CN116249779A - 免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了减毒的免疫刺激细菌，其基因组经过修饰以例如降低毒性和提高抗肿瘤活性，如通过增加在肿瘤微环境中、特别是在肿瘤驻留骨髓细胞中的积累、提高对补体失活的抗性、减少免疫细胞死亡、促进适应性免疫及增强T细胞功能进行。吞噬细胞定植的增加改良了编码的治疗产物向肿瘤微环境和肿瘤中的递送，并允许免疫刺激细菌的全身施用等途径。

Description

免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途
相关申请
本申请要求于2020年3月16日提交的共同未决美国临时专利申请No.62/990,404的优先权权益，题目为“TUMOR-SPECIFIC IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERYPLATFORM”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是Laura Hix Glickman、Christopher D.Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae和HaixingKehoe。
本申请要求于2020年1月16日提交的共同未决美国临时专利申请No.62/962,162的优先权权益，题目为“TUMOR-SPECIFIC IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERYPLATFORM”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是Laura Hix Glickman、Christopher D.Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae和HaixingKehoe。
本申请还要求于2019年11月12日提交的共同未决美国临时专利申请No.62/934,503的优先权权益，题目为“TUMOR-SPECIFIC IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERYPLATFORM”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是Laura Hix Glickman、Christopher D.Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae和HaixingKehoe。
这个申请涉及2020年2月27日提交的共同未决国际专利申请No.PCT/US2020/020240，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS,TUMOR-RESIDENT IMMUNE CELLS,AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT”，申请人是ActymTherapeutics,Inc.，以及发明人是Christopher D.Thanos、Laura Hix Glickman、JustinSkoble、Alexandre Charles Michel Iannello和Haixing Kehoe。
这个申请还涉及2020年1月16日提交的共同未决美国临时申请No.62/962,140，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS,TUMOR-RESIDENTIMMUNE CELLS,AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是Christopher D.Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble、AlexandreCharles Michel Iannello和Haixing Kehoe。
这个申请还涉及2019年11月12日提交的共同未决美国临时申请No.62/934,478，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS AND THE TUMORMICROENVIRONMENT”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是ChristopherD.Thanos、Laura Hix Glickman、Justin Skoble和Alexandre Charles Michel Iannello。
这个申请还涉及2018年7月11日提交的国际专利申请No.PCT/US2018/041713及2019年1月17日发布为WO 2019/014398，及涉及2018年7月11日提交的共同未决美国专利申请No.16/033,187及2019年1月17日发布为美国专利No.2019/0017050 A1，题目均为“ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF”，均要求2017年7月11日提交的美国临时专利申请No.62/531,327和2018年3月26日提交的62/648,380的优先权权益。在允许的情况下，每个这些申请的主题通过引用整体并入。
这个申请还涉及2019年7月11日提交的共同未决国际专利申请No.PCT/US2019/041489及2020年1月16日发布为WO 2020/014543，及涉及2019年7月23日提交的共同未决美国专利申请No.16/520,155，题目均为“ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIALSTRAINS AND USES THEREOF”，且均要求2019年1月8日提交的美国临时专利申请No.62/789,983和2019年4月3日提交的美国临时专利申请No.62/828,990的优先权权益。
这个申请还涉及2019年2月27日提交的美国临时专利申请No.62/811,521和2019年4月3日提交的62/828,990的优先权权益。
在这些申请中的每一个申请中提供的免疫刺激细菌可以如本申请中所述进行修饰，并且这些细菌通过引用并入本文。在允许的情况下，这些申请中的每一个申请的主题均通过引用整体并入。
通过引用并入以电子方式提供的序列表
与本申请一起提交序列表的电子版本，其内容通过引用整体并入。该电子文件创建于2020年11月11日，大小为687kb，名称为1707SEQPC1.txt。
发明领域
提供了具有被修饰的基因组的减毒免疫刺激细菌，以例如降低毒性和提高抗肿瘤活性，例如通过增加在肿瘤微环境中、特别是在肿瘤驻留骨髓细胞中的积累，通过提高对补体失活的抗性，通过减少免疫细胞死亡，通过促进适应性免疫及通过增强T细胞功能而实现。吞噬细胞定植的增加改善了编码的治疗产物向肿瘤微环境和肿瘤的递送，并允许所述免疫刺激细菌的全身施用等途径。
发明背景
抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1免疫检查点抗体的临床成功证明，癌症免疫治疗领域取得了长足进步(见例如Buchbinder et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3377-3383；Hodiet al.(2010)N.Engl.J.Med.363(8):711-723；and Chen et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3384-3391)。肿瘤已经进化出一种极度的免疫抑制环境。其启动多种机制以逃避免疫监视，重新编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫性，并且持续突变出对最新癌症疗法的抗性(见例如Mahoney et al.(2015)Nat.Rev.Drug Discov.14(8):561-584)。设计克服免疫耐受和逃逸及同时限制目前的免疫疗法的自身免疫相关毒性的免疫治疗方法和癌症治疗方法在免疫肿瘤学领域是个挑战。因此，需要额外的和创新的免疫疗法和其它疗法。
发明概述
提供了含有基因组修饰的免疫刺激细菌，和编码一种或多种治疗产物例如抗癌治疗剂或相关治疗剂的质粒。所述基因组修饰导致免疫刺激细菌在肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞中积累，并在其中表达编码的治疗产物。本文提供的免疫刺激细菌编码一种或多种互补产物，这些互补产物在受试者中刺激或诱导或导致强力的抗癌反应。
提供了含有在真核启动子控制下的编码治疗产物或治疗产物组合的质粒的免疫刺激细菌。所述细菌的基因组包含选自以下的修饰，例如一种、两种或更多种修饰：
a)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖(LPS)，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖；和/或
与野生型细菌相比，六酰化脂多糖显著减少至少10倍，或不存在；
b)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌具有减弱的Toll样受体(TLR)的识别，所述受体为TLR2、TLR4和TLR5；
c)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活卷曲菌毛和/或纤维素的合成；
d)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成；
e)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌对于嘌呤、腺苷或ATP是营养缺陷型的；
f)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌缺乏鞭毛；
g)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞；
h)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞，并且不能在肿瘤驻留骨髓细胞中复制；和
i)缺失或破坏或失活lppA和lppB之一或二者，以降低或消除脂蛋白在膜中的表达，由此编码的治疗性蛋白质在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中的表达增加。
例如，所述免疫刺激细菌含有a)、d)和f)的修饰，包括缺失、插入和置换，或c)和d)的修饰，或a)、c)、d)、e)和f)的修饰，或a)、c)、d)、e)、f)和i)的修饰，或a)、d)、f)和i)的修饰，或c)、d)和i)的修饰，或f)和i)的修饰，或a)至i)的修饰，或a)、b)、d)和f)的修饰，或a)、b)、c)和d)的修饰，以及a)至i)的其它组合。
在所有实施方案中，免疫刺激细菌还可以包含或进一步包含编码鞭毛的基因的缺失或破坏，由此所述细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)并且不产生鞭毛，其中野生型细菌具有鞭毛。所述免疫刺激细菌可以是嘌呤营养缺陷型，例如腺苷营养缺陷型，或腺苷、腺嘌呤和/或ATP营养缺陷型。所述免疫刺激细菌也可以是purI-。所述免疫刺激细菌也可以是pagP-。所述免疫刺激细菌也可以是asd-(天冬氨酸-半醛脱氢酶-)，例如当细菌是asd-时，由于编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的全部或部分破坏或缺失，从而内源性asd不表达。所述细菌可以在质粒上编码在细菌启动子控制下的天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。所述免疫刺激细菌也可以是msbB-，或可以是pagP-/msbB-。例如，所述免疫刺激细菌可以是asd-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-，或者可以是asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。
提供了含有在真核启动子控制下编码治疗产物的质粒，或在多个真核启动子或单个启动子控制下编码多个产物的免疫刺激细菌。免疫刺激细菌的基因组通过缺失足够部分的基因或通过破坏基因而被修饰，由此所述细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-中的一种或多种细菌。本文提供的免疫刺激细菌还包括具有缺失或破坏的基因lppA(lpp1)和/或lppB(lpp2)的那些细菌，其分别编码主要外膜脂蛋白Lpp1(LppA)和Lpp2(LppB)，以消除或基本上减少所编码的脂蛋白的表达。特别地，所述细菌是lppA-和lppB-。提供了免疫刺激细菌，其含有在真核调节序列控制下编码抗癌治疗剂的质粒，并且是lppA-和lppB-。例如，所述免疫刺激细菌可以是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、lppA-和lppB-。
在本文的实施方案中，所述治疗产物是抗癌治疗剂或用于癌症治疗的治疗剂。编码的产物可以与编码分泌信号的核酸可操作地连接，由此当表达时，所述治疗产物被分泌，例如从肿瘤驻留免疫细胞中分泌。
任何免疫刺激细菌还可以具有涉及沙门氏菌(Salmonella)致病岛1(SPI-1)侵袭的一个或多个基因或操作子被缺失或失活，由此所述免疫刺激细菌不会侵入或感染上皮细胞。例如，所述一种或多种基因/操作子选自以下：avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP。
免疫刺激细菌中的质粒可以以低拷贝数或中等拷贝数存在。所述质粒可以含有中等至低拷贝数的复制起点，例如低拷贝数的复制起点。在一些实施方案中，所述质粒以较高的拷贝数存在。一般而言，中等拷贝数小于150或小于约150，大于20或约20，或介于20或25和150之间；低拷贝数小于25，或小于20，或小于约25，或少于约20个拷贝。具体而言，低至中等拷贝数小于约150个拷贝，或小于150个拷贝；低拷贝数小于约25个拷贝，或小于25个拷贝。
提供了核酸构建体，其是编码产物例如蛋白质的核酸分子，其被设计成引入细胞或质粒中以表达编码的产物。所述构建体含有编码多种抗癌产物的核酸，作为在单个启动子控制下的多顺反子序列。所述启动子可以是真核启动子。本文提供和描述了其它真核生物调节序列例如增强子和编码蛋白质转运信号例如分泌信号的核酸，以及其它调节控序列例如终止子，包括防止在所述构建体上的细菌启动子通读的细菌终止子，以及元件的特定构型和产物编码核酸开放阅读框和/或基因的顺序。在所述构建体中，多顺反子序列可以包括导致由多顺反子构建体编码的分立产物表达的信号或编码信号，例如肽。这种肽的实例是病毒肽的2A家族。所述构建体包括在编码每个产物的每个开放阅读框之间的这种肽或其它信号。所述2A肽包括T2A、P2A、E2A或F2A中的一种或多种。
抗癌产物包括用于治疗癌症或促进或有助于或刺激或帮助受试者的抗癌反应的任何产物。通常抗癌产物是蛋白质。编码的产物包括在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的一种或多种免疫刺激蛋白。示例的编码的产物是在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白，例如选自以下一种或多种中的任意：IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，具有减弱的与IL-2Ra结合的IL-2，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，修饰的不结合IL-2Ra的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，CCL3，CCL4，CCL5，参与或影响或增强T细胞募集/持续性的蛋白质，共刺激蛋白，例如CD40，CD40配体(CD40L)，CD28，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，包括胞质结构域缺失或截短以消除免疫抑制反向信号传导的共刺激蛋白的形式，其具有促进细胞中正确方向(即细胞质中的细胞质结构域)的任选修饰；B7-CD28家族成员，CD47拮抗剂，抗IL-6抗体或IL-6结合诱饵受体，TGF-β多肽拮抗剂，包括可溶性TGF-β受体和TGF-β拮抗剂，以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。
其它产物包括在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白，其选自以下一种或多种：IFN-α，IFN-β，GM-CSF，IL-2，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经过修饰使其不结合IL-2Ra的IL-2，CXCL9，CXCL10(IP-10)，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，参与T细胞的潜在募集和/或持续性的分子，CD40，CD40配体(CD40L)，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，缺失胞质结构域(4-1BBLΔcyt)或部分缺失胞质结构域的4-1BBL，所述结构域被缺失或截短以消除免疫抑制反向信号传导，B7-CD28家族成员，和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。例如，所述构建体可含有编码具有缺失或部分缺失的胞质结构域或部分缺失的胞质结构域并且任选包括氨基酸修饰的4-1BBL的核酸，由此所得4-1BBL当在细胞中表达时假定是正确方向(见SEQ ID NO:389-392和下文的详细描述，提供了示例的具有截短的胞质结构域的修饰的4-1BBL变体，其中残基被带正电荷的残基(即K和L)置换以当在细胞中表达时赋予正确的方向)。所述胞质结构域被截短至足以消除或减少免疫抑制反向信号传导。因此，提供了构建体，所述构建体含有编码具有缺失或部分缺失的胞质结构域的4-1BBL的核酸或编码具有截短和修饰的胞质结构域的修饰的4-1BBL的核酸，其中4-1BBL的序列在SEQ ID NO:389-392中示出，并在下文的详细描述和实施例中举例说明了序列。构建体还可以含有编码以下任何产物和产物组合的核酸：
IL-12、或IL-15、或IL12p70、或IL-15/IL-15Rα链复合物中的一种或多种；
细胞因子和STING通路激动剂；
细胞因子、STING通路激动剂和共刺激分子或免疫检查点抑制剂；
细胞因子和STING通路激动剂，以及TGF-β多肽拮抗剂；
细胞因子、STING通路激动剂、TGF-β多肽拮抗剂和共刺激分子(受体或配体)或免疫检查点抑制剂，
其中STING通路激动剂是通过激活STING通路增加I型干扰素表达的任何产物。示例的是编码干扰素基因刺激因子(Stimulator of Interferon Genes，STING)多肽或其变体或其嵌合体的构建体，如本文详细描述。其中的构建体是编码治疗产物组合的那些构建体，所述治疗产物组合选自以下组合：
抗CTLA-4抗体和STING多肽，
IL-15和STING多肽，
4-1BBL和STING多肽，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和STING多肽，
IL-12和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-15和STING多肽，
4-1BBL、IL-15和STING多肽，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-15和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12和STING多肽，
4-1BBL、IL-12和STING多肽，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-12和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-15、TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂和STING多肽，
4-1BBL和IL-15，TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及一种STING多肽，
抗CTLA-4抗体，和IL-12，TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和STING多肽，
4-1BBL和IL-12，TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、IL-15和STING多肽，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-12、IL-15和STING多肽，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-12、IL-15和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15、TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、IL-21、TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL、IL-12、IL-21和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-12、IL-15和STING多肽，
IL-15、IL-21和STING多肽，
IL-12、IL-21和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-15、IL-21和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-21和STING多肽，
4-1BBL、IL-15、IL-21和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、IL-21和STING多肽，
抗CTLA-4抗体和IL-15，
抗CTLA-4抗体、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL和IL-15，
4-1BBL、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
抗CTLA-4抗体和IL-12，
抗CTLA-4抗体和IL-12，以及TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL和IL-12，
4-1BBL、IL-12和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
抗CTLA-4抗体和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-12和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-12、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和
IL-15和IL-21，以及TGF-诱饵受体或多肽拮抗剂，其中：
抗CTLA-4抗体是scFv或scFv-Fc；
STING多肽包括野生型STING，或变体STING多肽，或嵌合STING多肽，以及具有赋予例如功能获得(gain-of-function)的氨基酸置换的嵌合STING蛋白；及
4-1BBL是具有缺失的胞质结构域的4-1BBL、具有修饰的胞质结构域的4-1BBL、具有截短的胞质结构域的4-1BBL，或具有截短和修饰的胞质结构域的4-1BBL。
其它构建体包括编码选自以下的治疗产物组合的那些构建体：
IL-2和IL-12p70；
IL-2和IL-21；
IL-2，IL-12p70，和STING功能获得(GOF)变体；
IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；
IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
IL-15/IL-15Rα和IL-21；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；
IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和STING GOF变体；
IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-18；
IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-2，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-2，和IL-21；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，和IL-21；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，和IL-18；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-2，和IL-21；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及
CD40激动剂和STING GOF变体，其中：
4-1BBL是具有缺失的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)、具有修饰的胞质结构域的4-1BBL、具有截短的胞质结构域的4-1BBL或具有截短和修饰的胞质结构域的4-1BBL；和
抗-CTLA-4抗体是scFv或scFv-Fc。
STING多肽的示例是其中STING多肽被修饰以导致I型干扰素的表达增加或组成型表达的那些多肽，或者是一种嵌合多肽，其包含具有来自不同物种的C末端尾区的人STING多肽，其NF-κB信号传导活性低于人STING的NF-κB信号传导活性，其中例如CTT中的TRAF6结合位点任选缺失；且人STING蛋白具有SEQ ID NO:305-309所示序列。编码的产物的特定组合包括其中所编码的治疗性蛋白质包含IL-12p70和嵌合人STING多肽的那些组合，所述嵌合人STING多肽具有来自袋獾的CTT和导致I型干扰素表达增加或组成型表达的氨基酸置换，或者是具有导致I型干扰素表达增加或组成型表达的氨基酸置换的STING多肽，其中导致I型干扰素表达增加或组成型表达的突变是功能获得性突变。示例的是具有在详细描述部分中描述的置换的STING蛋白质或多肽，例如参考与示出人STING蛋白的SEQ ID NO:305-309任一的比对，在STING多肽中的氨基置换对应于R284G或N154S/R284G。这些构建体可以另外编码IL-36γ和/或免疫检查点抑制剂抗体。如本文所述，抗体包括其抗原结合部分，以及任何各种形式的抗体，例如但不限于scFv和scFv-Fc(通常为IgG Fc)，其中Fc的存在使所得产物多聚化，由此其具有两条链。靶向的免疫检查点包括但不限于CTLA-4或PD-1或PD-L1，并且其抗体形式包括scFV和scFV-Fc双链多肽。
提供了含有上述构建体以及贯穿本文的质粒。质粒包括细菌质粒，其中构建体与真核转录调节序列可操作地连接。
提供了组合物，例如药物组合物，其含有由所述构建体或质粒编码的抗癌蛋白产物的混合物，作为所述组合物中唯一的抗癌蛋白。因此，在这些组合物中提供了含有治疗性蛋白质的互补组合的组合物；所述混合物包括独特的药剂组合。这些组合包括本文提供和描述的药剂组合。
还提供了含有任何所述构建体和/或质粒的免疫刺激细菌。所述构建体和质粒可以在本文提供的、包括上文和下文讨论的任何免疫刺激细菌中提供或引入其中。还可以将所述构建体和质粒引入本领域已知的合适细菌中，例如在出版物例如国际申请公开号WO2020/172461和WO2020/172462以及美国专利号10,449,237、10,286,051和9,616,114中描述的细菌。
本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，例如缺失、破坏和改变，例如改变全部或部分基因的方向，从而不表达功能性基因产物。其中提供的免疫刺激细菌是经过修饰以使所得细菌是msbB-/purI-的那些。在一些实施方案中，所述细菌是msbB-和purI-，由此msbB-和/或purI-基因的至少编码部分的全长被缺失。也可以修饰细菌的基因组，使细菌缺乏鞭毛。这是在通常表达鞭毛的细菌中实现的。在这样的细菌中，例如沙门氏菌中的基因或其它物种中与fliC-/fljB-相当的基因，可以被缺失或进行其它修饰，从而不表达功能性基因产物。细菌还可以被修饰为腺苷营养缺陷型和/或是msbB-/pagP-。还提供了免疫刺激细菌和含有其的药物组合物，其中所述细菌不表达L-天冬酰胺酶II，由此所述细菌是ansB-。
提供了含有在真核启动子控制下编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成。这种细菌的实例是其中天冬酰胺酶是由基因ansB编码的L-天冬酰胺酶II的那些细菌。
本文表明，在是msbB-和purI-的亲本菌株VNP20009中，基因没有完全缺失。在所提供的免疫刺激细菌中，细菌的基因组被修饰，由此msbB-和purI-基因的至少编码部分的全长被缺失。这些菌株比亲本菌株更适合、更快和/或更大程度生长。在本文的所有实施方案中，可以修饰细菌以使天然asd基因产物失活或不表达。为了帮助产生所述菌株，将asd基因在原核启动子如诱导型启动子控制下的质粒上编码。
在实施方案中，所述菌株包括修饰使得细菌缺乏鞭毛，并且是pagP-、ansB-和csgD-。此外，所述细菌是purI-和asd-。因此提供了菌株，包括修饰的亲本菌株，其已经是msbB-和purI-，和/或具有其它修饰，特别是修饰LPS的那些修饰，所述菌株也是Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD。所述菌株也可以是腺苷营养缺陷型或腺苷和腺嘌呤营养缺陷型。
编码的治疗产物包括核酸和蛋白质。质粒可以编码两种或更多种治疗产物。示例的产物包括但不限于细胞因子、组成型诱导I型干扰素(IFN)的蛋白质和共刺激受体或配体。下文描述了进一步的示例组合。在一些实施方案中，共刺激分子缺乏在抗原呈递细胞(APC)上表达的全部或部分胞质结构域，由此截短的分子能够通过共刺激受体向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短或以其它方式修饰的胞质结构域或其部分而不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。其它产物包括激活治疗性蛋白质的酶，例如激活前药的那些。如本文和下文所述，本文提供的免疫刺激细菌编码抗癌治疗剂，包括组合的治疗产物组合以提供强大的抗癌反应。编码的蛋白质是上文和下文列出的每一种产物，以及来自不同类别的产物的组合。包括共刺激蛋白，例如4-1BBL，特别是具有截短或缺失的胞质结构域以消除免疫抑制反向信号传导以及还具有任何补偿性突变以确保所得蛋白质在细胞中表达时在细胞膜中正确定向的那些。其它产物包括STING通路激动剂以诱导或导致I型干扰素组成型表达。这些产物包括STING蛋白，特别是本文提供和描述的修饰的和嵌合的STING蛋白。一种或多种细胞因子例如IL-12、IL-15、IL-21、L-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、与IL-2Ra结合减弱的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物及其它例如IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ也在质粒上编码。除共刺激产物外，STING通路激动剂蛋白如STING和细胞因子、抗体如检查点抑制剂抗体包括抗CTLA-4抗体均可在质粒上编码。所述抗体可以是scFvs和scFvs-Fc双链形式，以及其它形式。此外，在其它产物中，可以包括TGF-β拮抗剂和TGF-β受体诱饵。
编码的治疗产物可以与编码真核宿主识别的调节序列的核酸例如分泌信号可操作地连接，以实现从包含所述细菌或质粒的细胞中分泌。在免疫刺激细菌编码两种或更多种产物的实施方案中，每种产物的表达可以在单独启动子的控制下。或者，可以在单个启动子的控制下表达两种或更多种产物，并且每种产物由编码例如内部核糖体进入位点(IRES)或2A肽的核酸分开，以实现每种编码的治疗产物的单独表达。示例的2A肽是T2A、F2A、E2A或P2A，其可以在编码治疗产物的核酸的侧翼，以实现在单个启动子的控制下表达的治疗产物的单独表达。治疗产物在真核启动子如RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子的控制下表达。这些启动子包括是病毒启动子的RNA聚合酶II启动子，或哺乳动物RNA聚合酶II启动子，例如但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein-Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子、腺病毒启动子、延伸因子-1(EF-1)α启动子、UBC启动子、PGK启动子、CAGG启动子、腺病毒2或5晚期启动子、EIF4A1启动子、CAG启动子或CD68启动子。所述质粒进一步可包括其它真核调节序列，例如选自SV40、人生长激素(hGH)、牛生长激素(BGH或bGH)、MND(一种合成的启动子，其含有用骨髓增殖性肉瘤病毒增强子修饰的MoMuLV LTR的U3区)、鸡β-球蛋白和rbGlob(兔球蛋白)基因的终止子和/或启动子，以控制治疗产物的表达。其它调节序列包括polyA尾、土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。可以包括额外的调节元件，例如插入适当基因座中的细菌终止子，如本文所述，以减少或消除来自细菌启动子的通读。
编码的治疗产物包括本文和原始权利要求中描述的任何产物，例如编码是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器途径的一部分的蛋白质的核酸，或其变体。I型干扰素包括干扰素-α和干扰素-β。变体包括当在受试者中表达时导致I型IFN组成型表达的那些。这些包括不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸来导致I型IFN表达的功能获得(GOF)变体。这些蛋白质的示例是选自以下的蛋白质：STING，RIG-I，MDA-5，IRF-3，IRF-7，TRIM56，RIP1，Sec5，TRAF3，TRAF2，TRAF6，STAT1，LGP2，DDX3，DHX9，DDX1，DDX9，DDX21，DHX15，DHX33，DHX36，DDX60和SNRNP200，及其具有增加的活性或导致I型干扰素(IFN)组成型表达的变体。变体包括STING、RIG-I、IRF-3或MDA5的变体，其中由于病毒感染而被磷酸化的一个或多个丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基被天冬氨酸(D)置换，由此产生的变体是组成型诱导I型IFN的磷酸模拟物，以及本领域技术人员已知和/或本文所述的任何变体。变体包括例如其中突变选自以下的那些变体：a)在STING中，参考SEQ ID NO:305-309，选自以下的一个或多个突变：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A和S324A/S326A；b)在MDA5中，参考SEQ ID NO:310，选自以下一个或多个突变：T331I，T331R，A489T，R822Q，G821S，A946T，R337G，D393V，G495R，R720Q，R779H，R779C，L372F和A452T；c)在RIG-I中，参考SEQ ID NO:311，E373A和C268F之一或二者；及d)在IRF-3中，参考SEQ ID NO:312，S396D，如含有参考SEQ ID NO:305-309选自以下一个或多个氨基酸置换的变体STING：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A，N154S/R284G和S324A/S326A，及其保守置换，及其组合。
免疫刺激细菌还可以编码在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子或共刺激分子。这些的实例是选自以下一种或多种的蛋白质：IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，经过修饰而不与IL-2Ra结合的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，CCL3，CCL4，CCL5，参与或实现或增强T细胞募集和/或持续性的蛋白质，CD40，CD40配体(CD40L)，CD28，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，B7-CD28家族成员，CD47拮抗剂，抗IL-6抗体或IL-6结合诱饵受体，TGF-β多肽拮抗剂和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。选自CD40，CD40配体，CD28，OX40，OX40配体，4-1BB和4-1BB配体的共刺激分子可以被截短，使得该分子缺乏在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域(或其一部分)；并且截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失的胞质结构域或部分缺失或截短的胞质结构域而不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号，以消除免疫抑制反向信号传导。其它这种蛋白质是TGF-β多肽拮抗剂，例如抗TGF-β抗体或抗体片段，抗TGF-β受体抗体或抗体片段，可溶性TGF-β拮抗剂多肽或TGF-β结合诱饵受体。
质粒可以编码治疗性抗体或其抗原结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、scFv-Fc、Fv、dsFv、纳米抗体(nanobody)、双特异抗体(diabody)片段或单链抗体。实例包括但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2或IL-6的拮抗剂。
在一些实施方案中，本文提供的免疫刺激细菌含有编码两种或更多种治疗性蛋白质的质粒，所述治疗性蛋白质选自：a)在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白质；b)一种或多种蛋白质，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器途径的一部分，或其具有增加的增加I型干扰素表达的活性的变体，或其导致I型IFN组成型表达的变体；和c)抗癌抗体或其抗原结合部分。例如，免疫刺激蛋白可以是共刺激分子，其是缺乏在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其足够部分的分子，由此截短的共刺激分子能通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。在一些实施方案中，免疫刺激细菌编码至少两种治疗产物，所述治疗产物选自细胞因子、组成型诱导I型IFN的蛋白质、共刺激分子和抗癌抗体或其抗原结合部分，其可以在单个启动子的控制下。例如，编码至少两种或所有产物的核酸的表达在单个启动子的控制下，并且编码每种产物的核酸被编码2A多肽的核酸分开，由此在翻译时，每种产物单独表达。编码每种产物的核酸可以与编码指导所表达的产物从细胞中分泌的序列的核酸可操纵地连接。
提供了编码两种或更多种治疗产物的免疫刺激细菌，其中至少一种产物选自a)和至少一种产物选自b)，并且a)是IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-23、IL-36γ、与IL-2Ra结合减弱的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、经修饰使其不与IL-2Ra结合的IL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、CCL3、CCL4、CCL5、参与或影响或增强T细胞募集和/或持续性的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员、TGF-β多肽拮抗剂或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员；以及b)是STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-5、IRF-7、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60或SNRNP200。其还可以编码TGF-β抑制性抗体、TGF-β结合诱饵受体、抗IL-6抗体和IL-6结合诱饵受体中的一种或多种。
示例的编码的治疗产物的组合是以下治疗产物组合中的任何一种：IL-2和IL-12p70；IL-2和IL-21；IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；IL-2，IL-21，和STING GOF变体；IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt，其中Δcyt是缺失的胞质结构域，和具有截短的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLcyt trunc))；IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt，和具有截短的胞质结构域4-1BBL)；IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyttrunc)；IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；IL-15/IL-15Rα和IL-21；IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；IL-12p70和IL-21；IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；IL-12p70和STING GOF变体；IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；IL-12p70和IL-18；IL-12p70，IL-18，和STINGGOF变体；IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyttrunc)；TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyttrunc)；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-18；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和具有截短的胞质结构域的4-1BBL)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；CD40激动剂，IL-2和IL-21；CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyttrunc)；CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyt trunc)；CD40激动剂和IL-12p70；CD40激动剂，IL-12p70，和STINGGOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyttrunc)；CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt和4-1BBLcyttrunc)；及CD40激动剂和STING GOF变体。
在包括4-1BBL的所有组合中，4-1BBL分子可以是全长蛋白质(见例如，人和小鼠4-1BBL分别为SEQ ID NO:389和393)；具有胞质结构域缺失的4-1BBL变体(4-1BBLΔcyt；见例如，人和鼠4-1BBLΔcyt分别为SEQ ID NO:390和394)；具有截短(即未完全缺失)的胞质结构域的4-1BBL变体(4-1BBLcyt trunc；见例如，人和小鼠4-1BBLcyt trunc变体为SEQ IDNO:391-392和SEQ ID NO:395-396)；或具有修饰的胞质结构域的4-1BBL分子，其中作为磷酸化位点的一个或多个Ser残基在适当的一个或多个基因座处被置换，例如对于人4-1BBL，参照SEQ ID NO:389，Ser5和Ser8用降低或消除反向信号传导的残基置换。此外，包括抗CTLA-4抗体的所有组合均可以包括抗CTLA-4抗体片段，例如抗CTLA-4 scFv(见例如，对于人和小鼠抗CTLA-4 scFv片段分别为SEQ ID NO:403和404)，或抗CTLA-4 scFv-Fc(见例如，人和小鼠抗CTLA-4 scFv-Fc片段分别为SEQ ID NO:402和405)。
还提供了修饰的非人干扰素基因刺激因子(STING)蛋白和STING蛋白嵌合体，以及递送载体，包括本文中描述的任何一种，药物组合物，编码或含有这些STING蛋白的细胞，及其治疗癌症的用途和方法。具体而言，本文提供的免疫刺激细菌编码如本文所述的修饰的非人STING蛋白、非人STING蛋白和嵌合体。这些由免疫刺激细菌编码的STING蛋白在本文中提供并在全文中进行了描述。本文提供的是：
1.修饰的非人STING蛋白，其中所述非人STING蛋白具有低于人STING蛋白的NF-κB活化活性，并且任选与野生型(WT)人STING蛋白相比具有较高的I型干扰素活化活性。这些非人STING蛋白经过修饰以包括一个或多个突变，由此其具有增加的活性，或在没有胞质核酸信号传导的情况下组成型起作用。所述突变通常是发生在人干扰素病中的氨基酸突变，例如上文针对人STING描述的那些突变。将相应的突变引入非人物种STING蛋白中，其中通过比对鉴定相应的氨基酸残基。此外，在一些实施方案中，STING蛋白的C末端尾区(CTT)中的TRAF6结合位点被缺失，从而降低了NF-κB信号传导活性。
2.修饰的STING蛋白，特别是人STING蛋白，其是嵌合体，其中来自一个物种例如人的STING蛋白中的CTT(C末端尾)区域被来自具有与人STING相比较低NF-κB信号传导活性和/或较高I型IFN信号传导活性的另一个物种的STING蛋白的CTT置换。此外，在这些嵌合体中任选缺失TRAF6结合位点。
3.上述2的修饰的STING蛋白也包括上述1的突变。
4.本文提供的或本领域技术人员已知的任何递送载体，例如免疫刺激细菌，包括例如外来体、纳米颗粒、微细胞、细胞、脂质体、溶酶体、溶瘤病毒和其它病毒载体，其编码上述1至3任一项的修饰的STING蛋白。
5.本文提供的或本领域技术人员已知的任何递送载体，例如免疫刺激细菌，包括例如外来体、纳米颗粒、微细胞、细胞、脂质体、溶酶体、溶瘤病毒和其它病毒载体，其编码来自非人物种的未经修饰的STING，所述非人物种STING蛋白与人STING相比具有降低的NF-κB信号传导活性降低并且任选与人STING相比具有增加的I型干扰素刺激/信号传导活性。
6.细胞(如果是人的话，不是受精卵)，例如用于细胞治疗的细胞，例如T细胞和干细胞，以及用于产生上述1至3任一项的STING蛋白的细胞。
7.药物组合物，其含有上述1至3任一项的STING蛋白，或4和5的递送载体，或6的细胞。
8.通过施用上述1至7任一项治疗癌症的用途和方法，如本文针对免疫刺激细菌所述。
本文描述了评估STING的NF-κB活性(信号传导活性)和I型干扰素刺激活性或干扰素-β刺激活性的测定法和方法，并且也是本领域技术人员已知的方法。方法包括例如在deOliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175中描述的方法，其中特别描述了来自不同物种包括人的STING蛋白的干扰素-β和NF-κB信号传导活性，从而鉴定了来自不同物种的具有低于人STING的NF-κB活性的STING蛋白，以及具有相当于或高于人STING的干扰素-β活性的那些STING蛋白。de Oliveira Mann et al.(2019)提供了每种物种中STING的物种比对和鉴定域，包括CTT域(另见de Oliveira Mann et al.(2019)的补充信息)。
非人STING蛋白可以是但不限于来自以下物种的STING蛋白：袋獾(Sarcophilusharrisii；SEQ ID NO:349)，狨猴(Callithrix jacchus；SEQ ID NO:359)，牛(Bos taurus；SEQ ID NO:360)，猫(Felis catus；SEQ ID NO:356)，鸵鸟(Struthio camelus australis；SEQ ID NO:361)，朱鹮(Nipponia nippon；SEQ ID NO:362)，腔棘鱼(Latimeriachalumnae；SEQ ID NO:363-364)、野猪(Sus scrofa；SEQ ID NO:365)、蝙蝠(Rousettusaegyptiacus；SEQ ID NO:366)、海牛(Trichechus manatus latirostris；SEQ ID NO:367)、鬼鲨(Callorhinchus milii；SEQ ID NO:368)，和小鼠(Mus musculus；SEQ ID NO:369)。这些脊椎动物STING蛋白很容易激活人体细胞中的免疫信号传导，表明STING信号传导的分子机制在脊椎动物中是共有的(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。
本文示出凭借感染骨髓细胞例如肿瘤驻留和组织驻留巨噬细胞的能力，并在至少有限的时间内保持活力，和/或递送质粒(所述质粒编码导致I型IFN表达的治疗产物和/或其它免疫刺激产物，例如不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸以使I型IFN表达的功能获得(GOF)变体)，本文提供的免疫刺激细菌可以将具有M2表型的巨噬细胞转化为M1或M1样以及免疫抑制特性降低或消除、而免疫刺激、抗肿瘤或抗病毒特性增强或增加的巨噬细胞。提供了含有编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，其中所述细菌对巨噬细胞、包括人巨噬细胞的感染，将M2巨噬细胞转化为M1表型或M1样表型巨噬细胞。提供了含有编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，所述治疗产物在巨噬细胞中的表达导致M2巨噬细胞例如人M2巨噬细胞转化或转化为M1或M1样表型。具有这种特性的免疫刺激细菌包括本文提供的任何细菌，其含有导致肿瘤驻留(在患有癌症的受试者中)和组织驻留骨髓细胞感染的基因组修饰。这些基因组修饰包括导致细菌不具有鞭毛的那些修饰，其中野生型细菌有鞭毛，以及其它修饰，例如导致细菌是pagP-/msbB-的那些修饰。其它修饰包括导致天冬酰胺酶活性消除的修饰，例如在感染骨髓细胞的细菌中产生ansB-细菌的修饰，从而增强T细胞活性，以及改变脂多糖(LPS)的其它修饰。
包括在巨噬细胞中编码治疗产物的免疫刺激细菌，所述治疗产物促进或导致M2巨噬细胞的转化，或将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型。示例的治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达、特别是组成型表达的胞质DNA/RNA传感器途径的一部分的那些。这包括治疗产物的功能获得(GOF)变体，其是胞质DNA/RNA传感器途径的一部分，并且不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸来导致I型IFN的表达，例如本文描述和提供的变体和非人STING蛋白。免疫刺激细菌包括可以如本文所述进行修饰的任何细菌，包括本文列出的物种，例如沙门氏菌物种和菌株。
还提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物例如蛋白质与赋予改善的药理学性质如药代动力学或药效学性质例如增加的血清半衰期的部分连接。因此，提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含Fc结构域或半衰期延长部分，例如人血清白蛋白或其一部分。半衰期延长方式或方法包括例如PEG化，糖基化修饰，唾液酸化，PASylation(用长度约为100-200个残基的PAS氨基酸的聚合物进行修饰)，ELPylation(见例如Floss et al.(2010)Trends Biotechnol.28(1):37-45)，HAPylation(用甘氨酸均聚物修饰)，与人血清白蛋白融合，与GLK融合，与CTP融合，GLP融合，与人免疫球蛋白(IgG)的恒定片段(Fc)结构域融合，与转铁蛋白融合，与非结构化多肽融合，例如XTEN(也称为rPEG，其是含有A、E、G、P、S和T的非精确重复肽序列的基因融合；见例如Schellenberger et al.(2009)Nat.Biotechnol.27(12):1186-1190)，以及增加尺寸、增加流体动力学半径、改变电荷或靶向受体以再循环而不是清除以及这种修饰的组合等其它这种修饰和融合。
还提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含B7蛋白跨膜结构域，或其中治疗产物通过内源的或添加的GPI锚而是GPI锚定的。编码的治疗产物可包含与胶原蛋白的融合物。
任何和所有实施方案中的免疫刺激细菌可以是任何合适的物种。在提及特定基因和基因修饰的情况下，所述基因和修饰是对应于作为示例物种的沙门氏菌所提及的基因和修饰的那些基因和修饰。物种和菌株包括例如以下物种的菌株：立克次体属(Rickettsia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，博德特氏菌属(Bordetella)，奈瑟菌属(Neisseria)，气单胞菌属(Aeromonas)，弗朗西斯氏菌属(Francisella)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，衣原体属(Chlamydia)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，布鲁氏菌属(Brucella)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，支原体属(Mycoplasma)，军团菌属(Legionella)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，螺杆菌属(Helicobacter)，弧菌属(Vibrio)，芽孢杆菌属(Bacillus)，和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)。例如立克次氏体立克次体(Rickettsia rickettsiae)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)，恙虫立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)，莫塞氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)，西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)，支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，嗜泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila)，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)，假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，马红球菌(Rhodococcus equi)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，小肠结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)，五日热罗卡利马氏体菌(Rochalimaeaquintana)或根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)。
通过本文所述的修饰，可以使细菌减毒，或使其具有低毒性或无毒。示例的细菌是沙门氏菌种，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株。本文提供的免疫刺激细菌包括内源性编码和表达或被修饰以编码和表达编码补体杀伤抗性(rck)基因例如沙门氏菌rck基因的那些免疫刺激细菌。治疗性大肠杆菌经过修饰以编码rck，由此其可以全身施用。如本文所述并且如权利要求中所述，还提供了治疗癌症、特别是人癌症的递送载体、细胞、药物组合物、方法、用途和治疗。还提供了伴随诊断和选择治疗对象的方法，以及监测治疗的方法。这些在下文以及权利要求中进行了描述，这些权利要求全部并入本节中。
附图简述
图1描绘了野生型人和袋獾STING蛋白的比对。
图2描绘了野生型人和狨猴STING蛋白的比对。
图3描绘了野生型人和牛STING蛋白的比对。
图4描绘了野生型人和猫STING蛋白的比对。
图5描绘了野生型人和鸵鸟STING蛋白的比对。
图6描绘了野生型人和朱鹮STING蛋白的比对。
图7描绘了野生型人和腔棘鱼(SEQ ID NO:345)STING蛋白的比对。
图8描绘了野生型人和斑马鱼STING蛋白的比对。
图9描绘了野生型人和野猪STING蛋白的比对。
图10描绘了野生型人和蝙蝠STING蛋白的比对。
图11描绘了野生型人和海牛STING蛋白的比对。
图12描绘了野生型人和鬼鲨STING蛋白的比对。
图13描绘了野生型人和小鼠STING蛋白的比对。
图14描绘了含有asd表达盒的示例性构建体，包括细菌启动子和任何其它细菌调节序列，其放置在与在真核启动子控制下编码有效载荷的盒的相反反向并且包括位于编码有效载荷的核酸两侧的细菌终止子，以及在终止来自原核启动子的任何通读转录物的方向上。
发明详述
大纲
A.定义
B用于癌症治疗的免疫刺激细菌概述
1.细菌癌症免疫疗法
2.现有靶向肿瘤微环境的治疗
a.自体T细胞疗法的局限性
b.病毒疫苗平台
c.细菌癌症疗法
i.李斯特菌(Listeria)
ii.沙门氏菌种(Salmonella)
iii.VNP20009
iv.野生型菌株
3.现有细菌癌症免疫疗法的局限性
C.免疫刺激细菌的修饰和增强以增加治疗指数和增加肿瘤驻留骨髓细胞的积累1.LPS生物合成途径中的基因缺失
a.msbB缺失
b.pagP缺失
2.营养缺陷型
a.purI缺失/破坏
b.腺苷营养缺陷
3.质粒维持和递送
a.asd缺失
b.endA缺失/破坏
4.鞭毛蛋白敲除菌株
5.工程化细菌以促进适应性免疫和增强T细胞功能
L-天冬酰胺酶II(ansB)缺失/破坏
6.卷曲菌毛表达所需的沙门氏菌基因中的缺失/破坏
7.改良对补体的抗性
Rck表达
8.缺失沙门氏菌和其它革兰氏阴性菌中脂蛋白表达所需的基因
9.强大的免疫刺激细菌，其基因组经过修饰以针对抗肿瘤治疗进行优化，并编码治疗产物，包括多种治疗产物
10.M2表型巨噬细胞转化为M1和M1样表型巨噬细胞
D.编码刺激肿瘤微环境中的免疫反应的遗传有效载荷的具有增强的治疗指数的免疫刺激细菌
1.免疫刺激蛋白质
a.细胞因子和趋化因子
b.共刺激分子
2.激活前药的分子
3.刺激免疫反应和/或I型IFN的组成型活性蛋白，非人STING蛋白，嵌合体和修饰形式
a.组成型STING表达和功能获得突变
b.组成型IRF3表达和功能获得突变
c.非人STING蛋白及其具有增强或组成型活性的变体，以及STING嵌合体及其具有增强或组成型活性的变体
d.作为胞质DNA/RNA传感器的其它基因产物及其组成型变体
i.RIG-I
ii.MDA5/IFIH1
iii.IRF7
e.其它I型IFN调节蛋白
4.抗体和抗体片段
a.TGF-β
b.双特异性scFvs和T细胞衔接蛋白
c.抗-PD-1/抗-PD-L1抗体
d.抗-CTLA-4抗体
e.其它示例的检查点靶
5.免疫调节蛋白的组合可以具有协同效应和/或互补效应
6.递送组合疗法的免疫刺激细菌
E.构建编码用于细菌递送的治疗产物的示例质粒
1.用于蛋白质异源表达的组成型启动子
2.多种治疗产物表达盒
a.单一启动子构建体
b.双重/多重启动子构建体
3.调节元件
a.转录后调节元件
b.聚腺苷酸化信号序列和终止子
c.增强子
d.分泌信号
e.改善细菌适应性
4.复制起点和质粒拷贝数
5.CpG基序和CpG岛
6.质粒维持/选择组分
7.DNA核靶向序列
F.药物制备、组合物和制剂
1.制备
a.细胞库制备
b.原料药(drug substance)制备
c.药物产品制备
2.组合物
3.制剂
a.流体、注射剂、乳剂
b.干燥的热稳定制剂
4.用于其它施用途径的组合物
5.剂量和施用
6.包装和制备产品
G.治疗方法和用途
1.选择患者以进行治疗和监测治疗的诊断
a.患者选择
b.评估或检测免疫刺激细菌活性的诊断表明治疗的有效性
2.肿瘤
3.施用
4.监测
H.实施例
A.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则本文整个公开内容中所指的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其它公开的材料均通过引用整体并入。在本文的术语有多种定义的情况下，以本节中的定义为准。在提到URL或其它这样的标识符或地址的地方，应当理解，这样的标识符可改变并且互联网上的特定信息可以发生变化，但是可以通过检索互联网来找到等价信息。对其的引用证实了这种信息的可得性和公开传播。
如本文所用，“治疗细菌”是当施用于受试者如人时实现治疗如抗癌或抗肿瘤疗法的细菌。
如本文所用，“免疫刺激细菌”是治疗细菌，当被引入受试者时，其会累积在免疫豁免组织和细胞中，例如肿瘤、肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞中，并复制和/或表达免疫刺激性或导致免疫刺激的产物。例如，由于免疫刺激细菌除了主要在免疫豁免环境中之外不能复制和/或表达产物(或具有降低的复制/产物表达)，所以由于降低的毒性或致病性和/或由于所编码的产物降低的毒性或致病性，因此所述免疫刺激细菌在宿主中被减毒。本文提供的免疫刺激细菌被修饰以编码一种或多种产物或表现出使其具有免疫刺激性的性状或性质。这种产物、性质和性状包括但不限于例如以下中的至少一种：免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子或共刺激分子；胞质DNA/RNA传感器或其功能获得或组成型活性变体(例如STING、IRF3、IRF7、MDA5、RIG-I)；RNAi，如siRNA(shRNA和microRNA)，CRISPR，其靶向、破坏或抑制免疫检查点基因如TREX1、PD-1、CTLA-4和/或PD-L1；抗体及其片段，例如抗免疫检查点抗体、抗IL-6抗体、抗VEGF抗体或TGF-β抑制性抗体；其它抗体构建体，例如双特异性T细胞衔接蛋白
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可溶性TGF-β受体，其用作诱饵以结合TGF-β或TGF-β拮抗多肽；和IL-6结合诱饵受体。免疫刺激细菌还可以包括修饰，所述修饰使细菌对于有免疫抑制性或在免疫抑制途径中的代谢物如腺苷呈营养缺陷型。
如本文所用，菌株名称VNP20009(见例如国际PCT申请公开号WO 99/13053，也参见美国专利号6,863,894)和YS1646和41.2.9可互换使用，是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号为202165的菌株。VNP20009是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的修饰的减毒株，含有msbB和purI缺失，由野生型菌株ATCC#14028产生。
如本文所用，菌株名称YS1456和8.7可互换使用，是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号为202164的菌株(参见美国专利号6,863,894)。
如本文所用，提及细菌“衍生自”特定菌株意味着这种菌株可以用作起始材料并且可以被修饰以产生特定细菌。
如本文所用，“表达盒”是指包括用于基因表达的调节序列的核酸构建体，其可操作地连接于编码开放阅读框(ORF)的核酸，该开放阅读框(ORF)编码有效载荷，例如治疗产物或其它蛋白质。
如本文所用，2A肽是长度为18至22个氨基酸(aa)的病毒寡肽，其在真核细胞中翻译期间介导多肽的切割。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域，不同的病毒2A通常以其来源的病毒命名。其中示例的是F2A(口蹄疫病毒2A)、E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2A)和T2A(明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A)。见例如Liuet al.(2017)Scientific Reports 7:2193，图1，编码序列。也见SEQ ID NO:327-330所示。这些肽通常共享DxExNPGP的核心序列基序，并存在于大量病毒家族中。其通过导致核糖体无法形成肽键来帮助分解多蛋白。2A肽提供给多顺反子载体，其中多种蛋白质从单个开放阅读框(ORF)表达。出于本文的目的，2A肽包括那些天然存在的肽及其任何修饰形式，例如与任何天然存在的2A肽具有97％、98％或99％序列相同性的任何肽，包括本文公开的那些，其导致从包含多个(2个或更多个)开放阅读框的转录物中转录和翻译单个多肽。
如本文所用，干扰素病是指由于参与调节或诱导干扰素表达的途径的基因产物中的突变而与干扰素上调相关的病症。所述产物的活性通常由介导物调节，如胞质DNA或RNA或核苷酸；当蛋白质产物被突变时，所述活性是组成型的。I型干扰素疾病包括一组列病症，包括重度形式的Aicardi-Goutières综合征(AGS)，和较轻的家族性冻疮红斑狼疮(Familial Chilblain Lupus，FCL)。可以在体外产生编码具有这些性质的突变产物的核酸分子，例如通过选择这样的突变，其产生与具有正常活性的等位基因产物相比具有功能获得性的产物，或与本文所述的疾病相关的功能获得性突变体相比具有进一步的功能获得性产物。
如本文所用，“功能获得性突变”是与没有所述突变的相同蛋白质相比增加蛋白质活性的突变。例如，如果蛋白质是受体，其对于配体的亲和性则增加；如果其是酶，其将具有增加的活性，包括组成型活性。
如本文所用，“复制起点”是在染色体、质粒或病毒中在此处开始复制的DNA序列。对于小DNA，包括细菌质粒和小病毒，单个起点即足够。
复制起点决定了载体拷贝数，这取决于选择的复制起点。例如，如果表达载体源自低拷贝数质粒pBR322，则其拷贝数在约15至20个拷贝/细胞之间，如果源自高拷贝数质粒pUC，则其可以是500至700个拷贝/细胞。
如本文所用，细胞中质粒的中等拷贝数为约或是150或小于150，低拷贝数是为15至30，例如20或小于20。低至中等拷贝数小于150个拷贝/细胞。高拷贝数是大于150个拷贝/细胞。
如本文所用，“CpG基序”是包括由在中央CpG侧翼(在其3’和5’侧上)的至少一个碱基包围的未甲基化的中央CpG(“p”是指连续的C和G核苷酸之间的磷酸二酯键)的碱基模式。CpG寡聚脱氧核苷酸是长度至少约10个核苷酸及包括未甲基化的CpG的寡聚脱氧核苷酸。5’CG 3’中至少C是未甲基化的。
如本文所用，“RIG-I结合序列”是指直接的5’三磷酸(5’ppp)结构，或者从聚(dA-dT)序列由RNA pol III合成的5’三磷酸(5’ppp)结构，其通过与RIG-I的相互作用可以通过RIG-I途径激活I型IFN。所述RNA包括至少4个A核糖核苷酸(A-A-A-A)；其可以含有4、5、6、7、8、9、10或更多个核糖核苷酸。将RIG-I结合序列引入细菌的质粒中以转录成polyA。
如本文所用，“细胞因子”是在细胞信号传导中重要的小蛋白质(约5-20kDa)的宽松类别。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子是细胞信号传导分子，其有助于免疫反应中的细胞通信，并刺激细胞向炎症、感染和创伤部位移动。
如本文所用，“趋化因子”是指化学引诱(趋化性)细胞因子，其与趋化因子受体结合，包括从天然来源分离的蛋白质以及如通过重组方式或化学合成而合成制备的那些。示例的趋化因子包括但不限于IL-8，IL-10，GCP-2，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，ENA-78，PBP，CTAPIII，NAP-2，LAPF-4，MIG(CXCL9)，CXCL10(IP-10)，CXCL11，PF4，SDF-1α，SDF-1β，SDF-2，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，MIP-1α(CCL3)，MIP-1β(CCL4)，MIP-1γ(CCL9)，MIP-2，MIP-2α，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，MIP-5，MDC，HCC-1，ALP，lungkine，Tim-1，嗜酸细胞激活趋化因子-1，嗜酸细胞激活趋化因子-2，I-309，SCYA17，TRAC，RANTES(CCL5)，DC-CK-1，淋巴细胞趋化因子，和分形趋化因子(fractalkine)以及其它本领域技术人员已知的趋化因子。趋化因子参与免疫细胞向炎症部位的迁移，以及免疫细胞的成熟和适应性免疫反应的产生。
如本文所用，“免疫刺激蛋白”是在肿瘤微环境中呈现或促进抗肿瘤免疫反应的蛋白质。示例的这种蛋白质是细胞因子、趋化因子和共刺激分子，例如但不限于IFN-α，IFN-β，GM-CSF，IL-2，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经修饰为不结合IL-2Ra的IL-2，CXCL9，CXCL10(IP-10)，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，参与T细胞潜在募集/持续性的分子，CD40，CD40配体(CD40L)，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，具有缺失的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)或具有部分缺失的(截短的)胞质结构域的4-1BBL，B7-CD28家族成员，以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
所述免疫刺激蛋白是截短的共刺激分子，例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L，每个都具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域的完全或部分缺失。这些截短的基因产物，例如缺失或部分缺失所述胞质结构域的那些基因产物，能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，但由于截短或缺失的胞质结构域而不能对APC发出反调节信号。
如本文所用，“胞质结构域缺失”是包含蛋白质的胞质结构域或胞内结构域的全部或部分氨基酸残基的缺失，其中所述缺失足以通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号传导，且足以抑制对APC发出反调节信号传导。例如，人4-1BBL(也称为TNFSF9)的胞质结构域包含SEQ ID NO:342的第1至28位氨基酸残基。人CD80的胞质结构域包含所述蛋白质的第264至288位氨基酸残基；人CD86的胞质结构域包含所述蛋白质的第269至329位氨基酸残基；人CD27L(也称为CD70)的胞质结构域包含所述蛋白质的第1至17位氨基酸残基；人B7RP1(也称为ICOSLG或ICOS配体)的胞质结构域包含所述蛋白质的第278至302位氨基酸残基；人OX40L(也称为TNFSF4或CD252)的胞质结构域包含所述蛋白质的第1至23位氨基酸残基。
如本文所用，“诱饵受体”是可以有效地特异性结合特定生长因子或细胞因子、但在结构上不能发出信号或激活预期受体复合物的受体。诱饵受体通过与配体结合并阻止其与其同源受体结合而起到抑制剂的作用。
例如，TGF-β家族受体包括细胞表面丝氨酸/苏氨酸激酶受体I型(TβRI或TGFβR1)和II型(TβRII或TGFβR2)，其在二聚配体存在下形成异聚复合物，以及包括III型受体β聚糖(TβRIII或TGFβR3)。TGF-β的可溶性诱饵受体，其阻止TGF-β与其受体结合，包括TβRI、TβRII或TβRIII(β聚糖)的可溶性胞外结构域(TGF-β结合区)，所述结构域可以与其它分子例如Fc结构域融合。此外，BAMBI(骨形态发生蛋白(BMP)和激活素膜结合抑制剂)在结构上与I型受体相关并充当抑制受体激活的诱饵。显性阴性TGFβR2(DN-TGFβR2)，其包含TGFβR2的细胞外结构域和跨膜区，但缺乏信号传导所需的胞质结构域，也可用作TGF-β诱饵受体(见例如国际申请公开号WO 2018/138003)。
如本文所用，共刺激分子激动剂是在与共刺激分子结合后激活其或增加其活性的分子。例如，所述激动剂可以是激动剂抗体。CD40激动剂抗体包括例如CP-870,893、达西组单抗(dacetuzumab)、ADC-1013(mitazalimab)和Chi Lob 7/4。
如本文所用，胞质DNA/RNA传感器途径是由存在DNA、RNA、核苷酸、二核苷酸、环核苷酸和/或环二核苷酸或其它核酸分子引发的途径，其导致I型干扰素的产生。胞质中的核酸分子来自病毒或细菌或放射或其它这种暴露，导致宿主免疫反应的激活。
如本文所用，“I型干扰素途径蛋白”是诱导先天免疫反应、例如诱导I型干扰素的蛋白质。
如本文所用，“胞质DNA/RNA传感器”是导致免疫答介质如I型干扰素的表达的胞质DNA/RNA传感器途径的一部分的蛋白质。“胞质DNA/RNA传感器”包括I型干扰素途径蛋白。例如，如本文所述和本领域技术人员已知的，胞质DNA由cGAS感测，导致产生cGAMP和随后的STING/TBK1/IRF3信号传导及I型干扰素产生。细菌环二核苷酸(如细菌环状di-AMP)也激活STING。因此，STING是一种诱导I型干扰素的免疫刺激蛋白。5’-三磷酸RNA和双链RNA由RIG-I和单独的MDA-5或MDA-5/LGP2感测。这导致线粒体MAVS(线粒体抗病毒信号蛋白)聚合，并还激活TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3)。这种途径中的蛋白质是免疫刺激性的并导致先天免疫反应介质如I型干扰素的表达。可以修饰DNA/RNA传感器途径中的免疫刺激蛋白，使其在没有胞质核酸的情况下具有增加的活性或组成型作用，从而导致免疫反应，例如I型干扰素的表达。
如本文所用，先天免疫蛋白STING的“羧基末端尾区”或“C末端尾区”(CTT)是指STING蛋白的C末端部分，其在野生型STING蛋白中通过灵活的接头区域连接于cGAMP结合结构域。CTT包括IRF3结合位点、TBK1结合位点和TRAF6结合位点。STING通过TANK结合激酶1(TBK1)磷酸化STING蛋白C末端尾区(CTT)，而促进诱导干扰素β(IFN-β)产生。STING和TBK1之间的相互作用是由STING羧基末端尾区(CTT)中进化上保守型的8个氨基酸残基片段介导的。TRAF6催化STING上K63连接的遍在蛋白链的形成，导致转录因子NF-κB的激活和诱导另一STING依赖性基因表达程序。缺失或破坏CTT中的TRAF6结合位点可减少NF-κB信号传导的激活。用来自具有低NF-κB活化的物种的STING蛋白的CTT(或其相应部分)取代人STING CTT(或其一部分)可以降低所得修饰的人STING蛋白对NF-κB的激活。STING CTT是一段非结构化的约40个氨基酸的序列，含有STING磷酸化和IRF3募集所需的序列基序(参见deOliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。人STING残基S366已被鉴定是主要TBK1磷酸化位点，其是激活干扰素信号传导的先天免疫适配子蛋白所共有的LxIS基序的一部分(参见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。人STING CTT含有第二个PxPLR基序，其包括TBK1结合所需的残基L374；LxIS和PxPLR序列在脊椎动物STING等位基因中是保守的(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。示例的STING CTT序列和IRF3、TBK1和TRAF6结合位点列于下表中：
Figure GDA0004138988600000251
如本文所用，“STING通路激动剂”是通过激活STING通路增加I型干扰素(IFN)表达的任何产物。这种激动剂的示例是本文提供的功能获得性STING多肽变体，以及其它胞质DNA/RNA传感器和I型IFN途径蛋白的功能获得性变体，例如IRF-3、IRF-7、MDA5和RIG-I的变体，其通过STING通路增加I型IFN表达或使I型IFN组成型表达。
如本文所用，经过修饰从而“在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少细胞死亡”或“在免疫细胞中诱导较少细胞死亡”的细菌是比未经修饰的细菌毒性小的细菌，或者与未经修饰的细菌相比毒力降低的细菌。这种修饰的示例是消除吞噬细胞中细胞焦亡和改变细菌上脂多糖(LPS)谱的那些修饰。这些修饰包括破坏或缺失鞭毛蛋白基因、pagP、SPI-1途径的一种或多种组分如hilA、杆状蛋白(例如prgJ)、针状蛋白(例如prgI)和QseC。
如本文所用，“经过修饰以使其优先感染肿瘤驻留免疫细胞”或“经过修饰以使其优先感染免疫细胞”的细菌在其基因组中具有修饰，从而降低其感染除免疫细胞之外的细胞的能力。这种修饰的示例是破坏3型分泌系统或4型分泌系统或影响细菌侵入非免疫细胞的能力的其它基因或系统的修饰。例如，修饰包括破坏/缺失SPI-1组分，该组分是沙门氏菌感染细胞例如上皮细胞所需的，但不影响沙门氏菌对免疫细胞例如吞噬细胞的感染。
如本文所用，“修饰”是指多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸或核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法对于本领域技术人员来说是常规的，例如通过使用重组DNA方法。
如本文所用，对细菌基因组或质粒或基因的修饰包括缺失、置换和插入核酸。
如本文所用，RNA干扰(RNAi)是生物学过程，其中RNA分子通过中和靶向的mRNA分子以抑制翻译并由此抑制靶向的基因的表达来抑制基因表达或翻译。
如本文所用，通过RNAi起作用的RNA分子是指借助其使靶向基因表达沉默而是抑制性的。沉默表达意味着靶向基因的表达被降低或阻抑或抑制。
如本文所用，经由RNAi的基因沉默被称作是抑制、阻抑、破坏或沉默靶向基因的表达。靶向基因含有与抑制性RNA中的序列相对应的核苷酸序列，从而抑制性RNA使靶mRNA的表达沉默。
如本文所用，抑制、阻抑、破坏或沉默靶向基因是指改变靶向基因的表达如翻译的过程，由此降低了由靶向基因编码的产物的活性或表达。降低包括完全敲除或部分敲除，由此参考本文提供的和本文施用的免疫刺激细菌，得以实现治疗。
如本文所用，小干扰RNA(siRNA)是通常长度为约21个核苷酸的小片段的双链(ds)RNA，在每个末端带有3’突出部分(2个核苷酸)，可通过在特定序列处结合并促进信使RNA(mRNA)的降解来“干扰”蛋白质的翻译。这样做时，siRNA基于其相应mRNA的核苷酸序列阻止特定蛋白质的产生。这个过程称为RNA干扰(RNAi)，也称为siRNA沉默或siRNA敲低。
如本文所用，短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹转角的人工RNA分子，可用于通过RNA干扰(RNAi)使靶基因表达沉默。shRNA在细胞中的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来完成。
如本文所用，肿瘤微环境(TME)是肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓衍生的炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ECM)。存在的病况包括但不限于血管生成增加、缺氧、低pH、乳酸浓度增加、丙酮酸浓度增加、间质液压力增加以及代谢物或代谢改变，例如较高的腺苷水平，这些表明存在肿瘤。
如本文所用，“细菌转染(bactofection)”是指细菌介导的基因或质粒DNA转移到真核细胞例如哺乳动物细胞中。
如本文所用，人I型干扰素(IFN)是调节免疫系统的活性的干扰素蛋白的亚组。所有I型IFN都与特定的细胞表面受体复合物例如IFN-α受体结合。I型干扰素包括IFN-α和IFN-β等。骨髓细胞是IFN-α和IFN-β的主要生产者，其具有主要参与先天性免疫反应的抗病毒活性。两种类型的IFN-β是IFN-β1(IFNB1)和IFN-β3(IFNB3)。
如本文所用，M1巨噬细胞表型和M2巨噬细胞表型是指巨噬细胞表型分成的两大类：M1(经典活化巨噬细胞)和M2(替代活化巨噬细胞)。M1巨噬细胞的作用是分泌促炎细胞因子和趋化因子，并呈递抗原，由此其参与正向免疫应答，起到免疫监测的作用。其产生的主要促炎细胞因子是IL-6、IL-12和TNF-α。M2巨噬细胞主要分泌精氨酸酶-I、IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子，具有减轻炎症、促进肿瘤生长和免疫抑制功能。具有M1样表型的巨噬细胞分泌促炎细胞因子，并且不具有M2巨噬细胞的免疫抑制活性。将M2巨噬细胞转化为具有M1或M1样表型的巨噬细胞会将M2巨噬细胞转化为不具有免疫抑制作用但参与抗肿瘤反应的巨噬细胞。转化为具有M1或M1样表型的巨噬细胞的M2巨噬细胞表现出更多的促炎细胞因子/趋化因子和受体，例如CD80和CCR7，以及趋化因子，例如IFNγ和CXCL10。M1表型标志物包括但不限于CD80、CD86、CD64、CD16和CD32中的一种或多种。M1巨噬细胞中一氧化氮合酶(iNOS)的表达也可以作为表型标志物。CD163和CD206是鉴定M2巨噬细胞的主要标志物。M2型细胞的其它表面标志物还包括CD68。任何M2标志物的减少或消除，以及指示M1巨噬细胞的细胞因子/趋化因子的增加，均反映了从M2表型到M1或M1样表型的转变。下文的部分，以及关于M2至M1样或M1表型转换的工作示例，描述了示例的细胞因子谱和诱导的标志物。
如本文所用，核酸或编码的RNA靶向基因的表述是指其通过任何机制抑制或阻抑或沉默基因的表达。通常，这种核酸包括与靶向基因互补的至少一部分，其中该部分足以与互补部分形成杂交体。
如本文所用，“缺失”当指核酸或多肽序列时，是指与序列例如靶多核苷酸或多肽或天然或野生型序列相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失。
如本文所用，“插入”在指核酸或氨基酸序列时，描述了在靶、天然、野生型或其它相关序列内包含一个或多个另外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比包含一个或多个插入的核酸分子在序列的线性长度内含有一个或多个另外的核苷酸。
如本文所用，“添加”至核酸和氨基酸序列描述了与另一序列相比在任一末端添加核苷酸或氨基酸。
如本文所用，“取代”或“置换”是指用可选的核苷酸或氨基酸置换天然的、靶、野生型或其它核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸，而不改变分子的长度(如核苷酸数或残基数所述)。因此，分子中的一个或多个取代不会改变分子的核苷酸或氨基酸残基的数目。与特定多肽相比的氨基酸置换可以依据沿着多肽序列长度的氨基酸残基的数目表示。
如本文所用，“在对应于…的位置”或核苷酸或氨基酸位置“对应于”如序列表中所述的公开序列中的核苷酸或氨基酸位置的表述，是指在使用标准比对算法例如GAP算法与所公开的序列以使相同性最大化进行比对时鉴别的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守且相同氨基酸残基作为指导鉴别相应的残基。通常，为鉴别相应位置，将氨基酸序列进行比对，以获得最高位的匹配(见例如ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；及Carrillo et al.(1988)SIAM J.Applied Math48:1073)。
如本文所用，序列的比对是指使用同源性来比对两个或更多个核苷酸或氨基酸序列。通常，将以50％或更多相同性相关的两个或更多个序列进行比对。比对的序列组是指在相应位置进行比对的及可以包括与基因组DNA序列比对的衍生自RNA的比对序列(例如EST和其它cDNA)的2个或更多个序列。相关或变体多肽或核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这种方法通常使匹配最大化，并且包括例如使用手动比对以及通过使用许多可用的比对程序(例如BLASTP)的方法，和本领域技术人员已知的其它方法。通过比对多肽或核酸的序列，本领域技术人员可以使用保守且相同氨基酸残基作为指导来鉴别相似的部分或位置。此外，本领域技术人员还可以使用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导，在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸或核苷酸残基。相应的位置也可以基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构的比对。在其它情况下，可以识别相应的区域。本领域技术人员还可以使用保守氨基酸残基作为指导，在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸残基。
如本文所用，多肽例如抗体的“性质”是指多肽表现出的任何性质，包括但不限于结合特异性、结构构型或构象、蛋白质稳定性、对蛋白水解的抗性、构象稳定性、耐热性和对pH条件的耐受性。性质的变化可以改变多肽的“活性”。例如，抗体多肽结合特异性的变化可以改变所述多肽结合抗原的能力和/或各种结合活性，例如亲和性或亲合力，或体内活性。
如本文所用，多肽例如抗体的“活性”或“功能活性”是指所述多肽表现出的任何活性。这些活性可以凭经验确定。示例的活性包括但不限于例如通过抗原结合、DNA结合、配体结合或二聚作用或酶活性例如激酶活性或蛋白水解活性与生物分子相互作用的能力。对于抗体(包括抗体片段)，所述活性包括但不限于特异性结合特定抗原的能力、抗原结合的亲和性(例如高或低亲和性)、抗原结合的亲合力(例如高或低亲合力)、结合率(on-rate)、解离率(off-rate)、效应子功能例如促进抗原中和或清除、病毒中和的能力、以及体内活性例如防止病原体感染或侵入，或促进清除，或穿透体内的特定组织或流体或细胞的能力。可以使用公认的测定法在体外或体内评估活性，所述测定例如ELISA、流式细胞计量术、表面等离子共振或等价测定以测量结合率或解离率、免疫组织化学和免疫荧光组织学和显微镜检查、基于细胞的测定和结合测定(例如淘选测定)。
如本文所用，“结合”、“结合的”或其语法上的变化是指分子参与与另一分子的任何有吸引力的相互作用，导致两个分子彼此紧邻的稳定缔合。结合包括但不限于非共价结合、共价结合(例如可逆和不可逆的共价结合)，及包括分子例如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子如包括药物在内的化合物之间的相互作用。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或完全合成的，例如重组产生的，包括含有免疫球蛋白分子的可变重链和轻链区的至少一部分的其任何片段，其足以形成抗原结合位点，以及在组装时足以特异性结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。例如，抗体是指含有两条重链(其可以表示为H和H’)和两条轻链(其可以表示为L和L’)的抗体，其中每条重链可以是足以形成抗原结合位点的全长免疫球蛋白重链或其一部分(例如，重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，每条轻链可以是足以形成抗原结合位点的全长轻链或其一部分(例如，轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。通常，抗体最少包括可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的全部或至少一部分。抗体还可以包括全部或部分恒定区。
出于本文的目的，术语抗体包括全长抗体及其一部分，包括抗体片段，例如抗CTLA-4抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、scFv-Fc片段(其中scFv中的VH结构域连接至Fc，例如人IgG1 Fc)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(anti-Id)抗体或上述任何一种抗体的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类别(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。用于人治疗的抗体通常是人抗体或人源化抗体。
如本文所用，“抗体片段”是指(i)含有可变重链和/或轻链的单价和单特异性抗体衍生物，或抗体的功能片段并且缺少Fc部分；和(ii)
Figure GDA0004138988600000291
(串联scFv)、DART、双抗体和单链双抗体(scDb)。因此，抗体片段包括：Fab、Fab’、scFab、scFv、scFv-Fc、Fv片段、纳米抗体(见例如衍生自双峰驼(Camelus bactriamus)、单峰驼(Camelus dromedarius)或羊驼(Lama pacco)的抗体)(见例如美国专利号5,759,808；和Stijlemans et al.(2004)J.Biol.Chem.279:1256-1261)、VHH、dAb(单域抗体)、最小识别单元、单链双抗体(scDb)、
Figure GDA0004138988600000292
和DART。所述抗体片段具有低于60kDa的分子量。
如本文所用，“核酸”是指通常通过磷酸二酯键连接在一起的至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。术语“核酸”还包括核酸的类似物，例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA和其它这种类似物和衍生物或其组合。核酸还包括DNA和RNA衍生物，所述DNA和RNA衍生物含有例如核苷酸类似物或“主链”键而不是磷酸二酯键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。该术语还包括由核苷酸类似物和单链(有义或反义)和双链核酸制成的RNA或RNA的等价物、衍生物、变体和类似物。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
如本文所用，分离的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分开的核酸分子。当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其它化学品。本文提供的示例的分离的核酸分子包括编码本文提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”是指核酸区域在功能上彼此相关。其指的是一种并置，从而如此描述的组件处于允许其以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响或实现编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。例如，可以将编码前导肽的核酸可操作地连接于编码多肽的核酸，由此可以转录和翻译所述核酸以表达功能性融合蛋白，其中前导肽实现融合多肽的分泌。在一些情况下，将编码第一个多肽(例如前导肽)的核酸与编码第二个多肽的核酸可操作地连接，并且将核酸转录为单个mRNA转录物，但是mRNA转录物的翻译可以产生被表达的两个多肽之一。例如，琥珀终止密码子可以位于编码第一个多肽的核酸与编码第二个多肽的核酸之间，使得当引入到部分琥珀抑制细胞中时，所得单个mRNA转录物可以被翻译以产生含有第一个和第二个多肽的融合蛋白，或者可以被翻译仅产生第一个多肽。在另一个实例中，启动子可以与编码多肽的核酸可操作地连接，由此所述启动子调节或介导核酸的转录。
