例えば、例示的なヒトおよびマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ断片について、それぞれ配列番号４０３および４０４参照）、または抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（例えば、例示的なヒトおよびマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片について、それぞれ配列番号４０２および４０５参照）を含み得る。
また、提供されるのは、改変非ヒトインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質、およびＳＴＩＮＧタンパク質キメラ、ならびに本明細書中に記載されるあらゆるものを含むデリバリー媒体、医薬組成物、これらのＳＴＩＮＧタンパク質をコードするか、または含有する細胞、およびそれらの使用、ならびにがんの処置方法である。特に、本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、本明細書中に記載される改変非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、およびキメラをコードする。免疫刺激細菌によってコードされるこれらのＳＴＩＮＧタンパク質は、本明細書中で提供されており、全体を通して記載されている。本明細書中で提供されるのは、以下のものである：
１．改変非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質であり、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、ＮＦ－κＢ活性化がヒトＳＴＩＮＧタンパク質よりも低く、適宜、Ｉ型インターフェロン活性化活性が、野生型（ＷＴ）ヒトＳＴＩＮＧタンパク質と比較して、より高いものである。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、活性が増大するか、または細胞内核酸シグナル伝達の不在下で構成的に作用するような突然変異を含むように改変されている。突然変異は典型的に、ヒトのインターフェロノパシーにおいて出現するアミノ酸突然変異であり、例えばヒトＳＴＩＮＧについて先に記載したものである。対応する突然変異は、非ヒト種ＳＴＩＮＧタンパク質中に導入され、対応するアミノ酸残基が、アラインメントによって識別される。また、一部の実施形態において、ＳＴＩＮＧタンパク質のＣ末端尾部（ＣＴＴ）内のＴＲＡＦ６結合部位は欠失されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減している。
２．キメラである改変ＳＴＩＮＧタンパク質、特にヒトＳＴＩＮＧタンパク質であり、一方の種、例えばヒト由来のＳＴＩＮＧタンパク質内のＣＴＴ（Ｃ末端尾部）領域は、ヒトＳＴＩＮＧよりもＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低く、かつ／またはＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性が高いもう一方の種のＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣＴＴにより置換されている。また、ＴＲＡＦ６結合部位は、これらのキメラ内で欠失されていてもよい。
３．また、１の突然変異を含む２の改変ＳＴＩＮＧタンパク質である。
４．１～３のいずれかの改変ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、デリバリー媒体、例えば免疫刺激細菌、本明細書中で提供されるか、または当業者に知られているあらゆるものであり、例えば、エキソソーム、ナノ粒子、ミニ細胞、細胞、リポソーム、リソソーム、腫瘍溶解性ウイルス、ならびに他のウイルスベクターを含む。
５．ヒトＳＴＩＮＧと比較して、ＳＴＩＮＧタンパク質のＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減しており、適宜、ヒトＳＴＩＮＧと比較して、Ｉ型インターフェロン刺激／シグナル伝達活性が増大した非ヒト種由来の非改変ＳＴＩＮＧをコードする、デリバリー媒体、例えば、免疫刺激細菌、本明細書中で提供されるか、または当業者に知られているあらゆるものであり、例えば、エキソソーム、ナノ粒子、ミニ細胞、細胞、リポソーム、リソソーム、腫瘍溶解性ウイルス、ならびに他のウイルスベクターを含む。
６．細胞（ヒトであれば、非接合子）、例えば、細胞療法に用いられる細胞、例えば、Ｔ細胞および幹細胞、ならびに１～３のいずれかのＳＴＩＮＧタンパク質を生成するのに用いられる細胞である。
７．１～３のいずれかのＳＴＩＮＧタンパク質、または４および５のデリバリー媒体、または６の細胞を含有する医薬組成物。
８．免疫刺激細菌について本明細書中に記載されるように、１～７のいずれかを投与することによる、がんの処置の使用および方法。
ＮＦ－κＢ活性（シグナル伝達活性）、およびＳＴＩＮＧのＩ型インターフェロン刺激活性またはインターフェロン－β刺激活性を評価するアッセイおよび方法が、本明細書中に記載されており、また、当業者に知られている。方法の例は、de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175に記載されるものを含み、これは、とりわけ、ヒトを含む種々の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質のインターフェロン－βおよびＮＦ－κＢシグナル伝達活性を記載しており、それによって、ヒトＳＴＩＮＧよりもＮＦ－κＢ活性が低い、種々の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質、また、インターフェロン－β活性がヒトＳＴＩＮＧに匹敵するか、またはこれよりも高いものを識別する。de Oliveira Mann et al. (2019)は、種アラインメントを提供して、ＣＴＴドメインを含む、各種におけるＳＴＩＮＧのドメインを識別する［de Oliveira Mann et al. (2019)について、Supplemental Informationも参照］。
非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、以下に限定されないが、以下の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質であり得る：タスマニアンデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ；配列番号３４９）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ；配列番号３５９）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ；配列番号３６０）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ；配列番号３５６）、ダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ；配列番号３６１）、トキ（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ；配列番号３６２）、シーラカンス（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ；配列番号３６３～３６４）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ；配列番号３６５）、コウモリ（Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ；配列番号３６６）、マナティー（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ；配列番号３６７）、ギンザメ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ；配列番号３６８）、およびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；配列番号３６９）。これらの脊椎動物のＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒト細胞内で免疫シグナル伝達を容易に活性化する。このことは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物において共有されていることを示している［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。
本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、骨髄性細胞、例えば腫瘍常在性マクロファージおよび組織常在性マクロファージに感染し、少なくとも限られた時間、生存度を保持し、かつ／またはＩ型ＩＦＮおよび／もしくは他の免疫刺激産物の発現をもたらす治療用産物をコードするプラスミド、例えば、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに細胞内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、もしくは環状ジヌクレオチドを必要としない機能獲得型（ＧＯＦ）変異体を送達する能力によって、Ｍ２表現型を有するマクロファージを、Ｍ１またはＭ１様の、免疫抑制特性が低減されているか、または除外されており、免疫刺激特性、抗腫瘍特性、または抗ウイルス特性が増強されているか、または加えられたマクロファージに変換することができることが、本明細書中で示されている。提供されるのは、治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌であり、ヒトマクロファージを含むマクロファージの、細菌による感染が、Ｍ２のマクロファージをＭ１表現型またはＭ１様の表現型マクロファージに変換する。提供されるのは、マクロファージでの発現が、Ｍ２マクロファージ、例えばヒトＭ２マクロファージからＭ１またはＭ１様の表現型への変換をもたらすか、またはこのように変換する治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌である。そのような特性を有する免疫刺激細菌は、本明細書中で提供される、腫瘍常在性（がんを患う対象内の）骨髄性細胞、および組織常在性骨髄性細胞の感染をもたらすゲノム改変を含有する細菌のあらゆるものを含む。これらのゲノム改変は、鞭毛を有しない細菌（野生型細菌は鞭毛を有する）をもたらすもの、および他のもの、例えばｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である細菌をもたらすものを含む。他の改変は、アスパラギナーゼ活性の排除をもたらすもの、例えば、骨髄性細胞に感染する細菌において、ａｎｓＢ－である細菌をもたらすことによって、Ｔ細胞活性を増強する改変、およびリポ多糖（ＬＰＳ）を変更する他の改変を含む。
含まれるのは、Ｍ２マクロファージからＭ１またはＭ１様の表現型への変換を促進するか、もしくはもたらすか、またはこのように変換する治療用産物をマクロファージ内にコードする免疫刺激細菌である。治療用産物の例として、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現、特に構成的発現に至る細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるものがある。これは、細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であり、本明細書中で記載され提供される変異体および非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質等のＩ型ＩＦＮの発現をもたらすのに、細胞内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを必要としない治療用産物の機能獲得型（ＧＯＦ）変異体を含む。免疫刺激細菌は、本明細書中に記載されるように改変され得るあらゆるものを含み、本明細書中に記載される種、例えば、サルモネラ属種および株を含む。
また、提供されるのは、コードされる治療用産物、例えばタンパク質が、薬理学的特性、例えば薬物動態学的特性または薬力学的特性の改善、例えば血清半減期の延長を与える部分にリンクしている免疫刺激細菌である。それゆえに、提供されるのは、コードされる治療用産物が、Ｆｃドメイン、または半減期延長部分、例えばヒト血清アルブミンもしくはその部分を含む、免疫刺激細菌である。半減期延長形態または半減期延長方法の例として、ペグ化、グリコシル化の改変、シアリル化、ＰＡＳ化（約１００～２００残基長であるＰＡＳアミノ酸のポリマーによる改変）、ＥＬＰ化［例えば、Floss et al. (2010) Trends Biotechnol. 28(1): 37-45参照］、ＨＡＰ化（グリシンホモポリマーによる改変）、ヒト血清アルブミンへの融合、ＧＬＫへの融合、ＣＴＰへの融合、ＧＬＰ融合、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常断片（Ｆｃ）ドメインへの融合、トランスフェリンへの融合、非構成的ポリペプチド、例えばＸＴＥＮ［ｒＰＥＧとも称され、これは、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、およびＴを含有する、非正確な反復ペプチド配列の遺伝的融合である；例えば、Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27(12): 1186-1190参照］への融合、ならびにサイズを増大させるか、流体力学半径を増大させるか、荷電を変更するか、またはクリアランスではなくリサイクルのために受容体を標的とするような他の改変および融合、ならびにそのような改変および融合の組合せを含む。
また、提供されるのは、コードされる治療用産物が、Ｂ７タンパク質膜貫通ドメインを含み、または治療用産物が、内因性であるか、もしくはさらなるＧＰＩアンカーによってＧＰＩ固定されている免疫刺激細菌である。コードされる治療用産物は、コラーゲンへの融合を含み得る。
あらゆるすべての実施形態における免疫刺激細菌は、適切なあらゆる種であり得る。特定の遺伝子および遺伝子改変に言及する場合、遺伝子および改変は、例示的な種としてサルモネラ属を参照した遺伝子および改変に相当するものである。種および株の例は、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、およびエリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属の株を含む。例えば、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ）、リケッチア・シビリカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、エロモナス・ユークレノフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）。
細菌は、本明細書中に記載される改変によって、弱毒化され得るか、または低い毒性もしくは非毒性にされ得る。細菌の例として、サルモネラ属の種、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株がある。本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、補体殺傷抵抗性（ｒｃｋ）をコードする遺伝子、例えばサルモネラ属ｒｃｋ遺伝子を内生的にコードかつ発現し、またはコードかつ発現するように改変されているものを含む。治療的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｒｃｋをコードして全身投与され得るように改変されている。また、本明細書中で提供され、記載され、特許請求の範囲に示されるのは、特にヒトにおける、デリバリー媒体、細胞、医薬組成物、方法、使用、およびがんの処置である。また、提供されるのは、処置のための対象の選択のためのコンパニオン診断法および方法、ならびに処置をモニタリングする方法である。これらは、以下に、また特許請求の範囲において記載されており、これらは、それらの全体が本セクション中に組み込まれる。
図１は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびタスマニアンデビル（配列番号３４９）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図２は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびマーモセット（配列番号３５９）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図３は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびウシ（配列番号３６０）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図４は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびネコ（配列番号３５６）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図５は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびダチョウ（配列番号３６１）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図６は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびトキ（配列番号３６２）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図７は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびシーラカンス（配列番号３６３）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図８は、野生型ヒト（配列番号３０６）およびゼブラフィッシュ（配列番号３４８）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図９は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびイノシシ（配列番号３６５）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図１０は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびコウモリ（配列番号３６６）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図１１は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびマナティー（配列番号３６７）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図１２は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびギンザメ（配列番号３６８）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図１３は、野生型ヒト（配列番号３０５）およびマウス（配列番号３６９）のＳＴＩＮＧタンパク質のアラインメントを示す。 図１４は、細菌性プロモーターおよび他の任意の細菌性制御配列を含み、真核性プロモーターの制御下にペイロードをコードするカセットの反対配向にあって、かつペイロードをコードする核酸に隣接する細菌性ターミネーターを含み、かつ原核性プロモーターからのいずれのリードスルー転写物も停止する配向にある、ａｓｄ発現カセットを含む例示的なコンストラクトを示す。
概略
Ａ．定義
Ｂ．がん治療のための免疫刺激細菌の概要
１．細菌がん免疫治療
２．腫瘍微小環境を標的とする先行治療
ａ．自家Ｔ細胞療法の限界
ｂ．ウイルスワクチンプラットフォーム
ｃ．細菌がん治療
ｉ．リステリア属
ｉｉ．サルモネラ属種
ｉｉｉ．ＶＮＰ２０００９
ｉｖ．野生型株
３．既存の細菌がん免疫治療の限界
Ｃ．治療指数を増大させ、腫瘍常在性骨髄性細胞内の蓄積を増大させるための免疫刺激細菌の改変および増強
１．ＬＰＳ生合成経路における遺伝子の欠失
ａ．ｍｓｂＢ欠失
ｂ．ｐａｇＰ欠失
２．栄養要求性
ａ．ｐｕｒＩ欠失／破壊
ｂ．アデノシン栄養要求性
３．プラスミド維持およびデリバリー
ａ．ａｓｄ欠失
ｂ．ｅｎｄＡ欠失／破壊
４．フラゲリンノックアウト株
５．適応免疫を促進し、Ｔ細胞機能を増強する細菌操作
Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）欠失／破壊
６．ｃｕｒｌｉ線毛発現に必要とされるサルモネラ属遺伝子の欠失／破壊
７．補体に対する抵抗性の改善
Ｒｃｋ発現
８．サルモネラ属および他のグラム陰性細菌におけるリポタンパク質発現に必要とされる遺伝子の欠失
９．抗腫瘍治療のために最適化されるようにゲノムが改変されており、複数を含む治療用産物をコードする頑健な免疫刺激細菌
１０．Ｍ２表現型マクロファージからＭ１およびＭ１様の表現型マクロファージへの変換
Ｄ．腫瘍微小環境において免疫応答を刺激する遺伝的ペイロードをコードする、増強した治療指数を有する免疫刺激細菌
１．免疫刺激タンパク質
ａ．サイトカインおよびケモカイン
ｂ．共刺激分子
２．プロドラッグを活性化する分子
３．免疫応答ならびに／またはＩ型ＩＦＮ、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、キメラ、および改変型を刺激する構成的に活性なタンパク質
ａ．構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型突然変異
ｂ．構成的ＩＲＦ３発現および機能獲得型突然変異
ｃ．活性が増大しているかまたは構成的活性を有する非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびその変異体、ならびに活性が増大しているかまたは構成的活性を有するＳＴＩＮＧキメラおよびその変異体
ｄ．細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその構成的変異体として作用する他の遺伝子産物
ｉ．ＲＩＧ－Ｉ
ｉｉ．ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１
ｉｉｉ．ＩＲＦ７
ｅ．他のＩ型ＩＦＮ調節タンパク質
４．抗体および抗体断片
ａ．ＴＧＦ－β
ｂ．二重特異性ｓｃＦｖおよびＴ細胞エンゲージャー
ｃ．抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体
ｄ．抗ＣＴＬＡ－４抗体
ｅ．さらなる例示的なチェックポイント標的
５．免疫調節タンパク質の組合せは相乗効果および／または補完効果を有し得る
６．併用療法をもたらす免疫刺激細菌
Ｅ．細菌のデリバリーのための治療用産物をコードする例示的プラスミドの構築
１．タンパク質の異種発現のための構成的プロモーター
２．複数の治療用産物発現カセット
ａ．単一プロモーターコンストラクト
ｂ．二重／多重プロモーターコンストラクト
３．調節エレメント
ａ．転写後調節エレメント
ｂ．ポリアデニル化シグナル配列およびターミネーター
ｃ．エンハンサー
ｄ．分泌シグナル
ｅ．細菌の適応度の改善
４．複製起点およびプラスミドコピー数
５．ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧアイランド
６．プラスミド維持／選択成分
７．ＤＮＡ核標的化配列
Ｆ．医薬品生成、組成物および製剤
１．製造
ａ．セルバンクの製造
ｂ．原体の製造
ｃ．薬物製品の製造
２．組成物
３．製剤
ａ．液剤、注射剤、乳濁剤
ｂ．乾燥熱安定性製剤
４．他の投与経路のための組成物
５．投薬量および投与
６．包装および製造品
Ｇ．処置の方法および使用
１．処置する患者を選択し処置をモニタリングするための診断法
ａ．患者選択
ｂ．免疫刺激細菌の活性を評価または検出するための診断法は処置の有効性を示す
２．腫瘍
３．投与
４．モニタリング
Ｈ．実施例
Ａ．定義
別段の定めがない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の開示の全体を通して参照されるすべての特許、特許出願、公開出願、ならびに刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト、および他の公開された素材は、特に明記しない限り、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書中の用語について複数の定義がある場合には、当該セクションのものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、当然、そのような識別子が変わって、インターネットに関する特定の情報が移り変わる場合があるが、等価の情報を、インターネットを検索することによって見出すことができる。その参照は、そのような情報の利用可能性および公的普及の証拠となる。
本明細書中で用いられる「治療細菌」は、対象、例えばヒトに投与されると、治療、例えば抗がん治療または抗腫瘍治療を達成する細菌である。
本明細書中で用いられる「免疫刺激細菌」は、対象中に導入された場合に、免疫特権組織および細胞、例えば腫瘍、腫瘍微小環境、ならびに腫瘍常在性免疫細胞において蓄積し、免疫刺激であるか、または免疫刺激をもたらす産物を複製かつ／もしくは発現する治療細菌である。例えば、免疫刺激細菌は、宿主内で、毒性もしくは病原性の低減によって、かつ／または毒性もしくは病原性を低減するコードされる産物によって、弱毒化される。というのも、免疫刺激細菌は、主に免疫特権環境における以外は、産物を複製かつ／または発現することができない（または複製／産物発現が低減される）からである。本明細書中で提供される免疫刺激細菌は、産物（複数可）をコードするか、または産物を免疫刺激にする形質もしくは特性を示すように改変されている。そのような産物、特性、および形質は、以下に限定されないが、例えば：免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子；細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、またはその機能獲得型のもしくは構成的に活性な変異体（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ）；チェックポイント遺伝子、例えば、ＴＲＥＸ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、および／またはＰＤ－Ｌ１を標的とするか、破壊するか、または阻害するＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ；抗体およびその断片、例えば、抗免疫チェックポイント抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、またはＴＧＦ－β阻害抗体；他の抗体コンストラクト、例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］；ＴＧＦ－βに結合するデコイとしての機能を果たす可溶性ＴＧＦ－β受容体、またはＴＧＦ－βアンタゴナイジングポリペプチド；ならびにデコイ受容体に結合するＩＬ－６の少なくとも１つを含む。また、免疫刺激細菌は、免疫抑制性であるか、または免疫抑制経路内にある代謝物質、例えばアデノシンについて、細菌を栄養要求性にする改変を含み得る。
本明細書中で用いられる株名称ＶＮＰ２０００９（例えば、国際出願ＰＣＴ国際公開第９９／１３０５３号参照、また、米国特許第６，８６３，８９４号も参照）、ＹＳ１６４６、および４１．２．９は、互換的に用いられており、各々が、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に寄託されて、登録番号２０２１６５が割り当てられている株を指す。ＶＮＰ２０００９は、ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ内に欠失を含有し、野生型株ＡＴＣＣ ＃１４０２８から生成された、ネズミチフス菌の改変弱毒化株である。
本明細書中で用いられる株名称ＹＳ１４５６および８．７は、互換的に用いられており、各々が、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に寄託されて、登録番号２０２１６４を割り当てられている株を指す（米国特許第６，８６３，８９４号参照）。
本明細書中で用いられる、細菌が特定の株に「由来する」という記載は、そのような株が出発材料として機能し得、特定の細菌が生じるように改変され得ることを意味する。
本明細書中で用いられる「発現カセット」は、ペイロード、例えば治療用産物または他のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸に作用可能に連結された、遺伝子発現用の調節配列を含む核酸コンストラクトを指す。
本明細書中で用いられる２Ａペプチドは、真核生物細胞内での翻訳中のポリペプチドの切断を媒介する、１８～２２個のアミノ酸（ａａ）長のウイルスオリゴペプチドである。名称「２Ａ」は、ウイルスゲノムの特定の領域を指し、様々なウイルス２Ａが、通常、これらが由来したウイルスの後に命名されてきた。これらの例として、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）、Ｅ２Ａ（ウマ科鼻炎Ａウイルス）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ）、およびＴ２Ａ［ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ］がある。コード配列について、例えば、Liu et al. (2017) Scientific Reports 7:2193、図１参照。また、配列番号３２７～３３０参照。これらのペプチドは、一般に、ＤｘＥｘＮＰＧＰのコア配列モチーフを共有しており、多数のウイルスファミリーにおいて存在する。当該ペプチドは、リボソームにペプチド結合させないことによって、ポリタンパク質をバラバラにする一助となる。２Ａペプチドは、複数のタンパク質が、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現されるマルチシストロン性ベクターを提供する。本明細書での目的のために、２Ａペプチドは、天然に存在するもの、およびそれらのあらゆる改変型を含み、例えば、いずれも、複数（２つ以上）のオープンリーディングフレームを含む転写産物から転写され翻訳されることになる単一のポリペプチドをもたらす、本明細書中で開示されるものを含む、天然に存在するあらゆる２Ａペプチドと９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
本明細書中で用いられる「インターフェロノパシー」は、インターフェロンの発現を調節または誘導する経路に関与する遺伝子産物中の突然変異によるインターフェロンのアップレギュレーションと関連する障害を指す。産物の活性は、通常、メディエータ、例えば、細胞内ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはヌクレオチドによって調節される；タンパク質産物が変異する場合、活性は構成的である。Ｉ型インターフェロノパシーは、エカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）の重度の形態、およびより軽度の家族性凍傷状狼瘡（ＦＣＬ）を含む範囲の状態を含む。これらの特性を有する変異産物をコードする核酸分子は、例えば、正常な活性を有する、または本明細書中に記載される疾患関連機能獲得型突然変異体と比較してさらなる機能獲得がある対立遺伝子の産物と比較して、産物において機能獲得が生じる突然変異について選択することによって、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で生成することができる。
本明細書中で用いられる「機能獲得型突然変異」は、突然変異を有していない同じタンパク質と比較して、タンパク質の活性を増大させるものである。例えば、タンパク質が受容体であるならば、リガンドに対する親和性が増大することとなる；タンパク質が酵素であるならば、構成的活性を含む活性が増大することとなる。
本明細書中で用いられる「複製起点」は、染色体もしくはプラスミド上の、またはウイルス内の、複製が開始されるＤＮＡの配列である。細菌プラスミドおよび小ウイルスを含む小ＤＮＡについて、単一の起点で十分である。
複製起点は、ベクターコピー数を決定する。これは、選択される複製起点に依存する。例えば、発現ベクターが低コピー数プラスミドｐＢＲ３２２に由来するならば、コピー数は約１５～２０コピー／細胞であり、高コピー数プラスミドｐＵＣに由来するならば、５００～７００コピー／細胞であり得る。
本明細書中で用いられる、細胞中のプラスミドの中程度のコピー数は、約１５０以下であり、低コピー数は、５～３０、例えば２０以下である。低～中程度のコピー数は、１５０コピー／細胞未満である。高コピー数は、１５０コピー／細胞超である。
本明細書中で用いられる「ＣｐＧモチーフ」は、中心ＣｐＧの側面（３’側および５’側）に位置する少なくとも１つの塩基によって囲まれる、非メチル化中心ＣｐＧ（ｐは、連続するＣヌクレオチドとＧヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指す）を含む塩基のパターンである。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、非メチル化ＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチドである。５’ＣＧ３’の少なくともＣは、メチル化されていない。
本明細書中で用いられる「ＲＩＧ－Ｉ結合配列」は、５’三リン酸（５’ｐｐｐ）構造を直接、またはポリ（ｄＡ－ｄＴ）配列からＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩによって合成されるものを指し、これは、ＲＩＧ－Ｉとの相互作用によって、ＲＩＧ－Ｉ経路を介してＩ型ＩＦＮを活性化することができる。ＲＮＡは、少なくとも４つのＡリボヌクレオチド（Ａ－Ａ－Ａ－Ａ）を含む；４、５、６、７、８、９、または１０個以上を含有することができる。ＲＩＧ－Ｉ結合配列は、ポリＡへの転写用の細菌内のプラスミド中に導入される。
本明細書中で用いられる「サイトカイン」は、細胞シグナル伝達において重要な、広くて曖昧なカテゴリーの小タンパク質（約５～２０ｋＤａ）である。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子を含む。サイトカインは、免疫応答において細胞間コミュニケーションを補助する細胞シグナリング分子であり、炎症、感染、および創傷の部位に向けた細胞の移動を刺激する。
本明細書中で用いられる「ケモカイン」は、ケモカイン受容体に結合する化学誘引性（走化性）サイトカインを指し、天然の源から単離されるタンパク質、および組換え手段によって、または化学合成によって合成的に製造されるタンパク質を含む。例示的なケモカインは、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＣＰ－２、ＧＲＯ－α、ＧＲＯ－β、ＧＲＯ－γ、ＥＮＡ－７８、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ ＩＩＩ、ＮＡＰ－２、ＬＡＰＦ－４、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１、ＰＦ４、ＳＤＦ－１α、ＳＤＦ－１β、ＳＤＦ－２、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＣＰ－５、ＭＩＰ－１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ－１β（ＣＣｌ４）、ＭＩＰ－１γ（ＣＣＬ９）、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－２α、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－４、ＭＩＰ－５、ＭＤＣ、ＨＣＣ－１、ＡＬＰ、ルングキン、Ｔｉｍ－１、エオタキシン－１、エオタキシン－２、Ｉ－３０９、ＳＣＹＡ１７、ＴＲＡＣ、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＤＣ－ＣＫ－１、リンホタクチン、およびフラクタルキン、ならびに当業者に知られている他のものを含むが、これらに限定されない。ケモカインは、炎症部位への免疫細胞の移動に、免疫細胞の成熟に、適応免疫応答の誘発に関与する。
本明細書中で用いられる「免疫刺激タンパク質」は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を示すか、または促進するタンパク質である。そのようなタンパク質の例として、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子、例えば、以下に限定されないが、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が弱まったＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の潜在的動員および／または持続性に関与する分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、細胞質ドメインが欠失している４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、または細胞質ドメインが部分的に欠失している（切り詰められた）４－１ＢＢＬ、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ならびに腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーがある。
免疫刺激タンパク質のうち、切り詰められた共刺激分子、例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌがあり、各々、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現について、完全または部分的な細胞質ドメイン欠失がある。これらの切り詰められた遺伝子産物、例えば細胞質ドメインの欠失または部分的欠失を有するものは、切り詰められた細胞質ドメインまたは欠失した細胞質ドメインに起因して、共刺激受容体結合を介して、Ｔ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達することができるが、ＡＰＣに対してカウンター調節シグナル伝達することができない。
本明細書中で用いられる「細胞質ドメイン欠失」は、タンパク質の細胞質ドメインまたは細胞内ドメインを含むアミノ酸残基のすべて、または一部における欠失であり、欠失は、共刺激受容体結合を介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達を引き起こすのに十分であり、ＡＰＣに対するカウンター調節シグナル伝達を阻害するのに十分である。例えば、ヒト４－１ＢＢＬ（別名ＴＮＦＳＦ９）の細胞質ドメインは、配列番号３４２のアミノ酸残基１～２８を含む。ヒトＣＤ８０の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基２６４～２８８を含み；ヒトＣＤ８６の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基２６９～３２９を含み；ヒトＣＤ２７Ｌ（別名ＣＤ７０）の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基１～１７を含み；ヒトＢ７ＲＰ１（別名ＩＣＯＳＬＧまたはＩＣＯＳリガンド）の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基２７８～３０２を含み；ヒトＯＸ４０Ｌ（別名ＴＮＦＳＦ４またはＣＤ２５２）の細胞質ドメインは、タンパク質のアミノ酸残基１～２３を含む。
本明細書中で用いられる「デコイ受容体」は、効率的に、特定の成長因子またはサイトカインに特異的に結合することができるが、意図される受容体複合体にシグナル伝達するか、またはこれを活性化することが構造的にできない受容体である。デコイ受容体は、リガンドに結合して、その同族受容体に結合するのを妨げることによって、阻害剤としての機能を果たす。
例えば、ＴＧＦ－βファミリー受容体は、細胞表面セリン／トレオニンキナーゼ受容体Ｉ型（ＴβＲＩまたはＴＧＦβＲ１）およびＩＩ型（ＴβＲＩＩまたはＴＧＦβＲ２）（二量体化されたリガンドの不在下でヘテロマーの複合体を形成する）、ならびにＩＩＩ型受容体ベータグリカン（ＴβＲＩＩＩまたはＴＧＦβＲ３）を含む。ＴＧＦ－βの、その受容体への結合を妨げる、ＴＧＦ－βについての可溶性デコイ受容体は、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ、またはＴβＲＩＩＩ（βグリカン）の可溶性細胞外ドメイン（ＴＧＦ－β結合領域）を含み、これらは、他の分子、例えばＦｃドメインと融合することができる。加えて、ＢＡＭＢＩ（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびアクチビン膜結合阻害剤）は、Ｉ型受容体と構造的に関連しており、受容体活性化を阻害するデコイとしての機能を果たす。また、ＴＧＦβＲ２および膜貫通領域の細胞外ドメインを含むが、シグナル伝達に必要とされる細胞質ドメインを欠いている、ドミナントネガティブＴＧＦβＲ２（ＤＮ－ＴＧＦβＲ２）を、ＴＧＦ－βデコイ受容体として用いることができる（例えば、国際公開第２０１８／１３８００３号参照）。
本明細書中で用いられる共刺激分子アゴニストは、共刺激分子に結合すると直ぐに、これを活性化するか、またはその活性を増大させる分子である。例えば、アゴニストはアゴニスト抗体であり得る。ＣＤ４０アゴニスト抗体の例は、ＣＰ－８７０，８９３、ダセツズマブ、ＡＤＣ－１０１３（ミタザリマブ）、およびＣｈｉ Ｌｏｂ ７／４を含む。
本明細書中で用いられる細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路は、Ｉ型インターフェロンの生成の原因となるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチドおよび／もしくは環状ジヌクレオチド、または他の核酸分子の存在によって開始されるものである。細胞内の核酸分子は、ウイルス、細菌、もしくは放射線の、または他のそのような曝露から発生し、宿主における免疫応答の活性化の原因となる。
本明細書中で用いられる「Ｉ型インターフェロン経路タンパク質」は、自然免疫応答を誘導するタンパク質である（Ｉ型インターフェロンの誘導等）。
本明細書中で用いられる「細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー」は、Ｉ型インターフェロン等の免疫応答メディエータの発現に導く細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質である。「細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー」は、Ｉ型インターフェロン経路タンパク質を含む。例えば、本明細書中に記載され、当業者に知られているように、細胞内ＤＮＡは、ｃＧＡＳによって感知されて、ｃＧＡＭＰおよび以降のＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３シグナル伝達の生成、およびＩ型ＩＦＮ生成の原因となる。また、細菌環状ジヌクレオチド（細菌環状ジ－ＡＭＰ等）がＳＴＩＮＧを活性化する。それゆえに、ＳＴＩＮＧはＩ型インターフェロンを誘導する免疫調節タンパク質である。５’－三リン酸ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが、ＲＩＧ－Ｉ、およびＭＤＡ－５単独またはＭＤＡ－５／ＬＧＰ２によって感知される。これにより、ミトコンドリアＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質）の重合が起こり、また、ＴＡＮＫ－結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）およびインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）が活性化する。そのような経路内のタンパク質は、免疫刺激であり、自然免疫応答メディエータ、例えばＩ型インターフェロンの発現の原因となる。ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路内の免疫調節タンパク質は、活性が増大するように、または細胞内核酸の不在下で構成的に作動するように改変されて、免疫応答、例えばＩ型インターフェロンの発現に至り得る。
本明細書中で用いられる、自然免疫タンパク質ＳＴＩＮＧの「カルボキシ末端尾部」または「Ｃ末端尾部」（ＣＴＴ）は、ＳＴＩＮＧタンパク質のＣ末端部分を指し、これは、野生型ＳＴＩＮＧタンパク質において、フレキシブルなリンカー領域によってｃＧＡＭＰ結合ドメインに繋がれている。ＣＴＴは、ＩＲＦ３結合部位、ＴＢＫ１結合部位、およびＴＲＡＦ６結合部位を含む。ＳＴＩＮＧは、ＴＡＮＫ結合性キナーゼ１（ＴＢＫ１）によるＳＴＩＮＧタンパク質Ｃ末端尾部（ＣＴＴ）のリン酸化を介したインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）産生の誘導を促進する。ＳＴＩＮＧとＴＢＫ１との相互作用は、ＳＴＩＮＧのカルボキシ末端尾部（ＣＴＴ）内の８つのアミノ酸残基の進化的に保存された範囲によって媒介される。ＴＲＡＦ６は、ＳＴＩＮＧ上でのＫ６３結合ユビキチン鎖の形成を触媒して、転写因子ＮＦ－κＢの活性化および代替のＳＴＩＮＧ依存性遺伝子発現プログラムの誘導に至る。ＣＴＴ内のＴＲＡＦ６結合部位の欠失または破壊は、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を低減し得る。ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴ（またはその部分）の、ＮＦ－κＢ活性化が低い種のＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣＴＴ（またはその対応する部分）との置換により、結果として生じる改変ヒトＳＴＩＮＧタンパク質によって、ＮＦ－κＢ活性化が低下し得る。ＳＴＩＮＧ ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要とされる配列モチーフを含有する約４０アミノ酸の構造化されていない範囲である［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。ヒトＳＴＩＮＧ残基Ｓ３６６は、インターフェロンシグナル伝達を活性化する自然免疫アダプタータンパク質間で共有されるＬｘＩＳのモチーフの一部である主要なＴＢＫ１リン酸化部位として同定されている［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴは、ＴＢＫ１結合に必要とされる、残基Ｌ３７４を含む第２のＰｘＰＬＲモチーフを含有する；ＬｘＩＳ配列およびＰｘＰＬＲ配列は、脊椎動物のＳＴＩＮＧ対立遺伝子の間で保存されている［de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照］。例示的なＳＴＩＮＧ ＣＴＴ配列、ならびにＩＲＦ３、ＴＢＫ１、およびＴＲＡＦ６結合部位を、以下の表に示す：
Figure 2023501539000002
本明細書中で用いられる「ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト」は、ＳＴＩＮＧ経路の活性化を介してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）発現を増大させるあらゆる産物である。そのようなアゴニストの例として、本明細書中で提供される機能獲得型ＳＴＩＮＧポリペプチド変異体、ならびに他の細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびＩ型ＩＦＮ経路タンパク質の機能獲得型変異体、例えば、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＭＤＡ５、およびＲＩＧ－Ｉの変異体があり、これらは、ＳＴＩＮＧ経路を介して、構成的Ｉ型ＩＦＮの発現を増大させる。
本明細書中で用いられる、「腫瘍常在性免疫細胞の細胞死をあまり誘導しない」または「免疫細胞の細胞死をあまり誘導しない」ように改変されている細菌は、改変のない細菌よりも毒性がないもの、または改変のない細菌と比較して病原性が低減されているものである。そのような改変の例として、食細胞のピロトーシスを無くすもの、および細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）プロファイルを変更するものがある。これらの改変は、フラゲリン遺伝子、ｐａｇＰ、またはＳＰＩ－１経路の１つまたは複数の成分、例えば、ｈｉｌＡ、ロッドタンパク質（例えばｐｒｇＪ）、ニードルタンパク質（例えばｐｒｇＩ）、およびＱｓｅＣの破壊または欠失を含む。
本明細書中で用いられる、「腫瘍常在性免疫細胞に優先的に感染するように改変されている」、または「免疫細胞に優先的に感染するように改変されている」細菌は、免疫細胞以外の細胞に感染する能力を低減する改変をゲノム中に有する。そのような改変の例は、３型分泌系もしくは４型分泌系、または非免疫細胞に侵入する細菌の能力に影響を与える他の遺伝子もしくは系を破壊する改変がある。例えば、改変として、ＳＰＩ－１成分の破壊／欠失を含み、これは、細胞、例えば上皮細胞の感染に必要とされるが、サルモネラ属による免疫細胞、例えば食細胞の感染に影響を与えない。
本明細書中で用いられる「改変」は、ポリペプチドのアミノ酸の配列、または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変に関し、アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入、および置換がそれぞれ挙げられる。ポリペプチドを改変する方法は、組換えＤＮＡ方法論を用いることによる等、当業者にとって常法である。
本明細書中で用いられる、細菌ゲノム、プラスミド、または遺伝子への改変は、核酸の欠失、置換、および挿入を含む。
本明細書中で用いられるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の翻訳を阻害し、それにより発現を阻害するために標的ｍＲＮＡ分子を中和することによって、遺伝子発現または翻訳を阻害する生物学的プロセスである。
本明細書中で用いられる、ＲＮＡｉを介して作動するＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現のサイレンシングによる阻害と称される。サイレンシング発現は、標的遺伝子の発現が低減されるか、抑制されるか、または阻害されることを意味する。
本明細書中で用いられる、ＲＮＡｉを介した遺伝子サイレンシングは、標的遺伝子の発現を阻害するか、抑制するか、破壊するか、または静まらせると言われている。標的遺伝子は、阻害ＲＮＡの配列に対応するヌクレオチドの配列を含有し、それによって阻害ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの発現を静まらせる。
本明細書中で用いられる、標的遺伝子を阻害すること、抑制すること、破壊すること、または静まらせることは、標的遺伝子の発現、例えば翻訳を変更し、それによって、標的遺伝子によってコードされる産物の活性または発現が低減されるプロセスを指す。低減は、完全ノックアウトまたは部分的ノックアウトを含み、それによって、本明細書中で提供される免疫刺激細菌および本明細書中の投与に関して、処置が達成される。
本明細書中で用いられる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、通常約２１ヌクレオチド長の、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの小片であり、各末端の３’突出部（２つのヌクレオチド）が用いられて、特定の配列にてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合してその分解を促進することによって、タンパク質の翻訳に「干渉する」ことができる。そうすることで、ｓｉＲＮＡは、その対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づく特定のタンパク質の産生を妨げる。当該プロセスは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれており、また、ｓｉＲＮＡサイレンシングまたはｓｉＲＮＡノックダウンとも称される。
本明細書中で用いられる、ショートヘアピンＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現を静まらせるのに用いることができる、タイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現は典型的に、プラスミドのデリバリーによって、またはウイルスベクターもしくは細菌ベクターを介して達成される。
本明細書中で用いられる腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍が存在する細胞環境であり、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来の炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む。存在する条件は、以下に限定されないが、腫瘍を示す、血管新生の増大、低酸素、低ｐＨ、ラクテート濃度の増大、ピルバート濃度の増大、間隙液圧の増大、および代謝物質または代謝の変更、例えばアデノシンのより高いレベルを含む。
本明細書中で用いられる「バクトフェクション」は、遺伝子またはプラスミドＤＮＡの、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞中への細菌媒介移入を指す。
本明細書中で用いられるヒトＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、免疫系の活性を調節するインターフェロンタンパク質のサブグループである。すべてのＩ型ＩＦＮは、特定の細胞表面受容体複合体、例えばＩＦＮ－α受容体に結合する。Ｉ型インターフェロンは、とりわけ、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含む。骨髄性細胞は、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βの主要なプロデューサであり、これらは、自然免疫応答に主に関与する抗ウイルス活性を有する。ＩＦＮ－βの２つの型として、ＩＦＮ－β１（ＩＦＮＢ１）およびＩＦＮ－β３（ＩＦＮＢ３）がある。
本明細書中で用いられるＭ１マクロファージ表現型およびＭ２マクロファージ表現型は、マクロファージ表現型を分ける２つの広い群：Ｍ１（古典的活性化マクロファージ）およびＭ２（代替活性化マクロファージ）を指す。Ｍ１マクロファージの役割は、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインを分泌すること、ポジティブ免疫応答に関与して、免疫モニターとして機能するように抗原を提示することである。産生される主要な炎症誘発性サイトカインとして、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、およびＴＮＦ－アルファがある。Ｍ２マクロファージは主に、アルギナーゼ－Ｉ、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、および他の抗炎症サイトカインを分泌し、これらは、炎症を低減し、腫瘍増殖および免疫抑制機能に貢献する機能を有する。Ｍ１様の表現型のマクロファージは、炎症誘発性サイトカインを分泌し、Ｍ２マクロファージの免疫抑制活性は有していない。Ｍ２マクロファージからＭ１またはＭ１様の表現型のマクロファージへの変換は、Ｍ２マクロファージを、免疫抑制性でないが、抗腫瘍応答に関与するものに変換する。Ｍ１またはＭ１様の表現型のマクロファージに変換されるＭ２マクロファージは、より炎症誘発性サイトカイン／ケモカインおよび受容体、例えばＣＤ８０およびＣＣＲ７、ならびにケモカイン、例えばＩＦＮγおよびＣＸＣＬ１０を示す。Ｍ１表現型マーカーは、以下に限定されないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ１６、およびＣＤ３２の１つまたは複数を含む。また、Ｍ１マクロファージにおける一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現は、表現型マーカーとして機能することができる。ＣＤ１６３およびＣＤ２０６は、Ｍ２マクロファージの識別のための主要なマーカーである。また、Ｍ２－型細胞用の他の表面マーカーは、ＣＤ６８を含む。あらゆるＭ２マーカーの低減または排除、およびＭ１マクロファージを示すサイトカイン／ケモカインの増大が、Ｍ２表現型からＭ１またはＭ１様の表現型への変換を反映している。以下のセクション、およびＭ２からＭ１様またはＭ１表現型の変換に関する実施例は、誘導される例示的なサイトカインプロファイルおよびマーカーを説明している。
本明細書中で用いられる、核酸またはコードされるＲＮＡが遺伝子を標的とするという記載は、何らかの機序によって遺伝子の発現を阻害するか、抑制するか、または静まらせることを意味する。通常、そのような核酸は、標的遺伝子と相補的な少なくとも部分を含み、当該部分は、相補部分とのハイブリッドを形成するのに十分である。
本明細書中で用いられる、核酸またはポリペプチド配列に言及する場合の「欠失」は、配列、例えば標的ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または天然もしくは野生型の配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失を指す。
本明細書中で用いられる、核酸またはアミノ酸配列に言及する場合の「挿入」は、標的の、天然、野生型、または他の関連する配列内の１つもしくは複数のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の包含を説明する。ゆえに、野生型配列と比較した１つまたは複数の挿入を含有する核酸分子は、配列の線状長さ内に１つまたは複数のさらなるヌクレオチドを含有する。
本明細書中で用いられる、核酸およびアミノ酸配列への「付加」は、別の配列と比較したいずれかの末端上への、ヌクレオチドまたはアミノ酸の追加を説明する。
本明細書中で用いられる「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」は、天然の、標的、野生型、または他の核酸またはポリペプチド配列内の１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、分子の長さ（ヌクレオチドまたは残基の数で記載される）を変えることなく、代替のヌクレオチドまたはアミノ酸により置換することを指す。ゆえに、分子内の１つまたは複数の置換が、分子のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数を変えることはない。特定のポリペプチドと比較したアミノ酸置換を、ポリペプチド配列の長さに沿って、アミノ酸残基の数に換算して表すことができる。
本明細書中で用いられる、「に対応する位置にて」、またはヌクレオチドもしくはアミノ酸位置が、例えば配列表に示される、開示される配列内のヌクレオチドもしくはアミノ酸位置に「対応する」という記載は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばＧＡＰアルゴリズムを用いて同一性を最大にするような、開示される配列とのアラインメントにより同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。配列をアラインすることによって、当業者であれば、例えば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、対応する残基を同定することができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最も高いオーダーマッチが得られるようにアラインされる［例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；およびCarrillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math 48:1073)参照］。
本明細書中で用いられる配列のアラインメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２つ以上の配列をアラインするための相同性の使用を指す。典型的には、５０％以上の同一性によって関連する２つ以上の配列がアラインされる。アラインされる配列セットは、対応する位置にてアラインされる２つ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされる、ＲＮＡに由来する配列、例えばＥＳＴおよび他のｃＤＮＡをアラインすることを含み得る。関連するポリペプチドもしくは核酸分子、または変異体ポリペプチドもしくは核酸分子を、当業者に知られているあらゆる方法によってアラインすることができる。そのような方法は典型的に、マッチを最大にし、例えば、マニュアルアラインメントを用いる方法、ならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）および当業者に知られている他のものを用いる方法を含む。ポリペプチドまたは核酸の配列をアラインすることによって、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、相似の部分または位置を同定することができる。さらに、当業者であれば、保存されたアミノ酸またはヌクレオチド残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列との間で対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を見出すこともできる。また、対応する位置は、例えばタンパク質構造のコンピュータシミュレートアラインメントを用いる、構造アラインメントに基づくこともできる。他の例において、対応する領域を同定することができる。また、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列との間で対応するアミノ酸残基を見出すこともできる。
本明細書中で用いられる、ポリペプチド、例えば抗体の「特性」は、ポリペプチドによって示されるあらゆる特性を指し、以下に限定されないが、結合特異性、構造的立体配置または高次構造、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、構造的安定性、熱抵抗性、およびｐＨ条件に対する抵抗性を含む。特性の変化は、ポリペプチドの「活性」を変更することができる。例えば、抗体ポリペプチドの結合特異性の変化は、抗原に結合する能力、および／または種々の結合活性、例えば親和性もしくは結合力、またはポリペプチドのインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性を変更することができる。
本明細書中で用いられる、ポリペプチド、例えば抗体の「活性」または「機能活性」は、ポリペプチドによって示されるあらゆる活性を指す。そのような活性は、実験に基づいて判定することができる。例示的な活性は、以下に限定されないが、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合、または二量体化、または酵素活性、例えばキナーゼ活性、またはタンパク質分解活性を介した、生体分子と相互作用する能力を含む。抗体（抗体断片を含む）について、活性は、以下に限定されないが、特定の抗原に特異的に結合する能力、抗原結合の親和性（例えば、高親和性または低親和性）、抗原結合の結合力（例えば、高結合力または低結合力）、結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、エフェクター機能、例えば抗原中和またはクリアランスを促進する能力、ウイルス中和、およびインビボ活性、例えば、病原体の感染もしくは侵入を妨げる、またはクリアランスを促進する、または体内の特定の組織もしくは体液もしくは細胞に侵入する能力を含む。活性は、認識されているアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラスモン共鳴、または結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）もしくは解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を測定する等価のアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡観察、細胞ベースのアッセイ、ならびに結合アッセイ（例えばパニングアッセイ）を用いて、インビトロまたはインビボ評価することができる。
本明細書中で用いられる「結合する」、「結合した」、またはその文法上の変形は、２つの分子が互いに近接している安定した関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）をもたらす、一方の分子の、もう一方の分子とのあらゆる引力相互作用への関与を指す。結合は、以下に限定されないが、非共有結合、共有結合（例えば、可逆的共有結合および不可逆的共有結合）を含み、分子、例えば、以下に限定されないが、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および小分子、例えば薬物を含む化合物間の相互作用を含む。
本明細書中で用いられる「抗体」は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片を指し、免疫グロブリン断片は、天然であるか、または部分的もしくは完全に合成的に、例えば組換えにより生成されるかを問わず、抗原結合部位を形成するのに、アセンブルされた場合に、抗原に特異的に結合するのに十分な免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域の少なくとも部分を含有するあらゆる断片を含む。それゆえに、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（抗体結合部位）に相同または実質的に相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖（ＨおよびＨ’と表され得る）および２つの軽鎖（ＬおよびＬ’と表され得る）を含有する抗体を指し、各重鎖は、全長免疫グロブリン重鎖、またはその、抗原結合部位を形成するのに十分な部分であり得（例えば、重鎖として、ＶＨ鎖、ＶＨ－ＣＨ１鎖、およびＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない）、各軽鎖は、全長軽鎖、またはその、抗原結合部位を形成するのに十分な部分であり得る（例えば、軽鎖として、ＶＬ鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない）。各重鎖（ＨおよびＨ’）は、１つの軽鎖（それぞれＬおよびＬ’）と対形成する。典型的には、抗体は、可変重（ＶＨ）鎖および／または可変軽（ＶＬ）鎖のすべてまたは少なくとも部分を最小限に含む。また、抗体は、定常領域のすべてまたは一部を含み得る。
本明細書中での目的のために、用語抗体は、全長抗体、およびその部分を含み、その部分は、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片等の抗体断片を含む。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片（ｓｃＦｖ内のＶＨドメインは、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ等のＦｃに連結されている）、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または上述のいずれかの抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。また、抗体は、合成抗体、組換えにより生成された抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびイントラボディを含む。本明細書中で提供される抗体は、あらゆる免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、あらゆるサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のメンバーを含む。ヒト治療用の抗体は一般に、ヒト抗体であるか、またはヒト化されている。
本明細書中で用いられる「抗体断片」は、（ｉ）可変重鎖および／もしくは軽鎖、または抗体の機能断片を含有し、Ｆｃ部分を欠いている一価の単一特異性抗体誘導体、；ならびに（ｉｉ）ＢｉＴＥ（登録商標）（タンデム型のｓｃＦｖ）、ＤＡＲＴ、ダイアボディ、および単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）を指す。ゆえに、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｖ断片、ナノボディ［例えば、カメルス・バクトリアムス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｍｕｓ）、ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、またはアルパカ（Ｌａｍａ ｐａｃｏｓ）に由来する抗体参照］［例えば、米国特許第５，７５９，８０８号；およびStijlemans et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:1256-1261参照］、ＶＨＨ、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、最小認識単位、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（登録商標）、およびＤＡＲＴを含む。列挙される抗体断片は、分子量が６０ｋＤａ未満である。
本明細書中で用いられる「核酸」は、典型的にはホスホジエステル結合によって結合されている、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む少なくとも２つの連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を指す。また、用語「核酸」に含まれるのは、核酸の類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオアートＤＮＡ、ならびに他のそのような類似体および誘導体、またはそれらの組合せである。また、核酸は、例えば、ヌクレオチド類似体、またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミダート結合、ホスホロチオアート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含有するＤＮＡ誘導体およびＲＮＡ誘導体を含む。また、当該用語は、ヌクレオチド類似体、ならびに一本鎖核酸（センスまたはアンチセンス）および二本鎖核酸から形成されるＲＮＡまたはＤＮＡの均等物、誘導体、変異体、および類似体を含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについて、ウラシル塩基はウリジンである。
本明細書中で用いられる単離核酸分子は、核酸分子の天然の源において存在する他の核酸分子から分離されたものである。「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって生成される場合、他の細胞物質も培地も実質的にあり得ず、または化学的に合成される場合、化学前駆体も他の化学物質も実質的にあり得ない。本明細書中で提供される例示的な単離核酸分子は、本明細書中で提供される抗体または抗原結合断片をコードする単離核酸分子を含む。
本明細書中で用いられる、核酸配列、領域、要素、またはドメインに関する「作用可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作用可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸領域が互いに機能的に関連していることを意味する。これは並置を指し、それによって、そのように記載される成分は、意図される様式で機能するのを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターが転写または発現に影響を与えるならば、コード配列に作用可能に連結されている。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結され得、それによって核酸は、機能的融合タンパク質を発現するように転写され翻訳され得、リーダーペプチドは、融合ポリペプチドの分泌を引き起こす。一部の例において、第１のポリペプチド（例えばリーダーペプチド）をコードする核酸は、第２のポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結されており、核酸は、単一のｍＲＮＡ転写産物として転写されるが、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳は、発現されることになる２つのポリペプチドのうち１つが生じ得る。例えば、アンバー終止コドンが、第１のポリペプチドをコードする核酸と第２のポリペプチドをコードする核酸との間に、部分的なアンバーサプレッサ細胞中に導入された場合に、結果として生じる単一のｍＲＮＡ転写産物が、第１および第２のポリペプチドを含有する融合タンパク質を生成するように翻訳され得るか、または第１のポリペプチドのみを生成するように翻訳され得るように、位置決めされ得る。別の例において、プロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結され得、それによってプロモーターは、核酸の転写を調節または媒介する。
本明細書中で用いられる、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する「合成的な」は、組換え方法および／または化学合成方法によって生成される核酸分子または遺伝子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書中で用いられる、天然に存在するα－アミノ酸の残基は、ヒトにおいて、同族ｍＲＮＡコドンでチャージされるｔＲＮＡ分子の特定の認識によってタンパク質中に組み込まれる、自然界に見出される２０種のα－アミノ酸の残基である。
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」は、共有結合した２つ以上のアミノ酸を指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で互換的に用いられる。
本明細書中で用いられる「ペプチド」は、２～約４０アミノ酸長であるポリペプチドを指す。
本明細書中で用いられる「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含有する。本明細書中の目的のために、提供される抗体および免疫刺激タンパク質内に含有されるアミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸（以下の表参照）、非天然のアミノ酸、およびアミノ酸類似体（例えば、α－炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。本明細書中で用いられる、本明細書中で表示されるポリペプチドの種々のアミノ酸配列中に存在するアミノ酸は、周知の、３文字略語または１文字略語（以下の表参照）に従って識別される。種々の核酸分子および断片内に存在するヌクレオチドは、当該技術においてルーチン的に用いられる標準的な単文字表示により示される。
本明細書中で用いられる「アミノ酸残基」は、そのペプチド結合でのポリペプチドの化学消化（加水分解）により形成されるアミノ酸を指す。本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、通常、「Ｌ」異性体形態である。「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、あらゆるＬアミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、37 C.F.R.§§1.821-1.822に採択されている標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基の略語を、以下の表に示す：
対応表
Figure 2023501539000003
式によって本明細書中で表されるアミノ酸残基のすべての配列は、アミノ末端の、カルボキシル末端への従来の方向の、左から右の向きを有する。フレーズ「アミノ酸残基」は、先の対応表において記載されるアミノ酸、ならびに改変アミノ酸、非天然のアミノ酸、および特殊なアミノ酸を含むと定義される。アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１つもしくは複数のアミノ酸残基のさらなる配列への、またはアミノ末端基、例えばＮＨ２への、またはカルボキシル末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示す。
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換が当業者に知られており、一般に、結果として生じる分子の生物活性を変更することなくなされ得る。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の単一のアミノ酸置換では、生物活性は実質的に変更されないことを認識する（例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224参照）。
そのような置換は、以下の表に示される例示的な置換に従ってなされ得る：
例示的な保存的アミノ酸置換
Figure 2023501539000004
また、他の置換も許容可能であり、実験に基づいて、または他の知られている保存的置換もしくは非保存的置換に従って決定することができる。
本明細書中で用いられる「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチド内に存在する２０種のＬ－アミノ酸を指す。
本明細書中で用いられる用語「非天然のアミノ酸」は、天然のアミノ酸に類似した構造を有するが、天然のアミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されている有機化合物を指す。ゆえに、天然に存在しないアミノ酸の例は、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のＤ－立体異性体を含むが、これに限定されない。例示的な非天然のアミノ酸は、当業者に知られており、２－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３－アミノアジピン酸（ｂＡａｄ）、β－アラニン／β－アミノプロピオン酸（Ｂａｌａ）、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－アミノ酪酸／ピペリジン酸（４Ａｂｕ）、６－アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２－アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３－アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２－アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’－ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ－エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ－エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、アロ－ヒドロキシリシン（Ａｈｙｌ）、３－ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４－ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロ－イソロイシン（Ａｉｌｅ）、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン（ＭｅＧｌｙ）、Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、６－Ｎ－メチルリシン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で用いられるＤＮＡコンストラクトは、自然界に見いだされない様式で組み合わされ、並置されるＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖、または二本鎖の、線状または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒト操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書中で用いられるＤＮＡセグメントは、指定された属性を有するより大きなＤＮＡ分子の部分である。例えば、指定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’の方向に読まれる場合、指定されたポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする、より長いＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたはプラスミド断片の部分である。
本明細書中で用いられる用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、当該ポリヌクレオチドは、天然の源から単離することができ、インビトロで合成することができ、または天然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書中で、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）に換算して与えられる。用語ヌクレオチドは、文脈が容認する場合、一本鎖分子および二本鎖分子に用いられる。当該用語は、二本鎖分子に用いられる場合、全長を意味するのに用いられて、用語塩基対に等しいことが理解されるであろう。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は、長さが僅かに異なり得ること、それらの末端は少しずつずらして並べられ得る（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ことが認識されよう；ゆえに、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが、対形成され得るわけではない。そのような対形成されていない末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
本明細書中で用いられる、組換え方法による生成は、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための、分子生物学の周知の方法の使用を指す。
本明細書中で用いられる「異種核酸」は、発現される細胞によって通常インビボ生成されない産物（すなわち、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）をコードする核酸、あるいは転写、翻訳、または他の調節可能な生化学プロセスに影響を与えることによって、通常存在しない遺伝子座内にある、または内因性核酸、例えばＤＮＡの発現を変更するメディエータを媒介もしくはコードする核酸である。また、異種核酸、例えばＤＮＡは、外来核酸とも称される。当業者であれば、発現される細胞と異種であるか、または当該細胞の外来であると認識するか、または考えるであろうあらゆる核酸、例えばＤＮＡは、本明細書中で、異種核酸に含まれる；異種核酸は、内生的にも発現される、外因的に加えられる核酸を含む。異種核酸は、通常、導入されるが、別の細胞から得られた細胞に内因性でないか、あるいは合成的に調製されるか、あるいは天然に存在しないか、または発現が、調節配列、もしくは天然の調節配列と異なる配列の制御下にあるゲノム遺伝子座中に導入される。
本明細書中の異種核酸の例は、以下に限定されないが、ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路内のタンパク質、またはその機能獲得型変異体もしくは構成的に活性な変異体、あるいは腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を与えるか、またはこれに貢献する免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子をコードする核酸を含む。また、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を与えるか、またはこれに貢献する他の産物、例えば、抗体およびその断片、ＢｉＴＥ（登録商標）、デコイ受容体、アンタゴナイジングポリペプチド、ならびにＲＮＡｉを含む。免疫刺激細菌において、異種核酸は一般に、導入されるプラスミド上にコードされるが、細菌のゲノム中に導入され得、例えば、細菌産物の発現を変更するプロモーターがある。異種核酸、例えばＤＮＡは、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの方法で媒介することができる核酸を含み、または異種核酸は、治療用産物の発現を、直接的または間接的に、何らかの方法で媒介する産物、例えばペプチドもしくはＲＮＡをコードすることができる
本明細書中で用いられる細胞療法は、疾患または状態を処置するための、対象への細胞のデリバリーを含む。対象とは同種異系であり得るか、または自己由来であり得る細胞は、例えば、対象に導入された場合に産物を送達または発現するような、本明細書中に記載される、免疫刺激細菌による細胞の感染によって、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）改変される。
本明細書中で用いられる遺伝的治療は、そのような治療が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの特定の細胞、例えば標的細胞中への異種核酸、例えばＤＮＡの移入を含む。核酸、例えばＤＮＡは、異種核酸、例えばＤＮＡが発現されて、それによってコードされる治療用産物が生成されるように、選択された標的細胞中に導入される。また、遺伝的治療を用いて、欠陥遺伝子を置換する遺伝子産物、または導入される哺乳動物もしくは細胞によって生成される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達することができる。導入された核酸は、哺乳動物宿主において通常生成されない、または治療的に有効な量で、もしくは治療的に有用な時点にて生成されない治療化合物、例えば成長因子もしくはその阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えばその受容体をコードし得る。治療用産物をコードする異種核酸、例えばＤＮＡは、患っている宿主の細胞中への導入前に改変されて、その産物または発現を増強するように、またはそうならないように変更することができる。また、遺伝的治療は、遺伝子発現の阻害剤もしくはリプレッサ、または他の調節因子のデリバリーを含み得る。
本明細書中で用いられる「発現」は、ポリペプチドがポリヌクレオチドの転写および翻訳によって生成されるプロセスを指す。ポリペプチドの発現のレベルは、例えば、宿主細胞から生成されるポリペプチドの量を判定する方法を含む、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて評価することができる。そのような方法は、以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡによる細胞溶解液中でのポリペプチドの定量化、ゲル電気泳動後のクマシーブルー染色、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ、およびＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを含み得る。
本明細書中で用いられる「宿主細胞」は、ベクターを受け入れ、維持し、複製し、かつ／または増幅するのに用いられる細胞である。また、宿主細胞は、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するのに用いることができる。ベクター内に含有される核酸は、宿主細胞が分裂するときに複製され、それによって核酸が増幅する。
本明細書中で用いられる「ベクター」は、適切な宿主細胞中にベクターが形質転換された場合に１つまたは複数の異種タンパク質が発現され得る複製可能核酸である。ベクターへの言及には、典型的には制限消化およびライゲーションによって、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が導入され得るベクターが含まれる。また、ベクターへの言及には、ポリペプチド、例えば改変抗ＣＴＬＡ－４抗体をコードする核酸を含有するベクターが含まれる。ベクターは、核酸の増幅のために、または核酸によってコードされるポリペプチドの発現／提示のために、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中に導入するのに用いられる。ベクターは典型的に、エピソームのままであるが、ゲノムの染色体中への遺伝子またはその部分の組込みを引き起こすように設計され得る。また、意図されるのは、人工染色体、例えば、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体であるベクターである。そのような媒体の選択および使用は、当業者には周知である。また、ベクターは、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」を含む。ウイルスベクターは、細胞中に外来遺伝子を移す（媒体またはシャトルとして）ために、外来遺伝子に作用可能に連結されている、操作されたウイルスである。
本明細書中で用いられる「発現ベクター」は、調節配列と作用可能に連結されているＤＮＡを発現することができるベクターを含み、当該調節配列は、例えば、そのようなＤＮＡ断片の発現を引き起こすことができるプロモーター領域である。そのようなさらなるセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、適宜、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナル等を含むことができる。発現ベクターは通常、プラスミドＤＮＡもしくはウイルスＤＮＡに由来するか、または両方のエレメントを含有し得る。ゆえに、発現ベクターは、適切な宿主細胞中への導入により、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらす組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクト、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターを指す。適切な発現ベクターが、当業者に周知であり、真核生物細胞および／もしくは原核生物細胞において複製可能であるもの、ならびにエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれものを含む。
本明細書中で用いられる「一次配列」は、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列、または核酸分子中のヌクレオチドの配列を指す。
本明細書中で用いられる「配列同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの比較において同一であるか類似したアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性が、核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントによって判定されて、類似性または同一性の領域を識別することができる。本明細書中の目的のために、配列同一性が通常、アラインメントによって判定されて、同一の残基が識別される。アラインメントはローカルであっても、グローバルであってもよい。マッチ、ミスマッチ、およびギャップを、比較した配列間で同定することができる。ギャップは、同一であるか、または類似する文字がアラインされるように、アラインされた配列の残基間に挿入されるヌルアミノ酸またはヌルヌクレオチドである。通常、内部ギャップおよび末端ギャップが存在し得る。ギャップペナルティを用いる場合、配列同一性は、末端ギャップについてペナルティなしで（例えば、末端ギャップは、ペナルティを課されない）判定することができる。これ以外にも、配列同一性を、同一の位置の数／アラインした総配列の長さ×１００として、ギャップを考慮することなく判定することができる。
本明細書中で用いられる「グローバルアラインメント」は、始めから終わりまで、２つの配列をアラインし、各配列内の各文字を一回のみアラインするアラインメントである。類似性または同一性が配列間に存在するか否かを問わず、アラインメントが作成される。例えば、「グローバルアラインメント」に基づく５０％配列同一性は、各々１００ヌクレオチド長の比較される２つの配列の完全配列のアラインメントにおいて、残基の５０％が同じであることを意味する。また、グローバルアラインメントは、アラインされる配列の長さが同じでない場合でも、配列同一性を判定するのに用いることができることが理解される。配列の末端における差異は、「末端ギャップについてペナルティなし」が選択されない限り、配列同一性を判定するのに考慮されることとなる。通常、グローバルアラインメントは、全長のほとんどにわたって有意な類似性を共有する配列に用いられる。グローバルアラインメントを実行するための例示的なアルゴリズムとして、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む［Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453］。グローバルアラインメントを実行するための例示的なプログラムが、公的に利用可能であり、National Center for Biotechnology Information（NCBI）ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/）にて利用可能なＧｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.にて利用可能なプログラムを含む。
本明細書中で用いられる「ローカルアラインメント」は、２つの配列をアラインするが、類似性または同一性を共有する配列の部分しかアラインしないアラインメントである。それゆえに、ローカルアラインメントは、一方の配列のサブセグメントが、もう一方の配列内に存在するかを判定する。類似性がないならば、アラインメントは返されない。ローカルアラインメントアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴまたはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム［Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)］を含む。例えば、「ローカルアラインメント」に基づく５０％配列同一性は、任意の長さの２つの比較される配列の完全配列のアラインメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、類似性または同一性の当該領域において同じである残基を５０％有することを意味する。
本明細書中の目的のために、配列同一性は、各供給元によって確立されたデフォルトギャップペナルティで用いられる標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって判定され得る。ＧＡＰプログラムについてのデフォルトパラメータは、以下を含み得る：（１）Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載される、Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745-6763の単項比較マトリックス（同一性について１の値、および非同一性について０を含有する）、および重み付けした比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティ、および各ギャップにおける各記号についてさらなる０．１０のペナルティ；ならびに（３）末端ギャップについて、ペナルティなし。２つの任意の核酸分子が、ヌクレオチド配列を有するか、または２つの任意のポリペプチドが、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（または同一性パーセントを列挙する他の類似したバリエーション）「同一」であるアミノ酸配列を有するかが、ローカルアラインメントまたはグローバルアラインメントに基づく、知られているコンピュータアルゴリズムを用いて判定され得る（例えば、何十もの知られており、公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供しているwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software参照）。通常、本明細書中の目的のために、配列同一性は、グローバルアラインメントに基づくコンピュータアルゴリズム、例えばＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴから入手可能なNeedleman-Wunsch Global Sequence Alignmentツール（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome）；LAlign［William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357］、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.にて入手可能なＸｉａｏｑｕｉ Ｈｕａｎｇのプログラムを用いて判定される。典型的には、比較されるポリペプチドまたはヌクレオチドの各々の全長配列は、グローバルアラインメントにおける各配列の全長にわたってアラインされる。また、比較されることになる配列が実質的に同じ長さである場合も、ローカルアラインメントを用いることができる。
したがって、本明細書中で用いられる用語「同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間での比較またはアラインメントを表す。非限定的な一例において、「と少なくとも９０％同一の」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して９０％～１００％の同一性パーセントを指す。９０％以上のレベルでの同一性は、例示を目的とすれば、１００アミノ酸またはヌクレオチドの試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長と参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長とが比較されて、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおけるアミノ酸またはヌクレオチドの１０％（すなわち、１００中１０）以下が、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸またはヌクレオチドと異なるという事実を示す。類似した比較が、試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの間でなされ得る。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分配される点突然変異として表され得、または、例えば１０／１００といった許容可能な最大アミノ酸差異（おおよそ９０％の同一性）まで、様々な長さの１つまたは複数の位置においてクラスター化され得る。また、差異は、アミノ酸残基の欠失またはトランケーションに起因し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失と定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５～９０％を上回る相同性または同一性のレベルにて、結果は、設定されるプログラムおよびギャップパラメータから独立し得る；同一性のそのような高いレベルは、多くの場合ソフトウェアに依存することなく、容易に評価することができる。
本明細書中で用いられる「疾患または障害」は、以下に限定されないが、感染、後天性状態、および遺伝的状態、ならびに定義可能な病徴によって特徴付けられるものを含む原因または状態に起因する、生物における病的状態を指す。
本明細書中で用いられる、疾患または状態を患う対象を「処置する」ことは、対象の病徴が、部分的に、もしくは全体として軽減されるか、または処置の後に静的なままであることを意味する。
本明細書中で用いられる「処置」は、疾患または障害の病徴を寛解させるあらゆる作用を指す。処置は、予防処置、治療、および／または療法を包含する。また、処置は、本明細書中で提供されるあらゆる免疫刺激細菌または組成物のあらゆる医薬的使用を包含する。
本明細書中で用いられる「予防処置」は、潜在的疾患の予防、および／または病徴の、もしくは疾患の進行の悪化の予防を指す。
本明細書中で用いられる、「予防」または予防処置、およびその文法的に等しい形態は、疾患または状態を進行させるリスクまたは可能性が低減される方法を指す。
本明細書中で用いられる「薬学的に有効な剤」は、あらゆる治療剤または生物活性剤を含み、以下に限定されないが、例えば、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、ならびに小分子薬および治療タンパク質を含む従来の治療薬を含む。
本明細書中で用いられる「治療効果」は、疾患もしくは状態の病徴を変更するか、または典型的には改善するか、もしくは寛解させる、あるいは疾患または状態を治療する、対象の処置に起因する効果を意味する。
本明細書中で用いられる「治療的に有効な量」または「治療的に有効な用量」は、対象への投与の後に治療効果を生み出すのに少なくとも十分な化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物の量を指す。それゆえにこれは、疾患または障害の病徴を予防するか、治療するか、寛解させるか、抑制するか、または部分的に抑制するのに必須の量である。
本明細書中で用いられる「治療有効性」は、化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物が投与された対象において治療効果を生み出す、化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物の能力を指す。
本明細書中で用いられる「予防的に有効な量」または「予防的に有効な用量」は、対象に投与された場合に、例えば、疾患もしくは病徴の発症もしくは再発を予防するか、もしくは遅延させること、疾患もしくは病徴の発症もしくは再発の見込みを低減すること、またはウイルス感染の発生率を低減することといった、意図される予防的効果を有する化合物を含有する剤、化合物、材料、または組成物の量を指す。完全な予防効果は、１回用量の投与によって必ずしも生じるわけではなく、一連の用量の投与の後にのみ生じ得る。ゆえに、予防的に有効な量は、１回または複数回の投与で投与され得る。
本明細書中で用いられる、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の病徴の寛解は、組成物または治療薬の投与に起因し得るか、または当該投与と関連し得る、永続的であるか一時的であるかを問わない、病徴の長続きするか、または一過性のあらゆる軽減を指す。
本明細書中で用いられる「抗がん剤」または「抗がん治療薬」は、悪性細胞および組織に対して直接的または間接的に破壊的であるか、または毒性であるあらゆる剤または治療薬を指す。例えば、抗がん剤は、がん細胞を死滅させるか、またはさもなければ腫瘍もしくはがん細胞の増殖を阻害するか、もしくは損なう剤を含む。例示的な抗がん剤は、化学療法剤および免疫治療剤である。
本明細書中で用いられる「治療活性」は、治療用産物、例えば、ポリペプチド、核酸分子、および他の治療分子のインビボ活性を指す。通常、治療活性は、疾患または状態の処置と関連する活性である。
本明細書中で用いられる用語「対象」は、哺乳動物、例えばヒトを含む動物を指す。
本明細書中で用いられる患者は、ヒト対象を指す。
本明細書中で用いられる「動物」は、以下に限定されないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長類；齧歯類、例えば、マウスおよびラット；家禽、例えばニワトリ；反芻動物、例えば、ヤギ、ウシ、シカ、およびヒツジ；ならびにブタおよび他の動物等のあらゆる動物を含む。非ヒト動物は、意図される動物としてヒトを除く。本明細書中で提供されるポリペプチドは、あらゆる源、動物、植物、原核生物、および菌類に由来する。ほとんどのポリペプチドは、哺乳動物起源を含む動物起源のものである。
本明細書中で用いられる「組成物」は、あらゆる混合物を指す。組成物として、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらのあらゆる組合せがあり得る。
本明細書中で用いられる「組合せ」は、２つ以上の項目間のあらゆる関連を指す。組合せは、２つ以上の別々の項目、例えば、２つの組成物または２つの集合、それらの混合物、例えば２つ以上の項目の単一の混合物、またはそれらのあらゆる変形物であり得る。組合せのエレメントは、通常、機能的に関連するか、または関係がある。
本明細書中で用いられる「併用療法」は、２種以上の異なる治療薬の投与を指す。異なる治療剤は、別々に、連続して、断続的に提供され投与され得、または単一の組成物により提供され得る。
本明細書中で用いられる「キット」は、パッケージされた組合せであり、他のエレメント、例えば追加的な試薬、およびその組合せまたはエレメントの使用説明書を、生物活性または特性の活性化、投与、診断、および評価を含むがこれらに限定されない目的のために含んでもよい。
本明細書中で用いられる「単位用量形態」は、ヒトおよび動物対象に適した、当該技術において知られるように、個々にパッケージされた、物理的に別々の単位を指す。
本明細書中で用いられる「単回投薬量製剤」は、直接投与用の製剤を指す。
本明細書中で用いられる「マルチドーズ型製剤」は、治療剤のいくつかの単回用量を提供するために、治療剤の複数回用量を含有し、直接投与され得る製剤を指す。用量は、分、時間、週、日、または月にわたって投与することができる。マルチドーズ型製剤は、用量調整、用量プール、および／または用量分割を可能にし得る。マルチドーズ型製剤は経時的に用いられるので、通常、微生物の増殖を妨げるための１つまたは複数の防腐剤を含有する。
本明細書中で用いられる「製造品」は、製造されて販売される産物である。本出願の全体を通して用いられる当該用語は、包装の物品内に含有される、本明細書中で提供されるあらゆる組成物を包含することが意図される。
本明細書中で用いられる「流体」は、流れることができるあらゆる組成物を指す。ゆえに、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。
本明細書中で用いられる、単離された、または精製されたポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、単離抗体またはその抗原結合断片）またはその生物学的に活性な部分（例えば、単離抗原結合断片）は、ポリペプチドもしくはタンパク質が由来する細胞もしくは組織から細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質が実質的にない、または化学的に合成された場合に化学前駆体もしくは他の化学物質から実質的に解放されている。調製物は、当業者によって純度を評価するために用いられる標準的な分析方法、例えば薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって判定される容易に検出可能な不純物がないように見えるならば、またはさらなる精製が、物理的特性および化学的特性、例えば、物質の酵素活性および生物学的活性を検出可能に変更しないほど十分に純粋であるならば、実質的に解放されていると判定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法が、当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合には、さらなる精製が、化合物の特定の活性を増大させるかもしれない。
本明細書中で用いられる「細胞抽出物」または「溶解液」は、溶解した細胞または破壊された細胞から構成される調製物または画分を指す。
本明細書中で用いられる「対照」は、試験パラメータにより処理されないこと、または血漿サンプルであるならば、注目する状態に冒されていない正常なボランティアに由来し得ること以外は、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを指す。また、対照は、内部対照であり得る。
本明細書中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと述べていない限り、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「免疫グロブリンドメイン」を含むポリペプチドへの言及は、免疫グロブリンドメインの１つまたは複数を有するポリペプチドを含む。
本明細書中で用いられる用語「または」は、選択肢のみに言及することが明示的に示されない限り、または選択肢が互いに相容れない限り、「および／または」を意味するのに用いられる。
本明細書中で用いられる範囲および量は、「約」特定の値または範囲と表され得る。また、「約」は、正確な量を含む。それゆえに、「約５つのアミノ酸」は、「約５つのアミノ酸」を、また「５つのアミノ酸」をも意味する。
本明細書中で用いられる「してもよい、適宜（ｏｐｔｉｏｎａｌまたはｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載される事象または状況が起こるか、または起こらないこと、ならびに記載が、前記事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。例えば、適宜変異体の部分は、当該部分が変異体または非変異体であることを意味する。
本明細書中で用いられる、あらゆる保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、特に明記しない限り、それらの一般的な使用、認識されている略語、またはＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに関するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ［Biochem. (1972) 11(9): 1726-1732参照］に従う。
限定するためではなく開示を明確にするために、詳細な説明を、続くサブセクションに分けている。
Ｂ．がん治療のための免疫刺激細菌の概要
細菌が抗がん活性を有するという認識は、１９世紀に遡る。そのころ、何人かの医師が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に感染した患者で腫瘍が後退するのを観察した。Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃｏｌｅｙは、細菌を末期がんの処置に利用する最初の研究を開始し、Ｓ．ピオゲネスおよびセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）で構成されるワクチンを開発した。これは、肉腫、癌腫、リンパ腫、および黒色腫を含めた様々ながんの処置に好成績で用いられた。それ以来、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、およびエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）を含めた、いくつかの細菌の種が、抗がんワクチンの源として研究されてきた（例えば、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ１９９９／０１３０５３号および第ＷＯ２００１／０２５３９９号：Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21；およびPawlek et al. (2003) Lancet Oncol. 4:548-556を参照）。
治療プラットフォームとして、細菌は、腫瘍溶解性ウイルスなどの他の療法に勝るいくつかの利点を有する。一部の細菌の種は、経口投与および全身（静脈内：ＩＶ）投与されるように操作することができ、それらは、インビトロおよびインビボで容易に増殖し、それらは、凍結乾燥された状態で保存および輸送することができる。細菌の染色体は、エクソンが無く、容易に操作することができ、極めて多数の株の完全なゲノムが完全に特徴づけられている（Felgner et al. (2016) mBio 7(5):e01220-16）。多くのタイプの細菌は、産生するのがウイルスより安価かつ簡単であり、操作された細菌は、宿主細胞ゲノムに永久に組み込まれないので、その適切なデリバリーは、ウイルスデリバリーよりも好都合でありえる。それらは、上皮細胞より骨髄性細胞を優先的に感染させ、それらは、必要に応じて、抗生物質で迅速に無くすことができ、このことが、それらを安全なものにしてる。
これらの有利な特性を活用するために改変されている免疫刺激細菌を本明細書で提供する。本明細書で提供する細菌は、それらが腫瘍微小環境、特に腫瘍常在性免疫細胞（骨髄性細胞）、例えば、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、樹状細胞（ＤＣ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などを感染させ、その中で増えるように改変されており、高レベルの治療用タンパク質およびその組合せ、特に補完的な組合せを発現し、デリバリーするように設計されてもいる。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、既存の細菌療法、また、細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、および先行の細菌療法よりも、優れている有利な特性を有する。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、任意の適した経路で投与することができるが、静脈内投与など、全身投与に適している。本明細書に示し、記載するように、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、主要な免疫経路を標的とすることができる。
本明細書で提供する細菌は、細菌の有益な足場特性を維持し、ウイルス様免疫シグネチャーを有するように設計され、操作されている。これは、抗がん治療薬として使用するのに有利である。細菌およびウイルスの免疫および足場特性の一部を以下の表にまとめる。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、細菌足場の実現可能性を保持するが、処置されている対象におけるウイルス様免疫応答をもたらす（下記のセクションＣでさらに詳細に論じる）。
Figure 2023501539000005
サルモネラ属種および他の細菌種において、鞭毛は、ＴＲＬ５媒介炎症に貢献し、ＬＰＳは、ＴＬＲ４媒介炎症反応をもたらし、接着性ｃｕｒｌｉ線毛は、ＴＬＲ２媒介炎症反応をもたらす。本明細書で提供する免疫刺激細菌のゲノムは、細菌が鞭毛および接着性ｃｕｒｌｉ線毛を失っており、改変されたＬＰＳを有するように改変されており、その結果、ＴＬＲ４媒介炎症反応が低減しているか、または無くなっている。結果として、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ウイルス様抗腫瘍免疫応答を誘導する。これらの成分の排除または改変は、以下に詳細に論じられるものなど、他の有利な特性を与える。免疫刺激細菌は、抗がん治療薬などの治療用産物、特に産物の相補的な組合せをデリバリーする。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、コードされた遺伝的ペイロードを腫瘍常在性骨髄性細胞に腫瘍特異的にデリバリーする。
抗がん治療用産物、１または複数の治療用産物をコードする遺伝的ペイロードをデリバリーする免疫刺激細菌を提供する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、完全または部分的な細胞質ドメイン欠失を有する、切り詰められた共刺激分子（受容体またはリガンド：例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）が含まれ、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの切り詰めまたは欠失により、ＡＰＣに逆調節シグナル伝達できない。
免疫刺激細菌は、以下のものの１つまたは複数をコードおよび発現することができる：ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、またはＩ型ＩＦＮ経路タンパク質、例えば、機能獲得型であるか、もしくは構成的に活性であるＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、もしくはＲＩＧ－Ｉ変異体（Ｉ型ＩＦＮを誘導する）など、ＴＧＦベータの阻害剤、例えば、ＴＧＦ－β阻害抗体、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、およびＴＧＦベータ結合性デコイ受容体など、抗体およびその断片、例えば、免疫チェックポイントを標的とするものなど、ならびに他の抗がん標的、例えば、ＶＥＧＦおよびＩＬ－６など、共刺激受容体／分子、例えば、細胞質ドメインが欠失しているか、切り詰められているか、もしくは別途に無くなっている４－１ＢＢＬを含めた４－１ＢＢＬなど、およびその他。免疫刺激細菌は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、部分的または完全な細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）もコードおよび発現していてもよく、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失または切り詰めによりＡＰＣに逆調節シグナル伝達できない。そのような治療用産物および薬剤の組合せは、単一の治療用組成物中に発現させることができる。細菌ゲノムの改変のおかげで、免疫刺激細菌は、腫瘍特異性局在および濃縮を示し、そうでなければ、全身的に活性化された場合に毒性となる抗腫瘍免疫経路の活性化用の静脈内（ＩＶ）投与を提供する。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、安全であり、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍常在性免疫細胞を標的とするように、遺伝的に設計されている。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ゲノム改変および他の改変の組合せ、ならびにコードされている治療用産物を含み、それらは、腫瘍常在性免疫細胞内で増え、毒性副作用なしか、または限られた毒性副作用で腫瘍および腫瘍微小環境で抗がん免疫刺激を誘導または促進する治療用産物、特に組合せをデリバリーするのに十分に長く持続する免疫刺激細菌を提供するように協調して機能する。全身性、例えば静脈内（ＩＶ）でデリバリーされるとき、免疫刺激細菌は、転移性病変に含めた腫瘍内で濃縮され、それらは、特に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、および樹状細胞（ＤＣ）を含めた腫瘍常在性骨髄性細胞への免疫ペイロードの効率的な遺伝子導入を提供し、それらは、強力な局所免疫応答を誘導して、腫瘍を破壊し、将来の再発に対してワクチン接種をし、治療が終わったとき、それらは、感染細胞による食作用および破壊などによって、自然に無くなるか、またはそれらは、１クールの抗生物質によって迅速に破壊することができる。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、設計されたプリン／アデノシン栄養要求性により、腫瘍微小環境でおよび／または腫瘍常在性免疫細胞で選択的蓄積を示し、貪食細胞の内部における複製不能を示す。血清補体によって不活性化を回避する免疫刺激細菌は、正常な組織への毒性を最小限にしながら、腫瘍微小環境内に直接的に高濃度の様々な免疫治療剤および治療用産物のデリバリーを可能にし、本明細書に提供されている。
例えば、セクションＣ．８．でさらに詳細に記載するように、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、本明細書に詳細に論じられるように、以下のゲノム改変：ＬＰＳ中のリピドＡを変え、ペンタアシル化（野生型リピドＡは、６～７本の脂肪酸鎖を有する）をもたらし、ＴＬＲ４親和性を低減する細菌をｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－にする改変；ｐｕｒＩ－などのアデノシン（ａｄｅｎｏｎｓｉｎｅ）／アデニン栄養要求体である改変；Ｔ細胞の質を改善するアスパラギナーゼＩＩ－（ａｎｓＢ－）である改変；特性のうち中でもｃｕｒｌｉ線毛を除去するｃｓｇＤ－である改変を含み、コードされている産物が活性型で産生されないようにする、挿入、欠失、破壊、および任意の他の改変など、他のオプションのゲノム改変を含む。免疫刺激細菌は、真核生物プロモーターの制御下に１または複数の治療用産物、特に抗がん産物をコードするプラスミドを含む。
治療用産物（例えば構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体ならびに他の免疫調節性タンパク質および産物）を腫瘍常在性骨髄性細胞にデリバリーする本明細書に提供されている免疫刺激細菌は、適応免疫を促進し、Ｔ細胞機能を増強する。免疫刺激細菌は、自然免疫の促進および適応免疫の抑制によって特徴づけられる、細菌表現型から離れて、適応抗腫瘍表現型の方へ、免疫抑制腫瘍微小環境の完全なリモデリングをもたらす。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ゲノム改変を含み、それによって、それらは、腫瘍常在性免疫細胞、特に腫瘍常在性骨髄性細胞、例えば、マクロファージ、ＭＤＳＣ（骨髄系由来サプレッサー細胞）およびＤＣ（樹状細胞）などを標的とするか、またはその中で増え、その中で、それらは、宿主細胞（真核生物）転写／翻訳機構によって認識される調節配列の制御下で発現されるコードされている治療用産物のペイロードをデリバリーする。コードされている産物は、骨髄性細胞内で発現され、適切に、腫瘍微小環境にデリバリーされる。細菌は、抗腫瘍免疫を生じさせ、腫瘍を直接的に処置する抗腫瘍産物、およびプロドラッグを活性化することができる産物をデリバリーすることもできる。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、無改変細菌と比較して少なくとも約１００，０００倍大きな腫瘍浸潤および濃縮を示すことができる。免疫刺激細菌は、腫瘍常在性免疫細胞によって消費され、免疫細胞および腫瘍微小環境内で発現され、産生される治療用産物をコードするプラスミドをデリバリーして、抗腫瘍免疫を生じさせる。
１．細菌がん免疫治療
多くの固形腫瘍型は、それらを、承認されたチェックポイント療法、例えば抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、および抗ＰＤ－Ｌ１療法などに対して高度に難治性にする非常に免疫抑制的な微小環境を進化させてきた。腫瘍がそれによってチェックポイント療法に対する抵抗性を進化させてきた１つのメカニズムは、Ｔ細胞排除、非炎症性、または「冷たい腫瘍」と記載される、腫瘍内Ｔ細胞および腫瘍抗原交差提示樹状細胞（ＤＣ）のそれらの欠如を介したものである（Sharma et al. (2017) Cell 168(4):707-723）。その腫瘍がＴ細胞炎症性であり、チェックポイント免疫治療に反応する少数の患者については、患者が、しばしば重度の自己免疫性毒性を経験し、多くは、最終的に再発して、チェックポイント難治性になる（例えば、Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3377-3383；Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363(8):711-723；およびChen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391を参照）。腫瘍は、免疫監視を避けるための複数のメカニズムを開始し、免疫を抑制するように抗腫瘍免疫細胞を再プログラムし、抗腫瘍Ｔ細胞を排除および不活性化し、標的に向けられたがん治療に対して出現した抵抗性を発達させる（例えば、Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8):561-584を参照）。この問題を解決するには、これらの腫瘍に適切に炎症を起こし、長期にわたる腫瘍縮小をもたらすことができる抗腫瘍免疫を生じさせることができる免疫治療が必要である。加えて、腫瘍内療法は困難であり、転移性疾患セッティングにおいてかなり制限的となろう。個々の転移性病変それぞれに適切に炎症を起こし、免疫抑制の複数の経路を克服する全身投与される療法が必要である。腫瘍常在性免疫細胞を特異的に標的とし、かつ複数の相補的な遺伝的ペイロード／治療用産物を発現するそれらの能力のおかげで、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、これらの問題に対処するように設計されている。
２．腫瘍微小環境を標的とする先行治療
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的とし、かつ抗腫瘍免疫の促進を試みるいくつかの療法が開発されている。それぞれ、それ自体の困難および欠点を有し、それらは、本明細書で提供する免疫刺激細菌によって対処される。
ａ．自家Ｔ細胞療法の限界
高度に免疫抑制的な腫瘍微小環境にアクセスすること、および腫瘍に炎症を起こし、抗腫瘍免疫を促進する適切な免疫応答を誘導することを目的として、いくつかの全身投与される治療プラットフォームが臨床的に調査されている。これらのプラットフォームには、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が含まれ、これは、患者からＴ細胞を採取し、それらを再設計して、Ｔ細胞受容体を特定の腫瘍抗原に特異的な抗体Ｉｇ可変細胞外ドメインに融合させることによって産生される。これは、活性化されたＴ細胞の細胞溶解性特性と共に、抗体の抗原認識特性を細胞に与える（例えば、Sadelain et al. (2015) J. Clin. Invest. 125(9):3392-3400を参照）。ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔチサゲンレクルユーセル（商標Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標）の下にあるものなど）およびアキシカブタゲンシロロイセル（商標Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標）の下にあるものなど）のＦＤＡ承認など、この技術の見込みおよび可能性にもかかわらず、成功は、ＣＤ１９＋造血器腫瘍に限定されており、しかもそれは、致命的な免疫関係有害事象を伴った（例えば、Jackson et al. (2016) Nat. Rev. Clin. Oncol. 13(6):370-383を参照）。腫瘍は、ＣＤ１９抗原を含めた、固形腫瘍の標的腫瘍抗原を下方制御するように、急速に突然変異する可能性があり、それにより免疫エスケープを発達させる（例えば、Mardiana et al. (2019) Sci. Transl. Med. 11(495):eaaw2293を参照）。あり余る程の腫瘍特異性標的抗原があるわけではない。健常な組織で発現されない固形腫瘍標的は、ＣＡＲ－Ｔ療法の主要な障害である。それに加えて、ＣＡＲ－Ｔ療法は、腫瘍内への適切なＴ細胞浸潤に必要である十分なＴ細胞ケモカイン勾配の欠如による他の障害により、固形腫瘍微小環境にアクセスするのが妨げられている。加えて、一旦それらが腫瘍に浸潤したならば、それらは急速に不活性化される（例えば、Brown et al. (2019) Nat. Rev. Immunol. 19(2):73-74を参照）。ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性が大幅に向上し、有効性が固形腫瘍にまで拡大したとしても、これらの労働集約的な療法と関連する実現可能性および経費が、それらのより広範な採用をなお限定している。
ｂ．ウイルスワクチンプラットフォーム
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、腫瘍細胞溶解を誘導し、Ｔ細胞を腫瘍に動員し、免疫調節性タンパク質を産生するように腫瘍細胞が読むことができる遺伝材料をデリバリーする天然の特性および操作された特性を有する。例えば、タリモジーンラハーパレプベック（Ｔ－ＶＥＣ）と称される腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に投与される、抗黒色腫抗原およびサイトカインＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）をコードする改変された単純ヘルペスウイルスである。Ｔ－ＶＥＣは、転移性黒色腫用にＦＤＡ承認されている（例えば、Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21を参照）。Ｔ－ＶＥＣは、一部の黒色腫患者について臨床的ベネフィットを示しており、免疫チェックポイント抗体またはＩＬ－２およびインターフェロン－アルファなどのＦＤＡ承認されている全身サイトカインより免疫毒性が少ない（例えば、Kim et al. (2006) Cytokine Growth Factor Rev. 17(5):349-366；およびPaul et al. (2015) Gene 567(2):132-137を参照）。
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）には、抗がん治療としていくつかの限界がある。まず、腫瘍溶解性ウイルスは、血液中のヒト補体系によって急速に不活性化される。所望の治療効果を有するのに十分なウイルスを全身投与を介してデリバリーすることは、難しいと判明している。腫瘍内デリバリーは、転移性セッティング（病変が全身に広がっている状況）では制限的であり、ほとんどの固形腫瘍型（例えば、肺および内臓病変）について難治性であり、反復投与を制限する注射用の介入的誘導画像診断を必要とする。ウイルスは、商業規模の製造および保存には困難であり得る。ほとんどのＯＶベースのワクチン、中でも、パラミクソウイルス、レオウイルス、およびピコルナウイルスをベースにしたものなどは、同様の限界を有する（例えば、Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300を参照）。腫瘍溶解性ウイルスは、本質的に免疫原性であり、ヒト血液から急速に除去され、腫瘍内に入るＴ細胞は、より弱い腫瘍新抗原よりウイルス抗原との親和性がはるかに高い（例えば、Aleksic et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42(12):3174-3179を参照）。したがって、プラットフォームに関する認識されている技術上の制限に加えて、これまでのＯＶは、耐久的な抗腫瘍免疫を刺激する能力が制限されている。
ｃ．細菌がん治療
前臨床動物研究において、いくつかの細菌種は、遠位部位から注射したとき、固形腫瘍の中で優先的な複製を示している。これらは、限定されるものではないが、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属、およびエシェリキア属の種を含む。細菌の腫瘍ホーミング特性は、細菌感染に対する宿主の自然免疫応答と合わせて、抗腫瘍応答を媒介することができる。この腫瘍組織指向性は、様々な程度で腫瘍サイズを低減する。これらの細菌種の腫瘍指向性に寄与する一因子は、無酸素および低酸素環境中で複製する能力である。いくつかのこれらの天然に腫瘍指向性の細菌は、抗腫瘍応答の潜在力が増大するようにさらに操作されている（Zu et al. (2014) Crit. Rev. Microbiol. 40(3):225-235；およびFelgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078で概説されている）。動物実験における概念実証にもかかわらず、動物モデルには存在しないヒト血清中の補体因子が細菌を不活性化することができ、このことが、がんを処置する療法としてのそれらの使用を制限している。
経口投与または全身投与するために、細菌株は、それらが全身疾患および／または感染性ショックを引き起こさないが、効果的な腫瘍コロニー形成のために依然としていくらかのレベルの感染性および補体による不活性化に対する抵抗性を維持するように、弱毒化されている。クロストリジウム属（例えば、Dang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(26):15155-15160；米国特許出願公開第２０１７／００２０９３１号および第２０１５／０１４７３１５号；ならびに米国特許第７，３４４，７１０号および第３，９３６，３５４号を参照）、マイコバクテリウム属（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２２４１５１号および第２０１５／００７１８７３号を参照）、ビフィドバクテリウム属（例えば、Dang et al. (2001)；およびKimura et al. (1980) Cancer Res. 40:2061-2068を参照）、ラクトバチルス属（例えば、Dang et al. (2001)を参照）、リステリア・モノサイトゲネス（例えば、Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868；Starks et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427；および米国特許出願公開第２００６／００５１３８０号を参照）、および大腸菌（例えば、米国特許第９，３２０，７８７号を参照）を含めたいくつかの異なる細菌種が、抗がん治療用の可能性のある薬剤として研究されている。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍を処置するために開発された先行の細菌についての問題に対処するゲノム改変を含む。改変は、腫瘍微小環内に細菌を向かわせるか、またはその中での増加を改善し、特に、細菌が、腫瘍常在性免疫細胞を感染させ、健常な組織を感染させず、それによって、毒性を低減し、コードされている産物のデリバリーを改善するように設計されている。免疫刺激細菌は、その組合せを含めた治療用産物をデリバリーするようにも設計されており、腫瘍の免疫抑制性効果を無くし、宿主の抗腫瘍応答を増強し、抗腫瘍産物を提供するように設計されている。
ｉ．リステリア属
リステリア・モノサイトゲネスは、がんのマウスモデルにおいて、発現されている腫瘍抗原に対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングを誘導することができる生きている弱毒化細胞内細菌であり、細菌がんベクターとしても探索されている（例えば、Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868を参照）。プライムブーストアプローチで同種異系膵がんベースのＧＶＡＸワクチンと共に腫瘍抗原メソテリンを組み込んだリステリア菌ベースのワクチンの臨床試験において、ＧＶＡＸワクチン単独で処置された患者の生存期間中央値が３．９カ月であったのに対して、進行膵がんを有する患者では６．１カ月の生存期間中央値が認められた（例えば、Le et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33(12):1325-1333を参照）。しかし、これらの結果は、より大きな第２ｂ相研究では反復されなかった。このことは、ヒトにおいて末梢免疫監視を低親和性の腫瘍ネオアンチゲンへと破壊することの難しさを指摘している。Ｌ．モノサイトゲネスも、食作用の後に細菌が溶解されるための要件による、コードされている腫瘍抗原に対する免疫応答の制限を示した。食作用後の溶菌は、効率的なプラスミド移動の必要条件であるが、Ｌ．モノサイトゲネスでは、ヒトマクロファージ内で起こることが実証されていない。
ｉｉ．サルモネラ属種
サルモネラ・エンテリカ血清型チフィリウム（Ｓ．チフィリウム）は、抗がん治療薬として用いるための細菌種で例である。Ｓ．チフィリウムは、組織壊死、漏出性の腫瘍脈管構造からの栄養の入手可能性、および免疫抑制腫瘍微小環境内でそれらが生存する見込みの増大により、低酸素区域および壊死区域で優先的に増えるグラム陰性通性嫌気性菌である（例えば、Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-394を参照）。通性嫌気性菌として、Ｓ．チフィリウムは、好気性および嫌気性条件下で増殖することができ、したがって、比較的に低酸素でない小さな腫瘍と比較的に低酸素である大きな腫瘍の両方でコロニー形成することができる。
糞口経路によるＳ．チフィリウム感染は、限局性胃腸感染を引き起こす。この細菌は、血流およびリンパ系に入ることもでき、その結果、全身組織、例えば、肝臓、脾臓、および肺などを感染させる。野生型Ｓ．チフィリウムの全身投与は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を過剰に刺激し、サイトカインカスケードおよび感染性ショックをもたらす。これらは、無処置のままにした場合、致命的となる可能性がある。その結果、Ｓ．チフィリウムなどの病原性細菌株は、腫瘍組織に効果的にコロニー形成するそれらの能力を完全に抑制せずに、全身感染症を防ぐために弱毒化しなければならない。弱毒化は、しばしば、病原体パターン認識を介して免疫応答を誘発することができる細胞構造、例えば細菌の外膜などを突然変異させることによって、または栄養の補足の不在下で複製する細菌の能力を限定することによって達成される。
Ｓ．チフィリウムは、マクロファージなどの骨髄系貪食細胞によって急速に取り入れられる細胞内病原体であるか、またはそのサルモネラ病原島１（ＳＰＩ－１）にコードされたＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ１）を介して上皮細胞などの非貪食細胞に直接的に侵入することができる。ひとたび細胞内に入れば、それは、ＳＰＩ－２調節を介して、サルモネラ含有液胞（ＳＣＶ）内で複製することができ、一部の上皮細胞の細胞質ゾル内に逃避することもできる（例えば、Agbor et al. (2011) Cell Microbiol. 13(12):1858-1869；およびGalan and Wolf-Watz (2006) Nature 444:567-573を参照）。Ｓ．チフィリウムの遺伝子改変細菌株は、直接的な殺腫瘍効果を誘発し、かつ／または殺腫瘍分子をデリバリーする抗腫瘍剤として記載されている（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760；およびZhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652を参照）。
細菌性病原体を弱毒化するための様々な方法が当技術分野で知られている。栄養要求性突然変異は、例えば、細菌が必須栄養を合成できなくなるようにし、ａｒｏ、ｐｕｒ、ｇｕａ、ｔｈｙ、ｎａｄ、およびａｓｄなどの遺伝子の欠失／突然変異（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号を参照）が用いられる。これらの遺伝子を含む生合成経路によって産生される栄養は、宿主細胞内では利用できないことが多く、したがって、細菌の生存は困難である。例えば、サルモネラ属種および他の種の弱毒化は、糖分解を芳香族アミノ酸生合とつなげるシキミ酸経路の一部であるａｒｏＡ遺伝子の欠失または破壊によって達成することができる（例えば、Felgner et al. (2016) mBio 7(5):e01220-16を参照）。ａｒｏＡの欠失または破壊は、芳香族アミノ酸についての細菌の栄養要求性およびそれに続く弱毒化をもたらす（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、第２００３／０１７５２９７号、第２０１２／０００９１５３号、および第２０１６／０３６９２８２号；ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号および第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。同様に、ａｒｏＣおよびａｒｏＤを含めた、芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する他の酵素が、弱毒化を達成するために欠失させられている（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６９２８２号；および国際出願公開第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。例えば、Ｓ．チフィリウムのＳＬ７２０７株は、芳香族アミノ酸栄養要求体（ａｒｏＡ－突然変異体）であり、Ａ１およびＡ１－Ｒ株は、ロイシンアルギニン栄養要求体である。
細菌を弱毒化する突然変異は、限定されるものではないが、ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡ、およびｌｐｘＴなど、リポ多糖（ＬＰＳ）の生合成を変える遺伝子の突然変異；ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌ、またはｐｈｌＡなど、自殺遺伝子を導入する突然変異；ｈｌｙおよびｃｌｙなど、細菌溶解遺伝子を導入する突然変異；ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃ、およびａｃｔなど、病原性因子をコードする遺伝子の突然変異；ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐ、およびｇｒｏＥＬなど、ストレス応答を改変する遺伝子の突然変異；ｍｉｎなど、細胞周期を破壊する遺伝子の突然変異；ならびにｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ、およびｏｍｐＲなど、調節機能を破壊または不活性化する遺伝子の突然変異も含む（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、第２００３／０１７０２７６号、および第２００７／０２９８０１２号；米国特許第６，１９０，６５７号；国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号；Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177；Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178；Frahm et al. (2015) mBio 6(2):e00254-15；Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038；ならびにKong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419を参照）。一般に、弱毒化突然変異は、病原性表現型への復帰をもたらすかもしれない自発的な代償的突然変異を防ぐ遺伝子欠失である。
安全性のためにＳ．チフィリウムを弱毒化する別の方法は、膜結合性センサーキナーゼ（ＰｈｏＱ）および細胞質転写調節因子（ＰｈｏＰ）で構成される典型的な細菌２成分調節系であるＰｈｏＰ／ＰｈｏＱオペロンシステムを用いることである（例えば、Miller, S. I. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5054-5058；およびGroisman, E. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7077-7081を参照）。ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱは、病原性に必要であり、その欠失は、マクロファージ内におけるこの細菌の生存を危うくし、マウスおよびヒトにおける著しい弱毒化をもたらす（例えば、Miller, S. I. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5054-5058；Groisman, E. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7077-7081；Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6:433-443；およびFields, P. I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5189-5193を参照）。ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ欠失株は、ワクチンデリバリー媒体として使用されている（例えば、Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6:433-443；Fields, P. I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5189-5193）；およびAngelakopoulos, H. and Hohmann, E. L. (2000) Infect. Immun. 68:2135-2141を参照）。しかし、本明細書に記載のように、ある菌株にとって、マクロファージ内での生存が制限されることは、その細菌がプラスミドを移そうとしていていないのであれば不利である。
これらの弱毒化細菌株は、静脈内投与（ＩＶ）されたとき、マウス、ブタ、およびサルで安全であることが分かっており（例えば、Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760；Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652；Tjuvajev J. et al. (2001) J. Control. Release 74:313-315；およびZheng, L. et al. (2000) Oncol. Res. 12:127-135を参照）、いくつかの生きている弱毒化サルモネラ属株は、ヒト臨床試験において、経口投与後に十分に忍容されることが示されている（例えば、Chatfield, S. N. et al. (1992) Biotechnology 10:888-892；DiPetrillo, M. D. et al. (1999) Vaccine 18:449-459；Hohmann, E. L. et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:1408-1414；およびSirard, J. C. et al. (1999) Immunol. Rev. 171:5-26を参照）。
治療用に弱毒化されているＳ．チフィリウムの他の株は、例えば、ロイシンアルギニン栄養要求株（ａｕｘｔｒｏｐｈ）Ａ－１（例えば、Zhao et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(3):755-760；Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；米国特許第８，８２２，１９４号；および米国特許出願公開第２０１４／０１７８３４１号を参照）およびその派生株ＡＲ－１（例えば、Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；Kawaguchi et al. (2017) Oncotarget 8(12):19065-19073；Zhao et al. (2006) Cancer Res. 66(15):7647-7652；Zhao et al. (2012) Cell Cycle 11(1):187-193；Tome et al. (2013) Anticancer Research 33:97-102；Murakami et al. (2017) Oncotarget 8(5):8035-8042；Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882；およびBinder et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1(2):123-133を参照）；ａｒｏＡ－突然変異体Ｓ．チフィリウムＳＬ７２０７株（例えば、Guo et al. (2011) Gene Therapy 18:95-105；ならびに米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、第２０１６／０３６９２８２号、および第２０１６／０１８４４５６号を参照）、およびその偏性嫌気性派生株ＹＢ１（例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号；Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；およびLeschner et al. (2009) PLoS ONE 4(8):e6692を参照）；ａｒｏＡ－／ａｒｏＤ－突然変異体Ｓ．チフィリウムＢＲＤ５０９株、ＳＬ１３４４（野生型）株の派生株（例えば、Yoon et al. (2017) Eur. J. Cancer 70:48-61を参照）；ａｓｄ－／ｃｙａ－／ｃｒｐ－突然変異体Ｓ．チフィリウムχ４５５０株（例えば、Sorenson et al. (2010) Biologics: Targets & Therapy 4:61-73を参照）ならびにｐｈｏＰ－／ｐｈｏＱ－Ｓ．チフィリウムＬＨ４３０株（例えば、国際出願公開第ＷＯ２００８／０９１３７５号参照）である。
しかし、弱毒化は、腫瘍常在性免疫細胞、腫瘍微小環境、および腫瘍細胞内で細菌が増える能力に影響を与える。この問題は、本明細書に解決される。本明細書に例示されるサルモネラ属株などの、免疫刺激細菌は、上記のもののうちのいくつかを含むことができるが、がん治療薬としての有用性を増強する本明細書に記載の他の改変および特性も有することができる改変のおかげで弱毒化されている。
Ｓ．チフィリウムの弱毒化株は、食作用および分解の後にＤＮＡをデリバリーする生得的な能力を有する（例えば、Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 41(7):3413-3414を参照）。それらは、遺伝子治療用のベクターとして用いられている。例えば、Ｓ．チフィリウム株は、サイトカイン、血管新生抑制剤、毒素、およびプロドラッグ変換酵素をコードするものを含めた様々な遺伝子をデリバリーおよび発現するのに用いられている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２９８０１２号；Loeffler et al. (2008) Cancer Gene Ther. 15(12):787-794；Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883；Loeffler et al. (2008) J. Natl. Cancer Inst. 100:1113-1116；Clairmont, C. et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760；Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652；およびTjuvajev J. et al. (2001) J. Control. Release 74:313-315を参照）。
Ｓ．チフィリウムは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サバイビン（ＳＶＮ）をデリバリーして、適応免疫をプライミングするように改変されている（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１８６４０１号；およびXu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270を参照）。ＳＶＮは、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）であり、細胞生存を延長し、細胞周期の制御を提供し、全ての固形腫瘍で過剰発現しており、正常な組織では発現が乏しい。この技術は、ＳＰＩ－２およびそのＩＩＩ型分泌装置を用いて、ＡＰＣの細胞質ゾルにＴＡＡをデリバリーし、次いで、ＡＰＣが活性化されて、ＴＡＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞および抗腫瘍免疫を誘導する（例えば、Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270を参照）。リステリアベースのＴＡＡワクチンと同様に、このアプローチは、マウスモデルで見込みがあることが示されているが、ヒトでは効果的な腫瘍抗原特異的なＴ細胞プライミングを示していない。
タンパク質をコードするＤＮＡのデリバリーに加えて、Ｓ．チフィリウムは、がん治療用の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）をデリバリーするために用いられている。例えば、Ｓ．チフィリウムは、例えば、免疫抑制遺伝子インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を標的とするものなど、特定のｓｈＲＮＡを発現するように改変されている。マウス黒色腫モデルにおけるＩＤＯ発現のサイレンシングは、腫瘍細胞死および好中球によるかなりの腫瘍浸潤をもたらした（例えば、Blache et al. (2012) Cancer Res. 72(24):6447-6456；国際出願公開第ＷＯ２００８／０９１３７５号；および米国特許第９，４５３，２２７号を参照）。このベクターとヒアルロニダーゼとの同時投与は、マウス膵管腺癌の処置において正の結果を示した（例えば、Manuel et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3(9):1096-1107；および米国特許出願公開第２０１６／０１８４４５６号を参照）別の研究では、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失によって弱毒化され、シグナル伝達および転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）特異的ｓｈＲＮＡを発現するＳ．チフィリウム株が腫瘍成長を阻害し、転移臓器の数を低減させ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの寿命を延長した（例えば、Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67(12):5859-5864を参照）。別の例では、Ｓ．チフィリウムＳＬ７２０７株が、β－カテニンをコードする遺伝子であるＣＴＮＮＢ１を標的とするｓｈＲＮＡのデリバリーのために用いられている（例えば、Guo et al. (2011) Gene Therapy 18:95-105；ならびに米国特許出願公開第２００９／０１２３４２６号および第２０１６／０３６９２８２号を参照）。Ｓ．チフィリウムＶＮＰ２０００９株は、ＳＴＡＴ３を標的とするｓｈＲＮＡのデリバリーのために用いられている（例えば、Manuel et al. (2011) Cancer Res. 71(12):4183-4191；米国特許出願公開第２００９／０２０８５３４号、第２０１４／０１８６４０１号、および第２０１６／０１８４４５６；ならびに国際出願公開第ＷＯ２００８／０９１３７５号、および第ＷＯ２０１２／１４９３６４号を参照）。Ｓ．チフィリウムＡ１－Ｒ株およびＶＮＰ２０００９株を用いて、オートファジー遺伝子Ａｔｇ５およびＢｅｃｌｉｎ１を標的とするｓｉＲＮＡｓが腫瘍細胞にデリバリーされている（例えば、Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882を参照）。
しかし、これらの株は、抗腫瘍免疫応答を効果的に刺激することもなく、また、治療用量のコードされている産物をデリバリーするために効果的に腫瘍にコロニー形成することもないことが見出されている。より効果的に抗腫瘍免疫応答を刺激するように、本明細書で提供する免疫刺激細菌など、そのような株を改善する必要がある。様々な細菌のさらなる改変および代替的な改変が、公開されている国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１９／０１４３９８号および米国公開第２０１９／００１７０５０Ａ１号に記載されている。これらの出版物の各々に記載され、本明細書にも記載されている細菌は、本明細書に記載のように、それらの免疫刺激特性および腫瘍標的特性をさらに改善するように改変することができる。
ｉｉｉ．ＶＮＰ２０００９
本明細書に記載の改変のための開始株として用いることができる治療用細菌の例は、ＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ＃２０２１６５、ＹＳ１６４６）と名付けられた株である。このウイルスは、臨床候補であった。ＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ＃２０２１６５、ＹＳ１６４６）は、安全性のため、ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ遺伝子の欠失によって、少なくとも５０，０００倍弱毒化されていた（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, pp. 47-59；およびLee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25を参照）。ｍｓｂＢ遺伝子の発現を妨げる欠失または破壊は、グラム陰性細菌外膜の主要成分であるリポ多糖のリピドＡドメインの組成を変える（例えば、Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41を参照）。これは、リポ多糖で誘発される敗血症性ショックを防止し、ＴＮＦαの潜在的に有害な産生を低減しながら、細菌株を弱毒化し、全身毒性を低減する（例えば、Dinarello, C.A. (1997) Chest 112(6 Suppl):321S-329S；およびLow et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41を参照）。ｐｕｒＩ遺伝子の発現を妨げる欠失または破壊は、細菌をプリンについて栄養要求性にし、これが、細菌をさらに弱毒化し、それらを腫瘍微小環境内に濃縮する（例えば、Pawelek et al. (1997) Cancer Res. 57:4537-4544；およびBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。本明細書に示すように、ＶＮＰ２０００９は、免疫抑制ヌクレオシドアデノシンについて栄養要求性でもある。アデノシンは、腫瘍内に病理学的に高いレベルで蓄積し、免疫抑制腫瘍微小環境に貢献する可能性がある（例えば、Peter Vaupel and Arnulf Mayer, Oxygen Transport to Tissue XXXVII, Advances in Experimental Medicine and Biology 876 chapter 22, pp. 177-183を参照）。
ＶＮＰ２０００９を同系またはヒト異種移植腫瘍を有するマウスに投与すると、細菌が、腫瘍の細胞外成分内で、３００～１０００：１を超える比率で優先的に増え、腫瘍増殖阻害および対照マウスとの比較における生存の延長を示した（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。ＶＮＰ２０００９は、動物モデルで良好な腫瘍ターゲティングおよび腫瘍成長抑制を示し、一方で、ごくわずかな毒性しか誘発しなかった（例えば、Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178；Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883；Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508；およびClairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。
ヒト転移性黒色腫の第１相臨床試験からの結果は、ＶＮＰ２０００９が比較的安全であり、十分に忍容されたが、非常に限られた抗腫瘍活性が観察されたことを明らかにした（例えば、e.g., Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照）。ＶＮＰ２０００９の使用は、転移性疾患の負荷に有意な変化をもたらさなかったが、それは、最大耐量（ＭＴＤ）で腫瘍コロニー形成のエビデンスを示した。なんらかの抗腫瘍活性を引き起こすのに必要であろう、これより高い用量は、高レベルの炎症促進性サイトカインと相関した毒性のため、不可能であった。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ＶＮＰ２０００９株には無い多数の改善および利点を提供する。免疫刺激細菌は、コードされている遺伝的ペイロードを腫瘍常在性骨髄性細胞に腫瘍特異的にデリバリーする。免疫刺激細菌は、遺伝子の欠失または破壊およびゲノムの他の改変などのゲノム改変のおかげで、例えば、鞭毛を無くすこと、ＬＰＳの改変、およびｃｕｒｌｉ線毛を無くすことのおかげで、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５媒介炎症の低減およびバイオフィルム形成の低減を示す。免疫刺激細菌は、例えばＬ－アスパラギナーゼＩＩの発現を無くしたおかげで、Ｔ細胞機能を増強し、プラスミド維持を容易にし、提供し、可能にし、支持する。細菌は、骨髄性細胞、特に腫瘍常在性骨髄性細胞のみで、または実質的にそれのみで増え（またはそれを標的とし）、食作用の後に高度に効率的なプラスミドデリバリーを提供する。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境にコロニー形成し、かつ全身投与することができる。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ＶＮＰ２０００９と比較して少なくとも１５倍改善されたＬＤ５０を示す。したがって、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、必要に応じて、ＶＮＰ２０００９と比較してはるかに高い用量で毒性効果無しに投与することができる（投薬量および投与について記載している、セクションＦ．５．における下記の表を参照）。
鞭毛を無くすこと、ＬＰＳ改変、および他の改変を含めた、本明細書に記載のように改変された免疫刺激細菌は、骨髄性細胞、特に腫瘍常在性骨髄性細胞で優先的に増えるか、それを標的とすることが示され、本明細書に記載されている。実施例は、全身投与、例えば静脈内投与などに続いて、免疫刺激細菌が、そのような細胞で増えることを実証する。実施例は、細菌の細胞死に続く、免疫刺激細菌から腫瘍常在性骨髄性細胞内へのプラスミド移動および耐久的なタンパク質発現、ならびにそれによる、抗がん応答および表現型をもたらす産物を含めた治療用産物のデリバリーについても記載し、示す。
ｉｖ．野生型株
腫瘍におけるＶＮＰ２０００９の蓄積は、親株ＡＴＣＣ１４０２８固有の侵襲性、低酸素環境内で複製するその能力、および腫瘍の間質液に存在する高濃度のプリンを求める要件性を含めた因子の組合せから生じる。本明細書に記載のように、例えばＶＮＰ２０００９などの弱毒化株を開始細菌株として用いる必要はない。本明細書に記載の改変のおかげで、細菌は、無毒であるか、または弱毒化されている。親株であるＡＴＣＣ１４０２８または別の野生型株を開始株として用いられることができ、本明細書に記載されるように改変することができる。
３．既存の細菌がん免疫治療の限界
多くのクラスの免疫治療は、それらの安全性および有効性を制限する有意な限界、ならびに広範に使用される可能性が低い複雑なプラットフォームを有する。細菌は、例えば腫瘍溶解性ウイルスと比較して、抗がん治療薬として用いる上で有利な特性を極めて多く有する。これらには、細菌を増やし、製造し、保存し、処置が完了したときに宿主から無くすことができる簡単さが含まれる。しかし、ウイルスもまた、宿主応答を含めた有利な特性を有する。細菌感染に対する応答は、自然炎症反応であり、それは抗がん治療薬にとって有利ではない。ウイルス感染に対する応答は、抗がん応答と類似している。これについて、以下の表にまとめる（上記概要も参照）。
Figure 2023501539000006
したがって、微生物抗がんプラットフォームとしての細菌の限界は、抗がん経路への類似性がそれより高いウイルス感知経路と比較して、細菌を感知した場合、そして細胞内細菌を感知した場合でさえ、免疫系によって開始される特異的な免疫プログラムに由来する。ウイルスを認識する感知プログラムは、高度に効果的なワクチンおよび耐久的な適応免疫の生成を可能にする。しかし、細菌に対するワクチン接種では、限定的な成功しか得られていない。例えば、ＦＤＡ承認されているサルモネラ・チフィに対する腸チフスワクチンは、Ｓ．チフィが、高度に免疫原性であるＶｉ莢膜およびＯ：９抗原を含有するにもかかわらず、わずか５５％の有効性であり（例えば、Hart et al. (2016) PLoS ONE 11(1):e0145945を参照）、Ｌ．モノサイトゲネスおよびＳ．チフィリウムなどの免疫原性がこれより低い細菌株では、そのようなものがなく、それらに対するワクチンも存在しない。
細菌およびウイルスは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られる保存された構造を含有し、それが、宿主の細胞パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって感知される。ＰＲＲによるＰＡＭＰの認識は、サイトカインおよびケモカインの誘導および特異的な免疫応答の開始をもたらす下流のシグナル伝達カスケードを誘発する（例えば、Iwasaki and Medzhitov (2010) Science 327(5963):291-295を参照）。ＰＡＭＰによる自然免疫系のエンゲージメントの仕方およびその感染病原体がどのようなタイプの感染病原体に由来するかによって、侵入している病原体と戦うために、適切な自然応答または適応応答が生成されるかどうかが決定される。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として知られている１クラスのＰＲＲが、細菌およびウイルス起源に由来するＰＡＭＰを認識し、細胞内の様々なコンパートメントに局在している。ＴＬＲは、リポ多糖（ＴＬＲ４）、リポタンパク質（ＴＬＲ２）、フラゲリン（ＴＬＲ５）、ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＴＬＲ９）、二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ３）、および一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）を含めた様々なリガンドを認識する（例えば、Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680；ならびにKawai and Akira (2005) Curr. Opin. Immunol. 17(4):338-344を参照）。ＤＮＡおよびＲＮＡベースのウイルスは、食作用の後に宿主の細胞質ゾルコンパートメントで感知するか、または細胞質ゾルで直接的に感知することができる。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）は、ウイルス起源または損傷した宿主細胞ＤＮＡの取り込みに由来する一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの宿主認識によって誘導されるシグネチャーサイトカインである。例えば、合成ｄｓＲＮＡアナログであるポリイノシンポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、エンドソームＴＬＲ３のアゴニストであり、Ｉ型ＩＦＮの強力な誘導物質であり、そのさらに安定なバージョンであるポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）という商標の下で販売されているものなど）が臨床開発された（例えば、Caskey et al. (2011) J. Exp. Med. 208(12):2357-2366を参照）。同様に、エンドソーム内の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８（ヒトでのみ）によって感知され、その既知の合成のリガンドであるレジキモドおよびイミキモドは、ＦＤＡ承認されている局所がん免疫治療である。
細胞質ゾルでは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）およびメラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）などのＲＮＡヘリカーゼによって感知され、それによりＩ型ＩＦＮの誘導がもたらされる（例えば、Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919を参照）。ｄｓＤＮＡの細胞質ゾルセンサーは、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）によって媒介される。ＳＴＩＮＧは、感染性病原体または異常な宿主細胞損傷に由来する細胞質ゾルｄｓＤＮＡを感知するための中心的メディエータであるＥＲ常在性アダプタータンパク質である（例えば、Barber (2011) Immunol. Rev. 243(1):99-108を参照）。ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）／インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）軸、およびＮＦ－κＢシグナル伝達軸を活性化し、ＩＦＮ－βならびに自然および適応免疫を強力に活性化する他の炎症促進性サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす（例えば、Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518を参照）。ＳＴＩＮＧを介した細胞質ゾルｄｓＤＮＡの感知は、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）を必要とする。ｃＧＡＳは、ｄｓＤＮＡに直接的に結合し、それに応答して、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）セカンドメッセンジャーである環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）を合成する宿主細胞ヌクレオチジルトランスフェラーゼであり、ｃＧＡＭＰがＳＴＩＮＧに結合して活性化する（例えば、Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791；およびWu et al. (2013) Science 339(6121):826-830を参照）。
ＳＴＩＮＧは、細胞内Ｌ．モノサイトゲネスから産生されるｃ－ジ－ＡＭＰ、またはＳ．チフィリウム由来のｃ－ジ－ＧＭＰなど、細菌由来のＣＤＮにも結合することができる。ｃＧＡＳは、細菌由来の標準的なＣＤＮには応答しないヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を活性化することができる非標準ＣＤＮを産生することが後で発見された。２個のプリンヌクレオシドが、３’－３’結合を有するリン酸架橋でつながれている細菌によって産生されるＣＤＮとは異なり、ｃＧＡＳによって合成されるｃＧＡＭＰ中のヌクレオチド内リン酸架橋は、非標準の２’－３’結合でつながれている。これらの２’－３’分子は、細菌の３’－３’ｃ－ジ－ＧＭＰより３００倍高い親和性でＳＴＩＮＧに結合し、したがって、より強力なＳＴＩＮＧの生理的リガンドである（例えば、Civril et al. (2013) Nature 498(7454):332-337；Diner et al. (2013) Cell Rep. 3(5):1355-1361；Gao et al. (2013) Sci. Signal 6(269):pl1；およびAblasser et al. (2013) Nature 503(7477):530-534を参照）。ヒトのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、細菌性病原体より優先的にウイルス病原体に応答するように進化したようである。
したがって、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ７／８など、ウイルスを感知するＰＲＲおよびＴＬＲは、効果的なＴ細胞媒介性適応免疫をもたらすＩ型ＩＦＮならびにサイトカインおよびケモカインを誘導する。腫瘍セッティングでは、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、ＣＸＣＬ１０などのＴ細胞輸送ケモカインを誘導する必要があり、腫瘍抗原のＤＣ交差提示を活性化して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞をプライミングする必要もある（例えば、Diamond et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):1989-2003；およびFuertes et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):2005-2016を参照）。
対照的に、Ｓ．チフィリウムなどの細菌の宿主監視は、主にＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５によって媒介される（例えば、Arpaia et al. (2011) Cell 144(5):675-688を参照）。これらのＴＬＲは、ＭｙＤ８８（骨髄分化一次応答タンパク質８８）およびＴＲＩＦ（Ｔｏｌｌ／インターロイキン－１受容体（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプター誘導インターフェロン－β）アダプター分子を介してシグナル伝達して、ＮＦ－κＢ依存的炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の誘導を媒介する（例えば、Pandey et al. (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7(1):a016246を参照）。Ｓ．チフィリウムは、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路を活性化し、カスパーゼ１の切断ならびにパイロトーシス細胞死をもたらす炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の誘導をもたらすことが示されている。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５のエンゲージメント、ならびにインフラマソーム活性化は、好中球およびマクロファージによる細菌の排除をもたらすケモカインおよびサイトカインを誘導する。Ｓ．チフィリウムがＴ細胞によって排除されるという証拠は、限定されており、それに対して生じた抗体は、非中和抗体である（例えば、McSorley (2014) Immunol. Rev. 260(1):168-182を参照）。さらに、Ｓ．チフィリウムは、Ｔ細胞機能を直接的に抑制する機序を有し、いかなる潜在的抗腫瘍Ｔ細胞応答が生じるのも妨害する（例えば、Kullas et al. (2012) Cell Host Microbe. 12(6)791-798を参照）。結果として、Ｓ．チフィリウムなどの細菌がん治療は、好中球およびマクロファージによる動員および排除をもたらし、これらは、抗腫瘍適応免疫を生じさせるのに必要なＴ細胞ではない。これらの違いによって、先行の細菌抗がんワクチンが、それらが宿主腫瘍抗原を保持している場合でも、ヒトにおけるＴ細胞プライミングベクターとして有効でない理由を説明できることが本明細書に記載されている。
これらの問題は、本明細書で提供する免疫刺激細菌によって対処される問題の一部である。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、以前にはウイルス性治療薬によってのみ提供されていた有利な特性を有し、細菌性治療薬の有利な特性も保持するように操作されている。本明細書で提供する細菌は、全身投与することができ、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞、および／または腫瘍微小環境に局在することができ、既存の全身免疫治療の自己免疫関連毒性も制限しながら、免疫抑制を克服し、抗腫瘍免疫を適切に活性化する。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍常在性免疫細胞に効果的に局在し、治療用抗がん産物をコードし、複数のそのような産物をコードすることができる。例えば、本明細書で提供する細菌は、相補的な治療用産物をコードすることができる。
効果的な適応免疫を誘導するウイルス様免疫応答を誘発しながら、細菌の有益な特性を保持するように操作された優れた微生物抗がんプラットフォームが本明細書で提供される。本明細書に記載のように、サルモネラ属および他の種の株などの細菌を、炎症作用が低減し、それゆえ毒性が減るように本明細書に記載されるように改変することができる。その結果、例えば、より高投薬量で投与することができる。当業者に知られており、かつ／または上記および本明細書に列挙されているサルモネラ属および細菌の他の種のこれらの株のいずれでも、本明細書に記載のように改変することができる。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境、腫瘍常在性免疫細胞、および腫瘍へのコロニー形成が増大するように改変されている。それらは、その毒性が低減し、腫瘍微小環境にそれらを向ける、アデノシン栄養要求性を含めた、他の特性を有するように操作されている。本明細書で提供する株は、それらが補体によって不活性化されないようにも操作されている。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、完全または切り詰め型または部分的な細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（受容体またはリガンド：例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）をコードする遺伝的ペイロードをデリバリーする抗がん治療用産物であって、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失または切り詰めによりＡＰＣに逆調節シグナル伝達できない、抗がん治療用産物が提供される。共刺激分子は、それらが、細胞膜中で正しい配向性で発現されることを確実にする残基（正の残基など）を切り詰められた細胞質ドメインに含むように、改変することもできる（下記の実施例は、これについてより詳細に記載している：例えば、実施例１９を参照）。
本明細書で提供する細菌の株は、治療用産物をデリバリーするように操作されている。本明細書の細菌株は、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子、ならびにＩ型ＩＦＮ発現を構成的に誘起または誘導することができる改変された機能獲得型細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーを含めた免疫刺激タンパク質、ならびに腫瘍微小環境内で抗腫瘍免疫応答を促進する他の治療用産物、限定されるものではないが、例えば、抗体およびその断片、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、２特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ（登録商標））、ＲＮＡｉ、およびこれらの相補的な組合せなどをデリバリーする。細菌株は、貪食細胞のパイロトーシスを低減し、それによって、より頑健な免疫応答を提供し、かつ／またはそれらが腫瘍、腫瘍微小環境、および腫瘍常在性免疫細胞内で、より効果的に増えるように、上皮細胞を感染／侵襲する能力を低減するか、もしくは無くすが、貪食細胞を感染／侵襲する能力を保持するゲノム改変も含む。細菌株は、また、ヒト血清中の補体因子による不活性化に抵抗性であるように改変されていてもよい。細菌株は、また、例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、Ｉ型ＩＦＮの構成的に活性な誘導物質、ならびに免疫チェックポイントに対する、およびまた、そのような他の標的に対するモノクローナル抗体（およびその断片）を、単独で、または組み合わせて含む治療用産物をコードするように改変されていてもよい。
Ｃ．治療指数を増大させ、腫瘍常在性骨髄性細胞内の蓄積を増大させるための免疫刺激細菌の改変および増強
腫瘍常在性骨髄性細胞内の蓄積を増大させること、補体不活性化に対する抵抗性を改善させること、免疫細胞死を低減すること、適応免疫を促進すること、およびＴ細胞機能を増強することなどによって、例えば、毒性を低減し、抗腫瘍活性を改善する細菌ゲノムまたは免疫刺激細菌への改変を含めた増強が本明細書で提供される。改変は、サルモネラ属、特にＳ．チフィリウムに関して記載され、当業者ならば他の細菌種および他のサルモネラ属株で類似の増強／改変を引き起こすことができるものと理解される。以下は、そのような増強／改変の例である。
１．ＬＰＳ生合成経路における遺伝子の欠失
グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）は、細菌膜の外葉の主要成分である。それは、リピドＡ、非反復性コアオリゴ糖、およびＯ抗原（またはＯ多糖）という３つの主要部分から構成されている。Ｏ抗原は、ＬＰＳの最も外部の部分であり、細菌の透過性に対する保護層として働くが、Ｏ抗原の糖組成は、株と株の間で広範に変化する。リピドＡおよびコアオリゴ糖は、それより変異幅が小さく、同じ種の複数の株の中で、より典型的に保存されている。リピドＡは、エンドトキシン活性を含有するＬＰＳの部分である。それは、典型的には、複数の脂肪酸で装飾された二糖である。これらの疎水性脂肪酸鎖が細菌膜中に入ってＬＰＳをつなぎ留めており、ＬＰＳの残部は、細胞表面から突出している。リピドＡドメインは、グラム陰性細菌の毒性の多くの原因となっている。典型的には、血液中のＬＰＳは、重大な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と認識されており、著明な炎症促進性応答を誘導する。ＬＰＳは、ＣＤ１４、ＭＤ２、およびＴＬＲ４を含む膜結合型受容体複合体のリガンドである。ＴＬＲ４は、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ経路を介してシグナル伝達して、ＮＦ－κＢ経路を刺激することができる膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６などの炎症促進性サイトカインの産生をもたらす。その帰結は、エンドトキシンショックでありえ、これは致命的であり得る。哺乳動物細胞の細胞質ゾル内にあるＬＰＳは、カスパーゼ４、５、および１１のＣＡＲＤドメインと直接的に結合することができ、自己活性化およびパイロトーシス細胞死をもたらす（例えば、Hagar et al. (2015) Cell Research 25:149-150を参照）。リピドＡの組成およびリピドＡ変異体の毒素産生性については、十分に記述されている。例えば、一リン酸化リピドＡは、複数のリン酸基を有するリピドＡよりも炎症性が低い。リピドＡ上のアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に著明な影響を有し得る。大腸菌由来の標準的なリピドＡは、６本のアシル鎖を有し、このヘキサアシル化が強力に毒性である。Ｓ．チフィリウムのリピドＡは、大腸菌のものと類似しており、それは、４本の第１ヒドロキシアシル鎖および２本の第２ヒドロキシアシル鎖を有するグルコサミン二糖である（例えば、Raetz et al. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71:635-700を参照）。
ａ．ｍｓｂＢ欠失
Ｓ．チフィリウムのｍｓｂＢ遺伝子によってコードされているリピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼという酵素は、リポ多糖（ＬＰＳ）のリピドＡドメインへの末端ミリストイル基の付加を触媒する（例えば、Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41を参照）。したがって、ｍｓｂＢの欠失は、グラム陰性細菌の外膜の主要構成成分であるＬＰＳのリピドＡドメインのアシル組成を変える。例えば、Ｓ．チフィリウムＶＮＰ２０００９株におけるｍｓｂＢの欠失は、天然のヘキサアシル化リピドＡより毒性が低い、主にペンタアシル化されたリピドＡの産生をもたらし、毒性ショックの誘導の無い全身デリバリーが可能となる（例えば、Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25を参照）。この改変は、敗血症性ショックを誘導するＬＰＳの能力を有意に低減し、細菌株を弱毒化し、それゆえ、サルモネラベースの免疫治療の治療指数を増大させる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、第２００３／０１０９０２６号、第２００４／０２２９３３８号、第２００５／０２５５０８８号、および第２００７／０２９８０１２号を参照）。重要なことに、ｍｓｂＢ産物を発現しないｍｓｂＢ突然変異体は、本明細書で例示するように（例えば、実施例２を参照）、細胞内で複製することができないが、これは、サルモネラ属の病原性の要件である（例えば、Leung et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11470-11474を参照）。
置換、欠失、または挿入を含めた、ＬＰＳ発現を変える他のＬＰＳ突然変異を、病原性を激減させ、それによって、毒性の低下をもたらし、より高用量の投与を可能にする、サルモネラ属株を含めた本明細書で提供する細菌株に導入することができる。
他の細菌種におけるリピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼの相同体またはオルソログをコードする対応遺伝子も、類似した結果を達成するように、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でミリストイル－アシルキャリアータンパク質依存的アシルトランスフェラーゼをコードするｌｐｘＭ；およびＳ．チフィでリピドＡアシルトランスフェラーゼをコードするｍｓｂＢを含む。
ｂ．ｐａｇＰ欠失
上述のように、Ｓ．チフィリウムのｍｓｂＢ突然変異体は、ＬＰＳの末端ミリストイル化を受けることができず、ヘキサアシル化されたリピドＡより有意に毒性が低い、主にペンタアシル化されたリピドＡを産生する。パルミチン酸によるリピドＡの改変は、リピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ（ＰａｇＰ）という酵素によって触媒される。ｐａｇＰ遺伝子の転写は、ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ系の制御下にあり、これは、マグネシウム濃度が低い状態、例えばＳＣＶ内の状態によって活性化される。したがって、Ｓ．チフィリウムのリピドＡのアシル含有量は、変動的であり、野生型細菌では、それは、ヘキサアシル化またはペンタアシル化されたものであり得る。Ｓ．チフィリウムがそのリピドＡをパルミトイル化する（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）能力は、ファゴリソソーム中に分泌される抗菌性ペプチドに対する抵抗性を増大させる。
野生型Ｓ．チフィリウムでは、ｐａｇＰの発現は、ヘプタアシル化されたリピドＡをもたらす。ｍｓｂＢ突然変異体（リピドＡの末端アシル鎖が付加できない突然変異体）では、ｐａｇＰの誘導がヘキサアシル化されたリピドＡをもたらす（例えば、Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038を参照）。ヘキサアシル化されたリピドＡは、最も炎症促進性であることが示されている。複数のグループが、例えばｐａｇＰを欠失または破壊して、ヘキサアシル化されたリピドＡのみの産生を可能にすることによって、この炎症促進性シグナルを活用しようとしているが（例えば、Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177；およびFelgner et al. (2018) Oncoimmunology 7(2):e1382791を参照）、これは、ＬＰＳのＴＮＦ－α媒介炎症促進性の性質により、乏しい抵抗性、および逆説的に、低下した適応免疫をもたらす可能性がある（例えば、Kocijancic et al. (2017) Oncotarget 8(30):49988-50001を参照）。
ＬＰＳは、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を誘導する強力なＴＬＲ４アゴニストである。１Ｅ９ ＣＦＵｓ／ｍ２でのＩ．Ｖ．ＶＮＰ２０００９臨床試験（例えば、Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照）における用量規制毒性は、２時間における血清中ＴＮＦ－αレベル＞１００，０００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－６レベル＞１０，０００ｐｇ／ｍｌで、サイトカイン媒介性であった（熱、低血圧）。ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢ欠失およびその発熱性の低減にもかかわらず、おそらくヘキサアシル化リピドＡの存在により、高用量では、ＬＰＳが依然として毒性であり得る。したがって、ヘキサアシル化リピドＡを産生することができず、ペンタアシル化リピドＡのみを産生し、その結果、炎症促進性サイトカインの誘導が低下している、ｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－株は、より高い用量でも忍容性が向上しており、１Ｅ９ ＣＦＵｓ／ｍ２以上でヒトで投与することが可能となる。より高い用量での投与は、腫瘍、腫瘍常在性免疫細胞、および腫瘍微小環境におけるさらなるコロニー形成をもたらし、免疫刺激細菌の治療有効性を増強する。結果として生じる、細菌の膜および構造の変化のため、全身投与の際に細菌が無くならないように、補体活性などの宿主免疫応答が変えられる。例えば、ｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－突然変異体株は、補体不活性化に対する抵抗性を増大させ、ヒト血清の安定性を増強していることが本明細書に示されている（例えば、実施例５を参照）。
ペンタアシル化リピドＡを有するＬＰＳのみを産生することができ、ｍｓｂＢ遺伝子の欠失を含有し、さらに、ｐａｇＰの欠失または破壊によって改変されている、Ｓ．チフィリウムの例示的な株など、生きている弱毒化サルモネラ属株によって例示される、免疫刺激細菌が本明細書で提供される。上に示したように、ｍｓｂＢ発現の欠失は、リピドＡの末端ミリストイル化を妨げ、一方、ｐａｇＰ発現の欠失は、パルミトイル化を妨げる。ペンタアシル化リピドＡを有するＬＰＳを産生するように改変された株は、腫瘍微小環境内で免疫応答を刺激する異種の遺伝的ペイロードを発現するようにさらに改変されたとき、炎症促進性サイトカインレベルの低下、血液中の安定性の改善、補体結合に対する抵抗性、抗菌性ペプチドに対する感受性の増大、忍容性の増強、および抗腫瘍免疫の増大をもたらす。
他の細菌種でリピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ（ＰａｇＰ）の相同体およびオルソログをコードする対応する遺伝子も、類似した結果を達成するように、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌で脂質ＩＶＡパルミトイルトランスフェラーゼをコードするｐａｇＰ；およびＳ．チフィで抗菌性ペプチド抵抗性およびリピドＡアシル化タンパク質をコードするｐａｇＰを含む。
２．栄養要求性
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、それらを、１または複数の必須栄養素、例えば、プリン（例えば、アデニン）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン）、アミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸、アルギニン、およびロイシン）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、または当技術分野で知られており、記載されている他の栄養素などについて栄養要求性にすることによって、弱毒化することができる。
ａ．ｐｕｒＩ欠失／破壊
ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼは、ｐｕｒＩ遺伝子（ｐｕｒＭ遺伝子と同義）によってコードされている酵素であり、プリンの生合成経路に関与している。したがって、ｐｕｒＩ遺伝子の破壊または欠失または不活性化は、細菌をプリンについて栄養要求性にする。弱毒化されていることに加えて、ｐｕｒＩ－突然変異体は、腫瘍環境中に濃縮され、有意な抗腫瘍活性を有する（例えば、Pawelek et al. (1997) Cancer Research 57:4537-4544を参照）。このコロニー形成が、腫瘍の急速な細胞ターンオーバーの結果として腫瘍の間質液に存在するプリンが高濃度であることの結果であることが以前に記載された。ｐｕｒＩ－細菌はプリンを合成することができないので、それらは、外部ソースのアデニンを必要とし、これにより、プリンが豊富な腫瘍微小環境中でそれらの制限増殖がもたらされるであろうと考えられた（例えば、Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225を参照）。ＶＮＰ２０００９株は、ｐｕｒＩ遺伝子の欠失を含有すると最初に報告されたが（例えば、Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine Vol. 90, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, pp. 47-59を参照）、後で行われたＶＮＰ２０００９の全ゲノム解析は、ｐｕｒＩ遺伝子が欠失しているのではなく、染色体逆位によって破壊されていることを実証した（例えば、Broadway et al. (2014) Journal of Biotechnology 192:177-178を参照）。全ｐｕｒＩ遺伝子が、挿入配列によって挟まれたＶＮＰ２０００９染色体の２つの部分の中に含有されており、挿入配列の１つは、活性のトランスポザーゼを有する。ｐｕｒＩ遺伝子の破壊により、複製が腫瘍組織／微小環境に限定されるが、それは、依然として細胞内複製および病原性を可能にしている。本明細書に例示するように（実施例２参照）、ｍｓｂＢ遺伝子およびｐｕｒＩ遺伝子の各々の欠失または破壊が、腫瘍組織内の細胞外間隙に増殖を限定し、細胞内複製を防ぐのに必要である。組み換えによる野生型へのいかなる可能な復帰変異も無くすために、これらの遺伝子のコーディング部分が完全に欠失している株が本明細書で提供される。
ｐｕｒＩ遺伝子欠失または破壊の他に、例えば、ａｒｏ、ｇｕａ、ｔｈｙ、ｎａｄ、およびａｓｄなど遺伝子内の欠失／突然変異によって、栄養素栄養要求性を免疫刺激細菌に導入することができる。これらの遺伝子を含む生合成経路によって産生される栄養は、宿主細胞内では利用できないことが多く、したがって、細菌の生存は困難である。例えば、サルモネラ属および他の細菌種の弱毒化は、糖分解を芳香族アミノ酸生合とつなげるシキミ酸経路の一部であるａｒｏＡ遺伝子の欠失によって達成することができる（例えば、Felgner et al. (2016) mBio 7(5):e01220-16を参照）。ａｒｏＡの欠失は、芳香族アミノ酸についての細菌の栄養要求性およびそれに続く弱毒化をもたらす（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、第２００３／０１７５２９７号、第２０１２／０００９１５３号、および第２０１６／０３６９２８２号；ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１５／０３２１６５号および第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。同様に、ａｒｏＣおよびａｒｏＤを含めた、芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する他の酵素が、弱毒化を達成するために欠失させられている（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６９２８２号；および国際出願公開第ＷＯ２０１６／０２５５８２号を参照）。例えば、Ｓ．チフィリウムのＳＬ７２０７株は、芳香族アミノ酸栄養要求体（ａｒｏＡ－突然変異体）であり、Ａ１およびＡ１－Ｒ株は、ロイシンアルギニン栄養要求体であり、ＶＮＰ２０００９／ＹＳ１６４６は、プリン栄養要求体（ｐｕｒＩ－突然変異体）である。本明細書に示されるように、ＶＮＰ２０００９／ＹＳ１６４６は、免疫抑制ヌクレオシドアデノシンについて、およびＡＴＰについて栄養要求性である（例えば、実施例１を参照）。
他の細菌種でホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ（ｐｕｒＩ）の相同体またはオルソログをコードする対応する遺伝子およびプリン合成に必要な他の遺伝子も、類似した結果を達成するように、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でホスホリボシルホルミルグリシンアミドシクロリガーゼをコードするｐｕｒＭ；Ｓ．チフィでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードするｐｕｒＭ；アデニロコハク酸シンセターゼをコードするｐｕｒＡ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩＩをコードするｐｕｒＱ、およびＬ．モノサイトゲネスでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼサブユニットｐｕｒＳをコードするｐｕｒＳ；ビフィドバクテリウム・ロンガムでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードするｐｕｒＭ（ＢＬ１１２２）；およびＡＩＲシンターゼをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５、およびクロストリジウム・ノービイでホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５（ｐｕｒＭ）を含む。
ｂ．アデノシン栄養要求性
トリプトファンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）／アデノシン経路に由来する代謝物質が、腫瘍／腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中に免疫抑制性環境を形成する際の主要なドライバーである。アデノシンは、細胞の内部および外部に遊離型で存在し、免疫機能のエフェクターである。アデノシンは、Ｔ細胞受容体によって誘導されるＮＦ－κＢの活性化を低減し、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＦＮ－γを阻害する。アデノシンは、Ｔ細胞細胞傷害性を低減し、Ｔ細胞アネルギーを増大させ、Ｆｏｘｐ３＋またはＬａｇ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔ－ｒｅｇ細胞、Ｔ－ｒｅｇｓ、またはＴｒｅｇｓ）へのＴ細胞分化を増大させる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上では、アデノシンは、ＩＦＮ－γ産生を低減し、ＮＫ細胞細胞傷害性を抑制する。アデノシンは、好中性接着および血管外漏出を遮断し、食作用を低減し、過酸化物および一酸化窒素のレベルを減弱する。アデノシンは、マクロファージ上でのＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびＭＩＰ－１α（ＣＣＬ３）の発現も低減し、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ発現を減弱し、ＩＬ－１０およびＩＬ－６のレベルを増大させる。アデノシンの免疫調節活性は、腫瘍の細胞外間隙へのその放出および標的免疫細胞、がん細胞、または内皮細胞の表面のアデノシン受容体（ＡＤＲ）の活性化の後に生じる。腫瘍微小環境中の高アデノシンレベルは、局所的免疫抑制をもたらし、それが、がん細胞を無くす免疫系の能力を限定する。
腫瘍間質細胞上に発現され、死細胞または瀕死の細胞から産生されるＡＴＰまたはＡＤＰのホスホヒドリシスによって協働してアデノシンを産生する膜結合エクトエンザイムＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、別名ＮＴＰＤａｓｅ１）およびＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）の逐次活性によって、細胞外アデノシンが産生される。ＣＤ３９が細胞外ＡＴＰ（またはＡＤＰ）を５’－ＡＭＰに変換し、それが、ＣＤ７３によってアデノシンに変換される。腫瘍微小環境の低酸素条件下で、内皮細胞上のＣＤ３９およびＣＤ７３の発現が増大し、それによって、アデノシンのレベルが増大する。腫瘍低酸素は、酸素のデリバリーを障害する不十分な血液供給および無秩序な腫瘍脈管構造から生じる得る（例えば、Carroll and Ashcroft (2005) Expert. Rev. Mol. Med. 7(6), DOI: 10.1017/S1462399405009117を参照）。低酸素は、腫瘍微小環境中に生じ、アデノシンをＡＭＰに変換するアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）も阻害し、非常に高い細胞外アデノシン濃度をもたらす。低酸素腫瘍微小環境中のアデノシンの細胞外濃度は、１０～１００μＭと測定されており、これは、最高約０．１μＭという典型的な細胞外アデノシン濃度よりも約１００～１０００倍高い（例えば、Vaupel et al. (2016) Adv. Exp. Med. Biol. 876:177-183；およびAntonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。腫瘍の低酸素領域は、微小血管から遠いので、腫瘍の一部の領域ではアデノシンの局所濃度が他より高くなる可能性がある。
免疫系を阻害する効果を指示するために、アデノシンは、がん細胞の増殖、アポトーシス、および血管新生に対する効果によってがん細胞の成長および播種を制御することもできる。例えば、アデノシンは、主にＡ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の刺激を介して、血管新生を促進することができる。内皮細胞上の受容体の刺激は、内皮細胞上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）およびＥ－セレクチンの発現を調節し、血管完全性を維持し、血管成長を促進することができる（例えば、Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。アデノシンによる様々な細胞上のＡ２Ａ、Ａ２Ｂ、またはＡ３のうちの１つまたは複数の活性化は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、またはアンジオポエチン２などの血管新生促進因子の産生を刺激することができる（例えば、Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。
アデノシンは、がん細胞上の受容体との相互作用を介して腫瘍細胞増殖、アポトーシス、および転移を直接的に調節することもできる。例えば、研究により、Ａ１およびＡ２Ａ受容体の活性化は、一部の乳がん細胞株における腫瘍細胞増殖を促進し、Ａ２Ｂ受容体の活性化は、結腸がん細胞におけるがん成長促進特性を有することが示されている（例えば、Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857を参照）。アデノシンは、がん細胞のアポトーシスを誘発することもでき、様々な研究は、この活性を、Ａ３を介した外因性アポトーシス経路またはＡ２ＡおよびＡ２Ｂを介した内因性アポトーシス経路の活性化と相関させている（例えば、Antonioli et al. (2013)を参照）。アデノシンは、細胞運動性、細胞外マトリックスへの接着、ならびに細胞付着タンパク質および受容体の発現を増大させて、細胞運動および運動性を促進することによって、腫瘍細胞遊走および転移を促進することができる。
刺激された免疫細胞、および損傷しているか、瀕死であるか、またはストレス下にある細胞から、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の細胞外放出が起こる。ＡＴＰのこの細胞外放出によって刺激されると、ＮＬＲファミリーパイリン領域含有３（ＮＬＲＰ３）インフラマソームがカスパーゼ１を活性化し、サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の分泌をもたらし、それらが、次いで、自然免疫応答および適応免疫応答を活性化する（例えば、Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358を参照）。ＡＴＰは、腫瘍組織中で、１００ｍＭ超の濃度まで蓄積することができ、一方、健常な組織中で見出されるＡＴＰのレベルは非常に低い（約１～５μＭ）（例えば、Song et al. (2016) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 310(2):C99-C114を参照）。ＡＴＰは、ＣＤ３９酵素およびＣＤ７３酵素によってアデノシンに異化される。活性化されたアデノシンは、ネガティブフィードバックメカニズムを介して、高度に免疫抑制的な代謝物質の働きをし、低酸素腫瘍微小環境中で、複数の免疫細胞型に対して多面的効果を有する（例えば、Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358を参照）。アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは、様々な免疫細胞上で発現され、アデノシンによって刺激されて、ｃＡＭＰによって媒介されるシグナル伝達の変化を促進し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の免疫抑制表現型をもたらす。その結果、ＣＤ７３などのエクトヌクレオチダーゼを過剰発現することが示されている、固形腫瘍などの病的組織では、アデノシンレベルがその正常濃度の１００倍超にまで蓄積し得る。アデノシンは、腫瘍血管新生および腫瘍形成を促進することも示されている。したがって、アデノシンについて栄養要求性である操作された細菌は、腫瘍ターゲティングおよびコロニー形成の増強を示すだろう。
サルモネラ・チフィなどの免疫刺激細菌は、例えば、ｔｓｘ遺伝子の欠失によって（例えば、Bucarey et al. (2005) Infection and Immunity 73(10):6210-6219を参照）、またはｐｕｒＤの欠失によって（例えば、Husseiny (2005) Infection and Immunity 73(3):1598-1605を参照）、アデノシンについて栄養要求性にすることができる。グラム陰性細菌イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）では、ｐｕｒＤ遺伝子ノックアウトが、アデノシンについて栄養要求性であることが示された（例えば、Park et al. (2007) FEMS Microbiol. Lett. 276:55-59を参照）。本明細書に例示されるように、Ｓ．チフィリウムのＶＮＰ２０００９株は、そのｐｕｒＩ改変により、アデノシンについて栄養要求性であり、それゆえ、それをアデノシンについて栄養要求性にするためのさらなる改変は必要ない。それゆえ、本明細書で提供する免疫刺激細菌株の実施形態は、アデノシンについて栄養要求性である。そのような栄養要求性細菌は、腫瘍微小環境で選択的に複製し、その結果、腫瘍内における、投与された細菌の蓄積および複製をさらに増大し、腫瘍内および周辺のアデノシンのレベルを低減し、それによって、アデノシンの蓄積によって引き起こされた免疫抑制を低減するか、または無くす。本明細書で提供するそのような細菌の例は、アデノシン栄養要求性をもたらすｐｕｒＩ－／ｍｓｂＢ－突然変異を含有するＳ．チフィリウムの改変された株である。他の株および細菌については、ＶＮＰ２０００９でされているように、ｐｕｒＩ遺伝子を破壊することができ、あるいは、それは、ｐｕｒＩ遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含有することができ、これは、野生型遺伝子への復帰変異が存在できないことを確実にする。本明細書のどこかに記載のように、ＶＮＰ２０００９株では、ｐｕｒＩ－遺伝子が逆位によって不活性化された。同様に、ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢ遺伝子は、完全には欠失されなかった。本明細書に例示のように、復帰変異のいかなるリスクも無くなるようにｐｕｒＩ遺伝子およびｍｓｂＢ遺伝子が完全に欠失されている株は、インビトロにおける培養物の成長によって評価した場合、優れた適応度を示す。
それらを、プリン（例えば、アデニン）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン）、アミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸、アルギニン、およびロイシン）、またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などの１または複数の必須栄養について栄養要求性にすることによって改変されている免疫刺激細菌が使用される。特に、Ｓ．チフィリウムの株など、本明細書で提供する免疫刺激細菌の実施形態では、細菌が、アデノシンについて栄養要求性にされており、かつＡＴＰについて栄養要求性にされていてもよく、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で優先的に増える。それゆえ、本明細書に記載の免疫刺激細菌の株は、それらが成長のためにプリン、アデノシン、および／またはＡＴＰを必要とし、それらが、下で論じるように、これらの代謝物質を豊富に有するＴＭＥに優先的にコロニー形成するので、弱毒化されている。一部の腫瘍の腫瘍微小環境中のアデノシン蓄積が免疫抑制性であるので、アデノシン栄養要求性は、特定のがんの腫瘍微小環境に蓄積するアデノシンから免疫抑制を無くす。
３．プラスミド維持およびデリバリー
ａ．ａｓｄ欠失
細菌のａｓｄ遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする。Ｓ．チフィリウムのａｓｄ－突然変異体は、細胞壁合成に必要であるジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）についての絶対的必要性を有し、ＤＡＰが枯渇した環境では溶解する。このＤＡＰ栄養要求性は、ａｓｄ遺伝子が細菌内のプラスミドでトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）補完される場合、抗生物質を使わずに、プラスミド選択およびインビボでのプラスミド安定性の維持に用いることができる。抗生物質ベースではないプラスミド選択系は、有利であり、１）有害症状が生じた場合に急速排除メカニズムとして投与される抗生物質の使用および２）通常は抗生物質の使用が避けられる場合における、抗生物質を用いない生産スケールアップを可能にする。ａｓｄ遺伝子相補性システムは、そのような抗生物質ベースではないプラスミド選択を提供する（例えば、Galan et al. (1990) Gene 94(1):29-35を参照）。腫瘍微小環境でプラスミドを維持するためのａｓｄ遺伝子相補性システムの使用は、免疫刺激タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子）；ＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３など、Ｉ型ＩＦＮを誘導する細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、およびその機能獲得型／構成的に活性な突然変異体；抗体およびその断片（例えば、チェックポイント阻害剤、または抗ＩＬ－６もしくは抗ＶＥＧＦ抗体）；２特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ（登録商標）という商標下で販売）；干渉ＲＮＡ；および本明細書にどこかで論じており、当技術分野で知られている他の治療用産物；ならびに以上の治療用産物の全ての相補的組合せなどの遺伝的ペイロード／治療用産物をコードするプラスミドをデリバリーするように操作されたＳ．チフィリウムの効力を増大すると予測される。
Ｓ．チフィリウムのａｓｄ突然変異体に代わる代替の使用は、自己融解株（または自殺株）を産生するＤＡＰ栄養要求性を、宿主腫瘍に持続的にコロニー形成する能力が無い感染細胞に治療用産物／高分子をデリバリーするのに活用することである。ａｓｄ遺伝子の欠失は、インビトロまたはインビボで増殖するとき、細菌をＤＡＰについて栄養要求性にする。本明細書に記載されている例は、ＤＡＰについて栄養要求性であり、ａｓｄ相補遺伝子を含有しない免疫調節性タンパク質のデリバリーに適したプラスミドを含有するａｓｄ欠失株を提供し、インビボでの複製を欠く株をもたらす。この株は、ＤＡＰの存在下でインビトロで繁殖し、正常に成長し、次いで、ＤＡＰが存在しない哺乳動物宿主に免疫治療剤として投与される。自殺株は、宿主細胞に侵入することができるが、哺乳動物組織におけるＤＡＰの不在により複製することができず、自動的に溶解して、その細胞質ゾル含有物（例えば、プラスミドまたはタンパク質）をデリバリーする。
他の細菌種でアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の相同体またはオルソログをコードする対応する遺伝子も、類似した結果を達成するように欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ；Ｓ．チフィでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ（ＳＴＹ４２７１）；Ｌ．モノサイトゲネスでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ（ｌｍｏ１４３７）；ビフィドバクテリウム・ロンガムでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするａｓｄ（ＢＬ０４９２）；およびクロストリジウム・ノービイでアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５（ａｓｄ）を含む。
ｂ．ｅｎｄＡ欠失／破壊
ｅｎｄＡ遺伝子（例えば、配列番号２５０を参照）は、グラム陰性細菌のペリプラズムで二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の分解を媒介するエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＩ：例えば、配列番号２５１を参照）をコードする。ｅｎｄＡ遺伝子の突然変異は、プラスミドＤＮＡの収率増大を可能にするので、実験室大腸菌の最も一般的な株は、ｅｎｄＡ－である。この遺伝子は、種の間で保存されている。無傷のプラスミドＤＮＡデリバリーを容易にするため、操作された免疫刺激細菌のｅｎｄＡ遺伝子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を防ぐため、欠失しているか、突然変異している。そのような突然変異の例には、Ｅ２０８Ｋアミノ酸置換（例えば、Durfee et al. (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606を参照）または目的の種の対応する突然変異がある。ｅｎｄＡは、残基Ｅ２０８を含めて、サルモネラ属を含めた細菌種の間で保存されている。したがって、Ｅ２０８Ｋ突然変異は、サルモネラ属種を含めた他の種でエンドヌクレアーゼ活性を無くすのに用いることができる。当業者ならば、ｅｎｄＡ活性を無くす他の突然変異または欠失を導入することができる。この突然変異を引き起こすか、またはこの遺伝子を欠失させるか、または破壊して、本明細書の免疫刺激細菌における、例えばサルモネラ属における、ｅｎｄＡの活性を無くすと、無傷のプラスミドＤＮＡデリバリーの効率が増大し、それによって、プラスミド上にコードされている任意の１種、または２種、または３種以上の免疫調節性タンパク質／治療用産物の発現を増大し、抗腫瘍免疫応答および抗腫瘍有効性を増強する。
４．フラゲリンノックアウト株
鞭毛は、時計回りまたは反時計回りで回転することができるフックを介して回転のモーターに付いている長いフィラメントで構成され、移動の手段を提供する細菌表面の細胞小器官である。鞭毛、例えば、Ｓ．チフィリウムの鞭毛は、胃腸管における粘膜層を通り抜ける運動性を媒介する能力により、走化性に、そして経口経路を介して感染を確立するために重要である。鞭毛は、インビトロでの腫瘍類円柱（ｔｕｍｏｒ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｓ）への走化性およびそのコロニー形成に必要であることが実証されており（例えば、Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209を参照）運動性は、腫瘍浸透に重要であることが示されているが（例えば、Toley and Forbes (2012) Integr. Biol. (Camb) 4(2):165-176を参照）、鞭毛は、細菌が静脈内に投与される場合、動物における腫瘍コロニー形成には必要ではない（例えば、Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456を参照）。各鞭毛フィラメントは、何万ものフラゲリンサブユニットで構成される。Ｓ．チフィリウム染色体は、ｆｌｉＣとｆｌｊＢの２つの遺伝子を含有し、これらは、抗原的に異なるフラゲリン単量体をコードする。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの欠損突然変異体は、経口感染経路を介して投与された場合には非運動性かつ非病原性であるが、非経口的に投与された場合には病原性を維持する。
フラゲリンは、サルモネラ属の主要な炎症促進性決定因子であり（例えば、Zeng et al. (2003) J. Immunol. 171:3668-3674を参照）、細胞表面のＴＬＲ５によって、そして細胞質ゾル中のＮＬＣＲ４によって直接的に認識される（例えば、Lightfield et al. (2008) Nat. Immunol. 9(10):1171-1178を参照）。両経路とも、炎症促進性応答をもたらし、その結果、ＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－６を含めたサイトカインの分泌が起こる。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢによってコードされているフラゲリンより大きな炎症を誘導するビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）のフラゲリンＢを分泌するように細菌を操作することによりフラゲリンに対する炎症促進性応答を増大させることによって、サルモネラベースのがん免疫治療をより強力にする試みがなされている（例えば、Zheng et al. (2017) Sci. Transl. Med. 9(376):eaak9537を参照）。
本明細書において、Ｓ．チフィリウムなどのサルモネラ属細菌は、フラゲリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠き、ＴＬＲ５媒介炎症促進性シグナル伝達を低減するように操作されている。同様にして、鞭毛を含有する他の細菌を、鞭毛を無くすように操作することができる。例えば、本明細書に示されるように、ＴＮＦ－アルファ誘導の低減をもたらす、ｍｓｂＢおよび／またはｐａｇＰの欠失があるサルモネラ属株が、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢノックアウトと組み合わせられる。これは、ＴＮＦ－アルファ誘導の低減とＴＬＲ５認識の低減とを併せ持つサルモネラ属株をもたらす。これらの細菌改変、すなわちｍｓｂＢ－、ｐａｇＰ－、ｆｌｉＣ－、およびｆｌｊＢ－を、免疫調節性タンパク質などの治療用産物を単独またはその組合せでコードする、ＣｐＧを含有していてもよい免疫刺激プラスミドと組み合わせることができる。生じる細菌は、炎症促進性シグナル伝達が低減しているが、頑健な抗腫瘍活性を有する。これらのゲノム改変は、本明細書にも記載されている他のゲノム改変と組み合わせることができる。
例えば、本明細書で例示され、提供されるように、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの二重突然変異体は、Ｓ．チフィリウムのａｓｄ欠失株であるＶＮＰ２０００９で構築した。ＶＮＰ２０００９は、ｐｕｒＩ／ｐｕｒＭの破壊により病原性について弱毒化されており、野生型リピドＡより毒素産生性が低いリピドＡサブユニットの産生をもたらすｍｓｂＢ遺伝子の改変（部分的な欠失）を含有する。これは、マウスモデルにおいて、静脈内投与の後、野生型リピドＡを有する株と比較して低減したＴＮＦ－α産生をもたらす。生じる株は、ＴＬＲ２／４シグナル伝達を低減するリピドＡの改変ならびにＴＬＲ５認識およびインフラマソーム誘導を低減するフラゲリンサブユニットの発現の欠失によって、細菌性炎症について弱毒化されている株の例である。
Ｓ．チフィリウムなどのサルモネラ属種を含めた特定の細菌種の病態形成には、サルモネラ病原島（ＳＰＩ）と称する一群の遺伝子が関与している。サルモネラ属は、宿主細胞の細胞質ゾルにエフェクタータンパク質を直接的に注入する針状構造を形成する、サルモネラ病原島１（ＳＰＩ－１）によってコードされている３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）を用いて、非貪食性腸上皮細胞に侵入する。これらのエフェクタータンパク質は、真核細胞細胞骨格の再編成を引き起こして、腸上皮の侵入を容易にし、炎症誘発性サイトカインも誘導する。ＳＰＩ－１と称されるＳＰＩは、上皮細胞への侵入を媒介する。ＳＰＩ－１遺伝子は、限定されるものではないが、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰを含む。これらの遺伝子の１つまたは複数の欠失は、細菌が上皮細胞を感染する能力を低減するか、または無くすが、細菌が、貪食免疫細胞を含めた貪食細胞を感染させるか、またはそれらに侵入する能力には影響を及ぼさない。例えば、ｆｌｉＣ遺伝子とｆｌｊＢ遺伝子の両方の欠失は、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＦ、およびｓｏｐＢなどのＳＰＩ－１遺伝子の発現を有意に低減し、それによって非貪食細胞に侵入する能力を低減したことが実証された（例えば、Elhadad et al. (2015) Infect. Immun. 83(9):3355-3368を参照）。
サルモネラ属などの細菌では、ＳＰＩ－１ ３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）に加えて、フラゲリンが、マクロファージでパイロトーシスを誘発するのに必要であり、マクロファージＮＬＲＣ４インフラマソームによって検出される可能性がある。フラゲリンサブユニットの除去は、マクロファージのパイロトーシスを低減する。例えば、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの欠失を有するＳ．チフィリウムは、野生型株に比べて、ＩＬ－１β分泌が有意に低減しているが、細菌の細胞取り込みおよび細胞内複製は影響を受けないままである。これは、フラゲリンが、インフラマソーム活性化で有意な役割を果たしていることを示している。加えて、ｆｌｉＣを構成的に発現するように操作されたＳ．チフィリウム株は、マクロファージパイロトーシスを誘導することが見出された（例えば、Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447；Fink and Cookson (2007) Cellular Microbiology 9(11):2562-2570；およびWinter et al. (2015) Infect. Immun. 83(4):1546-1555を参照）。
本明細書における免疫刺激細菌のゲノムは、Ｓ．チフィリウムにおけるフラゲリン遺伝子ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠失させるか、突然変異させ、マクロファージなどの腫瘍常在性免疫細胞の細胞死の低減をもたらし、免疫刺激細菌の抗腫瘍免疫応答を増強するように改変されていてもよい。ＬＰＳの改変と合わせて、フラゲリンサブユニットの欠失は、宿主における忍容性の増大を可能にし、取り込みを貪食細胞のみに限定し、それらのパイロトーシス細胞死を低減し、免疫刺激性応答を、ＴＭＥ、特に腫瘍常在性骨髄性細胞への免疫調節性タンパク質などの治療用産物のデリバリーへと方向付ける。生じる免疫刺激細菌は、抗腫瘍応答を誘発し、腫瘍に対する適応免疫応答を促進する。
他の細菌種でフラゲリンをコードする対応する遺伝子も類似した結果を達成するように欠失させることができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌で鞭毛フィラメント構造タンパク質をコードするｆｌｉＣ、および鞭毛基底小体タンパク質ＦｌｉＥをコードするｆｌｉＥ；Ｓ．チフィでフラゲリンをコードするｆｌｉＣ、および鞭毛基底小体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードするｆｌｇＢ；Ｌ．モノサイトゲネスでフラゲリンをコードするｆｌａＡ、鞭毛フック基盤体タンパク質ＦｌｉＥをコードするｆｌｉＥ、および鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードするｆｌｇＢ；ならびにクロストリジウム・ノービイでフラゲリンをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５、鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０（ｆｌｇＢ）、鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＣをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５（ｆｌｇＣ）、ならびに鞭毛基盤体ロッドタンパク質ＦｌｇＧをコードするＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５（ｆｌｇＧ）を含む。
５．適応免疫を促進し、Ｔ細胞機能を増強する細菌操作
Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）欠失／破壊
Ｌ－アスパラギナーゼＩＩは、Ｌ型アスパラギンからアンモニアおよびアスパラギン酸への変換を触媒する酵素である。大腸菌およびＳ．チフィリウムなどのいくつかの細菌株は、フルクトース－アスパラギンを炭素および窒素源として捕捉するのにＬ－アスパラギナーゼを利用する（例えば、Sabag-Daigle et al. (2018) Appl. Environ. Microbiol. 84(5):e01957-17を参照）。急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるものなど、悪性Ｔ細胞は、アスパラギンを合成する酵素をそれらが失っているので、アスパラギンを必要とする。Ｌ－アスパラギナーゼの投与は、１９７０年代初期以降、ＡＬＬのためのフロントライン治療とされてきた（例えば、Batool et al. (2016) Appl. Biochem. Biotechnol. 178(5):900-923を参照）。Ｓ．チフィリウムによるＬ－アスパラギナーゼＩＩの産生は、それが直接的にＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の下方制御を誘導し、Ｔ細胞サイトカイン産生を低減し、腫瘍細胞溶解機能を阻害するので、Ｔ細胞抑制に必要かつ十分である（例えば、Kullas et al. (2012) Cell Host Microbe. 12(6)791-798；およびvan der Velden et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(49):17769-17774を参照）。腫瘍微小環境におけるＴ細胞活性化中に生じるものなど、急速なクローン増殖条件下では、アスパラギンが必要とされ、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩによるその枯渇は、Ｔ細胞抑制をもたらす。したがって、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩは、Ｔ細胞抑制が治療のモダリティーであるがんの抗がん治療薬として用いられてきた。
抗がん治療薬としてのＬ－アスパラギナーゼの先行使用とは対照的に、本明細書で提供する免疫刺激細菌のＬ－アスパラギナーゼ活性の除去は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を増強することが本明細書で示される。Ｌ－アスパラギナーゼ活性の除去は、活性酵素の発現を無くすように細菌ゲノムを改変することによって引き起こすことができる。改変には、生じるコードされている酵素が活性でないか、または発現されないか、または無くなっているような、核酸の挿入、欠失、逆位、および置換が含まれる。免疫刺激細菌におけるコードされている酵素の発現を無くすような、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子ａｎｓＢの全てもしくは一部の欠失またはその破壊は、細菌によってコロニー形成された腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を増強することが本明細書で示される。Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ活性の抑制は、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩがそれにより産生されないような、免疫刺激細菌内のａｎｓＢ遺伝子の全てまたは一部の欠失または中断／破壊によって達成される。したがって、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩが産生されないようにそのゲノムが改変されている免疫刺激細菌が提供される。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、腫瘍常在性免疫細胞にコロニー形成して、抗腫瘍免疫応答を増強するために使用され、このようなゲノム改変には、欠失、挿入、破壊、および／またはＬ－アスパラギナーゼＩＩの発現を無くす他の改変が含まれる。
本明細書で示すように、本明細書における免疫刺激細菌のゲノムは、ａｎｓＢを欠失させるか、もしくはそれを破壊するか、もしくはそれを別途に改変するか、またはコードされているＬ－アスパラギナーゼＩＩを不活性にするか、またはアスパラギナーゼを無くし、その結果、インビボでＴ細胞抑制を妨げ、抗腫瘍Ｔ細胞機能を増強するように改変することができる。ａｎｓＢが無傷である株は、その株に感染したＴ細胞における著明なＴ細胞免疫抑制を誘導することが本明細書で示される。ａｎｓＢが欠失している株は、免疫抑制を誘導せず、したがって、コードされている治療用産物を腫瘍にデリバリーするために細菌を用いる際の、当技術分野における別の問題を解決する。したがって、機能的なコードされた酵素がそれにより発現されないａｎｓＢ遺伝子の欠失または破壊と、腫瘍微小環境中および／または腫瘍常在性免疫細胞中の蓄積の増大をもたらす本明細書に記載の他の改変とを組み合わせた免疫刺激細菌は、優れた治療用免疫刺激細菌を提供する。
他の細菌種でＬ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）の相同体またはオルソログをコードする対応する遺伝子も、類似した結果を達成するように欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でＬ－アスパラギナーゼ２をコードするａｎｓＢ；Ｓ．チフィでＬ－アスパラギナーゼをコードするａｎｓＢ（ＳＴＹ３２５９）；Ｌ．モノサイトゲネスでアスパラギンシンセターゼをコードするａｎｓＢ（ｌｍｏ１６６３）；およびビフィドバクテリウム・ロンガムでＬ－アスパラギナーゼ前駆体をコードするＢＬ１１４２を含む。
６．ｃｕｒｌｉ線毛発現に必要とされるサルモネラ属遺伝子の欠失／破壊
細菌および真菌は、バイオフィルムと呼ばれる多細胞構造を形成することができる。細菌のバイオフィルムは、集合的に細胞外ポリマー物質として知られている分泌型および細胞壁結合型の多糖、糖タンパク質、および糖脂質、ならびに細胞外ＤＮＡの混合物中に包まれている。これらの細胞外高分子物質は、複数の侵襲、例えば洗浄剤、抗生物質、および抗菌性ペプチドなどから細菌を保護する。細菌のバイオフィルムは、表面のコロニー形成を可能にし、義装具、例えば注入ポートおよびカテーテルなどの重大な感染の原因である。バイオフィルムは、組織中にも、感染の過程で形成することがあり、それにより、細菌の持続期間および排出期間が増大し、抗生物質療法の実効性が限定される。バイオフィルム中の細菌の慢性的持続は、例えば胆嚢のＳ．チフィ感染における腫瘍発生の増大と関連している（例えば、Di Domenico et al. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887を参照）。
Ｓ．チフィリウムなどのサルモネラ属において、バイオフィルム形成は、ｃｓｇＤによって調節されており、ｃｓｇＤは、ｃｓｇＢＡＣオペロンを活性化し、ｃｕｒｌｉ線毛サブユニットＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの産生を増大させる（例えば、Zakikhany et al. (2010) Molecular Microbiology 77(3):771-786を参照）。ＣｓｇＡは、ＴＬＲ２によりＰＡＭＰとして認識され、ヒトマクロファージからのＩＬ－８の産生を誘導する（例えば、Tukel et al. (2005) Molecular Microbiology 58(1):289-304を参照）。また、ｃｓｇＤは、ジグアニル酸シクラーゼをコードするａｄｒＡ遺伝子を活性化することによりセルロース産生を間接的に増大させる。ａｄｒＡによって生成される小分子である環状ジグアノシン一リン酸（ｃ－ジ－ＧＭＰ）は、ほとんどすべての細菌種に存在する遍在的な二次メッセンジャーである。ｃ－ジ－ＧＭＰの増加は、セルロースシンターゼ遺伝子ｂｃｓＡの発現を増強し、これが次に、ｂｃｓＡＢＺＣおよびｂｃｓＥＦＧオペロンの刺激を介して、セルロース産生を増大させ、セルロースバイオフィルム形成をもたらす。その結果、Ｓ．チフィリウムなどの細菌は、宿主免疫細胞による食作用からの保護として固形腫瘍中でバイオフィルムを形成することができる。バイオフィルムを形成することができない、サルモネラ属突然変異体などの細菌突然変異体は、宿主貪食細胞によって、より急速に取り入れられ、より容易に感染腫瘍から排除される（例えば、Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233を参照）。貪食細胞内の細胞内局在のこの増大は、細胞外細菌の持続を低減することができ、本明細書に示するように、本明細書に記載の免疫調節性タンパク質および他の抗がん治療薬などの治療用産物のプラスミドデリバリーの実効性を増強することができる。Ｓ．チフィリウムなどの免疫刺激細菌がバイオフィルムを形成する能力の低減は、例えば、ｃｓｇＤ、ｃｓｇＡ、ｃｓｇＢ、ａｄｒＡ、ｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＺ、ｂｃｓＥ、ｂｃｓＦ、ｂｃｓＧ、ｄｓｂＡ、またはｄｓｂＢなど、バイオフィルム形成に関与する遺伝子の欠失または破壊を介して達成することができる（例えば、Anwar et al. (2014) PLoS ONE 9(8):e106095を参照）。
バイオフィルム形成を低減するように免疫刺激細菌を操作すると、腫瘍／組織からの排除率が増大し、それにより療法の忍容性が増大し、患者における義装具のコロニー形成が防止され、それによって、これらの株の治療効果が増大することが本明細書で示される。アデノシンミメティックは、Ｓ．チフィリウムバイオフィルム形成を阻害することが知られており、これは、腫瘍微小環境中の高アデノシン濃度が、腫瘍関連のバイオフィルム形成に貢献し得ることを示している（例えば、Koopman et al. (2015) Antimicrob. Agents Chemother. 59:76-84を参照）。ｃｓｇＤ欠失株は、腫瘍常在性骨髄性細胞内への細菌の取り込みが増大しているため、改善された抗腫瘍有効性を示すことが本明細書で示される。
他の細菌種における、ｃｓｇＤの相同体およびオルソログをコードする対応する遺伝子、ならびにｃｕｒｌｉ線毛およびバイオフィルム形成に必要とされる他の遺伝子も、類似した結果を達成するように欠失させるか、破壊するか、別途に改変することができる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、例えば、大腸菌でＤＮＡ結合転写二重調節因子ＣｓｇＤをコードするｃｓｇＤ；Ｓ．チフィで調節タンパク質ＣｓｇＤをコードするｃｓｇＤ（ＳＴＹ１１７９）；およびＬ．モノサイトゲネスで、バイオフィルム形成に関与するリステリア属セルロース結合タンパク質をコードするｌｃｐを含む。
細菌ゲノムの、例えば、細菌をｃｓｇＤ－にする遺伝子欠失または破壊による改変は、ｃｕｒｌｉ線毛および炎症性環状ジヌクレオチド（ＣＤＮｓ）を無くし、セルロース分泌を取り除く。これは、炎症性および免疫抑制エレメントを無くし、ＬＰＳアシル化の変化を介してＴＬＲ４認識を妨げ、セルロース分泌と、それゆえ、潜在的バイオフィルム形成とを無くし、それによって、安全性および有効性を増大させる。
本明細書に記載のように、アデノシンについて栄養要求性となるように操作され；かつＬＰＳの改変および／またはフラゲリンの欠失により、炎症促進性サイトカインを誘導するそれらの能力が低減しており；かつ／またはＴ細胞機能を改善するようにＬ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず；かつ／またはバイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失を含有し；かつ／または抗生物質選択無しに、細胞あたりのプラスミドコピー数を、少なくとも低コピー数から中程度コピー数以上の相当数に維持するようにさらに改変されており、かつ治療用産物をコードする遺伝的発現カセットをデリバリーする、細菌株、例えばＳ．チフィリウム株などは、頑健な抗腫瘍免疫応答を促進する。プラスミドは、腫瘍微小環境中への、コードされている治療用産物の分泌を促進する調節配列を含む。
７．補体に対する抵抗性の改善
補体系は、ヒト宿主内のレクチン経路または代替経路（ＡＰ）カスケードを直接的に活性化する病原体の侵入に対する免疫防御の第一線である。補体系は、自然免疫応答において、細菌、ウイルス感染細胞、および寄生虫などの病原体を認識し、殺滅する機能を果たし、抗体媒介性免疫応答でも一役担う３０種を超える可溶性および細胞膜結合型のタンパク質を含む。補体カスケードの活性化は、外来微生物のオプソニン化および走化性ペプチドの放出をもたらし、最後に細菌細胞膜の破壊をもたらす。補体系（Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５）の３つの相同糖タンパク質が、補体機能における中心役割を果たし、他の補体成分と相互作用する。Ｃ３およびＣ４からそれぞれ生じるＣ３ｂおよびＣ４ｂは、補体カスケードの活性化を促進するコンバターゼの重要な成分である。Ｃ５の切断断片が、感染部位内への貪食細胞の遊走を誘導するＣ５ａ、ならびに膜侵襲複合体の形成および溶菌を開始するＣ５ｂである（例えば、Ramu et al. (2007) FEBS Letters 581:1716-1720を参照）。
生き残るために、病原体は、補体活性化の有害な結果を防ぐ戦略を発達させた。例えば、外膜タンパク質のＡｉｌ／Ｌｏｍファミリーのメンバーは、補足依存的な殺滅からの保護をいくつかの病原細菌に提供する。エルシニア属種、例えば、Ｙ．エンテロコリチカおよびＹ．シュードツベルクローシスのＡｉｌ（付着浸潤遺伝子座）、サルモネラ属種のＲｃｋ（補体殺傷耐性）およびＰａｇＣ、ならびに大腸菌のＯｍｐＸを含めた、Ａｉｌ／Ｌｏｍファミリーのメンバーは、有意なアミノ酸配列類似性および同一性を共有し、類似した膜トポロジーを有する外膜タンパク質である。タンパク質のこのファミリーのメンバーが多様な機能を示す一方、Ｙ．エンテロコリチカおよびＹ．シュードツベルクローシスのＡｉｌ、ならびにＳ．エンテリカのＲｃｋを含めた、それらのうちいくつかは、少なくとも部分的に、細菌を補体媒介溶解から保護する機能を果す、（例えば、Bartra et al. (2008) Infection and Immunity 76:612-622を参照）。
補体を回避または緩和するのを助ける別の細菌産物は、サルモネラ属におけるＰｇｔＥ（外膜セリンプロテアーゼ）と称される表面プロテアーゼ、およびオムプチン（ｏｍｐｔｉｎ）ファミリーの他のメンバーである。Ｓ．エンテリカの表面プロテアーゼＰｇｔＥは、腸内細菌の外膜アスパラギン酸プロテアーゼのオムプチンファミリーに属する。ＰｇｔＥおよび他のオムプチンは、活性であるためにラフ型ＬＰＳを必要とするが、Ｏ抗原による立体阻害を受ける。ｐｇｔＥの発現は、マクロファージ内部におけるサルモネラ属の成長中に上方制御され、マクロファージから放出された細菌は、強いＰｇｔＥ媒介タンパク質分解活性を示す。ＰｇｔＥは、哺乳動物の血漿中酵素前駆体であるプラスミノゲンをタンパク分解性に活性化してプラスミンにし、プラスミンの主な生理的阻害剤であるα２抗プラスミン因子を不活性化し、ヒト細胞の細胞外マトリックスへの細菌接着を媒介する。このように、ＰｇｔＥは細胞外マトリックス成分の分解を媒介して、強力な局在性タンパク質分解活性を生じさせ、これにより、細胞外マトリックスを通り抜けるサルモネラ属の遊走を促進することができる。ＰｇｔＥは、アルファヘリックス抗菌ペプチドも分解し、これは、サルモネラ属の細胞内成長中に重要である可能性がある。エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のオムプチンであるＰｌａは、ＰｇｔＥの近いオルソログであり、ＰｇｔＥと機能を共有している。ＰｌａはＣ３を切断し、ＰｇｔＥは、補体成分Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、およびＣ５を切断することによって、サルモネラ属の血清抵抗性を増大する。ｐｇｔＥ遺伝子および他の細菌種由来のそのオルソログは、補体に対する抵抗性を増大させるための、本明細書における免疫刺激細菌に含めることができる。
ヒト血清中の補体の効果は、げっ歯類モデルで効果的に腫瘍にコロニー形成することが示されていたサルモネラ属ＶＮＰ２０００９株など、治療用免疫刺激細菌の失敗を説明することが本明細書で示される。ＶＮＰ２０００９の全身投与は、マウス腫瘍のコロニー形成をもたらしたが（例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；およびBermudes et al. (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:219-33を参照）、ヒト患者におけるＶＮＰ２０００９の全身投与は、ごくわずかなコロニー形成しかもたらさなかった。進行黒色腫患者の第１相研究において、３０分の静脈内注入の後、ヒト腫瘍では、ごくわずかなＶＮＰ２０００９しか検出されなかった（Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:142-52参照）。さらに長い４時間にわたるＶＮＰ２０００９の注入を評価するフォローアップ研究に参加した患者も、腫瘍生検の後に、検出可能なＶＮＰ２０００９の不在を示した（Heimann et al. (2003) J. Immunother. 26:179-180参照）。腫瘍内投与の後、ＶＮＰ２０００９の派生株のコロニー形成が検出された（Nemunaitis et al. (2003) Cancer Gene Ther. 10:737-744参照）。ヒト腫瘍へのＶＮＰ２０００９の直接腫瘍内投与は、はるかに高い腫瘍コロニー形成をもたらした。これは、ヒト腫瘍に高レベルでコロニー形成させることができること、およびマウスとヒトの間での腫瘍コロニー形成の相違は、全身投与後にのみ生じることを示している。
野生型Ｓ．チフィリウムで起こることが以前には知られていなかったが、ＶＮＰ２０００９は、ヒト補体によって不活性化され、これが、ＶＮＰ２０００９の全身投与の際にヒトで観察された腫瘍コロニー形成の低さを説明することが本明細書で示され、記載されている。本明細書で提供する株は、補体に対する抵抗性を示す。それらの株は、Ｒｃｋおよび補体抵抗性または補体回避の媒介に関与する他のタンパク質、例えばエルシニア・エンテロコリチカのＡｉｌまたはサルモネラ・チフィリウムのＰｇｔＥなどを発現するように改変されているか、またはそのようなタンパク質をそれらの株が天然に発現する場合、それらの株が、Ｒｃｋおよび／または他のそのようなタンパク質を過剰発現するように改変されていてもよい。Ｒｃｋは、大腸菌など、相同体が無い細菌に導入してもよい。
Ｒｃｋ発現
Ｒｃｋ（補体殺傷耐性）は、Ｓ．エンテリティディスおよびＳ．チフィリウムなどのサルモネラ属種の大きな病原性プラスミドによってコードされている、上皮細胞への接着および侵入を誘導する１７ｋＤａの外膜タンパク質である。Ｒｃｋタンパク質は、Ｃ９重合およびその後の機能的膜侵襲複合体の構築を阻害することによって、Ｓ．エンテリカを補体から保護することが示されている。ｒｃｋ突然変異体は、野生型株に比べて、２～３倍の上皮細胞侵入の低減を示したが、野生型でのｒｃｋ過剰発現は侵入の増大をもたらす。Ｒｃｋタンパク質は、受容体介在性の過程、局所的アクチンリモデリングの促進、ならびに弱い接着性および密接な接着性を有する膜伸展（ｗｅａｋ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）により細胞侵入を誘導する。したがって、サルモネラ属は、Ｔ３ＳＳ－１複合体に媒介されるトリガー（Ｔｒｉｇｇｅｒ）メカニズムおよびｒｃｋによって誘導されるジッパー（Ｚｉｐｐｅｒ）メカニズムという２つの異なったメカニズムにより細胞に侵入することができる（例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364を参照）。サルモネラ属病原性プラスミド上のｒｃｋの発現は、膜侵襲複合体の形成を妨げることによって、ヒト補体による中和に対する高レベルの抵抗性を与える。ｒｃｋを含有するＳ．チフィリウム病原性プラスミドを大腸菌の高度に血清感受性の株で発現させたとき、Ｒｃｋは、補体抵抗性を回復させることができた。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ヒト補体に対する抵抗性をもたらすようにＲｃｋを保持するか、またはＲｃｋが提供されている。大腸菌などの免疫刺激細菌は、細菌内のプラスミド上にｒｃｋをコードして、それによって補体に対する抵抗性をもたらすことによって改変することができることが本明細書で示される。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、ｒｃｋを内因的にコードするか、または補体に対する抵抗性を増大するためにそれをコードするように改変することができる。補体に対する抵抗性を与えるための方法も提供される。例えば、米国特許出願公開第２０１８／０３２５９６３号および第２０１８／０２７３９５６号、ならびに米国特許第９，８８９，１６４号および第９，６８８，９６７号に記載の治療用大腸菌種を、その中の細菌を改変することによって、例えば、その中のプラスミド上にサルモネラ属ｒｃｋ遺伝子をコードする核酸を導入して、それによって補体に対する抵抗性を改善または提供することによって、改善することができる。補体に対して抵抗性である細菌を全身投与することができ、治療上有効であるのに十分な細菌が生き残ることができる。サルモネラ属ｒｃｋ遺伝子をコードする核酸を、治療用大腸菌などの細菌に導入して、それによって補体抵抗性を与えるか、または増大させる。
同様に、他の細菌種由来の、ｒｃｋの他のオルソログおよび相同体を、免疫刺激細菌内で発現させることができる。例えば、Ａｉｌは、エルシニア・エンテロコリチカ由来のＲｃｋ相同体であり、これは、異種発現下で補体抵抗性を増強する。ＰｇｔＥは、異種発現下で補体抵抗性を増強することが同じく示されている、Ｓ．チフィリウムの表面プロテアーゼである。
８．サルモネラ属および他のグラム陰性細菌におけるリポタンパク質発現に必要とされる遺伝子の欠失
ＬＰＳおよびブラウン（ムレイン）リポタンパク質（Ｌｐｐ）は、炎症および免疫応答の強力な刺激物質として機能する、グラム陰性腸内細菌の外膜の主要構成成分である。ブラウン（ムレイン）リポタンパク質（Ｌｐｐ）は、Ｓ．チフィリウムの外膜で最も豊富な成分の１つであり、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－６、およびＩＬ－８（ヒト）などのＴＬＲ２誘導をもたらす。サルモネラ属の細菌染色体上に位置する、リポタンパク質遺伝子の２つの機能的コピー［ｌｐｐＡ（配列番号３８７）およびｌｐｐＢ（配列番号３８８）］が細菌の病原性に寄与する。ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子の欠失、ならびにリポタンパク質発現の除去は、病原性を低減し、炎症促進性サイトカイン産生を低減する（例えば、Sha et al. (2004) Infect. Immun. 72(7):3987-4003；Fadl et al. (2005) Infect. Immun. 73(2):1081-1096を参照）。Ｌｐｐ遺伝子の欠失は、細胞の感染を低減し、それゆえ、コードされている治療用産物またはタンパク質のプラスミドデリバリーおよび発現を低減することが予測されるだろう。しかし、下記の実施例１８に示すように、これらの遺伝子の欠失が腫瘍コロニー形成を低減する一方、標的とされた細胞、すなわち、腫瘍常在性免疫細胞、特にマクロファージにデリバリーされるプラスミドの量は有意に増大した。したがって、これらの遺伝子（ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ）の欠失または破壊は、本明細書で示されるように、感染マクロファージ内で生き残る能力が無いことにより、病原性の低減をもたらしたが、免疫刺激細菌のプラスミドデリバリーの増大をもたらし、それによって、標的とされた細胞、すなわち、腫瘍常在性免疫細胞、特にマクロファージにおいて、コードされた治療用遺伝子の発現を増大させた。
９．抗腫瘍療法用に最適化されるようにゲノムが改変されており、複数を含む治療用産物をコードする頑健な免疫刺激細菌
本明細書に記載のように、栄養要求性アデノシンであるように操作されており、かつＬＰＳの改変および／またはフラゲリンの欠失により、それらが炎症促進性サイトカインを誘導する能力が低減しており、かつ／またはＬ－アスパラギナーゼＩＩ発現の欠失または除去によりＴ細胞機能を改善するように改変されており、かつ／またはバイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失または破壊により改変されており、かつ／またはｒｃｋ発現の増大により増強されたヒト血清中生存を示す細菌株、例えばＳ．チフィリウム株などは、免疫調節性タンパク質などの治療用産物をデリバリーし、頑健な抗腫瘍免疫応答を促進するようにさらに改変されている。
下の表は、細菌の遺伝子型／改変、それらの機能効果、および本明細書で達成される効果／利点のいくつかの概要を示す。
Figure 2023501539000007
本明細書で提供する株は、ΔＦＬＧ、および／またはΔｐａｇＰ、および／またはΔａｎｓＢ、および／または、ΔｃｓｇＤである。加えて、株は、ΔｐｕｒＩ（ΔｐｕｒＭ）、ΔｍｓｂＢ、およびΔａｓｄ（細菌ゲノム）のうちの１つまたは複数である。特に、株は、ΔｐｕｒＩ（ΔｐｕｒＭ）、ΔｍｓｂＢ、ΔｐａｇＰ、およびΔａｎｓＢ、ならびにΔａｓｄである。株は、ｌｐｐＡ－および／またはｌｐｐＢ－、特にｌｐｐＡ－／ｌｐｐＢ－でもよい。プラスミドは、宿主に認識されるプロモーター（例えば、真核生物および動物ウイルスに由来するものを含めた真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターなど）の制御下に治療用産物をコードするように改変されている。プラスミドは、本明細書のどこかに記載のように、インビボでの細菌複製を可能にするようにａｓｄをコードすることができ、他の有益な機能を有する核酸（ＣｐＧなど）をコードすることができ、遺伝子産物をコードすることができる。
本明細書で提供する免疫刺激細菌は、例えば鞭毛を無くすことによって、上皮細胞を感染させる能力を無くすように改変することができる。本明細書のどこかに記載のように、上皮細胞を感染させる能力を無くすことは、ＳＰＩ－１経路に関与する１つまたは複数の遺伝子の不活性化またはノックアウトを介して、ＳＰＩ－１依存的な侵入を不活性化することによって達成することもできる。これらの遺伝子は、限定されるものではないが、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰの１つまたは複数を含む。追加または代替として、免疫刺激細菌は、ｆｌｊＢ、ｆｌｉＣ、ｒｃｋ、ｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢ、およびｓｒｇＣ遺伝子のうちの１つまたは複数などの、ＳＰＩ－１に依存しない感染／侵入に関与する産物を不活性化する遺伝子ノックアウトまたは欠失を含有することができ、かつ／または免疫刺激細菌は、ｆｌｊＢ、ｆｌｉＣ、ｐｒｇＩ（針タンパク質）、およびｐｒｇＪ（ロッドタンパク質）を含めた、インフラマソームによって直接的に認識されるタンパク質をコードする遺伝子など、腫瘍常在性免疫細胞の細胞死を誘導する遺伝子の産物を不活性化するノックアウトまたは欠失を含有することができる。しかし、ｒｃｋ遺伝子は補体に対して不活性化から保護するので、ｒｃｋ遺伝子が望ましい。ｒｃｋを内因的にコードしていない細菌を、異種ｒｃｋ遺伝子をコードするように改変することができる。
免疫刺激細菌は、適した細菌株に由来する。細菌株は、弱毒化株、または標準的な方法によって弱毒化されているか、または本明細書で提供する改変のおかげで、それらがコロニー形成する能力が、主に免疫特権が与えられている組織および器官、特に、固形腫瘍を含めた、腫瘍常在性免疫細胞、ＴＭＥ、および腫瘍細胞に限定されているという点で弱毒化されている菌株であってもよい。細菌は、限定されるものではないが、例えば、サルモネラ属、シゲラ属、リステリア属、大腸菌、およびビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）の株を含む。例えば、菌種は、シゲラ・ソネイ、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・チフィリウム、サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびサルモネラ・エンテリティディスを含む。他の適した細菌種は、リケッチア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、エロモナス属、フランシセラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ菌、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、ビブリオ属、バチルス属、およびエリシペロスリクス属を含む。例えば、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹チフスリケッチア、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、エロモナス・ユークレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、ヒツジ偽結核菌、シトロバクター・フロインデイ、クラミジア・ニューモニエ、ヘモフィルス・ソムナス、ブルセラ・アボルタス、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・エルジノーサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブチリス、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ロシャリメア・クインターナ、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）。
本明細書で提供する免疫刺激細菌の例には、サルモネラ属の菌種がある。本明細書に記載の改変のための細菌の例には、サルモネラ属の野生型株、例えば、受託＃１４０２８としてアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されている菌株の特定する特徴の全てを有する株などがある。ＹＳ１６４６株（ＡＴＣＣカタログ＃２０２１６５、ＶＮＰ２０００９とも称する：国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９９／１３０５３号も参照）など、サルモネラ・チフィリウムの操作された株は、ａｓｄ遺伝子ノックアウトを補完し、かつ抗生物質のないプラスミド維持を可能にするプラスミドで操作されている。次いで、株は、フラゲリン遺伝子を欠失させ、かつ／またはｐａｇＰを欠失させるように改変されている。鞭毛ノックアウトおよびｐａｇＰ欠失の組合せは、株を、ヒト血清補体に対して高度に抵抗性にする。株は、プリン、特にアデノシンについて栄養要求性にされており、ａｓｄ－かつｍｓｂＢ－である。例示されているように、ｐｕｒＩおよびｍｓｂＢを完全に欠失している株は、ＶＮＰ２０００９株より適合度が高い（速く成長する）（ｍｏｒｅ ｆｉｔ （ｇｒｏｗ ｆａｓｔｅｒ） ｔｈａｔ ｓｔｒａｉｎ ＶＮＰ２０００９）。ＶＮＰ２０００９株では、これらの遺伝子が欠失しておらず、発現を無くすように改変されている。真核生物宿主内のインビボ複製用に、ａｓｄ遺伝子をプラスミド上に提供することができる。株は、それらの株が免疫抑制性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを産生するのを妨げ、腫瘍Ｔ細胞機能を改善する、ａｎｓＢ遺伝子内の改変、例えば、欠失、破壊、または他の改変なども有する。株は、例えばｃｓｇＤ欠失によって、バイオフィルム産生を無くすようにも改変されており、これにより、それらの株は、ｃｕｒｌｉ線毛、セルロース、およびｃ－ジ－ＧＭＰを産生することができなくなっており、その結果、望ましくない炎症反応が低減され、それらの株のバイオフィルム形成が妨げられている。
これらのゲノム欠失およびプラスミドは、本明細書のどこかに記載および例示されている。本明細書にどこかに記載され、かつ／または当業者に知られている免疫刺激タンパク質および他の産物などの治療用産物をコードする核酸ならばどれでも、プラスミド上に含めることができる。本明細書のどこかに記載のように、プラスミドは、一般に、低コピー数から中程度コピー数で存在する。治療用産物には、Ｉ型ＩＦＮ発現を構成的に誘起／誘導することができる細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの機能獲得型突然変異体、ならびに腫瘍微小環境中で抗腫瘍免疫応答を促進する他の免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子など、ならびに本明細書に記載されている他のそのような産物が含まれる。プラスミドは、免疫チェックポイントおよび他のがん標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、およびＴＧＦ－βなど、ならびに他の分子、例えば、２特異性Ｔ細胞エンゲージャー、またはＢｉＴＥｓ（登録商標）などを標的とする抗体およびその断片、例えば、単鎖抗体もコードすることができる。プラスミドは、ＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦベータ結合性デコイ受容体、およびＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニストもコードすることができる。後述する通り、プラスミドは、腫瘍／腫瘍微小環境に抗がん治療用産物をデリバリーするために、複数の治療用産物／遺伝的ペイロードの１つまたは複数（すなわち、マルチプレックス）をコードすることができる。産物は、輸送シグナル、例えば分泌用シグナルなどに作用可能に連結することができる。産物は、例えば腫瘍常在性骨髄性細胞中で、細胞表面に発現するように設計することができる。
１０．Ｍ２表現型マクロファージからＭ１およびＭ１様の表現型マクロファージへの変換
本明細書に記載のように、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、マクロファージ内で増え、かつ／またはそれを標的とする。マクロファージは、貪食免疫細胞であり、それらは、老化細胞およびアポトーシス細胞の排除、ならびに免疫関連複合体および病原体の食作用、ならびにホメオスタシスの維持において役割を果たす。マクロファージの表現型および機能は、微小環境によって極性化することができる。Ｍ１型（古典的に活性化されたマクロファージ）、およびＭ２型（代替的に活性化されたマクロファージ）という２つの型がある。
Ｍ１マクロファージの役割は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインを分泌すること、抗原を提示すること、およびそれゆえ、陽性免疫応答に参加し、免疫モニターとして機能を果すことである。Ｍ１マクロファージは、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、およびＴＮＦ－αを含めた、炎症促進性サイトカインを産生する。Ｍ２マクロファージは、アルギナーゼ１、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、および他の抗炎症性サイトカインを分泌し、それらは、炎症を低減し、腫瘍成長および免疫抑制性機能に寄与する機能を有する。したがって、がんならびに他のそのような疾患および障害の処置には、Ｍ１またはＭ１様の表現型が有利である。
Ｍ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージまたはＭ１様の表現型を有するマクロファージに変換することができる。本明細書に提供されている免疫刺激細菌は、マクロファージを感染させ、Ｍ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換することができる。Ｍ１マクロファージの表現型マーカーには、ＣＤ８０（Ｂ７、Ｂ７．１、またはＢＢ１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られている）、ＣＤ６４（高親和性免疫グロブリンガンマＦｃ受容体Ｉとしても知られている）、ＣＤ１６、およびＣＤ３２（低親和性免疫グロブリンガンマＦｃ受容体ＩＩｂとしても知られている）が含まれる。Ｍ１マクロファージにおける一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現も、表現型マーカーとして働き得る。ＣＤ１６３およびＣＤ２０６は、Ｍ２マクロファージを同定するためのマーカーである。アルギナーゼ１（Ａｒｇ１）およびＤＥＣＴＩＮ－１も、Ｍ２マクロファージを同定するための理想的な表現型指標である。したがって、変換は、これらのマーカーの発現によってモニターまたは評価することができる。
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、免疫抑制Ｍ２表現型と関連している。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、そのようなマクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換することができる。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす治療用産物をコードする、本明細書で提供する免疫刺激細菌は、そのような変換を引き起こすことができる。これは、本明細書で提供する免疫刺激細菌に特有の特性であり、マクロファージの感染をもたらすゲノム改変を含む細菌の能力を活用する。コードされている治療用産物には、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるもの、例えばＳＴＩＮＧ変異体（本明細書に詳細に記載されている）などが含まれる。コードしている免疫刺激細菌は、腫瘍常在性マクロファージの感染および治療用産物の発現の際に、Ｍ１表現型（またはＭ１様の表現型）への変換を引き起こすことができる。マクロファージ表現型を変換するこの能力は、下記の実施例１２で実証および例示されている。マクロファージを感染させ、ＳＴＩＮＧタンパク質を発現する、本明細書で提供する免疫刺激細菌による、改変されたＳＴＩＮＧタンパク質の発現は、Ｍ１マクロファージの表現型をＭ２マクロファージに変換する。
鞭毛の除去およびＬＰＳ改変など、本明細書に記載のゲノム改変（ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｓ ｄｅｓｃｒｂｉｅｄ ｈｅｒｅｉｎ）を含む本明細書で提供する免疫刺激細菌は、感染したＭ２マクロファージを、Ｍ１マクロファージのサイトカインプロファイルを誘導するものに変換する。ヒト初代Ｍ２マクロファージで構成的なＩ型ＩＦＮ発現をもたらす変異体ＳＴＩＮＧタンパク質を発現する免疫刺激細菌は、これらの細胞を、Ｍ１様の（Ｍ１マクロファージに典型的な表現型マーカーおよび／または発現プロファイルを有する）Ｉ型ＩＦＮ産生細胞に変換する。
実施例は、Ｍ２からＭ１様表現型またはＭ１表現型へのこの変化を実証する。感染してないＭ２マクロファージにおけるサイトカインプロファイルと、Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤであるサルモネラ属株に感染しているＭ２マクロファージにおいて誘導されたサイトカインとの比較において、Ｍ２は、高レベルのＩＦＮγ、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１分泌を誘導した。ｈｕＳＴＩＮＧ ｔａｚＣＴＴ Ｎ１５４Ｓ ＋ Ｒ２８４Ｇ変異体、ＷＴ ｈｕＩＬ－１２およびｈｕＳＴＩＮＧ ｔａｚＣＴＴ Ｎ１５４Ｓ ＋ Ｒ２８４Ｇ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１５をコードするプラスミドで形質転換された同じ株による感染は、プラスミドを含有していない非形質転換ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株より高いＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１分泌を誘導した。Ｍ１またはＭ１様の表現型に特徴的なサイトカインプロファイルが、様々なペイロードを用いて、これらの株で誘導された。例示的な結果が実施例に詳述されている。
Ｄ．腫瘍微小環境において免疫応答を刺激する遺伝的ペイロードをコードする、増強した治療係数を有する免疫刺激細菌
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境内および腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積するように改変され、そこで、治療用産物が真核生物プロモーターの制御下で発現される。細菌は、免疫系を刺激する産物および／または腫瘍の免疫抑制効果を後退もしくは緩和する産物を含む治療用産物、特に抗がん産物をコードする。本明細書に記載するように、細菌は、各産物の発現が別個のプロモーターの制御下にある、または１つのプロモーターの制御下にある、複数の産物をコードする場合があり、別個の産物の発現をもたらす配列を含む場合があり、適切な場合には、コードされている産物の腫瘍微小環境内への分泌を保証するための調節配列を含む。免疫刺激細菌は、プラスミド上にコードされている治療用産物を発現する。先に述べたように、プラスミドは、１つの産物または複数の産物をコードする場合がある。各産物は、異なる真核生物プロモーターの制御下にある場合があり、またはＴ２Ａ（配列番号３２７）、Ｐ２Ａ（配列番号３２８）、Ｅ２Ａ（配列番号３２９）、およびＦ２Ａ（配列番号３３０）などのコーディング部分の間に２Ａ自己切断ペプチドを含むことなどによって、コードされている複数の産物が単一のプロモーターの制御下で発現される場合がある。コードされている産物は、本明細書に記載されるものを含み、それらは、その活性が相補的な抗がん免疫刺激産物であり得る。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、さもなければ全身投与された場合に過度に有毒であろう複数の免疫調節産物またはペイロード（多重ペイロード）の組合せ投与を可能にする。多重ペイロードの例は、１つまたは複数のサイトカイン（複数可）、増大した活性を有するまたは構成的に活性であるＳＴＩＮＧまたはその変異体などの、Ｉ型ＩＦＮの発現を刺激または誘導するための免疫刺激タンパク質、および操作された４－１ＢＢＬ共刺激分子などの共刺激分子を含む。宿主の転写および翻訳機構の制御下で発現のためにプラスミドを骨髄細胞に送達する、本明細書に提供される免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされている場合に、改善された発現および活性を表す改変４－１ＢＢＬポリペプチド、およびコードされている核酸が、本明細書に提供される。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、多重ペイロードまたは単剤ペイロードのＩＶ投薬後などに、治癒の提供を含む強い抗腫瘍効果を有する。免疫刺激細菌は、全身投与された場合、浸潤し、固形腫瘍、ＴＭＥ、および腫瘍常在性骨髄細胞内に濃縮され、コードされている治療用産物がそこで発現され、次いで腫瘍微小環境に局所送達される。腫瘍常在性骨髄細胞によって飲み込まれると（ファゴサイトーシス）、細菌は、遺伝的ペイロードをコードするプラスミドを送達し、それは、異所性の、単一または多重ペイロードの発現を腫瘍特異的に可能にする。
１．免疫刺激タンパク質
本明細書における免疫刺激細菌は、抗腫瘍応答を促進、誘導、または増強する１つまたは複数の免疫刺激タンパク質をコードするように改変することができる。実施例に例示および記載されるように、コードする核酸がプラスミド上に配列される順序は、全体的な発現を改善することができ、プラスミドへの改変は、タンパク質をコードするプラスミドを含有する細菌の適応度を改善することができる。
免疫刺激タンパク質は、真核生物対象、特に、免疫刺激細菌を投与すべき対象、例えばヒトにおける発現のために、真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターの制御下で、細菌内のプラスミド上にコードされ得る。免疫刺激タンパク質（複数可）をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞における発現または輸送のための、例えば細胞表面での分泌または発現のための、他の調節シグナルを含み得る。
免疫刺激タンパク質は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）などの適切な環境内で、免疫刺激細菌が投与される対象による抗腫瘍応答を促進、またはそれに関与する、またはそれを増強することができるタンパク質である。免疫刺激タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子を含むが、それに限定されるわけではない。これらは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－３６γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、およびＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２などであるが、それに限定されるわけではないサイトカイン；ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１などであるが、それに限定されるわけではないケモカイン；ならびに／またはＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインが切り詰められているか、もしくは欠失している４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ２７およびＣＤ２７Ｌ）、およびＢ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー［例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、およびＩＣＯＳリガンド（Ｂ７ＲＰ１）］などであるが、それに限定されるわけではない共刺激分子を含む。
本明細書に提供される免疫刺激細菌内にコードさせるために、腫瘍の処置のために使用される、または抗腫瘍応答を促進するか、増強するか、もしくは別途に増大もしくは誘起することができる、当業者に公知の他のそのような免疫刺激タンパク質が企図されている。例えば、免疫刺激細菌は、ＡＰＣ上での発現のために完全または部分的細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌ）をコードする遺伝的ペイロードを送達することができ、その際、切り詰められた遺伝子産物は、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失または切り詰めにより、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない。本明細書の他の箇所に記載するように、例えば４－１ＢＢＬの、改変された、切り詰められた細胞質ドメインは、タンパク質の発現を増大させる、タンパク質ドメインの適切な配向性を保証するために、特定の残基を含有する。本明細書に記載するように、共刺激分子の細胞質ドメインの欠失（完全または部分）および改変は、免疫抑制逆シグナル伝達なしに共刺激分子の活性化を増強する。これは、実施例および以下に記載するように４－１ＢＢＬに関して例示される；膜内での適切な配向性を保証するために、切り詰められた細胞質ドメイン内の残基の置換を含む同じ改変を、任意の共刺激分子のみならず、他の膜貫通ポリペプチドに適用することができる。
ヒト４－１ＢＢＬの完全長配列（配列番号３８９、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４１２７３も参照）は：
Figure 2023501539000008
 であり、配列中、細胞質ドメインはアミノ酸１～２８（斜体）に対応し、膜貫通ドメインはアミノ酸２９～４９（太字）に対応し、細胞外ドメインはアミノ酸５０～２５４（下線）に対応する。ヒト４－１ＢＢＬΔｃｙｔ配列（配列番号３９０参照）は：
Figure 2023501539000009
 であり、本配列は、完全長タンパク質と同じであるが、細胞質ドメインを失っており、それにより、膜貫通ドメインはアミノ酸残基２～２２（太字）に対応し、細胞外ドメインはアミノ酸残基２３～２２７（下線）に対応する。
切り詰められた細胞質ドメインを有する例示的なヒト４－１ＢＢＬは、以下：
Figure 2023501539000010
 の通りであり（配列番号３９１参照）、配列中、切り詰められた細胞質ドメインは最初にＭを有する残基ＲＶＬＰ（斜体）に対応し、膜貫通ドメインは残基６～２６（太字）に対応し、細胞外ドメインは残基２７～２３１（下線）に対応する。
完全長４－１ＢＢＬに関して、ＲおよびＫなどの正荷電したアミノ酸は、細胞質（内部／細胞質ドメイン）に位置する傾向があり、そのことにより、Ｎ末端が内部になるように膜貫通ドメインが配向する。しかし、細胞質ドメインが切り詰められているとき、これにより、外部だけに（細胞外ドメインに）正荷電があるように荷電平衡が変更される。これは、タンパク質のＮ末端が細胞質側に向かずに外側にある立体配置に好都合であり、「インサイドアウト立体配置」がもたらされる。みかけの活性もしくは発現がより低いことまたは他のパラメータなどによってこれが観察される場合、発現した際に細胞膜内のタンパク質の適切な配向性を保証するために、細胞質ドメインが切り詰められた４－１ＢＢＬ変異体を、正の残基を含むように改変することができる。４－１ＢＢＬの可能な改変の例は、残基が正荷電した残基により置換された改変、またはｃ－ｍｙｃタグが含まれる改変である。当業者は、他の類似の置換／付加を構想して、同じ結果に達することができる。
細胞質ドメインが切り詰められた例示的な改変ヒト４－１ＢＢＬ変異体は、以下を含み、配列中、余分の正の残基（アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、斜体）は、以下のように細胞質ドメイン領域中に含まれ、それによりもたらされるタンパク質は、細胞内で発現されたときに、適切に配向する（正しい立体配置を有し、「インサイドアウト」立体配置を有さない）。それぞれ配列番号：３９１および３９２を参照のこと：
切り詰められた細胞質ドメイン：
Figure 2023501539000011
 これは、正荷電をＮ末端（Ｒ）に付加し戻し、そのことが、Ｎ末端が細胞質内に正しく配向される立体配置に好都合である。別の例では、ＭＹＣタグが付加される。
ＭＹＣタグを有する切り詰められた細胞質ドメイン：
Figure 2023501539000012
完全長マウス４－１ＢＢＬの配列、ならびにｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔ（細胞質ドメインの欠失を有するネズミ４－１ＢＢＬ）、切り詰められた細胞質ドメインを有するｍｕ４－１ＢＢＬ、および切り詰められた細胞質ドメインとＭＹＣタグとを有するｍｕ４－１ＢＢＬの、例示的な配列については、下の実施例１９を参照のこと；それぞれ配列番号３９３～３９６も参照のこと。
発現されたタンパク質の膜内での適切な配向性を保証するために、共刺激分子内に追加的または代替的なアミノ酸置換が含まれる場合がある。当業者は、切り詰められた細胞質ドメインを有する膜貫通タンパク質の適切な配向性を保証するために他の類似の改変を容易に調製することができる。
細胞質ドメインの欠失または切り詰めに加えて、改変された遺伝子産物が、共刺激受容体のエンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの改変により、ＡＰＣに対抗調節シグナルできないように、ＡＰＣ上での発現のための共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌ）をまた、細胞質ドメインに挿入、欠失、および／または置換などのアミノ酸の改変を導入することによって改変することができる。例えば、免疫抑制逆（細胞内）シグナル伝達は、細胞質ドメインのリン酸化部位を改変することによって、適切な１つまたは複数の座位の１つまたは複数のＳｅｒ残基を、逆シグナル伝達を低減するかまたは無くす残基により置換することなどによって、無くすことができる。例えば、ヒト４－１ＢＢＬについて、免疫抑制逆（細胞内）シグナル伝達は、完全長ヒト４－１ＢＢＬの配列（配列番号３８９）に関してＳｅｒ５およびＳｅｒ８を含む細胞質ドメインリン酸化部位を改変することによって無くすことができる。細胞質ドメイン内のセリン残基は、逆シグナル伝達を低減するかまたは無くす任意の他の残基によって置換することができる。
免疫抑制性細胞内（逆）シグナル伝達を無くすために、追加的または代替的なアミノ酸置換が共刺激分子内に含まれ得る。当業者は、免疫抑制逆シグナル伝達を無くすために他の類似の改変を容易に調製することができる一方で、共刺激分子が共刺激受容体のエンゲージメントを介してＴ細胞への構成的免疫刺激シグナル伝達を活性化する能力をまだ維持することができる。
ａ．サイトカインおよびケモカイン
一部の実施形態では、本明細書における免疫刺激細菌は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５（およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体）、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ならびにＩＦＮ－βを含むが、それに限定されるわけではないサイトカインを発現して免疫系を刺激するように操作される。サイトカインは、腫瘍部位で免疫エフェクター細胞および間質細胞を刺激し、細胞傷害性細胞による腫瘍細胞の認識を増強する。一部の実施形態では、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１などのケモカインを発現させるように免疫刺激細菌を操作することができる。
ＩＬ－２
がんの処置のために承認された最初のサイトカインであったインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の成長の活性化および促進、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の生成、Ｔｒｅｇ細胞の成長および増殖の促進、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の刺激、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の増殖および分化の促進を含むいくつかのメカニズムによる免疫系の活性化に意味付けられている。組換えＩＬ－２（ｒＩＬ－２）は、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）および転移性黒色腫の処置のためにＦＤＡから承認されている（例えば、Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166参照）。
ＩＬ－７
ＩＬ－２スーパーファミリーのメンバーであるＩＬ－７は、Ｔ細胞の生存、増殖および恒常性に意味付けられている。ＩＬ－７受容体における突然変異はＴ細胞における損失および重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）の発生をもたらすことが示されており、ＩＬ－７がＴ細胞の発生に演じる決定的な役割を強調している。ＩＬ－７は、休止ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞に連続シグナルを提供し、リンパ球減少症の状態の間に蓄積してＴ細胞の増殖およびＴ細胞レパートリーの多様性の両方に増大をもたらす、恒常性サイトカインである。ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－７は、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞と比べてＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大増殖することに選択的である。組換えＩＬ－７は、ワクチン接種後の抗原特異的Ｔ細胞応答、およびマウスにおける養子細胞療法を増強することが示されている。ＩＬ－７はまた、造血幹細胞移植の化学療法後のＴ細胞回復を促進することに役割を演じ得る。進行悪性腫瘍を有する患者に対する初期相臨床試験は、組換えＩＬ－７が生物学的活性用量（すなわち、循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数が３～４倍に増大する用量）で忍容性良好であり、限られた毒性を有することを示している（例えば、Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。ＩＬ－７は、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、前立腺がん、および神経膠芽腫などの腫瘍に抗腫瘍効果を有することが示されており、ネズミモデルにおけるＩＬ－７のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与は、がん細胞の成長減少をもたらした。ＩＬ－７はまた、ラット神経膠腫におけるＩＦＮ－γの抗腫瘍効果を増強し、単球によるＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの産生を誘導し、それが黒色腫の成長阻害をもたらすことが示されている。その上、小児肉腫の処置後の組換えＩＬ－７の投与は、免疫回復の促進をもたらした（例えば、Lin et al. (2017) Anticancer Research 37:963-968を参照）。
ＩＬ－１２［ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）］
細胞媒介免疫を促進する生物活性ＩＬ－１２（ＩＬ－１２ｐ７０）は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットから構成されるヘテロ二量体である一方で、ＩＬ－１２ｐ４０単量体およびホモ二量体は、ＩＬ－１２アンタゴニストとして作用する。抗原提示細胞によって分泌されるＩＬ－１２は、ＮＫ細胞およびＴ細胞からのＩＦＮ－γの分泌を促進し、腫瘍血管新生を阻害し、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖をもたらし、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を増強し、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を促進する。ＩＬ－１２は、黒色腫、結腸癌、乳癌、および肉腫のネズミモデルにおいて抗腫瘍効果を表すことが示されている（例えば、Kalinski et al. (2001) Blood 97:3466-3469; Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166；およびLee, S. and Margolin、K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒα
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と構造的に類似しており、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の両方がＴ細胞の増殖および活性化のための初期刺激を提供するのに対し、ＩＬ－１５は、刺激されたＴ細胞を無くし、Ｔ細胞トレランスを誘導することをもたらす過程である、ＩＬ－２誘導アポトーシスを遮断し、メモリーＴ細胞応答を限定し、ＩＬ－２単独の治療有効性を潜在的に限定する。ＩＬ－１５はまた、長期抗腫瘍免疫を維持するためのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続を支援し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の直接活性化を介して前臨床ネズミモデルにおいて抗原非依存的に顕著な抗腫瘍活性を実証している。ＣＤ８＋Ｔ細胞に加えて、ＩＬ－１５は、エフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発生、増殖および活性化を担う（例えば、Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893；およびHan et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810を参照）。
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）は、単球および樹状細胞などの抗原提示細胞によって協調的に発現され、ＩＬ－１５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現されるＩＬ－１５ＲβγＣ受容体複合体にＩＬ－１５Ｒαによってトランスに提示される。可溶性１Ｌ－１５：ＩＬ１５－Ｒα複合体は、ＩＬ－１５ＲβγＣ複合体を介して免疫応答をモジュレーションすることが示されており、ＩＬ－１５の生物活性は、それをＩＬ－１５と可溶性ＩＬ－１５Ｒαとの予め形成した複合体として投与することによって５０倍に増大することが示されており、この複合体は、ＩＬ－１５単独と比較して半減期が増大している。ＩＬ－１５Ｒαとの予備会合によるＩＬ－１５の治療有効性におけるこの顕著な増大は、ネズミ腫瘍モデルにおいて実証されている（例えば、Han et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810を参照）。
ＩＬ－１８
ＩＬ－１８は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を誘導し、それらの毒性を増強する。ＩＬ－１８はまた、マクロファージを活性化し、Ｔｈ１ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の発生を刺激する。ＩＬ－１８は、いくつかの前臨床マウスモデルにおいて有望な抗腫瘍活性を示している。例えば、組換えＩＬ－１８（ｒＩＬ－１８）の投与は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および／またはＮＫ細胞媒介応答を介して同系マウスにおける黒色腫または肉腫の退縮をもたらした。他の研究は、ＩＬ－１８抗腫瘍効果がＩＦＮ－γによって媒介され、抗血管新生メカニズムを伴ったことを示した。ＩＬ－１８と他のサイトカイン、例えばＩＬ－１２と、または共刺激分子、例えばＣＤ８０との組合せは、ＩＬ－１８媒介抗腫瘍効果を増強する。進行固形腫瘍およびリンパ腫を有する患者における第Ｉ相臨床試験は、ＩＬ－１８の投与が安全であったこと、それが免疫調節活性ならびに患者における血清ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦレベルの増大、ならびに中程度の臨床応答をもたらしたことを示した。臨床試験は、ＩＬ－１８が他の抗がん治療剤、例えばモノクローナル抗体、細胞傷害性薬、またはワクチンと組み合わせることができることを示した（例えば、Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675;およびLee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。
ＩＬ－１８を発現するように操作されたネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の弱毒株が、全身投与後にいかなる毒作用も有さずに同系マウスにおける皮下（Ｓ．Ｃ．）腫瘍の成長または肺転移を阻害したことを見出した。この操作された細菌を用いた処置は、腫瘍へのＴ細胞、ＮＫ細胞および顆粒球の蓄積を誘導し、サイトカインの腫瘍内産生をもたらした（例えば、Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675を参照）。
ケモカイン
ケモカインは、傷害または炎症の区域への白血球の遊走を媒介する小型サイトカインのファミリーであって、免疫応答および炎症応答の媒介に関与する。ケモカインは、その配列内のシステイン残基の位置に基づき４つのサブファミリー、すなわちＸＣ－、ＣＣ－、ＣＸＣ－、およびＣＸ３Ｃ－ケモカインリガンド、またはＸＣＬ、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、およびＣＸ３ＣＬに分類される。ケモカインリガンドは、その同族受容体に結合し、免疫細胞の循環、ホーミングおよび保持を調節し、各ケモカインリガンド－受容体ペアは、ある特定の型の免疫細胞を選択的に調節する。異なるケモカインは、異なる白血球集団を誘引し、インビボで濃度勾配を形成し、誘引された免疫細胞は、勾配を通過してより高い濃度のケモカインに向けて移動する（例えば、Argyle D. and Kitamura、T. (2018) Front. Immunol. 9:2629;およびDubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335を参照）。ケモカインは、腫瘍内への免疫細胞の浸潤を増大させ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の腫瘍流入領域リンパ節への移動を容易にすることによって抗腫瘍免疫応答を改善することができ、それは、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞をプライミングする（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340を参照）。本明細書における免疫刺激細菌は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１を含むが、それに限定されるわけではないケモカインをコードするように操作することができる。
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５は、高度の相同性を共有し、ヒトおよびマウスの両方において未熟ＤＣおよびＴ細胞を含むいくつかの細胞型の上のＣＣＲ５（ＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５）ならびにＣＣＲ１（ＣＣＬ３およびＣＣＬ５）に結合する。治療用Ｔ細胞は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５の腫瘍特異的分泌を介して自然免疫細胞の腫瘍部位への走化性を誘導することが示されている（例えば、Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335を参照）。
ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）応答の誘導によって、ＣＣＬ３が放出される。マウスのインビボおよびインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究は、ＣＣＬ３が好中球および単球の両方に対して走化性であることを指し示している。具体的には、ＣＣＬ３は、骨髄からの骨髄前駆細胞（ＭＰＣ）の動員を媒介することができ、ＭＰＣ調節効果および刺激効果を有する。ＣＣＬ３をトランスフェクションされたヒト卵巣癌細胞は、抗腫瘍応答の改善をもたらす腫瘍内のＴ細胞浸潤およびマクロファージの増強を示し、好中球のＣＣＬ３媒介走化性が腫瘍成長を抑制したことを指し示した。ＣＣＬ３によって動員された、腫瘍抗原ヒト黒色腫関連遺伝子（ＭＡＧＥ）－１をトランスフェクションされたＤＣは、マウス黒色腫モデルにおいて増大したリンパ球増殖、細胞溶解能、および生存、ならびに減少した腫瘍成長を含む優れた抗腫瘍効果を表した。ＣＣＬ３と、ＭＡＧＥ－１に対する抗原特異的プラットフォームとの組合せ使用はまた、胃がんの処置に使用されている。高免疫原性のネズミ結腸腫瘍、ＣＴ２６によるＣＣＬ３の産生は、インビボ腫瘍成長を減速した；この過程は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の、したがってＩＦＮγのＣＣＬ３依存性蓄積によって駆動され、結果として、ＣＸＣＬ９およびＣＸＬＣ１０の産生をもたらした（例えば、Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598;およびSchaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060を参照）。
ＣＣＬ３は、がんの処置のためのアジュバントとして使用されている。マウス肝細胞癌における高周波アブレーション後のＣＣＬ３活性変異体、ＥＣＩ３０１の投与は、腫瘍特異的応答を増大させ、このメカニズムは、ＣＣＲ１の発現に依存することがさらに示された。白血病／リンパ腫のモデルにおいてＣＣＬ３およびＩＬ－２または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をワクチン接種されたマウスが生存増大を表したことによって、ＣＣＬ３は、全身がんにおけるアジュバントとしても成功を示している（例えば、Schaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060を参照）。
ＣＣＬ３およびＣＣＬ４は、黒色腫および結腸がんにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を原発腫瘍部位に方向付けることに役割を演じる。ＣＣＬ４の腫瘍産生は、ＣＤ１０３＋ＤＣの蓄積をもたらし；ＷＮＴ／β－カテニン－依存経路によるＣＣＬ４の抑制は、黒色腫腫瘍のＣＤ１０３＋ＤＣ浸潤を防止した（例えば、Spranger et al. (2015) Nature 523(7559):231-235を参照）。ＣＣＬ３はまた、結腸がんのマウスモデルにおいて原発腫瘍部位へのＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増強することが示された（例えば、Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598を参照）。
ＣＣＬ３またはＣＣＬ５のそれらの受容体（ＣＣＲ１およびＣＣＲ５）への結合は、未熟ＤＣ、単球、ならびにメモリーおよびＴエフェクター細胞を循環から炎症部位または感染部位に移動させる。例えば、結腸直腸腫瘍におけるＣＣＬ５発現は、Ｔリンパ球の化学誘引および生存に寄与する。ＣＣＬ３およびＣＣＬ５は、いくつかの前臨床モデルにおいて腫瘍退縮および免疫を誘導するために単独で、または併用療法で使用されている。例えば研究は、ＣＣＬ３を発現するように遺伝子改変されたチャイニーズハムスター卵巣細胞の皮下注射が、腫瘍阻害および好中球浸潤をもたらしたことを示している。別の研究では、ＣＣＬ５を発現している組換え腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ－ＲＡＮＴＥＳ－Ｅ１Ａ）は、原発腫瘍の退縮をもたらし、乳癌ネズミモデルにおいて転移を遮断した（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340を参照）。
結腸直腸がんの橋渡し研究において、ＣＣＬ５は、マクロファージにおいて「抗ウイルス応答パターン」を誘導した。結腸直腸がんにおける肝転移の浸潤断端部でのリンパ球のＣＸＣＲ３媒介遊走の結果として、ＣＣＬ５が産生される。ＣＣＬ５受容体、ＣＣＲ５の遮断は、ＩＦＮおよび活性酸素種を産生しているマクロファージによって駆動される腫瘍死をもたらす。マクロファージが腫瘍微小環境内に存在する間、ＣＣＲ５の阻害は、Ｍ２表現型からＭ１表現型への表現型シフトを誘導する。ＣＣＲ５の遮断はまた、結腸直腸がん患者における臨床応答をもたらす（例えば、Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601を参照）。
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５は、リンパ系腫瘍、膀胱がん、結腸直腸がん、肺がん、黒色腫、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、または肝がんを含む状態を処置するために使用することができる（例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１５／０２３２８８０；および国際出願公開番号ＷＯ２０１５／０５９３０３、ＷＯ２０１７／０４３８１５、ＷＯ２０１７／１５６３４９およびＷＯ２０１８／１９１６５４を参照）。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１
ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、およびＣＸＣＬ１１（ＩＴＡＣ）は、ＩＦＮ－γの産生によって誘導される。これらのケモカインは、活性化Ｔ細胞上に優占的に発現されるＣＸＣＲ３と結合し、血管新生抑制と、白血球の動員および活性化との両方に機能する。結腸直腸がんにおける予後は、腫瘍浸潤Ｔ細胞、特にＴｈ１およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞と強く相関し；ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１の高い腫瘍内発現は、予後良好を指し示す。例えば、結腸がんを有する１６３人の患者の試料において、高レベルのＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１１を有する患者は、増大した術後生存を示し、高いＣＸＣ発現を有する患者は、有意に高い数のＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を有した。結腸直腸がん患者の肝転移では、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０レベルが浸潤断端部で増大し、エフェクターＴ細胞の密度と相関した。ＣＸＣＲ３に対するＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の作用を介するリンパ球遊走の刺激は、浸潤断端部でのＣＣＬ５の産生をもたらす（例えば、Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601；およびKistner et al. (2017) Oncotarget 8(52):89998-90012を参照）。
ＣＸＣＬ９は、インビボで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に対する化学誘引物質として機能し、末梢血リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴｈ１リンパ球を活性化した。ＣＸＣＬ９はまた、皮膚腫瘍のＴ細胞媒介抑制に重大である。例えば、全身性ＩＬ－２と組み合わせた場合に、ＣＸＣＬ９は、ＣＸＣＲ３＋単核細胞の腫瘍内浸潤の増大を介して腫瘍成長を阻害することが示されている。結腸癌のネズミモデルでは、ｈｕＫＳ１／４－ＩＬ－２融合タンパク質とＣＸＣＬ９遺伝子療法との組合せは、優れた抗腫瘍効果を達成し、化学誘引ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化を経由して寿命を延長した（例えば、Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335；およびRuehlmann et al. (2001) Cancer Res. 61(23):8498-8503を参照）。
活性化した単球、線維芽細胞、内皮細胞、およびケラチノサイトによって産生されるＣＸＣＬ１０は、活性化Ｔ細胞に対して走化性であり、インビボで血管新生の阻害剤として作用することができる。結腸直腸腫瘍におけるＣＸＣＬ１０の発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球の化学誘引およびより長い生存に寄与することが示されている。ＩＬ－１２などの免疫刺激サイトカインの投与は、ＣＸＣＬ１０によって生成される抗腫瘍効果を増強することが示されている。腫瘍細胞溶解液でプライミングされ、ＣＸＣＬ１０をトランスフェクションされた樹状細胞（ＤＣ）ワクチンは、マウスにおいて増大した免疫防御および有効性を有し；動物は、腫瘍負荷への抵抗性、腫瘍成長の減速、およびより長い生存期間を示した。ＣＸＣＬ１０－ムチン－ＧＰＩ融合タンパク質を使用するマウスにおけるインビボおよびインビトロ研究は、融合タンパク質で処置されなかった腫瘍と比較して高いレベルの動員ＮＫ細胞を有する腫瘍をもたらした。インターフェロン（形質細胞様樹状細胞によって産生され得る；これらの細胞は、原発性黒色腫病変と関連し、ＣＣＬ２０によって腫瘍部位に動員され得る）は、腫瘍ＤＣサブセット、例えば、ＣＤ１０３＋ＤＣに作用することができ、このことは、マウス黒色腫モデルにおいてＣＸＣＬ９／１０を産生することが示されており、ヒト疾患においてＣＸＣＬ９／１０と関連している。ＣＸＣＬ１０はまた、原発性黒色腫試料と比べてヒト転移性黒色腫試料中で高い発現を示している。治療的に、アジュバントＩＦＮ－α黒色腫療法は、ＣＸＣＬ１０の産生をアップレギュレーションするのに対し、化学療法剤シスプラチンは、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を誘導する（例えば、Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335; Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271; Li et al. (2007) Scand. J. Immunol. 65(1):8-13；およびMuenchmeier et al. (2013) PLoS One 8(8):e72749を参照）。
ＣＸＣＬ１０／１１およびＣＸＣＲ３の発現は、基底細胞癌（ＢＣＣ）に由来するヒトケラチノサイトにおいて立証されている。ＣＸＣＬ１１はまた、ヒト基底細胞癌において免疫抑制性のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を促進するのみならず、ケラチノサイトの増殖を増強することができ、それにより、いかなる浸潤性ＣＸＣＲ３＋エフェクターＴ細胞の抗腫瘍活性も低減され得る（例えば、Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271を参照）。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１は、がんを処置するために腫瘍溶解性ウイルスにコードされ得る（例えば、米国特許公開番号第２０１５／０２３２８８０号；および国際出願公開番号ＷＯ２０１５／０５９３０３を参照）。ＣＸＣＬ１０遺伝子をコードするシュードタイプ化腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子操作細菌もまた、がんを処置するために使用することができる（例えば、国際出願公開番号ＷＯ２０１８／００６００５およびＷＯ２０１８／１２９４０４を参照）。
ｂ．共刺激分子
共刺激分子は、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強し、共刺激経路は、腫瘍細胞によって阻害されて腫瘍形成を促進する。本明細書における免疫刺激細菌を操作して、共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバー（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２７リガンド、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、Ｆａｓ受容体、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＴＮＦ－Ｒ、ＨＶＥＭ、およびＲＡＮＫ）、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド（Ｂ７ＲＰ１）、およびＣＤ２８などを発現させることができる。その上、免疫刺激細菌は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のために、全部または部分的（完全な、または切り詰められた、または細胞で発現されるときに適切な配向性を保証するために改変された）細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、ＯＸ４０Ｌ）をコードし、発現し得る。完全欠失を含む、切り詰められた細胞質ドメインを有する遺伝子産物が、共刺激受容体のエンゲージメントを介してＴ細胞に構成的免疫刺激シグナル伝達を提供し、細胞質ドメインの切り詰めまたは欠失（または本明細書に別途記載するような改変）により、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できないことが、本明細書において示される。切り詰めは、シグナル伝達を提供するために、およびＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できないために十分である。本明細書に記載される共刺激分子の細胞質ドメインの完全または部分欠失は、免疫抑制逆シグナル伝達なしに共刺激分子の活性化を増強する。細胞質ドメインの部分欠失（または切り詰め）は、共刺激分子の発現にも、発現された共刺激分子の配向性にも影響せずにこれらの効果を達成するために十分な欠失である。
共刺激分子を改変して、挿入、欠失、および／または置換を含む細胞質ドメイン内のアミノ酸への改変によって免疫抑制性の細胞内／逆シグナル伝達を無くすかまたは低減することもできる。特に、共刺激分子は、細胞質ドメインリン酸化部位の改変によって、例えば置換によって改変される。例えば、適切な１つまたは複数の座位の１つまたは複数のＳｅｒ残基を、例えばヒト４－１ＢＢＬについて配列番号３８９を参照してＳｅｒ５およびＳｅｒ８を、逆シグナル伝達を低減するかまたは無くす残基により置換することである。
本明細書における免疫刺激細菌はまた、共刺激分子（例えば、４－１ＢＢ）に対するアゴニスト抗体を発現して抗腫瘍免疫応答を増強するように操作することができる。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド（ＴＮＦＳＦ）およびその受容体（ＴＮＦＲＳＦ）は、腫瘍および免疫エフェクター細胞の増殖、分化、活性化および生存に関与する。このファミリーのメンバーは、アポトーシスを誘導するＣＤ３０、Ｆａｓ－Ｌ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、およびＴＮＦ－Ｒ、ならびにＢおよびＴ細胞免疫応答を調節するＣＤ２７、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ－Ｌ、および４－１ＢＢＬを含む。他のメンバーは、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を含む。本明細書における免疫刺激細菌によるＴＮＦＳＦおよびＴＮＦＲＳＦの発現は、抗腫瘍免疫応答を増強することができる。例えば、ネズミ腫瘍における４－１ＢＢＬの発現が免疫原性を増強すること、およびＯＸ４０Ｌの発現増大を有する樹状細胞（ＤＣ）の腫瘍内注射が、ネズミモデルにおいて腫瘍拒絶をもたらし得ることが示されている。研究は、組換えＧＩＴＲを発現しているアデノウイルスのＢ１６黒色腫細胞内への注射がＴ細胞浸潤を促進し、腫瘍容量を低減することも示している。４－１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲなどの分子に対する刺激抗体を免疫刺激細菌によってコードさせて、免疫系を刺激することもできる。例えば、アゴニスト抗４－１ＢＢモノクローナル抗体が抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することが示されており、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体が移植可能腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を増大させることが示されている。その上、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体は、抗腫瘍応答および免疫を増強することが示されている（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340；およびPeggs et al. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157:9-19を参照）。
ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ４０は、ＡＰＣおよびＢ細胞によって発現されるのに対し、そのリガンド、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、活性化Ｔ細胞によって発現される。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用は、サイトカインを産生して、Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞死をもたらすようにＢ細胞を刺激する。研究は、抗腫瘍免疫応答が障害され、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ、または樹状細胞上のＣＤ４０の発現低減を有することを示している。ＣＤ４０は、いくつかのＢ細胞腫瘍、例えば濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病などの表面に発現され、それとＣＤ４０Ｌとの相互作用は、ＣＤ４０＋腫瘍細胞におけるＢ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子の発現を増大させるのみならず、それらの抗原提示能を増強することが示されている。多発性骨髄腫のネズミモデルにおけるＣＤ４０Ｌのトランスジェニック発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、局所および全身抗腫瘍免疫応答、ならびに腫瘍成長の低減をもたらした。抗ＣＤ４０アゴニスト抗体はまた、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導した（例えば、Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39; Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207；およびMurugaiyan et al. (2007) J. Immunol. 178:2047-2055を参照）。
４－１ＢＢおよび４－１ＢＢＬ
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、主としてＴ細胞およびＮＫ細胞によって発現される誘導性共刺激受容体であり；それは、ＤＣ、Ｂ細胞、および単球を含むＡＰＣ上に発現されるそのリガンド４－１ＢＢＬと結合して、免疫細胞の増殖および活性化をトリガーする。４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞のより長く、より広範な応答をもたらす。抗４－１ＢＢアゴニストおよび４－１ＢＢＬ融合タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔｈ１および腫瘍特異的ＣＴＬ活性によって媒介される、例えば肉腫およびマスト細胞腫に対する、免疫媒介抗腫瘍活性を増大させることが示されている（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340；およびMarin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39を参照）。４－１ＢＢＬは、その細胞質シグナル伝達ドメインによって負の調節を受ける。マクロファージ上の４－１ＢＢＬがＴ細胞にライゲーションする後期に、４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの逆シグナル伝達は、結合するために４－１ＢＢＬの表面転位を誘導して、ＴＬＲ４とシグナル伝達複合体を形成する。これは、適応免疫応答の免疫抑制をもたらすＴＬＲ４のＬＰＳ活性化と同様に、高レベルのＴＮＦ－αを誘導する（例えば、Ma et al. (2013) Sci. Signaling 295(6):1-11を参照）。
ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー、４－１ＢＢＬは、Ｂ細胞、樹状細胞、活性化Ｔ細胞およびマクロファージにおいて発現される。４－１ＢＢＬは、その受容体、４－１ＢＢに結合し、Ｔ細胞活性化および拡大増殖のための共刺激シグナルを提供する。ヒト４－１ＢＢＬ遺伝子は、２８アミノ酸の細胞質ドメイン、２１アミノ酸の膜貫通タンパク質ドメイン、および２０５アミノ酸の細胞外ドメインを含有する２５４アミノ酸のＩＩ型膜貫通タンパク質をコードする（配列番号３８９参照）。本明細書に記載される４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの全部または一部の欠失（配列番号３４２または３８９のアミノ酸残基１～２８に対応する）は、免疫抑制逆シグナル伝達なしに４－１ＢＢＬの活性化を増強する。欠失している部分は、４－１ＢＢＬの活性化を増強するために十分であるが、免疫抑制逆シグナル伝達を有さない。下記のように、切り詰められた細胞質ドメインは、細胞膜において発現されたタンパク質の適切な配向性を保証するためにアミノ酸または置換を含むことができる（類似の改変は、細胞質ドメインが切り詰められているかまたは欠失している他の膜貫通タンパク質において引き起こされる場合がある）。免疫抑制逆シグナル伝達を無くすために、細胞質ドメインを失っているかまたは切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ変異体をコードする核酸分子が、本明細書に提供される。そのような核酸およびコードされているタンパク質の例は、実施例に記載されている（例えば、配列番号３９１および３９５を参照）。受容体はまた、細胞質が切り詰められているかまたは欠失している場合がある。
ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌ
ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、活性化エフェクターＴ細胞上に発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるのに対し、そのリガンド、ＯＸ４０Ｌは、ＴＬＲアゴニストおよびＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌシグナル伝達による活性化後に、ＤＣ、Ｂ細胞およびマクロファージを含むＡＰＣ上に発現される。ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化、増強、増殖および生存のみならず、ＮＫ細胞機能のモジュレーションおよびＴｒｅｇの抑制活性の阻害をもたらす。ＯＸ４０を経由するシグナル伝達はまた、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＦＮ－γ）の分泌をもたらし、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞応答をブーストする。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による腫瘍抗原の認識は、予後改善と相関している、ＴＩＬによるＯＸ４０の発現増大をもたらす。研究は、黒色腫、肉腫、結腸癌、および乳がんのネズミモデルにおいて抗ＯＸ４０アゴニスト抗体またはＦｃ－ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質を用いた処置が腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の増強および生存増大をもたらすのに対し、腫瘍細胞ワクチンに組み込まれたＦｃ－ＯＸ４０Ｌは、後続の乳癌細胞による誘発からマウスを防御したことを実証している（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340;およびMarin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39を参照）。
Ｂ７－ＣＤ２８ファミリー
ＣＤ２８は、抗原提示細胞上に発現される共刺激分子であるＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）に対する受容体として作用する、Ｔ細胞の表面に発現される共刺激分子である。ＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化および生存に、およびＴ細胞アネルギーの予防に必要とされ、ＩＬ－６などのインターロイキンの産生をもたらす。
最適なＴ細胞プライミングは、２つのシグナル、すなわち（１）ＭＨＣ提示抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識、および（２）Ｔ細胞ＣＤ２８と、ＡＰＣ上に発現されるＢ７－１（ＣＤ８０）またはＢ７－２（ＣＤ８６）とのライゲーションに起因する共刺激シグナルを必要とする。Ｔ細胞の活性化後に、ＣＴＬＡ－４受容体が誘導され、それは次いで、Ｂ７－１リガンドおよびＢ７－２リガンドとの結合をＣＤ２８と競合して打ち負かす。腫瘍細胞による抗原提示は、それがＢ７－１／ＣＤ８０およびＢ７－２／ＣＤ８６などの共刺激分子の発現を失っていることにより不十分であり、その結果、Ｔ細胞受容体複合体を活性化できない。結果として、腫瘍細胞表面でのこれらの分子のアップレギュレーションは、それらの免疫原性を増強することができる。固形腫瘍および血液悪性腫瘍の免疫療法は、Ｂ７によって、例えば、Ｂ７の腫瘍細胞発現または可溶性Ｂ７－免疫グロブリン融合タンパク質を介してうまく誘導されている。ＩＣＡＭ－３およびＬＦＡ－３などの他の共刺激リガンドと組み合わせたＢ７のウイルス媒介腫瘍発現は、慢性リンパ性白血病および転移性黒色腫の処置のための前臨床試験および臨床試験において成功している。その上、可溶性Ｂ７融合タンパク質は、単剤免疫療法としての固形腫瘍の免疫療法における有望な結果を実証している（例えば、Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340;およびDotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207を参照）。
２．プロドラッグを活性化する分子
本明細書に提供される免疫刺激細菌内のプラスミドは、酵素的切断によって活性化される治療用産物、例えば化学療法プロドラッグを含むプロドラッグ、特に毒素の一部分の切断などによって活性化する、酵素などの分子をコードする核酸を含み得る。結果として、不活性なプロドラッグは、全身投与することができ、不活性である。プラスミドによってコードされている、酵素などの活性化分子は、本明細書に提供される免疫刺激細菌のデリバリー後に腫瘍微小環境内で発現され、それにより、不活性なプロドラッグが腫瘍微小環境内で活性化され、そこでそれはその抗腫瘍効果を発揮する。ある特定のヌクレオシド、および毒素コンジュゲートを含む、そのようなプロドラッグの多数の例がある。多数のそのようなプロドラッグおよび酵素は公知である（例えば、Malekshah et al., (2016) Curr. Pharmacol. Rep. 2:299-308を参照）。これらは、５－フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｃｉｌ）のプロドラッグ、オキサザホスホリン（ａｘａｚａｐｈｏｓｏｒｉｎｅｓ）、白金薬物、および酵素、例えばデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、ホスホリラーゼ、チトクロムＰ４５０酵素、ならびにその他多数を含む。
３．免疫応答ならびに／またはＩ型ＩＦＮ、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、キメラ、および改変型を刺激する構成的に活性なタンパク質
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ；インターフェロン１型とも称される）は、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含み、抗ウイルス、抗腫瘍、および免疫調節活性を有する多彩な（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）サイトカインである。ＩＦＮ－βは、大部分の細胞型によって産生され；ＩＦＮ－αは、主として造血細胞、特に形質細胞様樹状細胞によって産生される。Ｉ型ＩＦＮは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）による病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の感知後に産生される。それらは、病原体、主にウイルス性病原体に対する自然免疫応答に関与し、抗原提示を促進し、樹状細胞（ＤＣ）成熟を媒介し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージを活性化し、高親和性抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答ならびに免疫記憶の発生を促進することによって適応免疫系を活性化する、強力な免疫調節薬である。
Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍に対して抗増殖効果およびアポトーシス促進効果を表し、腫瘍の新生血管構造に対して抗血管新生効果を有する。それらは、腫瘍細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導し、腫瘍細胞の免疫原性を増大させ、それらに対する細胞傷害性を活性化する。Ｉ型ＩＦＮは、がんおよびウイルス感染の処置のための治療として使用されている。例えば、ＩＦＮ－α（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）／Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）－Ａの商標で販売）は、ヘアリー細胞白血病、悪性黒色腫、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、および濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置のために承認されており；全身免疫毒性のため使用が限られるものの、これは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、腎細胞癌、神経内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、非濾胞性非ホジキンリンパ腫、デスモイド腫瘍、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫の処置にも使用される（例えば、Ivashkiv and Donlin (2014) Nat. Rev. Immunol. 14(1):36-49；Kalliolias and Ivashkiv (2010) Arthritis Research & Therapy 12(Suppl 1):S1；およびLee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893を参照）。
本明細書における免疫刺激細菌が設計されて誘起する免疫応答の中に、腫瘍および腫瘍微小環境内のＩ型インターフェロンの発現がある。Ｉ型インターフェロンを誘導または誘起することは、がんの処置のための抗腫瘍免疫を提供する。
ａ．構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型突然変異
Ｉ型ＩＦＮ、炎症性サイトカインおよびケモカインの誘導は、ウイルス病原体による感染を予防または阻害する免疫応答を開始するために必要である。この応答はまた、抗腫瘍剤として有効であり得る。本明細書に提供される免疫刺激細菌は、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質をコードする。これらのタンパク質の中に、免疫応答調節薬の過剰産生を伴う様々な疾患または障害を有する個体中に存在するものがある。例えば、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症性サイトカインの過剰産生もしくは過度の産生、または負調節の欠損は、炎症性疾患および自己免疫疾患などの望ましくない効果をもたらし得る。Ｉ型ＩＦＮの過剰産生を伴う障害、一般的に慢性のものは、インターフェロン症と称される（例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118；およびKonno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123を参照）。Ｉ型インターフェロン症に関連する障害および臨床表現型は、アイカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）、小児期発症ＳＴＩＮＧ関連血管症（ＳＡＶＩ）、シングルトン・マートン症候群（ＳＭＳ）、非定型ＳＭＳ、家族性凍瘡状狼瘡（ＦＣＬ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、両側性線条体壊死（ＢＳＮ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、遺伝性対側性色素異常症（ＤＳＨ）、痙性不全対麻痺（ＳＰ）、Ｘ連鎖網状色素性障害（ＸＬＰＤＲ）、プロテアソーム関連自己炎症症候群（ＰＲＡＡＳ）、頭蓋内石灰化（ＩＣＣ）、メンデル遺伝子型マイコバクテリア易感染症（ＭＳＭＤ）、および脊椎内軟骨異形成症（ＳＰＥＮＣＤ）を含む（例えば、Rodero et al. (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527-2538を参照）。これらの表現型は、Ｉ型ＩＦＮの誘導に関与する産物の構成的活性をもたらす遺伝子における突然変異を伴う、特定の遺伝子型に関連する。
インターフェロンシグナル伝達の持続的活性化は、１）細胞内ＤＮＡの増大をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＴＲＥＸ１およびＳＡＭＨＤ１における突然変異）、または細胞内ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの増大をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、およびＰＯＬＡ１における突然変異）；２）細胞質ゾル中の自己核酸ＲＮＡ種のＲＮＡ編集および異常感知における障害をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＡＤＡＲ１における突然変異）；３）細胞内ＩＦＮシグナル伝達経路の構成的活性化／細胞内核酸リガンドの感度増大をもたらす機能獲得型突然変異（例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＳＴＩＮＧにおける突然変異）；４）小胞体ストレス応答の妨害によって引き起こされるＭＡＶＳを介する異常ＲＮＡシグナル伝達をもたらす機能喪失型突然変異（例えば、ＳＫＩＶ２Ｌにおける突然変異）；５）制御されないＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）産生をもたらす、ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ１／２）シグナル伝達を限定することを担う分子における機能喪失型突然変異（例えば、ＵＳＰ１８およびＩＳＧ１５における突然変異）；６）未知のメカニズムによるＩＦＮシグナル伝達の増大をもたらすプロテアソーム機能不全（例えば、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＢ４およびＰＳＭＢ８における突然変異）；ならびに７）Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達をもたらすメカニズムが不明確なままである、ＴＲＡＰ／ＡＣＰ５およびＣ１ｑにおける機能喪失型突然変異に起因し得る（例えば、Rodero et al. (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527-2538を参照）。
機能獲得（ＧＯＦ）をもたらす突然変異が、本明細書における目的である。コードされているタンパク質の構成的活性化、および／または内因性リガンドへの感度増強もしくは親和性もしくは結合の増大と関連する突然変異が、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５およびＲＩＧ－Ｉにおいて公知である。ＳＴＩＮＧにおけるＧＯＦ突然変異は、例えば、ＳＡＶＩおよびＦＣＬと連鎖し；ＭＤＡ５におけるＧＯＦ突然変異は、ＡＧＳおよびＳＭＳと連鎖し；ＲＩＧ－ＩにおけるＧＯＦ突然変異は、非定型ＳＭＳと連鎖する。
ＴＭＥＭ１７３ ＳＴＩＮＧ対立遺伝子
インターフェロン遺伝子の刺激物質（ＳＴＩＮＧ）は、約７ｋｂ長の遺伝子である膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）遺伝子によってコードされている。ヒトＴＭＥＭ１７３遺伝子は、対立遺伝子の顕著な不均一性および集団層別化によって特徴付けられる。最も多く見られるヒトＴＭＥＭ１７３対立遺伝子は、Ｒ２３２と称される（残基２３２に存在するアミノ酸を参照；例えば、様々なヒトＴＭＥＭ１７３対立遺伝子の配列に記載される配列番号３０５～３０９を参照のこと）。アメリカ人集団の半分よりも多くは、Ｒ２３２／Ｒ２３２ではない。２番目に多く見られる対立遺伝子はＲ７１Ｈ－Ｇ２３０Ａ－Ｒ２９３Ｑ（ＨＡＱ）である。他の多く見られる対立遺伝子は、ＡＱ（Ｇ２３０Ａ－Ｒ２９３Ｑ）、Ｑ（Ｑ２９３）およびＲ２３２Ｈ（Ｇｌｅｎ Ｂａｒｂｅｒによって最初に特定され、データベース中に収載された参照ＳＴＩＮＧ対立遺伝子にちなんでＲＥＦと名付けられた）を含む。
Ｒ２３２／Ｒ２３２は、ヨーロッパ人に最も多く見られる遺伝子型であるのに対し、ＨＡＱ／Ｒ２３２は、東アジア人に最も多く見られる遺伝子型である。アフリカ人はＨＡＱ／ＨＡＱ遺伝子型を有さず、Ｑ対立遺伝子を有し、アフリカ人の約４％は、他の民族集団に存在しないＡＱ／ＡＱである（例えば、Patel and Jin (2018) Genes & Immunity、doi:10.1038/s41435-018-0029-9を参照）。ＲＥＦ、ＡＱおよびＱ対立遺伝子は、３’３’ ｃ－ジ－ＧＭＰなどの細菌由来ＣＤＮに高度に不応性である（例えば、Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030を参照）。
ＳＴＩＮＧ機能獲得型突然変異
ＳＴＩＮＧに関する遺伝子、ＴＭＥＭ１７３における遺伝性およびデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）のいくつかの活性化突然変異または機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異は、希少自己炎症性疾患ＳＡＶＩ（小児期発症ＳＴＩＮＧ関連血管症）に連鎖している。ＳＡＶＩは、常染色体優性疾患であり、全身炎症、間質性肺疾患、皮膚血管炎、および再発性細菌感染によって特徴付けられる。デノボのＴＭＥＭ１７３突然変異を有するＳＡＶＩは、典型的には、早発（＜８週間）および重症表現型によって特徴付けられるのに対し、家族性突然変異は、遅発（ティーンエイジ～成人）およびより軽度の臨床症状をもたらす。遺伝性ＴＭＥＭ１７３活性化突然変異は、Ｇ１６６ＥおよびＶ１５５Ｍを含む一方で、デノボ突然変異は、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｃ２０６Ｙ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８１ＱおよびＳ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌを含む（例えば、Patel and Jin (2019) Genes & Immunity 20:82-89を参照）。特定された他の活性化ＴＭＥＭ１７３突然変異は、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１６Ｑ、およびＲ３７５Ａを含む（例えば、米国特許公報番号第２０１８／０３１１３４３号を参照）。ＴＭＥＭ１７３における別の機能獲得型突然変異は、高度に構成的活性なＳＴＩＮＧをもたらすＲ２８４Ｓであって、活性化ＣＤＮの非存在下で自然免疫シグナル伝達をトリガーし、炎症性サイトカインの慢性産生をもたらすことが見出されたＲ２８４Ｓである（例えば、Konno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123を参照）。
ＴＭＥＭ１７３突然変異、例えば、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５ＭおよびＶ１４７Ｌ、ならびに／または下の表に記載される突然変異のいずれかは、単独で、またはこれらおよび任意の他のそのような突然変異との任意の組合せで、例えばＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇで、構成的に活性で、リガンド刺激を必要としないかまたはリガンド刺激に高感受性の機能獲得型ＳＴＩＮＧをもたらし、ＳＴＩＮＧ－インターフェロン経路の慢性活性化に導く。これは実証されている（例えば、Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518を参照）。突然変異ＴＭＥＭ１７３（置換Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍの各々、および機能喪失型突然変異体Ｖ１５５Ｒを有する）、および非突然変異ＴＭＥＭ１７３のコンストラクトを、ＳＴＩＮＧ陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ＳＴＩＮＧリガンド、ｃＧＡＭＰを用いて刺激した。Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５ＭおよびＶ１４７Ｌ突然変異体をトランスフェクションされた細胞は、高度に上昇したＩＦＮＢ１（ＩＦＮ－βをコードする遺伝子）レポーター活性を表し、それは、ＳＴＩＮＧリガンドｃＧＡＭＰを用いた刺激によってあまりブーストされなかった。機能喪失型突然変異体（Ｖ１５５Ｒ）、非突然変異ＴＭＥＭ１７３、または対照プラスミドをトランスフェクションされた細胞は、顕著なベースライン活性化を有さなかった。ｃＧＡＭＰを用いた刺激は、非突然変異ＴＭＥＭ１７３を有する細胞において用量依存的な応答をもたらし、機能喪失型突然変異体を発現している細胞において最高のｃＧＡＭＰ濃度でのみ、最小の応答をもたらした（例えば、Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518を参照）。これらの結果は、活性化ＴＭＥＭ１７３突然変異が、ｃＧＡＭＰによる刺激の非存在下であってもＳＴＩＮＧの構成的活性化をもたらすことを示している。
Ｇ２０７Ｅは、脱毛症、光線過敏症、甲状腺機能不全、およびＳＡＶＩの特徴を引き起こす別の機能獲得型ＳＴＩＮＧ突然変異である。Ｇ２０７Ｅ突然変異は、ＨＥＫ細胞における炎症関連経路の構成的活性化のみならず、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における異常なインターフェロンシグネチャーおよびインフラマソーム活性化を引き起こす。Ｒ２３２またはＨ２３２対立遺伝子およびＧＯＦ突然変異Ｇ２０７Ｅを有するＳＴＩＮＧ変異体を使用して、ＣＤＮを用いた刺激後に、Ｒ２３２＋Ｇ２０７Ｅ変異体がＩＦＮ－βおよびＳＴＡＴ１／２経路において活性のわずかな増大をもたらしたのに対し、Ｈ２３２＋Ｇ２０７Ｅ変異体では、ＩＦＮ－βレベルは一定のままであり、ＳＴＡＴ１／２が活性低下を示したことが示された。両方の変異体は、刺激後に類似のＳＴＡＴ３およびＮＦ－κＢ経路の活性化を示した。これらの結果は、２３２位の残基ＲがｃＧＡＭＰの結合およびＩＦＮ誘導に重要であることを示し、Ｇ２０７Ｅ突然変異体が、ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の構成的活性化およびＮＦ－κＢ経路のリガンド依存性過剰活性化をもたらすことを示す。Ｒ２３２対立遺伝子およびＧ２０７Ｅ突然変異を有する患者は、より重症の疾患を有し；この多型は、突然変異体ＳＴＩＮＧの構成的活性化を増強し、下流の標的、例えばＩＦＮ、ＩＬ１－βおよびＩＬ－１８などの過剰発現をもたらした（例えば、Keskitalo et al. (2018)を参照、doi.org/10.1101/394353から入手可能）。
ネズミＳＴＩＮＧ（配列番号３６９）中の６７アミノ酸を個別または群のいずれかで突然変異させ（Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518を参照）、環状ジ－ＧＭＰ（ｃ－ジ－ＧＭＰ）の結合および／またはＩＦＮ誘導に関与するアミノ酸を特定した。特定された突然変異体の中には、ＩＦＮを低レベルのトランスフェクションで自然に誘導し、ｃ－ジ－ＧＭＰに応答しなかった、過剰活性突然変異体Ｒ１９６Ａ／Ｄ２０４Ａ、Ｓ２７１Ａ／Ｑ２７２Ａ、Ｒ３０９Ａ／Ｅ３１５Ａ、Ｅ３１５Ａ、Ｅ３１５Ｎ、Ｅ３１５Ｑ、およびＳ２７１Ａ（配列番号３０５～３０９に示されるヒトＳＴＩＮＧの配列を参照して、それぞれＲ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、およびＳ２７２Ａに対応する）、ならびに過剰発現された場合にＩＦＮを誘導したが、ｃ－ジ－ＧＭＰに応答しなかった、突然変異体Ｒ３７４Ａ、Ｒ２９２Ａ／Ｔ２９３Ａ／Ｅ２９５Ａ／Ｅ２９９Ａ、Ｄ２３０Ａ、Ｒ２３１Ａ、Ｋ２３５Ａ、Ｑ２７２Ａ、Ｓ３５７Ａ／Ｅ３５９Ａ／Ｓ３６５Ａ、Ｄ２３０Ａ／Ｒ２３１Ａ／Ｋ２３５Ａ／Ｒ２３７Ａ、およびＲ２３７Ａ（配列番号３０５～３０９に示されるヒトＳＴＩＮＧを参照して、それぞれＲ３７５Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ（ヒトＳＴＩＮＧにＥ２９９の相当物はない）、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、およびＲ２３８Ａに対応する）があった。一部のヒトＳＴＩＮＧ突然変異がｃ－ジ－ＧＭＰなどの細菌によって産生される３’３’ＣＤＮに対して低い親和性を有することが、後に発見されたので、これらの対立遺伝子はまだ、内因性ＣＤＮ、２’３’ｃ－ジ－ＧＡＭＰに応答し得る（例えば、Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030を参照）。
機能獲得型突然変異を有するこれらのタンパク質をコードする、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、これらのタンパク質の構成的活性化を活用して、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症性サイトカインの産生を増大させる。機能獲得型突然変異を有するＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、および／またはＲＩＧ－Ｉをコードする腫瘍標的化免疫刺激細菌は、本明細書に提供される。免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境におけるＩ型ＩＦＮ媒介性のサイトカインおよびケモカインの産生を増大させ、抗腫瘍免疫応答を増強し、免疫刺激細菌の治療有効性を改善する。ＳＴＩＮＧをコードする遺伝子は、ＴＭＥＭ１７３と称され、ＭＤＡ５をコードする遺伝子はＩＦＩＨ１であり、ＲＩＧ－Ｉをコードする遺伝子はＤＤＸ５８である。各遺伝子について多数の対立遺伝子、および対立遺伝子のいずれかを有する遺伝子中に存在し得る公知の突然変異があり、機能獲得型または構成的活性化をもたらす。下に記載された突然変異は、単独で存在する可能性も、また任意の組合せで使用される可能性もある。機能獲得をもたらす他の突然変異は、日常的なスクリーニング／突然変異プロトコールによって特定することができる。下の表は、ＳＴＩＮＧ／ＴＭＥＭ１７３（配列番号３０５～３０９）、ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１（配列番号３１０）、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８（配列番号３１１）、ＩＲＦ３（配列番号３１２）、およびＩＲＦ７（配列番号３１３）の各々における例示的な機能獲得型突然変異を記載する。他の突然変異、例えば、１つまたは複数のリン酸化部位の欠失または置換、例えばＳＴＩＮＧにおけるＳ３２４／Ｌ３２５／Ｓ３２６→Ｓ３２４Ａ／Ｌ３２５／Ｓ３２６Ａ、およびＳＴＩＮＧまたはそのようなシグナル伝達を採用する他のタンパク質における核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達を低減するためにリン酸化部位を無くすための他の置換も導入することができる。
もたらされるタンパク質は、本明細書に提供される免疫刺激細菌にコードされ得る。タンパク質は、免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされている。
野生型ＳＴＩＮＧをコードする核酸を投与することは、免疫応答を誘導し得る；腫瘍標的化免疫刺激細菌内の、本明細書に提供される構成的活性を有する機能獲得型ＳＴＩＮＧ突然変異体の投与は、より効力が高い免疫応答およびより有効な抗がん治療をもたらす。構成的に活性なＳＴＩＮＧ、または他のそのような改変ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、例えば、本明細書に提供されるＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３、またはＩＲＦ７の機能獲得型突然変異体の腫瘍標的化投与による増強した免疫応答は、治療的により有効な抗がん処置を提供する。例えば、本明細書に記載するように、免疫刺激細菌が上皮細胞に感染しないが、腫瘍常在性免疫細胞を含む食細胞に感染する能力を保持するようにそれらを改変することは、免疫刺激細菌を腫瘍微小環境に効果的に標的化し、治療効率を改善し、望ましくない全身免疫応答を防止する。これらの腫瘍標的化細菌は、例えば、リガンド刺激の非存在下であっても、構成的に活性な機能獲得型ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３、またはＩＲＦ７突然変異体をコードするように操作され、強力なＩ型ＩＦＮ応答を提供して、腫瘍微小環境における抗がん免疫応答を改善する。
したがって、例えば、構成的に活性化されたＳＴＩＮＧの投与は、がんの免疫療法処置のためのＳＴＩＮＧシグナル伝達をブーストするための代替手段を提供することができる。ある特定の実施形態では、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ２７２Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｆ２７９Ｌ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｓ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＲ３７５Ａより選択される機能獲得型突然変異のみならず、その保存的突然変異を有するＳＴＩＮＧ／ＴＭＥＭ１７３（配列番号３０５～３０９）をコードするように、本明細書に提供される腫瘍標的化免疫刺激細菌を改変することができる。加えて、ＳＴＩＮＧ機能獲得型突然変異の組合せは、それらの個別の突然変異対応物よりもＳＴＩＮＧシグナル伝達を顕著にブーストした可能性がある。
例示的な機能獲得型突然変異体の表
I型IFNの持続性発現をもたらす機能獲得型突然変異
Figure 2023501539000013