如本文所用，提及例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽时所用“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或基因或多肽分子。
如本文所用，天然存在的α-氨基酸的残基是在自然界中发现的那些20种α-氨基酸的残基，其通过带电荷的tRNA分子与其在人体内同源mRNA密码子的特异性识别而掺入蛋白质中。
如本文所用，“多肽”是指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
如本文所用，“肽”是指长度为2至约40或40个氨基酸的多肽。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基团的有机化合物。多肽包含两个或更多个氨基酸。出于本文的目的，所提供的抗体和免疫刺激蛋白中含有的氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸(见下表)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(例如其中α-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，存在于本文中出现的多肽的各种氨基酸序列中的氨基酸根据其熟知的三字母或单字母缩写识别(见下表)。存在于各种核酸分子和片段中的核苷酸以本领域常规使用的标准单字母名称命名。
如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键处化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基通常是“L”异构体形式。“D”异构体形式的残基可以被任何L-氨基酸残基取代，只要多肽保留期望的功能性质即可。NH2是指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽羧基末端的游离羧基。根据J.Biol.Chem.,243:3557-59(1968)中描述并在37C.F.R.§§1.821-1.822下接受的标准多肽命名法，氨基酸残基的缩写如下表所示：
对应表
Figure GDA0004138988600000301
/>
Figure GDA0004138988600000311
本文中由式表示的氨基酸残基的所有序列在氨基末端至羧基末端的常规方向上是从左至右的方向。短语“氨基酸残基”定义为包括在以上对应表中列出的氨基酸，以及修饰的、非天然的和非常见的氨基酸。氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列或与氨基末端基团如NH2或与羧基末端基团如COOH的肽键。
在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守取代为本领域技术人员已知，通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，通常多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物学活性(见例如Watson et al.,MolecularBiology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224)。
这种取代可以根据下表中列出的示例取代进行：
示例的保守氨基酸取代
原始残基 示例的保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
其它取代也是允许的并可以根据经验确定或根据其它已知保守或非保守取代确定。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指存在于多肽中的20个L-氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但已被结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此，非天然存在的氨基酸包括例如除20个天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例的非天然氨基酸为本领域技术人员已知，包括但不限于2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(bAad)、β-丙氨酸/β-氨基丙酸(Bala)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁酸/哌啶酸(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2,4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链素(Des)、2,2’-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟基赖氨酸(Hyl)、别羟基赖氨酸(Ahyl)、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和鸟氨酸(Orn)。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其含有以自然界中未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工操作的结果存在，包括所操作的分子的克隆和其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5’至3’方向读取时，其编码特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以从天然来源中分离、体外合成、或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中根据核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)给出。在上下文允许的情况下，术语核苷酸是指单链和双链分子。当将该术语应用于双链分子时，其用于表示整个长度，且应理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员将认识到，双链多核苷酸的两条链在长度上可以略有不同，其末端可以是交错的；因此，双链多核苷酸分子中的所有核苷酸不能配对。这种未配对末端在长度上通常将不超过20个核苷酸。
如本文所用，通过重组方法产生是指使用分子生物学熟知的方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，“异源核酸”是编码产物(即RNA和/或蛋白质)的核酸，所述产物在体内不由产物在之中表达的细胞正常产生，或者异源核酸是处于通常其不存在于之中的基因座中的核酸，或者是介导或编码通过影响转录、翻译或其它可调节的生化过程来改变内源核酸如DNA的表达的介导物的核酸。异源核酸，如DNA，也称为外来核酸。本领域技术人员认识到或认为对于核酸在其中表达的细胞而言是异源或外来的任何核酸如DNA，在本文中均为异源核酸所涵盖；异源核酸包括也是经内源表达而外源加入的核酸。异源核酸通常对于其所导入之中的细胞而言不是内源的，而是已经从另一细胞获得或合成制备，或被导入其非天然存在于之中的基因组基因座中，或其表达处于调节序列或者不同于天然调节序列的序列的控制下。
本文的异源核酸的实例包括但不限于编码DNA/RNA传感器途径的蛋白质或其功能获得性或组成型活性变体的核酸，或者编码免疫刺激蛋白如细胞因子、趋化因子或共刺激分子的核酸，所述免疫刺激蛋白赋予或有助于在肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫性。还包括其它产物，例如抗体及其片段、
Figure GDA0004138988600000331
诱饵受体、拮抗多肽和RNAi，其在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫性。在免疫刺激细菌中，异源核酸通常在所引入的质粒上编码，但是可以将其引入细菌的基因组中，例如改变细菌产物表达的启动子。异源核酸，如DNA，包括可以以某些方式介导编码治疗性产物的DNA的表达的核酸，或者其可以编码以某些方式直接或间接介导治疗性产物的表达的产物，例如肽或RNA。
如本文所用，细胞疗法涉及将细胞递送至受试者以治疗疾病或病症。所述细胞可以是同种异体或自体的细胞，被离体修饰，例如通过用本文提供的免疫刺激细菌感染，使其在导入受试者时递送或表达产物。
如本文所用，基因疗法涉及将异源核酸如DNA转移至患有寻求这种治疗的疾病或病症的哺乳动物特别是人的某些细胞例如靶细胞中。将核酸如DNA以使得异源核酸如DNA被表达并产生由此编码的治疗性产物的方式导入所选择的靶细胞中。基因疗法还可用于递送编码基因产物的核酸，所述基因产物取代缺陷基因或补充其导入的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码治疗性化合物，如生长因子或其抑制剂、或肿瘤坏死因子或其抑制剂，如其受体，其通常不由哺乳动物宿主正常产生或不以治疗有效量或在治疗有效时间产生。编码治疗性产物的异源核酸如DNA可以在导入到患病宿主的细胞之前被修饰，以增强或以另外改变产物或其表达。基因疗法还可包括递送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节物。
如本文所用，“表达”是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。可以使用本领域已知的任何方法评估多肽的表达水平，包括例如确定由宿主细胞产生的多肽的量的方法。这种方法可包括但不限于通过ELISA、凝胶电泳后的考马斯蓝染色、Lowry蛋白测定和Bradford蛋白测定来定量细胞裂解物中的多肽。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、维持、再生和/或扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达由载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸被复制，从而扩增核酸。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当将载体转化进合适的宿主细胞中时，可以从中核酸表达一种或多种异源蛋白质。关于载体，其包括通常通过限制性消化和连接可将编码多肽或其片段的核酸导入其中的那些载体。关于载体，还包括含有编码多肽如修饰的抗CTLA-4抗体的核酸的那些载体。载体用于将编码多肽的核酸导入宿主细胞中，以扩增核酸或表达/展示由核酸编码的多肽。载体通常保持游离型，但是可以设计为实现将基因或其部分整合到基因组染色体中。还考虑了是人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和使用是本领域技术人员熟知的。载体还包括“病毒性载体”或“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操作地连接，以将外源基因转移进细胞中(作为载体或传送物)。
如本文所用，“表达载体”包括能表达与调节序列如启动子区域可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列可以实现这种DNA片段的表达。这种另外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可以包含这两种元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或在导入合适的宿主细胞中导致克隆的DNA表达的其它载体。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及保持游离型的那些或整合入宿主细胞基因组中的那些。
如本文所用，“一级序列”是指多肽氨基酸残基序列或核酸分子核苷酸序列。
如本文所用，“序列相同性”是指在比较测试与参考多肽或多核苷酸之间相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基的数目。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列的序列比对以鉴别相似性或相同性区域而确定。出于本文的目的，通常通过比对以鉴别相同残基而确定序列相同性。比对可以是局部或全局比对。可以在比较的序列之间鉴别出匹配、错配和空位。空位是在比对序列的残基之间插入的空位氨基酸或核苷酸以排列相同或相似的字符。通常，可能存在内部和末端空位。当使用空位罚分时，可以确定序列相同性而对末端空位不罚分(例如对末端空位不罚分)。或者，可以在不考虑空位的情况下将序列相同性确定为总比对序列的相同位置的数目/长度×100。
如本文所用，“全局比对”是从头到尾比对两个序列，每个序列中的每个字母仅比对一次。无论序列之间是否存在相似性或相同性，均会产生比对。例如，基于“全局比对”具有50％序列相同性是指在两个比较的序列的全序列的比对中，每个长度为100个核苷酸的序列中50％的残基是相同的。应理解，即使比对序列的长度不同，全局比对也可以用于确定序列相同性。除非选择“对于末端空位无罚分”，否则在确定序列相同性时将考虑序列末端的差异。通常，全局比对用于在其大部分长度上具有显著相似性的序列。用于进行全局比对的示例的算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman etal.(1970)J.Mol.Biol.48:443)。用于进行全局比对的示例性程序是可公开获得的，且包括可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)上获得的全局序列比对工具，以及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的程序。
如本文所用，“局部比对”是比对两个序列、但是仅比对序列的具有相似性或相同性的那些部分的比对。因此，局部比对确定一个序列的子节段是否存在于另一序列中。如果不存在相似性，则不会返回比对信息。局部比对算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))。例如，基于“局部比对”具有50％序列相同性是指在任意长度的两个比较序列的全序列比对中，长度为100个核苷酸的相似性或相同性的区域在相似性或相同性区域中具有50％的相同的残基。
出于本文的目的，可以用每个供应商建立的默认空位罚分通过标准比对算法程序来确定序列相同性。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(含有对于相同性为1的值和对于非相同性为0的值)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745-6763的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence andStructure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)对于每个空位的罚分为3.0且对于每个空位中的每个符号附加0.10罚分；和(3)对于末端空位无罚分。无论任何两个核酸分子具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其它类似用语的核苷酸序列，还是任何两个多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其它类似用语的氨基酸序列，均可以使用基于局部或全局比对的已知计算机算法确定(见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software，其提供了数十个已知和可公开获得的比对数据库和程序的链接)。通常，出于本文的目的，使用基于全局比对的计算机算法确定序列相同性，如得自NCBI/BLAST的Needleman-Wunsch全局序列比对工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&Page_TYPE＝BlastHome)；LAlign(William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357))；以及可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的Xiaoqui Huang的程序。通常，在全局比对中，将每个比较的多肽或核苷酸的全长序列在每个序列的全长进行比对。当所比较的序列为基本相同的长度时，也可以使用局部比对。
因此，如本文所用，术语“相同性”表示测试与参考多肽或多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性实例中，“与…至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸具有90％至100％百分比相同性。在90％或更高水平的相同性表明以下事实：假设出于示例目的，比较了长度为100个氨基酸或核苷酸的测试与参考多肽或多核苷酸，测试多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中有10个)的氨基酸或核苷酸与参考多肽或多核苷酸的那些氨基酸或核苷酸不同。可以在测试与参考多核苷酸之间进行类似比较。这种差异可以表示为在氨基酸序列的整个长度上随机分布的点突变，或者其可以聚集在不同长度直至允许的最大长度的一个或多个位置，例如10/100个氨基酸差异(约90％相同性)。差异也可能是由于氨基酸残基的缺失或截短所致。差异被定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。取决于所比较序列的长度，在约85-90％以上的同源性或相同性水平，结果可以独立于程序和空位参数设置；通常无需依赖软件即可轻松评估出这种高水平相同性。
如本文所用，“疾病或病症”是指由某些原因或状况包括但不限于感染、获得性病况以及遗传病况等引起的生物体中的病理状况，且其特征在于可识别的症状。
如本文所用，“治疗”患有疾病或病况的受试者是指所述受试者的症状在治疗后部分或全部减轻或保持静态。
如本文所用，“治疗”是指改善疾病或病症的症状的任何作用。治疗包括预防、治疗和/或治愈。治疗还涵盖本文提供的任何免疫刺激细菌或组合物的任何药物用途。
如本文所用，“预防(prophylaxis)”是指预防(prevention)潜在疾病和/或预防疾病的症状恶化或进展。
如本文所用，“预防(prevention)”或预防(prophylaxis)及其语法等同形式是指降低进展为疾病或病况的风险或可能性的方法。
如本文所用，“药学有效物质”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂和常规治疗药，包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所用，“治疗作用”是指对受试者进行治疗而产生的改变、通常为改良或改善疾病或病况的症状或治愈疾病或病况的作用。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指一种物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，所述量在施用于受试者后至少足以产生治疗作用。因此，所述量是预防、治愈、改善、抑制或部分抑制疾病或病症的症状所需的量。
如本文所用，“治疗效力”是指一种物质、化合物、材料或包含化合物的组合物在已施用所述物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的受试者中产生治疗作用的能力。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”是指当将一种物质、化合物、材料或包含化合物的组合物施用于受试者时具有预期的预防作用的量，所述预防作用例如是预防或延迟疾病或症状的发作或复发、降低疾病或症状的发作或复发的可能性或降低病毒感染的发生率。通过施用一次剂量不需要发生完全的预防作用，以及可以是在施用一系列剂量后发生作用。因此，可以以一次或多次施用来施用预防有效量。
如本文所用，通过治疗例如通过施用药物组合物或其它治疗剂来改善特定疾病或病症的症状，是指可归因于组合物或治疗剂的施用或与组合物或治疗剂的施用相关的任何症状的减轻，无论永久的或暂时的、持续的或短暂的。
如本文所用，“抗癌剂”或“抗癌治疗剂”是指直接或间接对恶性细胞和组织具有破坏性或毒性的任何物质或治疗剂。例如，抗癌剂包括杀死癌细胞或另外抑制或损害肿瘤或癌细胞的生长的物质。示例的抗癌剂是化疗剂和免疫治疗剂。
如本文所用，“治疗活性”是指治疗性产物如多肽、核酸分子及其它治疗性分子的体内活性。通常，治疗活性是与治疗疾病或病况相关的活性。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，包括哺乳动物，如人。
如本文所用，患者是指人受试者。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊；以及猪和其它动物。非人动物除外人作为预期动物。本文提供的多肽来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数多肽是动物来源的，包括哺乳动物来源。
如本文所用，“组合物”是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水相的、非水相的或其任何组合。
如本文所用，“组合”是指两种或更多种物品之间或之中的任何关联。所述组合可以是两种或更多种单独的物品，例如两种组合物或两种集合，其混合物，如两种或更多种物品的单一混合物，或其任意变化。组合的元件通常在功能上关联或相关。
如本文所用，“组合疗法”是指施用两种或更多种不同治疗剂。所述不同的治疗剂可以单独、相继、间歇地提供和施用，或者可以在一个组合物中提供。
如本文所用，“试剂盒”是包装的组合，其任选包括其它元件，如另外的试剂和所述组合或其元件的使用说明，目的包括但不限于生物活性或性质的激活、施用、诊断和评估的目的。
如本文所用，“单位剂型”是指适于人和动物受试者以及如本领域中已知单独包装的物理上分立的单位。
如本文所用，“单一剂量制剂”是指直接施用的制剂。
如本文所用，“多剂量制剂”是指含有多剂量的治疗剂及可以直接施用以提供数个单剂量的治疗剂的制剂。所述剂量可以在几分钟、几小时、几周、几天或几个月的时间内施用。多剂量制剂可以允许剂量调节、剂量合并和/或剂量拆分。由于随着时间使用多剂量制剂，因此其通常含有一种或多种防腐剂以防止微生物生长。
如本文所用，“制造产品”是制备和销售的产品。如在本申请中通篇使用的，该术语旨在涵盖包含于包装物品中的本文提供的任何组合物。
如本文所用，“流体”是指可以流动的任何组合物。因此，流体涵盖半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、霜剂形式的组合物及其它这种组合物。
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白质(例如分离的抗体或其抗原结合片段)或其生物活性部分(例如分离的抗原结合片段)基本上不含细胞材料或来自所述多肽或蛋白质衍生自之中的细胞或组织的其它污染蛋白质，或基本不含化学合成时的化学前体或其它化学品。如果如通过本领域技术人员用来评估这种纯度的标准分析方法例如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC)所确定，所述制备物表现为不含容易检测到的杂质，或者制备物足够纯以至于进一步纯化不会可检测地改变该物质的物理和化学性质如酶和生物活性，则可以确定制备物是基本上不含这些物质。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可提高化合物的特异性活性。
如本文所用，“细胞提取物”或“裂解物”是指由裂解或破坏的细胞制成的制备物或级分。
如本文所用，“对照”是指与测试样品基本相同的样品，除了其不使用测试参数进行处理，或者，如果是血浆样品，则其可以来自未受感兴趣的病况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括其复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，关于包含“免疫球蛋白结构域”的多肽，包括具有一个或多个免疫球蛋白结构域的多肽。
如本文所用，除非明确指出仅是可选方案或可选方案是互斥的，否则术语“或”用于表示“和/或”。
如本文所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。“约”还包括精确量。因此，“约5个氨基酸”是指“约5个氨基酸”以及也是指“5个氨基酸”。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。例如，任选地变体部分是指该部分是变体或非变体。
除非另有说明，否则如本文所用的关于任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写应与其常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature一致(见Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。
出于清晰公开而不是通过限制的方式，关于发明的详细描述分为以下段落章节。
B.用于癌症治疗的免疫刺激细菌概述
细菌具有抗癌活性的认识可以追溯到十九世纪，当时几位医生观察到感染化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的患者肿瘤消退。William Coley开始了第一次利用细菌治疗终末期癌症的研究，并开发了一种由化脓性链球菌(S.pyogenes)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)组成的疫苗，该疫苗成功地用于治疗多种癌症，包括肉瘤、癌瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。从那时起，许多细菌物种，包括梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、单核细胞增生李斯特菌属(Listeriamonocytogenes)和埃希氏菌属(Escherichia)，已被研究作为抗癌疫苗的来源(见例如国际PCT申请公开号WO 1999/013053和WO 2001/025399；Bermudes et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Patyar et al.(2010)Journal ofBiomedical Science 17:21；和Pawlek et al.(2003)Lancet Oncol.4:548-556)。
作为一种治疗平台，与如溶瘤病毒等其它疗法相比，细菌具有几个优势。一些细菌物种可以被工程化为口服和全身(静脉内；IV)施用，其在体外和体内容易繁殖，并且可以在冻干状态下储存和运输。由于缺乏外显子，细菌染色体很容易被操纵，并且许多菌株的完整基因组已得到充分鉴定(Felgner et al.(2016)mBio 7(5):e01220-16)。许多类型的细菌比病毒更便宜、更容易生产，并且工程化的细菌的适当递送比病毒递送更有利，因为其不会永久整合到宿主细胞基因组中，其优先感染骨髓细胞而不是上皮细胞，并且必要时可以用抗生素迅速消除而使其更安全。
提供了经修饰以利用这些有利性质的免疫刺激细菌。本文提供的细菌经过修饰，以使其在肿瘤微环境中感染并积累，特别是在肿瘤驻留免疫细胞(骨髓细胞)中，例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、树突状细胞(DC)和髓源抑制因子细胞(MDSC)，并且还被设计为表达和递送高水平的治疗性蛋白质及其组合，特别是互补组合。本文提供的免疫刺激细菌具有优于现存细菌疗法以及细胞疗法、溶瘤病毒疗法和现有细菌疗法的有利性质。本文提供的免疫刺激细菌，虽然其可以通过任何合适的途径施用，但其适合于全身施用，例如静脉内施用。如本文所示和所述，本文提供的免疫刺激细菌可以靶向主要免疫途径。
本文提供的细菌被设计和工程化以保持细菌的有益支架属性，并具有病毒样免疫特征。这有利于用作抗癌治疗剂。下表总结了细菌和病毒的一些免疫和支架属性；本文提供的免疫刺激细菌保留了细菌支架的可行性，但在受治疗的受试者中产生了病毒样免疫应答(在下面的C部分中更详细地讨论)。
Figure GDA0004138988600000381
在沙门氏菌和其它细菌物种中，鞭毛有助于TRL5介导的炎症，LPS导致TLR4介导的炎症反应，而粘性卷曲菌毛导致TLR2介导的炎症反应。本文提供的免疫刺激细菌的基因组被修饰，使得细菌缺乏鞭毛和粘性卷曲菌毛，并具有修饰的LPS，从而导致TLR4介导的炎症反应的减少或消除。结果，本文提供的免疫刺激细菌诱导病毒样抗肿瘤免疫反应。这些组分的消除或修饰赋予了其它有利的性质，例如下文详细讨论的那些。所述免疫刺激细菌递送治疗产物，例如抗癌治疗剂，特别是产物的互补组合。本文提供的免疫刺激细菌以肿瘤特异性方式将编码的遗传有效载荷递送至肿瘤驻留骨髓细胞。
提供了抗癌治疗产物，免疫刺激细菌，其递送编码一种或多种治疗产物的遗传有效载荷。包括截短的共刺激分子(受体或配体；例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)，具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域的完全或部分缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于截短或缺失的胞质结构域而不能向APC发出反调节信号。
免疫刺激细菌可以编码和表达以下一种或多种：IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-12，IL-15，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，干扰素-α，干扰素-β，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经过修饰使其不结合与IL-2Ra的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，胞质DNA/RNA传感器或I型IFN途径蛋白，例如功能获得或组成型活性STING，IRF3，IRF7，MDA5或RIG-I变体(诱导I型IFN)，TGF-β抑制剂，例如TGF-β抑制性抗体，TGF-β多肽拮抗剂和TGF-β结合诱饵受体，抗体及其片段，例如靶向免疫检查点和其它抗癌靶的那些抗体，例如VEGF和IL-6，共刺激受体/分子，例如4-1BBL，包括胞质结构域缺失或截短或以其它方式消除的4-1BBL，等等。所述免疫刺激细菌还可以编码和表达截短的共刺激分子(例如，4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)，具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域的部分或完全缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域而不能向APC发出反调节信号。这种治疗产物和药剂的组合可以在单一治疗组合物中表达。凭借对细菌基因组的修饰，所述免疫刺激细菌表现出肿瘤特异性定位和富集，并提供静脉内(IV)施用以激活抗肿瘤免疫途径，否则如果全身性激活，这些途径会产生毒性。
本文提供的免疫刺激细菌在基因上被设计为安全的并且靶向肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞。本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰和其它修饰的组合，以及编码的治疗产物，其协同作用以提供在肿驻留免疫细胞中积聚并持续足够长的时间以递送治疗产物的免疫刺激细菌，特别是在肿瘤和肿瘤微环境中诱导或促进抗癌免疫刺激、无毒副作用或毒副作用有限的组合。当全身递送时，例如静脉内(IV)施用，所述免疫刺激细菌在肿瘤中、包括在转移性病变中富集；其提供免疫有效载荷的有效遗传转移，特别是转移至肿瘤驻留骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源性抑制细胞(MDSC)和树突状细胞(DC)中；其诱导强大力局部免疫反应，破坏肿瘤并为未来的复发接种疫苗；并且当治疗结束时，其会被自然消除，例如通过被感染细胞的吞噬作用和破坏，或者可以通过一个疗程的抗生素迅速破坏。
由于设计的嘌呤/腺苷营养缺陷，本文提供的免疫刺激细菌在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中表现出优先积累，并且表现出不能在吞噬细胞内复制。避免被血清补体失活的免疫刺激细菌允许在肿瘤微环境中直接递送各种高浓度的免疫治疗剂和治疗产物，同时最小化对正常组织的毒性，并且在本文中提供。
例如，如第C.8部分中更详细描述的，本文提供的免疫刺激细菌包括基因组的修饰，使其成为msbB-/pagP-，这会改变LPS中的脂质A，导致五酰化(野生型脂质A具有6-7条脂肪酸链)，降低TLR4亲和性；是腺苷/腺嘌呤营养缺陷型，例如purI-；是天冬酰胺酶II-(ansB-)，这可提高T胞质量；是csgD-，除其它性质外，其还去除了卷曲菌毛；并且包括其它任选的基因组修饰，例如插入、缺失、破坏和任何其它修饰，使得编码的产物不以活性形式产生，如本文详细讨论的。所述免疫刺激细菌包括在真核启动子控制下编码一种或多种治疗产物、特别是抗癌产物的质粒。
本文提供的免疫刺激细菌将治疗产物(例如组成型活性STING变体和其它免疫调节蛋白和产物)递送至肿瘤驻留骨髓细胞，促进适应性免疫并增强T细胞功能。所述免疫刺激细菌导致免疫抑制性肿瘤微环境完全重塑，向适应性抗肿瘤表型转变，远离特征在于促进先天免疫和抑制适应性免疫的细菌表型。
本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，由此其靶向或积聚在肿瘤驻留免疫细胞中，特别是肿瘤驻留骨髓细胞，例如巨噬细胞、MDSC(骨髓衍生抑制细胞)和DC(树突状细胞)，在这些细胞中其递送在宿主细胞(真核)转录/翻译机制识别的调节序列控制下表达的编码的治疗产物的有效载荷。编码的产物在骨髓细胞中表达，并适当地递送到肿瘤微环境中。所述细菌产生抗肿瘤免疫，也可以递送直接治疗肿瘤的抗肿瘤产物，以及可以激活前药的产物。
与未修饰的细菌相比，本文提供的免疫刺激细菌可以表现出高至少约100,000倍的肿瘤浸润和富集。所述免疫刺激细菌被肿瘤驻留的免疫细胞消耗，并递送编码治疗产物的质粒，这些产物在免疫细胞和肿瘤微环境中表达和产生，以产生抗肿瘤免疫性。
1.细菌癌症免疫治疗
许多实体瘤类型已经进化出一种高度免疫抑制的微环境，这使得其对已批准的检查点疗法高度难治，例如抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1疗法。肿瘤对检查点疗法逐渐形成耐药性的一种机制是缺乏肿瘤内T细胞和肿瘤抗原交叉呈递树突状细胞(DC)，被描述为T细胞排除、非炎性或“冷肿瘤”(Sharma et al.(2017)Cell 168(4):707-723)。对于少数肿瘤为T细胞炎性且对检查点免疫疗法有反应的患者，他们经常经历严重的自身免疫毒性，许多患者最终会复发并成为检查点难治性(见例如Buchbinder et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3377-3383；Hodi et al.(2010)N.Engl.J.Med.363(8):711-723；和Chen et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3384-3391)。肿瘤启动多种机制来逃避免疫监视，重新编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫，排除和失活抗肿瘤T细胞，并对靶向癌症治疗产生耐药性(见例如Mahoney et al.(2015)Nat.Rev.Drug Discov.14(8):561-584)。解决这个问题将需要能够适当地使这些肿瘤产生炎性的免疫疗法，并产生可以提供长期肿瘤消退的抗肿瘤免疫。此外，肿瘤内治疗是棘手的，并且在转移性疾病情况中会受到很大限制。需要适当地使每个单独的转移性病变产生炎症并克服多种免疫抑制途径的全身施用疗法。凭借其特异性靶向肿瘤驻留免疫细胞和表达多种互补遗传有效载荷/治疗产物的能力，本文提供的免疫刺激细菌旨在解决这些问题。
2.现有靶向肿瘤微环境的治疗
已经开发了许多靶向肿瘤微环境(TME)并试图促进抗肿瘤免疫的疗法。每种疗法都有其自身的挑战和缺点，本文提供的免疫刺激细菌解决了这些挑战和缺点。
a.自体T细胞疗法的局限性
临床上已经研究了几种全身施用的治疗平台，目的是进入高度免疫抑制的肿瘤微环境，并诱导对炎症肿瘤的适当免疫反应，促进抗肿瘤免疫。这些平台包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其是通过从患者采集T细胞并对其进行重新工程化以将T细胞受体融合到特异于特定肿瘤抗原的抗体Ig可变胞外域而产生的。这赋予细胞抗体的抗原识别性质，以及活化的T细胞的溶细胞性质(见例如Sadelain et al.(2015)J.Clin.Invest.125(9):3392-3400)。尽管这项技术具有前景和效力，例如FDA批准了CD19 CAR-Ttisagenlecleucel(例如商标为
Figure GDA0004138988600000401
)和axicabtagene ciloleucel(商标为/>
Figure GDA0004138988600000402
)，但成功仅限于CD19+造血系统恶性肿瘤，并且以致命的免疫相关不良事件为代价(见例如Jackson et al.(2016)Nat.Rev.Clin.Oncol.13(6):370-383)。肿瘤可以快速突变以下调实体瘤的靶向肿瘤抗原，包括抗原CD19，从而促进免疫逃逸(见例如Mardiana et al.(2019)Sci.Transl.Med.11(495):eaaw2293)。没有过多的肿瘤特异性靶抗原。不在健康组织中表达的实体瘤靶点是CAR-T治疗的主要障碍。除此之外，由于缺乏足够的T细胞趋化因子梯度，这是适当的T细胞浸润到肿瘤中所必需的，因此CAR-T疗法在进入实体瘤微环境方面还存在其它障碍。此外，一旦其浸润肿瘤，则其被迅速失活(见例如Brown et al.(2019)Nat.Rev.Immunol.19(2):73-74)。如果CAR-T细胞的安全性得到显著改善并将功效扩展到实体瘤，与这些费力疗法相关的可行性和成本仍然限制了这种疗法的更广泛采用。
b.病毒疫苗平台
溶瘤病毒(OV)具有天然和工程化性质，可诱导肿瘤细胞裂解，将T细胞募集到肿瘤中，并递送可被肿瘤细胞读取的遗传物质以产生免疫调节蛋白。例如，命名为Talimogenelaherparepvec(T-VEC)的溶瘤病毒是一种修饰的单纯疱疹病毒，编码抗黑色素瘤抗原和细胞因子GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，可在瘤内施用。其已获FDA批准用于转移性黑色素瘤(见例如Bastin et al.(2016)Biomedicines 4(3):21)。已证明T-VEC对一些黑色素瘤患者有临床益处，并且免疫毒性低于免疫检查点抗体或FDA批准的全身施用的细胞因子，例如IL-2和干扰素-α(见例如Kim et al.(2006)Cytokine Growth Factor Rev.17(5):349-366；和Paul et al.(2015)Gene 567(2):132-137)。
溶瘤病毒(OV)作为抗癌疗法具有许多局限性。首先，溶瘤病毒被血液中的人体补体系统迅速失活。已证明难以通过全身施用递送足够的病毒以产生所需的治疗效果。肿瘤内施用在转移性情况中受到限制(病变遍布全身)，对于大多数实体瘤类型(例如肺和内脏病变)而言是难治的，并且需要介入性、引导放射学进行注射，这限制了重复给药。病毒很难以商业规模生产和储存。大多数基于OV的疫苗，例如基于副粘病毒、呼肠孤病毒和小核糖核酸病毒等的疫苗，具有类似的局限性(见例如Chiocca et al.(2014)CancerImmunol.Res.2(4):295-300)。溶瘤病毒具有固有的免疫原性并能迅速从人体血液中清除，进入肿瘤的T细胞对病毒抗原的亲和性比对较弱肿瘤新抗原的亲和性要高得多(见例如Aleksic et al.(2012)Eur.J.Immunol.42(12):3174-3179)。因此，除了公认的平台技术限制外，迄今为止，OV刺激持久抗肿瘤免疫的能力有限。
c.细菌癌症治疗
在临床前动物研究中，当从远端部位注射时，许多细菌物种已证明在实体瘤内优先复制。这些细菌物种包括但不限于沙门氏菌属(Salmonella)、双歧杆菌属(Bifodobacterium)、梭菌属(Clostridium)和埃希氏菌属(Escherichia)。细菌的肿瘤归巢性质与宿主对细菌感染的先天免疫反应相结合，可以介导抗肿瘤反应。这种肿瘤组织趋向性不同程度地减小了肿瘤的大小。这些细菌物种的肿瘤趋向性的一个促成因素是在缺氧和低氧环境中复制的能力。许多这些天然的肿瘤嗜性细菌已被进一步工程化以增加抗肿瘤反应的效力(Zu et al.(2014)Crit.Rev.Microbiol.40(3):225–235；和Felgner et al.(2017)Microbial Biotechnology 10(5):1074–1078)。尽管在动物研究中进行了概念验证，但在动物模型中不存在的人血清中的补体因子可以使细菌失活，从而限制了其作为治疗癌症的疗法的用途。
为了口服或全身施用，所述细菌菌株被减毒以使其不会引起全身性疾病和/或感染性休克，但仍保持一定程度的感染性以有效地定植肿瘤，并抵抗补体失活。许多不同的细菌物种已被研究作为抗癌治疗的可能药物，这些细菌物种包括：梭菌属(Clostridium)(见例如Dang et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(26):15155-15160；美国专利公开号2017/0020931和2015/0147315；及美国专利号7,344,710和3,936,354)，分支杆菌属(Mycobacterium)(见例如美国专利公开号2015/0224151和2015/0071873)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)(见例如Dang et al.(2001)；和Kimura et al.(1980)Cancer Res.40:2061-2068)，乳杆菌属(Lactobacillus)(见例如Dang et al.(2001))，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(见例如Le et al.(2012)Clin.Cancer Res.18(3):858-868；Starks et al.(2004)J.Immunol.173:420-427；和美国专利公开号2006/0051380)和大肠杆菌(Escherichia coli)(见例如美国专利号9,320,787)。
本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，其解决了为治疗肿瘤而开发的现有细菌的问题。这些修饰改善了细菌在肿瘤微环境中的靶向或积累，特别是经设计使细菌感染肿瘤驻留免疫细胞而不是健康组织，从而降低毒性并改善编码产物的递送。所述免疫刺激细菌还旨在递送治疗产物，包括其组合，旨在消除肿瘤的免疫抑制作用，增强宿主的抗肿瘤反应，并提供抗肿瘤产物。
i.李斯特菌属(Listeria)
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种活的减毒的细胞内细菌，能够诱导强力CD8+T细胞启动以在小鼠癌症模型中表达肿瘤抗原，也已被探索作为细菌癌症载体(见例如Le et al.(2012)Clin.Cancer Res.18(3):858-868)。在一项基于单核细胞增生李斯特菌的疫苗的临床试验中，结合了肿瘤抗原间皮素，以及一种基于异基因胰腺癌的GVAX疫苗，采用初免-加强方法，表明在晚期胰腺癌患者的中位生存期为6.1个月，相应的单独使用GVAX疫苗治疗的患者的中位生存期为3.9个月(见例如Le et al.(2015)J.Clin.Oncol.33(12):1325-1333)。然而，这些结果并未在更大的2b期研究中重复，这表明人难以将外周免疫监视颠覆为低亲和性肿瘤新抗原。由于需要在吞噬作用后裂解细菌，这是有效质粒转移的先决条件，因此单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)对编码的肿瘤抗原也表现出有限的免疫反应，尚未证明单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)在人巨噬细胞中会发生这种情况。
ii.沙门氏菌属(Salmonella)物种
肠沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)是用作抗癌治疗剂的细菌物种的示例。鼠伤寒沙门氏菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，由于可以利用来自组织坏死、渗漏的肿瘤脉管系统的营养物质以及其在免疫抑制的肿瘤微环境中存活的可能性增加，其优先积聚在缺氧和坏死区域(见例如Baban et al.(2010)Bioengineered Bugs 1(6):385-394)。作为兼性厌氧菌，鼠伤寒沙门氏菌能够在需氧和厌氧条件下生长，因此能够定殖于缺氧较少的小肿瘤和缺氧较多的大肿瘤。
鼠伤寒沙门氏菌通过粪口途径传播会导致局部胃肠道感染。这种细菌还可以进入血液和淋巴系统，感染如肝、脾和肺等全身组织。野生型鼠伤寒沙门氏菌的全身施用会过度刺激TNF-α和IL-6，导致细胞因子级联反应和感染性休克，如果不加以治疗，可能会致命。因此，必须对致病性细菌菌株如鼠伤寒沙门氏菌进行减毒以防止全身感染，而不能完全抑制其有效定植肿瘤组织的能力。减毒通常是通过突变可以通过病原体模式识别引发免疫反应的细胞结构来实现的，例如细菌外膜，或者通过限制细菌在没有补充营养物的情况下复制的能力来实现。
鼠伤寒沙门氏菌是一种细胞内病原体，可被巨噬细胞等吞噬性骨髓细胞迅速吸收，也可通过其沙门氏菌致病岛1(SPI-1)编码的III型分泌系统(T3SS1)直接侵入非吞噬细胞，如上皮细胞。一旦进入细胞，其可以通过SPI-2调节而在含沙门氏菌的液泡(SCV)内复制，也可以逃逸到一些上皮细胞的胞质溶胶中(见例如Agbor et al.(2011)CellMicrobiol.13(12):1858-1869；和Galan and Wolf-Watz(2006)Nature 444:567-573)。鼠伤寒沙门氏菌的遗传修饰的细菌菌株已被描述作为抗肿瘤剂以引发直接的杀肿瘤作用和/或递送杀肿瘤分子(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Bermudes,D.et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Zhao,M.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:755-760；和Zhao,M.et al.(2006)CancerRes.66:7647-7652)。
用于减弱减毒细菌病原体的各种方法是本领域已知的。例如，营养缺陷型突变使细菌不能合成必需的营养物质，以及使用基因如aro、pur、gua、thy、nad和asd中的缺失/突变(见例如美国专利公开号2012/0009153)。由涉及这些基因的生物合成途径产生的营养物质在宿主细胞中通常是不可用的，因此细菌的生存受到挑战。例如，沙门氏菌和其它物种的减毒可以通过缺失或破坏作为莽草酸酯途径的一部分的aroA基因来实现，将糖酵解与芳香族氨基酸生物合成联系起来(见例如Felgner et al.(2016)mBio7(5):e01220-16)。aroA的缺失或破坏导致芳香族氨基酸的细菌营养缺陷和随后减毒(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0175297、2012/0009153和2016/0369282；和国际申请公开号WO 2015/032165和WO 2016/025582)。类似地，已经缺失了参与芳香族氨基酸生物合成途径的其它酶，包括aroC和aroD，以实现减毒(见例如美国专利公开号2016/0369282；和国际申请公开号WO 2016/025582)。例如，鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207是芳香族氨基酸营养缺陷型(aroA-突变体)，菌株A1和A1-R是亮氨酸-精氨酸营养缺陷型。
减毒细菌的突变还包括但不限于在改变脂多糖(LPS)生物合成的基因中的突变，所述基因例如rfaL，rfaG，rfaH，rfaD，rfaP，rFb，rfa，msbB，htrB，firA，pagL，pagP，lpxR，arnT，eptA，和lpxT；引入自杀基因的突变，如sacB，nuk，hok，gef，kil，或phlA；引入细菌裂解基因的突变，如hly和cly；编码毒力因子的基因突变，如IsyA，pag，prg，iscA，virG，plc，和act；修饰应激反应的基因突变，如recA，htrA，htpR，hsp，和groEL；破坏细胞周期的基因突变，例如min；以及破坏或失活调节功能的基因突变，例如cya，crp，phoP/phoQ，和ompR(见例如美国专利公开号2012/0009153，2003/0170276和2007/0298012；美国专利号6,190,657；国际申请公开号WO 2015/032165；Felgner et al.(2016)Gut Microbes 7(2):171-177；Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178；Frahm et al.(2015)mBio 6(2):e00254-15；Kong et al.(2011)Infection and Immunity79(12):5027-5038；和Konget al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(47):19414-19419)。一般来说，减毒突变是基因缺失，以防止可能导致反转为毒力表型的自发补偿突变。
另一种安全减毒鼠伤寒沙门氏菌的方法是使用PhoP/PhoQ操纵子系统，这是一种典型的细菌双组分调节系统，由膜相关传感器激酶(PhoQ)和胞质转录调节子(PhoP)组成(见例如Miller,S.I.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:5054-5058；和Groisman,E.A.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7077-7081)。PhoP/PhoQ是毒力所必需的；其缺失导致这种细菌在巨噬细胞中的存活率不佳，并且在小鼠和人中显著减毒(见例如Miller,S.I.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:5054-5058；Groisman,E.A.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7077-7081；Galan,J.E.andCurtiss,R.III.(1989)Microb.Pathog.6:433-443；和Fields,P.I.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5189-5193)。PhoP/PhoQ缺失菌株已被用作疫苗递送载体(见例如Galan,J.E.and Curtiss,R.III.(1989)Microb.Pathog.6:433-443；Fields,P.I.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5189-5193；和Angelakopoulos,H.andHohmann,E.L.(2000)Infect.Immun.68:2135-2141)。然而，如本文所述，如果细菌不被试图转移质粒，则菌株在巨噬细胞中的存活有限是不利的。
已发现这些减毒细菌菌株在静脉内(IV)施用时对小鼠、猪和猴子是安全的(见例如Zhao,M.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:755-760；Zhao,M.et al.(2006)Cancer Res.66:7647-7652；Tjuvajev J.et al.(2001)J.Control.Release 74:313-315；和Zheng,L.et al.(2000)Oncol.Res.12:127-135)，以及某些活的减毒沙门氏菌菌株在人体临床试验中口服施用后显示出良好的耐受性(见例如Chatfield,S.N.et al.(1992)Biotechnology10:888-892；DiPetrillo,M.D.et al.(1999)Vaccine 18:449-459；Hohmann,E.L.et al.(1996)J.Infect.Dis.173:1408-1414；和Sirard,J.C.et al.(1999)Immunol.Rev.171:5-26)。
其它已被减毒用于治疗的鼠伤寒沙门氏菌菌株是例如亮氨酸-精氨酸营养缺陷型A-1(见例如Zhao et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(3):755-760；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；美国专利号8,822,194；和美国专利公开号2014/0178341)，及其衍生物AR-1(见例如Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；Kawaguchi et al.(2017)Oncotarget 8(12):19065-19073；Zhao et al.(2006)CancerRes.66(15):7647-7652；Zhao et al.(2012)Cell Cycle 11(1):187-193；Tome et al.(2013)Anticancer Research 33:97-102；Murakami et al.(2017)Oncotarget 8(5):8035-8042；Liu et al.(2016)Oncotarget7(16):22873-22882；和Binder et al.(2013)Cancer Immunol.Res.1(2):123-133)；aroA-突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207(见例如Guo et al.(2011)Gene Therapy 18:95-105；和美国专利公开号2012/0009153、2016/036928和2016/0184456)及其专性厌氧菌衍生物YB1(见例如国际申请公开号WO 2015/032165；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；和Leschner et al.(2009)PLoSONE 4(8):e6692)；aroA-/aroD-突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株BRD509，这是SL1344(野生型)菌株的衍生物(见例如Yoon et al.(2017)Eur.J.Cancer70:48-61)；asd-/cya-/crp-突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株χ4550(见例如Sorenson et al.(2010)Biologics:Targets&Therapy 4:61-73)，及phoP-/phoQ-鼠伤寒沙门氏菌菌株LH430(见例如国际申请公开号WO 2008/091375)。
然而，减毒会影响细菌在肿瘤驻留免疫细胞、肿瘤微环境和肿瘤细胞中积累的能力。这个问题在此得到解决。免疫刺激细菌，例如本文示例说明的沙门氏菌菌株，是通过修饰而减毒，所述修饰可以包括上述那些修饰中的一些，但也具有本文所述的增强作为癌症治疗剂的有效性的其它修饰和性质。
鼠伤寒沙门氏菌的减毒菌株具有在吞噬和降解后递送DNA的先天能力(见例如Weiss et al.(2003)Int.J.Med.Microbiol.41(7):3413-3414)。其已被用作基因治疗的载体。例如，鼠伤寒沙门氏菌菌株已被用于递送和表达多种基因，包括编码细胞因子、血管生成抑制剂、毒素和前药转化酶的那些基因(见例如美国专利公开号2007/0298012；Loeffleret al.(2008)Cancer Gene Ther.15(12):787-794；Loeffler et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104(31):12879-12883；Loeffler et al.(2008)J.Natl.Cancer Inst.100:1113-1116；Clairmont,C.et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Bermudes,D.et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Zhao,M.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:755-760；Zhao,M.et al.(2006)CancerRes.66:7647-7652；和Tjuvajev J.et al.(2001)J.Control.Release 74:313-315)。
鼠伤寒沙门氏菌已被修饰以将肿瘤相关抗原(TAA)存活素(SVN)递送至抗原呈递细胞(APC)以引发适应性免疫(见例如美国专利公开号2014/0186401，和Xu et al.(2014)Cancer Res.74(21):6260-6270)。SVN是一种凋亡蛋白(IAP)抑制剂，可延长细胞存活并提供细胞周期控制，在所有实体瘤中均过度表达，而在正常组织中表达较差。这种技术使用SPI-2及其III型分泌系统以将TAA递送到APC的胞质中，然后被激活以诱导TAA特异性CD8+T细胞和抗肿瘤免疫(见例如Xu et al.(2014)Cancer Res.74(21):6260-6270)。与基于李斯特菌的TAA疫苗类似，这种方法已在小鼠模型中显示出前景，但尚未在人类中证明有效的肿瘤抗原特异性T细胞启动。
除了递送编码蛋白质的DNA外，鼠伤寒沙门氏菌还被用于递送用于癌症治疗的小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。例如，减毒的鼠伤寒沙门氏菌已被修饰以表达某些shRNA，例如靶向免疫抑制基因吲哚胺双加氧酶(IDO)的那些。在鼠黑色素瘤模型中沉默的IDO表达导致肿瘤细胞死亡和中性粒细胞显著的肿瘤浸润(见例如Blache etal.(2012)Cancer Res.72(24):6447-6456；国际申请公开号WO 2008/091375；和美国专利号No.9,453,227)。这个载体与透明质酸酶的共同施用在小鼠胰腺导管腺癌的治疗中显示出正向结果(见例如Manuel et al.(2015)Cancer Immunol.Res.3(9):1096-1107；和美国专利公开号No.2016/0184456)。在另一项研究中，鼠伤寒沙门氏菌菌株因phoP/phoQ缺失而减毒，并表达信号转导和转录激活因子3(STAT3)特异性shRNA，抑制肿瘤生长并减少转移器官的数量，延长C57BL/6小鼠的寿命(见例如Zhang et al.(2007)Cancer Res.67(12):5859-5864)。在另一个实例中，鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207已被用于递送靶向CTNNB1的shRNA，这是编码β-连环蛋白的基因(见例如Guo et al.(2011)Gene Therapy18:95-105；及美国专利公开号2009/0123426和2016/0369282)。鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009已用于递送靶向STAT3的shRNA(见例如Manuel et al.(2011)Cancer Res.71(12):4183-4191；美国专利公开号2009/0208534,、2014/0186401和2016/0184456；及国际申请公开号WO 2008/091375和WO 2012/149364)。已使用鼠伤寒沙门氏菌菌株A1-R和VNP20009将靶向自噬基因Atg5和Beclin1的siRNA递送至肿瘤细胞(见例如Liu et al.(2016)Oncotarget 7(16):22873-22882)。
然而，已经发现这些菌株不能有效地刺激抗肿瘤免疫反应，也不能有效地定殖肿瘤以递送治疗剂量的编码产物。需要改进这些菌株，以使其更有效地刺激抗肿瘤免疫反应，例如本文提供的免疫刺激细菌。已公开的国际PCT申请号WO 2019/014398和美国公开号2019/0017050A1中描述了各种细菌的进一步和替代修饰。在这些出版物中的每一个中描述的细菌，也在本文中描述，可以如本文所述进行修饰，以进一步改善其免疫刺激和肿瘤靶向性质。
iii.VNP20009
可用作本文所述修饰的起始菌株的治疗性细菌的示例是称作VNP20009的菌株(ATCC#202165，YS1646)。这个病毒是临床候选病毒。通过缺失msbB和purI基因，VNP20009(ATCC#202165，YS1646)的安全性至少减毒50,000倍(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Low et al.(2003)Methods in Molecular Medicine,Vol.90,Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews,pp.47-59；和Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology 19:19-25)。防止msbB基因表达的缺失或破坏会改变脂多糖的脂质A结构域的组成，脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分(见例如Lowet al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。这可以防止脂多糖诱导的脓毒性休克，减毒细菌菌株并降低全身毒性，同时减少潜在有害的TNFα产生(见例如Dinarello,C.A.(1997)Chest 112(6Suppl):321S-329S；和Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。阻止purI基因表达的缺失或破坏以会使细菌对嘌呤是营养缺陷型的，这会进一步减毒细菌并使其在肿瘤微环境中富集(见例如Pawelek et al.(1997)Cancer Res.57:4537-4544；和Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。如本文所示，VNP20009对于免疫抑制性核苷腺苷也是营养缺陷型的。腺苷可以在肿瘤中积累到病理性高水平，并有助于形成免疫抑制性肿瘤微环境(见例如Peter Vaupel and Arnulf Mayer,Oxygen Transportto Tissue XXXVII,Advances in Experimental Medicine and Biology 876chapter 22,pp.177-183)。
当VNP20009被施用于携带同基因的或人异种移植肿瘤的小鼠时，与对照小鼠相比，所述细菌优先在肿瘤的细胞外组分中以超过300-1000比1的比率积累，并表现出肿瘤生长抑制以及生存期延长(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。VNP20009在动物模型中证明了成功靶向肿瘤和抑制肿瘤生长，同时引发的毒性非常小(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178；Loeffler et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104(31):12879-12883；Luo et al.(2002)OncologyResearch12:501-508；和Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。
人转移性黑色素瘤的1期临床试验结果表明，虽然VNP20009是相对安全的且耐受性良好，但观察到的抗肿瘤活性非常有限(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。虽然使用VNP20009并未导致转移性疾病荷载变化，但它确实证明了在最大耐受剂量(MTD)下肿瘤定植的证据。由于与高水平的促炎细胞因子相关的毒性，无法实现任何抗肿瘤活性所需的更高剂量。
本文提供的免疫刺激细菌提供了菌株VNP20009所缺乏的许多改进和优势。所述刺激细菌以肿瘤特异性方式将编码的遗传有效载荷递送瘤驻留骨髓细胞。所述刺激性细菌通过基因组修饰，例如基因的缺失或破坏，以及基因组的其它修饰，表现出TLR2、TLR4和TLR5介导的炎症减少，例如鞭毛的消除，LPS的修饰，以及卷曲菌毛的消除和生物膜形成的减少。所述免疫刺激细菌增强T细胞功能，例如通过消除L-天冬酰胺酶II的表达，并促进、提供、允许和支持质粒维持。细菌仅或基本上仅在骨髓细胞、特别是肿瘤驻留骨髓细胞中积累(或靶向)，在吞噬作用后提供高效的质粒递送。本文提供的免疫刺激细菌在肿瘤微环境中定殖，并且可以全身施用。与VNP20009相比，本文提供的免疫刺激细菌表现出至少15倍改进的LD50。因此，与VNP20009相比，如果需要，可以施用更高剂量的本文提供的免疫刺激细菌而没有毒性作用(参见下文描述剂量和施用的部分F.5中的表)。
本文显示和描述了如本文所述修饰的免疫刺激细菌，包括鞭毛的消除、LPS修饰和其它修饰，所述细菌优先积累在或靶向骨髓细胞，特别是肿瘤驻留骨髓细胞。本文实施例证明免疫刺激细菌在全身施用如静脉内施用后在这些细胞中积累。实施例还描述并显示了从免疫刺激细菌到肿瘤驻留骨髓细胞的质粒转移，以及细菌细胞死亡后的持久蛋白质表达，从而递送治疗产物，包括导致抗癌反应和表型的产物。
iv.野生型菌株
VNP20009在肿瘤中的积累是由多种因素共同造成的，包括：亲本菌株ATCC 14028的固有侵袭性、其在缺氧环境中复制的能力以及对肿瘤间质液中存在的高浓度嘌呤的需求。如本文所述，不必要使用减毒菌株例如VNP20009作为起始细菌菌株。凭借本文所述的修饰，使细菌无毒或减毒。亲本菌株ATCC 14028或另一种野生型菌株可用作起始菌株，并如本文所述进行修饰。
3.现有细菌癌症免疫疗法的局限性
许多类别的免疫疗法具有限制其安全性和有效性的重大局限性，以及不太可能广泛使用的复杂平台。与例如溶瘤病毒相比，细菌具有许多用作抗癌治疗剂的有利性质。这些性质包括细菌可以很容易地在传播、制造、储存以及在治疗完成后将其从宿主中消除。然而，病毒也具有有利的性质，包括宿主应答。对细菌感染的应答是一种先天的炎症应答，这对于抗癌治疗是不利的。对病毒感染的应答类似于抗癌反应。下表对此进行了总结(另请参见上面的概述)：
Figure GDA0004138988600000471
因此，与更类似于抗癌途径的病毒感知途径相比，细菌作为微生物抗癌平台的局限性源于特定的免疫程序，该程序在免疫系统感知细菌甚至细胞内细菌时启动。识别病毒的感知程序允许产生高效疫苗和持久的适应性免疫。然而，针对细菌的疫苗接种取得了有限的成功。例如，FDA批准的针对伤寒的疫苗只有55％有效(见例如Hart et al.(2016)PLoSONE 11(1):e0145945)，但是含有高度免疫原性的Vi荚膜和O:9抗原的伤寒沙门氏菌(S.typhi)不会出现在免疫原性较低的细菌菌株中，例如单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)和鼠伤寒沙门氏菌，目前尚无针对其的疫苗。
细菌和病毒含有称为病原体相关分子模式(PAMP)的保守结构，这些结构由宿主细胞模式识别受体(PRR)感知。PRR对PAMP的识别触发下游信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的诱导，并引发特定的免疫反应(见例如Iwasaki and Medzhitov(2010)Science327(5963):291-295)。PAMP参与先天免疫系统的方式以及来自哪种类型的感染因子，决定了是否会产生适当的先天或适应性反应来对抗入侵的病原体。
一类称作Toll样受体(TLR)的PRR，可识别源自细菌和病毒的PAMP，并位于细胞内的各个区室中。TLR可识别多种配体，包括脂多糖(TLR4)、脂蛋白(TLR2)、鞭毛蛋白(TLR5)、DNA中的未甲基化CpG基序(TLR9)、双链RNA(TLR3)和单链RNA(TLR7和TLR8)(见例如Akiraet al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680；和Kawai and Akira(2005)Curr.Opin.Immunol.17(4):338-344)。基于DNA和RNA的病毒可以在吞噬作用后在宿主胞质区室中被感知，也可以直接在胞质中被感知。I型干扰素(IFN-α、IFN-β)是宿主识别单链和双链DNA和RNA(病毒来源或来自摄取受损宿主细胞DNA)诱导的特征性细胞因子。例如，合成的dsRNA类似物聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly(I:C))是内体TLR3的激动剂和I型IFN的强大诱导剂，其更稳定的版本poly ICLC(例如以商标
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销售)，一直在临床开发中(见例如Caskey et al.(2011)J.Exp.Med.208(12):2357-2366)。类似地，内体中的单链RNA(ssRNA)被TLR7和TLR8(仅在人体中)感知，其已知的合成配体雷西莫特(resiquimod)和咪喹莫特(imiquimod)是FDA批准的局部癌症免疫治疗剂。
在胞质中，双链RNA(dsRNA)被RNA解旋酶感知，例如视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)，从而诱导I型干扰素(见例如Ireton and Gale(2011)Viruses 3(6):906-919)。dsDNA的胞质传感器是通过干扰素基因刺激因子(STING)介导的，STING是一种ER驻留的衔接器，是感知来自感染性病原体或异常宿主细胞损伤的胞质dsDNA的主要介体(见例如Barber(2011)Immunol.Rev.243(1):99-108)。STING信号传导激活TANK结合激酶1(TBK1)/干扰素调节因子3(IRF3)轴和NF-κB信号传导轴，从而诱导IFN-β和其它强力激活先天和适应性免疫的促炎细胞因子和趋化因子(见例如Burdette et al.(2011)Nature 478(7370):515-518)。通过STING感知胞质dsDNA需要环状GMP-AMP合酶(cGAS)，这是一种直接结合dsDNA的宿主细胞核苷酸转移酶，作为响应，合成环二核苷酸(CDN)第二信使环状GMP-AMP(cGAMP)，其结合并激活STING(见例如Sun et al.(2013)Science 339(6121):786-791；和Wu et al.(2013)Science 339(6121):826-830)。
STING还可以与细菌来源的CDN结合，例如细胞内单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)产生的c-di-AMP，或鼠伤寒沙门氏菌产生的c-di-GMP。后来发现，cGAS产生的非经典CDN可以激活对细菌衍生的经典CDN无反应的人STING等位基因。与细菌产生的CDN(其中两个嘌呤核苷通过具有3’-3’键的磷酸键桥连接)不同，cGAS合成的cGAMP中的核苷酸间磷酸键桥通过非经典的2’-3’键连接。这些2’-3’分子与STING结合的亲和力比细菌3’-3’c-di-GMP高300倍，因此是更有效的STING生理配体(见例如Civril et al.(2013)Nature 498(7454):332-337；Diner et al.(2013)Cell Rep.3(5):1355-1361；Gao et al.(2013)Sci.Signal 6(269):pl1；和Ablasser et al.(2013)Nature503(7477):530-534)。人体中的cGAS/STING信号传导途径似乎已经进化为优先应答病毒病原体而不是细菌病原体。
因此，感知病毒的PRR和TLR，如STING、RIG-I、TLR3和TLR7/8，诱导I型IFN，以及细胞因子和趋化因子，导致有效T细胞介导的适应性免疫。在肿瘤环境中，需要I型IFN信号传导来诱导T细胞运输趋化因子，例如CXCL10，以及还激活肿瘤抗原的DC交叉呈递以引发CD8+T细胞(见例如Diamond et al.(2011)J.Exp.Med.208(10):1989–2003；and Fuertes etal.(2011)J.Exp.Med.208(10):2005–2016)。
相比之下，宿主对细菌如鼠伤寒沙门氏菌的监视主要通过TLR2、TLR4和TLR5介导(见例如Arpaia et al.(2011)Cell 144(5):675-688)。这些TLR通过MyD88(髓样分化初级反应蛋白88)和TRIF(含有衔接器的Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域诱导干扰素-β)衔接器分子发出信号，以介导NF-κB依赖性促炎细胞因子TNF-α和IL-6的诱导(见例如Pandeyet al.(2015)Cold Spring Harb.Perspect.Biol.7(1):a016246)。鼠伤寒沙门氏菌被证明可激活NLRP3炎性体通路，导致胱天蛋白酶-1的裂解和促炎细胞因子IL-1β和IL-18的诱导，从而导致细胞焦亡。TLR2、TLR4和TLR5的参与以及炎性体的激活，诱导趋化因子和细胞因子导致通过中性粒细胞和巨噬细胞清除细菌。例如，鼠伤寒沙门氏菌被T细胞清除的证据有限，并且针对其产生的抗体是非中和的(见例如McSorley(2014)Immunol.Rev.260(1):168-182)。此外，鼠伤寒沙门氏菌具有直接抑制T细胞功能的机制，从而削弱任何潜在的抗肿瘤T细胞反应的产生(见例如Kullas et al.(2012)Cell Host Microbe.12(6)791-798)。结果，细菌性癌症疗法如鼠伤寒沙门氏菌，导致被中性粒细胞和巨噬细胞的募集和清除，而这些细胞不是产生适应性抗肿瘤免疫所需的T细胞。本文描述了这些差异可以解释为什么先前的细菌抗癌疫苗，即使是那些含有宿主肿瘤抗原的疫苗，在人体中也是较差的T细胞启动载体。
这些问题属于本文提供的免疫刺激细菌所解决的问题。本文提供的免疫刺激细菌被工程化为具有以前仅由病毒疗法提供的有利性质，并且还保留了细菌疗法的有利性质。本文提供的细菌可以全身施用，可以定位于肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境，克服免疫抑制，并适当激活抗肿瘤免疫，同时还限制现有全身免疫疗法的自身免疫相关毒性。本文提供的免疫刺激细菌有效定位于肿瘤驻留免疫细胞，并编码治疗性抗癌产物，并可编码多种这种产物。例如，本文提供的细菌可以编码补充治疗产物。
本文提供了一种优越的微生物抗癌平台，经工程化为以保留细菌的有益性质，同时引发诱导有效适应性免疫的病毒样免疫反应。如本文所述，细菌，例如沙门氏菌和其它物种的细菌菌株，可以如本文所述进行修饰，以具有降低的炎症作用，因此毒性更小。结果，例如，可以施用更高的剂量。任何这些沙门氏菌菌株，以及本领域技术人员已知的和/或上文和本文中列出的其它细菌物种菌株，都可以如本文所述进行修饰。本文提供的免疫刺激细菌被修饰为具有增加的肿瘤微环境、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤的定植。所述细菌经工程化，因此其具有降低的毒性，以及将其靶向肿瘤微环境的其它性质，包括腺苷营养缺陷型。本文提供的菌株也经过工程化，使得其不会被补体失活。
提供了一种抗癌治疗产物，其递送编码截短的共刺激分子(受体或配体；例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)的遗传有效载荷，在抗原呈递细胞(APC)上表达，具有完整或截短或部分胞质结构域缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域不能对APC发出反调节信号。还可以修饰共刺激分子以在截短的胞质结构域中包括残基(例如阳性残基)，以确保其在细胞膜中以正确的方向表达(以下实施例对此进行了更详细的描述；见例如实施例19)。
本文提供的细菌菌株经工程化以递送治疗产物。本文的细菌菌株递送免疫刺激蛋白，包括细胞因子、趋化因子和共刺激分子，以及可组成型诱发或诱导I型IFN表达的修饰的功能获得性胞质DNA/RNA传感器，以及其它治疗产物，例如但不限于，抗体及其片段、TGF-β和IL-6结合诱饵受体、TGF-β多肽拮抗剂、双特异性T细胞衔接器剂
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RNAi，及其互补组合，促进抗肿瘤微环境中的肿瘤免疫反应。细菌菌株还包括减少吞噬细胞焦亡的基因组修饰，从而提供更强大的免疫反应，和/或减少或消除感染/侵入上皮细胞的能力，但保留感染/侵入吞噬细胞的能力，因此其在肿瘤、肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞中更有效地积累。所述细菌菌株也可以被修饰以抵抗人血清中补体因子的失活。所述细菌菌株还可以被修饰以编码治疗产物，包括，单独或组合，例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子、I型IFN的组成型活性诱导剂和免疫检查点以及其它这种靶位的单克隆抗体(及其片段)。
C.免疫刺激细菌的修饰和增强以增加治疗指数和增加肿瘤驻留骨髓细胞的积累
本文提供了增强、包括修饰细菌基因组或免疫刺激细菌以降低毒性和提高抗肿瘤活性，例如通过增加肿瘤驻留骨髓细胞中的积累、提高对补体失活的抗性，减少免疫细胞死亡，促进适应性免疫以及，增强T细胞功能。所述修饰是关于沙门氏菌、特别是鼠伤寒沙门氏菌加以描述的；应当理解，技术人员可以在其它细菌物种和其它沙门氏菌菌株中实现类似的增强/修饰。这种增强/修饰的示例如下。
1.LPS生物合成途径中的基因缺失
革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)是细菌膜外叶的主要成分。其由三个主要部分组成：脂质A、非重复核心寡糖和O抗原(或O多糖)。O抗原是LPS的最外部分，并作为防止细菌渗透的保护层，但是O抗原的糖组分在菌株之间差异很大。脂质A和核心寡糖变化较小，以及更通常在相同物种的菌株中是保守型的。脂质A是LPS的包含内毒素活性的部分。其通常是以多种脂肪酸装饰的二糖。这些疏水性脂肪酸链将LPS锚定在细菌膜中，以及其余LPS从细胞表面突出。脂质A结构域是革兰氏阴性细菌大部分毒性的原因。通常，血液中的LPS被认为是重要的病原体相关分子模式(PAMP)，以及诱导极大的促炎应答。LPS是包含CD14、MD2和TLR4的膜结合受体复合物的配体。TLR4是一种跨膜蛋白，其可以通过MyD88和TRIF途径发出信号，以刺激NF-κB途径及导致促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β的产生，其结果可能是可以致命的内毒素性休克。哺乳动物细胞的胞质中的LPS可以直接与胱天蛋白酶4、5和11的CARD结构域结合，导致自体激活和焦亡性细胞死亡(见例如Hagar et al.(2015)Cell Research 25:149-150)。脂质A的组成和脂质A变体的产毒性是有据可查的。例如，与具有多个磷酸基团的脂质A相比，单磷酸化脂质A的炎性要低得多。脂质A上酰基链的数量和长度也会对毒性程度产生极大影响。来自大肠杆菌的规范脂质A有六个酰基链，并且这种六酰基化具有很强的毒性。鼠伤寒沙门氏菌脂质A与大肠杆菌的相似；其是一种葡糖胺二糖，带有四个一级和两个二级羟基酰基链(见例如Raetz et al.(2002)Annu.Rev.Biochem.71:635-700)。
a.msbB缺失
由鼠伤寒沙门氏菌中的msbB基因编码的酶脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶催化将末端肉豆蔻酰基添加到脂多糖(LPS)的脂质A 结构域中(见例如Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。因此，msbB的缺失改变了LPS的脂质A结构域的酰基组成，LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分。例如，鼠伤寒沙门氏菌VNP20009菌株中msbB的缺失导致产生主要是五酰化脂质A，其毒性低于天然六酰化脂质A，并且允许全身递送而不诱导毒性休克(见例如Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology19:19-25)。这种修饰显著降低了LPS诱导感染性休克、减毒细菌菌株的能力，从而提高了基于沙门氏菌的免疫疗法的治疗指数(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0109026、2004/0229338、2005/0255088和2007/0298012)。重要的是，不表达msbB产物的msbB突变体不能在细胞内复制，如本文所示例(见例如实施例2)，这是沙门氏菌毒力的要求(见例如Leung etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:11470-11474)。
可以将改变LPS表达的其它LPS突变，包括置换、缺失或插入，引入本文提供的细菌菌株包括沙门氏菌菌株中，由此显著降低毒力，从而提供更低的毒性，并允许施用更高的剂量。
编码其它细菌物种中脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶的同源物或直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以达到类似的结果。这些基因包括但不限于例如在大肠杆菌中编码肉豆蔻酰基-酰基载体蛋白依赖性酰基转移酶的lpxM；和在伤寒沙门氏菌中编码脂质A酰基转移酶的msbB。
b.pagP缺失
如上所述，鼠伤寒沙门氏菌的msbB突变体不能进行LPS的末端肉豆蔻酰化，并且主要产生比六酰化脂质A毒性低得多的五酰化脂质A。用棕榈酸酯对脂质A的修饰是由酶脂质A棕榈酰转移酶(PagP)催化的。pagP基因的转录在PhoP/PhoQ系统的控制下，该系统由低浓度的镁激活，例如在SCV内。因此，鼠伤寒沙门氏菌脂质A的酰基含量是可变的，对于野生型细菌，其可以是六酰化或五酰化的。鼠伤寒沙门氏菌将其脂质A棕榈酸化的能力增加了对分泌到吞噬溶酶体中的抗菌肽的抗性。
在野生型鼠伤寒沙门氏菌中，pagP的表达导致七酰化的脂质A。在msbB突变体(其中脂质A的末端酰基链不能添加)中，pagP的诱导导致六酰化脂质A(见例如Kong et al.(2011)Infection and Immunity 79(12):5027–5038)。六酰化脂质A已被证明是最促炎的。虽然研究小组试图利用这种促炎信号，例如通过缺失或破坏pagP以仅产生六酰化脂质A(见例如Felgner et al.(2016)Gut Microbes 7(2):171-177；和Felgner et al.(2018)Oncoimmunology 7(2):e1382791)，但由于LPS的TNF-α介导的促炎性质，这可能导致耐受性差，并且自相矛盾的适应性免疫较少(见例如Kocijancic et al.(2017)Oncotarget8(30):49988-50001)。
LPS是一种有效的TLR4激动剂，可诱导TNF-α和IL-6。在1E9 CFUs/m2的静脉注射VNP20009临床试验中的剂量限制性毒性(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)，是细胞因子介导的(发热、低血压)，在2小时时血清中TNF-α水平>100,000pg/ml，IL-6水平>10,000pg/ml。尽管VNP20009中的msbB缺失及其产热原性降低，但LPS在高剂量下仍然可能有毒，可能是由于存在六酰化脂质A所致。因此，pagP-/msbB-菌株不能产生六酰化脂质A，仅产生五酰化脂质A，导致促炎细胞因子的诱导较低，在较高剂量下具有更好的耐受性，并且允许以在或高于1E9 CFUs/m2的剂量在人体中给药。更高的剂量会导致肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境的定植增加，从而增强所述免疫刺激细菌的治疗效力。由于导致细菌膜和结构的变化，因此宿主免疫反应如补体活性被改变，由此所述细菌在全身施用时不会被消除。例如，本文示出(见实施例5)pagP-/msbB-突变株对补体失活的抗性增加，并且在人血清中的稳定性增加。
本文提供了免疫刺激细菌，例如活的减毒沙门氏菌菌株，例如示例的鼠伤寒沙门氏菌菌株，其仅能产生具有五酰化脂质A的LPS，其含有msbB基因的缺失，并且进一步通过缺失/破坏pagP被修饰。如上所述，msbB表达的缺失阻止了脂质A的末端肉豆蔻酰化，而pagP表达的缺失阻止了棕榈酰化。经修饰以产生具有五酰化脂质A的LPS的菌株当进一步修饰以表达刺激肿瘤微环境中免疫反应的异源遗传有效载荷时，可降低促炎细胞因子水平，提高血液中的稳定性，对补体固定抗性，增加对抗菌肽的敏感性，增强耐受性，并增加抗肿瘤免疫性。
编码其它细菌物种中脂质A棕榈酰转移酶(PagP)的同源物和直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以达到类似的结果。这些基因包括但不限于，例如在大肠杆菌中编码脂质IVA棕榈酰转移酶的pagP；和在伤寒沙门氏菌(S.typhi)中编码抗微生物肽抗性和脂质A酰化蛋白的pagP。
2.营养缺陷型
本文提供的免疫刺激细菌可以通过使其对一种或多种必需营养素是营养缺陷型来减毒，所述营养素例如嘌呤(例如腺嘌呤)、核苷(例如腺苷)、氨基酸(例如芳香族氨基酸、精氨酸和亮氨酸)、三磷酸腺苷(ATP)或本领域已知和描述的其它营养素。
a.purI缺失/破坏
磷酸核糖氨基咪唑合成酶是一种由purI基因(与purM基因同义)编码的酶，参与嘌呤的生物合成途径。purI基因的破坏或缺失或失活因此使细菌对嘌呤是营养缺陷的。除了被减毒之外，purI-突变体在肿瘤环境中富集并且具有显著的抗肿瘤活性(见例如Paweleket al.(1997)Cancer Research 57:4537-4544)。先前描述了这种定植是由于肿瘤细胞间液中存在的高浓度嘌呤所致，这是由于肿瘤的快速细胞更新所致。由于purI-细菌不能合成嘌呤，需要外部来源的腺嘌呤，被认为这将导致其在富含嘌呤的肿瘤微环境中的生长受限(见例如Rosenberg et al.(2002)J.Immunotherapy 25(3):218-225)。虽然最初报道VNP20009菌株含有purI基因的缺失(见例如Low et al.(2003)Methods in MolecularMedicine Vol.90,Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews,pp.47-59)，但随后对VNP20009的整个基因组的研究表明purI基因没有被缺失，而是被染色体倒位破坏(见例如Broadway et al.(2014)Journal of Biotechnology 192:177-178)。整个purI基因包含在VNP20009染色体的两个部分中，两侧是插入序列，其中一个具有活性转座酶。虽然purI基因的破坏限制了在肿瘤组织/微环境的复制，但其仍然允许细胞内复制和毒力。如本文所示例的(参见实施例2)，msbB和purI基因中的每一个的缺失或破坏是限制在肿瘤组织中细胞外空间生长并防止细胞内复制所必需的。本文提供了其中这些基因的编码部分被完全缺失以消除任何可能通过重组恢复为野生型的菌株。
除了purI基因缺失或破坏，营养素营养缺陷可以通过例如aro、gua、thy、nad和asd等基因缺失/突变而引入免疫刺激细菌。由涉及这些基因的生物合成途径产生的营养素在宿主细胞中通常是不可用的，因此，细菌的生存具有挑战性。例如，沙门氏菌和其它细菌物质的减毒可以通过缺失aroA基因来实现，该基因是将糖酵解与芳香族氨基酸生物合成联系起来的莽草酸途径的一部分(见例如Felgner et al.(2016)mBio7(5):e01220-16)。aroA的缺失导致芳香族氨基酸的细菌营养缺陷和随后的减毒(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0175297、2012/0009153和2016/0369282；以及国际申请公开号WO2015/032165和WO2016/025582)。类似地，已经缺失了参与芳香族氨基酸生物合成途径的其它酶，包括aroC和aroD，以实现减毒(见例如美国专利公开号2016/0369282；和国际申请公开号WO2016/025582)。例如，鼠伤寒沙门氏菌SL7207菌株是芳香族氨基酸营养缺陷型(aroA-突变体)；A1和A1-R菌株是亮氨酸-精氨酸营养缺陷型；VNP20009/YS1646是嘌呤营养缺陷型(purI-突变体)。如本文所示，VNP20009/YS1646对于免疫抑制性核苷腺苷和ATP也是营养缺陷型的(参见实施例1)。
编码磷酸核糖酰氨基咪唑合成酶(PurI)的同源物或直系同源物的相应基因，以及在其它细菌物种中嘌呤合成所需的其它基因，也可以被缺失或破坏以获得类似的结果。这些基因包括但不限于，例如，purM，在大肠杆菌中编码磷酸核糖酰甲酰基甘氨酰胺环连接酶；purM，在伤寒沙门氏菌中编码磷酸核糖酰甲酰基甘氨酰脒环连接酶；purA，编码腺苷酸琥珀酸合成酶，purQ，编码磷酸核糖酰甲酰基甘氨脒合酶II，及purS，编码单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)中磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶亚基PurS；purM(BL1122)，编码长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中磷酸核糖酰甲酰基甘氨脒环连接酶；及NT01CX_RS09765，编码AIR合酶，和NT01CX_RS07625(purM)，编码诺氏梭菌(Clostridium novyi)中磷酸核糖酰甲酰基甘氨脒环连接酶。
b.腺苷营养缺陷型
衍生自色氨酸和三磷酸腺苷(ATP)/腺苷途径的代谢产物是在肿瘤/肿瘤微环境(TME)内形成免疫抑制环境的主要驱动力。以游离形式存在于细胞内部和外部的腺苷是免疫功能的效应子。腺苷降低T细胞受体诱导的NF-κB的激活，并抑制IL-2、IL-4和IFN-γ。腺苷降低T细胞的细胞毒性，增加T细胞的免疫失能，并增加T细胞分化为Foxp3+或Lag-3+调节性T细胞(T-reg细胞，T-regs或Tregs)。对于自然杀伤(NK)细胞，腺苷降低IFN-γ产生，并抑制NK细胞的细胞毒性。腺苷阻断中性粒细胞的粘附和外渗，降低吞噬作用，以及减弱超氧化物和一氧化氮的水平。腺苷还降低巨噬细胞上TNF-α、IL-12和MIP-1α(CCL3)的表达，减弱II类主要组织相容复合物(MHC)的表达，以及增加IL-10和IL-6的水平。腺苷免疫调节活性在其释放到肿瘤的细胞外空间并激活靶免疫细胞、癌细胞或内皮细胞的表面上的腺苷受体(ADR)后发生。肿瘤微环境中高腺苷水平导致局部免疫抑制，这限制了免疫系统消除癌细胞的能力。
细胞外腺苷是由膜相关的胞外酶CD39(胞外-三磷酸核苷二磷酸水解酶1，或NTPDase1)和CD73(胞外-5’-核苷酸酶)的相继活性产生的，所述酶在肿瘤基质细胞上表达，通过由死亡细胞或垂死细胞产生的ATP或ADP的磷酸分解作用共同产生腺苷。CD39将细胞外ATP(或ADP)转化为5’AMP，其由CD73转化为腺苷。内皮细胞上的CD39和CD73的表达在肿瘤微环境的缺氧条件下增加，从而增加腺苷水平。肿瘤缺氧可以由血液供应不足和肿瘤脉管系统紊乱造成，从而削弱氧气递送(见例如Carroll and Ashcroft(2005)Expert.Rev.Mol.Med.7(6),DOI:10.1017/S1462399405009117)。发生在肿瘤微环境中的缺氧也抑制腺苷酸激酶(AK)，所述激酶可将腺苷转化为AMP，从而导致非常高的细胞外腺苷浓度。缺氧肿瘤微环境中腺苷的细胞外浓度已测量为10-100μM，这比约0.1μM的典型细胞外腺苷浓度高约100-1000倍(见例如Vaupel et al.(2016)Adv.Exp.Med.Biol.876:177-183；和Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。由于肿瘤中的缺氧区域远离微血管，因此腺苷在肿瘤某些区域的局部浓度可能高于其它区域。
为了指导抑制免疫系统的效应，腺苷还可以通过对癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响来控制癌细胞的生长和扩散。例如，腺苷可以主要通过刺激A2A和A2B受体来促进血管生成。刺激内皮细胞上的受体可以调节细胞间粘附分子1(ICAM-1)和E-选择素在内皮细胞上的表达，维持血管完整性并促进血管生长(见例如Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。腺苷激活各种细胞上的A2A、A2B或A3中的一种或多种可以刺激促血管生成因子的产生，例如血管内皮生长因子(VEGF)、白介素8(IL-8)或血管生成素2(见例如Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。
腺苷还可以通过与癌细胞上的受体相互作用来直接调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移。例如，研究表明A1和A2A受体的激活促进某些乳腺癌细胞系中的肿瘤细胞增殖，并且A2B受体的激活在结肠癌细胞中具有促进癌症生长的性质(见例如Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。腺苷还可以触发癌细胞的凋亡，并且各种研究已经将该活性与通过A3的外在凋亡途径的激活或通过A2A和A2B的固有凋亡途径的激活相关联(见例如Antonioli et al.(2013))。通过增加细胞运动性、与细胞外基质的粘附，以及细胞粘附蛋白和受体的表达以促进细胞运动和运动性，腺苷可促进肿瘤细胞的迁移和转移。
三磷酸腺苷(ATP)的细胞外释放发生于受刺激的免疫细胞以及受损、垂死或应激的细胞。当受到这种ATP的胞外释放的刺激时，含NLR家族pyrin结构域蛋白3(NLRP3)炎性体激活胱天蛋白酶-l，并导致细胞因子IL-1β和IL-18的分泌，其进而激活先天性和适应性免疫应答(见例如Stagg and Smyth(2010)Oncogene 29:5346–5358)。ATP可以在肿瘤组织中积累到超过100mM的浓度，而在健康组织中发现的ATP水平非常低约1-5μM)(见例如Song etal.(2016)Am.J.Physiol.Cell Physiol.310(2):C99–C114)。ATP通过CD39和CD73酶分解代谢为腺苷。激活的腺苷通过负反馈机制作为高度免疫抑制的代谢产物，并且在缺氧肿瘤微环境中对多种免疫细胞类型具有多效效应(见例如Stagg and Smyth(2010)Oncogene 29:5346–5358)。腺苷受体A2A和A2B在多种免疫细胞上表达，并被腺苷刺激以促进cAMP介导的信号传导变化，从而导致T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤(NKT)细胞的免疫抑制表型。结果，腺苷水平可在病理组织例如实体瘤中累积至其正常浓度的一百倍以上，该组织已显示过表达胞外核苷酸酶如CD73。腺苷也已显示出促进肿瘤血管生成和发展。因此，对腺苷呈营养缺陷型的工程化细菌将表现出增强的肿瘤靶向和定植。
可以例如通过缺失tsx基因(见例如Bucarey et al.(2005)Infection andImmunity73(10):6210–6219)或通过缺失purD(见例如Husseiny(2005)Infection andImmunity73(3):1598–1605)，使免疫刺激细菌例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)对于腺苷呈营养缺陷型。在革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)中，purD基因敲除菌株示出对腺苷呈营养缺陷型(见例如Park et al.(2007)FEMSMicrobiol.Lett.276:55–59)。如本文所示例，鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009由于其purI缺失而对腺苷呈营养缺陷型，因此不需要进一步修饰使其对腺苷呈营养缺陷型。因此，本文提供的免疫刺激细菌菌株的实施方案对腺苷呈营养缺陷型。这种营养缺陷型细菌选择性地在肿瘤微环境中复制，进一步增加所施用细菌在肿瘤中的积累和复制，并降低了肿瘤内和周围的腺苷的水平，从而减少或消除由腺苷积累引起的免疫抑制。本文提供的这种细菌的示例是含有purI-/msbB-突变以提供腺苷营养缺陷的鼠伤寒沙门氏菌的修饰的菌株。对于其它菌株和细菌，purI基因可以如在VNP20009中一样被破坏，或者其可以含有purI基因的全部或部分缺失，这确保不会恢复为野生型基因。如本文别处所述，在菌株VNP20009中，purI-基因通过倒位失活。类似地，VNP20009中的msbB基因未完全缺失。如本文所示例，其中purI和msbB基因已被完全缺失以消除任何反转风险的菌株，通过体外培养生长评估显示出优异的适应性。
使用通过使免疫刺激细菌对一种或多种必需营养素例如嘌呤(例如腺嘌呤)、核苷(例如腺苷)、氨基酸(例如芳香族氨基酸、精氨酸和亮氨酸)或三磷酸腺苷(ATP)呈营养缺陷型而被修饰的免疫刺激细菌。特别地，在本文提供的免疫刺激细菌例如鼠伤寒沙门氏菌菌株的实施方案中，使所述细菌对腺苷和任选对ATP呈有营养缺陷型，并优先在肿瘤微环境(TME)中积累。因此，本文所述的免疫刺激细菌菌株被减毒，因为其需要嘌呤、腺苷和/或ATP来生长，并且其优先定殖在具有丰富的这些代谢物的TME中，如下所述。由于某些肿瘤的肿瘤微环境中的腺苷积累具有免疫抑制作用，因此腺苷营养缺陷消除了某些癌症的肿瘤微环境中积累的腺苷的免疫抑制作用。
3.质粒维持和递送
a.asd缺失
细菌中的asd基因编码天冬氨酸-半醛脱氢酶。鼠伤寒沙门菌的asd-突变体对二氨基庚二酸(DAP)具有专性要求，这是细胞壁合成所必需的，并将在DAP剥夺的环境进行裂解。当asd基因在细菌中质粒上反式互补时，这种DAP营养缺陷可用于质粒选择和体内质粒稳定性的维持，而无需使用抗生素。基于非抗生素的质粒选择系统是有利的，并且允许1)在不良症状的事件下施用抗生素用作快速清除机制的用途，和2)在通常避免这种用途的情况下允许无抗生素的大规模生产。asd基因互补系统提供了这种基于无抗生素的质粒选择(见例如Galán et al.(1990)Gene 94(1):29-35)。预期使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中，以增加经工程化以递送编码遗传有效载荷/治疗产物的质粒的鼠伤寒沙门菌的效力，所述遗传有效载荷/治疗产物例如免疫刺激蛋白(例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子)；诱导I型IFN的胞质DNA/RNA传感器，如STING和IRF3及其功能获得/组成型活性突变体；抗体及其片段(例如检查点抑制剂，或抗IL-6或抗VEGF抗体)；双特异性T细胞衔接器(以商标
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销售)；干扰RNA；以及本文其它部分讨论的和本领域已知的其它治疗产物；以及所有前述治疗产物的互补组合。
鼠伤寒沙门菌的asd突变体的可选用途是利用DAP营养缺陷产生自溶(或自杀)菌株，用于将治疗产物/的分子递送至感染的细胞，而无需持久地定植于宿主肿瘤的能力。在体外或体内生长时，asd基因的缺失使细菌对DAP呈营养缺陷型。本文所述的实例提供了一种asd缺失菌株，该菌株对DAP呈营养缺陷型，并含有适合于递送免疫刺激蛋白的质粒，该质粒不包含asd互补基因，从而产生体内复制有缺陷的菌株。这个菌株在DAP存在下在体外繁殖并正常生长，然后作为免疫治疗剂施用于不存在DAP的哺乳动物宿主。自杀菌株能够侵袭宿主细胞，但是由于在哺乳动物组织中不存在DAP而不能复制，从而自动裂解并递送其胞质内容物(例如质粒或蛋白质)。
编码其它细菌物种中天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的同源物或直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以获得类似的结果。这些基因包括但不限于，例如，asd，编码大肠杆菌中的天冬氨酸-半醛脱氢酶；asd(STY4271)，编码伤寒沙门氏菌中天冬氨酸-半醛脱氢酶；asd(lmo1437)，编码单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)中天冬氨酸-半醛脱氢酶；asd(BL0492)，编码长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中天冬氨酸-半醛脱氢酶；和NT01CX_RS04325(asd)，编码诺氏梭菌(Clostridium novyi)中天冬氨酸-半醛脱氢酶。
b.endA缺失/破坏
endA基因(例如SEQ ID NO:250)编码核酸内切酶(DNA特异性核酸内切酶，见例如SEQ ID NO:251)，该核酸内切酶介导双链DNA(dsDNA)在革兰氏阴性细菌的周质中的降解。实验室大肠杆菌的最常见菌株是endA-，因为endA基因的突变允许质粒DNA的更高产量。这个基因在物种之间是保守的。为了促进完整质粒DNA的递送，工程化的免疫刺激细菌的endA基因被缺失或突变以防止其核酸内切酶活性。装置突变的示例是E208K氨基酸取代(见例如Durfee et al.(2008)J.Bacteriol.190(7):2597-2606)或感兴趣的物种中的相应突变。endA，包括E208，在包括沙门菌属在内的细菌物种中是保守的。因此，E208K突变可用于消除包括沙门菌属物种在内的其它物种中的核酸内切酶活性。本领域技术人员可以引入其它突变或缺失以消除endA活性。在本文的免疫刺激细菌如沙门菌属中，进行这个突变或缺失或破坏基因以消除endA的活性，提高完整质粒DNA递送的效率，从而提高在质粒上编码的任一种、或两种或更多种免疫调节蛋白/治疗产物的表达，并增强抗肿瘤反应和抗肿瘤效力。
4.鞭毛蛋白敲除菌株
鞭毛是细菌表面上的细胞器，其由通过钩子连接到旋转马达的长丝组成，该旋转马达可以顺时针或逆时针方式旋转以提供移位的手段。由于介导穿过肠胃道的黏液层的运动性的能力，例如鼠伤寒沙门菌中的鞭毛对于趋化性和对于通过口服途径建立感染很重要。虽然鞭毛已被证明是趋化性和肿瘤椭圆柱体外定植所必需的(见例如Kasinskas andForbes(2007)Cancer Res.67(7):3201-3209)，并且运动性已被证明对肿瘤穿透很重要(见例如Toley and Forbes(2012)Integr.Biol.(Camb)4(2):165-176)，但当细菌通过静脉内施用时，鞭毛对于在动物内肿瘤定植是不必需的(见例如Stritzker et al.(2010)International Journal of Medical Microbiology 300:449–456)。每个鞭毛丝由数万个鞭毛蛋白亚基组成。鼠伤寒沙门菌染色体包含两个基因，fliC和fljB，其编码抗原不同的鞭毛蛋白单体。当通过口服感染途径施用时，fliC和fljB均缺陷的突变体是非动性和无毒性的，但当在胃肠外施用时，则保持毒力。
鞭毛蛋白是沙门菌属的主要促炎性决定因子(见例如Zeng et al.(2003)J.Immunol.171:3668-3674)，并直接被细胞表面上的TLR5和胞质溶胶中的NLCR4识别(见例如Lightfield et al.(2008)Nat.Immunol.9(10):1171–1178)。这两种途径均导致促炎应答，从而导致分泌细胞因子，包括IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6。试图通过将细菌工程化为分泌创伤弧菌(Vibrio vulnificus)鞭毛蛋白B来增加对鞭毛蛋白的促炎反应，从而使基于沙门菌属的癌症免疫疗法更加有效，该创伤弧菌鞭毛蛋白B与fliC和fljB编码的鞭毛蛋白相比，诱导更大的炎症(见例如Zheng et al.(2017)Sci.Transl.Med.9(376):eaak9537)。
在本文中，沙门菌属细菌鼠伤寒沙门菌被工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基fliC和fljB，以减少TLR5介导的促炎信号传导。其它含有鞭毛的细菌也可以通过类似的工程化来消除鞭毛。例如，如本文所示，将缺乏msbB和/或pagP的沙门菌属菌株(其导致降低的TNF-α诱导)与fliC和fljB敲除组合。这导致具有组合的TNF-α诱导降低和TLR5识别降低的沙门菌属菌株。这些细菌修饰msbB-、pagP-、fliC-和fljB-可以与免疫刺激质粒组合，该质粒任选含有CpG，单独或组合编码治疗产物，例如免疫调节蛋白。由此产生的细菌减少了促炎信号传导，但具有强大的抗肿瘤活性。这些基因组修饰也可以与本文所述的其它基因组修饰组合。
例如，如本文示例和提供的，在鼠伤寒沙门菌的asd缺失菌株VNP20009中构建了fliC和fljB双突变体。VNP20009是通过破坏purI/purM来减毒，其含有msbB基因的修饰(部分缺失)，导致产生比野生型脂质A低毒性的脂质A亚基。这导致与具有野生型脂质A的菌株相比，在静脉内施用后小鼠模型中降低的TNF-α产生。所得菌株是针对细菌炎症减毒的示例菌株，通过修饰脂质A以减少TLR2/4信号传导和缺失鞭毛蛋白亚基的表达以降低TLR5识别和炎性体诱导而实现。
某些细菌物种的发病机制，包括沙门氏菌物种，如鼠伤寒沙门氏菌，涉及一组被称为沙门氏菌致病岛(SPI)的基因。沙门氏菌使用由沙门氏菌致病岛1(SPI-1)编码的3型分泌系统(T3SS)侵入非吞噬性肠上皮细胞，其形成针状结构，将效应蛋白直接注入宿主细胞的胞质中。这些效应蛋白导致真核细胞细胞骨架的重排以促进侵入肠上皮，并且还诱导促炎细胞因子。称作SPI-1的SPI介导上皮细胞的侵入。SPI-1基因包括但不限于：avrA，hilA，hilD，invA，invB，invC，invE，invF，invG，invH，invI，invJ，iacP，iagB，spaO，spaP，spaQ，spaR，spaS，orgA，orgB，orgC，prgH，prgI，prgJ，prgK，sicA，sicP，sipA，sipB，sipC，sipD，sirC，sopB，sopD，sopE，sopE2，sprB，和sptP。缺失这些基因中的一个或多个基因会降低或消除细菌感染上皮细胞的能力，但不影响其感染或侵入吞噬细胞(包括吞噬免疫细胞)的能力。例如，已证明fliC和fljB基因的同时缺失显著降低了SPI-1基因的表达，例如hilA、hilD、invA、invF和sopB的表达，从而降低了侵入非吞噬细胞的能力(见例如Elhadad etal.(2015)Infect.Immun.83(9):3355-3368)。
在如沙门氏菌等细菌中，除了SPI-1 3型分泌系统(T3SS)外，鞭毛蛋白是引发巨噬细胞焦亡所必需的，并且可以被巨噬细胞NLRC4炎性体检测到。鞭毛蛋白亚基的消除降低了巨噬细胞的焦亡。例如，与野生型菌株相比，具有fliC和fljB缺失的鼠伤寒沙门氏菌导致IL-1β分泌显著减少，而细菌的细胞摄取和细胞内复制不受影响。这表明鞭毛蛋白在炎性体激活中起重要作用。此外，发现经工程化以组成型表达fliC的鼠伤寒沙门氏菌菌株可诱导巨噬细胞焦亡(见例如Li et al.(2016)Scientific Reports 6:37447；Fink and Cookson(2007)Cellular Microbiology 9(11):2562-2570；和Winter et al.(2015)Infect.Immun.83(4):1546-1555)。
可以对本文的免疫刺激细菌的基因组进行修饰，以缺失或突变鼠伤寒沙门氏菌中的鞭毛蛋白基因fliC和fljB，从而减少肿瘤驻留免疫细胞(例如巨噬细胞)的细胞死亡，并增强所述免疫刺激细菌的抗肿瘤免疫反应。鞭毛蛋白亚基的缺失与LPS的修饰的组合，可提高宿主的耐受性，限制仅吞噬细胞的摄取并降低其细胞焦亡，并针对递送治疗产物例如免疫调节蛋白的免疫刺激反应引导至TME，尤其是肿瘤驻留的骨髓细胞。由此产生的免疫刺激细菌引发抗肿瘤反应并促进对肿瘤的适应性免疫反应。
编码其它细菌物种中鞭毛蛋白的相应基因也可以被缺失以获得类似的结果。这些基因包括但不限于例如在大肠杆菌中，fliC，其编码鞭毛丝结构蛋白，和fliE，其编码鞭毛基体蛋白FliE；在伤寒沙门氏菌中，fliC，其编码鞭毛蛋白，和flgB，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgB；在单核细胞增生李斯特菌中，flaA，其编码鞭毛蛋白，fliE，其编码鞭毛钩基体蛋白FliE，和flgB，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgB；及在诺氏梭菌中，NT01CX_RS04995、NT01CX_RS04990、NT01CX_RS05070和NT01CX_RS05075，其编码鞭毛蛋白，NT01CX_RS05080(flgB)，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgB，NT01CX_RS05085(flgC)，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgC，及NT01CX_RS05215(flgG)，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgG。
5.工程化细菌以促进适应性免疫和增强T细胞功能
L-天冬酰胺酶II(ansB)缺失/破坏
L-天冬酰胺酶II是一种催化L-天冬酰胺转化为氨和天冬氨酸的酶。一些细菌菌株，例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，利用L-天冬酰胺酶来清除果糖-天冬酰胺作为碳和氮源(见例如Sabag-Daigle et al.(2018)Appl.Environ.Microbiol.84(5):e01957-17)。恶性T细胞，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)，需要天冬酰胺，因为所述T细胞缺乏合成其的酶。自1970年代初以来，施用L-天冬酰胺酶一直是ALL的一线疗法(见例如Batool et al.(2016)Appl.Biochem.Biotechnol.178(5):900-923)。鼠伤寒沙门氏菌产生L-天冬酰胺酶II对于抑制T细胞是必要和充分的，因为它直接诱导T细胞受体(TCR)下调，减少T细胞细胞因子的产生，并抑制肿瘤细胞溶解功能(见例如Kullas et al.(2012)Cell HostMicrobe.12(6)791-798；和van der Velden et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(49):17769-17774)。在快速克隆扩展条件下，例如在肿瘤微环境中T细胞活化过程中发生的那些情况，天冬酰胺是必需的，其被L-天冬酰胺酶II消耗导致T细胞抑制。因此，L-天冬酰胺酶II已被用作癌症的抗癌治疗剂，其中T细胞抑制是一种治疗方式。
与L-天冬酰胺酶作为抗癌治疗剂的现有用途相反，本文显示在本文提供的免疫刺激细菌中L-天冬酰胺酶活性的消除增强了T细胞在肿瘤微环境中的功能。L-天冬酰胺酶活性的消除可以通过修饰细菌基因组以消除活性酶的表达来实现。修饰包括核酸的插入、缺失、倒位和置换，由此所得编码的酶没有活性，或不表达，或被消除。本文示出，编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或部分缺失或其破坏，以消除编码的酶在免疫刺激细菌中的表达，增强了T细胞在细菌定植的肿瘤微环境中的功能。L-天冬酰胺酶II活性的抑制是通过免疫刺激细菌中基因ansB的全部或部分缺失或中断/破坏来实现的，由此不产生L-天冬酰胺酶II。因此，提供了其基因组被修饰从而不产生L-天冬酰胺酶II的免疫刺激细菌。本文提供的免疫刺激细菌用于定殖肿瘤驻留免疫细胞以增强抗肿瘤免疫反应；基因组修饰中包括缺失、插入、破坏和/或消除L-天冬酰胺酶II表达的其它修饰。
如本文所示，本文中的免疫刺激细菌的基因组可以被修饰以缺失ansB，或破坏其或以其它方式修饰其，导致编码的L-天冬酰胺酶II失活，或消除天冬酰胺酶，防止T细胞抑制和增强体内抗肿瘤T细胞功能。本文示出，ansB是完整的菌株在用该菌株感染的T细胞中诱导显著的T细胞免疫抑制。ansB是缺失的菌株不诱导免疫抑制，因此解决了本领域中使用细菌将编码的治疗产物递送至肿瘤的另一个问题。因此，将ansB基因缺失或破坏而由此不表达功能性编码的酶与本文描述的导致在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中积累增加的其它修饰相组合的免疫刺激细菌，提供了优越的治疗性免疫刺激细菌。
在其它细菌物种中，编码L-天冬酰胺酶II(ansB)的同源物或直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以获得类似的结果。这些基因包括但不限于例如：ansB，在大肠杆菌中编码L-天冬酰胺酶2；ansB(STY3259)，在伤寒沙门氏菌中编码L-天冬酰胺酶；ansB(lmo1663)，在单核细胞增生李斯特菌中编码L-天冬酰胺合成酶；和BL1142，在长双歧杆菌中编码L-天冬酰胺酶前体。
6.卷曲菌毛表达所需的沙门氏菌基因缺失/破坏
细菌和真菌能够形成称为生物膜的多细胞结构。细菌生物膜包裹在分泌的和细胞壁相关的多糖、糖蛋白和糖脂以及细胞外DNA的混合物中，统称为细胞外聚合物。这些细胞外聚合物可以保护细菌免受多种侵害，例如清洁剂、抗生素和抗菌肽的侵害。细菌生物膜允许表面定植，并且是假体(例如注射口和导管)严重感染的原因。在感染过程中，生物膜也可以在组织中形成，这会导致细菌持续和脱落的持续时间延长，并限制抗生素治疗的有效性。细菌在生物膜中的长期存在与增加的肿瘤发生有关，例如在胆囊的伤寒沙门氏菌感染中(见例如Di Domenico et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18:1887).。
在沙门氏菌中，例如鼠伤寒沙门氏菌，生物膜形成受csgD调节，csgD激活csgBAC操纵子并导致卷曲菌毛亚基CsgA和CsgB的产生增加(见例如Zakikhany et al.(2010)Molecular Microbiology 77(3):771–786)。CsgA被TLR2识别为PAMP，并诱导人巨噬细胞产生IL-8(见例如Tukel et al.(2005)Molecular Microbiology 58(1):289–304)。此外，csgD通过激活编码二鸟苷酸环化酶的adrA基因间接增加纤维素产量。由adrA产生的小分子环状二鸟苷一磷酸(c-di-GMP)是一种普遍存在的次级信使，几乎存在于所有细菌物种中。c-di-GMP的增加增强了纤维素合酶基因bcsA的表达，这反过来又通过刺激bcsABZC和bcsEFG操纵子增加了纤维素的产生，从而导致纤维素生物膜的形成。因此，细菌，如鼠伤寒沙门氏菌，可以在实体瘤中形成生物膜，以防止被宿主免疫细胞吞噬。不能形成生物膜的细菌突变体，例如沙门氏菌突变体，会更快地被宿主吞噬细胞吸收，并且更容易从感染的肿瘤中清除(见例如Crull et al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。吞噬细胞内细胞内定位的这种增加可以减少细胞外细菌的持久性，并且如本文所示，可以增强治疗产物如本文所述的免疫调节蛋白和其它抗癌治疗剂的质粒递送的有效性。免疫刺激细菌例如鼠伤寒沙门氏菌形成生物膜的能力的降低可以通过缺失或破坏参与生物膜形成的基因来实现，所述基因例如是csgD、csgA、csgB、adrA、bcsA、bcsB、bcsZ、bcsE、bcsF、bcsG、dsbA、或dsbB(见例如Anwar et al.(2014)PLoS ONE 9(8):e106095)。
本文示出，对免疫刺激细菌进行工程化以减少生物膜形成可提高从肿瘤/组织中的清除率，提高治疗的耐受性，并防止假体在患者体内定植，从而提高这些菌株的治疗益处。已知腺苷模拟物可抑制鼠伤寒沙门氏菌生物膜形成，这表明肿瘤微环境中的高腺苷浓度有助于肿瘤相关生物膜的形成(见例如Koopman et al.(2015)Antimicrob.AgentsChemother.59:76-84)。本文示出，由于更多的细菌摄取到肿瘤驻留骨髓细胞中，因此缺失csgD的菌株表现出改善的抗肿瘤功效。
在其它细菌物种中编码csgD的同源物和直系同源物的相应基因以及卷曲菌毛和生物膜形成所需的其它基因，也可以被缺失或破坏或以其它方式修饰以获得类似的结果。这些基因包括但不限于例如：csgD，在大肠杆菌中编码DNA结合转录双重调节因子CsgD；csgD(STY1179)，在伤寒沙门氏菌中编码调节蛋白CsgD；和lcp，在单核细胞增生李斯特菌中编码参与生物膜形成的李斯特菌纤维素结合蛋白。
细菌基因组的修饰，例如通过缺失或破坏基因以使细菌是csgD-，导致卷曲菌毛和炎性环状二核苷酸(CDN)消除，并消除纤维素分泌。由此消除了炎症和免疫抑制因素，通过改变的LPS酰化阻止TLR4识别，消除纤维素分泌及因此可能的生物膜形成，从而提高安全性和有效性。
如本文所述，细菌菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌菌株，其被工程化为腺苷营养缺陷型；并且通过修饰LPS和/或缺失鞭毛蛋白而降低其诱导促炎细胞因子的能力；和/或不表达L-天冬酰胺酶II以改善T细胞功能；和/或含有生物膜形成所需基因的缺失；和/或进一步修饰以在没有抗生素选择的情况下保持每个细胞显著的质粒拷贝数，至少低至中等拷贝数或更高；并且递送编码治疗产物的基因表达盒，促进强大的抗肿瘤免疫反应。所述质粒包括调节序列以促进编码的治疗产物分泌到肿瘤微环境中。
7.改良对补体的抗性
补体系统是抵御入侵病原体的第一道防线，这些病原体直接激活人体宿主中的凝集素途径或替代途径(AP)级联。补体系统涉及30多种可溶的和细胞膜结合蛋白，它们在先天免疫反应中发挥作用，以识别和杀死病原体，如细菌、病毒感染的细胞和寄生虫，并在抗体介导的免疫中发挥作用。补体级联的激活导致外来微生物的调理作用、趋化肽的释放，最后导致细菌细胞膜的破坏。补体系统中的三种同源糖蛋白C3、C4和C5在补体功能中起核心作用并与其它补体成分相互作用。分别由C3和C4产生的C3b和C4b是促进补体级联激活的转化酶的重要成分。C5的切割片段是C5a，其诱导吞噬细胞迁移到感染部位，和C5b，其启动膜攻击复合物的形成和细菌裂解(见例如Ramu et al.(2007)FEBS Letters 581:1716-1720)。
为了存活，病原体已形成策略来防止补体激活的有害后果。例如，外膜蛋白的Ail/Lom家族成员可以保护许多病原菌免受补体依赖性杀伤。Ail/Lom家族的成员，包括耶尔森氏菌(Yersinia)的Ail(附着侵入位点)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)，及包括沙门氏菌的Rck(补体杀伤抗性)和PagC，以及大肠杆菌的OmpX，这些家族成员是外膜蛋白，具有显著的氨基酸序列相似性和相同性，并具有相似的膜拓扑结构。虽然这个蛋白质家族的成员表现出不同的功能，但其中一些细菌，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)的Ail以及肠道沙门菌(S.enterica)的Rck，至少部分起到保护细菌免受补体介导的裂解的作用(见例如Bartra et al.(2008)Infection and Immunity76:612–622)。
另一种有助于避免或减轻补体的细菌产物是表面蛋白酶，在沙门氏菌中被称为PgtE(外膜丝氨酸蛋白酶)，以及omptin家族的其它成员。肠道沙门菌(S.enterica)的表面蛋白酶PgtE属于肠杆菌外膜天冬氨酸蛋白酶的omptin家族。PgtE和其它omptin需要粗糙型LPS才能激活，但会受到O抗原的空间抑制。pgtE的表达在沙门氏菌在巨噬细胞内的生长期间上调，并且从巨噬细胞释放的细菌表现出强力的PgtE介导的蛋白水解活性。PgtE蛋白水解激活哺乳动物血浆纤溶酶原为纤溶酶，使纤溶酶的主要生理抑制剂α2-抗纤溶酶失活，并介导细菌粘附到人细胞的细胞外基质。通过这种方式，PgtE介导细胞外基质成分的降解并产生强力的局部蛋白水解活性，这可以促进沙门氏菌穿过细胞外基质的迁移。PgtE还降解α-螺旋抗菌肽，这在沙门氏菌的细胞内生长期间可能很重要。鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)的omptin Pla是PgtE的密切直系同源物，并与PgtE共享功能。Pla切割C3，PgtE通过切割补体成分C3b、C4b和C5增加沙门氏菌的血清抗性。来自其它细菌物种的基因pgtE及其直系同源物可以包括在本文的免疫刺激细菌中以增加对补体的抗性。
本文示出，人血清中补体的作用解释了治疗性免疫刺激细菌例如沙门氏菌菌株VNP20009的失败，所述细菌已被证明在啮齿动物模型中有效地定植肿瘤。VNP20009的全身施用导致小鼠肿瘤定植(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；和Bermudes et al.(2001)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18:219-33)；而在人患者中全身施用VNP20009导致非常少的定植。在晚期黑色素瘤患者的1期研究中，在30分钟静脉输注后，在人肿瘤中检测到非常少的VNP20009(见Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20:142-52)。进入评估更长的4小时输注VNP20009的随访研究的患者，在肿瘤活检后也表现出缺乏可检测的VNP20009(见Heimann et al.(2003)J.Immunother.26:179–180)。在瘤内施用药后，检测到VNP20009衍生物的定殖(见Nemunaitis et al.(2003)Cancer Gene Ther.10:737-744)。将VNP20009直接在肿瘤内施用于人肿瘤会导致更高的肿瘤定植，这表明人肿瘤可以在高水平上定植，并且小鼠和人之间的肿瘤定植差异仅在全身施用后才会出现。
本文示出并描述了虽然以前不知道在野生型鼠伤寒沙门氏菌中出现，但VNP20009被人补体失活，这解释了在全身施用VNP20009后在人体中观察到的低肿瘤定植的原因。本文提供的菌株表现出对补体的抗性。其可以被修饰为表达Rck和其它参与介导补体抗性或避性的蛋白质，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的Ail或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的PgtE，或者如果其天然表达这种蛋白质，则将其可以修饰为过表达Rck和/或其它这种蛋白质。Rck可以被引入缺乏同源物的细菌例如大肠杆菌中。
Rck表达
Rck(补体杀伤抗性)是一种17kDa的外膜蛋白，由沙门氏菌如肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌的较大毒力质粒编码，可诱导上皮细胞粘附和侵袭。已示出Rck蛋白通过抑制C9聚合和随后组装功能性膜攻击复合物来保护肠炎沙门氏菌免于补体破坏。与野生型菌株相比，rck突变体的上皮细胞侵袭减少了2-3倍，而野生型中的rck过表达导致侵袭增加。Rck蛋白通过受体介导的过程诱导细胞进入，促进局部肌动蛋白重塑，以及微弱和紧密粘附的膜延伸。因此，沙门氏菌可以通过两种不同的机制进入细胞：由T3SS-1复合物介导的触发机制和由rck诱导的拉链机制(见例如Manon et al.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annous and Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。rck在沙门氏菌毒力质粒上的表达通过阻止膜攻击复合物的形成，赋予了对人补体中和的高水平抗性。当含有rck的鼠伤寒沙门氏菌毒力质粒在对血清高度敏感的大肠杆菌菌株中表达时，Rck能够恢复补体抗性。
本文提供的免疫刺激细菌保留或提供有Rck以赋予对人补体的抗性。本文示出，免疫刺激细菌，例如大肠杆菌，可以通过在细菌中的质粒上编码rck进行修饰，从而赋予对补体的抗性。本文提供的免疫刺激细菌内源地编码rck，或者可以被修饰以编码其以增加对补体的抗性。还提供了赋予补体抗性的方法。例如，美国专利申请公开号2018/0325963和2018/0273956以及美国专利号9,889,164和9,688,967中描述的治疗性大肠杆菌物种可以通过修饰其中的细菌而被改良，例如通过引入在质粒上编码沙门氏菌rck基因的核酸，从而提高或提供对补体的抗性。可以全身施用对补体有抗性的细菌，并且足够的细菌可以存活以产生治疗效果。将编码沙门氏菌rck基因的核酸引入细菌，例如治疗性大肠杆菌，从而赋予或增加补体抗性。
来自其它细菌物种的rck的其它直系同源物和同源物，同样可以在免疫刺激细菌中表达。例如，Ail是来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的Rck同源物，其增强异源表达下的补体抗性。PgtE是一种鼠伤寒沙门氏菌表面蛋白酶，其也已示出在异源表达下增强补体抗性。
8.缺失脂蛋白在沙门氏菌和其它革兰氏阴性菌中表达所需的基因
LPS和Braun(胞壁质)脂蛋白(Lpp)是革兰氏阴性肠道细菌外膜的主要成分，可作为炎症和免疫反应的强力刺激物。Braun(胞壁质)脂蛋白(Lpp)是鼠伤寒沙门氏菌外膜最丰富的成分之一，并导致TLR2诱导促炎细胞因子，例如TNFα、IL-6和IL-8(在人体中)。位于沙门氏菌细菌染色体上的脂蛋白基因的两个功能拷贝(lppA(SEQ ID NO:387)和lppB(SEQ IDNO:388))促成细菌毒力。lppA和lppB基因的缺失以及脂蛋白表达的消除，会降低毒力并减少促炎细胞因子的产生(见例如Sha et al.(2004)Infect.Immun.72(7):3987-4003；Fadlet al.(2005)Infect.Immun.73(2):1081-1096)。预计Lpp基因的缺失会减少细胞感染，从而减少质粒递送和编码的治疗产物或蛋白质的表达。然而，如下面的实施例18所示，虽然这些基因的缺失确实减少了肿瘤定植，但递送至靶细胞、肿瘤驻留免疫细胞、特别是巨噬细胞的质粒量显著增加。如本文所示，这些基因(lppA和lppB)的缺失或破坏因此导致由于无法在受感染的巨噬细胞中存活而降低的毒力，但导致免疫刺激细菌的质粒递送增强，从而增加编码的治疗基因在靶细胞即肿瘤驻留免疫细胞、特别是巨噬细胞中的表达。
9.强力的免疫刺激细菌，其基因组经过修饰以针对抗肿瘤治疗进行优化，并编码治疗产物，包括多种治疗产物
如本文所述，细菌菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌菌株，被工程化为腺苷营养缺陷型，并且通过修饰LPS和/或缺失鞭毛蛋白而降低其诱导促炎细胞因子的能力，和/或通过缺失或消除L-天冬酰胺酶II表达进行修饰以改善T细胞功能，和/或通过缺失或破坏生物膜形成所需的基因进行修饰，和/或由于rck表达增加而表现出增强的人血清存活力，所述细菌菌株被进一步修饰以递送治疗产物，例如免疫调节蛋白，并促进强力的抗肿瘤免疫反应。
下表总结了细菌基因型/修饰、其功能作用以及本文实现的一些效果/益处。
Figure GDA0004138988600000621
本文提供的菌株是ΔFLG，和/或ΔpagP，和/或ΔansB，和/或ΔcsgD。此外，菌株是ΔpurI(ΔpurM)、ΔmsbB和Δasd(在细菌基因组中)中的一种或多种。特别地，菌株是ΔpurI(ΔpurM)、ΔmsbB、ΔpagP和ΔansB和Δasd。菌株也可以是lppA-和/或lppB-，特别是lppA-/lppB-。质粒被修饰以在宿主识别的启动子(例如真核启动子，如RNA聚合酶II启动子，包括来自真核生物和动物病毒的启动子)控制下编码治疗产物。质粒可以编码asd以允许细菌在体内复制，并且可以编码具有其它有益功能的核酸(例如CpG)，并且可以编码基因产物，如本文其它地方所述。
可以修饰本文提供的免疫刺激细菌以消除感染上皮细胞的能力，例如通过消除鞭毛实现。如本文别处所述，消除感染上皮细胞的能力也可以通过失活SPI-1依赖性侵入、通过失活或敲除参与SPI-1途径的一种或多种基因来实现。这些基因包括但不限于以下中的一种或多种：avrA，hilA，hilD，invA，invB，invC，invE，invF，invG，invH，invI，invJ，iacP，iagB，spaO，spaP，spaQ，spaR，spaS，orgA，orgB，orgC，prgH，prgI，prgJ，prgK，sicA，sicP，sipA，sipB，sipC，sipD，sirC，sopB，sopD，sopE，sopE2，sprB，和sptP。另外或或者，免疫刺激细菌可含有基因敲除或缺失以失活参与SPI-1非依赖性感染/侵入的产物，例如基因fljB、fliC、rck、pagN、hlyE、pefI、srgD、srgA、srgB和srgC中的一种或多种，和/或免疫刺激细菌可以含有敲除或缺失以失活诱导肿瘤驻留免疫细胞的细胞死亡的基因产物，例如编码被炎性体直接识别的蛋白质的基因，包括fljB、fliC、prgI(针状蛋白)和prgJ(杆状蛋白)。然而，rck基因是可取的，因为其免受补体失活作用。不内源性编码rck的细菌可以被修饰以编码异源rck基因。
所述免疫刺激细菌来源于合适的细菌菌株。细菌菌株可以是减毒菌株，或通过标准方法减毒的菌株，或通过本文提供的修饰而减毒的菌株，其定殖能力主要限于免疫豁免组织和器官，特别是肿瘤驻留免疫细胞，TME和肿瘤细胞，包括实体瘤。细菌包括但不限于例如如下菌株：沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，李斯特菌属(Listeria)，大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌属(Bifidobacteriae)。例如，细菌物种包括：宋内志贺菌(Shigella sonnei)，弗氏志贺菌(Shigella flexneri)，痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。其它合适的细菌物种包括：立克次体属(Rickettsia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，博德特氏菌属(Bordetella)，奈瑟菌属(Neisseria)，气单胞菌属(Aeromonas)，弗朗西斯氏菌属(Francisella)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，衣原体属(Chlamydia)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，布鲁氏菌属(Brucella)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，支原体属(Mycoplasma)，军团菌属(Legionella)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，螺杆菌属(Helicobacter)，弧菌属(Vibrio)，芽孢杆菌属(Bacillus)，和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)。例如立克次氏体立克次体(Rickettsia rickettsiae)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)，恙虫立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)，莫塞氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)，西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)，支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，嗜泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila)，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)，假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，马红球菌(Rhodococcus equi)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，小肠结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)，五日热罗卡利马氏体菌(Rochalimaea quintana)或根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)。
本文提供的免疫刺激细菌的示例是沙门氏菌属。如本文所述修饰的细菌的示例是沙门氏菌的野生型菌株，例如具有保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中登录号#14028的菌株的所有鉴别特征的菌株。工程化的鼠伤寒沙门氏菌菌株，例如菌株YS1646(ATCC目录#202165，也称为VNP20009；也参见国际PCT申请公开号WO99/13053)，用质粒进行工程化以补充asd基因敲除和允许无抗生素质粒维持。然后对菌株进行修饰以缺失鞭毛蛋白基因，和/或缺失pagP。鞭毛敲除和pagP缺失的组合使菌株对人血清补体具有高度抗性。这些菌株也被赋予嘌呤营养缺陷型，特别是腺苷，并且是asd-和msbB-。例如，purI和msbB被完全缺失的菌株比VNP20009菌株更适合(生长更快)，VNP20009中这些基因没有被缺失，而是被修饰以消除表达。可以在质粒上提供asd基因，用于在真核宿主体内复制。所述菌株还在ansB基因中进行了修饰，例如缺失、破坏或其它修饰，从而阻止其产生免疫抑制性L-天冬酰胺酶II，并改善肿瘤T细胞功能。所述菌株还经过修饰以消除生物膜的产生，例如通过csgD缺失实现，这使其无法产生卷曲菌毛、纤维素和c-di-GMP，从而减少不需要的炎症反应，并阻止其形成生物膜。
这些基因组缺失和质粒在本文别处描述和举例说明。编码治疗产物如免疫刺激蛋白和其它产物的任何核酸，在本文别处描述和/或本领域技术人员已知，可以包括在质粒上。如本文别处所述，质粒通常以低至中等拷贝数存在。治疗产物包括胞质DNA/RNA传感器的功能获得性突变体，其可以组成型引起/诱导I型IFN表达，以及包括其它免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子和共刺激分子，其促进肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应，以及包括本文所述的其它这种产物。质粒还可以编码抗体及其片段，例如单链抗体，其靶向免疫检查点和其它癌症靶标，例如VEGF、IL-6和TGF-β，以及其它分子，例如双特异性T细胞衔接器，或
Figure GDA0004138988600000641
质粒还可以编码IL-6结合诱饵受体、TGF-β结合诱饵受体和TGF-β多肽拮抗剂。如下文所述，质粒可以编码一种或多种治疗产物/遗传有效载荷(即多复合的)，用于将抗癌治疗产物递送至肿瘤/肿瘤微环境。所述产物可以与运输信号例如分泌信号可操作地连接。所述产物还可以设计为在细胞表面表达，例如在肿瘤驻留骨髓细胞中。
10.M2表型巨噬细胞转化为M1和M1样表型巨噬细胞
如本文所述，本文提供的免疫刺激细菌在巨噬细胞中积累和/或靶向巨噬细胞。巨噬细胞是吞噬性免疫细胞；其在清除衰老和凋亡细胞、吞噬免疫相关复合物和病原体以及维持体内稳态方面发挥作用。巨噬细胞的表型和功能可以被微环境极化。有两种类型：M1型(经典活化巨噬细胞)和M2型(替代活化巨噬细胞)。
M1巨噬细胞的作用是分泌促炎细胞因子和趋化因子，并呈递抗原，从而参与正向免疫反应并发挥免疫监测器的作用。M1巨噬细胞产生促炎细胞因子，包括IL-6、IL-12和TNF-α。M2巨噬细胞分泌精氨酸酶1、IL-10、TGF-β和其它抗炎细胞因子，具有减轻炎症、促进肿瘤生长和免疫抑制功能。因此，对于癌症和其它这种疾病和病症的治疗，M1或M1样表型是有利的。
M2巨噬细胞可以转化为M1巨噬细胞或具有M1样表型的巨噬细胞。本文提供的免疫刺激细菌感染巨噬细胞，可将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型。M1巨噬细胞表型标志物包括CD80(也称为B7、B7.1或BB1)、CD86(也称为B7.2)、CD64(也称为高亲和性免疫球蛋白γFc受体I)、CD16和CD32(也称为称为低亲和性免疫球蛋白γFc受体IIb)。M1巨噬细胞中一氧化氮合酶(iNOS)的表达也可以作为表型标记。CD163和CD206是鉴定M2巨噬细胞的标志物。精氨酸酶1(Arg1)和DECTIN-1也是鉴定M2巨噬细胞的理想表型指征。因此，可以通过这些标志物的表达来监测或评估转化。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)与免疫抑制M2表型相关。本文提供的免疫刺激细菌可以将这种巨噬细胞转化为M1或M1样表型。本文提供的编码导致I型干扰素(IFN)表达的治疗产物的免疫刺激细菌可以实现这种转化。这是本文提供的免疫刺激细菌独有的性质，并利用了细菌的能力，包括导致巨噬细胞感染的基因组修饰。编码的治疗产物包括是胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的那些产物，例如STING变体(本文详细描述)。在感染肿瘤驻留巨噬细胞和表达治疗产物后，编码免疫刺激细菌可实现向M1表型(或M1样表型)的转化。这种转化巨噬细胞表型的能力在下面的实施例12中得到证明和举例说明。通过本文提供的感染巨噬细胞并表达STING蛋白的免疫刺激细菌表达修饰的STING蛋白，将M1巨噬细胞的表型转化为M2巨噬细胞表型。
本文提供的免疫刺激细菌，包括如本文所述的基因组修饰，例如鞭毛的消除和LPS修饰，将感染的M2巨噬细胞转化为诱导M1巨噬细胞细胞因子谱的那些巨噬细胞。表达STING蛋白变体的免疫刺激细菌会导致在人原代M2巨噬细胞中的组成型I型IFN表达，将这些细胞转化为M1样(具有M1巨噬细胞典型的表型标记和/或表达谱)I型IFN产生细胞。
实施例证明了从M2到M1样或M1表型的这种变化。比较未感染的M2巨噬细胞中的细胞因子谱与感染沙门氏菌菌株的M2巨噬细胞中的诱导细胞因子，其是Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD M2，诱导较高水平的IFNγ、CXCL10和CXCL11分泌。用编码huSTINGtazCTT N154S+R284G变体、WT huIL-12和huSTING tazCTT N154S+R284G变体或WT huIL-15的质粒转化的相同菌株感染，诱导比不含质粒的未转化的ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的菌株更高的CXCL10和CXCL11分泌。在菌株中用各种不同的有效载荷诱导M1或M1样表型的特征细胞因子谱。示例的结果详述于实施例中。
D.编码在肿瘤微环境中刺激免疫反应的遗传有效载荷的具有增强的治疗指数的免疫刺激细菌
本文提供的免疫刺激细菌被修饰，使其在肿瘤微环境和肿瘤驻留骨髓细胞中积累，在此在真核启动子的控制下表达所述治疗产物。所述细菌编码治疗产物，特别是抗癌产物，包括刺激免疫系统和/或反转或减轻肿瘤免疫抑制作用的产物。如本文所述，细菌可以编码多种产物，其中每种产物的表达均在在单独的启动子的控制下，或者其在一个启动子的控制下，并且可以包括导致分立的产物表达的序列，并且在适当的情况下，包括调节序列以确保编码的产物分泌到肿瘤微环境中。所述免疫刺激细菌在质粒上表达编码的治疗产物。如所讨论的，质粒可以编码一种产物或多种产物。每个产物可以在不同的真核启动子的控制下，或者多个编码的产物可以在单个启动子的控制下表达，例如通过在编码部分之间包括2A自切割肽，例如T2A(SEQ ID NO:327)、P2A(SEQ ID NO:328)、E2A(SEQ ID NO:329)和F2A(SEQ ID NO:330)。编码的产物包括本文所述的那些，它们可以是活性互补的抗癌免疫刺激产物。本文提供的免疫刺激细菌允许组合施用多种免疫调节产物或有效载荷(多重有效载荷)，否则如果全身施用则毒性太大。多重有效载荷的示例包括一种或多种的细胞因子，刺激或诱导I型IFN表达的免疫刺激蛋白，例如具有增加的活性或组成型活性的STING或其变体，以及共刺激分子，例如工程化的4-1BBL共刺激分子。本文提供了修饰的4-1BBL多肽和编码核酸，当在本文提供的免疫刺激细菌中的质粒上编码时表现出改善的表达和活性，所述免疫刺激细菌将质粒递送至骨髓细胞以在宿主转录和翻译机制的控制下表达。
本文提供的免疫刺激细菌具有强力的抗肿瘤作用，包括提供治愈，例如在用多重有效载荷或单一药剂有效载荷IV给药后。所述免疫刺激细菌在全身施用时浸润并富集在实体瘤、TME和肿瘤驻留骨髓细胞中，在次表达编码的治疗产物，然后局部递送至肿瘤微环境。在肿瘤驻留骨髓细胞消耗(吞噬作用)后，细菌递送遗传有效载荷编码质粒，该质粒允许以肿瘤特异性方式异位、单一或多重有效载荷表达。
1.免疫刺激蛋白质
可以修饰本文的免疫刺激细菌以编码促进、诱导或增强抗肿瘤反应的免疫刺激蛋白。如实施例中举例说明和描述的，编码核酸在质粒上排列的顺序可以提高整体表达，对质粒的修饰可以提高含有编码蛋白质的质粒的细菌的适应性。
可以在真核启动子如被RNA聚合酶II识别的启动子的控制下，在细菌中的质粒上编码免疫刺激蛋白，以在真核受试者中表达，特别是在待施用免疫刺激细菌的受试者(诸如人体中表达。除真核启动子外，编码免疫刺激蛋白的核酸还可包括其它用于在细胞中表达或运输(例如用于在细胞表面上分泌或表达)的调节信号。
免疫刺激蛋白是在适当的环境例如肿瘤微环境(TME)中可以促进或参与或增强施用了免疫刺激细菌的受试者的抗肿瘤反应的那些蛋白质。免疫刺激蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，例如但不限于IL-2，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-36γ，GM-CSF，IFNα，IFNβ，与IL-2Ra减弱结合的IL-2，和被修饰以不结合IL-2Ra的IL-2；趋化因子，例如但不限于CCL3，CCL4，CCL5，CXCL9，CXCL10，和CXCL11；和/或共刺激分子，例如但不限于CD40，CD40L，OX40，OX40L，4-1BB，4-1BBL，具有截短或缺失的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，TNF/TNFR超家族成员(例如CD27和CD27L)，以及B7-CD28家族成员(例如CD80，CD86，ICOS，和ICOS配体(B7RP1))。
本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可以促进、增强或以其它方式增加或引起抗肿瘤反应的其它这种免疫刺激蛋白，预期用于在本文提供的免疫刺激细菌中编码。例如，所述免疫刺激细菌可以递送编码截短的共刺激分子(例如，4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L)的遗传有效载荷，具有在APC表达的胞质结构域的完全或部分缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域而无法向APC发出反调节信号。如本文中所述，例如4-1BBL的修饰的截短的胞质结构域含有特定的残基，以确保蛋白质结构域的正确方向，从而增加蛋白质的表达。如本文所述，共刺激分子的胞质结构域的缺失(完全或部分)和修饰增强了共刺激分子的激活，而没有免疫抑制反向信号传导。如实施例及如下以4-1BBL为例所述；相同的修饰，包括置换截短的胞质结构域中的残基以确保在膜中的正确方向，可以应用于任何共刺激分子，以及其它跨膜多肽。
人4-1BBL的全长序列(SEQ ID NO:389，Uniprot P41273)是：
Figure GDA0004138988600000661
其中胞质结构域对应于氨基酸1-28(斜体)，跨膜结构域对应于氨基酸29-49(粗体)，胞外结构域对应于氨基酸50-254(下划线)。人4-1BBLΔcyt序列(见SEQ ID NO:390)是：
Figure GDA0004138988600000671
其与全长蛋白质相同，但缺少胞质结构域，因此跨膜结构域对应氨基酸残基2-22(粗体)，胞外结构域对应氨基酸残基23-227(下划线)。
具有截短的胞质结构域的示例的人4-1BBL的序列如下(见SEQ ID NO:391)：
Figure GDA0004138988600000672
其中截短的胞质结构域对应于残基RLVP(斜体)，从M起始，跨膜结构域对应于残基6-26(粗体)，胞外结构域对应于残基27-231(下划线)。
对于全长4-1BBL，带正电荷的氨基酸，如R和K，往往位于胞质(内部/胞质结构域)中，这使跨膜结构域定向为使N末端位于内部。但是当胞质结构域被截短时，这会改变电荷平衡，因此外部(细胞外结构域中)只有正电荷。这有利于蛋白质的N末端位于外部而不是朝向胞质的构型，从而形成“由内向外的构型”。如果例如通过明显较低的活性或表达或其它参数观察到这种情况，可以修饰具有截短的胞质结构域的4-1BBL变体以包括阳性残基，以确保蛋白质在细胞膜中表达的正确方向。4-1BBL的可能修饰的示例是其中残基被带正电荷的残基置换或包括c-myc标签那些修饰。本领域技术人员可以设想其它类似的置换/添加来实现相同的结果。
具有截短的胞质结构域的示例的修饰的人4-1BBL变体包括以下变体，其中在胞质结构域区域中包括额外的阳性残基(精氨酸(R)、赖氨酸(K)，斜体)，如下所示，从而所得蛋白质当在细胞中表达时是正确方向(具有正确的构型，而不是“由内而外”构型)。分别参见SEQ ID NO:391和392所示：
截短的胞质结构域：
Figure GDA0004138988600000673
这是将正电荷添加回N末端(R)，这有利于N末端在胞质内正确定向的构型。在另一个实例中，添加了MYC标签。
具有MYC标签的截短的胞质结构域：
Figure GDA0004138988600000674
对于全长小鼠4-1BBL的序列，以及mu4-1BBLΔcyt(具有胞质结构域缺失的小鼠4-1BBL)的示例序列，即具有截短胞质结构域的mu4-1BBL和具有截短胞质结构域和MYC标签的mu4-1BBL，见下文实施例19所示；也分别见SEQ ID NO:393-396。
共刺激分子中可以包括额外的或替代的氨基酸置换，以确保在膜中表达的蛋白质的正确方向。技术人员可以容易地制备其它类似的修饰以确保具有截短的胞质结构域的跨膜蛋白的正确方向。
除了胞质结构域的缺失或截短之外，用于在APC上表达的共刺激分子(例如，4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L)也可以通过引入氨基酸修饰来修饰，例如对胞质结构域的插入、缺失和/或置换，使得修饰的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于对胞质结构域的修饰而不能对APC发出反调节信号。例如，可以通过修饰胞质结构域磷酸化位点来消除免疫抑制反向(细胞内)信号，例如通过用减少或消除反向信号传导的残基置换一个或多个适当基因座的一个或多个Ser残基进行修饰。例如，对于人4-1BBL，免疫抑制反向(细胞内)信号传导可以通过修饰胞质结构域磷酸化位点而消除，所述位点包括参考全长人4-1BBL的序列(SEQ ID NO:389)的Ser5和Ser8。胞质结构域中的丝氨酸残基可以用减少或消除反向信号传导的任何其它残基置换。
额外的或替代的氨基酸置换可以包括在共刺激分子中以消除免疫抑制性细胞内(反向)信号传导。本领域技术人员可以容易地制备其它类似修饰以消除免疫抑制反向信号传导，同时仍保持共刺激分子通过共刺激受体参与向T细胞发出激活组成型免疫刺激信号的能力。
a.细胞因子和趋化因子
在一些实施方案中，本文的免疫刺激细菌被工程化以表达刺激免疫系统的细胞因子，包括但不限于IL-2，IL-7，IL-12，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15(和IL-15:IL-15Rα链复合物)，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，与IL-2Ra减弱结合的IL-2，经修饰不结合IL-2Ra的IL-2，IFN-α和IFN-β。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌可以被工程化以表达趋化因子，例如CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。
IL-2
白细胞介素-2(IL-2)是第一个被批准用于治疗癌症的细胞因子，其通过几种机制参与免疫系统的激活，包括激活和促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生长，产生淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，促进Treg细胞生长和增殖，刺激肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，及促进T细胞、B细胞和NK细胞增殖和分化。重组IL-2(rIL-2)被FDA批准用于治疗转移的肾细胞癌(RCC)和转移的黑色素瘤(见例如Sheikhi et al.(2016)Iran J.Immunol.13(3):148-166)。
IL-7
IL-7是IL-2超家族的成员，参与T细胞的存活、增殖和体内稳态。IL-7受体中的突变已示出导致T细胞的丧失和严重联合免疫缺陷(SCID)的发展，突出了IL-7在T细胞发育中的关键作用。IL-7是一种稳态细胞因子，可为静息的初始和记忆T细胞提供连续信号，以及在淋巴细胞减少症期间积累，导致T细胞增殖和T细胞库集多样性增加。与IL-2相比，IL-7选择性地扩展CD8+ T细胞而不是CD4+FOXP3+调节性T细胞。重组IL-7已示出在小鼠中增强接种疫苗和过继细胞疗法后的抗原特异性T细胞应答。IL-7还可以在造血干细胞移植化疗后促进T细胞恢复中发挥作用。晚期恶性肿瘤患者的早期临床实验表明，重组IL-7在生物活性剂量下具有良好的耐受性和有限的毒性(即其中循环CD4+和CD8+ T细胞的数量增加了3至4倍)(见例如Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。已示出IL-7对肿瘤例如胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌和胶质母细胞瘤具有抗肿瘤作用，并且在小鼠模型中体内施用IL-7导致癌细胞生长减少。IL-7还被证实增强IFN-γ在大鼠胶质瘤肿瘤中的抗肿瘤作用，并诱导单核细胞产生IL-1α、IL-1β和TNF-α，从而抑制黑色素瘤生长。此外，在治疗小儿肉瘤后施用重组IL-7导致促进免疫恢复(见例如Lin et al.(2017)AnticancerResearch 37:963-968)。
IL-12(IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35))
促进细胞介导的免疫性的生物活性IL-12(IL-12p70)是一种异源二聚体，由p35和p40亚基组成，而IL-12p40单体和同源二聚体则作为IL-12拮抗剂。IL-12由抗原呈递细胞分泌，促进NK细胞和T细胞分泌IFN-γ，抑制肿瘤血管生成，导致NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化和增殖，增强天然CD4+T细胞分化为Th1细胞，以及促进针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。IL-12在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和肉瘤的小鼠模型中已示出抗肿瘤作用(见例如Kalinski et al.(2001)Blood97:3466-3469；Sheikhi et al.(2016)Iran J.Immunol.13(3):148-166；and Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
IL-15和IL-15:IL-15Rα
IL-15在结构上与IL-2相似，虽然IL-2和IL-15均为T细胞的增殖和活化提供早期刺激，但IL-15阻断IL-2诱导的细胞凋亡，这是导致消除刺激的T细胞及诱导T细胞耐受、限制记忆性T细胞应答及潜在限制单独的IL-2的治疗功效的过程。IL-15还支持记忆CD8+ T细胞的持久性，以维持长期抗肿瘤免疫性，并通过以抗原非依赖性方式直接激活CD8+效应T细胞，在临床前小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性。除了CD8+ T细胞外，IL-15负责效应子自然杀伤(NK)细胞的发育、增殖和激活(见例如Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893；and Han et al.(2011)Cytokine 56(3):804-810)。
IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)由抗原呈递细胞(例如单核细胞和树突状细胞)协同表达，并且IL-15通过IL-15Rα反式呈递给在CD8+ T细胞和NK细胞表面上表达的IL-15βγc受体复合物。可溶的IL-15:IL15-Rα复合物已示出通过IL-15βγc复合物调节免疫应答，以及示出将IL-15以预先形成的IL-15和可溶的IL-15Rα复合物施用，IL-15的生物活性增加50倍，其半衰期与单独施用IL-15相比更长。这种通过与IL-15Rα预缔合显著提高IL-15的治疗功效已在鼠肿瘤模型中证实(见例如Han et al.(2011)Cytokine56(3):804-810)。
IL-18
IL-18通过NK和CD8+T细胞诱导IFN-γ分泌，增强其毒性。IL-18还激活巨噬细胞并刺激Th1辅助CD4+ T细胞的发育。IL-18在一些临床前小鼠模型中已示出有希望的抗肿瘤活性。例如，施用重组IL-18(rIL-18)通过激活CD4+ T细胞和/或NK细胞介导的应答，导致同源小鼠的黑色素瘤或肉瘤消退。其它研究表明，IL-18的抗肿瘤作用是由IFN-γ介导的，并涉及抗血管生成机制。IL-18与其它细胞因子(如IL-12)或共刺激分子如CD80的组合增强了IL-18介导的抗肿瘤作用。晚期实体瘤和淋巴瘤患者的I期临床实验表明施用IL-18是安全的，并且导致免疫调节活性和患者中血清IFN-γ和GM-CSF水平增加及适度的临床应答。临床实验表明，IL-18可以与其它抗癌治疗剂组合，如单克隆抗体、细胞毒性药物或疫苗(见例如Fabbi et al.(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675；and Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
已发现经工程化为表达IL-18的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株，在全身施用后在同源小鼠中抑制皮下(S.C.)的肿瘤或肺转移瘤的生长，而没有任何毒性作用。使用这种工程化细菌进行治疗诱导肿瘤中T细胞、NK细胞和粒细胞的累积，并导致细胞因子的瘤内产生(见例如Fabbi et al.(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675)。
趋化因子
趋化因子是小细胞因子家族，可介导白细胞迁移到损伤或炎症区域，并参与介导免疫和炎症应答。根据半胱氨酸残基在其序列中的位置，趋化因子分为四个亚家族，即XC-、CC-、CXC-和CX3C-趋化因子配体，或XCL、CCL、CXCL和CX3CL。趋化因子配体与其同源受体结合并调节免疫细胞的循环、归巢和滞留，其中每个趋化因子配体-受体对选择性地调节某种类型的免疫细胞。不同的趋化因子吸引不同的白细胞群体，并在体内形成浓度梯度，其中被吸引的免疫细胞通过梯度向趋化因子浓度较高的方向移动(见例如Argyle D.andKitamura,T.(2018)Front.Immunol.9:2629；和Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335)。趋化因子可以通过增加免疫细胞对肿瘤的浸润，促进抗原呈递细胞(APC)向肿瘤引流淋巴结移动，引发天然T细胞和B细胞，从而改良抗肿瘤免疫应答(见例如Lechner etal.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340)。本文的免疫刺激细菌可以被工程化以编码趋化因子，包括但不限于CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。
CCL3、CCL4、CCL5
CCL3、CCL4和CCL5具有高度的同源性，并在人和小鼠中的结合一些细胞类型包括未成熟DC和T细胞上的CCR5(CCL3、CCL4和CCL5)和CCR1(CCL3和CCL5)。已示出治疗性T细胞通过CCL3、CCL4和CCL5的肿瘤特异性分泌诱导先天免疫细胞趋化于肿瘤部位(见例如Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335)。
诱导T辅助细胞1型(Th1)应答可释放CCL3。小鼠体内和体外研究表明，CCL3对中性粒细胞和单核细胞均有趋化性；具体而言，CCL3可以介导骨髓前体细胞(MPC)从骨髓动员，并具有MPC调节和刺激作用。用CCL3转染的人卵巢癌细胞示出肿瘤内增强的T细胞浸润和巨噬细胞，导致改良的抗肿瘤应答，并表明CCL3介导的中性粒细胞趋化性抑制了肿瘤生长。被CCL3招募的用肿瘤抗原人黑色素瘤相关基因(MAGE)-1转染的DC在黑色素瘤小鼠模型中表现出优异的抗肿瘤作用，包括增加淋巴细胞增殖、细胞溶解能力、存活力和降低肿瘤生长。CCL3与MAGE-1的抗原特异性平台的组合使用也已用于治疗胃癌。CT26是一种高免疫原性小鼠结肠肿瘤，其产生的CCL3减缓体内肿瘤生长；这个过程被表明是由自然杀伤(NK)细胞的CCL3依赖性累积驱动，并因此IFNγ导致CXCL9和CXLC10的产生(见例如Allen et al.(2017)Oncoimmunology7(3):e1393598；and Schaller et al.(2017)ExpertRev.Clin.Immunol.13(11):1049-1060)。
CCL3已被用作治疗癌症的佐剂。在小鼠肝细胞癌射频消融后施用CCL3活性变体ECI301增加了肿瘤特异性应答，并且进一步表明这种机制依赖于CCR1的表达。也已经示出CCL3在全身性癌症中作为佐剂取得了成功，在白血病/淋巴瘤模型中接种CCL3和IL-2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的小鼠表现出存活率增加(见例如Schaller et al.(2017)Expert Rev.Clin.Immunol.13(11):1049-1060)。
CCL3和CCL4在指导CD8+ T细胞浸润进黑色素瘤和结肠癌的原发肿瘤部位中发挥作用。CCL4的肿瘤产生导致CD103+DC的累积；通过WNT/β-连环蛋白依赖性途径抑制CCL4，阻止黑色素瘤肿瘤的CD103+ DC浸润(见例如Spranger et al.(2015)Nature 523(7559):231-235)。在结肠癌小鼠模型中，CCL3还显示出增强CD4+和CD8+ T细胞向原发肿瘤部位的浸润(见例如Allen et al.(2017)Oncoimmunology 7(3):e1393598)。
CCL3或CCL5与其受体(分别为CCR1和CCR5)的结合将未成熟的DC、单核细胞、记忆和T效应细胞从循环中移至炎症或感染部位。例如，在结肠直肠肿瘤中的CCL5表达有助于T淋巴细胞的趋化作用和存活。CCL3和CCL5已在几个临床前模型中单独使用或组合疗法中使用以诱导肿瘤消退和免疫性。例如，研究表明，皮下注射经遗传修饰为表达CCL3的中国仓鼠卵巢细胞，导致肿瘤抑制和中性粒细胞浸润。在另一项研究中，重组溶瘤腺病毒表达CCL5(Ad-RANTES-E1A)在乳腺癌小鼠模型中导致原发肿瘤消退并阻止转移(见例如Lechner etal.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340)。
在结肠直肠癌的转化研究中，CCL5在巨噬细胞中诱导“抗病毒应答模式”。作为CXCR3介导的淋巴细胞在结直肠癌肝转移浸润边缘迁移的结果，产生了CCL5。阻断CCR5(CCL5受体)导致肿瘤死亡，这是由产生IFN的巨噬细胞和活性氧驱动的。虽然巨噬细胞存在于肿瘤微环境中，但CCR5抑制诱导从M2至M1的表型转变。CCR5阻断还导致结直肠癌患者的临床反应(见例如Halama et al.(2016)Cancer Cell 29(4):587-601)。
CCL3、CCL4和CCL5可用于治疗包括淋巴肿瘤、膀胱癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或肝癌的病症(见例如美国专利公开号US 2015/0232880；国际专利公开号WO 2015/059303、WO 2017/043815、WO 2017/156349和WO 2018/191654)。
CXCL9、CXCL10、CXCL11
CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)和CXCL11(ITAC)由IFN-γ的产生而诱导。这些趋化因子结合CXCR3，优先在活化的T细胞上表达，并在血管生成抑制和白细胞的募集和活化中起作用。结直肠癌的预后与肿瘤浸润性T细胞密切相关，尤其是Th1和CD8+效应T细胞；CXCL9、CXCL10和CXCL11的高肿瘤内表达表明预后良好。例如，在163名结肠癌患者的样本中，具有高水平CXCL9或CXCL11的患者显示术后生存率增加，而CXC高表达患者的CD3+ T细胞、CD4+ T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞数量显著增加。在结直肠癌患者的肝转移中，CXCL9和CXCL10水平在浸润边缘增加，并且与效应T细胞密度相关。通过CXCL9和CXCL10对CXCR3的作用刺激淋巴细胞迁移导致在浸润边缘产生CCL5(见例如Halama et al.(2016)Cancer Cell29(4):587-601；和Kistner et al.(2017)Oncotarget 8(52):89998-90012)。
在体内，CXCL9对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、活化的外周血淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞和Th1淋巴细胞起到化学引诱物的作用。CXCL9对于T细胞介导的皮肤肿瘤抑制也至关重要。例如，当与全身性IL-2组合时，CXCL9已被证实可通过增加CXCR3+单核细胞的肿瘤内浸润来抑制肿瘤生长。在结肠癌的小鼠模型中，huKS1/4-IL-2融合蛋白与CXCL9基因疗法的组合通过CD8+和CD4+ T淋巴细胞的化学吸引和激活获得了优异的抗肿瘤效果和延长寿命(见例如Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335；和Ruehlmann et al.(2001)Cancer Res.61(23):8498-8503)。
CXCL10由活化的单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞产生，对活化的T细胞具有趋化性，并可作为体内血管生成的抑制剂。CXCL10在结直肠肿瘤中的表达已示出有助于细胞毒性T淋巴细胞的趋化作用和更长的生存期。已示出施用免疫刺激细胞因子如IL-12增强CXCL10产生的抗肿瘤作用。用肿瘤细胞裂解物引发及用CXCL10转染的树突状细胞(DC)疫苗在小鼠中具有增强的免疫保护作用和有效性；所述动物表现出对肿瘤挑战的抵抗力、肿瘤生长减慢和更长的存活时间。与未用融合蛋白治疗的肿瘤相比，使用CXCL10-粘蛋白-GPI融合蛋白在小鼠中进行的体内和体外研究导致肿瘤具有更高水平的募集的NK细胞。干扰素(可由浆细胞样树突状细胞产生；这些细胞与原发性黑色素瘤病变相关，以及可以被CCL20募集到肿瘤部位)可以作用于肿瘤DC亚群，例如CD103+DC，已示出在小鼠黑色素瘤模型中产生CXCL9/10，及在人疾病中与CXCL9/10相关。相对于原发性黑色素瘤样品，CXCL10在人转移性黑色素瘤样品中也显示出更高的表达。在治疗上，辅助IFN-α黑色素瘤疗法上调CXCL10的产生，而化学治疗剂顺铂诱导CXCL9和CXCL10(见例如Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335；Kuo et al.(2018)Front.Med.(Lausanne)5:271；Li etal.(2007)Scand.J.Immunol.65(1):8-13；和Muenchmeier et al.(2013)PLoS One 8(8):e72749).
已经确定CXCL10/11和CXCR3在源自基底细胞癌(BCC)的人角质形成细胞中表达。CXCL11在人基底细胞癌中还能促进免疫抑制性吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达以及增强角质形成细胞的增殖，这可以降低任何浸润性CXCR3+效应T细胞的抗肿瘤活性(见例如Kuoet al.(2018)Front.Med.(Lausanne)5:271)。
CXCL9、CXCL10和CXCL11可以在溶瘤病毒中编码以治疗癌症(见例如美国专利公开号US 2015/0232880；国际专利公开号WO 2015/059303)。假型溶瘤病毒或编码CXCL10基因的遗传工程化细菌可用于治疗癌症(见例如国际申请公开号WO 2018/006005和WO 2018/129404)。
b.共刺激分子
共刺激分子增强对肿瘤细胞的免疫应答，以及肿瘤细胞抑制共刺激途径而促进肿瘤发生。本文的免疫刺激细菌可以被工程化为表达共刺激分子，例如CD40，CD40L，4-1BB，4-1BBL，具有胞质结构与缺失的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，具有截短的比值结构域的4-1BBL，OX40(CD134)，OX40L(CD252)，TNFR超家族其它成员(例如CD27，CD27配体，GITR，CD30，Fas受体，TRAIL-R，TNF-R，HVEM，和RANK)，B7，CD80，CD86，ICOS，ICOS配体(B7RP1)，和CD28。此外，免疫刺激细菌可以编码和表达截短的共刺激分子(例如，4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)，具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域的完全或部分缺失(完全或截短或修饰以确保在细胞中表达时正确定向)。本文示出，具有截短的胞质结构域(包括完全缺失)的基因产物通过共刺激受体参与向T细胞提供组成型免疫刺激信号，并且由于截短或缺失(或如本文所述以其它方式修饰)的胞质结构域而不能向APC发出反调节信号。所述截短足以提供信号传导，并且无法为APC提供反调节信号。如本文所述，共刺激分子的胞质结构域的完全或部分缺失增强了共刺激分子的活化，而没有免疫抑制反向信号传导。胞质结构域的部分缺失(或截短)足以实现这些效果，而不影响共刺激分子的表达或表达的共刺激分子的方向。
还可以通过修饰胞质结构域中的氨基酸，包括插入、缺失和/或置换来修饰共刺激分子以消除或减少免疫抑制性细胞内/反向信号传导。特别地，通过修饰例如通过置换胞质结构域磷酸化位点来修饰共刺激分子。例如，用减少或消除反向信号传导的残基置换在适当的一个或多个基因座的一个或多个Ser残基，例如对于人4-1BBL，置换参考SEQ IDNO:389的Ser5和Ser8。
本文中的免疫刺激细菌也可以被工程化为表达针对共刺激分子(例如4-1BB)的激动抗体以增强抗肿瘤免疫应答。
TNF受体超家族
TNF配体超家族(TNFSF)及其受体(TNFRSF)参与肿瘤和免疫效应细胞的增殖、分化、活化和存活。这个家族的成员包括诱导细胞凋亡的CD30、Fas-L、TRAIL-R和TNF-R，以及调节B和T细胞免疫应答的CD27、OX40L、CD40L、GITR-L和4-1BBL。其它成员包括疱疹病毒进入介导物(HVEM)。本文的免疫刺激细菌表达TNFSF和TNFRSF可增强抗肿瘤免疫应答。例如，已经表明，4-1BBL在小鼠肿瘤中的表达增强了免疫原性，以及肿瘤内注射OX40L表达增加的树突状细胞(DC)可导致小鼠模型中的肿瘤排斥。研究还表明，将表达重组GITR的腺病毒注射进B16黑色素瘤细胞中促进T细胞浸润并减少肿瘤体积。针对分子(例如4-1BB、OX40和GITR)的刺激性抗体也可由免疫刺激细菌编码以刺激免疫系统。例如，已显示激动性抗4-1BB单克隆抗体增强抗肿瘤CTL应答，而激动性抗OX40抗体已示出增加可移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。此外，激动性抗GITR抗体已示出增强抗肿瘤应答和免疫性(见例如Lechner etal.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；和Peggs et al.(2009)Clinical andExperimental Immunology 157:9-19)。
CD40和CD40L
CD40是TNF受体超家族的成员，由APC和B细胞表达，而其配体CD40L(CD154)由活化的T细胞表达。CD40和CD40L之间的相互作用刺激B细胞产生细胞因子，导致T细胞活化和肿瘤细胞死亡。研究表明，抗肿瘤免疫应答因T细胞上CD40L或树突状细胞上CD40的表达减少而受损。CD40在一些B细胞肿瘤如滤泡性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、成淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病的表面上表达，并且其与CD40L的相互作用已示出在CD40+肿瘤细胞中增加B7.1/CD80、B7.2/CD86和HLA II类分子的表达，以及增强其抗原呈递能力。CD40L在多发性骨髓瘤小鼠模型中的转基因表达导致CD4+和CD8+ T细胞的诱导、局部和全身抗肿瘤免疫应答以及肿瘤生长减少。抗CD40激动性抗体也诱导抗肿瘤T细胞应答(见例如Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11:39；Dotti et al.(2002)Blood 100(1):200-207；和Murugaiyan et al.(2007)J.Immunol.178:2047-2055)。
4-1BB和4-1BBL
4-1BB(CD137)是一种可诱导的共刺激受体，主要由T细胞和NK细胞表达；其结合在APC、包括DC、B细胞和单核细胞上表达的其配体4-1BBL，以触发免疫细胞增殖和激活。4-1BB导致活化T细胞的应答时间更长以及范围更广。抗4-1BB激动剂和4-1BBL融合蛋白已示出增加免疫介导的抗肿瘤活性，例如由CD4+和CD+ T细胞介导的针对肉瘤和肥大细胞瘤的免疫介导的抗肿瘤活性，以及肿瘤特异性CTL活性(见例如Lechner et al.(2011)Immunotherapy3(11):1317-1340；and Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology11:39)。4-1BBL受其胞质信号传导结构域的负调控。在巨噬细胞与T细胞上4-1BBL连接的后期，4-1BBL胞质结构域的反向信号传导诱导4-1BBL的表面易位与TLR4结合形成信号传导复合物。这会诱导高水平的TNF-α，与TLR4的LPS活化相当，从而导致适应性免疫反应的免疫抑制(见例如Ma et al.(2013)Sci.Signaling295(6):1-11。
4-1BBL是TNF超家族的成员，在B细胞、树突状细胞、活化的T细胞和巨噬细胞中表达。4-1BBL与其受体4-1BB结合，并为T细胞活化和扩展提供共刺激信号。人4-1BBL基因编码254个氨基酸的II型跨膜蛋白，其含有28个氨基酸的胞质结构域、21个氨基酸的跨膜蛋白结构域和205个氨基酸的胞外结构域(见SEQ ID NO:389)。如本文所述，缺失全部或部分4-1BBL的胞质结构域(对应于SEQ ID NO:342或389的氨基酸残基1-28)增强了4-1BBL的活化而没有免疫抑制反向信号传导。缺失的部分足以增强4-1BBL的活化，但没有免疫抑制反向信号传导。如下所述，截短的胞质结构域可以包括氨基酸或置换，以确保表达的蛋白质在细胞膜中的正确方向(类似的修饰可以在胞质结构域被截短或缺失的其它跨膜蛋白中进行)。本文提供了编码4-1BBL变体的核酸分子，所述变体缺少胞质结构域或具有截短的胞质结构域，以消除免疫抑制反向信号传导。这种核酸和编码的蛋白质的实例在实施例中描述(见例如SEQ ID NO:391和395)。所述受体也可以在细胞质被截短或缺失。
OX40和OX40L
OX40(CD134)是TNF受体超家族的成员，其在激活的效应T细胞上表达，而其配体OX40L在APC包括DC、B细胞和巨噬细胞上表达，随后由TLR激动剂及CD40-CD40L信号传导激活。OX40-OX40L信号传导导致T细胞的激活、增强、增殖和存活，以及调节NK细胞功能和抑制Treg的抑制活性。通过OX40的信号传导还导致细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ)的分泌，增强Th1和Th2细胞应答。TIL对肿瘤抗原的识别导致通过TIL的OX40的表达增加，这与改善的预后相关。研究表明，用抗OX40激动抗体或Fc-OX40L融合蛋白的治疗在黑色素瘤、肉瘤、结肠癌和乳腺癌小鼠模型中增强肿瘤特异性CD4+ T细胞应答及增加存活率，而掺入肿瘤细胞疫苗中的Fc-OX40L保护小鼠免受乳腺癌细胞的后续攻击(见例如Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；和Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11:39)。
B7-CD28家族
CD28是在T细胞表面表达的共刺激分子，其充当B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的受体，其是在抗原呈递细胞上表达的共刺激分子。CD28-B7信号传导是T细胞活化和存活以及防止T细胞无效能所需的，并导致白细胞介素如IL-6的产生。
最佳的T细胞引发需要两个信号：(1)MHC呈递的抗原的T细胞受体(TCR)识别，和(2)得自T细胞CD28与在APC上表达的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)连接的共刺激信号。在T细胞激活后，CTLA-4受体被诱导，然后在与B7-1和B7-2配体的结合方面胜过CD28。由于肿瘤细胞缺乏共刺激分子(例如B7-1/CD80和B7-2/CD86)的表达，导致无法激活T细胞受体复合物，因此肿瘤细胞的抗原呈递较差。结果，在肿瘤细胞表面上调这些分子可以增强其免疫原性。B7已成功诱导实体瘤和血液恶性病的免疫疗法，例如通过B7或可溶性B7免疫球蛋白融合蛋白的肿瘤细胞表达而实现。B7的病毒介导的肿瘤表达与其它共刺激配体如ICAM-3和LFA-3组合，已在治疗慢性淋巴细胞白血病和转移性黑色素瘤的临床前和临床实验中取得成功。此外，可溶的B7融合蛋白作为单药免疫疗法在实体瘤的免疫疗法中已示出有希望的结果(见例如Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；and Dotti et al.(2002)Blood 100(1):200-207)。
2.激活前药的分子
本文提供的免疫刺激细菌中的质粒可以包括编码分子的核酸，例如酶，所述酶例如通过裂解治疗产物、例如前药包括化疗前药、特别是毒素的一部分而使其激活，通过酶促裂解激活。结果，无活性的前药可以全身施用，并且是无活性的。质粒编码的激活分子，例如酶，在递送本文提供的免疫刺激细菌后在肿瘤微环境中表达，从而使无活性的前药在肿瘤微环境中被激活，从而发挥其抗肿瘤作用。这种前药有很多实例，包括某些核苷和毒素缀合物。许多这样的前药和酶是已知的(见例如Malekshah et al.,(2016)Curr.Pharmacol.Rep.2:299-308)。这些包括5-氟尿嘧啶、恶氮膦(axazaphosorines)、铂类药物和酶如脱氨酶、硝基还原酶、磷酸化酶、细胞色素P450酶等的前药。
3.刺激免疫反应和/或I型IFN、非人STING蛋白、嵌合体和修饰形式的组成型活性蛋白
I型干扰素(IFN；也称为干扰素1型)，包括IFN-α和IFN-β，是具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的多效细胞因子。IFN-β由大多数细胞类型产生；IFN-α主要由造血细胞产生，特别是浆细胞样树突状细胞。I型干扰素是在模式识别受体(PRR)感知病原体相关分子模式(PAMP)后产生的。它们参与针对病原体(主要是病毒)的先天免疫反应，是强力的免疫调节剂，可促进抗原呈递，介导树突状细胞(DC)成熟，激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞，并通过促进高亲和性抗原特异性T细胞和B细胞应答和免疫记忆的发生来激活适应性免疫系统。
I型干扰素对肿瘤具有抗增殖和促凋亡作用，对肿瘤新血管系统具有抗血管生成作用。它们诱导肿瘤细胞表面MHC I类分子的表达，增加肿瘤细胞的免疫原性，并激活针对其的细胞毒性。I型干扰素已被用作治疗癌症和病毒感染的治疗剂。例如，IFN-α(以商标
Figure GDA0004138988600000751
-A销售)被批准用于治疗毛细胞白血病、恶性黑色素瘤、AIDS相关的Kaposi’s肉瘤和滤泡性非霍奇金淋巴瘤；其也用于治疗慢性髓系白血病(CML)、肾细胞癌、神经内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤、非滤泡性非霍奇金淋巴瘤、硬纤维瘤和皮肤T细胞淋巴瘤，但是由于全身免疫毒性而使用受到限制(见例如Ivashkiv and Donlin(2014)Nat.Rev.Immunol.14(1):36-49；Kalliolias and Ivashkiv(2010)Arthritis Research&Therapy 12(Suppl 1):S1；和Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
I型干扰素在肿瘤和肿瘤微环境中的表达是本文的免疫刺激细菌旨在引发的免疫反应之一。诱导或诱发I型干扰素为治疗癌症提供抗肿瘤免疫。
a.组成型STING表达和功能获得性突变
I型干扰素、促炎细胞因子和趋化因子的诱导对于产生预防或抑制病毒病原体感染的免疫反应是必要的。这种反应也可以作为有效抗肿瘤剂。本文提供的免疫刺激细菌编码组成型诱导I型IFN的蛋白质。在这些蛋白质中，有发生在患有涉及免疫反应调节物过度产生的各种疾病或病症的个体中的蛋白质。例如，I型IFN和促炎细胞因子的过度产生或超量产生或的负调控缺陷，可导致不良影响，例如炎症和自身免疫性疾病。涉及I型IFN过度产生的疾病(通常是慢性)被称为干扰素病(见例如Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118；和Konno et al.(2018)Cell Reports 23:1112-1123)。与I型干扰素病相关的疾病和临床表型包括Aicardi-Goutiéres综合征(AGS)、婴儿期发病的STING相关血管病(SAVI)、Singleton-Merten综合征(SMS)、非典型SMS、家族性冻疮性狼疮(FCL)、系统性红斑狼疮病(SLE)、双侧纹状体坏死(BSN)、脑血管疾病(CVD)、遗传性对称性色素异常症(DSH)、痉挛性截瘫(SP)、X连锁网状色素异常症(XLPDR)、蛋白酶体相关自身炎症综合征(PRAAS)、颅内钙化(ICC)、呈孟德尔遗传的分枝杆菌病(MSMD)和脊椎软骨发育不良(SPENCD)(见例如Rodero et al.(2016)J.Exp.Med.213(12):2527-2538)。这些表型与特定基因型相关，涉及基因突变，导致参与I型IFN诱导的产物的组成型活性。
干扰素信号传导的持续激活可能是由于：1)功能丧失突变导致胞质DNA增加(例如，TREX1和SAMHD1中的突变)，或胞质RNA/DNA杂合体增加(例如，RNASEH2A、RNASEH2B，RNASEH2C和POLA1中的突变)；2)功能丧失突变导致RNA编辑缺陷和胞质中自身核酸RNA种类的异常感知(例如ADAR1中的突变)；3)功能获得突变导致胞质IFN信号传导途径的组成型激活/对胞质核酸配体的敏感性增加(例如，RIG-I、MDA5和STING中的突变)；4)功能丧失突变导致通过由未折叠蛋白应答紊乱所致MAVS的异常RNA信号传导(例如，SKIV2L中的突变)；5)负责限制IFN受体(IFNAR1/2)信号传导的分子中的功能丧失突变，导致不受控制的IFN刺激基因(ISG)产生(例如，USP18和ISG15中的突变)；6)蛋白酶体功能异常，通过未知机制导致IFN信号传导增加(例如，PSMA3、PSMB4和PSMB8中的突变)；和7)TRAP/ACP5和C1q的功能丧失突变，其中导致I型IFN信号传导的机制仍然不清楚(见例如Rodero et al.(2016)J.Exp.Med.213(12):2527-2538)。
本文感兴趣的是导致功能获得(GOF)的突变。STING、MDA5和RIG-I中存在已知的突变，这些突变与编码的蛋白质的组成型激活和/或与内源性配体增强的敏感性或增加的亲和性或结合有关。例如，STING中的GOF突变与SAVI和FCL相关；MDA5中的GOF突变与AGS和SMS相关；RIG-I中的GOF突变与非典型SMS相关。
TMEM173 STING等位基因
干扰素基因刺激因子(STING)由跨膜蛋白173(TMEM173)基因编码，该基因是一个长度约7kb的基因。人TMEM173基因的特征在于等位基因的显著异质性和人口分层。最常见的人TMEM173等位基因称为R232(指存在于残基232位置的氨基酸；见例如SEQ ID NO:305-309，列出了各种人TMEM173等位基因的序列)。超过一半的美国人口不是R232/R232。第二个最常见的等位基因是R71H-G230A-R293Q(HAQ)。其它常见等位基因包括AQ(G230A-R293Q)、Q(Q293)和R232H(参考在数据库中由Glen Barber首次鉴别和编目的STING等位基因后命名为REF)。
R232/R232是欧洲人最常见的基因型，而HAQ/R232是东亚人最常见的基因型。非洲人没有HAQ/HAQ基因型，但有Q等位基因，约4％的非洲人是AQ/AQ，这在其它种族人群中不存在(见例如Patel and Jin(2018)Genes&Immunity,doi:10.1038/s41435-018-0029-9)。REF、AQ和Q等位基因对细菌来源的CDN例如3’3’c-di-GMP高度耐药(见例如Corrales etal.(2015)Cell Reports 11:1018-1030)。
STING功能获得性突变
STING基因TMEM173中的几个激活或功能获得(GOF)突变，遗传的以及新生的，均与一种罕见的自身炎症性疾病SAVI(STING相关的婴儿期发病血管病变)有关。SAVI是一种常染色体显性遗传病，且其特征在于全身炎症、间质性肺病、皮肤血管炎和复发性细菌感染。具有新生TMEM173突变的SAVI的特征通常在于早发(<8周)和严重的表型，而家族性突变导致晚发(青少年到成人)和较轻的临床症状。遗传的TMEM173激活突变包括G166E和V155M，而新生突变包括N154S、V155M、V147M、V147L、C206Y、R284G、R281Q和S102P/F279L(见例如Patel and Jin(2019)Genes&Immunity 20:82-89)。其它已鉴定的TMEM173激活突变包括R284M、R284K、R284T和R375A(见例如美国专利公开号2018/0311343)。TMEM173中另一个功能获得性突变是R284S，其导致高度组成型活性STING，并被发现在没有激活CDN的情况下触发先天免疫信号传导，导致促炎细胞因子的慢性产生(见例如Konno et al.(2018)CellReports 23:1112-1123)。