Figure 2023501539000014
配列番号３０５～３０９のいずれかに示されるように、ヒトＳＴＩＮＧの配列を参照したアミノ酸残基Ｒ１９７、Ｄ２０５、Ｒ３１０、Ｒ２９３、Ｔ２９４、Ｅ２９６、Ｓ２７２、Ｑ２７３、Ｅ３１６、Ｄ２３１、Ｒ２３２、Ｋ２３６、Ｓ３５８、Ｅ３６０、Ｓ３６６、およびＲ２３８は、それぞれ、配列番号３６９に示されるように、ネズミＳＴＩＮＧの配列を参照したアミノ酸残基Ｒ１９６、Ｄ２０４、Ｒ３０９、Ｒ２９２、Ｔ２９３、Ｅ２９５、Ｓ２７１、Ｑ２７２、Ｅ３１５、Ｄ２３０、Ｒ２３１、Ｋ２３５、Ｓ３５７、Ｅ３５９、Ｓ３６５、およびＲ２３７に対応する。
置換Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇの組合せが、Ｉ型インターフェロンの構成的発現をもたらすことが本明細書に示される。置換の各々の保存的置換えも含まれる（各アミノ酸について例示的な保存的突然変異を記載している、定義のセクションの表を参照）。
ｂ．構成的ＩＲＦ３発現および機能獲得型突然変異
ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３、またはＩＲＦ－３）およびＩＲＦ７（またはＩＲＦ－７）は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の重要な活性化因子である。ウイルス誘導Ｃ末端リン酸化（ＴＢＫ１による）の後に、活性化ＩＲＦ３およびＩＲＦ７は、ホモ二量体を形成し、細胞質から核へと転位し、ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）に結合してＩ型ＩＦＮ応答を誘導する。ＩＲＦ３は、刺激されていない細胞内で構成的に発現され、不活性細胞質形態として存在するのに対し、ＩＲＦ７は、細胞内で構成的に発現されず、ＩＦＮ、リポ多糖、およびウイルス感染によって誘導される。ＩＲＦ３の過剰発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子のウイルス媒介発現を有意に増大させ、抗ウイルス状態の誘導をもたらす。ＩＲＦ３の活性化はまた、ウイルス感染後にＣＣ－ケモカインＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）の転写をアップレギュレーションすることが示されている（例えば、Lin et al. (1999) Mol. Cell Biol. 19(4):2465-2474を参照）。
ＩＲＦ３のＣ末端ドメインにおける残基Ｓ３８５、Ｓ３８６、Ｓ３９６、Ｓ３９８、Ｓ４０２、Ｔ４０４、およびＳ４０５は、ウイルス感染後にリン酸化され、ＩＲＦ３の活性化をもたらすコンフォメーション変化を誘導する。ＩＲＦ３の活性化は、ウイルス感染だけでなく、リポ多糖（ＬＰＳ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）によっても誘導される。ＩＲＦ３のＣ末端クラスター中でリン酸化され得る７つの残基のうち、単一の点変異、Ｓ３９６Ｄは、ＩＲＦ３の構成的活性型の生成に十分である。ＩＲＦ３（Ｓ３９６Ｄ）は、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－β、およびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化を野生型ＩＲＦ３と比較してそれぞれ１３、１４、および１１倍増強する。別の突然変異体、ＩＲＦ３（Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ）は、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－β、およびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化を野生型ＩＲＦ３と比較してそれぞれ１３、１２、および１２倍増強する。ＩＲＦ３の別の構成的活性突然変異体は、３９６、３９８、４０２、４０４、および４０５位のセリンまたはトレオニン残基がリン酸化模倣アスパラギン酸残基によって置換されているＩＲＦ３（５Ｄ）［ＩＲＦ３（Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄ）］である。Ｉ型インターフェロンの誘導などの免疫応答メディエータの構成的活性をもたらす類似の機能獲得型突然変異は、免疫応答シグナル伝達経路内の他のタンパク質、例えばＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、およびＳＴＩＮＧにおけるセリン残基をリン酸化模倣アスパラギン酸に突然変異させることによって達成することができる。
ＩＲＦ３（５Ｄ）は、構成的ＤＮＡ結合およびトランス活性化活性、二量体形成、転写コアクチベーターｐ３００（ＥＰ３００、またはＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００とも呼ばれる）／ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質、またはＣＲＥＢＢＰとしても知られる）との会合、および核局在を表す。そのトランス活性化活性は、ウイルス感染によってさらに誘導されない。ＩＲＦ３（５Ｄ）は、ＩＦＮ－βおよびＩＳＧ－１５の遺伝子発現の非常に強力な活性化因子であり；ＩＲＦ３（５Ｄ）は、単独でＩＦＮ－β発現をウイルス感染と同じほど強く刺激し、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－β、およびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化を野生型ＩＲＦ３と比較してそれぞれ９倍、５．５倍、および８倍増強する（例えば、Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327; Lin et al. (1998) Mol. Cell Biol. 18(5):2986-2996；およびServant et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(11):9441-9447を参照）。Ｓ３８５、Ｓ３８６、Ｓ３９６、Ｓ３９８、Ｓ４０２、Ｔ４０４、およびＳ４０５位のいずれかを、単独でまたは組み合わせて突然変異させて、本明細書に提供される免疫刺激細菌内に構成的に活性なＩＲＦ３突然変異体を産生することができる。
ｃ．活性が増大しているかまたは構成的活性を有する非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびその変異体、ならびに活性が増大しているかまたは構成的活性を有するＳＴＩＮＧキメラおよびその変異体
上述のように、細胞内二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、転写因子インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）を活性化する小胞体（ＥＲ）常在性アダプタータンパク質ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激物質）を経由してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を刺激する。ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）／ＩＲＦ３軸は、Ｉ型ＩＦＮの誘導、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫を活性化するための樹状細胞（ＤＣ）の活性化および腫瘍抗原の交差提示をもたらす。ＳＴＩＮＧシグナル伝達はまた、活性化Ｂ細胞（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達軸の核因子カッパ軽鎖エンハンサーを活性化し、炎症促進応答をもたらすが、抗腫瘍免疫に必要とされるＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらさない。
２’３’ｃＧＡＭＰを認識すると、ＳＴＩＮＧは小胞体からゴルジ装置を通過して転位し、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の動員ならびに転写因子ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの活性化を可能にする。ＳＴＩＮＧのカルボキシル末端尾部（Ｃ末端尾部またはＣＴＴ）領域は、ＴＢＫ１を活性化し、ＩＲＦ３のリン酸化を刺激するために必要かつ十分であり；それは、ＮＦ－κＢシグナル伝達にも関与する。ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧのリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要とされる配列モチーフを含有する約４０アミノ酸の構造不定のストレッチである。ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの下流シグナル伝達は、脊椎動物種の間で保存されているＳＴＩＮＧのＣ末端尾部（ＣＴＴ）内の特定の配列モチーフに起因する。ＩＲＦ３結合モジュール、ＴＢＫ１結合モジュールおよびＴＲＡＦ６結合モジュールを含む、ＣＴＴ内のモジュラーモチーフは、細胞シグナル伝達および免疫応答の強度および特異性を制御する。
種、およびＳＴＩＮＧのＣＴＴの別個のエレメントのそれぞれの特徴に依存して、ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの下流の応答が影響される場合があり、時には相反する。ＳＴＩＮＧのＣＴＴエレメントは、２つのシグナル伝達経路の間の均衡を指示し、きめ細かく調整し、異なる生物学的応答をもたらす。ヒトおよびマウス免疫細胞において、例えば、ＳＴＩＮＧ依存性ＩＲＦ３活性化は、主にＩ型インターフェロン応答をもたらす。ヒト細胞におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達はまた、ＴＲＡＦ６動員を介してカノニカルＮＦ－κＢ経路および可能性があることに非カノニカルＮＦ－κＢ経路を経由して炎症促進応答を駆動する。ヒトＳＴＩＮＧ残基Ｓ３６６（例えば、配列番号３０５－３０９参照）は、ＣＴＴ内のＬｘＩＳモチーフの部分である一次ＴＢＫ１リン酸化部位であり、それは、ＩＲＦ３の結合に必要とされるのに対し、残基Ｌ３７４を含む第２のＰｘＰＬＲモチーフは、ＴＢＫ１の結合に必要とされる。ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲモチーフは、すべての脊椎動物ＳＴＩＮＧ対立遺伝子において高度に保存されている。他の種では、ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、主にＮＦ－κＢシグナル伝達軸の活性化をもたらす。例えば、ＮＦ－κＢシグナル伝達の過剰活性化に応答性であるゼブラフィッシュＣＴＴは、ヒトおよび他の哺乳動物ＳＴＩＮＧ対立遺伝子に存在しないＣ最末端で高度に保存されたＰｘＥｘｘＤモチーフによる伸長を含有し；このモチーフは、腫瘍壊死因子受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）結合部位と類似性を共有する。ヒトＳＴＩＮＧシグナル伝達におけるＴＲＡＦ６の役割が可欠であるのに対し、ＴＲＡＦ６の動員は、ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ誘導ＮＦ－κＢ活性化に不可欠である。ヒトＳＴＩＮＧがゼブラフィッシュＳＴＩＮＧのＣＴＴモジュールＤＰＶＥＴＴＤＹを含有するように操作されたヒト－ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧキメラは、ＮＦ－κＢ活性化の１００倍よりも大きい活性化を誘導したが、これは、増強したＮＦ－κＢシグナル活性化を指示するためにこの領域が必要かつ十分であることを指し示している。ゼブラフィッシュＣＴＴの付加はまた、増大したＳＴＩＮＧインターフェロン応答をもたらした（de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175を参照）。
本明細書では、ＩＲＦ３とＮＦ－κＢシグナル伝達との間の均衡における種間差を活用して、低減したＮＦ－κＢシグナル伝達を有し、かつ／または増大したＩＲＦ３シグナル伝達を有してもよい改変ＳＴＩＮＧタンパク質を産生する。それにより、ＴＭＥにＳＴＩＮＧタンパク質が送達され、そこで発現されたとき、もたらされる応答は、無改変ＳＴＩＮＧタンパク質と比較して増大した抗腫瘍／抗ウイルス応答である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるまたは当業者に公知の免疫刺激細菌のいずれかを含むデリバリー媒体内のみならず、腫瘍溶解性ベクターを含むウイルスベクター、ミニセル（ｍｉｎｉｃｅｌｌ）、エキソソーム、リポソームなどの他のデリバリー媒体内に、ならびに細胞療法に使用され、細菌および腫瘍溶解性ベクターなどの媒体を送達するために使用されるＴ細胞などの細胞内に、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低いかまたは無い種からのＳＴＩＮＧタンパク質が提供される。
非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、以下の種からのＳＴＩＮＧタンパク質であり得るが、それに限定されるわけではない：タスマニアンデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ；配列番号３４９）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ；配列番号３５９）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ；配列番号３６０）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ；配列番号３５６）、ダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ；配列番号３６１）、トキ（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ；配列番号３６２）、シーラカンス（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ；配列番号３６３～３６４）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ；配列番号３６５）、コウモリ（Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ；配列番号３６６）、マナティー（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ；配列番号３６７）、ギンザメ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ；配列番号３６８）、およびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；配列番号３６９）。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒト細胞における免疫シグナル伝達を容易に活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子メカニズムが脊椎動物において共通であることを指し示している（de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175を参照）。
他の実施形態では、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、上記のヒトＳＴＩＮＧ内の座位に対応する非ヒトＳＴＩＮＧ内の対応する座位に、構成的ＳＴＩＮＧ活性化および機能獲得型突然変異のいずれかを含有する（様々な種における例示的なアライメントおよび対応する突然変異を提供する、下記の実施例１７を参照；図１～１３も参照）。
他の実施形態では、ＳＴＩＮＧタンパク質のキメラが提供される。キメラでは、ＮＦ－κＢシグナル伝達／活性を与えるかまたはそれに関与する第１の種のＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴ領域またはその部分（複数可）は、そのＳＴＩＮＧタンパク質がより低いまたは非常に小さいヒト未満のＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する第２の種からの対応するＣＴＴまたはその部分（複数可）と置換される。一般的に、第１の種はヒトであり、ＣＴＴまたはその部分（複数可）の置換は、ずっと低いＮＦ－κＢ活性を有するタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、およびギンザメなどの種のＳＴＩＮＧからのものである。それにより、これは、抗腫瘍活性に重要なＩ型インターフェロンを誘導するＳＴＩＮＧタンパク質であって、抗腫瘍療法に望ましくないＮＦ－κＢ活性が限られているかまたは無いＳＴＩＮＧタンパク質をもたらす。キメラは、対応する座位にヒト構成的ＳＴＩＮＧ活性化および機能獲得型突然変異をさらに含んで、Ｉ型インターフェロン活性を増大させる、または構成的にすることができる。全ての実施形態では、ＴＲＡＦ６結合モチーフを欠失させて、抗腫瘍治療に望ましくない活性をさらに減少させるかまたは無くすことができる。
これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、キメラ、および突然変異体は、本明細書に記載される、または当業者に公知のいずれかなどの、腫瘍溶解性ウイルスベクター、細胞、例えば細胞療法に使用される幹細胞およびＴ細胞、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積し、コードされているタンパク質を腫瘍微小環境および腫瘍に送達するエキソソーム、ミニセル、リポソーム、および本明細書に提供される免疫刺激細菌を含む、デリバリー媒体中に提供される。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、改変ＳＴＩＮＧタンパク質、およびＳＴＩＮＧキメラは、本明細書に記載される腫瘍の処置のための治療薬として使用するため、または当業者に公知の他の方法に使用するためのものである。ＳＴＩＮＧタンパク質、デリバリー媒体、およびコードしている核酸を含有する医薬組成物もまた提供される。
ｄ．細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその構成的変異体として作用する他の遺伝子産物
細胞内核酸を感知する、またはそれと相互作用する他の遺伝子産物は、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）およびＭＤＡ５（黒色腫分化関連タンパク質５）を含むＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）である。ＲＬＲは、細菌によって分泌される、ウイルスｄｓＲＮＡおよび核酸の細胞質センサーであり、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、およびＬＧＰ２（遺伝学および生理学研究室２）を含む。ウイルスｄｓＲＮＡ、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５などのリガンドが結合した際に、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達アダプタータンパク質、またはＭＡＶＳを活性化し、それが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を動員して、ミトコンドリア外膜にシグナル伝達複合体を集合させる。下流のシグナル伝達成分が、ＴＲＡＦによってさらに動員され、ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＩＲＦ７、ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー）、およびＡＰ－１（アクチベータータンパク質１）のリン酸化および活性化をもたらす。結果として、ＩＦＮ、炎症性サイトカイン、および病原体排除に関与する他の遺伝子の発現が誘導される（例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。ＳＴＩＮＧのように、機能獲得型突然変異によるＭＤＡ５およびＲＩＧ－Ｉの構成的活性化は、Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらし、それを、免疫刺激細菌における抗腫瘍免疫応答を増強するために活かすことができる。
ｉ．ＲＩＧ－Ｉ
ＤＤＸ５８（ＤＥＸＤ／Ｈ－ボックスヘリカーゼ５８）としても知られるレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）は、その構成的活性化がインターフェロン症、例えば非定型スミス・マゲニス症候群の発生に連鎖している別のタンパク質である。ＲＩＧ－Ｉは、ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１のように、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーのメンバーであり、ウイルスｄｓＲＮＡの検出に機能する９２５残基の細胞内パターン認識受容体である。ＲＩＧ－Ｉは、Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮならびに炎症性サイトカインの発現を促進する独立した経路を通過してウイルスＲＮＡに対する自然免疫応答を開始する（例えば、Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274;およびLu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。
歯の異常の特徴を有さないが、緑内障、大動脈石灰化、および骨格異常を含む可変性の表現型を有する、非定型スミス・マゲニス症候群は、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）をコードするＤＥＸＤ／Ｈ－ボックスヘリカーゼ５８遺伝子（ＤＤＸ５８）における突然変異によって引き起こされることが見出されている。特に、ＤＤＸ５８における突然変異Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆは、ＲＩＧ－Ｉに機能獲得を引き起こすと特定された。突然変異ＤＤＸ５８の量の増大は、ＮＦ－κＢレポーター遺伝子活性の基礎レベルにおける有意な増大と関連し、この活性は、ｄｓＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）を用いた刺激によってさらに増大した。ＲＩＧ－Ｉ突然変異はまた、基礎ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞およびポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の両方における基礎レベルのＩＲＦ３のリン酸化および二量体化を誘導し、ＩＦＮＢ１、インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）、およびケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）の発現増大をもたらした。これらの結果は、突然変異ＤＤＸ５８／ＲＩＧ－Ｉが構成的活性化をもたらし、ＩＦＮ活性およびＩＦＮ刺激遺伝子発現の増大をもたらすことを指し示している（例えば、Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274；およびLu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆなどであるがそれに限定されるわけではない機能獲得型突然変異を単独および組合せで有するＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８（例えば、配列番号３１１参照）をコードするように、本明細書に提供される腫瘍標的化免疫刺激細菌を改変することができる。
ｉｉ．ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１
別のインターフェロン症遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ様ファミリーの細胞質ＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡ受容体のメンバーである、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）としても知られるヘリカーゼＣドメイン含有ＩＦＮ誘導性タンパク質１（ＩＦＩＨ１）である。ＩＦＩＨ１によってコードされているＭＤＡ５は、細胞質内のウイルス二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および分泌性細菌核酸を感知し、アダプター分子、ＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質）を経由するＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化する、アミノ酸１，０２５個の細胞質パターン認識受容体である。ＭＡＶＳは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を動員し、これは今度は、下流のシグナル伝達成分を動員し、ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＩＲＦ７、ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞核因子カッパ軽鎖エンハンサー）、およびＡＰ－１（アクチベータータンパク質１）のリン酸化および活性化をもたらす。これは、ＩＦＮ、炎症性サイトカイン、および病原体の排除に関与する他の遺伝子の発現ももたらす（例えば、Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282; Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509；およびLu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。
機能獲得型（ＧＯＦ）ＩＦＩＨ１変異体は、血管の顕著な炎症によって特徴付けられるアイカルディ・グティエール症候群（ＡＧＳ）およびシングルトン・マートン症候群（ＳＭＳ）を含む自己免疫障害を有する対象に存在する。ＡＧＳは、特に脳および皮膚を冒す炎症性疾患であり、インターフェロン誘導転写物のアップレギュレーションによって特徴付けられる。ＡＧＳは、典型的には、ＤＮＡエキソヌクレアーゼＴＲＥＸ１、ＲＮアーゼＨ２エンドヌクレアーゼ複合体、デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼＳＡＭＨＤ１、および二本鎖ＲＮＡ編集酵素ＡＤＡＲ１の３つの非対立遺伝子成分をコードする遺伝子のいずれかにおける突然変異により発生する。ＡＧＳを有する一部の患者は、これらの遺伝子のいずれにも突然変異を有さないが、ＩＦＩＨ１にＧＯＦ突然変異を有し、これは、この遺伝子がＡＧＳにも意味付けられることを指し示している。シングルトン・マートン症候群は、血管（例えば、石灰化）、歯（例えば、早期発症歯周炎、歯根吸収）、および骨（例えば、骨減少症、先端骨溶解症、骨粗鬆症）における異常によって特徴付けられる常染色体優性障害である。インターフェロンシグネチャー遺伝子は、シングルトン・マートン症候群の患者においてアップレギュレーションされ、これはＩＦＩＨ１におけるＧＯＦ突然変異と連鎖した（例えば、Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509；およびRutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282を参照）。
野生型ＩＦＩＨ１、およびＡＧＳ患者において特定された６つのＩＦＩＨ１ ＧＯＦ突然変異体（Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ３３７Ｇ、Ｒ７７９Ｃ、Ｇ４９５Ｒ、Ｄ３９３Ｖ）のＩＦＮ－βレポーター刺激活性を、低レベルの内因性ウイルスＲＮＡ受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において比較した。長鎖（＞１ｋｂ）ｄｓＲＮＡアナログであるポリイノシンポリシチジン酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］が結合した際に野生型ＩＦＩＨ１が誘導されたが、短鎖１６２ｂｐのｄｓＲＮＡによっては誘導されず、外因性ＲＮＡの非存在下で最小の活性を有した。ＩＦＩＨ１突然変異体は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答する強いシグナル伝達に加えて、短鎖１６２ｂｐのｄｓＲＮＡに応答するＩＦＮシグナル伝達の顕著な誘導を示した。突然変異体はまた、外因性リガンドの非存在下で４～１０倍高いレベルのベースラインシグナル伝達活性を表した（例えば、Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509を参照）。
別の機能獲得型ＩＦＩＨ１突然変異、Ｒ８２２Ｑが、Ｉ型ＩＦＮ産生をトリガーし、早期動脈石灰化のみならず、歯の炎症および吸収をもたらすことによってシングルトン・マートン症候群を引き起こすと特定された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（最低レベルの内因性ＩＦＩＨ１発現を有する）を使用して、野生型およびＲ８２２Ｑ ＭＤＡ５を過剰発現させた。野生型ＩＦＩＨ１の発現は、ＩＦＮＢ１（インターフェロン、ベータ１、線維芽細胞）の発現増大を用量依存的にもたらした一方で、突然変異ＩＦＩＨ１は、約２０倍大きいＩＦＮＢ１発現をもたらした。ｄｓＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）を用いた刺激後に、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１は、野生型ＩＦＩＨ１よりも高いレベルのＩＦＮＢ１発現をもたらし、これは、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１が非自己ｄｓＲＮＡに過剰活性であることを指し示している。シングルトン・マートン症候群患者からの全血試料中にＩＦＩ２７、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＲＳＧ１５、ＲＳＡＤ２、およびＳＩＧＬＥＣ１などのインターフェロンシグネチャー遺伝子のより高い発現もあり、これは、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１によるＩＦＮＢ１の発現レベルがより高いことと一致した（例えば、Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282を参照）。
ＩＦＩＨ１の別のＧＯＦ突然変異、Ａ４８９Ｔを有する患者に観察されるインターフェロンシグネチャーは、Ｉ型インターフェロン症を指し示し；ＩＦＩＨ１ Ａ４８９Ｔは、増大したインターフェロン産生ならびに凍瘡状狼瘡、ＡＧＳおよびＳＭＳに類似する表現型に関連する（例えば、Bursztejn et al. (2015) Br. J. Dermatol. 173(6):1505-1513を参照）。Ａ４８９Ｔ変異体は、長鎖ｄｓＲＮＡアナログ、ポリ（Ｉ：Ｃ）を用いた刺激後だけでなく、短鎖ｄｓＲＮＡを用いた刺激後にもＩＦＮ誘導をもたらした。ＩＦＩＨ１、Ｔ３３１ＩおよびＴ３３１Ｒにおける２つの追加的な機能獲得型突然変異が、ＩＦＮ誘導転写物の有意なアップレギュレーションを提示したＳＭＳ表現型を有する患者において特定された。Ｔ３３１ＩおよびＴ３３１Ｒ変異体は、ＭＤＡ５の観察された構成的活性化と一致して、外因性ｄｓＲＮＡリガンドの非存在下であってもＩＦＮ－βの発現増大をもたらした（例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118を参照）。
Ａ９４６Ｔは、Ｉ型ＩＦＮの産生増大をもたらし、炎症を促進し、自己免疫のリスクを増大させる、ＩＦＩＨ１の別のＧＯＦ突然変異である。ＩＦＩＨ１におけるＡ９４６Ｔ突然変異は、ＳＴＩＮＧにおけるＴＭＥＭ１７３ Ｒ２３２対立遺伝子およびＧ２０７Ｅ ＧＯＦ突然変異と組み合わせた場合に相加的作用をもたらし、ＳＡＶＩに類似する特徴を有する重症早期発症表現型をもたらす（例えば、Keskitalo et al. (2018)を参照、前刷りはdoi.org/10.1101/394353から入手可能）。Ｇ８２１Ｓは、マウスモデルにおいて自然発生狼瘡様自己免疫症状をもたらすことが示されている、ＩＦＩＨ１におけるＧＯＦ突然変異であるのに対し（例えば、Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282を参照）、ＡＧＳを有する個体において特定されたＩＦＩＨ１ミスセンス突然変異Ａ４５２Ｔ、Ｒ７７９ＨおよびＬ３７２Ｆは、Ｉ型インターフェロンの過剰産生を引き起こすことが示された（例えば、Oda et al. (2014) Am. J. Hum. Genet. 95:121-125を参照）。
Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ｒ３３７Ｇ、Ｌ３７２Ｆ、Ｄ３９３Ｖ、Ａ４５２Ｔ、Ａ４８９Ｔ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｇ８２１Ｓ、Ｒ８２２Ｑ、およびＡ９４６Ｔから選択される機能獲得型突然変異を単独または任意の組合せで有するＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１をコードするように、本明細書に提供される腫瘍標的化免疫刺激細菌を改変することができる（例えば、配列番号３１０を参照）。
ｉｉｉ．ＩＲＦ７
構成的活性型のＩＲＦ７（またはＩＲＦ－７）は、ＩＲＦ７（Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）、ＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）、およびＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄ）を含む、異なるＣ末端セリンがリン酸化模倣Ａｓｐによって置き換えられた突然変異体を含む。ＩＲＦ７（Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）は、ＩＦＮＡおよびＲＡＮＴＥＳ遺伝子の発現に関する強力なトランスアクチベーターであって、ウイルス感染の非存在下であっても遺伝子発現を刺激する。ＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）、およびＩＲＦ７（Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄ）は、ＩＲＦ７（Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ）のトランス活性化活性をさらに増強しないが、３つの突然変異体すべてのトランス活性化活性は、ウイルス感染によってさらに刺激される。未感染細胞内の核に局在する突然変異体ＩＲＦ７（Δ２４７－４６７）は、ＩＲＦ７の非常に強力な構成型であり；これは、未刺激細胞およびウイルス感染細胞において野生型ＩＲＦ７よりも転写を１５００倍よりも高く活性化する（例えば、Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327を参照）。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、残基４７５～４７７、４７９、４８３、および４８７に置換を有するもの、ならびにアミノ酸欠失を有するものを含む、構成的に活性なＩＲＦ７突然変異体をコードし、発現し得る。免疫刺激細菌は、ヒトを含む哺乳動物宿主によって認識されるプロモーターおよび任意の他の所望の調節シグナルの制御下でプラスミド上にこれらのタンパク質をコードする。
ｅ．他のＩ型ＩＦＮ調節タンパク質
構成的Ｉ型ＩＦＮ発現を生成するために、Ｉ型ＩＦＮ応答を活性化するＤＮＡ／ＲＮＡの認識に関与する他のタンパク質を突然変異させることができる。非改変および／または改変タンパク質は、タンパク質を腫瘍微小環境、例えば腫瘍常在性免疫細胞に送達して、Ｉ型ＩＦＮの発現を増大させるために使用するために、本明細書に提供される免疫刺激細菌内にコードされ得る。
これらのタンパク質は、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９（ＤＤＸ９）、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００と呼ばれるタンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
Figure 2023501539000015

Figure 2023501539000016

Figure 2023501539000017
機能獲得型変異体は、スクリーニングおよび／または突然変異誘発などによって産生され得る。部位特異的突然変異誘発をインビトロで行って、より高いレベルおよび／または構成的Ｉ型ＩＦＮ発現をもたらす活性増強を有する突然変異を特定することができる。無傷のゲノムＤＮＡを、自己免疫症状および自己炎症症状を経験している血縁関係のない患者、および健康な個体から得て、その発現がＩ型ＩＦＮの発現増大または構成的発現をもたらす他の産物についてスクリーニングし、それを特定することができる。全エキソームシークエンシングを行うことができ、イントロンおよびエクソンを分析することができ、それにより、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現に関連する経路における、突然変異を有するタンパク質が特定される。突然変異の特定後、特定された突然変異（複数可）を有するおよび有さない完全長遺伝子をコードしているｃＤＮＡ分子が、Ｉ型インターフェロンの発現を測定するレポーター細胞系にトランスフェクションされる。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βについてのプロモーターの制御下に置かれるレポーター細胞系を生成することができる。構成的に活性な機能獲得型突然変異体は、ＩＦＮ－βの発現を促進するのに対し、未刺激野生型タンパク質は促進しないであろう。刺激は、ウイルス感染、細菌感染、細菌核酸、ＬＰＳ、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、またはタンパク質のリガンド（例えば、ＣＤＮ）の外因性レベルを増大させることによる場合がある。特定されたタンパク質はまた、対象における目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するものを含む。免疫応答は、（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること；（ｉｉ）ＮＦ－κＢ経路のシグナル伝達を刺激すること；（ｉｉｉ）炎症応答を刺激すること；（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；（ｖ）樹状細胞の発生、活性、または動員を刺激すること；（ｖｉ）その発現が免疫応答を増強する産物を指し示す任意の他の応答；および（ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）の任意の組合せのうち１つまたは複数によって特徴付けられる細胞性免疫応答または液性免疫応答を含む。
４．抗体および抗体断片
抗体操作における進歩は、特に製造、組織透過、および使用の容易さに関して、従来のモノクローナル抗体を超える多くの改善を有する組換え抗体断片の創出をもたらしている。これらの例は、一般的に（Ｇ４Ｓ）３配列であるフレキシブルなペプチドリンカーによって一緒につながった抗体結合部位の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単鎖断片可変部（ｓｃＦｖ）である（例えば、Weisser et al. (2009) Biotechnol. Adv. 27(4):502-520を参照）。他の例は、ｓｃＦｖのＶＨドメインがＦｃ領域に連結されているｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片を含む。このような抗体断片は、本明細書において例示されるようにプラスミド上にコードされ、送達され得る方法で、免疫刺激細菌による抗原の標的化を可能にする。標的化すべき潜在的抗原の例は、下記に記載されるものを含むが、それに限定されるわけではない。
ａ．ＴＧＦ－β
形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）は、胚形成、創傷治癒、血管新生、および免疫調節に数多くの役割を有する多彩なサイトカインである。それは、哺乳動物細胞において３つのアイソフォーム、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３として存在する；ＴＧＦ－β１が免疫細胞内に最も支配的である（例えば、Esebanmen et al. (2017) Immunol. Res. 65:987-994を参照）。ＴＧＦ－βの免疫抑制剤としての役割は、ほぼ間違いなくその最も優位の機能である。腫瘍微小環境内の潜在型からのその活性化は、特に、ＤＣおよびそれが抗原特異的Ｔ細胞を寛容化する能力に顕著な免疫抑制効果を有する。ＴＧＦ－βはまた、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞を免疫抑制性Ｔｒｅｇに直接的に変換することができ、腫瘍トレランスをさらに促進する（例えば、Travis et al. (2014) Annu. Rev. Immunol. 32:51-82を参照）。その腫瘍特異的免疫抑制性機能に基づき、ならびにその公知のがん細胞成長および転移促進特性にかかわらず、ＴＧＦ－βの阻害は、がん治療の標的である。高レベルのＴＧＦ－βシグナル伝達は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含むいくつかのヒト腫瘍型で実証されている（例えば、Colak et al. (2017) Trends Cancer 3(1):56-71を参照）。ＴＧＦ－βの全身阻害は、許容できない自己免疫毒性をもたらす可能性があり、その阻害は、腫瘍微小環境に局在すべきである。これを遂行する一方法は、ＴＧＦ－βと結合するためのデコイとして作用する可溶性ＴＧＦ－β受容体を創出することである（例えば、Zhang et al. (2008) J. Immunol. 181:3690-3697を参照）。このように、本明細書に提供されるＴＧＦ－β受容体デコイを含有する腫瘍標的化免疫刺激細菌は、ＴＧＦ－βと結合し、腫瘍微小環境からそれを排除し、それにより、腫瘍の免疫トレランスを破壊し、抗腫瘍免疫を刺激することができる。
ＴＧＦ－ベータ結合性デコイ受容体に加えて、ＴＧＦ－βと結合し、腫瘍微小環境からそれを排除し、それにより、腫瘍の免疫トレランスを破壊し、抗腫瘍免疫を刺激することができる他のＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストは、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチドを含む。
腫瘍微小環境内、腫瘍内、特に、腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積する免疫刺激細菌であって、例えば、ＴＧＦ－ベータ結合性デコイ受容体（ＴＧＦ－β受容体デコイ）、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦベータアンタゴニストポリペプチドを含むＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストをコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌が、本明細書に提供される。抗体断片は、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃなどであるが、それに限定されるわけではない、当技術分野において公知の、または本明細書に記載される、任意のものを含み得る。
ｂ．二重特異性ｓｃＦｖおよびＴ細胞エンゲージャー（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）
ｓｃＦｖの使用は、多くの場合に、長いリンカーによって一緒につながった１つまたは複数のｓｃＦｖ断片（二重特異性、三重特異性など）の使用により、標的への結合価を増大させることによって改善されている。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）の商標で販売）コンストラクトは、がん免疫療法で利用される人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスであって、一方のｓｃＦｖが細胞傷害性Ｔ細胞の表面でＣＤ３と結合し、他方が特異的腫瘍関連抗原と結合するように、２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を連結することによって形成される。したがって、ＢｉＴＥ（登録商標）は、Ｔ細胞を腫瘍細胞に標的化し、ＭＨＣクラスＩまたは共刺激分子に依存せずに、Ｔ細胞活性化、サイトカイン産生、および腫瘍細胞細胞傷害性を刺激する。腫瘍抗原ＥｐＣＡＭ、およびＣＤ３に対し、悪性腹水の処置に使用されるカツマキソマブ、ならびに再発、難治性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の処置のために使用される、ＣＤ１９およびＣＤ３に対するＢｉＴＥ（登録商標）抗体であるブリナツモマブを含むＢｉＴＥ（登録商標）の２つの例が、ＦＤＡによって承認されている（例えば、Ahamadi-Fesharaki et al. (2019) Mol. Ther. Oncolytics 14:38-56を参照）。他のＢｉＴＥ（登録商標）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、Ｈｅｒ２、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、および黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）を含む他の抗原を標的化する。本明細書において例示されるように、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体はまた、免疫刺激細菌によるデリバリー後にプラスミドから発現され得る。
ｃ．抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、免疫応答の負の調節に関与する免疫阻害受容体である。その同族リガンド、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現され、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合した際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能の喪失をもたらし、Ｔ細胞トレランスを誘導する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ある特定のヒトがんにおいて腫瘍の侵襲性および生存低減と関連することが多い（例えば、Gao et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(3):971-979を参照）。
抗ＰＤ－１（例えば、ペムブロリズマブ、およびニボルマブ）および抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブ）抗体などの、免疫チェックポイントを遮断するように設計された抗体は、Ｔ細胞アネルギーを防止し、免疫トレランスを破壊することができる。しかし、処置された患者のごくわずかが臨床的利益を表し、それを表す患者は、自己免疫関連毒性を提示することが多い（例えば、Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373(16):1490-1492；およびTopalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366(26):2443-2454参照）。毒性を獲得する以外に、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１療法は抵抗性をもたらすことが多く、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）の併用は、臨床試験において限られた成功を示し、顕著な相加毒性を有する。毒性を制限し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断の効力を増強するために、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に対する抗体または抗体断片、例えばｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃ、および当技術分野において公知のまたは本明細書に記載されるその他をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌は、免疫細胞の活性化と相乗作用して抗腫瘍免疫を増強する。
ｄ．抗ＣＴＬＡ－４抗体
ＣＤ１５２（分化クラスター１５２）としても知られるＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答をダウンレギュレーションする、別の免疫阻害受容体である。ＣＴＬＡ－４は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、またはＴｒｅｇ）において構成的に発現され、それらの阻害機能に寄与するが、活性化後にだけ従来のＴ細胞においてアップレギュレーションされる。ＣＴＬＡ－４は、阻害シグナルをＴ細胞に伝達することによって免疫チェックポイントとして機能する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８と相同であり、両方の分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ８０（Ｂ７－１またはＢ７．１としても知られる）およびＣＤ８６（Ｂ７－２またはＢ７．２としても知られる）リガンドに結合する。ＣＴＬＡ－４のこれらのリガンドへの結合は、阻害シグナルをＴ細胞に伝達する一方で、ＣＤ２８の結合は刺激シグナルを伝達する。
Ｔ細胞の活性化後、ＣＴＬＡ－４受容体が誘導され、それは次いでＡＰＣ表面のＣＤ８０およびＣＤ８６リガンドとの結合をＴ細胞上のＣＤ２８受容体と競合して打ち負かす。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０およびＣＤ８６にＣＤ２８よりも大きな親和性およびアビディティーで結合することで、ＣＴＬＡ－４はそのリガンドをＣＤ２８と競合して打ち負かすことができ、Ｔ細胞への阻害シグナルの伝達および免疫阻害応答がもたらされる。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ－４の発現増大をもたらす。
最適なＴ細胞プライミングは、Ｔ細胞ＣＤ２８とＣＤ８０および／またはＣＤ８６とのライゲーションに起因する共刺激シグナルを必要とする。したがって、これらのリガンドへの結合からＣＴＬＡ－４を遮断することは、Ｔ細胞プライミングを増強し、抗腫瘍免疫応答の誘導を可能にする。
一部の実施形態では、本明細書に提供される免疫刺激細菌株は、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（例えば、例示的なヒト抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ断片についての配列番号４０３を参照）、および抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（例えば、例示的なヒト抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片についての配列番号４０２参照；実施例２０も参照）などであるが、それに限定されるわけではない、その断片を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体をコードするプラスミドを含有する。
ｅ．さらなる例示的なチェックポイント標的
それらに対するｓｃＦｖ、または任意の他の組換え抗体断片が調製され得るかまたは本明細書において例示される、例示的な免疫チェックポイント標的は、下の表に記載されるものを含むが、それに限定されるわけではない。
Figure 2023501539000018
５．免疫調節タンパク質の組合せは相乗効果および／または補完効果を有し得る
サイトカインは、抗腫瘍免疫応答の強力なモジュレーターである。サイトカインの組合せは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および骨髄細胞（樹状細胞およびマクロファージを含む）を伴う異なる免疫区画に顕著な相乗効果を有することが知られている。サイトカインは、樹状細胞による抗原プライミング、自然免疫細胞および抗原特異的Ｔ細胞の生存および増殖、ならびにＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害活性に主な役割を演じることが知られている。サイトカイン組合せは、生物学的応答を最大化し、抗腫瘍免疫を増強するように適切に選ばれなければならない。例えば、肝炎のネズミモデルにおいて、ＩＦＮ－α単独は、ウイルス感染細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能を増強することが見出されたのに対し、ＩＬ－１５単独は、活性化リンパ球の増殖を増強した。一緒になると、それらは、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染を最大限に抑制した（例えば、Di Scala et al. (2016) J. Virol. 90(19):8563-8574を参照）。別の例では、サイトカインＩＬ－１５＋ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５＋ＩＬ－２１の組合せは、ヒトＮＫおよびＴ細胞からのＩＦＮ－γの産生を増強することができた（例えば、Strengell et al. (2003) J. Immunol. 170(11):5464-5469を参照）。別の例では、ＩＬ－２＋ＩＬ－１８は、相乗的にＩＦＮ－γ産生を増強し、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫリンパ球の細胞溶解機能を増大させた（例えば、Son et al. (2001) Cancer Res. 61(3):884-888を参照）。その上、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８は、ヒトＴ細胞からのＩＦＮ－γの抗原－ＣＤ３ Ｔ細胞ライゲーションに非依存的な産生を相乗的に促進することが見出された（例えば、Tominaga et al. (2000) Int. Immunol. 12(2):151-160を参照）。サイトカインの組合せは、Ｔ細胞機能の強力なエンハンサーであるが、ＦＤＡ承認抗がんサイトカインは、全身投与には毒性が高すぎ、したがって、使用されることが稀であり、全身投与されるサイトカインの組合せは、毒性を複雑にするだけである（例えば、Conlon et al. (2019) J. Interferon Cytokine Res. 39(1):6-21を参照）。
本明細書に提供される免疫刺激細菌は、これらの問題を解決する。サイトカインの組合せ、ならびに／または本明細書に述べるＩ型インターフェロンの誘導物質などの他の治療用産物、および共刺激分子、ケモカイン、および抗体およびその断片を含むその他との組合せの腫瘍特異的デリバリーを可能にする免疫調節タンパク質などの複数の治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌が提供される。これらの免疫刺激細菌は、サイトカインおよび他の治療用産物の直接ＩＶ投与に関連する全身毒性および薬物動態（ＰＫ）の不利な点なしに強力で相乗的な免疫活性化を達成する。
本明細書に提供される免疫刺激細菌内のプラスミドにコードされ得る治療用産物の組合せは、例えば、２つ以上のサイトカイン；１つまたは複数のサイトカインおよびＩ型ＩＦＮの誘導物質（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、および構成的に活性なそのＧＯＦ変異体）、および／または共刺激分子（例えば、４－１ＢＢＬ、４－１ＢＢＬΔｃｙｔ、および本明細書に述べる４－１ＢＢＬの他の変異体）；ＴＧＦ－βデコイ受容体および１つまたは複数のサイトカイン；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩ型ＩＦＮの誘導物質；ＴＧＦ－βデコイ受容体、１つもしくは複数のサイトカイン、および／またはＩ型ＩＦＮの誘導物質、および／または共刺激分子；抗体（例えば、ＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイントに対するもの）および１つまたは複数のサイトカイン；抗体およびＩ型ＩＦＮの誘導物質；抗体、１つもしくは複数のサイトカイン、および／またはＩ型ＩＦＮの誘導物質、および／または共刺激分子；共刺激分子アゴニスト（例えば、ＣＤ４０アゴニスト）および１つまたは複数のサイトカイン；共刺激分子アゴニストおよびＩ型ＩＦＮの誘導物質；ならびに共刺激分子アゴニスト、１つもしくは複数のサイトカイン、および／またはＩ型ＩＦＮの誘導物質、および／または共刺激分子を含むが、それに限定されるわけではない。
下に述べるように、多重治療用産物発現カセットは、単一プロモーターコンストラクトおよび／または二重／多重プロモーターコンストラクトのみならず、転写後調節エレメント、および他の調節エレメント、例えば、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、シグナルペプチドなどを含み得る。核酸配列は、タンパク質の発現を増大させるためにコドン最適化することができ、一般的に真核生物プロモーターの制御下である。特定のコンストラクトおよびその詳細は、本明細書に別途記載されている。
本明細書に提供される免疫刺激細菌の中に、免疫刺激タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子）、ならびに／または腫瘍微小環境内の免疫応答を増大させる機能獲得型突然変異を有する遺伝子産物（例えば、Ｉ型ＩＦＮを誘導する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー）、ならびに／または抗体およびその断片、ならびに／またはＴＧＦ－βおよび／もしくはＩＬ－６デコイ受容体などの抗腫瘍応答を増強する他の治療用産物、ならびに／またはＴＧＦ－β拮抗ポリペプチドをコードするプラスミドを含有するものである。サイトカイン、機能獲得型産物／Ｉ型ＩＦＮ経路タンパク質、ならびに／またはケモカイン、ならびに／または共刺激分子、ならびに／または抗体およびその断片、例えば、本明細書に述べる単鎖抗体、ならびに他の治療用産物をコードするこれらの免疫刺激細菌は、腫瘍微小環境、腫瘍、および腫瘍常在性免疫細胞に優先的に浸潤する免疫刺激細菌を含む。免疫刺激細菌はまた、腫瘍常在性免疫細胞に、より少ない細胞死を誘導するようにゲノムが改変されたものを含み、その際、免疫刺激細菌は、腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積して、標的細胞における多重遺伝的ペイロードの高レベルの異所性発現を達成し、治療用産物／免疫調節タンパク質を腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に送達して、腫瘍に対する免疫応答を刺激する。特に、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、アデノシン栄養要求性、ｃｓｇＤ－、ｐａｇＰ－、ｍｓｂＢ－、フラジェリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐｕｒＩ－、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ならびに本明細書に記載される、あるいは腫瘍微小環境および／もしくは腫瘍常在性骨髄細胞への標的化もしくはその中での蓄積を改善すること、または安全性および耐容性（より高い用量を許容すること）を改善する、免疫抑制性のサイトカインプロファイルを低減する、Ｔ細胞の品質および機能を改善する、健康な組織における複製を限定する、バイオフィルムを無くす、および抗腫瘍免疫応答を改善する、または本明細書に別途述べる望ましく有利な特性のいずれかを与えることが知られている任意の他の改変を含むが、それに限定されるわけではない、本明細書に記載される最大約８つまたは８つの改変を含む。
免疫刺激細菌はさらに、特定の腫瘍に対する応答を増強するために、対象の腫瘍からの腫瘍抗原などの他の治療用産物をコードし得る。サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、および機能獲得型Ｉ型ＩＦＮ経路産物（複数可）などの治療用産物をコードするように、本明細書に提供される、上記および下記の免疫刺激細菌のいずれかを改変することができる。治療用産物は、宿主によって認識されるプロモーター、およびヒト、または他の動物、または哺乳動物の対象などの真核生物において認識される任意の他の所望の調節配列の制御下でプラスミドにコードされている。一般的に、産物をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。その上、改変のための本明細書に記載される細菌のいずれか、例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびエリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）の菌株、またはその弱毒化株、もしくはその改変株のいずれかは、宿主によって認識されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で治療用産物（複数可）をコードしている核酸を含有するプラスミドを導入すること、またはその核酸を細菌内のプラスミド上にコードさせることによって、改変することができる。治療用産物は、感染した対象の細胞内で発現される。免疫刺激細菌は、腫瘍、ＴＭＥおよび／または腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積するか、またはそれに優先的に感染するように改変された、本明細書に記載されるものを含む。例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ－ベータ、および／または本明細書に述べる他の治療用産物の発現または構成的発現をもたらす機能獲得型産物をコードしている免疫刺激細菌は、上皮細胞に感染する能力が低減しているかもしくはその能力を有さないようにさらに改変されるが、腫瘍常在性免疫細胞を含む食細胞に感染することができ、かつ／または免疫刺激細菌は、感染した食細胞を死滅させないように改変される。
本明細書に記載するように、ＳＰＩ－１経路および鞭毛に関連する遺伝子は、食細胞（免疫細胞）中のインフラマソームを活性化して、ピロトーシスをトリガーする。ＳＰＩ－１遺伝子および鞭毛をコードしている遺伝子をノックアウトすることは、食細胞のピロトーシスを減少させるかまたは無くし、また、上皮細胞の感染も無くし、食細胞の感染増大をもたらす。真核生物プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるものによって制御され、本明細書に述べる他の真核生物調節シグナルを含むプラスミド上にコードされている遺伝的ペイロード／治療用産物を中で発現する食細胞、特に腫瘍常在性免疫細胞、例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、および樹状細胞（ＤＣ）などに蓄積する免疫刺激細菌が提供される。発現される治療用産物は、免疫応答を誘起するもの、例えば、腫瘍微小環境内の宿主応答を増大させるＩ型インターフェロンを増大または誘導する経路を経由するものなどを含む。免疫刺激細菌はまた、本明細書に述べる免疫刺激タンパク質、例えばＩＬ－２および／もしくは他のサイトカイン、ならびに／または他の免疫刺激タンパク質および治療用産物をコードし、腫瘍微小環境内で免疫応答をさらに増強し得る。
免疫刺激細菌は、細胞の細胞質ゾル中で核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチド、および他のそのような分子などに曝露された場合に免疫応答を誘起する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーと称される産物をコードし得る。本明細書における免疫刺激細菌は、免疫応答を構成的に誘起し、細胞質ゾル中のＤＮＡ／ＲＮＡの存在を必要としない、改変治療用産物をコードする。その例は、Ｉ型インターフェロン発現を誘導する経路の成分である。本明細書において企図される治療用産物は、構成的活性または活性増大を有する、これらの細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの改変型（すなわち、機能獲得型産物）を含み、それにより、Ｉ型インターフェロン（複数可）は、細胞の細胞質ゾル中のヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチド、および他のそのようなリガンドの非存在下で発現または産生される。細胞内、特に、腫瘍常在性免疫細胞を含む腫瘍細胞内でのこれらの改変産物の発現は、腫瘍微小環境内のインターフェロン－βを含むＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらす。これらの機能獲得型産物を発現する免疫刺激細菌は、腫瘍細胞／ＴＭＥ／腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積するかまたはそれに優先的に感染するので、治療用産物は、腫瘍微小環境内に発現され、腫瘍微小環境内の免疫応答の増大をもたらす。
免疫刺激細菌および他の媒体中にコードされ得る例示的な遺伝子産物は、細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡを認識し、Ｉ型インターフェロン産生を活性化する、自然経路を感知するまたはそれに関与するタンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。Ｉ型インターフェロンを活性化する、自然ＤＮＡ／ＲＮＡ認識に関与するタンパク質は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１／ＲＩＰＫ１、Ｓｅｃ５／ＥＸＯＣ２、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２／ＤＨＸ５８、ＤＤＸ３／ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＸ９／ＤＤＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５／ＤＤＸ１５、ＤＨＸ３３／ＤＤＸ３３、ＤＨＸ３６／ＤＤＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、それに限定されるわけではない。構成的Ｉ型インターフェロン発現をもたらすこれらのタンパク質のいずれかにおける機能獲得型突然変異は公知であるか、または特定することができ、突然変異体は、食細胞の感染、または腫瘍細胞への標的化および結合によるなどして、免疫刺激細菌によって腫瘍微小環境に送達することができる。
機能獲得型突然変異は、構成的Ｉ型インターフェロンの発現に起因する障害を有する個体から特定されたものを含む。機能獲得型産物の例は、インターフェロン症を有する対象に存在するものである。上述のように、スクリーニングによって突然変異を特定して、同様に機能獲得型産物を生成することができる。
治療用産物をコードする核酸をさらに改変して、発現のための特性を改善することができる。改変は、例えば哺乳動物対象、特にヒト対象における転写効率を増大させるためのコドン最適化、例えばＧＣ含量またはＣｐＧジヌクレオチド含量の低減、潜在スプライシング部位の除去、真核細胞における発現を改善するためにＣｐＧアイランドを付加または除去（全般的に除去）すること、ならびに転写効率を増大させるためのＴＡＴＡボックスおよび／または末端シグナルの置換を含む。コドンは、コドン使用頻度のバイアスを変更すること、ＧＣ含量を減少させること、ｍＲＮＡの二次構造を減少させること、未熟なＰｏｌｙＡ部位を除去すること、ＲＮＡ不安定性モチーフ（ＡＲＥ）を除去すること、ｍＲＮＡの安定自由エネルギーを低減すること、内部カイ部位およびリボソーム結合部位を改変すること、ならびにＲＮＡの二次構造を低減することによって翻訳効率を増大させるために最適化することができる。発現を改善するため、および細菌適応度を維持または増強するための追加的な改変が、免疫刺激細菌内に組み込まれている。これらは、下の節に記載されており、下の実施例に詳述され、例示されている。
上記のように、一本鎖および二本鎖ＲＮＡの、環状ジ－ヌクレオチド（ＣＤＮ）、および核酸の他のそのような形態などの細胞内核酸の宿主認識によって媒介されるＩ型インターフェロン誘導経路は、Ｉ型ＩＦＮを誘導する。細胞質ゾル中の一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの宿主認識によって媒介されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）非依存性Ｉ型ＩＦＮ経路もある。これらは、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）を含むＲＮＡヘリカーゼによって、ＩＲＦ３転写因子のＩＦＮ－βプロモーター刺激物質１（ＩＰＳ－１）アダプタータンパク質媒介リン酸化を経由して感知され、ＩＦＮ－βの誘導をもたらす（例えば、Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919を参照）。本明細書に述べるように、これらの経路におけるタンパク質を改変することができ、またはＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含むＩ型インターフェロン（インターフェロン１型とも称される）の構成的発現をもたらす変異体として存在することができる。そのようなタンパク質の例は、インターフェロンが誘導の非存在下で発現されるようにＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらす突然変異を有するものを含む、本明細書に提供される改変ＳＴＩＮＧポリペプチド、ならびにＣ末端尾部（ＣＴＴ）部分が第２の種からのＳＴＩＮＧタンパク質からのＣＴＴ部分により置換されたものなどのキメラＳＴＩＮＧタンパク質でもあり、その際、第２の種のＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性よりも低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有するが、ＣＴＴ内のＴＲＡＦ６結合部位は欠失していてもよい。
本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた治療法は、チェックポイント阻害剤療法を含む任意の他の抗がん治療、ならびに上述および本明細書の別途述べるように他のがん処置および化学療法と組み合わせることができる。
６．併用療法をもたらす免疫刺激細菌
本明細書における免疫刺激細菌を使用して、１つよりも多い治療用産物、特に抗がん治療のためのものを提供することができる。一般に産物は、抗腫瘍免疫応答を増強およびリプログラムするための相補的産物である。免疫刺激細菌は、本明細書に記載されるゲノム改変のおかげで、特に、ａｓｄ－、フラジェリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐａｇＰ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、アデノシン栄養要求性、ｍｓｂＢ－、ａｎｓＢ－、および本明細書に別途記載されるまたは当業者に公知の任意の他の改変のいくつかまたは全部の組合せのおかげで、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内に蓄積し、腫瘍常在性免疫細胞（骨髄細胞）に感染する。免疫刺激細菌は、宿主によって認識される１つまたは複数のプロモーター、およびヒト、または他の動物、または哺乳動物の対象などの真核生物において認識される任意の他の所望の調節配列の制御下で相補的治療用産物をコードしているプラスミドを含有して、コードされている産物の発現および産物の分泌も引き起こす。免疫刺激細菌は、ＴＭＥ内に、特に骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、および樹状細胞（ＤＣ）を含む腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積し、コードされている治療用産物がそこで発現され、次いで腫瘍微小環境内に分泌されて、抗腫瘍効果を達成する。産物の適切な組合せによって、様々な産物と宿主免疫系との相互作用のおかげで、抗腫瘍効果を増強することができる。
本明細書に別途述べるように、単一のプロモーターおよびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有して治療用産物をコードするプラスミドを含有する免疫刺激細菌は、ｃａｐ非依存的なウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用により、または２Ａペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ）の翻訳リードスルーおよびその後の同等発現される共タンパク質への自己切断によって、２つ（以上）のタンパク質を発現させることができる。あるいは、遺伝的ペイロード／治療用産物は、各タンパク質が別々のプロモーターの制御下で発現される二重または多重プロモーターコンストラクトを使用して発現させることができる。３つ以上のタンパク質を発現させるための単一および二重／多重プロモーターコンストラクトの組合せもまた、プラスミド上に含まれ得る。一般的に、治療用産物をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。例えば、プロモーターは、ＥＦ－１α、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵＢＣ、ＣＢＡ、ＰＧＫ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＥＩＦ４１Ａ、ＣＡＧ、ＣＤ６８、および合成ＭＮＤプロモーターを含むが、それに限定されるわけではない。プラスミドは、コードされている治療用産物の発現および／または分泌を増強または増大することができる他の調節エレメント、例えば、転写後調節エレメント（ＰＲＥ；例えば、ＷＰＲＥ、ＨＰＲＥ）、ポリアデニル化シグナル配列、ターミネーター、エンハンサー、分泌シグナル（シグナルペプチド／配列、リーダーペプチド／配列としても知られる）、ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、および本明細書に別途記載される、または当業者に公知の他の調節エレメントを含有し得る。
プラスミド上にコードされている遺伝的ペイロードまたは治療用産物は、免疫刺激タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子など；Ｉ型ＩＦＮおよびその機能獲得型の／構成的に活性な突然変異体／変異体を誘導する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー；抗体およびその断片；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］；ＴＧＦ－β、またはＴＧＦ－β拮抗ポリペプチドとの結合についてのデコイとして作用する可溶性ＴＧＦ－β受容体；ＩＬ－６結合デコイ受容体；干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）；ならびに下述の、および本明細書に別途述べられる、および当技術分野において公知の、他の治療用産物；ならびに前記治療用産物の全部の相補的組合せを含む。一部の実施形態では、サイトカインは、膜アンカーモチーフ、例えば膜貫通ドメイン、およびコラーゲン結合ドメインと共に免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされ得る。
プラスミド上にコードされ得るサイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子を含む免疫刺激タンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／または持続に関与するかまたはそれを引き起こすもしくは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、細胞質ドメインに欠失を有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ならびに腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーを含むが、それに限定されるわけではない。免疫刺激タンパク質はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現のために、完全長細胞質ドメインを有する、または切り詰められた細胞質ドメイン欠失、もしくは部分的な細胞質ドメイン欠失、もしくは適切な配向性を保証するための改変を有する部分的な細胞質ドメイン欠失を有する、切り詰められた共刺激分子、例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１およびＯＸ４０Ｌなどを含み、そこで切り詰められた遺伝子産物は、共刺激受容体のエンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失により、ＡＰＣに対抗調節シグナル伝達できない。
Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導または活性化する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーは、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、およびＩＲＦ７、ならびにその機能獲得型（ＧＯＦ）または構成的に活性な変異体を含むが、それに限定されるわけではない。ＤＮＡ／ＲＮＡの認識に関与する他のタンパク質であって、構成的Ｉ型ＩＦＮ発現を生成するために突然変異させることができ、プラスミド上にコードされ得る、Ｉ型ＩＦＮ応答を活性化する他のタンパク質は、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、それに限定されるわけではない。
本明細書における免疫刺激細菌によって送達されるプラスミド上にコードされ得るかまたは抗腫瘍応答を増強または増大する細菌と同時投与され得る他の治療用産物は、抗体およびその断片、例えば、ＴＧＦ－β阻害抗体；抗ＩＬ－６抗体；チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４に対する抗体；ならびにＶＥＧＦ、ＣＤ７３、ＣＤ３８、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、メソセリン、およびＢＣＭＡに対する抗体またはその阻害剤を含むが、それに限定されるわけではない。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］、ＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦ－ベータ結合性デコイ受容体、およびＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストもまた、プラスミド上での発現、または本明細書における免疫刺激細菌との同時投与のために企図されている。これらの抗体、阻害剤、またはデコイ受容体のいずれかは、本明細書における免疫刺激細菌と同時投与することができる。一部の実施形態では、ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ）－リボースポリメラーゼ）阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤および／または化学療法もまた、単独または任意の組合せで上記の治療用産物のいずれかと同時投与することができる。
本明細書における免疫刺激細菌内のプラスミド上にコードされ得る治療用産物の相補的組合せの例は、
ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－２およびＩＬ－２１；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ならびにＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体と；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体と；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）と；
ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびにＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体と
を含むが、それに限定されるわけではない。
４－１ＢＢＬを含むすべての組合せにおいて、４－１ＢＢＬ分子は、完全長タンパク質（例えば、ヒトおよびマウス４－１ＢＢＬについてそれぞれ配列番号３８９および３９３を参照）；細胞質ドメインが欠失している４－１ＢＢＬ変異体（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ；例えば、それぞれヒトおよびネズミ４－１ＢＢＬΔｃｙｔについて配列番号３９０および３９４を参照）；切り詰められた（すなわち、完全には欠失していない）細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ変異体（４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃ；例えば、例示的なヒトおよびマウス４－１ＢＢＬｃｙｔ ｔｒｕｎｃ変異体について配列番号３９１～３９２および配列番号３９５～３９６を参照）；またはリン酸化部位として作用する１つもしくは複数のＳｅｒ残基が適切な１つもしくは複数の座位で置換されている、例えばヒト４－１ＢＢＬについて、配列番号３８９を参照して、Ｓｅｒ５およびＳｅｒ８が逆シグナル伝達を低減するかまたは無くす残基で置換されている、改変細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ分子であり得る。その上、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含むすべての組合せは、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片、例えば抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（例えば、それぞれ例示的なヒトおよびマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ断片について配列番号４０３および４０４を参照）、または抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（例えば、それぞれ例示的なヒトおよびマウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片について、配列番号４０２および４０５を参照）を含み得る。その上、ＴＧＦ－β受容体デコイは、例えば、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチドを含む、腫瘍微小環境からのＴＧＦ－βと結合してそれを除去できる他のＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストによって置換され得る。
下の表は、免疫刺激細菌内のプラスミド中にコードされ得る例示的な産物およびそのような産物のいくつかの効果／特徴を記載するものである。
Figure 2023501539000019

*DC = 樹状細胞
上記の相補的組合せのいずれかでは、ＴＧＦ－βデコイ受容体をＴＧＦ－β拮抗ポリペプチドにより置換することができる。上述のように、ＴＧＦ－βデコイ受容体は、ＴＧＦ－βと結合してそれを排除するためのデコイとして作用するいずれかであるかまたはＴＧＦ－β拮抗ポリペプチド（例えば、抗ＴＧＦ－ベータ抗体もしくは抗体断片、および抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体もしくは抗体断片）である。Ｉ型ＩＦＮの産生を誘導または活性化するＳＴＩＮＧタンパク質または他のＤＮＡ／ＲＮＡセンサーは、ＧＯＦ／構成的活性変異体の場合があるかまたは本明細書に記載および提供される改変ＳＴＩＮＧポリペプチドおよびキメラＳＴＩＮＧポリペプチドを含む野生型タンパク質の場合がある。上記の相補的組合せのいずれかはまた、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗メソセリン抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、およびその抗体断片のみならず、ＰＡＲＰ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、または化学療法、およびその組合せのうち任意の１つまたは複数と組み合わせて投与され得る。
本明細書に提供されるプラスミドおよび免疫刺激細菌は、治療的ペイロードの組合せをコードする。これらは、上の表に記載される産物のいずれかまたはすべてをコードしている核酸の組合せを含む。
相補的ペイロードの組合せを評価したが、例示的な組合せおよびそれらの効果を実施例に記載する。抗原特異的Ｔ細胞の活性化に対する、および骨髄細胞による、抗腫瘍Ｔ細胞の動員に関与する主なケモカインであるＣＸＣＬ１０の分泌に対する、ペイロードの様々な組合せの効果を評価した。例えば、ペイロードの組合せは、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）によるＣＸＣＬ１０の強い分泌を誘導することができる。ＩＬ－３６γをＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴと組み合わせることは、ＢＭＤＣによるＣＸＣＬ１０およびＩＦＮ－γのより高い分泌をもたらした（実施例２６を参照）。多くの組合せは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（例えば、４－１ＢＢの発現）の活性化、およびＩＦＮ－γの分泌を誘導する。実施例（実施例２６参照）における結果は、特定のサイトカイン組合せがＴ細胞を活性化できることを示す。例えば、ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋ＩＦＮ－α２；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋抗４－１ＢＢアゴニスト抗体；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－３６γ；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－２１；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－２１＋ＩＬ－３６γ；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－３６γ＋ＩＦＮ－α２；ＩＬ－１２ｐ７０＋ＩＬ－３６γ＋抗４－１ＢＢアゴニスト抗体；ＩＬ－１５＋ＩＬ－３６γ＋ＩＦＮ－α２；およびＩＬ－１５＋ＩＬ－３６γ＋抗４－１ＢＢアゴニスト抗体の組合せは、Ｔ細胞から高レベルのＩＦＮ－γの分泌をもたらすが、分泌されるＩＬ－６は比較的低レベルであり、したがってそれらは、腫瘍微小環境内の抗腫瘍免疫の誘導のための最適なＴ細胞活性化に理想的な組合せとなる。
その上、サイトカイン（ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－３６γ）と４－１ＢＢエンゲージメントとのいくつかの組合せは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞について抗ＣＤ３εアゴニスト抗体によるＴＣＲ刺激を行っておよび行わずに高レベルのＩＦＮ－γを分泌するようにＴ細胞を活性化する。本明細書に記載されるＳＴＩＮＧ変異体のみならず、ＩＬ－１２は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的活性化を増大させることができる。データ（実施例２４参照）はまた、結腸直腸癌のマウス（ｍｕ）モデルにおいて、ＩＬ－１５、または４－１ＢＢＬΔｃｙｔ＋ＩＬ－１２の組合せを発現している免疫刺激細菌株が、４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）またはＩＬ－１２単独を発現している同じ株よりも腫瘍成長阻害を強力に阻害するが、高い完全奏効率（治癒率５０％）をもたらしたことを示した。他の組合せも試験し、それらがインビボで強力な抗腫瘍活性を有することを示した。
ペイロードの組合せは、共刺激分子、例えば、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、もしくは４－１ＢＢＬポリペプチド、またはその細胞質欠失もしくは切り詰め変異体の１つ、および／または本明細書において記載および例示されるその改変型；あるいは抗免疫チェックポイント抗体またはその断片、例えば抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（それぞれ実施例２０ならびに配列番号４０２および４０３を参照）；１つまたは複数のサイトカイン／ケモカイン、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－α２、およびＣＸＣＬ１０；ＴＧＦ－β結合性デコイ受容体および他のＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニスト、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと融合したヒト可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｈｕ ｓＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ；配列番号４０７）、抗ＴＧＦ－ベータ抗体または抗体断片、抗ＴＧＦ－ベータ受容体抗体または抗体断片、および可溶性ＴＧＦ－ベータアンタゴニストポリペプチド；ならびに本明細書に記載および例示されるＳＴＩＮＧタンパク質または改変および／もしくはキメラＳＴＩＮＧタンパク質のうち１つまたは複数を含み得る。
本明細書に述べるように、これらのペイロード／産物／ポリペプチドは、単一のプロモーター（すなわち、単一プロモーターシステム）、および必要に応じて他の調節配列の制御下でポリシストロンコンストラクトとしてコードされている場合があり、２Ａポリペプチドまたは個別の産物の翻訳をもたらす他のそのようなポリペプチドも含み得る。ペイロードはまた、それぞれ異なるプロモーターの制御下で２つの別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するプラスミド上に発現され得る（すなわち、二重プロモーターシステム）。プラスミド上にコードされている順序で、ポリシストロンコンストラクト中にコードされている２Ａペプチドを含む、ペイロードの例示的な組合せは、下の表に示される。
産物の例示的な組合せおよびプラスミド上の例示的な順序
Figure 2023501539000020