TMEM173突变，例如N154S、V155M和V147L，和/或下表中列出的任何突变，单独或与这些和任何其它这种突变如N154S/R284G的任何组合导致功能获得性STING，所述STING具有组成型活性并且不需要或对配体刺激高度敏感，导致STING-干扰素途径的慢性激活。这已经得到证实(见例如Liu et al.(2014)N.Engl.J.Med.371:507-518)。将突变的TMEM173(具有各个置换V147L、N154S、V155M和功能丧失突变体V155R)和非突变的TMEM173的构建体转染到STING阴性HEK293T细胞中，并用STING配体cGAMP进行刺激。用N154S、V155M和V147L突变体转染的细胞表现出高度升高的IFNB1(编码IFN-β的基因)报告基因活性，而用STING配体cGAMP刺激并未显著增强这种活性。用功能丧失突变体(V155R)、未突变的TMEM173或对照质粒转染的细胞没有显著的基线激活。用cGAMP刺激在具有未突变TMEM173的细胞中产生剂量依赖性模式的应答，以及在表达功能丧失突变体的细胞中仅在最高cGAMP浓度才产生最小应答(见例如Liu et al.(2014)N.Engl.J.Med.371:507-518)。这些结果表明，即使在没有cGAMP刺激的情况下，激活TMEM173突变也会导致STING的组成型激活。
G207E是另一种功能获得性STING突变，其导致脱发、光敏性、甲状腺功能异常和SAVI特征。G207E突变导致HEK细胞中炎症相关途径的组成型激活，以及患者外周血单核细胞(PBMC)中的异常干扰素特征和炎性体激活。使用具有R232或H232等位基因和GOF突变G207E的STING变体，示出在用CDN刺激后，R232+G207E变体导致IFN-β和STAT1/2途径的活性略有增加，而H232+G207E变体导致IFN-β水平保持不变，以及STAT1/2显示活性减弱。这两种变体在刺激后均示出相似的STAT3和NF-κB途径激活。这些结果表明，在第232位的残基R对于cGAMP结合和IFN诱导是重要的，并表明G207E突变体导致STING信号传导途径的组成型激活和NF-κB途径的配体依赖性过度激活。具有R232等位基因和G207E的患者患有的疾病更严重；这种多态性加强了突变体STING的组成型激活，导致下游靶标如IFN、IL1-β和IL-18的过度表达(见例如Keskitalo et al.(2018),available from:doi.org/10.1101/394353)。
将鼠STING(见例如SEQ ID NO:369)中的67个氨基酸单独或成组突变(见Burdetteet al.(2011)Nature 478(7370):515-518)，以鉴别参与环状di-GMP(c-di-GMP)结合和/或IFN诱导的氨基酸。其中鉴别的突变体是超活性突变体R196A/D204A、S271A/Q272A、R309A/E315A、E315A、E315N、E315Q和S271A(通过参照SEQ ID NO:305-309所示人STING序列而分别对应于R197A/D205A、S272A/Q273A、R310A/E316A、E316A、E316N、E316Q和S272A)，其自发诱导的IFN处于低水平转染及不应答c-di-GMP，以及突变体R374A、R292A/T293A/E295A/E299A、D230A、R231A、K235A、Q272A、S357A/E359A/S365A、D230A/R231A/K235A/R237A和R237A(通过参照SEQ ID NO:305-309所示人STING序列而分别对应于R375A、R293A/T294A/E296A(在人STING中没有E299A等价物)、D231A、R232A、K236A、Q273A、S358A/E360A/S366A、D231A/R232A/K236A/R238A和R238A)，当其过表达时诱导IFN，但不应答c-di-GMP。这些等位基因仍然可以应答内源性CDN 2’3’c-di-GAMP，因为后来发现一些人STING突变对细菌产生的3’3’CDN例如c-di-GMP的亲和性较低(见例如Corrales et al.(2015)Cell Reports 11:1018-1030)。
本文提供的编码具有功能获得性突变的这些蛋白质的免疫刺激细菌利用这些蛋白质的组成型激活来增加I型IFN和促炎细胞因子的产生。本文提供了编码具有功能获得性突变的STING、IRF3、IRF5、IRF7、MDA5和/或RIG-I的肿瘤靶向免疫刺激细菌。所述免疫刺激菌增加了肿瘤微环境中I型IFN介导的细胞因子和趋化因子的产生，增强了抗肿瘤免疫反应，提高了所述免疫刺激菌的治疗效果。编码STING的基因称为TMEM173，编码MDA5的基因是IFIH1，编码RIG-I的基因是DDX58。每个基因都有许多等位基因，并且已知突变可能发生在具有任何等位基因的基因中，导致功能获得或组成型激活。下面列出的突变可以单独出现，也可以任意组合使用。其它导致功能获得的突变可以通过常规筛选/突变方案进行鉴定。下表列出了STING/TMEM173(SEQ ID NO:305-309)、MDA5/IFIH1(SEQ ID NO:310)、RIG-I/DDX58(SEQ ID NO:311)、IRF3(SEQ ID NO:312)和IRF7(SEQ ID NO:313)中的每一个的示例功能获得突变。也可以被引入其它突变，例如缺失或置换一个或多个磷酸化位点，例如STING中的S324/L325/S326→S324A/L325/S326A，以及消除磷酸化位点以减少核因子-κB(NF-κB)在STING中的信号传导的其它置换，或使用这种信号传导的其它蛋白质，。
所得蛋白质可以在本文提供的免疫刺激细菌中编码。蛋白质在免疫刺激细菌的质粒上编码。
施用编码野生型STING的核酸可以诱导免疫应答；在靶向肿瘤的递送载体中施用具有本文提供的组成型活性的功能获得性STING突变体导致更强力的免疫应答和更有效的抗癌治疗剂。通过靶向肿瘤地施用组成型活性STING或其它这种修饰的DNA/RNA传感器(例如本文提供的MDA5、RIG-I、IRF3或IRF7的功能获得性突变体)而增强的免疫应答，提供了治疗上更有效的抗癌治疗。例如，如本文所述，修饰所述免疫刺激细菌使其不感染上皮细胞，但保留感染包括肿瘤驻留免疫细胞在内的吞噬细胞的能力，有效地将免疫刺激细菌靶向肿瘤微环境，改良治疗效率和防止不期望的全身免疫反应。这些靶向肿瘤的细菌被工程化为编码功能获得性STING、MDA5、RIG-I、IRF3或IRF7突变体，其具有组成型活性，例如即使在没有配体刺激的情况下也提供强力的I型IFN应答以改善肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。
因此，例如施用组成型激活的STING可以提供一种替代方法来增强STING信号传导，用于癌症的免疫治疗性治疗。在某些实施方案中，本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激细菌可以被修饰编码具有选自以下的功能获得性突变的STING/TMEM731(SEQ ID NO:305-309)：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，R197A，D205A，R197A/D205A，C206Y，G207E，D231A，R232A，K236A，R238A，D231A/R232A/K236A/R238A，S272A，Q273A，S272A/Q273A，F279L，S102P/F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R293A，T294A，E296A，R293A/T294A/E296A，R310A，E316A，E316N，E316Q，R310A/E316A，S324A/S326A，S358A，E360A，S366A，S358A/E360A/S366A，N154S/R284G，和R375A，及其保守突变。此外，与各个突变对应物相比，STING功能获得性突变的组合可以显著增强STING信号传导。
示例的功能获得突变体表
导致I型IFN持续表达的功能获得性突变
Figure GDA0004138988600000791
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Figure GDA0004138988600000801
参考如SEQ ID NO:305-309任一所示人STING的序列，氨基酸残基R197、D205、R310、R293、T294、E296、S272、Q273、E316、D231、R232、K236、S358、E360、S366和R238，分别对应于如SEQ ID NO:369所示小鼠STING的序列的氨基酸残基R196、D204、R309、R292、T293、E295、S271、Q272、E315、D230、R231、K235、S357、E359、S365和R237。
本文显示置换N154S/R284G的组合导致I型干扰素的组成型表达。还包括每个置换的保守取代(参见定义部分中的表，列出每个氨基酸的示例保守突变)。
b.组成型IRF3表达和功能获得性突变
IRF3(干扰素调节因子3或IRF-3)和IRF7(或IRF-7)是I型IFN基因的关键激活物。在病毒诱导的C末端磷酸化之后(通过TBK1)，活化的IRF3和IRF7形成同源二聚体，从细胞质易位至细胞核，并与IFN刺激的应答元件(ISRE)结合以诱导I型IFN应答。IRF-3在未受刺激的细胞中组成型表达，以无活性的细胞质形式存在，而IRF7在细胞中不组成型表达，并且由IFN、脂多糖和病毒感染诱导。IRF3的过表达显著增加了病毒介导的I型IFN基因的表达，从而诱导抗病毒状态。IRF3激活也已显示出在病毒感染后上调CC-趋化因子RANTES(CCL5)的转录(见例如Lin et al.(1999)Mol.Cell Biol.19(4):2465-2474)。
IRF3的C末端结构域中的残基S385、S386、S396、S398、S402、T404和S405在病毒感染后被磷酸化，诱导构象变化，这导致IRF3激活。IRF3激活不仅由病毒感染诱导，也由脂多糖(LPS)和poly(I:C)诱导。在IRF3的C末端簇中可以磷酸化的7个残基中，单点突变S396D足以产生组成型活性形式的IRF-3。与野生型IRF3相比，IRF3(S396D)将IFNα1、IFN-β和RANTES启动子的反式激活分别提高了13、14和11倍。与野生型IRF3相比，另一个突变体IRF3(S396D/S398D)将IFNα1、IFN-β和RANTES启动子的反式激活分别提高了13、12和12倍。IRF3的另一个组成型活性突变体是IRF-3(5D)，其中第396、398、402、404和405位的丝氨酸或苏氨酸残基被拟磷酸天冬氨酸残基置换(IRF-3(S396D/S398D/S402D/T404D/S405D))。通过将免疫应答信号传导途径中的其它蛋白质如RIG-I、MDA5和STING中的丝氨酸残基突变为拟磷酸天冬氨酸，可以实现类似的功能获得性突变，导致免疫应答介导物的组成型活性，如I型干扰素的诱导。
IRF3(5D)显示组成型DNA结合和反式激活活性、二聚体形成、与转录辅激活因子p300(也称为EP300或E1A结合蛋白p300)/CBP(也称为CREB结合蛋白或CREBBP)缔合以及核定位。病毒感染不会进一步诱导其反式激活活性。IRF3(5D)是一种非常强的IFN-β和ISG15基因表达激活物；单独的IRF3(5D)刺激IFN-β表达与病毒感染一样强烈，以及与野生型IRF3相比使IFNα1、IFN-β和RANTES启动子的反式激活分别提高9倍、5.5倍和8倍(见例如Lin etal.(2000)J.Biol.Chem.275(44):34320-34327；Lin et al.(1998)Mol.Cell Biol.18(5):2986-2996；和Servant et al.(2003)J.Biol.Chem.278(11):9441-9447)。S385、S386、S396、S398、S402、T404和S405中任何位置可以单独或组合突变，以在本文提供的免疫刺激细菌中产生组成型活性的IRF3突变体。
c.非人STING蛋白及其具有增强或组成型活性的变体，以及STING嵌合体及其具有增强或组成型活性的变体
如上所述，胞质双链DNA(dsDNA)通过内质网(ER)驻留适配蛋白STING(IFN基因刺激因子)刺激I型干扰素(IFN)的产生，其激活转录因子干扰素调节因子3(IRF3)。TANK结合激酶(TBK1)/IRF3轴导致I型IFN的诱导，以及树突状细胞(DC)的激活和肿瘤抗原的交叉呈递，从而激活CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫性。STING信号传导还激活活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导轴，导致促炎应答，但不激活抗肿瘤免疫性所需的DC和CD8+ T细胞。
基于2’3’cGAMP的识别，STING从内质网通过高尔基体易位，从而募集TANK结合激酶1(TBK1)并激活转录因子IRF3和NF-κB。STING的羧基末端尾区(C末端尾区或CTT)区域是激活TBK1和刺激IRF3磷酸化所必需且足够的；其也参与NF-κB信号传导。CTT是一段约40个氨基酸的非结构化片段，含有STING磷酸化和IRF3募集所需的序列基序。IRF3和NF-κB下游信号传导归因于在脊椎动物物种中保守的STING的C末端尾区(CTT)内特定序列基序。CTT中的模块基序，包括IRF3-、TBK1-和TRAF6-结合模块，其控制细胞信号传导和免疫应答的强度和特异性。
根据物种及其STING CTT离散元件的各自特征，IRF-3和NF-κB下游应答可能会受到影响，且有时甚至相反。STING CTT元件命令并微调两个信号传导途径之间的平衡，从而产生不同的生物应答。例如，在人和小鼠免疫细胞中，STING依赖性IRF3激活主要导致I型干扰素应答。人细胞中的STING信号传导还通过TRAF6募集通过经典和可能的非经典NF-κB途径驱动促炎应答。人STING残基S366(见例如SEQ ID NO:305-309)是主要的TBK1磷酸化位点，其是CTT中LxIS基序的一部分，这是IRF3结合所需的，而第二个PxPLR基序包括残基L374，是TBK1结合所需的。LxIS和PxPLR基序在所有脊椎动物STING等位基因中均高度保守。在其它物种中，STING信号传导主要导致NF-κB信号传导轴的激活。例如，负责NF-κB信号传导过度活化的斑马鱼CTT在C极末端含有一个具有高度保守型的PxExxD基序的延伸，这在人和哺乳动物STING等位基因中是不存在的；这个基序与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)结合位点具有相似性。虽然TRAF6在人STING信号传导中的作用不是必需的，但TRAF6募集对于斑马鱼STING诱导的NF-κB激活是必需的。人-斑马鱼STING嵌合体，其中人STING被工程化为含有斑马鱼STING CTT模块DPVETTDY，诱导NF-κB激活高100倍以上，表明这个区域对于引导增强的NF-κB信号激活是必要且足够的。加入斑马鱼CTT还导致STING干扰素应答增加(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。
本文利用物种中IRF3和NF-κB信号传导之间平衡的差异来产生修饰的STING蛋白，这些蛋白降低了NF-κB信号传导，和/或任选增加了IRF3信号传导，使得在STING蛋白被递送至TME并表达时，与未修饰的STING蛋白相比，所得应答是增强的抗肿瘤/抗病毒应答。
在一些实施方案中，来自具有低或无NF-κB信号传导活性的物种的STING蛋白被提供在递送载体中，包括本文描述的或本领域技术人员已知的任何免疫刺激细菌，及提供在其它递送载体中，例如病毒载体，包括溶瘤病毒载体、微细胞、外来体(exosome)、脂质体，以及提供在细胞中，如用于细胞疗法中和用于递送载体的T细胞，如细菌和溶瘤载体。
非人STING蛋白可包括但不限于来自如下物种的STING蛋白：袋獾(Sarcophilusharrisii；SEQ ID NO:349)，狨猴(Callithrix jacchus；SEQ ID NO:359)，牛(Bos taurus；SEQ ID NO:360)，猫(Fells catus；SEQ ID NO:356)，鸵鸟(Struthio camelus australis；SEQ ID NO:361)，朱鹮(Nipponia nippon；SEQ ID NO:362)，腔棘鱼(Latimeriachalumnae；SEQ ID NO:363-364)，野猪(Sus scrota；SEQ ID NO:365)，蝙蝠(Rousettusaegyptiacus；SEQ ID NO:366)，海牛(Trichechus manatus latirostris；SEQ ID NO:367)，鬼鲨(Callorhinchus milli；SEQ ID NO:368)，及小鼠(Mus musculus；SEQ ID NO:369)。这些脊椎动物STING蛋白易于激活人细胞中免疫信号传导，表明STING信号传导的分子机制在大多数脊椎动物中是共享的(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。
在其它实施方案中，非人STING蛋白在所述非人STING中对应于人STING的那些的相应基因座中含有任何组成型STING激活和功能获得性突变，如上文所述(见实施例17，其提供了示例比对和各物种中相对应的突变，也见图1-13)。
在其它实施方案中，提供了STING蛋白的嵌合体。在嵌合体中，第一物种STING蛋白的CTT区域或其赋予或参与NF-κB信号传导/活性的部分被来自第二物种的相应CTT或其部分置换，第二物种的STING蛋白具有较低的或极少的、低于人STING的NF-κB信号传导活性。通常，第一物种是人，所述置换CTT或其部分来自如袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼和鬼鲨等物种的STING，具有更低的NF-κB活性。这因此获得诱导I型干扰素的STING蛋白，其对于抗肿瘤活性很重要，并且具有有限的或没有在抗肿瘤疗法中不希望的NF-κB活性。所述嵌合体可以进一步包括在相应基因座中的组成型STING激活和功能获得性突变，以增加或提供I型干扰素组成型活性。在所有实施方案中，可以缺失TRAF6结合基序以进一步降低或消除在抗肿瘤治疗剂中不期望的活性。
这些非人STING蛋白、嵌合体和突变体在递送载体中提供，例如本文描述的或本领域技术人员已知的任何递送载体，包括溶瘤病毒载体、细胞(例如用于细胞疗法的干细胞和T细胞)、外来体、微细胞、脂质体和本文提供的免疫刺激细菌，其在肿瘤驻留免疫细胞中积累，并将编码的蛋白质递送至肿瘤微环境和肿瘤。非人STING蛋白、修饰的STING蛋白和嵌合体用作治疗剂，用于在如本文所述或本领域技术人员已知的其它方法中治疗肿瘤。还提供了含有STING蛋白、递送载体和编码核酸的药物组合物。
d.充当胞质DNA/RNA传感器的其它基因产物及其组成型变体
感知或与胞质核酸相互作用的其它基因产物是视黄酸可诱导的基因I(RIG-I)样受体(RLR)，包括RIG-I和MDA5(黑色素瘤分化相关蛋白5)。RLR是病毒dsRNA和细菌分泌的核酸的胞质传感器，以及包括RIG-I、MDA5和LGP2(遗传生理学实验室laboratory ofgenetics and physiology 2)。基于如病毒dsRNA等配体的结合，RIG-I和MDA5激活线粒体抗病毒信号传导适配蛋白或MAVS，其募集肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF)，以在线粒体外膜组装信号传导复合体。下游信号传导组分进一步被TRAF募集，导致IRF3(干扰素调节因子3)、IRF-7、NF-κB(活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子)以及AP-1(激活蛋白1)的磷酸化和激活。结果，诱导了干扰素、促炎细胞因子和参与病原体清除的其它基因的表达(见例如Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。与STING一样，由于功能获得性突变所致MDA5和RIG-I的组成型激活导致I型IFN的诱导，其可用于增强免疫刺激细菌的抗肿瘤免疫反应。
i.RIG-I
视黄酸可诱导的基因I(RIG-I)，也称为DDX58(DEXD/H-盒解旋酶58)是其组成型激活与如非典型Smith-Magenis综合征等干扰素疾病的发展有关的另一种蛋白质。RIG-I，与MDA5/IFIH1一样，是RIG-I样受体(RLR)家族的成员，以及是925个残基的胞质模式识别受体，在病毒dsRNA的检测中起作用。RIG-I通过促进I型和III型干扰素和促炎细胞因子表达的独立途径启动对病毒RNA的先天免疫应答(见例如Jang et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:266-274；和Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。
非典型Smith-Magenis综合征，没有标志性的牙齿异常，但具有可变的表型，包括青光眼、主动脉钙化和骨骼异常，已发现其是由DEXD/H-盒解旋酶58基因(DDX58)中的突变引起的，其编码视黄酸可诱导的基因I(RIG-I)。特别地，DDX58中的E373A和C268F突变被鉴别为导致RIG-I中的功能获得。突变的DDX58数量增加与NF-κB报道基因活性基础水平的显著增加有关，以及这种活性通过dsRNA类似物poly(I:C)刺激而进一步增加。RIG-I突变还在基础水平诱导IRF-3磷酸化和二聚化，并导致IFNB1、干扰素刺激基因15(ISG15)和趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)在基础的和poly(I:C)转染的HEK293FT细胞中的表达均增加。这些结果表明突变的DDX58/RIG-I导致组成型激活，导致增加的IFN活性和IFN刺激的基因表达(见例如Jang et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:266-274；和Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激细菌可以被修饰为编码具有功能获得性突变的RIG-I/DDX58(SEQ ID NO:311)，所述功能获得性突变例如但不限于E373A和C268F(单独或组合的)。
ii.MDA5/IFIH1
另一个干扰素疾病基因是具有含有解旋酶C结构域的蛋白1诱导的IFN(IFIH1)，也称为黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)，其是细胞质DExD/H盒RNA受体的RIG-I样家族成员。MDA5由IFIH1编码，是一种1025个氨基酸的细胞质模式识别受体，其感测细胞质中的病毒双链RNA(dsRNA)和分泌的细菌核酸，并通过适配分子MAVS(线粒体抗病毒信号传导蛋白)激活I型干扰素信号传导。MAVS募集肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF)，进而募集下游信号传导组分，导致IRF-3(干扰素调节因子3)、IRF-7、NF-κB(活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子)和AP-1(激活蛋白1)的磷酸化和活化。这样导致了干扰素、促炎细胞因子和参与病原体清除的其它基因的表达(见例如Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282；Rice et al.(2014)Nat.Genet.46(5):503-509；and Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。
功能获得性(GOF)IFIH1变体发生在患有自身免疫性病症的患者中，包括Aicardi-Goutiéres综合征(AGS)和Singleton-Merten综合征(SMS)，其特征在于显著的血管炎症。AGS是一种炎症性疾病，特别影响大脑和皮肤，且其特征在于干扰素诱导的转录物的上调。AGS通常是由于编码DNA外切核酸酶TREX1、RNase H2内切核酸酶复合物的3个非等位基因组分、三磷酸脱氧核苷三磷酸水解酶SAMHD1和双链RNA编辑酶ADAR1的任何基因中的突变所致而发生的。一些患有AGS的患者在任何这6个基因中没有突变，但IFIH1中有GOF突变，表明这个基因也与AGS有关。Singleton-Merten综合征(SMS)是一种常染色体显性遗传疾病，其特征在于异常的血管(如钙化)、牙齿(如早发性牙周炎、牙根吸收)和骨骼(如骨质减少、肢端骨质溶解、骨质疏松)。Singleton-Merten综合征患者中干扰素特征基因上调，这与IFIH1中的GOF突变有关(见例如Rice et al.(2014)Nat.Genet.46(5):503-509；和Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282)。
在表达低水平内源性病毒RNA受体的HEK293T细胞中比较了在AGS患者中鉴别的野生型IFIH1和6种IFIH1 GOF突变体(R720Q、R779H、R337G、R779C、G495R、D393V)的IFN-β报道子刺激活性。野生型IFIH1基于长的(>1kb)dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyI:C)结合被诱导，但不被短的162bp的dsRNA诱导，并且在没有外源RNA的情况下具有较低活性。除了应答polyI:C的强大信号传导外，IFIH1突变体还示出对162bp短dsRNA应答的显著诱导IFN信号传导。在没有外源配体的情况下，所述突变体也表现出高4至10倍的基线信号传导活性(见例如Rice et al.(2014)Nat.Genet.46(5):503-509)。
另一个功能获得性IFIH1突变R822Q被鉴别为通过触发I型干扰素产生引起Singleton-Merten综合征，并导致早期动脉钙化以及牙齿炎症和吸收。HEK293T细胞(其具有最低的内源性IFIH1表达水平)用于过表达野生型和R822Q MDA5。野生型IFIH1表达导致IFNB1(干扰素，β1，成纤维细胞)以剂量依赖性方式表达增加，而突变的IFIH1导致IFNB1表达增加约20倍。在用dsRNA类似物poly(I:C)刺激后，R822Q IFIH1较野生型IFIH1导致IFNB1高水平表达，表明R822Q IFIH1对非自身dsRNA过度活跃。在Singleton-Merten综合征患者的全血样本中干扰素特征基因如IFI27、IFI44L、IFIT1、ISG15、RSG15、RSAD2和SIGLEC1的表达也较高，这与通过R822Q IFIH1的IFNB1的较高表达水平一致(见例如Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282)。
在具有另一种IFIH1 GOF突变A489T的患者中观察到的干扰素特征指示I型干扰素疾病；IFIH1 A489T与增加的干扰素产生和类似于冻疮狼疮、AGS和SMS的表型有关(见例如Bursztejn et al.(2015)Br.J.Dermatol.173(6):1505-1513)。A489T变体不仅在用长dsRNA类似物poly(I:C)刺激后导致IFN诱导，用短dsRNA刺激也如此。在具有SMS表型的患者中发现IFIH1中两个另外的功能获得性突变，T3311和T331R，这些患者表现为IFN诱导的转录物显著上调。T3311和T331R变体导致IFN-β表达增加，即使在没有外源dsRNA配体的情况下，这与观察到的MDA5的组成型激活一致(见例如Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。
A946T是另一种IFIH1 GOF突变，导致I型干扰素的产生增加，促进炎症并增加自身免疫的风险。IFIH1中的A946T突变当与TMEM173 R232等位基因和G207E GOF突变结合时产生累加效应，导致严重的早发表型，其特征类似于SAVI(见例如Keskitalo et al.(2018)preprint,，得自doi.org/10.1101/394353)。G821S是IFIH1中的GOF突变，已被证实导致小鼠模型中自发进展的狼疮样自身免疫症状(见例如Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282)，而在患有AGS的个体中鉴别的IFIH1错义突变A452T、R779H和L372F示出导致I型干扰素过量产生(见例如Oda et al.(2014)Am.J.Hum.Genet.95:121-125)。
本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激细菌可以被修饰为编码具有选自如下(单独或任意组合的)功能获得性突变的MDA5/IFIH1(SEQ ID NO:310)：T331I，T331R，R337G，L372F，D393V，A452T，A489T，G495R，R720Q，R779H，R779C，G821S，R822Q和A946T。
iii.IRF7
IRF7(或IRF-7)的组成型活性形式包括其中不同的C末端丝氨酸被拟磷酸Asp取代的突变体，包括IRF-7(S477D/S479D)、IRF-7(S475D/S477D/S479D)和IRF-7(S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D)。IRF-7(S477D/S479D)是IFNA和RANTES基因表达的强反式激活物，并且刺激基因表达，即使在没有病毒感染的情况下。IRF-7(S475D/S477D/S479D)和IRF-7(S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D)没有进一步增强IRF-7(S477D/S479D)的反式激活活性，但是所有3个突变体的反式激活活性都受到病毒感染的进一步刺激。位于未感染细胞的细胞核的突变体IRF-7(Δ247-467)是IRF7的一种非常强的组成型形式；其在未受刺激和病毒感染的细胞中激活的转录比野生型IRF-7高1500倍以上(见例如Lin et al.(2000)J.Biol.Chem.275(44):34320-34327)。
本文提供的免疫刺激细菌可以编码和表达组成型活性IRF7突变体，包括在残基475-477、479、483和487处具有置换的那些突变体，以及具有氨基酸缺失的那些突变体。所述免疫刺激细菌在由哺乳动物宿主(包括人)识别的启动子和任何其它希望的调节信号控制下在质粒上编码这些蛋白质。
e.其它I型IFN调节蛋白
参与识别激活I型IFN应答的DNA/RNA的其它蛋白质可以突变以产生组成型I型IFN表达。未修饰的和/或修饰的蛋白质可以在本文提供的免疫刺激细菌中编码，以用于将蛋白质递送至肿瘤微环境如递送至肿瘤驻留免疫细胞，以增加I型干扰素的表达。
这些蛋白质包括但不限于如下名称的蛋白质：TRIM56，RIP1，Sec5，TRAF2，TRAF3，TRAF6，STAT1，LGP2，DDX3，DHX9，DDX1，DDX21，DHX15，DHX33，DHX36，DDX60和SNRNP200。
Figure GDA0004138988600000851
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Figure GDA0004138988600000861
可以产生功能获得变体，例如通过筛选和/或通过诱变。可以在体外进行定点诱变，以鉴别具有增强活性的突变，其导致I型IFN更高水平表达和/或组成型表达。完整的基因组DNA可得自经历自身免疫和自身炎症症状的非相关患者及得自健康个体，以筛选和鉴别其表达导致I型IFN表达增加或组成型表达的其它产物。可以进行全外显子组测序，并且可以分析内含子和外显子，从而鉴别在与I型干扰素增加的或组成型表达相关的途径中具有突变的蛋白质。在鉴别突变后，将编码全长基因的cDNA分子(带有或不带有鉴别的突变)转染进报告细胞系中，其测量I型干扰素的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达置于IFN-β的启动子控制下。组成型活性的功能获得性突变体将促进IFN-β的表达，而未受刺激的野生型蛋白则否。刺激可以通过病毒感染、细菌感染、细菌核酸、LPS、dsRNA、poly(I:C)或通过增加蛋白质配体(例如CDN)的外源水平来实现。鉴定的蛋白质还包括增强针对对象中感兴趣的抗原的免疫应答的蛋白质。所述免疫应答包括细胞或体液免疫应答，其特征在于如下一项或多项：(i)刺激I型干扰素信号传导途径；(ii)刺激NF-κB信号传导途径；(iii)刺激炎症应答；(iv)刺激细胞因子产生；(v)刺激树突状细胞发育、活性或动员；(vi)表示产物的表达增强免疫应答的任何其它应答；以及(vii)前述(i)至(vi)的任何组合。
4.抗体和抗体片段
抗体工程化的进步导致了重组抗体片段的产生，这些片段比传统的单克隆抗体有许多改进，特别是在制备、组织渗透和易用性方面。其中的一个实例是单链片段可变区(scFv)，由抗体结合位点的重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成，通过通常为(G4S)3序列的灵活性肽接头连接在一起(见例如Weisser et al.(2009)Biotechnol.Adv.27(4):502-520)。其它实例包括scFv-Fc抗体片段，其中scFv的VH结构域与Fc区连接。诸如这种的抗体片段使得可以以如本文所示例的可在质粒上编码并由免疫刺激细菌递送的方式靶向抗原。靶向的潜在抗原的实例包括但不限于以下所列。
a.TGF-β
转化生长因子β(TGF-β)是一种在胚胎形成、伤口愈合、血管生成和免疫调节中具有多种作用的多效细胞因子。其以三种同种型存在于哺乳动物细胞中，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1是免疫细胞中最主要的(见例如Esebanmen et al.(2017)Immunol.Res.65:987-994)。TGF-β作为免疫抑制剂的作用可以说是其最主要的功能。特别是，其在肿瘤微环境中以潜在形式激活，对DC及其耐受抗原特异性T细胞的能力具有深远的免疫抑制作用。TGF-β还可以直接将Th1 CD4+ T细胞转化为免疫抑制性Treg，进一步提高肿瘤耐受性(见例如Travis et al.(2014)Annu.Rev.Immunol.32:51-82)。基于其肿瘤特异性免疫抑制功能，无论其已知的癌细胞生长和转移促进性质如何，TGF-β的抑制都是癌症治疗的靶点。已经在几种人肿瘤类型中证实了高水平的TGF-β信号传导，包括结直肠癌(CRC)、肝细胞癌(HCC)、胰腺导管腺癌(PDAC)和非小细胞肺癌(NSCLC)(见例如Colak et al.(2017)Trends Cancer3(1):56-71)。TGF-β的全身施用抑制作用可导致不可接受的自身免疫毒性，其抑制作用应局限于肿瘤微环境。实现此目的的一种方法是产生可溶性TGF-β受体，该受体充当结合TGF-β的诱饵(见例如Zhang et al.(2008)J.Immunol.181:3690-3697)。因此，本文提供的含有TGF-β受体诱饵的肿瘤靶向免疫刺激细菌可以结合并从肿瘤微环境中去除TGF-β，从而破坏肿瘤免疫耐受并刺激抗肿瘤免疫。
除了TGF-β结合诱饵受体之外，可以结合并从肿瘤微环境中去除TGF-β从而破坏肿瘤免疫耐受并刺激抗肿瘤免疫的其它TGF-β多肽拮抗剂，包括抗TGF-β抗体或抗体片段、抗TGF-β受体抗体或抗体片段、和可溶性TGF-β拮抗剂多肽。
本文提供了在肿瘤微环境中、在肿瘤中、特别是在肿瘤驻留免疫细胞中积累的免疫刺激细菌，其含有编码TGF-β多肽拮抗剂的质粒，包括例如TGF-β结合诱饵受体(TGF-β结合诱饵受体-β受体诱饵)，抗TGF-β抗体或抗体片段，抗TGF-β受体抗体或抗体片段，和可溶性TGF-β拮抗剂多肽。抗体片段可包括本领域已知的或本文描述的任何抗体片段，例如但不限于scFv和scFv-Fc。
b.双特异性scFvs和T细胞衔接器(engager)
通过增加与靶结合的效价改良scFv的使用，通常通过使用由长接头连接在一起的一个或多个scFv片段(双特异性、三特异性等)。双特异性T细胞衔接器(以商标
Figure GDA0004138988600000881
销售)构建体是一类用于癌症免疫治疗的人工双特异性单克隆抗体，通过连接两个单链可变片段(scFv)形成，由此一个scFv结合细胞毒性T细胞表面的CD3，另一个scFv结合特异性肿瘤相关抗原。因此，/>
Figure GDA0004138988600000882
独立于MHCI类或共刺激分子将T细胞靶向肿瘤细胞，刺激T细胞活化、细胞因子产生和肿瘤细胞细胞毒性。/>
Figure GDA0004138988600000883
的两个实例已获得FDA批准，包括针对肿瘤抗原EpCAM和CD3的卡妥索单抗(catumaxomab)，用于治疗恶性腹水，以及针对CD19和CD3的
Figure GDA0004138988600000884
抗体贝林妥欧单抗(blinatumomab)，用于治疗复发性难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)(见例如Ahamadi-Fesharaki et al.(2019)Mol.Ther.Oncolytics 14:38-56)。其它
Figure GDA0004138988600000885
靶向其它抗原，包括癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、EGFR、EphA2、Her2、ADAM17/TACE、前列腺干细胞抗原(PSCA)和黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。如本文所例示的，/>
Figure GDA0004138988600000886
抗体也可以在通过免疫刺激细菌递送后从质粒表达。
c.抗-PD-1/抗-PD-L1抗体
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种免疫抑制受体，参与免疫反应的负调控。其同源配体程序性死亡配体1(PD-L1)在抗原呈递细胞(APC)上表达，与T细胞上的PD-1结合后导致CD8+ T细胞效应功能丧失，诱导T细胞耐受性。在某些人体癌症中，PD-L1的表达通常与肿瘤侵袭性和存活率降低有关(见例如Gao et al.(2009)Clin.Cancer Res.15(3):971-979)。
旨在阻断免疫检查点的抗体，例如抗PD-1(例如，pembrolizumab和nivolumab)和抗PD-L1(例如，atezolizumab、avelumab和durvalumab)抗体，可以防止T细胞无反应性和破坏免疫耐受。然而，只有一小部分接受治疗的患者表现出临床益处，而那些确实表现出临床益处的患者通常会出现与自身免疫相关的毒性(见例如Ribas(2015)N.Engl.J.Med.373(16):1490-1492；和Topalian et al.(2012)N.Engl.J.Med.366(26):2443-2454)。除了获得毒性外，抗PD-1/抗PD-L1治疗通常会导致耐药性，同时使用抗CTLA-4抗体(例如，易普利姆玛ipilimumab)在临床试验中显示出有限的成功，具有显着的附加毒性。为了限制毒性和增强PD-1/PD-L1阻断的效力，含有编码抗体或抗体片段例如scFv或scFv-Fc的质粒的免疫刺激细菌以及本领域已知或本文描述的针对PD-1或PD-L1的其它制剂，将协同激活免疫细胞以增强抗肿瘤免疫。
d.抗-CTLA-4抗体
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152(分化簇152)，是另一种免疫抑制受体，可作为免疫检查点，并下调免疫反应。CTLA-4在调节性T细胞(Tregs或Tregs)中组成型表达，并有助于其抑制功能，但仅在激活后在常规T细胞中上调。CTLA-4通过将抑制信号传递给T细胞发挥免疫检查点的作用。CTLA-4与T细胞共刺激蛋白CD28同源，这两种分子均与CD80(也称为B7-1或B7.1)和CD86(也称为B7-2或B7.2)配体在抗原呈递细胞(APC)上结合。CTLA-4与配体的结合将抑制信号传递给T细胞，而CD28的结合传递刺激信号。
T细胞活化后，CTLA-4受体被诱导，然后与T细胞上的CD28受体竞争结合APC表面上的CD80和CD86配体。CTLA-4以比CD28更高的亲和性和亲和力与CD80和CD86结合，从而使其在与配体结合方面胜过CD28。从而使其对于配体上胜过CD28，从而将抑制信号传递给T细胞，并产生免疫抑制反应。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4表达增加。
最佳T细胞启动需要T细胞CD28与CD80和/或CD86连接产生的共刺激信号。因此，阻断CTLA-4与这些配体的结合增强了T细胞启动，并允许诱导抗肿瘤免疫反应。
在一些实施方案中，本文提供的免疫刺激细菌菌株含有含编码抗-CTLA-4抗体的质粒，包括其片段，例如但不限于抗-CTLA-4scFvs(见例如示例的人抗-CTLA-4scFv片段的SEQ ID NO:403))和抗-CTLA-4scFv-Fcs(参见例如示例的人抗-CTLA-4scFv-Fc片段的SEQID NO:402；也参见实施例20)。
e.其它示例的检查点靶
针对其可以制备或示例的scFv或任何其它重组抗体片段的示例免疫检查点靶，包括但不限于下表中列出的那些：
Figure GDA0004138988600000891
5.免疫调节蛋白的组合可以具有协同效应和/或互补效应
细胞因子是抗肿瘤免疫反应的强力调节剂。已知细胞因子组合对涉及T细胞、NK细胞和骨髓细胞(包括树突状细胞和巨噬细胞)的不同免疫区室具有深远的协同效应。已知细胞因子在树突状细胞的抗原引发、先天免疫细胞和抗原特异性T细胞的存活和增殖以及NK细胞和T细胞的细胞毒活性中起主要作用。必须正确选择细胞因子组合，以最大限度地提高生物反应并增强抗肿瘤免疫性。例如，在小鼠肝炎模型中，发现单独的IFN-α可增强病毒感染细胞的CD8+ T细胞的细胞溶解功能，而单独的IL-15可增强活化淋巴细胞的增殖。它们一起最大程度地抑制了乙型肝炎(HBV)感染(见例如Di Scala et al.(2016)J.Virol.90(19):8563-8574)。在另一个实施例中，细胞因子的组合IL-15+IL-18和IL-15+IL-21能增强人NK细胞和T细胞产生IFN-γ(见例如Strengell et al.(2003)J.Immunol.170(11):5464-5469)。在另一个实例中，IL-2+IL-18协同作用以增强IFN-γ的产生并增加CD4+ T细胞、CD8+T细胞和NK淋巴细胞的细胞溶解功能(见例如Son et al.(2001)Cancer Res.61(3):884-888)。此外，发现IL-12和IL-18可协同促进人T细胞以抗原-CD3T细胞连接非依赖形式产生IFN-γ(见例如Tominaga et al.(2000)Int.Immunol.12(2):151-160)。细胞因子的组合是T细胞功能的强力增强剂，但FDA批准的抗癌细胞因子毒性太大，不能全身给药，因此很少使用，全身施用的细胞因子组合只会增加毒性(见例如Conlon et al.(2019)J.InterferonCytokine Res.39(1):6-21)。
本文提供的免疫刺激细菌解决了这些问题。提供了含有编码多种治疗产物例如免疫调节蛋白的质粒的免疫刺激细菌，其允许肿瘤特异性递送细胞因子组合和/或与其它治疗产物的组合，例如本文讨论的I型干扰素诱导剂等，包括共刺激分子、趋化因子和抗体及其片段。这些免疫刺激细菌实现了强力和协同的免疫激活作用，而没有与直接IV施用细胞因子和其它治疗产物相关的全身毒性和药代动力学(PK)倾向。
可以在本文提供的免疫刺激细菌中在质粒上编码的治疗产物的组合包括但不限于例如两种或更多种细胞因子；一种或多种细胞因子和I型IFN的诱导剂(例如，STING、IRF3、IRF7、MDA5、RIG-I及其组成型活性GOF变体)和/或共刺激分子(例如，4-1BBL、4-1BBLΔcyt和本文讨论的4-1BBL的其它变体)；TGF-β诱饵受体和一种或多种细胞因子；TGF-β诱饵受体和I型IFN诱导剂；TGF-β诱饵受体，一种或多种细胞因子，和/或I型IFN诱导剂，和/或共刺激分子；抗体(例如，针对免疫检查点如CTLA-4)和一种或多种细胞因子；抗体和I型IFN诱导剂；抗体、一种或多种细胞因子和/或I型干扰素诱导剂和/或共刺激分子；共刺激分子激动剂(例如CD40激动剂)和一种或多种细胞因子；共刺激分子激动剂和I型IFN的诱导剂；以及共刺激分子激动剂，一种或多种细胞因子，和/或I型IFN的诱导剂，和/或共刺激分子。
如下文所讨论的，多治疗产物表达盒可以包括单启动子构建体和/或双重/多重启动子构建体，以及转录后调控元件，和其它调控元件，例如增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、信号肽等。可以对核酸序列进行密码子优化以增加蛋白质表达，并且通常在真核启动子的控制下。特定构建体及其细节在本文别处描述。
本文提供的免疫刺激细菌包括含有质粒的那些细菌，所述质粒编码免疫刺激蛋白(例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子)、和/或具有增加肿瘤微环境中的免疫反应的功能获得突变的基因产物(例如诱导I型IFN的胞质DNA/RNA传感器)，和/或其抗体及其片段，和/或增强抗肿瘤反应的其它治疗产物，例如TGF-β和/或IL-6诱饵受体，和/或TGF-β拮抗多肽。这些编码细胞因子、功能获得产物/I型IFN途径蛋白和/或趋化因子和/或共刺激分子和/或抗体及其片段例如单链抗体及其它本文讨论的治疗产物的免疫刺激细菌，包括优先侵润肿瘤微环境、肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞的免疫刺激细菌。所述免疫刺激细菌还包括基因组被修饰的那些细菌，从而其在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡，由此所述免疫刺激细菌在肿瘤驻留骨髓细胞中积累，以实现在靶细胞中多重遗传有效载荷的高水平异位表达，并将治疗产物/免疫调节蛋白递送至肿瘤微环境(TME)，以激发针对肿瘤的免疫反应。具体而言，本文提供的免疫刺激细菌包括多达约8种或8种如本文所述的修饰，包括但不限于腺苷营养缺陷型、csgD-、pagP-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、purI-、ansB-、asd-和本文所述或已知的任何其它修饰，以改善靶向肿瘤微环境和/或肿瘤驻留骨髓细胞或积累于之中，或改善安全性和耐受性(允许更高剂量)，降低免疫抑制细胞因子谱，改善T细胞质量和功能，限制在健康组织中的复制，消除生物膜和改善抗肿瘤免疫反应，或赋予本文其它地方讨论的任何希望的和有利的性质。
所述免疫刺激细菌还可以编码其它治疗产物，例如来自受试者肿瘤的肿瘤抗原，以增强对特定肿瘤的反应。本文提供的和上下文描述的任何免疫刺激细菌均可以被修饰以编码治疗产物，例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子和功能获得I型IFN途径产物。所述治疗产物在宿主识别的启动子和真核生物如人或其它动物或哺乳动物受试者中识别的任何其它所需调节序列的控制下在质粒上编码。通常，编码产物的核酸处于RNA聚合酶II启动子的控制之下。此外，本文所述用于修饰的任何细菌，例如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、双歧杆菌属(Bifidobacteriae)、立克次氏体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、李斯特菌属(Listeria)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、博德特氏菌属(Bordetella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、气单胞菌属(Aeromonas)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、霍乱菌属(Cholera)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、布鲁氏菌属(Brucella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、军团菌属(Legionella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)，或其减毒菌株，或其修饰菌株，均可以通过在细菌中引入含有或在质粒上编码在宿主识别的RNA聚合酶启动子控制下编码治疗产物的核酸的质粒来修饰。治疗产物在受感染受试者的细胞中表达。免疫刺激细菌包括如本文所述被修饰以在肿瘤、TME和/或肿瘤驻留骨髓细胞中积聚或优先感染的那些细菌。例如，编码导致I型干扰素(IFN)例如IFN-β和/或本文讨论的其它治疗产物表达或组成型表达的功能获得产物的免疫刺激细菌，进一步被修饰为具有降低的感染上皮细胞的能力或没有这个能力，但能够感染吞噬细胞，包括肿瘤驻留免疫细胞，和/或所述免疫刺激细菌被修饰以使其不杀死受感染的吞噬细胞。
如本文所述，参与SPI-1途径的基因和鞭毛激活吞噬细胞(免疫细胞)中的炎性体，引发细胞焦亡。敲除SPI-1基因和编码鞭毛的基因，减少或消除了吞噬细胞的焦亡，同时消除上皮细胞的感染，导致吞噬细胞的感染增加。提供了在吞噬细胞中积累的免疫刺激细菌，特别是肿瘤驻留免疫细胞，例如髓源抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和树突状细胞(DC)，其中它们表达在真核启动子控制下在质粒上编码的遗传有效载荷/治疗产物，例如由RNA聚合酶II识别的那些启动子，并包括如本文所讨论的其它真核调节信号。表达的治疗产物包括那些引起免疫反应的产物，例如通过增加或诱导I型干扰素的途径，从而增加肿瘤微环境中的宿主反应。所述免疫刺激细菌还可以编码免疫刺激蛋白，例如IL-2和/或其它细胞因子，和/或其它免疫刺激蛋白和治疗产物，如本文所讨论的，进一步增强肿瘤微环境中的免疫反应。
所述免疫刺激细菌可以编码产物，称为胞质DNA/RNA传感器，当暴露于细胞胞质中的核酸(例如RNA、DNA、核苷酸、二核苷酸、环核苷酸、环二核苷酸和其它这种分子)时会引发免疫反应。本文中的免疫刺激细菌编码组成型引起免疫反应的修饰的治疗产物，并且不需要在胞质中存在DNA/RNA。这样的示例是诱导I型干扰素表达的途径的组分。本文考虑的治疗产物包括这些胞质DNA/RNA传感器的修饰形式，其具有组成型活性或增加的活性(即功能获得产物)，使得I型干扰素在细胞胞质中不存在核苷酸、二核苷酸、环状核苷酸、环状二核苷酸和其它这种配体的情况下表达或产生。这些修饰产物在细胞中的表达，特别是在肿瘤细胞、包括肿瘤驻留免疫细胞中的表达，导致I型干扰素、包括干扰素-β在肿瘤微环境中的组成型表达。由于表达这些功能获得性产物的免疫刺激细菌在肿瘤细胞/TME/肿瘤驻留免疫细胞中积累或优先感染，因此所述治疗产物在肿瘤微环境中表达，导致肿瘤微环境中的免疫反应增加。
可以在免疫刺激细菌和其它载体中编码的示例基因产物包括但不限于感知或参与识别胞质DNA/RNA并激活I型干扰素产生的先天途径的蛋白质。参与先天DNA/RNA识别并激活I型干扰素的蛋白质包括但不限于：STING，RIG-I，MDA5，IRF3，IRF7，TRIM56，RIP1/RIPK1，Sec5/EXOC2，TRAF2，TRAF3，TRAF6，STAT1，LGP2/DHX58，DDX3/DDX3X，DHX9/DDX9，DDX1，DDX21，DHX15/DDX15，DHX33/DDX33，DHX36/DDX36，DDX60和SNRNP200。导致组成型I型干扰素表达的任何这些蛋白质中的功能获得性突变是已知的或可以被鉴定的，并且可以通过免疫刺激细菌将突变体递送到肿瘤微环境，例如通过感染吞噬细胞或通过靶向和结合肿瘤细胞而递送。
功能获得性突变包括从患有由组成型I型干扰素表达引起的疾病的个体中鉴定的突变。功能获得性产物的示例是出现在患有干扰素病的受试者中的那些产物。如上所述，突变可以通过筛选来鉴定，也可以产生功能获得性产物。
可以进一步修饰编码治疗产物的核酸以改善表达性质。修饰包括例如密码子优化以提高在哺乳动物、特别是人受试者中的转录效力，例如降低GC含量或CpG二核苷酸含量，去除隐蔽剪接位点，添加或去除(通常去除)CpG岛以改善在真核细胞中表达，并置换TATA盒和/或末端信号以提高转录效力。可以通过改变密码子使用偏差、降低GC含量、减少mRNA二级结构、去除过早的PolyA位点、去除RNA不稳定性基序(ARE)、降低mRNA的稳定自由能、修改内部chi位点和核糖体结合位点及减少RNA二级结构来优化密码子以提高翻译效力。用于改善表达以及维持或增强细菌适应性的其它修饰已被掺入所述免疫刺激细菌中。这些修饰在以下部分中进行了描述，并在以下工作实施例中进行了详细描述和举例说明。
如上所述，由宿主识别胞质核酸(例如单链和双链RNA、环二核苷酸(CDN)和其它这种形式的核酸)介导的I型干扰素诱导途径诱导I型IFN。还存在Toll样受体(TLR)非依赖性I型IFN途径，由宿主识别胞质中的单链(ss)和双链(ds)RNA介导。这些由RNA解旋酶感知，包括视黄酸诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)，以及通过IFN-β启动子刺激物1(IPS-1)衔接器介导的磷酸化IRF3转录因子，导致IFN-β的诱导(见例如Ireton andGale(2011)Viruses 3(6):906-919)。如本文所讨论的，这些途径中的蛋白质可以被修饰，或可以作为变体存在，导致I型干扰素(也称为1型干扰素)的组成型表达，所述干扰素包括IFN-α和IFN-β。这种蛋白质的示例是本文提供的修饰的STING多肽，包括具有导致I型干扰素组成型表达的突变从而干扰素在不存在诱导的情况下表达的那些多肽，以及嵌合STING蛋白，例如在其中C末端尾区(CTT)部分被来自第二物种的STING蛋白的CTT部分置换的那些嵌合蛋白，其中第二物种的STING蛋白具有比人STING的NF-κB信号传导活性低的NF-κB信号传导活性，以及CTT中的TRAF6结合位点任选被缺失。
使用本文提供的免疫刺激细菌的疗法可以与任何其它抗癌疗法组合，包括检查点抑制剂疗法以及如上文和本文其它地方所讨论的其它癌症疗法和化学疗法。
6.递送组合疗法的免疫刺激细菌
本文的免疫刺激细菌可用于提供一种以上的治疗产物，特别是那些用于抗癌治疗的产物。一般来说，这些产物是增强和重新编程抗肿瘤免疫反应的互补产物。所述免疫刺激细菌，凭借本文所述的基因组修饰，特别是asd-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、csgD-、purI-、腺苷营养缺陷、msbB-、ansB-中的几种或全部的组合以及本文别处描述的或本领域技术人员已知的任何其它修饰，积累在肿瘤微环境(TME)中并感染肿瘤驻留免疫细胞(骨髓细胞)。所述免疫刺激细菌含有在宿主识别的一个或多个启动子以及在真核生物如人或其它动物或哺乳动物受试者中识别的任何其它所需调节序列的控制下编码互补治疗产物的质粒，以实现编码产物的表达以及所述产物的分泌。所述免疫刺激细菌积累在TME、特别是在肿瘤驻留免疫细胞中，包括髓源抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和树突状细胞(DC)，其中编码的治疗产物被表达，然后分泌到肿瘤微环境中，达到抗肿瘤作用。通过产物的适当组合，可以通过各种产物与宿主免疫系统的相互作用来增强抗肿瘤作用。
如本文其它地方所讨论的，含有编码治疗产物的质粒、具有单个启动子和开放阅读框(ORF)的免疫刺激细菌可以通过使用帽非依赖性病毒内部核糖体进入位点(IRES)或通过2A肽(例如T2A、P2A、E2A或F2A)的翻译通读，以及随后自我切割成同等表达的辅蛋白而表达两种(或多种)蛋白质。或者，可以使用双重或多重启动子构建体表达遗传有效载荷/治疗产物，其中每种蛋白质在单独启动子的控制下表达。质粒上也可以包括单个和双重/多重启动子构建体的组合，以表达三种或更多种蛋白质。通常，编码治疗产物的核酸处于RNA聚合酶II启动子的控制之下。例如，启动子包括但不限于EF-1α、CMV、SV40、UBC、CBA、PGK、GUSB、GAPDH、EIF41A、CAG、CD68和合成MND启动子。质粒可以含有在本文别处描述或本领域技术人员已知的其它调控元件，例如转录后调控元件(PREs；例如，WPRE、HPRE)、多聚腺苷酸化信号序列、终止子、增强子、分泌信号(也称为信号肽/序列、前导肽/序列)、DNA核靶向序列(DTS)和其它调控元件，其可以增强或增加编码的治疗产物的表达和/或分泌。
质粒上编码的遗传有效载荷或治疗产物包括免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子和共刺激分子；诱导I型IFN及其功能获得/组成型活性突变体的胞质DNA/RNA传感器；抗体及其片段；双特异性T细胞衔接器
Figure GDA0004138988600000931
可溶性TGF-β受体，用作结合TGF-β的诱饵或TGF-β拮抗多肽；IL-6结合诱饵受体；干扰RNA(例如siRNA、shRNA、miRNA)；以及下文和本文其它地方讨论的以及本领域已知的其它治疗产物；以及所有前述治疗产物的互补组合。在一些实施方案中，细胞因子可以在免疫刺激细菌内的质粒上编码，具有膜锚定基序，例如跨膜结构域和胶原蛋白结合结构域。
可在质粒上编码的免疫刺激蛋白，包括细胞因子，趋化因子和共刺激分子，包括但不限于IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，干扰素-α，干扰素-β，与IL-2结合减弱的IL-2Ra，经修饰不与IL-2Ra结合的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，参与或影响或增强T细胞募集和/或持久性的蛋白质结合，CD40，CD40配体(CD40L)，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，具有胞质结构域缺失的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，ICOS，CD27，B7-CD28家族成员和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。免疫刺激蛋白还包括截短的共刺激分子，例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L，具有全长胞质结构域，或具有截短的、或部分的、或部分具有确保正确定向的修饰的胞质结构域缺失，所述胞质结构域在抗原呈递细胞(APC)上表达，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于胞质结构域缺失而不能向APC发出反调节信号。
诱导或激活I型IFN产生的胞质DNA/RNA传感器包括但不限于STING、RIG-I、MDA5、IRF3、IRF5和IRF7，以及其功能获得(GOF)或组成型活性变体。其它参与识别激活I型IFN反应的DNA/RNA的蛋白质，可以被突变以产生I型IFN组成型表达并可以在质粒上编码，包括但不限于TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF2、TRAF3、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
可在由本文的免疫刺激细菌递送的质粒上编码或可与所述细菌共同施用的增强或增加抗肿瘤反应的其它治疗产物包括但不限于抗体及其片段，例如TGF-β抑制性抗体；抗IL-6抗体；针对检查点抑制剂的抗体，例如PD-1、PD-L1和CTLA-4；以及针对VEGF、CD73、CD38、Siglec-15、EGFR、Her2、间皮素和BCMA的抗体或抑制剂。还预期在质粒上表达或与本文的免疫刺激细菌共同施用的是双特异性T细胞衔接器
Figure GDA0004138988600000941
IL-6结合诱饵受体、TGF-β结合诱饵受体和TGF-β多肽拮抗剂。任何这些抗体、抑制剂或诱饵受体均可以与本文的免疫刺激细菌共同施用。在一些实施方案中，PARP(聚(ADP)-核糖聚合酶)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂和/或化学疗法也可以与上面列出的任何治疗产物单独或以任何组合共同施用。
可以在本文的免疫刺激细菌中在质粒上编码的治疗产物的互补组合的示例包括但不限于：
IL-2和IL-12p70；IL-2和IL-21；IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；IL-2，IL-21，和STING GOF变体；IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；IL-15/IL-15Rα和IL-21；IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；IL-12p70，IL-21，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和STING GOF变体；IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和IL-18；IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；和IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，和STINGGOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-18；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STINGGOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；CD40激动剂，IL-2，和IL-21；CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STINGGOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂和IL-12p70；CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和CD40激动剂和STING GOF变体。
在包括4-1BBL在内的所有组合中，4-1BBL分子可以是全长蛋白质(见例如SEQ IDNO:389和393，分别表示人和小鼠4-1BBL)；具有胞质结构域缺失的4-1BBL变体(4-1BBLΔcyt；见例如SEQ ID NO:390和394，分别表示人和鼠4-1BBLΔcyt)；具有截短(即未完全缺失)胞质结构域的4-1BBL变体(4-1BBLcyt trunc；见例如SEQ ID NO:391-392和SEQ ID NO:395-396，表示示例的人和小鼠4-1BBLcyt trunc变体)；或具有修饰的胞质结构域的4-1BBL分子，其中一个或多个充当磷酸化位点的Ser残基在适当的一个或多个基因座处被置换，例如对于人4-1BBL，参考SEQ ID NO:389为Ser5和Ser8，用减少或消除反向信号传导的残基置换。此外，包括抗CTLA-4抗体在内的所有组合均可以包括抗CTLA-4抗体片段，例如抗CTLA-4scFv(见例如SEQ ID NO:403和404，分别表示人和小鼠抗-CTLA-4 scFv片段)，或抗CTLA-4scFv-Fc(见例如SEQ ID NO:402和405，分别表示示例的人和小鼠抗CTLA-4 scFv-Fc片段)。此外，TGF-β受体诱饵可以被其它TGF-β多肽拮抗剂置换，这些拮抗剂可以结合并从肿瘤微环境中去除TGF-β，包括例如抗TGF-β抗体或抗体片段、抗TGF-β受体抗体或抗体片段，以及可溶的TGF-β拮抗剂多肽。
下表列出了可在免疫刺激细菌中的质粒中编码的示例产物，以及这种产物的一些作用/特征。
Figure GDA0004138988600000961
Figure GDA0004138988600000971
*DC＝树突状细胞
在上述任何互补组合中，TGF-β诱饵受体可以用TGF-β拮抗多肽置换。如上所述，TGF-β诱饵受体是充当结合TGF-β以去除其的诱饵的任何受体，或者是TGF-β拮抗多肽(例如，抗TGF-β抗体或抗体片段，以及抗TGF-β受体抗体或抗体片段)。STING蛋白或其它诱导或激活I型IFN产生的DNA/RNA传感器可以是GOF/组成型活性变体，或可以是野生型蛋白质，包括本文描述和提供的修饰的STING多肽和嵌合STING多肽。上述任何互补组合也可以与以下任何一种或多种制剂组合施用：抗PD-1抗体，抗CTLA-4抗体，抗PD-L1抗体，抗IL-6抗体，抗Siglec-15抗体，抗VEGF抗体，抗CD73抗体，抗CD38抗体，抗EGFR抗体，抗Her2抗体，抗间皮素抗体，抗BCMA抗体及其抗体片段，以及PARP抑制剂，HDAC抑制剂，或化学疗法，以及其组合。
本文提供的质粒和免疫刺激细菌编码治疗有效载荷的组合。这些包括编码任何或所有上表所列产物的核酸组合。
评估了互补有效载荷的组合，示例的组合及其效力在实施例中进行描述。评估了各种有效载荷组合对抗原特异性T细胞活化和骨髓细胞分泌CXCL10(参与抗肿瘤T细胞募集的关键趋化因子)的影响。例如，有效载荷组合可以诱导骨髓树突状细胞(BMDC)强力分泌CXCL10。将IL-36γ与IL-12p70和STING R284G tazCTT组合导致BMDC分泌更高的CXCL10和IFN-γ(见实施例26)。许多组合诱导CD8+ T细胞应答的激活(例如，4-1BB表达)和IFN-γ的分泌。工作实施例中的结果(见实施例26)表明特定的细胞因子组合可以激活T细胞。例如以下组合：IL-12p70+IL-15；IL-12p70+IL-15+IFN-α2；IL-12p70+IL-15+抗4-1BB激动抗体；IL-12p70+IL-15+IL-36γ；IL-12p70+IL-15+IL-21；IL-12p70+IL-21+IL-36γ；IL-12p70+IL-36γ+IFN-α2；IL-12p70+IL-36γ+抗4-1BB激动抗体；IL-15+IL-36γ+IFN-α2；和IL-15+IL-36γ+抗4-1BB激动抗体，导致T细胞分泌高水平的IFN-γ，但相对较低水平的IL-6水平，使其成为最佳T细胞活化的理想组合，用于在肿瘤微环境中诱导抗肿瘤免疫。
此外，对于CD4+和CD8+ T细胞，在有或没有抗CD3ε激动抗体刺激TCR的情况下，细胞因子(IL-12p70、IL-15、IL-21和IL-36γ)和4-1BB参与的几种组合激活T细胞以分泌高水平的IFN-γ。本文所述的STING变体以及IL-12可以增加人CD8+ T细胞的抗原特异性活化。数据(见实施例24)还显示，在小鼠(mu)结肠直肠癌模型中，表达IL-15或4-1BBLΔcyt+IL-12组合的免疫刺激菌株比单独表达4-1BBL(Δcyt)或IL-12的相同菌株更强力抑制肿瘤生长抑制作用，并导致高完全反应率(50％治愈率)。还测试了其它组合并显示在体内具有强力的抗肿瘤活性。
有效载荷的组合可以包括共刺激分子，例如OX40L多肽，或4-1BBL多肽，或其胞质缺失或截短变体之一，和/或其在本文中描述和举例说明的修饰形式；或抗-免疫检查点抗体或其片段，例如抗-CTLA-4 scFv-Fc或抗-CTLA-4 scFv(分别见实施例20和SEQ ID NO:402和403)；一种或多种细胞因子/趋化因子，如IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、IFN-β、IFN-α2和CXCL10；TGF-β结合诱饵受体及其它TGF-β多肽拮抗剂，例如与人IgGlFc融合的人可溶性TGFβ受体II(hu sTGFβRII-Fc；SEQ ID NO:407)，抗TGF-β抗体或抗体片段，抗TGF-β受体抗体或抗体片段，和可溶性TGF-β拮抗剂多肽；和一种或多种STING蛋白或修饰的和/或嵌合的STING蛋白，如本文所述和举例说明的。
如本文所讨论的，这些有效载荷/产物/多肽可以编码为多顺反子构建体，在单个启动子(即，单一启动子系统)和根据需要的其它调节序列的控制下，并且还可以包括2A多肽或其它导致各个产物翻译的这种多肽。所述有效载荷也可以在含有两个单独的开放阅读框(ORF)的质粒上表达，每个开放阅读框在不同启动子的控制下(即双重启动子系统)。下表列出了以其在质粒上编码的顺序并且包括在多顺反子构建体中编码的2A肽的示例性有效荷载组合。
示例的产物组合和示例的质粒上顺序
1st编码的产物 1st 2A肽 2nd编码的产物 2nd2A肽 3rd编码的产物 3rd2A肽 4th编码的产物
4-1BBL* T2A IL-12p70
4-1BBL* T2A 嵌合STING**
4-1BBL* T2A IL-12p70 P2A 嵌合STING**
IL-12p70 T2A 嵌合STING**
IL-12p70 T2A IL-15
IL-12p70 T2A IL-21
IL-12p70 T2A IL-15
IL-12p70 T2A IL-21
IL-21 T2A IL-12p70
IL-12p70 T2A IL-36γ
IL-36γ T2A IL-12p70
4-1BBL T2A IL-12p70 P2A IL-15
4-1BBL* T2A IL-12p70 P2A IL-21
4-1BBL* T2A IL-12p70 P2A IL-36γ
4-1BBL T2A IL-12p70 P2A IL-15 T2A 嵌合STING**
4-1BBL T2A IL-12p70 P2A IL-21 T2A 嵌合STING**
4-1BBL T2A IL-12p70 P2A IL-36γ T2A 嵌合STING**
IL-12p70 T2A IL-21 P2A 嵌合STING**
IL-21 T2A IL-12p70 P2A 嵌合STING**
IL-12p70 T2A IL-15 P2A 嵌合STING**
IL-12p70 T2A IL-36γ P2A 嵌合STING**
IL-36γ T2A IL-12p70 P2A 嵌合STING**
抗-CTLA-4 scFv-Fc T2A IL-12p70
抗-CTLA-4 scFv-Fc T2A IL-12p70 P2A 嵌合STING**
抗-CTLA-4 scFv-Fc T2A IL-12p70 P2A IL-15 T2A
抗-CTLA-4 scFv-Fc T2A IL-12p70 P2A IL-21 T2A
抗-CTLA-4 scFv-Fc T2A IL-12p70 P2A IL-36γ T2A
4-1BBL* T2A sTGFβRIIFc# T2A
sTGFβRIIFc# T2A IL-12p70 P2A 嵌合STING**
4-1BBL* T2A sTGFβRIIFc# P2A IL-12p70 T2A
4-1BBL* T2A IL-12p70 P2A sTGFβRIIFc# T2A
IL-36γ T2A IL-23 P2A OX40L
*4-1BBL＝具有胞质截短和残基修饰的修饰的4-1BBL，以使剩余的胞质结构域更积极保持相对于细胞膜的正确方向。
**嵌合STING＝具有袋獾CTT和R284G/N154S置换的STING。
sTGFβRIIFc#＝II型受体β聚糖。
可以选择本文提供的免疫刺激细菌的性质，以涵盖癌症免疫周期，例如在肿瘤驻留骨髓细胞和TME中的积累，以及可以表达的产物/有效载荷的组合。所述周期中的每个步骤，以及免疫刺激细菌和有效载荷的作用总结如下：
1)癌细胞抗原的释放---所述免疫刺激细菌在肿瘤驻留骨髓细胞中积累；
2)癌症抗原呈递---本文提供的免疫刺激细菌编码和表达免疫刺激物，例如STING多肽及其变体和IL-12，导致I型干扰素包括IFN-α和IFN-β的表达；
3)启动和激活---所述免疫刺激细菌编码STING多肽及其变体，以及共刺激蛋白，例如4-1BBL和IL-12；
4)将T细胞运输到肿瘤---表达编码的STING变体，导致由此IFN-α和IFN-β表达；
5)T细胞浸润到肿瘤---血管渗漏和免疫抑制性骨髓细胞的复极化；
6)T细胞识别癌细胞---I型IFN和IFNγ，并上调MHC；和
7)杀死癌细胞---编码的细胞因子/趋化因子组合，例如IL-12、IL-15、IL-21和/或IL-36γ，其诱导T细胞增殖和IFN-γ的释放，以及可溶性TGF-β诱饵受体的表达。
基于本文的公开内容和他们的知识，本领域技术人员可以鉴定在多顺反子构建体上编码的其它产物有效载荷组合和产物的其它顺序，其具有免疫激活和/或免疫抑制作用以增强本文提供的免疫刺激细菌的抗肿瘤活性。
E.构建编码用于细菌递送的治疗产物的示例质粒
本文的免疫刺激细菌可以被修饰以编码一种或多种治疗产物，包括免疫调节蛋白，其促进或诱导或增强抗肿瘤反应。所述治疗产物可以在细菌中的质粒上编码，在真核启动子如RNA聚合酶II识别的启动子的控制下，用于在真核受试者中表达，特别是施用了所述免疫刺激细菌受试者，如人。除了真核启动子之外，编码治疗产物的核酸除了真核启动子之外还可以包括用于在细胞中表达或运输的其它调节信号，例如用于在细胞表面上分泌或表达的调节信号。免疫刺激蛋白是在合适的环境例如肿瘤微环境(TME)中可以促进或参与或增强施用了所述免疫刺激细菌的受试者中的抗肿瘤反应的那些蛋白质。免疫刺激蛋白包括但不限于细胞因子，趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，例如但不限于IL-2，IL-7，IL-12，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经修饰不结合IL-2Ra的IL-2，IFN-α，和IFN-β；趋化因子，例如但不限于CCL3，CCL4，CCL5，CXCL9，CXCL10和CXCL11；参与或影响或增强T细胞募集和/或持久性的蛋白质；和/或共刺激分子，例如但不限于CD40，CD40L，OX40，OX40L，4-1BB，4-1BBL，具有胞质结构域缺失的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，具有截短的胞质结构域或以其它方式修饰的截短的胞质结构域4-1BBL，ICOS，ICOS配体，CD27，CD27配体，CD80，CD86，TNF/TNFR超家族成员和B7-CD28家族成员。本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可促进、增强或以其它方式增加或引起抗肿瘤反应的其它这种免疫刺激蛋白，被考虑用于编码本文提供的免疫刺激细菌。
由本文的免疫刺激细菌编码的其它治疗产物包括诱导或激活I型干扰素产生的胞质DNA/RNA传感器，包括STING、MDA5、RIG-I、IRF3和IRF7，以及其功能获得和组成型其活性变体。例如，组成型活性STING变体包括具有突变V147L、N154S、V155M、C206Y、R281Q和/或R284G的那些变体，例如N154S/R284G，以及本文所述和本领域已知的其它变体，而组成型活性IRF3变体包括具有突变S396D、S398D、S402D、T404D和/或S405D的那些变体，以及本文描述的和本领域已知的其它变体。由本文的免疫刺激细菌编码的其它治疗产物包括抗体和抗体片段，包括单链可变区片段(scFvs)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，Fv片段，二硫键连接的Fvs(dsFvs)，Fd片段，Fd’片段，单链Fab(scFab)，双抗体，抗独特型(抗-Id)抗体，合成抗体，重组产生的抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，人抗体，非人抗体，人源化抗体，嵌合抗体和胞内抗体，或上述任何抗体的抗原结合片段。抗体可针对免疫检查点，例如PD-1，PD-L1，CTLA-4，IDO 1和2，CTNNB1(β-连环蛋白)，SIRPα，VISTA和TREX-1以及本领域已知或本文所述的其它免疫检查点，或针对其它靶例如TGF-β，VEGF，HER2，EGFR，STAT3和IL-6的抗体，以及其抑制改善抗肿瘤反应的其它这种靶。所述免疫刺激细菌还可以编码RNAi，例如针对免疫检查点例如TREX1的siRNA(shRNA和miRNA)，以及其抑制、阻抑或破坏可改善抗肿瘤反应的其它靶。
在一些实施方案中，本文中的免疫刺激细菌被工程化以编码和表达一种或多种细胞因子以刺激免疫系统，所述细胞因子包括但不限于IL-2，IL-7，IL-12(IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35))，IL-15(和IL-15:IL-15Rα链复合物)，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，IFN-α和IFN-β。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌可以被工程化以编码和表达趋化因子，所述趋化因子例如是CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11中的一种或多种。可以编码任何治疗产物的互补组合并将其递送至肿瘤微环境，以增强免疫刺激细菌的抗肿瘤效力。这些修饰以及编码其的免疫刺激细菌在上面讨论并在下面举例说明。
1.蛋白质异源表达的组成型启动子
本文提供的质粒被设计为编码治疗产物，例如免疫刺激蛋白，当其在哺乳动物受试者中表达时，在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫；所述免疫刺激蛋白或其它治疗产物在真核启动子控制下在细菌中的质粒上编码，所述启动子例如是RNA聚合酶II(RNAPII)识别的启动子。通常，所述启动子是组成型启动子，例如晚期真核病毒启动子。示例的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子，延伸因子-1α(EF-1α)启动子，遍在蛋白C(UBC)启动子，猿病毒40(SV40)早期启动子，磷酸甘油酸酯激酶1(PGK)启动子，鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子及其衍生启动子CAGG或CAG，β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子，MND启动子(一种合成启动子，含有修饰的MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR的U3区，具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子和缺失阴性对照区的)，真核起始因子4A-I(EIF4A1)启动子，CD68启动子和GAPDH启动子等(见例如Powell et al.(2015)Discov.Med.19(102):49–57)。CAG启动子包括：(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；(A)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一个外显子和第一个内含子；(G)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。MND是一种合成启动子，含有修饰的MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR的U3区，具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子和缺失的阴性对照区(鼠白血病病毒衍生的MND启动子(骨髓增殖性肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的，dl587rev引物结合位点取代的(见例如Li et al.(2010)J.Neurosci.Methods 189:56-64)。
这些启动子中的两个或更多个启动子可以在质粒上的多个开放阅读框(ORF)中编码。某些启动子，包括但不限于CMV，含有多个cAMP应答元件结合蛋白(CREB)位点。当含有这些元件的质粒被释放到胞质中时，例如包含在鼠伤寒沙门氏菌中的那些质粒在细菌破坏后被释放到胞质中，它们可以使用CREB介导的宿主微管机制有效地穿梭到细胞核中(见例如Bai et al.(2017)Biosci.Rep.37(6):BSR20160616)。
所述质粒可以包括多个启动子，包括细菌启动子，例如用于表达asd的启动子，以及用于表达治疗产物的真核启动子。已经评估了启动子和其它调节序列的各种构型以改善治疗产物的表达并改善细菌生长和适应性。如以下实施例所示(见实施例30)，在所测试的构型中，反转真核表达盒在质粒上的方向，并包含一个或多个细菌终止子，可以提高编码的有效载荷表达的效力，并可以改善细菌适应性。
2.多种重治疗产物表达盒
a.单一启动子构建体
可以实现从单个构建体在同一细胞中表达多个基因，并且当需要几种蛋白质的共表达以引发所需的生物学效应(例如抗肿瘤反应)时，这是有利的。内部核糖体进入位点(IRES)序列已用于在单一启动子的控制下分隔两个编码序列，然而第二个蛋白质的表达水平与第一个蛋白质相比可以降低，并且IRES序列的长度可以是在某些情况下是限制的，例如使用小包装容量的病毒时。发现了称为2A肽的短的(长度约18至22个氨基酸长)病毒衍生的肽序列，其介导核糖体跳跃事件，使得能够从单个mRNA以相似水平生成多个单独的肽产物。所述2A肽编码序列包含在编码多肽的转基因之间(见例如Daniels et al.(2014)PLoSOne 9(6):e100637)。
IRES和2A肽使用不同的机制在一个转录物中共表达多个基因。例如，当使用IRES在一个mRNA中表达多个基因时，直接位于启动子下游的基因通过典型的帽依赖机制翻译，而IRES下游的基因通过帽非依赖性机制翻译，所述帽非依赖性机制翻译机制具的翻译效力低于帽依赖性机制，导致表达不平衡，IRES驱动的基因的表达较低(见例如Chng et al.(2015)mAbs 7(2):403-412)。另一方面，2A连锁基因在一个开放阅读框(ORF)中翻译。由2A序列分隔的蛋白质的切割在非常规过程中共翻译地发生，在此2A肽中的C末端甘氨酸和脯氨酸之间通常无法形成肽键(即，肽键被“跳过”)。尽管如此，翻译仍在继续，两种不同的蛋白质以等量产生。编码大约20个氨基酸的2A肽序列的短片段足以引起键跳跃。然而，如果没有发生键跳跃，则会生成融合蛋白，该蛋白随后不会切割(见例如Daniels et al.(2014)PLoS One 9(6):e100637)。
已经描述了许多这些2A肽，包括但不限于来自Thosea asigna病毒的T2(SEQ IDNO:327)、来自猪捷申病毒(teschovirus)-1的P2A(SEQ ID NO:328)、来自马鼻炎A病毒的E2A(SEQ ID NO:329)，以及来自口蹄疫病毒的F2A(SEQ ID NO:330)等。不同的研究报告了各种2A肽的切割效力相互矛盾，2A肽的切割效力可能受所表达蛋白质的性质、2A序列侧翼基因的顺序、所用2A肽的长度和上游蛋白质和2A肽之间的接头的影响。切割效力和增强的蛋白质表达通常可以通过使用上游病毒切割序列来提高，例如但不限于肽弗林蛋白酶切割序列RRKR，以及通过紧接在2A肽之前插入GSG和SGS肽接头V5表位标签(GKPUPNPLLGLDST)或的3xFlag表位标签(见例如Chng et al.(2015)mAbs 7(2):403-412)。
本文的免疫刺激细菌，含有编码治疗产物例如免疫调节蛋白的质粒，具有单个启动子和ORF，可以通过使用帽非依赖性病毒内部核糖体进入位点(IRES)或通过2A肽的翻译通读，以及随后的自我切割成同等表达的辅蛋白，由此可以表达两种或更多种蛋白质。所述质粒可以含有其它调控元件，如下文和本文其它地方所讨论的。例如，示例构建体(见实施例14)是CMV-muIL-2CO_T2A_muIFN-α2-WPRE，其中密码子优化的鼠IL-2与鼠IFN-α2共表达，使用CMV启动子和T2A肽。此外，还包括土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)，以增强表达。例如，如果要通过质粒表达第三种治疗产物，则2A序列的侧翼是前两种蛋白质，它们在第一启动子(例如CMV)的控制下表达，第三种蛋白质在第二启动子例如EF-1α控制下。这种构建体的示例是CMV-muIL-15Rα/IL-15sc_T2A_muSTING-R283G+EF-1α-muIL-18-WPRE，其中鼠15Rα/IL-15sc和具有置换R283G的鼠STING在CMV启动子控制下使用T2A共表达，鼠IL-18在EF-1α启动子的控制下单独表达。这个示例构建体还包括用于增强表达的WPRE。
b.双重/多重启动子构建体
或者，可以使用双重或多重启动子构建体表达遗传有效载荷/治疗产物，其中每种蛋白质在单独启动子的控制下表达。因此，编码以组合形式表达的治疗产物(例如免疫调节蛋白)的质粒可以含有多个启动子，每个启动子通过适当的终止密码子加工控制单个完整的ORF(即双重/多重启动子构建体)；或多个蛋白质可以在一个ORF中通过使用2A肽表达(即单个启动子构建体)；或质粒可以含有单个启动子和双重/多重启动子构建体的混合物，以表达三种或更多种蛋白质，如上所述。
3.调节元件
a.转录后调节元件
为了增强来自单个质粒的单个和多个治疗产物/免疫调节蛋白的表达，可以使用增强感兴趣的蛋白质的转录和翻译的调节元件。例如，土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(PRE)，当插入到ORF的3’非翻译区时，可以将表达水平提高几倍(见例如Zuffereyet al.(1999)J.Virol.73(4):2886-2892)。类似地，其它这种元件，包括但不限于乙型肝炎病毒PRE(HPRE)，也可以增强表达。这些元件组合可用在多个ORF的3’末端，以改善多个蛋白质在单个质粒上的表达。
PREs WPRE和HPRE是肝炎病毒顺式作用RNA元件，可通过促进mRNA从细胞核输出而增加胞质mRNA的积累，并可增强转录后加工和稳定性。
b.聚腺苷酸化信号序列和终止子
质粒上可以增强蛋白质表达的其它元件包括多聚腺苷酸化信号序列和终止子。聚腺苷酸化是转录后在mRNA转录物的3’末端添加poly(A)尾，这是产生成熟mRNA进行翻译的过程的一部分。聚腺苷酸化信号序列对于核输出、mRNA稳定性和有效翻译很重要。终止子是定义转录物末端的序列，产生一个游离的3’末端，并启动新合成的mRNA从转录机制中的释放。然后，游离的3’末端可用于添加poly(A)尾。终止子位于待转录基因的下游，通常直接出现在任何3’调节元件例如聚腺苷酸化或poly(A)信号之后。表达质粒中常用的哺乳动物终止子包括猿病毒40(SV40)、人生长激素(hGH)、牛生长激素(BGH或bGH)和兔β-珠蛋白(rbGlob)polyA序列，其包括序列基序AAUAAA(SEQ ID NO：398)、并促进聚腺苷酸化和终止。
当置于ORF的3’末端时，猿病毒40polyA(SV40pA)或牛生长激素poly A(bGHpA)信号等序列导致在体外和体内表达增加数倍(见例如Powell et al.(2015)Discov.Med.19(102):49–57)。这些及其它这种元件可以进一步增强从单个质粒表达的多种治疗产物包括免疫调节蛋白的表达和翻译。
c.增强子
启动子和增强子位于质粒中多克隆位点(MCS)的上游，其共同决定转录速率。增强子是结合激活蛋白的序列，以使DNA形成环，并将特定的启动子带入起始复合物，从而提高转录速率。它们可以邻近或远离其影响的启动子，包括CMV、EF-1α、SV40和合成增强子，或MND启动子，这是是一种合成启动子，含有具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子的修饰的MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR的U3区域。本文的免疫刺激细菌含有质粒，其可以包含增强剂以增强在质粒上编码的治疗产物/蛋白质的表达。
d.分泌信号
分泌信号，也称为信号序列或肽、前导序列或肽、或定位信号或序列，是待分泌的新合成蛋白质的N末端的短肽。信号肽促进细胞转位蛋白质，通常转位到细胞膜。蛋白质分泌的效力很大程度上取决于信号肽。因此，本文中的免疫刺激细菌含有可以包含信号肽/分泌信号肽的质粒，以促进和/或增加编码的治疗产物的表达或分泌。
e.改良细菌适应性(fitness)
编码治疗产物的免疫刺激细菌中的质粒包括为细菌基因的表达和复杂的多顺反子真核有效载荷的表达提供的基因和调节元件。这种进化上不同的生物体之间的转换为原核生物和真核生物的正常功能带来了挑战。将细菌在体外培养，然后施用于真核对象，其中质粒被递送至癌症受试者的细胞，特别是肿瘤驻留骨髓细胞，有效载荷在其中被表达、加工和运输。如实施例中所述(见实施例30)，细菌中来自真核启动子例如CMV启动子的转录渗漏，与大的真核基因和调节序列组合，可导致细菌适应性降低，表现为注射原液存活力低以及降低的肉汤培养的生长速度。
如实施例中所示(见实施例30)，为了最小化对细菌适应性的负面影响，同时维持在哺乳动物细胞中的高异位表达，系统地修饰递送质粒以改善细菌适应性，并维持或改善真核表达。可能的示例性负面影响和解决方案包括例如如下所述：
1)使用PromoterHunter(可在线得自phisite.org/promoterhunter/；见例如Klucar et al.(2010)Nucleic Acids Res.38(Database issue):D366-D370)鉴定在CMV启动子增强子区域内编码的隐蔽细菌启动子序列，并将这些推定的启动子序列置换为CREB结合位点和部分CREB结合位点，以促进有效的质粒递送；
2)为抑制CMV启动子的转录渗漏，在ORF 1的5’UTR中插入多个细菌终止子，以抑制在细菌中的表达(见实施例30中的表)；
3)为了降低从复制起点的通读转录水平，反转从CMV启动子上游到多聚腺苷酸化信号末端的表达盒的方向，在表达盒与复制起点之间插入和不插入转录终止子；和
4)将导致注射原液存活力增加的上述1)至3)中的修饰，与增强的体外遗传有效载荷表组合，以进一步改善。
实施例中详述的结果(见实施例30)表明，当在质粒上反转表达盒并且在编码区之后插入BBa_B0015细菌终止子，以及在CMV启动子下游插入T4细菌终止子时(见图14)，与没有修饰的质粒相比，所述细菌细胞存活力增加，倍增时间减少，生长到更高的固定OD600，并且编码的有效载荷在体外的表达增加。
BBa_B0015终止子是复合终止子，其中连接了源自大肠杆菌的终止子(BBa_B0010)和源自T7噬菌体的终止子(BBa_B0012)。
因此，本文提供了质粒，其中真核启动子例如病毒启动子，与细菌启动子例如控制外源asd基因在质粒上表达的细菌启动子的方向相反。例如，外源asd盒(包括用于表达的调节序列和在asd-细菌中的质粒上编码的外源asd基因)与真核调节序列和可操作地连接的有效荷载编码核酸的方向相反。这样减少了真核启动子的通读(渗漏)。这些构建体还包括位于有效载荷表达盒两侧的细菌终止子，该有效荷载表达盒包括真核启动子，其减少了细菌启动子的通读。例如，图14提供了示例的构建体构型。
因此，如果需要，可以通过几种策略中的一种或多种策略来改善细菌适应性，所述策略包括将包含真核启动子的表达盒定向在与细菌启动子控制下的那些表达盒相反的方向，以及包含细菌识别的终止子以终止在策略基因座的细菌表达。可以包括其它这样的修饰以增强体外细菌生长，并有利于在真核宿主如人中体内真核启动子的表达或不干扰其表达。因此，通过包含细菌启动子以及通过反转编码有效载荷的核酸相对于外源asd编码盒的方向来改进构建体。
4.复制起点与质粒拷贝数
质粒是自主复制的染色体外环状双链DNA分子，其通过复制起点保持在细菌内。拷贝数影响质粒稳定性。当在细胞分裂中发生随机分配时，高拷贝数通常导致质粒的更大稳定性。质粒的高拷贝数通常降低生长速率，因此可能允许具有很少质粒的细胞主导培养，因为其生长更快。这可以通过使用基因减毒和基因给药策略来改善，这些策略限制了质粒上某些基因的表达，这些基因在以高拷贝数存在时可能对细菌有毒。复制起点还决定了质粒的兼容性：与同一细菌细胞内的另一质粒一起复制的能力。利用相同复制系统的质粒不能共存于同一细菌细胞中。据说其属于同一兼容性组。以来自同一兼容性组的第二个质粒的形式引入新的起点，模拟了存留质粒的复制结果。因此，在将两个质粒分离到不同的细胞以产生正确的复制前拷贝数之前，阻止任何进一步的复制。
许多细菌复制起点是本领域技术人员已知的。可以选择起点以获得所需的拷贝数。复制起点含有通过DNA依赖性DNA聚合酶被识别的序列作为质粒复制起始位点(见例如del Solar et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(2):434-464)。不同的复制起点在每个细胞内提供了不同的质粒拷贝水平，并且可以为1至数百个拷贝/细胞。常用的细菌质粒复制起点包括但不限于pMB1衍生的起点，其具有非常高的拷贝衍生物如pUC，及低拷贝衍生物如pBR322，以及ColE1、p15A、pSC101及具有低拷贝数的其它起点。这样的起点是本领域技术人员熟知的。例如，pUC19起点导致500-700个拷贝/细胞的拷贝数。pBR322起点具有15-20个拷贝/细胞的已知拷贝数。这些起点仅因单个碱基对而异。ColE1起点拷贝数为15-20个，并且衍生物如pBluescript具有300-500个拷贝数。例如，质粒pACYC184中的p15A起点导致约10个拷贝数。pSC101起点赋予约5个的拷贝数。可以从中获得复制起点的其它低拷贝数载体包括例如pWSK29、pWKS30、pWKS129和pWKS130(见例如Wang et al.(1991)Gene 100:195-199)。中等至低拷贝数小于150，或小于100。低拷贝数小于20、25或30。一般而言，低于中等拷贝数是小于150个拷贝，低于低拷贝数是小于约25或小于25个拷贝，通常拷贝数是指制剂中每个细菌的平均质粒拷贝数。本领域技术人员可以鉴定具有低、中等或高拷贝数的质粒。例如，为了通过实验确定，无论拷贝数是高还是低均进行小量制备。高拷贝质粒在每1ml的LB培养物应产生3-5μg的DNA；低拷贝质粒每ml的LB培养物将产生0.2-1μg的DNA。细菌质粒的序列，包括复制起点的鉴定和序列，是众所周知的(见例如snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/)。示例的复制起点及其质粒拷贝数总结在下表中。
复制起点 拷贝数 SEQ ID NO.