Figure 2023501539000021

*4-1BBL = 細胞膜に対して正しい配向性を保持するために残りの細胞質ドメインをより大きく陽性にするために細胞質切り詰めおよび残基改変を有する改変4-1BBL。
**キメラSTING=タスマニアンデビルCTTおよび置換R284G/N154Sを有するSTING 。
sTGFβRIIFc# = II型受容体ベータグリカン。
本明細書に提供される免疫刺激細菌の性質、例えば、腫瘍常在性骨髄細胞内およびＴＭＥ内での蓄積など、および発現され得る産物／ペイロードの組合せは、がん免疫サイクルをカバーするように選択することができる。サイクル中の各工程、ならびに免疫刺激細菌およびペイロードの役割は、以下のように要約される：
１）がん細胞抗原の放出 － 免疫刺激細菌が腫瘍常在性骨髄細胞内に蓄積する；
２）がん抗原提示 － 本明細書に提供される免疫刺激細菌は、免疫刺激物質、例えばＳＴＩＮＧポリペプチドおよびその変異体、ならびにＩＬ－１２をコードおよび発現し、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含むＩ型インターフェロンの発現をもたらす；
３）プライミングおよび活性化 － 免疫刺激細菌は、ＳＴＩＮＧポリペプチドおよびその変異体、ならびに共刺激タンパク質、例えば４－１ＢＢＬ、およびＩＬ－１２をコードする；
４）Ｔ細胞の腫瘍への輸送 － コードされているＳＴＩＮＧ変異体が発現され、結果としてのＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βの発現をもたらす；
５）腫瘍へのＴ細胞の浸潤 － 免疫抑制性骨髄細胞の血管漏出および再分極；
６）Ｔ細胞によるがん細胞認識 － Ｉ型ＩＦＮ、およびＩＦＮγ、およびＭＨＣのアップレギュレーション；ならびに
７）がん細胞の殺滅 － Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ－γの放出、および可溶性ＴＧＦ－βデコイ受容体の発現を誘導する、コードされているサイトカイン／ケモカイン、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および／またはＩＬ－３６γなどの組合せ。
当業者は、本明細書における開示およびその知識に基づき、免疫活性化効果および／または免疫抑制効果を有して、本明細書に提供される免疫刺激細菌の抗腫瘍活性を増強する、ポリシストロンコンストラクト上にコードされている場合の他の産物ペイロードの組合せおよび産物の他の順序を特定することができる。
Ｅ．細菌デリバリーのための治療用産物をコードする例示的プラスミドの構築
本明細書の免疫刺激細菌は、抗腫瘍応答を促進または誘導または増強する１または複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）の治療用産物、例えば免疫調節性タンパク質をコードするように改変することができる。治療用産物は、真核生物の対象、特に、免疫刺激細菌が投与されることになる対象、例えばヒトにおける発現のために、真核生物プロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターの制御下で、細菌中のプラスミド上にコードされ得る。治療用産物をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞における発現または輸送のための、例えば、細胞表面上での分泌または発現ための他の調節シグナルを含むことができる。免疫刺激タンパク質は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）などの適切な環境において、免疫刺激細菌が投与される対象において抗腫瘍応答を促進する、または抗腫瘍応答に関与する、または抗腫瘍応答を増強することができるものである。免疫刺激タンパク質としては、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子が挙げられる。これらには、サイトカイン、例えば、限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱したＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βに結合できないように改変されているＩＬ－２；ケモカイン、例えば、限定されないが、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１；Ｔ細胞の動員および／もしくは持続に関与しているか、もしくはそれを引き起こすかもしくは増強するタンパク質；ならびに／または共刺激分子、例えば、限定されないが、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、切り詰められた細胞質ドメインまたはそうでなければ改変され切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、およびＢ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバーが挙げられる。当業者に既知である、腫瘍の処置に使用される、または抗腫瘍応答を促進する、増強する、もしくはそうでなければ増大する、もしくは誘起する他のそのような免疫刺激タンパク質は、本明細書で提供される免疫刺激細菌においてコードするために企図される。
本明細書の免疫刺激細菌によってコードされている他の治療用産物としては、Ｉ型インターフェロン産生を誘導または活性化する細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、例えば、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７、ならびにそれらの機能獲得型の構成的に活性な変異体が挙げられる。例えば、構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体には、突然変異Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｃ２０６Ｙ、Ｒ２８１Ｑおよび／またはＲ２８４Ｇ、例えばＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを有するもの、ならびに本明細書に記載の、および当技術分野で既知の他のものが含まれ、一方で、構成的に活性なＩＲＦ３変異体としては、突然変異Ｓ３９６Ｄ、Ｓ３９８Ｄ、Ｓ４０２Ｄ、Ｔ４０４Ｄおよび／またはＳ４０５Ｄ有するもの、ならびに本明細書に記載の、および当技術分野で既知の他のものが挙げられる。本明細書の免疫刺激細菌によってコードされている他の治療用産物には、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、合成抗体、組換えで生成した抗体、多重特異性抗体（例えば、２重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体およびイントラボディまたは上記のいずれかの抗原結合性断片を含めた抗体および抗体断片が含まれる。抗体は、免疫チェックポイント、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ１および２，ＣＴＮＮＢ１（β－カテニン）、ＳＩＲＰα、ＶＩＳＴＡならびにＴＲＥＸ－１、ならびに当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の他のものに対して向けられるもの、または他の標的、例えば、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３およびＩＬ－６、ならびにその阻害が抗腫瘍応答を改善する他のそのような標的に対するものでもよい。免疫刺激細菌は、免疫チェックポイント、例えばＴＲＥＸ１、およびその阻害、抑制または破壊が抗腫瘍応答を改善する他の標的に対するＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）をコードすることもできる。
一部の実施形態では、本明細書の免疫刺激細菌は、免疫系を刺激化するために、限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２［ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）］、ＩＬ－１５（およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体）、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＦＮ－アルファならびにおよびＩＦＮ－ベータを含めた１または複数のサイトカインをコードし、発現するように操作されている。サイトカインは、腫瘍部位においてエフェクター細胞および間質細胞を刺激化し、細胞傷害性細胞による腫瘍細胞認識を増強する。一部の実施形態では、免疫刺激細菌は、ケモカイン、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１などの１つまたは複数をコードし、発現するように操作され得る。免疫刺激細菌の抗腫瘍有効性を増強するために、治療用産物のいずれかの相補的組合せがコードされ、腫瘍微小環境に送達され得る。これらの改変、およびそれらをコードする免疫刺激細菌は上述され、以下に例示される。
１．タンパク質の異種発現のための構成的プロモーター
本明細書で提供されるプラスミドは、治療用産物、例えば、哺乳動物対象で発現された場合に、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードするように設計されており；免疫刺激タンパク質または他の治療用産物は、真核生物プロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩ）によって認識されるプロモーターの制御下にある、細菌中のプラスミド上にコードされている。一般に、プロモーターは構成的プロモーター、例えば、後期真核生物ウイルスプロモーターである。例示的プロモーターとしては、限定されないが、数ある中でも、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターおよびその派生的プロモーターＣＡＧＧまたはＣＡＧ、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有し、負の制御領域が欠失した、改変されたＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）、真核生物開始因子４Ａ－Ｉ（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ならびにＧＡＰＤＨプロモーターが挙げられる（例えば、Powell et al. (2015) Discov. Med. 19(102):49-57を参照されたい）。ＣＡＧプロモーターは、（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；（Ａ）プロモーター、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロン；ならびに（Ｇ）ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライス受容体からなる。ＭＮＤは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有し、負の制御領域が欠失した、改変されたＭｏＭｕＬＶ［モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーターである（マウス白血病ウイルス由来ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位の置き換え（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ））；例えば、Li et al. (2010) J. Neurosci. Methods 189:56-64）を参照されたい。
これらのプロモーターの２つ以上は、プラスミド上の複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にコードされ得る。限定されないがＣＭＶを含めて、ある特定のプロモーターは、複数のｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）部位を含む。これらのエレメントを含むプラスミド、例えば、細菌の破壊後に細胞質ゾルに放出される、ネズミチフス菌内に含まれるプラスミドが細胞質ゾルに放出される場合、プラスミドは、ＣＲＥＢ媒介性宿主微小管機構を使用して効率的に核にシャトルされる（例えば、Bai et al. (2017) Biosci. Rep. 37(6):BSR20160616を参照されたい）。
プラスミドは、例えばａｓｄの発現のための細菌プロモーターおよび治療用産物の発現のための真核生物プロモーターを含めて、多重プロモーターを含むことができる。治療用産物の発現を改善するため、ならびに細菌の増殖および適応度を改善するために、プロモーターおよび他の調節配列の様々な構成が評価された。以下の実施例（実施例３０を参照されたい）に示すように、試験した構成の中で、プラスミド上の真核生物発現カセットの配向性を逆にすること、および１つまたは複数の細菌ターミネーターを含むことが、コードされているペイロードの発現の効率を高めることができ、かつ細菌の適応度を改善することができる。
２．複数の治療用産物発現カセット
ａ．単一プロモーターコンストラクト
同じ細胞における、単一コンストラクトからの複数の遺伝子の発現は、いくつかのタンパク質の共発現が、所望の生物学的効果、例えば抗腫瘍応答を誘発するのに必要とされる場合に、達成することができ、かつ有利である。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、単一プロモーターの制御下にある２つのコード配列を分離するために使用されたが、第１のタンパク質と比較して第２のタンパク質の発現レベルが低減している可能性があり、特定の場合に、例えば、パッケージング能力が小さいウイルスを使用する場合に、ＩＲＥＳ配列の長さが禁制的である可能性がある。リボソームスキッピングイベントを媒介する、２Ａペプチドとして知られる短い（約１８～２２アミノ酸長）ウイルス由来ペプチド配列の発見によって、単一ｍＲＮＡから同様のレベルで複数の個別のペプチド産物を産生することが可能になる。２Ａペプチドコード配列は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子間に含まれる（例えば、Daniels et al. (2014) PLoS One 9(6):e100637を参照されたい）。
ＩＲＥＳおよび２Ａペプチドは、１つの転写物における複数の遺伝子の共発現のために、異なるメカニズムを使用する。例えば、１つのｍＲＮＡで複数の遺伝子を発現させるためにＩＲＥＳを使用する場合、プロモーターの直接下流の遺伝子は標準のキャップ依存性メカニズムによって翻訳され、ＩＲＥＳの下流のものはキャップ非依存性メカニズムによって翻訳され、これは、キャップ依存性メカニズムよりも翻訳効率が低く、不均衡な発現をもたらし、ＩＲＥＳに駆動される遺伝子の発現がより低くなる（例えば、Chng et al. (2015) mAbs 7(2):403-412を参照されたい）。これに反して、２Ａで連結された遺伝子は、１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で翻訳される。２Ａ配列によって分離されているタンパク質の切断は、非通常性のプロセスで同時翻訳で起こり、この場合、２ＡペプチドのＣ末端のグリシンおよびプロリンの間でペプチド結合が形成されないことが多い（すなわち、ペプチド結合が「スキップされる」）。これにもかかわらず、翻訳は進行し、２つの別々のタンパク質が等量で産生される。２Ａペプチド配列のおよそ２０アミノ酸をコードするより短いストレッチは、結合スキッピングを引き起こすのに十分である。しかし、結合スキッピングが起こらない場合、その後に切断されない融合タンパク質が生成される（例えば、Daniels et al. (2014) PLoS One 9(6):e100637を参照されたい）。
限定されないが、数ある中でも、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ（配列番号３２７）、ブタテッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ（配列番号３２８）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来のＥ２Ａ（配列番号３２９）、および口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ（配列番号、３３０）を含めて、これらの２Ａペプチド多くは記載されている。異なる研究が、様々な２Ａペプチドの矛盾する切断効率を報告しており、２Ａペプチドの切断効率は、発現されるタンパク質の性質、２Ａ配列に隣接する遺伝子の順序、使用される２Ａペプチドの長さ、および上流タンパク質と２Ａペプチドの間のリンカーに影響を及ぼされ得る。切断効率および増強されたタンパク質発現は、上流のウイルス切断配列、例えば、限定されないが、ペプチドフューリン切断配列、ＲＲＫＲを使用して、および２Ａペプチドの直前にＧＳＧおよびＳＧＳペプチドリンカー、Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＵＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）または３×Ｆｌａｇエピトープタグを挿入することによって改善することができることが多い（例えば、Chng et al. (2015) mAbs 7(2):403-412を参照されたい）。
単一プロモーターおよびＯＲＦとともに、治療用産物、例えば免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドを含む本明細書の免疫刺激細菌は、キャップ非依存性であるウイルス配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、または２Ａペプチドの翻訳リードスルー、およびその後の等しく発現される共タンパク質への自己切断を通して、２種以上のタンパク質を発現することができる。プラスミドは、本明細書において以下および他の個所で述べるように、他の調節エレメントを含むことができる。例えば、例示的コンストラクト（実施例１４を参照されたい）はＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２ ＣＯ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＦＮ－α２－ＷＰＲＥであり、この場合、ＣＭＶプロモーターおよびＴ２Ａペプチドを使用して、コドン最適化されたマウスＩＬ－２がマウスＩＦＮ－α２とともに共発現される。さらに、発現を増強するために、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。例えば、第３の治療用産物がプラスミドによって発現される場合、２Ａ配列は、第１のプロモーター、例えばＣＭＶの制御下で発現される最初の２つのタンパク質に隣接し、第３のタンパク質は、第２のプロモーター、例えばＥＦ－１αの制御下でコードされている。そのようなコンストラクトの例は、ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５ｓｃ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ＋ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－１８－ＷＰＲＥであり、この場合、Ｔ２Ａを使用して、マウス１５Ｒα／ＩＬ－１５ｓｃと置換Ｒ２８３Ｇを有するマウスＳＴＩＮＧとがＣＭＶプロモーターの制御下で共発現され、マウスＩＬ－１８がＥＦ－１αプロモーターの制御下で個別に発現される。この例示的コンストラクトは、発現の増強のためにＷＰＲＥも含む。
ｂ．二重／多重プロモーターコンストラクト
あるいは、遺伝子ペイロード／治療用産物は、二重または多重プロモーターコンストラクトを使用して発現させることができ、この場合、各タンパク質は個別のプロモーターの制御下で発現される。したがって、組み合わせて発現される治療用産物、例えば免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドは、多重プロモーターを含むことができ、それぞれが適切な停止コドンプロセシングを有する個々のインタクトなＯＲＦを制御する（すなわち、二重／多重プロモーターコンストラクト）；または複数のタンパク質を、２Ａペプチドを使用して単一ＯＲＦで発現させることができる（すなわち、単一プロモーターコンストラクト）；またはプラスミドは、上記のように、３種以上タンパク質を発現させるために、単一プロモーターコンストラクトと二重／多重プロモーターコンストラクトの混合物を含むことができる。
３．調節エレメント
ａ．転写後調節エレメント
単一プラスミドからの単一および複数の治療用産物／免疫調節性タンパク質の発現を増強するために、目的のタンパク質の転写および翻訳を増強する調節エレメント用いることができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（ＷＰＲＥ）は、ＯＲＦの３’非翻訳領域に挿入された場合に、発現レベルを数倍増強することができる（例えば、Zufferey et al. (1999) J. Virol. 73(4):2886-2892を参照されたい）。同様に、限定されないが、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）を含めて、他のそのようなエレメントも発現を増強することができる。単一プラスミド上の複数のタンパク質の発現を改善するために、これらの組合せを複数のＯＲＦの３’末端で使用することができる。
ＷＰＲＥおよびＨＰＲＥ ＰＲＥは、核からのｍＲＮＡ移行を促進することによって細胞質ｍＲＮＡの蓄積を増大することができ、転写後プロセシングおよび安定性を増強することができる、ヘパドナウイルスのシス作用性ＲＮＡエレメントである。
ｂ．ポリアデニル化シグナル配列およびターミネーター
タンパク質発現を増強することができるプラスミド上の他のエレメントとしては、ポリアデニル化シグナル配列およびターミネーターが挙げられる。ポリアデニル化は、ｍＲＮＡ転写物の３’末端へのポリ（Ａ）テールの転写後付加であり、これは、翻訳のための成熟ｍＲＮＡを産生するプロセスの一部である。ポリアデニル化シグナル配列は核外移行、ｍＲＮＡの安定性および効率的な翻訳に重要である。ターミネーターは、転写物の末端を規定し、遊離３’末端を作出し、転写装置からの新しく合成されたｍＲＮＡの放出を開始する配列である。次いで遊離３’末端は、ポリ（Ａ）テールの付加に利用可能である。ターミネーターは転写される遺伝子の下流に見出され、典型的には、任意の３’調節エレメント、例えば、ポリアデニル化またはポリ（Ａ）シグナルの直後に存在する。発現プラスミドにおいて一般に使用される哺乳動物ターミネーターとしては、配列モチーフＡＡＵＡＡＡを含み、ポリアデニル化と終結の両方を促進する、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨまたはｂＧＨ）およびウサギベータ－グロビン（ｒｂＧｌｏｂ）のポリＡ配列が挙げられる。
ＯＲＦの３’末端に設置される場合に、シミアンウイルス４０ポリＡ（ＳＶ４０ｐＡ）またはウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨｐＡ）シグナルなどの配列は、インビトロとインビボの両方で数倍の発現増大をもたらす（例えば、Powell et al. (2015) Discov. Med. 19(102):49-57を参照されたい）。これらのおよび他のそのようなエレメントは、単一プラスミドから発現される免疫調節性タンパク質を含めて、複数の治療用産物の発現および翻訳をさらに増強することができる。
ｃ．エンハンサー
プロモーターおよびエンハンサーはプラスミド中のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に見出され、協力して転写の速度を決定する。エンハンサーは、ＤＮＡをループ化するために、アクチベータータンパク質に結合し、特定のプロモーターを開始複合体に連れて行き、このようにして、転写の速度を高める配列である。これらは、影響を与えるプロモーターに隣接していてもよく、または該プロモーターから離れていてもよく、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、ＳＶ４０および合成エンハンサー、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変されたＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーターであるＭＮＤプロモーターを含む。本明細書の免疫刺激細菌は、プラスミド上にコードされている治療用産物／タンパク質の発現を増強するために、エンハンサーを含むことができるプラスミドを含む。
ｄ．分泌シグナル
シグナル配列もしくはシグナルペプチド、リーダー配列もしくはペプチド、または局在シグナルもしくは局在配列としても知られる分泌シグナルは、分泌されることになる新しく合成されたタンパク質のＮ末端にある短いペプチドである。シグナルペプチドは、細胞がタンパク質を通常細胞膜に移動させるのを促進する。タンパク質分泌の効率はシグナルペプチドによって強く決定される。したがって、本明細書の免疫刺激細菌は、コードされている治療用産物の発現または分泌を容易にするおよび／または増大するために、シグナルペプチド／分泌シグナルペプチドを含むことができるプラスミドを含む。
ｅ．細菌の適応度の改善
治療用産物をコードする免疫刺激細菌中のプラスミドは、細菌遺伝子の発現のために、および複雑な多シストロン性真核生物ペイロードの発現のためにも提供される遺伝子および調節エレメントを含む。そのような進化的に分岐した生物の間の転換は、原核生物および真核生物で適切に機能するための課題をもたらす。細菌がインビトロで培養され、次いで、真核生物の対象に投与され、がん対象において、プラスミドが細胞に、特に腫瘍常在性骨髄性細胞に送達され、ペイロードが発現され、プロセッシングを受け、輸送される。実施例（実施例３０を参照されたい）に記載されているように、大きな真核生物遺伝子および調節配列と組み合わされた、細菌中の真核生物プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターからの転写漏出性は、低い注射ストック生存率およびブロス培養における増殖速度の低減として顕在化する、細菌の適応度の低減をもたらす可能性がある。
実施例（実施例３０を参照されたい）に示すように、哺乳動物細胞において高い異所性発現を維持しながら、細菌の適応度に対する負の影響を最小化するために、細菌の適応度を改善するように、および真核性発現を維持するまたは改善するようにデリバリープラスミドを体系的に改変した。あり得る例示的な負の影響および解決策としては、例えば、以下が挙げられる：
１）ＰｒｏｍｏｔｅｒＨｕｎｔｅｒ（ｐｈｉｓｉｔｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｈｕｎｔｅｒ／においてオンラインで利用可能；例えば、Klucar et al. (2010) Nucleic Acids Res. 38(Database issue):D366-D370を参照されたい）を使用して、ＣＭＶプロモーターのエンハンサー領域内にコードされている潜在性細菌プロモーター配列を特定し、これらの推定上のプロモーター配列をＣＲＥＢ結合部位および部分的ＣＲＥＢ結合部位と置換して、効率的なプラスミドデリバリーを促進した。
２）ＣＭＶプロモーターからの転写漏出性を阻害するために、いくつかの細菌ターミネーターをＯＲＦ１の５’ＵＴＲに挿入して、細菌における発現を阻害した（以下の実施例３０の表を参照されたい）；
３）複製起点からのリードスルー転写のレベルを低減するために、発現カセットと複製起点の間に挿入される転写ターミネーターの有り無しで、ＣＭＶプロモーターの上流からポリアデニル化シグナルの末端までの発現カセットの配向性を逆にした；
４）さらなる改善のために、注射ストック生存率が増大し、インビトロでの遺伝子ペイロードの発現が増強した上記の１）～３）の中の改変を組み合わせた。
実施例（実施例３０を参照されたい）において詳しく述べられる結果は、プラスミド上で発現カセットを逆にし、コード領域の後にＢＢａ＿Ｂ００１５細菌ターミネーターを挿入し、ＣＭＶプロモーターの下流にＴ４細菌ターミネーターを挿入した場合（例えば、図１４を参照されたい）、改変無しのプラスミドと比較して、インビトロにおいて、細菌細胞生存率の増大、倍加時間の低減、より高い静止（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ）ＯＤ６００への増殖、およびコードされているペイロードの発現増大があったことを示す。
ＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターは、大腸菌由来するターミネーター（ＢＢａ＿Ｂ００１０）とＴ７ファージに由来するターミネーター（ＢＢａ＿Ｂ００１２）が結合している複合性ターミネーターである。
したがって、真核生物プロモーター、例えばウイルスプロモーターが細菌プロモーター、例えば、プラスミド上の外来性ａｓｄ遺伝子の発現を制御する細菌プロモーターと反対の配向性にあるプラスミドが本明細書で提供される。例えば、外来性ａｓｄカセット（ａｓｄ－細菌においてプラスミド上にコードされている、発現のための調節配列および外来性ａｓｄ遺伝子を含む）は、真核生物調節配列と反対の配向性にあり、ペイロードをコードする核酸に作用可能に連結されている。これは、真核生物プロモーターのリードスルー（漏出性）を低減する。これらのコンストラクトは、真核生物プロモーターを含むペイロード発現カセットに隣接する細菌ターミネーターも含み、これは、細菌プロモーターからのリードスルーを低減する。例えば、図１４は例示的なコンストラクト構成を提供する。
したがって、所望ならば、真核生物プロモーターを含む発現カセットを細菌プロモーターの制御下にあるものと反対方向に配向させること、および戦略的な場所で細菌の発現を終結するために、細菌で認識されるターミネーターを含むことを含めたいくつかのストラテジーの１つまたは複数によって、細菌の適応度を改善することができる。インビトロで細菌の増殖を増強するために、および発現を支持するために、またはヒトなどの真核生物（ｅｕｋａｒｙｔｉｃ）宿主において、インビボで真核生物プロモーターからの発現を妨げないために、他のそのような改変を含むことができる。したがって、コンストラクトは、細菌プロモーターを含むことによって；および外来性ａｓｄをコードするカセットに対して、ペイロードをコードする核酸の配向性を逆にすることによって、改善された。
４．複製起点およびプラスミドコピー数
プラスミドは、複製起点によって細菌内で維持される、自律的に複製する染色体外の環状二本鎖ＤＮＡ分子である。コピー数は、プラスミドの安定性に影響を与える。高コピー数は、一般に、ランダムな分配が細胞分裂で起こる場合に、プラスミドのより大きな安定性をもたらす。高コピー数のプラスミドは、一般に増殖速度を低下させ、したがって、プラスミドが少ない細菌細胞がより速く増殖するので、これが培養で優位を占めることをおそらく可能にする。これは、高コピー数で存在する場合に細菌に対して毒性を持つ可能性がある、プラスミド上のある特定の遺伝子の発現を制限する、遺伝子減弱および遺伝子投薬ストラテジーを使用して、改良され得る。複製起点は、プラスミドの適合性、すなわち、同じ細菌細胞内の別のプラスミドとともに複製する能力も決定する。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌細胞中に共存することができず；これは、同じ適合性群に属すると言われる。同じ適合性群からの第２のプラスミドの形態で新しい起点を導入することは、内在プラスミドの複製の結果を模倣する。したがって、２種のプラスミドが異なる細胞に分離して、複製前の正確なコピー数の作出の後まで、いかなるさらなる複製も防止される。
多数の細菌性複製起点は当業者に既知である。起点は、所望のコピー数を達成するように選択することができる。複製起点は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介したプラスミド複製の開始部位として認識される配列を含む（例えば、del Solar et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2):434-464を参照されたい）。異なる複製起点によって、各細胞内でプラスミドコピーレベルが変動し、細胞あたり１～数１００コピーの範囲になり得る。一般に使用される細菌プラスミド複製起点としては、限定されないが、非常に高いコピーの誘導体、例えばｐＵＣ、およびより低いコピーの誘導体、例えばｐＢＲ３２２を有する、ｐＭＢ１に由来する起点、ならびに低コピー数を有する、ＣｏｌＥ１、ｐ１５ＡおよびｐＳＣ１０１ならびに他の起点が挙げられる。そのような起点は当業者に周知である。例えば、ｐＵＣ１９起点は細胞あたり５００～７００コピーのコピー数をもたらす。ｐＢＲ３２２起点は、細胞あたり１５～２０コピーの既知のコピー数を有する。これらの起点は単一塩基対しか異ならない。ＣｏｌＥ１起点のコピー数は１５～２０であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどの誘導体は３００～５００の範囲のコピー数を有し得る。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４中にあるｐ１５Ａ起点は、例えば、およそ１０のコピー数をもたらす。ｐＳＣ１０１起点はおよそ５のコピー数を与える。複製起点を得ることができる他の低コピー数ベクターとしては、例えば、ｐＷＳＫ２９、ｐＷＫＳ３０、ｐＷＳＫ１２９およびｐＷＫＳ１３０が挙げられる（例えば、Wang et al. (1991) Gene 100:195-199を参照されたい）。中程度～低コピー数は１５０未満または１００未満である。低コピー数は２０、２５または３０未満である。一般に、中程度コピー数未満は１５０コピー未満であり、低コピー数未満は約２５コピー未満または２５コピー未満であり、一般に、コピー数は、調製物中の細菌あたりのプラスミドの平均コピーを指す。当業者は、低、中程度または高コピー数を有するプラスミドを特定することができる。例えば、コピー数が高いかまたは低いかを実験的に決定する１つの方法は、ミニプレップを行うことである。高コピープラスミドは、１ｍｌのＬＢ培養あたり３～５μｇの間のＤＮＡをもたらすはずであり；低コピープラスミドは、ｍｌのＬＢ培養あたり０．２～１μｇの間のＤＮＡをもたらすであろう。複製起点の特定および複製起点の配列を含めて、細菌プラスミドの配列は周知である（例えば、snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/を参照されたい）。例示的複製起点およびそれらのプラスミドコピー数を以下の表に概説する。
Figure 2023501539000022
高コピープラスミドはインビトロにおけるタンパク質の異種発現のために選択され、染色体の遺伝子と比較して遺伝子投薬量が増大するので、タンパク質の比収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｙｉｅｌｄｓ）が高くなり、治療用細菌については、コードされている治療薬の治療投薬量がより高くなる。しかし、本明細書では、例えばネズミチフス菌による、治療用産物（例えば、免疫調節性タンパク質）をコードするプラスミドのデリバリーについては、一部の実施形態では、高コピープラスミドが有利である場合があることが示される。
発現される分子が生物に対して毒性を持つ場合、細菌が高コピープラスミドを維持するための要件が問題になり得る。これらのプラスミドを維持するための代謝要件は、インビボでの複製適応度のかなりの犠牲をともなう可能性がある。治療用産物のデリバリーのための最適なプラスミドコピー数は、プラスミドを送達するように操作された菌株の減弱のメカニズムに依存し得る。必要であれば、当業者は、本明細書における本開示を考慮して、細菌の特定の免疫刺激性種および菌株に対して適切なコピー数を選択することができる。
５．ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧアイランド
非メチル化シチジン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフは、細菌のゲノムＤＮＡで広く認められるが、脊椎動物のゲノムＤＮＡではそうではない。病原ＤＮＡおよびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は宿主防御メカニズムを活性化し、自然免疫応答および獲得免疫応答をもたらす。非メチル化ＣｐＧモチーフは、中央の非メチル化ＣＧジヌクレオチド＋隣接領域を含む。ヒトでは、４つの異なるクラスのＣｐＧ ＯＤＮが、構造の違いおよびこれらが誘導する免疫応答の性質に基づいて特定されている。Ｋ型ＯＤＮ（Ｂ型とも称される）は、典型的にはホスホロチオエート骨格上に１～５個のＣｐＧモチーフを含む。Ｄ型ＯＤＮ（Ａ型とも称される）は混合ホスホジエステル／ホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造の形成を可能にするパリンドローム配列が隣接する単一ＣｐＧモチーフならびに３’および５’末端のポリＧモチーフを有する。Ｃ型ＯＤＮはホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造または二量体を形成することができる複数のパリンドロームＣｐＧモチーフを含む。Ｐ型ＣｐＧ ＯＤＮはホスホロチオエート骨格を有し、そのＧＣリッチ３’末端でヘアピンを形成することができる二重パリンドロームを有する複数のＣｐＧモチーフを含む（例えば、Scheiermann et al. (2014) Vaccine 32(48):6377-6389を参照されたい）。本明細書において、ＣｐＧはプラスミドＤＮＡ中にコードされており；これはモチーフとして導入され得るか、または遺伝子中に導入され得る。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を感知し、病原体に対する自然免疫を活性化するための重要な受容体である（例えば、Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680を参照されたい）。ＴＬＲ９は、哺乳動物ＤＮＡ中に天然に存在しない、原核生物のＤＮＡ中の低メチル化ＣｐＧモチーフを認識する（例えば、McKelvey et al. (2011) J. Autoimmun. 36:76-86を参照されたい）。ＣｐＧモチーフの認識は、免疫細胞サブセットにおけるエンドソーム中への病原体のファゴサイトーシスの際に、ＩＲＦ７依存的Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を誘導し、自然免疫および適応免疫を活性化する。
ＣｐＧアイランドまたはモチーフを含むプラスミドを保有する免疫刺激細菌、例えばサルモネラ属種、例えばネズミチフス菌株が本明細書で提供される。これらの細菌は、ＴＬＲ９を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ媒介性自然免疫および適応免疫を誘導することができる。本明細書で例示されるように、低メチル化ＣｐＧアイランドを含む細菌プラスミドは、プラスミド上にコードされている治療用産物、例えば免疫刺激タンパク質とＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３および他の細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの構成的に活性な変異体とを組み合わせて、相乗的または増強された抗腫瘍活性を有し得る、自然および適応抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。例えば、ａｓｄ遺伝子（配列番号４８）は高頻度の低メチル化ＣｐＧアイランドをコードする。ＣｐＧモチーフは、免疫刺激細菌において、本明細書に記載されるかまたは本明細書の説明から明らかである治療用産物のいずれかと組み合わせて含まれて、それによって、処置される対象において抗腫瘍免疫応答を増強または改善することができる。
免疫刺激性ＣｐＧは、遺伝子産物をコードする、典型的に細菌遺伝子由来の核酸を含むことによって、およびさらに、ＣｐＧモチーフをコードする核酸を付加することによって、プラスミド中に含むことができる。本明細書のプラスミドはＣｐＧモチーフを含むことができる。例示的ＣｐＧモチーフは既知である（例えば、米国特許第８，２３２，２５９号、第８，４２６，３７５号および第８，２４１，８４４号を参照されたい）。これらには、例えば、１０から１００、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、または１０から７５塩基対長であり、一般式：（ＣｐＧ）ｎ（式中、ｎは反復の数である）を有する合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドが含まれる。一般に、少なくとも１つまたは２つの反復が使用され；非ＣＧ塩基は散在し得る。当業者は、ＴＬＲ、特にＴＬＲ９をモジュレートすることによって免疫応答を誘導するためのＣｐＧモチーフの一般的な使用に非常に精通している。
６．プラスミド維持／選択成分
実験室環境におけるプラスミドの維持は、通常、プラスミド上に抗生物質耐性遺伝子を含み、増殖培地において抗生物質を使用することによって保障される。上記のように、プラスミド上の機能的ａｓｄ遺伝子で補完されるａｓｄ欠失突然変異体の使用によって、抗生物質を使用しないで、インビトロでプラスミド選択が可能になり、インビボでプラスミド維持が可能になる。ａｓｄ遺伝子補完システムはそのような選択／維持を提供する（例えば、Galan et al. (1990) Gene 94(1):29-35を参照されたい）。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにａｓｄ遺伝子補完システムを使用することによって、治療用産物、例えば免疫刺激タンパク質、構成的に活性な細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー、抗体、抗体断片または本明細書で論じられる他のそのような産物をコードするプラスミドを送達するように操作されたネズミチフス菌および他の免疫刺激細菌株の効力が高められる。
７．ＤＮＡ核標的化配列
ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、例えばＳＶ４０ ＤＴＳは、核膜孔複合体を通したＤＮＡ配列の移動を媒介する。この輸送のメカニズムは、核局在化配列を含むＤＮＡ結合タンパク質の結合に依存していることが報告されている。核輸送および発現を増大させるためにプラスミド上にＤＴＳを含むことが示され（例えば、Dean, D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res. 253(2):713-722を参照されたい）、これは、ネズミチフス菌によって送達されるプラスミドからの遺伝子発現を増大するために使用された（例えば、Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419を参照されたい）。
Ｒｈｏ非依存性またはクラスＩ転写ターミネーター、例えば、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子のＴ１ターミネーターは、転写伸長複合体の解離を引き起こす二次構造を形成するＤＮＡ配列を含む。ネズミチフス菌の転写装置による異種タンパク質の発現を防止するために、転写ターミネーターがプラスミド中に含まれる。これによって、治療用産物の発現が宿主細胞転写装置に限られることが保証される。
本明細書に記載のがん治療として、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌の形質転換に使用されるプラスミドは、以下の属性のすべてまたはいくつかを含む：１）タンパク質の異種発現のための１または複数の構成的プロモーター；２）１または複数のヒト免疫調節性発現カセット；３）細菌性複製起点および最適化されたプラスミドコピー数；４）免疫刺激性ＣｐＧアイランド；５）プラスミド維持および選択のためのａｓｄ遺伝子選択マーカー；６）ＤＮＡ核標的化配列；ならびに７）転写ターミネーター。
Ｆ．医薬品生成、組成物および製剤
製造方法、ならびに本明細書で提供される免疫刺激細菌のいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤または添加剤を含む医薬組成物および製剤が、本明細書で提供される。医薬組成物は、疾患、例えば、過剰増殖性の疾患または状態、例えば、腫瘍またはがんの処置で使用することができる。免疫刺激細菌は、単剤療法として投与することができ、またはさらなる薬剤もしくは処置との併用療法で投与することができる。併用療法としては、免疫刺激細菌および／または本明細書で提供される他のデリバリー媒体との、任意の他の抗がん治療または処置、例えば、限定されないが、免疫治療、例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法およびチェックポイント阻害剤、放射線照射、手術、化学療法剤、例えば、ヌクレオシドアナログおよび白金化合物、ならびに細胞療法との組合せ療法（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ）が挙げられる。組成物は、単回投薬量の投与のために、または多回投薬量の投与のために製剤化することができる。薬剤は、直接投与のために製剤化することができる。組成物は、液体または乾燥製剤として提供することができる。
１．製造
ａ．セルバンクの製造
本明細書に記載の免疫治療薬の活性成分が操作された自己複製細菌からなるので、選択された組成は、長期保存のために、および原体（ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の製造のための出発材料として維持される一連のセルバンクにおいて、増やされる。セルバンクは、Code of Federal Regulations (CFR) 21 part 211、または他の関連する規制当局に従って、適切な製造施設において、現行適正製造基準（ｃＧＭＰ）の下で生成される。免疫治療薬の活性薬剤が生きている細菌であるので、本明細書に記載の産物は、定義によれば、非滅菌であり、最終的に滅菌することができない。汚染を防止するために、製造プロセス全体を通して無菌手順が確実に使用されることに注意を払わなければならない。したがって、すべての原材料および溶液は、製造プロセスで使用する前に滅菌されなければならない。
マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、出発材料中に夾雑物が存在しないことを確実にするために、選択された細菌株の連続的系列単一コロニー単離（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｓｅｒｉａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）によって生成される。滅菌した培地（複合培地、例えば、ＬＢもしくはＭＳＢ、または限定培地、例えば、適切な栄養素が補充されたＭ９であり得る）を含む滅菌した培養容器に単一ウェル単離細菌コロニーを接種し、例えば、振盪しながら３７℃でインキュベートすることによって、細菌を複製させる。次いで、凍結保護剤（複数可）を含む溶液中に懸濁することによって、凍結保存のための細菌を調製する。
凍結保護剤の例としては、以下が挙げられる：タンパク質、例えば、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリン；例えば、単糖類（例えば、ガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど）およびこれらの非還元誘導体（例えば、メチルグルコシド）、二糖類（トレハロース、ショ糖など）、シクロデキストリン、ならびに多糖類（例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど）を含めた炭水化物；アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン、アラニン、アルギニンまたはヒスチジン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなど）；メチルアミン、例えばベタイン；ポリオール、例えば、三価または高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；界面活性物質、例えば、プルロニック（登録商標）；または有機硫黄化合物、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ならびにこれらの組合せ。凍結保存溶液は、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム）、ならびに／または緩衝剤、例えば、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および当業者に既知の他のそのような緩衝剤も含むことができる溶液中に１または複数の凍結保護剤を含むことができる。
凍結保存溶液中の細菌の懸濁液は、濃縮された凍結保護剤（複数可）を培養材料に添加して、凍結解凍プロセス中に細菌の生存率を保つ終濃度（例えば、０．５％～２０％終濃度のグリセロール）にすることか、または細菌を回収し（例えば、遠心分離による）、適切な終濃度の凍結保護剤を含む凍結保存溶液中に懸濁することかのいずれかによって、得ることができる。次いで、凍結条件下で完全な閉鎖を維持することができる容器閉鎖システム（例えば、ブチルストッパーおよびクリンプシール）を用いて、凍結保存溶液中の細菌の懸濁液を適切な滅菌したバイアル（プラスチックまたはガラス）中にいっぱいに入れる。次いで、マスターセルバンクのバイアルを凍結する（速度制御フリーザーによって緩徐に、またはフリーザー中に直接入れることによって急速に）。次いで、長期の生存率を保つ温度（例えば、－６０℃以下）でＭＣＢを凍結保存する。適切な当局による規則に従って同一性、純度、および活性を保証するために、解凍したマスターセルバンク材料を徹底的に特徴付ける。
ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）は、マスターセルバンクとほぼ同じ方法で生成され、出発材料はＭＣＢに由来する。ＭＣＢ材料は、滅菌した培地を含む発酵容器中に直接移し、上記のように増やすことができる。次いで、細菌を凍結保存溶液中に懸濁し、容器中にいっぱいに入れ、密閉し、－２０℃以下で凍結する。複数のＷＣＢをＭＣＢ材料から生成することができ、ＷＣＢ材料は、さらなるセルバンク（例えば、製造業者のワーキングセルバンク（ＭＷＣＢ））を作製するのに使用することができる。ＷＣＢを凍結保存し、同一性、純度、および活性を保証するために特徴付ける。ＷＣＢ材料は、典型的には、操作された細菌などの生物製剤の原体の生成で使用される出発材料である。
ｂ．原体の製造
原体は、上記のように、ｃＧＭＰの下で無菌のプロセスを使用して製造される。ワーキングセルバンク材料は、ｃＧＭＰの下での原体の製造のための出発材料として典型的には使用されるが、他のセルバンクを使用してもよい（例えば、ＭＣＢまたはＭＷＣＢ）。細菌細胞ベース療法を含めて、すべての細胞療法の生成のために、無菌処理が使用される。セルバンクからの細菌は発酵によって増やされ；これは、前培養（例えば、振盪フラスコ中）の生成によって、または発酵槽の直接接種によって達成することができる。発酵は、使い捨てでもよいし、再利用可能でもよい滅菌したバイオリアクターまたはフラスコ中で成し遂げられる。細菌は、濃縮（例えば、遠心分離、連続遠心分離または接線流濾過による）によって回収される。濃縮された細菌は、培地を緩衝剤と交換すること（例えば、透析濾過による）によって、培地成分および細菌代謝物から精製される。バルク薬物製品は製剤化され、中間体として保たれる（例えば、凍結もしくは乾燥による）か、または薬物製品に直接処理される。原体は、同一性、強度、純度、効力および品質について試験される。
ｃ．薬物製品の製造
薬物製品は、その最終的な容器中に含まれる活性物質の最終的な製剤と定義される。薬物製品は、ｃＧＭＰの下で無菌プロセスを使用して製造される。薬物製品は原体から生成される。原体は解凍されるか、または必要ならば再構成され、次いで、適切な標的強度で製剤化される。薬物製品の活性成分は生きている操作された細菌であるので、強度は、懸濁液内に含まれるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数によって決定される。バルク産物は、以下に記載のように、保存および使用に適切な最終的な製剤に希釈される。容器は満たされ、容器閉鎖システムで密閉され、薬物製品は標識される。薬物製品は安定性を保つのに適切な温度で保存され、同一性、強度、純度、効力および品質について試験され、これが指定の承認基準を満たす場合、ヒト使用のために発売される。
２．組成物
薬学的に許容される組成物は、規制当局または他の当局の許可を考慮して調製され、ならびに／または動物およびヒトで使用するための一般に認識される薬局方に従って調製される。組成物は、溶液剤、懸濁剤、粉末剤または持続性放出製剤として調製することができる。典型的には、化合物は、当技術分野で周知の技法および手順を使用して医薬組成物に製剤化される（例えば、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, page 126を参照されたい）。製剤は投与様式に適するべきである。
組成物は、筋内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内、皮下、腫瘍内、硬膜外、経鼻、経口、腟、直腸、局所、局部、耳、吸入、頬側（例えば、舌下）および経皮投与を含めた当業者に既知の任意の経路による、または任意の適切な経路による投与のために、製剤化することができる。他の投与様式も企図される。投与は、処置の場所に応じて、局部、局所または全身的であり得る。処置を必要としている領域への局部投与は、例えば、限定されないが、手術中の局部注入、例えば創傷被覆材と併せた手術後の局所的適用によって、注射によってカテーテルによって、坐剤によって、または埋植によって達成することができる。組成物は、連続して、断続的に、または同じ組成物中で、他の生理活性物質とともに投与することもできる。投与は、制御放出製剤を含めた制御放出システム、および例えばポンプによるデバイス制御放出も含むことができる。
任意の所与の場合における最も適切な経路は、様々な因子、例えば、疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度および使用される特定の組成物に依存する。医薬組成物は、各投与経路に適切な剤形で製剤化することができる。特に、組成物は、全身的、局部、腹腔内、経口または直接投与のための任意の適切な医薬調製物に製剤化することができる。例えば、組成物は、皮下、筋内、腫瘍内、静脈内または皮内投与のために製剤化することができる。投与方法は、分解性プロセス、例えば、抗原性応答および免疫原性応答を介する免疫学的介入への活性薬剤の曝露を低下させるために用いることができる。そのような方法の例としては、処置部位での局部投与または持続注入が挙げられる。
免疫刺激細菌は、適切な医薬調製物、例えば、経口投与のための溶液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続性放出製剤またはエリキシル剤、ならびに経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器に製剤化することができる。典型的には、化合物は、当技術分野で周知の技法および手順を使用して医薬組成物に製剤化される（例えば、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, page 126を参照されたい）。一般に、製剤の様式は投与経路の関数である。組成物は、乾燥（凍結乾燥もしくは他の形態のガラス化）または液体形態に製剤化することができる。組成物が乾燥形態で提供される場合、適切な緩衝剤、例えば、滅菌した食塩水を添加することによって、使用直前にこれを再構成することができる。
３．製剤
ａ．液剤、注射剤、乳濁剤
製剤は、一般に、投与経路に適するように作製される。一般に、皮下、筋内、腫瘍内、静脈内または皮内のいずれかの注射または注入によって特徴付けられる非経口投与が本明細書で企図される。非経口投与のための細菌の調製物としては、直ぐに注射できる状態の懸濁剤（直接投与）、使用前に解凍される凍結懸濁剤、使用直前に再懸濁溶液と直ぐに混ぜ合わせることができる状態の乾燥可溶性生成物、例えば凍結乾燥粉末剤、および乳濁剤が挙げられる。後で使用するための単位用量の保存のために、乾燥熱安定性製剤、例えば凍結乾燥製剤を使用することができる。
医薬調製物は、凍結液体形態、例えば懸濁剤の形態であってもよい。凍結液体形態で提供される場合、薬物製品は、使用前に解凍され、かつ治療有効濃度に希釈される濃縮調製物として提供することができる。
医薬調製物は、使用するために解凍または希釈を必要としない剤形で提供することもできる。そのような液体調製物は、適宜、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトール、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステルまたは分画植物油）；および微生物治療薬での使用に適した防腐剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。医薬調製物は、使用前に水または他の滅菌した適切な媒体で再構成するために、乾燥形態、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥で提供することができる。
適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロースまたはグリセロールである。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。静脈内に投与される場合、適切な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、および静脈内水分補給に使用される他の緩衝溶液が挙げられる。腫瘍内投与については、増粘剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、油乳濁液、ならびにこれらの混合物を含む溶液が、注射物質（ｉｎｊｅｃｔａｎｔ）の局在化を維持するのに適切であり得る。
医薬組成物は、担体または他の賦形剤を含むことができる。例えば、本明細書で提供される医薬組成物は、希釈剤、アジュバント、抗粘着剤、結合剤、コーティング剤、フィラー、香料、色素、潤滑剤、流動促進剤、防腐剤、界面活性剤もしくは吸着剤およびこれらの組合せ、または改変された治療用細菌が投与される媒体のいずれか１つまたは複数を含むことができる。例えば、非経口調製物で使用される薬学的に許容される担体または賦形剤としては、水性媒体、非水性媒体、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が挙げられる。液体調製物を含めて、製剤は、薬学的に許容される添加剤または賦形剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。
医薬組成物は、担体、例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または組成物が投与される媒体を含むことができる。適切な医薬品担体の例は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、一般に精製された形態または部分的に精製された形態の治療有効量の化合物または薬剤を適切な量の担体とともに含む。そのような医薬品担体は、石油、動物、野菜または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油およびゴマ油を含めて、滅菌した液体、例えば、水および油であり得る。水は典型的な担体である。特に注射用溶液のための液体担体として、食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を用いることもできる。組成物は、活性成分とともに以下のものを含むことができる：希釈剤、例えば、ラクトース、ショ糖、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えばデンプン、天然ゴム、例えばアカシアゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者に既知の他のそのような結合剤。適切な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールが挙げられる。例えば、適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。組成物は、所望ならば、他の少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度増強剤ならびに他のそのような薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなども含むことができる。
非経口調製物で使用される薬学的に許容される担体としては、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が挙げられる。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液ならびにデキストロースおよび乳酸化リンガーの注射液が挙げられる。非水性非経口媒体としては、野菜起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびピーナッツ油が挙げられる。等張剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸およびクエン酸が挙げられる。抗酸化剤としては硫酸水素ナトリウムが挙げられる。局所麻酔薬としては塩酸プロカインが挙げられる。懸濁および分散剤としては、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、例えば、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖またはキレート剤、例えばＥＤＴＡを含むことができる。医薬品担体は、水混和性媒体のためのポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含む。非抗微生物防腐剤を含むことができる。
医薬組成物は、他の少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度増強剤ならびに他のそのような薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなども含むことができる。一定レベルの投薬量が維持されるような徐放性または持続性放出システムの埋植（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照されたい）も本明細書で企図される。そのような非経口組成物に含まれる活性化合物のパーセンテージは、それらの特定の性質ならびに化合物の活性および対象の要求に非常に依存している。
ｂ．乾燥熱安定性製剤
細菌を乾燥させることができる。乾燥熱安定性製剤、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末およびガラス化ガラスは、溶液剤、乳濁剤および他の混合物としての投与のために再構成することができる。乾燥熱安定性製剤は、上記の懸濁剤などの液体製剤のいずれかから調製することができる。医薬調製物は、使用前に水または他の適切な媒体で再構成するために、凍結乾燥またはガラス化形態で提供することができる。
熱安定性製剤は、滅菌した溶液で乾燥化合物を再構成することによる投与のために調製される。溶液は、活性物質または粉末から調製された再構成された溶液の安定性または他の薬理学的属性を改善する賦形剤を含むことができる。熱安定性製剤は、賦形剤、例えば、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、ショ糖または他の適切な薬剤を適切な緩衝剤、例えば、クエン酸、ナトリウムもしくはリン酸カリウムまたは当業者に既知の他のそのような緩衝剤中に溶解することによって調製される。次いで、原体が得られた混合物に添加され、それが混合するまで撹拌される。得られた混合物は乾燥するためにバイアル中に配分される。各バイアルは、バイアルあたり１×１０５～１×１０１１ＣＦＵを含む単回投薬量を含む。乾燥後、生成物のバイアルは、水分または夾雑物が密閉バイアル中への進入するのを防止する容器閉鎖システムで密閉される。乾燥生成物は、－２０℃、４℃または室温などの適切な条件下で保存することができる。水または緩衝液を用いたこの乾燥製剤の再構成は、非経口投与で使用するための製剤を提供する。正確な量は、処置される適応症および選択される化合物に依存する。そのような量は、経験的に決定することができる。
４．他の投与経路のための組成物
処置される状態に応じて、非経口に加えて他の投与経路、例えば、局所的適用、経皮パッチならびに経口および直腸投与も本明細書で企図される。上記の懸濁剤および粉末剤は経口的に投与することができ、または経口投与のために再構成することができる。直腸投与のための医薬品剤形は、直腸坐剤、カプセル剤ならびに全身作用のための錠剤およびゲルカプセ剤である。直腸坐剤は、体温で融けるか柔らかくなり、１または複数の薬理学的または治療的に活性な成分を放出する、直腸へ挿入するための固形物を含む。直腸坐剤で薬学的に許容される物質は、基剤または媒体および融点を上げるための薬剤である。基剤の例としては、ココアバター（カカオ脂）、グリセリン－ゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）ならびに脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリドの適切な混合物が挙げられる。様々な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤としては、鯨蝋およびワックスが挙げられる。直腸坐剤は、圧縮方法または成形のいずれかによって調製することができる。直腸坐剤の典型的な重量は約２～３グラムである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、経口投与のための製剤と同じ薬学的に許容される物質を使用して、かつ経口投与のための製剤と同じ方法によって製造される。直腸投与に適した製剤は、単位用量坐剤として提供することができる。これらは、原体を１または複数の従来の固体担体、例えばココアバターと混合し、次いで得られた混合物を形づくることによって、調製することができる。
経口投与については、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。
頬側（舌下）投与に適した製剤としては、例えば、香味基剤、通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガント中に活性化合物を含むロゼンジ剤；ならびに不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴム中に化合物を含む香錠が挙げられる。
局所混合物は、局部および全身投与について記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液であり得、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、乳濁剤、溶液剤、エリキシル剤、ローション剤、懸濁剤、チンキ剤、ペースト剤、フォーム剤、エアロゾル剤、洗浄剤、スプレー剤、坐剤、包帯、皮膚パッチ剤または局所投与に適した任意の他の製剤として製剤化される。
組成物は、例えば吸入による局所的適用のためのエアロゾル剤として製剤化することができる（例えば、肺疾患の処置に有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾル剤を記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号および第４，３６４，９２３号を参照されたい）。気道への投与のためのこれらの製剤は、ネブライザーのためのエアロゾル剤または溶液剤の形態でもよく、または単独であるかまたはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた吹送（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）のための超微粒粉末でもよい。そのような場合、製剤の粒子は、典型的には、５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径を有する。
化合物は、局部または局所的適用するために、例えば、ゲル剤、クリーム剤およびローション剤の形態で、皮膚および眼内などの粘膜に局所的適用するために、ならびに眼に適用するために、または嚢内もしくは髄腔内適用のために、製剤化することができる。局所投与は、経皮デリバリーのために企図され、同様に眼もしくは粘膜への投与のために、または吸入療法のために企図される。単独であるかまたは他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた活性化合物の点鼻液も投与することができる。
経皮投与に適した製剤が提供される。これは、任意の適切な形式、例えば、長時間にわたってレシピエントの表皮と密接に接触したままであるように適合された個別のパッチ剤で提供することができる。そのようなパッチ剤は、活性化合物に関して例えば０．１～０．２Ｍ濃度の適宜緩衝化された水溶液中に活性化合物を含む。経皮投与に適した製剤は、イオン導入法によって送達することもでき（例えば、Tyle, P. (1986) Pharmaceutical Research 3(6):318-326を参照されたい）、典型的には、活性化合物の適宜緩衝化された水溶液の形態をとることができる。
医薬組成物は、制御放出製剤および／またはデリバリーデバイスによって投与することもできる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第３，６３０，２００号；第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第４，００８，７１９号；第４，７６９，０２７号；第５，０５９，５９５号；第５，０７３，５４３号；第５，１２０，５４８号；第５，５９１，７６７号；第５，６３９，４７６号；第５，６７４，５３３号；および第５，７３３，５６６号を参照されたい）。
５．投薬量および投与
組成物は、単回投薬量または多回投薬量の投与のための医薬組成物として製剤化することができる。処置される患者に対して望ましくない副作用無しに治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で免疫刺激細菌を含むことができる。例えば、薬学的に活性な化合物の濃度は、注射が所望の薬理学的作用をもたらすのに有効な量を提供するように調整される。治療有効濃度は、既知のインビトロおよびインビボシステムで、例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で既知のアッセイを使用することによって、免疫刺激細菌を試験することによって、経験的に決定することができる。例えば、標準的な臨床的技法を用いることができる。最適な投薬量範囲を特定するのを支援するために、インビトロアッセイおよび動物モデルを用いることができる。経験的に決定することができる正確な用量は、患者または動物の年齢、体重、体表面積および状態、投与される特定の免疫刺激細菌、投与経路、処置される疾患のタイプ、ならびに疾患の重篤度に依存し得る。
したがって、正確な投薬量および処置の継続期間は、処置を受ける疾患の関数であり、既知の試験プロトコールを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データからの外挿によって、経験的に決定することができることが理解されよう。濃度および投薬量の値は、軽減される状態の重症度によっても変動し得る。任意の特定の対象について、個体の要求（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｎｅｅｄ）、および組成物を投与する者または組成物の投与を監督する者の専門的判断に従って、特定の投薬量レジメンが、経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載の濃度範囲は例示的なものに過ぎず、組成物およびそれを含む組合せの範囲または使用を限定することを意図しないことをさらに理解されたい。組成物は、１時間ごと、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与することができる。一般に、投薬量レジメンは毒性を制限するように選択される。毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓もしくは他の組織の機能障害が理由で、投薬量を下げるために、どのようにして、およびいつ療法を終了する、中断するまたは調整するかを主治医は知っているであろうことに留意されたい。逆に、主治医は、臨床応答が十分でない場合、どのようにして、およびいつより高いレベルに処置を調整する（有毒な副作用は起こらないようにする）かも知っているであろう。
免疫刺激細菌は、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で組成物に含まれる。例えば、量は、過剰増殖性の疾患または状態、例えばがんの処置において治療効果を達成するものである。例示的用量は約１×１０９ＣＦＵ／ｍ２であり得る。以下の表に示すように、および上記のように、より高い用量を投与することができる。マウスモデルにおける実験からの以下のデータは、本明細書に記載のゲノム改変を有する菌株は、ＶＮＰ２０００９と比較して少なくとも約１５倍有意に改善された忍容性を有し、したがって、より多い量で投与することができることを示す。
Figure 2023501539000023
薬学的および治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的には、単位剤形または多回剤形で製剤化され、投与される。各単位用量は、必要とされる医薬品担体、媒体または希釈剤とともに、所望の治療効果をもたらすのに十分である、治療的に活性な化合物のあらかじめ決定された分量を含む。単位剤形としては、限定されないが、適切な分量の化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、非経口懸濁剤、経口溶液剤または懸濁剤および水中油形乳剤が挙げられる。単位投与形態は、バイアル、アンプルおよびシリンジ、または個々に包装された錠剤もしくはカプセル剤中に含まれ得る。単位投与形態は、その分数量または倍数量で投与することができる。多回投与形態は、分離された単位投与形態で投与される、単一容器中に包装されている複数の同一の単位剤形である。多回投与形態の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルが挙げられる。したがって、多回投与形態は、包装中で分離されていない多数の単位用量である。一般に、０．００５％～１００％の範囲で活性成分を含み、残りが非毒性の担体から構成される剤形または組成物を調製することができる。医薬組成物は、各投与経路に適切な剤形に製剤化することができる。
単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針がついているシリンジ中に包装される。薬学的に活性な化合物を含む液体溶液または再構成粉末調製物の容量は、処置される疾患および包装用に選択される特定の製造品の関数である。非経口投与のためのすべての調製物は、当技術分野で既知であり、実施されるように、滅菌されなければならない。
示されるように、本明細書で提供される組成物は、限定されないが、皮下、筋内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内、硬膜外、腟、直腸、局部、耳もしくは経皮投与、または任意の投与経路を含めて、当業者に既知の任意の経路のために製剤化することができる。そのような経路に適する製剤は当業者に既知である。組成物は、連続して、断続的に、または同じ組成物中で、他の生理活性物質とともに投与することもできる。
医薬組成物は、制御放出製剤および／またはデリバリーデバイスによって投与することができる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第３，６３０，２００号；第３，８４５，７７０号；第３，８４７，７７０号；第３，９１６，８９９号；第４，００８，７１９号；第４，６８７，６６０号；第４，７６９，０２７号；第５，０５９，５９５号；第５，０７３，５４３号；第５，１２０，５４８号；第５，３５４，５５６号；第５，５９１，７６７号；第５，６３９，４７６号；第５，６７４，５３３号；および第５，７３３，５６６号を参照されたい）。様々なデリバリーシステムが既知であり、選択された組成物を投与するのに使用することができ、本明細書における使用が企図され、そのような粒子は容易に作製することができる。
６．包装および製造品
包装材料、本明細書で提供される任意の医薬組成物、および組成物が本明細書に記載の疾患または状態の処置に使用されることを示す標識を含む製造品も提供される。例えば、標識は、処置が腫瘍のため、またはがんのためであることを示すことができる。
本明細書に記載の免疫刺激細菌と別の治療剤の組合せも製造品中に包装することができる。一例では、製造品は免疫刺激細菌組成物を含む医薬組成物を含み、さらなる薬剤または処置を含まない。他の例では、製造品は、別のさらな治療剤、例えば、異なる抗がん剤を含む。この例では、薬剤は、製造品として包装するために、一緒にまたは個別に提供することができる。
本明細書で提供される製造品は包装材料を含む。医薬製品を包装するための包装材料は当業者に周知である。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３２３，９０７号、第５，０５２，５５８号および第５，０３３，２５２号を参照されたい。医薬品の包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、ボトル、管、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤ならびに投与および処置の目的の様式に適した任意の包装材料が挙げられる。製造品の例は、単一チャンバー容器および二重チャンバー容器を含めた容器である。容器としては、限定されないが、管、ボトルおよびシリンジが挙げられる。容器は、静脈内投与のための針をさらに含むことができる。
包装の選択は、薬剤、およびそのような組成物が一緒に包装されるかまたは個別に包装されるかどうかに依存する。一般に、包装用品（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）はその中に含まれる組成物と非反応性である。他の例では、一部の成分を混合物として包装することができる。他の例では、すべての成分が個別に包装される。したがって、例えば、投与の直前に混合すると一緒に直接投与することができる個別の組成物として成分を包装することができる。あるいは、個別に投与するための個別の組成物として成分を包装することができる。
選択された組成物は、それらの製造品を含めて、キットとして提供することができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物および製造品として提供される投与のための物品を含むことができる。組成物は、投与のための物品中に含むことができるか、または後で加えるために個別に提供することができる。キットは、適宜、投薬量、投与レジメンを含む適用のための使用説明書、および投与様式に関する使用説明書を含むことができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物および診断のための物品も含むことができる。
Ｇ． 処置の方法および使用
本明細書に提供される方法は、がんなどの、そのような細菌の投与によって症状を寛解または軽減できる疾患または状態を有する対象を処置するために、免疫刺激細菌を投与または使用する方法を含む。特定の例では、疾患または状態は腫瘍またはがんである。その上、抗がん剤または抗ヒアルロナン剤などの、処置のために１つまたは複数の追加的な薬剤を用いる併用療法の方法も提供される。細菌は、非経口、全身、外用、および局所、例えば、腫瘍内、静脈内、直腸、経口、筋肉内、粘膜、および他の経路を含むが、それに限定されるわけではない任意の適切な経路によって投与することができる。本明細書に記載される細菌の改変が原因で、全身投与に関連する問題が解決される。各投与経路に適切な製剤が提供される。当業者は、適切なレジメンおよび用量を確立することができ、投与経路を選択することができる。
１．処置する患者を選択し処置をモニタリングするための診断法
ａ．患者選択
バイオマーカーは、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた治療法に応答する可能性が高い患者を特定するために使用することができる。例えば、アデノシンシグネチャーおよび骨髄シグネチャーは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現パネルによって評価することができ、腫瘍のＴ細胞浸潤は、腫瘍部位での宿主免疫応答を測定することによって初期結腸がん患者の再発リスクを予測するために使用されるインビトロ診断検査であるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）検査によって評価することができる。腫瘍または体液が免疫応答性または免疫応答を示す患者は、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた処置に応答する可能性がより高い。
他のバイオマーカーは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＴＮＡＰ（組織非特異的アルカリホスファターゼ）、ＣＤ３８、ＣＤ６８、ＰＤ－Ｌ１、およびＦｏｘＰ３を含む。例えば、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いて処置できる腫瘍は、排除されたＴ細胞であり、高レベルのプリン／アデノシンを表し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的化療法に非応答性である。
様々なＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現パネルを用いて決定することができる遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）は、例えば、腫瘍の「アデノシンシグネチャー」を特定するために分析することができる。高濃度のアデノシンは、数ある中で結腸直腸癌（ＣＲＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および膵がんを含むある特定の腫瘍に見出される。本明細書における免疫刺激細菌は、プリン／アデノシンが豊富な腫瘍微小環境内に蓄積し、複製するので、高濃度のプリン／アデノシンを表す腫瘍を有する患者は、治療法に応答する可能性が高い。したがって、「アデノシンシグネチャー」を発現する腫瘍の特定を使用して、治療法に対する患者の応答を予測することができる。その上、本明細書における免疫刺激細菌は、腫瘍常在性骨髄細胞内に優先的に蓄積し、それに感染する。したがって、「骨髄シグネチャー」を使用して、免疫刺激細菌を用いた治療法に対する患者の応答を予測することもできる。例えば、「アデノシンシグネチャー」は、腎細胞癌（ＲＣＣ）患者におけるアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）単剤療法に対する応答不良と関連する「骨髄シグネチャー」とほぼ同一であることが示されており、これは、抗ＰＤ－Ｌ１療法からの腫瘍の逃避にアデノシンが果たす役割を指し示す（例えば、McDermott et al. (2018) Nature Medicine 24:749-757を参照）。腫瘍－骨髄および腫瘍－アデノシンＮａｎｏＳｔｒｉｎｇシグネチャーパネルは利用可能であり、患者の選択のために使用することができる。
マクロファージは、例えば、トリプルネガティブ乳がんにおいて、固形腫瘍内へのＴ細胞浸潤を限定し、その機能を抑制する（例えば、Keren et al. (2018) Cell 174:1373-1387を参照）。ＣＲＣなどのある特定のがんでは、マクロファージは、腫瘍内免疫集団を支配し、Ｔ細胞の排除を促進し、結果として、腫瘍関連マクロファージはＣＲＣにおける予後不良と関連する（例えば、Bindea et al. (2013) Immunity 39:782-795を参照）。がんに浸潤し、がんを取り囲む免疫細胞に基づき、がん患者の予後を推定する方法、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）を使用して、Ｔ細胞排除またはＴ細胞浸潤を測定することができる。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）は、がんの分類に宿主免疫応答の影響を組み込み、予後予測精度を改善する。これは、腫瘍の中心および周辺で２つのＴリンパ球集団（ＣＤ３／ＣＤ８、ＣＤ３／ＣＤ４５ＲＯ、またはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ）の密度を測定し、両方の領域で両方の細胞型の低い密度が見出された場合の０（Ｉ０）から、両方の領域で高い密度が見出された場合の免疫スコア４（Ｉ４）までの範囲のスコアを提供する。Ｔリンパ球の低浸潤は、高リスクと相関する低いＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）をもたらすのに対し、Ｔリンパ球の高浸潤は、低リスクと相関する高いＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）をもたらす。したがって、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ（登録商標）は、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いた治療法に応答する患者を特定するための前向きバイオマーカーとして評価することができる。例えば、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、コールド腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）におけるＴ細胞浸潤を誘導するので、Ｔ細胞不足／非炎症腫瘍を処置することができる。そのような腫瘍は、チェックポイント阻害が不応性である、アンメットニーズの高い集団を表す。
細胞外アデノシンは、一緒になって死細胞または瀕死細胞から産生されるＡＴＰまたはＡＤＰのリン加水分解によってアデノシンを産生する、腫瘍間質細胞上に発現される膜関連エクト酵素、ＣＤ３９（エクト－ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、またはＮＴＰＤアーゼ１）およびＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）の順次活性によって産生される。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰ（またはＡＤＰ）を５’－ＡＭＰに変換し、それは、ＣＤ７３によってアデノシンに変換される。内皮細胞上のＣＤ３９およびＣＤ７３の発現は、腫瘍微小環境の低酸素状態下で増大し、それにより、アデノシンのレベルを増大させる。したがって、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いて標的化できるアデノシンが豊富な腫瘍を指し示すバイオマーカーとして使用することができる。
環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られるＣＤ３８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂリンパ球、およびナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞の表面に見出される糖タンパク質である。細胞活性化のマーカーであるＣＤ３８の損失は、免疫応答の障害と関連し、白血病、骨髄腫、および固形腫瘍と連鎖している。その上、ＣＤ３８の発現増大は、慢性リンパ性白血病における予後不良の診断マーカーであり、疾患進行の増大と関連する。ＣＤ３８はまた、多発性骨髄腫の処置のために承認されているダラツムマブ［Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）］についての標的として使用される。ＣＤ６８は、単球、循環マクロファージ、および組織マクロファージ（例えば、クッパー細胞、ミクログリア）によって高度に発現される。ＦｏｘＰ３は、免疫系の応答に関与し、免疫抑制性である制御性Ｔ細胞（またはＴｒｅｇ）の発生および機能における調節物質として作用する。がんにおいて、過剰の制御性Ｔ細胞活性は、免疫系ががん細胞を破壊することを防止することができる。したがって、ＣＤ３８、ＣＤ６８、およびＦｏｘＰ３はまた、本明細書における免疫刺激細菌を用いた治療法に応答する可能性が高い患者を選択するためのバイオマーカーとして使用することができる。
ｂ．免疫刺激細菌の活性を評価または検出するための診断は処置の有効性を示す
バイオマーカーを使用して、処置後に免疫刺激細菌をモニタリングすることができる。バイオマーカーは、腫瘍試料中および／または体液試料中、例えば、血液、血漿、尿、唾液、および他の液体中に存在する。検証済みの末梢血バイオマーカーを使用して、処置の前および途中に患者の免疫状態を評価して、処置の有効性と相関する免疫状態における変化が決定される。抗腫瘍免疫応答の状態への変化またはその増大は、免疫刺激細菌を用いた処置が効果を有していることを指し示す。例えば、用量漸増試験および拡大試験における本明細書に提供される免疫刺激細菌の免疫調節活性を評価することができる。バイオマーカーの検討は、疾患（例えば、腫瘍）状態およびその処置に関係する予後因子および予測因子を明らかにし、それは、処置をモニタリングすることを助けることができる。腫瘍微小環境を評価することは、例えば、免疫療法に対する腫瘍応答のメカニズムへの洞察を提供する。免疫刺激細菌の免疫調節活性を検出するための血清バイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ９、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、炎症性血清サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１／ＣＣＬ１）、およびＩＬ－１８結合タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、例えば免疫療法に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および腫瘍への輸送に必要なケモカインである。ニボルマブ、抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤の第３相試験において、以前に処置された転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）を有する患者の処置について、投与された用量にかかわらず、大部分の患者に共通であった免疫薬力学効果が特定された。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術［Ｍｙｒｉａｄ（登録商標）Ｒｕｌｅｓ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＲＢＭ）］に基づくマルチプレックスパネルを使用して、ＩＦＮ－γ調節血清ケモカインＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の評価を行い、結果は、増大したＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０血清レベルのみならず、腫瘍における増大した転写が臨床応答と相関したことを実証した。ニボルマブを用いた処置後のケモカインレベルにおけるベースラインからの増大の中央値は、末梢血中でＣＸＣＬ９について１０１％、およびＣＸＣＬ１０について３７％であった（例えば、Choueiri et al. (2016) Clin. Cancer Res. 22(22):5461-5471を参照）。その上、ＭＫ－１４５４ ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｍｅｒｃｋ）を用いた進行固形腫瘍またはリンパ腫を有する患者の処置は、腫瘍内投薬後の血清ＣＸＣＬ１０における用量依存性増大をもたらした（例えば、Harrington et al. ESMO Annual Meeting (2018)を参照）。ＩＦＮ－βの血清レベルにおける用量依存性増大が、ＡＤＵ－Ｓ１００ ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）の腫瘍内投薬後に観察された（例えば、Meric-Bernstam et al. ASCO Annual Meeting (2019)を参照）。その上、ＶＮＰ２０００９の静脈内投与は、炎症性サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１２の血清レベルにおける用量依存性増大を誘導した（例えば、Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照）。
ＩＬ－１８は、細胞内細菌、真菌およびウイルスに対する防御免疫応答に関与し、肺がん、乳がん、肉腫、および黒色腫の前臨床モデルにおいて抗腫瘍活性を実証している。ＩＬ－１８の生物活性は、ＩＦＮ－γを経由して誘導されるＩＬ－１８結合性タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）による負のフィードバックループにおいてモジュレーションされる。したがって、ＩＬ－１８ＢＰの血清レベルは、臨床ＩＦＮ－γ活性を予測する。進行がんを有する患者への組換えヒトＩＬ－１８（ｒｈＩＬ－１８）の静脈内投与は、ＩＬ－１８結合性タンパク質の血清濃度の用量依存的な増大のみならず、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、および可溶性Ｆａｓリガンドにおける増大をもたらした（例えば、Robertson et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(14):4265-4273を参照）。その上、尿および血清中のＩＬ－１８ＢＰのレベルは、前立腺がんを有する患者における腫瘍状態と相関することが観察された；前立腺がんを有する例と有さない例との間で尿ＩＬ－１８ＢＰレベルに有意差が見出され、増大した血清ＩＬ－１８ＢＰレベルは、前立腺がんグリーソンスコアが増大することと相関し、前立腺がん細胞からのＩＬ－１８ＢＰ分泌の上昇が、免疫サーベイランスを逃避しようとするがんによる試みを指し示し得ることを実証している（例えば、Fujita et al. (2011) Int. J. Cancer 129(2):424-432を参照）。したがって、ＩＬ－１８ＢＰを腫瘍免疫応答についてのバイオマーカーとして使用することができる。
２．腫瘍
本明細書に提供される免疫刺激細菌、組合せ、使用、および方法は、肺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、胃がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝がん、膵がん、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんを含むがん、特に固形腫瘍を含む、すべての腫瘍型を処置するために適用することができる。方法はまた、血液がんを処置するために使用することができる。
本明細書に提供される免疫刺激細菌、組成物、組合せ、使用、および方法による処置に供される腫瘍およびがんは、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、膵臓、消化管、中枢および末梢神経系、腎系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、関節、脂肪組織を含む結合組織系、ならびに血管壁を含む循環系を起源とするものを含むが、それに限定されるわけではない。本明細書に提供される免疫刺激細菌を用いて処置することができる腫瘍の例は、癌腫、神経膠腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、腺癌、腺肉腫、および腺腫を含む。そのような腫瘍は、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部、または肝臓を含む身体の事実上すべての部分に存在し得る。
骨格系の腫瘍は、例えば、肉腫および芽細胞腫、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、および軟骨芽細胞腫を含む。筋肉および心臓の腫瘍は、骨格筋および平滑筋の両方の腫瘍、例えば、平滑筋腫（平滑筋の良性腫瘍）、平滑筋肉腫、横紋筋腫（骨格筋の良性腫瘍）、横紋筋肉腫、および心臓肉腫を含む。消化管の腫瘍は、例えば、口、食道、胃、小腸、および結腸の腫瘍、ならびに結腸直腸腫瘍のみならず、消化管分泌臓器、例えば唾液腺、肝臓、膵臓、および胆道の腫瘍を含む。中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍は、脳、網膜、および脊髄の腫瘍を含み、また、関連する結合組織、骨、血管、または神経組織を起源とし得る。末梢神経系の腫瘍の処置もまた企図される。末梢神経系の腫瘍は、悪性末梢神経鞘腫を含む。腎臓系の腫瘍は、腎臓の腫瘍、例えば、腎細胞癌のみならず、尿管および膀胱の腫瘍を含む。生殖器系の腫瘍は、子宮頸部、子宮、卵巣、前立腺、精巣、および関連する分泌腺の腫瘍を含む。免疫系の腫瘍は、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方を含む血液ベースの腫瘍および固形腫瘍を含む。呼吸器系の腫瘍は、鼻道、気管支、および肺の腫瘍を含む。乳房の腫瘍は、例えば、小葉癌および腺管癌の両方を含む。
免疫刺激細菌によって処置できる腫瘍および本明細書に提供される方法の他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、消化管および腎臓の癌腫および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫（多形膠芽腫など）、および平滑筋肉腫を含む。本明細書に提供されるように処置できる他のがんの例は、リンパ腫、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患を含むが、それに限定されるわけではない。そのようながんの例は、血液悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病／リンパ腫、およびＴ細胞急性リンパ性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄新生物、例えば、成熟を伴う急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害；中枢神経系の腫瘍、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、髄芽腫、上衣腫、および網膜芽腫；頭頸部固形腫瘍（例えば、鼻咽頭がん、唾液腺癌、および食道がん）、肺（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）、消化器系（例えば、消化器がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒまたはｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胆管または胆道のがん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、および肛門癌）、生殖器系（例えば、睾丸がん、陰茎がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、外陰がん、子宮頸がん、卵巣がん、および子宮内膜がん）、皮膚（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮がん、日光角化症、および皮膚黒色腫）、肝臓（例えば、肝がん、肝癌、肝細胞がん、および肝細胞腫）、骨（例えば、破骨細胞腫、および溶骨性骨がん）、追加的な組織および臓器（例えば、膵がん、膀胱がん、腎臓がんまたは腎がん、甲状腺がん、乳がん、腹膜がん、およびカポジ肉腫）、血管系の腫瘍（例えば、血管肉腫および血管周皮腫）、ウィルムス腫瘍、網膜芽腫、骨肉腫、およびユーイング肉腫を含む。
３．投与
本明細書における使用および方法を実施する場合、本明細書に提供される免疫刺激細菌は、腫瘍を有するもしくは新生細胞を有する対象、または免疫処置すべき対象を含む対象に投与することができる。免疫刺激細菌を投与するために適した状態を有する対象を診断すること、対象の免疫適格性を決定すること、対象を免疫処置すること、化学療法剤を用いて対象を処置すること、放射線を用いて対象を処置すること、または対象を外科的に処置することを含むが、それに限定されるわけではない１つまたは複数の工程は、対象への免疫刺激細菌の投与前、投与と同時、または投与後に行うことができる。
担腫瘍対象に免疫刺激細菌を治療目的で投与することを含む実施形態について、対象は、典型的には、以前に新生物状態と診断されている。診断方法はまた、新生物状態の型を決定すること、新生物状態のステージを決定すること、対象における１つもしくは複数の腫瘍のサイズを決定すること、対象のリンパ節中の転移性細胞もしくは新生細胞の存在もしくは非存在を決定すること、または対象における転移の存在を決定することを含み得る。
対象に免疫刺激細菌を投与するための治療方法の一部の実施形態は、原発腫瘍のサイズまたは新生物性疾患のステージを決定する工程を含む場合がある。そして、原発腫瘍のサイズが閾値容量以上の場合、または新生物性疾患のステージが閾値ステージ以上の場合、免疫刺激細菌が対象に投与される。類似の実施形態では、原発腫瘍のサイズが閾値容量未満の場合、または新生物性疾患のステージが閾値ステージ以下の場合、免疫刺激細菌は、対象にまだ投与されず；そのような方法は、腫瘍サイズまたは新生物性疾患のステージが閾値量に達するまで対象をモニタリングし、次いで、対象に免疫刺激細菌を投与することを含み得る。閾値サイズは、腫瘍の成長速度、免疫刺激細菌が腫瘍に感染する能力、および対象の免疫適格性を含むいくつかの要因に応じて変動し得る。一般的に、閾値サイズは、免疫刺激細菌が宿主の免疫系によって完全には排除されずに腫瘍内または腫瘍近くで蓄積および複製するために十分なサイズであり、典型的には、宿主が腫瘍細胞に対する免疫応答を開始するために十分長い時間、典型的には約１週間以上、約１０日以上、または約２週間以上、細菌感染を持続させるために十分なサイズでもある。例示的な閾値ステージは、最低ステージ（例えば、ステージＩもしくは等価物）を超える任意のステージ、または原発腫瘍が閾値サイズよりも大きな任意のステージ、または転移性細胞が検出される任意のステージである。
免疫刺激細菌が腫瘍または転移に侵入することを投与様式が可能にするならば、対象に微生物を投与する任意の様式を使用することができる。投与様式は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、外用、腫瘍内、多穿刺、吸入、鼻腔内、経口、体腔内（例えば、カテーテルを介して膀胱に投与すること、または坐剤もしくは浣腸により腸に投与すること）、耳内、直腸、および眼内投与を含み得るが、それに限定されるわけではない。
当業者は、対象および細菌と適合性の任意の投与様式であって、細菌が腫瘍および／または転移に到達することをもたらす可能性も高い投与様式を選択することができる。投与経路は、当業者によって、疾患の性質、腫瘍の種類、および医薬組成物中に含有される特定の細菌を含む多様な要因のいずれかにより選択され得る。標的部位への投与は、例えば、弾道デリバリーによって、もしくはコロイド分散系として行うことができ、または全身投与は動脈内注射によって行うことができる。
投薬量レジメンは多様な方法および量のいずれであってもよく、当業者が公知の臨床因子により決定することができる。免疫刺激が処置を引き起こす疾患または障害を処置するために、単回用量が治療的に有効であり得る。そのような刺激の例は、特異的免疫応答および非特異的免疫応答の一方または両方、特異的応答および非特異的応答の両方、自然応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、およびサイトカイン発現を含むが、それに限定されるわけではない免疫応答である。
医術において公知のように、対象のための投薬量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫適格性、および全身の健康状態、投与すべき特定の細菌、投与の期間および経路、疾患の種類およびステージ、例えば腫瘍サイズ、および同時投与される他の化合物、例えば薬物を含む多数の要因に依存し得る。上記要因に加えて、そのようなレベルは、当業者によって決定され得るように細菌の感染力および細菌の性質によって影響される場合がある。本方法では、細菌の適切な最小投薬量レベルは、細菌が腫瘍内または転移内で生存、成長、および複製するために十分なレベルであり得る。６５ｋｇのヒトに細菌を投与するための例示的な最低レベルは、少なくとも約５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）、少なくとも約１×１０７ＣＦＵ、少なくとも約５×１０７ＣＦＵ、少なくとも約１×１０８ＣＦＵ、または少なくとも約１×１０９ＣＦＵを含み得る。本方法では、細菌のおよその最大投薬量レベルは、宿主に有毒でないレベル、３×以上の脾腫を起こさないレベル、または約１日後、もしくは約３日後、もしくは約７日後に正常組織または臓器にコロニーもプラークももたらさないレベルであり得る。６５ｋｇのヒトに細菌を投与するための例示的な最高レベルは、約５×１０１１ＣＦＵ以下、約１×１０１１ＣＦＵ以下、約５×１０１０ＣＦＵ以下、約１×１０１０ＣＦＵ以下、または約１×１０９ＣＦＵ以下を含み得る。
本明細書に提供される方法および使用は、対象への免疫刺激細菌の単回投与、または対象への免疫刺激細菌の複数回投与、または他の抗腫瘍療法および／もしくは処置との併用療法を含むその他の多様なレジメンを含み得る。これらは、例えば、細胞療法、例えば改変免疫細胞の投与；ＣＡＲ－Ｔ療法；ＣＲＩＳＰＲ療法；チェックポイント阻害剤、例えば抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ－４抗体、ならびに他のそのような免疫療法）；化学療法化合物、例えばヌクレオシドアナログ；外科手術；および放射線療法を含む。他のがん治療はまた、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＧＦ－βもしくは抗ＩＬ－６抗体、またはその断片、がんワクチン、および腫瘍溶解性ウイルスを含む。
一部の実施形態では、単回投与は、腫瘍内に免疫刺激細菌を樹立するために十分であり、そこで、細菌は定着することができ、対象において抗腫瘍応答を引き起こすまたは増強することができる。他の実施形態では、本明細書における方法に使用するために提供される免疫刺激細菌は、時間が離れた、典型的には少なくとも１日離れた、異なる機会に投与することができる。別々の投与は、腫瘍または転移に細菌を送達する可能性を増大させることができ、その際、以前の投与は、腫瘍または転移に細菌を送達することに無効であった場合がある。実施形態では、別々の投与は、細菌の定着／増殖が起こり得る腫瘍または転移上の位置を増大させることができ、また、腫瘍中に蓄積した細菌の力価を別途増大させることができ、それにより、宿主の抗腫瘍免疫応答の誘起または増強を増大させることができる。
別々の投与が行われる場合、各投与は、他の投与の投薬量と比べて同じまたは異なる投薬量であり得る。一実施形態では、すべての投与の投薬量は、同じである。他の実施形態では、第１の投薬量は、１つまたは複数のその後の投薬量よりも大きな、例えば、その後の投薬量よりも少なくとも１０×大きな、少なくとも１００×大きな、または少なくとも１０００×大きな投薬量であり得る。第１の投薬量が１つまたは複数のその後の投薬量よりも大きい、別々の投与方法の一例では、すべてのその後の投薬量は、第１の投与と比べて同じ、より少ない量であり得る。
別々の投与は、２、３、４、５、または６回の投与を含む、２回以上の任意の回数の投与を含み得る。当業者は、治療方法をモニタリングするための当技術分野において公知の方法、および本明細書に提供される他のモニタリング方法により、１つまたは複数の追加的な投与を行うための投与回数または投与する望ましさを容易に決定することができる。したがって、本明細書に提供される方法は、対象に免疫刺激細菌の１回または複数回の投与を提供し、モニタリングの結果に基づき、１つまたは複数の追加的な投与を提供するかどうかを決める方法を含み、その際、投与回数は、対象をモニタリングすることによって決定することができる。１つまたは複数の追加的な投与を提供するかどうかを決めることは、腫瘍成長または腫瘍成長阻害の指標、新しい転移または転移の阻害の出現、対象の抗細菌抗体力価、対象の抗腫瘍抗体力価、対象の健康全般、および対象の体重を含むが、それに限定されるわけではない多様なモニタリング結果に基づき得る。
投与同士の間の期間は、多様な期間のいずれかであり得る。投与の間の期間は、投与回数、対象が免疫応答を開始する期間、対象が正常組織から細菌を浄化する期間、または腫瘍もしくは転移内の細菌の定着／増殖の期間に関して記載されるような、モニタリング工程を含む多様な要因のいずれかの関数であり得る。一例では、期間は、対象が免疫応答を開始する期間の関数である場合があり；例えば期間は、対象が免疫応答を開始する期間よりも長い、例えば、約１週間より長い、約１０日より長い、約２週間より長い、または約１カ月より長い場合がある。別の例では、期間は、対象が免疫応答を開始する期間より短い、例えば約１週間未満、約１０日未満、約２週間未満、または約１カ月未満の場合がある。別の例では、期間は、腫瘍または転移内の細菌の定着／増殖の期間の関数である場合があり；例えば期間は、検出可能なマーカーを発現している微生物の投与後、例えば約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１カ月後の腫瘍または転移内に検出可能なシグナルが生じる時間よりも長い場合がある。
本明細書に使用される方法はまた、本明細書に提供される免疫刺激細菌を含有する懸濁物および他の製剤などの組成物を投与することによって行うことができる。そのような組成物は、本明細書に提供される、または当業者に公知の、細菌および薬学的に許容される賦形剤または媒体を含有する。
上述のように、本明細書に提供される使用および方法はまた、免疫刺激細菌を対象に投与することに加えて、１つまたは複数の治療用化合物、例えば抗腫瘍化合物または他のがん治療薬を対象に投与することを含み得る。治療用化合物は、腫瘍治療効果のために独立して、または免疫刺激細菌と共に作用し得る。独立して作用し得る治療用化合物は、免疫刺激細菌が腫瘍内に蓄積する、腫瘍内で複製する、および対象において抗腫瘍免疫応答を引き起こすまたは増強する能力を低減せずに、腫瘍成長を阻害する、転移の成長および／もしくは形成を阻害する、腫瘍もしくは転移のサイズを減少させる、または腫瘍もしくは転移を無くすことができる多様な公知の化学療法化合物のいずれかを含む。そのような化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アンドロゲン薬、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗アドレナリン薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン［Ｆａｒｅｓｔｏｎ（登録商標）］を含む抗エストロゲン薬；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；アジリジン、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、およびウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルメラミン；葉酸補充剤（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えばフォリン酸；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；白金アナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えばアルギニンデアミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、および５－ＦＵ；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、およびそのアルブミネート型（すなわち、ｎａｂ－パクリタキセルおよびｎａｂ－ドセタキセル）；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばＲＦＳ－２０００；チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えばＴｏｍｕｄｅｘ（登録商標）；ならびにアセグラトンを含む追加的な化学療法剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デホスファミド；デメコルチン；ジアジクオン；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；エフロルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；およびトポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカンを含むが、それに限定されるわけではない。上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も使用することができる。
免疫刺激細菌と共に作用する治療用化合物は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、チェックポイント遺伝子（複数可）の発現を阻害、抑制、もしくは破壊するＲＮＡｉ分子、他の標的に対する１つもしくは複数のチェックポイント阻害剤抗体もしくはその断片、または細菌の定着／増殖をさらに増強することができる化合物などの、コードされている治療用産物の発現を増大させることによって細菌の免疫応答誘発特性を増大させる化合物を含む。例えば、遺伝子発現変更化合物は、プラスミド上にコードされている外因性遺伝子などの、細菌内で遺伝子の転写を誘導または増大させ、それにより、免疫応答を誘発することができる。ＩＰＴＧおよびＲＵ４８６を含む、遺伝子発現を変更することができる多種多様な化合物のいずれかは、当技術分野において公知である。発現をアップレギュレーションできる例示的な遺伝子は、毒素、プロドラッグを抗腫瘍薬物に変換することができる酵素、サイトカイン、転写調節タンパク質、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムを含む、タンパク質およびＲＮＡ分子をコードするものを含む。他の実施形態では、細菌の定着／増殖または免疫応答誘発特性を増大させる免疫刺激細菌と共に作用することができる治療用化合物は、細菌にコードされている遺伝子産物と共に相互作用することができる化合物であり、そのような相互作用は、腫瘍細胞の殺滅増大、または対象における抗腫瘍免疫応答の増大をもたらし得る。細菌によりコードされている遺伝子産物と相互作用することができる治療用化合物は、例えばその対象に投与された形態でほとんどまたはまったく毒性も他の生物活性も有さないプロドラッグまたは他の化合物を含み得るが、細菌によりコードされている遺伝子産物と相互作用した後、化合物は、細胞傷害性、アポトーシスを誘導する能力、または免疫応答をトリガーする能力を含むが、それに限定されるわけではない、腫瘍細胞死をもたらす特性を発生することができる。ガンシクロビル、５－フルオロウラシル、６－メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン－ドキソルビシン、４－［（２－クロロエチル）（２－メスルオキシエチル（ｍｅｓｕｌｏｘｙｅｔｈｙｌ））アミノ］ベンゾイル－Ｌ－グルタミン酸、アセトアミノフェン、インドール－３－酢酸、ＣＢ１９５４、７－エチル－１０－［４－（１－ピペリジノ）－１－ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン、ビス－（２－クロロエチル）アミノ－４－ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、１－クロロメチル－５－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－ベンズ［ｅ］インドール、エピルビシン－グルクロニド、５’－デオキシ５－フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、およびリナマリンを含む、多様なプロドラッグ様物質が当技術分野において公知である。
４．モニタリング
本明細書に提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および／または対象に投与された免疫刺激細菌をモニタリングする１つまたは複数の工程をさらに含むことができる。腫瘍サイズをモニタリングすること、転移の存在および／またはサイズをモニタリングすること、対象のリンパ節をモニタリングすること、対象の体重または血液もしくは尿のマーカーを含む他の健康指標をモニタリングすること、抗細菌抗体の力価をモニタリングすること、検出可能な遺伝子産物の細菌発現をモニタリングすること、および対象の腫瘍、組織、または臓器中の細菌力価を直接モニタリングすることを含むが、それに限定されるわけではない、多様なモニタリング工程のいずれかが、本明細書に提供される方法に含まれ得る。
モニタリングの目的は、単に対象の健康状態、もしくは対象の治療的処置の進行を評価するための場合もあり、また、同じもしくは異なる免疫刺激細菌のさらなる投与が正当化されるかどうかを決定するため、または化合物が治療方法の有効性を増大させるように作用できる、もしくは化合物が対象に投与された細菌の病原性を減少させるように作用できる対象に、化合物をいつ投与すべきか、もしくは投与すべきかどうかを決定するための場合もある。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、細菌により発現される１つまたは複数の遺伝子をモニタリングすることを含み得る。本明細書に提供されるもの、または当技術分野において別途公知のものなどの細菌は、検出可能なタンパク質を含むが、それに限定されるわけではない１つまたは複数の検出可能な遺伝子産物を発現することができる。
本明細書に提供されるように、細菌において発現される検出可能な遺伝子産物の測定は、対象に存在する細菌のレベルの正確な決定を提供することができる。本明細書にさらに提供されるように、検出可能な遺伝子産物の、例えば、断層撮影法を含むイメージング法による位置の測定は、対象における細菌の位置を決定することができる。したがって、検出可能な細菌遺伝子産物をモニタリングすることを含む、本明細書に提供される方法を使用して、対象の１つもしくは複数の臓器内もしくは組織内の細菌の存在もしくは非存在、および／または対象の腫瘍内もしくは転移内の細菌の存在もしくは非存在を決定することができる。さらに、検出可能な細菌遺伝子産物をモニタリングすることを含む本明細書に提供される方法を使用して、１つまたは複数の臓器、組織、腫瘍、または転移に存在する細菌の力価を決定することができる。対象における細菌の位置および／または力価をモニタリングすることを含む方法は、正常組織および臓器の細菌感染、特に感染レベルが、細菌の病原性を指し示すことができるので、細菌の病原性を決定するために使用することができる。対象における免疫刺激細菌の位置および／または力価をモニタリングすることを含む方法は、複数の時点で行うことができ、したがって、対象の１つまたは複数の臓器内または組織内の細菌複製速度を含む、対象における細菌の複製速度を決定することができ；したがって、細菌遺伝子産物をモニタリングすることを含む方法は、細菌の複製適格性を決定するために使用することができる。本明細書に提供される方法を使用して、多様な臓器または組織、および腫瘍内または転移内に存在する免疫刺激細菌の量を定量することもでき、したがって、対象における細菌の優先的蓄積の程度を指し示すことができる；したがって、細菌遺伝子産物のモニタリングは、細菌が、正常な組織内または臓器内よりも腫瘍内または転移内に蓄積する能力を決定する方法に使用することができる。本明細書に提供される方法に使用される免疫刺激細菌は腫瘍全体に蓄積することができるか、または腫瘍内の複数の部位に蓄積することができ、転移内にも蓄積することができるので、細菌遺伝子産物をモニタリングするための本明細書に提供される方法を使用して、対象に存在する腫瘍のサイズまたは転移の数を決定することができる。腫瘍内または転移内の細菌遺伝子産物のそのような存在を一連の時間にわたりモニタリングすることを用いて、腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生、または転移の消失を含む、腫瘍または転移における変化を評価することができ、それを使用して、腫瘍の成長もしくは縮小の速度、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度、または腫瘍の成長もしくは縮小の速度変化、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度変化を決定することもできる。したがって、細菌遺伝子産物をモニタリングすることは、腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度、あるいは腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度変化を決定することによって、対象における新生物性疾患をモニタリングするために、または新生物性疾患の処置の有効性を決定するために使用することができる。
多様な検出可能タンパク質のいずれかは、モニタリングによって検出することができ、その例は、多様な蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）のいずれか、多様なルシフェラーゼ、トランスフェリン、もしくは他の鉄結合タンパク質のいずれか；または受容体、結合性タンパク質、および抗体であり、その際、受容体、結合性タンパク質または抗体と特異的に結合する化合物は、検出可能な薬剤の場合も、また、検出可能な物質（例えば、放射性核種またはイメージング剤）でラベルされている場合もある。
腫瘍および／または転移のサイズは、外部評価法、または断層撮影もしくは磁気イメージング法を含む、当技術分野において公知の多様な方法のいずれかによってモニタリングすることができる。当技術分野において公知の方法に加えて、本明細書に提供される方法、例えば、細菌遺伝子発現のモニタリングは、腫瘍および／または転移のサイズをモニタリングするために使用することができる。
いくつかの時点にわたりサイズをモニタリングすることは、腫瘍または転移のサイズにおける増大または減少に関する情報を提供することができ、対象における追加的な腫瘍および／または転移の存在に関する情報も提供することができる。いくつかの時点にわたり腫瘍サイズをモニタリングすることは、対象における新生物性疾患の処置の有効性を含む、対象における新生物性疾患の発生に関する情報を提供することができる。
本明細書に提供される方法はまた、対象への免疫刺激細菌の投与に応答して産生される抗体を含む、対象における抗体力価をモニタリングすることを含み得る。本明細書に提供される方法において投与される細菌は、内因性細菌抗原の免疫応答を誘発することができる。本明細書に提供される方法において投与される細菌はまた、細菌によって発現される外因性遺伝子に対する免疫応答を誘発することができる。本明細書に提供される方法において投与される細菌はまた、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発することができる。細菌抗原、細菌により発現される外因性遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体の力価をモニタリングすることを使用して、細菌の毒性をモニタリングする、処置方法の有効性をモニタリングする、または産生および／もしくは回収のための遺伝子産物（複数可）もしくは抗体のレベルをモニタリングすることができる。
抗体力価のモニタリングを使用して、細菌の毒性をモニタリングすることができる。細菌に対する抗体力価は、対象への細菌の投与後の期間にわたり変動する場合があり、その際、いくつかの特定の時点で、低い抗（細菌抗原）抗体力価は、より低い毒性を指し示すことができるのに対し、他の時点で、高い抗（細菌抗原）抗体力価は、より高い毒性を指し示すことができる。本明細書に提供される方法に使用される細菌は、免疫原性でありえ、したがって、対象に細菌を投与した後すぐに免疫応答を誘発することができる。一般的に、対象の免疫系が強い免疫応答を開始することができる免疫刺激細菌は、対象の免疫系がすべての正常な臓器または組織から細菌を排除することができる場合に低い毒性を有する細菌であり得る。したがって、一部の実施形態では、対象に細菌を投与した後すぐの、細菌抗原に対する高い抗体力価は、細菌の低い毒性を指し示し得る。
他の実施形態では、抗体力価をモニタリングすることを使用して、処置方法の有効性をモニタリングすることができる。本明細書に提供される方法では、抗（腫瘍抗原）抗体力価などの抗体力価は、治療方法、例えば、新生物性疾患を処置するための治療方法の有効性を指し示すことができる。本明細書に提供される治療方法は、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすまたは増強することを含み得る。したがって、抗（腫瘍抗原）抗体力価をモニタリングすることによって、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすかまたは増強することへの治療方法の有効性をモニタリングすることが可能である。
他の実施形態では、抗体力価をモニタリングすることは、産生および／または回収のために遺伝子産物（複数可）または抗体のレベルをモニタリングするために使用され得る。本明細書に提供されるように、方法は、腫瘍内、腫瘍微小環境内、および／または腫瘍常在性免疫細胞内に蓄積している微生物内で外因性遺伝子を発現することによって、タンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物を産生するために使用することができる。タンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物に対する抗体力価をモニタリングすることは、腫瘍蓄積微生物によるタンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物の産生レベルを指し示すことができ、また、そのようなタンパク質、ＲＮＡ分子、または他の化合物に特異的な抗体のレベルを直接指し示すこともできる。
本明細書に提供される方法はまた、対象の健康をモニタリングする方法を含み得る。本明細書に提供される方法の一部は、新生物性疾患治療方法を含む治療方法である。対象の健康をモニタリングすることを使用して、当技術分野において公知のように、治療方法の有効性を決定することができる。本明細書に提供される方法はまた、本明細書に提供される免疫刺激細菌を対象に投与する工程を含み得る。対象の健康をモニタリングすることを使用して、対象に投与される免疫刺激細菌の病原性を決定することができる。疾患、例えば新生物性疾患、感染性疾患、または免疫関連疾患をモニタリングするための多様な健康診断方法のいずれかを、当技術分野において公知のようにモニタリングすることができる。例えば、対象の体重、血圧、脈拍、呼吸、色、温度、または他の観察可能な状態は、対象の健康を指し示すことができる。加えて、対象からの試料中の１つまたは複数の成分の存在、または非存在、またはレベルは、対象の健康を指し示すことができる。典型的な試料は、血液および尿試料を含む場合があり、その際、１つまたは複数の成分の存在、または非存在、またはレベルは、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断検査を行うことによって決定することができる。対象の健康を指し示す例示的な成分は、白血球数、ヘマトクリット、およびｃ反応性タンパク質濃度を含むが、それに限定されるわけではない。
本明細書に提供される方法は、治療法をモニタリングすることを含む場合があり、その際、治療的判断は、モニタリングの結果に基づき得る。本明細書に提供される治療方法は、対象に免疫刺激細菌を投与することを含む場合があり、その際、細菌は、腫瘍内、腫瘍微小環境内、もしくは腫瘍常在性免疫細胞内、および／または転移内に優先的に蓄積する場合があり、その際、細菌は、抗腫瘍免疫応答を引き起こすまたは増強することができる。そのような治療方法は、特定の免疫刺激細菌の複数回投与、第２の免疫刺激細菌の投与、または治療用化合物の投与を含む多様な工程を含み得る。対象に投与するための免疫刺激細菌または化合物の量、タイミング、または型の決定は、対象をモニタリングすることからの１つまたは複数の結果に基づき得る。例えば、対象における抗体力価を使用して、免疫刺激細菌および適宜、化合物を投与することが望ましいかどうか、投与すべき細菌および／または化合物の量、ならびに投与すべき細菌および／または化合物の型を決定することができ、その際、例えば低い抗体力価は、追加的な免疫刺激細菌、異なる免疫刺激細菌、および／または治療用化合物、例えば細菌の遺伝子発現を誘導する化合物、もしくは免疫刺激細菌に依存せずに有効な治療用化合物を投与する望ましさを指し示すことができる。
別の例では、対象の全体的な健康状態を使用して、免疫刺激細菌および適宜、化合物を投与することが望ましいかどうか、投与すべき細菌および／または化合物の量、ならびに投与すべき細菌および／または化合物の型を決定することができ、その際、例えば、対象が健康であることを決定することは、追加的な細菌、異なる細菌、または治療用化合物、例えば細菌遺伝子／遺伝的ペイロード／治療用産物の発現を誘導する化合物を投与する望ましさを指し示すことができる。別の例では、細菌により発現される検出可能な遺伝子産物をモニタリングすることを使用して、免疫刺激細菌および適宜、化合物を投与することが望ましいかどうか、投与すべき細菌および／または化合物の量、ならびに投与すべき細菌および／または化合物の型を決定することができ、その際、例えば、対象が健康であることを決定することは、追加的な細菌、異なる細菌、または治療用化合物、例えば細菌遺伝子／遺伝的ペイロード／治療用産物の発現を誘導する化合物を投与する望ましさを指し示すことができる。そのようなモニタリング方法を使用して、治療方法が有効かどうか、治療方法が対象に病原性かどうか、細菌が腫瘍または転移内に蓄積したかどうか、および細菌が正常な組織または臓器内に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような決定に基づき、さらなる治療方法の望ましさおよび形態を導出することができる。
別の例では、モニタリングは、免疫刺激細菌が対象の腫瘍または転移内に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような決定の際に、追加的な細菌、異なる免疫刺激細菌、および適宜、化合物を対象にさらに投与するために決定を行うことができる。
Ｈ．実施例
以下の実施例は説明の目的のためのみに含まれており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
［実施例１］
サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の栄養要求性株
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株ＹＳ１６４６はアデノシンに対して栄養要求性である。
本明細書で提供する株はアデノシンに対して栄養要求性になるように操作されている。結果として、これらの株は正常組織の低いアデノシン濃度では複製することができないので、インビボで弱毒化し、コロニー形成は主としてアデノシンレベルが高い固形腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中で起こる。サルモネラ株ＹＳ１６４６は野生型株ＡＴＣＣ １４０２８の誘導体であり、ｐｕｒＩ遺伝子（ｐｕｒＭと同義）の破壊によってプリンに対して栄養要求性になるように操作されている（例えばLow et al. (2004) Methods Mol. Med. 90:47-60を参照）。ＹＳ１６４６の全ゲノムの引き続く解析によって、ｐｕｒＩ遺伝子は事実上欠失していないが、その代わりに染色体の逆転によって破壊されており（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnol. 192:177-178を参照）、全遺伝子は、挿入配列に隣接するＹＳ１６４６染色体の２つの部分（その１つが活性トランスポサーゼを有している）の中に依然として含まれていることが実証された。染色体のリエンゲージメントによって破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子への復帰の可能性を未解決のままにしている。ＹＳ１６４６のプリン栄養要求性はインビトロで１４０を超える連続継代の後でも安定であることが既に実証されているが、復帰速度は明らかでない（例えばClairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。
株ＹＳ１６４６はアデノシンが提供されれば最小培地中で複製することができる一方、野生型の親株ＡＴＣＣ １４０２８はアデノシンが添加されていない最小培地中で増殖することができることが、本明細書で示されている。株ＹＳ１６４６を溶原性ブロス（ＬＢ）培地中で一夜増殖させ、Ｍ９最小培地で洗浄し、アデノシンを含まないかまたは増大するアデノシンの濃度を含むＭ９最小培地中に希釈した。増殖は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、３７℃で１５分ごとにＯＤ６００を読み取ることによって測定した。
結果は、全てのアデノシンの濃度で増殖することができた野生型株（ＡＴＣＣ １４０２８）とは異なり、株ＹＳ１６４６のみはアデノシンが１１～３００マイクロモルの範囲の濃度で提供された場合に複製することができ、Ｍ９単独または１３０ナノモルのアデノシンが添加されたＭ９中では完全に複製不能であることを示した。これらのデータは、ｐｕｒＩ突然変異体(mutant)は腫瘍の微小環境中で見出されるアデノシンの濃度で複製することができるが、正常組織中で見出される濃度では複製できないことを実証している。本明細書で例示した操作されたアデノシン栄養要求性株には、ｐｕｒＩオープンリーディングフレームの全部または一部が染色体から欠失して野生型への復帰を防止する株が含まれる。そのような遺伝子欠失は、以下に記載するラムダレッドシステムを含む当業者には既知の任意の方法によって達成することができる。
サルモネラ株ＹＳ１６４６はＡＴＰに対して栄養要求性である。
プリンおよびアデノシンに対する栄養要求性に加えて、ｐｕｒＩ欠失株がＡＴＰも捕捉することができるか否かを判定した。ＡＴＰは死滅する腫瘍細胞からの漏れによって腫瘍微小環境中に高いレベルで集積する。株ＹＳ１６４６はＡＴＰが提供されれば最小培地中で複製することができるが、ＡＴＰが添加されなければ増殖することができないことが本明細書において示される。これを実証するため、株ＹＳ１６４６をＬＢ培地中で一夜増殖させ、Ｍ９最小培地で洗浄し、ＡＴＰを含まないかまたは増大する濃度のＡＴＰ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＭ９最小培地中に希釈した。増殖は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、３７℃で１５分ごとにＯＤ６００を読み取って測定した。結果は、株ＹＳ１６４６はＡＴＰが０．０１２ｍＭの濃度で提供されれば複製することができるが、Ｍ９単独では複製することができないことを実証した。
［実施例２］
細胞内複製の欠陥はｍｓｂＢ突然変異(mutation)に帰せられる。
ＹＳ１６４６株は、複製を高濃度のプリン、アデノシン、またはＡＴＰを含む部位に限定するｐｕｒＩにおける突然変異、およびＴＬＲ４媒介炎症促進性シグナル伝達を低減するようにリポ多糖（ＬＰＳ）表面コートを変化させるｍｓｂＢにおける突然変異を含む。野生型サルモネラとは異なり、株ＹＳ１６４６はマクロファージ中では複製できないことも確立されている。これらの遺伝的突然変異のいずれが野生型株ＡＴＣＣ １４０２８の中にその表現型を与えるために関与しているかを決定するための実験を実施した。
このアッセイでは、マウスＲＡＷマクロファージ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）を、ｐｕｒＩ、ｍｓｂＢ、またはその両方の欠失を含む野生型サルモネラ株に、細胞あたり約５細菌の感染多重度（ＭＯＩ）で３０分、感染させ、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞外細菌を死滅させるためにゲンタマイシンを含む培地を加えた。ゲンタマイシンは細胞膜を通過できないので、細胞内細菌はゲンタマイシンによって死滅しない。感染後の種々の時点で細胞の単層を水による浸透圧ショックによって溶解し、細胞溶解物を希釈し、ＬＢ寒天上に播種して生存するコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。
下表に示すように、ｐｕｒＩ－突然変異のみを含む野生型サルモネラ株は、それでも複製することができた。これは、腫瘍微小環境に対する高度の特異性を達成しながら、ｐｕｒＩ欠失単独で忍容性の中程度の改善しか観察されなかった理由を説明している。ｍｓｂＢ－突然変異のみを含む株、ならびにｐｕｒＩ－およびｍｓｂＢ－突然変異を含む株は複製することができず、４８時間以内に細胞から急速に消失した。
Figure 2023501539000024

［実施例３］
サルモネラａｓｄ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
株ＹＳ１６４６Δａｓｄを調製した。これは、ａｓｄ遺伝子の欠失を有するように操作された株ＹＳ１６４６（これはＡＴＣＣから購入可能、カタログ＃２０２１６５）から誘導された弱毒化サルモネラ・チフィムリウム株である。この実施例では、サルモネラ・チフィムリウム株ＹＳ１６４６Δａｓｄを、以下に記載するようにDatsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］の方法の改変を使用して操作した。
株ＹＳ１６４６へのラムダレッドヘルパープラスミドの導入
ＹＳ１６４６株は、ＬＢ中で培養物を増殖させて１００倍に濃縮し、次いで氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄することによって、以前に記載された（Sambrook J. (1998) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)のように、エレクトロコンピテントになるように調製した。エレクトロコンピテントな株を、以下の設定、即ち２．５ｋＶ、１８６オーム、および５０μＦで、０．２ｃｍの間隙のキュベットを使用して、ラムダレッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６（配列番号２１８）とともに電気穿孔した。ｐＫＤ４６を有するトランスフォーマントを、アンピシリンおよび１ｍＭのＬ－アラビノースを含む５ｍＬのＳＯＣ培地中、３０℃で増殖させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。次いで株ＹＳ１６４６について上に記載したように、ラムダレッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６を含むＹＳ１６４６クローンをエレクトロコンピテントにした。
ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットの構築
ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットを設計するために、株ＹＳ１６４６のゲノム由来のａｓｄ遺伝子(Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178)を使用した。ａｓｄ遺伝子の左手領域および右手領域にそれぞれ相同の２０４および２０３塩基対（ｂｐ）を含むプラスミドを、ＤＨ５－アルファコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングした。次いでａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットを、プライマーａｓｄ－１およびａｓｄ－２（表１を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製した。
ａｓｄ遺伝子の欠失
プラスミドｐＫＤ４６を有するＹＳ１６４６株を、ゲル精製した線状ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットとともに電気穿孔した。電気穿孔した細胞をＳＯＣ培地中に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天プレート上に播種した。この工程の間に、ラムダレッドリコンビナーゼが染色体ａｓｄ遺伝子のｋａｎカセットによる相同組換え（染色体ａｓｄ遺伝子の上流および下流の相同隣接配列の存在による）を誘起し、ａｓｄ遺伝子の染色体コピーのノックアウトが起こる。選択されたカナマイシン耐性クローン中の破壊されたａｓｄ遺伝子の存在を、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム由来のプライマー（プライマーａｓｄ－３）およびマルチクローニング部位由来のプライマー（プライマーｓｃＦｖ－３）（表１を参照）を用いるＰＣＲ増幅によって確認した。ＤＡＰの栄養要求性を実証するため、ＤＡＰの添加ありと添加なしとで、コロニーもＬＢプレート上に複製播種した。ａｓｄ遺伝子が欠失した全てのクローンはＤＡＰの添加なしでは増殖できず、ＤＡＰに対する栄養要求性が実証された。
表1. プライマー情報
Figure 2023501539000025
カナマイシン遺伝子カセットの除去
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えシステムを使用することによって、ｋａｎ選択可能なマーカーを除去した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ遺伝子ＫａｎＲ突然変異体を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドであるｐＪＷ１６８（配列番号２２４）によって形質転換した。ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した。続いて４２℃における増殖によってｐＪＷ１６８を無くした。選択したクローンを、カナマイシンありおよびなしのＬＢ寒天プレートに複製播種することによって、ｋａｎの喪失について試験し、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム由来のプライマー（プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４、プライマー配列については表１を参照）を使用するＰＣＲ検証によって確認した。
機能性ａｓｄ欠失突然変異体株ＹＳ１６４６Δａｓｄ（ＡＳＴ－１０１とも命名）の確認
Δａｓｄ突然変異体はＬＢ寒天プレート上、３７℃では増殖できなかったが、５０μｇ／ｍＬのジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含むＬＢプレート上では増殖できた。Δａｓｄ突然変異体の増殖速度をＬＢ液体培地中で評価した。これは液体ＬＢ中では増殖できなかったが、６００ｎＭにおける吸光度の測定によって判定されたように、５０μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加したＬＢ中では増殖することができた。
ａｓｄ遺伝子欠失後の株ＹＳ１６４６Δａｓｄにおけるａｓｄ遺伝子座配列の配列確認
ａｓｄ遺伝子欠失株を、プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４（表１を参照）を使用するＤＮＡ配列決定によって検証した。ａｓｄ遺伝子座に隣接する領域のシーケンシングを実施し、ａｓｄ遺伝子がＹＳ１６４６染色体から欠失していることが配列より確認された。
プラスミドからのａｓｄの発現によるａｓｄ欠失の相補性
プラスミドｐＡＴＩＵ６（配列番号２２５）を化学合成し、組み立てた。プラスミドは下記の特徴を有していた。複製の起点の高いコピー（ｐＵＣ１９）、短いヘアピンの発現を推進するためのＵ６プロモーター、引き続いて除去されるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に隣接するアンピシリン耐性遺伝子、および開始コドンの上流の８５塩基対の配列を含むａｓｄ遺伝子（配列番号２４６）。このベクターの中に、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによる制限酵素消化、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５－アルファ細胞へのライゲーションおよびクローニングによって、マウスＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを導入した。得られたプラスミドをｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１と命名した。
免疫刺激細菌株へのプラスミドの電気穿孔
免疫刺激タンパク質および機能性ａｓｄ遺伝子をコードする発現カセットを含む選択されたプラスミドを、ＢＴＸ（登録商標）ＥＣＭ６００エレクトロポレーターにより、０．２ｃｍギャップのキュベットを使用し（ＢＴＸ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、以下の設定、即ち２．５ｋＶ、１８６オーム、および５０μＦで、ａｓｄ遺伝子を失っているサルモネラ・チフィムリウム株に電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、５０μＭのジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を添加した１ｍＬのＳＯＣに加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＤＡＰを含まない寒天プレートに散布して、機能性ａｓｄ遺伝子を有するプラスミドを受容した株を選択した。単一コロニーを単離した後、無菌の溶原性ブロス（ＬＢ）のフラスコにサルモネラ・チフィムリウムの単一ウェルの単離されたコロニーを接種し、２５０ＲＰＭで撹拌しながら３７℃でインキュベートすることによって、細胞バンクを産生した。培養物が定常相にまで増殖した後、１０％のグリセロールを含むＰＢＳで細菌を洗浄し、－６０℃未満で凍結したアリコートで保存した。
プラスミドｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１を大腸菌中で増幅し、電気穿孔によってＹＳ１６４６Δａｓｄ株への形質転換およびＬＢ Ａｍｐプレート上でのクローン選択のために精製して、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１を産生した。ｐＡＴＩＵ６由来のプラスミドを補完したＹＳ１６４６Δａｓｄ突然変異体は、ＤＡＰの不在下のＬＢ寒天上および液体培地中で増殖することができた。
引き続く反復実験で、ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１由来のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。これはｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いてゲル精製によってＡｍｐＲ遺伝子を除去することによって達成された。カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子は、プライマーＡＰＲ－００１およびＡＰＲ－００２（それぞれ配列番号２２６および配列番号２２７）を使用するＰＣＲおよびそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる消化、およびゲル精製し消化したｐＡＴＩＵ６プラスミドへのライゲーションによって増幅した。
引き続く反復実験で、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ)ならびにプライマーＡＰＲ－００３（配列番号２２８）およびＡＰＲ－００４（配列番号２２９)を使用して、ｐＵＣ１９複製の起点でｐＡＴＩＫａｎプラスミドに単一点変異を導入して、１４８位のヌクレオチドＴをＣに変更した。この突然変異によって、複製の起点が複製の起点のコピー数が少ないｐＢＲ３２２の複製の起点と相同になり、プラスミドのコピー数が減少する。
ａｓｄ補完システムを使用してインビボで実証されたプラスミドの維持
本実施例では、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスを、ＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを発現するプラスミドを含む株ＹＳ１６４６（ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１）、または機能性ａｓｄ遺伝子およびＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを含むプラスミドを含むＹＳ１６４６のａｓｄ欠損株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１）で処置した。
ＣＴ２６（結腸腫瘍＃２６）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＮ－ニトロ－Ｎ－メチルウレタン（ＮＭＵ）に曝露することに起源する腫瘍モデルであり、侵襲性で未分化かつチェックポイント難治性のヒト結腸直腸癌を反復する転移性の高い癌腫をもたらす（例えばCastle et al. (2014) BMC Genomics 15(1):190を参照）。側腹部の皮下に移植した場合には、結腸における同所性移植とは対照的に、腫瘍の免疫表現型ははるかに免疫抑制性かつチェックポイント難治性である。腫瘍は主としてＴ細胞の浸潤を失っている一方、骨髄性細胞、例えばマクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に富んでいる（例えばZhao et al. (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787参照）。このモデルはヒトのマイクロサテライトステーブル（ＭＳＳ）結腸直腸がんによく類似しているので、これは本明細書で提供する治療用アプローチを評価するための理想的なモデルである。
この実験のため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス３匹）の右側腹部皮下（ＳＣ）にＣＴ２６（ＡＴＣＣより購入）腫瘍細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）。８日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、３用量の５×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株、または親ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１株を、８日目、１５日目、および２３日目に静脈内（ＩＶ）注射した。プラスミドは例示的な治療用製剤としてｓｈＴＲＥＸ１をコードしており、他の任意の所望の治療用製剤を置換してもよい。
体重および腫瘍は週に２回測定した。腫瘍測定は電子キャリパー（Ｆｏｗｌｅｒ、Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用して実施した。腫瘍体積は改変した楕円公式［１／２（長さ×幅２）］を使用して計算した。マウスは腫瘍サイズが体重の２０％を超えたときまたは壊死を生じたときにＩＡＣＵＣの規制に従って安楽死させた。
最後のサルモネラ注射の１２日後に腫瘍をホモジナイズし、ホモジネートを段階希釈して、存在するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を計数するためにＬＢ寒天プレートに、またはカナマイシン耐性コロニーの数を計数するためにカナマイシン含有ＬＢプレートに、播種した。
結果は、サルモネラ・チフィムリウム株ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１がｓｈＲＮＡプラスミドを維持する選択圧を有していなかったことを実証し、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）コロニーのパーセントが１０％未満であったことから、プラスミドの顕著な喪失を実証した。プラスミドの維持のためにａｓｄ遺伝子補完システムを用いた株、即ちＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１は、ほぼ同一の数のカナマイシン耐性およびカナマイシン感受性のＣＦＵを有していた。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子補完システムが、マウスの腫瘍微小環境に関連するプラスミドを維持するために十分であることを実証している。
ａｓｄ補完システムを使用する抗腫瘍有効性の増強
ａｓｄ補完システムは、プラスミドの喪失を防止し、インビボにおけるサルモネラ・チフィムリウム株による治療用製剤のデリバリーの抗腫瘍有効性を増強するために設計されている。これを試験するため、ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１）、または機能性ａｓｄ遺伝子カセットを含むスクランブル対照（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ）のマウス結腸癌モデルにおける抗腫瘍有効性を、ａｓｄ遺伝子カセットを失っており、したがってプラスミド維持の機構を有しないプラスミドであるプラスミドｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１を含む株ＹＳ１６４６（ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１）と比較した。ｓｈＴＲＥＸ１は、例示的な治療用製剤である。
この実験のため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス８匹）の右側腹部のＳＣにＣＴ２６細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１、またはＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１を、８日目および１８日目に２回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１株は、経時的にプラスミドの喪失を示したにも関わらず、ＰＢＳと比較して増強された腫瘍制御を示した［２８日目における腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）７０％］。ａｓｄ遺伝子補完システムおよびｓｈＴＲＥＸ１を有するプラスミドを含むΔａｓｄ株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１）は、ＰＢＳと比較して優れた腫瘍成長阻害を示した（ＴＧＩ ８２％、ｐ＝０．００２、２５日目）。これらのデータは、ａｓｄ補完システムを使用してプラスミドの喪失を防止することおよびｓｈＴＲＥＸ１のデリバリーによって、ａｓｄ補完遺伝子システムのないプラスミドを含むＹＳ１６４６と比較して改善された能力が達成されることを実証している。即ち、ａｓｄ補完システムを有する株は優れた抗がん治療薬である。
［実施例４］
ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子の欠失によるサルモネラ・チフィムリウムのフラゲリンノックアウト
株の操作および特徴解析
本明細書の実施例では、両方のフラゲリンサブユニットを除去するため、ａｓｄ遺伝子欠失を含む生存弱毒化サルモネラ・チフィムリウムＹＳ１６４６株をさらに操作してｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子を欠失させた。これにより、炎症促進性ＴＬＲ５活性化が無くなり、炎症促進性シグナル伝達が低減されて抗腫瘍適応免疫が改善される。
ｆｌｉＣ遺伝子の欠失
本実施例では、前の実施例で詳細に記載したように、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ株の染色体からｆｌｉＣを欠失させた。簡単に述べると、ｆｌｉＣ遺伝子に隣接する相同配列の２２４塩基および２４５塩基を含む合成ｆｌｉＣ遺伝子相同性アーム配列を、ｐＳＬ０１４７と呼ばれるプラスミド（配列番号２３０）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１４７にクローニングし、ｆｌｉＣ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｆｌｉｃ－１（配列番号２３２）およびｆｌｉｃ－２（配列番号２３３）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、次いで温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔した細胞をＳＯＣ＋ＤＡＰ培地中に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天プレートに播種した。コロニーを選択し、プライマーｆｌｉｃ－３（配列番号２３４）およびｆｌｉｃ－４（配列番号２３５）を使用するＰＣＲによって、ノックアウト断片の挿入についてスクリーニングした。次いで選択されたカナマイシン耐性株を４２℃で培養し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングすることによって、ｐＫＤ４６をキュアした。次いでＣｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド（ｐＪＷ１６８）の電気穿孔によってカナマイシン耐性マーカーをキュアし、ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した。続いて培養物を４２℃で増殖させることによってｐＪＷ１６８を排除した。次いで破壊部位に隣接するプライマー（ｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４）を使用するＰＣＲによるカナマイシンマーカーの喪失およびアガロースゲル上の電気泳動による運動性の評価について、選択されたｆｌｉＣノックアウトクローンを試験した。
ｆｌｊＢ遺伝子の欠失
次いで上記の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ株からｆｌｊＢ遺伝子を欠失させた。ｆｌｊＢ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２４９塩基および２１３塩基を含む合成ｆｌｊＢ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０１４８と呼ばれるプラスミド（配列番号２３１）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１４８にクローニングし、ｆｌｊＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｆｌｊｂ－１（配列番号２３６）およびｆｌｊｂ－２（配列番号２３７）（表１を参照）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製して、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容温度での増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。それぞれプライマーｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４、またはｆｌｊｂ－３（配列番号２３８）およびｆｌｊｂ－４（配列番号２３９）を使用するＰＣＲによってｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子ノックアウト配列を増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。株ＹＳ１６４６のこの突然変異誘導体を、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢ、または短縮してＹＳ１６４６／Δａｓｄ／ΔＦＬＧと命名した。
操作されたサルモネラ・チフィムリウムのフラゲリンノックアウト株のインビトロ特徴解析
本明細書でＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧと称する、ｆｌｉＣとｆｌｊＢとの両方の欠失を有するＹＳ１６４６由来ａｓｄ－突然変異体を、１０マイクロリッターの一夜培養物をスイミンブプレート（０．３％の寒天および５０ｍｇ／ｍＬのＤＡＰを含むＬＢ）にスポットすることによって、遊泳運動性について評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ株については運動性が観察された一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株については、運動性は明らかでなかった。次いでＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ａｓｄ遺伝子を含むプラスミドとともに電気穿孔し、ＤＡＰの不在下におけるその増殖速度を評価した。ａｓｄを補完したプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は、添加のＤＡＰが存在しないＬＢ中で複製することができ、ａｓｄを補完したプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ株と同程度の速度で増殖した。これらのデータは、フラゲリンの排除はインビトロにおけるサルモネラ・チフィムリウムの適合性を低下させないことを実証している。
鞭毛の排除はマウスマクロファージにおけるピロトーシスを低下させる
５×１０５個のマウスＲＡＷマクロファージ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）を、いずれもａｓｄ補完プラスミドを有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ株に、ゲンタマイシン保護アッセイにおいてほぼ１００のＭＯＩで感染させた。感染の２４時間後に培養上清を収集し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ．）を使用して、マクロファージ細胞の死のマーカーとしてのラクテート脱水素酵素の放出について評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ株は７５％の最大ＬＤＨ放出を誘起した一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は５４％の最大ＬＤＨ放出を誘起し、フラゲリン遺伝子の欠失が感染したマクロファージのサルモネラ・チフィムリウム誘起ピロトーシスを低減することが実証された。
鞭毛を欠失した突然変異体は感染したヒト単球におけるピロトーシスの低減を導く
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株ではマクロファージにおける細胞死を惹起する能力が低減していることを実証するため、ＴＨＰ－１ヒトマクロファージ細胞（ＡＴＣＣカタログ＃２０２１６５）を、サルモネラ・チフィムリウム株ＹＳ１６４６およびプラスミドの維持を保証する機能性ａｓｄ遺伝子をコードするプラスミドを含むΔａｓｄ株を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧに感染させた。ＤＭＥＭおよび１０％のＦＢＳを含む９６ウェルのディッシュに、５×１０４個の細胞を入れた。細胞をサルモネラ・チフィムリウムの洗浄したログ相の培養物に細胞あたり１００ＣＦＵのＭＯＩで１時間、感染させ、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞外細菌を死滅させるための５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび単球をマクロファージ表現型に転換するための５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγを含む培地に培地を交換した。２４時間後、ＴＨＰ－１細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて染色し、発光を定量するためのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する発光細胞生存アッセイを使用して、生存細胞のパーセンテージを決定した。ＹＳ１６４６株を感染させた細胞はわずか３８％の生存率しかなかった一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を感染させた細胞は５１％の生存率を有し、フラゲリン遺伝子の欠失が、極めて高く超生理学的なＭＯＩにも関わらず、ヒトマクロファージの細胞死をあまり誘起しないことが示された。
全身投与の後の腫瘍のコロニー形成に鞭毛は必要でない
結腸癌のマウスモデルにおいて投与されたフラゲリンノックアウト株の影響を評価するため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＣＴ２６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を接種した。１０日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、単一用量の３×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株をＩＶ注射した。腫瘍移植後３５日目にマウスを安楽死させ、腫瘍をホモジナイズしてＬＢプレートに播種し、腫瘍組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計数した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株は、腫瘍組織１ｇあたり平均５．９×１０７ＣＦＵで腫瘍をコロニー形成した一方、鞭毛を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株は平均１．１×１０８ＣＦＵ／ｇ腫瘍組織とほぼ２倍に増加した腫瘍をコロニー形成した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株の脾臓コロニー形成は平均１．５×１０３ＣＦＵ／ｇ脾臓組織と計算された一方、鞭毛を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株の脾臓コロニー形成は平均１．２×１０３ＣＦＵ／ｇ脾臓組織とやや低かった。
これらのデータは、鞭毛が存在しないことはＩＶ投与後の腫瘍のコロニー形成に負に影響しないだけでなく、鞭毛が無傷の株と比較して腫瘍のコロニー形成を増強することを実証している。重要なことに、鞭毛の欠失は脾臓のコロニー形成を僅かに低減させ、腫瘍と脾臓の比を１０万倍にする。これらのデータは、当技術からの予想と異なり、鞭毛は腫瘍のコロニー形成に必要でないだけでなく、それを無くすことによって脾臓のコロニー形成を低減しつつ腫瘍のコロニー形成を増強することを実証している。
鞭毛を欠失した株はマウスにおいて抗腫瘍活性の増強を示す
結腸癌のマウスモデルにおいて投与されたフラゲリンノックアウト株の影響を評価するため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＣＴ２６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、単一用量の３×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、またはＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。マウスはキャリパー測定によって腫瘍成長についてモニターした。
結果は、鞭毛を作ることができないＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株が親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株と比較して増強された腫瘍制御（ＴＧＩ ２７％、２４日目）およびＰＢＳ対照と比較して有意な腫瘍制御（ＴＧＩ ７３％、ｐ＝０．０４、２４日目）を示したことを実証した。これらのデータは、鞭毛が腫瘍のコロニー形成に必要でないだけでなく、その喪失が抗腫瘍有効性を増強し得ることを実証している。
鞭毛を欠失した株はマウス腫瘍モデルにおいて適応免疫の増強を示す
免疫応答に対するフラゲリン欠失の影響、およびｓｈＲＮＡの腫瘍骨髄性細胞デリバリーからＳＴＩＮＧチェックポイント遺伝子ＴＲＥＸ１へのＳＴＩＮＧ活性化が適応性I型ＩＦＮ免疫シグネチャーを促進するかを評価した。結腸癌のＣＴ２６マウスモデルを用い、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＣＴ２６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、腫瘍移植の１１日後に５×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株、またはスクランブルしたプラスミド対照株であるＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲをＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。投薬の７日後にヘパリンナトリウムをコートした管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にマウスから採血した。次いで凝固していない血液を同体積のＰＢＳで希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｍ細胞分離試薬（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を使用して全血の相間層から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。単離したＰＢＭＣを、１３００ＲＰＭ、室温で３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで洗浄し、フロー緩衝液中に再懸濁した。Ｖ底９６ウェルプレートに１ウェルあたり百万個のＰＢＭＣを播種した。細胞を１３００ＲＰＭ、室温（ＲＴ）で３分、遠心分離し、蛍光色素コンジュゲートＡＨ１ペプチド：ＭＨＣクラスＩテトラマー（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）および細胞表面フローサイトメトリー抗体ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５クローンＭ１／６９（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含む１００μＬのフロー緩衝液中で、室温、暗所で４５分再懸濁した。４５分後に、１２００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いでＤＡＰＩ（４’，６－ジアミノ－２－インドール、生死染色）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に細胞を再懸濁し、直ちにＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
以下の細胞型を総生存細胞のパーセンテージとして計数した：ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋好中球（エクスビボ機能性アッセイによるさらなる表現型決定が必要であろうが、おそらくＭＤＳＣ）、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＴ２６腫瘍拒絶抗原ｇｐ７０（ＡＨ１）、即ちマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）関連細胞表面抗原のエンベロープ遺伝子の産物を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞（例えばCastle et al. (2014) BMC Genomics 15(1):190を参照）。
下表にまとめた結果は、非特異的なスクランブルしたｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ株が、ＰＢＳ（ｐ＝０．０２）、鞭毛が無傷のＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株（ｐ＝０．０２）、および最低レベルの循環好中球を有する鞭毛を欠失した株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１（ｐ＝０．０１）と比較して有意に増加した好中球の典型的な抗菌免疫プロファイルを誘発することを示している。同様に、細菌によって誘起されたマクロファージも、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ株において、ＰＢＳ（ｐ＝０．０１）、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株（ｐ＝０．０１）、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株（ｐ＝０．０１）と比較して有意に上昇した。即ち、Ｉ型ＩＦＮ誘起ペイロードを有する両方の株は、正常な抗菌免疫応答を上書きすることができ、そのため好中球およびマクロファージによって細菌感染が消失し、適応Ｔ細胞媒介免疫が誘起されない。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体の循環レベルは全ての群にわたって同様である一方、鞭毛を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株はＰＢＳと比較して有意（ｐ＝０．０４）に増加したＡＨ１テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを実証した。
これらのデータは、腫瘍常在性骨髄性細胞にウイルス様Ｉ型ＩＦＮ誘起プラスミドを送達するように細菌を操作することの実現可能性を実証している。これは、ウイルス性が高く細菌性が低い免疫プロファイルに向けての免疫応答の劇的な再プログラミングをもたらす。鞭毛の欠失は、細菌によって動員される好中球およびマクロファージから有意に増加した腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞への転換をさらに増強した。即ち、細菌性のＴＬＲ５媒介炎症を無くすことによって、適応免疫を増強することができる。
Figure 2023501539000026

SD = 標準偏差
鞭毛を欠失した株はインビボにおいて食細胞性骨髄免疫細胞コンパートメントに制限される
文献によれば、ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ株は、非食細胞性細胞へのＳＰＩ－１に媒介された進入に関連する多くの下流遺伝子の抑制を示す。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株も非食細胞性細胞取り込みを欠いているかを決定するため、細菌性ｒｐｓＭプロモーターの下にｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）を構成的に発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ＭＣ３８皮下側腹部腫瘍を有するマウスにＩＶ投与した。
ＭＣ３８（マウス結腸腺癌＃３８）モデルは、突然変異生成を使用するＣＴ２６モデルと同様に、しかしジメチルヒドラジンを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統において誘導した（例えばCorbett et al. (1975) Cancer Res. 35(9):2434-2439参照）。ＣＴ２６と同様に、皮下移植は結腸に同所移植した場合より多くのＴ細胞が除外され、免疫抑制性腫瘍微小環境がもたらされた（例えばZhao et al. (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787を参照）。ＭＣ３８はＣＴ２６よりも高い変異の負荷およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって検出できる同様のウイルス由来ｇｐ７０抗原（ｐ１５Ｅ）を有しているが、これは拒絶抗原とはみなされない。ＭＣ３８の変異体(variant)はチェックポイント療法に部分的に関与していることが見出されているが、細胞系の大部分の変異体は、本明細書で使用されるＭＣ３８細胞を含めて、チェックポイント難治性でありＴ細胞が除外されていると考えられる（例えばMariathasan et al. (2018) Nature 555:544-548を参照）。
この実験のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。３４日目に、定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに１×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株をＩＶ注射した。ＩＶ投薬の７日後に腫瘍を切除し、２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１０％のＦＢＳと１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。ナイロンメッシュを５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。ナイロンメッシュを５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳで洗浄し、濾過された細胞を１０００ＲＰＭで７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
フローサイトメトリー染色のため、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに１００μＬの単一細胞懸濁液を播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬで加え、細胞を氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞を蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５クローンＭ１／６９（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後に、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
結果は、腫瘍浸潤性単球の７．２７％が腫瘍微小環境において鞭毛欠失ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んだことを実証した。同様に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）集団の８．９６％および腫瘍浸潤性樹状細胞（ＤＣ）の３．３３％が鞭毛欠失ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んだ。対照的に、間質細胞および腫瘍細胞に対応するＣＤ４５－集団の中では、僅か０．０７６％がｍＣｈｅｒｒｙ発現について陽性を示した（バックグラウンド染色の０．０６７％と比較して）。これらのデータは、鞭毛およびＳＰＩ－１に対するその下流のシグナル伝達インパクトが上皮細胞の感染力を可能にするために必要であること、ならびにその欠如が細菌の取り込みを腫瘍微小環境の食細胞性免疫細胞コンパートメント（即ち、腫瘍常在性免疫／骨髄性細胞）のみに制限していることを実証している。
鞭毛の欠失は、適応免疫を抑制するＴＬＲ５誘起炎症性サイトカインの排除、マクロファージのピロトーシスの低減、ならびに腫瘍常在性食細胞性細胞に取り込みが限局している場合の全身投与における腫瘍特異性富化の維持（または増強）を含む多数の利点を免疫刺激サルモネラ・チフィムリウム株に与えている。
［実施例５］
サルモネラｐａｇＰ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
本実施例では、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ｐａｇＰを欠失するようにさらに改変した。ｐａｇＰ遺伝子はサルモネラ・チフィムリウムの感染ライフサイクルの間に誘起され、リピッドＡをパルミチン酸塩で改変する酵素（リピッドＡパルミトイルトランスフェラーゼ）をコードする。野生型サルモネラ・チフィムリウムでは、ｐａｇＰの発現は、ヘプタアシル化されるリピッドＡ分子をもたらす。リピッドＡの末端アシル鎖が付加できないｍｓｂＢ－突然変異体では、ｐａｇＰの発現はヘキサアシル化されたリピッドＡ分子をもたらす。ヘキサアシル化リピッドＡを有するＬＰＳは高度に炎症促進性であり、ＴＬＲ４に高い親和性を有することが示されている（野生型で見出されたヘプタアシル化ＬＰＳはＴＬＲ４に対して最大の親和性を有する）。本実施例では、ｐａｇＰおよびｍｓｂＢが欠失した株はペンタアシル化リピッドＡのみを産生することができ、ＴＬＲ４に対する低い親和性による低い炎症促進性サイトカイン、忍容性の増強、および免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドを送達するように細菌を操作した場合の適応免疫の増大が可能になる。
ΔｐａｇＰ株の構築
先行する実施例に記載した方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株からｐａｇＰ遺伝子を欠失させた。ｐａｇＰ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２０３塩基および２７９塩基を含む合成のｐａｇＰ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０１９１と呼ばれるプラスミド（配列番号３３１）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１９１にクローニングし、ｐａｇＰ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｐａｇｐ－１（配列番号３１５）およびｐａｇｐ－２（配列番号３１６）（表１を参照）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製して、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度での増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーｐａｇｐ－３（配列番号３１７）およびｐａｇｐ－４（配列番号３１８）を使用するＰＣＲによってｐａｇＰ遺伝子ノックアウト配列を増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られたＹＳ１６４６の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰと命名した。
ｐａｇＰ欠失突然変異体はペンタアシル化ＬＰＳを有し、炎症性サイトカインの低減を誘起する
Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000))および上記のように、ラムダ誘導Ｒｅｄ組換えシステムを使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ株からｐａｇＰ遺伝子も欠失させて、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰを生成した。次いでこの株を、欠失したａｓｄ遺伝子を補完し、インビボにおけるプラスミドの維持を保証する機能性ａｓｄ遺伝子を含むプラスミドとともに電気穿孔した。次いでこの株からリピッドＡを抽出し、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）によって評価し、野生型サルモネラ・チフィムリウム株ＡＴＣＣ １４０２８、ＹＳ１６４６株（これはｍｓｂＢおよびｐｕｒＩが欠失している）、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ株由来のリピッドＡと比較した。野生型サルモネラは、機能性ｍｓｂＢ遺伝子の存在による、それぞれのヘプタアシル化種とヘキサアシル化種とに対応する質量２０３４の小さなリピッドＡのピークおよび質量１７９６の大きなピークを有していた。ｍｓｂＢ欠失株であるＹＳ１６４６およびＹＳ１６４６Δａｓｄは、ヘキサアシル化およびペンタアシル化リピッドＡの混合物に対応する１８２８および１５８５の大きなピークを有していた。ｍｓｂＢおよびｐａｇＰが欠失した株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰは、ペンタアシル化リピッドＡに対応する質量１５８５の単一ピークのみを有していた。これらのデータは、ｐａｇＰの欠失がリピッドＡのパルミトイル化を防止し、それによりリピッドＡを単一のペンタアシル化種に限定することを実証している。
ΔｐａｇＰ突然変異体株由来のペンタアシル化リピッドＡを含むＬＰＳがＴＬＲ４シグナル伝達を低減するかを決定するために、野生型株、ＹＳ１６４６株またはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株由来の４μｇの精製されたＬＰＳを、ＴＨＰ－１ヒト単球細胞(ＡＴＣＣカタログ＃ＴＩＢ－２０２)に加え、２４時間後に、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、炎症性サイトカインの存在について上清を評価した。結果は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株由来のＬＰＳが野生型ＬＰＳと比較して２５％の量のＴＮＦαを誘起し、野生型ＬＰＳより７分の１少ないＩＬ－６を誘起したことを示した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株由来のＬＰＳは株１６４６より２２分の１少ないＩＬ－６を誘起し、ΔｐａｇＰ突然変異体由来のペンタアシル化ＬＰＳ種の炎症性がヒト細胞において有意に低いことが実証され、ΔｐａｇＰ突然変異体がヒトにおいてより良く忍容され得ることが示された。
ｐａｇＰの欠失は初代ヒトＭ２マクロファージにおいて有意に少ないＩＬ－６を誘起する
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株が初代ヒトＭ２マクロファージから炎症性が低く用量制限的なＩＬ－６も誘発することを実証するため、この株を評価し、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧおよび親ＹＳ１６４６株と比較した。ヒトドナー由来のＭ２マクロファージは、Ｔ細胞を除外した固形腫瘍において高度に富化された免疫抑制性表現型を代表している。健康なヒトドナーから単離して凍結したヒトＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１倍の非必須アミノ酸＋５％のヒトＡＢ血清）中で解凍し、室温、８００ＲＰＭで１０分、遠心分離することによって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。次いで単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）および１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中に再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５）を最終体積７５０μＬで２４ウェルプレートに播種した。播種の２日後、細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を４８時間、加えた。６日目に細胞培養培地を完全に吸引し、サイトカインを含まない新鮮な完全培地単独、またはＭＯＩ ２０でサルモネラ・チフィムリウム株のログ相培養物を含む培地に交換した。細胞を１時間感染させ、次いでＰＢＳで洗浄し、細胞外細菌を死滅させるために５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む新鮮な培地に培地を交換した。次いでウェルを洗浄し、新鮮な培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。４８時間後に上清を収穫し、ヒトＩＬ－６サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してメーカーの使用説明書に従ってサイトカインについてアッセイした。
結果は、親株ＹＳ１６４６に感染したヒト初代Ｍ２マクロファージからの分泌されたＩＬ－６のレベルが平均１４８３９±９２６ｐｇ／ｍＬであった一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株由来のＩＬ－６のレベルが２０７５±７２３ｐｇ／ｍＬで有意に低かった（ｐ＝０．００４）ことを実証した。このことは、鞭毛の欠失およびＴＬＲ５シグナル伝達の排除がＩＬ－６の誘起に及ぼす影響をさらに確認している。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ｐａｇＰ株は３３２±１００ｐｇ／ｍＬと最小のＩＬ－６レベルを誘発し、この改変されたＬＰＳコーティングがＴＬＲ４を刺激する能力の低下、およびその結果としての炎症性ＩＬ－６の産生の劇的な低下を実証している。
鞭毛とｐａｇＰの欠失の組合せはマウスにおける忍容性を顕著に増強する
上記の改変された株が親株ＹＳ１６４６より弱毒化しているかを決定するため、メディアン致死用量（ＬＤ５０）の研究を行った。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）に、３ｅ５～３ｅ７ＣＦＵの用量範囲の株ＹＳ１６４６、または誘導株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰを静脈内注射した。株ＹＳ１６４６とは異なり、誘導株は全身投与された場合に顕著な毒性を示すＦＤＡ承認のサイトカインであるマウスＩＬ－２をコードするプラスミドも有していた。
株ＹＳ１６４６のＬＤ５０は４．４×１０６ＣＦＵ（２回の研究の平均）であることが見出され、以前に公開されたＹＳ１６４６のＬＤ５０の報告と一致し、野生型サルモネラ・チフィムリウムと比較して１０００倍を超える改善であった（例えばClairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002を参照）。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株のＬＤ５０は２．０７×１０７ＣＦＵと決定され、株ＹＳ１６４６と比較して４．５分の１未満への病原性の低減が示された。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株のＬＤ５０は１．３９×１０６ＣＦＵと決定され、株１６４６と比較して少なくとも３．２分の１への病原性の低減が示された。これは、この株がまだ高度に炎症性の鞭毛を有していることを考慮すれば予想されることである。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株では投与した最大用量でマウスが死亡しなかったため、ＬＤ５０は確定できなかったが、６．２×１０７ＣＦＵより大きかった。したがって、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株は親ＹＳ１６４６株と比較して１４分の１以下への病原性の低減を示す。これらのデータは、上記の遺伝子改変が臨床的サルモネラ・チフィムリウム株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９としても知られている）の病原性を低減させ、したがってヒトにおける忍容性の増大をもたらすことを実証している。
ＶＮＰ２０００９（例えばToso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152を参照)の第Ｉ相臨床試験において、試験した２つの最高用量、即ち３×１０８ＣＦＵ／ｍ２（３３％存在）および１×１０９ＣＦＵ／ｍ２（５０％存在）において患者の腫瘍に部分的にのみ細菌が存在することが観察され、腫瘍のコロニー形成を達成するにはＶＮ２０００９の忍容用量が低すぎることを示している。上記の改変によって株の忍容性を改善することにより、必要であれば１４倍を超える高い用量を投与することができ、その腫瘍がコロニー形成する患者のパーセンテージが改善され、腫瘍あたりの治療用コロニー形成のレベルが増加され、それによりＶＮＰ２０００９で観察された問題が解決される。
鞭毛とｐａｇＰとの欠失の組合せはマウスにおける抗サルモネラ・チフィムリウム抗体の生成を顕著に制限する
上記の３×１０６ＣＦＵ投薬群から生存したマウス（ＹＳ１６４６投薬群のＮ＝４を除いてＮ＝５）をＩＶ投薬後４０日間保持し、その時点で採血して血清を採取して、改変した流動基準抗体タイタリングシステムによってサルモネラ・チフィムリウムに対する抗体価を評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株の一夜培養物を洗浄し、フローサイトメトリー用固定緩衝液で固定した。以前処置したマウスおよびナイーブな対照マウスの血清を９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＳによる連続希釈を実施した。次に１×１０６ＣＦＵを含む２５μＬのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ培養物を血清に加え、室温で２５分インキュベートした。次いで４０００ＲＰＭで５分遠心分離することによって細菌をＰＢＳにて２回洗浄した。最後の洗浄の後、二次ヤギ抗マウスＦｃ ＡＦ４８８抗体（ストックから４００倍希釈）を含むＰＢＳ中に細菌を再懸濁し、室温で遮光下に２５分インキュベートした。次いで４０００ＲＰＭで５分遠心分離することによって細菌をＰＢＳにて３回洗浄した。最後の洗浄の後、細菌をＰＢＳ中に再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してデータを取得し、ＭＦＩ ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
フローサイトメトリーの結果を評価するため、全ての群の中でシグナルを有する最大の希釈倍率を選択し（血清希釈１２５０倍）、対応する平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をプロットした。無染色で得られたＭＦＩがＭＦＩ １０００であり、これがヤギ抗マウスＦｃ ＡＦ４８８抗体のみにて染色されるバックグラウンドであるので、これを検出限界（ＬＯＤ）として選択した。したがって、１０００より大きなＭＦＩを陽性シグナルとみなし、ＭＦＩ値を有していてもこの値と同じかそれより低いものは全て陰性の結果とみなした。
このアッセイの結果より、３×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６株で処置したマウスから抗サルモネラ・チフィムリウム血清抗体の高いＭＦＩ価(ＭＦＩ ２９１９６．３±２０７３０)が明らかになり、ＹＳ１６４６が血清抗体（これは非中和性である）を生成できるという以前公開されたデータと一致した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株で処置したマウスでは検出された抗体は少なく（ＭＦＩ １１２５７±９２９０）、これは鞭毛由来のアジュバント活性の欠如によるものであり得る。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株で処置したマウスでは、株ＹＳ１６４６と比較して有意に少ない抗体（ＭＦＩ ４４９４±３８６１)が生成し（ｐ＝０．０３３）、これはＬＰＳ表面コーティングの変更によるものであり得る。血清抗体において最も有意な減少は、数匹のマウスが１０００未満のＭＦＩ価を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ処置群で示され（ＭＦＩ １９３０±２４４５）、血清抗体について陰性とみなされた（株ＹＳ１６４６に対してｐ＝０．０２１）。したがって、鞭毛とｐａｇＰ遺伝子との欠失の組合せは、安全性の改善と免疫原性の顕著な低減とを可能にし、これはヒトにおける高いＣＦＵの繰り返し投薬を可能にすることになる。
ｐａｇＰおよび鞭毛が欠失した株およびそれらの組合せは、株ＹＳ１６４６と比較してヒト血清中における有意により高い生存能力を示す
株ＹＳ１６４６は全身投与の後でヒトにおいて限定された腫瘍のコロニー形成を示す。本明細書において株ＹＳ１６４６はヒト血液中の補体因子によって不活化されることが示されている。これを実証するため、株ＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂを、細菌の表面を改変するさらなる変異を含む本明細書で提供する例示的な免疫刺激細菌と比較した。これらの例示的な改変株は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰであった。これら３つの株、ならびにＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂ培養物を、プールしたマウス血液またはプールした健康なヒトドナー（ｎ＝３）からの血清または熱不活化（ＨＩ）した血清と、３７℃で３時間インキュベートした。血清とのインキュベーションの後、細菌を連続希釈してＬＢ寒天プレートに播種し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。
マウス血清中では全ての株は１００％生存したままであり、補体活性化に対して完全に耐性であった。ヒト血清中では、全ての株は熱不活化血清中で１００％生存した。大腸菌Ｄ１０Ｂ株は全ヒト血清中で３時間後に完全に排除された。全ヒト血清中では、ＹＳ１６４６株は僅かに６．３７％の生存コロニーを示し、ＹＳ１６４６臨床株の腫瘍のコロニー形成がヒト血液中における補体不活化によって限定されていることが示された。ヒト血清との３時間のインキュベーションの後で、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株については３１．４７％の生存コロニーが残存し、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株については７２．９％の生存コロニーが残存していた。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株の組合せは、ヒト血清中で補体に対して完全に耐性であった。
これらのデータは、株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）が全身投与された場合に極めて低い腫瘍のコロニー形成を有している理由を説明する。株ＹＳ１６４６はヒト血清中で補体不活化に極めて感受性であるが、マウス血清中ではそうでないことが本明細書で示されている。これらのデータは、ヒトでは限定された腫瘍のコロニー形成が観察された一方、マウス腫瘍は高いレベルでコロニー形成した理由を説明する。ｆｌｊＢ／ｆｌｉＣもしくはｐａｇＰの欠失、またはこれらの突然変異の組合せは、部分的にまたは完全にこの表現型を救済する。即ち、ヒト血清中でＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株において観察された安定性の増強は、ヒト腫瘍のコロニー形成の増大を提供する。
［実施例６］
サルモネラａｎｓＢ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
本実施例では、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株を、細菌のＬ－アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子であるａｎｓＢを欠失させるようにさらに改変した。Ｔ細胞の存在下におけるサルモネラ・チフィムリウムによるＬ－アスパラギナーゼＩＩの分泌は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の低下および細胞傷害性サイトカインの産生の障害によってＴ細胞の機能を直接障害することが示されている。結果として、細菌由来のアスパラギナーゼが急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を処置するために数十年にわたって成功裡に使用されてきた。ａｎｓＢの欠失はＬ－アスパラギナーゼＩＩを産生するサルモネラ・チフィムリウムの能力を無くし、それにより細菌によってコロニー形成した腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を増強する。
ΔａｎｓＢ株の構築
先行する実施例に記載した方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株からａｎｓＢ遺伝子を欠失させた。ａｎｓＢ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２３６塩基および２５１塩基を含む合成ａｎｓＢ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０２３０と呼ばれるプラスミド（配列番号３３２）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０２３０にクローニングし、ａｎｓＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーａｎｓｂ－１（配列番号３１９）およびａｎｓｂ－２（配列番号３２０）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーａｎｓｂ－３（配列番号３２１）およびａｎｓｂ－４（配列番号３２２）を使用するＰＣＲによってａｎｓＢ遺伝子ノックアウト配列を増幅し（表１を参照）、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られたＹＳ１６４６の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢと命名した。
ａｎｓＢの欠失はインビトロにおけるアスパラギナーゼ活性を無くす
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株のＬ－アスパラギナーゼＩＩ産生が少ないかを決定するため、この株の培養物をａｎｓＢが無傷のＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株とともにＬＢ中で増殖させ、定常相に到達させた。この時点で培養物からの５０μＬの馴化培地のアスパラギナーゼ活性を、比色アスパラギナーゼアッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してメーカーの使用説明書に従って解析した。４０分のインキュベーションの後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ)により５７０ｎｍの吸光度により吸光度単位を読み取った。
１．９５の吸光度を示した組換えＬ－アスパラギナーゼＩＩ陽性対照と比較して、ａｎｓＢが無傷のＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株の吸光度は０．８２であった。しかしＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失は、０．１０９の吸光度で検出されるアスパラギナーゼ活性のバックグラウンドレベルを生じた。これらのデータは、ΔａｎｓＢの突然変異がアスパラギナーゼ活性を完全に無くすことを確認している。
ａｎｓＢの欠失はインビトロの共培養アッセイにおいてＴ細胞の機能を回復させる
Ｔ細胞に対するＬ－アスパラギナーゼＩＩの活性の低下の影響についてａｎｓＢ欠失株を機能的に特徴解析するため、脾臓由来の精製したＴ細胞との培養における株感染したマウス初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を使用する共培養アッセイを確立した。このアッセイのため、健康なＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を単離して解離し、マウスＴ細胞単離キット(ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を使用してメーカーの使用説明書に従って脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離したＴ細胞から１ウェルあたり２ｅ５個の細胞を、５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５－２Ｃ１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予めコートした平底９６ウェルプレートに加えた。定常相まで増殖させたＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ培養物由来の馴化したＬＢ培地を０．４５μＭのナイロンメッシュで濾過し、共刺激のためのアゴニストである１０μｇ／ｍｌのＣＤ２８抗体の添加ありまたはなしで、Ｔ細胞に加えた。２０Ｕ／ｍＬの組換えアスパラギナーゼを含む対照群および正常培養培地をアッセイにおける対照として用いた。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後２４時間に、１００μＬの共培養上清をウェルから収穫し、マウスＴｈ１特異的サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を実施した。同時にＴ細胞を収穫し、フローサイトメトリーによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の表面Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の発現、ならびにＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２の細胞内染色について解析した。
結果から、マクロファージに感染させるために使用され、続いてＴ細胞と共培養された、ａｎｓＢが無傷の株（ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ）が高度のＴ細胞免疫抑制を誘起することが確認された。このことは、培地対照および２０Ｕ／ｍＬの組換えアスパラギナーゼの陽性対照と比較して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞におけるＴＣＲβの表面発現の顕著な下方制御によって示された（下表を参照）。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失は、親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株と比較して、ＣＤ４＋（ｐ＝０．００４）およびＣＤ８＋（ｐ＝０．００２）の両方のＴ細胞におけるＴＣＲβの表面発現を有意に回復させた。
Figure 2023501539000027

SD = 標準偏差
共培養後２４時間におけるＴ細胞からのサイトカインの分泌を、Ｔ細胞の細胞溶解機能のマーカーとして測定した。下表に示すように、Ｔ細胞によるサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２の産生は、培地対照と比較してＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株による処理の後で顕著に低く、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失によって有意に回復した［ＩＦＮγ（ｐ＝０．０５）、ＴＮＦα（ｐ＝０．０１２）、およびＩＬ－２（ｐ＝０．００６）］。これらのデータは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失が、親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株と比較してＴ細胞の細胞溶解機能を有意に回復することを示している。
Figure 2023501539000028

SD = 標準偏差
ａｎｓＢの欠失はインビボで腫瘍に存在するＴ細胞のＴＣＲβの発現を回復する
インビトロの共培養アッセイにおいて、ａｎｓＢの発現は、フローサイトメトリーによるＴ細胞上のＴＣＲβの下方制御を含むＴ細胞機能に対する免疫抑制効果を示した。これがインビボでも同様に起こるかを評価するため、結腸直腸がんのＭＣ３８マウスモデルを利用した。
この実験のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス４匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。１７日目に、定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに１×１０７ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株をＩＶ注射した。ＩＶ投薬の７日後に腫瘍を切除し、２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０を含む１０％のＦＢＳ）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳでナイロンメッシュを１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳでナイロンメッシュを洗浄し、次いで濾過された細胞を１０００ＲＰＭで７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
フローサイトメトリー染色のため、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに１００μＬの単一細胞懸濁液を播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬで加え、細胞を氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＴＣＲβ ＰＥクローンＨ５７－５９７；およびＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５、全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）およびＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に細胞を再懸濁し、氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後に、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
下表に示すように、コロニー形成した親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株との腫瘍内における相互作用に続く腫瘍浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴＣＲβの表面発現についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ａｎｓＢ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株より有意に低く（ｐ＝０．０４２）、後者はＰＢＳ対照処置マウスさえよりも高かった。
Figure 2023501539000029

MFI = 平均蛍光強度; AVG =平均; SD = 標準偏差
総合して、これらのデータにより、免疫抑制性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩの細菌産生によるＴ細胞機能の回復のためにａｎｓＢ遺伝子を欠失させる必要があることが確認され、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株におけるａｎｓＢの欠失に伴って観察されたＴ細胞機能の増強が実証される。
［実施例７］
サルモネラｃｓｇＤ遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株を、サルモネラ・チフィムリウムのｃｕｒｌｉ線毛の形成、セルロースの産生、およびｃ－ｄｉ－ＧＭＰの産生を制御するマスター遺伝子であるｃｓｇＤを欠失するようにさらに改変した。ｃｓｇＤの欠失は、セルロース媒介バイオフィルム形成の可能性を無くし、炎症促進性シグナル伝達を低減し、宿主の食細胞性細胞による取り込みを増強する。それにより、細胞内局在化のこの増大は、プラスミドデリバリーおよび免疫調節性タンパク質産生の有効性を増強する。
ΔｃｓｇＤ株の構築
先行する実施例に記載した方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株からｃｓｇＤ遺伝子を欠失させた。ｃｓｇＤ遺伝子に隣接し、それぞれ左手および右手の配列の２０７塩基および２０９塩基を含む合成ｃｓｇＤ遺伝子相同性アーム配列を合成して、ｐＳＬ０１９６と呼ばれるプラスミド（配列番号３３３）にクローニングした。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１９６にクローニングし、ｃｓｇＤ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｃｓｇｄ－１（配列番号３２３）およびｃｓｇｄ－２（配列番号３２４）によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製して、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ａｎｓＢに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。プライマーｃｓｇｄ－３（配列番号３２５）およびｃｓｇｄ－４（配列番号３２６）を使用するＰＣＲによってｃｓｇＤ遺伝子ノックアウト配列を増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた親株ＹＳ１６４６の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと命名した。
ｃｓｇＤ欠失株はコンゴーレッドプレート上でＲＤＡＲコロニーを形成できない
コンゴーレッドプレート上での増殖の後でＲｏｕｇｈ Ｄｒｙ Ａｎｄ Ｒｅｄ（ＲＤＡＲ）コロニーを形成する能力は、細菌バイオフィルム形成のよくバリデートされたアッセイである。ラフで乾燥したテキスチャーはセルロースの産生によって生じ、赤色はｃｕｒｌｉ線毛の表面構造による色素の集積による。このアッセイのため、コンゴーレッド寒天プレート上でのインキュベーションの後、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株のＲＤＡＲ表現型を形成する能力をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株と比較した。
コンゴーレッド寒天プレートをソイトン（１０ｇ／Ｌ）および酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）とともに調製し（ＮａＣｌなしの改変ＬＢ）、コンゴーレッド（４０ｍｇ／Ｌ）およびクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０（２０ｍｇ／Ｌ）を補完した。５μＬの定常相細菌培養液をコンゴーレッドプレート上にスポットし、３７℃で１６時間インキュベートし、次いで３０℃に移してさらに１２０時間インキュベートした。コロニー形態および色の視覚解析を実施し、毎日記録して、ＲＤＡＲコロニー形態型の存在または不在を確認した。
２つの株の間のコロニー形態型を比較すると、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は平滑な表現型を有し、コロニーは色素を欠いていた。比較して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株はまだｃｓｇＤ遺伝子を含んでおり、古典的なラフで乾燥した外観、および色素取り込みの明らかな証拠を呈していた。即ち、機能性アッセイにより、ΔｃｓｇＤ株はｃｕｒｌｉ線毛およびセルロースの産生を失っているので、バイオフィルムを形成できないことが確認される。
ｃｓｇＤ欠失株はトリプルネガティブ乳がんの高度難治性マウスモデルにおいて優れた抗腫瘍有効性を示す
免疫刺激細菌療法が腫瘍をコロニー形成させるが限定的な有効性しか示さないモデルにおけるｃｓｇＤ欠失の影響を評価した。これは、腫瘍常在性骨髄性細胞中への取り込みを制限し、それにより治療的有用性を制限することができる細菌産生セルロースの存在を示し得る。（例えばCrull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233を参照）。ヒトのトリプルネガティブ乳がんの代表的なモデルである治療困難なＥＭＴ６モデルを利用した（例えばYu et al. (2018) PLoS ONE 13(11):e0206223を参照）。ＥＭＴ６腫瘍細胞が側腹部皮下とは異なって乳腺脂肪体に同所投与された場合、モデルはＴ細胞を排除して高度に転移性で、かつ承認された全てのチェックポイント抗体を含む免疫治療に高度に難治性である（例えばMariathasan et al. (2018) Nature 554: 544-548を参照）。
この実験のため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス５匹）の左乳腺脂肪体にＥＭＴ６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２７５５）を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）。１３日で定着した乳腺腫瘍（約５５ｍｍ３）を有するマウスに、単一用量の１×１０７ＣＦＵのｃｓｇＤ欠失株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。細菌株は構成的に活性なマウスＳＴＩＮＧ（ＥＦ－１α ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）を発現するプラスミドを含んでいた。
ＰＢＳ処置マウスの腫瘍は均一に増殖し、３５日目に最大腫瘍体積（１１９９．０±２９８．１ｍｍ３）に達した。ｃｓｇＤが無傷の株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢで処置したマウスはこのモデルにおいて抗腫瘍有効性の証拠を示さず、これも３５日目に最大腫瘍体積（１６８９．１±５３７．０）に達した。これらの腫瘍のエクスビボＬＢ播種より、全ての腫瘍がコロニー形成することが明らかになった。しかし、ｃｓｇＤ欠失株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤでは、５匹中３匹のマウスでその原発およびいずれの転移疾患でも完全な治癒がもたらされた（６０日以上）。全腫瘍成長阻止（ＴＧＩ）は４５．７％であり、他の２つの残った腫瘍のうち１つは最終的に増殖する前に部分奏功した。２つの細菌株は同じプラスミドペイロードを含んでいたが、１つだけが有意な抗腫瘍有効性を示した。即ち、最も難治性で高度に転移性の同系腫瘍モデルの１つである同所性ＥＭＴ６において、ｃｓｇＤが欠失した株は全身的抗腫瘍有効性を誘起し、６０％の完全奏功をもたらすことができた。
ｃｓｇＤ欠失株はインビボで増強された細胞内取り込みを示す
ｃｓｇＤ欠失株が、腫瘍常在性骨髄性細胞中への細菌のより大きな取り込みによる有効性の改善を示すかを決定するため、エクスビボゲンタマイシン保護アッセイを実施した（Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233を参照）。この実験のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス４匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに、１７日目に１×１０７ＣＦＵのｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株（Ｎ＝１２）、または親ＹＳ１６４６株（Ｎ＝４）をＩＶ注射した。ＩＶ投薬の７日後に腫瘍を切除し、秤量し、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０ｍｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを添加したＲＰＭＩ中で細切し、３７℃で振盪しながら３０分インキュベートして、単一細胞懸濁液を生成した。３０分後に、７０ｍｍのフィルターに懸濁液を通し、回収した体積を同一の別の２つの試料に分割した。細胞外細菌を死滅させるために、対になった試料のそれぞれ１つにゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２００ｍｇ／ｍＬで加え、試料を振盪しながら３７℃で９０分インキュベートした。次いで細胞懸濁液を洗浄し、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘで溶解して、ＣＦＵを計数するためにＬＢ寒天プレートに播種した。
結果は、ゲンタマイシン処理がないＹＳ１６４６処理腫瘍からのＣＦＵ（１１９２５±１９８５９ＣＦＵ）と比較して、ゲンタマイシン処理は腫瘍から検出される極めて少ないＣＦＵ（５１±４５ＣＦＵ）をもたらしたことを示している。これは、これらの腫瘍における細菌は主として細胞外に存在しており、したがってゲンタマイシンによる排除に感受性であることを示している。ｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ処置群においては、よくコロニー形成した腫瘍から予想されるように、非ゲンタマイシン処理腫瘍は高いＣＦＵを生じ、ゲンタマイシンによる処理は、より少なく、親ＹＳ１６４６株処理腫瘍よりはるかに多いＣＦＵ（１２７６±２４１０ＣＦＵ)を生じた。これは、細胞内に存在し、したがってゲンタマイシンから保護されているｃｓｇＤ欠失細菌によるところが大きい。これらのデータは、ｃｓｇＤの欠失が細菌の細胞内取り込みを改善し、それによりインビボにおける免疫調節性タンパク質のプラスミドデリバリーが増強され得ることを実証している。
［実施例８］
ｐＡＴＩ－１．７５ベクターの構築
以下の特徴、即ちｐＢＲ３２２複製の起点、ａｓｄ遺伝子、キュアリングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接されるカナマイシン耐性遺伝子、および発現カセットの挿入のための多重クローニング部位を有するプラスミド（ｐＡＴＩ－１．７５）を設計して合成した。発現カセットは、真核性プロモーター、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、転写後制御エレメント、およびポリアデニル化シグナルを含む、種々の構造で組み立てられた多重エレメントからなっている。
例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー配列の直接下流にコードされたＣＭＶ最初期コアプロモーター、およびヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）のためのコアプロモーターが含まれる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には、それぞれがタンパク質に翻訳され、２Ａ配列の挿入によって区別できるポリペプチドに分離され得る１つまたは複数の配列が含まれ、それにより真核性リボソームは２Ａ配列の中のＧｌｙとＰｒｏ残基との間にペプチド結合を挿入することができない。２Ａ配列の例としては、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）カプシドタンパク質由来のＴ２Ａペプチド（配列番号３２７）、およびブタテスコウイルス［ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ）］由来のＰ２Ａペプチド（配列番号３２８）がある。上流のフューリン切断部位（ＲＲＫＲ）およびその他のエンハンサーエレメントが上流に置かれて、発現したタンパク質を分離する切断を容易にする。
転写後制御エレメント（ＰＲＥ）の例には、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ、配列番号３４６）およびＢ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ、配列番号３４７）が含まれ、これらは細胞質へのｍＲＮＡ核エクスポートを促進することによって遺伝子の細胞質ｍＲＮＡの蓄積を増大し、３’末端のプロセッシングおよび安定性を増強する。ポリアデニル化シグナル配列の例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれ、これらはいずれも転写終結を促進するように働き、ＲＮＡ切断複合体によって認識される配列モチーフを含む３’制御エレメントである。
［実施例９］
設計された異種タンパク質発現プラスミドはヒト細胞からの機能性タンパク質の産生を誘起する
ヒト細胞において確立されたサイトカインの最適発現
免疫刺激サイトカインがヒト細胞中で設計されたプラスミドから発現できることを例証するため、ＥＦ－１αプロモーターの制御下にサイトカインのパネルをｐＡＴＩ－１．７５プラスミドにクローニングした。サイトカインには、それだけに限らないが、マウスＩＬ－２（ｍｕＩＬ－２）、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－２３、およびヒトＩＬ－２（ｈｕＩＬ－２）が含まれる。ＩＬ－１５単一鎖に融合したｍｕＩＬ－１５受容体α（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）については、ＥＦ－１αおよびＣＭＶのプロモーターを試験した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルのプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１ウェルあたり２００，０００細胞にて、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一夜播種して８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、サイトカインプラスミドＤＮＡそれぞれ２００ｎｇを無血清培地中で希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、トランスフェクトしていないウェルを陰性対照とした（二重測定）。トランスフェクション後２４時間で各試料から細胞培養上清を収集し、各サイトカインに特異的なＥＬＩＳＡによってタンパク質発現について評価した。
ｍｕＩＬ－２コンストラクトを、マウスＩＬ－２ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でメーカーの使用説明書に従って評価し、コドン最適化したｍｕＩＬ－２のさらなるバージョン（ｍｕＩＬ－２ ＣＯ）も評価した。未希釈の上清中の濃度を試験し、ｍｕＩＬ－２コンストラクトについては平均１６８０ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２、ｍｕＩＬ－２ ＣＯコンストラクトについては１８１２ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２が得られた。これらのデータはコンストラクトの機能性を確認し、収率はコドン最適化によって改善され得ることを実証した。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０コンストラクトをマウスＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でメーカーのプロトコールに従って評価した。上清を未希釈で添加すると、平均４００ｐｇ／ｍＬの分泌されたｍｕＩＬ－１２ｐ７０が測定されたが、これは直線範囲の外であった。上清を５倍に希釈すると、平均１０５ｐｇ／ｍＬの分泌されたｍｕＩＬ－１２ｐ７０が検出された。ｍｕＩＬ－２３プラスミドについては、マウスＩＬ－２３ ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してキットの使用説明書に従ってタンパク質の検出を実施した。上清を未希釈で添加すると、平均９６６ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２３が検出された。ヒトＩＬ－２プラスミドについては、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してキットの使用説明書に従ってタンパク質の検出を行った。上清を未希釈で添加すると、平均１４２２ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２が検出された。ＥＦ－１αまたはＣＭＶプロモーターのいずれかを使用して発現したｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについては、キットの使用説明書に従ってマウスＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を使用した。未希釈で添加すると、ＥＦ－１αプロモーターを用いたｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃプラスミドは平均１３１ｐｇ／ｍＬを生じた一方、ＣＭＶプロモーターを用いたｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃプラスミドは平均２８９ｐｇ／ｍＬを生じた。
これらのデータは、ヒト細胞中におけるマウスとヒトとの両方の免疫調節性サイトカインをコードするプラスミド発現コンストラクトを妥当とするものである。さらに、これらのデータは、コドン最適化およびＣＭＶ等のプロモーターの使用によってタンパク質の発現を増強できることを示している。
転写後制御エレメントはサイトカインの発現を増強する。
ＯＲＦの３’末端に付加された転写後制御エレメント（ＰＲＥ）がヒト細胞中における免疫刺激サイトカインの発現を増強するかを決定するため、ＥＦ－１αプロモーターの制御下におけるｈｕＩＬ－２の発現を、ｐＡＴＩ－１．７５プラスミド中のウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）の添加ありまたはなしで試験した。
ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルのプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１ウェルあたり２００，０００細胞にて、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一夜播種して８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、サイトカインプラスミドＤＮＡそれぞれ２００ｎｇを無血清培地中で希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、トランスフェクトしていないウェルを陰性対照とした（二重測定）。トランスフェクション後２４時間にて各試料から細胞培養上清を収集し、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってメーカーの使用説明書に従って活性について評価した。上清は未希釈で添加するか、または５倍希釈した。
結果は、上清を未希釈で添加した場合には、平均１５４０ｐｇ／ｍＬを分泌したＷＰＲＥなしのｈｕＩＬ－２コンストラクトと比較して、ＷＰＲＥありのｈｕＩＬ－２コンストラクトは３．６倍に増加した５５１１ｐｇ／ｍＬを分泌したことを実証した。５倍希釈した上清では、非ＷＰＲＥ ｈｕＩＬ－２コンストラクトは３１５ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を分泌した一方、ＷＰＲＥありのｈｕＩＬ－２コンストラクトは４．６倍に増加した１４４１ｐｇ／ｍＬを分泌した。即ち、それだけに限らないがＷＰＲＥによって例証される３’転写後制御エレメントの付加は、ヒト細胞中におけるタンパク質の発現を有意に改善することができる。
プロモーターの最適化および転写後制御エレメントは初代Ｍ２マクロファージにおけるサイトカインの産生を増強する
ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ等のサイトカインの発現はＣＭＶプロモーターの使用によってヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で増強される一方、サイトカインの発現が、Ｔ細胞が除外されたヒト固形腫瘍における主要なマクロファージ表現型であるドナー由来の初代ヒトＭ２マクロファージ中で同様に増強できるかを決定した。さらに、ＷＰＲＥ等の転写後制御エレメントがこれらの細胞中における発現を増強できるかを決定した。
タンパク質の発現が改善され得るかを決定するため、プロモーターＥＦ－１αおよびＣＭＶをｍｕＩＬ－２の発現の制御について試験し、ＷＰＲＥをｈｕＩＬ－２の発現について試験した。健康なヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを完全培地(ＲＰＭＩ－１６４０＋１倍の非必須アミノ酸＋５％ ヒトＡＢ血清)中で解凍し、室温、８００ＲＰＭにて１０分の遠心分離によって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。単離した単球を、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含むＲＰＭＩ培地中で６日間培養してＭ２マクロファージを生成した。このため、単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中で再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５）を２４ウェルプレートに播種して最終体積７５０μＬとした。播種の２日後に細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目に細胞培養培地を完全に吸引し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ）によるトランスフェクションのために、サイトカインを含まない新鮮な完全培地に交換した。
Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤによるトランスフェクションは、メーカーの使用説明書に従って実施した。簡単に述べると、ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－２コンストラクト、ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２コンストラクト、ＥＦ－１α－ｈｕＩＬ－２コンストラクト、またはＥＦ－１α－ｈｕＩＬ－２＋ＷＰＲＥコンストラクトを含む５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ならびにトランスフェクトしていない対照を提供された緩衝液で希釈し、０．２μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合して、室温で１５分インキュベートして、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間にて上清を収穫し、マウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用し、キットの使用説明書に従って、サイトカインについてアッセイした。
結果は、ＥＦ－１αプロモーターの制御下にｍｕＩＬ－２コンストラクトでトランスフェクトされた初代ヒトＭ２マクロファージから収穫した未希釈上清からのｍｕＩＬ－２の発現が、平均５９．７ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２の分泌をもたらしたことを実証した。ＣＭＶプロモーターによるｍｕＩＬ－２コンストラクトはほぼ５倍に増加した平均２７５ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２を生じた。ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡについては、ＷＰＲＥを失っているプラスミドでトランスフェクトした細胞由来の未希釈上清は平均１７０ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を生じた。ＷＰＲＥを含むｈｕＩＬ－２コンストラクトは、平均２１９ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を生じた。これらのデータは、ＣＭＶ等のプロモーター、およびＷＰＲＥ等の転写後制御エレメントが、初代ヒトＭ２マクロファージを含む多種の細胞型におけるサイトカインの発現を有意に改善し得ることを確認している。
ヒト細胞から発現した共刺激性受容体リガンド４－１ＢＢＬ
４－１ＢＢＬ等の共刺激性分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現したとき、Ｔ細胞上で発現した４－１ＢＢと連携して最適のＴ細胞機能を促進することができる。４－１ＢＢＬはその細胞質シグナル伝達ドメインによって負に制御されている。Ｔ細胞へのマクロファージの４－１ＢＢＬライゲーションの後期では、４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの逆進シグナル伝達が４－１ＢＢＬの表面転座を誘起してＴＬＲ４に結合し、これとシグナル伝達複合体を形成する。これは、ＴＬＲ４のＬＰＳによる活性化と同程度の高レベルのＴＮＦ－αを誘起し、これが適応性免疫応答の免疫抑制をもたらす（例えばMa et al. (2013) Sci. Signal. 6(295):ra87を参照）。
本実施例では、マウス４－１ＢＢＬをコードする配列をｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。Ｔ細胞を最大に連携させるため、細胞質ドメイン（配列番号３４４のアミノ酸残基１～８２に対応）を欠失させることによって、４－１ＢＢＬ細胞質ドメインの逆進シグナル伝達を無くし、ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔを生成させた。ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔがヒト細胞の表面上で機能的に発現し得るかを決定するため、ＨＥＫ－２９３Ｔを利用した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルのプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１ウェルあたり２００，０００細胞にて、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一夜播種して８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔをコードする２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを無血清培地中で希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、トランスフェクトしていないウェルを陰性対照とした（二重測定）。４８時間後に１３００ＲＰＭにて３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＰＥコンジュゲートマウス抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＤＡＰＩ（生死染色）にて染色した。３０分後、１３００ＲＰＭにて３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
生存細胞のパーセンテージとして、トランスフェクトしていない対照細胞はマウス４－１ＢＢＬの陽性染色率１４．６％を示した。比較として、ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔをコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞の９３．４％は４－１ＢＢＬの表面発現について陽性であった。これらのデータは、ヒト細胞の表面上に高レベルで４－１ＢＢＬを発現するために、ｐＡＴＩ－１．７５プラスミドを効果的に使用し得ることを実証している。
ヒト細胞から発現した可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ
全ＴＧＦβ受容体ＩＩの細胞質および膜貫通部分を除去することによって、可溶性マウスＴＧＦβ受容体ＩＩ変異体を設計した。さらに、検出のためにＦＬＡＧまたはＦｃタグのいずれかを付加した。ＣＭＶプロモーターおよび３’ＷＰＲＥの制御下に、これらの変異体をｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。配列はＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした６ウェルのプレートに１．５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１日前に播種して、８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、３μｇのＤＮＡを無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。４８時間のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集した。いくつかの上清は１０ｋＤａのスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清についてマウスＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による直接ＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡデータを４５０ｎｍにおける吸光度とともに下表に提供する。
Figure 2023501539000030
これらのコンストラクトの機能性をＴ細胞アッセイにおいて試験した。磁気単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスＴ細胞を脾臓から収穫した。Ｔ細胞を、可溶性受容体ありまたはなしで、種々の濃度のマウスＴＧＦベータにて、抗マウスＣＤ３ε抗体とインキュベートした。マウスＴＨ１ ＣＢＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ４、ＣＤ８、４－１ＢＢ、およびＣＤ６９のフローサイトメトリー標識を使用して、Ｔ細胞の活性化を定量した。
これらのデータは、免疫刺激細菌によるヒト等の真核細胞へのデリバリーのために操作されたプラスミドから異種分子、例えばＦｃドメインに融合した細胞外受容体を発現する能力を実証している。
ヒト細胞からのＣＤ３×ＣＤ１９二特異性Ｔ細胞エンゲージャーの発現
ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むＣＤ３×ＣＤ１９二特異性Ｔ細胞エンゲージャー［ＢｉＴＥ（登録商標）］を、ＣＭＶプロモーターの制御下に３’ＷＰＲＥとともにｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。配列はＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。ポリ－Ｌ－リシンでコートした６ウェルのプレートに１．５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１日前に播種して、８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、３μｇのＤＮＡを無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。４８時間のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集した。いくつかの上清は１０ｋＤａのスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において濃縮した。
このコンストラクトの機能性を、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）へのＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（登録商標）の結合によって試験した。Ｂｉｔｅ（登録商標）は、フローサイトメトリーにより抗ＦＬＡＧ－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して検出した。それぞれの条件について５０，０００個の細胞の１つのウェルを操作した。ＡＰＣ陽性事象の平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびＡＰＣ陽性としてゲーティングした細胞の数を下表に提供する。
Figure 2023501539000031
さらに、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦＡＴ細胞の共培養においてこのコンストラクトを試験した。ＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（登録商標）ありまたはなしで細胞をインキュベートし、ＢｉＴＥ（登録商標）の添加後６時間および２４時間で発光（ＮＦＡＴレポーターに対応）を検出した。このアッセイの発光の読み取り値を下表に提供する。
Figure 2023501539000032
これらのデータは、本明細書の免疫刺激細菌によって送達され得る操作されたプラスミドからヒト等の真核細胞中においてｓｃＦｖ、代替の抗体コンストラクト、および二特異性Ｔ細胞エンゲージャー等の異種分子を発現する能力を実証している。
［実施例１０］
免疫刺激細菌株はヒト細胞中で効率的にプラスミドを送達し、サイトカインを発現させる
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株はヒト単球における感染に続いて機能性ＩＬ－２タンパク質の発現を誘起する
上記のように、ａｓｄ遺伝子が欠失したサルモネラ・チフィムリウムのＹＳ１６４６株からフラゲリン遺伝子であるｆｌｊＢおよびｆｌｉＣを欠失させて、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを生成させた。この株をＥＦ－１αプロモーターおよびマウスサイトカインＩＬ－２（ｍｕＩＬ－2)を有する発現カセットを含むプラスミドとともに電気穿孔した。さらに、無関係のサイトカインのための対照として、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、マウスＩＬ－１５δをコードする発現プラスミドとともに電気穿孔した。さらなるコンストラクトを、ＣＭＶプロモーターを使用して創成した。
発現プラスミドを含むこれらの株がヒト単球に感染し、マウスＩＬ－２の産生を誘起することができるかを決定するため、ＲＰＭＩ１６４０［Ｇｉｂｃｏ（商標）］＋１０％ Ｎｕ－Ｓｅｒｕｍ（商標）［Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）］中、５０，０００細胞／ウェルで、ＴＨＰ－１ヒト単球細胞を感染の１日前に播種した。細胞をＲＰＭＩ中１時間、ＭＯＩ ５０にて種々の株に感染させ、次いでＰＢＳにて３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁した。４８時間後に９６ウェルプレートから上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってマウスＩＬ－２の濃度について評価した。
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ＩＬ１５δ対照ウェルにおいて検出されたｍｕＩＬ－２の濃度は予想されたように極めて低く（６．５２ｐｇ／ｍＬ）、おそらく内因性ヒトＩＬ－２受容体へのいくらかの交差反応性を反映している。対照的に、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株は平均３５．１ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２を誘起した。これらのデータは、ヒト単球におけるサルモネラ・チフィムリウム免疫調節性プラットフォーム株からのＩＬ－２等の機能性異種タンパク質の発現および分泌の実現可能性を実証している。
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株およびｐａｇＰ欠失株は初代ヒトＭ２マクロファージにおいて、トランスフェクトしたｍｕＩＬ－２ ＤＮＡと比較して増強されたＩＬ－２発現を示す
初代ヒトＭ２マクロファージにおけるｍｕＩＬ－２の発現について、トランスフェクション（即ちプラスミドＤＮＡの直接移送）とバクトフェクション（即ち本明細書の免疫刺激細菌株によるプラスミドＤＮＡの移送）との相対的効率を比較した。健康なヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１×非必須アミノ酸＋５％ ヒトＡＢ血清)中で解凍し、室温、８００ＲＰＭにて１０分の遠心分離によって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中で再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。次いで単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中に再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５)を最終体積７５０μＬとして２４ウェルプレートに播種した。播種の２日後に細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目に細胞培養培地を完全に吸引し、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ）によるトランスフェクションのために、サイトカインを含まない新鮮な完全培地に交換した。
Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤによるトランスフェクションを、キットの使用説明書に従って実施した。簡単に述べると、ＥＦ－１αプロモーターの制御下（ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－２）もしくはＣＭＶプロモーターの制御下（ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２）にｍｕＩＬ－２をコードするコンストラクト由来のプラスミドＤＮＡまたはトランスフェクトしていない対照５００ｎｇを提供された緩衝液で希釈して０．２μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤトランスフェクション試薬と混合し、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を、単球を含む２４ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。さらなる細胞のウェルを、ＥＦ－１α－ｍｕＩＬ－２コンストラクトを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株、またはＣＭＶ－ｍｕＩＬ－２コンストラクトを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株にＲＰＭＩ中１時間、ＭＯＩ ４５０にて感染させ、次いでＰＢＳにて３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。
２４時間後に、β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）（Ｑｉａｇｅｎ）を含む３５０μＬの緩衝液ＲＬＴにて細胞を溶解し、以下の改変を行ったＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するための、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するゲノムＤＮＡ排除ステップがキット内に含まれていた。総ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度も、Ａ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。ＲＮＡは、逆転写を実施するまで凍結解凍せずに－８０℃にて保存した。ｃＤＮＡの合成は、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って、０．４～１μｇの鋳型ＲＮＡを使用して３０μＬの反応において実施した。
ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって実施した。マウスＩＬ－２のためのＳＹＢＲ（登録商標）プライマー(アッセイＩＤ：ｑＭｍｕＣＥＤ００６０９７８)は、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）はｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的熱サイクリングプログラムは、９５℃、３０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、５秒と６０℃、３０秒との４０サイクルからなっていた。各プレートのプライマーの各組について鋳型なしの対照による反応が含まれていた。全ての試料は二重測定を行い、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量はＧａｐｄｈ（グリセルアルデヒド－３－ホスフェート脱水素酵素）参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アッセイＩＤ：ｑＭｍｕＣＥＤ００２７４９７）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的（ｍｕ－ＩＬ２）と参照（Ｇａｐｄｈ）遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは処置のΔＣｑ値を非処置対照のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。倍数増加は２＾－ΔΔＣｑとして計算した。トランスフェクトしていない／感染していない対照に対する倍数増加を下表に示す。
Figure 2023501539000033
結果は、トランスフェクションまたはバクトフェクションのいずれにおいても、ＣＭＶプロモーターが初代ヒトＭ２マクロファージにおいてＥＦ－１αプロモーターと比較してｍｕＩＬ－２の優れた発現を示したことを示している。現在利用可能な最も効率的な試薬を使用するトランスフェクションによって最高レベルのｍｕＩＬ－２発現が生じる一方、バクトフェクションも高発現レベルのｍｕＩＬ－２を誘発し、本明細書で提供する細菌プラットフォームによる異種遺伝子移送の高い有効性が示された。
［実施例１１］
細菌株はインビボで免疫調節性プラスミドを効率的に送達し、強力な抗腫瘍活性を示す
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株は結腸直腸癌のマウスモデルにおいて毒性なしに強力な腫瘍阻止を誘起する
ｍｕＩＬ－２発現プラスミドを含むサルモネラ・チフィムリウム株がさらなる毒性なしに抗腫瘍有効性を誘起できることを実証するため、ｍｕＩＬ－２プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、皮下側腹部ＭＣ３８結腸直腸腺癌モデルにおける安全性および有効性についてＰＢＳ対照と比較した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株、またはＰＢＳ媒体対照を１１日目にＩＶ注射した。腫瘍測定および体重を、週２回記録した。
結果から、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２株が、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（ＴＧＩ ７６．７％、Ｐ＝０．００５、２１日目）を示し、ＰＢＳマウスを安楽死させた移植後４０日目まで腫瘍がよく制御されていることが明らかになった。治療はさらなる株の弱毒化がなくても、よく忍容され、初期の体重損失は一過性であり、４０日目のＰＢＳ対照と比較して体重はわずかに３．４％減少したのみであった。即ち、ｍｕＩＬ－２を発現する免疫刺激株は、結腸直腸癌のモデルにおいて安全かつ非毒性の様式で腫瘍成長阻害を強力に阻害する。
マウスＩＬ－２をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株はインビボでＩＬ－２の腫瘍特異的産生を誘起する
デリバリーの腫瘍特異的な性質を確認するため、脾臓に関連する腫瘍ｍｕＩＬ－２の発現のレベルを決定した。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２、またはＰＢＳ媒体対照を１０日目にＩＶ注射した。腫瘍移植後３１日目に腫瘍および脾臓を切除し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒおよび２ｍＬのＰＢＳ中のＭ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）分子セッティングを使用して腫瘍抽出物のために処理した。ホモジネートを１３００ＲＰＭで１０分、遠心分離し、上清を収集して、ｍｕＩＬ－２ ＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してメーカーの使用説明書に従ってアッセイした。結果はｍｕＩＬ－２のｐｇ／ｍＬとして定量し、組織１ｇあたりに標準化した。
ＰＢＳ対照腫瘍は腫瘍中のバックグラウンドレベルのｍｕＩＬ－２を示し、腫瘍組織１ｇあたり平均１３４ｐｇ／ｍＬであった。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２で処置した腫瘍は腫瘍組織１ｇあたりはるかに高い平均３８９．９ｐｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－２を生じ、腫瘍常在性骨髄性細胞におけるプラスミドデリバリーによるｍｕＩＬ－２レベルの上昇を検出する能力を実証した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍｕＩＬ－２を注射したマウスの脾臓中のｍｕＩＬ－２のレベルは組織１ｇあたり平均６．６ｐｇ／ｍＬであり、これはＰＢＳ対照中よりも低かった。腫瘍に対するこの特異性により、腫瘍を標的としていない従来のサイトカイン療法よりはるかに安全な様式での免疫調節性レベルのＩＬ－２のデリバリーが可能になる。
マウス共刺激性受容体リガンド４－１ＢＢＬをコードするプラスミドを含む弱毒化した細菌株はインビボで治癒効果を示す
４－１ＢＢＬ等の共刺激性分子の腫瘍特異的デリバリーが抗腫瘍有効性を増強するかを決定するため、ＣＭＶプロモーターの制御下に４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）（上記）をコードするプラスミドを含み、３’ＷＰＲＥエレメントを含む細菌株を、結腸直腸腺癌のＭＣ３８マウスモデルで評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ＣＭＶ－４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）－ＷＰＲＥプラスミドを含む１×１０７ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ、またはＰＢＳ媒体対照を１０日目にＩＶ注射した。
治療はよく忍容され、初期体重損失は僅か２．２％で、これは３日後には完全に回復した。ＰＢＳと比較して、４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）療法は高度に効果的で治癒的であった（ＴＧＩ ９０．７％、完全奏功（ＧＲ）６０％、３０日目）。これらのデータは、共刺激性分子をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌を腫瘍特異的に送達することの有効性および安全性を実証している。
［実施例１２］
構成的Ｉ型インターフェロン産生を促進する遺伝子における機能獲得型突然変異の特定
病因が未知の重篤な自己炎症性状態および血管障害を提示する対象の例が生じ、しばしば突然変異から誘導される。これらの状態の原因は特定されており、また特定され得る。そのような病変の突然変異による根拠を特定するステップは下記の通りである。ステップ１では、症状を経験している患者および健康な個体から無傷のゲノムＤＮＡを得る。全エキソームシーケンシングを実施し、イントロンおよびエクソンを解析する。遺伝子の解析、およびＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現に関連する経路における産物の突然変異の特定を実施する。この解析から、コードされたタンパク質の構成的機能活性化およびそれに続くI型ＩＦＮの永続的な発現をもたらすことが知られている遺伝子において突然変異を発見する。
突然変異の特定の後、特定した突然変異を含みおよび含まない、完全長の遺伝子をコードするｃＤＮＡをＩ型ＩＦＮの発現を測定するレポーター細胞系にトランスフェクトする。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βのプロモーターの制御下にある場合に、レポーター細胞系を生成することができる。構成的に活性な機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異体はＩＦＮ－βの発現を促進する一方、刺激されていない野生型（ＷＴ）のタンパク質は促進しない。既知のＳＴＩＮＧ ＳＡＶＩ（幼児期に発症するＳＴＩＮＧ関連血管障害）突然変異体の場合、ＩＦＮ－βのＷＴ－ＳＴＩＮＧ刺激はＷＴ－ＳＴＩＮＧを直接活性化するために、増加する外因性レベルのｃＧＡＭＰの付加を必要とする。構成的に活性な突然変異は、ｃＧＡＭＰに依存しない様式でＩＦＮ－βの発現を刺激する。ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、およびＩＲＦ７のそれぞれにおける例示的な機能獲得型突然変異は下の実施例１５で説明しており、本明細書の別の箇所で論じる。機能獲得型突然変異が対象において特定されることができるか、またはインビトロの突然変異およびスクリーニングによって産生されることができるそのような他の遺伝子には、それだけに限らないが、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００が含まれる。
ヒト細胞における機能性構成的I型ＩＦＮ突然変異体の発現
ヒトＳＴＩＮＧ（対立遺伝子Ｒ２３２）およびＩＲＦ－３機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異体（下表を参照）をｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングし、ＰＣＲによって配列を確認した。ＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３ ＧＯＦ発現プラスミドがヒト細胞中で機能性Ｉ型ＩＦＮを誘起できるかを決定するため、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してプラスミドを評価した。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ここでＩＳＲＥのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。Ｉ型インターフェロンの活性は、Ｉ型ＩＦＮによって刺激された細胞上清中のＳＥＡＰの産生をモニタリングすることによって評価することができる。
ＧＯＦ突然変異体のそれぞれによるＩ型ＩＦＮの相対的産生を試験するため、ポリ－Ｌ－リシンでコートしたプレートに１×１０５個の２９３Ｔ－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１日前に播種して、２４ウェルプレートで８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、ＳＴＩＮＧ野生型（ＷＴ）およびＩＲＦ３ ＷＴ対照を含むＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３ ＧＯＦ突然変異体のパネルをコードする２００ｎｇのプラスミド、およびヒト細胞中で非機能性であることが文献で報告されている陰性対照突然変異［ＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｒ陰性対照（ＮＣ）］を無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。一夜のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集し、１０μＬの細胞培養上清を５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。これをＳＥＡＰの測定に使用する。Ｉ型インターフェロンの活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光度にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。
下表に示すように、全てのＧＯＦ突然変異体は、Ｉ型ＩＦＮ活性を誘起しなかった野生型および陰性対照と比較して、ヒト細胞中でＳＴＩＮＧリガンド非依存的にＩ型ＩＦＮ活性を誘起することができた。最高レベルのＩ型ＩＦＮ誘起は、ヒトＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ変異体およびヒトＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄリン酸化模倣変異体によって観察された。これらのデータは、ＧＯＦ突然変異体をコードするプラスミドの、Ｉ型ＩＦＮをｃＧＡＭＰ非依存的に誘起することができる機能性の構成的ＳＴＩＮＧおよび構成的リン酸化模倣ＩＲＦ３を産生する能力を支持している。
Figure 2023501539000034
構成的Ｉ型ＩＦＮ突然変異体をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株の感染はヒトＭ２マクロファージをＩ型ＩＦＮ産生Ｍ１マクロファージに変換する
構成的Ｉ型ＩＦＮ ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株に感染した初代ヒトＭ２マクロファージがＩ型ＩＦＮおよび下流のケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０としても知られている）のプロデューサに変換され得るかを決定した。
健康なヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１×非必須アミノ酸＋５％ ヒトＡＢ血清）中で解凍し、８００ＲＰＭ、室温で１０分の遠心分離によって洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＣＤ１６欠失キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単球をネガティブ単離した。初代ヒトＭ２マクロファージを生成するために、単離した未処理の単球をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中の遠心分離によって洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む完全培地中に再懸濁した。次いで単離した単球（１ウェルあたり３ｅ５）を最終体積７５０μＬにて２４ウェルプレートに播種した。播種の２日後、細胞培養培地を完全に吸引し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地に交換した。２日後（４日目に）、サイトカインを含む１ウェルあたり５００μＬの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目に、細胞培養培地を完全に吸引し、サイトカインを含まない新鮮な完全培地に交換した。以下の株、即ち野生型（ＷＴ）ヒト（ｈｕ）ＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ変異体をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ＷＴ ｈｕＩＲＦ３をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ｈｕＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄ変異体をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；またはプラスミド対照を含む株によってＭＯＩ ４５０にてＲＰＭＩ中１時間、二重測定ウェルを感染させた。次に細胞をＰＢＳにて３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００ μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。対照として、臨床用化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログであるＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を細胞に１０μｇ／ｍＬで加えた。
２４時間後にβ－ＭＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む３５０μＬの緩衝液ＲＬＴにて細胞を溶解し、以下の改変を加えたＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するゲノムＤＮＡ排除ステップを含ませた。総ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度もＡ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。ＲＮＡは逆転写を実施するまで凍結解凍せずに－８０℃にて保存した。ｃＤＮＡの合成は、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って０．４～１μｇの鋳型ＲＮＡから３０μＬの反応において実施した。
ｑＰＣＲはＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって実施した。ｈｕＣＸＣＬ１０（ｑＨｓａＣＥＤ００４６６１９）、ｈｕＩＲＦ３（ｑＨｓａＣＩＤ００１３１２２）、ｈｕＳＴＩＮＧ（ｑＨｓａＣＩＤ００１０５６５）、およびｈｕＩＦＮβ１（ｑＨｓａＣＥＤ００４６８５１）のためのＳＹＢＲ（登録商標）プライマーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）は、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的熱サイクリングプログラムは、９５℃、３０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、５秒と６０℃、３０秒との４０サイクルからなっていた。鋳型なしの対照による反応が各プレートのプライマーの各組に含まれていた。全ての試料は二重測定で操作し、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量はＧａｐｄｈ参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ｑＭｍｕＣＥＤ００２７４９７）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的と参照遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは処置のΔＣｑ値を非処置対照のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。倍数増加は２＾－ΔΔＣｑとして計算した。値を二重測定ウェルの平均として下表に示す。
下表に示すように、プラスミド対照の感染と比較して、ｈｕＳＴＩＮＧ ＷＴおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧの株は高レベルのＳＴＩＮＧ発現を誘起し、これはプラスミド対照または小分子のＳＴＩＮＧアゴニストと比較して有意に高かった。同様に、ＷＴ ｈｕＩＲＦ３およびｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄをコードするプラスミドを含む株は高レベルのＩＲＦ３発現を誘起し、これはプラスミド対照または小分子のＳＴＩＮＧアゴニストより有意に高かった。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ変異体をコードするプラスミドを含む細菌株は、ＷＴ ｈｕＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含む株と比較して、ＩＦＮβおよびＣＸＣＬ１０のはるかに高い発現を誘起した。これは、構成的ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドを含む株がヒト初代免疫抑制性Ｍ２マクロファージをＩ型ＩＦＮ産生 Ｍ１細胞に転換する能力を実証している。ＷＴ ｈｕＩＲＦ３およびｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄをコードするプラスミドを含む株は両方ともより多いかまたは同程度のレベルのＩＦＮβを誘起した一方、これらはｈｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８４Ｇ変異体より少ないＣＸＣＬ１０を誘起した。
Figure 2023501539000035

ND = データなし
これらのデータは、ヒト初代Ｍ２マクロファージにおける構成的ＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮ変異体の発現およびこれらの細胞のＩ型ＩＦＮ産生 Ｍ１様細胞への変換を実証している。
［実施例１３］
構成的Ｉ型ＩＦＮ変異体をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌は結腸直腸がんのマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍免疫性を示す
ヒトＧＯＦ ＳＴＩＮＧ突然変異体はマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を示す
構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体をコードする発現プラスミドを含む免疫刺激細菌株が抗腫瘍有効性を誘起することを実証するため、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ（両方のフラゲリン遺伝子ｆｌｊＢおよびｆｌｉＣのノックアウト）を、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターの後ろに対立遺伝子Ｒ２３２およびＧＯＦ突然変異Ｖ１５５Ｍを有するヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍ）のための発現カセットを含むプラスミドとともに電気穿孔して、株ＹＳ１６４６単独およびＰＢＳ媒体対照と比較した。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍをコードする遺伝子を、ＤＮＡ合成を使用して生成し、ｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。構成的ヒトＳＴＩＮＧ変異体がマウスにおいて抗腫瘍活性を示し得るかを評価するため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍを株ＹＳ１６４６とともに、またはＰＢＳ対照とともに８日目にＩＶ注射した。
結果は、以前公開されたデータと一致して、ＹＳ１６４６親株が抗腫瘍療法としては弱い効果しかなく、治癒的でなかった［ＴＧＩ ３５％、ｐ＝ＮＳ（有意でない）、２８日目］ことを示した。しかし、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含むより弱毒化された株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍは、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍制御を誘発し（ＴＧＩ ６０％、ｐ＜０．０５、２８日目）、２０％の治癒率を有していた。即ち、構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体を送達する免疫刺激細菌株は腫瘍成長を強力に阻害し、結腸直腸腺癌のモデルにおいて治癒効果を示す。
マウスのリン酸化模倣ＩＲＦ３はインビボで治癒効果を示す
リン酸化模倣ヒトＩＲＦ３変異体のマウスバージョンを設計し、ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄと命名して、結腸直腸腺癌のマウスモデルにおいて評価した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターの後ろにＧＯＦ突然変異Ｓ３８８Ｄを有するマウスＩＲＦ３のための発現カセット（ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄ）を含むプラスミドとともに電気穿孔して、ＰＢＳ媒体対照と比較した。ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄをコードする遺伝子を、ＤＮＡ合成を使用して生成し、ｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングした。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス５匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞を接種した（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ＥＦ－１α－ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄを１０日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
治療は極めてよく忍容され、初期体重減少の最低は僅か０．３％であった。ＰＢＳと比較して、ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄ ＧＯＦ突然変異体をコードするプラスミドを含む細菌株は高度に効果的であり、治癒的であった（ＴＧＩ ８１．８％、ＣＲ ６０％、４２日目）。これらのデータは、構成的Ｉ型ＩＦＮ誘起性変異体を腫瘍特異的に送達することの有効性および安全性を実証している。
マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体は強力かつ治癒的な抗腫瘍活性を示す
ヒト患者にて発見されたヒトＳＴＩＮＧ変異体のマウスオルソログのパネルを設計した。これらのオルソログはヒト変異体と１コドンだけ異なり、ＥＦ－１αプロモーターの制御下にｐＡＴＩ－１．７５ベクターにクローニングして、以下の突然変異体の組、とりわけｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５４Ｍ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８０Ｑ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６Ｌ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ、およびｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙを得た。ＳＴＩＮＧ変異体を、マウス腺癌のＭＣ３８モデルにおいて抗腫瘍有効性について評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５４Ｍ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８０Ｑ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６Ｌ、またはｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇの発現を推進するＥＦ－１αを有するプラスミド、またはスクランブルしたｓｈＲＮＡプラスミド対照を含む５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを１０日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
本実験では、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ＥＦ－１α－ｓｈＳＣＲ（スクランブルしたプラスミド対照)はＰＢＳ対照と比較して抗腫瘍有効性を示し（ＴＧＩ ７３％、２６日目）、これは歴史的に示されているＹＳ１６４６親株よりはるかに強力であった。これはプラスミドそれ自体の上の本質的に免疫刺激性のエレメント、例えばＣｐＧｓおよびＲＮＡｉ刺激性エレメントによるものであろう。しかし、この療法は群の中で最も忍容性が低く、最低９．９％の体重減少を示し、これは研究の最後の終了時でのみ解消した。対照的に、構成的に活性なマウスＳＴＩＮＧ突然変異体は一過性で数日以内に解消する、より少ない体重減少をもたらした。これらの変異体の相対的抗腫瘍有効性は活性における相違を明らかにし、２つの変異体、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３ＳおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇのみがプラスミド対照に対して治癒効果および増強された有効性を示した。
Figure 2023501539000036
フォローアップ研究において、マウスＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ変異体をＲ２８３ＧおよびＮ１５３Ｓ変異体とともに試験し、その抗腫瘍有効性を比較した。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ、またはｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙの発現を推進するＥＦ－１αを有するプラスミドを含む５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを９日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。以前と同様に、ＳＴＩＮＧ変異体はよく忍容され、一時的な体重減少のみが観察されたが、迅速に解消した。これは小分子ＳＴＩＮＧアゴニストにおいても観察されたので、おそらくオンターゲット療法によるものであろう。２つの構成的に活性なマウスＳＴＩＮＧ変異体、即ちｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３ＳおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇの有効性は以前の研究とほぼ同一であったが、明らかでない理由で体重減少ははるかに少なかった。ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ変異体も高度に効果的であったが、治癒的ではなかった。
Figure 2023501539000037
これらの研究からのＳＴＩＮＧによって治癒したマウスを、最初の腫瘍移植後４０日で反対側の側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を再チャレンジした。全ての腫瘍が増殖したナイーブマウス（Ｎ＝５）と比較して、ＳＴＩＮＧで治癒したマウスの全てが腫瘍を拒絶し、適応免疫の関与を示した。
これらのデータは、結腸直腸癌のマウスモデルにおけるヒト構成的活性ＳＴＩＮＧ変異体のマウスバージョンの安全性および有効性を妥当とし、他のＳＴＩＮＧ変異体と比較して増強された有効性を有する変異体の小さなサブセットを明らかにしている。これらの高度に活性な変異体はまた、防御免疫を誘発し、Ｉ型インターフェロンの腫瘍特異的産生の有効性を実証している。
マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体はＩＶ投薬に続いて有意な腫瘍リモデリングを示す
次に、構成的ＳＴＩＮＧ変異体をコードするプラスミドを含む細菌株がＩＶ投薬に続いて腫瘍微小環境（ＴＭＥ）をリモデルする能力において相違を示すかを決定した。これを試験するため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５４Ｍ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８０Ｑ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６Ｌ、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇの発現を推進するＥＦ－１αを有するプラスミドまたはプラスミド対照を含む５×１０５ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを８日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
腫瘍移植後２８日目に、腫瘍を解析のために切除した。腫瘍を２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分、インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。ナイロンメッシュを５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０にて１０％ ＦＢＳとともにナイロンメッシュを洗浄し、濾過された細胞を１０００ＲＰＭにて７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
種々のＧＯＦ ｍｕＳＴＩＮＧ突然変異体をコードするプラスミドを含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧの投与に続く、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、好中球、単球、樹状細胞（ＤＣ）、Ｍ１マクロファージ、およびＭ２マクロファージを含む生きた腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定した。フローサイトメトリー染色のため、１００μＬの単一細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートのウェルに播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標），ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬにて加え、暗所、氷上にて３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４ ＦＩＴＣ クローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１ クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣ クローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７ クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０ クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥ クローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５ クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７ クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５ クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５ クローンＭ１／６９；全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、暗所、氷上にて３０分インキュベートした。３０分後、細胞を１３００ＲＰＭにて３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
下表に示すように、ＥＦ－１αプラスミド制御を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は、おそらくプラスミド上の免疫刺激エレメントにより、いくつかのＣＤ８＋Ｔ細胞の動員にも関わらず圧倒的に高い好中球浸潤を示した。対照的に、様々なｍｕＳＴＩＮＧ変異体は特有の腫瘍浸潤性免疫細胞シグネチャーを有しており、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６ＬおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ等のいくつかはＰＢＳ対照よりも少ない免疫抑制性好中球をもたらした。最も好ましい免疫プロファイルは、多数のＣＤ４＋Ｔｈ１細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびに少数の好中球とともにｍｕＴＩＮＧ Ｒ２８３ＧおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ突然変異体を投与したマウスの腫瘍において観察され、適応免疫応答を生成するための高度に好ましい条件を示している。さらに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３ＧおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ突然変異体はＰＢＳと比較して有意に高いｐ１５ｅ腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍中に有していた。以下に示すように、これらの傾向は総細胞計数においても反復された。即ち、腫瘍常在性骨髄性細胞への構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体のデリバリーは、適応性抗腫瘍表現型に向い、細菌性表現型から離れる免疫抑制性腫瘍微小環境の完全なリモデリングをもたらし、これは先天性免疫の促進および適応性免疫の抑制によって特徴付けられる。
生存している腫瘍浸潤性白血球(TIL)の%
Figure 2023501539000038

総細胞計数
Figure 2023501539000039

［実施例１４］
コンビナトリアルプラスミド発現カセットを使用する多数の免疫調節性タンパク質の発現
マルチモジュラープラスミド発現カセットはヒト細胞中で多数の免疫調節性タンパク質を産生する能力を示す
ＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮ誘起性変異体およびサイトカインをコードする核酸の組合せを、ＣＭＶおよびＥＦ－１αプロモーターの制御下に別の２つのＯＲＦを使用し（二元プロモーター系）、またはＯＲＦ中のＴ２Ａペプチドおよび１つのプロモーターを使用して（単一プロモーター系）、ｐＡＴＩ－１．７５ベクター中にクローニングした。コンストラクトは、３’ＷＰＲＥもしくはＨＰＲＥ等の転写後制御エレメント（ＰＲＥ）、および／またはＳＶ４０もしくはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル等のポリアデニル化シグナル配列も適宜含んでいた。調製したコンストラクトには、サイトカインｍｕＩＬ－２、コドン最適化されたｍｕＩＬ－２（ｍｕＩＬ－２ ＣＯ）、ｍｕＩＬ－２１、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、ｍｕＩＬ－１８、およびｍｕＩＦＮ－α２、ならびにそれらの組合せ；突然変異Ｒ２８３Ｇを有するｍｕＳＴＩＮＧ変異体；ならびに／または細胞質ドメインが欠失したマウス共刺激分子４－１ＢＢＬ（ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）をコードするコンストラクトが含まれていた。配列はＰＣＲによって確認した。
ＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮ誘起性変異体を含む組合せプラスミドがヒト細胞中で機能性Ｉ型ＩＦＮを誘起できるかを決定するため、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してプラスミドを評価した。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現し、ここでＩＳＲＥのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。Ｉ型インターフェロンの活性は、Ｉ型ＩＦＮによって刺激された細胞上清中のＳＥＡＰの産生をモニタリングすることによって評価することができる。さらに、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによって相対的サイトカイン濃度を評価した。
Ｉ型ＩＦＮおよび共発現するサイトカインの相対産生を試験するため、ポリ－Ｌ－リシンでコートした２４ウェルプレートに２×１０５個の２９３Ｔ－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１日前に播種して、８０％のコンフルエンシーを達成した。トランスフェクションの日に、ＧＯＦ変異体のパネル、サイトカイン、および共刺激分子を単独または種々の組合せでコードする５００ｎｇのプラスミドを無血清培地中に希釈し、適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。一夜のインキュベーションの後、各試料からの細胞培養上清を収集し、２０μＬの細胞培養上清を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。I型インターフェロンの活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、６５０ｎｍの吸光度にてＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。ｍｕＩＬ－２コンストラクトはマウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、メーカーの使用説明書に従ってｍｕＩＬ－２の発現について評価した。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０コンストラクトはマウスＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、メーカーの推奨に従って評価した。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについては、マウスＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をキットの使用説明書に従って使用した。ＩＦＮ－α２はＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧレポーター細胞系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して測定した。マウスＩＬ－１８およびマウスＩＬ－２１はＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって測定した。
下表に示すように、分泌された機能性タンパク質の存在を検出するために実施したアッセイによって、多数の組合せペイロードの高度の発現が示された。これらには、サイトカインの組合せ、ならびにＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体との組合せ、および／または共刺激性ペイロードが含まれている。これらのデータは、単一の発現カセットから多数の免疫調節性タンパク質を発現する本明細書で提供するプラットフォームの能力を妥当とするものである。
Figure 2023501539000040

Figure 2023501539000041

Figure 2023501539000042


Figure 2023501539000043

構成的Ｉ型ＩＦＮ誘起性変異体は特有のサイトカインおよびケモカインのプロファイルを有する
上記のように試験したヒトＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体のパネルを用いたＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクション実験から収穫した上清を、ヒト抗ウイルスＣＢＡパネル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、メーカーのプロトコールに従って、下流シグナル伝達の相違について評価した。それぞれのトランスフェクションは二重で実施し、サイトカインレベルを測定した。２回の測定の平均を計算した。平均サイトカイン分泌における倍数増加を、平均サイトカイン分泌を１．００と設定したトランスフェクトしていないウェルと比較して計算した。
下表に示すように、低レベルのヒトＩＬ－１２ｐ７０が細胞内で産生された。しかし、リン酸化模倣ＩＲＦ３変異体（ｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄ）を含むいくつかのヒトＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体は、いくつかの構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体と同様に、Ｉ型ＩＦＮ－α２および／またはＩＦＮ－βの産生を誘起した。これらのＧＯＦ変異体のいくつかは高レベルの分泌されたＣＸＣＬ１０を産生し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境中に動員するこれらの発現された変異体の能力を実証している。ＣＸＣＬ１０発現の最高レベルは、突然変異Ｒ２８４Ｇを有するｈｕＳＴＩＮＧ変異体の発現に続いて観察された。
これらのデータは、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０等の機能性の下流のサイトカインおよびケモカインの誘導のためのＩ型ＩＦＮ誘起性ＧＯＦ変異体を含む多重プラスミド発現コンストラクトの使用を妥当とするものである。これらの変異体は全て特有のシグネチャーを有しており、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体、特にｈｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８４Ｇ（ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇに相当）は最高レベルのＣＸＣＬ１０分泌を誘起した。
Figure 2023501539000044
免疫細胞共培養アッセイは免疫調節性標的の最適な組合せを特定する
Ｔ細胞の動員および活性化を誘発するサイトカインの最適な組合せを決定するため、マクロファージとＴ細胞の共培養アッセイとにおいてパネルを試験した。２４ウェルプレートを使用し、上記（実施例６を参照）のように、ゴールデンチケット（ＳＴＩＮＧ欠失）マウス初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を生成した。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、各ウェルに適切なＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。コンストラクトには、ｍｕＩＬ－２ ＣＯ、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ、ｍｕＩＬ－２ ＣＯ＋ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ＋ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、およびｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ＋ｍｕＩＬ－１８をコードするコンストラクトが含まれていた。
トランスフェクションの２４時間後に、フローサイトメトリー系サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）のためにウェルから１００μＬの細胞培養上清を収穫した。並行して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから２つの脾臓を切除し、マウスＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用説明書に従って脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。次いで１ウェルあたり２００，０００個の単離したＴ細胞を、１ウェルあたり０．５μｇ／ｍＬの最終濃度のＣＤ３ε抗体（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）ありまたはなしで、トランスフェクトした細胞に加えた。トランスフェクトした細胞へのＴ細胞の添加の２４時間または４８時間後に、フローサイトメトリー系サイトカインビーズアレイのために１００μＬの共培養上清をウェルから収穫した。トランスフェクトした骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）および骨髄マクロファージ／Ｔ細胞共培養からの上清を、それぞれマウス抗ウイルスおよびマウスＴｈ１特異的サイトカインビーズアレイを使用してサイトカイン含量について分析した。
下表に示すように、ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３ＧをコードするプラスミドのみがマクロファージからＣＸＣＬ１０産生を誘発した一方、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０をコードするプラスミドは単独でまたは他のタンパク質との組合せで、共培養Ｔ細胞から最高レベルのＩＦＮγを誘発し、これはＣＤ３ε刺激に起因するバックグラウンド量より大きかった。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１８＋ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇの組合せは、マクロファージからのＣＸＣＬ１０の産生および共培養したＴ細胞からのＩＦＮγの産生の両方を誘起することができた。
これらのデータは、単一のプラスミドから多数の免疫調節性ペイロードを発現することの実現可能性ならびにこれらの組合せの相乗的活性を実証している。
Figure 2023501539000045
コンビナトリアル免疫治療は結腸直腸腺癌のマウスモデルにおける増強された抗腫瘍活性を示す
サイトカインの組合せの腫瘍特異的デリバリーが抗腫瘍有効性を増強するかを決定するため、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１８、およびｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇの組合せをコードするコンストラクト（ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１８＋ＥＦ－１α－ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ－ＷＰＲＥ）を、結腸直腸腺癌のＭＣ３８マウスモデルで評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群あたりマウス５匹)の右側腹部ＳＣにＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ｍｕＩＬ－１８、およびｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇの組合せをコードするプラスミド（ＣＭＶ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１８＋ＥＦ－１α－ｍｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８３Ｇ－ＷＰＲＥ）を含む１×１０７ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ、またはＰＢＳ媒体対照を１０日目にＩＶ注射した。
併用療法は極めてよく忍容され、初期体重減少は僅か３．６％であり、これは３日後に完全に回復した。これは、これらのサイトカイン（ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８）の全身投与で観察された毒性とは顕著に対照的である。ＰＢＳ対照と比較して、併用療法は高度に効果的かつ治癒的であった（ＴＧＩ ９２．３％、治癒率 ６０％、３０日目）。これらのデータは、本明細書に記載した免疫刺激細菌株を使用してサイトカインの組合せを腫瘍特異的に送達することの有効性および安全性を実証している。
［実施例１５］
ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、およびその他のインターフェロン経路遺伝子における改善された機能獲得型突然変異を特定するためのタンパク質操作スクリーニング
構成的に活性でインターフェロン血症を促進する機能獲得型（ＧＯＦ）アミノ酸突然変異体がヒトから特定される。遺伝子中の特定の位置にあるアミノ酸コドンを変化させる単一塩基対のヌクレオチドの変化によって、多くのＧＯＦ突然変異が生じる。例えばＳＴＩＮＧにおいては、ｃ．４３９Ｇ→Ｃにおける突然変異によってＶ１４７Ｌ突然変異が生じ、ｃ．４６１Ａ→Ｇにおける突然変異によってＮ１５４Ｓが生じ、ｃ．４６３Ｇ→Ａにおける突然変異によってＶ１５５Ｍが生じる。スクリーニングの目的は、高レベルのＩ型インターフェロンの発現をもたらす構成的に活性な突然変異体を特定することであった。ヒト患者で突然変異した場合にインターフェロン血症を促進することが知られている部位における設計された突然変異は、より多くのアミノ酸置換を試験することを可能にする。本実施例では、設計されたアミノ酸による部位指向性変異生成が既知の突然変異の場所で実施され（インターフェロン血症を促進する遺伝子中の突然変異を列挙した下表を参照）、高レベルのＩ型インターフェロンの発現をもたらす増強された活性を有する突然変異が特定される。
Figure 2023501539000046

Figure 2023501539000047
配列番号３０５～３０９で表されるヒトＳＴＩＮＧの配列に関連するアミノ酸残基Ｒ１９７、Ｄ２０５、Ｒ３１０、Ｒ２９３、Ｔ２９４、Ｅ２９６、Ｓ２７２、Ｑ２７３、Ｅ３１６、Ｄ２３１、Ｒ２３２、Ｋ２３６、Ｓ３５８、Ｅ３６０、Ｓ３６６、およびＲ２３８は、配列番号３６９で表されるマウスＳＴＩＮＧの配列に関連するアミノ酸残基それぞれＲ１９６、Ｄ２０４、Ｒ３０９、Ｒ２９２、Ｔ２９３、Ｅ２９５、Ｓ２７１、Ｑ２７２、Ｅ３１５、Ｄ２３０、Ｒ２３１、Ｋ２３５、Ｓ３５７、Ｅ３５９、Ｓ３６５、およびＲ２３７に対応する。
ＰＣＲプライマーは、遺伝子の相同のｃＤＮＡ配列を有する５’および３’末端に隣接する設計された置換とともに生成される。設計された突然変異を組み込むＰＣＲ産物を生成するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはその他の同様の市販のキットが使用される。ＰＣＲ増幅されたプラスミドはＤｐｎＩで処理され、次いでコンピテントな大腸菌細胞に電気穿孔される。個別のクローンが単離され、プラスミドミニプレップが実施され、所望の突然変異の配列同一性が確認される。次いでより大きな規模のプラスミド調製が実施され（Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔを使用）、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にＤＮＡがトランスフェクトされる。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下にあって分泌型ルシフェラーゼであるＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼを発現し、ここでＩＦＮ－βのコード配列はノックイン技術の使用によってＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼＯＲＦに置き換えられている。次いで構成的に活性化された突然変異体が特定され、ＩＦＮ－βプロモーターによって誘起されるルシフェラーゼ活性の発現の測定によってランク付けされる。
［実施例１６］
サルモネラ・チフィムリウムにおける欠失に対応する不活化欠失を有する種々の種の免疫刺激細菌
上の実施例は、免疫が存在している骨髄性細胞および腫瘍微小環境におけるサルモネラ・チフィムリウムへの標的化およびその蓄積を増大し、治療用産物／ペイロードを腫瘍に送達し、他の細胞型に感染する細菌の能力を無くすことによって細菌の毒性を低減する、サルモネラ・チフィムリウムのゲノムへの例示的な改変を記載している。これらの遺伝子改変は同様に、以下に記載するような他の種における対応する遺伝子の欠失等によって、他の細菌株および種に導入することができる。
大腸菌
ｌｐｘＭ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＥ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、およびｃｓｇＤ遺伝子のインフレーム染色体欠失は、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］によって記載された組換え方法に基づく手法を使用して連続的に大腸菌株で作製される。大腸菌中の遺伝子は下記の通りである。
１）ｌｐｘＭ：ミリストイル－アシルキャリアータンパク質依存性アシルトランスフェラーゼをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４５１４３］；
２）ｐｕｒＭ：ホスホリボシルホルミルグリシンアミドシクロ－リガーゼをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９４６９７５］；
３）ａｓｄ：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７９３９］；
４）ｆｌｉＣ：鞭毛フィラメント構造タンパク質をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４９１０１］；
５）ｆｌｉＥ：鞭毛基底体タンパク質ＦｌｉＥをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６４４６］；
６）ｐａｇＰ：リピッドＩＶＡパルミトイルトランスフェラーゼをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６３６０］；
７）ａｎｓＢ：Ｌ－アスパラギナーゼ２をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７４５４］；
８）ｃｓｇＤ：ＤＮＡ－結合転写二元レギュレーターＣｓｇＤをコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４９１１９］；および
９）ｒｐｓＭ：３０ＳリボソーマルサブユニットプロテインＳ１３（プロモーター）をコードする［大腸菌株Ｋ－１２、サブストレインＭＧ１６５５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７７９１］
簡単に述べると、特定の染色体配列が、相同性アームに隣接される選択可能な抗生物質耐性マーカーに置き換えられ、続いてｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによって除去される。各標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、抗生物質耐性遺伝子の反対側においてプラスミドベクターにクローニングされる。抗生物質耐性遺伝子および隣接する５’および３’相同性アームを含む遺伝子欠失カセットがＰＣＲ増幅され、ゲル精製され、電気穿孔によって大腸菌株に導入される。電気穿孔された細胞が回収され、抗生物質プレートでトランスフォーマントが選択される。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを使用して抗生物質マーカーがキュアされる。ここで抗生物質耐性クローンはｃｒｅ発現温度依存性プラスミドによって形質転換される。コロニーが３０℃で選択し、続いて４２℃における連続継代によって排除され、次いで抗生物質耐性の喪失によってスクリーニングされる。コロニーＰＣＲおよび配列解析によって、抗生物質感受性クローンが遺伝子欠失について確認される。
ヒト補体に対する耐性の増大または大腸菌の耐性化
大腸菌ΔｌｐｘＭ／ΔｐｕｒＭ／Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｉＥ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株におけるサルモネラ・チフィムリウムｒｃｋ（補体殺傷耐性）遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ホモログａｉｌ（付着浸潤遺伝子座）、またはサルモネラ・チフィムリウムｐｇｔＥ（外膜セリンプロテアーゼ）遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上の大腸菌またはサルモネラ・チフィムリウムのｒｐｓＭ等の構成的プロモーターから下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ｌｐｘＭ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＥ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、またはｃｓｇＤ遺伝子座のいずれかにおける）によって、達成される。
サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）
ｍｓｂＢ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、およびｃｓｇＤ遺伝子のインフレーム染色体欠失を、大腸菌系株について上記した手法を使用してサルモネラ・チフィ株において連続的に作製する。
サルモネラ・チフィΔｍｓｂＢ／ΔｐｕｒＭ／Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｇＢ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株におけるサルモネラ・チフィムリウムｒｃｋ（補体殺傷耐性）遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはサルモネラ・チフィムリウムｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上のサルモネラ・チフィムリウムまたはサルモネラ・チフィのｒｐｓＭ等の構成的プロモーターの下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ｍｓｂＢ、ｐｕｒＭ、ａｓｄ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、またはｃｓｇＤ遺伝子座のいずれかにおける）によって達成される。サルモネラ・チフィ中の遺伝子は以下の通りである：
１）ｍｓｂＢ（ＳＴＹ２０９７）：リピッドＡアシルトランスフェラーゼをコードする［サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４８４４０］；
２）ｐｕｒＭ（ＳＴＹ２７４０）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４９０５４］；
３）ａｓｄ（ＳＴＹ４２７１）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２５０４８８］；
４）ｆｌｉＣ（ＳＴＹ２１６７）：フラゲリンをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４８５０７］；
５）ｆｌｇＢ（ＳＴＹ１２１３）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４７６１７］；
６）ｐａｇＰ（ＳＴＹ０６７７）：抗微生物ペプチド耐性およびリピッドＡアシル化タンパク質をコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４７１３７］；
７）ａｎｓＢ（ＳＴＹ３２５９）：Ｌ－アスパラギナーゼをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４９５４１］；
８）ｃｓｇＤ（ＳＴＹ１１７９）：制御タンパク質ＣｓｇＤをコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２４７５８５]；および
９）ｒｐｓＭ（ＳＴＹ４３８０）：３０Ｓリボソーマルサブユニットタンパク質Ｓ１３（プロモーター）をコードする［サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィ、株ＣＴ１８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２５０５９４］
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）
リステリア・モノサイトゲネスのｐｕｒＡ、ｐｕｒＱ、ｐｕｒＳ、ａｓｄ、ｆｌａＡ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、およびａｎｓＢ遺伝子のインフレーム染色体欠失は、抗生物質耐性を与え、低温（３０℃）での複製を可能にするが高温（４３℃）では複製することができない、ｐＫＳＶ７等の温度感受性シャトルベクターを使用する対立遺伝子交換手法によって達成される。それぞれの標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、ｐＫＳＶ７ベクターにタンデムにおいてクローニングされる。これはレシピエントであるリステリア・モノサイトゲネスに形質転換され、抗生物質を含む寒天プレートに播種することによって選択される。プラスミドの染色体統合は、選択下における４２℃での抗生物質耐性トランスフォーマントの連続継代によって誘起される。引き続く逐次的な３０℃での株の二次培養によって、その中でプラスミドが第２のクロスオーバー事象によって切除されて元の野生型遺伝子への復帰または５’および３’隣接配列相同性アームの組込みを生じ、標的とした欠失突然変異体を生成する細胞のサブ集団がもたらされる。抗生物質感受性クローンはこのステップにおいてコロニーＰＣＲおよび配列解析によってスクリーニングされる。
補体耐性を増大させるため、リステリア・モノサイトゲネスΔｐｕｒＡ／ΔｐｕｒＱ／ΔｐｕｒＳ／Δａｓｄ／ΔｆｌａＡ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｇＢ／ΔａｎｓＢ株におけるサルモネラ・チフィムリウムｒｃｋ(補体殺傷耐性)遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはサルモネラ・チフィムリウムｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド(ａｓｄ相補性システム適合性の)上のＰｈｙｐｅｒまたはＰｈｅｌｐｅｒ等の構成的プロモーターの下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ｐｕｒＡ、ｐｕｒＱ、ｐｕｒＳ、ａｓｄ、ｆｌａＡ、ｆｌｉＣ、ｆｌｇＢ、またはａｎｓＢ遺伝子座のいずれかにおける)によって、達成される。リステリア・モノサイトゲネス中の遺伝子は以下の通りである：
１）ｐｕｒＡ（ｌｍｏ００５５）：アデニロスクシネートシンセターゼをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ９８６０６９］；
２）ｐｕｒＱ（ｌｍｏ１７６９）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩＩをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５９７２］；
３）ｐｕｒＳ（ｌｍｏ１７７１）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ サブユニットＰｕｒＳをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５９７０］；
４）ａｓｄ（ｌｍｏ１４３７）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８６４９２］；
５）ｆｌａＡ（ｌｍｏ０６９０）：フラゲリンをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８７１６７］；
６）ｆｌｉＥ（ｌｍｏ０７１２）：鞭毛性フック基底体タンパク質ＦｌｉＥをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５０６２］；
７）ｆｌｇＢ（ｌｍｏ０７１０）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９８５０５９］；および
８）ａｎｓＢ（ｌｍｏ１６６３）：アスパラギンシンセターゼをコードする［リステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ－ｅ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９８５６６３］
遺伝子ｍｓｂＢおよびｐａｇＰは、グラム陽性細菌であるリステリア・モノサイトゲネスには存在しない。ＣｓｇＤもリステリア・モノサイトゲネスには存在しない。その代わり、リステリアは、バイオフィルムの形成に関与するリステリアセルロース結合タンパク質をコードするｌｃｐを発現する。これも欠失させることができる。
ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）
ビフィドバクテリウム・ロングムにおけるＢＬ１１２２（ｐｕｒＭ）、ＢＬ０４９２（ａｓｄ）、およびＢＬ１１４２(Ｌ－アスパラギナーゼ前駆体をコードする)のインフレーム染色体欠失は、不適合性プラスミドベクターシステムを使用する対立遺伝子交換手法によって達成される。ここではプラスミド複製遺伝子ｒｅｐＡを失ったｐＢＳ４２３－ΔｒｅｐＡ等の条件付き複製ベクターが最初にゲノムに組み込まれ、抗生物質耐性が提供される。続いてｒｅｐＡ遺伝子をコードするｐＴＢＲ１０１－ＣＭ等の第２のプラスミドが形質転換され、最初のインテグラントの切除のために選択する第２のクロスオーバー事象を容易にする。それぞれの標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、ｒｅｐＡを失った条件付き複製ベクターにタンデムでクローニングされ、ビフィドバクテリウム・ロングムΔＢＬ１１２２／ΔＢＬ０４９２／ΔＢＬ１１４２株に形質転換される。クロスオーバー組換え事象は相同性アーム配列にて生じることができ、成功したプラスミドインテグラントが選択されて抗生物質プレート上で単離される。次いでインテグラントがｒｅｐＡの機能性コピーをコードする不適合プラスミドによって形質転換され、これが第２のクロスオーバー事象およびｒｅｐＡ欠損プラスミドの切除を容易にする。ｒｅｐＡ欠損プラスミドはプラスミドの不適合性のために続けて失われる。ゲノム欠失はコロニーＰＣＲおよび配列解析によって確認され、残ったプラスミドは除去選択および引き続くＲｉｆ処理によってキュアされる。
ビフィドバクテリウム・ロングムΔＢＬ１１２２／ΔＢＬ０４９２／ΔＢＬ１１４２株におけるサルモネラ・チフィムリウムｒｃｋ(補体殺傷耐性)遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはサルモネラ・チフィムリウムｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上のＰｇａｐ等の強力な構成的プロモーターの下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ＢＬ１１２２、ＢＬ０４９２、またはＢＬ１１４２遺伝子座のいずれかにおける）によって達成される。ビフィドバクテリウム・ロングムの遺伝子は下記の通りである：
１）ｐｕｒＭ（ＢＬ１１２２）：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジン シクロ－リガーゼをコードする［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２２６６９］；
２）ａｓｄ（ＢＬ０４９２）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３０８９］；
３）ＢＬ１１４２：Ｌ－アスパラギナーゼ前駆体（Ｎｔｎ＿アスパラギナーゼ＿２＿様；ＮＴＮヒドロラーゼスーパーファミリーの２型Ｌ－アスパラギナーゼ様酵素）をコードする［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３１２０］；および
４）ＢＬ１３６３ ｇａｐ（プロモーター）［ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２２８２８］
ビフィドバクテリウム・ロングムは非運動性でフラゲリンを失っており、グラム陽性でｍｓｂＢおよびｐａｇＰを失っている。ａｎｓＢ遺伝子は存在するが、アスパルテートからのフマレートの形成を触媒するアスパルテートアンモニアリアーゼをコードする（ａｓｐＡ／ａｎｓＢ）［ＢＬ０３３８、ビフィドバクテリウム・ロングム株ＮＣＣ２７０５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３２５９］。
クロストリジウム・ノヴィイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）
クロストリジウムにおけるＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５（ａｓｄ）；フラゲリン遺伝子ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５；ならびに鞭毛性基底体ロッドタンパク質遺伝子ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０（ｆｌｇＢ）、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５（ｆｌｇＣ）、およびＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５（ｆｌｇＧ）のインフレーム染色体欠失は、トキシン－アンチトキシン系を含むカウンターセレクション法を必要とする対立遺伝子交換手法によって達成することができ、これは誘起可能なプロモーターおよび大腸菌ｍＲＮＡインターフェラーゼｍａｚＦ等の毒性遺伝子を必要とする。それぞれの標的遺伝子の５’および３’隣接配列が特定され、対立遺伝子交換カウンターセレクション含有ベクター中のｆｒｔ隣接抗生物質耐性カセットの反対側の配置においてクローニングされ、クロストリジウム・ノヴィイ中に形質転換される。ｍａｚＦ遺伝子は対立遺伝子交換交換ベクター上の誘起可能なｌａｃプロモーターの制御下でコードされており、ラクトース添加寒天プレート上の増殖による二重クロスオーバー事象の選択を可能にする。ゲノム欠失は、コロニーＰＣＲおよび配列解析によって確認される。次いでＦｌｐ－ｆｒｔ組換えを使用して染色体から抗生物質耐性カセットをキュアすることができる。
クロストリジウム・ノヴィイΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５／ΔＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５株におけるサルモネラ・チフィムリウムｒｃｋ(補体殺傷耐性)遺伝子、エルシニア・エンテロコリチカホモログａｉｌ、またはサルモネラ・チフィムリウムｐｇｔＥ遺伝子の発現は、プラスミド（ａｓｄ相補性システム適合性の）上のＰｔｈｌ、Ｐｐｔｂ、またはその他の変異体等の強力な構成的プロモーターから下流のｒｃｋ、ａｉｌ、またはｐｇｔＥ遺伝子配列をコードすることによって、または細菌染色体上の挿入（ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０、ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５、またはＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５遺伝子座のいずれかにおける）によって達成される。クロストリジウム・ノヴィイの遺伝子は下記の通りである：
１）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０９７６５：ＡＩＲシンターゼをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４１５８３］；
２）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０７６２５：ホスホリボシルホルミルグリシンアミジン シクロ－リガーゼをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０６６９］；
３）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４３２５（ａｓｄ）：アスパラギン酸セミアルデヒト脱水素酵素をコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４１７６２］；
４）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９５：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４１７０３］；
５）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０４９９０：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５３９９８４］；
６）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７０：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５３９８８６］；
７）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０７５：フラゲリンをコードする［クロストリジウム・ノヴィイＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５３９６９９］；
８）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８０（ｆｌｇＢ）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＢをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０６３７］；
９）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５０８５（ｆｌｇＣ）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＣをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０１４３］；および
１０）ＮＴ０１ＣＸ＿ＲＳ０５２１５（ｆｌｇＧ）：鞭毛性基底体ロッドタンパク質ＦｌｇＧをコードする［クロストリジウム・ノヴィイ株ＮＴ；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５４０２４５］
クロストリジウム・ノヴィイはグラム陽性であり、ｍｓｂＢおよびｐａｇＰを失っている。
［実施例１７］
ヒトＳＴＩＮＧより強いＩ型ＩＦＮシグナル伝達および／または弱いＮＦ－κＢシグナル伝達を誘起する脊椎動物ＳＴＩＮＧ変異体を発現するように改変された免疫刺激細菌
ＳＴＩＮＧシグナル伝達は２つのシグナル伝達経路を活性化する。第１はＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）／ＩＲＦ３アクシスであり、Ｉ型ＩＦＮの誘起、ならびに樹状細胞（ＤＣ）の活性化および腫瘍抗原の交差提示をもたらし、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫を活性化する。第２は活性化されたＢ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達アクシスであり、炎症促進性応答をもたらすが、抗腫瘍免疫に必要なＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらさない。細菌に基づくがん免疫治療は、Ｉ型ＩＦＮを誘起して腫瘍抗原交差提示および恒久的な抗腫瘍免疫を促進するために必要なＣＤ８＋Ｔ細胞を動員し活性化する能力に限界がある。したがって、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を誘起および／または増大し、かつ低減したＮＦ－κＢシグナル伝達を有し、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫の誘起を増大し、細菌の治療有効性を増強する免疫刺激細菌が本明細書で提供される。上記の免疫刺激細菌は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を野生型ＳＴＩＮＧと比較して増大させることができるか、またはＩ型ＩＦＮの発現を構成的にすることができるＳＴＩＮＧの機能獲得型突然変異体である改変されたＳＴＩＮＧタンパク質をコードする。本実施例（およびまた詳細な説明に記載された）では、ＳＴＩＮＧタンパク質はＮＦ－κＢシグナル伝達活性を低減しまたは無くし、Ｉ型ＩＦＮを誘起する能力を保持するように改変され、および／または増大したもしくは構成的なＩ型ＩＦＮの発現のために改変される。これは、抗腫瘍免疫を誘起し、通常では細菌病原体による感染に起因するＮＦ－κＢシグナル伝達を誘起しない（または誘起が少ない）免疫刺激細菌をもたらす。
種々の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質は、様々なレベルのＩ型ＩＦＮおよびＮＫ－κＢシグナル伝達活性を呈する。例えば、ヒトおよびマウスの細胞におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達は、強いＩ型ＩＦＮ応答および弱い炎症促進性ＮＦ－κＢ応答をもたらす。サケおよびゼブラフィッシュ等の条鰭魚類におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達は対照的に、一次的にＮＦ－κＢに推進される応答の強固な活性化を示し、これはＩＲＦ－３によって推進される（即ちＩ型ＩＦＮ誘起性の）応答と比較して１００倍を超えて大きい。タスマニアンデビル等の他の種では、ＳＴＩＮＧシグナル伝達はＩ型ＩＦＮ応答をもたらすが、本質的にＮＦ－κＢ応答をもたらさない。本明細書で提供する免疫刺激細菌は、随伴するＮＦ－κＢ応答の誘起なしにＩ型ＩＦＮ応答を誘起するＳＴＩＮＧの能力を活用するためにタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ等の非ヒト種由来のＳＴＩＮＧをコードしている。本明細書に記載したように、これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質はまた、Ｉ型ＩＦＮ応答を増大するか、またはこれを構成的にする突然変異によって改変される。ヒトＳＴＩＮＧにおいてこの効果を有する特定された突然変異が非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質に導入される。対応する残基はアラインメントによって特定される。
ＳＴＩＮＧのＣ末端鎖(tail)（ＣＴＴ）が１つの種、例えばヒトにおいて、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性を殆どまたは全く示さない第２（例えば非ヒト）の種のＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣＴＴに置き換えられるキメラも提供される。ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧのリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要な配列モチーフを含むほぼ４０アミノ酸の無構造の並びである。これはＩ型ＩＦＮとＮＦ－κＢのシグナル伝達との間のバランスを変化させることによって、下流の免疫を形作ることができる。これはＩＲＦ３、ＴＢＫ１、およびＴＲＡＦ６結合モジュールを含むＣＴＴにおける独立のモジュールを通して制御される。例えば、ヒトＳＴＩＮＧの残基Ｓ３６６（例えば配列番号３０５～３０９を参照）は、ＩＲＦ３の結合のために必要なＣＴＴにおけるＬｘＩＳモチーフの一部である一次ＴＢＫ１リン酸化部位であり、一方、残基Ｌ３７４を含む第２のＰｘＰＬＲモチーフはＴＢＫ１の結合のために必要である。ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲモチーフは全ての脊椎動物ＳＴＩＮＧ対立遺伝子において高度に保存されている。ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴを例えばタスマニアンデビルのＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えると、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘起するがＮＦ－κＢ応答を誘起しないＳＴＩＮＧ変異体が産生される。
本実施例では、免疫刺激細菌が、野生型（ＷＴ）ヒトＳＴＩＮＧ（例えば配列番号３０５～３０９を参照）と比較して増大したＩ型ＩＦＮシグナル伝達および／または低減されたＮＦ－κＢシグナル伝達を有するＳＴＩＮＧ変異体を発現するように操作される。ＳＴＩＮＧ変異体は非ヒト脊椎動物、例えば哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、または魚類の種由来であってよい。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が誘導される種には、それだけに限らないが、タスマニアンデビル［サルコフィルス・ハリシイ（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ）；配列番号３４９］、マーモセット［カリスリックス・ジャクス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）；配列番号３５９］、ウシ［ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）；配列番号３６０］、ネコ［フェリス・カツス（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）；配列番号３５６］,ダチョウ［ストルチオ・カメルス・オーストラリス（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）；配列番号３６１］,トキ［ニッポニア・ニッポン（Ｎｉｐｐｏｎｉａ ｎｉｐｐｏｎ）；配列番号３６２］、シーラカンス［ラチメリア・チャルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ）；配列番号３６３～３６４］、イノシシ［スス・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）；配列番号３６５］、コウモリ［ロウセツス・エジプチアクス（Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ）；配列番号３６６］、マナティー［トリケクス・マナツス・ラチロストリス（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ）；配列番号３６７］、ギンザメ［カロリンクス・ミリイ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ）；配列番号３６８］、およびマウス［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；配列番号３６９］が含まれる。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質はヒト細胞中で免疫シグナル伝達を容易に活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物において共有されていることを示している（例えばde Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175を参照）。これらの種由来のＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトＳＴＩＮＧより少ないＮＦ－κＢシグナル活性化および／またはこれより多いＩ型ＩＦＮシグナル活性化を誘起する（例えばde Oliveira Mann et al. (2019), Fig. 1Aを参照）。様々な非ヒト種由来の野生型または改変されたＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトおよび非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質のキメラと同様に、本明細書の免疫刺激細菌によって発現することができる。
種々の非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、非ヒトＳＴＩＮＧがヒトＳＴＩＮＧより低いＮＦ－κＢ活性化を有し、より高いＩ型インターフェロン活性化を有してもよいように改変される。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、細胞質核酸リガンド（例えばＣＤＮ）の不在下にＩ型ＩＦＮ活性が増大するか構成的に作用するような突然変異を含むように改変される。突然変異は、典型的にはヒトにおけるインターフェロン血症に付随する機能獲得型突然変異等のアミノ酸の突然変異である。対応する突然変異が非ヒト種のＳＴＩＮＧタンパク質に導入され、ここで対応するアミノ酸残基がアラインメントによって特定される。例えば、突然変異には、それだけに限らないが、配列番号３０５～３０９で表されるヒトＳＴＩＮＧの配列を参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａが含まれる。他の種由来のＳＴＩＮＧにおける対応する突然変異を下表に列挙する。得られる非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の変異体には、これらの突然変異の１つまたは複数が含まれ、ＣＴＴの置換およびＴＲＡＦ６結合部位の欠失が含まれてもよい。
ＳＴＩＮＧ変異体には、ホスホリル化部位におけるアミノ酸セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるリン酸化模倣である１つまたは複数の置換が含まれ、それにより増大したまたは構成的な活性がもたらされる。その他の突然変異には、ＳＴＩＮＧにおける３２４～３２６ ＳＬＳ→ＡＬＡ等のリン酸化部位の欠失または置換、およびリン酸化部位を無くしてＳＴＩＮＧにおけるＮＦ－κＢシグナル伝達を低減させるその他の置換が含まれる。さらに、ヒトＳＴＩＮＧの他の種由来のＳＴＩＮＧによるキメラも提供され、ここではヒトＳＴＩＮＧのＣ末端鎖（ＣＴＴ）が、より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性および／またはより高いＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有する別の種由来のＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられている。変異体ＳＴＩＮＧタンパク質は、ＮＦ－κＢシグナル伝達を低減させるためにＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位に欠失を含んでもよい。
Figure 2023501539000048