pMB1 可变 254
p15A 10-12 255
pSC101 ～5 256
pBR322 15-20 243
ColE1 15-20 257
pPS10 15-20 258
RK2 ～5 259
R6K(α起点) 15-20 260
R6K(β起点) 15-20 261
R6K(γ起点) 15-20 262
P1(oriR) Low 263
R1 Low 264
pWSK Low 265
ColE2 10-15 266
pUC(pMB1) 500-700 267
F1 300-500 268
选择高拷贝质粒用于蛋白质的体外异源表达，因为相对于染色体基因的基因剂量增加，蛋白质的特异性产量更高，并且对于治疗性细菌，所编码治疗剂的治疗剂量更高。然而，本文显示，为了例如通过鼠伤寒沙门菌递送编码治疗产物(例如免疫溶解蛋白)的质粒，在一些实施方案中高拷贝质粒可能是有利的。
如果表达的分子对生物体有毒，那么细菌维持高拷贝质粒的需求就可能成为一个问题。维持这些质粒的代谢要求可能以体内复制适应性为代价。用于递送治疗产物的最佳质粒拷贝数可以取决于工程化以递送质粒的菌株的减毒机制。如果需要，鉴于本文的公开内容，技术人员可以为细菌的特定免疫刺激物种和菌株选择合适的拷贝数。
5.CpG基序和CpG岛
未甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷(CpG)基序在细菌基因组DNA中普遍存在，但在脊椎动物基因组DNA中不存在。含有CpG基序的致病性DNA和合成寡脱氧核苷酸(ODN)激活宿主防御机制，导致先天性和获得性免疫应答。未甲基化的CpG基序含有一个中央未甲基化的CG二核苷酸加上侧翼区域。在人中，根据结构的差异及其诱导的免疫应答的性质，已经鉴别了四种不同类别的CpG ODN。K型ODN(也称为B型)含有1至5个CpG基序，通常位于硫代磷酸酯骨架上。D型ODN(也称为A型)具有混合的磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架，并具有单个CpG基序，侧翼是允许形成茎环结构的回文结构序列，以及在3’和5’末端的poly G基序。C型ODN具有硫代磷酸酯骨架并含有可形成茎环结构或二聚体的多个回文结构CpG基序。P类CpG ODN具有硫代磷酸酯骨架，并含有带有双回文结构的多个CpG基序，可以在其富含GC的3’末端形成发夹(见例如Scheiermann et al.(2014)Vaccine 32(48):6377-6389)。出于本文的目的，CpG在质粒DNA中编码；其可以作为基序或引入基因中。
Toll样受体(TLR)是感知病原体相关分子模式(PAMP)和激活针对病原体的先天免疫的关键受体(见例如Akira et al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680)。TLR9识别原核生物DNA中非天然存在于哺乳动物DNA中的去甲基化CpG基序(见例如McKelvey et al.(2011)J.Autoimmun.36:76-86)。免疫细胞亚群的内体中病原体被吞噬之后识别CpG基序会诱导IRF7依赖性I型干扰素信号传导及激活先天免疫和适应性免疫。
本文提供了携带含有CpG岛/基序的质粒的免疫刺激细菌，例如沙门氏菌属物种，如鼠伤寒沙门氏菌菌株。这些细菌可以激活TLR9并诱导I型IFN介导的先天免疫和适应性免疫。如本文所示例，含有去甲基化CpG岛的细菌质粒可引发先天性和适应性抗肿瘤免疫应答，其与在质粒上编码的治疗产物组合可具有协同或增强的抗肿瘤活性，所述治疗产物例如免疫刺激蛋白和STING、IRF3和其它胞质DNA/RNA传感器的组成型活性变体。例如，asd基因(见例如SEQ ID NO:48)编码高频去甲基化CpG岛。如本文所述或从本文描述中明显可见，CpG基序可以与任何治疗性产物组合包括在所述免疫刺激细菌中，并从而在治疗的受试者中增强或改善抗肿瘤免疫反应。
免疫刺激性CpG可以包括在质粒中，通过包含编码基因产物的通常来自细菌基因的核酸以及通过加入编码CpG基序的核酸而实现。本文的质粒可包含CpG基序。示例的CpG基序是已知的(见例如美国专利号8,232,259、8,426,375和8,241,844)。这些包括例如合成的免疫刺激性寡核苷酸，长度在10至100、10至20、10至30、10至40、10至50或10至75个碱基对之间，具有通式(CpG)n，其中n是重复数。通常使用至少一或两次重复；非CG碱基可以散布于其中。本领域技术人员非常熟悉CpG基序通过调节TLR、特别是TLR9来诱导免疫应答的一般性用途。
6.质粒维持/组分选择
通常通过在质粒上包含抗生素抗性基因并在生长培养基中使用抗生素来确保质粒在实验室环境中的维持。如上所述，在质粒上使用与功能性asd基因互补的asd缺失突变体允许在不使用抗生素的情况下在体外进行质粒选择，并且允许在体内进行质粒维持。asd基因互补系统提供了这样的选择(见例如Galán et al.(1990)Gene 94(1):29-35)。使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中提高了鼠伤寒沙门菌及其它免疫刺激细菌菌株的效力，这些菌株被工程化以递送编码治疗产物的质粒，所述治疗产物例如免疫刺激蛋白质、组成型活性胞质DNA/RNA传感器、抗体、抗体片段，或如本文所述其它这种产物。
7.DNA核靶向序列
DNA核靶向序列(DTS)，如SV40 DTS，介导DNA序列通过核孔复合物的易位。据报道，这种转运机制依赖于含有核定位序列的DNA结合蛋白的结合。已示出在质粒上包含DTS以增加核转运和表达(见例如Dean,D.A.et al.(1999)Exp.Cell Res.253(2):713-722)，并已被用于增加鼠伤寒沙门菌递送的质粒的基因表达(见例如Kong et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(47):19414–19419)。
Rho非依赖性的或I类转录终止子，例如大肠杆菌的rrnB基因的T1终止子，含有DNA序列，其形成导致转录延伸复合物的解离的二级结构。转录终止子可包括在质粒中，以防止鼠伤寒沙门氏菌转录机制表达编码的治疗产物。这确保了编码的产物的表达仅限于宿主细胞转录机制。
作为本文所述的癌症疗法，用于转化沙门菌属例如鼠伤寒沙门菌的质粒含有以下所有或部分属性：1)一个或多个用于蛋白质异源表达的组成型启动子；2)一个或多个人免疫调节表达盒；3)细菌复制起点和优化的质粒拷贝数；4)免疫刺激性CpG岛；5)asd基因选择标记，用于质粒维持和选择；6)DNA核靶向序列；和7)转录终止子。
F.药物制备、组合物和制剂
本文提供了生产含有本文提供的任何免疫刺激细菌和药学上可接受的赋形剂或添加剂的药物组合物和制剂的方法。所述药物组合物可用于治疗疾病，如过度增生性疾病或病况，例如肿瘤或癌症。所述免疫刺激细菌可以在单剂疗法中施用，也可以在与其它药剂或治疗的组合疗法中施用。组合疗法包括将与本文提供的免疫刺激细菌和/或其它递送载体的疗法与任何其它抗癌疗法或治疗方法组合，包括但不限于免疫疗法，例如CAR-T疗法和检查点抑制剂，放射，手术，化学治疗剂例如核苷类似物和铂化合物，以及细胞疗法。可以将组合物配制成单剂量施用或多剂量施用。可以将药剂配制为直接施用。所述组合物可以液体或干燥制剂形式提供。
1.制备
a.细胞库制备
由于本文所述免疫治疗剂的活性成分由工程化的自我复制细菌组成，因此将选择的组合物扩展为一系列细胞库，这些细胞库将维持长期保存并用作制备原料药的起始材料。根据美国联邦法规(CFR)21第211部分或其它相关监管机构的规定，在适当的生产工厂中在现行原料药生产质量管理规范(cGMP)下生产细胞库。由于所述免疫治疗剂的活性剂是活细菌，因此从定义上讲本文所述的产物是未经灭菌的且不能进行最终灭菌。必须注意确保在整个制备过程中使用无菌程序以防止污染。因此，在制备过程中使用之前，必须对所有原材料和溶液进行灭菌。
通过对所选细菌菌株进行连续系列单集落分离来生产主细胞库(MCB)，以确保起始材料中不存在污染物。用单个充分分离的细菌集落接种含有无菌培养基(可以是复合培养基，例如LB或MSBB或定义的培养基，例如补充有适当营养素的M9)的无菌培养容器，并使细菌可以复制，例如通过在37℃摇动孵育。然后通过将细菌悬浮在含有一种或多种冷冻保护剂的溶液中制备细菌用于低温贮存。
冷冻保护剂的实例包括：蛋白质如人或牛血清白蛋白、明胶、和免疫球蛋白；碳水化合物，包括单糖(例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等)及其非还原性衍生物(例如甲基葡葡萄糖甙)、二糖(海藻糖、蔗糖等)、环糊精、和多糖(例如棉子糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐等)；氨基酸(例如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或组氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲胺，如甜菜碱；多元醇，如三羟或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；表面活性剂，例如
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或有机硫化合物，如二甲亚砜(DMSO)，及其组合。低温贮存溶液可以在溶液中包含一种或多种冷冻保护剂，其也可以包含盐(例如氯化钠、氯化钾、硫酸镁)，和/或缓冲剂，如磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)，以及其它本领域技术人员已知的这种缓冲剂。
可以通过在培养材料中加入一种或多种浓缩的冷冻保护剂以达到在冷冻和解冻期间保持细菌的活力的最终浓度(例如0.5％至20％丙三醇最终浓度)，或通过收获细菌(例如通过离心)并将其悬浮在含有适当终浓度的一种或多种冷冻保护剂的低温贮存液中，从而实现将细菌悬浮在低温贮存液中。然后将在低温贮存溶液中的细菌悬浮液装入具有容器封闭系统的合适的无菌小瓶(塑料或玻璃)中，该容器封闭系统可以在冷冻条件下保持封闭完整性(例如丁基医用螺旋帽和压接密封)。然后将主细胞库的小瓶冷冻(通过控制速率的冷冻机缓慢地冷冻，或通过直接放入冷冻机快速地冷冻)。然后将MCB冷冻贮存在保持长期活力的温度(例如-60℃或更低)。对解冻的主细胞库材料进行彻底鉴定，以确保相同性、纯度和活性符合相应当局的规定。
工作细胞库(WCB)以与主细胞库相同的方式生产，但起始材料来自MCB。MCB材料可以直接转移到含有无菌培养基的发酵容器中，并如上所述扩增。然后将细菌悬浮在低温贮存液中，装入容器中，密封并在-20℃或以下冷冻。可以由MCB材料生产多个WCB，且WCB材料可以用于制备另外的细胞库(例如制造商的工作细胞库MWCB)。将WCB冷冻保存并鉴定以确保相同性、纯度和活性。WCB材料通常是用于生产例如工程化细菌的生物学样品的起始材料。
b.原料药(Drug substance)制备
如上所述，在cGMP下使用无菌工艺制备原料药。工作细胞库材料通常用作在cGMP下制备原料药的起始材料，然而也可以使用其它细胞库(例如MCB或MWCB)。无菌加工用于所有细胞疗法的生产，包括基于细菌细胞的疗法。将来自细胞库的细菌通过发酵扩增；这可以通过产生预培养物(例如在摇瓶中)或通过直接接种发酵罐来实现。发酵是在无菌的生物反应器或烧瓶中完成的，该反应器或烧瓶可以是一次性使用的或可重复使用的。通过浓缩(例如通过离心、连续离心或切向流过滤)收获细菌。通过用缓冲剂交换培养基(例如通过渗滤)从培养基组分和细菌代谢物中纯化浓缩的细菌。散装药物产物被配制并保存为中间体(例如通过冷冻或干燥)或直接加工成药物产物。检测原料药的相同性、强度、纯度、效价和质量。
c.药物产物制备
药物产物定义为其最终容器中所含活性物质的最终制剂。药物产物是根据cGMP使用无菌工艺制备的。药物产物是由原料药生产的。如有必要，可将原料药解冻或重建，然后以适当的目标强度配制。因为药物产物的活性组分是活的工程化细菌，所以强度取决于悬浮液中所含CFU的数量。如下所述，将散装产物稀释成适合于储存和使用的最终制剂。填充于容器中，并用容器封闭系统密封，对药物产物贴标签。将药物产物贮存在适当的温度下以保持稳定性，检测其相同性、强度、纯度、效价和质量，并如果符合指定的接受标准则发布以供人使用。
2.组合物
药学上可接受的组合物是经监管机构或其它机构批准而制备的，根据公认的用于动物和人体的药典制备。所述组合物可以制备为溶液剂、混悬剂、粉剂或缓释制剂。通常，使用本领域熟知的技术和规程将化合物配制成药物组合物(见例如Ansel,Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,page 126)。所述制剂应适合于施用模式。
可以将组合物配制为通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、瘤内、硬膜外、鼻腔、口服、阴道、直肠、表面、局部、耳道、吸入、颊(例如舌下)和经皮施用或任何施用途径。也可以考虑其它施用模式。取决于治疗的部位，施用可以是局部、表面或全身的。可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、表面应用例如与手术后的伤口敷料联合、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物来局部施用到需要治疗的区域。组合物也可以与其它生物活性剂相继、间歇地或以在相同组合物中一起施用。施用还可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控释，例如通过泵。
在任何给定情况下，最合适的途径取决于多种因素，例如疾病的性质、疾病的进展、疾病的严重程度以及所使用的特定组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。特别地，可以将组合物配制成用于全身、局部腹膜内、口服或直接施用的任何合适的药物制剂。例如，可以将组合物配制成用于皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内施用。可以采用施用方法来减少活性剂暴露于降解过程，例如通过抗原和免疫原性应答的免疫干预。这种方法的实例包括在治疗部位的局部施用或连续输注。
可以将免疫刺激细菌配制成合适的药物制备物，例如用于口服施用的溶液剂、混悬剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂，以及透皮贴剂制备物和粉吸入剂。通常，使用本领域熟知的技术和规程将化合物配制成药物组合物(见例如Ansel,Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,page 126)。通常，制剂的模式取决于施用途径。可以将组合物配制成干燥(冻干的或其它玻璃化形式)或液体形式。当组合物以干燥形式提供时，其可以在即将使用之前通过加入适当的缓冲剂例如无菌盐溶液而重建。
3.制剂
a.流体、注射剂、乳剂
制剂通常被制成适于施用途径的模式。本文考虑到胃肠外施用通常特征在于以皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内注射或输注。用于胃肠外施用的细菌制备物包括备用于注射(直接施用)的悬浮液或在使用前解冻的冷冻悬浮液、备用于在使用前与再悬浮溶液组合的干燥的可溶性产物如冻干粉，以及乳剂。干燥的热稳定制剂例如冻干试剂可用于单位剂量的储存以备后用。
药物制备物可以是冷冻液体形式，例如悬浮液。如果以冷冻液体形式提供，则药物产物可以以浓缩制备物形式提供，以在使用前解冻并稀释至治疗有效浓度。
药物制备物也可以以不需要解冻或稀释而使用的剂型提供。这种液体制备物可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂适当制备，例如悬浮剂(例如山梨糖醇、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；以及适用于微生物治疗剂的防腐剂。所述药物制备物可以干燥形式存在，例如冻干或喷雾干燥的，在使用前用水或其它无菌的合适载体重建。
合适的赋形剂是例如水、盐水、葡聚糖、或甘油。溶液可以是水性或非水性的。如果静脉内施用，则合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及用于静脉内水合作用的其它缓冲溶液。对于瘤内施用，包含增稠剂例如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇的溶液，油乳剂及其混合物可以适合于维持注入物的定位。
药物组合物可以包括载体或其它赋形剂。例如，本文提供的药物组合物可包含以下的任何一种或多种：稀释剂、佐剂、抗粘剂、粘合剂、包衣、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、清洁剂、或吸附剂及其组合或施用修饰的治疗性细菌的载体。例如，胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载体或赋形剂包括水性载体、非水性载体、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、隐蔽剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂或赋形剂制备包括液体制备物在内的制剂。
药物组合物可以包括载体，例如稀释剂、佐剂、赋形剂或与施用所述组合物的载体。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中进行了描述。这样的组合物将包含治疗有效量的通常为纯化形式或部分纯化形式的化合物或试剂，以及合适量的载体，以提供适当施用于患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、和芝麻油。水是典型的载体。盐溶液和葡聚糖及甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。组合物除了活性成分还可包含：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙、或羧甲基纤维素；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、和滑石；和粘合剂，例如淀粉、天然树胶例如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其它本领域技术人员已知的这种粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、和乙醇。例如，合适的赋形剂是例如水、盐水、葡聚糖、丙三醇或乙醇。如果需要的话，组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其它这种试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载体包括水性载体、非水性载体、抗菌剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。水性载体的实例包括氯化钠注射液、林格注射液(RingersInjection)、等渗葡聚糖糖注射液、无菌水注射液、葡聚糖和乳酸林格注射液。非水性胃肠外载体包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。等渗剂包括氯化钠和葡聚糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括例如聚山梨酯，例如聚山梨酯80(TWEEN 80)。可以包括金属离子的掩蔽剂或螯合剂，例如EDTA。药物载体还包括用于水混溶性载体的聚乙二醇和丙二醇，以及用于调节pH值的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可以包括非抗微生物防腐剂。
药物组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其它这种试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。本文还预期植入缓释或持续释放系统，以维持恒定剂量水平(见例如美国专利号3,710,795)。这种胃肠外组合物中包含的活性化合物的百分比高度依赖于其特定性质以及化合物的活性和受试者的需求。
b.干燥的热稳定制剂
可以对细菌进行干燥。干燥的热稳定制剂，例如冻干或喷雾干燥的粉末和玻璃化的玻璃制品(vitrified glass)，可以重建为以溶液、乳剂和其它混合物形式施用。干燥的热稳定制剂可以由任何液体制剂例如上述悬浮液制备。药物制备物可以冻干或玻璃化形式存在，在使用前用水或其它合适的载体重建。
通过用无菌溶液重建干燥的化合物来制备施用的热稳定制剂。溶液可以包含赋形剂，其可以改善由粉末制备的活性物质或重建溶液的稳定性或其它药理学性质。通过将赋形剂例如葡聚糖糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适试剂溶解于合适的缓冲剂例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它本领域技术人员已知的这种缓冲剂中以制备热稳定制剂。然后，将原料药加入所得混合物中，并搅拌直至混合。将所得混合物分配到小瓶中以进行干燥。每个小瓶将包含单个剂量，包含每小瓶l×105至l×1011个CFU。干燥后，将产物小瓶用容器封闭系统密封，防止水分或污染物进入密封的瓶中。干燥的产物可以在适当的条件下存储，例如-20℃、4℃或室温下。用水或缓冲溶液重建所述干燥的制剂提供了用于胃肠外施用的制剂。精确量取决于所治疗的适应症和所选化合物。这种量可以根据经验确定。
4.用于其它施用途径的组合物
取决于所治疗的病况，本文还考虑了除胃肠外以外的其它施用途径，例如表面施用、透皮贴剂，口服和直肠施用。上述悬浮液和粉剂可以口服施用，或者可以重建以口服施用。用于直肠施用的药物剂型是直肠栓剂、胶囊和片剂以及用于全身作用的凝胶胶囊。直肠栓剂包括插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，释放一种或多种药学或治疗活性成分。直肠栓剂中的药学上可接受的物质是基质或载体以及提高熔点的试剂。基质的实例包括可可脂(可可油)、甘油-明胶、碳蜡(聚氧乙二醇)和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模制来制备。直肠栓剂的典型重量为约2至3克。用于直肠施用的片剂和胶囊是使用与口服施用制剂相同的药学上可接受的物质制备的及通过与口服施用制剂相同的方法制备的。适于直肠施用的制剂可以以单位剂量的栓剂提供。可以通过将原料药与一种或多种常规固体载体例如可可脂混合，并然后对所得混合物塑形而制备。
对于口服施用，药物组合物可以采取通过常规方式用药学上可接受的赋形剂制备的例如片剂或胶囊形式，所述赋形剂例如是粘合剂(例如预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羧乙酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法将片剂包被。
适用于颊(舌下)施用的制剂包括例如在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中含有所述活性化合物的锭剂(lozenges)；以及在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中含有所述化合物的糖锭剂(pastilles)。
如针对局部和全身施用所述制备局部表面施用混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，以及配制成霜剂、凝胶、软膏剂、乳剂、溶液剂、酏剂、洗剂、悬浮剂、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或其它适合局部表面施用的制剂。
所述组合物可以配制成用于局部用途的气雾剂，例如通过吸入(见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，描述了递送用于治疗肺部疾病的类固醇的气雾剂)。这些施用于呼吸道的制剂可以是单独或与惰性载体如乳糖组合以用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式或以用于吹入的微粉形式。在这种情况下，所述制剂的颗粒直径通常小于50微米或小于10微米。
可以将化合物配制成用于局部或表面施用，例如以凝胶、霜剂和洗剂形式表面应用于皮肤和粘膜例如眼中，以及应用于眼或脑池内或椎管内应用。预期表面施用是透皮递送，以及也施用于眼或粘膜，或用于吸入疗法。活性化合物的鼻用溶液也可以单独或与其它药学上可接受的赋形剂组合施用。
提供了适于透皮施用的制剂。其可以以任何合适的形式提供，例如适合于与接受者的表皮长时间保持紧密接触的分立贴剂。这种贴剂含有在任选缓冲水溶液中的活性化合物，所述缓冲水溶液例如对于活性化合物而言是0.1至0.2M的浓度。适于透皮施用的制剂也可以通过电离子透入疗法递送(见例如Tyle,P.(1986)Pharmaceutical Research3(6):318-326)，以及通常采取活性化合物的任选缓冲水溶液的形式。
药物组合物也可以通过控释试剂和/或递送装置施用(见例如美国专利号3,536,809，3,598,123，3,630,200，3,845,770，3,916,899，4,008,719，4,769,027，5,059,595，5,073,543，5,120,548，5,591,767，5,639,476，5,674,533和5,733,566)。
5.剂量和施用
可以将所述组合物配制成用于单剂量或多剂量施用的药物组合物。所述免疫刺激细菌可以以对所治疗的患者不产生不良副作用的情况下足以发挥治疗有效作用的量包含于其中。例如，调节所述药物活性化合物的浓度，使得注射提供有效量以产生所需的药理作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中检测免疫刺激细菌而凭经验确定，例如通过使用本文所述或本领域已知的测定法。例如，可以采用标准的临床技术。可以采用体外测定法和动物模型以帮助确定最佳剂量范围。可以根据经验确定的精确剂量可以取决于患者或动物的年龄、体重、体表面积和病况、施用的特定免疫刺激细菌、施用途径、待治疗的疾病类型和疾病的严重性。
因此，应理解的是，精确的剂量和治疗持续时间取决于所治疗疾病，以及可以使用已知的检测方案凭经验确定或通过从体内或体外检测数据推断。浓度和剂量值也可以随待减轻的病症的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定的受试者，应根据个体需要及施用或监督施用所述组合物的人员的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，本文列出的浓度范围仅作为示例，并不意图限制组合物及包含其的组合的范围或用途。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年施用一次或仅施用一次。通常，选择剂量方案以限制毒性。应注意的是，主治医生知道根据毒性、骨髓、肝、肾或其它组织功能障碍如何以及何时终止、中断或调整疗法至更低剂量。相反，如果临床反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也知道如何以及何时将治疗调整到更高的水平。
所述免疫刺激细菌以足以发挥治疗有效作用的量包含在组合物中。例如，所述量是在治疗过度增殖性疾病或病况例如癌症中达到治疗效果的量。示例的剂量可以是大约1×109CFU/m2。如下表所示和上面提到的，可以施用更高的剂量。以下来自小鼠模型实验的数据显示，与VNP20009相比，具有本文所述基因组修饰的菌株的耐受性显著提高至少约15倍，因此可以以更高的量给药。
Figure GDA0004138988600001121
药物和治疗活性化合物及其衍生物通常以单位剂型或多剂型配制和施用。每个单位剂量包含预定量的足以产生所需治疗效果的治疗活性化合物，结合所需的药物载体、载体或稀释剂。单位剂量形式包括但不限于包含合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胃肠外混悬剂和口服溶液剂或混悬剂，以及水包油乳剂。单位剂量形式可以包含于小瓶、安瓿瓶和注射器中，或者是独立包装的片剂或胶囊剂。单位剂量形式可以其部分或多个施用。多剂量形式是包装在单个容器中以便以单独的单位剂型施用的多个相同的单位剂量形式。多剂量形式的实例包括片剂或胶囊小瓶或瓶或品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是未在包装中分开的多个单位剂量。通常，可以制备包含0.005％至100％范围的活性成分，其余部分由无毒载体平衡的剂型或组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。
单位剂量的胃肠外施用制备物包装在安瓿瓶、小瓶或带针头的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或重建的粉末制备物的体积取决于要治疗的疾病和选择用于包装的特定制备产物。如本领域已知和实践的，用于胃肠外施用的所有制备物必须是无菌的。
如所指出的，本文提供的组合物可以配制为本领域技术人员已知的任何途径，包括但不限于皮下、肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳道、透皮施用或任何施用途径。适用于这种途径的制剂为本领域技术人员已知。组合物也可以与其它生物活性物质相继、间歇地或在相同组合物中一起施用。
药物组合物可以通过控释制剂和/或递送装置来施用(见例如美国专利3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719；4,687,660；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,556；5,591,767；5,639,476；5,674,533；和5,733,566号)。已知各种递送系统，并可以用于施用预期在本文中使用的选择的组合物，并且这种颗粒可以容易地制备。
6.包装和制备产物
还提供了包含包装材料、本文提供的任何药物组合物和标示组合物用于治疗本文所述的疾病或病况的标签的制备产物。例如，标签可以标示治疗是针对肿瘤或癌症。
本文所述的免疫刺激细菌和另一种治疗剂的组合也可以包装在制备产物中。在一个实例中，所述制备产物包含含有所述免疫刺激细菌组合物的药物组合物，且不再包含其它试剂或治疗。在其它实例中，所述制备产物还包括另外治疗剂，例如不同的抗癌剂。在这个实例中，可以将所述试剂一起或分开提供，以包装为制备产物。
本文提供的制备产物包含包装材料。用于包装药物产物的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，每个专利均以其全部内容并入本文作参考。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适于选择的制剂和指定施用和治疗模式的任何包装材料。制备产物的示例是包括单室和双室容器的容器。所述容器包括但不限于管、瓶和注射器。容器可以进一步包括用于静脉内施用的针。
包装的选择取决于所述药剂，以及这些组合物是一起包装还是分开包装。通常，所述包装与其中所含的组合物不反应。在其它实例中，某些组分可以以混合物包装。在其它实例中，所有成分均单独包装。因此，例如可以将各组分包装为单独的组合物，在即将施用前混合，可以将其直接一起施用。可选地，可以将各组分包装为单独的组合物以分别施用。
包括选择的组合物的其制备产物的也可以以试剂盒提供。试剂盒可包括本文所述的药物组合物和以制备产物形式供施用的物品。所述组合物可以包含在用于施用的物品中，或者可以单独提供以随后加入。所述试剂盒可任选地包括使用说明，包括剂量、施用方案和施用方式说明。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。
G.治疗方法和用途
本文提供的方法包括施用或使用免疫刺激细菌用于治疗患有疾病或病况的受试者的方法，所述受试者的症状可通过施用这种细菌来改善或减轻，例如癌症。在特定的实例中，所述疾病或病况是肿瘤或癌症。另外，还提供了与一种或多种额外的药剂如抗癌剂或抗透明质酸剂的组合疗法的方法。所述细菌可以通过任何合适的途径施用，包括但不限于胃肠外、全身、表面和局部，例如通过瘤内、静脉内、直肠、口服、肌肉内、粘膜和其它途径。由于本文所述细菌的修饰，解决了与全身施用相关的问题。提供了适合于每种施用途径的制剂。本领域技术人员可以确立合适的方案和剂量及可以选择施用途径。
1.选择患者以进行治疗和监测治疗的诊断
a.患者选择
生物标志物可用于鉴定可能对用本文提供的免疫刺激细菌治疗有反应的患者。例如，腺苷特征和骨髓特征可以通过NanoString基因表达面板进行评估，肿瘤的T细胞浸润可以通过
Figure GDA0004138988600001145
测试进行评估，该测试是在早期结肠癌患者中预测癌症复发风险的体外诊断测试，通过测量在肿瘤部位的宿主免疫应答进行。其肿瘤或体液指示免疫反应性或免疫应答的患者更可能对本文提供的免疫刺激细菌的治疗产生反应。
其它生物标志物包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CD73、CD39、TNAP(组织非特异性碱性磷酸酶)、CD38、CD68、PD-L1和FoxP3。例如，可以用本文提供的免疫刺激细菌治疗的肿瘤不包括T细胞，表现出高水平的嘌呤/腺苷，并且对PD-1/PD-L1靶向治疗无反应。
可以分析使用各种NanoString基因表达面板可确定的基因表达谱(GEP)，例如以鉴定肿瘤的“腺苷特征”。在某些肿瘤中发现了高浓度的腺苷，包括结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌等。具有高浓度嘌呤/腺苷的肿瘤患者可能对治疗有反应，因为本文中的免疫刺激细菌在富含嘌呤/腺苷的肿瘤微环境中积累和复制。因此，表达“腺苷特征”的肿瘤的鉴定可用于预测患者对治疗的反应。此外，本文中的免疫刺激细菌优先积累在并感染肿瘤驻留骨髓细胞。因此，“骨髓特征”也可用于预测患者对免疫刺激细菌治疗的反应。例如，已示出“腺苷特征”与“髓样特征”几乎相同，后者与肾细胞癌(RCC)患者对阿特珠单抗(抗PD-L1)单药治疗反应不佳有关，这表明腺苷在肿瘤逃避抗PD-L1治疗中的作用(见例如McDermott et al.(2018)Nature Medicine 24:749-757)。可获得肿瘤-骨髓和肿瘤-腺苷的NanoString特征面板，且可用于选择患者。
巨噬细胞限制T细胞浸润到实体瘤中并抑制其功能，例如在三阴性乳腺癌中(见例如Keren et al.(2018)Cell 174:1373-1387)。在某些癌症中，例如CRC，巨噬细胞在肿瘤内免疫群体中占主导地位并促进T细胞排斥，因此与肿瘤相关的巨噬细胞与CRC的预后不良有关(见例如Bindea et al.(2013)Immunity 39:782-795)。
Figure GDA0004138988600001141
是一种评估癌症患者预后的方法，基于浸润和包围癌症的免疫细胞，可用于测量T细胞排斥或T细胞浸润。
Figure GDA0004138988600001142
将宿主免疫反应的影响纳入癌症分类并提高预后准确性。其测量肿瘤中心和周围两个T淋巴细胞群(CD3/CD8、CD3/CD45RO或CD8/CD45RO)的密度，当在两个区域发现这两种细胞类型的密度较低时，赋予从0开始的分值(I0)，当在两个区域均发现高密度时，赋予Immunoscore 4(I4)。T淋巴细胞的低浸润导致低/>
Figure GDA0004138988600001143
这与高风险相关，而T淋巴细胞高浸润导致高/>
Figure GDA0004138988600001144
这与低风险相关。因此，/>
Figure GDA0004138988600001151
可以作为一种预期的生物标志物进行评估，以鉴定将对本文提供的免疫刺激细菌的治疗产生反应的患者。例如，可以治疗T细胞不佳/非炎症的肿瘤，因为本文提供的免疫刺激细菌在冷肿瘤中诱导T细胞浸润。这种肿瘤代表了对检查点抑制作用无效的高度需求人群。
胞外腺苷由膜相关胞外酶CD39(胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，或NTPDase1)和CD73(胞外5’-核苷酸酶)的连续活性产生，其在肿瘤基质细胞上表达，通过磷酸水解由死亡或垂死细胞产生的ATP或ADP一起产生腺苷。CD39将细胞外ATP(或ADP)转化为5’-AMP，后者被CD73转化为腺苷。在肿瘤微环境的缺氧条件下，内皮细胞上CD39和CD73的表达增加，从而增加了腺苷的水平。因此，CD39和CD73可用作指示富含腺苷的肿瘤的生物标志物，该肿瘤可被本文提供的免疫刺激细菌靶向。
CD38，也称为环状ADP核糖水解酶，是一种糖蛋白，存在于许多免疫细胞的表面，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞。作为细胞活化标志物的CD38的缺失与免疫反应受损有关，并且与白血病、骨髓瘤和实体瘤有关。此外，CD38表达增加是慢性淋巴细胞白血病的不利诊断标志物，并且与疾病进展增加有关。CD38也被用作已被批准用于治疗多发性骨髓瘤的达雷木单抗
Figure GDA0004138988600001152
的靶。CD68由单核细胞、循环巨噬细胞和组织巨噬细胞(例如枯否细胞、小胶质细胞)高度表达。FoxP3参与免疫系统反应，并在具有免疫抑制作用的调节性T细胞(或Tregs)的发育和功能中充当调节剂。在癌症中，过度的调节性T细胞活性可以阻止免疫系统破坏癌细胞。因此，CD38、CD68和FoxP3也可用作生物标志物，用于选择可能对本文的免疫刺激细菌治疗有反应的患者。
b.评估或检测免疫刺激细菌活性的诊断表明治疗的有效性
生物标志物可用于监测治疗后的免疫刺激细菌。生物标志物存在于肿瘤样本和/或体液样本中，例如血液、血浆、尿液、唾液和其它体液。经验证的外周血生物标志物用于评估患者在治疗前和治疗期间的免疫状态，以确定与治疗效力相关的免疫状态变化。抗肿瘤免疫反应状态的改变或增加表明用免疫刺激细菌的治疗正在产生效力。可以评估本文提供的免疫刺激细菌的免疫调节活性，例如在剂量递增和扩展研究中。生物标志物的检验揭示了与疾病(例如肿瘤)状态及其治疗相关的预后和预测因素，这可有助于监测治疗。例如，评估肿瘤微环境可以深入了解肿瘤对免疫疗法的反应机制。用于检测免疫刺激细菌的免疫调节活性的血清生物标志物包括但不限于CXCL10(IP-10)、CXCL9、干扰素-β、干扰素-γ、促炎血清细胞因子(例如，IL-6、TNF-α、MCP-1/CCL1)和IL-18结合蛋白。
CXCL10和CXCL9是CD8+T细胞例如响应免疫疗法而活化和运输到肿瘤所必需的趋化因子。在作为抗PD-1免疫检查点抑制剂的纳武单抗的3期试验中，对于治疗既往治疗的转移性肾细胞癌(mRCC)患者，鉴定了与施用的剂量无关的大多数患者都具有免疫药效学效应。使用基于Luminex技术(
Figure GDA0004138988600001153
Rules-Based Medicine(RBM))的多重面板对IFN-γ调节的血清趋化因子CXCL9和CXCL10进行评估，结果表明与临床反应相关的CXCL9和CXCL10血清水平增加，以及在肿瘤中的转录增加。用纳武利尤单抗治疗后，外周血中趋化因子水平的中位数从基线水平增加101％(对于CXCL9)和37％(对于CXCL10)(见例如Choueiri et al.(2016)Clin.Cancer Res.22(22):5461-5471)。此外，使用MK-1454STING激动剂(Merck)治疗晚期实体瘤或淋巴瘤患者，导致肿瘤内给药后血清CXCL10呈剂量依赖性增加(见例如Harrington et al.ESMO Annual Meeting(2018))。在瘤内给药ADU-S100 STING激动剂(Aduro)后，观察到血清IFN-β水平的剂量依赖性增加(见例如Meric-Bernstam et al.ASCOAnnual Meeting(2019))。此外，VNP20009的静脉内施用诱导促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12的血清水平呈剂量依赖性增加(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。
IL-18参与对细胞内细菌、真菌和病毒的保护性免疫反应，并在肺癌、乳腺癌、肉瘤和黑色素瘤的临床前模型中显示出抗肿瘤活性。IL-18的生物活性在负反馈回路中受到IL-18结合蛋白(IL-18BP)的调节，通过IFN-γ诱导。因此，IL-18BP的血清水平可预测临床IFN-γ活性。为晚期癌症患者静脉内施用重组人IL-18(rhIL-18)导致血清IL-18结合蛋白浓度以剂量依赖性方式增加，以及IFN-γ、GM-CSF、和可溶性Fas配体也增加(见例如Robertsonet al.(2006)Clin.Cancer Res.12(14):4265-4273)。此外，观察到在尿和血清中IL-18BP水平与前列腺癌患者的肿瘤状态相关；尿IL-18BP水平在前列腺癌患者和非前列腺癌患者之间存在显著差异，血清IL-18BP水平升高例如与增加的前列腺癌Gleason评分相关，表明前列腺癌细胞分泌的IL-18BP升高可能表明癌症试图逃避免疫监视(见例如Fujita et al.(2011)Int.J.Cancer 129(2):424-432)。因此，IL-18BP可用作肿瘤免疫反应的生物标志物。
2.肿瘤
本文提供的免疫刺激细菌、组合、用途和方法适用于治疗所有类型的肿瘤，包括癌症，特别是实体瘤，包括肺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。所述方法也可用于血液学癌症。
通过本文提供的免疫刺激细菌、组合物、组合、用途和方法进行治疗的肿瘤和癌症包括但不限于源自免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳房、胰腺、胃肠道、中枢和周围神经系统、肾脏系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统包括关节、脂肪组织以及循环系统包括血管壁的那些肿瘤和癌症。可以用本文提供的免疫刺激细菌治疗的肿瘤的实例包括癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、腺癌、腺肉瘤、和腺瘤。这种肿瘤几乎可以发生在身体的所有部位，包括例如乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈、或肝脏。
骨骼系统的肿瘤包括例如肉瘤和母细胞瘤，例如骨肉瘤、软骨肉瘤和软骨母细胞瘤。肌肉和心脏肿瘤包括骨骼肌和平滑肌的肿瘤，例如平滑肌瘤(平滑肌的良性肿瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤(骨骼肌的良性肿瘤)、横纹肌肉瘤和心脏肉瘤。胃肠道的肿瘤包括例如口腔、食道、胃、小肠、结肠和结肠直肠的肿瘤，以及胃肠道分泌器官例如唾腺、肝、胰腺和胆道的肿瘤。中枢神经系统(CNS)的肿瘤包括脑、视网膜和脊髓的肿瘤，也可以起源于相关的结缔组织、骨骼、血管或神经组织。还考虑了周围神经系统肿瘤的治疗。周围神经系统的肿瘤包括恶性周围神经鞘瘤。肾脏系统的肿瘤包括肾的那些肿瘤，例如肾细胞癌，以及输尿管和膀胱的肿瘤。生殖系统的肿瘤包括子宫颈、子宫、卵巢、前列腺、睾丸和相关分泌腺的肿瘤。免疫系统的肿瘤包括基于血液的肿瘤和实体瘤，包括淋巴瘤，例如霍奇金(Hodgkin′s)和非霍奇金(non-Hodgkin′s)淋巴瘤。呼吸系统的肿瘤包括鼻道、支气管和肺的肿瘤。乳腺肿瘤包括例如小叶癌和导管癌。
可以通过本文提供的免疫刺激细菌和方法治疗的肿瘤的其它实例包括Kaposi肉瘤，中枢神经系统肿瘤，成神经细胞瘤，毛细血管性血管母细胞瘤，脑膜瘤和转移性脑肿瘤，黑素瘤，胃肠道癌和肾癌及肉瘤，横纹肌肉瘤，胶质母细胞瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)和平滑肌肉瘤。如本文提供的可以治疗的其它癌症的实例包括但不限于淋巴瘤，母细胞瘤，神经内分泌肿瘤，间皮瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，黑素瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤。这种癌症的实例包括恶性血液肿瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤；非霍奇氏金淋巴瘤(伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤)，小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病，蕈样真菌病，套细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病和淋巴浆细胞白血病；淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括B细胞型急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤，和T细胞型急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤，胸腺瘤，成熟T和NK细胞的肿瘤，包括外周T细胞白血病，成年T细胞白血病/T细胞淋巴瘤以及巨粒淋巴细胞白血病，朗格汉斯细胞组织细胞增多症；骨髓瘤形成例如急性髓性白血病，包括成熟型AML，无分化型AML，急性前髓细胞性白血病，急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞白血病，骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生性病症，包括慢性髓性白血病；中枢神经系统的肿瘤，例如神经胶质瘤、胶质母细胞瘤，成神经细胞瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，室管膜瘤和视网膜母细胞瘤；头颈部的实体瘤(例如，鼻咽癌，唾腺癌和食道癌)，肺癌(例如，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞癌)，消化系统癌症(例如胃癌，包括胃肠道癌，胆管或胆道癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌和肛门癌)，生殖系统癌(例如睾丸，阴茎或前列腺癌，子宫，阴道，外阴，子宫颈，卵巢和子宫内膜的癌症)，皮肤癌(例如黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，光化性角化病，皮肤黑素瘤)，肝癌(例如肝癌，肝癌瘤，肝细胞癌和肝细胞瘤)，骨癌(例如破骨细胞瘤和溶骨性骨癌)，其它组织和器官的癌症(例如胰腺癌，膀胱癌，肾脏癌或肾癌，甲状腺癌，乳腺癌，腹膜癌和卡波西肉瘤)，血管系统的肿瘤(例如血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)，威尔姆斯瘤(Wilms′tumor)，视网膜母细胞瘤，骨肉瘤和尤因氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)。
3.施用
在实践本文的用途和方法中，可以将本文提供的免疫刺激细菌施用于受试者，包括患有肿瘤或具有赘生性细胞的受试者或待免疫的受试者。可以在向受试者施用免疫刺激细菌之前、同时或之后进行一个或多个步骤，包括但不限于以适合于施用免疫刺激细菌的条件诊断受试者，确定受试者的免疫能力，对受试者进行免疫，用化学治疗剂治疗受试者，用放射治疗受试者或手术治疗受试者。
对于包括出于治疗目的而向荷瘤受试者施用免疫刺激细菌的实施方案，通常先前已经诊断出该受试者患有赘生病况。诊断方法还可包括确定赘生病况的类型，确定赘生病况的阶段，确定受试者中一种或多种肿瘤的大小，确定受试者的淋巴结中存在或不存在转移性或肿瘤细胞，或确定受试者存在转移。
为受试者施用免疫刺激细菌的治疗方法的一些实施方案可以包括确定原发肿瘤的大小或赘生性疾病的阶段的步骤，以及如果原发肿瘤的大小等于或大于阈值体积，或如果赘生性疾病的阶段处于或超过阈值阶段，则为受试者施用免疫刺激细菌。在相似的实施方案中，如果原发肿瘤的大小低于阈值体积，或者如果赘生性疾病的阶段处于或低于阈值阶段，则免疫刺激细菌尚未施用于受试者；这种方法可包括监测受试者直至肿瘤大小或赘生性疾病阶段达到阈值量，并然后将免疫刺激细菌施用于受试者。阈值大小可以根据一些因素而变化，包括肿瘤的生长速率、免疫刺激细菌感染肿瘤的能力以及受试者的免疫能力。通常，阈值大小将是足以使免疫刺激细菌在肿瘤内或附近累积和复制而不会被宿主的免疫系统完全去除的大小，且通常还是足以维持细菌感染足够长的时间以使宿主对肿瘤细胞产生免疫应答的大小，通常约一周或更长时间，大约十天或更长时间或大约两周或更长时间。示例性阈值阶段是超过最低阶段的任何阶段(例如，I阶段或等同阶段)，或者是原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或者是检测到转移性细胞的任何阶段。
可以使用为受试者施用微生物的任何方式，条件是施用方式允许免疫刺激细菌进入肿瘤或转移灶。施用方式可包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、肿瘤内、多次穿刺、吸入、鼻内、口服、腔内(例如通过导管施用于膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用于肠道)、耳、直肠和眼部施用。
本领域技术人员可以选择与受试者和细菌相容以及也有可能导致细菌到达肿瘤和/或转移灶的任何施用方式。本领域技术人员可以根据多种因素中的任何一种来选择施用途径，包括疾病的性质、肿瘤的类型以及药物组合物中所含的特定细菌。可以例如通过弹道式递送以胶体分散系统的形式施用于靶部位，或者可以通过注射入动脉来进行全身施用。
剂量方案可以是多种方法和量中的任一种，以及可以由本领域技术人员根据已知的临床因素确定。对于治疗其中免疫刺激影响治疗的疾病或病症，单剂量可以是治疗有效的。这种刺激的示例是免疫应答，其包括但不限于特异性免疫应答和非特异性免疫应答之一或二者、特异性和非特异性应答二者、先天免疫应答、初级免疫应答、适应性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。
如医学领域所知，施用于受试者的剂量可以取决于许多因素，包括受试者的物种、体格、体表面积、年龄、性别、免疫能力和一般健康状况、施用的特定细菌、施用持续时间和途径、疾病的种类和阶段例如肿瘤大小以及同时施用的其它化合物例如药物。除了上述因素之外，如本领域技术人员可以确定的，这种水平还可以受到细菌的感染性和细菌的性质的影响。在本发明的方法中，细菌的合适的最小剂量水平可以是足以使细菌在肿瘤或转移灶中存活、生长和复制的水平。对于为65kg人施用细菌的示例的最低水平可包括至少约5×106集落形成单位(CFU)、至少约1×107CFU、至少约5×107CFU、至少约1×108CFU、或至少约1×109CFU。在本发明的方法中，细菌的合适的最大剂量水平可以是对宿主无毒的水平、不引起3倍或更大的脾肿大的水平、和/或在约1天后或约3天后或约7天后不会在正常组织或器官中产生集落或菌斑的水平。为65kg人施用细菌的示例的最大水平可包括不超过约5×1011CFU、不超过约1×1011CFU、不超过约5×1010CFU、不超过约1×1010CFU，或不超过约1×109CFU。
本文提供的方法和用途可包括为受试者单次施用免疫刺激细菌或为受试者多次施用免疫刺激细菌或其它各种方案，包括与其它抗肿瘤治疗剂和/或治疗的组合疗法。这些包括例如细胞疗法，例如施用经修饰的免疫细胞，CAR-T疗法，CRISPR疗法，免疫检查点抑制剂，如抗体(例如抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体)，化疗/化学治疗性化合物，例如核苷类似物，手术和放疗。其它癌症疗法还包括抗VEGF、抗VEGFR、抗VEGFR2、抗TGF-β或抗IL-6抗体或其片段、癌症疫苗和溶瘤病毒。
在一些实施方案中，单次施用足以在肿瘤中建立免疫刺激细菌，其中细菌可以定植及可以在受试者中引起或增强抗肿瘤应答。在其它实施方案中，可以在不同的时机施用供本文方法中使用的免疫刺激细菌，时间间隔通常至少一天。在之前的施用可能无法有效地将细菌递送到肿瘤或转移灶的情况下，分开施用可以增加将细菌递送到肿瘤或转移灶的可能性。在实施方案中，分开施用可以增加肿瘤或转移灶上可能发生细菌定植/增殖的位置，或者可以以其它方式增加肿瘤中累积的细菌的滴度，这可以增加引发或增强宿主抗肿瘤免疫应答。
当进行分开施用时，每次施用可以是相对于其它施用剂量的量相同或不同剂量的量。在一个实施方案中，所有施用剂量的量是相同的。在其它实施方案中，第一剂量的量可以是比一个或多个后续剂量的量更大的剂量的量，例如，比后续剂量的量大至少10×，大至少100×或大至少1000×。在其中第一剂量的量大于一个或多个后续剂量的量的分开施用方法的一个实例中，所有后续剂量的量可以是相对于第一次施用而言相同的、较小的量。
分开施用可以包括两次或更多次施用中的任意数目，包括两次、三次、四次、五次或六次施用。根据本领域已知的用于监测治疗方法的方法和本文提供的其它监测方法，本领域技术人员可以容易地确定进行的施用次数，或进行一种或多种其它施用的需求。因此，本文提供的方法包括为受试者提供免疫刺激细菌的一次或多次施用的方法，其中可以通过监测受试者，并基于监视的结果确定是否要提供一次或多次其它施用来确定施用的次数。可以基于多种监测结果来决定是否提供一种或多种额外的施用，包括但不限于肿瘤生长的指示或肿瘤生长的抑制、新转移灶的出现或转移灶的抑制、受试者的抗细菌抗体滴度、受试者的抗肿瘤抗体滴度、受试者的整体健康状况和受试者的体重。
施用之间的时间段可以是多种时间段中的任何一个。施用之间的时间段可以取决于多种因素中的任何一个，包括关于施用次数所述的监测步骤、受试者产生免疫应答的时间段，受试者清除正常组织中的细菌的时间段，或者肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段。在一个实例中，时间段可以取决于受试者产生免疫应答的时间段；例如，该时间段可以大于受试者产生免疫应答的时间段，例如大于约一周，大于约十天，大于大约两周或大于约一个月；在另一个实例中，该时间段可以小于受试者产生免疫应答的时间段，例如小于约一周，小于约十天，小于约两周或小于约一个月。在另一个实例中，时间段可以取决于肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段；例如，该时间段可以大于施用表达可检测标记的微生物后在肿瘤或转移灶中产生可检测信号的时间量，例如约3天，约5天，约一周，约十天，约两周或约一个月。
也可以通过施用含有本文提供的免疫刺激细菌的组合物例如混悬液和其它制剂来进行本文所用的方法。这种组合物包含如本文提供的或本领域技术人员已知的细菌和药学上可接受的赋形剂或载体。
如上所述，本文所提供的用途和方法除了为受试者施用免疫刺激细菌外，还包括为受试者施用一种或多种治疗性化合物，例如抗肿瘤化合物或其它癌症治疗剂。治疗性化合物可以独立地或与免疫刺激细菌一起发挥作用，用于肿瘤治疗作用。可以独立起作用的治疗性化合物包括各种已知的化学治疗性化合物中的任一种，所述化学治疗性化合物可以抑制肿瘤生长、抑制转移灶生长和/或形成、减小肿瘤或转移灶的尺寸、或消除肿瘤或转移灶，而不降低免疫刺激细菌在肿瘤中积累、在肿瘤中复制，以及引起或增强受试者的抗肿瘤免疫应答的能力。这种化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和对哌泊舒凡(piposulfan)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carubicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗雌激素包括，例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托米芬(toremifine，Fareston)；抗代谢物例如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、喋罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙基蜜胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylmelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylol melamine)；叶酸补充物(folic acid replenisher)，例如亚叶酸；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophos-phamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧二氯甲基二乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；蛋白质类如精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)和天冬酰胺酶(asparaginase)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮鸟苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和5-FU；紫杉烷类(taxanes)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel)以及其白蛋白化形式(即nab-紫杉醇和nab-多烯紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合酶抑制剂(如
Figure GDA0004138988600001211
)；及其它化学治疗剂，包括乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰胼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)；/>
Figure GDA0004138988600001212
丙亚胺(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2′2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside，“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)、去甲长春碱(Navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；/>
Figure GDA0004138988600001213
伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-ll；视黄酸；esperamycin；卡培他滨(capecitabine)；和扑异构酶抑制剂如伊立替康(irinotecan)。可以使用上述中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
与免疫刺激细菌联合作用的治疗性化合物包括例如增加细菌的免疫应答引发性质的化合物，例如通过增加编码的治疗性产物的表达，所述治疗产物例如细胞因子，趋化因子，共刺激分子，组成型诱导I型IFN的蛋白质，抑制、阻抑或破坏检查点基因表达的RNAi分子，检查点抑制剂抗体和针对其它靶标的抗体或其片段，或可进一步增强细菌定植/增殖的化合物。例如，改变基因表达的化合物可以诱导或增加细菌中基因的转录，例如质粒上编码的外源基因，从而引发免疫反应。可以改变基因表达的多种化合物中的任何一种都是本领域已知的，包括IPTG和RU486。其表达可以上调的示例性基因包括编码蛋白质和RNA分子的那些基因，包括毒素、可以将前药转化为抗肿瘤药物的酶、细胞因子、转录调节蛋白、shRNA、siRNA和核酶。在其它实施方案中，可以与免疫刺激细菌联合起作用以增加细菌的定植/增殖或免疫应答引发性质的治疗性化合物是可以与细菌表达的基因产物相互作用的化合物，以及这种相互作用可以导致受试者中增加的肿瘤细胞杀死或增加的抗肿瘤免疫应答。可以与细菌表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可以包括例如前药或其它化合物，其在施用于受试者的形式几乎没有或没有毒性或具有其它生物活性，但是在与细菌表达的基因产物相互作用之后，所述化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但不限于细胞毒性、诱导凋亡的能力或触发免疫应答的能力。本领域已知多种前药样物质，包括更昔洛韦(ganciclovir)、5-氟尿嘧啶、6-甲基嘌呤脱氧核苷、头孢菌素-多柔比星、4-[(2-氯乙基)(2-甲硫氧基乙基))氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、对乙酰氨基酚、吲哚-3-乙酸、CB1954、7-乙基l0-[4-(l-哌啶基)-l-哌啶基]羰基氧喜树碱、双-(2-氯乙基)氨基-4-羟基苯基氨基甲酮28、1-氯甲基-5-羟基-1,2-二羟基-3H-苯并[e]吲哚、表柔比星-葡糖苷酸(epirubicin-glucoronide)、5’-脱氧5-氟尿苷、胞嘧啶阿糖胞苷和亚麻苦苷(linamarin)。
4.监测
本文提供的方法可进一步包括以下的一个或多个步骤：监测受试者、监测肿瘤和/或监测为受试者施用的免疫刺激细菌。本文提供的方法中可以包括多种监测步骤中的任一个，包括但不限于监测肿瘤大小、监测转移灶的存在和/或大小、监测受试者的淋巴结、监测受试者的体重或其它健康指标包括血液或尿液标记物、监测抗菌抗体滴度、监测可检测基因产物的细菌表达以及直接监测受试者的肿瘤、组织和器官中的细菌滴度。
监测的目的可以是简单地评估受试者的健康状态或受试者的治疗性处理的进展，或者可以确定是否需要进一步施用相同或不同的免疫刺激细菌，或者确定何时或是否将化合物施用于受试者，其中所述化合物可起到增加治疗方法的功效的作用，或者化合物可起到降低施用于受试者的细菌的致病性的作用。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括监测一种或多种细菌表达的基因。细菌，如本文提供的或本领域其它已知的那些细菌，可以表达一种或多种可检测的基因产物，包括但不限于可检测的蛋白质。
如本文所提供的，在细菌中表达的可检测基因产物的测量可以提供受试者中存在的细菌水平的准确测定。如本文进一步提供的，测量可检测基因产物的位置，例如通过包括断层成像方法的成像方法，可以确定细菌在受试者中的定位。因此，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定受试者的一个或多个器官或组织中细菌的存在与否，和/或受试者的肿瘤或转移灶中细菌的存在与否。此外，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定存在于一个或多个器官、组织、肿瘤或转移灶中的细菌的滴度。包括监测受试者中细菌的定位和/或滴度的方法可用于确定细菌的致病性，因为正常组织和器官的细菌感染，以及特别是感染水平可指示细菌的致病性。可以在多个时间点进行包括监测受试者中免疫刺激细菌的定位和/或滴度的方法，并因此可以确定受试者中的细菌复制速率，包括受试者的一个或多个器官或组织中的细菌复制速率；因此，包括监测细菌基因产物的方法可以用于确定细菌的复制能力。本文提供的方法还可以用于定量存在于各种器官或组织以及肿瘤或转移灶中的免疫刺激细菌的量，并从而可以指示细菌在受试者中优先累积的程度；因此，细菌基因产物监测可用于确定细菌优先于正常组织或器官而在肿瘤或转移灶中累积的能力的方法。由于本文提供的方法中使用的免疫刺激细菌可以在整个肿瘤中累积或可以在肿瘤中的多个部位累积，并可以在转移灶中积累，本文提供的用于监测细菌基因产物的方法可用于确定肿瘤的大小或存在于受试者中的转移灶的数目。这种监测一段时间内肿瘤或转移灶中细菌基因产物的存在可用于评估肿瘤或转移灶的变化，包括肿瘤的生长或缩小，或新转移灶的进展或转移灶的消失，并可以用于确定肿瘤的生长或缩小的速率，或新转移灶的进展或转移灶的消失，或肿瘤的生长或缩小的速率变化，或新转移灶的进展或转移灶的消失。因此，通过确定肿瘤的生长或缩小的速率、或新转移灶的发展或转移灶的消失、或肿瘤的生长或缩小的速率变化、或新转移灶的进展或转移灶的消失，监测细菌基因产物可用于监测受试者的赘生性疾病，或确定治疗赘生性疾病的功效。
可以通过监测来检测多种可检测蛋白质的任一种，其示例是多种荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质)中的任一种、多种荧光素酶中的任一种、转铁蛋白或其它铁结合蛋白质；或受体、结合蛋白质、和抗体，其中特异性结合受体、结合蛋白或抗体的化合物可以是可检测物质或者可以用可检测物质(例如放射性核素或显像剂)进行标记。
肿瘤和/或转移灶大小可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种进行监测，包括外部评估方法或断层扫描或磁成像方法。除了本领域已知的方法，本文提供的方法例如监测细菌基因表达可用于监测肿瘤和/或转移灶大小。
在一些时间点监测大小可以提供有关肿瘤或转移灶的大小增加或缩小的信息，并还可以提供有关受试者中存在额外的肿瘤和/或转移灶的信息。在多个时间点监测肿瘤大小可以提供有关受试者中赘生性疾病进展的信息，包括治疗受试者中赘生性疾病的功效。
本文提供的方法还可以包括监测受试者中的抗体滴度，包括应答为受试者施用免疫刺激细菌而产生的抗体。本文提供的方法中施用的细菌可以引发对内源性细菌抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对由细菌表达的外源基因的免疫应答。本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对细菌抗原、细菌表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体滴度可用于监测细菌的毒性，治疗方法的功效或用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。
监测抗体滴度可用于监测细菌的毒性。在将细菌施用于受试者后的一段时间内，针对细菌的抗体滴度可能会有变化，其中在某些特定时间点，较低的抗(细菌抗原)抗体滴度可表示较高的毒性，而在其它时间点，高的抗(细菌抗原)抗体滴度可表示较高的毒性。本文提供的方法中使用的细菌可以是免疫原性的，并因此可以在将细菌施用于受试者后立即引发免疫应答。通常，当受试者的免疫系统可以从所有正常器官或组织中去除细菌时，受试者的免疫系统可以对免疫刺激细菌产生强烈免疫应答的免疫刺激细菌可以是具有低毒性的细菌。因此，在一些实施方案中，在将细菌施用于受试者之后不久，针对细菌抗原的高抗体滴度可以表明细菌的低毒性。
在其它实施方案中，监测抗体滴度可用于监测治疗方法的功效。在本文提供的方法中，抗体滴度如抗(肿瘤抗原)抗体滴度可以指示治疗方法例如治疗赘生性疾病的治疗方法的功效。本文提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答。因此，通过监测抗(肿瘤抗原)抗体的滴度，可以监测治疗方法引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答的功效。
在其它实施方案中，监测抗体滴度可用于监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。如本文所提供的，通过在肿瘤中累积的微生物中表达外源基因，本发明方法可用于产生蛋白质、RNA分子如shRNA或其它化合物。监测针对蛋白质、RNA分子或其它化合物的抗体滴度可以指示肿瘤累积的微生物产生的蛋白质、RNA分子或其它化合物的水平，以及可以直接指示特异于这种蛋白质、RNA分子或其它化合物的抗体的水平。
本文提供的方法还可以包括监测受试者健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括赘生性疾病治疗方法。如本领域中已知的，监测受试者的健康可以用于确定治疗方法的功效。本文提供的方法还可以包括为受试者施用本文提供的免疫刺激细菌的步骤。监测受试者的健康可以用于确定施用于受试者的免疫刺激细菌的致病性。如本领域中已知的，可以监测用于监测疾病例如赘生性疾病、感染性疾病或免疫相关疾病的多种健康诊断方法的任一种。例如，受试者的体重、血压、脉搏、呼吸、面色、温度或其它可观察到的状态均可以指示受试者的健康。另外，来自受试者的样品中一种或多种组分的存在或不存在或水平可以指示受试者的健康。典型的样品可以包括血液和尿液样品，其中一种或多种组分的存在或不存在或水平可以通过进行例如血液全系或尿液全系诊断测试来确定。指示受试者健康的示例组分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容和c-反应蛋白浓度。
本文提供的方法可以包括监测疗法，其中治疗决策可以基于监测的结果。本文提供的治疗方法可以包括为受试者施用免疫刺激细菌，其中细菌可以优先在肿瘤和/或转移灶中累积，及其中细菌可以引起或增强抗肿瘤免疫应答。这种治疗方法可以包括多个步骤，包括多次施用特定的免疫刺激细菌，施用第二种免疫刺激细菌或施用治疗性化合物。可以基于监测受试者的一种或多种结果来确定施用于受试者的免疫刺激细菌或化合物的量、时间或类型。例如，受试者中的抗体滴度可用于确定是否需要施用免疫刺激细菌和任选地化合物，施用的细菌和/或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如，低抗体滴度可指示期望施用额外的免疫刺激细菌、不同的免疫刺激细菌和/或治疗性化合物，例如诱导细菌基因表达的化合物或独立于免疫刺激细菌有效的治疗性化合物。
在另一个实例中，受试者的总体健康状况可以用于确定是否需要施用免疫刺激细菌和任选地化合物、施用的细菌或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如确定受试者是健康的可表示需要施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物如诱导细菌基因表达的化合物。在另一个实例中，监测可检测的细菌表达的基因产物可以用于确定是否需要施用免疫刺激细菌和任选地化合物、施用的细菌或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如确定受试者是健康的可指示需要施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物如诱导细菌基因表达的化合物。这种监测方法可以用于确定治疗方法是否有效，治疗方法对于受试者是否是致病性的，细菌是否已在肿瘤或转移灶中累积，以及细菌是否在正常组织或器官中累积。基于这种确定，可以得出进一步治疗方法的期望和形式。
在另一个实例中，监测可以确定免疫刺激细菌是否已经在受试者的肿瘤或转移灶中累积。基于这种确定，可以决定为受试者进一步施用额外的细菌、不同的免疫刺激细菌和任选地，化合物。
H.实施例
仅用于说明示例目的包括以下实施例，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)营养缺陷型菌株
沙门氏菌菌株YS1646对于腺苷是营养缺陷型
本文提供的菌株被工程化为对于腺苷是营养缺陷型的。结果，其在体内是减毒的，因其不能在低腺苷浓度的正常组织中复制，且定植主要发生在腺苷水平高的实体瘤微环境(TME)中。沙门氏菌菌株YS1646是野生型菌株ATCC#14028的衍生物，由于purI基因(与purM同义)的破坏而被工程化为对于嘌呤是营养缺陷型的(见例如Low et al.(2004)MethodsMol.Med.90:47-60)。随后对YS1646整个基因组的分析表明，purI基因实际上并未缺失，而是被染色体倒位破坏(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnol.192:177-178)，整个基因仍包含在YS1646染色体的两部分中，其侧翼是插入序列，其中一个具有活性转座酶。purI基因的完整基因序列的存在通过染色体再联锁方式被破坏，留下回复为野生型基因的可能性。虽然之前已经证实YS1646的嘌呤营养缺陷型在体外连续传代>140次之后仍是稳定的，但不清楚回复率是多少(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。
本文表明，当提供腺苷时，菌株YS1646能在基本培养基中复制，而野生型亲本菌株ATCC#14028可以在未补充腺苷的基本培养基中生长。将YS1646在溶原性肉汤(LB)培养基中生长过夜，用M9基本培养基洗涤，然后在不含腺苷或增加浓度的腺苷的M9基本培养基中稀释。使用
Figure GDA0004138988600001251
M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃下测量生长，每15分钟读取一次OD600。
结果表明，与能在所有腺苷浓度下生长的野生型菌株(ATCC#14028)不同，YS1646菌株仅在提供11至300微摩尔浓度的腺苷时才能复制，但在单独的M9或补充有130纳摩尔腺苷的M9中完全无法复制。这些数据表明purI突变体在肿瘤微环境中发现的腺苷浓度下能复制，但在正常组织中发现的浓度下不能复制。本文举例说明的工程化的腺苷营养缺陷型的菌株包括其中从染色体中缺失全部或部分purI开放读框的菌株，以防止回复为野生型。这种基因缺失可通过本领域技术人员已知的任何方法实现，包括如下所述的λred系统。
沙门氏菌菌株YS1646对于ATP是营养缺陷型的
除了嘌呤和腺苷营养缺陷外，还确定了purI缺失的菌株是否也能清除ATP。由于垂死的肿瘤细胞的渗漏，ATP在肿瘤微环境中累积到高水平。如本文所示，当提供ATP时，菌株YS1646能在基本培养基中复制，但在不补充ATP时无法生长。为了证实这一点，将菌株YS1646在LB培养基中生长过夜，用M9基本培养基洗涤，然后在不含ATP或增加浓度的ATP(Fisher)的M9基本培养基中稀释。使用
Figure GDA0004138988600001252
M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃测量生长，每15分钟读取一次OD600。结果表明，当以0.012mM浓度提供ATP时，菌株YS1646能复制，但仅在M9中时不能。
实施例2
胞内复制缺陷归因于msbB突变
YS1646菌株在purI中包含突变，这样将复制限于含有高浓度嘌呤、腺苷或ATP的位点，及在msbB中的突变，其改变脂多糖(LPS)表面包被以减少TLR4介导的促炎信号传导。也已经确定，与野生型沙门氏菌不同，菌株YS1646无法在巨噬细胞中复制。进行实验以确定这些基因突变中的哪一个突变导致在野生型菌株ATCC 14028中赋予这个表型。
在这个测定中，将小鼠RAW巨噬细胞(InvivoGen,San Diego,Ca.)用含有purI、msbB或这两者缺失的野生型沙门氏菌菌株感染，感染复数(MOI)为30分钟每个细胞约5个细菌，然后用PBS洗涤细胞，加入含有庆大霉素的培养基杀死胞外细菌。庆大霉素不能杀死细胞内细菌，因为其不能穿过细胞膜。在感染后的不同时间点，将细胞单层用水渗透压裂解，将细胞裂解物稀释并铺在LB琼脂上，以计算存活的集落形成单位(CFU)。
如下表所示，仅包含purI突变的野生型沙门氏菌菌株仍然能复制。这解释了为什么单独purI缺失仅观察到耐受性的适度改善，同时实现了对肿瘤微环境的高度特异性。仅含有msbB-突变的菌株以及含有purI-和msbB-突变的菌株不能复制且在48小时内从细胞中迅速清除。
Figure GDA0004138988600001261
实施例3
沙门氏菌asd基因敲除菌株工程化和鉴定
制备菌株YS1646Δasd。其是衍生自菌株YS1646(可购自ATCC，目录号#202165)的减毒鼠伤寒沙门菌菌株，已被工程化为具有asd基因缺失。在这个实施例中，将鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)菌株YS1646Δasd使用如下文所述的Datsenko和Wanner方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))的修改进行工程化。
在YS1646菌株中引入λ-Red辅助质粒
如先前所述(Sambrook J.(1998)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory)，通过在LB中生长培养物并浓缩100倍，然后用冰冷的10％丙三醇洗涤三次将YS1646菌株制备为电感受态。使用λ-Red辅助质粒pKD46(SEQ ID NO:218)在以下设置下使用0.2cm间隙比色皿对所述电感受态菌株进行电穿孔：2.5kV，186ohms，50μF。在30℃将携带pKD46的转化株在具有氨苄青霉素和1mM L-阿拉伯糖的5mL SOC培养基中生长。然后如以上针对YS1646菌株所述将含有λ-Red辅助质粒pKD46的YS1646克隆制备为电感受态。
构建asd基因敲除盒
来自YS1646的基因组的asd基因(Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)用于设计asd基因敲除盒。将含有分别与asd基因的左侧和右侧区域同源的204bp和203bp的质粒转化到DH5-α感受态细胞中(Thermo Fisher Scientific)。将侧翼是lox P位点的卡那霉素基因盒克隆到这个质粒中。然后使用引物asd-l和asd-2(见表1)对asd基因敲除盒进行PCR扩增，并进行凝胶纯化
asd基因的缺失
用凝胶纯化的线性asd基因敲除盒对携带质粒pKD46的YS1646菌株进行电穿孔。在SOC培养基中回收电穿孔的细胞，并将其铺板于补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/ml)的LB琼脂平板上。在这个步骤期间，λ-Red重组酶诱导染色体asd基因与kan盒的同源重组(由于存在于染色体asd基因上游和下游的同源侧翼序列)，并且发生asd基因的染色体拷贝的敲除。通过用来自破坏位点侧翼的YS1646基因组的引物(引物asd-3)和来自多克隆位点的引物(引物scFv-3)进行PCR扩增证实了选择的卡那霉素抗性克隆中存在被破坏的asd基因(表1)。将集落也复制地铺板于有和没有补充DAP的LB平板上，以证实DAP营养缺陷。在没有补充DAP的情况下，所有具有asd基因缺失的克隆均无法生长，这表明DAP营养缺陷。
表1：引物信息
Figure GDA0004138988600001262
Figure GDA0004138988600001271
卡那霉素基因盒去除
通过使用Cre/loxP位点特异性重组系统去除kan选择性标记。用pJWT68(表达cre重组酶的温度敏感质粒，SEQ ID NO:224)转化YS1646Δasd基因KanR突变体。在30℃选择AmpR集落；随后通过在42℃生长而消除pJWT68。然后通过复制铺板在具有和不具有卡那霉素的LB琼脂平板上检测选择的克隆的kan缺失，并使用来自在破坏位点侧翼的YS1646基因组的引物(引物asd-3和asd-4，引物序列见表1)通过PCR验证进行确认。
功能性asd缺失突变体菌株YS1646Δasd(也称作AST-101)的确认
Δasd突变体无法在37℃的LB琼脂平板上生长，但能在包含50μg/mL二氨基庚二酸(DAP)的LB平板上生长。在LB液体培养基中评估Δasd突变体生长速率；其无法在液体LB中生长，但能在补充有50μg/mL DAP的LB中生长，如通过在600nM测量吸光度所测定的。
asd基因缺失后菌株YS1646Δasd中asd基因座序列的序列确认
使用引物asd-3和asd-4(见表1)通过DNA测序来验证asd基因缺失菌株。对在asd基因座侧翼的区域进行测序，证实所述序列中asd基因从YS1646染色体缺失。
通过质粒的asd表达互补asd缺失
化学合成质粒(pATIU6)并组装(SEQ ID NO:225)。所述质粒包含以下特征：高拷贝(pUC19)复制起点，用于驱动短发夹表达的U6启动子，侧翼是随后去除的HindIII限制性位点的氨苄青霉素抗性基因，以及包含在起始密码子上游序列的85个碱基对的asd基因(SEQID NO:246)。通过用SpeI和XhoI进行限制性消化并连接和克隆到大肠杆菌DH5-α中，将靶向鼠TREX1的shRNA引入这个载体。所得的质粒称作pATI-shTREX1。
将质粒电穿孔进免疫刺激细菌菌株中
使用
Figure GDA0004138988600001281
ECM600电穿孔仪，使用0.2cm间隙比色皿(BTX,San Diego,Calif)在以下设置下将含有编码免疫刺激蛋白和功能性asd基因的表达盒的选择的质粒电穿孔到缺乏asd基因的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株中：2.5kV，186ohms，50μF。将经电穿孔的细胞加入补加50μM二氨基庚二酸(DAP)的1mL SOC中，在37℃温育1小时，然后播布于不含DAP的琼脂平板上，以选择接受了具有功能性asd基因质粒的菌株。在分离单集落后，将一个充分分离的鼠伤寒沙门氏菌集落接种在无菌溶原性肉汤(LB)的烧瓶中，在37℃以250RPM搅拌温育，从而产生细胞库。将培养物生长至稳定期后，将细菌在含有10％甘油的PBS中洗涤，在低于-60℃的条件下等份冷冻保存。
将质粒pATI-shTREX1在大肠杆菌中扩增并纯化以通过电穿孔转化为YS1646Δasd菌株中，在LB Amp平板上克隆选择，以产生菌株YS1646Δasd-shTREX1。用与pATIU6衍生的质粒互补的YS1646Δasd突变体能在没有DAP的LB琼脂和液体培养基上生长。
在随后的迭代中，将来自pAT1-shTREX1的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)用卡那霉素抗性基因取代。这是通过用HindIII消化pATI-shTREX1质粒，然后进行凝胶纯化以去除AmpR基因而实现的。使用引物APR-001和APR-002(分别为SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:227)通过PCR扩增卡那霉素抗性(KanR)基因，然后用HindIII消化并连接到凝胶纯化的、消化的pATIU6质粒中。
在随后的迭代中，使用
Figure GDA0004138988600001282
定向位点诱变试剂盒(New England Biolabs)和引物APR-003(SEQ ID NO:228)和APR-004(SEQ ID NO:229)在pUC19复制起点将单点突变引入pATIKan质粒中，以将第148位核苷酸T变为C。这个突变使所述复制起点与pBR322复制起点同源，后者是低拷贝复制起点，以减少质粒拷贝数。
使用asd互补系统在体内证实质粒维持
在这个实施例中，将CT26荷瘤小鼠用含有表达靶向TREX1的shRNA的质粒的菌株YS1646(YS1646-shTREX1)或含有带有功能性asd基因和靶向TREX1的shRNA的质粒的asd缺失的YS1646菌株(YS1646Δasd-shTREX1)处理。
CT26(结肠肿瘤#26)是一种肿瘤模型，源自将BALB/c小鼠暴露于N-硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯(NMU)，导致高度转移癌，重现侵润性、未分化和检查点难治性人结直肠癌(见例如Castle et al.(2014)BMC Genomics 15(1):190)。当经皮下植入侧腹时，与原位植入结肠相反，肿瘤免疫表型更具免疫抑制性和检查点难治性。虽然大量缺乏T细胞浸润，但肿瘤富含如巨噬细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)等骨髓细胞(见例如Zhao et al.(2017)Oncotarget 8(33):54775-54787)。由于这个模型更类似于人微卫星稳定(MSS)结直肠癌，因此是评估本文提供的治疗方法的理想模型。
对于这个实验，为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组3只)在右侧腹部经皮下(SC)接种CT26(购自ATCC)肿瘤细胞(在100μL PBS中2×105个细胞)。在第8、15和23天，为对带有8天龄植入的侧腹部肿瘤的小鼠经静脉注射3剂5×106CFU的YS1646Δasd-shTREX1菌株或亲本菌株YS1646-shTREX1。所述质粒编码shTREX1作为示例的治疗产物；任何其它希望的治疗产物均可被取代。
每周测量两次体重和肿瘤。使用电子卡尺(Fowler,Newton,MA)进行肿瘤测量。肿瘤体积采用修正的椭圆体公式1/2(长×宽2)计算。根据IACUC规定，当肿瘤大小达到体重的>20％或坏死时，对小鼠实施安乐死。
在最后一次注射沙门氏菌后12天，将肿瘤匀浆，并将匀浆连续稀释及铺板于LB琼脂平板上，以计算存在的集落形成单位(CFU)的总数，或铺板于含有卡那霉素的LB平板上以计算卡那霉素抗性集落数量。
结果表明，鼠伤寒沙门氏菌YS1646-shTREX1没有选择压力以维持shRNA质粒，并且表现出显著的质粒损失，因为卡那霉素抗性(KanR)集落百分比小于10％。使用asd基因互补系统进行质粒维持的菌株YS1646Δasd-shTREX1具有几乎相同数量的卡那霉素抗性和卡那霉素敏感性CFU。这些数据表明，asd基因互补系统足以在小鼠肿瘤微环境的背景下维持质粒。
使用asd互补系统增强的抗肿瘤效力
asd互补系统被设计为防止质粒缺失及增强鼠伤寒沙门氏菌菌株在体内递送治疗产物的抗肿瘤功效。为了测试这一点，将含有shTREX1质粒(YS1646Δasd-shTREX1)或含有功能性asd基因盒的乱序对照(YS1646Δasd-shSCR)的YS1646Δasd菌株在鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效与含有质粒pEQU6-shTREX1的YS1646菌株(YS1646-shTREX1)进行比较，质粒pEQU6-shTREX1是一种缺乏asd基因盒的质粒，因此没有质粒维持机制。shTREX1是示例的治疗产物。
对于这个实验，为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组8只)经皮下在右侧腹部接种CT26细胞(在100μL PBS中2×105个细胞)。在第8天和第18天，为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉注射5×106CFU的YS1646Δasd-shTREX1或YS1646-shTREX1，并与PBS对照组进行比较。
与PBS相比，YS1646-shTREX1菌株表现出增强的肿瘤控制(70％肿瘤生长抑制(TGI)，第28天)，尽管其质粒随着时间的推移而缺失。与PBS相比，含有具有asd基因互补系统的质粒和shTREX1的Δasd菌株(YS1646Δasd-shTREX1)显示出优于PBS的肿瘤生长抑制(82％ TGI，p＝0.002，第25天)。这些数据表明，与包含不具有asd基因互补系统的质粒的YS1646相比，通过防止质粒缺失、使用asd互补系统和shTREX1的递送，可以提高效力。因此，具有asd互补系统的菌株是优良的抗癌治疗剂。
实施例4
通过缺失fliC和fljB基因的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白敲除
菌株工程化和鉴定
在本文的实施例中，将含有asd基因缺失的活的减毒的鼠伤寒沙门菌菌株YS1646进一步工程化以缺失fliC和fljB基因，以除去两个鞭毛蛋白亚基。这样消除了促炎TLR5激活，以减少促炎信号传导和改良抗肿瘤适应性免疫。
fliC基因的缺失
在这个实施例中，如在前述实施例中详细描述的使用Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))的修改方法将fliC从YS1646Δasd菌株的染色体中缺失。简而言之，将在fliC基因侧翼含有224个和245个碱基的同源序列的合成的fliC基因同源臂序列，克隆进称为pSL0147的质粒(SEQ ID NO:230)中。然后将侧翼是cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到质粒pSL0147中，然后用引物fliC-l(SEQ ID NO:232)和fliC-2(SEQ ID NO:233)对fliC基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，然后通过电穿孔将其引入带有温度敏感性λ-Red重组质粒pKD46的YS1646Δasd菌株中。在SOC+DAP培养基中回收电穿孔的细胞，并铺板于补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/mL)的LB琼脂板上。选择集落并筛选以通过使用引物fliC-3(SEQ ID NO:234)和fliC-4(SEQ IDNO:235)进行PCR以插入敲除片段。然后通过在42℃培养选择的卡那霉素抗性菌株及筛选氨苄青霉素抗性丧失对pKD46进行处理。然后，通过电穿孔表达Cre重组酶的温度敏感质粒(pJW168)处理卡那霉素抗性标记，在30℃选择AmpR集落；随后通过在42℃生长培养物以消除pJW168。然后通过使用在破坏位点侧翼的引物(fliC-3和flic-4)进行PCR和在琼脂糖凝胶上的电泳迁移率的评估，以检测选择的fliC敲除克隆的卡那霉素标记缺失。
fljB基因的缺失
然后，使用上述修饰方法，在YS1646Δasd/ΔfliC菌株中缺失fljB。合成的fljB基因同源臂序列，其含有fliB基因侧翼的分别为249和213个碱基的左手侧和右手侧序列，将其合成并克隆到称为pSL0148的质粒中(SEQ ID NO:231)。然后将侧翼是cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0148中，然后用引物fljb-l(SEQ ID NO:236)和fljb-2(SEQ IDNO:237)(见表1)对fljB基因敲除盒进行PCR扩增及凝胶纯化，通过电穿孔将其引入带有温度敏感性λ-Red重组质粒pKD46的YS1646Δasd/ΔfliC菌株中。然后如上所述通过Cre-介导的重组以处理卡那霉素抗性基因，通过在非容许温度下生长以处理温度敏感性质粒。通过分别使用引物fliC-3和fliC-4或fljb-3(SEQ ID NO:238)和fljb-4(SEQ ID NO:239)进行PCR以扩增fliC和fljB基因敲除序列，通过DNA测序进行验证。将YS1646的这个突变衍生物命名为YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB，或简短称作YS1646Δasd/ΔFLG。
工程化的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白敲除菌株的体外鉴定
通过将10μL的过夜培养物点样于游泳平板(含有0.3％琼脂和50mg/mL的DAP的LB)上以评估具有fliC和fljB缺失的YS1646衍生的asd-突变菌株(在本文称为YS1646Δasd/ΔFLG)的游泳运动性。虽然观察到了YS1646Δasd菌株的运动性，但YS1646Δasd/ΔFLG菌株明显没有运动性。然后将YS1646Δasd/ΔFLG菌株用含有asd基因的质粒电穿孔，评估其在没有DAP下的生长速率。具有asd互补质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株在不存在补充DAP的情况下能在LB中复制，并且以与含有asd互补质粒的YS1646Δasd菌株相当的速率生长。这些数据表明，鞭毛蛋白的消除不降低鼠伤寒沙门菌在体外的适应性。
鞭毛的消除降低鼠巨噬细胞中的细胞焦亡
在庆大霉素保护试验中以MOI约100用均具有asd互补质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株或亲本YS1646Δasd菌株感染5×105个小鼠RAW巨噬细胞(InvivoGen,San Diego,Ca.)。感染24小时后，使用PierceTM LDH细胞毒性测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma.)，收集培养物上清液并评估作为细胞死亡的标志的乳酸脱氢酶释放。YS1646Δasd菌株诱导75％的最大LDH释放，而YS1646Δasd/ΔFLG菌株诱导54％的最大LDH释放，表明鞭毛蛋白基因的缺失降低了鼠伤寒沙门菌诱导的感染的巨噬细胞的细胞焦亡。
鞭毛缺失的突变体导致感染的人单核细胞中较少的细胞焦亡
为了证实YS1646Δasd/ΔFLG菌株引起巨噬细胞中细胞死亡的能力降低，将THP-1人巨噬细胞(ATCC目录号#202165)用鼠伤寒沙门氏菌菌株YS1646和YS1646Δasd/ΔFLG菌株感染，Δasd菌株含有编码功能性asd基因的质粒以确保质粒维持。将5×104个细胞置于具有DMEM和10％ FBS的96孔培养皿中。将细胞用洗涤的鼠伤寒沙门氏菌对数期培养物感染1小时，MOI为100CFU/细胞，然后用PBS洗涤细胞，并将培养基替换为含有50μg/mL庆大霉素和50ng/mL的IFNγ的培养基，庆大霉素用以杀死细胞外细菌，IFNγ用以将单核细胞转化为巨噬细胞表型。24小时后，将THP-1细胞用
Figure GDA0004138988600001311
试剂(Promega)染色，存活细胞的百分比使用发光细胞存活测定法确定，使用/>
Figure GDA0004138988600001312
M3平板读器(Molecular Devices)以量化发光。感染YS1646菌株的细胞只有38％的存活率，而感染YS1646Δasd/ΔFLG菌株的细胞有51％的存活率，表明鞭毛蛋白基因的缺失导致人巨噬细胞的细胞死亡减少，尽管具有非常高的超生理性MOI。
在全身性施用后鞭毛不再为肿瘤定植所需要
为了评估在结肠癌小鼠模型中施用的鞭毛蛋白敲除菌株的影响，为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只小鼠)经皮下在右侧腹部接种CT26细胞(100μL PBS中的2×105个细胞)。带有10天已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉注射单剂量3×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株或亲本YS1646Δasd-shTREX1菌株。在肿瘤植入后第35天，对小鼠实施安乐死，将肿瘤均质化及铺板于LB平板上以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)数。YS1646Δasd-shTREX1菌株定植的肿瘤的平均值为每克肿瘤组织5.9×107CFU，而鞭毛缺失的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株定植的肿瘤的平均值几乎增加了2倍，为每克肿瘤组织1.1×108CFU。YS1646Δasd-shTREX1菌株的脾定植经计算为平均每克脾组织1.5×103CFU，而鞭毛缺失的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株的脾定植略低，平均为每克脾组织1.2×103CFU。
这些数据表明，在静脉内施用后，鞭毛的缺失不仅不会对肿瘤定植产生负面影响，而且与鞭毛完整菌株相比增强肿瘤定植。重要的是，鞭毛的缺失略微减少脾定植，使肿瘤与脾的比率是100,000倍。这些数据表明，与本领域的预期相反，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且其消除增强了肿瘤定植同时减少了脾定植。
鞭毛缺失的菌株在小鼠中证实增强的抗肿瘤活性
为了评估在结肠癌小鼠模型中施用鞭毛蛋白敲除菌株的影响，将6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种CT26细胞(在100μL PBS中2×105个细胞)。为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射单剂量3×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株或YS1646Δasd-shTREX1菌株，并与PBS对照组进行比较。通过卡尺测量监测小鼠的肿瘤生长。
结果表明，与亲本YS1646Δasd-shTREX1菌株相比，无法产生鞭毛的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株显示出增强的肿瘤控制(27％ TGI，第24天)，与PBS对照组相比具有显著的肿瘤控制作用(73％ TGI，p＝0.04，第24天)。这些数据表明，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且鞭毛的缺失可以增强抗肿瘤功效。
鞭毛缺失的菌株在鼠肿瘤模型中证实增强的适应性免疫
评估了鞭毛缺失对免疫应答的影响，以及肿瘤骨髓细胞向STING检查点基因TREX1递送shRNA而激活STING是否会促进适应性I型IFN免疫特征。使用CT26结肠癌小鼠模型，其中为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种CT26细胞(100μL PBS中2×105个细胞)。携带已建立的侧腹肿瘤的小鼠在肿瘤植入后11天用5×106CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株、或亲本YS1646Δasd-shTREX1或乱序质粒对照菌株YS1646Δasd-shSCR进行静脉注射，并与PBS对照组进行比较。在给药后7天在肝素钠涂层管(BecktonDickinson)上对小鼠进行放血。然后用等体积的PBS稀释未凝固的血液，使用
Figure GDA0004138988600001321
-M细胞分离试剂(Cedarlane)从全血的中间层中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过在室温以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤分离的PBMC，并重新悬浮在流动缓冲液中。在V形底96孔平板的每个孔中接种100万个PBMC。将细胞在室温(RT)下以1300RPM离心3分钟，然后在室温避光重悬于100μL流动缓冲液中45分钟，所述缓冲液中含有荧光染料缀合的AH1肽：MHCI类四聚体(MBL International)和细胞表面流式细胞术抗体CD4 FITC克隆的RM4-5、CD8aBV421克隆53-6.7、F4/80APC克隆BM8、CD11b PE-Cy7克隆M1/70、CD45 BV570克隆30-F11、CD3 PE克隆145-2C11、Ly6C BV785克隆HK1.4、I-A/I-E APC-Cy7克隆M5/114.15.2、Ly6GBV605克隆1A8和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69(均来自BioLegend)。45分钟后，通过以1200RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于含有DAPI(4’,6-二氨基-2-苯基吲哚，死/活(dead/live)染色)的PBS+2％ FBS中，立即使用/>
Figure GDA0004138988600001323
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取数据，并使用F1owJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
以下细胞类型被列举为总活细胞的百分比：CD11b+Gr1+中性粒细胞(可能是MDSC，但需要在离体功能测定中进一步表型)、CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD8+ T细胞和识别CT26肿瘤排斥抗原gp70(AH1)的CD8+ T细胞，鼠白血病病毒(MuLV)相关细胞表面抗原的包膜基因产物(见例如Castle et al.(2014)BMC Genomics 15(1):190)。
下表总结的结果表明，与PBS(p＝0.02)相比、与鞭毛完整的菌株YS1646Δasd-shTREX1(p＝0.02)相比、与鞭毛缺失的的菌株YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1(p＝0.01)(其具有最低水平的循环中性粒细胞)相比，含有编码非特异性乱序shRNA的质粒的YS1646Δasd-shSCR菌株引发了显著增加的中性粒细胞的典型抗菌免疫应答。相似地，与PBS(p＝0.01)相比、与YS1646Δasd-shTREX1菌株(p＝0.01)相比以及与YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株(p＝0.01)相比，在YS1646Δasd-shSCR菌株中细菌诱导的巨噬细胞也显著升高。因此，携带诱导I型IFN的有效载荷的两种菌株均能覆写正常的抗菌免疫应答，通过中性粒细胞和巨噬细胞清除细菌感染，并且不会诱导适应性T细胞介导的免疫。然而，虽然所有组中CD8+ T细胞整体循环水平相似，但鞭毛缺失的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株与PBS相比显示出显著增加的AH1-四聚体+CD8+ T细胞百分比(p＝0.04)。
这些数据表明对细菌进行工程化以将病毒样I型IFN诱导质粒递送至肿瘤驻留骨髓细胞的可行性。这导致免疫应答的明显重新编程为更多病毒免疫性和更少细菌免疫性。鞭毛的缺失进一步增强了从细菌募集的中性粒细胞和巨噬细胞向显著增加的肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞转变。因此，消除细菌TLR5介导的炎症可增强适应性免疫。
Figure GDA0004138988600001322
Figure GDA0004138988600001331
SD＝标准差
鞭毛缺失菌株限于体内吞噬性骨髓免疫细胞区室
根据文献，ΔfljB/ΔfliC菌株显示出抑制许多与SPI-1介导的进入非吞噬细胞相关的下游基因。为了确定YS1646Δasd/ΔFLG菌株是否也缺乏非吞噬细胞摄取，将在细菌rpsM启动子控制下组成型表达mCherry(红色荧光蛋白)的YS1646Δasd/ΔFLG菌株经静脉注射到MC38皮下携带侧腹肿瘤的小鼠中。
MC38(鼠结肠腺癌#38)模型的衍生与CT26模型相似地使用诱变衍生，但使用二甲肼嗪和C57BL/6小鼠品系(见例如Corbett et al.(1975)Cancer Res.35(9):2434-2439)。与CT26类似，与原位植入结肠相比，皮下植入导致更多的T细胞排除和免疫抑制性肿瘤微环境(见例如Zhao et al.(2017)Oncotarget 8(33):54775-54787)。MC38具有比CT26更高的突变负荷，CD8+ T细胞可以检测类似的病毒衍生的gp70抗原(p15E)，尽管其不被视为排斥抗原。虽然已发现MC38的变体对检查点疗法有部分反应，但大多数细胞系变体被认为是检查点难治性的及T细胞排除的(见例如Mariathasan et al.(2018)Nature 555:544-548)，包括本文使用的MC38细胞。
本实验中，6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第34天，为带有较大的建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射l×106CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry菌株。静脉给药后7天切除肿瘤并切成2至3mm的小块，放入装有2.5mL酶混合物(RPMI-1640 10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL DNase I)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离肿瘤块，将整个细胞制备物在37℃搅拌温育45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入肿瘤)程序进行第二轮解离，所得单细胞悬浮液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL的RPMI-1640+10％ FBS洗涤一次，然后使用新的70μM尼龙网将细胞再次过滤到新的50mL管中。将尼龙网用5mL的RPMI-1640+10％ FBS洗涤，然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将所得解离的细胞重新悬浮在PBS中并在染色之前在冰上保持。
对于流式细胞术染色，将100μL的单细胞悬浮液接种在V形底的96孔平板的孔中。每孔加入100μL含有死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc封闭试剂(BDBiosciences)的PBS，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于PBS+2％ FBS中，其中含有荧光染料缀合的抗体(CD4 FITC克隆RM4-5、CD8a BV421克隆53-6.7、F4/80 APC克隆BM8、CD11b PE-Cy7克隆M1/70、CD45 BV570克隆30-F11、CD3 PE克隆145-2C11、Ly6C BV785克隆HK1.4、I-A/I-EAPC-Cy7克隆M5/114.15.2、Ly6G BV605克隆1A8和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69，均来自BioLegend)，在冰上避光温育30分钟。30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次，然后重悬在流式细胞术固定缓冲液(ThermoFisher Scientific)中。流式细胞术数据使用
Figure GDA0004138988600001332
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
结果表明，7.27％的肿瘤浸润单核细胞在肿瘤微环境中摄取了鞭毛缺失的mCherry菌株。相似地，8.96％的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和3.33％的肿瘤浸润树突状细胞(DC)摄取了鞭毛缺失的mCherry菌株。相反，在CD45-群体中，对应于基质细胞和肿瘤细胞，只有0.076％的mCherry表达呈阳性(与0.067％的背景染色相比)。这些数据表明鞭毛及其下游信号传导对SPI-1的影响对于使上皮细胞具有感染性是必要的，并且其缺乏将细菌的摄取限于仅肿瘤微环境(即肿瘤驻留免疫/骨髓细胞)的吞噬免疫细胞区室。
鞭毛的缺失赋予免疫刺激性鼠伤寒沙门氏菌菌株多种益处，包括消除TLR5诱导的抑制适应性免疫的炎性细胞因子，减少巨噬细胞焦亡，以及在全身施用时维持(或增强)肿瘤特异性富集，其中摄取被限于肿瘤驻留吞噬细胞。
实施例5
沙门氏菌pagP基因敲除菌株工程化和鉴定
在这个实施例中，对YS1646Δasd/ΔFLG菌株进一步修饰以缺失pagP基因。pagP基因在鼠伤寒沙门氏菌的感染性生命周期中被诱导，并编码用棕榈酸酯修饰脂质A的一种酶(脂质A棕榈酰转移酶)。在野生型鼠伤寒沙门氏菌中，pagP的表达产生七酰化的脂质A分子。在msbB-突变体中，其中不能加入脂质A的末端酰基链，因此pagP的表达产生六酰化脂质A分子。具有六酰化脂质A的LPS已示出具有高度的促炎性，并且对TLR4具有高亲和性(在野生型中发现的七酰化LPS对TLR4的亲和性最高)。在这个实施例中，缺失pagP和msbB的菌株只能产生五酰化脂质A，因此当所述细菌被工程化为递送编码免疫调节蛋白的质粒时可以由于其对TLR4的亲和性较低而减少促炎细胞因子，增强耐受性，以及增加适应性免疫。
ΔpagP菌株构建
使用前述实施例中描述的方法的修改，从YS1646Δasd/ΔFLG菌株中缺失pagP基因。合成的pagP基因同源臂序列在pagP基因的侧翼分别包含左侧和右侧序列的203和279个碱基，其被合成及克隆到称为pSL0191(SEQ ID NO:331)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0191中，使用引物pagp-1(SEQ ID NO:315)和pagp-2(SEQID NO:316)对pagP基因敲除盒进行PCR扩增(见表1)、凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ-Red重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，及通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。使用引物pagp-3(SEQ ID NO:317)和pagp-4(SEQ ID NO:318)通过PCR扩增pagP基因敲除序列，且通过DNA测序验证。所得YS1646突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP。
pagP缺失突变体具有五酰化LPS及诱导减少的炎性细胞因子