Figure 2023501539000049
Figure 2023501539000050

Figure 2023501539000051
例えば、改変されたＳＴＩＮＧ変異体には、突然変異Ｃ２０６Ｙ（配列番号３５０）またはＲ２８４Ｇ（配列番号３５１）を有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられる変異体（配列番号３５２）、突然変異Ｃ２０６Ｙ（配列番号３５３）またはＲ２８４Ｇ（配列番号３５４）を有し、ＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられるヒトＳＴＩＮＧ、ＴＲＡＦ６結合ドメイン［残基３７７～３７９（ＤＦＳ）に対応］に欠失を有する野生型ヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３５５）、突然変異Ｃ２０５Ｙ（配列番号３５７）またはＲ２８３Ｇ（配列番号３５８）を有するネコＳＴＩＮＧ、およびその他のそのような改変されたＳＴＩＮＧ変異体が含まれる。
ＳＴＩＮＧ突然変異のための対応するアミノ酸残基を決定するため、種々の非ヒト種由来の野生型ＳＴＩＮＧタンパク質の配列をそれぞれ野生型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の配列［配列番号３０５（Ｒ２３２対立遺伝子）または配列番号３０６（Ｈ２３２対立遺伝子）の対立遺伝子変異体の］とアラインさせた。アラインメントは、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｋａｌｉｇｎ／から入手可能のＫａｌｉｇｎ配列アラインメントツール、またはｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／から入手可能のＥＭＢＯＳＳニードル配列アラインメントツールを使用して実施した。図１～１３に、それぞれタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、トキ、シーラカンス、ゼブラフィッシュ、イノシシ、コウモリ、マナティー、ギンザメ、およびマウス種由来のＳＴＩＮＧタンパク質と比較したヒトＳＴＩＮＧの例示的な配列アラインメントを図示する。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッド変異体は樹状細胞において有意に増強されたＩ型インターフェロンとＮＦ－κＢ活性との比を示す
マウスにおいて最大レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞ケモカインＣＸＣＬ１０を誘発する最適のＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体を決定するため、ＳＴＩＮＧ突然変異体のパネルをマウス初代骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）において試験した。これらには、構成的ヒトＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙ（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ；配列番号３５０）またはＲ２８４Ｇ（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ；配列番号３５１）を有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ、構成的ＧＯＦ突然変異体Ｃ２０５Ｙ（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ；配列番号３９９）またはＲ２８３Ｇ（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ；配列番号４００）を有するマウスＳＴＩＮＧ、構成的ＧＯＦ突然変異体Ｃ２０５Ｙ（ｃａｔＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ；配列番号３５７）またはＲ２８３Ｇ（ｃａｔＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ；配列番号３５８）を有するネコＳＴＩＮＧ、ならびにヒトＳＴＩＮＧ（配列番号３７０）のＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ（配列番号３７１）のＣＴＴに置き換えられ、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ ｔａｚＣＴＴ、例えば配列番号３５２を参照）、またはヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ ｔａｚＣＴＴ、例えば配列番号３５３を参照）もしくはＲ２８４Ｇ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ、例えば配列番号３５４を参照)を含む変異体が含まれていた。構成的なＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ）またはＲ２８４Ｇ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）を有するヒトＳＴＩＮＧ変異体も含まれていた。
これらを試験するため、マウス骨髄を単離して１．５ｍＬのエッペンドルフ管に流し込み、１２００ＲＰＭで５分遠心分離して、骨髄性細胞を収集した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳにて１回洗浄し、次いで２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中で９６ウェルのＴＣ処理したプレートに播種した。２日ごとに培地の半分を新鮮な完全培地に交換した。６日後、非付着細胞をウェルからピペットで除き、トランスフェクションのためにＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ中、１ウェルあたり１ｅ５細胞で９６ウェルプレートに再播種した。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤを使用し、メーカーの使用説明書に従って細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のパネルからの２００ｎｇのプラスミドＤＮＡならびにトランスフェクトしていない対照を、提供された緩衝液で希釈して０．０８μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合し、室温で１５分インキュベートして、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定で）、プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。４８時間で上清を収穫して、フローサイトメトリーに基づくサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用してメーカーのプロトコールに従ってマウスＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）についてアッセイした。
下表に示すように、マウスＣＸＣＬ１０の最大の発現を誘起したコンストラクトは、ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含み、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴによる置換を含むヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）であった。ＣＸＣＬ１０の２番目に大きい発現は、ＧＯＦ突然変異Ｃ２０６Ｙを含むヒトＳＴＩＮＧ変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ）およびヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含むタスマニアンデビルＳＴＩＮＧコンストラクト（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）によって誘起された。ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６ＹおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）は、対応するマウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体（それぞれｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５ＹおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）より強力であり、これらは初代マウス樹状細胞において同じＧＯＦ突然変異を含むネコＳＴＩＮＧ突然変異体（それぞれｃａｔＳＴＩＮＧ Ｃ２０５ＹおよびｃａｔＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ）よりも弱かった。
Figure 2023501539000052
これらのデータは、タスマニアンデビル等の他の種から得られたＳＴＩＮＧタンパク質を構成的なＧＯＦヒトＳＴＩＮＧ突然変異と組み合わせて、強力なＴ細胞動員ケモカインを誘発することができることを実証している。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッド変異体はヒト単球において有意に増強されたＩ型インターフェロンとＮＦ－κＢ活性との比を示す
他の種由来のＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッド変異体を使用してＳＴＩＮＧ誘起I型インターフェロンとＮＦ－κＢのシグナル伝達との比を変化させることができることを実証するため、ヒト単球細胞系においてパネルを試験した。パネルには、野生型ヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ）および構成的ヒトＧＯＦ突然変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するｈｕＳＴＩＮＧ突然変異体、野生型タスマニアンデビルＳＴＩＮＧ（ｔａｚＳＴＩＮＧ）および構成的ＧＯＦ突然変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するｔａｚＳＴＩＮＧ突然変異体、野生型ネコＳＴＩＮＧおよび構成的ＧＯＦ突然変異Ｃ２０５またはＲ２８３Ｇを有するネコＳＴＩＮＧ突然変異体、構成的ＧＯＦ突然変異Ｃ２０５ＹまたはＲ２８３Ｇを有するマウスＳＴＩＮＧ突然変異体、およびヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられ、野生型ヒトＳＴＩＮＧまたはヒトＧＯＦ ＳＴＩＮＧ突然変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを含む変異体が含まれていた。ＴＲＡＦ６結合ドメインに欠失を有する野生型ヒトＳＴＩＮＧ（残基３７７～３７９、ＤＦＳに対応、例えば配列番号３５５を参照）および野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧも含まれていた。
この実験のため、内因性ＳＴＩＮＧを失うように、また内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下にあって分泌型ルシフェラーゼであるＬｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼを発現するように変更されたＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）ＫＯ ＳＴＩＮＧ細胞を利用した。次いで構成的に活性なＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体を特定し、ＩＦＮ－βプロモーターによって誘起されるルシフェラーゼ活性の発現の測定によってランク付けした。これらの細胞は、内因性ＮＦ－κＢプロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）も発現し、ここでＮＦ－κＢのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体によって誘起されるＮＦ－κＢの活性は、細胞上清中のＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価することができる。
この実験のため、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤを使用し、メーカーの使用説明書に従ってＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）ＫＯ ＳＴＩＮＧ細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異体のパネル由来の２００ｎｇのプラスミドＤＮＡならびにトランスフェクトしていない対照を提供された緩衝液にて希釈し、０．０８μＬのＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤと混合して室温で１５分インキュベートし、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）複合体を形成させた。次いでＤＮＡ／Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと加え（二重測定）、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。さらに、野生型ＳＴＩＮＧ変異体をＳＴＩＮＧアゴニストである３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（ＣＤＮ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（臨床用化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログ）ありまたはなしで処理し、これを１０μｇ／ｍＬで２４時間のインキュベーションの後に細胞に加えた。４８時間で上清を収穫し、メーカーのプロトコールに従ってＮＦ－κＢ－ＳＥＡＰおよびＩＦＮ－Ｌｕｃｉａレポーターシグナルについてアッセイした。簡単に述べると、１０μＬの細胞培養上清を５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（これはＳＥＡＰの測定に使用する）に加えた。ＮＦ－κＢの活性化は、ＮＦ－κＢ誘起ＳＥＡＰ活性をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で６５０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定することによって決定した。ＩＦＮ－ＬｕｃｉａからのＩ型インターフェロンの活性を測定するため、１０μＬの細胞培養上清を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３照度計を使用して定量される光シグナルを発するルシフェラーゼ反応のコエレンテラジン基質を含む５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）に加え、相対的光単位（ＲＬＵ）として表した。
下表に示すように、最大のI型ＩＦＮ応答は、ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられ、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含む変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）から、ならびにＣＤＮ ＳＴＩＮＧアゴニストを含む野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ（ｚｆＳＴＩＮＧ ＷＴ＋ＣＤＮ）から観察された。しかし、極めて高いＮＦ－κＢシグナル伝達を有していた野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧと異なり、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体は高いＩ型ＩＦＮシグナル伝達とはるかに低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性とを有していた。より高いI型ＩＦＮとより低いＮＦ－κＢシグナル伝達との最良の比は、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４Ｇを含むタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ変異体（ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ）で見出された。
Figure 2023501539000053

SD = 標準偏差
これらのデータは、ヒト単球において免疫抑制性ＮＦ－κＢ活性を最小化しながら有益なＩ型インターフェロン活性を増強するために、タスマニアンデビル由来のＳＴＩＮＧタンパク質等の非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質を使用し、これらをヒト構成的機能獲得型ＳＴＩＮＧ突然変異と組み合わせることをさらに実証している。
［実施例１８］
ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子の欠失によるサルモネラ・チフィムリウムリポタンパク質のノックアウト
膜表面リポタンパク質を除去するため、Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ遺伝子欠失を含む生存弱毒化サルモネラ・チフィムリウムＹＳ１６４６株を、ｌｐｐＡ（配列番号３８７）およびｌｐｐＢ（配列番号３８８）遺伝子を欠失するように操作した。これにより炎症促進性ＴＬＲ２活性化が低減し、これが免疫抑制性サイトカインを低減し、抗腫瘍適応免疫を改善する。以下に示すように、これは腫瘍におけるプラスミドデリバリーおよびコードされたタンパク質発現も増強する。
株の操作および特徴解析
ｌｐｐＡ遺伝子の欠失
上に詳細に記載したように、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)］の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株の染色体からｌｐｐＡを欠失させた。ｌｐｐＡ遺伝子に隣接する左手および右手の配列のそれぞれ２３１塩基および２００塩基を含む合成のｌｐｐＡ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１４８（配列番号２３１）と呼ばれるプラスミドにクローニングした。ｌｐｐＡ遺伝子の配列を配列番号３８７に示す。遺伝子配列を使用して、ＰＣＲ増幅のために適切なプライマーを設計した。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１４８にクローニングし、次いでｌｐｐＡ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｌｐｐＡ－１およびｌｐｐＡ－２によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、次いで温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔した細胞をＳＯＣ＋ＤＡＰ培地中に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天プレートに播種した。コロニーを選択し、プライマーｌｐｐＡ－３およびｌｐｐＡ－４を使用するＰＣＲによってノックアウト断片の挿入についてスクリーニングした。次いで選択したカナマイシン耐性株を４２℃で培養し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングすることによって、ｐＫＤ４６をキュアした。次いでＣｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド（ｐＪＷ１６８）の電気穿孔によってカナマイシン耐性マーカーをキュアし、ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した。続いて培養物を４２℃で増殖させることによって、ｐＪＷ１６８を無くした。次いで選択したｌｐｐＡノックアウトクローンを、破壊部位に隣接するプライマー（ｌｐｐＡ－３およびｌｐｐＡ－４）を使用してＰＣＲによってカナマイシンマーカーの喪失について試験し、電気泳動における移動性の評価をアガロースゲルにて実施した。株ＹＳ１６４６のこの突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡと命名した。
ｌｐｐＢ遺伝子の欠失
次いで上記の方法の改変を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ｌｐｐＡ株においてｌｐｐＢを欠失させた。ｌｐｐＢ遺伝子に隣接する左手および右手の配列のそれぞれ２２４塩基および２３１塩基を含む合成のｌｐｐＢ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１４８（配列番号２３１）と呼ばれるプラスミドにクローニングした。ｌｐｐＢ遺伝子の配列を配列番号３８８に示す。遺伝子配列を使用して、ＰＣＲ増幅のために適切なプライマーを設計した。次いでｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをプラスミドｐＳＬ０１４８にクローニングし、ｌｐｐＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｌｐｐＢ－５およびｌｐｐＢ－６によってＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ｌｐｐＡに電気穿孔によって導入した。次いでカナマイシン耐性遺伝子を、上記のようにＣｒｅ媒介組換えによってキュアし、温度感受性プラスミドを非許容的温度での増殖によってキュアした。ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子ノックアウト配列を、それぞれｌｐｐＡ－３およびｌｐｐＡ－４ならびにｌｐｐＢ－７およびｌｐｐＢ－８と命名したプライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。株ＹＳ１６４６のこの突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢと命名し、またはニックネームをＹＳ１６４６ΔｌｐｐＡＢとした。
操作したサルモネラ・チフィムリウムリポタンパク質ノックアウト株のインビトロ特徴解析
ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢの欠失を有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株を、ＬＢ中の一夜培養による増殖について評価した。増殖はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、３７℃で１５分ごとにＯＤ６００を読み取って測定した。結果は、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢがＬＢ中で親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株と同程度の増殖速度にて複製できることを実証した。これらの結果は、リポタンパク質の排除がインビトロでサルモネラ・チフィムリウムの適合性を低下させないことを実証している。
リポタンパク質の欠失は全身投与後のプラスミドの腫瘍へのデリバリーを増強する。
ＴＬＲ２は血管内皮細胞において発現され、ＴＬＲ２の活性化は血管の透過性を増強するので、腫瘍のコロニー形成に対するΔｌｐｐＡＢおよび引き続くＴＬＲ２アゴニスムの低減の影響を評価した。ペイロードの発現に対する効果も評価した。以下に示すように、全身投与後、腫瘍のコロニー形成はやや低下したが、プラスミドデリバリーおよびコードされた遺伝子の発現は有意に増大した。
トリプルネガティブ乳がんのマウスモデルにおけるリポタンパク質ノックアウト株の影響を実証するため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス４匹）の４番目の乳腺脂肪体に、ＥＭＴ６細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を同所接種した。１０日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、それぞれ分泌される［ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）］ルシフェラーゼタンパク質［ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）ルシフェラーゼ、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ］をＣＭＶプロモーターの制御下にコードするプラスミドを含む単一用量の１×１０７ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株、または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株をＩＶ注射した。ＩＶ投薬後７日目にマウスを安楽死させ、腫瘍をホモジナイズしてＬＢプレートに播種し、腫瘍組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は腫瘍組織１ｇあたり平均３．３×１０６ＣＦＵで腫瘍をコロニー形成した一方、リポタンパク質を欠失したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株は平均１．１８×１０６ＣＦＵ／ｇ腫瘍組織と、約２分の１に減少した腫瘍をコロニー形成した。
腫瘍へのプラスミドデリバリー、およびそれに続く異種遺伝子発現およびタンパク質分泌を測定するため、ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性を測定した。このため、ホモジナイズした腫瘍をＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ／Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の読み取りを使用してルシフェラーゼ活性について評価した。親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は平均発光相対光単位（ＲＬＵ）４４８２．６を誘起した一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株はほぼ１０倍に増大した平均３３，９２６．６ＲＬＵを誘起した。これらのデータは、腫瘍のコロニー形成を改善し、ペイロードの発現を増強するリポタンパク質欠失株の能力を実証している。
これらのデータは、リポタンパク質の欠失がＩＶ投薬の後で腫瘍のコロニー形成をやや低減させる一方、腫瘍におけるプラスミドデリバリーおよびペイロードの発現を有意に増強することを明らかにしている。これらのデータは、これらの遺伝子の欠失がコロニー形成を低下させるという当技術からの予想と逆に、リポタンパク質の欠失が腫瘍微小環境中で、および腫瘍中で、プラスミドデリバリーおよびタンパク質の発現を増強することを実証している。
［実施例１９］
切り詰められた細胞質ドメインを有するヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬは野生型４－１ＢＢＬと同様に発現される
本明細書で論じるように、細胞質ドメインを失った共刺激性分子４－１ＢＢＬの変異体（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）は、この分子の細胞質ドメインを通して生じる免疫抑制性の逆シグナル伝達なしに、４－１ＢＢＬの活性化を増強する。実施例９で、マウス４－１ＢＢＬΔｃｙｔがヒト細胞の表面にて発現できることが示されている。以下に示すように、細胞質ドメインを完全に失った４－１ＢＢＬ変異体はほとんど発現しない。これに対処するため、細胞質ドメインが切り詰められ、それにより免疫抑制性逆シグナル伝達が無くされた４－１ＢＢＬの変異体が提供される。
完全長のヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬは細胞質ドメインの中に陽電荷を含み、これはタンパク質のＮ末端に存在する。これはＮ末端が細胞質の中に位置するために有利であり、膜貫通ドメインの、したがって細胞外ドメインの適正な配向を可能にする。したがって完全長のヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬが高レベルで発現する。４－１ＢＢＬΔｃｙｔ変異体を生成するヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬからの完全な細胞質ドメインの欠失に際しては、Ｎ末端における陽電荷が除去され、Ｎ末端が細胞の外に位置するために有利になる。これは、膜貫通ドメイン（これは今ではＮ末端にある）の正しくない配向および細胞表面に発現される４－１ＢＢＬΔｃｙｔ変異体の「裏返しの」構成をもたらす。したがって４－１ＢＢＬΔｃｙｔ変異体は完全長の４－１ＢＢＬタンパク質よりはるかに低いレベルにて発現する。
免疫抑制性の逆シグナル伝達を誘起せずに４－１ＢＢＬの発現を改善するため、ヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬ変異体を、細胞質ドメインの完全な欠失よりむしろ細胞質ドメインに切り詰めを有するように合理的に設計した。切り詰められた細胞質ドメインを有するヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬ変異体は、それぞれ細胞質ドメインの最後の４つ（ＲＶＬＰ）および最後の５つ（ＳＲＨＰＫ）のアミノ酸残基を含み、これらは膜貫通ドメインに隣接している。これは陽荷電した残基をＮ末端に戻して再導入し、これが細胞の内部に位置することを有利にし、膜貫通ドメインの配向および「裏返し」の構成を補正する。これは、４－１ＢＢＬΔｃｙｔ変異体の発現と比較して切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ変異体の発現の増大をもたらす一方、それでもタンパク質の細胞質ドメインを通して生じる免疫抑制性の逆シグナル伝達を抑制する。
さらに、Ｍｙｃタグの付加はＮ末端が切り詰められた細胞質ドメインに追加の陽性残基を付加し、裏返しのコンフィギュレーションを補正してタンパク質発現を増大させるであろうとの仮説により、切り詰められた細胞質ドメインおよびＮ末端に付加されたＭｙｃタグを有するヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬの変異体を生成させた。
完全長のヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬタンパク質、ならびに部分的に切り詰められた細胞質ドメインを有する変異体（ＣｙｔＴｒｕｎｃ）、および欠失した細胞質ドメイン（Δｃｙｔ）の配列を下表に示す。細胞質ドメインは太字で示し、下線を付している。膜貫通領域は太字で示している。細胞外領域は下線を付している。Ｍｙｃタグは二重下線を付している。
完全長のヒトおよびマウスの4-1BBLおよび切り詰められまたは欠失した細胞質ドメインを有する変異体の配列
Figure 2023501539000054

Figure 2023501539000055
操作された４－１ＢＢＬ変異体の発現レベルを完全長の４－１ＢＢＬタンパク質の発現レベルと比較するため、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、適正な試薬：ＤＮＡ比にて、トランスフェクトしていない細胞を陰性対照として、完全長のタンパク質または変異体をコードする５００ｎｇのＤＮＡでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収穫し、必要に応じて抗マウス４－１ＢＢＬまたは抗ヒト４－１ＢＢＬ抗体にて染色した。マウス４－１ＢＢＬの染色はマウス４－１ＢＢＬに対するビオチン化抗体（クローンＴＫＳ－１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびそれに続くストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して実施した。ヒト４－１ＢＢＬの染色はヒト４－１ＢＢＬに対するＡＰＣコンジュゲート抗体（クローン５Ｆ４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して実施した。トランスフェクトしていない細胞も、バックグラウンド蛍光を測定するために染色した。膜結合４－１ＢＢＬの発現をフローサイトメトリーによって測定し、結果はバックグラウンドを差し引いた平均蛍光強度（ｄＭＦＩ）［即ち試料のＭＦＩから陰性対照（トランスフェクトしていない細胞を染色）のＭＦＩを差し引くことによる］の観点で提供する。
下表に示すように、ヒトおよびマウスの４－１ＢＢＬの両方について、切り詰められた細胞質ドメインを有する変異体の発現は、細胞質ドメインの完全な欠失を有する変異体の発現より有意に高かった。切り詰められた細胞質ドメインを有するヒト４－１ＢＢＬ変異体は完全長の細胞質ドメインを失っているにも関わらず、完全長のヒト４－１ＢＢＬの発現のレベルの９３％にて発現した一方、完全な細胞質ドメインの欠失を有するヒト４－１ＢＢＬ変異体は完全長のヒト４－１ＢＢＬの発現のレベルの４２％にて発現した。相同のマウス４－１ＢＢＬについては、切り詰められた細胞質ドメインを有する変異体は完全長のマウス４－１ＢＢＬの発現のレベルの６３％にて発現した一方、完全な細胞質ドメインの欠失を有する変異体は完全長のマウス４－１ＢＢＬの発現のレベルの１３％にて発現した。
４－１ＢＢＬの切り詰められた細胞質部分にさらなる陽性アミノ酸残基を付加することによって発現レベルを増大するかを決定するため、切り詰められたマウスおよびヒトの４－１ＢＢＬ変異体のそれぞれについてＭｙｃタグとのコンストラクトを試験した。しかし下表に示すように、切り詰められた細胞質ドメインを有する変異体へのＭｙｃタグの付加は、切り詰められた細胞質ドメインを有しＭｙｃタグを有しない変異体と比較した場合、発現を低下させた。Ｍｙｃタグが発現を低減させる理由は明らかでないが、Ｍｙｃタグの付加は潜在的に４－１ＢＢＬの発現には最適でない配列をもたらし得る。
切り詰められまたは欠失した細胞質ドメインを有するヒト4-1BBL変異体の発現レベル
Figure 2023501539000056
切り詰められまたは欠失した細胞質ドメインを有するマウス4-1BBL変異体の発現レベル
Figure 2023501539000057

［実施例２０］
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖと比較してＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４およびＣＤ８６／ＣＴＬＡ－４相互作用の優れた封鎖を示す
イピリムマブのアミノ酸配列を使用して、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的なｓｃＦｖ－Ｆｃ（核酸およびタンパク質の配列についてそれぞれ配列番号４０１および４０２を参照）を設計した。イピリムマブはヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する完全にヒトのＩｇＧ１κモノクローナル抗体であり（例えば米国特許出願公開第２００２／００８６０１４号および米国特許第６，９８４，７２０号において１０Ｄ１と命名された抗体を参照）、ＣＴＬＡ－４‘のＣＤ８０（Ｂ７．１またはＢ７－１としても知られている）およびＣＤ８６（Ｂ７．２またはＢ７－２としても知られている）との免疫阻害性相互作用をブロックする。
イピリムマブｓｃＦｖ抗体断片（配列番号４０３を参照）を生成するため、イピリムマブの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を２０アミノ酸長さのグリシン－セリン（ＧＳ）リンカー［ＧＧＧＧＳ）４］に連結した。ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片（配列番号４０２を参照）を生成するため、イピリムマブｓｃＦｖの可変重鎖を、ヒンジ領域の遊離のシステインのセリンへの突然変異（配列番号４０２の２７２位における）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃに連結した。リーダー配列（ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ；配列番号４０２の残基１～２０に対応)は、ヒト免疫グロブリンカッパ可変３～２０（ＩＧＫＶ３－２０）タンパク質の配列から誘導した。配列はＧｅｎＳｃｒｉｐ ＧｅｎＳｍａｒｔ（商標）Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツールを使用してコドン最適化した。
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃの中和能力を、抗体断片のそれぞれのＣＴＬＡ－４とそのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用をブロックする能力を測定する競合的ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ(ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分を欠く)の中和能力と比較した。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、適正な試薬：ＤＮＡ比にて、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ抗体断片コンストラクトをコードする３μｇのＤＮＡによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含まない培養上清を収穫し、濾過し、抗ＣＴＬＡ－４抗体断片の封鎖活性を評価する競合的ＥＬＩＳＡに使用した。
競合的ＥＬＩＳＡのため、高タンパク質結合性９６ウェルプレートを濃度１００ｎｇ／ｍｌのマウスＣＤ８０またはＣＤ８６組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を一夜、４℃でコートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて１回洗浄し、ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて室温で、１時間ブロックした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて１回洗浄した。抗ＣＴＬＡ－４抗体断片のそれぞれを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清を１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＣＴＬＡ－４－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合してウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１抗体をウェルに加え(Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０にて３回洗浄し、検出試薬［３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］をウェルに加えた。硫酸（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて酵素反応を停止し、光学密度を４５０ｎｍで読み取った。
競合的ＥＬＩＳＡの結果を下表にまとめる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－ＦｃはＣＴＬＡ－４のＣＤ８６への結合を７５．５％ブロックし、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０への結合を４０．６％ブロックした一方、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖはＣＴＬＡ－４のＣＤ８６への結合を３２．５％ブロックし、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０への結合を７％ブロックした。両方の抗体断片にてより高度のＣＤ８６／ＣＴＬＡ－４ブロッキング活性（ＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４ブロッキング活性と比較して）が観察され、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃにて抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖと比較した場合、優れた中和活性が観察された。
競合的ELISAの結果
Figure 2023501539000058
本明細書で提供する免疫刺激細菌の中には、本明細書で提供する抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ抗体断片および抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体断片を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体およびその断片をプラスミド上でコードする免疫刺激細菌、ならびに他の治療用産物をコードする核酸分子との組合せが含まれる。
［実施例２１］
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤはインビボで食細胞性骨髄性免疫細胞コンパートメンに限局されている。
上で示したように、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧは非食細胞性細胞取り込みを欠いている（実施例４を参照）。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤも非食細胞性細胞取り込みを欠いていることを確認するため、細菌性ｒｐｓＭプロモーターの下でｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）を構成的に発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株を、ＥＭＴ６同所腫瘍を有するマウスにＩＶ投与した。
この実験のため、６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたりマウス４匹）に、ＥＭＴ６細胞（ＰＢＳ１００μＬ中、２×１０５細胞）を同所移植した。定着した大きな側腹部腫瘍を有するマウスに、３×１０６ＣＦＵのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍＣｈｅｒｒｙ株を１０日目にＩＶ注射した。ＩＶ投薬の８日後に腫瘍を切除し、２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１０％のＦＢＳと１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩとを含むＲＰＭＩ－１６４０）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。ナイロンメッシュを１０％のＦＢＳを含む５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０にて１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。１０％のＦＢＳを含む５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０にてナイロンメッシュを洗浄し、濾過された細胞を１０００ＲＰＭにて７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、染色プロセスの前に氷上に保存した。
フローサイトメトリー染色のため、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに１００μＬの単一細胞懸濁液を播種した。生死染色［Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ］およびＦｃブロッキング試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μＬにて加え、プレートを氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで蛍光色素コンジュゲート抗体（ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６．７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１．４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４．１５．２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５クローンＭ１／６９；全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に細胞を再懸濁し、氷上、暗所で３０分インキュベートした。３０分後に、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
結果（下表を参照）は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍＣｈｅｒｒｙ株をＩＶ注射したマウスの腫瘍において、腫瘍微小環境中の腫瘍浸潤性単球の１．９５％および腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）の３．３６％がｍＣｈｅｒｒｙの発現について陽性であった一方、ＰＢＳをＩＶ注射したマウスの腫瘍は、腫瘍浸潤性単球について０．６４％、ＴＡＮについて０．０１％のバックグラウンド染色／蛍光を示したことを実証した。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）集団の２．９２％および腫瘍浸潤性樹状細胞（ＤＣ）の４．３４％がＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んでいた一方、ＰＢＳを注射したマウスの腫瘍におけるバックグラウンド蛍光はＴＡＭおよびＤＣについてそれぞれ０．７０％および０．５０％であった。Ｍ１ ＴＡＭの２．３９％およびＭ２ ＴＡＭの０．５３％はＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍＣｈｅｒｒｙについて陽性に染色された一方、ＰＢＳを注射したマウスの腫瘍はＭ１ ＴＡＭにおいて０．２０％、Ｍ２ ＴＡＭにおいて０．５０％のバックグラウンドシグナルを有していた。対照的に、間質および腫瘍の細胞（即ち、腫瘍が存在しない免疫／骨髄性細胞）に対応するＣＤ４５－集団の中では、僅か０．０８１％がｍＣｈｅｒｒｙの発現について陽性を示した（ＰＢＳを注射したマウスのバックグラウンド染色０．００２％と比較して）。
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mCherry株をIV注射したマウスの腫瘍におけるmCherry発現の%
Figure 2023501539000059

SD = 標準偏差; DCs = 樹状細胞; TAMs = 腫瘍関連マクロファージ; TANs = 腫瘍関連好中球
PBSをIV注射したマウスの腫瘍におけるmCherry発現の%
Figure 2023501539000060

SD = 標準偏差; DCs = 樹状細胞; TAMs = 腫瘍関連マクロファージ; TANs = 腫瘍関連好中球
これらのデータは、鞭毛を無くした株からのｐａｇＰ、ａｎｓＢ、およびｃｓｇＤの欠失が、腫瘍微小環境（即ち、腫瘍常在性免疫／骨髄性細胞）の食細胞性免疫細胞コンパートメントによる細菌の取り込みの特異性に顕著には影響しないことを示している。上記および本明細書の他の場所で論じたように、上皮細胞への感染力には鞭毛およびＳＰＩ－１に対するその下流のシグナル伝達の影響が必要であり、それを失っていることは細菌の取り込みを腫瘍常在性免疫／骨髄性細胞のみに制限する。鞭毛を無くすことは、サルモネラ・チフィムリウム株を含む免疫刺激細菌に数多くの利益を与える。これらの利益には、適応免疫を抑制するＴＬＲ５誘起炎症性サイトカインを無くすこと、マクロファージのピロトーシスを低減すること、ならびに腫瘍常在性食細胞性細胞に取り込みが限局している場合の全身投与における腫瘍特異的富化を維持（または増強）することが含まれる。
鞭毛を無くした株からのｐａｇＰ、ａｎｓＢ、およびｃｓｇＤの排除は、腫瘍常在性免疫細胞による細菌の取り込みの特異性に顕著には影響せず、例えばＴＬＲ４誘起炎症促進性サイトカインを低減させること、免疫原性を低減し忍容性を増強すること（ΔｐａｇＰ）、Ｔ細胞機能を回復させること（ΔａｎｓＢ）、ならびにインビボにおけるコードされた免疫調節性タンパク質のプラスミドデリバリーを増強し、治療有効性を改善する細菌の細胞内取り込みを改善すること（ΔｃｓｇＤ）を含むさらなる利益を与えることが、本明細書で示されている。
［実施例２２］
サルモネラｐｕｒＩおよびｍｓｂＢクリーン欠失遺伝子ノックアウト株の操作および特徴解析
株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）のｐｕｒＩ遺伝子は欠失しなかった。これは１６．６ｋｂｐ(キロ塩基対)のゲノム逆転事象をもたらすトランスポゾン（Ｔｎ１０）の挿入によって破壊し、それにより引き続いてゲノム中に２つの挿入配列（ＩＳ）エレメントを、１つはｐｕｒＩ（ｐｕｒＭ）遺伝子の中に、他はａｃｒＤ遺伝子の３’末端に直接隣接する遺伝子間領域における１６．６ｋｂｐ上流に、組み込んだ。２つのＩＳエレメントの間の領域は逆転されており、ｙｆｆＢ、ＤＣ５１＿２５６８、ｕｐｐ、ｕｒａＡ、ｙｆｇＥ、ｙｆｇＤ、ＤＣ５１＿２５７３、ｐｅｒＭ、ｐｕｒＣ、およびその他を含む１８個の遺伝子を含んでいる。遺伝子間領域における挿入配列エレメントは完全に機能的なトランスポサーゼをコードしており、潜在的な遺伝子安定性の問題を表している（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。染色体のリエンゲージメントによって破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子への復帰の可能性を未解決のままにしている。
株ＹＳ１６４６のｍｓｂＢ遺伝子も完全には欠失しなかったが、ｐｙｋＡ遺伝子（ピルベートキナーゼをコードする）の伸長をもたらし、最後の５アミノ酸のコドンを１３個の新たなコドンに置き換える、遺伝子操作された５１１ｂｐ（９７２ｂｐの遺伝子の）の欠失によって破壊した（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。
ｐｕｒＩおよびｍｓｂＢ遺伝子のそれぞれの野生型遺伝子への復帰の可能性を無くすため、およびこれらの遺伝子のクリーンな欠失の効果を判定するため、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤをさらに改変して、残りのｐｕｒＩおよびｍｓｂＢ遺伝子配列断片、ならびに２つのトランスポゾン関連挿入配列エレメントおよびｐｙｋＡ遺伝子伸長を欠失させた。
ｐｕｒＩ遺伝子断片およびトランスポゾン関連挿入配列エレメントの欠失
ｙｆｆＢとｐｕｒＮ遺伝子との間に位置し、１）Broadway et. al (2014)によって得られた配列においてＤＣ５１＿２５８６と注記された１，２０９ｂｐのトランスポゾン挿入配列エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００７８０４およびＣＰ００８７４５を参照）、および２）残りの８９１ｂｐのｐｕｒＩ遺伝子断片（本明細書で大きなｐｕｒＩ遺伝子断片と称する）のうち７４０ｂｐを含む第１の領域を、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)を参照］の方法の改変を使用して欠失の標的とした。８９１ｂｐ（大きい）のｐｕｒＩ遺伝子断片のうち小さな１５１ｂｐの部分は、隣接する下流の遺伝子ｐｕｒＮ（ホスホリボシルグリシンアミド ホルミルトランスフェラーゼをコードする）への影響を避けるためにそのままとした。ＤＣ５１＿２５８６挿入配列エレメントおよび大きなｐｕｒＩ遺伝子断片のそれぞれ左手および右手の領域との相同性を有する２８４および２６２ｂｐを含むプラスミドｐＳＬ０１６５を、ＤＨ５－ａｌｐｈａコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングし、得られたベクターをｐＳＬ０１７４と命名した。次いでＤＣ５１＿２５８６挿入配列エレメントおよび大きなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウトカセットを、プライマーｐｕｒｍ－１およびｐｕｒｍ－２（それぞれ配列番号４１０および４１１、表２を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤに電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにｃｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。ＤＣ５１＿２５８６挿入配列エレメントおよび大きなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウト配列を、プライマーｐｕｒｍ－３およびｐｕｒｍ－４（それぞれ配列番号４１２および４１３、表２を参照）を使用するＰＣＲによって確認し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）と命名した。
ａｃｒＤとＤＣ５１＿２５６８遺伝子との間に位置し、１）Broadway et. al (2014)によって得られた配列においてＤＣ５１＿２５６６と注記された１，２０９ｂｐのトランスポゾン挿入配列エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００７８０４およびＣＰ００８７４５を参照）、および残りの２３１ｂｐのｐｕｒＩ遺伝子断片（本明細書で小さなｐｕｒＩ遺伝子断片と称する）を含む第２の領域を、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)を参照］の方法の改変を使用して欠失の標的とした。ＤＣ５１＿２５６６挿入配列エレメントおよび小さなｐｕｒＩ遺伝子断片のそれぞれ左手および右手の領域との相同性を有する２４１および２６５ｂｐを含むプラスミドｐＳＬ０２１０を、ＤＨ５－ａｌｐｈａコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングし、得られたベクターをｐＳＬ０２１２と命名した。次いでＤＣ５１＿２５６６挿入配列エレメントおよび小さなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウトカセットを、プライマーａｃｒｄ－１およびｐｕｒｍ－５（それぞれ配列番号４１６および４１４、表２を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）に電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにｃｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。ＤＣ５１＿２５６６挿入配列エレメントおよび小さなｐｕｒＩ遺伝子断片ノックアウト配列は、プライマーｐｕｒｍ－６およびａｃｒｄ－３（それぞれ配列番号４１５および４１７、表２を参照）を使用するＰＣＲによって確認し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｌａｒｇｅ ｃｌｅａｎ）の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）と命名した。
ｍｓｂＢ遺伝子断片の欠失およびｐｙｋＡの伸長
株ＹＳ１６４６のｍｓｂＢ遺伝子を、ｐｙｋＡ遺伝子の伸長をもたらし、最後の５アミノ酸のコドンを１３個の新たなコドンに置き換える、遺伝子操作された５１１ｂｐの欠失（９７２ｂｐの遺伝子のうち）によって破壊した（例えばBroadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178を参照）。残りのｍｓｂＢ遺伝子断片およびｐｙｋＡにおける最後の１３アミノ酸のコドンをコードする配列を含む領域を、Datsenko and Wanner［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)を参照］の方法の改変を使用して欠失の標的とした。残りのｍｓｂＢ遺伝子断片およびｐｙｋＡ遺伝子伸長のそれぞれ左手および右手の領域との相同性を有する２００および１９６ｂｐを含むプラスミドＳＬ０２０９（配列番号４０８を参照）を、ＤＨ５－ａｌｐｈａコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。ｌｏｘＰ部位に隣接されるカナマイシン遺伝子カセットをこのプラスミドにクローニングし、得られたベクターをｐＳＬ０２１１（配列番号４０９を参照）と命名した。次いでｍｓｂＢ遺伝子断片およびｐｙｋＡ遺伝子伸長ノックアウトカセットを、プライマーｍｓｂＢ－１およびｍｓｂＢ－２（それぞれ配列番号４１８および４１９、表２を参照）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）に電気穿孔によって導入した。次いで上記のようにｃｒｅ媒介組換えによってカナマイシン耐性遺伝子をキュアし、非許容性温度における増殖によって温度感受性プラスミドをキュアした。ｍｓｂＢ遺伝子断片およびｐｙｋＡ遺伝子伸長ノックアウト配列は、プライマーｍｓｂＢ－３およびｍｓｂＢ－４（それぞれ配列番号４２０および４２１、表２を参照）を使用するＰＣＲによって確認し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。得られた親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）の突然変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）と命名した。
表2.プライマー配列情報
Figure 2023501539000061

Fwd= フォワード; Rev = リバース; KO = ノックアウト
プラスミド情報
Figure 2023501539000062
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）株はブロス培地中で増強された増殖を示す
細菌ゲノム由来の残りのｐｕｒＩおよびｍｓｂＢ遺伝子断片、トランスポゾン関連挿入配列エレメント、およびｐｙｋＡ遺伝子伸長の欠失の免疫刺激細菌のインビトロ適合性に対する効果を評価するため、ＣＭＶプロモーター（ＡＤＮ－２５６と命名されたプラスミド）の制御下にｎａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）をコードする同じプラスミドを発現する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤのブロス増殖プロファイルを、ブロス増殖アッセイによって直接比較した。一夜の定常相培養物をＬＢ培地中の希釈によってＯＤ６００ｎｍ＝１に調節し、得られた正規化培養物５μＬを使用して技術的二重測定にて２５０μＬのＬＢ培地を９６ウェルのプレートに接種した。プレートを振盪しながら３７℃でインキュベートし、１６時間の経過にわたって１５分間隔にてＯＤ６００ｎｍ値をモニターした。ＯＤ６００ｎｍ値をプロットして増殖曲線を構築し、増殖のログ相の勾配を計算して各株についての倍加時間を決定した。４回の独立した増殖曲線を実施し、下表に示す結果は、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－２５６）が６７．７４分［標準偏差（ＳＤ）＝３．２１］の平均倍加時間を有していた一方、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－２５６）が６０．１３分（ＳＤ＝３．０８）の平均倍加時間を有していたことを示している。
ブロス培地における免疫刺激性細菌の増殖に対するpurIおよびmsbBのクリーンな欠失の効果
Figure 2023501539000063

SD = 標準偏差
同じプラスミド（マウス４－１ＢＢＬΔｃｙｔ、マウスＩＬ－１２ｐ７０、および改変されたヒトＳＴＩＮＧキメラタンパク質をコードするＡＤＮ－４８０）を含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）を、大きな十分に通気した振盪フラスコ条件および豊富な培地（４ＸＹＴ）中でブロス増殖について評価した。等価のＯＤ６００ｎｍ光学密度（ＯＤ）の一夜定常相培養物５０μＬを使用して、通気キャップを有する１２５ｍＬのバッフル付き振盪フラスコに１２．５ｍＬの４ＸＹＴ培地を接種し、培養物を２２５ＲＰＭにて振盪しながら３７℃でインキュベートした。１８時間の経過にわたってほぼ１時間の間隔でＯＤ６００ｎｍをモニターした。ＯＤ６００ｎｍ値をプロットして増殖曲線を構築し、増殖のログ相の勾配を計算して各株についての倍加時間を決定するために使用した。
結果は、４１．８３分の倍加時間を有していた株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－４８０）が、４８．３３分の倍加時間を有していた株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－４８０）より僅かに速く増殖し、より迅速に定常相に達したことを示した。このデータは、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）の、親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと比較して増強された増殖プロファイルを実証している。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）は２つの独立した増殖曲線アッセイ（９６ウェルプレート中のＬＢ培地、および２５０ｍＬ振盪フラスコ中の豊富な４ＸＹＴ培地）においてより速い倍加時間で増殖し、ｐｕｒＩおよびｍｓｂＢの遺伝子欠失が潜在的な遺伝子安定性の問題を軽減するだけでなく、より速い増殖および優れた適合性を可能にする代謝上の利益を与えることを示している。
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）は増強された注射用ストック細胞の生存能力を呈する
細菌ゲノム由来の残りのｐｕｒＩおよびｍｓｂＢ遺伝子断片、トランスポゾン関連挿入配列エレメント、およびｐｙｋＡ遺伝子伸長の欠失の免疫刺激細菌のインビトロ適合性に対する効果を評価するため、同じプラスミド（改変されたヒトＳＴＩＮＧキメラタンパク質をコードするＡＤＮ－５４２）を含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの細胞生存能力を、凍結された注射用ストックのための培養プロセッシングの後の生存ＣＦＵを直接比較することによって評価した。等価のＯＤ６００ｎｍ値の一夜定常相培養物１００μｌを使用して、通気キャップを有する２５０ｍｌのバッフル付き振盪フラスコに２５ｍｌの４ＸＹＴ培地を接種し、培養物を２２５ＲＰＭにて振盪しながら３７℃でほぼ６時間インキュベートした。等価のＯＤ６００ｎｍ値（株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－５４２）について１１．４、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－５４２）について１１．７）の定常相において培養物を収穫し、２回洗浄し、ＯＤ６００ｎｍ＝２に調節し、分注し、－８０℃で凍結した。翌日、各株の２つのアリコートを解凍してＯＤ６００ｎｍ値を測定し、培養物を寒天プレートに播種して力価および生存率を決定した。生存率％はＯＤ６００ｎｍとＣＦＵ／ｍｌとの比の計算によって決定した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－５４２）株注射用ストック調製物の生存率は５２％、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－５４２）株注射用ストック調製物の生存率は９６％と決定された。
このデータは、親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと比較した株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）の増強された適合性プロファイルを実証している。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）は凍結注射用ストック調製の後で増強された生存率を呈し、ｐｕｒＩおよびｍｓｂＢの遺伝子欠失が潜在的な遺伝子安定性の問題を軽減するだけでなく、細胞の生存率の増大を可能にする代謝上の利益を与えることを示している。
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）は腫瘍微小環境において増強されたプラスミドペイロードデリバリーおよび異所性遺伝子発現を呈する
腫瘍微小環境におけるプラスミドデリバリーおよび引き続く異所性遺伝子発現を評価するため、マウスＩＬ－１２（ｍｕＩＬ－１２ｐ７０）（ならびにマウス４－１ＢＢＬΔＣｙｔおよび改変されたヒトＳＴＩＮＧキメラタンパク質）をコードする同じプラスミド（ＡＤＮ－４８０）を含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）を、インビボの同所性ＥＭＴ６乳癌モデルで評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０５個のＥＭＴ６細胞の同所移植を受けさせ、続いて１×１０７ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－４８０）、または株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－４８０）、またはＰＢＳを、移植の１０日後に静脈内注射した。注射の４日後にマウスを犠牲死させ、腫瘍を収穫して、逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によるマウスＩＬ－１２ｐ７０発現の解析のために処理した。
ＩＶ投薬の４日後に腫瘍を切除し、２～３ｍｍの切片に切断して、２．５ｍＬの酵素混合物（１０％のＦＢＳと１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶおよび２０μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩを含むＲＰＭＩ－１６４０）を満たしたｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に入れた。ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）特異的解離プログラム（マウス移植腫瘍）を使用して腫瘍切片を解離し、全体の細胞調製物を撹拌しながら３７℃で４５分インキュベートした。４５分のインキュベーションの後、ＯｃｔｏＭＡＣＳ（商標）（マウス移植腫瘍）プログラムを使用して第２ラウンドの解離を実施し、得られた単一細胞懸濁液を、７０μＭのナイロンメッシュを通して５０ｍＬの管の中に濾過した。ナイロンメッシュを１０％のＦＢＳを含む５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０にて１回洗浄し、２度目に新たな７０μＭのナイロンメッシュを使用して新たな５０ｍＬの管の中に細胞を濾過した。１０％のＦＢＳを含む５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０にてナイロンメッシュを洗浄し、濾過された細胞を１０００ＲＰＭにて７分、遠心分離した。得られた解離した細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、次いで２００μＬのＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）にて細胞溶解し、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ（商標）９６キットを使用してメーカーのプロトコールに従ってＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度も、Ａ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。
ｃＤＮＡの合成は、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って０．５～１μｇの鋳型ＲＮＡから２０μＬの反応において実施した。マウスＩＬ－１２ｐ７０（ｍｕＩＬ－１２ｐ７０）のためのＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）Ｐｒｏｂｅ ＡｓｓａｙはＢｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）は、ｉＱ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的な熱サイクリングプログラムは、９５℃、１５０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、１５秒と６０℃、５５秒との３９サイクルからなっていた。全ての試料は三重測定を行い、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量は、アクチン参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＥＰ００３６２８０）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的と参照遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－４８０）およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－４８０）で処置した群のΔＣｑ値をＰＢＳ処置対照群の平均ΔＣｑ値に対して正規化することによって得、ＰＢＳに対するマウスＩＬ－２ｐ７０発現の倍数増加は、２＾－ΔΔＣｑとして計算した。ＰＢＳ処置腫瘍におけるマウスＩＬ－１２ｐ７０の発現は、平均ΔＣｑ値に基づいて値１．０に正規化した。
下表に示すように、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－（ＡＤＮ－４８０）のＩＶ注射は、ＰＢＳに対してｍｕＩＬ－１２ｐ７０発現の平均倍数増加（２＾－ΔΔＣｑ）５．１９をもたらした一方、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）－（ＡＤＮ－４８０）のＩＶ注射はＰＢＳに対してｍｕＩＬ－１２ｐ７０発現の平均倍数増加（２＾－ΔΔＣｑ）６．５２をもたらした。
これらのデータは、親株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと比較して増強された株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）によるプラスミドデリバリーおよび異所性遺伝子発現の誘起の能力を実証している。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｐｕｒＩ（ｃｌｅａｎ）／ΔｍｓｂＢ（ｃｌｅａｎ）は腫瘍微小環境の中で増大したプラスミドデリバリーおよび異所性ｍｕＩＬ－１２ｐ７０遺伝子発現を呈し、ｐｕｒＩおよびｍｓｂＢの遺伝子欠失が潜在的な遺伝子安定性の問題を軽減するだけでなく、ペイロードデリバリーの増強された能力および治療有効性の増大した可能性を与えることを示している。
腫瘍における遺伝子発現に対するpurIおよびmsbBのクリーンな欠失の効果
Figure 2023501539000064

SD = 標準偏差
［実施例２３］
免疫刺激細菌および免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドにて形質転換された免疫刺激細菌による感染はヒトＭ２表現型マクロファージをＭ１表現型マクロファージに変換する
野生型（ＷＴ）ａｓｄをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株、または免疫刺激タンパク質（例えばＳＴＩＮＧ変異体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１）をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株に感染した初代ヒトＭ２マクロファージがＭ１表現型（またはＭ１様表現型）に変換されて炎症促進性表面受容体、例えばＣＤ８０およびＣＣＲ７、ならびにサイトカイン／ケモカイン、例えばＩＦＮγおよびＣＸＣＬ１０を発現することができるかを、本明細書で決定した(例えばGerrick et al. (2018) PLoS ONE 13(12):e0208602を参照)。
健康なヒトドナーから単離した凍結ヒト単球を完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中で解凍し、６００×ｇ、室温で１０分の遠心分離によって洗浄した。初代ヒトＭ２マクロファージを生成するため、単球を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）＋１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４＋１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１０を含むＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁した。次いで単球（１ウェルあたり７ｅ５）を最終体積５００μＬで２４ウェルプレートに播種した。３日後（３日目）に、２００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１０を含む５００μＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｍｅｄｉｕｍを１ウェルあたりに加え、細胞を７２時間インキュベートした。
６日目に、三重測定ウェルを、下記の株、即ちＧＯＦ突然変異Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを有し、ｈｕＳＴＩＮＧのＣ末端鎖（ＣＴＴ）がタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられたヒト（ｈｕ）ＳＴＩＮＧ変異体（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ、配列番号３９７）をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ；野生型（ＷＴ）ｈｕＩＬ－１２およびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ；ＷＴ ｈｕＩＬ－１５をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ；またはＷＴ ｈｕＩＬ－２１をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤに、ＭＯＩ ２０にて、ＲＰＭＩ中で１時間、感染させた。次いで細胞をＰＢＳにて３回洗浄し、細胞外細菌を死滅させるためにＲＰＭＩ＋１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁した（ゲンタマイシンはマクロファージ中に浸透できない）。対照として、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ中で生成させたヒトＭ１マクロファージ、臨床的化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログであるＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ＲｐＲｐ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で処理したヒトＭ２マクロファージ、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ中で再分極したヒトＭ２マクロファージ、およびプラスミドを含まない株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤに感染させたＭ２マクロファージが含まれていた。
４８時間後、上清を収穫して、特製のヒトＭ２／Ｍ１ Ｕ－ＰＬＥＸパネル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用し、メーカーのプロトコールに従って下流のシグナル伝達の相違について評価した。サイトカインの分泌を測定し、三重測定の平均を計算した。平均サイトカイン分泌の倍数増加を、平均サイトカイン分泌を１．００と設定した未処理のＭ２マクロファージと比較して計算した。
炎症促進性表面受容体ＣＤ８０およびＣＣＲ７の発現のレベルを測定するため、２００μＬのＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）にて細胞を溶解し、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ（商標）９６Ｋｉｔを使用してメーカーのプロトコールに従ってＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料の純度も、Ａ２６０／Ａ２３０吸光度比から評価した。ｃＤＮＡの合成は、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って０．５～１μｇの鋳型ＲＮＡから２０μＬの反応において実施した。ｑＰＣＲはＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にて実施した。ヒトＣＤ８０（アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＩＰ００２６７６４）およびヒトＣＣＲ７（アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＩＰ００３３３６４）についてのＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）Ｐｒｏｂｅ ＡｓｓａｙはＢｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）はｉＱ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的な熱サイクリングプログラムは、９５℃、１５０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、１５秒と６０℃、５５秒との３９サイクルからなっていた。全ての試料は三重測定を行い、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量は、アクチン参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＥＰ００３６２８０）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的と参照遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは、処置のΔＣｑ値を非処置対照のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。倍数増加は、２＾－ΔΔＣｑとして計算した。値を三重測定ウェルの平均として下表に示す。
下表に示すように、平均サイトカイン分泌を１．００と設定した未処理のＭ２マクロファージ対照と比較して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの全ての株は、高いレベルのＩＦＮγ、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１の分泌を誘起した。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１２およびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１５をコードするプラスミドで形質転換したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、プラスミドを含まないＹＳ１６４６ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株より高いレベルのＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１の分泌を誘起した。特に、ＷＴ ｈｕＩＬ－１５をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、ＳＴＩＮＧアゴニストで処理したＭ２マクロファージおよび未処理のＭ１マクロファージより有意に高いレベルのＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１を誘起した。さらに、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１２およびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１５をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、プラスミドを含まないＹＳ１６４６ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株より高いレベルのＣＤ８０およびＣＣＲ７の発現を誘起した。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１２およびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ変異体、またはＷＴ ｈｕＩＬ－１５をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株はより高いレベルのＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＤ８０、およびＣＣＲ７を誘起した一方、プラスミドを含まないＹＳ１６４６ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株より少ないＩＦＮγを誘起した。ＷＴ ｈｕＩＬ－２１をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は他のＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株より有意に高いレベルのＣＤ８０の発現を誘起したが、これらは低いレベルのＩＦＮγ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、およびＣＣＲ７の発現を誘起した。
これらのデータは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと命名された株等の株単独または１つもしくは複数の免疫刺激タンパク質をコードするプラスミドを含むそのような株の、ヒト初代免疫抑制性Ｍ２表現型マクロファージを免疫抑制特性が低減されまたは無くされ、かつ免疫刺激、抗腫瘍、または抗ウイルスの特性が増強されまたは付加されたＭ１またはＭ１様表現型マクロファージに変換する能力を実証している。
免疫刺激性細菌に感染したM2マクロファージにおけるIFNγ、CXCL10、CXCL11、CD80、およびCCR7の発現
Figure 2023501539000065

STINGアゴニスト= 3'5' RpRp c-di-AMP; LPS =リポ多糖; STING変異体 = huSTING N154S/R284G tazCTT
［実施例２４］
ＩＬ－１５をコードするプラスミドまたは４－１ＢＢＬとＩＬ－１２との組合せをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤのＩＶ送達された株は、結腸直腸癌のマウスモデルにおいて増強された有効性を示し、恒久的な抗腫瘍免疫を誘起する
マウスＩＬ－１５（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）、またはマウスＩＬ－１２ｐ７０（ｍｕＩＬ－１２ｐ７０）、または細胞質ドメイン欠失を含むマウス４－１ＢＢＬ［ｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）］、またはｍｕＩＬ－１２ｐ７０とｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）との組合せをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株の抗腫瘍有効性を、側腹部皮下ＭＣ３８結腸直腸腺癌モデルにて評価した。この研究のため、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりマウス８匹）の右側腹部ＳＣにＭＣ３８細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を接種した。定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、２×１０７ＣＦＵの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、または株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、または株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）、または株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）、またはＰＢＳ媒体対照を７日目にＩＶ注射した。腫瘍の測定および体重を週２回記録した。
結果より、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ株がＰＢＳと比較して有意な腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示し（ＴＧＩ ７０．９％、２４日目）、治癒率はマウス８匹中４匹（５０％）であることが明らかになった。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０株はＰＢＳと比較して有意なＴＧＩを示し（ＴＧＩ ８１．１％、２４日目）、治癒率はマウス８匹中２匹（２５％）であった。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕ４－１ＢＢＬ（ΔＣｙｔ）株もＰＢＳと比較して高度のＴＧＩを示し（ＴＧＩ ８１．０％、２４日目）、これもマウス８匹中２匹（２５％）の治癒率をもたらした。ｍｕＩＬ－１２ｐ７０とｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）との組合せを発現する株は最高のＴＧＩ（ＴＧＩ ９０．６％、２４日目）を示し、マウス８匹中４匹が完全治癒を達成した（治癒率５０％）。即ち、ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃまたは４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）とＩＬ－１２ｐ７０との組合せを発現する免疫刺激細菌株は、４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）またはＩＬ－１２ｐ７０単独を発現する株より強力に腫瘍成長阻害を阻害し、結腸直腸癌のモデルにおいて高い完全奏功率（治癒率５０％）をもたらす。
治癒した全てのマウスは腫瘍がない状態が続いた。腫瘍移植後６６日目にマウスの反対側の側腹部にＭＣ３８細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、５×１０５細胞）を再チャレンジし、ナイーブな（以前に腫瘍を移植していない）週齢を一致させたマウスと比較した。腫瘍移植後２６日目までに平均腫瘍サイズ１３８４．７ｍｍ３に達したナイーブなマウスと比較して、以前に治癒した（そして再チャレンジした）マウスのそれぞれは腫瘍がないままであった。これらのデータは、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）、またはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）のいずれかで処置したマウスの、腫瘍の再発を防止し、腫瘍の再チャレンジから保護する恒久的な抗腫瘍免疫を生じる能力を実証している。
［実施例２５］
ｃｓｇＤ、ｌｐｐＡＢ、ｐａｇＰ、およびＦＬＧ、ならびにそれらの組合せの欠失および／または破壊は、株ＹＳ１６４６と比較してヒト血清中で有意に高い生存能力を有する株をもたらす
株ＹＳ１６４６は全身投与後にヒトで限定的な腫瘍のコロニー形成を呈する。株ＹＳ１６４６はヒト血液中で補体因子によって不活化されることが本明細書で示されている（実施例５を参照）。本実施例では、株ＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂを、細菌の表面を変化させるさらなる突然変異を含む本明細書で提供する例示的な免疫刺激細菌と比較した。これらの例示的な改変された株は、ＣＭＶプロモーターの制御下に分泌型ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）［ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）］をコードするプラスミドＡＤＮ－２５６をそれぞれ含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢであった。ＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂの培養物に加えてこれら３つの株を、健康なヒトドナー（ｎ＝３）からの血清または熱不活化（ＨＩ）血清とともに技術的三重測定にて、３７℃で３時間インキュベートした。血清とのインキュベーションの後、細菌を連続希釈してＬＢ寒天プレートに播種し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。生存率％は、熱不活化血清中に存在するＣＦＵに対する全血清中に存在するＣＦＵを計算することによって決定した。
結果は、全ての株が熱不活化ヒト血清中で１００％生存可能であることを示した。大腸菌Ｄ１０Ｂ株は全ヒト血清中、３時間後に完全に無くなった一方、株ＹＳ１６４６は僅かに１２．２２％の平均生存率を呈し、ＹＳ１６４６臨床株の腫瘍のコロニー形成がヒト血液中における補体不活化のために制限されていることを示している。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰはヒト血清との３時間のインキュベーションの後、平均７４．５６％の生存率を示した一方、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢはそれぞれ１２９．５６％および１５８．３３％の平均生存率％を呈した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株は１００％より大きな生存率を示し、これらがヒト血清中で補体不活化に対して完全に耐性であることを示している。
これらのデータは、株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）が全身投与された場合に極めて低い腫瘍のコロニー形成を有している理由を説明する。株ＹＳ１６４６はヒト血清中で補体不活化に極めて感受性であることが本明細書で示されている。ｆｌｊＢ／ｆｌｉＣ（ＦＬＧ）、ｐａｇＰ、ｃｓｇＤ、およびｌｐｐＡＢの欠失／破壊、またはこれらの突然変異の組合せは、部分的にまたは完全にこの表現型を救済する。即ち、ヒト血清中でＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ、およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株において観察された安定性の増強は、ヒト腫瘍のコロニー形成の増大を提供する。
［実施例２６］
サイトカイン、ＳＴＩＮＧ変異体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、４－１ＢＢＬ、および抗４－１ＢＢＬアゴニスト抗体を含む、プラスミドにコードされた治療用産物の組合せは、骨髄性細胞からのＣＸＣＬ１０の分泌を強力に誘起し、Ｔ細胞の活性化を誘起する
免疫刺激細菌中のプラスミドにコードされた免疫調節性ペイロードおよびその組み合わせの発現の、Ｔ細胞および骨髄性細胞の活性化および機能に対する影響を決定した。種々の免疫調節性ペイロードの発現に応じた骨髄性細胞およびＴ細胞によるＩＦＮ－γおよびＣＸＣＬ１０等のサイトカインおよびケモカインの分泌を、保護的抗腫瘍免疫のインジケーターとして測定した。腫瘍促進性炎症性サイトカインＩＬ－６の分泌も並行してモニターした。
本実施例は、本明細書の免疫刺激細菌による種々の組合せの免疫調節性ペイロードのデリバリーの、抗原特異的Ｔ細胞の活性化および抗腫瘍Ｔ細胞の動員に関与する重要なケモカインであるＣＸＣＬ１０の骨髄性細胞による分泌に対する影響を記載し実証する。これは、マウス樹状細胞に種々の組合せのペイロードをコードするプラスミドをトランスフェクトすること、トランスフェクトした樹状細胞を自己マウスＴ細胞と共培養すること、および各細胞型によって分泌されるサイトカインを同定し定量することによって評価した。
免疫調節性ペイロード／タンパク質をコードするプラスミドには、単一のペイロードをコードするプラスミド、ならびにペイロードの組合せをコードするプラスミドが含まれていた。例えば下表に示すように、単一のペイロードには、分泌型ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）；マウスＩＬ－１２ｐ７０（ｍｕＩＬ－１２ｐ７０）；ＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ［突然変異Ｒ２８４Ｇを有するヒトＳＴＩＮＧおよびヒトＳＴＩＮＧのＣ末端鎖（ＣＴＴ）のタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴによる置換を含むキメラタンパク質］;マウス抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（クローン９Ｄ９）；細胞質ドメインが欠失したマウス４－１ＢＢＬ［ｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）］；マウスＩＬ－１８（ｍｕＩＬ－１８）；およびマウスＩＬ－２１（ｍｕＩＬ－２１）が含まれていた。
２つまたは３つのペイロードを含むペイロードの組合せを、Ｔ２Ａおよび／またはＰ２Ａペプチドを使用して単一プラスミド上で発現させ、それにより多数のタンパク質が同じプロモーターの制御下にコードされるようにした。ペイロードの組合せには、例えば１）マウスＩＬ－１８およびマウスＩＬ－１２ｐ７０；２）マウスＩＬ－２１およびマウスＩＬ－１２ｐ７０；３）マウスＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；４）マウスＩＬ－１２ｐ７０、抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；５）抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、マウスＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；６）抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖおよびマウスＩＬ－１２ｐ７０；７）抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖおよびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；８）マウスＩＬ－２１、マウスＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；９）マウス４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；１０）マウス４－１ＢＢＬ（ΔＣｙｔ）およびマウスＩＬ－１２ｐ７０；ならびに１１）マウス４－１ＢＢＬ（ΔＣｙｔ）、マウスＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴが含まれていた。
ＳＴＩＮＧが欠如しているゴールデンチケットマウスから骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を生成し、検討した種々の組合せのペイロードをコードするプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に上清を収穫して、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＵ－Ｐｌｅｘアッセイプラットフォームを使用し、メーカーのプロトコールに従ってＢＭＤＣ培養上清中の分泌されたＣＸＣＬ１０のレベルを測定した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を測定するため、トランスフェクトしたＢＭＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（Ｈ－２Ｋｂ）制限ペプチドエピトープであるニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７－２６４）ペプチドでパルス処理した。Ｒａｇ１－／－ＯＴ－Ｉマウスから単離され、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ－２Ｋｂによって提示されるＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する脾臓Ｔ細胞を、共培養のためにＢＭＤＣに加えた。ＢＭＤＣ／Ｔ細胞の共培養の７２時間後に上清を収穫し、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）キットを使用して細胞培養上清中の分泌されたＩＦＮ－γのレベルを測定した。
結果を下表にまとめる。これは、種々の単一のおよび組合せのペイロードをコードするプラスミドによるトランスフェクションに応答してＢＭＤＣによって分泌されたＣＸＣＬ１０のレベル、ならびにトランスフェクトされたＢＭＤＣとの共培養の後でＣＤ８＋Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮ－γのレベルを示している。
結果はＢＭＤＣによる高レベルのＣＸＣＬ１０の分泌を誘起するコードされたペイロードの特定の組合せを示し、ペイロードを組み合わせた場合に相乗効果が観察されることを示している。例えば、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０とＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの発現との間に相乗効果が観察された。ｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）または抗マウスＣＴＬＡ－４抗体断片とＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴの発現との組合せも、ＢＭＤＣによるより高いレベルのＣＸＣＬ１０の分泌をもたらす。結果は、ＢＭＤＣによるｍｕＩＬ－１２ｐ７０、ならびにｍｕＩＬ－１８とｍｕＩＬ－１２ｐ７０；ｍｕＩＬ－２１とｍｕＩＬ－１２ｐ７０；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０とＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０と抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦＶとＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦＶとｍｕＩＬ－１２ｐ７０；およびｍｕ４－１ＢＢＬ（Δｃｙｔ）とｍｕＩＬ－１２ｐ７０等のペイロードの組合せのいくつかの発現がＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の活性化およびＩＦＮ－γの分泌を誘起することも示している。
BMDCによるCXCL10の分泌およびCD8+T細胞の活性化に対する単一および組合せのペイロードのデリバリーの効果
Figure 2023501539000066

SEM = 平均の標準誤差
上に列挙したペイロードとマウス（ｍｕ）ＩＬ－３６γ、ｍｕＩＬ－２３、ｍｕＯＸ４０Ｌ、およびｍｕＩＦＮ－α２の１つまたは複数とを組み合わせた場合の同じ生物学的応答を検討した。ＳＴＩＮＧが欠如しているゴールデンチケットマウスからＢＭＤＣを単離し、下表に示すように種々の組合せのペイロードをコードするプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）キットを使用してＢＭＤＣ培養上清中の分泌されたＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－６のレベルを測定した。上記のように、Ｒａｇ１－／－ＯＴ－Ｉマウス由来の脾臓Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ細胞）を添加する前に、ＢＭＤＣをオボアルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原ペプチドでパルス処理した。３０時間のＢＭＤＣ／Ｔ細胞の共培養の後、分泌されたＩＦＮ－γのレベルを細胞培養上清中でＣＢＡキットを使用して測定した。Ｔ細胞をＡＰＣコンジュゲート抗マウス４－１ＢＢ抗体（クローン１７Ｂ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色して、活性化マーカー４－１ＢＢの発現をモニターした。
下表にまとめた結果は、ｍｕＩＬ－３６γ＋ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ＴａｚＣＴＴおよびｍｕＩＬ－３６γ＋ｍｕＩＬ－２３＋ＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ＴａｚＣＴＴ等のペイロードの特定の組合せが、ＢＭＤＣによる高レベルのＣＸＣＬ１０の分泌を誘起することを示している。ｍｕＩＬ－３６γとｍｕＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴとの組合せも、ＢＭＤＣによる高レベルのＩＦＮ－γの分泌を誘起するが、比較的低いレベルのＩＬ－６の分泌を誘起し、抗腫瘍免疫の誘起のための治療的に有用な組合せを表している。
結果は、下表に列挙した組合せの多くが、４－１ＢＢの発現およびＩＦＮ－γの分泌によって評価して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の活性化を誘起することも示している。例えば、ｍｕＩＬ－３６γ＋ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ＴａｚＣＴＴの組合せは、ＣＤ８＋Ｔ細胞による最高レベルのＩＦＮ－γの分泌を誘起し、高レベルの４－１ＢＢの発現を誘起して、適正な抗腫瘍免疫の生成のために重要なＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な活性化および機能性を示している。
免疫調節性ペイロードの組合せをコードするプラスミドによるBMDCのトランスフェクションに続くBMDCおよびCD8+T細胞の活性化によるサイトカインの分泌
Figure 2023501539000067

SEM = 平均の標準誤差
Ｔ細胞の機能に対する種々の組合せのペイロードおよび受容体－リガンド相互作用の効果も、プールしたマウスのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を組換えサイトカインおよびアゴニスト抗体で処理することによって検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）をネガティブ単離し、次いで２．５ｎＭの１つまたは複数の組換えサイトカイン［例えばｍｕＩＬ－１２ｐ７０；ｍｕＩＬ－１５複合体（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）；ｍｕＩＬ－２１；ｍｕＩＬ－３６γ；ｍｕＩＦＮ－α２；およびそれらの組合せ］、および／または１．５μｇ／ｍＬの抗マウス４－１ＢＢアゴニスト抗体（クローン１７Ｂ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理した。２４時間の処理の後、分泌されたＩＦＮ－γおよびＩＬ－６のレベルをＴ細胞培養上清中でＣＢＡキットを使用して測定した。
下表に示す結果は、サイトカインのいくつかの組合せが、抗マウス４－１ＢＢアゴニスト抗体の添加ありまたはなしで、Ｔ細胞を活性化することを実証している。例えば、ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１５複合体（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１５複合体＋ｍｕＩＦＮ－α２；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１５複合体＋抗マウス４－１ＢＢアゴニスト抗体；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１５複合体＋ｍｕＩＬ－３６γ；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－１５複合体＋ｍｕＩＬ－２１；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－２１＋ｍｕＩＬ－３６γ；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－３６γ＋ｍｕＩＦＮ－α２；ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＋ｍｕＩＬ－３６γ＋抗マウス４－１ＢＢアゴニスト抗体；ｍｕＩＬ－１５複合体＋ｍｕＩＬ－３６γ＋ｍｕＩＦＮ－α２；およびｍｕＩＬ－１５複合体＋ｍｕＩＬ－３６γ＋抗マウス４－１ＢＢアゴニスト抗体の組合せが、Ｔ細胞からの高レベルのＩＦＮ－γの分泌をもたらすが、比較的低いレベルのＩＬ－６の分泌をもたらし、これらを腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫の誘起のための最適のＴ細胞活性化のための理想的な組合せとしている。
T細胞の活性化に対する種々のサイトカインおよび/または抗マウス4-1BBアゴニスト抗体および/またはそれらの組合せによる処理の効果
Figure 2023501539000068

Figure 2023501539000069

SEM = 平均の標準誤差; IL-15複合体 = muIL-15Rα-IL-15sc
ヒトＴ細胞の活性化に対する１つもしくは複数の組換えヒトサイトカインおよび／または抗ヒト４１ＢＢ抗体（クローン４Ｂ４－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）による処理の効果を評価した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブ単離し、それぞれコートされたアゴニスト抗ヒトＣＤ３ε（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ヒト４－１ＢＢ（クローン４Ｂ４－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を使用して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および４－１ＢＢ刺激ありまたはなしで、１ｎＭの組換えサイトカインで処理した。２４時間および７２時間の処理の後、上清を収穫し、分泌されたＩＦＮ－γのレベルを細胞培養上清中でＣＢＡキットを使用して測定した。Ｔ細胞はまた、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ２５抗体（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色して、活性化マーカーＣＤ２５の発現をモニターした。
下の２つの表にまとめた結果は、サイトカイン（ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－３６γ）のいくつかの組合せおよび４－１ＢＢの関与によってＴ細胞が活性化され、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について抗ＣＤεアゴニスト抗体によるＴＣＲの刺激ありおよびなしで、高レベルのＩＦＮ－γを分泌することを示している。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヒトサイトカインおよび／または抗ヒト４－１ＢＢアゴニスト抗体の様々な組合せによる処理に応答して、特に抗ＣＤ３εアゴニスト抗体による刺激の後で、活性化マーカーＣＤ２５を発現した。ＣＤ２５の発現はＣＤ８＋Ｔ細胞においてはるかに顕著であり、処理した全ての群についてＣＤ２５陽性細胞のパーセンテージは９０％を超えた(これが下表でＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ３ε刺激によるＣＤ２５の発現の尺度として平均蛍光強度（ＭＦＩ）を提供した理由である)。これは、ＣＤ２５がＣＤ８＋Ｔ細胞のよく確立された活性化マーカーであり（ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもそうである）、ＣＤ８＋Ｔ細胞がこの活性化マーカーへの刺激に対して反応性がより大きいためである。
T細胞によるIFN-γの分泌に対する種々のヒトサイトカインおよび/または抗ヒト4-1BBアゴニスト抗体および/またはそれらの組合せによる処理の効果
Figure 2023501539000070

Figure 2023501539000071


SEM = 平均の標準誤差
ヒトサイトカインおよび/または抗ヒト4-1BBアゴニスト抗体の種々の組合せによる処理に続くCD4+およびCD8+T細胞におけるCD25の発現
Figure 2023501539000072

SEM = 平均の標準誤差
*CD3ε刺激によるCD25発現の%が全ての群について90%を超えたため、MFI値を提供。
抗原と接触したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増大する免疫調節性ペイロードの能力を評価した。ヒト単球由来の樹状細胞（ＭｏｄＤＣ）を生成し、分泌型ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）；置換Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇを有するヒトＳＴＩＮＧ（ＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ；配列番号３９８）；置換Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４ＧおよびヒトＳＴＩＮＧのＣ末端鎖（ＣＴＴ）のタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴによる置換を有するヒトＳＴＩＮＧ（ＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ；配列番号３９７）；またはＩＬ－１２ｐ７０をコードするプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、ヒト樹状細胞をＨＩＶ－１（陰性対照）、ＣＥＦ、またはＣＭＶ ＭＨＣ－Ｉ制限ペプチドでパルス処理して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を広いアレイのウイルスペプチドで刺激した。同じドナーからヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、パルス処理した樹状細胞と４８時間、共培養した。４８時間の共培養の後、上清を収穫し、分泌されたＩＦＮ－γのレベルを細胞培養上清中でＣＢＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して測定した。
下表にまとめた結果は、ＩＬ－１２ｐ７０、ならびにＮ１５４ＳおよびＲ２８４Ｇ ＧＯＦ突然変異を有し、ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ ＣＴＴによる置換ありもしくはなしのＳＴＩＮＧ変異体の、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの分泌に関して測定されるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的活性化の増大における強力な効果を実証している。
免疫調節性タンパク質による処理に続くヒトCD8+T細胞の抗原特異的活性化
Figure 2023501539000073

SEM = 平均の標準誤差
［実施例２７］
免疫刺激細菌細胞死に続くプラスミドの移送はヒト初代Ｍ２マクロファージにおける恒久的なタンパク質産生を可能にする
初代ヒトＭ２マクロファージにおけるレポーター遺伝子の発現のためのトランスフェクション（即ちプラスミドＤＮＡの直接移送）とバクトフェクション（即ち本明細書の免疫刺激細菌株による感染によるプラスミドＤＮＡの移送）とを比較した。細菌感染に際しての株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ由来の遺伝子発現カセットをコードするプラスミドの免疫抑制性食細胞性細胞への移送（即ちバクトフェクション）を評価した。健康なヒトドナーからヒトＭ２マクロファージを生成し、次いでＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）［ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ］レポーター遺伝子をコードするＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株に感染させた。トランスフェクション（即ちプラスミドＤＮＡの直接移送）実験も対照として実施し、バクトフェクション（即ち本明細書の免疫刺激細菌株によるプラスミドＤＮＡの移送）と比較した遺伝子発現の有効性を決定するために使用した。
ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ネガティブ単離したヒト単球からヒトＭ２マクロファージを生成した。１００ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を含む最終体積５００μＬにて、単球（１ウェルあたり５×１０５細胞）を２４ウェルプレートに播種した。３日後、２００ｎｇ／ｍＬのヒトＭ－ＣＳＦ＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４＋２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１０を含む１ウェルあたり５００μＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｍｅｄｉｕｍを加え、細胞をさらに３日インキュベートした。６日目に、ＣＭＶプロモーターの制御下に分泌型ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）［ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）］をコードするプラスミドを含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤをＭＯＩ １５０にてＭ２マクロファージに感染させた［本明細書で株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）と称する］。５日間にわたって２４時間ごとに細胞培養上清を収穫し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分泌型ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のレベルを測定した。
結果を下表にまとめる。下表に示すように、ルシフェラーゼ活性アッセイから検出される相対光単位（ＲＬＵ）に関して測定して、感染したＭ２マクロファージについての分泌型ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の量は、感染していないＭ２マクロファージ（６０．０ＲＬＵのバックグラウンド発光を生じた対照）と比較して２４時間から１２０時間まで測定したあらゆる時点で増大していた。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のシグナルは時間とともに有意に増大し、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）によるＭ２マクロファージの感染に際して数日の期間にわたるプラスミドＤＮＡの効率的なデリバリーおよびタンパク質をコードするｍＲＮＡの持続的な発現を示している。これらのデータは、細菌感染に際しての、およびＭ２マクロファージ内での細菌細胞死に続く、細菌からＭ２マクロファージへの効率的なプラスミドの移送を実証している。
レポーター遺伝子をコードするプラスミドを含む免疫刺激性細菌によるM2マクロファージの感染に続くタンパク質の分泌
Figure 2023501539000074
並行した実験で、上記のように、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ ｍＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡトランスフェクション試薬（ＯｒｉＧｅｎｅ）を使用して、Ｍ２マクロファージに、１μｇの同じｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現プラスミドをトランスフェクトし、または株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）を感染させた。５日間にわたって２４時間ごと、および各時点について、感染およびトランスフェクトしたＭ２マクロファージをＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）にて溶解し、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ（商標）９６ Ｋｉｔを使用してメーカーのプロトコールに従ってＲＮＡ抽出を実施した。ｃＤＮＡの合成は、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って鋳型ＲＮＡから２０μＬの反応において実施した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のｑＰＣＲは、ｉＱ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で実施した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的熱サイクリングプログラムは、９５℃、１５０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、１５秒と６０℃、５５秒との３９サイクルからなっていた。全ての試料は三重測定を行い、平均Ｃｑ値を計算した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ｍＲＮＡの定量は、アクチン参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アッセイＩＤ：ｑＨｓａＣＥＰ００３６２８０）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的［即ちＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）］と参照遺伝子（即ちアクチン）との差として計算した。ΔΔＣｑは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）を感染させたＭ２マクロファージおよびＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＭ２マクロファージのΔＣｑ値をトランスフェクトしていない対照群の平均ΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。トランスフェクトしたＭ２マクロファージにおけるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発現は、平均ΔＣｑ値に基づいて１．０の値に正規化し、トランスフェクトしたＭ２マクロファージからのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発現に対する感染させたＭ２マクロファージ（即ちバクトフェクション）からのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発現における倍数増加は、２＾－ΔΔＣｑとして計算した。
結果を下表にまとめる。これは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＭ２マクロファージにおけるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発現のレベルと比較して、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）を感染させたＭ２マクロファージにおいて高いレベルのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発現が２４時間におけるＲＴ－ｑＰＣＲによって検出されたことを示している。これは、プラスミドＤＮＡによる細胞の直接トランスフェクションと比較して、免疫刺激細菌によるＭ２マクロファージの感染に際しての高度のプラスミドデリバリーを示している。
M2マクロファージのバクトフェクションまたはトランスフェクションに続く遺伝子発現レベル
Figure 2023501539000075

SEM = 平均の標準誤差
［実施例２８］
複数の異種産物をコードするプラスミドにおけるコード核酸の位置決めはヒト細胞における検出可能なタンパク質の産生を増強し得る
本実施例は、本明細書で提供する免疫刺激細菌中のプラスミドにコードされた複数の治療用産物の発現が、他の産物をコードする核酸分子の位置に対する１つの産物をコードする核酸分子の位置によって改善できることを示している。これを実証するため、および標的細胞中で最高レベルのタンパク質の発現をもたらす組合せプラスミド上の発現カセットにおける特定の産物（ペイロード）をコードする各遺伝子の位置を特定するために、サイトカインおよびその他の免疫刺激タンパク質の種々の組合せを、１つまたは複数の真核生物プロモーターを含むプラスミドにクローニングした。プラスミドは、それぞれが異なるプロモーター［ＥＦ－１αプロモーターおよびＣＭＶプロモーター（即ち二重プロモーターシステム）］の制御下にある２つの分離されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいたか、または１つのＯＲＦの中の２Ａペプチド（例えばＴ２Ａおよび／またはＰ２Ａ）および２つ以上の遺伝子の発現を推進する１つのプロモーター（即ち単一プロモーターシステム）を含んでいた。プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞培養上清中の種々のコードされた産物（ペイロード）の発現レベルを決定した。
組合せプラスミドにコードされるペイロードには、それだけに限らないが、例えばＧＯＦ（機能獲得型）突然変異Ｃ２０５Ｙを有するマウスＳＴＩＮＧ（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ）；ＧＯＦ突然変異Ｒ２８４ＧおよびヒトＳＴＩＮＧ Ｃ末端鎖（ＣＴＴ）のタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ ＣＴＴによる置換を有するヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）；ＧＯＦ突然変異Ｎ１５４ＳおよびＲ２８４ＧならびにヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴのタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ ＣＴＴによる置換を有するヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）；ＧＯＦ突然変異Ｎ１５４ＳおよびＲ２８４Ｇを有するヒトＳＴＩＮＧ（ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ）；マウスＩＬ－１２ｐ７０（ｍｕＩＬ－１２ｐ７０）；マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ（ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ）；マウスＩＬ－２１（ｍｕＩＬ－２１）；マウスＩＬ－１８（ｍｕＩＬ－１８）；マウスＣＸＣＬ１０（ｍｕＣＸＣＬ１０）；抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（抗ｍｕＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ；配列番号４０４）；抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（抗ｍｕＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ；配列番号４０５）；マウス４－１ＢＢＬΔＣｙｔ（ｍｕ４－１ＢＢＬΔＣｙｔ、ここでΔＣｙｔは細胞質ドメインの欠失を示す)；マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃと融合したマウス可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｍｕ ｓＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ；配列番号４０６）；ヒトＩｇＧ Ｆｃと融合したヒト可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｈｕ ｓＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ；配列番号４０７）；マウスＩＦＮ－アルファ２（ｍｕＩＦＮ－α２）；マウスＩＦＮ－ベータ（ｍｕＩＦＮ－β）；マウスＩＬ－３６ガンマ（ｍｕＩＬ－３６γ）；マウスＩＬ－２３（ｍｕＩＬ－２３）；マウスＯＸ４０Ｌ（ｍｕＯＸ４０Ｌ）；およびそれらの２つ以上の種々の組合せが含まれる。配列はＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。
抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ（配列番号４０４）および抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号４０５）は９Ｄ９クローンから誘導した。ｓｃＦｖは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを介して連結されたＩｇＫリーダーマウス配列とクローン９Ｄ９由来のＶＬおよびＶＨドメインとを含む。ｓｃＦｖ－ＦｃはＶＨドメインに連結されたマウスＩｇＧ２ａＦｃも含む。
内因性ＳＴＩＮＧを含まず、内因性ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）プロモーターの制御下にあって分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現する（ここでＩＳＲＥのコード配列はノックイン技術の使用によってＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている）ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ Ｃｅｌｌｓ［２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ Ｃｅｌｌｓ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ］を使用した。ポリ－Ｌ－リシンをコートした２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ ｃｅｌｌｓ［２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ Ｃｅｌｌｓ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ］を１ウェルあたり２００，０００細胞にて播種し、５％ＣＯ２中３７℃で一夜インキュベートして、８０％のコンフルエンシーを達成した。翌日、５００ｎｇの各プラスミドＤＮＡを無血清培地で希釈して、陰性対照として働く非トランスフェクトウェルとともに適正な試薬：ＤＮＡ比にてＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた（二重測定）。トランスフェクションの４８時間後に、各試料からの細胞培養上清を収集した。
コードされたＳＴＩＮＧ変異体（ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ、およびｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ）のそれぞれのＳＴＩＮＧ活性を、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧ Ｎｕｌｌ ＩＳＲＥ－ＳＥＡＰレポーター細胞系［２９３－Ｄｕａｌ（商標）Ｎｕｌｌ Ｃｅｌｌｓ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ］によって評価した。これらの細胞を使用して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）活性（ＳＴＩＮＧによって誘起される）は、細胞上清中のＩ型ＩＦＮ刺激ＳＥＡＰ産生をモニタリングすることによって評価される。２０μＬの細胞培養上清を、ＳＥＡＰを測定するために使用される１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に加えた。Ｉ型インターフェロンの活性化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において、６５０ｎｍの吸光度でＩＳＲＥ誘起ＳＥＡＰ活性を測定することによって決定した。
細胞培養上清を、各サイトカインに特異的なＥＬＩＳＡを使用することによって、コードされたサイトカインの発現についても評価した。ｍｕＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃコンストラクトについては、マウスＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃ ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をキットの使用説明書に従って使用した。マウスＩＬ－１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウスＩＬ－２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウスＩＬ－１２ｐ７０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩＬ－２３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＣＸＣＬ１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびマウスＩＬ－３６γ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）に特異的なＥＬＩＳＡを使用して、細胞培養上清中におけるこれらのサイトカインのそれぞれのレベルを測定した。マウスＩＦＮ－α２およびマウスＩＦＮ－βは、適切なＵ－ＰＬＥＸ Ａｓｓａｙｓ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して測定した。
Ｆｃとマウスまたはヒトの可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩとの融合体をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞培養上清について、それぞれマウスＴＧＦ－β１またはヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による直接ＥＬＩＳＡを実施し、これらのタンパク質の発現レベルを測定した。抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖおよび抗マウスＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞の細胞培養上清についてマウスＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による直接ＥＬＩＳＡを実施し、これらのタンパク質の発現レベルを測定した。
トランスフェクションの４８時間後に、マウス細胞表面リガンド４－１ＢＢＬΔｃｙｔおよびＯＸ４０Ｌの発現をフローサイトメトリーによって評価した。ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔをコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞については、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ビオチンコンジュゲート抗マウス４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色した。３０分のインキュベーションの後、細胞を１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色した。３０分のインキュベーションの後、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、ＤＡＰＩ（生死染色）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
代替として、ｍｕＯＸ４０Ｌを発現する細胞を、１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄した。次いで細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁し、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＯＸ４０Ｌ抗体（クローンＲＭ１３４Ｌ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色した。３０分のインキュベーションの後、細胞を１３００ＲＰＭ、３分の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳにて２回洗浄し、ＤＡＰＩ（生死染色）を含むＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁した。ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
組合せプラスミドにおける個別のペイロードの発現を、発現レベルを示す記号－、＋、＋＋、および＋＋＋を使用して下表にまとめる。－は発現なしを示す。＋はいくらかの発現を示す。＋＋は良好な発現を示す。＋＋＋は高度の発現を示す。記号＋／－は＋と－との間の発現レベル、即ち低い発現を示す。＋／＋＋は＋と＋＋との間の発現、即ち中程度の発現を示す。＋＋／＋＋＋は＋＋と＋＋＋との間の発現、即ち高度の発現を示す。
プラスミドが単一のＣＭＶプロモーターの制御下に２つ以上のペイロードをコードし、２Ａペプチド（Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）が遺伝子またはＯＲＦのそれぞれの対の間にコードされる単一のプロモーター系については、Ｘ＿Ｔ２Ａは評価されるペイロード（即ち「Ｘ」）がＣＭＶプロモーターを有するプラスミドの上でＴ２Ａペプチドの前にコードされていることを示し、Ｔ２Ａ＿Ｘは評価されるペイロードがＣＭＶプロモーターを有するプラスミドの上でＴ２Ａペプチドの後にコードされていることを示し、Ｐ２Ａ＿Ｘは評価されるペイロードがＣＭＶプロモーターを有するプラスミドの上でＰ２Ａペプチドの後にコードされていることを示し、Ｐ２Ａ＿Ｘ＿Ｔ２Ａ＿Ｘ＊は、Ｘ＊が評価されるペイロードである場合に、評価されるペイロードがＣＭＶプロモーターを有するプラスミドの上でＰ２ＡペプチドおよびＰ２Ａポリペプチドに続くペイロード（Ｘ）の後にコードされるＴ２Ａペプチドの後にコードされていることを示す。
プラスミドが単一のＥＦ－１αプロモーターの制御下に２つ以上のペイロードをコードし、２Ａペプチド（Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）が遺伝子またはＯＲＦのそれぞれの対の間にコードされる単一のプロモーター系については、Ｘ＃＿Ｔ２ＡおよびＴ２Ａ＿Ｘ＃は、Ｘ＃が評価されるペイロードである場合に、ペイロードがＥＦ－１αプロモーターを有するプラスミドの上でそれぞれＴ２Ａペプチドの前または後に発現されることを示す。例えば、ＣＭＶ ｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｐ２Ａ＿ｍｕ ｓＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ＿Ｔ２Ａ＿ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴをコードするプラスミドにおいて、Ｘ＿Ｔ２Ａはｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔを表し、Ｔ２Ａ＿ＸはｍｕＩＬ－１２ｐ７０を表し、Ｐ２Ａ＿Ｘはｍｕ ｓＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃを表し、Ｐ２Ａ＿Ｘ＿Ｔ２Ａ＿Ｘ＊は ｈｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴを表す。同様に、ＣＭＶ ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－２１＋ＥＦ－１αｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔ＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙをコードするプラスミドにおいては、Ｘ＿Ｔ２ＡはｍｕＩＬ－１２ｐ７０を表し、Ｔ２Ａ＿ＸはｍｕＩＬ－２１を表し、Ｘ＃＿Ｔ２Ａはｍｕ４－１ＢＢＬΔｃｙｔを表し、Ｔ２Ａ＿Ｘ＃はｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙを表す。
個別のプロモーターの制御下にそれぞれのペイロード（または１つのプロモーターを有するただ１つのペイロード、即ち単一のエクスプレッサー）をコードするプラスミドについては、ＣＭＶ＿ＸおよびＥＦ－１α＿Ｘ＃は、評価されるペイロードがそれぞれＣＭＶプロモーターの後（ペイロードＸ）またはＥＦ－１αプロモーターの後（ペイロードＸ＃）にコードされていることを示す。
下表に示すように、単一のエクスプレッサーは一般に最高の発現レベルを示す。より多くのタンパク質がプラスミド上にコードされるとともに、それが二重プロモータープラスミドであっても単一プロモータープラスミドであっても、それぞれのペイロードについて発現は低下する傾向がある。組合せプラスミドの最初の位置（例えば第１のＴ２Ａの前）に位置するペイロードの発現は、プラスミド上の他の位置における同じペイロードの発現より一般に高かった。２つ以上のペイロードを含む組合せプラスミドにおいては、ＣＭＶプロモーターの後の最初の位置において、より高い発現がしばしば見られた。マウス４－１ＢＢＬΔＣｙｔは、組合せプラスミドにおいてＣＭＶプロモーターの後の最初の位置にコードされた場合にのみ、よく発現することが見出された。
単一および組合せのペイロードの発現レベル
Figure 2023501539000076

Figure 2023501539000077

Figure 2023501539000078

Figure 2023501539000079

Figure 2023501539000080


Figure 2023501539000081


Figure 2023501539000082


Figure 2023501539000083


Figure 2023501539000084


Figure 2023501539000085


Figure 2023501539000086

HPRE = B型肝炎ウイルス転写後制御エレメント; WPRE = ウッドチャック肝炎ウイルス (WHP) 転写後制御エレメント; bGHpA = ウシ成長ホルモンポリA; SV40pA = シミアンウイルス40ポリA
［実施例２９］
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢにおける生体内分布、クリアランス、腫瘍のコロニー形成、および異所性遺伝子発現の研究
腫瘍を有しないマウスの肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、腸、筋肉、骨髄、およびリンパ節を含む種々の組織における株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢの全身投与に続く生体内分布ならびにそれからのクリアランスを評価し、親株ＹＳ１６４６の生体内分布およびクリアランスと比較した。腫瘍内の株のコロニー形成を、腫瘍を有するマウスの非腫瘍組織のコロニー形成と比較し、腫瘍組織と非腫瘍組織における細菌中のプラスミドにコードされた異種遺伝子産物の発現も決定した。
Ａ．ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株はナイーブマウスから急速に消失し、健常組織における異所性遺伝子発現は観察されない。
親ＹＳ１６４６株ならびに株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢの間の腫瘍を有しないマウスにおける組織からの経時的な細菌クリアランスを比較するため、生体内分布研究を実施した。下記のように、健常な非腫瘍組織における異所性遺伝子発現のレベルを決定するため、ルシフェラーゼタンパク質をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株のプラスミドにコードし、組織におけるルシフェラーゼの発現も評価した。そのため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス３匹）に単一用量の２×１０６ＣＦＵの各細菌株またはＰＢＳ媒体対照をＩＶ注射した。投薬後２時間、２４時間、および３０日でマウスを安楽死させ、脾臓、肝臓、心臓、肺、腎臓、腸、筋肉、骨髄、およびリンパ節を収穫した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒおよび２ｍＬのＰＢＳ中のＭ管（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）分子セッティングを使用して組織をホモジナイズし、ホモジネートをＬＢプレートに播種して組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計数した。
下表に示すように、３つ全ての株はＩＶ投薬後２時間で脾臓および肝肝臓においてＣＦＵを示し、心臓、肺、および腎臓でより少ないＣＦＵを示した。投薬後２４時間で脾臓および肝臓において高いＣＦＵを示し続けた親ＹＳ１６４６株と異なり、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株で処置したマウスの脾臓および肝臓においては、有意により低いＣＦＵが検出された。投薬後３０日目には、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢは全ての臓器から消失した。親ＹＳ１６４６株では対照的に、投薬後３０日目には脾臓および肝臓において検出されたコロニー形成を含み、投薬後２４時間で多くの組織においてコロニー形成が実証された。
腫瘍を有しないマウスにおけるIV投薬後2時間、24時間、および30日の株YS1646の生体内分布
Figure 2023501539000087