使用Datsenko and Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))及上文所述的λ衍生的Red重组系统，从YS1646Δasd菌株中缺失pagP基因，产生菌株YS1646Δasd/ΔpagP。然后用含有功能性asd基因的质粒对这个菌株进行电穿孔，以补充缺失的asd基因并确保体内质粒维持。然后从这个菌株中提取脂质A并通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI MS)进行评估，并与来自野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株ATCC14028、YS1646菌株(缺失msbB和purI)以及YS1646Δasd菌株的脂质A进行比较。由于存在功能性msbB基因，野生型沙门氏菌具有质量为2034的次要脂质A峰和质量为1796的主要峰，分别对应于七酰化和六酰化脂质A。msbB缺失菌株YS1646和YS1646Δasd具有在1828和1585处的主要峰，对应于六酰化和五酰化脂质A的混合物。msbB和pagP缺失菌株YS1646Δasd/ΔpagP只有一个质量为1585的单峰，对应于五酰化脂质A。这些数据表明pagP的缺失阻止脂质A的棕榈酰化，从而将其限制为单一的五酰化物质。
为了确定来自ΔpagP突变株的五酰化脂质A降低TLR4信号传导，将4μg来自野生型菌株、YS1646菌株或YS1646Δasd/ΔpagP菌株的纯化LPS加入THP-1人单核细胞中(ATCC目录号#TIB-202)，在24小时后使用Cytometric Bead Array(CBA)试剂盒(BD Biosciences)评估上清液中炎症细胞因子的存在。结果显示，与野生型LPS相比，来自YS1646Δasd/ΔpagP菌株的LPS诱导的TNFα量是野生型LPS的25％，诱导的IL-6比野生型LPS少7倍。来自YS1646Δasd/ΔpagP菌株的LPS诱导的IL-6比菌株YS1646少22倍，表明来自ΔpagP突变体的五酰化LPS物质在人细胞中的炎症显著降低，并表明ΔpagP突变体在人体中的耐受性更好。
在原代人M2巨噬细胞中pagP缺失诱导显著减少的IL-6
为了证实YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株在原代人M2巨噬细胞中也引起较少的炎症和剂量限制性IL-6，对这个菌株进行了评估，并与YS1646Δasd/ΔFLG和亲本YS1646菌株进行了比较。来自人供体的M2巨噬细胞代表了在排除T细胞的实体瘤中高度富集的免疫抑制表型。将从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1X非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，并在室温下以800RPM离心10分钟进行洗涤。将PBMC重悬于PBS+2％ FBS中，使用CD16耗竭试剂盒(depletion kit)(StemCell Technologies)负分离单核细胞。然后通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤分离的未接触的单核细胞，并重新悬浮在含有100ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。将分离的单核细胞(每孔3e5)接种到24孔平板中，终体积为750μL。接种两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的500μl完全培养基，持续48小时。然后在第6天，将细胞培养基完全吸出并替换为仅不含细胞因子的新鲜完全培养基，或替换为含有鼠伤寒沙门氏菌菌株对数期培养物(MOI为20)的培养基。感染细胞1小时，然后用PBS洗涤，更换含50μg/mL庆大霉素的新鲜培养基，以杀灭胞外细菌。然后将孔洗涤并更换为新鲜培养基，在37℃和5％ CO2下温育。48小时后，收集上清液并根据制造商的说明使用人IL-6细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒(BD Biosciences)测定细胞因子。
结果表明，感染亲本YS1646菌株的人原代M2巨噬细胞分泌的IL-6水平平均为14839±926pg/mL，而感染YS1646Δasd/ΔFLG菌株的IL-6水平明显较低，为2075±723pg/mL(p＝0.004)。这进一步证实了鞭毛的缺失和TLR5信号传导的消除对诱导IL-6的影响。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP引起最低的IL-6水平，为332±100pg/mL，表明这种修饰的LPS包被刺激TLR4的能力降低，从而显著降低了炎性IL-6的产生。
鞭毛和pagP组合缺失显著增强小鼠中的耐受性
为了确定上述修饰的菌株比亲本菌株YS1646减毒程度更高，进行了中位致死剂量(LD50)研究。为6-8周龄BALB/c小鼠(每组5只)静脉注射剂量范围为3e5至3e7 CFU的YS1646菌株或衍生菌株YS1646Δasd/ΔFLG、YS1646Δasd/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP。与菌株YS1646不同，衍生菌株还携带编码鼠IL-2的质粒，这是一种FDA批准的细胞因子，在全身施用时表现出显著的毒性。
发现菌株YS1646的LD50为4.4×106CFU(两项研究的平均值)，与先前发表的YS1646的LD50报告一致，与野生型鼠伤寒沙门氏菌相比提高了>1000倍(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。YS1646Δasd/ΔFLG菌株的LD50被确定为2.07×107CFU，表明与YS1646菌株相比毒力降低了4.5倍以上。YS1646Δasd/ΔpagP菌株的LD50被确定为1.39×106CFU，表明与YS1646菌株相比毒力降低了3.2倍，这是预期的，因为所述菌株仍然具有高度炎症性鞭毛。无法确定YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株的LD50，因为在给予的最高剂量时没有小鼠死亡，但LD50大于6.2×107CFU。因此，与亲本菌株YS1646相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株的毒力降低了>14倍。这些数据表明，上述遗传修饰降低了临床鼠伤寒沙门氏菌菌株YS1646(也称作VNP20009)的毒力，因此导致在人体中的耐受性提高。
在VNP20009的I期临床试验中(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)，在测试的两个最高剂量3×108CFU/m2(33％存在)和1×109CFU/m2(50％存在)观测到患者肿瘤中仅部分存在所述细菌，表明VNP20009的耐受剂量太低，无法实现肿瘤定植。通过上述修饰改良菌株的耐受性，如有必要，可以施用>14倍更高的剂量，改善肿瘤定植患者的百分比，并提高每个肿瘤的治疗性定植水平，从而解决施用VNP20009所观测到的问题。
鞭毛和PagP组合缺失显著限制小鼠中抗鼠伤寒沙门氏菌抗体的产生
来自3×106CFU给药组(N＝5，除了YS1646给药组中为N＝4)的存活小鼠在静脉给药后保持40天，此时对其放血取血清并通过改进的基于流动的抗体滴定系统评估对于鼠伤寒沙门氏菌的抗体滴度。洗涤YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry菌株的过夜培养物并用流式细胞术固定缓冲液固定。将来自先前处理过的小鼠和来自未经处理的对照小鼠的血清接种在96孔平板中，在PBS中进行系列稀释。接下来，将含有1×106CFU的25μLYS1646Δasd/ΔFLG-mCherry培养物加入血清中，并室温下温育25分钟。然后通过以4000RPM的速度旋转5分钟，用PBS洗涤细菌两次。最后一次洗涤后，将细菌重悬于含有二级山羊抗小鼠Fc AF488抗体(原液的1/400稀释液)的PBS中，在室温下避光温育25分钟。然后将细菌以4000RPM旋转5分钟，用PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，将细菌重悬于PBS中，使用
Figure GDA0004138988600001361
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取数据，并使用MFI F1owJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
为评价流式细胞术的结果，选择所有组中具有信号的最高稀释度(1250×血清稀释度)，并绘制相应的平均荧光强度(MFI)值。在MFI为1000选择检测限度(LOD)，因为这是在没有染色以及仅使用山羊抗小鼠Fc AF488抗体背景染色的情况下获得的MFI。因此，MFI大于1000被认为是阳性信号，尽管具有MFI值，但所有等于或低于这个值均被认为是阴性结果。
这个测定的结果揭示了来自用3×106CFU的YS1646菌株的处理的小鼠的抗鼠伤寒沙门氏菌血清抗体的高MFI滴度(MFI为29196.3±20730)，与先前公布的YS1646能产生血清抗体(非中和)的数据一致。用YS1646Δasd/ΔFLG菌株处理的小鼠中检测到的抗体较少(MFI为11257±9290)，这可能是由于缺乏鞭毛佐剂活性所致。在用YS1646Δasd/ΔpagP菌株处理的小鼠中，与菌株YS1646(p＝0.033)相比，产生的抗体显著减少(MFI为4494±3861)，这可能是由于LPS表面包被改变所致。表明在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP治疗组中血清抗体降低最显著(MFI为1930±2445)，其中一些小鼠的MFI滴度低于1000，因此被认为血清抗体阴性(p＝0.021，相对于菌株YS1646)。因此，鞭毛和pagP基因的组合缺失既能提高安全性，又能显著降低免疫原性，这将可以在人体中重复给予高CFU剂量。
与菌株YS1646相比，pagP和鞭毛缺失的菌株及其组合在人血清中表现出显著更高的存活率
菌株YS1646在全身性施用后在人体中呈现出受限的肿瘤定植。本文示出菌株YS1646被人血液中的补体因子失活。为了证实这一点，将菌株YS1646和大肠杆菌D10B与本文提供的含有改变细菌表面的额外突变的示例免疫刺激细菌进行比较。这些示例修饰的菌株是YS1646Δasd/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP。除了YS1646和大肠杆菌D10B培养物外，将这三个菌株与来自集合的小鼠血液或集合的健康人供体(n＝3)的血清或热失活(HI)血清在37℃温育3小时。与血清温育后，将细菌连续稀释，铺板于LB琼脂平板上，测定集落形成单位(CFU)。
在小鼠血清中，所有菌株都保持100％的存活率，并且对补体失活完全抗性。在人血清中，所有菌株在热失活血清中均100％存活。3小时后，在全人血清中完全消除了大肠杆菌D10B菌株。在全人血清中，YS1646菌株仅显示6.37％的活集落，表明YS1646临床菌株的肿瘤定植由于人血中的补体失活而受到限制。对于YS1646Δasd/ΔFLG菌株，在与人血清温育3小时后，31.47％的活集落保留，而对于YS1646Δasd/ΔpagP菌株，72.9％的活集落保留。组合的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株对人血清中的补体完全抗性。
这些数据解释了菌株YS1646(VNP20009)在全身施用时为什么具有非常低的肿瘤定植。本文示出菌株YS1646对人血清中的补体失活高度敏感，但对小鼠血清中的补体失活不敏感。这些数据解释了为什么在人体中观察到的肿瘤定植有限，而小鼠肿瘤定植水平很高。fljB/fliC或pagP缺失或这些突变的组合，部分或完全挽救了这个表型。因此，在用YS1646Δasd/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株在人血清中观察到的增强的稳定性提供了增加的人肿瘤定植。
实施例6
沙门氏菌ansB基因敲除菌株工程化和鉴定
在这个实施例中，将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株进一步修饰以缺失ansB，即编码细菌L-天冬酰胺酶II的基因。在T细胞存在的情况下，鼠伤寒沙门氏菌分泌L-天冬酰胺酶II已示出通过降低T细胞受体(TCR)表达和削弱胞溶性细胞因子的产生直接削弱T细胞功能。因此，这几十年来，细菌衍生的天冬酰胺酶已成功用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)。ansB的缺失消除了鼠伤寒沙门氏菌产生L-天冬酰胺酶II的能力，从而增强了T细胞在细菌定植的肿瘤微环境中的功能。
ΔansB菌株构建
使用前述实施例中描述的方法的加以修改，从YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株中缺失ansB基因。合成的ansB基因同源臂序列分别含有位于ansB基因侧翼的左侧和右侧序列的236和251个碱基，将其合成并克隆到称为pSL0230(SEQ ID NO:332)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0230中，并用引物ansb-1(SEQ ID NO:319)和ansb-2(SEQ ID NO:320)对ansB基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ-Red重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。ansB基因敲除序列使用引物ansb-3(SEQ ID NO:321)和ansb-4(SEQ ID NO:322)(见表1)通过PCR扩增，并通过DNA测序验证。所得YS1646突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB。
ansB的缺失在体外消除天冬酰胺酶活性
为了确定YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株是否产生较少的L-天冬酰胺酶II，将该菌株的培养物与ansB完整的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株一起在LB中生长并使其达到稳定期。此时，根据制造商的说明，使用比色天冬酰胺酶检测试剂盒(Sigma-Aldrich)分析来自50μL条件培养基中培养物的天冬酰胺酶活性。温育40分钟后，使用
Figure GDA0004138988600001381
M3分光光度计(Molecular Devices)读取在570nm的吸光度的吸光度单位。
与吸光度为1.95的重组L-天冬酰胺酶II阳性对照相比，ansB-完整的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株的吸光度为0.82。然而，在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失ansB会导致天冬酰胺酶活性的背景水平，在0.109的吸光度下检测到。这些数据证实ΔansB突变完全消除了天冬酰胺酶的活性。
ansB的缺失在体外共培养测定中恢复T细胞功能
为了在功能上鉴定ansB缺失菌株关于降低的L-天冬酰胺酶II活性对T细胞的影响，使用菌株感染的鼠原代骨髓衍生巨噬细胞(BMM)建立共培养测定，与脾纯化的T细胞一起培养。对于这个测定，从健康BALB/c小鼠分离和解离脾，使用小鼠T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)，按照制造商的说明分离脾CD4+和CD8+ T细胞。从分离的T细胞中，将2e5细胞/孔添加到平底96孔平板中，该平板预先已用5μg/ml抗小鼠CD3ε抗体(克隆145-2C11，Thermo Fisher Scientific)包被。将在条件LB培养基中生长至静止期的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB培养物，通过0.45μM尼龙网过滤并加入T细胞中，添加或不添加10μg/ml用于共刺激的激动性CD28抗体。含有20U/mL重组天冬酰胺酶和正常培养基的对照组用作该测定中的对照。将平板在5％CO2温育箱中于37℃下温育。在温育后24小时，从孔中收集100μL的共培养上清液，并进行鼠Th1特异性细胞因子珠阵列(CBA，BioLegend)。同时，收集T细胞并通过流式细胞术分析在CD4+和CD8+ T细胞上表面T细胞受体β(TCRβ)的表达，以及IFNγ、TNFα和IL-2的细胞内染色。
结果证实，ansB-完整菌株(YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP)用于感染巨噬细胞并随后与T细胞共培养，可诱导严重的T细胞免疫抑制。与培养基对照和20U/mL重组天冬酰胺酶的阳性对照相比，CD4+和CD8+ T细胞中TCRβ表面表达均显著下调(见下表)表明了这一点。与亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失ansB显著恢复了CD4+(p＝0.004)和CD8+ T细胞(p＝0.002)中的TCRβ表面表达。
Figure GDA0004138988600001382
SD＝标准差
共培养24小时后，测量细胞因子的T细胞分泌作为T细胞胞溶功能的标志。如下表所示，与培养基对照相比，用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株处理后，细胞因子IFNγ、TNFα和IL-2的T细胞产生显著降低，并且通过在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失ansB而明显恢复(IFNγ(p＝0.05)，TNFα(p＝0.012)，及IL-2(p＝0.006))。这些数据表明，与亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中ansB的缺失显著恢复了T细胞的胞溶功能。
Figure GDA0004138988600001391
SD＝标准差
ansB的缺失在体内恢复肿瘤驻留T细胞TCRβ的表达
在体外共培养测定中，通过流式细胞术编码ansB的表达对T细胞功能的免疫抑制作用，包括对T细胞TCRβ表达的下调。为了评估这是否会在体内同样发生，使用了结直肠癌的MC38小鼠模型。
对于这个实验，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组4只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第17天，为带有较大已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉内注射1×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry菌株。在经静脉内给药后7天切除肿瘤并切成2-3mm的碎片放入充填2.5mL酶混合物(含有10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL DNase I的RPMI-1640)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入的肿瘤)解离肿瘤碎片，然后在37℃下搅拌温育全细胞制备物45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入的肿瘤)程序进行第二轮解离，将所得单细胞悬浮液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL RPMI-1640+10％FBS洗涤一次，然后使用新的70μM尼龙网将细胞第二次过滤到新的50mL管中。将尼龙网用5mL RPMI-1640+10％FBS洗涤，然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将得到的解离细胞重新悬浮在PBS中，并在染色过程前保持在冰上。
对于流式细胞术染色，将100μL单细胞悬液接种在V形底96孔平板的孔中。以每孔100μL加入含有死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc阻断剂(BD Biosciences)的PBS，并将细胞在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％FBS洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于含有荧光染料缀合的抗体(CD45BV570克隆30-F11；TCRβPE克隆H57-597；和CD4 FITC克隆RM4-5；均来自BioLegend)和DAPI(BioLegend)的PBS+2％FBS中，避光在冰上温育30分钟。30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％FBS洗涤细胞两次，并重新悬浮在流式细胞仪固定缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中。使用ACEA
Figure GDA0004138988600001392
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如下表所示，TCRβ在肿瘤浸润的CD4+ T细胞上的表面表达的平均荧光强度(MFI)在肿瘤内与定殖的亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株相互作用后显著ansB缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株(p＝0.042)，后者甚至高于PBS对照处理的小鼠。
Figure GDA0004138988600001401
MFI＝平均荧光强度；AVG＝平均值；SD＝标准差
总之，这些数据证实缺失ansB基因以恢复T细胞功能的必要性，因为细菌产生了免疫抑制性L-天冬酰胺酶II，并表明了在具有ansB缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中观察到的增强的T细胞功能。
实施例7
沙门氏菌csgD基因敲除菌株工程化和鉴定
将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株进一步修饰以缺失csgD，这是控制鼠伤寒沙门氏菌卷曲菌毛形成、纤维素产生和c-di-GMP产生的主要基因。csgD缺失消除了纤维素介导的生物膜形成的可能性，减少了促炎信号传导，并增强了宿主吞噬细胞的摄取。这种细胞内定位的增加将因此增强质粒递送和免疫调节蛋白产生的效力。
ΔcsgD菌株构建
使用前述实施例中描述的方法的修改，在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失csgD基因。合成的csgD基因同源臂序列分别含有位于csgD基因的侧翼的左侧和右侧序列的207和209个碱基，将其合成并克隆到称为pSL0196(SEQ ID NO:333)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0196中，用引物csgd-1(SEQ ID NO:323)和csgd-2(SEQ ID NO:324)对csgD基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ-Red重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ansB中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，通过在非许可温度下生长以处理温度敏感质粒。使用引物csgd-3(SEQ ID NO:325)和csgd-4(SEQ ID NO:326)通过PCR扩增csgD基因敲除序列，并通过DNA测序验证。亲本菌株YS1646的所得突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD。
csgD-缺失菌株在刚果红(Congo Red)平板上不能形成RDAR集落
在刚果红平板上生长后形成粗糙干燥和红色(RDAR)集落的能力是一种经过充分验证的细菌生物被膜形成试验。粗糙和干燥的质地是通过产生纤维素而发生的，红色是由于卷曲菌毛表面结构积累的色素所致。对于这个试验，将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株与YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株比较在刚果红琼脂平板上温育后形成RDAR表型的能力。
将刚果红琼脂平板用大豆蛋白(10g/L)和酵母提取物(5g/L)(改良的LB，不含NaCl)制备，并补充刚果红(40mg/L)和考马斯亮蓝G-250(20mg/L)。将5微升固定相细菌培养物点印在刚果红平板上并在37℃温育16小时，然后转移至30℃再温育120小时。进行集落形态和颜色的目测分析，每天记录以确认RDAR集落形态型的存在或不存在。
比较这两种菌株的集落形态型，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株具有平滑表型，集落缺少色素。相比之下，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株仍然含有csgD基因，表现出经典的粗糙和干燥外观，以及色素吸收的明显证据。因此，功能性测定证实ΔcsgD菌株无法形成生物被膜，因为其缺乏卷曲菌毛和纤维素产生。
csgD缺失的菌株在三阴性乳腺癌的高度难治性小鼠模型中显示出卓越的抗肿瘤功效
评估了csgD缺失在免疫刺激细菌疗法定植肿瘤但显示功效有限的模型中的影响。这可以表明细菌产生的纤维素的存在可以限制肿瘤驻留骨髓细胞的摄取，从而限制治疗效果(见例如Crull et al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223–1233)。采用难治性EMT6模型，这是人三阴性乳腺癌的代表性模型(见例如Yu et al.(2018)PLoS ONE13(11):e0206223)。当EMT6肿瘤细胞原位施用于乳腺脂肪垫时，与在侧腹部皮下注射相反，所述模型是T细胞排除的、高度转移及对免疫疗法包括对所有批准的检查点抗体而言是高度难治的模型(见例如Mariathasan et al.(2018)Nature 554:544–548)。
对于这个实验，将6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)在左侧乳腺脂肪垫中接种EMT6肿瘤细胞(ATCC#CRL-2755)(100μL PBS中2×105个细胞)。为携带13天龄已建立的乳腺肿瘤(～55mm3)的小鼠静脉注射单剂量1×107CFU的csgD缺失菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD或亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株，并与PBS对照组比较。所述细菌菌株含有表达组成型活性鼠STING(EF1αmuSTING R283G)的质粒。
在PBS处理的小鼠中的肿瘤生长均匀，在第35天达到最大肿瘤体积(1199.0±298.1mm3)。用csgD完整菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB处理的小鼠在这个模型中没有表现出抗肿瘤功效的迹象，在第35天也达到最大肿瘤体积(1689.1±537.0)。这些肿瘤的离体LB铺板显示所有肿瘤都被定植。然而，csgD缺失的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD导致5只小鼠中有3只完全治愈了其原发性和任何转移性疾病(第60+天)。总体TGI为45.7％，另外两个肿瘤之一在最终生长出之前部分应答。这两种细菌菌株含有相同的质粒有效载荷，但只有一种表现出显著功效。因此，在最难治疗和高度转移的同基因肿瘤模型之一中，原位具有csgD缺失的菌株EMT6能诱导全身抗肿瘤功效并导致60％的完全应答。
csgD缺失的菌株证实体内细胞内摄取增强
为了确定csgD缺失菌株是否因肿瘤驻留骨髓细胞更多的细菌摄取而表现出改善的功效，进行了离体庆大霉素保护试验(见Crull et al.(2011)Cellular Microbiology13(8):1223–1233)。对于这个试验，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组4只小鼠)皮下接种MC38细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第17天，为带有较大侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射1×107CFU的csgD缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株(N＝12)或亲本YS1646菌株(N＝4)。在静脉内给药后7天切除肿瘤，称重并在补充有1mg/mL胶原酶IV和20mg/mL DNase I的RPMI中切碎，在37℃振荡温育30分钟以产生单细胞悬浮液。30分钟后，将所述悬浮液通过70mm过滤器，回收的体积被分成两个独立的相同样品。将200mg/mL的庆大霉素(Thermo Fisher Scientific)加入每对样品之一中以杀死细胞外细菌，将样品在37℃振荡培养90分钟。然后将细胞悬浮液样品用0.05％ Triton X洗涤并裂解，并铺在LB琼脂板上以计数CFU。
结果表明，与未经庆大霉素处理的YS1646处理肿瘤的CFU(11925±19859CFU)相比，庆大霉素处理导致从肿瘤中检测到的CFU非常少(51±45CFU)。这表明细菌主要存在于这些肿瘤中的细胞外，因此对庆大霉素消除敏感。在csgD缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD处理组中，非庆大霉素处理的肿瘤产生高CFU，正如对定植良好的肿瘤所预期的那样，庆大霉素处理产生更少CFU(1276±2410CFU)，远高于亲本YS1646菌株处理的肿瘤。这是由于更多csgD缺失的细菌驻留于细胞内，因此受到了庆大霉素的保护。这些数据表明csgD缺失改善了细菌的细胞内摄取，这可以增强体内免疫调节蛋白的质粒递送。
实施例8
pATI-1.75载体构建
设计并合成质粒(pATI-1.75)，其含有以下特征：pBR322复制起点、asd基因、侧翼是HindIII位点用以处理的卡那霉素抗性基因，以及用于插入表达盒的多克隆位点。所述表达盒包含多个元件，包括真核启动子、开放读框、转录后调节元件和聚腺苷酸化信号，将其以各种构型装配。
示例的启动子包括直接在CMV立即早期增强子序列下游编码的人巨细胞病毒(CMV)立即早期核心启动子和人延伸因子-1α(EF-1α)的核心启动子。开放读框(ORF)可以包含一个或多个序列，每个序列都被翻译成蛋白质，并且可以通过插入2A序列将其分离成不同的多肽，从而真核核糖体无法在2A序列内的Gly和Pro残基之间插入肽键。2A序列的示例是来自Thosea asigna病毒(TaV)衣壳蛋白的T2A肽(SEQ ID NO:327)和来自猪捷申(PTV)的P2A肽(SEQ ID NO:328)。上游弗林蛋白酶裂解位点(RRKR)和其它增强子元件被置于上游以促进裂解分离表达的蛋白。
转录后调节元件(PRE)的示例包括土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE，SEQ ID NO:346)和乙型肝炎病毒PRE(HPRE，SEQ ID NO:347)，其通过促进mRNA向细胞质的核输出、增强3’末端加工和稳定性而增加基因胞质mRNA的积累。聚腺苷酸化信号序列的示例包括SV40聚腺苷酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化信号，二者均是3’调节元件，用于促进转录终止并含有由RNA裂解复合物识别的序列基序。
实施例9
设计的异源蛋白表达质粒诱导人细胞产生功能性蛋白
在人细胞中建立的细胞因子的最佳表达
为了举例说明免疫刺激性细胞因子可以在人细胞中从设计的质粒中表达，将一组细胞因子克隆到在EF-1α启动子控制下的pATI-1.75质粒中。所述细胞因子包括但不限于鼠IL-2(muIL-2)、muIL-12p70、muIL-23和人IL-2(huIL-2)。对于融合到IL-15单链的muIL-15受体-α(muIL-15Rα-IL-15sc)，测试了EF-1α和CMV启动子。将HEK293T STING Null细胞(InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植在用聚L-赖氨酸包被的24孔平板中，在5％CO2温育器中于37℃下过夜，以达到80％汇合度。第二天，将200ng的每种细胞因子质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率加入
Figure GDA0004138988600001421
转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。在转染后24小时收集每个样品的细胞培养上清液，并通过特异于每种细胞因子的ELISA评估蛋白质表达。
根据制造商的说明，在鼠IL-2ELISA(R&D Systems)中评估muIL-2构建体，并且还评估了具有密码子优化的另一版本的muIL-2(muIL-2CO)。测试了纯上清液的浓度，对于muIL-2构建体，平均产生1680pg/mL的muIL-2，对于muIL-2CO构建体，平均产生1812pg/mLmuIL-2。这些数据证实了所述构建体的功能，并表明通过密码子优化可以提高产量。根据制造商的方案，在鼠IL-12ELISA(R&D Systems)中评估了muIL-12p70构建体。当加入纯净上清液时，测得分泌的muIL-12p70的平均值为400pg/mL，尽管这个值超出了线性范围。当将上清液稀释5倍时，检测到平均105pg/mL分泌的muIL-12p70。对于muIL-23质粒，根据试剂盒说明，使用鼠IL-23ELISA(BioLegend)实现蛋白质检测。加入纯净上清液，检测到平均966pg/mL的muIL-23。对于人IL-2质粒，根据试剂盒说明，使用人IL-2ELISA(Invitrogen)实现蛋白质检测。加入纯净上清液，检测到平均1422pg/mL的huIL-2。对于使用EF-1α或CMV启动子表达的muIL-15Rα-IL-15sc构建体，按照试剂盒说明使用鼠IL-15ELISA(eBioscience,Inc.)。当加入纯净上清液时，带有EF-1α启动子的muIL-15Rα-IL-15sc质粒产生平均131pg/mL，而带有CMV启动子的muIL-15Rα-IL-15sc质粒产生平均289pg/mL。
这些数据验证了在人细胞中编码小鼠和人免疫调节细胞因子的质粒表达构建体。此外，数据表明密码子优化和启动子如CMV的使用可以增强蛋白质表达。
转录后调节元件增强细胞因子表达
为了确定在在ORF的3’末端添加的转录后调节元件(PREs)是否增强人细胞中免疫刺激细胞因子的表达，在pATI-1.75质粒中添加或不添加土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的条件下测试在EF-1α启动子控制下的huIL-2的表达。
将HEK293T STING Null细胞(InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植在用聚L-赖氨酸包被的24孔平板中，在5％ CO2温育器中于37℃下过夜，以达到80％汇合度。第二天，将200ng的每种细胞因子质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到
Figure GDA0004138988600001431
转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。根据制造商的说明，在转染后24小时收集每个样品的细胞培养上清液，并通过人IL-2ELISA(Invitrogen)评估其活性。上清液以纯净的形式加入，或稀释5倍。
结果表明，当加入纯净上清液时，与没有WPRE的huIL-2构建体(平均分泌1540pg/mL)相比，具有WPRE的huIL-2构建体分泌5511pg/mL，增加3.6倍。在5倍稀释的上清液中，非WPRE huIL-2构建体分泌315pg/mL的huIL-2，而具有WPRE的huIL-2构建体分泌1441pg/mL，增加4.6倍。因此，添加3’转录后调节元件，例如但不限于WPRE，可以显著改善人细胞中的蛋白质表达。
启动子优化和转录后调节元件增强原代M2巨噬细胞中的细胞因子产生
虽然通过使用CMV启动子在人HEK293T细胞中增强了muIL-15Rα-IL-15sc等细胞因子的表达，但要确定在供体来源的原代人M2巨噬细胞(排除T细胞的人实体瘤中的主要巨噬细胞表型)中是否可以类似地增强细胞因子的表达。此外，还确定了转录后调节元件(如WPRE)是否可以增强这些细胞中的表达。
为了确定是否可以改善蛋白质表达，测试了启动子EF-1α和CMV对于muIL-2表达的控制，并测试了WPRE转录后调节元件对于huIL-2表达的影响。从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1×非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，并且在室温下以800RPM离心10分钟洗涤。将PBMC重新悬浮在PBS+2％ FBS中，并使用CD16耗竭试剂盒(StemCell Technologies)负分离单核细胞。将分离的单核细胞在含有M-CSF和IL-4的RPMI培养基中培养6天，以产生M2巨噬细胞。为此，通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤分离的未接触的单核细胞，并重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(3e5/孔)种植在24孔平板中，最终体积为750微升。种植两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入500μL含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基，并温育48小时。在第6天，完全吸出细胞培养基，并更换为不含细胞因子的新鲜完全培养基，以使用
Figure GDA0004138988600001441
RED mRNA和质粒转染试剂(Lipocalyx)进行转染。
根据制造商的说明使用
Figure GDA0004138988600001442
RED进行转染。简而言之，将含有EF-1α-muIL-2构建体、CMV-muIL-2构建体、EF-1α-huIL-2构建体或EF-1α-huIL-2+WPRE构建体的500ng质粒DNA以及未转染的对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.2μL/>
Figure GDA0004138988600001443
RED混合，在室温下温育15分钟以形成/>
Figure GDA0004138988600001444
复合物。然后将/>
Figure GDA0004138988600001445
RED复合物缓慢加入24孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在37℃的CO2温育器中温育24小时。在24小时收集上清液，并根据试剂盒说明使用鼠IL-2ELISA(R&D Systems)或人IL-2ELISA(Invitrogen)测定细胞因子。
结果表明，从在EF-1α启动子控制下的用muIL-2构建体转染的原代人M2巨噬细胞收获的纯上清液中muIL-2的表达，导致平均分泌59.7pg/mL的muIL-2。具有CMV启动子的muIL-2构建体平均产生275pg/mL的muIL-2，几乎增加了5倍。对于人IL-2ELISA，来自用缺乏WPRE的质粒转染的细胞的纯上清液平均产生170pg/mL的huIL-2。含有WPRE的huIL-2构建体平均产生219pg/mL的huIL-2。这些数据证实，CMV等启动子和WPRE等转录后调节元件可以显著改善多种细胞类型(包括原代人类M2巨噬细胞)中的细胞因子表达。
由人细胞表达的共刺激受体配体4-1BBL
共刺激分子，例如4-1BBL，当在抗原呈递细胞(APCs)上表达时，可以与T细胞上表达的4-1BB结合，以促进最佳的T细胞功能。4-1BBL受其细胞质信号传导结构域的负调节。在4-1BBL使巨噬细胞与T细胞连接的后期，4-1BBL胞质结构域的反向信号传导诱导4-1BBL的表面易位以与TLR4结合并形成信号传导复合物。这会诱导高水平的TNF-α，与TLR4的LPS活化相当，从而导致适应性免疫反应的免疫抑制(见例如Ma et al.(2013)Sci.Signal.6(295):ra87)。
在这个实施例中，编码鼠4-1BBL的序列被克隆到pATI-1.75载体中。为了最大限度地衔接T细胞，通过缺失胞质结构域(对应于SEQ ID NO:344的氨基酸残基1-82)消除4-1BBL胞质结构域的反向信号传导，产生mu4-1BBLΔcyt。为了确定mu4-1BBLΔcyt是否可以在人细胞表面功能性表达，使用了HEK-293T细胞。将HEK293T STING Null细胞(InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植于用聚L-赖氨酸包被的24孔平板中，在CO2温育器中于37℃下过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将编码mu4-1BBLΔcyt的200ng质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到
Figure GDA0004138988600001446
转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。48小时后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次。然后将细胞重新悬浮在PBS+2％ FBS中，并用PE缀合的鼠抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1，BioLegend)和DAPI(死/活染色)染色。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次，并重悬于PBS+2％FBS中。使用ACEA/>
Figure GDA0004138988600001447
流式细胞仪(ACEABiosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
作为活细胞的百分比，未转染的对照细胞对鼠4-1BBL的阳性染色百分比为14.6。相比之下，用编码mu4-1BBLΔcyt的质粒转染的细胞中有93.4％的细胞是4-1BBL表面表达阳性的。这些数据表明pATI-1.75质粒可以有效地用于在人细胞表面高水平表达4-1BBL。
人细胞表达可溶性TGFβ受体II
可溶性小鼠TGFβ受体II变体是通过去除完整TGFβ受体II的胞质和跨膜部分而设计的。此外，还添加了FLAG或Fc标签以进行检测。将这些变体克隆到在CMV启动子和3’WPRE元件控制下的pATI-1.75载体中。通过Sanger测序确认序列。将1.5×106HEK293T细胞在前一天铺板在用聚-L-赖氨酸包被的6孔平板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将3μgDNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到
Figure GDA0004138988600001451
转染试剂(Promega)中。温育48小时后收集每个样品的细胞培养上清液。将一些上清液在10kDa离心柱(Millipore)中浓缩。使用小鼠TGF-β1(R&D系统)对转染的HEK293T细胞的上清液进行直接ELISA。下表提供了450nm吸光度的ELISA数据。
构建体 在450nm吸光度
浓缩的可溶性小鼠TGFβ受体II-Fc 1.522±0.025
可溶性小鼠TGFβ受体II-Fc 1.508±0.018
培养基(对照) 0.041±0.002
在T细胞测定中测试这些构建体的功能。使用磁性分离试剂盒(StemCellTechnologies)从脾中收获小鼠T细胞。将T细胞与具有或不具有可溶性受体的抗小鼠CD3ε抗体在不同浓度的小鼠TGF-β温育。使用小鼠TH1 CBA试剂盒(BioLegend)和CD4、CD8、4-1BB和CD69的流式细胞术标记对T细胞活化进行量化。
这些数据证明了从工程化为由免疫刺激细菌递送到真核细胞例如人细胞的质粒表达异源分子的能力，例如融合于Fc结构域的细胞外受体。
来自人细胞的CD3xCD19双特异性T细胞衔接器的表达
将含有FLAG标签和His标签的CD3xCD19双特异性T细胞衔接器
Figure GDA0004138988600001456
克隆到在CMV启动子的控制下并带有3’WPRE元件的pATI-1.75载体中。通过Sanger测序确认序列。将1.5×106个HEK293T细胞在前一天铺板于用聚-L-赖氨酸包被的6孔平板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将3μg DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到
Figure GDA0004138988600001452
转染试剂(Promega)中。温育48小时后收集每个样品的细胞培养上清液。将一些上清液在10kDa离心柱(Millipore)中浓缩。
通过CD3xCD19
Figure GDA0004138988600001453
与Raji和Jurkat-LuciaTM NFAT细胞(InvivoGen)的结合来测试该构建体的功能。使用流式细胞仪使用抗FLAG-APC(BioLegend)检测/>
Figure GDA0004138988600001454
每种条件下运行一个包含50,000个细胞的孔。下表提供了APC阳性事件的平均荧光强度(MFI)和门控为APC阳性的细胞数。/>
Figure GDA0004138988600001455
此外，将这个构建体在Raji和Jurkat-LuciaTM NFAT细胞的共培养中进行测试。将细胞在有或没有CD3xCD19
Figure GDA0004138988600001461
的条件下温育，在添加/>
Figure GDA0004138988600001462
后6小时和24小时检测发光(对应于NFAT报告基因)。下表提供了这个测定的发光读数。
Figure GDA0004138988600001463
这些数据证明了在真核细胞例如人、细胞中从可以由本文的免疫刺激细菌递送的工程化质粒表达异源分子例如scFv、替代抗体构建体和双特异性T细胞衔接器的能力。
实施例10
免疫刺激细菌菌株在人体细胞中有效递送质粒和表达细胞因子
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失菌株在人单核细胞感染后诱导功能性IL-2蛋白表达
如上所述，从具有asd基因缺失的鼠伤寒沙门氏菌YS1646菌株中缺失鞭毛蛋白基因fljB和fliC，产生菌株YS1646Δasd/ΔFLG。用含有带有EF-1α启动子和鼠细胞因子IL-2(muIL-2)的表达盒的质粒对这个菌株进行电穿孔。此外，将YS1646Δasd/ΔFLG菌株用编码鼠IL-15δ的表达质粒电穿孔，作为非同源细胞因子的对照。使用CMV启动子产生另外的构建体。
为了确定这些含有表达质粒的菌株是否可以感染人单核细胞并诱导鼠类IL-2的产生，将THP-1人单核细胞在感染前一天以50,000个细胞/孔铺板于RPMI 1640(GibcoTM)+10％ Nu-SerumTM
Figure GDA0004138988600001464
中。将细胞在RPMI中以50的MOI用各种菌株感染1小时，然后用PBS洗涤3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。48小时后从96孔平板收集上清液，并通过ELISA(R&D Systems)评估鼠IL-2的浓度。
正如预期的那样，在YS1646Δasd/ΔFLG-IL15δ对照孔中检测到的muIL-2浓度非常低(6.52pg/mL)，这可能反映了与内源性人IL-2受体的一些交叉反应性。相比之下，YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株平均诱导35.1pg/mL的muIL-2。这些数据证明了在人单核细胞中表达和分泌来自鼠伤寒沙门氏菌免疫调节平台菌株的功能性异源蛋白例如IL-2的可行性。
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失的和pagP缺失的菌株与在原代人M2巨噬细胞中转染的muIL-2DNA相比，表现出增强的IL-2表达
比较了在原代人M2巨噬细胞中针对muIL-2表达的转染(即直接转移质粒DNA)与细菌转染(bactofection)(即通过本文的免疫刺激菌株转移质粒DNA)的相对效率。将从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1×非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，并通过在室温下以800RPM离心10分钟进行洗涤。将PBMC重新悬浮在PBS+2％FBS中，并使用CD16耗竭试剂盒(StemCell Technologies)负分离单核细胞。然后将分离的未接触的单核细胞通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤，并重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(3e5/孔)种植在24孔平板中，最终体积为750微升。种植两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的500μL完全培养基，并温育48小时。第6天，将细胞培养基完全吸出，更换为不含细胞因子的新鲜完全培养基，用
Figure GDA0004138988600001471
RED mRNA和质粒转染试剂(Lipocalyx)进行转染。
根据试剂盒说明使用
Figure GDA0004138988600001472
RED进行转染。简而言之，将来自在EF-1α启动子(EF-1α-muIL-2)的控制下或在CMV启动子(CMV-muIL-2)控制下编码muIL-2的构建体的500ng质粒DNA或未转染对照，在提供的缓冲液中稀释，与0.2μL的/>
Figure GDA0004138988600001473
RED转染试剂混合，并在室温下温育15分钟以使/>
Figure GDA0004138988600001474
RED复合物形成。然后将/>
Figure GDA0004138988600001475
RED复合物缓慢加入含有单核细胞的24孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在37℃的CO2温育器中温育24小时。在RPMI中用含有EF-1α-muIL-2构建体的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株或含有CMV-muIL-2构建体的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株以450的MOI感染其它孔的细胞1小时，然后用PBS洗涤3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。
24小时后，将细胞用350μL具有β-巯基乙醇(β-ME)的缓冲液RLT(Qiagen)裂解，并使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒加以以下修改进行RNA提取。将使用RNase-Free DNase试剂盒(Qiagen)去除基因组DNA的步骤包括在试剂盒中，以从总RNA中去除基因组DNA。使用NanoDropTM OneC UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也通过A260/A230吸收比进行评估。将RNA在-80℃储存，无需冻融，直到进行逆转录。根据制造商的说明，使用C1000 Touch热循环仪(Bio-Rad)和SuperScriptTM VILOTM MasterMix(Invitrogen)在30μL反应中使用0.4-1μg模板RNA进行cDNA合成。
使用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行qPCR(定量聚合酶链式反应)。用于鼠IL-2的
Figure GDA0004138988600001476
引物(Assay ID：qMmuCED0060978)购自Bio-Rad。按照方案进行qPCR反应(20μL)，使用iTaqTM Universal/>
Figure GDA0004138988600001477
Green Supermix(Bio-Rad)。Bio-Rad CFX96TM实时系统上的标准热循环程序包括95℃变性30秒，然后是95℃进行5秒和60℃进行30秒的40个循环。每个平板上的每组引物都包括无模板对照的反应。所有样品均一式两份运行，并计算平均Cq值。使用Gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)参考mRNA(Bio-Rad，Assay ID：qMmuCED0027497)对靶mRNA的定量进行标准化。以靶(mu-IL2)和参考(Gapdh)基因之间的差异计算ΔCq。通过将处理组的ΔCq值标准化为非处理对照组的ΔCq值来获得ΔΔCq。增加倍数以2^-ΔΔCq计算。相对于未转染/未感染对照组的增加倍数如下表所示。
处理组 muIL-2增加倍数
YS1646 <1
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP，EF-1α-muIL-2(感染) 74
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP，CMV-muIL-2(感染) 668.2
转染，EF-1α-muIL-2 249.4
转染，CMV-muIL-2 1527
结果表明，无论是转染还是细菌转染，与EF-1α启动子相比，CMV启动子在人原代M2巨噬细胞中均表现出优异的muIL-2表达。虽然使用目前可用的最有效试剂进行转染产生最高水平的muIL-2表达，但细菌转染也引发了muIL-2的高表达水平，表明使用本文提供的细菌平台进行异源基因转移的高效性。
实施例11
细菌菌株在体内有效递送免疫调节质粒并显示出有效的抗肿瘤活性
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失菌株在结直肠癌小鼠模型中诱导强力的肿瘤抑制而无毒性
为了证明含有muIL-2表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌菌株可以诱导抗肿瘤效力而没有额外毒性，将含有muIL-2质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株与PBS对照在皮下侧翼MC38结肠直肠腺癌模型中比较安全性和有效性。在这项研究中，为6-8周大的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第11天，用5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株或PBS载体对照，为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠进行静脉注射。每周两次记录肿瘤测量值和体重。
结果表明，与PBS相比，YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株表现出显著的肿瘤生长抑制(TGI)(76.7％ TGI，P＝0.005，第21天)，肿瘤在植入后第40天得到很好的控制，此时PBS小鼠被安乐死。即使没有进一步的菌株减毒，该疗法也具有良好的耐受性，并且与PBS对照在第40天相比，早期的体重减轻是短暂的，仅导致体重减少3.4％。因此，表达muIL-2的免疫刺激菌株在结肠直肠癌模型中以安全且无毒的方式抑制肿瘤生长抑制。
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失菌株在体内诱导肿瘤特异性IL-2产生
确定相对于脾的肿瘤muIL-2表达水平以确认递送的肿瘤特异性性质。为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结肠直肠腺癌细胞(100μLPBS中的5×105个细胞)。在第10天，用5×105CFU菌株YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2或PBS载体对照为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射。在肿瘤植入后第31天，切除肿瘤和脾，并使用GentleMACSTM Octo Dissociator和M管(Miltenyi Biotec)分子装置在2mL PBS中处理肿瘤提取物。根据制造商的说明，将匀浆以1300RPM旋转10分钟，收集上清液并使用muIL-2CBA试剂盒(BD Biosciences)进行分析。结果被量化为以表示pg/mL的muIL-2，并根据每克组织进行标准化。
PBS对照处理的肿瘤在肿瘤中表现出muIL-2的背景水平，平均每克肿瘤组织为134pg/mL。YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2处理的肿瘤产生了更高的平均每克肿瘤组织389.9pg/mL的muIL-2，证明检测由于肿瘤驻留骨髓细胞中的质粒递送而升高的muIL-2水平的能力。来自经注射YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株的小鼠脾中的muIL-2水平平均为每克组织6.6pg/mL，低于PBS对照组。这种对肿瘤的特异性使得可以比非肿瘤靶向的常规细胞因子疗法更安全的方式递送免疫调节水平的IL-2。
含有编码鼠共刺激受体配体4-1BBL的质粒的减毒菌株在体内显示疗效
为了确定共刺激分子如4-1BBL的肿瘤特异性递送是否增强抗肿瘤功效，将含有在CMV启动子控制下编码4-1BBL(Δcyt)(如上所述)的质粒和含有3’WPRE元件的菌株在MC38鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。在这项研究中，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结肠直肠腺癌细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第10天，用1×107CFU的含有CMV-4-1BBL(Δcyt)-WPRE质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB或PBS载体对照，为已建立的侧腹肿瘤小鼠进行静脉注射。
该疗法的耐受性非常好，最初体重仅减轻2.2％，3天后完全恢复。与PBS相比，4-1BBL(Δcyt)疗法非常有效且具有治愈性(90.7％ TGI，60％完全反应(CR)，第30天)。这些数据证明了以肿瘤特异性方式递送含有编码共刺激分子的质粒的免疫刺激细菌的效力和安全性。
实施例12
鉴定促进组成型I型干扰素产生的基因中的功能获得性突变
出现具有严重自身炎症性病况和病因不明的血管病变的受试者病例，并且通常源自突变。已经且可以确定这些病症的原因。确定这种病理的突变基础的步骤如下。第一步，从出现症状的患者和健康个体中获取完整的基因组DNA。进行全外显子测序，然后分析内含子和外显子。对与I型干扰素(IFN)表达相关的途径中的产物进行基因分析和突变鉴定。从这个分析中，在已知导致编码蛋白质的组成型功能激活以及随后持续表达I型IFN的基因中发现了突变。
在鉴定突变后，将编码全长基因的cDNA(带有或不带有已鉴定的突变)转染到报告细胞系中，以测量I型IFN的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达置于IFN-β启动子的控制之下。具有组成型活性的功能获得性(GOF)突变体促进IFN-β的表达，而未受刺激的野生型(WT)蛋白质则否。在已知STING SAVI(STING相关的婴儿期发病血管病变)突变体的情况下，IFN-β的WT-STING刺激需要增加cGAMP的外源性水平以直接激活WT-STING。组成型活性突变以cGAMP非依赖性方式刺激IFN-β的表达。STING、RIG-1、MDA5、IRF3和IRF7中的每一个中的示例性功能获得性突变在下文实施例15中阐述并在本文别处讨论。其中可以在受试者中鉴定或通过体外突变和筛选产生的功能获得性突变的其它这种基因包括但不限于TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
功能组成型I型IFN突变体在人细胞中的表达
将人STING(等位基因R232)和IRF3功能获得性(GOF)突变体(见下表)克隆到pATI-1.75载体中，通过PCR确认序列。为了确定STING和IRF3 GOF表达质粒是否能在人细胞中诱导功能性I型干扰素，使用不含内源性STING的HEK293T STING Null Reporter细胞(InvivoGen)对质粒进行评估。这些细胞表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性干扰素刺激的应答元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列已经使用敲入技术由SEAP ORF置换。可以通过监测细胞上清液中I型干扰素刺激的SEAP产生来评估I型干扰素活性。
为了检测GOF突变体产生的I型IFN的相对产量，前一天将1×105 293T-DualTMNull细胞(InvivoGen)铺板在用聚L-赖氨酸包被的平板上，以在24孔平板中达到80％的汇合度。在转染当天，将编码一组STING和IRF3 GOF突变体、包括STING野生型(WT)和IRF3 WT对照以及文献中报道的在人细胞中无功能的阴性对照突变(STING V155R阴性对照(NC))的200ng质粒在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率率加入
Figure GDA0004138988600001491
转染试剂(Promega)。过夜温育后收集每个样品的细胞培养上清液，将10μL细胞培养上清液加入50μLQUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)，用于测量SEAP。I型干扰素激活通过在/>
Figure GDA0004138988600001492
M3分光光度计(Molecular Devices)上在650nm吸光度下测量ISRE诱导的SEAP活性来确定。
如下表所示，与不诱导I型IFN活性的野生型和阴性对照相比，所有GOF突变体均能在人细胞中以STING配体非依赖性方式诱导I型IFN活性。在人STING R284G和IRF3 S396D拟磷酸变体中观察到最高水平的I型IFN诱导。这些数据支持编码GOF突变体的质粒产生功能性的、组成型的STING和组成型的拟磷酸IRF3的能力，其以cGAMP非依赖性方式诱导I型干扰素。
Figure GDA0004138988600001501
感染含有编码组成型I型IFN突变体的质粒的鞭毛缺失菌株将人M2巨噬细胞转化为产生I型IFN的M1巨噬细胞
确定用含有编码组成型I型IFN GOF变体的质粒的鞭毛缺失的菌株感染的原代人M2巨噬细胞，是否可以转化为I型IFN和下游趋化因子如CXCL10(也称为IP-10)的生产物。
将从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1×非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，在室温以800RPM离心10分钟进行洗涤。将PBMC重悬于PBS+2％FBS中，使用CD16耗竭试剂盒(StemCell Technologies)负分离单核细胞。为了产生原代人M2巨噬细胞，将分离的未接触的单核细胞通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤，并重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(3e5/孔)种植于终体积为750μL的24孔平板中。种植两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入500μL的含有细胞因子的完全培养基，温育48小时。在第6天，将细胞培养基完全吸出并替换为不含细胞因子的新鲜完全培养基。将一式两份的孔以450的MOI在RPMI中用以下菌株感染1小时：含有编码野生型(WT)人(hu)STING的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；含有编码huSTING R284G变体的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；含有编码WT huIRF3的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；含有编码huIRF3S396D变体的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；或含有对照质粒的菌株。然后用PBS洗涤细胞3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。作为对照，将临床化合物ADU-S100的类似物STING激动剂3’5’RpRp c-di-AMP(InvivoGen)以10μg/mL加入细胞中。
24小时后，用具有β-ME(Qiagen)的350μL缓冲液RLT裂解细胞，使用Qiagen RNeasyMini试剂盒做以下修改进行RNA提取。基因组DNA去除步骤，包括使用RNase-Free DNase试剂盒(Qiagen)从总RNA中去除基因组DNA。使用NanoDropTM OneC紫外-可见分光光度计(Thermo Scientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也根据A260/A230吸收比进行评估。将RNA储存在-80℃，无需冻融直到进行逆转录。使用C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)和SuperScriptTM VILOTM Master Mix(Invitrogen)在30μL反应中根据制造商的说明从0.4-1μg模板RNA合成cDNA。
使用CFX96TM实时系统(Bio-Rad)进行qPCR。huCXCL10(qHsaCED0046619)、huIRF3(qHsaCID0013122)、huSTING(qHsaCID0010565)和huIFNβ1(qHsaCED0046851)的
Figure GDA0004138988600001511
引物购自Bio-Rad。按照方案进行qPCR反应(20μL)，使用iTaqTM Universal/>
Figure GDA0004138988600001512
GreenSupermix(Bio-Rad)。BioRad CFX96TM实时系统上的标准热循环程序包括在95℃变性30秒，然后进行在95℃5秒和在60℃30秒的40个循环。每个平板上的每组引物均包括与无模板对照反应。所有样品均一式两份操作，计算平均Cq值。使用Gapdh参考mRNA(Bio-Rad，qMmuCED0027497)对靶mRNA定量进行标准化。以靶基因和参考基因之间的差异计算ΔCq。ΔΔCq是通过将处理的ΔCq值根据非处理对照的ΔCq值标准化而获得的。倍数增加以2^-ΔΔCq计算。这些值在下表中示出，是一式两份孔的平均值。
如下表所示，与对照质粒的感染相比，含有编码huSTING WT和huSTING R284G的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株诱导高水平的STING表达，这个水平显著高于对照质粒或小分子STING激动剂。相似地，含有编码WT huIRF3和huIRF3-S396D质粒的菌株诱导高水平的IRF3表达，显著高于对照质粒或小分子STING激动剂。与含有编码WT huSTING的质粒的菌株相比，含有编码huSTING R284G变体的质粒的细菌菌株诱导更高的IFNβ和CXCL10表达。这证实含有编码组成型STING GOF变体的质粒的菌株将人原代免疫抑制性M2巨噬细胞转化为I型IFN的M1生产细胞的能力。虽然含有编码WT huIRF3和huIRF3-S396D的质粒的菌株均诱导了更多或相似水平的IFNβ，但与huSTING-R284G变体相比，其诱导的CXCL10更少。
Figure GDA0004138988600001513
ND＝无数据
这些数据证实组成型GOF I型IFN变体在人原代M2巨噬细胞中表达，并将这些细胞转化为M1样I型IFN生产细胞。
实施例13
含有编码组成型I型IFN变体的免疫刺激细菌证实在鼠结肠直肠癌模型中强力的抗肿瘤免疫性
人GOF STING突变体示出在小鼠模型中的抗肿瘤活性
为了证实含有编码组成型活性STING变体的表达质粒的免疫刺激细菌菌株诱导抗肿瘤功效，将菌株YS1646Δasd/ΔFLG(鞭毛蛋白基因fljB和fliC均敲除)用在人延伸因子-1α(EF-1α)启动子之后含有具有等位基因R232和GOF突变V155M的人STING(huSTING V155M)的表达盒的质粒电穿孔，并将所述菌株与单独的菌株YS1646和PBS载体对照进行比较。编码huSTING V155M的基因使用DNA合成方法产生并克隆到pATI-1.75载体中。为了评估组成型人STING变体是否能在小鼠中具有抗肿瘤活性，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(在100μL PBS中5×105个细胞)。在第8天为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG huSTING V155M菌株、YS1646菌株或PBS对照。
结果表明，YS1646亲本菌株作为抗肿瘤疗法仅轻微有效，且不能治愈(35％ TGI，p＝NS(不显著)，第28天)，与先前公布的数据一致。然而，与PBS相比，含有编码组成型活性人STING的质粒的减毒程度更高的菌株YS1646Δasd/ΔFLG huSTING V155M引起了显著的肿瘤控制作用(60％ TGI，p<0.05，第28天)，且治愈率为20％。因此，递送组成型活性STING变体的免疫刺激细菌菌株有效抑制肿瘤生长抑制作用，并在结直肠腺癌模型中显示出疗效。
鼠拟磷酸IRF3示出体内治愈疗效
设计了拟磷酸人IRF3变体的鼠版本，命名为muIRF3-5388D，并在鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。将菌株YS1646Δasd/ΔFLG用在人延伸因子-1α(EF-1α)启动子后的含有具有GOF突变S388D的鼠IRF3(muIRF3-S388D)的表达盒的质粒电穿孔，并与PBS载体对照进行比较。使用DNA合成方法产生编码muIRF3-5388D的基因并克隆到pATI-1.75载体中。为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第10天对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的菌株YS1646Δasd/ΔFLG-EF-1α-muIRF3-S388D，并与PBS载体对照进行比较。
所述疗法的耐受性非常好，最初的体重减轻最低点仅为0.3％。与PBS相比，含有编码muIRF3-5388D GOF突变体的质粒的细菌菌株具有高效和治愈性(81.8％ TGI，60％治愈率，第42天)。这些数据证实以肿瘤特异性方式递送组成型I型IFN诱导变体的效力和安全性。
鼠STING GOF变体显示出强力和治愈性的抗肿瘤活性
设计一组在人患者中发现的人STING变体的鼠直向同源物。这些直向同源物与人变体有一个密码子不同，并将其克隆到EF-1α启动子控制下的pATI-1.75载体中，以产生以下一组突变体：muSTING N153S，muSTING V154M，muSTING R280Q，muSTING V146L，muSTINGR283G和muSTING C205Y等。在鼠腺癌MC38模型中评估STING变体的抗肿瘤功效。在研究中，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第10天，为带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG菌株，所述菌株含有带有驱动muSTINGN153S、muSTING V154M、muSTING R280Q、muSTING V146L或muSTING R283G表达的EF-1α的质粒，或乱序的shRNA对照质粒，并与PBS载体对照组相比。
在这个实验中，YS1646Δasd/ΔFLG EF-1α-shSCR(乱序对照质粒)与PBS对照相比表现出抗肿瘤功效(73％ TGI，第26天)，这比YS1646亲本菌株历史上显示的疗效更强力。这可能是由于质粒自身固有的免疫刺激元件例如CpG和RNAi刺激元件所致。这种疗法是组中耐受性最差的，示出9.9％的体重减轻最低点，仅在研究最终时恢复。相反，组成型活性鼠STING突变体导致较低的体重减轻，这种减轻是暂时的并在几天内恢复。这些变体的相对抗肿瘤功效揭示了活性差异，其中只有两个变体muSTING N153S和muSTING R283G表现出治愈疗效和超过质粒对照的增强的功效。
Figure GDA0004138988600001521
/>
Figure GDA0004138988600001531
在后续研究中，对鼠STING C205Y变体与R283G和N153S变体一起进行检测，以比较其抗肿瘤功效。为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第9天，为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG菌株，所述菌株含有具有驱动muSTING N153S、muSTINGR283G或muSTING C205Y表达的EF-1α的质粒，并与PBS载体对照进行比较。与之前一样，STING变体的耐受性良好，并仅观察到体重减轻的短暂下降并迅速恢复。这可能是由于靶向疗法所致，因为在小分子STING激动剂中也观察到了这一点。两种组成型活性鼠STING变体muSTING N153S和muSTING R283G的功效与之前的研究几乎相同，但不明原因地体重减轻要少得多。muSTING C205Y变体也非常有效，但不能治愈。
Figure GDA0004138988600001532
来自这些研究的STING治愈的小鼠在初始肿瘤植入后第40天用MC38结肠直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)皮下在对侧腹部进行再次挑战。与其中所有肿瘤均长出的天然小鼠(N＝5)相比，所有STING治愈的小鼠均排斥肿瘤，证实适应性免疫的参与。
这些数据验证了人组成型STING变体的鼠版本在鼠结肠直肠癌模型中的安全性和效力，并揭示了与其它STING变体相比具有增强效力的一个小组。这些高度活性的变体还引发保护性免疫，证实I型干扰素的肿瘤特异性产生的效力。
鼠STING GOF变体证实在静脉内给药后的显著的肿瘤重塑
接下来确定含有编码组成型STING变体的质粒的细菌菌株在静脉内给药后是否表现出重塑肿瘤微环境(TME)的能力的差异。为了检测这一点，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结肠直肠腺癌细胞(100μLPBS中5×105个细胞)。在第8天，对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉内注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG菌株，所述菌株含有带有驱动muSTING N153S、muSTING V154M、muSTING R280Q、muSTINGV146L、muSTING R283G表达的EF-1α的质粒或质粒对照，并与PBS载体对照进行比较。
在肿瘤植入后第28天，切除肿瘤用于分析。将肿瘤切成2至3毫米的碎片，放入装有2.5mL酶混合物(RPMI-1640+10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL DNase I)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。将肿瘤碎片使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离，并将整个细胞制备物在37℃搅拌温育45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入肿瘤)程序进行第二轮解离，并且所得单细胞悬浮液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL的RPMI-1640 10％ FBS洗涤一次，并使用新的70μM尼龙网将细胞再次过滤到新的50mL管中。将尼龙网用5mL具有10％ FBS的RPMI-1640洗涤，以及然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将所得解离的细胞重新悬浮在PBS中并在染色过程之前保持在冰上。
通过流式细胞术在施用含有编码各种GOF muSTING突变体的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株后，确定活的肿瘤浸润白细胞(TIL)的百分比，包括CD4+ Tregs、CD4+ Th1细胞、CD8+ T细胞、中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。对于流式细胞术染色，将100μL的单细胞悬浮液接种在V型底96孔平板的孔中。每孔加入100μL含死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc封闭试剂(BD Biosciences)的PBS，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于PBS+2％ FBS中，其含有荧光染料缀合的抗体(CD4 FITC克隆RM4-5；CD8aBV421克隆53-6.7；F4/80APC克隆BM8；CD11b PE-Cy7克隆M1/70；CD45 BV570克隆30-F11；CD3 PE克隆145-2C11；Ly6C BV785克隆HK1.4；I-A/I-E APC-Cy7克隆M5/114.15.2；Ly6GBV605克隆1A8；和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69；均来自BioLegend)，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，将细胞用PBS+2％ FBS以1300RPM离心3分钟洗涤两次，并重悬于流式细胞仪固定缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中。流式细胞术数据使用ACEA
Figure GDA0004138988600001541
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)采集，并使用F1owJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如下表所示，带有EF-1α质粒对照的菌株YS1646Δasd/ΔFLG表现出主要是高嗜中性粒细胞浸润，尽管有一些CD8+ T细胞募集，这可能是由于质粒上的免疫刺激元件所致。相反，不同的muSTING变体具有独特的肿瘤浸润免疫细胞特征，其中一些例如muSTING V146L和muSTING R283G，导致比PBS对照更少的免疫抑制性中性粒细胞。在施用突变体muSTINGR283G和muSTING N153S的小鼠肿瘤中观察到最有利的免疫特征，其具有大量CD4+ Th1细胞和CD8+ T细胞，以及少量中性粒细胞，这表示用于产生适应性免疫的高度有利的条件。此外，与PBS相比，muSTING R283G和muSTING N153S突变体在肿瘤中具有显著更高的p15e肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞。这些趋势也在总细胞计数中得到了重述，如下所示。因此，将组成型活性STING变体递送至肿瘤驻留骨髓细胞导致免疫抑制性肿瘤微环境的完全重塑，朝向适应性抗肿瘤表型，并远离特征在于促进先天免疫性和抑制适应性免疫的细菌表型。
活肿瘤侵润白细胞(TIL)的百分比％
Figure GDA0004138988600001542
Figure GDA0004138988600001551
总细胞计数
Figure GDA0004138988600001552
实施例14
使用组合的质粒表达盒表达多种免疫调节蛋白
多模块质粒表达盒表明在人细胞中产生多种免疫调节蛋白的能力
使用在CMV和EF-1α启动子(双启动子系统)控制下的两个单独的ORF，或使用在ORF内的T2A肽和一个启动子(单启动子系统)，将编码GOF I型IFN诱导变体和细胞因子的核酸组合克隆到pATI-1.75载体中。所述构建体还任选地包括转录后调节元件(PRE)，例如3’WPRE或HPRE，和/或腺苷酸化信号序列，例如SV40或牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。制备的构建体包括编码细胞因子muIL-2、具有密码子优化的muIL-2(muIL-2CO)、muIL-21、muIL-12p70、muIL-15Rα-IL-15sc、muIL-18和muIFN-α2及其组合的那些构建体；具有突变R283G的muSTING变体；和/或缺失胞质结构域的鼠共刺激分子4-1BBL(mu4-1BBLΔcyt)。通过PCR确认序列。
为了确定含有GOF I型IFN诱导变体的组合质粒是否可以在人细胞中诱导功能性I型IFN，使用不含内源性STING的HEK293T STING Null Reporter细胞(InvivoGen)评估质粒。这些细胞表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激的反应元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列已使用敲入技术置换为SEAP ORF。可以通过监测细胞上清液中I型IFN刺激的SEAP产生来评估I型干扰素活性。此外，收集上清液并通过ELISA评估相对细胞因子浓度。
为了检测物I型IFN和共表达细胞因子的相对产生，前一天将2×105个293T-DualTMNull细胞(InvivoGen)铺板在用聚-L-赖氨酸包被的24孔平板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将500ng编码单独或各种组合的一组GOF变体、细胞因子和共刺激分子的质粒在无血清培养基中稀释并以适当的试剂:DNA比率添加到
Figure GDA0004138988600001553
转染试剂(Promega)中。温育过夜后收集每个样品的细胞培养上清液，将20μL细胞培养上清液加入180μL QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)中。通过在/>
Figure GDA0004138988600001554
M3分光光度计(Molecular Devices)上在650nm的吸光度测量ISRE诱导的SEAP活性来确定I型干扰素活化。根据制造商的说明，在鼠IL-2ELISA(R&D Systems)中评估muIL-2构建体的muIL-2表达。根据制造商的建议，在鼠IL-12ELISA(R&D Systems)中评估muIL-12p70构建体。对于muIL-15Rα-IL-15sc构建体，按照试剂盒说明使用鼠IL-15ELISA(eBioscience)。使用RAW-LuciaTM ISG报告细胞系(InvivoGen)测量IFN-α2。通过ELISA(Invitrogen)测量鼠IL-18和鼠IL-21。
如下表所示，为检测分泌的功能性蛋白质的存在而进行的测定显示出多种组合有效载荷的高表达。这些包括细胞因子组合，以及与I型IFN诱导GOF变体和/或共刺激有效载荷的组合。这些数据验证了本文提供的平台从单个表达盒表达多种免疫调节蛋白的能力。
Figure GDA0004138988600001561
/>
Figure GDA0004138988600001571
组成型I型IFN诱导变体具有独特的细胞因子和趋化因子谱根据制造商的方案，使用人抗病毒CBA组(BD Biosciences)评估从HEK293T转染试验中收获的上清液的下游信号差异，所述转染试验是使用如上所述检测的一组人I型IFN诱导GOF变体。每个转染一式两份进行，并测量细胞因子水平。计算两次测量的平均值。与未转染的孔相比，计算平均细胞因子分泌的增加倍数，其中平均细胞因子分泌设置为1.00。
如下表所示，细胞中产生了低水平的人IL-12p70。然而，一些人I型IFN诱导GOF变体诱导I型IFN-α2和/或IFN-β的产生，包括拟磷酸IRF3变体(huIRF3-S396D)，以及一些组成型活性STING变体。许多这些GOF变体产生高水平的分泌的CXCL10，证明了这些表达的变体将T细胞募集到肿瘤微环境中的能力。在具有突变R284G的huSTING变体表达后，观察到最高水平的CXCL10表达。
这些数据验证了含有I型IFN诱导GOF变体的多重质粒表达构建体在诱导功能性下游细胞因子和趋化因子例如CXCL10/IP10中的应用。这些变体都具有独特的特征，STINGGOF变体诱导最高水平的CXCL10分泌，尤其是huSTING-R284G(对应于muSTING-R283G)。
Figure GDA0004138988600001581
免疫细胞共培养测定鉴定了免疫调节靶的最佳组合
为了确定引发T细胞募集和激活的细胞因子的最佳组合，在巨噬细胞和T细胞共培养测定中测试了一组组合。如上文所述使用24孔平板产生Golden Ticket(STING缺陷型)鼠原代骨髓衍生巨噬细胞(BMM)(参见实施例6)。将每个孔使用
Figure GDA0004138988600001582
转染试剂(Promega)用适当的DNA构建体转染。所述构建体包括编码muIL-2CO、muIL-12p70、muSTING-R283G、muIL-2CO+muIL-12p70、muIL-15Rα-IL-15sc+muIL-12p70和muIL-12p70+muSTING-R283G+muIL-18的那些构建体。
转染后24小时，从孔中收集100μL细胞培养上清液，用于基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(CBA)。同时，解剖来自C57BL/6小鼠的两个脾脏，按照小鼠T细胞分离试剂盒的说明(StemCell Technologies)分离脾CD4+和CD8+T细胞。然后将每孔200,000个分离的T细胞加入转染的细胞中，有或没有CD3ε抗体(克隆145-2C11，BioLegend)，最终浓度为每孔0.5μg/ml。在将T细胞加入转染细胞后24和48小时，从孔中收集100μL共培养上清液，用于基于流式细胞术的细胞因子珠阵列。分别使用鼠抗病毒和鼠Th1特异性细胞因子珠阵列分析来自转染的骨髓巨噬细胞(BMM)和骨髓巨噬细胞/T细胞共培养物的上清液的细胞因子含量。
如下表所示，只有编码muSTING-R283G的质粒引发巨噬细胞产生CXCL10，而编码muIL-12p70的质粒单独或与其它蛋白质组合从共培养的T-细胞中引发最高水平的IFNγ，高于得自CD3ε刺激产生的背景量。muIL-12p70+muIL-18+muSTING-R283G的组合能够诱导巨噬细胞产生CXCL10，以及共培养的T细胞产生IFNγ。
这些数据证明了从单个质粒表达多种免疫调节有效载荷的可行性，以及这些组合的协同活性。
Figure GDA0004138988600001591
联合免疫疗法在小鼠结肠直肠腺癌模型中显示出增强的抗肿瘤活性
为了确定细胞因子组合的肿瘤特异性递送是否增强抗肿瘤功效，将编码muIL-12p70、muIL-18和muSTING-R283G组合的构建体(CMV-muIL-12p70_T2A_muIL-18+EF-1α-muSTING-R283G-WPRE)在MC38小鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。在这项研究中，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μLPBS中的5×105个细胞)。在第10天，给带有已建立侧腹肿瘤的小鼠静脉注射1×107CFU菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB，所述菌株含有编码muIL-12p70、muIL-18和muSTING-R283G组合的质粒(CMV-muIL-12p70_T2A_muIL-18+EF-1α-muSTING-R283G-WPRE)，或具有PBS载体对照。
所述联合疗法的耐受性非常好，最初体重减轻3.6％，3天后完全恢复。这与全身施用这些细胞因子(IL-12p70和IL-18)时观察到的毒性形成鲜明对比。与PBS对照相比，所述联合疗法非常有效且具有治愈性(92.3％ TGI，60％治愈率，第30天)。这些数据表明使用本文所述的免疫刺激细菌菌株以肿瘤特异性方式递送细胞因子组合的效力和安全性。
实施例15
蛋白质工程化筛选以鉴定STING、RIG-I、MDA5、IRF3、IRF7和其它干扰素途径基因中改进的功能获得性突变
从人体中鉴定了组成型活性并促进干扰素疾病的功能获得性(GOF)氨基酸突变体。许多GOF突变是由于单个碱基对核苷酸的变化而发生的，这些变化改变了基因中特定位置的氨基酸密码子。例如，在STING中，V147L突变是由于c.439G→C的突变而发生的；N154S是由于c.461A→G的突变而发生的；V155M是由于c.463G→A的突变而发生的。筛选的目的是鉴定导致高水平I型干扰素表达的组成型活性突变体。在已知当突变时促进人患者干扰素疾病的位点上设计的突变使得可以检测更多数量的氨基酸取代。在这个实施例中，在已知突变的位置(见下表列出促进干扰素病的基因中的突变)用设计的氨基酸进行定点诱变，以鉴定具有增强活性的突变，其导致高水平I型干扰素表达。
Figure GDA0004138988600001601
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Figure GDA0004138988600001611
参考SEQ ID NO:305-309所示人STING序列的氨基酸残基R197、D205、R310、R293、T294、E296、S272、Q273、E316、D231、R232、K236、S358、E360、S366和R238，分别对应于参考SEQ ID NO:369所示小鼠STING序列的氨基酸残基R196、D204、R309、R292、T293、E295、S271、Q272、E315、D230、R231、K235、S357、E359、S365和R237。
PCR引物是用在来自所述基因的同源cDNA序列5’和3’末端侧翼设计的取代产生的。
Figure GDA0004138988600001612
定点诱变试剂盒(Agilent)或其它类似的可商购试剂盒用于产生掺入设计的突变的PCR产物。将PCR扩增的质粒用DpnI处理，然后在感受态大肠杆菌细胞中进行电穿孔。分离单个克隆，进行质粒小量制备(mini-preps)，并确认所需突变的序列相同性。然后进行更大规模的质粒制备(使用Qiagen试剂盒)并将DNA转染到不含内源性STING的HEK293T STING报道细胞(InvivoGen)中。这些细胞表达LuciaTM荧光素酶，这是一种分泌的荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制之下；IFN-β的编码序列已使用敲入技术由LuciaTM荧光素酶ORF取代。然后通过测量IFN-β启动子诱导的荧光素酶活性表达来鉴别和分级组成型激活的突变体。
实施例16
与鼠伤寒沙门氏菌缺失相对应的各种具有失活缺失的免疫刺激细菌
上述实施例描述了对鼠伤寒沙门氏菌基因组的示例性修饰，以增加对鼠伤寒沙门氏菌在免疫驻留骨髓细胞和肿瘤微环境中的靶向和积累，向肿瘤递送治疗产物/有效载荷，并通过消除其感染其它细胞类型的能力降低细菌的毒性。类似地，这些遗传修饰可以引入其它细菌菌株和物种，例如通过缺失其它物种中的相应基因而实现，如下所述。
大肠杆菌(Escherichia coli)
lpxM、purM、asd、fliC、fliE、pagP、ansB和csgD基因的符合读框的染色体缺失是使用基于Datsenko和Wanner描述的重组工程方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))的技术在大肠杆菌菌株中相继制成的。大肠杆菌中的基因如下：
1)lpxM，编码肉豆蔻酰基-酰基载体蛋白依赖性酰基转移酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：945143]；
2)purM，编码磷酸核糖甲酰甘氨酰胺环连接酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：946975]；
3)asd，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：947939]；
4)fliC，编码鞭毛丝结构蛋白[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：949101]；
5)fliE，编码鞭毛基体蛋白FliE[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：946446]；
6)pagP，编码脂质IVA棕榈酰转移酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：946360]；
7)ansB，编码L-天冬酰胺酶2[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：947454]；
8)csgD，编码DNA结合转录双重调节因子CsgD[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：949119]；和
9)rpsM，编码30S核糖体亚基蛋白S13(启动子)[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：947791]。
简而言之，特定的染色体序列被两侧是同源臂的可选择抗生素抗性标记所取代，随后通过cre/loxP系统去除。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并克隆到与抗生素抗性基因相对侧的质粒载体中。将包含抗生素抗性基因和侧翼5’和3’同源臂的基因缺失盒通过PCR扩增、凝胶纯化，并通过电穿孔引入大肠杆菌菌株。回收电穿孔的细胞，并在抗生素平板上选择转化体。然后使用cre/loxP重组系统处理抗生素标记，其中抗生素抗性克隆用表达cre的温度依赖性质粒转化。在30℃下选择菌落，随后在42℃下通过连续传代消除，然后筛选抗生素抗性的丧失。通过菌落PCR和序列分析确认抗生素敏感克隆的基因缺失。
增加大肠杆菌对人补体抗性或使其产生抗性
鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail(附着侵入位点)或鼠伤寒沙门氏菌pgtE(外膜丝氨酸蛋白酶)基因在大肠杆菌ΔlpxM/ΔpurM/Δasd/ΔfliC/ΔfliE/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株中的表达，是通过在质粒上(asd互补系统兼容的)编码组成型启动子例如大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌rpsM下游的rck、ail或pgtE基因序列，或通过插入在细菌染色体上(在任何的lpxM、purM、asd、fliC、fliE、pagP、ansB或csgD基因座)来实现。
伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)
msbB、purM、asd、fliC、flgB、pagP、ansB和csgD基因的符合读框地染色体缺失是在伤寒沙门氏菌菌株中使用上述基于大肠杆菌菌株的技术相继制成的。
在伤寒沙门氏菌ΔmsbB/ΔpurM/Δasd/ΔfliC/ΔflgB/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株中表达鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码组成型启动子如鼠伤寒沙门氏菌或伤寒沙门氏菌rpsM下游的rck、ail或pgtE基因序列，或者通过插入在细菌染色体上(在任何的msbB、purM、asd、fliC、flgB、pagP、ansB或csgD)来实现的。伤寒沙门氏菌中的基因如下：
1)msbB(STY2097)，编码脂质A酰基转移酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1248440]；
2)purM(STY2740)，编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1249054]；
3)asd(STY4271)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1250488]；
4)fliC(STY2167)，编码鞭毛蛋白[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1248507]；
5)flgB(STY1213)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgB[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1247617]；
6)pagP(STY0677)，编码抗菌肽抗性和脂质A酰化蛋白[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，CT18株；NCBI基因ID：1247137]；
7)ansB(STY3259)，编码L-天冬酰胺酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1249541]；
8)csgD(STY1179)，编码调节蛋白CsgD[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1247585]；和
9)rpsM(STY4380)，编码30S核糖体亚基蛋白S13(启动子)[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1250594]。
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)
单核细胞增生李斯特菌中purA、purQ、purS、asd、flaA、fliC、flgB和ansB基因的符合读框地染色体缺失是通过使用温度敏感穿梭载体如pKSV7的等位基因交换技术实现的，该载体赋予抗生素抗性并允许在低温(30℃)下复制，但无法在更高温度(43℃)下复制。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并串联克隆到pKSV7载体中，将其转化为受体单核细胞增生李斯特菌，并通过铺板在具有抗生素的琼脂平板上进行选择。质粒的染色体整合是通过在42℃选择的抗生素抗性转化株的连续传代来诱导的。随后在30℃对所述菌株进行连续继代培养，产生细胞亚群，其中通过第二次交换事件切除质粒，产生恢复为原始野生型基因，或掺入5’和3’侧翼序列同源臂以生成靶向缺失突变体。在此步骤通过菌落PCR和序列分析筛选抗生素敏感克隆。
为了增加补体抗性，在单核细胞增生李斯特菌ΔpurA/ΔpurQ/ΔpurS/Δasd/ΔflaA/ΔfliC/ΔflgB/ΔansB菌株中鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因的表达，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码组成型启动子例如Phyper或Phelper下游的rck、ail或pgtE基因序列，或通过插入在细菌染色体上(在任何的purA、purQ、purS、asd、flaA、fliC、flgB或ansB基因座)而实现的。单核细胞增生李斯特菌中的基因如下：
1)purA(lmo0055)，编码腺苷酸琥珀酸合成酶[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：986069]；
2)purQ(lmo1769)，编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶II[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985972]；
3)purS(lmo1771)，编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒合酶亚基PurS[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985970]；
4)asd(lmo1437)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：986492]；
5)flaA(lmo0690)，编码鞭毛蛋白[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：987167]；
6)fliE(lmo0712)，编码鞭毛钩基体蛋白FliE[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985062]；
7)flgB(lmo0710)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgB[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID 985059]；和
8)ansB(lmo1663)，编码天冬酰胺合成酶[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985663]。
单核细胞增生李斯特菌中不存在msbB和pagP基因，这是一种革兰氏阳性细菌。CsgD在单核细胞增生李斯特菌中也不存在。相反，李斯特菌表达编码参与生物膜形成的李斯特菌纤维素结合蛋白的lcp，该基因也可以被缺失。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
长双歧杆菌中BL1122(purM)、BL0492(asd)和BL1142(编码L-天冬酰胺酶前体)的符合读框地染色体缺失是通过使用不相容质粒载体系统的等位基因交换技术实现的，其中最初将缺乏质粒复制基因repA的条件化复制载体如pBS423ΔrepA整合到基因组中，提供抗生素抗性。随后转化编码repA基因的第二个质粒如pTBR101-CM，并促进选择切除初始整合体的第二次交换事件。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并串联克隆到缺乏repA的条件化复制载体中，并转化为长双歧杆菌ΔBL1122/ΔBL0492/ΔBL1142菌株。交叉重组事件可以发生在同源臂序列上，选择成功的质粒整合体并在抗生素平板上分离。然后用编码repA功能拷贝的不相容质粒转化整合体，这有助于第二次交换事件和repA缺陷质粒的切除，其随后由于质粒不相容而丧失。通过菌落PCR和序列分析确认基因组缺失，通过去除选择和随后的Rif处理来处理剩余的质粒。
在长双歧杆菌ΔBL1122/ΔBL0492/ΔBL1142菌株中表达鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码强组成型启动子如Pgap下游的rck、ail或pgtE基因序列来实现的，或通过插入在细菌染色体上(在任何的BL1122、BL0492或BL1142基因座)而实现的。长双歧杆菌中的基因如下：
1)purM(BL1122)，编码磷酸核糖甲酰基甘氨酰胺环连接酶[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1022669]；
2)asd(BL0492)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1023089]；
3)BL1142，编码L-天冬酰胺酶前体(Ntn_天冬酰胺酶_2_样；NTN-水解酶超家族的L-天冬酰胺酶2型样酶)[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1023120]；和
4)BL1363 gap(启动子)[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1022828]。
长双歧杆菌无能动性，缺乏鞭毛蛋白，是革兰氏阳性菌，缺乏msbB和pagP。存在ansB基因，但编码天冬氨酸解氨酶，该酶催化天冬氨酸(aspA/ansB)形成富马酸[BL0338，长双歧杆菌NCC2705；NCBI基因ID：1023259]。
诺氏梭菌(Clostridium novyi)
梭菌中NT01CX_RS09765、NT01CX_RS07625和NT01CX_RS04325(asd)；鞭毛蛋白基因NT01CX_RS04995、NT01CX_RS04990、NT01CX_RS05070和NT01CX_RS05075；鞭毛基体杆蛋白基因NT01CX_RS05080(flgB)、NT01CX_RS05085(flgC)和NT01CX_RS05215(flgG)的符合读框地染色体缺失是通过等位基因交换技术实现的，该技术需要包括毒素-抗毒素系统在内的反选择方法，这需要诱导型启动子和毒性基因，例如大肠杆菌mRNA干扰酶mazF。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并克隆到含等位基因交换反选择载体中的frt侧翼抗生素抗性盒的相对侧的构型中，并转化为新梭菌。mazF基因在等位基因交换载体上在诱导型lac启动子的控制下编码，并允许通过在补充了乳糖的琼脂平板上生长来选择双交换事件。通过菌落PCR和序列分析确认基因组缺失。然后可以使用Flp-frt重组来处理染色体中的抗生素抗性盒。
在诺氏梭菌ΔNT01CX_RS09765/ΔNT01CX_RS07625/ΔNT01CX_RS04325/ΔNT01CX_RS04995/ΔNT01CX_RS04990/ΔNT01CX_RS05070/ΔNT01CX_RS05075/ΔNT01CX_RS05080/ΔNT01CX_RS05085/ΔNT01CX_RS05215菌株中表达鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码强组成型启动子如Pthl、Pptb或其它变体下游的rck、ail或pgtE基因序列来实现的，或者通过插入在细菌染色体(在任何的NT01CX_RS09765、NT01CX_RS07625、NT01CX_RS04325、NT01CX_RS04995、NT01CX_RS04990、NT01CX_RS05070、NT01CX_RS05075、NT01CX_RS05080、NT01CX_RS05085、或NT01CX_RS05215基因座)上实现的。诺氏梭菌中的基因如下：
1)NT01CX_RS09765，编码AIR合酶[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4541583]；
2)NT01CX_RS07625，编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540669]；
3)NT01CX_RS04325(asd)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4541762]；
4)NT01CX_RS04995，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4541703]；
5)NT01CX_RS04990，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4539984]；
6)NT01CX_RS05070，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌NT；NCBI基因ID：4539886]；
7)NT01CX_RS05075，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌NT；NCBI基因ID：4539699]；
8)NT01CX_RS05080(flgB)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgB[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540637]；
9)NT01CX_RS05085(flgC)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgC[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540143]；和
10)NT01CX_RS05215(flgG)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgG[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540245]。
诺氏梭菌是革兰氏阳性菌，缺乏msbB和pagP。
实施例17
经修饰以表达比人STING诱导更强I型IFN信号传导和/或更弱NF-κB信号传导的脊椎动物STING变体的免疫刺激细菌
STING信号传导激活两种信号传导途径。第一种是TANK结合激酶(TBK1)/IRF3轴，导致I型干扰素的诱导，以及树突状细胞(DC)的激活和肿瘤抗原的交叉呈递以激活CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫。第二种是激活的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导轴，导致促炎反应，但不激活抗肿瘤免疫所需的DC和CD8+ T细胞。基于细菌的癌症免疫疗法在诱导I型IFN以募集和激活促进肿瘤抗原交叉呈递和持久抗肿瘤免疫所必需的CD8+ T细胞方面的能力有限。因此，本文提供了诱导和/或增加I型IFN信号传导并且具有降低的NF-κB信号传导的免疫刺激细菌，从而增加CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫的诱导，并增强细菌的治疗功效。上述免疫刺激细菌编码修饰的STING蛋白，这些蛋白是STING的功能获得性突变体，其与野生型STING相比，可以增加I型IFN的诱导，或使I型IFN的表达成为组成型。在本实施例中(且也在详细描述中描述)，STING蛋白被修饰以降低或消除NF-κB信号传导活性，并保留诱导I型IFN的能力，和/或STING蛋白被修饰为增加I型干扰素表达或组成型表达I型干扰素。这导致产生免疫刺激细菌，其诱导抗肿瘤免疫，并且不诱导(或诱导较少)通常由细菌病原体感染引起的NF-κB信号传导。
来自不同物种的STING蛋白表现出不同水平的I型IFN和NF-κB信号传导活性。例如，人和小鼠细胞中的STING信号传导导致强I型IFN应答和弱促炎NF-κB应答。相比之下，鳍鱼类(ray-finned fish)如鲑鱼和斑马鱼中的STING信号传导引起主要是NF-κB驱动的应答的强烈激活，与IRF3驱动的(即I型IFN诱导的)应答相比高100倍以上。在其它物种例如袋獾中，STING信号传导导致I型IFN应答，但基本上没有NF-κB应答。本文提供的免疫刺激细菌编码来自非人物种的STING例如袋獾STING，以便利用STING诱导I型IFN应答的能力，但不会同时诱导NF-κB应答。如本文所述，这些非人STING蛋白也通过突变修饰以增加I型IFN应答，或使其成为组成型。在人STING中鉴定的具有这种效应的突变被引入到非人STING蛋白中。通过比对鉴定相应的残基。
还提供了嵌合体，其中STING的C末端尾部(CTT)在一个物种(例如人)中用来自表现出很少或没有NF-κB信号传导活性的第二个(例如非人)物种的CTT替换。CTT是一个约40个氨基酸的非结构化片段，其含有STING磷酸化和IRF3募集所需的序列基序。其可以通过改变I型IFN和NF-κB信号传导之间的平衡来塑造下游免疫。这通过CTT中的独立模块控制，包括IRF3、TBK1和TRAF6结合模块。例如，人STING残基S366(见例如SEQ ID NO:305-309)是主要的TBK1磷酸化位点，其是IRF3结合所需的CTT中LxIS基序的一部分，而第二个PxPLR基序，包括残基L374，是TBK1结合所需的。LxIS和PxPLR基序在所有脊椎动物STING等位基因中高度保守。用例如袋獾STING的CTT取代人STING的CTT产生诱导I型IFN应答但不诱导NF-κB应答的STING。
在这个实施例中，免疫刺激细菌被工程化为表达与野生型(WT)人STING(SEQ IDNO:305-309)相比具有增加的I型IFN信号传导和/或减少的NF-κB信号传导的STING变体。STING变体可以来自非人脊椎动物，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类物种。非人STING蛋白源自的物种包括但不限于袋獾(Sarcophilus harrisii；SEQ ID NO:349)，狨猴(Callithrix jacchus；SEQ ID NO:359)，牛(Bos taurus；SEQ ID NO:360)，猫(Fellscatus；SEQ ID NO:356)，鸵鸟(Struthio camelus australis；SEQ ID NO:361)，朱鹮(Nipponia nippon；SEQ ID NO:362)，腔棘鱼(Latimeria chalumnae；SEQ ID NO:363-364)，野猪(Sus scrofa；SEQ ID NO:365)，蝙蝠(Rousettus aegyptiacus；SEQ ID NO:366)，海牛(Trichechus manatus latirostris；SEQ ID NO:367)，鬼鲨(Callorhinchusmilli；SEQ ID NO:368)，和小鼠(Mus musculus；SEQ ID NO:369)。这些脊椎动物STING蛋白很容易激活人细胞中的免疫信号传导，表明STING信号传导的分子机制在脊椎动物之间是共享的(见例如de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。与人STING相比，来自这些物种的STING蛋白诱导更少的NF-κB信号激活和/或更多的I型干扰素信号激活(见例如de Oliveira Mann et al.(2019)，图1A)。来自不同非人物种的野生型或修饰的STING蛋白可以由本文的免疫刺激细菌表达，其可以是人和非人STING蛋白的嵌合体。
各种非人STING蛋白被修饰，使得非人STING具有比人STING更低的NF-κB激活，并且任选地具有更高的I型干扰素激活。这些非人STING蛋白被修饰以包括一个或多个突变，以使其具有增加的I型IFN活性，或在没有胞质核酸配体(例如CDN)的情况下组成型地起作用。突变通常是与人干扰素疾病相关的氨基酸突变，例如功能获得性突变。相应的突变被引入非人物种STING蛋白，其中相应的氨基酸残基通过比对而鉴定。例如，突变包括但不限于S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A和S324A/S326A，其参照SEQ ID NO:305-309所示的人STING序列。下表列出了来自其它物种的STING中的相应突变。所得非人STING蛋白的变体包括一种或多种的这些突变，和任选CTT置换，以及任选TRAF6结合位点中的缺失。
STING变体包括磷酸化位点处的氨基酸丝氨酸(S)或苏氨酸(T)用拟磷酸的天冬氨酸(D)进行的一个或多个置换，由此产生增加的或组成型活性。其它突变包括缺失或置换一个或多个磷酸化位点，例如STING中的324-326SLS→ALA，以及其它置换以消除磷酸化位点，降低STING中的NF-κB信号传导。此外，还提供了人STING与来自其它物种的STING的嵌合体，其中人STING的C末端尾部(CTT)用来自另一个物种的具有更低NF-κB信号传导活性和/或更高I型IFN信号活性的STING的CTT置换。变体STING蛋白可以包括CTT的TRAF6结合位点中的缺失，以降低NF-κB信号传导。
Figure GDA0004138988600001681
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Figure GDA0004138988600001691
例如，修饰的STING变体包括具有突变C206Y(SEQ ID NO:350)或R284G(SEQ IDNO:351)的袋獾STING；其中人STING的CTT被袋獾STING的CTT取代的变体(SEQ ID NO:352)；具有突变C206Y(SEQ ID NO:353)或R284G(SEQ ID NO:354)的人STING，并且其中CTT被袋獾STING的CTT置换；具有TRAF6结合结构域中的缺失(对应于残基377-379，DFS))的野生型人STING(SEQ ID NO:355)；具有突变C205Y(SEQ ID NO:357)或R283G(SEQ ID NO:358)的猫STING；和其它这种修饰的STING变体。
为了确定STING突变的相应氨基酸残基，将来自各种非人物种的野生型STING序列各自与野生型人STING序列(SEQ ID NO:305(R232等位基因)或SEQ ID NO:306(H232等位基因)的等位基因变体的)进行比对。使用可从ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/获得的Kalign序列比对工具，或者可从ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得的EMBOSS needle序列比对工具进行比对。图1-13中描绘了人STING分别与来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、朱鹭、腔棘鱼、斑马鱼、野猪、蝙蝠、海牛、鬼鲨和小鼠物种的STING蛋白的示例性序列比对。
STING GOF杂合变体证实在树突状细胞中的显著提高的I型干扰素与NF-κB比率
为了确定在小鼠中引起最高水平CD8+ T细胞趋化因子CXCL10的优化STING GOF突变体，在小鼠原代骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)中测试了一组突变体。这些包括具有组成型人GOF突变C206Y(tazSTING C206Y；SEQ ID NO:350)或R284G(tazSTING R284G；SEQ IDNO:351)的袋獾STING；具有组成型GOF突变体C205Y(muSTING C205Y；SEQ ID NO:399)或R283G(muSTING R283G；SEQ ID NO:400)的鼠STING；具有组成型GOF突变体C205Y(catSTINGC205Y；SEQ ID NO:357)或R283G(catSTING R283G；SEQ ID NO:358)的猫STING；以及以及其中人STING(SEQ ID NO:370)的CTT被袋獾STING(SEQ ID NO:371)的CTT置换并含有野生型人STING(huSTING tazCTT；见例如SEQ ID NO:352)或人STING GOF突变C206Y(huSTINGC206Y tazCTT；见例如SEQ ID NO:353)或R284G(huSTING R284G tazCTT；见例如SEQ IDNO:354)的变体。还包括具有组成型GOF突变C206Y(huSTING C206Y)或R284G(huSTINGR284G)的人STING变体。
为了测试这些，分离鼠骨髓并冲入1.5mL Eppendorf管并以1200RPM旋转5分钟以收集骨髓细胞。将细胞在RPMI-1640+10％ FBS中洗涤一次，然后种植在96孔TC处理的具有20ng/ml GM-CSF的RPMI-1640+10％ FBS平板中。每2天用新鲜的完全培养基更换50％的培养基。6天后，将非贴壁细胞从孔中吸出并以1e5/孔细胞重新种植在96孔平板中的RPMI-1640+10％ FBS中用于转染。根据制造商的说明，使用
Figure GDA0004138988600001701
RED转染细胞。简而言之，将来自一组STING GOF突变体的200ng质粒DNA以及未转染对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.08μL的/>
Figure GDA0004138988600001702
RED混合并在室温下温育15分钟以使得可以形成/>
Figure GDA0004138988600001703
复合物。然后将/>
Figure GDA0004138988600001704
RED复合物缓慢加入96孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在CO2温育器中在37℃温育。根据制造商的方案，在48小时收集上清液并使用基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(CBA)测定鼠CXCL10(IP-10)。
如下表所示，诱导鼠CXCL10最高表达的构建体人STING(huSTING R284G tazCTT)，其含有GOF突变R284G，并且含有人STING的CTT被置换为袋獾STING的CTT。次高的CXCL10表达是由含有GOF突变C206Y人STING变体(huSTING C206Y)和含有人STING GOF突变R284G的袋獾STING构建体(tazSTING R284G)诱导的。在原代鼠树突状细胞中，人STING GOF突变体(huSTING C206Y和huSTING R284G)比相应的鼠STING GOF突变体(分别为muSTING C205Y和muSTING R283G)更强效，后者甚至不如含有相同GOF突变(分别为catSTING C205Y和catSTING R283G)的猫STING强效。
构建体 muCXCL10(pg/mL)
未转染的 11.48±3.889
huSTING C206Y 861.0±58.48
huSTING R284G 769.7±95.16
muSTING C205Y 194±27.15
muSTING R283G 230.1±1.018
huSTING C206Y tazCTT 366.6±42.61
huSTING R284G tazCTT 1326±137.9
tazSTING C206Y 808.8±95.78
tazSTING R284G 831.3±30.15
catSTING C205Y 480.7±24.94
catSTING R283G 376.2±6.682
这些数据证实利用从其它物种例如袋獾获得的STING蛋白可以与组成型GOF人STING突变组合以引发强力的T细胞募集趋化因子。
STING GOF杂合变体证实在人单核细胞中的显著提高的I型干扰素与NF-κB比率
为了证实使用来自其它物种的STING GOF杂合变体可以改变STING诱导的I型干扰素与NF-κB信号传导比率，在人单核细胞系中测试了一个小组。该小组包括野生型人STING(huSTING)，和具有组成型人GOF突变C206Y或R284G的人STING突变体；野生型袋獾STING(tazSTING)，和具有组成型GOF突变C206Y或R284G的tazSTING突变体；野生型猫STING，和具有组成型GOF突变C205或R283G的猫STING突变体；具有组成型GOF突变C205Y或R283G的鼠STING突变体；以及其中人STING的CTT被置换为袋獾STING的CTT并含有野生型人STING或人STING突变C206Y或R284G的变体。还包括在TRAF6结合结构域具有缺失(相应于残基377-379，DFS，见例如SEQ ID NO:355)的野生型人STING，以及野生型斑马鱼STING。
对于这个实验，使用了THP1-DualTM KO STING细胞，这些细胞已经被改变为缺乏内源性STING，并且还表达LuciaTM荧光素酶，其是一种分泌型荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制之下。然后通过测量IFN-β启动子诱导的荧光素酶活性表达鉴定和分级组成型活性的STING GOF突变体。这些细胞还表达在内源性NF-κB启动子控制下的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，其中NF-κB的编码序列已使用敲入技术置换为SEAP ORF。STING GOF突变体诱导的NF-κB活性可以通过监测细胞上清液中的SEAP产生来评估。
对于这个实验，根据制造商指导，用
Figure GDA0004138988600001711
RED转染THP1-DualTM KO STING细胞。简而言之，将来自一组STING GOF突变体的200ng质粒DNA以及未转染的对照在提供的缓冲液中稀释，与0.08μL的/>
Figure GDA0004138988600001712
RED混合并在室温下温育15分钟以允许形成/>
Figure GDA0004138988600001713
复合物。然后将/>
Figure GDA0004138988600001714
RED复合物缓慢加入96孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在CO2温育器中在37℃温育。此外，野生型STING变体用或不用STING激动剂3’5’RpRp c-di-AMP(CDN，InvivoGen)处理，该激动剂是临床化合物ADU-S100的类似物，在温育24小时后以10μg/mL加入到细胞。根据制造商的方案，在48小时收集上清液并测定NF-κB-SEAP和IFN-Lucia报告分子信号。简而言之，将10μL细胞培养上清液加入到50μL QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)(用于测量SEAP)。NF-κB活化是通过在/>
Figure GDA0004138988600001721
M3分光光度计(MolecularDevices)上在吸光度(Abs)为650nm测量NF-κB诱导的SEAP活性而确定。为了测量来自IFN-Lucia的I型干扰素活性，将10μL细胞培养上清液加入50μL含有用于荧光素酶反应的腔肠素底物的QUANTI-LucTM，其产生光信号，使用/>
Figure GDA0004138988600001722
M3分光光度计定量所述光信号，并表示为相对光单位(RLU)。
如下表所示，最高的I型IFN应答在其中人STING的CTT被袋獾STING的CTT置换并且含有人STING GOF突变R284G的变体(huSTING R284G tazCTT)中观察到，以及在具有CDNSTING激动剂的野生型斑马鱼STING(zfSTING WT+CDN)中观察到。然而，与具有非常高的NF-κB信号传导的野生型斑马鱼STING不同，huSTING R284G tazCTT变体具有高I型IFN信号传导，而NF-κB信号传导活性低得多。在含有人STING GOF突变R284G的袋獾STING变体(tazSTING R284G)中发现了较高I型IFN与较低NF-κB信号传导的最佳比率。
Figure GDA0004138988600001723
SD＝标准差
这些数据进一步证实使用非人STING蛋白(例如来自袋獾的STING蛋白)并将其与人组成型功能获得性STING突变组合，以在人单核细胞中增强有益的I型干扰素活性，同时最小化免疫抑制性NF-κB活性。
实施例18
通过缺失lppA和lppB基因敲除鼠伤寒沙门氏菌脂蛋白
将含有Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD基因缺失的活的减毒鼠伤寒沙门氏菌YS1646菌株工程化以缺失lppA(SEQ ID NO:387)和lppB(SEQ ID NO:388)基因，以便去除膜表面脂蛋白。这减少了促炎TLR2的活化，从而减少了免疫抑制细胞因子并提高了抗肿瘤适应性免疫。如下所示，这也增强了肿瘤中的质粒递送和编码蛋白表达。
菌株工程化和鉴定
lppA基因的缺失
如上文详细描述，使用修改的Datsenko和Wanner方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))，从YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的染色体中缺失lppA。合成合成的lppA基因同源臂序列含有分别位于lppA基因两侧的231和200个碱基的左侧和右侧序列，将其克隆到称为pSL0148(SEQ ID NO：231)的质粒中。lppA基因的序列如SEQ ID NO:387所示；利用该基因序列设计了合适的PCR扩增引物。然后将两侧有cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到质粒pSL0148中，然后用引物lppA-1和lppA-2对lppA基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，然后通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株中。将电穿孔细胞回收在SOC+DAP培养基中，并铺板在补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/mL)的LB琼脂板上。使用引物lppA-3和lppA-4，通过PCR选择并筛选插入敲除片段的菌落。然后通过在42℃培养选定的卡那霉素抗性菌株并筛选氨苄青霉素抗性的丧失来处理pKD46。然后通过电穿孔表达Cre重组酶的温度敏感质粒(pJW168)处理卡那霉素抗性标记，并在30℃下选择AmpR菌落；随后通过在42℃生长培养物消除pJW168。然后使用位于破坏位点侧翼的引物(lppA-3和lppA-4)，通过PCR检测选定的lppA敲除克隆的卡那霉素标记丢丧失，并在琼脂糖凝胶上评估电泳迁移率。菌株YS1646的这种突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppA。
lppB基因的缺失
然后使用上述方法的修改在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/lppA菌株中缺失lppB。合成合成的lppB基因同源臂序列分别含有位于lppB基因的两侧224和231个碱基的左侧和右侧序列，并将其克隆到称为pSL0148(SEQ ID NO：231)的质粒中。lppB基因的序列如SEQ ID NO:388所示；利用该基因序列设计了合适的PCR扩增引物。然后将两侧有cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到质粒pSL0148中，用引物lppB-5和lppB-6对lppB基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/lppA。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长来处理温度敏感质粒。分别使用称为lppA-3和lppA-4、lppB-7和lppB-8的引物通过PCR扩增lppA和lppB基因敲除序列，并通过DNA测序验证。菌株YS1646的这种突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB，或绰号为YS1646ΔlppAB。
工程化的鼠伤寒沙门氏菌脂蛋白敲除菌株的体外鉴定
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株具有lppA和lppB缺失，通过在LB中过夜培养来评估其生长。使用
Figure GDA0004138988600001731
M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃下测量生长，每15分钟读取一次OD600。结果表明，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB能够以与亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株相当的生长速率在LB中复制。这些数据表明，脂蛋白的消除不会降低体外鼠伤寒沙门氏菌的适应性。
脂蛋白缺失增强了全身施用后质粒向肿瘤的递送
由于TLR2在血管内皮细胞上表达，并且TLR2的活化增强了血管通透性，因此评估了ΔlppAB以及随后TLR2激动作用的降低对肿瘤定植的影响。还评估了对有效载荷表达的影响。如下所示，在全身给药后，虽然肿瘤的定植有所减少，但质粒递送和编码的基因表达显著增加。
为了证明脂蛋白敲除菌株对小鼠三阴性乳腺癌模型的影响，为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组4只小鼠)在4th乳腺脂肪垫中原位接种EMT6细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。给已建立10天的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射单剂量的1×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株或亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，每个菌株均含有在CMV启动子控制下编码分泌的荧光素酶蛋白(
Figure GDA0004138988600001741
荧光素酶或/>
Figure GDA0004138988600001742
Promega)/>
Figure GDA0004138988600001743
的质粒。在静脉内给药后第7天，将小鼠安乐死，将肿瘤均质化并铺在LB板上，以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)的数量。亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株以每克肿瘤组织平均3.3×106CFU定植肿瘤，而脂蛋白缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株的肿瘤定植为平均1.18×106CFU/g肿瘤组织，相比之下减少2倍。
为了测量质粒递送至肿瘤以及随后的异源基因表达和蛋白质分泌，测量了
Figure GDA0004138988600001744
的活性。为此，使用/>
Figure GDA0004138988600001745
检测试剂(Promega)评估均质化肿瘤的荧光素酶活性，并在/>
Figure GDA0004138988600001746
M3分光光度计/发光计(MolecularDevices)上读取。虽然亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株诱导的平均发光相对光单位(RLUs)为4482.6，但YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株诱导的平均发光相对光单位(RLU)增加了近10倍，达到33,926.6RLU。这些数据证明了脂蛋白缺失菌株改善肿瘤定植和增强有效载荷表达的能力。
这些数据表明，虽然脂蛋白的缺失在一定程度上减少了静脉内给药后的肿瘤定植，但其显著增强了肿瘤中的质粒递送和有效载荷表达。这些数据表明，与本领域的预期这些基因的缺失将减少定植相反，脂蛋白缺失增强了肿瘤微环境和肿瘤中的质粒递送和蛋白质表达。
实施例19
具有截短胞质结构域的人和鼠4-1BBL与野生型4-1BBL一样表达
如本文所讨论的，缺乏胞质结构域的共刺激分子4-1BBL的变体(4-1BBLΔcyt)增强了4-1BBL的活化，而没有通过分子的胞质结构域发生的免疫抑制反向信号传导。实施例9表明，鼠4-1BBLΔcyt可以在人细胞表面表达。如下所示，完全缺乏胞质结构域的4-1BBL变体表达不佳。为了解决这个问题，提供了4-1BBL的变体，其中胞质结构域被截短，从而消除了免疫抑制反向信号传导。
全长人和小鼠4-1BBL在胞质结构域内含有正电荷，该结构域位于蛋白质的N末端。这有利于将N末端定位在细胞质内，并允许跨膜结构域的正确方向，及因此细胞外结构域的正确方向。因此，全长人和小鼠4-1BBL以高水平表达。在从人和小鼠4-1BBL中缺失完整的胞质结构域后，产生4-1BBLΔcyt变体，N末端的正电荷被去除，有利于N末端位于细胞外。这样导致跨膜结构域(现在位于N末端)的方向不正确，以及细胞表面表达的4-1BBLΔcyt变体的“由内而外(inside out)”构型。因此，4-1BBLΔcyt变体的表达水平远低于全长4-1BBL蛋白。
为了提高4-1BBL表达，而不诱导免疫抑制反向信号传导，人和小鼠4-1BBL变体被合理地设计为胞质结构域的截短，而不是胞质结构域的完全缺失。具有截短胞质结构域的人和小鼠4-1BBL变体分别含有与跨膜结构域相邻的胞质结构域的最后4个(RVLP)和最后5个(SRHPK)氨基酸残基。这将带正电的残基重新引入N末端，有利于使其定位于细胞内部，并纠正跨膜结构域的方向和“由内而外”构型。与4-1BBLΔcyt变体的表达相比，这导致具有截短胞质结构域的4-1BBL变体的表达增加，同时仍抑制通过蛋白质的胞质结构域发生的免疫抑制反向信号传导。
此外，产生了具有截短胞质结构域和在N末端添加Myc标签的人和小鼠4-1BBL变体，假设添加Myc标签会在N末端截短的胞质结构域添加额外的阳性残基，纠正由内而外的构型并增加蛋白质表达。
全长人和小鼠4-1BBL蛋白的序列，以及具有部分截短的胞质结构域(CytTrunc)和缺失的胞质结构域(Δcyt)的变体的序列如下表所示。胞质结构域用粗体表示并加下划线；跨膜区用粗体表示；胞外区用下划线表示；
Figure GDA0004138988600001752
用双下划线表示。
全长人和小鼠4-1BBL的序列，以及具有截短或缺失的胞质结构域的变体的序列
Figure GDA0004138988600001751
/>
Figure GDA0004138988600001761
为了比较工程化4-1BBL变体与全长4-1BBL蛋白的表达水平，使用
Figure GDA0004138988600001762
转染试剂(Promega)以适当的试剂:DNA比率用500ng编码全长蛋白或变体的DNA转染HEK293T细胞，未转染的细胞作为阴性对照。转染后48小时，收获转染的HEK293T细胞，并酌情用抗小鼠4-1BBL或抗人4-1BBL抗体染色。使用针对小鼠4-1BBL(克隆TKS-1；BioLegend)的生物素化抗体对小鼠4-1BBL进行染色，然后使用链霉亲和素-别藻蓝蛋白(APC)缀合物(BioLegend)染色。使用针对人4-1BBL(克隆5F4；BioLegend)的APC缀合抗体对人4-1BBL进行染色。未转染的细胞也被染色，以测量背景荧光。通过流式细胞术测量膜结合4-1BBL的表达，结果以减去背景的平均荧光强度(dMFI)的形式提供(即，从来自样本的MFI减去阴性对照(染色的未转染细胞)的MFI)。
如下表所示，对于人和小鼠4-1BBL，具有截短的胞质结构域的变体的表达显著高于具有完全缺失的胞质结构域的变体的表达。尽管缺乏全长胞质结构域，但具有截短的胞质结构域的人4-1BBL变体的表达水平是全长人4-1BBL表达水平的93％，而具有完整胞质结构域缺失的人4-1BBL变体的表达水平是全长人4-1BBL表达水平的42％。对于直系同源小鼠4-1BBL，具有截短的胞质结构域的变体的表达水平是全长小鼠4-1BBL表达水平的63％，而具有完整胞质结构域缺失的变体的表达水平是全长小鼠4-1BBL表达水平的13％。
对于每种截短的小鼠和人4-1BBL变体，检测了带有Myc标签的构建体，以确定在4-1BBL的截短的胞质部分添加额外的正电荷氨基酸残基是否会增加表达水平。然而，如下表所示，与具有截短的胞质结构域且没有Myc标签的变体相比，为具有截短的胞质结构域的变体添加Myc标签会降低表达。不确定为什么Myc标签会降低表达，但是添加Myc标签可能会导致4-1BBL表达的非最佳序列。
具有截短或缺失的胞质结构域的人4-1BBL变体的表达水平
Figure GDA0004138988600001763
Figure GDA0004138988600001771
具有截短或缺失的胞质结构域的鼠4-1BBL变体的表达水平
Figure GDA0004138988600001772
实施例20
与抗CTLA-4 scFv相比，抗CTLA-4 scFv-Fc示出显著阻断与CD80/CTLA-4和CD86/CTLA-4相互作用
使用易普利姆玛(ipilimumab)的氨基酸序列设计特异于人CTLA-4的scFv-Fc(核酸和蛋白质序列分别为SEQ ID NO:401和402)。易普利姆玛是一种完全人源IgG1κ单克隆抗体，其特异性结合人CTLA-4(见例如美国专利公开号2002/0086014和美国专利号6,984,720中称作10D1的抗体)，阻断CTLA-4与CD80(也称为B7.1或B7-1)和CD86(也称为B7.2或B7-2)的免疫抑制相互作用。
为了产生易普利姆玛scFv抗体片段(见SEQ ID NO:403)，将易普利姆玛(ipilimumab)的可变轻链(VL)和可变重链(VH)与长度为20个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸(GS)接头((GGGGS)4)连接。为了产生scFv-Fc抗体片段(见SEQ ID NO:402)，将易普利姆玛scFv的可变重链与人IgG1 Fc连接，含有铰链区中的游离半胱氨酸突变为丝氨酸(在SEQ ID NO:402中的第272位)。前导序列(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；对应于SEQ ID NO:402中的残基1-20)来源于人免疫球蛋白κ可变3-20(IGKV3-20)蛋白的序列。使用GenScrip GenSmartTM密码子优化工具对序列进行密码子优化。
使用竞争性ELISA比较CTLA-4 scFv-Fc与抗CTLA-4 scFv(缺乏人IgG1 Fc部分)的中和能力，以测量每个抗体片段阻断CTLA-4与其配体CD80和CD86之间相互作用的能力。将HEK293T细胞用3μg编码抗CTLA-4scFv-Fc或抗CTLA-4 scFv抗体片段构建体的DNA转染，使用
Figure GDA0004138988600001773
转染试剂(Promega)，以适当的试剂:DNA比率进行。转染后48小时，收获无HEK293T细胞培养上清液、过滤，并用于竞争性ELISA以评估抗CTLA-4抗体片段的阻断活性。
对于竞争性ELISA，将小鼠CD80或CD86重组蛋白(R&D Systems)在4℃以100ng/ml的浓度在高蛋白质结合96孔板上包被过夜。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤一次，并在室温下用ELISA封闭缓冲液封闭孔1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤一次。将含有每种抗CTLA-4抗体片段的HEK293T细胞培养上清液与10ng/ml重组鼠CTLA-4-人IgG1Fc嵌合体(R&D Systems)混合，并加入孔中及在室温下温育2小时。然后将孔用PBS 0.05％Tween-20洗涤3次，向孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG1抗体(JacksonImmunoResearch)，并在室温下温育1小时。然后将孔用PBS 0.05％Tween-20洗涤3次，并向孔中加入检测试剂(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，Thermo Fisher Scientific)。用硫酸(BioLegend)终止酶促反应，并在450nm读取光密度。
竞争性ELISA的结果总结在下表中。抗CTLA-4 scFv-Fc阻断CTLA-4与CD86的结合为75.5％，阻断CTLA-4与CD80的结合为40.6％，而抗CTLA-4 scFv阻断CTLA-4与CD86的结合为32.5％，并阻止CTLA-4与CD80的结合为7％。这两种抗体片段均观察到更高程度的CD86/CTLA-4阻断活性(与CD80/CTLA-4阻断活性相比)，并且与抗CTLA-4 scFv-Fc相比，使用抗CTLA-4 scFv观察到优异的中和活性。
竞争性ELISA结果
抗CTLA-4抗体片段 ％CD86阻断活性 ％CD80阻断活性
抗-CTLA-4 scFv 32.5 7.0
抗-CTLA-4 scFv-Fc 75.5 40.6
包括在本文提供的免疫刺激细菌中的是在质粒上编码抗CTLA-4抗体及其片段的那些，包括抗CTLA-4 scFv抗体片段和抗CTLA-4 scFv-Fc抗体片段，如本文所提供的，以及与编码其它治疗产物的核酸分子的组合。
实施例21
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD在体内被限制在吞噬性骨髓免疫细胞区室
如上所述，菌株YS1646Δasd/ΔFLG是非吞噬细胞摄取缺陷的(见实施例4)。为了证实菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD也是非吞噬细胞摄取缺陷的，将在细菌rpsM启动子下组成型表达mCherry(一种红色荧光蛋白)的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株经静脉内施用于EMT6原位荷瘤小鼠。
对于这个实验，6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(每组4只小鼠)接受原位植入EMT6细胞(100μL PBS中的2×105个细胞)。在第10天，给带有已建立的较大侧腹肿瘤的小鼠静脉注射用3×106CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mCherry菌株。在静脉内给药后8天切除肿瘤，并将其切成2-3mm的碎片，放入装有2.5mL酶混合物(RPMI-1640，含有10％FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL DNaseI)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离肿瘤碎片，然后在37℃下搅拌温育全细胞制备物45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入肿瘤)程序进行第二轮解离，将所得单细胞悬液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用含有10％FBS的5mL RPMI-1640洗涤一次，然后使用新的70μM尼龙网将细胞第二次过滤到新的50mL试管中。将尼龙网用含有10％FBS的5mL RPMI-1640洗涤，然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将得到的解离细胞重新悬浮在PBS中，并在染色过程前保持在冰上。
对于流式细胞术染色，将100μL单细胞悬液接种在V形底96孔板的孔中。以每孔100μL加入含有死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc阻断剂(BD Biosciences)的PBS，并将平板在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于含有荧光染料缀合抗体(CD4 FITC克隆RM4-5；CD8a BV421克隆53-6.7；F4/80APC克隆BM8；CD11b PE-Cy7克隆M1/70；CD45 BV570克隆30-F11；CD3 PE克隆145-2C11；Ly6C BV785克隆HK1.4；I-A/I-E APC-Cy7克隆M5/114.15.2；Ly6G BV605克隆1A8；和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69；均来自BioLegend)的PBS+2％ FBS中，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次，并重新悬浮在流式细胞仪固定缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中。使用
Figure GDA0004138988600001791
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
结果(见下表)表明，在静脉注射YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mCherry菌株的小鼠肿瘤中，在肿瘤微环境中1.95％的肿瘤浸润单核细胞和3.36％的肿瘤相关中性粒细胞(TAN)对mCherry表达呈阳性，而来自酵母注射PBS的小鼠肿瘤显示肿瘤浸润单核细胞为0.64％的背景染色/荧光，TAN为0.01％。2.92％的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)群和4.34％的肿瘤浸润树突状细胞(DC)摄取YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mCherry菌株，而注射PBS的小鼠肿瘤中的背景荧光对于TAM和DC分别为0.70％和0.50％。2.39％的M1 TAM和0.53％的M2 TAM对YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mCherry染色呈阳性，而来自注射PBS的小鼠肿瘤在M1 TAM中的背景信号为0.20％，在M2TAM中为0.50％。相比之下，在CD45-群体中，对应于基质细胞和肿瘤细胞(即不是肿瘤驻留免疫/骨髓细胞的细胞)，只有0.081％示出mCherry表达呈阳性(与来自PBS注射小鼠的0.002％背景染色相比)。
在静脉注射YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mCherry菌株的小鼠肿瘤中mCherry表达百分比％
Figure GDA0004138988600001792
SD＝标准差；DC＝树突状细胞；TAM＝肿瘤相关巨噬细胞；TAN＝肿瘤相关中性粒细胞
酵母注射PBS的小鼠肿瘤中mCherry表达百分比％
Figure GDA0004138988600001793
/>
SD＝标准差；DC＝树突状细胞；TAM＝肿瘤相关巨噬细胞；TAN＝肿瘤相关中性粒细胞
这些数据表明，从鞭毛消除菌株中缺失pagP、ansB和csgD不会显著影响肿瘤微环境(即肿瘤驻留免疫/骨髓细胞)的吞噬免疫细胞区室对细菌摄取的特异性。如上文和本文其它部分所讨论的，鞭毛及其下游信号传导对SPI-1的影响是上皮细胞感染性所必需的，并且缺乏鞭毛使细菌仅限于被肿瘤驻留免疫/骨髓细胞摄取。消除鞭毛为免疫刺激细菌包括鼠伤寒沙门氏菌菌株带来了许多益处。这些益处包括消除TLR5诱导的抑制适应性免疫的炎性细胞因子，减少巨噬细胞焦亡，以及在全身施用时维持(或增强)肿瘤特异性富集，其中摄取仅限于肿瘤驻留吞噬细胞。
本文显示，从鞭毛消除菌株中消除pagP、ansB和csgD不会显著影响肿瘤驻留免疫细胞摄取细菌的特异性，并带来额外的益处，包括例如减少TLR4诱导的促炎细胞因子，降低免疫原性和增强耐受性(ΔpagP)；恢复T细胞功能(ΔansB)；并改善细菌的细胞内摄取，从而增强体内编码的免疫调节蛋白的质粒递送并提高治疗效果(ΔcsgD)。
实施例22
沙门氏菌purI和msbB清洁缺失基因敲除菌株工程化和鉴定
菌株YS1646(VNP20009)中的purI基因未被缺失；其被转座子(Tn10)插入破坏，导致16.6kbp(千碱基对)基因组倒位事件，从而随后两个插入序列(IS)元件被掺入基因组中，一个位于purI(purM)基因内，另一个位于acrD基因3’端直接侧翼的基因间区域上游16.6kbp。两个IS元件之间的区域是倒置的，含有18个基因，包括yffB、DC51_2568、upp、uraA、yfgE、yfgD、DC51_2573、perM、purC等。基因间区域中的插入序列元件编码全功能转座酶，并代表潜在的遗传稳定性问题(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。purI基因的完整基因序列的存在，通过染色体重排而被破坏，留下了恢复为野生型基因的可能性。
菌株YS1646中的msbB基因也没有完全缺失，但被基因工程化的511bp缺失(972bp基因)破坏，导致pykA基因(编码丙酮酸激酶)的延伸，用13个新密码子置换了最后5个氨基酸密码子(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。
为了消除任何可能的purI和msbB基因回复到其各自的野生型基因，并为了确定这些基因清洁缺失的影响，将菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD进一步修改以缺失剩余的purI和msbB基因序列片段，以及两个转座子相关的插入序列元件，以及一个pykA基因延伸。
缺失purI基因片段和转座子相关的插入序列元件
第一个区域，位于yffB和purN基因之间，含有：1)1,209bp转座子插入序列元件，在得自Broadway et.al(2014)的序列中注释为DC51_2586(见GenBank登录号CP007804和CP008745)；和2)剩余的891bp purI基因片段的740bp(本文称为大purI基因片段)，将第一个区域靶向缺失，使用经修改的Datsenko和Wanner的方法(见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))。将891bp(大)purI基因片段的一小部分151bp保持完整，以避免影响相邻的下游基因purN(编码磷酸核糖基甘氨酰胺甲酰基转移酶)。将含有分别与DC51_2586插入序列元件和大purI基因片段的左侧和右侧区域同源的284和262bp的质粒pSL0165转化到DH5-α感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)中。将两侧有loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到该质粒中，所得载体被命名为pSL0174。然后将DC51_2586插入序列元件和大purI基因片段敲除盒使用引物purm-1和purm-2(分别为SEQID NO:410和411；见表2)进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红色重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD中。然后如上所述通过cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长处理温度敏感质粒。DC51_2586插入序列元件和大purI基因片段敲除序列使用引物purm-3和purm-4(分别为SEQID NO:412和413；见表2)通过PCR确认，并通过DNA测序验证。将所得亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的突变衍生物命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(large clean)。
第二个区域，位于acrD和DC51_2568基因之间，含有：1)1,209bp转座子插入序列元件，在得自Broadway et.al(2014)的序列中注释为DC51_2566(见，GenBank登录号CP007804和CP008745)；以及剩余的231bp purI基因片段(在本文中称为小purI基因片段)，将第二个区域使用修改的Datsenko和Wanner方法靶向缺失(见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))。将含有分别与DC51_2566插入序列元件和小purI基因片段的左侧和右侧区域同源的241和265bp的质粒pSL0210转化到DH5-α感受态细胞(Thermo FisherScientific)中。将两侧有loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到该质粒中，所得载体被命名为pSL0212。然后将DC51_2566插入序列元件和小purI基因片段敲除盒使用引物acrd-1和purm-5(分别为SEQ ID NO:416和414；参见表2)进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(large clean)中。然后如上所述通过cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长来处理温度敏感质粒。将DC51_2566插入序列元件和小purI基因片段敲除序列使用引物purm-6和acrd-3(分别为SEQ ID NO:415和417；参见表2)通过PCR确认，并通过DNA测序验证。将所得亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(large clean)的突变衍生物命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)。
msbB基因片段的缺失和pykA延伸
将菌株YS1646中的msbB基因通过基因工程化的511bp缺失(972bp基因)破坏，导致pykA基因的延伸，用13个新密码子置换最后5个氨基酸密码子(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。将含有剩余的msbB基因片段和编码pykA中最后13个氨基酸密码子的序列的区域靶向缺失，使用经修改的Datsenko和Wanner方法(见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))进行。将含有分别与剩余msbB基因片段和pykA基因延伸的左侧和右侧区域同源的200和196bp的质粒SL0209(见SEQ ID NO:408)转化进DH5-α感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)。将侧翼是loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到该质粒中，所得载体被命名为pSL0211(见SEQ ID NO:409)。然后使用引物msbB-1和msbB-2(分别为SEQ ID NO:418和419；见表2)对msbB基因片段和pykA基因延伸敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)中。然后如上所述通过cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长来处理温度敏感质粒。msbB基因片段和pykA基因延伸敲除序列使用引物msbB-3和msbB-4(分别为SEQ ID NO:420和421；见表2)通过PCR确认，并通过DNA测序验证。所得亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)的突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)。
表2：引物序列信息
Figure GDA0004138988600001821
Fwd＝正向；Rev＝反向；KO＝敲除
质粒信息
Figure GDA0004138988600001822
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)菌株在肉汤培养基中表现出增强的生长
为了评估来自细菌基因组的剩余purI和msbB基因片段、转座子相关插入序列元件和pykA基因延伸的缺失对免疫刺激细菌体外适应性的影响，将菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)和表达在CMV启动子控制下编码
Figure GDA0004138988600001823
的相同质粒(称作ADN-256的质粒)的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的肉汤生长概况通过肉汤生长测定直接比较。通过在LB培养基中稀释，将过夜固定相培养物调整为OD600nm＝1，并使用5μl所得标准化培养物在96孔板中接种250μl LB培养基，一式两份。将平板在37℃下振荡温育，并在16小时程中以15分钟间隔监测OD600nm值。绘制OD600nm值以构建生长曲线，计算对数生长期的斜率并用于确定每个菌株的倍增时间。执行了四个独立的生长曲线，结果如下表所示，表明菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-256)的平均倍增时间为67.74分钟(标准偏差(SD)＝3.21)，而菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(ADN-256)的平均倍增时间为60.13分钟(SD＝3.08)。
purI和msbB的完全缺失对肉汤培养基中免疫刺激细菌生长的影响
Figure GDA0004138988600001831
SD＝标准差
在具有富集培养基(4XYT)的大型高度充气摇瓶条件下，评估菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和含有相同质粒(ADN-480，编码鼠4-1BBLΔcyt、鼠IL-12p70和修饰的人STING嵌合蛋白)的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)菌株的肉汤生长情况。将50μl具有相同OD600nm光密度(OD)的过夜固定相培养物用于接种125ml带通风盖的带挡板摇瓶中的12.5ml的4XYT培养基，并在37℃下以225RPM摇动温育培养物。在18小时程中，以大约1小时的间隔监测OD600nm。绘制OD600nm值以构建生长曲线，计算对数生长期的斜率并用于确定每个菌株的倍增时间。
结果表明，倍增时间为41.83分钟的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(ADN-480)比倍增时间为48.33分钟菌株YS1646Δasd/ΔFLG/Δpag P/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-480)生长稍快并更快达到固定相。这个数据表明，与亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/Δcsg D/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)的生长情况增强。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)在两个独立的生长曲线测定(96孔板中的LB培养基和250ml振荡瓶中的富集4XYT培养基)中以更快的倍增时间生长，表明purI和msbB的基因组缺失不仅缓解了潜在的遗传稳定性问题，而且还赋予了代谢益处，从而允许更快的生长和更好的适应性。
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)显示增强的注射原液细胞活率
为了评估细菌基因组中剩余purI和msbB基因片段、转座子相关插入序列元件和pykA基因延伸的缺失对免疫刺激细菌体外适应性的影响，通过直接比较在培养处理冷冻的注射原液后存活的CFUs，评估了菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)和含有相同质粒(ADN-542，编码修饰的人STING嵌合蛋白)的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的细胞存活率。将100μl具有相同OD600nm值的过夜固定相培养物接种到250ml带通气盖的带挡板摇瓶中的25ml的4XYT培养基中，并在37°C下以225RPM摇动温育约6小时。在稳定期以等效OD600nm值收获培养物(菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-542)为11.4，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(ADN-542)为11.7)，洗涤两次，调整至OD600nm＝2，等分并在-80℃冷冻。第二天，将每个菌株的两个等分试样解冻，测量OD600nm值，并将培养物铺板在琼脂板上以确定滴度和存活率。通过计算OD600nm与CFUs/ml的比率来确定存活率％。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-542)注射原液制备物的存活率为52％，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(AD N-542)的注射原液制备物的存活率为96％。
这个数据表明，与亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)的适应度增强。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)在冷冻注射液制备后显示出增强的存活力，表明purI和msbB的基因组缺失不仅减少了潜在的遗传稳定性问题，而且还赋予代谢益处，从而提高细胞存活率。
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)在肿瘤微环境中显示增强的质粒有效载荷递送和异位基因表达
为了评估质粒在肿瘤微环境中的递送和随后的异位基因表达，在体内原位EMT6乳腺癌模型中评估菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和含有编码鼠IL-12(muIL-12p70)(以及鼠4-1BBLΔCyt，和修饰的人STING嵌合蛋白)的相同质粒(ADN-480)的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)。BALB/c小鼠接受原位植入5×105个EMT6细胞，然后在植入后10天静脉注射1×107CFU的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-480)或菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(ADN-480)，或PBS。注射后第4天，处死小鼠，收获并处理肿瘤，用于通过逆转录定量实时PCR(RT-qPCR)分析鼠IL-12p70表达。
在静脉内给药后4天切除肿瘤，并切成2-3mm的碎片并放入装有2.5mL酶混合物(RPMI-1640，含有10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL Dnase I)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离肿瘤碎片，然后在37℃下搅拌温育全细胞制备物45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入肿瘤)程序进行第二轮解离，将所得单细胞悬液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL含有10％ FBS的RPMI-1640洗涤一次，然后使用新的70μM尼龙网将细胞第二次过滤到新的50mL试管中。将尼龙网用5mL含有10％ FBS的RPMI-1640洗涤，然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将得到的解离细胞重新悬浮在PBS中，然后用200μL RNA裂解缓冲液(Zymo Research)裂解，并根据制造商的方案使用Zymo Research Quick-RNATM96试剂盒进行RNA提取。使用NanoDropTM2000 UV-Vis分光光度计(Thermo FisherScientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也通过A260/A230吸光度比进行评估。
使用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)和iScriptTM Reverse TranscriptionSupermix for RT-qPCR(Bio-Rad)根据制造商的说明在20μL反应中从0.5-1μg模板RNA合成cDNA。用于鼠IL-12p70(muIL-12p70)的PrimePCRTM Probe Assay购自Bio-Rad。qPCR反应(20μL)使用iQTM Multiplex Powermix(Bio-Rad)按照方案进行。Bio-RadCFX96TM实时PCR检测系统上的标准热循环程序包括95℃变性150秒，然后是95℃进行15秒和60℃进行55秒的39个循环。所有样品一式三份运行，并计算平均Cq值。使用肌动蛋白参考mRNA(Bio-Rad，assayID：qHsaCEP0036280)对靶mRNA的定量进行标准化。ΔCq计算为靶基因和参考基因之间的差异。ΔΔCq是通过对YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-480)和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(ADN-480)处理组的ΔCq值相对于PBS处理对照组的平均ΔCq值进行标准化，小鼠IL-2p70表达相对于PBS组的增加倍数计算为2^-ΔΔCq。基于平均ΔCq值，将PBS处理的肿瘤中的鼠IL-12p70表达标准化为1.0的值。
如下表所示，静脉内注射菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-480)导致muIL-12p70表达相对于PBS平均增加倍数为(2^-ΔΔCq)5.19，而静脉内注射菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)-(ADN-480)导致muIL-12p70表达相对于PBS平均增加倍数为(2^-ΔΔCq)6.52。
这些数据表明，与亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)的质粒递送和诱导异位基因表达的能力增强。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(clean)/ΔmsbB(clean)在肿瘤微环境中显示出增加的质粒递送和异位muIL-12p70基因表达，表明purI和msbB的基因组缺失不仅降低了潜在的遗传稳定性问题，也赋予了有效载荷传递能力的增强和治疗效果的增加潜力。
purI和msbB完全缺失对肿瘤中基因表达的影响
Figure GDA0004138988600001851
SD＝标准差
实施例23
用免疫刺激细菌和用编码免疫调节蛋白的质粒转化的免疫刺激细菌感染将人M2表型巨噬细胞转化为M1表型巨噬细胞
本文确定了用含有编码野生型(WT)asd的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株或用含有编码免疫刺激蛋白(如STING变体、IL-12、IL-15和IL-21)的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株感染的原代人M2巨噬细胞是否可转化为M1表型(或M1样表型)，并表达促炎表面受体，如CD80和CCR7，以及细胞因子/趋化因子，例如IFNγ和CXCL10(见例如Gerrick et al.(2018)PLoS ONE 13(12):e0208602)。
从健康人供体中分离的冷冻人单核细胞在完全培养基(RPMI-1640+10％ FBS)中解冻，并通过在室温下以600xg离心10分钟来洗涤。为了产生原代人M2巨噬细胞，将单核细胞重悬于含有100ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)+10ng/mL人IL-4+10ng/mL人IL-10的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCell Technologies)中。然后将单核细胞(7e5/孔)种植在24孔平板中，最终体积为500μL。三天后(第3天)，每孔加入含有200ng/mL人M-CSF+20ng/mL人IL-4+20ng/mL人IL-10的500μL ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基，将细胞温育72小时。
第6天，在RPMI中以20的MOI一式三份感染孔，持续一小时，使用以下菌株：YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD，含有编码具有GOF突变N154S/R284G的人(hu)STING变体的质粒，以及huSTING的C-末端尾部(CTT)置换为袋獾STING的CTT(huSTING N154S/R284G tazCTT；SEQ ID NO:397)；YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD，含有编码野生型(WT)huIL-12的质粒和huSTING N154S/R284G tazCTT变体；YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD，含有编码WT huIL-15的质粒；或YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD，含有编码WT huIL-21的质粒。然后将细胞用PBS洗涤3次，并重新悬浮在RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中，以杀死任何细胞外细菌(庆大霉素不能渗透到巨噬细胞中)。作为对照，包括：在10ng/mL LPS+50ng/mL IFNγ中产生的人M1巨噬细胞；用STING激动剂3’5’RpRpc-di-AMP(InvivoGen)(临床化合物ADU-S100的类似物)处理的人M2巨噬细胞；在10ng/mL LPS+50ng/mL IFNγ中重新极化的人M2巨噬细胞；以及用不含质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD感染的M2巨噬细胞。
48小时后，收集上清液并根据制造商的说明使用定制的人M2/M1 U-PLEX面板(Meso Scale Discovery)评估下游信号传导的差异。测量细胞因子分泌，并计算一式三份测量的平均值。与未处理的M2巨噬细胞相比，计算了平均细胞因子分泌的增加倍数，其中平均细胞因子分泌设置为1.00。
为了测量促炎表面受体CD80和CCR7的表达水平，将细胞用200μL RNA裂解缓冲液(ZymoResearch)裂解，并使用Zymo Research Quick-RNATM96试剂盒根据制造商的说明进行RNA提取。使用NanoDropTM 2000 UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也通过A260/A230吸收比进行评估。使用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)和iScriptTM Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR(Bio-Rad)根据制造商的说明在20μL反应中从0.5-1μg模板RNA合成cDNA。qPCR使用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行。用于人CD80(Assay ID：qHsaCIP0026764)和人CCR7(Assay ID：qHsaCIP0033364)的PrimePCRTM Probe Assay购自Bio-Rad。qPCR反应(20μL)使用iQTMMultiplex Powermix(Bio-Rad)按照方案进行。Bio-RadCFX96TM实时PCR检测系统上的标准热循环程序包括95℃变性150秒，然后是95℃进行15秒和60℃进行55秒的39个循环。所有样品一式三份运行，并计算平均Cq值。使用肌动蛋白参考mRNA(Bio-Rad,AssayID:qHsaCEP0036280)对靶mRNA的定量进行标准化。ΔCq计算为靶基因和参考基因之间的差异。通过将处理的ΔCq值标准化为未处理对照的ΔCq值来获得ΔΔCq。增加倍数计算为2^-ΔΔCq。这些值显示在下表中，作为一式三份孔的平均值。
如下表所示，与未处理的M2巨噬细胞对照(其中平均细胞因子分泌设为1.00)相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的所有菌株均诱导高水平分泌IFNγ、CXCL10和CXCL11。用编码huSTING N154S/R284G tazCTT变体、或WT huIL-12和huSTINGN154S/R284G tazCTT变体、或WT huIL-15的质粒转化的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，比不含质粒的YS1646ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株诱导更高水平的CXCL10和CXCL11分泌。特别是，与STING激动剂处理的M2巨噬细胞和未处理的M1巨噬细胞相比，含有编码WT huIL-15的质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD诱导显著更高水平的CXCL10和CXCL11。此外，与不含质粒的菌株YS1646ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比，含有编码huSTING N154S/R284G tazCTT变体、或WT huIL-12和huSTINGN154S/R284GtazCTT变体、或WT huIL-15的质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD，诱导更高水平的CD80和CCR7表达。与不含质粒的菌株YS1646ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比，含有编码huSTING N154S/R284G tazCTT变体、或WT huIL-12和huSTING N154S/R284G tazCTT变体、或WT huIL-15的质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD诱导更高水平的CXCL10、CXCL11、CD80和CCR7，但其诱导较低水平的IFNγ。与其它YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株相比，含有编码WT huIL-21的质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD显著较高水平的CD80表达，但诱导较低水平的IFNγ、CXCL10、CXCL11和CCR7表达。
这些数据证明了菌株例如单独命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的菌株，或含有编码一种或多种免疫刺激蛋白的质粒的这种菌株将人原发的免疫抑制M2表型巨噬细胞转变为M1或M1样表型巨噬细胞的能力，其免疫抑制性质降低或消除，以及免疫刺激、抗肿瘤或抗病毒性质增强或增加。
IFNγ、CXCL10、CXCL11、CD80和CCR7在免疫刺激细菌感染的M2巨噬细胞中的表达
Figure GDA0004138988600001871
STING激动剂＝3’5’RpRp c-di-AMP；LPS＝脂多糖；STING变体＝huSTING N154S/R284G tazCTT
实施例24
经静脉内递送含有编码IL-15或编码4-1BBL和IL-12组合的质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD在小鼠结肠直肠癌模型中显示出增强的功效并诱导持久的抗肿瘤免疫
含有编码鼠IL-15(muIL-15Rα-IL-15sc)或鼠IL-12p70(muIL-12p70)或含有胞质结构域缺失的鼠4-1BBL(mu4-1BBL(Δcyt))或muIL-12p70和mu4-1BBL(Δcyt)的组合的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的抗肿瘤功效，在皮下侧腹部MC38结直肠腺癌模型中进行评估。在这项研究中，将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组8只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第7天为带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠经静脉内注射2×107CFU的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL-15sc 或 菌 株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-12p70 或 菌 株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mu4-1BBL(Δcyt) 或 菌 株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-12p70+4-1BBL(Δcyt)，或注射PBS载体作为对照。每周两次记录肿瘤测量值和体重。
结果表明，与PBS相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL-15sc表现出显著的肿瘤生长抑制(TGI)(70.9％ TGI，第24天)，治愈率为在8只小鼠中4只小鼠治愈(50％)。与PBS相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-12p70表现出显著的TGI(81.1％TGI，第24天)，治愈率为在8只小鼠中2只小鼠治愈(25％)。与PBS相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mu4-1BBL(ΔCyt)也表现出高度的TGI(81.0％TGI，第24天)，治愈率也为在8只小鼠中有2只治愈(25％)。表达muIL-12p70和mu4-1BBL(Δcyt)组合的菌株表现出最高的TGI(90.6％ TGI，第24天)，8只小鼠中有4只实现完全治愈(50％治愈率)。因此，表达muIL-15Rα-IL-15sc或4-1BBL(Δcyt)和IL-12p70的组合的免疫刺激菌株比只表达4-1BBL(Δcyt)或IL-12p70的菌株在结直肠癌模型中更有效地抑制肿瘤生长，并获得高完全反应率(50％治愈率)。
所有治愈的小鼠继续保持无肿瘤状态，在肿瘤植入后第66天，小鼠在另一侧用MC38细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)再挑战小鼠，并与天然小鼠(之前没有肿瘤植入)、年龄匹配的小鼠进行比较。与在肿瘤植入后第26天达到平均肿瘤大小1384.7mm3的天然小鼠相比，每只先前治愈(和再次挑战)的小鼠均保持无肿瘤。这些数据表明用任何菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL-15sc、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-12p70 、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-mu4-1BBL(Δcyt) 或YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-12p70+mu4-1BBL(Δcyt)处理的小鼠产生持久的抗肿瘤免疫的能力，防止肿瘤复发并以防肿瘤再攻击。
实施例25
与菌株YS1646相比，缺失和/或破坏csgD、lppAB、pagP和FLG及其组合，导致菌株在人血清中具有显著较高的存活力
菌株YS1646在全身施用后在人体中表现出有限的肿瘤定植。本文显示菌株YS1646被人血液的补体因子失活(见实施例5)。在这个实施例中，将菌株YS1646和大肠杆菌D10B与本文提供的含有改变细菌表面的其它突变的示例免疫刺激细菌进行比较。这些示例的修饰的菌株是YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB，每个菌株都含有在CMV启动子的控制下编码分泌的
Figure GDA0004138988600001881
的质粒ADN-256。除了YS1646和大肠杆菌D10B培养物外，将这三种菌株在37℃下与来自健康人供体(n＝3)的血清或热灭活(HI)血清一式三份温育3小时。在与血清一起温育后，将细菌连续稀释并铺板在LB琼脂平板上，并测定菌落形成单位(CFU)。通过计算存在于全血清中的CFU与存在于热灭活血清中的CFU来确定存活百分比。
结果表明，所有菌株在热灭活的人血清中均100％存活。3小时后，在全人血清中的大肠杆菌D10B菌株被完全消除，而YS1646菌株的平均存活率仅为12.22％，这表明YS1646临床菌株的肿瘤定植由于人血中的补体失活而受到限制。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP在与人血清温育3小时后显示平均74.56％的存活率，而菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和S1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB显示平均存活率分别为129.56％和158.33％。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB示出的存活率大于100％，表明其对人血清中的补体失活具有完全抗性。
这些数据解释了为什么菌株YS1646(VNP20009)在全身施用时具有非常低的肿瘤定植。本文显示菌株YS1646对人血清中的补体失活高度敏感。fljB/fliC(FLG)、pagP、csgD和lppAB缺失/破坏或这些突变的组合，部分或完全挽救了这种表型。因此，用菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB在人血清中观察到的增强的稳定性提供了增加的人肿瘤定植。
实施例26
在质粒上编码的治疗产物的组合，包括细胞因子、STING变体、抗CTLA-4抗体、4-1BBL和抗4-1BBL激动性抗体，可强力诱导骨髓细胞分泌CXCL10并诱导T-细胞活化
确定了在免疫刺激细菌中的质粒上编码的免疫调节有效载荷及其组合的表达对T细胞和骨髓细胞的活化和功能的影响。测量骨髓细胞和T细胞应答各种免疫调节有效载荷的表达而分泌的细胞因子和趋化因子，如IFN-γ和CXCL10，作为保护性抗肿瘤免疫的指标。还同时监测促肿瘤炎性细胞因子IL-6的分泌。
这个实施例描述并证明了本文的免疫刺激细菌递送各种免疫调节有效载荷组合对抗原特异性T细胞的活化和对CXCL10的分泌的影响，CXCL10是参与骨髓细胞募集抗肿瘤T细胞的关键趋化因子。这是通过用编码各种有效载荷组合的质粒转染小鼠树突状细胞，将转染的树突状细胞与自体小鼠T细胞共培养，以及鉴定和量化每种细胞类型分泌的细胞因子来评估的。
编码免疫调节有效载荷/蛋白质的质粒包括编码单个有效载荷的那些质粒，以及编码有效载荷组合的那些质粒。例如，如下表所示，单个有效载荷包括分泌的
Figure GDA0004138988600001891
小鼠IL-12p70(muIL-12p70)；STING R284G tazCTT(含有具有R284G突变和人STING的C末端尾部(CTT)置换为袋獾STING的CTT的人STING的嵌合蛋白)；鼠抗CTLA-4scFv(克隆9D9)；具有缺失的胞质结构域的鼠4-1BBL(mu4-1BBL(Δcyt))；鼠IL-18(muIL-18)；和鼠IL-21(muIL-21)。
使用T2A和/或P2A肽在单个质粒上表达有效载荷的组合，包括两种或三种有效载荷，以便在同一启动子的控制下编码多种蛋白质。有效载荷的组合包括例如：1)鼠IL-18和鼠IL-12p70；2)鼠IL-21和鼠IL-12p70；3)鼠IL-12p70和STING R284G tazCTT；4)鼠IL-12，抗鼠CTLA-4 scFv，和STING R284G tazCTT；5)抗鼠CTLA-4 scFv，鼠IL-12p70，和STINGR284G tazCTT；6)抗鼠CTLA-4 scFv和鼠IL-12p70；7)抗鼠CTLA-4 scFv，和STING R284GtazCTT；8)鼠IL-21，鼠IL-12p70，和STING R284G tazCTT；9)鼠4-1BBL(Δcyt)和STINGR284G tazCTT；10)鼠4-1BBL(ΔCyt)和鼠IL-12p70；及11)鼠4-1BBL(ΔCyt)，鼠IL-12p70，和STING R284G tazCTT。
骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)由STING缺陷的Goldenticket小鼠产生，将其用编码所研究有效载荷的各种组合的质粒转染。转染后24小时，收集上清液并根据制造商的方案使用Meso Scale Discovery的U-Plex测定平台测量BMDC培养上清液中分泌的CXCL10水平。
为了测量CD8+ T细胞活化，将转染的BMDC用鸡卵清蛋白(OVA)SIINFEKL(OVA257-264)肽进行脉冲处理，这是由CD8+T细胞识别的一种主要组织相容性复合物(MHC)I类(H-2Kb)限制性肽表位。分离自Rag1-/-OT-I小鼠的脾T细胞，其表达特异于由MHC I类分子H-2Kb呈递的SIINFEKL的T细胞受体(TCR)，将其加入到BMDC中用于共培养。在BMDC/T细胞共培养72小时后，收集上清液，并使用细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒测量细胞培养上清液中分泌的IFN-γ水平。
结果总结在下表中，该表显示了BMDC应答用编码各种单一和组合有效载荷的质粒转染而分泌的CXCL10水平，以及在与转染的BMDC共培养后CD8+ T细胞分泌的IFN-γ水平。
结果示出了编码的有效载荷的特定组合，这些组合诱导BMDC高水平分泌CXCL10，并示出在组合有效载荷时观察到协同作用。例如，在muIL-12p70和STING R284G tazCTT表达之间观察到协同作用。mu4-1BBL(Δcyt)或抗鼠CTLA-4抗体片段与STING R284G tazCTT表达的组合也导致BMDC分泌较高水平的CXCL10。结果还示出，muIL-12p70以及几种有效载荷的组合诱导应答BMDC的CD8+T细胞活化以及IFN-γ的分泌，所述有效载荷的组合例如是muIL-18和muIL-12p70；muIL-21和muIL-12p70；muIL-12p70和STING R284G tazCTT；muIL-12p70，抗鼠CTLA-4 scFV和STING R284GtazCTT；抗鼠CTLA-4 scFV和muIL-12p70；以及mu4-1BBL(Δcyt)和muIL-12p70。
单一和组合有效载荷的递送对BMDC分泌CXCL10和对CD8+T细胞活化的影响
Figure GDA0004138988600001901
/>
Figure GDA0004138988600001911
SEM＝均值标准误差
当将上面列出的有效载荷与鼠(mu)IL-36γ、muIL-23、muOX40L和muIFN-α2中的一种或多种组合时，研究了相同的生物学反应。将BMDC从STING缺陷的Goldenticket小鼠中分离，并用编码各种有效载荷组合的质粒转染，如下表所示。转染后24小时，使用细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒测量BMDC培养上清液中分泌的CXCL10、IFN-γ和IL-6的水平。如上所述，在加入来自Rag1-/-OT-I小鼠的脾T细胞(OT-I细胞)之前，用卵清蛋白SIINFEKL抗原肽对BMDC进行脉冲处理。在BMDC/T细胞共培养30小时后，使用CBA试剂盒测量细胞培养上清液中分泌的IFN-γ水平。用APC缀合的抗鼠4-1BB抗体(克隆17B5，BioLegend)对T细胞进行染色，以监测活化标记物4-1BB的表达。
下表总结的结果表明，特定的有效载荷组合，例如muIL-36γ+muIL-12p70+STINGR284G TazCTT和muIL-36γ+muIL-23+STING R284G TazCTT，诱导BMDC分泌高水平的CXCL10。muIL-36γ与muIL-12p70和STING R284G tazCTT的组合也诱导BMDC分泌高水平的IFN-γ，但分泌相对较低水平的IL-6，代表了一种治疗上有用的组合，可诱导抗肿瘤免疫。
结果还表明，下表中列出的许多组合诱导CD8+ T细胞应答的激活，如通过4-1BB表达评估，以及诱导IFN-γ分泌。例如，muIL-36γ+muIL-12p70+STING R284G TazCTT的组合诱导CD8+T细胞分泌最高水平的IFN-γ，并诱导高水平的4-1BB表达，表明CD8+T细胞有效激活和功能性，这对于产生适当的抗肿瘤免疫至关重要。
用编码免疫调节有效载荷组合的质粒转染BMDC后，BMDC的细胞因子分泌和CD8+ T细胞活化
Figure GDA0004138988600001912
/>
Figure GDA0004138988600001921
SEM＝均值标准误差
还通过用重组细胞因子和激动性抗体处理鼠合并的CD4+和CD8+ T细胞来研究各种有效载荷组合和受体-配体相互作用对T细胞功能的影响。负分离来自BALB/c小鼠的脾T细胞(CD4+和CD8+)，然后用2.5nM的一种或多种重组细胞因子(例如，muIL-12p70；muIL-15复合物(muIL-15Rα-IL-15sc)；muIL-21；muIL-36γ；muIFN-α2；及其组合)和/或用1.5μg/ml的抗鼠4-1BB激动抗体(克隆17B5，BioLegend)处理。处理24小时后，使用CBA试剂盒测量T细胞培养上清液中分泌的IFN-γ和IL-6的水平。
下表显示的结果表明，在添加或不添加抗鼠4-1BB激动剂抗体的情况下，几种细胞因子组合可激活T细胞。例如，组合muIL-12p70+muIL-15复合物(muIL-15Rα-IL-15sc)；muIL-12p70+muIL-15复合物+muIFN-α2；muIL-12p70+muIL-15复合物+抗鼠4-1BB激动剂抗体；muIL-12p70+muIL-15复合物+muIL-36γ；muIL-12p70+muIL-15复合物+muIL-21；muIL-12p70+muIL-21+muIL-36γ；muIL-12p70+muIL-36γ+muIFN-α2；muIL-12p70+muIL-36γ+抗鼠4-1BB激动剂抗体；muIL-15复合物+muIL-36γ+muIFN-α2；和muIL-15复合物+muIL-36γ+抗鼠4-1BB激动剂抗体，导致T细胞分泌高水平的IFN-γ，但分泌相对较低水平的IL-6，使其成为最佳T细胞活化的理想组合，用于在肿瘤微环境中诱导抗肿瘤免疫。
用各种细胞因子和/或抗鼠4-1BB激动剂抗体和/或其组合治疗对T细胞活化的影响
Figure GDA0004138988600001922
/>
Figure GDA0004138988600001931
SEM＝标准平均误差；IL-15复合物＝muIL-15Rα-IL-15sc
评估了用一种或多种重组人细胞因子和/或抗人41BB抗体(克隆4B4-1，BioLegend)处理对人T细胞活化的影响。将人CD4+和CD8+T细胞从人外周血单核细胞(PBMC)中负分离，并用1nM重组细胞因子处理，有或没有T细胞受体(TCR)和4-1BB刺激，分别使用包被的激动剂抗人CD3ε(克隆OKT3，BioLegend)和抗人4-1BB(克隆4B4-1，BioLegend)抗体。处理24小时和72小时后，收获上清液，并使用CBA试剂盒测量细胞培养上清液中分泌的IFN-γ水平。T细胞也用藻红蛋白(PE)缀合的抗人CD25抗体(克隆BC96，BioLegend)染色，以监测活化标记CD25的表达。
下两个表总结的结果表明，细胞因子(IL-12p70、IL-15、IL-21和IL-36γ)和4-1BB衔接器的几种组合激活T细胞分泌高水平IFN-γ，对于CD4+和CD8+T细胞，有和没有抗CD3ε激动抗体的TCR刺激。在应答用人细胞因子和/或抗人4-1BB激动性抗体的各种组合处理，特别是在用抗CD3ε激动性抗体刺激后，CD4+和CD8+ T细胞表达活化标志物CD25。CD25的表达在CD8+ T细胞中更为明显，所有处理组的CD25阳性细胞百分比均高于90％(这就是为什么在下文提供平均荧光强度(MFI)作为在CD8+ T细胞中用CD3ε刺激测量表达CD25值的原因)。这是因为CD25是一种公认的CD8+T细胞活化标志物(比CD4+T细胞更明显)，并且CD8+T细胞对该活化标志物的刺激更具反应性。
用各种人细胞因子和/或抗人4-1BB激动剂抗体和/或其组合治疗对T细胞分泌IFN-γ的影响
Figure GDA0004138988600001941
/>
Figure GDA0004138988600001951
SEM＝均值标准误差
用人细胞因子和/或抗人4-1BB激动性抗体的各种组合处理后，在CD4+和CD8+ T细胞上CD25的表达
Figure GDA0004138988600001952
/>
Figure GDA0004138988600001961
SEM＝均值标准误差
*提供MFI值是因为所有组的CD3ε刺激下的CD25表达百分比均高于90％。
评估了免疫调节有效载荷增加经历人抗原的CD8+ T细胞活化的能力。产生人单核细胞衍生的树突状细胞(ModDC)，并用编码分泌的
Figure GDA0004138988600001962
具有置换N154S/R284G的人STING(STING N154S/R184G；SEQ ID NO:398)、具有置换N154S/R284G和人STING的C末端尾部(CTT)置换为袋獾STING CTT的人STING(STING N154S/R284GtazCTT；SEQ ID NO:397)、或者IL-12p70的质粒转染。转染后5小时，将人树突状细胞用HIV-1(阴性对照)、CEF或CMVMHC-I限制肽脉冲，以用广泛的病毒肽刺激抗原特异性CD8+ T细胞。从同一供体分离人CD8+T细胞并与脉冲的树突状细胞共培养48小时。共培养48小时后，收获上清液，并使用CBA试剂盒(BioLegend)测量细胞培养上清液中分泌的IFN-γ水平。
下表总结的结果证明了IL-12p70以及具有N154S和R284G GOF突变的STING变体，有或无人STING CTT置换为袋獾STING CTT，在增加人CD8+ T细胞的抗原特异性激活中的强力作用，根据T细胞分泌的IFN-γ来测量。
免疫调节蛋白处理后人CD8+ T细胞的抗原特异性激活
Figure GDA0004138988600001963
/>
Figure GDA0004138988600001971
SEM＝均值标准误差
实施例27
免疫刺激细菌细胞死亡后的质粒转移能够在人原代M2巨噬细胞中持久产生蛋白质
在原代人M2巨噬细胞中关于报告基因的表达，比较了转染(即直接转移质粒DNA)与细菌转染(即通过用本文的免疫刺激菌株感染转移质粒DNA)的相对效力。评估了基于细菌感染将编码基因表达盒的质粒从菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD转移到免疫抑制性吞噬细胞(即细菌转染)。M2巨噬细胞由健康人供体产生，然后用编码
Figure GDA0004138988600001972
(/>
Figure GDA0004138988600001973
Promega)报告基因的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株感染。也进行转染(即质粒DNA的直接转移)试验作为对照，并用于确定与细菌转染(即通过本文的免疫刺激菌株转移质粒DNA)相比的基因表达效力。
使用ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(Stem Cell Technologies)从负分离的人单核细胞中产生人M2巨噬细胞。将单核细胞(每孔5×105个细胞)接种在24孔平板中，最终体积为500μL，含有100ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。三天后，每孔加入500μL的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基，其中含有200ng/mL人M-CSF+20ng/mL人IL-4+20ng/mL人IL-10，将细胞再温育三天。在第6天，将M2巨噬细胞以150的MOI用菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD感染，该菌株含有在CMV启动子控制下编码分泌的
Figure GDA0004138988600001974
的质粒(本文称为菌株/>
Figure GDA0004138988600001975
)。每24小时收集一次细胞培养上清液，为期5天，并使用荧光素酶检测试剂盒(Promega)测量分泌的/>
Figure GDA0004138988600001976
水平。
结果总结在下表中。如下表所示，与未感染的M2巨噬细胞(对照，其背景发光为60.0RLU)相比，从24小时直至120小时，感染的M2巨噬细胞分泌的
Figure GDA0004138988600001977
的量(以从荧光素酶活性测定中检测到的相对光单位(RLU)衡量)在每个测量时间点都增加。/>
Figure GDA0004138988600001978
信号随时间明显增加，表明在基于用菌株/>
Figure GDA0004138988600001979
感染M2巨噬细胞后，在几天的时间内质粒DNA的有效递送和mRNA编码蛋白的持续表达。这些数据表明，基于细菌感染以及随后在M2巨噬细胞内的细菌细胞死亡后，质粒从细菌有效转移到M2巨噬细胞。
含有编码报告基因的质粒的免疫刺激细菌感染M2巨噬细胞后的蛋白质分泌
Figure GDA00041389886000019710
在平行实验中，使用
Figure GDA0004138988600001981
RED mRNA和质粒DNA转染试剂(OriGene)用1μg相同的/>
Figure GDA0004138988600001982
表达质粒转染M2巨噬细胞，或用
Figure GDA0004138988600001983
感染，如上所述。每24小时持续五天及在每个时间点，用RNA裂解缓冲液(Zymo Research)裂解感染和转染的M2巨噬细胞，并使用Zymo Research Quick-RNATM96试剂盒根据制造商的说明进行RNA提取。根据制造商的说明，使用iScriptTMReverse Transcription Supermix for RT-qPCR(Bio-Rad)在20μL反应中从模板RNA合成cDNA。/>
Figure GDA0004138988600001984
的qPCR采用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)使用iQTMMultiplex Powermix(Bio-Rad)进行。Bio-Rad CFX96TM实时PCR检测系统上的标准热循环程序包括95℃变性150秒，然后是95℃进行15秒和60℃进行55秒的39个循环。所有样品一式三份运行，并计算平均Cq值。/>
Figure GDA0004138988600001985
mRNA的定量使用肌动蛋白参考mRNA(Bio-Rad,assay ID:qHsaCEP0036280)进行标准化。ΔCq以靶基因(即/>
Figure GDA0004138988600001986
)和参考基因(即肌动蛋白)之间的差异计算。通过将/>
Figure GDA0004138988600001987
感染的M2巨噬细胞和用编码/>
Figure GDA0004138988600001988
的质粒转染的M2巨噬细胞的ΔCq值根据未转染对照组的平均ΔCq值标准化，获得ΔΔCq。在转染的M2巨噬细胞中的/>
Figure GDA0004138988600001989
表达基于平均ΔCq值被标准化为1.0的值，以及来自感染的M2巨噬细胞(即细菌转染)的/>
Figure GDA00041389886000019810
表达相对于来自转染的M2巨噬细胞的/>
Figure GDA00041389886000019811
表达的增加倍数，计算为2^-ΔΔCq。
结果总结在下表中，示出与用编码
Figure GDA00041389886000019816
的质粒转染的M2巨噬细胞中
Figure GDA00041389886000019812
的表达水平相比，在用菌株/>
Figure GDA00041389886000019813
感染的M2巨噬细胞中，通过RT-qPCR在24小时检测到更高水平的/>
Figure GDA00041389886000019814
表达。这表明与用质粒DNA直接转染细胞相比，用免疫刺激细菌感染M2巨噬细胞后质粒递送程度更高。
在细菌转染或转染M2巨噬细胞后的基因表达水平
Figure GDA00041389886000019815
SEM＝均值标准误差
实施例28
在编码多种异源产物的质粒中定位编码核酸可以增强人细胞中可检测蛋白质的产生
这个实施例表明，在本文提供的免疫刺激细菌中的质粒上编码的多种治疗产物的表达，可以通过编码一种产物的核酸分子的位置相对于编码其它产物的核酸分子的位置而得到改善。为了证明这一点，以及为了鉴定在组合质粒上编码表达盒中特定产物(有效载荷)的每个基因的位置，从而导致靶细胞中最高水平蛋白质表达，将细胞因子和其它免疫刺激蛋白的各种组合克隆到含有一个或多个真核启动子的质粒中。所述质粒含有两个独立的开放阅读框(ORF)，每个都在不同启动子(EF-1α启动子和CMV启动子(即双启动子系统))的控制下，或在一个ORF内含有2A肽(例如T2A和/或P2A)，一个启动子驱动两个或多个基因的表达(即单一启动子系统)。将质粒转染到HEK293T细胞中，并测定细胞培养上清液中各种编码的产物(有效载荷)的表达水平。
在所述组合质粒上编码的有效载荷包括但不限于，例如，具有GOF(功能获得)突变C205Y(muSTINGC205Y)的鼠STING；具有GOF突变R284G及人STINGC末端尾部(CTT)置换为袋獾STING CTT的人STING(huSTING R284G tazCTT)；具有GOF突变N154S和R284G及人STINGCTT置换为袋獾STING CTT的人STING(huSTING N154S/R284GtazCTT)；具有GOF突变N154S和R284G的人STING(huSTINGN154S/R284G)；鼠IL-12p70(muIL-12p70)；鼠IL-15Rα-IL-15sc(muIL-15Rα-IL-15sc)；鼠IL-21(muIL-21)；鼠IL-18(muIL-18)；鼠CXCL10(muCXCL10)；抗鼠CTLA-4 scFv(抗muCTLA-4 scFv；SEQ ID NO:404)；抗鼠CTLA-4 scFv-Fc(抗muCTLA-4scFv-Fc；SEQ ID NO:405)；鼠4-1BBLΔCyt(mu4-1BBLΔCyt，其中Δcyt表示胞质结构域的缺失)；与鼠IgG2a Fc融合的鼠可溶的TGFβ受体II(mu sTGFβRII-Fc；SEQ ID NO:406)；与人IgG1 Fc融合的人可溶的TGFβ受体II(hu sTGFβRII-Fc；SEQ ID NO:407)；鼠IFN-α2(muIFN-α2)；鼠IFN-β(muIFN-β)；鼠IL-36γ(muIL-36γ)；鼠IL-23(muIL-23)；鼠OX40L(muOX40L)；以及其两种或更多种的各种组合。通过Sanger测序确认序列。
抗鼠CTLA-4 scFv(SEQ ID NO:404)抗鼠CTLA-4 scFv-Fc(SEQ ID NO:405)源自9D9克隆。scFv含有IgK前导小鼠序列，以及来自克隆9D9的VL和VH结构域，通过(Gly4Ser)3接头连接。scFv-Fc还含有与VH结构域连接的小鼠IgG2a Fc。
使用HEK293T STING Null细胞(293-DualTM Null Cells；InvivoGen)，不含内源性STING，表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激的应答元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列通过使用敲入技术置换为SEAP ORF。将HEK293T STINGNull细胞(293-DualTM Null Cells；InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植于包被有聚-L-赖氨酸的24孔平板中，在5％ CO2温育器中在37℃温育过夜，以达到80％汇合度。第二天，将500ng的每种质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到
Figure GDA0004138988600001991
转染试剂(Promega)中，未转染的孔用作阴性对照(一式两份)。在转染后48小时收集每个样品的细胞培养上清液。
使用HEK 293T STING Null ISRE-SEAP报告细胞系(293-DualTM Null Cells；InvivoGen)评估每个编码的STING变体(muSTING C205Y，huSTING N154S/R284G，huSTINGR284G tazCTT和huSTING N154S/R284G tazCTT)的STING活性。使用这些细胞，通过监测细胞上清液中I型IFN刺激的SEAP产生来评估I型干扰素(IFN)活性(由STING诱导)。将20μL细胞培养上清液添加到180μL的QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)中，用于测量SEAP。通过在
Figure GDA0004138988600001992
M3分光光度计(Molecular Devices)上测量在650nm的吸光度的ISRE诱导的SEAP活性，确定I型干扰素的活化。
还通过使用特异于每种细胞因子的ELISA来评估细胞培养上清液中编码的细胞因子的表达。对于muIL-15Rα-IL-15sc构建体，按照试剂盒说明使用鼠IL-15Rα-IL-15scELISA(Thermo Fisher Scientific)。特异于鼠IL-18(Invitrogen)、鼠IL-21(Invitrogen)、鼠IL-12p70(BioLegend)、鼠IL-23(BioLegend)、鼠CXCL10(BioLegend)和鼠IL-36γ(RayBiotech)的ELISA，用于测量细胞培养上清液中每种这些细胞因子的水平。使用适当的U-PLEX测定(Meso Scale Discovery)测量鼠IFN-α2和鼠IFN-β。
对质粒转染的HEK293T细胞的细胞培养上清液进行使用小鼠TGF-β1或人TGF-β1(R&D Systems)直接ELISA，所述质粒分别编码与Fc融合的鼠或人可溶性TGFβ受体II，以测量这些蛋白质的表达水平。对用质粒转染的细胞的细胞培养上清液进行使用小鼠CTLA-4-Fc(R&D Systems)的直接ELISA，所述质粒编码抗鼠CTLA-4 scFv和抗鼠CTLA-4 scFv-Fc，以测量这些蛋白质的表达水平。
转染后48小时，通过流式细胞术评估鼠细胞表面配体4-1BBLΔcyt和OX40L的表达。对于用编码mu4-1BBLΔcyt的质粒转染的细胞，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在PBS+2％ FBS中，并用生物素缀合的抗鼠4-1BBL抗体(克隆TKS-1，BioLegend)染色。温育30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次，重悬于PBS+2％ FBS中，并用APC缀合的链霉抗生物素蛋白(BioLegend)染色。温育30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次，并重悬于具有DAPI(死/活染色剂)的PBS+2％ FBS中。使用ACEA
Figure GDA0004138988600002001
流式细胞仪(ACEABiosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(TreeStar,Inc.)进行分析。
或者，将表达muOX40L的细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在PBS+2％ FBS中，并用APC缀合的抗小鼠OX40L抗体(克隆RM134L，BioLegend)染色。温育30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次，并重悬于具有DAPI(死/活染色剂)的PBS+2％ FBS中。使用ACEA
Figure GDA0004138988600002002
流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(TreeStar,Inc.)进行分析。/>
下表总结了组合质粒中各个有效载荷的表达，使用符号–、+、++和+++表示表达水平。–表示不表达；+表示有些表达；++表示表达良好；+++表示高表达。符号+/–表示在+和-之间的表达水平，即低表达；+/++表示在+和++之间的表达水平，即中等表达；++/+++表示在++和+++之间的表达水平，即高表达。
对于单一启动子系统，其中质粒在单一CMV启动子的控制下编码两种或多种有效载荷，2A肽(T2A或P2A)在每对基因或ORF之间编码，X_T2A表示评估的有效载荷(即“X”)在带有CMV启动子的质粒上的T2A肽之前编码；T2A_X表示评估的有效载荷在带有CMV启动子的质粒上的T2A肽之后编码；P2A_X表示评估的有效载荷在带有CMV启动子的质粒上的P2A肽之后编码；和P2A_X_T2A_X*，其中X*是评估的有效载荷，表示评估的有效载荷是在带有CMV启动子的质粒上在T2A肽之后编码的，T2A肽是在P2A肽和在P2A多肽之后的有效载荷(X)之后编码的。
对于单一启动子系统，其中质粒在单一EF-1α启动子的控制下编码两种或多种有效载荷，2A肽(T2A或P2A)在每对基因或ORF之间编码，X#_T2A和T2A_X#，其中X#是评估的有效负载，表示在具有EF-1α启动子的质粒上分别在T2A肽之前或之后表达的有效载荷。例如，在CMV mu4-1BBLΔcyt_T2A_muIL-12p70_P2A_mu sTGFβRII-Fc_T2A_huSTING N154S/R284GtazCTT的质粒中，X_T2A表示mu4-1BBLΔcyt；T2A_X表示muIL-12p70；P2A_X表示mu sTGFβRII-Fc；P2A_X_T2A_X*表示huSTING N154S/R284G tazCTT。相似地，在编码CMV muIL-12p70_T2A_muIL-21+EF-1αmu4-1BBLΔcyt_T2A_muSTING C205Y的质粒中，X_T2A表示muIL-12p70；T2A_X表示muIL-21；X#_T2A表示mu4-1BBLΔcyt；T2A_X#表示muSTING C205Y。
对于在单独的启动子控制下编码每种有效载荷的质粒(或只有一个有效载荷和一个启动子，即单个表达子)，CMV_X和EF-1α_X#分别表示评估的有效载荷在CMV启动子之后编码(有效载荷X)，或在EF-1α启动子之后编码(有效载荷X#)。
如下表所示，单个表达子通常表现出最高的表达水平。随着质粒上编码更多蛋白质，无论是双启动子质粒还是单启动子质粒，每种有效载荷的表达均趋于降低。位于组合质粒第一位置(例如在第一个T2A之前)的有效负载的表达通常高于质粒其它位置的相同有效载荷的表达。在含有多种有效载荷的组合质粒中，在CMV启动子之后的第一位置经常看到更高的表达。发现鼠4-1BBLΔCyt仅在组合质粒中在CMV启动子之后的第一个位置编码时表达良好。
单一和组合有效载荷的表达水平
Figure GDA0004138988600002011
/>
Figure GDA0004138988600002021
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Figure GDA0004138988600002031
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Figure GDA0004138988600002041
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Figure GDA0004138988600002051
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Figure GDA0004138988600002061
/>
Figure GDA0004138988600002071
HPRE＝乙型肝炎病毒转录后调节元件；WPRE＝土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件；bGHpA＝牛生长激素poly A；SV40pA＝猿病毒40poly A。
实施例29
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB中的生物分布、清除、肿瘤定植和异位基因表达研究
评估了在全身施用后菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB在非荷瘤小鼠的各种组织包括肝、脾、心脏、肺、肾、肠、肌肉、骨髓和淋巴结中的生物分布以及从中的清除，并与评估并与亲本菌株YS1646的生物分布和清除进行比较。.将在荷瘤小鼠中所述菌株在肿瘤中的定殖与在非肿瘤组织的定殖进行比较，并且还确定了在细菌中的质粒上编码的异源基因产物在肿瘤与非肿瘤组织中的表达.