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
腫瘍を有しないマウスにおけるIV投薬後2時間、24時間、および30日の株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgDの生体内分布
Figure 2023501539000088

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
腫瘍を有しないマウスにおけるIV投薬後2時間、24時間、および30日の株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppABの生体内分布
Figure 2023501539000089

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
これらのデータは、鞭毛をコードする遺伝子、ならびに遺伝子ａｓｄ、ｐａｇＰ、ａｎｓＢ、ｃｓｇＤ、および適宜ｌｐｐＡＢの欠失または破壊が、健常な非腫瘍組織からの免疫刺激細菌株の親株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９、これはｍｓｂＢ－／ｐｕｒＩ－である）より速いクリアランスをもたらし、２４時間から３０日以内に非腫瘍組織からの細菌の完全なクリアランスをもたらす一方、株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）は非腫瘍組織の中で投薬後２４時間でも、また肝臓および脾臓においては投薬後３０日で検出されることを実証している。これは、本明細書で提供するゲノム改変を有する免疫刺激細菌が株ＶＮＰ２０００９より安全に投与され、より良く忍容されることを示している。即ち、より高い用量の本明細書で提供する免疫刺激細菌を投与することができる。
種々の非腫瘍組織への細菌によるプラスミドデリバリー、ならびにそれに続く異種遺伝子発現およびタンパク質の分泌を測定するため、分泌型ルシフェラーゼタンパク質［ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ、ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）と略す］の活性を測定した。ＩＶ投与したＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株はそれぞれ、真核性ＣＭＶプロモーターの制御下にｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードするプラスミドを含んでいた。上記のようにマウス組織をホモジナイズした後、ホモジネートを１３００ＲＰＭ、１０分の遠心分離で沈降させ、上清を収集し、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ／Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を測定した。
投薬後２４時間で脾臓および肝臓においてＣＦＵが観察されたにも関わらず、全ての組織で、かつ全ての時点で、バックグラウンドを超えるルシフェラーゼ活性は検出されなかった。これらのデータは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株の、腫瘍を有しないマウスの健常な組織から急速に消失し、親ＹＳ１６４６株と異なり、投薬後３０日目において細菌クリアランスのために抗生物質を必要としない能力を実証している。重要なことに、健常な組織においてはいかなる時点でも異所性遺伝子発現は観察されなかった。
Ｂ．ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株は腫瘍組織に優先的に集積し、異所性遺伝子発現はもっぱら腫瘍特異的である
親ＹＳ１６４６株と比較した、相対的組織コロニー形成およびｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドを含む欠失株の腫瘍特異的遺伝子発現を決定するため、腫瘍を有するマウスにおいて生体内分布研究を実施した。このため、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりマウス４匹）の４番目の乳腺脂肪体に、４Ｔ１乳癌細胞（ＰＢＳ １００μＬ中、２×１０５細胞）を同所接種した。１０日で定着した側腹部腫瘍を有するマウスに、それぞれｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードするプラスミドを含む単一用量の２×１０６ＣＦＵの ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株、もしくはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株、または単一用量の２×１０６ＣＦＵの親ＹＳ１６４６株をＩＶ注射した。細菌のＩＶ投薬後１日目、４日目、および８日目にマウスを安楽死させ、腫瘍、脾臓、肝臓、心臓、肺、腎臓、腸、筋肉、骨髄、およびリンパ節を収穫し、上記のように処理して、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計数し、腫瘍組織１ｇあたりの平均発光［相対的光単位（ＲＬＵ）で］を測定した。さらにこれらの時点でマウスから採血して血清を収集し、下で論じるように細菌の異なる株の投与に応答して誘起される全身性炎症促進性サイトカインのレベルを決定した。
下表に示すように、３つ全ての株は投薬後１日目に他の組織に対して腫瘍における優先的なコロニー形成（平均ＣＦＵで決定される）を示し、４日目および８日目で増大する腫瘍のコロニー形成を示した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤは株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢより速く高いレベルの腫瘍のコロニー形成を示した。さらに、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株について、またＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ株についてはより顕著に、腫瘍以外の組織、脾臓、および肝臓において極めて少ないコロニーが観察された。対照的に、親ＹＳ１６４６株のコロニー形成が、投薬後８日目でもマウス全体で健常な非腫瘍組織において観察された。
腫瘍を有するマウスにおけるIV投薬後1日、4日、および8日の腫瘍中と健常組織中の株YS1646の生体内分布
Figure 2023501539000090

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
腫瘍を有するマウスにおけるIV投薬後1日、4日、および8日の腫瘍中と健常組織中の株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgDの生体内分布
Figure 2023501539000091

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
腫瘍を有するマウスにおけるIV投薬後1日、4日、および8日の腫瘍中と健常組織中の株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppABの生体内分布
Figure 2023501539000092

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
腫瘍中および種々の非腫瘍マウス組織中における異種遺伝子発現およびタンパク質分泌のレベルを決定するため、細菌中のプラスミドにコードされたｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の活性を、上記のようにルシフェラーゼ活性アッセイを使用して、組織ホモジネートからの上清中で測定した。下表に示すように、他の組織で細菌性ＣＦＵが観察された（上に示したように）にも関わらず、両方の株におけるｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発現は腫瘍組織に限局されていた。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株を投与したマウスの骨髄において観察されたＲＬＵは夾雑物由来であると判定され、引き続く実験では観察されなかった。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ欠失株と比較して、腫瘍のコロニー形成の遅れ（上の表に示すように）のために、腫瘍ｓｅｃＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現の遅れを示した。
株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD中のプラスミドにコードされたsecNanoLuc(登録商標)の腫瘍特異的発現
Figure 2023501539000093

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB中のプラスミドにコードされたsecNanoLuc(登録商標)の腫瘍特異的発現
Figure 2023501539000094

SD = 標準偏差; LOD = 検出の限界
上で論じたように、免疫刺激細菌株によるＩＶ投薬後１日目、４日目、および８日目に、腫瘍を有するマウスから採血して血清を収集した。ＩＶ投薬後１日目（Ｄ１）、４日目（Ｄ４）、および８日目（Ｄ８）に、サイトメトリービーズアレイ（Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ＣＢＡ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、全身性炎症促進性サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびＩＬ－１０のレベルについて血清を評価した。
下表に示すように、細菌のＩＶ投薬後１日目に、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株についてのＩＬ－６の僅かに高いレベルを例外として、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢを投薬したマウスからのサイトカインの全ての血清中濃度は、親ＹＳ１６４６株を投薬したマウスからの血清中濃度と比較して低かった。投薬後１日目で、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢを投薬したマウスからのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびＩＬ－１０の血清中濃度は、ＰＢＳ対照と同じであった（即ち０ｐｇ／ｍＬ）。親株ＹＳ１６４６は４日目にＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－２についてピークの全身サイトカインレベルを示した一方、欠失株のそれぞれの投与後の血清サイトカインレベルは親株の投与後に観察されたレベルより十分低く、ＰＢＳ媒体対照測定に近かった。親株による投薬後１日目の、ＴＬＲ２シグナル伝達の直接の標的であるＩＬ－１０の高い血清中濃度は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えばリポタンパク質）の欠失または改変を含む欠失株のそれぞれによる投薬後には存在しなかった。
これらのデータは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株におけるＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５のシグナル伝達を改変するゲノム欠失が、強固な細菌性腫瘍のコロニー形成にも関わらず、全身性炎症促進性サイトカインの産生を大きく無効化することを実証している。結果として、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢはよく忍容され、必要であれば親株ＹＳ１６４６より高い濃度で投薬することができ、増強された治療有効性がもたらされる。
免疫刺激性細菌株による腫瘍を有するマウスのIV投薬に応じたIL-6、TNF-α、およびIFN-γの血清中レベル
Figure 2023501539000095
免疫刺激性細菌株による腫瘍を有するマウスのIV投薬に応じたIL-2およびIL-10の血清中レベル
Figure 2023501539000096
これらのデータは、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠損株がＩＶ投薬後、ナイーブマウスから急速に消失し、抗生物質による除去を必要としないことを示している。ナイーブマウスおよび腫瘍を有するマウスでは、欠失株は健常な組織と比較して優先的に腫瘍をコロニー形成し、プラスミドにコードされたペイロードの発現は腫瘍特異的である。さらに、親ＹＳ１６４６株と異なり、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｌｐｐＡＢ欠失株は強固な腫瘍のコロニー形成にも関わらず、毒性で免疫抑制性の炎症促進性全身性サイトカインを誘発せず、これらの株がインビボでよく忍容され、必要であれば株ＹＳ１６４６（ＶＮＰ２０００９）より高い濃度で投薬することができ、より高い治療有効性がもたらされることを示している。
［実施例３０］
免疫調節性ペイロードをコードするデリバリープラスミドへの改変
デリバリープラスミドは、細菌の適合性および機能のためならびにコードされた複雑な多シストロン性真核性ペイロードの適正な発現のために必要な遺伝子および制御性エレメントをコードする。そのような進化的に分岐した生命体の間の切り替えは、両方における適正な機能化に対する課題を導入する。細菌では、ＣＭＶプロモーター等の真核性プロモーターからの転写リーク性が観察される。細菌において真核性プロモーターからのあるレベルの基底転写が常に存在する場合に、プロモーターは「リーク性」とみなされる。このプロモーターのリーク性は、細菌中にコードされた場合（例えばプラスミドに）、大きな真核性遺伝子および制御配列と組み合わされて、注射用ストックの生存能力の低下に現れる細菌の適合性の低下およびブロス培養における増殖速度の低下をもたらす。細菌の適合性は真核性プロモーターからのリーク性によって影響されることが本明細書で見出された。リーク性プロモーターは、転写／翻訳の負荷の増大、および蓄積するとともに細菌細胞に対して毒性になり得る正常に分泌された真核性タンパク質の部分的発現等のいくつかの理由によって、細菌の適合性に影響することがある。
ＣＭＶプロモーターのリーク性を低下させ、細菌の増殖および適合性を改善するため、例えばファージＴ４、ｔｒｐＡ、およびＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーター等の細菌特異的ターミネーター配列を含ませること、および／または強力な細菌性プロモーターを反対の配向で設ける（即ち、リバースプロモーターを含ませる）ことによって、細菌のＣＭＶリーク性を低下させまたは阻害することができることが本明細書で示される。例えば、本明細書でＲｅｖＭＴＬ＊と称するリバースプロモーター（アンチセンス配向のプロモーター）は、ＭＴＬプロモーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）から誘導される強力なプロモーターであり、ＭＴＬプロモーターはｐｒｏＤプロモーターから順番に誘導され（例えばDavis et al. (2011) Nucleic Acids Research 39(3):1131-1141を参照）、真核性遺伝子の発現を無くしまたは低減するために配列中の全てのアンチセンスＡＴＧを除去するように変異されていた。
真核性プロモーターの中の予測される細菌性プロモーター配列を変更する操作された突然変異も、ＣＭＶプロモーターのリーク性が低減された変異体を生成するために使用できることが、本明細書で示されている。ＣＭＶプロモーターのリーク性に加えて、強固なａｓｄ発現リードスルー（ａｓｄ相補性系を組み込むプラスミドを含むａｓｄ株における）は、真核性ペイロードの発現カセットを通してリーク性を惹起することがある。ａｓｄ発現リードスルーをブロックまたは低減する戦略には、発現カセットを逆配向に設けること、および／またはａｓｄ遺伝子とペイロード発現カセットとの間に細菌性ターミネーター配列を挿入することが含まれることが本明細書で示されている。
哺乳動物細胞における高い異所性遺伝子／ペイロード発現を維持しながら細菌の適合性に対する負の影響を最小化するため、以下の４つの異なる方法において、デリバリープラスミドを体系的に改変した。
１）ＰｒｏｍｏｔｅｒＨｕｎｔｅｒ（ｐｈｉｓｉｔｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｈｕｎｔｅｒ／にてオンライン入手可能、例えばKlucar et al. (2010) Nucleic Acids Res. 38(Database issue):D366-D370を参照）を使用して、ＣＭＶプロモーターエンハンサー領域内にコードされた潜在性細菌プロモーター配列を特定し、次いで効率的なプラスミドデリバリーを促進するために、推測されるプロモーター配列をＣＲＥＢ結合部位および部分的ＣＲＥＢ結合部位に置き換えた；
２）ＣＭＶプロモーターからの転写リーク性を阻害するため、いくつかの細菌性ターミネーターをオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入して、細菌内での発現を阻害した（下表を参照）；
３）複製の起点からのリードスルー転写のレベルを低減するため、発現カセットと複製の起点との間に転写ターミネーターを挿入しおよび挿入せずに、ＣＭＶプロモーターの上流からポリアデニル化シグナルの終点までの発現カセットの配向を逆転させた；および
４）インビトロの遺伝子ペイロードの発現の増強とともに注射用ストックの生存能力の増大をもたらした上の１）～３）からの改変を、さらなる改善のために組み合わせた。
細菌感染した真核細胞からのコードされたペイロードの発現を測定するため、ＴＨＰ－１ヒトマクロファージ細胞（ＡＴＣＣカタログ＃２０２１６５）に、上で論じた改変を有し、下表に列挙した、プラスミドの維持を確実にするための機能性ａｓｄ遺伝子ならびに複合真核性発現カセット（ＣＭＶ ｍｕＩＬ－１２ｐ７０＿Ｔ２Ａ＿ｍｕＩＬ－１８ ＨＰＲＥ ｂＧＨポリＡ＋ＥＦ－１α ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙ ＷＰＲＥ ＳＶ４０ポリＡ）をコードするプラスミドを含むサルモネラ・チフィムリウムＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤの株を感染させた。プラスミドＡＤＮ－２８７は真核性発現カセットを含み、さらなる改変を含まない。プラスミドＡＤＮ－３９７、ＡＤＮ－３９８、およびＡＤＮ－３９９はそれぞれ１つの特有のＣＭＶ潜在性プロモーター置換（ＣＲＥＢ結合部位または部分的ＣＲＥＢ結合部位による）を含む。プラスミドＡＤＮ－４００、ＡＤＮ－４０１、およびＡＤＮ－４０２はそれぞれ２つのＣＭＶ潜在性プロモーター置換を含み、プラスミドＡＤＮ－４０３は３つのＣＭＶ潜在性プロモーター置換を含む。プラスミドＡＤＮ－３５５はプラスミドＡＤＮ－２８７由来の真核性発現カセットを逆配向で含む。プラスミドＡＤＮ－３５８はＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターがポリアデニル化部位の下流に置かれ、発現カセットが逆配向である、プラスミドＡＤＮ－２８７由来の発現カセットを含む。プラスミドＡＤＮ－３２５はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にＴ４細菌性ターミネーターを含む。プラスミドＡＤＮ－３８２はプラスミドＡＤＮ－３２５と同一であるが、発現カセットは逆配向で置かれている。プラスミドＡＤＮ－３７３はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にＴ４細菌性ターミネーターを含み、その後にＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターが続き、発現カセットは逆配向である。プラスミドＡＤＮ－３２７はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にｔｒｐＡ細菌性ターミネーターを含む。プラスミドＡＤＮ－３８１はプラスミドＡＤＮ－３２７と同一であるが、発現カセットは逆配向である。プラスミドＡＤＮ－３７２はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にｔｒｐＡ細菌性ターミネーターを含み、その後にＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターが続き、発現カセットは逆配向である。プラスミドＡＤＮ－３２９はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にＲｅｖＭＴＬ＊プロモーターを含む（上の説明を参照）。プラスミドＡＤＮ－３８３はプラスミドＡＤＮ－３２９と同一であるが、発現カセットは逆配向である。プラスミドＡＤＮ－３７４はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にＲｅｖＭＴＬ＊プロモーターを含み、その後にＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターが続き、発現カセットは逆配向である。プラスミドＡＤＮ－３２８はＣＭＶプロモーターとＡＤＮ－２８７発現カセットとの間にＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターを含む。プラスミドＡＤＮ－２５７はＣＭＶプロモーターの制御下にｍｕＩＬ１２－ｐ７０をコードする遺伝子を含み、さらなる改変を含まない。
５×１０５個の細胞をＲＰＭＩおよび１０％のＦＢＳとともに２４ウェルディッシュの各ウェルに入れた。細胞を、サルモネラ・チフィムリウム株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ（上記および下表に列挙したプラスミドの１つを含む）の洗浄した定常相の培養物に、１細胞あたりＭＯＩ ２００ＣＦＵで１時間感染させ、次いで細胞をＰＢＳにて洗浄し、細胞外細菌を死滅させるために２００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む培地に培地を交換した。２４時間後、β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）を含む３５０μＬの緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）にて細胞を溶解し、以下の改変を含むＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡ抽出を実施した。総ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するため、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するゲノムＤＮＡ排除ステップがキットに含まれていた。総ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。ＲＮＡは逆転写を実施するまで凍結解凍なしに－８０℃で保存した。ｃＤＮＡの合成は、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って０．４～１μｇの鋳型ＲＮＡを使用して３０μLの反応において実施した。
ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって実施した。マウスＩＬ－１２（アッセイＩＤ：ｑＭｍｕＣＩＤ００１５６６８）のためのＳＹＢＲ（登録商標）プライマーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入した。ｑＰＣＲ反応（２０μＬ）は、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、プロトコールに従って行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおける標準的熱サイクリングプログラムは、９５℃、３０秒の熱変性およびそれに続く９５℃、５秒と６０℃、３０秒との４０サイクルからなっていた。各プレートのプライマーの各組について鋳型なしの対照による反応が含まれていた。全ての試料は二重測定を行い、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量はベータ－アクチン参照ｍＲＮＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ｑＭｍｕＣＥＤ００２７５０５）を使用して正規化した。ΔＣｑは標的（即ちｍｕＩＬ－１２ｐ７０）と参照（即ちベータ－アクチン）遺伝子との差として計算した。ΔΔＣｑは個別の株のΔＣｑ値を改変していないプラスミド（ＡＤＮ－２８７、下表を参照）を有する株のΔＣｑ値に対して正規化することによって得た。倍数発現は２＾－ΔΔＣｑとして計算した。
個別の細菌株のそれぞれについての倍加時間を、ブロス増殖曲線から計算した。これは、ＯＤ６００で正規化した定常培養をＯＤ６００＝０．０５に希釈し、振盪しながら３７℃で一夜培養し、次いでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して１５分ごとにＯＤ６００を読み取ることによって実施した。倍加時間（Ｇ）は、式Ｇ＝ｔ／ｎを使用して指数増殖相から誘導した。ここでｔ＝分で表した時間間隔（ｔｆｉｎａｌ－ｔｓｔａｒｔ）、およびｎ＝（ｌｏｇＯＤ６００（ｆｉｎａｌ）－ｌｏｇＯＤ６００（ｓｔａｒｔ））／ｌｏｇ２。
注射用ストックは、４ＸＹＴ培地中で増殖したそれぞれのサルモネラ・チフィムリウムＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株の２５ｍＬの一夜定常培養物をＰＢＳ中１０％グリセロールの氷冷溶液にて３回洗浄し、ＯＤ６００＝２に正規化し、１ｍｌのアリコートをドライアイス中、フラスコで凍結することによって調製した。ストックは－８０℃で保存した。注射用ストックの生存能力は、解凍した注射用ストックバイアルを滴定し、バイアルあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）をＯＤ６００に基づいて予想されるＣＦＵによって割ることによって決定した。記載したプラスミド（論じた改変ありおよびなしの）のそれぞれを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株についてのｍｕＩＬ－１２ｐ７０の発現レベル、細菌の倍加時間、注射用ストックの生存能力、および平均定常相終了ＯＤ６００読み取り値の結果を下表に示す。
ペイロードの発現レベルおよび細菌の適合性に対するプラスミド改変の効果
Figure 2023501539000097

Figure 2023501539000098

RevMTL*はMTLプロモーター(Molecular Technologies Laboratories)から誘導される強力な細菌性プロモーターであるリバースプロモーター(アンチセンス配向のプロモーター)であり、MTLプロモーターはproD プロモーターから誘導され、真核性遺伝子の発現を低減しまたは無くすために全てのアンチセンスATGを除去するように変異されていた。
結果は、発現カセットがプラスミド上で逆転し、ＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーターがそれに続き、ＣＭＶプロモーターの下流にＴ４ターミネーターが挿入される場合には［（ＣＭＶ－Ｔ４ターミネーター－ＡＤＮ－２８７カセット－ＢＢａ＿Ｂ００１５ターミネーター）逆配向、プラスミドＡＤＮ－３７３の結果を参照］、親プラスミドＡＤＮ－２８７を有する株と比較して細菌細胞の生存率の増大があった(２２％と比較して４１％の注射用ストックの生存率)ことを示している。このプラスミドを有する株は、親プラスミドＡＤＮ－２８７を有する同じ株と比較して、インビトロでより高いレベルのｍｕＩＬ－１２ｐ７０を発現し（１．０と比較して１．５）、低減された倍加時間を有し（１２５分と比較して１０１分）、より高い定常ＯＤ６００まで増殖した（３．６２と比較して３．９８）。他のプラスミドはいずれも全てのマトリックスにわたってそのような改善をもたらさなかった。
即ち、プラスミドが複合多シストロン性真核性ペイロードをコードする場合には、１）ＣＭＶプロモーターの下流にＴ４細菌性ターミネーター等の細菌性ターミネーターを挿入すること、２）発現カセットの後に細菌性ＢＢａ＿Ｂ０００１５ターミネーター等の別のターミネーターを続けること、および３）プラスミド上の真核性発現カセットの配向を逆転させること、の組合せによって、コードされたペイロードの発現の効率が増大し、細菌の適合性が改善される。
改変は当業者には明らかであるので、本発明は添付した請求項の範囲によってのみ限定されることが意図されている。

Claims (379)

  1. 複数の抗がん産物をコードする核酸を、単一プロモーターの制御下にある多シストロン性配列として含む核酸コンストラクト。
  2. 多シストロン性配列が、各産物をコードする各オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間に２Ａペプチドを含む、請求項１に記載のコンストラクト。
  3. 抗がん産物がタンパク質である、請求項１または請求項２に記載のコンストラクト。
  4. ２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａの１つまたは複数である、請求項２または請求項３に記載のコンストラクト。
  5. コードされている産物が、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する１または複数の免疫刺激タンパク質である、請求項１～４のいずれかに記載のコンストラクト。
  6. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／または持続に関与しているか、またはそれを引き起こすか、または増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、免疫抑制逆シグナル伝達を無くす細胞質ドメイン欠失または切り詰めを有する４－１ＢＢＬ、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＣＤ４７アンタゴニスト、抗ＩＬ６抗体またはＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、ならびに腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの１つまたは複数の中から選択される、請求項５に記載のコンストラクト。
  7. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の潜在的な動員および／または持続に関与している分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、免疫抑制逆シグナル伝達を無くすように細胞質ドメインが欠失しているか、または切り詰められている、細胞質ドメインの欠失（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）または細胞質ドメインの部分的な欠失を有する４－１ＢＢＬ、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ならびに腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの１つまたは複数の中から選択される、請求項５に記載のコンストラクト。
  8. 細胞質ドメインの欠失もしくは部分的な欠失、または細胞質ドメインの部分的な欠失を有し、アミノ酸改変を含んでいてもよい４－１ＢＢＬをコードする核酸を含み、それによって、生じる４－１ＢＢＬが、細胞で発現されるときに、適切な配向性を呈する、請求項１～７のいずれかに記載のコンストラクト。
  9. 細胞質ドメインの欠失もしくは部分的な欠失を有する４－１ＢＢＬバリアントまたは切り詰められ改変された細胞質ドメインを有する改変された４－１ＢＢＬをコードする核酸を含み、４－１ＢＢＬの配列が、配列番号３９０、配列番号３９１、および配列番号３９２に記載されている、請求項１～８のいずれかに記載のコンストラクト。
  10. 以下の産物および産物の組合せ：
    ＩＬ－１２、またはＩＬ－１５、またはＩＬ１２ｐ７０、またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体の１つまたは複数；
    サイトカインおよびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路アゴニスト；
    サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、および共刺激受容体リガンドまたは免疫チェックポイント阻害剤；
    サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、およびＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト；ならびに
    サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、および共刺激受容体リガンドまたは免疫チェックポイント阻害剤、
    のいずれかをコードする核酸を含み、
    ＳＴＩＮＧ経路アゴニストが、ＳＴＩＮＧ経路の活性化を介して、Ｉ型インターフェロン発現を増大する任意の産物である、請求項１～９のいずれかに記載のコンストラクト。
  11. インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１～１０のいずれかに記載のコンストラクト。
  12. 以下の組合せ：
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＩＬ－１５およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬおよびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＴＧＦベータ受容体デコイまたはアンタゴニストポリペプチドおよびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＩＬ－１２およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＴＧＦベータ受容体デコイまたはアンタゴニスポリペプチド、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧポリペプチド、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１５、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１５、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１２、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬおよびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１５およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１２およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、ならびに
    ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、
    の中から選択される治療用産物の組合せをコードする核酸を含み、
    ４－１ＢＢＬが、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ、改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、または切り詰められ改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬであり、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体がｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃであり、
    ＳＴＩＮＧポリペプチドが、野生型ＳＴＩＮＧ、またはバリアントＳＴＩＮＧポリペプチド、またはキメラＳＴＩＮＧポリペプチド、またはアミノ酸置換を有するキメラＳＴＩＮＧポリペプチドである、
    請求項１～１１のいずれかに記載のコンストラクト。
  13. ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ機能獲得型（ＧＯＦ）バリアント；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    Δｃｙｔが細胞質ドメインの欠失である、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはＴＧＦ－βポリペプチドアンタゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに
    ＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント
    の中から選択される治療用産物の組合せをコードし、
    ４－１ＢＢＬが、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔ）、改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、または切り詰められ改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬであり、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体が、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃである、
    請求項１～１１のいずれかに記載コンストラクト。
  14. ＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現増大または構成的発現をもたらすように改変されているか、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する様々な種由来のＣ末端テール（ＣＴＴ）を有するヒトＳＴＩＮＧポリペプチドを含むキメラポリペプチドであり、
    ＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位が欠失していてもよく、
    ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有する、
    請求項１～１３のいずれかに記載のコンストラクト。
  15. コードされている治療用タンパク質が、ＩＬ－１２ｐ７０、ならびにタスマニアンデビル由来のＣＴＴおよびＩ型インターフェロンの発現増大または構成的発現をもたらすアミノ酸置換を有するキメラヒトＳＴＩＮＧポリペプチドを含むか、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現をもたらすアミノ酸置換を有するＳＴＩＮＧポリペプチドであり、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現をもたらす突然変異が、機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異である、請求項１～１４のいずれかに記載のコンストラクト。
  16. ＳＴＩＮＧポリペプチド中のアミノ酸置換（ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が、アラインメント用に配列番号３０５～３０９のいずれかを参照して、Ｒ２８４Ｇに対応する、請求項１５に記載のコンストラクト。
  17. ＳＴＩＮＧポリペプチドがＮ１５４Ｓ置換をさらに含む、請求項１１～１６のいずれかに記載のコンストラクト。
  18. ＩＬ－３６γをコードする核酸を含む、請求項１～１７のいずれかに記載のコンストラクト。
  19. 免疫チェックポイント阻害剤抗体またはその抗原結合性部分をコードする、請求項１～１８のいずれかに記載のコンストラクト。
  20. 免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、またはＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１である、請求項１９に記載のコンストラクト。
  21. コードされている産物が、ｓｃＦｖである抗体であるか、またはｓｃＦｖ－Ｆｃ ２本鎖ポリペプチドである、請求項１～２０のいずれかに記載のコンストラクト。
  22. 請求項１～２１のいずれかに記載のコンストラクトを含むプラスミド。
  23. 細菌プラスミドであり、コンストラクトが真核生物転写調節配列に作用可能に連結されている、請求項２２に記載のプラスミド。
  24. 転写調節配列が真核生物プロモーターを含む、請求項２３に記載のプラスミド。
  25. 請求項１～２４のいずれかに記載のコンストラクトまたはプラスミドによってコードされている抗がんタンパク質産物の混合物を含む組成物。
  26. 請求項１～２４のいずれかに記載のコンストラクトまたはプラスミドを含む免疫刺激細菌。
  27. 得られる細菌がｍｓｂＢ－／ｐｕｒＩ－であるように細菌のゲノムが改変されている、請求項２６に記載の免疫刺激細菌。
  28. 細菌がｍｓｂＢ－かつｐｕｒＩ－であり、それによって、ｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－遺伝子の少なくともコーディング部分の全長が欠失している、請求項２６または請求項２７に記載の免疫刺激細菌。
  29. 細菌のゲノムが改変されており、それによって、細菌が鞭毛を失っている、請求項２６～２８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  30. ゲノム改変を含み、それによって、細菌がｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である、請求項２６～２９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  31. ゲノム改変を含み、それによって、細菌がＬ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず、そのため、細菌がａｎｓＢ－である、請求項２６～３０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  32. 複数の治療用産物をコードするプラスミドを含み、細菌がｍｓｂＢ－かつｐｕｒＩ－であるように、細菌のゲノムが改変されており、それによって、ｍｓｂＢ－およびｐｕｒＩ－遺伝子の少なくともコーディング部分の全長が欠失している、免疫刺激細菌。
  33. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、分泌アスパラギナーゼの合成を活性化しない、免疫刺激細菌。
  34. アスパラギナーゼが、ａｎｓＢ遺伝子によってコードされているＬ－アスパラギナーゼＩＩである、請求項３３に記載の免疫刺激細菌。
  35. ゲノム改変を有し、それによって、細菌が鞭毛を失っており、ｐａｇＰ－、ａｎｓＢ－、かつｃｓｇＤ－である、請求項３４に記載の免疫刺激細菌。
  36. Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤである、請求項３５に記載の免疫刺激細菌。
  37. ゲノム改変を有し、それによって、細菌がｍｓｂＢ－である、請求項３３～３６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  38. ゲノム改変を有し、それによって、細菌が、アデノシン栄養要求体であるか、アデノシンおよびアデニン栄養要求体である、請求項３３～３７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  39. ゲノム改変を有し、それによって、細菌がｐｕｒＩ－である、請求項３３～３８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  40. プラスミドがアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードする、請求項３３～３９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  41. ｐｕｒＩ－である、請求項３３～４０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  42. 真核生物プロモーターの制御下にある、複数の治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、ペンタアシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）を生じるように改変されており、
    ヘキサアシル化されたリポ多糖が、野生型細菌に比べて、１０分の１以下に、実質的に低減されているか、不在であり、
    プラスミドが、単一プロモーターの制御下に、複数の補完抗がん治療用産物をコードし、補完治療用産物の各々が、がんの異なる側面を処置するか、異なるメカニズムを介して作用し、そのため、併用効果が、各産物の個別の効果の少なくとも相加である、免疫刺激細菌。
  43. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５による、細菌の認識が減弱しており、
    プラスミドが、単一プロモーターの制御下に、複数の補完治療用産物をコードする、免疫刺激細菌。
  44. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、ｃｕｒｌｉ線毛および／またはセルロースの合成を活性化せず、
    プラスミドが、単一プロモーターの制御下に、複数の補完治療用産物をコードする、免疫刺激細菌。
  45. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、プリン、アデノシン、またはＡＴＰについて栄養要求性であり、遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が鞭毛を失っており、
    プラスミドが、単一の真核生物プロモーターの制御下に、複数の治療用産物をコードする、免疫刺激細菌。
  46. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が鞭毛を失っており、
    プラスミドが、単一プロモーターの制御下に、複数の治療用産物をコードする、免疫刺激細菌。
  47. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変されており、
    プラスミドが、単一プロモーターの制御下に、複数の治療用産物をコードする、免疫刺激細菌。
  48. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変されており、腫瘍常在性骨髄性細胞内で複製できない、免疫刺激細菌。
  49. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが、
    ａ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌が、ペンタアシル化されたリポ多糖を生じるように改変され、
    免疫刺激細菌のゲノムが遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変され、それによって、細菌が、ペンタアシル化されたリポ多糖を生じるように改変され、
    ヘキサアシル化されたリポ多糖が、野生型細菌に比べて、１０分の１以下に、実質的に低減されるか、不在となる、欠失または破壊；
    ｂ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５の１つまたは複数による細菌の認識が減弱される、欠失または破壊；
    ｃ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌がｃｕｒｌｉ線毛および／またはセルロースの合成を活性化しなくなる、欠失または破壊；
    ｄ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌が分泌アスパラギナーゼの合成を活性化しなくなる、欠失または破壊；
    ｅ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌が、プリン、アデノシン、またはＡＴＰについて栄養要求性となる、欠失または破壊；
    ｆ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌が鞭毛を失う、欠失または破壊；
    ｇ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌が、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変される、欠失または破壊；
    ｈ）遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊であって、それによって、細菌が、腫瘍常在性骨髄性細胞に特異的に感染するように改変され、腫瘍常在性骨髄性細胞内で複製できない、欠失または破壊；ならびに
    ｉ）膜におけるリポタンパク質発現を低減するか、または無くす、ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢのいずれかまたは両方の欠失または破壊であって、それによって、コードされている治療用タンパク質の発現が腫瘍微小環境内および／または腫瘍常在性免疫細胞で増大する、欠失または破壊
    の中から選択される２つ以上の改変を含む、免疫刺激細菌。
  50. 改変ａ）、ｄ）、およびｆ）を含むか、または改変ｃ）およびｄ）を含む、請求項４９に記載の免疫刺激細菌。
  51. 改変ａ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、およびｆ）を含む、請求項４９に記載の免疫刺激細菌。
  52. 改変ａ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、およびｉ）を含むか、または改変ａ）、ｄ）、ｆ）、およびｉ）を含むか、または改変ｃ）、ｄ）、およびｉ）を含むか、または改変ｆ）およびｉ）を含むか、または改変ａ）～ｉ）を含む、請求項４９に記載の免疫刺激細菌。
  53. 改変ａ）、ｂ）、ｄ）、およびｆ）を含むか、または改変ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）を含む、請求項４９に記載の免疫刺激細菌。
  54. ｌｐｐＡおよびｌｐｐＢが欠失している、請求項２６～５３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  55. 鞭毛を失っており、ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－であり、プラスミドが、共刺激分子、サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、および免疫チェックポイント阻害剤抗体の中から選択される２種以上の治療用タンパク質の組合せをコードする、請求項２６～５４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  56. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、細菌によるマクロファージの感染が、ヒトＭ２マクロファージをＭ１表現型マクロファージに変換する、免疫刺激細菌。
  57. 治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    免疫刺激細菌が、そのゲノムに改変を含み、それによって、細菌が、腫瘍常在性マクロファージに感染し、上皮細胞に感染せず、
    マクロファージにおける治療用産物の発現が、ヒトＭ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換する、免疫刺激細菌。
  58. 治療用産物をコードするプラスミドを含み、マクロファージにおける治療用産物の発現が、ヒトＭ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換する、請求項２６～５７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  59. 治療用産物が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である、請求項２６～５８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  60. Ｉ型ＩＦＮの発現が構成的である、請求項５９に記載の免疫刺激細菌。
  61. 治療用産物が、細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である治療用産物の機能獲得型（ＧＯＦ）バリアントであり、ＧＯＦバリアント産物が、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを必要としない、請求項５９または請求項６０に記載の免疫刺激細菌。
  62. 治療用産物がバリアントＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項２６～６１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  63. 細菌による感染が、ヒトＭ２マクロファージをＭ１様のＩ型ＩＦＮ産生細胞に変換する、請求項２６～６２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  64. 鞭毛を失っており、野生型細菌が鞭毛を有し、免疫刺激細菌（ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｂａｃｔｅｒｉａｕｍ）がｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である、請求項２６～６３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  65. 免疫刺激細菌がゲノム改変を含有し、それによって、細菌が鞭毛を失っており、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢ）を産生しない、請求項２６～６４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  66. 免疫刺激細菌がゲノム改変も有し、それによって、細菌がｍｓｂＢ－かつｐａｇＰ－である、請求項６５に記載の免疫刺激細菌。
  67. 免疫刺激細菌がゲノムの改変を有し、それによって、ゲノムによって与えられる細菌表現型が、Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤまたはΔａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ／ΔｍｓｂＢ／ΔｐｕｒＩであり、プラスミドがアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードしてもよい、請求項２６～６６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  68. ＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするプラスミドを含む、請求項２６～６７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  69. ＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｉ型インターフェロンの発現増大または構成的発現をもたらすバリアントＳＴＩＮＧポリペプチドである、請求項６８に記載の免疫刺激細菌。
  70. ＳＴＩＮＧポリペプチドが、タスマニアンデビルＳＴＩＮＧ由来のＣ末端テール（ＣＴＴ）を含むヒトキメラＳＴＩＮＧポリペプチドである、請求項６９に記載の免疫刺激細菌。
  71. ＳＴＩＮＧポリペプチドが、アラインメント用に配列番号３０５～３０９のいずれかを参照して、Ｒ２８４Ｇに対応する置換を含む、請求項６９または請求項７０に記載の免疫刺激細菌。
  72. 配列番号３０５～３０９のいずれかを参照して、Ｎ１５４Ｓに対応する置換をさらに含む、請求項７１に記載の免疫刺激細菌。
  73. ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１の１つまたは複数をコードするプラスミドを含む、請求項２６～７２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  74. サルモネラ菌株である、請求項２６～７３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  75. 治療用産物が抗がん治療薬である、請求項２６～７４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  76. 細菌が、免疫刺激タンパク質である治療用産物をコードする、請求項２６～７５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  77. 免疫刺激タンパク質が、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質、改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激受容体もしくはリガンドである、請求項７６に記載の免疫刺激細菌。
  78. 細菌がゲノム改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っている、請求項２６～７７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  79. 細菌がゲノム改変を含み、それによって、細菌がｐａｇＰ－またはｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である、請求項２６～７８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  80. 細菌がゲノム改変を含み、それによって、細菌が、アスパラギナーゼを発現しないか、もしくは分泌アスパラギナーゼの合成を活性化せず、かつ／または
    免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードするａｎｓＢ遺伝子のすべてもしくは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、ａｎｓＢ－であり、活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現しない、
    請求項２６～７９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  81. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムがｃｓｇＤのすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌がｃｓｇＤ－であり、ｃｕｒｌｉ線毛の合成を活性化しない、免疫刺激細菌。
  82. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードするａｎｓＢ遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌がａｎｓＢ－であり、活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現しない、免疫刺激細菌。
  83. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが、Ｌ－アスパラギナーゼＩＩをコードするａｎｓＢ遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊、およびｃｓｇＤ遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、ａｎｓＢ－であり、活性Ｌ－アスパラギナーゼＩＩを発現せず、かつｃｓｇＤ－であり、ｃｕｒｌｉ線毛の合成を活性化しない、免疫刺激細菌。
  84. 鞭毛をコードする遺伝子または十分な部分のすべての欠失または破壊をさらに含み、それによって、細菌がフラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）であり、鞭毛を産生せず、野生型細菌が鞭毛を有する、請求項２６～８３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  85. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが、細菌のリポタンパク質をコードするｌｐｐＡおよびｌｐｐＢ遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、リポタンパク質が産生されず、プラスミド上にコードされている治療用産物が抗がん治療薬である、免疫刺激細菌。
  86. 免疫刺激細菌のゲノムが、ｃｓｇＤ遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によってさらに改変されており、それによって、細菌がｃｓｇＤ－であるか、またはゲノムに別または追加の改変を有し、それによって、バイオフィルム形成が損なわれている、請求項８５に記載の免疫刺激細菌。
  87. 細菌のゲノムが、遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によってさらに改変されており、それによって、細菌がｃｓｇＤ－／ｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－である、請求項８２～８６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  88. 細菌がゲノムの改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っている、請求項８２、８３、および８５～８７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  89. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が鞭毛を失っており、ｌｐｐＡ－／ｌｐｐＢ－であり、ｃｓｇＤ－であってもよいか、または鞭毛を失っており、ａｎｓＢ－であり、ｃｓｇＤ－であってもよい、免疫刺激細菌。
  90. 細菌がプリンについて栄養要求性である、請求項２６～８９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  91. 細菌がアデノシンについて栄養要求性である、請求項２６～８９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  92. アデノシン、アデニン、およびＡＴＰについて栄養要求性である、請求項２６～８９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  93. 細菌がｐｕｒＩ－である、請求項２６～９２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  94. 細菌がｐａｇＰ－である、請求項２６～９３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  95. 細菌がａｓｄ－である、請求項２６～９４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  96. アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素－（ａｓｄ－）であり、細菌が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードする内在性遺伝子のすべてまたは一部の破壊または欠失によりａｓｄ－であり、それによって、内在性ａｓｄが発現されない、請求項２６～９５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  97. 細菌プロモーターの制御下に、プラスミド上にアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）をコードする、請求項２６～９６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  98. 細菌がｍｓｂＢ－である、請求項２６～９７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  99. ゲノム改変を含み、それによって、細菌が、ａｓｄ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、かつｐａｇＰ－であり、野生型細菌が鞭毛を有する、請求項２６～９８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  100. ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、かつｐａｇＰ－であり、野生型細菌が鞭毛を有する、請求項２６～９８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  101. ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、かつｐａｇＰ－であり、野生型細菌が鞭毛を有する、請求項２６～９８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  102. 細菌がフラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）であり、野生型細菌が鞭毛を有する、請求項９６～１００のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  103. 細菌のゲノムが、ｌｐｐＡおよび／またはｌｐｐＢ遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌がｌｐｐＡ－および／またはｌｐｐＢ－であり、それによって、プラスミド上にコードされている治療用タンパク質の、腫瘍微小環境および／または腫瘍常在性マクロファージにおける発現が、完全なｌｐｐＡおよび／またはｌｐｐＢを有することを除いて同じ免疫刺激細菌と比較して、増大している、請求項２６～１０２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  104. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが、遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌が、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－、かつｐａｇＰ－であり、野生型細菌が鞭毛を有する、免疫刺激細菌。
  105. 真核生物プロモーターの制御下にある、治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、免疫刺激細菌のゲノムが、遺伝子のすべてまたは十分な部分の欠失または破壊によって改変されており、それによって、細菌がａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－であり、野生型細菌が鞭毛を有し、ｐａｇＰ－である、免疫刺激細菌。
  106. 細菌がフラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）である、請求項１０４または請求項１０５に記載の免疫刺激細菌。
  107. 細菌のゲノムがさらなる改変を含み、それによって、細菌が、ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐａｇＰ－、ｌｐｐＡ－、かつｌｐｐＢ－である、請求項１０５または１０６に記載の免疫刺激細菌。
  108. 治療用産物が抗がん治療薬である、請求項２６～１０７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  109. 治療用産物をコードする核酸が、分泌シグナルをコードする核酸に作用可能に連結されており、それによって、発現されたときに、治療用産物が分泌される、請求項２６～１０８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  110. ＳＰＩ－１侵入に関与する１つまたは複数の遺伝子またはオペロンが欠失または不活性化されており、それによって、免疫刺激細菌が上皮細胞に侵入しないか、または感染しない、請求項２６～１０９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  111. ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰの１つまたは複数が欠失または不活性化されている、請求項１１０に記載の免疫刺激細菌。
  112. プラスミドが低コピー数または中程度コピー数で存在する、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  113. プラスミドが中程度～低コピー数複製開始点を含む、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  114. プラスミドが低コピー数複製開始点を含む、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  115. プラスミドが低コピー数で存在する、請求項２６～１１１および１１４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  116. プラスミドがコピー数１５０またはそれ未満で存在する、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  117. プラスミドがコピー数１５０超で存在する、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  118. プラスミドが高コピー数で存在する、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  119. プラスミドが、両端を含めた２０と１５０の間であるか、１５０未満もしくは約１５０未満かつ２０もしくは約２０超であるか、または２０と１５０の間のコピー数である、中程度コピー数で存在する、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  120. プラスミドのコピー数が１５０超である、請求項２６～１１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  121. プラスミドのコピー数が１５０コピーもしくはそれ未満であるか、または１５０以下である、請求項１１６に記載の免疫刺激細菌。
  122. プラスミドが低コピー数で存在し、低コピー数が、２５未満もしくは２０未満、または約２５未満もしくは約２０コピー未満である、請求項２６～１１５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  123. 治療用産物が核酸またはタンパク質である、請求項２６～１２２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  124. 治療用産物がタンパク質である、請求項１２３に記載の免疫刺激細菌。
  125. プラスミドが２種以上の治療用産物をコードする、請求項２６～１２４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  126. プラスミド上にコードされている治療用産物が抗がん処置である、請求項２６～１２５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  127. 細菌が、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、および共刺激受容体または分子の中から選択される２種以上の産物をコードする、請求項２６～１２６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  128. 共刺激分子が細胞質ドメインを失っているか、またはコードされている共刺激分子が、確実に、細胞内で正しい配向性で発現されるように、改変され切り詰められた細胞質ドメインを有するか、または切り詰められた細胞質ドメインを有し、それによって免疫抑制逆シグナル伝達が消滅もしくは低減している、請求項１２７に記載の免疫刺激細菌。
  129. 治療用産物の１つまたは複数をコードする核酸が、細菌またはプラスミドを含む細胞から治療用産物を分泌するためのシグナルをコードする核酸を含む、請求項２６～１２８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  130. プラスミド上で産物をコードしている核酸が、真核生物宿主によって認識される調節配列に作用可能に連結されている、請求項２６～１２９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  131. 免疫刺激細菌が２種以上の産物をコードし、各産物の発現が、個別のプロモーターの制御下にあるか、またはすべての発現が、単一プロモーターの制御下にあり、コードされている各治療用産物の別個の翻訳を引き起こすように、各産物が、２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されている、請求項２６～１３０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  132. 単一プロモーターの制御下で発現される治療用産物の個別の発現を引き起こすように、核酸がＴ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａペプチドをコードする、請求項１３１に記載の免疫刺激細菌。
  133. 真核生物プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項２６～１３２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  134. プロモーターが、ウイルスプロモーターまたは哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１３３に記載の免疫刺激細菌。
  135. プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、およびアデノウイルスプロモーターの中から選択されるウイルスプロモーターである、請求項１３４に記載の免疫刺激細菌。
  136. プラスミド上にコードされている治療用産物または異種タンパク質の１つまたは複数の発現を制御するプロモーターが、伸長因子１（ＥＦ－１）アルファプロモーター、またはＭＮＤプロモーター、またはＵＢＣプロモーター、またはＰＧＫプロモーター、またはＣＡＧプロモーターである、請求項２６～１３４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  137. プラスミド上にコードされている治療用産物または異種タンパク質の１つまたは複数の発現を制御するプロモーターが、ＥＦ－１アルファ、アデノウイルス２または５後期、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＥＩＦ４Ａ１、ＣＡＧ、またはＣＤ６８プロモーターである、請求項２６～１３４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  138. プラスミド上にコードされている治療用産物または異種タンパク質の１つまたは複数の発現を制御するプロモーターが、後期プロモーターであるウイルスプロモーターである、請求項２６～１３４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  139. プラスミドが、治療用産物の発現を制御する、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、ＭＮＤ、ニワトリβ－グロブリン、およびｒｂＧｌｏｂ（ウサギグロブリン）遺伝子の中から選択されるターミネーターおよび／またはプロモーターを含む調節配列を含む、請求項２６～１３８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  140. コードされている治療用産物が、プラスミドを含有する細胞から分泌するためのシグナル配列に作用可能に連結されている、請求項２６～１３９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  141. 治療用産物をコードするプラスミドが、エンハンサー、プロモーター、治療用産物または異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテールを含むコンストラクトを含む、請求項２６～１４０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  142. プラスミドが、エンハンサー、プロモーター、ＩＲＥＳ、治療用産物または異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテールを含むコンストラクトを含む、請求項２６～１４１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  143. プラスミドが、エンハンサー、プロモーター、ＩＲＥＳ、局在化配列、治療用産物をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテールを含むコンストラクトを含む、請求項２６～１４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  144. プラスミドが、プラスミド上の細菌プロモーターからのリードスルーを低減するように配置された細菌ターミネーターを含むコンストラクトを含む、請求項２６～１４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  145. プラスミド上の真核生物プロモーターが、プラスミド上の細菌プロモーターとは反対方向を向いている、請求項２６～１４４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  146. 細菌プロモーターがａｓｄ遺伝子の発現を制御する、請求項１４５に記載の免疫刺激細菌。
  147. 治療用産物または異種タンパク質をコードするプラスミド上のコンストラクトがウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）を含む、請求項２６～１４６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  148. プラスミドが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるか、またはそのバリアントである治療用産物をコードする核酸を含有する、請求項２６～１４７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  149. 無改変型の治療用産物が、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、もしくは環状ジヌクレオチドを直接的もしくは間接的に感知するか、またはそれと相互作用して、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導し、バリアントタンパク質が、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを感知するか、またはそれと相互作用すること無しに、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導する、請求項１４８に記載の免疫刺激細菌。
  150. 治療用産物が、対象内で発現されたときに、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすバリアントである、請求項１４８に記載の免疫刺激細菌。
  151. 治療用産物が、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすのに、細胞質内核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、または環状ジヌクレオチドを必要としない機能獲得型（ＧＯＦ）バリアントである、請求項１４８に記載の免疫刺激細菌。
  152. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００、ならびに活性を増大させるか、またはＩ型インターフェロン活性が増大するかもしくは構成的となるように活性を増大させるそのバリアントの中から選択される、請求項２６～１５１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  153. 治療用産物が、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００、ならびに活性を増大させるか、またはＩ型インターフェロン活性が増大するかもしくは構成的となるように活性を増大させるそのバリアントの中から選択される、請求項２６～１５２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  154. 治療用産物が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現増大をもたらすか、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらす活性増大を有するバリアントタンパク質である、請求項２６～１５３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  155. プラスミドが、ヒトでインターフェロン症を促進するか、または引き起こすタンパク質の機能獲得型の構成的に活性なバリアントをコードする、請求項２６～１５４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  156. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧタンパク質中のリン酸化部位を無くし、それによって活性化Ｂ細胞の核因子カッパ－軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達を低減する突然変異を含むバリアントである、請求項６２～８０および１４８～１５５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  157. Ｉ型ＩＦＮを誘導する治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、もしくはＭＤＡ５、またはそのバリアントである、請求項１４８～１５６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  158. Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導する治療用産物が、活性増大または構成的活性を有するそのバリアントであり、
    治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、もしくはＭＤＡ５、またはそのバリアントである、
    請求項１４８～１５７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  159. 治療用産物が、Ｉ型ＩＦＮの発現増大をもたらす機能獲得型突然変異を含むＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、またはＭＤＡ５のバリアントである、請求項１４８～１５８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  160. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、またはＭＤＡ５のバリアントであって、ウイルス感染の結果としてリン酸化される１つまたは複数のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されており、それによって、生じるバリアントが、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するリン酸化模倣体となっている、バリアントである、請求項１４８～１５９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  161. 治療用産物が、アラインメント用に配列番号３１２を参照して、位置３９６、３９８、４０２、４０４、および４０５の残基で１つまたは複数の置換を有するＩＲＦ－３であり、
    前記残基がアスパラギン酸残基で置換されている、
    請求項１４８～１６０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  162. ＩＲＦ－３が、アラインメント用に配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ置換を含む、請求項１６１に記載の免疫刺激細菌。
  163. ＩＲＦ－３が、アラインメント用に配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄ置換を含む、請求項１６１に記載の免疫刺激細菌。
  164. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、およびＳＮＲＮＰ２００、ならびに活性を増大させるか、またはＩ型インターフェロン活性が増大するかもしくは構成的となるように活性を増大させるそのバリアントの中から選択される、請求項１４８～１６３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  165. 細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡを感知する治療用産物が、バリアントＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、またはＩＲＦ－３であり、
    無改変ＳＴＩＮＧが配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有し、無改変ＭＤＡ５が配列番号３１０に記載の配列を有し、無改変ＲＩＧ－Ｉが配列番号３１１に記載の配列を有し、無改変ＩＲＦ－３が配列番号３１２に記載の配列を有する、
    請求項１４８～１６４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  166. 治療用産物が、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、およびＲＩＧ－Ｉの中から選択され、かつＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、またはＲＩＧ－Ｉを構成的に活性にする機能獲得型突然変異を含み、それによって、Ｉ型ＩＦＮの発現が構成的である、請求項１４８～１６５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  167. 突然変異が、以下：
    ａ）ＳＴＩＮＧ中、アラインメント用に配列番号３０５～３０９を参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１つまたは複数；
    ｂ）ＭＤＡ５中、アラインメント用に配列番号３１０を参照して、Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２Ｆ、およびＡ４５２Ｔの１つまたは複数；
    ｃ）ＲＩＧ－Ｉ中、アラインメント用に配列番号３１１を参照して、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；ならびに
    ｄ）ＩＲＦ－３中、アラインメント用に配列番号３１２を参照して、Ｓ３９６Ｄ
    のように選択される、請求項１６５または請求項１６６に記載の免疫刺激細菌。
  168. 治療用産物が、アラインメント用に配列番号３０５～３０９のいずれかを参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｓ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａ、およびＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ、ならびにその保存的置換の中から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含有するバリアントＳＴＩＮＧである、請求項１４８～１６７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  169. 治療用タンパク質が、Ｉ型ＩＦＮの発現を増大させるか、または誘導し、
    Ｉ型ＩＦＮがインターフェロンαまたはインターフェロンβである、
    請求項２６～１６８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  170. ＳＰＩ－１侵入またはＳＰＩ－１非依存性侵入に関与する１つまたは複数の遺伝子またはオペロンが欠失、破壊、または不活性化されており、それによって、免疫刺激細菌が上皮細胞に侵入しないか、もしくは感染しないか、または上皮細胞に侵入するか、もしくは感染する能力が低減している、請求項２６～１６９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  171. ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢ、およびｓｐｔＰの１つまたは複数が欠失、破壊、または不活性化されている、請求項１７０に記載の免疫刺激細菌。
  172. １つまたは複数の遺伝子がｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢ、およびｓｒｇＣの中から選択される、請求項１７１に記載の免疫刺激細菌。
  173. ＳＰＩ－２複合体内のタンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊を有する、請求項２６～１７２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  174. プラスミドが、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードする、請求項２６～１７３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  175. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員および／または持続に関与しているか、またはそれを引き起こすか、もしくは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、免疫抑制逆シグナル伝達を無くすように、欠失しているか、もしくは切り詰められているか、または別途に改変されている細胞質ドメインを有する４－１ＢＢｌ、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＣＤ４７アンタゴニスト、抗ＩＬ６抗体またはＩＬ－６結合性デコイ受容体、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、ならびに腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの１つまたは複数の中から選択される、請求項１７４に記載の免疫刺激細菌。
  176. プラスミドが、配列番号３９０、配列番号３９１、または配列番号３９２にその配列が記載されている改変４－１ＢＢＬをコードする、請求項１７４または請求項１７５に記載の免疫刺激細菌。
  177. 共刺激タンパク質の精製または発現を容易にするように、共刺激タンパク質に連結されているタグをさらに含む、請求項１７５または請求項１７６に記載の免疫刺激細菌。
  178. タグが、配列番号３９２の残基２～１１として示されている配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含むｃ－ｍｙｃタグである、請求項１７７に記載の免疫刺激細菌。
  179. プラスミドが、４－１ＢＢＬポリペプチドおよび少なくとも１種の追加の治療用タンパク質をコードする、請求項１７４～１７８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  180. 追加の治療用タンパク質がＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃもしくはＩＬ－１２、またはＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５ｓｃおよびＩＬ－１２である、請求項１７９に記載の免疫刺激細菌。
  181. 単一プロモーターの制御下にある多シストロン性核酸中にコードされている、１－４ＢＢＬポリペプチドおよび１種または複数の追加の治療用ポリペプチドを含み、１－４ＢＢＬポリペプチドがポリシストロンの第１のポリペプチドである、請求項１７４～１８０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  182. 免疫刺激タンパク質が、細胞質ドメイン内で切り詰められていてもよいか、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、細胞質ドメインを失っていて、免疫抑制逆シグナル伝達を消滅させている、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢおよび４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）の中から選択される共刺激分子であり、
    切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの切り詰めまたは欠失により、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に逆調節シグナル伝達できない、
    請求項１７４～１８１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  183. コードされている産物が、ＳＴＩＮＧタンパク質、改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、キメラＳＴＩＮＧタンパク質、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、４－１ＢＢＬおよびその改変型もしくは切り詰め型、ＴＧＦベータ受容体デコイもしくはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、およびＩＬ－２１、ならびに／または
    ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５、もしくはＩＬ１２ｐ７０、もしくはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体の１つもしくは複数；
    サイトカインおよびＳＴＩＮＧ経路アゴニスト；
    サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、および共刺激分子もしくは免疫チェックポイント阻害剤のいずれか；
    サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、およびＴＧＦベータ受容体デコイもしくはポリペプチドアンタゴニスト；ならびに／または
    サイトカイン、ＳＴＩＮＧ経路アゴニスト、ＴＧＦベータ受容体デコイまたはポリペプチドアンタゴニスト、および共刺激分子もしくは免疫チェックポイント阻害剤
    の任意のもののうちの１つまたは複数を含む、請求項２６～１８２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  184. プラスミドが、腫瘍細胞アポトーシスを誘導するか、または腫瘍細胞に対して細胞毒性である産物をコードする核酸を含む、請求項２６～１８３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  185. 産物が核酸であり、
    産物をコードしている核酸が、分泌シグナルをコードする核酸を含み、それによって、産物が分泌される、
    請求項１８４に記載の免疫刺激細菌。
  186. 産物がアポトーシスを誘導する、請求項１８３または請求項１８４に記載の免疫刺激細菌。
  187. アポトーシスを誘導する産物がアズリンである、請求項１８６に記載の免疫刺激細菌。
  188. プラスミドが、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードし、免疫刺激タンパク質がサイトカインまたはケモカインである、請求項１７４～１８７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  189. プラスミドが、共刺激分子またはその細胞質ドメイン欠失型もしくは切り詰め型もしくは別途の改変型である、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質をコードする、請求項１７４～１８８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  190. 腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質が、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、およびＯＸ４０Ｌ、およびその細胞質ドメイン欠失型もしくは切り詰め型もしくは切り詰めかつ改変型の中から選択され、タンパク質が細胞で発現されたときに、改変が正しい配向性を促進し、細胞質の欠失、切り詰め、および／または改変が免疫抑制逆シグナル伝達を無くすか、または低減させる、請求項１８９に記載の免疫刺激細菌。
  191. プラスミドが、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニストである治療用産物をコードする、請求項２６～１９０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  192. ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニストが、抗ＴＧＦベータ抗体またはその断片、抗ＴＧＦベータ受容体抗体またはその断片、可溶性ＴＧＦベータアンタゴニストポリペプチド、およびＴＧＦベータ結合性デコイ受容体の中から選択される、請求項１９１に記載の免疫刺激細菌。
  193. ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニストをコードする核酸が、コードされているポリペプチドを分泌するためのシグナル配列をコードする核酸を含む、請求項１９１または請求項１９２に記載の免疫刺激細菌。
  194. 治療用産物が抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２６～１９３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  195. 抗体またはその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ナノボディ、ダイアボディ断片、単鎖抗体、およびｓｃＦｖ－Ｆｃ２本鎖抗体の中から選択される抗原結合性断片である、請求項１９４に記載の免疫刺激細菌。
  196. 抗体がｓｃＦＶである、請求項１９５に記載の免疫刺激細菌。
  197. 抗体がＦｃを含み、それによって、生じる抗体が２本鎖を含む、請求項１９５または請求項１９６に記載の免疫刺激細菌。
  198. 抗体が、可変軽鎖、リンカー、可変重鎖、およびＩｇＧ Ｆｃをコードする核酸を含む核酸によってコードされており、それによって、コードされている抗体がｓｃＦｖ－Ｆｃである、請求項１９５～１９７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  199. 抗体が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項１９５～１９８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  200. 抗体またはその抗原結合性断片が、ヒト化されているか、ヒトのものである、請求項１９４～１９９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  201. 抗体またはその抗原結合性断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、またはＩＬ－６のアンタゴニストである、請求項１９４～２００のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  202. プラスミドが、
    ａ）腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質；
    ｂ）Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはＩ型ＩＦＮの発現を増やす活性増大を有するそのバリアント、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすそのバリアントの１つまたは複数；および
    ｃ）抗がん抗体またはその抗原結合性部分
    の中から選択される２種以上の治療用産物をコードする、請求項２６～２０１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  203. 免疫刺激タンパク質が、細胞質ドメインまたは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に十分なその部分を失っている共刺激分子であり、それによって、切り詰められた共刺激分子が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に逆調節シグナル伝達できない、請求項２０２に記載の免疫刺激細菌。
  204. 単一プロモーターの制御下で、２種以上の治療用産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、
    治療用産物が、
    ａ）腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を与えるか、またはそれに貢献する免疫刺激タンパク質；
    ｂ）Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現をもたらす細胞質内ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質、またはＩ型ＩＦＮの発現を増やす活性増大を有するそのバリアント、またはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすそのバリアントの１つまたは複数；および
    ｃ）抗がん抗体またはその抗原結合性部分
    の中から選択され、
    コードしている核酸がＩＲＥＳ配列または２Ａペプチドによって分離されており、各産物をコードしている各核酸が、シグナル配列をコードする核酸に作用可能に連結されていてもよく、それによって、コードされているｍＲＮＡの翻訳の際に、各産物が、細菌および／またはプラスミドを含む細胞から個別に発現および分泌される、免疫刺激細菌。
  205. 免疫刺激タンパク質が、細胞質ドメインまたは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に十分なその部分を失っている共刺激分子であり、それによって、切り詰められた共刺激分子が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に逆調節シグナル伝達できない、請求項２０４に記載の免疫刺激細菌。
  206. プラスミドが、サイトカイン、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質、共刺激分子、および抗がん抗体またはその抗原結合性部分の中から選択される少なくとも２種の治療用産物をコードする、請求項２６～２０５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  207. プラスミドが、単一プロモーターの制御下で２種以上の治療用産物をコードし、
    産物の少なくとも２つまたは全てをコードする核酸の発現が、単一のプロモーターの制御下にあり、各産物をコードする核酸が、２Ａペプチドをコードする核酸によって分離されており、それによって、翻訳の際に、各産物が個別に発現される、
    請求項２６～２０６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  208. 治療用産物の１つまたは複数をコードする核酸が、発現された産物の分泌を指示する配列をコードする核酸に作用可能に連結されている、請求項２０２～２０７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  209. 治療用産物が、細胞質ドメイン欠失もしくは切り詰めまたは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現に関する他の改変を有する共刺激分子であり、
    切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介してＴ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメイン欠失、切り詰め、または他の改変によりＡＰＣに逆調節シグナル伝達できない、
    請求項２６～２０８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  210. 細胞質ドメインが欠失しているか、または切り詰められているか、または別段に改変されている共刺激分子が、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、またはＯＸ４０Ｌ、および細胞内で発現されるときに、タンパク質の正しい配向性を増大させるバリアントである、請求項２０９に記載の免疫刺激細菌。
  211. ２種以上の治療用産物をコードし、少なくとも１つの産物がａ）から選択され、少なくとも１つがｂ）から選択され、
    ａ）が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱しているＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように改変されているＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員／持続に関与するか、もしくはそれを引き起こすか、もしくは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＴＧＦベータポリペプチドアンタゴニスト、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、
    ｂ）が、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０、またはＳＮＲＮＰ２００である、
    請求項２６～２１０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  212. ＴＧＦベータ阻害抗体またはその抗原結合性断片、ＴＧＦベータ結合性デコイ受容体、抗ＩＬ６抗体またはその抗原結合性断片、およびＩＬ－６結合性デコイ受容体の１つまたは複数をコードするか、またはさらにコードする、請求項２６～２１１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  213. 治療用産物の以下の組合せ：
    ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ機能獲得型（ＧＯＦ）バリアント；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、およびΔｃｙｔが細胞質ドメインの欠失である４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに
    ＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント
    の１つまたは複数をコードし、
    ４－１ＢＢＬが、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ、改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、または切り詰められ改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬであり、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体がｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃである、
    請求項２６～２１２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  214. 以下の組合せ：
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ、
    ＩＬ－１５およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬおよびＳＴＩＮＧ、
    ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    ＩＬ－１２およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧ、
    ＴＧＦベータデコイ受容体またはアンタゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、およびＩＬ－１５、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、およびＩＬ－１２、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、およびＩＬ－１２、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＳＴＩＮＧ、
    ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ、
    ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１５、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１５、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、およびＩＬ－１２、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１２、
    ４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１２、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ４－１ＢＢＬおよびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１５およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１２およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、
    ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト、およびＩＬ－１５、およびＩＬ－２１、およびＴＧＦベータデコイ受容体またはポリペプチドアンタゴニスト
    の中から選択される治療用産物の組合せをコードする核酸を含み、
    ＩＬ－１５がＩＬ－１５またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体であり、
    ＳＴＩＮＧがＳＴＩＮＧポリペプチド、またはバリアントＳＴＩＮＧポリペプチド、またはキメラＳＴＩＮＧポリペプチド、またはアミノ酸置換を有するキメラＳＴＩＮＧであり、
    ＴＧＦベータが可溶性ＴＧＦベータデコイまたはＴＧＦベータアンタゴニストであり、
    ４－１ＢＢＬが、細胞質ドメインの欠失を有する４－１ＢＢＬ、改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、切り詰められた細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬ、または切り詰められ改変された細胞質ドメインを有する４－１ＢＢＬであり、
    抗ＣＴＬＡ－４抗体がｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃである、
    請求項２６～２１３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  215. ＴＧＦベータデコイがＦｃ融合を含むか、または抗ＴＧＦ抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項２１４に記載の免疫刺激細菌。
  216. ４－１ＢＢＬが、完全長であるか、またはＳｅｒ５および／もしくはＳｅｒ８にアミノ酸置換を有し、それによって免疫抑制逆シグナル伝達が低減されているか、もしくは無くなっている完全長であるか、または細胞質ドメイン欠失もしくは免疫抑制逆シグナル伝達を無くすか、もしくは低減する細胞質ドメイン切り詰めを有する１－４ＢＢＬであるか、または切り詰められた細胞質ドメイン中にアミノ酸置換を有し、それによって、細胞で発現されたときに、４－１ＢＢＬが正しい配向性である４－１ＢＢＬである、請求項２１４または請求項２１５に記載の免疫刺激細菌。
  217. ＳＴＩＮＧポリペプチドがＲ２８４Ｇ置換を含むか、またはＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇ置換を含むか、またはタスマニアンデビル由来のＣＴＴを有するキメラヒトＳＴＩＮＧポリペプチドであるか、もしくはタスマニアンデビル由来のＣＴＴと、全て配列番号３０５～３０９をアラインメント用に参照してＲ２８４Ｇに対応する置換もしくはＮ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇに対応する置換を有するキメラヒトＳＴＩＮＧポリペプチドであるキメラＳＴＩＮＧポリペプチドである、請求項２１４～２１６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  218. ＳＴＩＮＧ機能獲得型（ＧＯＦ）バリアントが、請求項１６７または請求項１６８に記載のいずれかの中から選択される、請求項２１３～２１５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  219. 治療用産物の以下の組合せ：
    ＩＬ－２およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－２およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    Δｃｙｔが細胞質ドメインの欠失である、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαおよびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２１；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１８；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＴＧＦ－βデコイ受容体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１２ｐ７０；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）、
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－２１；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニストおよびＩＬ－１２ｐ７０；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＬ－１８；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント；
    ＣＤ４０アゴニスト、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント、および４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢＬΔｃｙｔを含む）；ならびに
    ＣＤ４０アゴニストおよびＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアント
    の１つまたは複数をコードする免疫刺激細菌または細胞。
  220. ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアントが、請求項１６７または請求項１６８に記載のいずれかの中から選択される、請求項２１９に記載の免疫刺激細菌または細胞。
  221. コードされている治療用産物がＦｃドメインを含む、請求項２６～２２０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  222. コードされている治療用産物がＢ７タンパク質膜貫通ドメインを含む、請求項２６～２２１のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  223. コードされている治療用産物がＧＰＩアンカーで固定されている、請求項２６～２２２のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  224. コードされている治療用産物が、ヒト血清アルブミン、またはコードされている産物の血清中半減期を増大させるその誘導体を含む、請求項２６～２２３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  225. コードされている治療用産物がコラーゲンとの融合体を含む、請求項（ｃｌａｍｓ）２６～２２４のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  226. 細菌がグラム陰性細菌である、請求項２６～２２５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  227. 細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、大腸菌、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、エロモナス属、フランシセラ属、コレラ、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ菌、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、もしくはエリシペロスリクス属の菌株、または先行リストの細菌株のいずれかのその弱毒化株もしくはその改変株である、
    請求項２６～２２６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  228. 細菌が、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、発疹チフスリケッチア、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、エロモナス・ユークレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、ヒツジ偽結核菌、シトロバクター・フロインデイ、クラミジア・ニューモニエ、ヘモフィルス・ソムナス、ブルセラ・アボルタス、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・エルジノーサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブチリス、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ロシャリメア・クインターナ、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）である、請求項２６～２２６のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  229. 弱毒化細菌であるか、またはグラム陰性細菌である、請求項２６～２２８のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  230. サルモネラ属の菌株である、請求項２６～２２９のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  231. ネズミチフス菌株である、請求項２３０に記載の免疫刺激細菌。
  232. 無改変サルモネラ属が野生型株である、請求項２３０または請求項２３１に記載の免疫刺激細菌。
  233. 無改変サルモネラ菌株が弱毒化されている、請求項２３０または請求項２３１に記載の免疫刺激細菌。
  234. 免疫刺激細菌がＡＳＴ－１００株（ＶＮＰ２０００９またはＹＳ１６４６）またはＡＴＣＣ１４０２８株またはＡＴＣＣ１４０２８株の特定する特徴の全てを有する株に由来する、請求項２６～２３３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  235. ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、かつｐａｇＰ－である、請求項２２７～２３３のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  236. 細菌が補体殺傷耐性（ｒｃｋ）遺伝子をコードし、発現する、請求項２６～２３５のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  237. ｒｃｋ遺伝子がサルモネラ属ｒｃｋ遺伝子である、請求項２３６に記載の免疫刺激細菌。
  238. 治療用量で静脈内投与されたときに、血清ＩＬ－６、血清ＴＮＦアルファ、および血清ＩＬ－１０の誘導が、処置７日後に測定したときに、それぞれ１５０ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項２６～２３７のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  239. 治療用量で静脈内投与されたときに、血清ＩＬ－６、血清ＴＮＦアルファ、および血清ＩＬ－１０の誘導が、処置７日後に測定したときに、それぞれ１５０ｐｇ／ｍｌ未満である、免疫刺激細菌。
  240. 用量が１×１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）である、請求項２３８または請求項２３９に記載の免疫刺激細菌。
  241. 用量が１×１０８ＣＦＵ～１×１０９ＣＦＵである、請求項２３８または請求項２３９に記載の免疫刺激細菌。
  242. 治療用産物をコードし、補体殺傷耐性（ｒｃｋ）遺伝子をコードし、発現するように改変されているプラスミドを含み、野生型細菌がｒｃｋをコードしない、免疫刺激細菌。
  243. 大腸菌株である、請求項２４２に記載の免疫刺激細菌。
  244. 抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するための、完全または部分的な細胞質ドメイン欠失を有する切り詰められた共刺激分子をコードするデリバリー媒体であって、切り詰められた遺伝子産物が、共刺激受容体エンゲージメントを介して、Ｔ細胞に構成的に免疫刺激シグナル伝達でき、細胞質ドメインの欠失により、ＡＰＣに逆調節シグナル伝達できない、デリバリー媒体。
  245. 共刺激分子が、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、またはＯＸ４０Ｌ、または細胞質ドメインの欠失もしくは切り詰めおよび／もしくは細胞で発現されたときにタンパク質の適切な配向性を与える突然変異を有するそのバリアントである、請求項２４４に記載のデリバリー媒体。
  246. 免疫刺激細菌、エキソソーム、ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルス、または細胞である、請求項２４４または請求項２４５に記載のデリバリー媒体。
  247. 細胞である、請求項２４４～２４６のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  248. 細胞が幹細胞である、請求項２４７に記載のデリバリー媒体。
  249. 幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項２４８に記載のデリバリー媒体。
  250. ＭＳＣが、免疫調節性サイトカインの組合せを発現するように遺伝子改変されている、請求項２４９に記載のデリバリー媒体。
  251. サイトカインがインターロイキン１２（ＩＬ－１２）およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）である、請求項２５０に記載のデリバリー媒体。
  252. 請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体を含む単離された細胞。
  253. 請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌を含む単離された細胞。
  254. 免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、または初代細胞系である、請求項２５２または請求項２５３に記載の細胞。
  255. 造血細胞である、請求項２５４に記載の細胞。
  256. Ｔ細胞である、請求項２５５に記載の細胞。
  257. デリバリー媒体または免疫刺激細菌で細胞を感染させることによってエクスビボで産生される、請求項２５２～２５６のいずれかに記載の細胞。
  258. 胚起源でない幹細胞である、請求項２５２～２５４のいずれかに記載の細胞。
  259. 細胞が幹細胞である、請求項２５２～２５４のいずれかに記載の細胞。
  260. 幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項２５９に記載の細胞。
  261. ＭＳＣが、免疫調節性サイトカインの組合せを発現するように遺伝子改変されている、請求項２６０に記載の細胞。
  262. サイトカインがインターロイキン１２（ＩＬ－１２）およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）である、請求項２６１に記載の細胞。
  263. 薬学的に許容される媒体中に、請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物。
  264. 薬学的に許容される媒体中に請求項８４の免疫刺激細菌を含む医薬組成物。
  265. 無希釈の投与用に製剤化されている、請求項２６３または請求項２６４に記載の医薬組成物。
  266. 全身投与用に製剤化されている、請求項２６３～２６５のいずれかに記載の医薬組成物。
  267. 非経口投与用に製剤化されている、請求項２６３～２６６のいずれかに記載の医薬組成物。
  268. 静脈内投与用に製剤化されている、請求項２６７に記載の医薬組成物。
  269. 腫瘍内投与用に製剤化されている、請求項２６７に記載の医薬組成物。
  270. 腹腔内投与用に製剤化されている、請求項２６７に記載の医薬組成物。
  271. 経口投与用に製剤化されている、請求項２６６に記載の医薬組成物。
  272. 対象内に固形腫瘍または血液系腫瘍を含むがんの処置の方法であって、請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞または請求項２６３～２７１のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  273. 対象内に固形腫瘍または血液系腫瘍を含むがんの処置のための、請求項２６～２４４のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞、または請求項２６３～２７１のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  274. 対象内に固形腫瘍または血液系腫瘍を含むがんの処置のための使用のための請求項２６～２４４のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞、または請求項２６３～２７１のいずれかに記載の医薬組成物。
  275. 対象がヒトである、請求項２７２～２７４のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  276. がんが固形腫瘍を含む、請求項２７２～２７５のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  277. がんが血液系腫瘍を含む、請求項２７２～２７５のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  278. 処置が、第２の抗がん剤または処置が投与される併用療法を含む、請求項２７２～２７７のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  279. 第２の抗がん剤または処置が、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物の前に、またはそれと同時に、またはその後に、またはそれと間欠的に投与される、請求項２７８に記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  280. 第２の抗がん剤または処置が免疫治療である、請求項２７８または請求項２７９に記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  281. 免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物の投与が非経口投与である、請求項２７２～２８０のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  282. 免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物の投与が経口投与または直腸投与であるか、または肺へのエアロゾルによるか、または腫瘍内投与である、請求項２７２～２８０のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  283. 免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物の投与が、静脈内投与、筋内投与、または皮下投与である、請求項２７２～２８０のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  284. がんが、白血病；リンパ腫；胃がん；ならびに乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部、および肝臓のがんの中から選択される、請求項２７２～２８３のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  285. 免疫治療が、抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはその抗原結合性部分もしくは抗原結合型の投与を含む、請求項２８０に記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  286. 免疫刺激細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、リステリア属、または大腸菌種である、請求項２７２～２８５のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  287. 免疫刺激細菌がサルモネラ属種である、請求項２７２～２８６のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  288. 免疫刺激細菌がネズミチフス菌株である、請求項２７２～２８７のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  289. 免疫刺激細菌の投与が腹腔内投与または腫瘍内投与による、請求項２７２～２８８のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  290. 対象が転移性がんを有する、請求項２７２～２８９のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  291. 第２の抗がん処置を投与することを含み、第２の処置が、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＩＬ－６、抗シグレック１５、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ７３、および抗ＣＤ３８抗体、またはその抗原結合性部分もしくは抗原結合型の中から選択される、請求項２７２～２９０のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  292. 第２の抗がん処置またはさらなる抗がん処置を投与することを含み、第２の処置またはさらなる処置が、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、化学療法剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗Ｈｅｒ２抗体、抗メソテリン抗体、および抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体の中から選択される、請求項２７２～２９１のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  293. 免疫刺激細菌がａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、かつｐａｇＰ－である、請求項２７２～２９２のいずれかに記載の方法、使用、免疫刺激細菌、デリバリー媒体、細胞、または医薬組成物。
  294. 請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞、または請求項２６３～２７１のいずれかに記載の医薬組成物で処置するための対象を選択する方法であって、
    対象から生体試料を得ること、および
    免疫排除または免疫砂漠腫瘍表現型を示す１または複数のバイオマーカーを検出すること
    を含む方法。
  295. バイオマーカーが、
    腫瘍微小環境内へのＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤を示す試験；
    腫瘍および腫瘍コアの浸潤辺縁部へのＴ細胞またはＴＩＬの限定を測定するバイオマーカー；
    ＴＩＬのレベル；
    ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＴＨＢＳ１、ＩＬ－６、ＣＳＦ－３、ＩＬ－１ベータ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、またはＣＣＬ７を示すアデノシンシグネチャー（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）；
    ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－６、またはＰＴＧＳ２を示す骨髄シグネチャー（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）；および
    ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＴＮＡＰ（組織非特異性アルカリホスファターゼ）、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＰＤ－Ｌ１、およびＦｏｘＰ３の１つまたは複数のレベル
    の中から選択される、請求項２９４に記載の方法。
  296. 請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞、または請求項２６３～２７１のいずれかに記載の医薬組成物による療法をモニターする方法であって、
    対象から生体試料を得ること、およびバイオマーカーのレベルの変化を検出することを含み、
    抗がん表現型を示すバイオマーカーの増大が、処置が有効なことを示し、
    バイオマーカーが、サイトカイン応答、Ｉ型インターフェロンの活性化、またはＩＩ型インターフェロンの活性化を示す任意のものである、方法。
  297. バイオマーカーが、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＣＸＣＬ９、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、炎症促進性血清サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１、またはＣＣＬ２、およびＩＬ－１８結合タンパク質の１つまたは複数のレベルの中から選択され、
    バイオマーカーの１つまたは複数のレベルの増大が、処置が有効なことを示す、
    請求項２９６に記載の方法。
  298. 生体試料が腫瘍生検または体液の試料である、請求項２９４～２９７のいずれかに記載の方法。
  299. 請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項２４４～２５１のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項２５２～２６２のいずれかに記載の細胞、または請求項２６３～２７１のいずれかに記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、請求項２９４～２９８のいずれかに記載の方法。
  300. 非ヒト種由来の改変されたインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質であって、非ヒトＳＴＩＮＧが、ヒトＳＴＩＮＧと比較して低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し、ヒトＳＴＩＮＧと比較して高いＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路シグナル伝達活性を有してもよいものであり、
    非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が改変されて、その活性が増大するか、または細胞質内核酸の非存在下に構成的に作用するような突然変異を含み、
    突然変異がアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換であり、
    ＳＴＩＮＧタンパク質が、ＴＲＡＦ６結合部位の欠失または破壊を有してもよい、
    改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  301. 非ヒト種由来の改変されたインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質、またはキメラヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびその改変体であって、コードされているＳＴＩＮＧタンパク質の構成的な活性化および／もしくは感受性の増強、または内在性リガンドに対する親和性または結合の増大をもたらす機能獲得（ＧＯＦ）を伴う１つまたは複数の突然変異を含み、それによって、ＳＴＩＮＧタンパク質が、アミノ酸の挿入、欠失、および置換の１つまたは複数によって改変されており、
    ＳＴＩＮＧタンパク質が、ＩＦＮ－ベータシグナル伝達活性、およびヒトＳＴＩＮＧと比較して減弱した活性化Ｂ細胞の核因子カッパ－軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達活性を有し、
    突然変異が、ＳＴＩＮＧ活性の増大またはＩＦＮ－ベータ産生の誘導における構成的な活性をもたらす、
    改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  302. ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有するか、または配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそのヒト対立遺伝子バリアントである、請求項３００または請求項３０１に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  303. ＳＴＩＮＧタンパク質が、第１の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質中のＣ末端テール（ＣＴＴ）領域の、第２の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴによる置換を含むキメラであり、
    第２の種のＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し、
    ＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位が欠失していてもよい、
    請求項３００～３０２のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  304. 突然変異が、自己炎症性疾患であるＳＴＩＮＧ関連血管炎（ＳＡＶＩ）と関連するものに対応する任意のものである、請求項３００～３０３のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  305. キメラである改変されたインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質であって、第１の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質中のＣＴＴ（Ｃ末端テール）領域の、第２の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴによる置換を含み、
    第２の種のＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し、
    ＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位が欠失していてもよい、
    改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  306. ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有するか、または配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそのヒト対立遺伝子バリアントである、請求項３０３～３０５のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  307. 第１の種がヒトであり、第２の種が、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメの中から選択される、請求項３０３～３０６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  308. Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の活性の少なくともまたは少なくとも約３０％である、請求項３００～３０７のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  309. ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧ ＮＦ－κＢシグナル伝達活性の３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満である、請求項３００～３０８のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  310. 非ヒト種または第２の種が、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメの中から選択される、請求項３００～３０９のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  311. ＳＴＩＮＧの改変が、ヒトＳＴＩＮＧへの参照およびそれとのアラインメントによって、インターフェロン症で起こる突然変異に対応する突然変異であり、アラインメントするヒトＳＴＩＮＧ配列が配列番号３０５～３０９に記載されている、請求項３００～３１０のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  312. ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して低減したＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有するＳＴＩＮＧタンパク質由来のＣ末端テール（ＣＴＴ）による、ＣＴＴの置換を含む、請求項３００～３１１のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  313. 置換する側のＣＴＴが、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメＳＴＩＮＧタンパク質由来である、請求項３１２に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  314. 置換する側のＣＴＴが、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメＳＴＩＮＧタンパク質由来であり、それがヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴを置換する、請求項３１２に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  315. 置換する側のＣＴＴが以下の種の中から選択され、以下の配列：
    タスマニアンデビル RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF 配列番号３７１、
    マーモセット EEEEVTVGSLKTSEVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRSDLF 配列番号３７２、
    ウシ EREVTMGSTETSVMPGSSVLSQEPELLISGLEKPLPLRSDVF 配列番号３７３、
    ネコ EREVTVGSVGTSMVRNPSVLSQEPNLLISGMEQPLPLRTDVF 配列番号３７４、
    ダチョウ RQEEYTVCDGTLCSTDLSLQISESDLPQPLRSDCL 配列番号３７５、
    イノシシ EREVTMGSAETSVVPTSSTLSQEPELLISGMEQPLPLRSDIF 配列番号３７６、
    コウモリ EKEEVTVGTVGTYEAPGSSTLHQEPELLISGMDQPLPLRTDIF 配列番号３７７、
    マナティー EREEVTVGSVGTSVVPSPSSPSTSSLSQEPKLLISGMEQPLPLRTDVF 配列番号３７８、
    トキ CHEEYTVYEGNQPHNPSTTLHSTELNLQISESDLPQPLRSDCF 配列番号３７９、
    シーラカンス
    （バリアント１） QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKRQVC 配列番号３８０、
    シーラカンス
    （バリアント２） QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKSGF 配列番号３８１、
    ギンザメ LTEYPVAEPSNANETDCMSSEPHLMISDDPKPLRSYCP 配列番号３８３、および
    マウス EKEEVTMNAPMTSVAPPPSVLSQEPRLLISGMDQPLPLRTDLI 配列番号３８４、
    またはこれらの配列それぞれと少なくとも９８％の配列同一性を有するそれらの対立遺伝子バリアント
    を有する、請求項３１３または請求項３１４に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  316. ヒトＣＴＴが、配列EKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS（配列番号３７０）を含むか、それと少なくとも９８％の配列同一性を有する対立遺伝子バリアントである、請求項３１４または請求項３１５に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  317. 改変されたＳＴＩＮＧタンパク質が、ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ由来のＣＴＴで置換されているキメラである、請求項３０５～３１６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  318. タスマニアンデビルＳＴＩＮＧ由来のＣ末端テール（ＣＴＴ）が配列RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF（配列番号３７１）を含むか、それと少なくとも９８％の配列同一性を有する対立遺伝子バリアントである、請求項３１７に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  319. ＴＲＡＦ６結合部位の欠失または破壊を含む、請求項３００～３１８のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  320. ＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧタンパク質であり、ＴＲＡＦ６結合部位がＣ末端にアミノ酸残基ＤＦＳを含む、請求項３１９に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  321. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達活性を増大させるか、または活性を細胞質内核酸の非存在下で構成的にする改変を含む、請求項３００～３２０のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  322. 改変が、ヒトＳＴＩＮＧへの参照およびそれとのアラインメントによって、インターフェロン症で起こる突然変異に対応し、ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有する、請求項３２１に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  323. 改変が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のヒトＳＴＩＮＧの配列をアラインメント用に参照して、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５Ａ、およびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａの１つまたは複数に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換である、請求項３００～３２２のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  324. 配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のヒトＳＴＩＮＧの配列をアラインメント用に参照して、Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇに対応する置換を含む、請求項３２３に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  325. Ｎ１５４Ｓ／Ｒ２８４Ｇに対応する置換を含む、請求項３２４に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  326. タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項３００に記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質。
  327. 請求項３００～３２６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸を含むデリバリー媒体。
  328. 非ヒト種由来のＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸を含むデリバリー媒体であって、ＳＴＩＮＧタンパク質がＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性、およびヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して減弱したＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有するデリバリー媒体。
  329. ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３０５～３０９のいずれかに記載の配列を有するか、または配列番号３０５～３０９のいずれかに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそのヒト対立遺伝子バリアントである、請求項３２８に記載のデリバリー媒体。
  330. Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧのＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性の少なくともまたは少なくとも約３０％である、請求項３２８または請求項３２９に記載のデリバリー媒体。
  331. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質のＮＦ－κＢシグナル伝達活性がヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性の３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満である、請求項３２７～３３０のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  332. 非ヒト種がタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメである、請求項３２７～３３１のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  333. 細胞、エキソソーム、腫瘍溶解性ウイルスもしくはウイルスベクター、リポソームもしくは他の脂質ベースの媒体、または免疫刺激細菌である、請求項３２７～３３２のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  334. デリバリー媒体が、幹細胞または免疫細胞である細胞である、請求項３３３に記載のデリバリー媒体。
  335. デリバリー媒体が、請求項２６～２４３のいずれかに記載の免疫刺激細菌である、請求項３３３に記載のデリバリー媒体。
  336. 免疫刺激細菌がａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、かつｐａｇＰ－である、請求項３３５に記載のデリバリー媒体。
  337. 免疫刺激細菌がａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐａｇＰ－、ｌｐｐＡ－、かつｌｐｐＢ－である、請求項３３５に記載のデリバリー媒体。
  338. 請求項３００～３２６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質をコードするか、または非ヒト種由来のＳＴＩＮＧタンパク質をコードするプラスミドを含む免疫刺激細菌であって、コードされているＳＴＩＮＧタンパク質がＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性、およびヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して減弱したＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する、免疫刺激細菌。
  339. ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－であり、野生型細菌が鞭毛を有し、ｐａｇＰ－である、請求項３３８に記載の免疫刺激細菌。
  340. ａｎｓＢ－、ａｓｄ－、ｃｓｇＤ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラゲリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）であり、野生型細菌が鞭毛を有し、ｐａｇＰ－、ｌｐｐＡ－かつｌｐｐＢ－である、請求項３３８に記載の免疫刺激細菌。
  341. 非ヒト種が、タスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティー、トキ、シーラカンス、マウス、およびギンザメの中から選択される、請求項３３８～３４０のいずれかに記載の免疫刺激細菌。
  342. 免疫刺激細菌がグラム陰性細菌である、請求項３３８～３４１のいずれかに記載の免疫刺激細菌または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  343. 免疫刺激細細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、大腸菌、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、エロモナス属、フランシセラ属、コレラ、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ菌、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、もしくはエリシペロスリクス属の菌株、または先行リストの細菌株のいずれかのその弱毒化株もしくはその改変株である、請求項３３８～３４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  344. 免疫刺激細菌が、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、発疹チフスリケッチア、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、エロモナス・ユークレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、ヒツジ偽結核菌、シトロバクター・フロインデイ、クラミジア・ニューモニエ、ヘモフィルス・ソムナス、ブルセラ・アボルタス、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・エルジノーサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブチリス、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ロシャリメア・クインターナ、もしくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）、または先行リストの細菌株のいずれかのその弱毒化株もしくはその改変株である、請求項３３８～３４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  345. 免疫刺激細菌が弱毒化細菌である、請求項３３８～３４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  346. 細菌がサルモネラ属の菌株である、請求項３３８～３４２のいずれかに記載の免疫刺激細菌または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体。
  347. 細菌がネズミチフス菌株である、請求項３４６に記載の免疫刺激細菌またはデリバリー媒体。
  348. 無改変サルモネラ属が野生型株である、請求項３４６または請求項３４７に記載の免疫刺激細菌またはデリバリー媒体。
  349. 無改変サルモネラ菌株が弱毒化されている、請求項３４６または請求項３４７に記載の免疫刺激細菌またはデリバリー媒体。
  350. 免疫刺激細菌がＡＳＴ－１００株（ＶＮＰ２０００９またはＹＳ１６４６）またはＡＴＣＣ１４０２８株またはＡＴＣＣ１４０２８株の特定する特徴の全てを有する株に由来する、請求項３２７～３４９のいずれかに記載の免疫刺激細菌またはデリバリー媒体。
  351. 薬学的に許容される媒体中に、請求項３００～３２６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌を含む医薬組成物。
  352. 請求項３００～３２６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌を含み、ヒト受精卵の接合子ではない、単離された細胞。
  353. 免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、または初代細胞系である、請求項３５２に記載の細胞。
  354. 請求項３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌を含む単離された細胞または培養細胞。
  355. 造血細胞である、請求項３５３または請求項３５４に記載の細胞。
  356. Ｔ細胞である、請求項３５５に記載の細胞。
  357. 免疫刺激細菌またはデリバリー媒体で細胞を感染させることによってエクスビボで産生される、請求項３５２～３５６のいずれかに記載の細胞。
  358. Ｔ細胞または造血細胞である、請求項３５７に記載の細胞。
  359. 請求項３００～３２６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項３５１に記載の医薬組成物、または請求項３５２～３５８のいずれかに記載の細胞を、固形腫瘍を含むか、または血液系腫瘍であるがんを有する対象に投与することを含む、がんの処置の方法。
  360. がんが固形腫瘍を含む、請求項３５９に記載の方法。
  361. がんが転移性である、請求項３５９または請求項３６０に記載の方法。
  362. がんが、リンパ腫；白血病；胃がん；ならびに乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部、および肝臓のがんの中から選択される、請求項３５９～３６１のいずれかに記載の方法。
  363. がんの処置のための、請求項３００～３２６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、または請求項３２７～３３７のいずれかに記載のデリバリー媒体、または請求項３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌、または請求項３５１に記載の医薬組成物、または請求項３５２～３５８のいずれかに記載の細胞の使用。
  364. がんが固形腫瘍または血液系腫瘍を含む、請求項３６３に記載の使用。
  365. がんが転移性である、請求項３６３または請求項３６４に記載の使用。
  366. がんが、リンパ腫；白血病；胃がん；ならびに乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部、および肝臓のがんの中から選択される、請求項３６３～３６５のいずれかに記載の使用。
  367. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、配列番号３４９、３５６、または３５９～３６９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号３４９、３５６、または３５９～３６９のいずれかに記載のアミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有する、各種のＳＴＩＮＧタンパク質の対立遺伝子バリアントである、請求項３００～３６６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、デリバリー媒体、免疫刺激細菌、医薬組成物、細胞、方法、または使用。
  368. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質またはキメラが、配列番号３５０～３５５、３５７、または３５８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、請求項３００～３６６のいずれかに記載の改変されたＳＴＩＮＧタンパク質、デリバリー媒体、免疫刺激細菌、医薬組成物、細胞、方法、または使用。
  369. Ｍ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型に変換する方法であって、請求項２６～２４３および３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌を、抗腫瘍免疫応答を増強することによって処置される状態、疾患、または障害を有する対象に投与することを含む方法。
  370. がんを有する対象内で、Ｍ２マクロファージをＭ１またはＭ１様の表現型マクロファージに変換し、それによって、抗腫瘍免疫応答が誘導されるか、または増強される使用のための、請求項２６～２４３および３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌または請求項２５～３４３および３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌の使用。
  371. 疾患、障害、または状態が、固形腫瘍を含むがんである、請求項３６９に記載の方法または請求項３７０に記載の使用もしくは細菌。
  372. 請求項２６～２４３および３３８～３５０のいずれかに記載の免疫刺激細菌を含む単離された細胞。
  373. 免疫細胞または幹細胞である、請求項３７２に記載の細胞。
  374. 細胞が、胚幹細胞ではない幹細胞である、請求項３７３に記載の細胞。
  375. Ｔ細胞である、請求項３７３に記載の細胞。
  376. ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項３７５に記載の細胞。
  377. 請求項３７２～３７６のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、がんの処置の方法。
  378. がんの処置のための使用のための、請求項３７２～３７６のいずれかに記載の細胞。
  379. がんの処置のための、請求項３７２～３７６のいずれかに記載の細胞の使用。
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