A.YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株从天然小鼠中快速清除并且在健康组织中的未观察到异位基因表达
进行了一项生物分布研究，以比较亲本YS1646菌株与菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB之间在非荷瘤小鼠组织中的细菌清除随时间的变化。在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB中的质粒上编码荧光素酶蛋白，并评估组织中荧光素酶的表达，以确定健康的非肿瘤组织中的异位基因表达，如下所述。为此，为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组3只小鼠)静脉注射单剂量的2×106CFU的每种细菌菌株，或注射PBS载体对照。在给药后2小时、24小时和30天，将小鼠安乐死，并收获脾、肝、心脏、肺、肾、肠、肌肉、骨髓和淋巴结。将所述组织在2mL PBS中使用GentleMACSTM Octo离解器和M管(Miltenyi Biotec)分子设置进行匀浆，并将匀浆置于LB板上以计算每克组织的菌落形成单位(CFU)的数量。
如下表所示，在静脉内给药后2小时，所有三种菌株在脾和肝中均显示出CFU，在心脏、肺和肾中的程度较低。与在给药后24小时在脾和肝中继续表现出高CFU的亲本YS1646菌株不同，在用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株处理的小鼠的脾和肝中检测到显著降低的CFU。在给药后第30天，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB从所有器官中清除。相比之下，亲本YS1646菌株在给药后24小时在许多组织中显示定植，包括在给药后第30天在脾和肝中检测到定植。
菌株YS1646在静脉给药后2小时、24小时和30天在非荷瘤小鼠的生物分布
Figure GDA0004138988600002081
SD＝标准差；LOD＝检测限
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD在静脉内给药后2小时、24小时和30天在非荷瘤小鼠的生物分布
Figure GDA0004138988600002082
SD＝标准差；LOD＝检测限
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB在静脉内给药后2小时、24小时和30天在非荷瘤小鼠的生物分布
Figure GDA0004138988600002083
/>
Figure GDA0004138988600002091
SD＝标准差；LOD＝检测限
这些数据表明，编码鞭毛的基因以及基因asd、pagP、ansB、csgD和任选的lppAB的缺失或破坏导致所述免疫刺激菌株比亲本菌株YS1646(VNP20009，即msbB-/purI-)更快地从健康、非肿瘤组织清除，并导致所述细菌在24小时至30天内从非肿瘤组织中完全清除；而菌株YS1646(VNP20009)在给药后24小时仍然可以在非肿瘤组织中检测到，在给药后30天在肝和脾中检测到。这表明本文提供的具有基因组修饰的免疫刺激细菌比菌株VNP20009的施用更安全且耐受性更好。因此，可以施用更高剂量的本文提供的免疫刺激细菌。
为了测量所述细菌对各种非肿瘤组织的质粒递送，以及随后的异源基因表达和蛋白质分泌，测量了分泌的荧光素酶蛋白(
Figure GDA0004138988600002092
Promega，缩写为/>
Figure GDA0004138988600002093
)的活性。静脉内施用的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株各自含有在真核CMV启动子的控制下编码
Figure GDA0004138988600002094
的质粒。在如上所述将小鼠组织匀浆后，将匀浆以1300RPM离心10分钟，收集上清液并使用/>
Figure GDA0004138988600002095
检测试剂(Promega)测定荧光素酶活性，并使用/>
Figure GDA0004138988600002096
M3分光光度计/发光计(Molecular Devices)测量发光。
在所有组织中及在所有时间点，尽管在给药后24小时在脾和肝中观察到CFU，但没有检测到高于背景的荧光素酶活性。这些数据表明YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株在非荷瘤小鼠的健康组织中快速清除的能力，并且与亲本YS1646菌株不同，在给药后30天不需要抗生素来清除细菌。重要的是，在任何时间点都没有在健康组织中观察到异位基因表达。
B.YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株优先在肿瘤组织中积累，并且异位基因表达是肿瘤特异性的
为了确定与亲本YS1646菌株相比，含有
Figure GDA0004138988600002097
质粒的缺失菌株的相对组织定植和肿瘤特异性基因表达，在荷瘤小鼠中进行了生物分布研究。为此，为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组4只小鼠)用4T1乳腺癌细胞(100μL PBS中的2×105个细胞)原位接种在4th乳腺脂肪垫中。为携带已建立10天的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射单剂量的2×106CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株或YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株，每个菌株都含有编码/>
Figure GDA0004138988600002098
的质粒，或静脉内注射单剂量2×106CFU的亲本YS1646菌株。在静脉内给药后的第1天、第4天和第8天，对小鼠实施安乐死，并收获肿瘤、脾、肝、心脏、肺、肾、肠、肌肉、骨髓和淋巴结并如上所述处理，以计算集落形成单位(CFU)的数量，以及测量每克肿瘤组织的平均发光(以相对光单位(RLU)为单位)。此外，在这些时间点对小鼠取血并收集血清，以确定应答施用不同细菌菌株而诱导的全身性促炎细胞因子的水平，如下所述。
如下表所示，在给药后第1天，相对于其它组织，所有三种菌株在肿瘤中均表现出优先定植(由平均CFU确定)，并在第4天和第8天表现出增加的肿瘤定植。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD示出比菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB更快和更高水平的肿瘤定植。此外，对于YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株以及更大程度的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株，在除肿瘤、脾和肝以外的组织中观察到的菌落非常少。相反，在整个小鼠的健康、非肿瘤组织中观察到亲代YS1646菌株的定殖，即使在给药后第8天也是如此。
菌株YS1646在静脉给药后第1、4和8天在荷瘤小鼠中在肿瘤与健康组织中的生物分布
Figure GDA0004138988600002101
SD＝标准差；LOD＝检测限
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD在静脉给药后第1、4和8天在荷瘤小鼠中在肿瘤与健康组织中的生物分布
Figure GDA0004138988600002102
SD＝标准差；LOD＝检测限
菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB在静脉给药后第1、4和8天在荷瘤小鼠中在肿瘤与健康组织中的生物分布
Figure GDA0004138988600002111
SD＝标准差；LOD＝检测限
为了确定在肿瘤和各种非肿瘤小鼠组织中异源基因表达和蛋白质分泌的水平，如上所述使用荧光素酶活性测定在组织匀浆上清液中测量在细菌中的质粒上编码的
Figure GDA0004138988600002112
的活性。如下表所示，尽管在其它组织中观察到细菌CFU(如上所示)，但两种菌株中/>
Figure GDA0004138988600002113
的表达都仅限于肿瘤组织。在给予YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株的小鼠的骨髓中观察到的RLU被确定为来自污染，并且在随后的实验中未观察到。与YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD缺失菌株相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株显示延迟的肿瘤
Figure GDA0004138988600002114
表达，这是由于肿瘤定植延迟所致(如上表所示)。
在菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD中在质粒上编码的
Figure GDA0004138988600002115
的肿瘤特异性表达
Figure GDA0004138988600002116
SD＝标准差；LOD＝检测限
在菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB中在质粒上编码的
Figure GDA0004138988600002117
的肿瘤特异性表达/>
Figure GDA0004138988600002118
Figure GDA0004138988600002121
SD＝标准差；LOD＝检测限
如上所述，将荷瘤小鼠在静脉内施用所述免疫刺激菌株后第1、4和8天用取血，并收集血清。在静脉内给药后第1天(D1)、第4天(D4)和第8天(D8)，通过细胞计数珠阵列(Mouse Inflammation CBA,BD Biosciences)评估血清的全身性促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-10的水平。
如下表所示，在给予所述细菌后第1天，来自给予菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB的小鼠的所有细胞因子的血清浓度均低于给予亲本YS1646菌株的小鼠的血清中的相应浓度水平，除了给予YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的IL-6水平稍高之外。在给药后第1天来自给予菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB的小鼠的血清IFN-γ、IL-2和IL-10浓度与PBS对照组相同(即0pg/mL)。亲本菌株YS1646在第4天表现出IL-6、IFN-γ和IL-2的全身细胞因子水平峰值，而施用每种缺失菌株后的血清细胞因子水平远低于施用亲本菌株的相应水平，更接近PBS载体对照组测量值。IL-10是TLR2信号传导的直接靶标，在给予亲本菌株后第1天的高血清浓度IL-10，在给予每种缺失菌株后不存在，所述缺失菌株含有TLR2激动剂(例如脂蛋白)的缺失或修饰。
这些数据表明在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株中修饰TLR2、TLR4和TLR5信号传导的基因组缺失在很大程度上消除了系统性促炎细胞因子的产生，尽管有强大的细菌肿瘤定植。因此，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB具有良好的耐受性，并且如果需要，可以在比亲本菌株YS1646更高的浓度下给药，从而增强治疗效果。
应答为荷瘤小鼠静脉内施用所述免疫刺激细菌菌株的IL-6、TNF-α和IFN-γ的血清水平
Figure GDA0004138988600002122
Figure GDA0004138988600002131
应答为荷瘤小鼠静脉内施用所述免疫刺激细菌菌株的IL-22和IL-10的血清水平
Figure GDA0004138988600002132
这些数据表明，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株在静脉内给药后从天然小鼠中迅速清除，并且不需要抗生素清除。在天然和荷瘤小鼠中，与健康组织相比，所述缺失菌株优先定殖肿瘤，并且质粒编码的有效载荷的表达是肿瘤特异性的。此外，与亲本YS1646菌株不同，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB缺失菌株不会引发毒性和免疫抑制性的促炎全身细胞因子，尽管肿瘤定植很强，表明这些菌株在体内具有良好的耐受性，并且如有必要，可以以比菌株YS1646(VNP20009)更高的浓度给药，从而获得更高的治疗效果。
实施例30
编码免疫调节有效载荷的递送质粒的修饰
递送质粒编码细菌适应性和功能以及编码的复合多顺反子真核有效载荷的正确表达所需的基因和调节元件。这种进化上不同的生物之间的转换为两者的正常功能带来了挑战。在细菌中，观察到来自真核启动子(例如CMV启动子)的转录渗漏。其中细菌中总是存在来自真核启动子的某种程度的基础转录，则启动子被认为是“渗漏的”。这种启动子渗漏与大型真核基因和调节序列组合，当在细菌中(例如在质粒上)编码时，导致细菌适应性降低，表现为注射原液存活率低，以及在肉汤培养中的生长速率降低。在此发现细菌适应性受真核启动子的渗漏影响。渗漏的启动子会因多种原因影响细菌的适应性，例如增加的转录/翻译负荷，以及正常分泌的真核蛋白的部分表达，这些蛋白在积累时会对细菌细胞产生毒性。
为了减少CMV启动子渗漏和改善细菌生长和适应性，本文示出可以减少或抑制细菌CMV渗漏，例如通过包括细菌特异性终止子序列如噬菌体T4、trpA和BBa_B0015终止子，和/或通过将强细菌启动子置于相反方向(即包括反向启动子)实现。例如，本文称为RevMTL*的反向启动子(反义方向的启动子)是衍生自MTL启动子(得自MolecularTechnologies Laboratories)的强启动子，其又衍生自proD启动子(见例如Davis et al.(2011)Nucleic Acids Research 39(3):1131–1141)，其被突变以去除序列中的所有反义ATG，以消除或减少真核基因的表达。
本文显示，改变真核启动子内预测的细菌启动子序列的工程化突变也可用于产生CMV启动子渗漏性降低的变体。除了CMV启动子渗漏之外，稳健的asd表达通读(在含有掺入asd互补系统的质粒的asd-菌株中)可能导致通过真核有效载荷的表达盒的渗漏。本文显示阻断或减少asd表达通读的策略包括将表达盒置于相反方向，和/或在asd基因和有效载荷表达盒之间插入细菌终止子序列。
为了尽量减少对细菌适应性的负面影响，同时在哺乳动物细胞中保持高异位基因/有效载荷表达，以四种不同的方式系统地修饰了递送质粒，如下所示：
1)在CMV启动子增强子区域内编码的隐蔽细菌启动子序列使用PromoterHunter鉴定(可在phisite.org/promoterhunter/在线获得；见例如Klucar et al.(2010)NucleicAcids Res.38(Database issue):D366-D370)，然后将推定的启动子序列替换为CREB-结合位点和部分CREB-结合位点，以促进有效的质粒递送；
2)为了抑制CMV启动子的转录渗漏，在开放阅读框(ORF)1的5’非翻译区(UTR)插入一些细菌终止子，以抑制在细菌中的表达(见下表)；
3)为了降低从复制起点的通读转录水平，反转从CMV启动子上游到多聚腺苷酸化信号末端的表达盒的方向，具有和不具有在表达盒与复制起点之间插入的转录终止子；和
4)将导致提高的注射原液存活率的上述1)至3)中的修饰与增强的体外遗传有效载荷表达组合，以进一步改进。
为了测量来自细菌感染的真核细胞的编码的有效载荷的表达，将THP-1人巨噬细胞(ATCC目录#202165)用鼠伤寒沙门氏菌YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株感染，所述菌株含有功能性asd基因的质粒以确保质粒维持，以及复合的真核表达盒(CMV muIL-12p70_T2A_muIL-18HPRE bGHpolyA+EF-1αmuSTING C205Y WPRESV40polyA)，所述表达盒具有上述修饰并在下表中列出。质粒ADN-287含有真核表达盒，没有进一步的修饰。质粒ADN-397、ADN-398和ADN-399各含有一个独特的CMV隐蔽启动子置换(具有CREB-结合位点或部分CREB-结合位点)；质粒ADN-400、ADN-401和ADN-402各含有两个CMV隐蔽启动子置换；和质粒ADN-403含有三个CMV隐蔽启动子置换。质粒ADN-355含有来自质粒ADN-287的真核表达盒，方向相反；质粒ADN-358包含来自质粒ADN-287的表达盒，具有在聚腺苷酸化位点下游的BBa_B0015终止子，以及相反方向的表达盒；质粒ADN-325含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间T4细菌终止子；质粒ADN-382与质粒ADN-325相同，但表达盒置于相反方向；质粒ADN-373含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间T4细菌终止子，其后是BBa_B0015终止子，表达盒方向相反；质粒ADN-327含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间的trpA细菌终止子；质粒ADN-381与质粒ADN-327相同，但表达盒方向相反；质粒ADN-372含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间的trpA细菌终止子，其后是BBa_B0015终止子，表达盒方向相反；质粒ADN-329含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间的RevMTL*启动子(见上文描述)；质粒ADN-383与质粒ADN-329相同，但表达盒方向相反；质粒ADN-374含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间的RevMTL*启动子，其后是BBa_B0015终止子，表达盒方向相反；质粒ADN-328含有在CMV启动子和ADN-287表达盒之间的BBa_B0015终止子。质粒ADN-257含有编码muIL12-p70的基因，在CMV启动子的控制下，没有进一步的修饰。
将5×105个细胞置于24孔培养皿的具有RPMI和10％ FBS的每个孔。用经过洗涤的、固定相培养的鼠伤寒沙门氏菌菌株YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD(含有上述质粒之一并列于下表)以200CFU/细胞的MOI感染细胞1小时，然后用PBS洗涤细胞，将培养基更换为含有200μg/mL庆大霉素的培养基，以杀死细胞外细菌。24小时后，用350μL具有β-巯基乙醇(β-ME)的缓冲液RLT(Qiagen)裂解细胞，并使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒根据以下修改提取RNA。使用RNase-Free DNase试剂盒(Qiagen)包括的基因组DNA消除步骤，以从总RNA中去除基因组DNA。使用NanoDropTM OneC UV-Vis分光光度计(ThermoFisher Scientific)测量总RNA浓度。将RNA在-80℃储存，无需冻融，直到进行逆转录。根据制造商的说明，使用C1000 TouchTM热循环仪(Bio-Rad)和SuperScriptTM VILOTM MasterMix(Invitrogen)在30μL反应中使用0.4-1μg模板RNA进行cDNA合成。
使用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行qPCR(定量聚合酶链式反应)。用于鼠IL-12的
Figure GDA0004138988600002151
引物(Assay ID：qMmuCID0015668)购自Bio-Rad。按照方案使用iTaqTMUniversal/>
Figure GDA0004138988600002152
Green Supermix(Bio-Rad)进行qPCR反应(20μL)。Bio-Rad CFX96TM实时PCR检测系统的标准热循环程序包括95℃变性30秒，然后是95℃进行5秒和60℃进行30秒的40个循环。每个平板上的每组引物都包括无模板对照的反应。所有样品均一式两份运行，并计算平均Cq值。使用β-肌动蛋白参考mRNA(Bio-Rad，qMmuCED0027505)对靶mRNA的定量进行标准化。ΔCq计算为靶基因(即muIL-12p70)和参考基因(即β-肌动蛋白)之间的差异。ΔΔCq是通过将各个菌株的ΔCq值标准化为携带未修饰质粒(ADN-287；见下表)的菌株的ΔCq值而获得的。表达倍数计算为2^-ΔΔCq。
每个细菌菌株的倍增时间是根据肉汤培养生长曲线计算的，该曲线通过将OD600标准化的固定培养物稀释至OD600＝0.05，并在37℃下振荡生长过夜，然后使用
Figure GDA0004138988600002153
M3分光光度计(MolecularDevices)每15分钟读取一次OD600而获得。倍增时间(G)来自指数生长期，使用公式G＝t/n，其中t＝时间间隔(tfinal-tstart)，以分钟为单位，n＝(logOD600(final)-logOD600(start))/log2。
注射原液是通过在PBS中洗涤3次在冰冷10％甘油溶液中在4XYT培养基中生长的25ml过夜静止培养的每个鼠伤寒沙门氏菌YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，以OD600＝2标准化，将1ml等分试样放入干冰中冷冻而制备的。原液在-80℃储存。注射原液的存活率是通过滴定解冻的注射液瓶，将每瓶的菌落形成单位(CFU)除以基于OD600的预期CFU来确定的。含有每个所述质粒(有或无所述修饰)的菌株YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的muIL-12p70表达水平、细菌倍增次数、注射原液存活率和平均固定相终末OD600读数的结果如下表所示。
质粒修饰对有效载荷表达水平和细菌适应性的影响
Figure GDA0004138988600002154
Figure GDA0004138988600002161
RevMTL*是反向启动子(反义方向的启动子)，其是一种强细菌启动子，源自MTL启动子(Molecular Technologies Laboratories)，其源自proD启动子，经过突变以去除所有反义ATG，以减少或消除真核基因的表达。
结果表明，当在质粒上反转表达盒及后接BBa_B0015终止子时，将T4终止子插入CMV启动子下游((CMV-T4终止子-ADN-287盒-BBa_B0015终止子)反向；参见质粒ADN-373的结果)，与携带亲本质粒ADN-287的菌株相比，细菌细胞存活率增加(41％的注射原液活存活率与22％相比)。携带这种质粒的菌株与携带亲本质粒ADN-287的相同菌株相比，在体外也表达更高水平的muIL-12p70(1.5与1.0相比)，倍增时间缩短(101分钟与125分钟相比)，并生长至更高的静止OD600(3.98与3.62相比)。没有其它质粒在所有指标上都有这样的改进。
因此，当质粒编码复合的多顺反子真核有效载荷时，组合：1)在CMV启动子下游插入细菌终止子，例如T4细菌终止子；2)在表达盒之后加上另一个终止子，例如细菌BBa_B00015终止子；3)反转真核表达盒在质粒上的方向，提高编码的有效载荷表达的效力并提高细菌适应性。
由于修改对本领域技术人员来说是显而易见的，因此本发明旨在仅由所附权利要求的范围来限制。
序列表
<110> 阿克蒂姆治疗有限公司
<120> 免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途
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<212> DNA
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<223> 程序性死亡配体1(PD-L1), 同种型1
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gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120
aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180
gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240
tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300
atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360
gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420
attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480
cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540
accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600
acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660
acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720
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ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840
aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg 870
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<223> CTNNB1 (Beta-连环蛋白), 同种型1
<400> 32
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ctg 2343
<210> 33
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 信号调节蛋白alpha (SIRP-alpha)
同种型1
<400> 33
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tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 420
gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 480
acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 540
accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 600
gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 660
gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 720
cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 780
cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 840
cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 900
accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 960
tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1020
gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1080
gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1140
accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1200
gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1260
acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1320
gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1380
cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1440
acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1500
gtcccgagga ag 1512
<210> 34
<211> 1108
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TREX1 同种型1
<400> 34
aatgggccct ggagctcgca gacagggcag gattgtgcag ggaaggcctg agatgtgctt 60
ctgcccaccc cctaccccac tccctcccct tcggatctta acactgggca ctcacacacc 120
caccccatgc tcctctccag gctcagcagc aggtacgtac ccaaccatgg gctcgcaggc 180
cctgcccccg gggcccatgc agaccctcat ctttttcgac atggaggcca ctggcttgcc 240
cttctcccag cccaaggtca cggagctgtg cctgctggct gtccacagat gtgccctgga 300
gagccccccc acctctcagg ggccacctcc cacagttcct ccaccaccgc gtgtggtaga 360
caagctctcc ctgtgtgtgg ctccggggaa ggcctgcagc cctgcagcca gcgagatcac 420
aggtctgagc acagctgtgc tggcagcgca tgggcgtcaa tgttttgatg acaacctggc 480
caacctgctc ctagccttcc tgcggcgcca gccacagccc tggtgcctgg tggcacacaa 540
tggtgaccgc tacgacttcc ccctgctcca agcagagctg gctatgctgg gcctcaccag 600
tgctctggat ggtgccttct gtgtggatag catcactgcg ctgaaggccc tggagcgagc 660
aagcagcccc tcagaacacg gcccaaggaa gagctatagc ctaggcagca tctacactcg 720
cctgtatggg cagtcccctc cagactcgca cacggctgag ggtgatgtcc tggccctgct 780
cagcatctgt cagtggagac cacaggccct gctgcggtgg gtggatgctc acgccaggcc 840
tttcggcacc atcaggccca tgtatggggt cacagcctct gctaggacca agccaagacc 900
atctgctgtc acaaccactg cacacctggc cacaaccagg aacactagtc ccagccttgg 960
agagagcagg ggtaccaagg atcttcctcc agtgaaggac cctggagccc tatccaggga 1020
ggggctgctg gccccactgg gtctgctggc catcctgacc ttggcagtag ccacactgta 1080
tggactatcc ctggccacac ctggggag 1108
<210> 35
<211> 933
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> T细胞激活的V-结构域Ig阻抑物
(VISTA)
<400> 35
atgggcgtcc ccacggccct ggaggccggc agctggcgct ggggatccct gctcttcgct 60
ctcttcctgg ctgcgtccct aggtccggtg gcagccttca aggtcgccac gccgtattcc 120
ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgtc accctcacct gcaggctctt gggccctgtg 180
gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctcgag gggcgaggtg 240
cagacctgct cagagcgccg gcccatccgc aacctcacgt tccaggacct tcacctgcac 300
catggaggcc accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagcgcca cgggctggag 360
tcggcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatgc gcaacctgac cctgctggat 420
agcggcctct actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accactcgga gcacagggtc 480
catggtgcca tggagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctgtgtggtg 540
tacccatcct cctcccagga tagtgaaaac atcacggctg cagccctggc tacgggtgcc 600
tgcatcgtag gaatcctctg cctccccctc atcctgctcc tggtctacaa gcaaaggcag 660
gcagcctcca accgccgtgc ccaggagctg gtgcggatgg acagcaacat tcaagggatt 720
gaaaaccccg gctttgaagc ctcaccacct gcccagggga tacccgaggc caaagtcagg 780
caccccctgt cctatgtggc ccagcggcag ccttctgagt ctgggcggca tctgctttcg 840
gagcccagca cccccctgtc tcctccaggc cccggagacg tcttcttccc atccctggac 900
cctgtccctg actctccaaa ctttgaggtc atc 933
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huPD-L1的shRNA-编码序列
<400> 36
gtagagtatg gtagcaatat ctagagtatt gctaccatac tctac 45
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huCTNNB1的shRNA-编码序列
<400> 37
gacagactgc cttcaaattt ctagagaatt tgaaggcagt ctgtc 45
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huSIRPalpha的shRNA-编码序列
<400> 38
gccaggtgag gaagttctat ctagagtaga acttcctcac ctggc 45
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTREX1的shRNA-编码序列
<400> 39
gcagcgcatg ggcgtcaatt ctagagattg acgcccatgc gctgc 45
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huVISTA的shRNA-编码序列
<400> 40
gaccaccatg gcaacttctt ctagagagaa gttgccatgg tggtc 45
<210> 41
<211> 3220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEQU6 载体
<400> 41
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccaa ggtcgggcag gaagagggcc 720
tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta 780
gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 840
aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 900
ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaact 960
agttttttct cgagtagcta gagaattcat ggtaatagcg atgactaata cgtagatgta 1020
ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat gtactgggca taatgccagg cgggccattt 1080
accgtcattg acgtcaatag ggggcgtact tggcatatga tacacttgat gtactgccaa 1140
gtgggcagtt taccgtaaat agtccaccca ttgacgtcaa tggaaagtcc ctattggcgt 1200
tactatggga acatacgtca ttattgacgt caatgggcgg gggtcgttgg gcggtcagcc 1260
aggcgggcca tttaccgtaa gttatgtaac gcggaactcc atatatgggc tatgaactaa 1320
tgaccccgta attgattact attaataact agacccagct ttcttgtaca aagttggcat 1380
tataagaaag cattgcttat caatttgttg caacgaacag gtcactatca gtcaaaataa 1440
aatcattatt tgccatccag ctgatatccc ctatagtgag tcgtattaca tggtcatagc 1500
tgtttcctgg cagctctggc ccgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa 1560
aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt 1620
tatgagccat attcaacggg aaacgtcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 1680
tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 1740
cttgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 1800
caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 1860
gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 1920
cggaaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga 1980
tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa 2040
cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 2100
tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat 2160
gcataaactt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga 2220
taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 2280
cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 2340
attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 2400
gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta atcagaattg gttaattggt tgtaacactg 2460
gcagagcatt acgctgactt gacgggacgg cgcaagctca tgaccaaaat cccttaacgt 2520
gagttacgcg tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 2580
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 2640
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 2700
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 2760
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 2820
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 2880
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 2940
caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 3000
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 3060
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 3120
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 3180
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 3220
<210> 42
<211> 3802
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEQU6-H1 载体
<400> 42
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720
tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780
gtatgagacc actccctagg tttttgtcga cagatctggc gcgccatagt ggccagcggc 840
cgcaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt 900
agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct 960
caggtctgcc cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 1020
ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 1080
actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggccca 1140
agttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 1200
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 1260
atcttatcat gtctggatcc aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt 1320
catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa 1380
acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg 1440
cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt 1500
tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa ctagtttttt ctcgagtagc 1560
tagagaattc atggtaatag cgatgactaa tacgtagatg tactgccaag taggaaagtc 1620
ccataaggtc atgtactggg cataatgcca ggcgggccat ttaccgtcat tgacgtcaat 1680
agggggcgta cttggcatat gatacacttg atgtactgcc aagtgggcag tttaccgtaa 1740
atagtccacc cattgacgtc aatggaaagt ccctattggc gttactatgg gaacatacgt 1800
cattattgac gtcaatgggc gggggtcgtt gggcggtcag ccaggcgggc catttaccgt 1860
aagttatgta acgcggaact ccatatatgg gctatgaact aatgaccccg taattgatta 1920
ctattaataa ctagacccag ctttcttgta caaagttggc attataagaa agcattgctt 1980
atcaatttgt tgcaacgaac aggtcactat cagtcaaaat aaaatcatta tttgccatcc 2040
agctgatatc ccctatagtg agtcgtatta catggtcata gctgtttcct ggcagctctg 2100
gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac 2160
aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg 2220
ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 2280
ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgcttgtatg ggaagcccga 2340
tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 2400
gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 2460
ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa cagcattcca 2520
ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 2580
gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 2640
tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 2700
cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt 2760
ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 2820
ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga 2880
tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt 2940
tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga 3000
tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac 3060
ttgacgggac ggcgcaagct catgaccaaa atcccttaac gtgagttacg cgtcgttcca 3120
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3180
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3240
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3300
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3360
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3420
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3480
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3540
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3600
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3660
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 3720
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 3780
ggccttttgc tggccttttg ct 3802
<210> 43
<211> 3263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEQU6-shPDL1-shRNA 载体
<400> 43
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccaa ggtcgggcag gaagagggcc 720
tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta 780
gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 840
aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 900
ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaact 960
aggtagagta tggtagcaat atctagagta ttgctaccat actctacttt tttcgagtag 1020
ctagagaatt catggtaata gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt 1080
cccataaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa 1140
tagggggcgt acttggcata tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta 1200
aatagtccac ccattgacgt caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg 1260
tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg 1320
taagttatgt aacgcggaac tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt 1380
actattaata actagaccca gctttcttgt acaaagttgg cattataaga aagcattgct 1440
tatcaatttg ttgcaacgaa caggtcacta tcagtcaaaa taaaatcatt atttgccatc 1500
cagctgatat cccctatagt gagtcgtatt acatggtcat agctgtttcc tggcagctct 1560
ggcccgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa 1620
caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac 1680
gggaaacgtc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 1740
gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg 1800
atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 1860
agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 1920
tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggaaaa acagcattcc 1980
aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 2040
tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 2100
gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 2160
acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat 2220
tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 2280
aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 2340
atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 2400
ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 2460
atgagttttt ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga 2520
cttgacggga cggcgcaagc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagttac gcgtcgttcc 2580
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 2640
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tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1380
tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1440
caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1500
tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 1560
tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggta gagtatggta gcaatatcta gagtattgct 1620
accatactct acttttttcg agtagctaga gaattcatgg taatagcgat gactaatacg 1680
tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg 1740
ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt 1800
actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct 1860
attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc 1920
ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta 1980
tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag acccagcttt cttgtacaaa 2040
gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt 2100
caaaataaaa tcattatttg ccatccagct gatatcccct atagtgagtc gtattacatg 2160
gtcatagctg tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2220
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2280
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 2340
gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 2400
atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 2460
agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 2520
cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 2580
gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 2640
attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 2700
ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt 2760
ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 2820
aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 2880
tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 2940
gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 3000
tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 3060
aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg 3120
taacactggc agagcattac gctgacttga cgggacggcg caagctcatg accaaaatcc 3180
cttaacgtga gttacgcgtc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3240
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3300
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3360
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3420
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3480
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3540
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3600
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 3660
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3720
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3780
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3840
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgct 3888
<210> 48
<211> 1104
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> 菌株LT2天冬氨酸-半醛脱氢酶
(asd)
<400> 48
atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggaatggtcg gctctgttct catgcaacgc 60
atggtagagg agcgcgattt cgacgctatt cgccctgttt tcttttctac ctcccagttt 120
ggacaggcgg cgcccacctt cggcgacacc tccaccggca cgctacagga cgcttttgat 180
ctggatgcgc taaaagcgct cgatatcatc gtgacctgcc agggcggcga ttataccaac 240
gaaatttatc caaagctgcg cgaaagcgga tggcagggtt actggattga tgcggcttct 300
acgctgcgca tgaaagatga tgccattatt attctcgacc cggtcaacca ggacgtgatt 360
accgacggcc tgaacaatgg cgtgaagacc tttgtgggcg gtaactgtac cgttagcctg 420
atgttgatgt cgctgggcgg tctctttgcc cataatctcg ttgactgggt atccgtcgcg 480
acctatcagg ccgcctccgg cggcggcgcg cgccatatgc gcgagctgtt aacccagatg 540
ggtcagttgt atggccatgt cgccgatgaa ctggcgacgc cgtcttccgc aattcttgat 600
attgaacgca aagttacggc attgacccgc agcggcgagc tgccggttga taactttggc 660
gtaccgctgg cgggaagcct gatcccctgg atcgacaaac agctcgataa cggccagagc 720
cgcgaagagt ggaaaggcca ggcggaaacc aacaagattc tcaatactgc ctctgtgatt 780
ccggttgatg gtttgtgtgt gcgcgtcggc gcgctgcgct gtcacagcca ggcgttcacc 840
atcaagctga aaaaagaggt atccattccg acggtggaag aactgctggc ggcacataat 900
ccgtgggcga aagtggtgcc gaacgatcgt gatatcacta tgcgcgaatt aaccccggcg 960
gcggtgaccg gcacgttgac tacgccggtt ggtcgtctgc gtaagctgaa catggggcca 1020
gagttcttgt cggcgtttac cgtaggcgac cagttgttat ggggcgccgc cgagccgctg 1080
cgtcgaatgc tgcgccagtt ggcg 1104
<210> 49
<211> 861
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> 菌株 LT2 TSX
<400> 49
atgaaaaaaa ctttactcgc agtcagcgca gcgctggcgc tcacctcatc ttttactgct 60
aacgcagcag aaaatgatca gccgcagtat ttgtccgact ggtggcacca gagcgtaaac 120
gtggtaggca gctaccatac ccgtttctcg ccgaaattga acaacgacgt ctatctggaa 180
tatgaagcat ttgccaaaaa agactggttt gatttctacg gctatatcga tattcccaaa 240
acctttgatt ggggtaacgg caacgataaa ggtatctggt ccgacggttc tccgctgttc 300
atggaaatcg aaccgcgttt ctcaattgat aagctgaccg gcgcagacct gagcttcggc 360
ccgtttaaag agtggtattt cgccaacaac tacatctacg atatgggcga taacaaagcc 420
agccgccaga gcacgtggta tatgggtctg gggaccgata tcgacaccgg cctgccgatg 480
ggtctgtcgc tgaacgtgta tgcgaaatat cagtggcaaa actacggcgc gtccaatgaa 540
aacgaatggg acggctaccg tttcaaagtg aaatacttcg tccccatcac cgatctgtgg 600
ggcggtaaac tgagctatat cggctttacc aactttgact ggggatctga tttaggcgac 660
gatccgaacc gtaccagcaa ctccatcgct tccagccata tcctggcgct gaactacgat 720
cactggcact actcggtcgt tgcgcgttac ttccataacg gcggacagtg gcagaatggc 780
gcaaaactga actggggcga cggcgatttc agcgcgaaat ctaccggctg gggcggctac 840
ctggtcgtgg gttacaactt c 861
<210> 50
<211> 864
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)
<400> 50
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600
ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660
gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720
tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780
tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840
gatggacact gctcttggcc cctc 864
<210> 51
<211> 933
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 程序性细胞死亡蛋白2 (PD-2), 同种型1
<400> 51
atggctgccg ccggggccag gcctgtggag ctgggcttcg ccgagtcggc gccggcgtgg 60
cgactgcgca gcgagcagtt ccccagcaag gtgtatgcgc cgctgcctgg ccgcccggac 120
gccttccacc gctgcatctt cctcttctgc tgccgcgagc agccgtgctg tgccggcctg 180
cgagttttta ggaatcaact acccaggaaa aacgattttt actcatatga gccaccttct 240
gagaatcctc ccccagaaac aggagaatca gtgtgtctcc agcttaagtc tggtgctcat 300
ctctgcaggg tttgtggctg tttaggcccc aaaacgtgct ccagatgcca caaagcatat 360
tactgcagca aggagcatca gaccctagac tggagattgg gacataagca ggcttgtgca 420
caaccagatc atctggacca tataattcca gaccacaact tcctttttcc agaatttgaa 480
attgtaatag aaacagaaga tgagattatg cctgaggttg tggaaaagga agattactca 540
gagattatag ggagcatggg tgaagcactt gaggaagaac tggattccat ggcaaaacat 600
gaatccaggg aagataaaat ttttcagaag tttaaaactc agatagccct tgaaccagaa 660
cagattctta gatatggcag aggtattgcc cccatctgga tttctggtga aaatattcct 720
caagaaaagg atattccaga ttgcccctgt ggtgccaaga gaatattgga attccaggtc 780
atgcctcagc tcctaaacta cctgaaggct gacagactgg gcaagagcat tgactggggc 840
atcctggctg tcttcacctg tgctgagagc tgcagcttgg gtactggcta tacagaagaa 900
tttgtgtgga agcaggatgt aacagataca ccg 933
<210> 52
<211> 819
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 程序性死亡配体2 (PD-L2), 同种型1
<400> 52
atgatcttcc tcctgctaat gttgagcctg gaattgcagc ttcaccagat agcagcttta 60
ttcacagtga cagtccctaa ggaactgtac ataatagagc atggcagcaa tgtgaccctg 120
gaatgcaact ttgacactgg aagtcatgtg aaccttggag caataacagc cagtttgcaa 180
aaggtggaaa atgatacatc cccacaccgt gaaagagcca ctttgctgga ggagcagctg 240
cccctaggga aggcctcgtt ccacatacct caagtccaag tgagggacga aggacagtac 300
caatgcataa tcatctatgg ggtcgcctgg gactacaagt acctgactct gaaagtcaaa 360
gcttcctaca ggaaaataaa cactcacatc ctaaaggttc cagaaacaga tgaggtagag 420
ctcacctgcc aggctacagg ttatcctctg gcagaagtat cctggccaaa cgtcagcgtt 480
cctgccaaca ccagccactc caggacccct gaaggcctct accaggtcac cagtgttctg 540
cgcctaaagc caccccctgg cagaaacttc agctgtgtgt tctggaatac tcacgtgagg 600
gaacttactt tggccagcat tgaccttcaa agtcagatgg aacccaggac ccatccaact 660
tggctgcttc acattttcat cccctcctgc atcattgctt tcattttcat agccacagtg 720
atagccctaa gaaaacaact ctgtcaaaag ctgtattctt caaaagacac aacaaaaaga 780
cctgtcacca caacaaagag ggaagtgaac agtgctatc 819
<210> 53
<211> 669
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4
(CTLA-4), 同种型1
<400> 53
atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctac caggacctgg 60
ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480
gacttcctcc tctggatcct tgcagcagtt agttcggggt tgttttttta tagctttctc 540
ctcacagctg tttctttgag caaaatgcta aagaaaagaa gccctcttac aacaggggtc 600
tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660
cccatcaat 669
<210> 54
<211> 969
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD47 转录物变体1
<400> 54
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420
gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480
ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540
gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600
gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660
atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720
atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780
gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840
gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 900
cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 960
aatgatgaa 969
<210> 55
<211> 1209
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)1
<400> 55
atggcacacg ctatggaaaa ctcctggaca atcagtaaag agtaccatat tgatgaagaa 60
gtgggctttg ctctgccaaa tccacaggaa aatctacctg atttttataa tgactggatg 120
ttcattgcta aacatctgcc tgatctcata gagtctggcc agcttcgaga aagagttgag 180
aagttaaaca tgctcagcat tgatcatctc acagaccaca agtcacagcg ccttgcacgt 240
ctagttctgg gatgcatcac catggcatat gtgtggggca aaggtcatgg agatgtccgt 300
aaggtcttgc caagaaatat tgctgttcct tactgccaac tctccaagaa actggaactg 360
cctcctattt tggtttatgc agactgtgtc ttggcaaact ggaagaaaaa ggatcctaat 420
aagcccctga cttatgagaa catggacgtt ttgttctcat ttcgtgatgg agactgcagt 480
aaaggattct tcctggtctc tctattggtg gaaatagcag ctgcttctgc aatcaaagta 540
attcctactg tattcaaggc aatgcaaatg caagaacggg acactttgct aaaggcgctg 600
ttggaaatag cttcttgctt ggagaaagcc cttcaagtgt ttcaccaaat ccacgatcat 660
gtgaacccaa aagcattttt cagtgttctt cgcatatatt tgtctggctg gaaaggcaac 720
ccccagctat cagacggtct ggtgtatgaa aggttctggg aagacccaaa ggagtttgca 780
gggggcagtg caggccaaag cagcgtcttt cagtgctttg acgtcctgct gggcatccag 840
cagactgctg gtggaggaca tgctgctcag ttcctccagg acatgagaag atatatgcca 900
ccagctcaca ggaacttcct gtgctcatta gagtcaaatc cctcagtccg tgagtttgtc 960
ctttcaaaag gtgatgctgg cctgcgggaa gcttatgacg cctgtgtgaa agctctggtc 1020
tccctgagga gctaccatct gcaaatcgtg actaagtaca tcctgattcc tgcaagccag 1080
cagccaaagg agaataagac ctctgaagac ccttcaaaac tggaagccaa aggaactgga 1140
ggcactgatt taatgaattt cctgaagact gtaagaagta caactgagaa atcccttttg 1200
aaggaaggt 1209
<210> 56
<211> 1260
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)2
<400> 56
atgttgcatt ttcattatta tgatacttca aacaaaataa tggagcccca cagaccgaat 60
gtgaagacag cagtgccatt gtctttggaa agctatcaca tatctgaaga gtatggcttt 120
cttcttccag attctctgaa agaacttcca gatcattata ggccttggat ggaaattgcc 180
aacaaacttc ctcaattgat tgatgctcac cagcttcaag ctcatgtgga caagatgccc 240
ctgctgagct gccagttcct gaagggtcac cgggagcagc gcctggccca cctggtcctg 300
agcttcctca ccatgggtta tgtctggcag gaaggagagg cgcagcctgc agaggtcctg 360
ccaaggaatc ttgcccttcc atttgtcgaa gtctccagga acttggggct ccctcctatc 420
ctggtccact cagacttggt gctgacgaac tggaccaaaa aagatccaga cggattcctg 480
gaaattggga acctggagac catcatctca tttcctgggg gagagagcct gcatggtttt 540
atactggtga ctgctttggt agagaaagaa gcagtgcctg ggataaaggc tcttgttcag 600
gccacgaatg ctatcttgca gcccaaccag gaggccctgc tccaagccct gcagcgactg 660
agactgtcta ttcaggacat caccaaaacc ttaggacaga tgcatgatta tgtagatcca 720
gacatatttt atgcaggcat ccggatcttt ctctctggat ggaaagacaa cccagcaatg 780
cctgcagggc tgatgtatga aggagtttcc caagagcccc tgaaatactc cggcgggagt 840
gcagctcaga gcacagtgct tcatgccttt gatgagttct taggcattcg tcatagcaag 900
gaaagtggtg actttctgta cagaatgagg gattacatgc ctccttccca taaggccttc 960
atagaagaca tccactcagc accttccctg agggactaca tcctgtcatc tggacaggac 1020
cacttgctga cagcttataa ccagtgtgtg caggccctgg cagagctgcg gagctatcac 1080
atcaccatgg tcaccaaata cctcatcaca gctgcagcca aggcaaagca tgggaagcca 1140
aaccatctcc cagggcctcc tcaggcttta aaagacaggg gcacaggtgg aaccgcagtt 1200
atgagctttc ttaagagtgt cagggataag accttggagt caatccttca cccacgtggt 1260
<210> 57
<211> 2310
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 信号转导和转录激活因子3
(STAT3)
<400> 57
atggcccaat ggaatcagct acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag 60
ctctacagtg acagcttccc aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt 120
caagattggg catatgcggc cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc 180
ctgggagaga ttgaccagca gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag 240
cacaatctac gaagaatcaa gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag 300
attgcccgga ttgtggcccg gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc 360
actgcggccc agcaaggggg ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag 420
cagcagatgc tggagcagca ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag 480
aaaatgaaag tggtagagaa tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag 540
agtcaaggag acatgcaaga tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg 600
cagcagctgg aacagatgct cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag 660
ctggcggggc ttttgtcagc gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg 720
gctgactgga agaggcggca acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta 780
gatcggctag aaaactggat aacgtcatta gcagaatctc aacttcagac ccgtcaacaa 840
attaagaaac tggaggagtt gcagcaaaaa gtttcctaca aaggggaccc cattgtacag 900
caccggccga tgctggagga gagaatcgtg gagctgttta gaaacttaat gaaaagtgcc 960
tttgtggtgg agcggcagcc ctgcatgccc atgcatcctg accggcccct cgtcatcaag 1020
accggcgtcc agttcactac taaagtcagg ttgctggtca aattccctga gttgaattat 1080
cagcttaaaa ttaaagtgtg cattgacaaa gactctgggg acgttgcagc tctcagagga 1140
tcccggaaat ttaacattct gggcacaaac acaaaagtga tgaacatgga agaatccaac 1200
aacggcagcc tctctgcaga attcaaacac ttgaccctga gggagcagag atgtgggaat 1260
gggggccgag ccaattgtga tgcttccctg attgtgactg aggagctgca cctgatcacc 1320
tttgagaccg aggtgtatca ccaaggcctc aagattgacc tagagaccca ctccttgcca 1380
gttgtggtga tctccaacat ctgtcagatg ccaaatgcct gggcgtccat cctgtggtac 1440
aacatgctga ccaacaatcc caagaatgta aactttttta ccaagccccc aattggaacc 1500
tgggatcaag tggccgaggt cctgagctgg cagttctcct ccaccaccaa gcgaggactg 1560
agcatcgagc agctgactac actggcagag aaactcttgg gacctggtgt gaattattca 1620
gggtgtcaga tcacatgggc taaattttgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc 1680
ttctgggtct ggctggacaa tatcattgac cttgtgaaaa agtacatcct ggccctttgg 1740
aacgaagggt acatcatggg ctttatcagt aaggagcggg agcgggccat cttgagcact 1800
aagcctccag gcaccttcct gctaagattc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact 1860
ttcacttggg tggagaagga catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac 1920
acaaagcagc agctgaacaa catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg 1980
gatgctacca atatcctggt gtctccactg gtctatctct atcctgacat tcccaaggag 2040
gaggcattcg gaaagtattg tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt 2100
agcgctgccc catacctgaa gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac ctgcagcaat 2160
accattgacc tgccgatgtc cccccgcact ttagattcat tgatgcagtt tggaaataat 2220
ggtgaaggtg ctgaaccctc agcaggaggg cagtttgagt ccctcacctt tgacatggag 2280
ttgacctcgg agtgcgctac ctcccccatg 2310
<210> 58
<211> 1575
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 淋巴细胞激活基因3(LAG3)
<400> 58
atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctttgggt ggctccagtg 60
aagcctctcc agccaggggc tgaggtcccg gtggtgtggg cccaggaggg ggctcctgcc 120
cagctcccct gcagccccac aatccccctc caggatctca gccttctgcg aagagcaggg 180
gtcacttggc agcatcagcc agacagtggc ccgcccgctg ccgcccccgg ccatcccctg 240
gcccccggcc ctcacccggc ggcgccctcc tcctgggggc ccaggccccg ccgctacacg 300
gtgctgagcg tgggtcccgg aggcctgcgc agcgggaggc tgcccctgca gccccgcgtc 360
cagctggatg agcgcggccg gcagcgcggg gacttctcgc tatggctgcg cccagcccgg 420
cgcgcggacg ccggcgagta ccgcgccgcg gtgcacctca gggaccgcgc cctctcctgc 480
cgcctccgtc tgcgcctggg ccaggcctcg atgactgcca gccccccagg atctctcaga 540
gcctccgact gggtcatttt gaactgctcc ttcagccgcc ctgaccgccc agcctctgtg 600
cattggttcc ggaaccgggg ccagggccga gtccctgtcc gggagtcccc ccatcaccac 660
ttagcggaaa gcttcctctt cctgccccaa gtcagcccca tggactctgg gccctggggc 720
tgcatcctca cctacagaga tggcttcaac gtctccatca tgtataacct cactgttctg 780
ggtctggagc ccccaactcc cttgacagtg tacgctggag caggttccag ggtggggctg 840
ccctgccgcc tgcctgctgg tgtggggacc cggtctttcc tcactgccaa gtggactcct 900
cctgggggag gccctgacct cctggtgact ggagacaatg gcgactttac ccttcgacta 960
gaggatgtga gccaggccca ggctgggacc tacacctgcc atatccatct gcaggaacag 1020
cagctcaatg ccactgtcac attggcaatc atcacagtga ctcccaaatc ctttgggtca 1080
cctggatccc tggggaagct gctttgtgag gtgactccag tatctggaca agaacgcttt 1140
gtgtggagct ctctggacac cccatcccag aggagtttct caggaccttg gctggaggca 1200
caggaggccc agctcctttc ccagccttgg caatgccagc tgtaccaggg ggagaggctt 1260
cttggagcag cagtgtactt cacagagctg tctagcccag gtgcccaacg ctctgggaga 1320
gccccaggtg ccctcccagc aggccacctc ctgctgtttc tcatccttgg tgtcctttct 1380
ctgctccttt tggtgactgg agcctttggc tttcaccttt ggagaagaca gtggcgacca 1440
agacgatttt ctgccttaga gcaagggatt caccctccgc aggctcagag caagatagag 1500
gagctggagc aagaaccgga gccggagccg gagccggaac cggagcccga gcccgagccc 1560
gagccggagc agctc 1575
<210> 59
<211> 903
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域-3 (TIM-3)
<400> 59
atgttttcac atcttccctt tgactgtgtc ctgctgctgc tgctgctact acttacaagg 60
tcctcagaag tggaatacag agcggaggtc ggtcagaatg cctatctgcc ctgcttctac 120
accccagccg ccccagggaa cctcgtgccc gtctgctggg gcaaaggagc ctgtcctgtg 180
tttgaatgtg gcaacgtggt gctcaggact gatgaaaggg atgtgaatta ttggacatcc 240
agatactggc taaatgggga tttccgcaaa ggagatgtgt ccctgaccat agagaatgtg 300
actctagcag acagtgggat ctactgctgc cggatccaaa tcccaggcat aatgaatgat 360
gaaaaattta acctgaagtt ggtcatcaaa ccagccaagg tcacccctgc accgactcgg 420
cagagagact tcactgcagc ctttccaagg atgcttacca ccaggggaca tggcccagca 480
gagacacaga cactggggag cctccctgat ataaatctaa cacaaatatc cacattggcc 540
aatgagttac gggactctag attggccaat gacttacggg actctggagc aaccatcaga 600
ataggcatct acatcggagc agggatctgt gctgggctgg ctctggctct tatcttcggc 660
gctttaattt tcaaatggta ttctcatagc aaagagaaga tacagaattt aagcctcatc 720
tctttggcca acctccctcc ctcaggattg gcaaatgcag tagcagaggg aattcgctca 780
gaagaaaaca tctataccat tgaagagaac gtatatgaag tggaggagcc caatgagtat 840
tattgctatg tcagcagcag gcagcaaccc tcacaacctt tgggttgtcg ctttgcaatg 900
cca 903
<210> 60
<211> 732
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT), 同种型1
<400> 60
atgcgctggt gtctcctcct gatctgggcc caggggctga ggcaggctcc cctcgcctca 60
ggaatgatga caggcacaat agaaacaacg gggaacattt ctgcagagaa aggtggctct 120
atcatcttac aatgtcacct ctcctccacc acggcacaag tgacccaggt caactgggag 180
cagcaggacc agcttctggc catttgtaat gctgacttgg ggtggcacat ctccccatcc 240
ttcaaggatc gagtggcccc aggtcccggc ctgggcctca ccctccagtc gctgaccgtg 300
aacgatacag gggagtactt ctgcatctat cacacctacc ctgatgggac gtacactggg 360
agaatcttcc tggaggtcct agaaagctca gtggctgagc acggtgccag gttccagatt 420
ccattgcttg gagccatggc cgcgacgctg gtggtcatct gcacagcagt catcgtggtg 480
gtcgcgttga ctagaaagaa gaaagccctc agaatccatt ctgtggaagg tgacctcagg 540
agaaaatcag ctggacagga ggaatggagc cccagtgctc cctcaccccc aggaagctgt 600
gtccaggcag aagctgcacc tgctgggctc tgtggagagc agcggggaga ggactgtgcc 660
gagctgcatg actacttcaa tgtcctgagt tacagaagcc tgggtaactg cagcttcttc 720
acagagactg gt 732
<210> 61
<211> 1065
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> GALECTIN-9/LGALS9, 同种型1
<400> 61
atggccttca gcggttccca ggctccctac ctgagtccag ctgtcccctt ttctgggact 60
attcaaggag gtctccagga cggacttcag atcactgtca atgggaccgt tctcagctcc 120
agtggaacca ggtttgctgt gaactttcag actggcttca gtggaaatga cattgccttc 180
cacttcaacc ctcggtttga agatggaggg tacgtggtgt gcaacacgag gcagaacgga 240
agctgggggc ccgaggagag gaagacacac atgcctttcc agaaggggat gccctttgac 300
ctctgcttcc tggtgcagag ctcagatttc aaggtgatgg tgaacgggat cctcttcgtg 360
cagtacttcc accgcgtgcc cttccaccgt gtggacacca tctccgtcaa tggctctgtg 420
cagctgtcct acatcagctt ccagaacccc cgcacagtcc ctgttcagcc tgccttctcc 480
acggtgccgt tctcccagcc tgtctgtttc ccacccaggc ccagggggcg cagacaaaaa 540
cctcccggcg tgtggcctgc caacccggct cccattaccc agacagtcat ccacacagtg 600
cagagcgccc ctggacagat gttctctact cccgccatcc cacctatgat gtacccccac 660
cccgcctatc cgatgccttt catcaccacc attctgggag ggctgtaccc atccaagtcc 720
atcctcctgt caggcactgt cctgcccagt gctcagaggt tccacatcaa cctgtgctct 780
gggaaccaca tcgccttcca cctgaacccc cgttttgatg agaatgctgt ggtccgcaac 840
acccagatcg acaactcctg ggggtctgag gagcgaagtc tgccccgaaa aatgcccttc 900
gtccgtggcc agagcttctc agtgtggatc ttgtgtgaag ctcactgcct caaggtggcc 960
gtggatggtc agcacctgtt tgaatactac catcgcctga ggaacctgcc caccatcaac 1020
agactggaag tggggggcga catccagctg acccatgtgc agaca 1065
<210> 62
<211> 720
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> LIGHT/TNSF14
<400> 62
atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca 60
ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggtgggtctg 120
ggtctcttgc tgttgctgat gggggccggg ctggccgtcc aaggctggtt cctcctgcag 180
ctgcactggc gtctaggaga gatggtcacc cgcctgcctg acggacctgc aggctcctgg 240
gagcagctga tacaagagcg aaggtctcac gaggtcaacc cagcagcgca tctcacaggg 300
gccaactcca gcttgaccgg cagcgggggg ccgctgttat gggagactca gctgggcctg 360
gccttcctga ggggcctcag ctaccacgat ggggcccttg tggtcaccaa agctggctac 420
tactacatct actccaaggt gcagctgggc ggtgtgggct gcccgctggg cctggccagc 480
accatcaccc acggcctcta caagcgcaca ccccgctacc ccgaggagct ggagctgttg 540
gtcagccagc agtcaccctg cggacgggcc accagcagct cccgggtctg gtgggacagc 600
agcttcctgg gtggtgtggt acacctggag gctggggaga aggtggtcgt ccgtgtgctg 660
gatgaacgcc tggttcgact gcgtgatggt acccggtctt acttcggggc tttcatggtg 720
<210> 63
<211> 849
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> HVEM/TNSFR14 (LIGHT配体的受体)
<400> 63
atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc 60
ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 120
tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 180
tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 240
ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300
ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360
tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 420
tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc 480
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag 540
caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac 600
tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc 660
ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc 720
gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc 780
cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc 840
ccaaaccac 849
<210> 64
<211> 660
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD28
<400> 64
atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60
attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120
aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180
agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240
aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300
aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360
ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 420
tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 480
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 540
agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 600
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 660
<210> 65
<211> 1578
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 癌胚抗原相关细胞粘附分子1 (CEACAM1, 或CD66a)
<400> 65
atggggcacc tctcagcccc acttcacaga gtgcgtgtac cctggcaggg gcttctgctc 60
acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg cccagctcac tactgaatcc 120
atgccattca atgttgcaga ggggaaggag gttcttctcc ttgtccacaa tctgccccag 180
caactttttg gctacagctg gtacaaaggg gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattgta 240
ggatatgcaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg caaacagcgg tcgagagaca 300
atatacccca atgcatccct gctgatccag aacgtcaccc agaatgacac aggattctac 360
accctacaag tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggaca gttccatgta 420
tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccctgt ggaggacaag 480
gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggaca caacctacct gtggtggata 540
aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600
actctactca gtgtcacaag gaatgacaca ggaccctatg agtgtgaaat acagaaccca 660
gtgagtgcga accgcagtga cccagtcacc ttgaatgtca cctatggccc ggacaccccc 720
accatttccc cttcagacac ctattaccgt ccaggggcaa acctcagcct ctcctgctat 780
gcagcctcta acccacctgc acagtactcc tggcttatca atggaacatt ccagcaaagc 840
acacaagagc tctttatccc taacatcact gtgaataata gtggatccta tacctgccac 900
gccaataact cagtcactgg ctgcaacagg accacagtca agacgatcat agtcactgag 960
ctaagtccag tagtagcaaa gccccaaatc aaagccagca agaccacagt cacaggagat 1020
aaggactctg tgaacctgac ctgctccaca aatgacactg gaatctccat ccgttggttc 1080
ttcaaaaacc agagtctccc gtcctcggag aggatgaagc tgtcccaggg caacaccacc 1140
ctcagcataa accctgtcaa gagggaggat gctgggacgt attggtgtga ggtcttcaac 1200
ccaatcagta agaaccaaag cgaccccatc atgctgaacg taaactataa tgctctacca 1260
caagaaaatg gcctctcacc tggggccatt gctggcattg tgattggagt agtggccctg 1320
gttgctctga tagcagtagc cctggcatgt tttctgcatt tcgggaagac cggcagggca 1380
agcgaccagc gtgatctcac agagcacaaa ccctcagtct ccaaccacac tcaggaccac 1440
tccaatgacc cacctaacaa gatgaatgaa gttacttatt ctaccctgaa ctttgaagcc 1500
cagcaaccca cacaaccaac ttcagcctcc ccatccctaa cagccacaga aataatttat 1560
tcagaagtaa aaaagcag 1578
<210> 66
<211> 864
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD80/B7-1
<400> 66
atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60
cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120
gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180
caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240
atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300
attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360
tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420
gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480
atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540
gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600
agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660
ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720
gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780
tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840
agaagggaaa gtgtacgccc tgta 864
<210> 67
<211> 995
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD86/B7-2
<400> 67
cagccaaaat ggatccccag tgcactatgg gactgagtaa cattctcttt gtgatggcct 60
tcctgctctc tggtgctgct cctctgaaga ttcaagctta tttcaatgag actgcagacc 120
tgccatgcca atttgcaaac tctcaaaacc aaagcctgag tgagctagta gtattttggc 180
aggaccagga aaacttggtt ctgaatgagg tatacttagg caaagagaaa tttgacagtg 240
ttcattccaa gtatatgggc cgcacaagtt ttgattcgga cagttggacc ctgagacttc 300
acaatcttca gatcaaggac aagggcttgt atcaatgtat catccatcac aaaaagccca 360
caggaatgat tcgcatccac cagatgaatt ctgaactgtc agtgcttgct aacttcagtc 420
aacctgaaat agtaccaatt tctaatataa cagaaaatgt gtacataaat ttgacctgct 480
catctataca cggttaccca gaacctaaga agatgagtgt tttgctaaga accaagaatt 540
caactatcga gtatgatggt attatgcaga aatctcaaga taatgtcaca gaactgtacg 600
acgtttccat cagcttgtct gtttcattcc ctgatgttac gagcaatatg accatcttct 660
gtattctgga aactgacaag acgcggcttt tatcttcacc tttctctata gagcttgagg 720
accctcagcc tcccccagac cacattcctt ggattacagc tgtacttcca acagttatta 780
tatgtgtgat ggttttctgt ctaattctat ggaaatggaa gaagaagaag cggcctcgca 840
actcttataa atgtggaacc aacacaatgg agagggaaga gagtgaacag accaagaaaa 900
gagaaaaaat ccatatacct gaaagatctg atgaagccca gcgtgttttt aaaagttcga 960
agacatcttc atgcgacaaa agtgatacat gtttt 995
<210> 68
<211> 1095
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD244/2B4
<400> 68
atgctggggc aagtggtcac cctcatactc ctcctgctcc tcaaggtgta tcagggcaaa 60
ggatgccagg gatcagctga ccatgtggtt agcatctcgg gagtgcctct tcagttacaa 120
ccaaacagca tacagacgaa ggttgacagc attgcatgga agaagttgct gccctcacaa 180
aatggatttc atcacatatt gaagtgggag aatggctctt tgccttccaa tacttccaat 240
gatagattca gttttatagt caagaacttg agtcttctca tcaaggcagc tcagcagcag 300
gacagtggcc tctactgcct ggaggtcacc agtatatctg gaaaagttca gacagccacg 360
ttccaggttt ttgtatttga taaagttgag aaaccccgcc tacaggggca ggggaagatc 420
ctggacagag ggagatgcca agtggctctg tcttgcttgg tctccaggga tggcaatgtg 480
tcctatgctt ggtacagagg gagcaagctg atccagacag cagggaacct cacctacctg 540
gacgaggagg ttgacattaa tggcactcac acatatacct gcaatgtcag caatcctgtt 600
agctgggaaa gccacaccct gaatctcact caggactgtc agaatgccca tcaggaattc 660
agattttggc cgtttttggt gatcatcgtg attctaagcg cactgttcct tggcaccctt 720
gcctgcttct gtgtgtggag gagaaagagg aaggagaagc agtcagagac cagtcccaag 780
gaatttttga caatttacga agatgtcaag gatctgaaaa ccaggagaaa tcacgagcag 840
gagcagactt ttcctggagg ggggagcacc atctactcta tgatccagtc ccagtcttct 900
gctcccacgt cacaagaacc tgcatataca ttatattcat taattcagcc ttccaggaag 960
tctggatcca ggaagaggaa ccacagccct tccttcaata gcactatcta tgaagtgatt 1020
ggaaagagtc aacctaaagc ccagaaccct gctcgattga gccgcaaaga gctggagaac 1080
tttgatgttt attcc 1095
<210> 69
<211> 1251
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD155/PVR
<400> 69
atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60
tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120
ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180
gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240
acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300
gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360
tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420
gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480
gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540
tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600
actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660
tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720
tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780
gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840
acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900
cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960
cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020
tcccgtaacg ccatcatctt cctggttctg ggaatcctgg tttttctgat cctgctgggg 1080
atcgggattt atttctattg gtccaaatgt tcccgtgagg tcctttggca ctgtcatctg 1140
tgtccctcga gtacagagca tgccagcgcc tcagctaatg ggcatgtctc ctattcagct 1200
gtgagcagag agaacagctc ttcccaggat ccacagacag agggcacaag g 1251
<210> 70
<211> 1614
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD122/结合素-2
<400> 70
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180
cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300
gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360
caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc 420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc 480
aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg 540
gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg 600
gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc 660
agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg 720
gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct 780
cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc 840
ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca 900
ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacaggcggc 1080
atcatcgggg gcatcatcgc cgccatcatt gctactgctg tggctgccac gggcatcctt 1140
atctgccggc agcagcggaa ggagcagacg ctgcaggggg cagaggagga cgaagacctg 1200
gagggacctc cctcctacaa gccaccgacc ccaaaagcga agctggaggc acaggagatg 1260
ccctcccagc tcttcactct gggggcctcg gagcacagcc cactcaagac cccctacttt 1320
gatgctggcg cctcatgcac tgagcaggaa atgcctcgat accatgagct gcccaccttg 1380
gaagaacggt caggaccctt gcaccctgga gccacaagcc tggggtcccc catcccggtg 1440
cctccagggc cacctgctgt ggaagacgtt tccctggatc tagaggatga ggagggggag 1500
gaggaggaag agtatctgga caagatcaac cccatctatg atgctctgtc ctatagcagc 1560
ccctctgatt cctaccaggg caaaggcttt gtcatgtccc gggccatgta tgtg 1614
<210> 71
<211> 1008
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD226 抗原
<400> 71
atggattatc ctactttact tttggctctt cttcatgtat acagagctct atgtgaagag 60
gtgctttggc atacatcagt tccctttgcc gagaacatgt ctctagaatg tgtgtatcca 120
tcaatgggca tcttaacaca ggtggagtgg ttcaagatcg ggacccagca ggattccata 180
gccattttca gccctactca tggcatggtc ataaggaagc cctatgctga gagggtttac 240
tttttgaatt caacgatggc ttccaataac atgactcttt tctttcggaa tgcctctgaa 300
gatgatgttg gctactattc ctgctctctt tacacttacc cacagggaac ttggcagaag 360
gtgatacagg tggttcagtc agatagtttt gaggcagctg tgccatcaaa tagccacatt 420
gtttcggaac ctggaaagaa tgtcacactc acttgtcagc ctcagatgac gtggcctgtg 480
caggcagtga ggtgggaaaa gatccagccc cgtcagatcg acctcttaac ttactgcaac 540
ttggtccatg gcagaaattt cacctccaag ttcccaagac aaatagtgag caactgcagc 600
cacggaaggt ggagcgtcat cgtcatcccc gatgtcacag tctcagactc ggggctttac 660
cgctgctact tgcaggccag cgcaggagaa aacgaaacct tcgtgatgag attgactgta 720
gccgagggta aaaccgataa ccaatatacc ctctttgtgg ctggagggac agttttattg 780
ttgttgtttg ttatctcaat taccaccatc attgtcattt tccttaacag aaggagaagg 840
agagagagaa gagatctatt tacagagtcc tgggatacac agaaggcacc caataactat 900
agaagtccca tctctaccag tcaacctacc aatcaatcca tggatgatac aagagaggat 960
atttatgtca actatccaac cttctctcgc agaccaaaga ctagagtt 1008
<210> 72
<211> 545
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD160 抗原
<400> 72
ggatgctgtt ggaacccggc agaggctgct gtgccctggc catcctgctg gcaattgtgg 60
acatccagtc tggtggatgc attaacatca ccagctcagc ttcccaggaa ggaacgcgac 120
taaacttaat ctgtactgta tggcataaga aagaagaggc tgaggggttt gtagtgtttt 180
tgtgcaagga caggtctgga gactgttctc ctgagaccag tttaaaacag ctgagactta 240
aaagggatcc tgggatagat ggtgttggtg aaatatcatc tcagttgatg ttcaccataa 300
gccaagtcac accgttgcac agtgggacct accagtgttg tgccagaagc cagaagtcag 360
gtatccgcct tcagggccat tttttctcca ttctattcac agagacaggg aactacacag 420
tgacgggatt gaaacaaaga caacaccttg agttcagcca taatgaaggc actctcagtt 480
caggcttcct acaagaaaag gtctgggtaa tgctggtcac cagccttgtg gcccttcaag 540
ctttg 545
<210> 73
<211> 264
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人U6 RNA Pol III 启动子
<400> 73
aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60
aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120
aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180
aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240
atcttgtgga aaggacgaaa ctag 264
<210> 74
<211> 99
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人H1 RNA Pol III 启动子
<400> 74
atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60
tgggaatctt ataagttctg tatgagacca ctccctagg 99
<210> 75
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向muPD-L1的shRNA-编码序列
<400> 75
ccggccgaaa tgatacacaa ttcgactcga gtcgaattgt gtatcatttc ggtttttg 58
<210> 76
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向muSIRPA的shRNA-编码序列
<400> 76
ccggccacaa ctggaatgtc ttcatctcga gatgaagaca ttccagttgt ggttttt 57
<210> 77
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向muTREX1的shRNA-编码序列, 克隆1
<400> 77
ccggacaacc aacctaaggc cacatctcga gatgtggcct taggttggtt gttttttg 58
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向muTREX1的shRNA-编码序列, 克隆2
<400> 78
ccggcctaga tggtaccttc tgtgtctcga gacacagaag gtaccatcta ggtttttg 58
<210> 79
<211> 3966
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体1-人shTREX1-1_shPDL1-1
<400> 79
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac 600
catatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat 660
ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actccctagg cagcgcatgg gcgtcaattc 720
tagagattga cgcccatgcg ctgctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc 780
ggccgcaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 840
agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 900
cctcaggtct gcccgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg 960
aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt 1020
ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc 1080
ccaagttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 1140
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1200
tgtatcttat catgtctgga tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc 1260
cttcatattt gcatatacga tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg 1320
taaacacaaa gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt 1380
ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt 1440
atttcgattt cttggcttta tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggta gagtatggta 1500
gcaatatcta gagtattgct accatactct acttttttcg agtagctaga gaattcatgg 1560
taatagcgat gactaatacg tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt 1620
actgggcata atgccaggcg ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg 1680
gcatatgata cacttgatgt actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt 1740
gacgtcaatg gaaagtccct attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca 1800
atgggcgggg gtcgttgggc ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc 1860
ggaactccat atatgggcta tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag 1920
ccatccagct gatatcccat ggtcatagct gtttcctggc agctctggcc cgtgtctcaa 1980
aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct 2040
gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc 2100
ggaatggtcg gctctgttct catgcaacgc atggtagagg agcgcgattt cgacgctatt 2160
cgccctgttt tcttttctac ctcccagttt ggacaggcgg cgcccacctt cggcgacacc 2220
tccaccggca cgctacagga cgcttttgat ctggatgcgc taaaagcgct cgatatcatc 2280
gtgacctgcc agggcggcga ttataccaac gaaatttatc caaagctgcg cgaaagcgga 2340
tggcagggtt actggattga tgcggcttct acgctgcgca tgaaagatga tgccattatt 2400
attctcgacc cggtcaacca ggacgtgatt accgacggcc tgaacaatgg cgtgaagacc 2460
tttgtgggcg gtaactgtac cgttagcctg atgttgatgt cgctgggcgg tctctttgcc 2520
cataatctcg ttgactgggt atccgtcgcg acctatcagg ccgcctccgg cggcggcgcg 2580
cgccatatgc gcgagctgtt aacccagatg ggtcagttgt atggccatgt cgccgatgaa 2640
ctggcgacgc cgtcttccgc aattcttgat attgaacgca aagttacggc attgacccgc 2700
agcggcgagc tgccggttga taactttggc gtaccgctgg cgggaagcct gatcccctgg 2760
atcgacaaac agctcgataa cggccagagc cgcgaagagt ggaaaggcca ggcggaaacc 2820
aacaagattc tcaatactgc ctctgtgatt ccggttgatg gtttgtgtgt gcgcgtcggc 2880
gcgctgcgct gtcacagcca ggcgttcacc atcaagctga aaaaagaggt atccattccg 2940
acggtggaag aactgctggc ggcacataat ccgtgggcga aagtggtgcc gaacgatcgt 3000
gatatcacta tgcgcgaatt aaccccggcg gcggtgaccg gcacgttgac tacgccggtt 3060
ggtcgtctgc gtaagctgaa catggggcca gagttcttgt cggcgtttac cgtaggcgac 3120
cagttgttat ggggcgccgc cgagccgctg cgtcgaatgc tgcgccagtt ggcgtagtca 3180
gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcgca 3240
agctcatgac caaaatccct taacgtgagt tacgcgtcgt tccactgagc gtcagacccc 3300
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3360
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3420
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3480
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3540
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3600
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3660
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 3720
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3780
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3840
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3900
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3960
tttgct 3966
<210> 80
<211> 3972
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体2-小鼠 shTREX1-1_shPDL1-1
<400> 80
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac 600
catatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat 660
ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actccctaga caaccaacct aaggccacat 720
ctcgagatgt ggccttaggt tggttgtttt tttcgacaga tctggcgcgc catagtggcc 780
agcggccgca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 840
tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 900
cttcctcagg tctgcccggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc 960
tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt 1020
tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg 1080
ggcccaagtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 1140
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 1200
caatgtatct tatcatgtct ggatccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga 1260
ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga 1320
ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt 1380
agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa 1440
agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaactag ccgaaatgat 1500
acacaattcg actcgagtcg aattgtgtat catttcggtt ttttcgagta gctagagaat 1560
tcatggtaat agcgatgact aatacgtaga tgtactgcca agtaggaaag tcccataagg 1620
tcatgtactg ggcataatgc caggcgggcc atttaccgtc attgacgtca atagggggcg 1680
tacttggcat atgatacact tgatgtactg ccaagtgggc agtttaccgt aaatagtcca 1740
cccattgacg tcaatggaaa gtccctattg gcgttactat gggaacatac gtcattattg 1800
acgtcaatgg gcgggggtcg ttgggcggtc agccaggcgg gccatttacc gtaagttatg 1860
taacgcggaa ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc cgtaattgat tactattaat 1920
aactagccat ccagctgata tcccatggtc atagctgttt cctggcagct ctggcccgtg 1980
tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa 2040
ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga aaaatgttgg ttttatcggc 2100
tggcgcggaa tggtcggctc tgttctcatg caacgcatgg tagaggagcg cgatttcgac 2160
gctattcgcc ctgttttctt ttctacctcc cagtttggac aggcggcgcc caccttcggc 2220
gacacctcca ccggcacgct acaggacgct tttgatctgg atgcgctaaa agcgctcgat 2280
atcatcgtga cctgccaggg cggcgattat accaacgaaa tttatccaaa gctgcgcgaa 2340
agcggatggc agggttactg gattgatgcg gcttctacgc tgcgcatgaa agatgatgcc 2400
attattattc tcgacccggt caaccaggac gtgattaccg acggcctgaa caatggcgtg 2460
aagacctttg tgggcggtaa ctgtaccgtt agcctgatgt tgatgtcgct gggcggtctc 2520
tttgcccata atctcgttga ctgggtatcc gtcgcgacct atcaggccgc ctccggcggc 2580
ggcgcgcgcc atatgcgcga gctgttaacc cagatgggtc agttgtatgg ccatgtcgcc 2640
gatgaactgg cgacgccgtc ttccgcaatt cttgatattg aacgcaaagt tacggcattg 2700
acccgcagcg gcgagctgcc ggttgataac tttggcgtac cgctggcggg aagcctgatc 2760
ccctggatcg acaaacagct cgataacggc cagagccgcg aagagtggaa aggccaggcg 2820
gaaaccaaca agattctcaa tactgcctct gtgattccgg ttgatggttt gtgtgtgcgc 2880
gtcggcgcgc tgcgctgtca cagccaggcg ttcaccatca agctgaaaaa agaggtatcc 2940
attccgacgg tggaagaact gctggcggca cataatccgt gggcgaaagt ggtgccgaac 3000
gatcgtgata tcactatgcg cgaattaacc ccggcggcgg tgaccggcac gttgactacg 3060
ccggttggtc gtctgcgtaa gctgaacatg gggccagagt tcttgtcggc gtttaccgta 3120
ggcgaccagt tgttatgggg cgccgccgag ccgctgcgtc gaatgctgcg ccagttggcg 3180
tagtcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 3240
ggcgcaagct catgaccaaa atcccttaac gtgagttacg cgtcgttcca ctgagcgtca 3300
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 3360
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 3420
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 3480
ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 3540
gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 3600
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 3660
tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 3720
cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 3780
agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 3840
agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 3900
gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 3960
tggccttttg ct 3972
<210> 81
<211> 1281
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> aroA
<400> 81
atggaatccc tgacgttaca acccatcgcg cgggtcgatg gcgccattaa tttacctggc 60
tccaaaagtg tttcaaaccg tgctttgctc ctggcggctt tagcttgtgg taaaaccgct 120
ctgacgaatc tgctggatag cgatgacgtc cgccatatgc tcaatgccct gagcgcgttg 180
gggatcaatt acaccctttc tgccgatcgc acccgctgtg atatcacggg taatggcggc 240
gcattacgtg cgccaggcgc tctggaactg tttctcggta atgccggaac cgcgatgcgt 300
ccgttagcgg cagcgctatg tctggggcaa aatgagatag tgttaaccgg cgaaccgcgt 360
atgaaagagc gtccgatagg ccatctggtc gattcgctgc gtcagggcgg ggcgaatatt 420
gattacctgg agcaggaaaa ctatccgccc ctgcgtctgc gcggcggttt taccggcggc 480
gacattgagg ttgatggtag cgtttccagc cagttcctga ccgctctgct gatgacggcg 540
ccgctggccc ctaaagacac aattattcgc gttaaaggcg aactggtatc aaaaccttac 600
atcgatatca cgctaaattt aatgaaaacc tttggcgtgg agatagcgaa ccaccactac 660
caacaatttg tcgtgaaggg aggtcaacag tatcactctc caggtcgcta tctggtcgag 720
ggcgatgcct cgtcagcgtc ctattttctc gccgctgggg cgataaaagg cggcacggta 780
aaagtgaccg gaattggccg caaaagtatg cagggcgata ttcgttttgc cgatgtgctg 840
gagaaaatgg gcgcgaccat tacctggggc gatgatttta ttgcctgcac gcgcggtgaa 900
ttgcacgcca tagatatgga tatgaaccat attccggatg cggcgatgac gattgccacc 960
acggcgctgt ttgcgaaagg aaccacgacg ttgcgcaata tttataactg gcgagtgaaa 1020
gaaaccgatc gcctgttcgc gatggcgacc gagctacgta aagtgggcgc tgaagtcgaa 1080
gaagggcacg actatattcg tatcacgccg ccggcgaagc tccaacacgc ggatattggc 1140
acgtacaacg accaccgtat ggcgatgtgc ttctcactgg tcgcactgtc cgatacgcca 1200
gttacgatcc tggaccctaa atgtaccgca aaaacgttcc ctgattattt cgaacaactg 1260
gcgcgaatga gtacgcctgc c 1281
<210> 82
<211> 1094
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> aroC
<400> 82
acggagccgt gatggcagga aacacaattg gacaactctt tcgcgtaacc actttcggcg 60
aatcacacgg gctggcgctt gggtgtatcg tcgatggcgt gccgcccggc atcccgttga 120
cggaggccga tctgcaacac gatctcgaca gacgccgccc cggcacctcg cgctatacta 180
cccagcgccg cgaaccggac caggtaaaaa ttctctccgg cgtgtttgat ggcgtgacga 240
ccggcaccag cattggccta ctgattgaaa acaccgatca gcgctcgcag gactacagcg 300
cgattaaaga tgtttttcgt ccgggacacg cggattacac ctatgagcag aaatacggcc 360
tgcgcgatta ccgtggcggt ggacgttctt ccgcgcgtga aaccgcgatg cgcgtagcgg 420
caggggcgat cgccaagaaa tacctggcgg aaaagttcgg catcgaaatc cgcggctgcc 480
tgacccagat gggcgacatt ccgctggaga ttaaagactg gcgtcaggtt gagcttaatc 540
cgttcttttg tcccgatgcg gacaaacttg acgcgctgga cgaactgatg cgcgcgctga 600
aaaaagaggg tgactccatc ggcgcgaaag tgacggtgat ggcgagcggc gtgccggcag 660
ggcttggcga accggtattt gaccgactgg atgcggacat cgcccatgcg ctgatgagca 720
ttaatgcggt gaaaggcgtg gagatcggcg aaggatttaa cgtggtggcg ctgcgcggca 780
gccagaatcg cgatgaaatc acggcgcagg gttttcagag caaccacgct ggcggcatcc 840
tcggtggcat cagtagcggg caacacattg tggcgcatat ggcgctgaaa cctacctcca 900
gcattaccgt gccgggacgt acgatcaacc gggcaggtga agaagtcgaa atgatcacca 960
aagggcgcca cgatccgtgt gtggggattc gcgcagtgcc gatcgcagaa gccatgctgg 1020
cgatcgtgct gatggatcac ctgctgcgcc atcgggcaca gaatgcggat gtaaagacag 1080
agattccacg ctgg 1094
<210> 83
<211> 767
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> aroD
<400> 83
aagggtacca aatgaaaacc gtaactgtaa gagatctcgt ggttggcgaa ggcgcgccaa 60
agatcattgt gtcgctaatg ggaaaaacca ttaccgatgt gaaatcggaa gcactcgcct 120
accgtgaagc ggatttcgat attctggagt ggcgcgttga ccattttgcc aacgtgacaa 180
cggcggaaag cgtacttgag gccgccggcg ccatccggga gattattacc gataaaccct 240
tgctatttac cttccgcagc gcgaaagaag gcggcgaaca ggcgctaacc accggacagt 300
atatcgatct gaatcgtgca gcggttgaca gcggtctggt cgatatgatc gatcttgagc 360
tttttaccgg cgacgatgag gtgaaagcca ccgtcggcta tgctcatcaa cacaatgttg 420
cggtgatcat gtctaaccat gattttcata aaacgcccgc agcggaagag attgttcagc 480
gtctgcgtaa aatgcaggaa ctgggcgctg atattccgaa gatcgccgtc atgccacaga 540
ctaaagccga tgtcctgacc ttacttaccg ccactgtaga aatgcaggag cgctatgcgg 600
atcgtccgat tattaccatg tcgatgtcga aaaccggggt aatatctcgt cttgccggcg 660
aagtgttcgg ttctgcggca acgtttggcg cggtgaaaaa agcatctgcg ccgggacaaa 720
tatcggtagc cgatctgcgt accgtattaa ctatattgca ccaggcg 767
<210> 84
<211> 684
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> PhoP
<400> 84
aagggagaag agatgatgcg cgtactggtt gtagaggata atgcattatt acgccaccac 60
ctgaaggttc agctccagga ttcaggtcac caggtcgatg ccgcagaaga tgccagggaa 120
gctgattact accttaatga acaccttccg gatatcgcta ttgtcgattt aggtctgccg 180
gatgaagacg gcctttcctt aatacgccgc tggcgcagca gtgatgtttc actgccggtt 240
ctggtgttaa ccgcgcgcga aggctggcag gataaagtcg aggttctcag ctccggggcc 300
gatgactacg tgacgaagcc attccacatc gaagaggtaa tggcgcgtat gcaggcgtta 360
atgcgccgta atagcggtct ggcctcccag gtgatcaaca tcccgccgtt ccaggtggat 420
ctctcacgcc gggaattatc cgtcaatgaa gaggtcatca aactcacggc gttcgaatac 480
accattatgg aaacgcttat ccgtaacaac ggtaaagtgg tcagcaaaga ttcgctgatg 540
cttcagctgt atccggatgc ggaactgcgg gaaagtcata ccattgatgt tctcatgggg 600
cgtctgcgga aaaaaataca ggcccagtat ccgcacgatg tcattaccac cgtacgcgga 660
caaggatatc tttttgaatt gcgc 684
<210> 85
<211> 1461
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> PhoQ
<400> 85
atgaataaat ttgctcgcca ttttctgccg ctgtcgctgc gggttcgttt tttgctggcg 60
acagccggcg tcgtgctggt gctttctttg gcatatggca tagtggcgct ggtcggctat 120
agcgtaagtt ttgataaaac cacctttcgt ttgctgcgcg gcgaaagcaa cctgttttat 180
accctcgcca aatgggaaaa taataaaatc agcgttgagc tgcctgaaaa tctggacatg 240
caaagcccga ccatgacgct gatttacgat gaaacgggca aattattatg gacgcagcgc 300
aacattccct ggctgattaa aagcattcaa ccggaatggt taaaaacgaa cggcttccat 360
gaaattgaaa ccaacgtaga cgccaccagc acgctgttga gcgaagacca ttccgcgcag 420
gaaaaactca aagaagtacg tgaagatgac gatgatgccg agatgaccca ctcggtagcg 480
gtaaatattt atcctgccac ggcgcggatg ccgcagttaa ccatcgtggt ggtcgatacc 540
attccgatag aactaaaacg ctcctatatg gtgtggagct ggttcgtata cgtgctggcc 600
gccaatttac tgttagtcat tcctttactg tggatcgccg cctggtggag cttacgccct 660
atcgaggcgc tggcgcggga agtccgcgag cttgaagatc atcaccgcga aatgctcaat 720
ccggagacga cgcgtgagct gaccagcctt gtgcgcaacc ttaatcaact gctcaaaagc 780
gagcgtgaac gttataacaa ataccgcacg accctgaccg acctgacgca cagtttaaaa 840
acgccgctcg cggttttgca gagtacgtta cgctctttac gcaacgaaaa gatgagcgtc 900
agcaaagctg aaccggtgat gctggaacag atcagccgga tttcccagca gatcggctat 960
tatctgcatc gcgccagtat gcgcggtagc ggcgtgttgt taagccgcga actgcatccc 1020
gtcgcgccgt tgttagataa cctgatttct gcgctaaata aagtttatca gcgtaaaggg 1080
gtgaatatca gtatggatat ttcaccagaa atcagttttg tcggcgagca aaacgacttt 1140
gtcgaagtga tgggcaacgt actggacaac gcttgtaaat attgtctgga gtttgtcgag 1200
atttcggctc gccagaccga cgatcatttg catattttcg tcgaagatga cggcccaggc 1260
attccccaca gcaaacgttc cctggtgttt gatcgcggtc agcgcgccga taccctacga 1320
ccaggacaag gcgtggggct ggctgtcgcg cgcgagatta cggaacaata cgccgggcag 1380
atcattgcca gcgacagtct gctcggtggc gcccgtatgg aggtcgtttt tggccgacag 1440
catcccacac agaaagagga a 1461
<210> 86
<211> 2731
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> 腺苷酸环化酶 (cyaA)
<400> 86
tctttcttta cggtcaatga gcaaggtgtt aaattgatca cgttttagac cattttttcg 60
tcggtattag ataaaaatat gcaggcgaga aagggtaacg gttatttttg acatacggtt 120
tatcccgaat ggcgacggtc aagtactgac ctgcaccatg acgggtagca acatcaggcg 180
atacgtcttg tacctctata ttgagactct gaaacagaga ctggatgcca taaatcaact 240
gcgtgtggat cgcgcgcttg ctgccatggg acccgctttt cagcaggttt acagtcttct 300
gccgacatta ttgcactatc accatccact gatgccgggt taccttgatg gtaacgttcc 360
cagcggtatt tgcttctaca cgcctgatga aacccaacgc cactatctga acgaacttga 420
gctgtaccgc ggtatgacgc cgcaggaccc gccgaagggc gagctgccga ttaccggcgt 480
ttacaccatg ggcagcacct cctcggtcgg gcagagctgc tcgtccgacc tggatatctg 540
ggtgtgccat cagtcctggc tcgacggcga agagcgtcag ttgctgcaac gtaagtgtag 600
cctgctggaa agctgggccg cctcgcttgg cgttgaggtg agcttcttcc tgatcgacga 660
gaaccgtttc cgccataacg aaagcggcag tctgggcggg gaagactgtg gttctacgca 720
gcatatcctg ttgcttgatg agttttatcg taccgctgtg cgcctggccg ggaagcgtat 780
cctgtggagt atggtgccgt gcgacgaaga agagcattac gacgactatg tcatgacgct 840
ctatgcgcag ggcgtattaa cgccaaacga atggctggat ctggggggct taagctcgct 900
ctccgccgaa gagtactttg gcgccagcct gtggcagcta tacaagagca ttgactcgcc 960
gtacaaagcg gtgctgaaaa cgctgctgct ggaagcctat tcatgggaat atcctaaccc 1020
acgtctgctg gcgaaagata ttaaacaacg tctgcatgac ggtgaaatcg tatcgtttgg 1080
actcgatccc tactgcatga tgctggaacg ggtcactgaa tacctgacgg cgattgaaga 1140
tccgacgcgg ctggatttag tccgccgctg cttttacctg aaagtgtgcg agaaattaag 1200
tcgcgagcgt gcctgcgtag gctggcgtcg ggaagtatta agccagttag tcagcgagtg 1260
gggatgggac gacgcgcgtc tgaccatgct cgataatcgc gcaaactgga aaatcgatca 1320
ggtgcgcgaa gcccacaacg aattgctcga cgccatgatg caaagctatc gtaatctgat 1380
tcgctttgcg cggcgcaaca acctcagcgt gagtgccagc ccgcaggata tcggcgtact 1440
gacgcgtaag ctgtacgcgg cttttgaagc gttgccgggt aaagtcacgc tggtgaaccc 1500
gcagatatcg ccggatctgt ccgagccgaa tttaaccttt atccatgtgc cgccgggacg 1560
cgccaaccgt tcaggctggt atctctacaa ccgcgcgccg aacatggatt ccatcatcag 1620
ccatcagccg ctggaatata accgttatct taataagctg gtcgcgtggg cgtggttcaa 1680
cggcctgctg acgtcgcgaa cgcatctgtt tattaagggc aacggtattg tcgacctgcc 1740
taagttacag gagatggtcg ccgatgtttc gcaccatttc ccgctgcgct tgcctgctcc 1800
gacgccgaaa gcgctctaca gcccctgtga aattcgccat ctggcgatta tcgttaacct 1860
cgaatatgac ccgacggcgg cgtttcgcaa taaagtggtc cattttgact tccgtaagct 1920
ggacgttttc agctttggcg aagagcaaaa ctgtctgata ggcagtatcg acttgttata 1980
tcgcaactcg tggaacgaag tgcgtactct gcactttaac ggcgagcagg cgatgatcga 2040
agcgctgaaa acgattctgg ggaaaatgca ccaggatgcc gcgccgccgg atagcgtgga 2100
ggtgttctgc tacagtcagc atcttcgcgg cctgattcgc acccgtgtgc agcaactggt 2160
ctccgaatgt attgagctac gtctttccag cacccgtcag gagaccggtc gcttcaaggc 2220
gctgcgggtt tccgggcaga cgtgggggct attcttcgaa cgcttgaatg tctcggtgca 2280
gaagctggag aacgctatcg aattctacgg cgcgatttcg cataacaagc tgcacgggct 2340
gtcggtacag gtggaaacca accaggtgaa attgccgtca gtggtggatg gcttcgccag 2400
cgaagggatt atccagttct tctttgaaga aacaggcgat gagaaaggct ttaacattta 2460
tattctggat gaaagtaacc gggcggaagt atatcaccac tgcgaaggta gcaaggaaga 2520
actggtgcgc gacgtcagtc gcttctattc gtcatcgcac gatcgcttca cgtatggctc 2580
cagttttatc aactttaacc tgccgcagtt ctaccagata gtgaaaaccg atggccgcgc 2640
gcaggtgatc ccattccgta cgcagcctat caacaccgtg ccgccagcaa accaggatca 2700
tgacgcgccg ctattgcagc agtatttttc g 2731
<210> 87
<211> 826
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> cAMP-活化的全局转录调节物(crp)
<400> 87
aagctatgct aaaacagaca agatgctaca gtaatacatt gacgtactgc atgtatgcag 60
aggacatcac attacaggct acaatctatt ttcgtagccc ccttcccagg tagcgggaag 120
tatatttttg caaccccaga gacagtgccg ttttctggct ctggagacag cttataacag 180
aggataaccg cgcatggtgc ttggcaaacc gcaaacagac ccgactcttg aatggttctt 240
gtctcattgc cacattcata agtacccgtc aaagagcacg ctgattcacc agggtgaaaa 300
agcagaaacg ctgtactaca tcgttaaagg ctccgtggca gtgctgatca aagatgaaga 360
agggaaagaa atgatccttt cttatctgaa tcagggtgat tttattggtg aactgggcct 420
gtttgaagaa ggccaggaac gcagcgcctg ggtacgtgcg aaaaccgcat gtgaggtcgc 480
tgaaatttcc tacaaaaaat ttcgccaatt aatccaggtc aacccggata ttctgatgcg 540
cctctcttcc cagatggctc gtcgcttaca agtcacctct gaaaaagtag gtaacctcgc 600
cttccttgac gtcaccgggc gtatcgctca gacgctgctg aatctggcga aacagcccga 660
tgccatgacg cacccggatg ggatgcagat caaaatcact cgtcaggaaa tcggccagat 720
cgtcggctgc tcccgcgaaa ccgttggtcg tattttgaaa atgctggaag atcaaaacct 780
gatctccgcg catggcaaga ccatcgtcgt ctacggcacc cgttaa 826
<210> 88
<211> 1566
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 环状GMP-AMP (cGAMP)合酶(cGAS), 同种型1
<400> 88
atgcagcctt ggcacggaaa ggccatgcag agagcttccg aggccggagc cactgccccc 60
aaggcttccg cacggaatgc caggggcgcc ccgatggatc ccaccgagtc tccggctgcc 120
cccgaggccg ccctgcctaa ggcgggaaag ttcggccccg ccaggaagtc gggatcccgg 180
cagaaaaaga gcgccccgga cacccaggag aggccgcccg tccgcgcaac tggggcccgc 240
gccaaaaagg cccctcagcg cgcccaggac acgcagccgt ctgacgccac cagcgcccct 300
ggggcagagg ggctggagcc tcctgcggct cgggagccgg ctctttccag ggctggttct 360
tgccgccaga ggggcgcgcg ctgctccacg aagccaagac ctccgcccgg gccctgggac 420
gtgcccagcc ccggcctgcc ggtctcggcc cccattctcg tacggaggga tgcggcgcct 480
ggggcctcga agctccgggc ggttttggag aagttgaagc tcagccgcga tgatatctcc 540
acggcggcgg ggatggtgaa aggggttgtg gaccacctgc tgctcagact gaagtgcgac 600
tccgcgttca gaggcgtcgg gctgctgaac accgggagct actatgagca cgtgaagatt 660
tctgcaccta atgaatttga tgtcatgttt aaactggaag tccccagaat tcaactagaa 720
gaatattcca acactcgtgc atattacttt gtgaaattta aaagaaatcc gaaagaaaat 780
cctctgagtc agtttttaga aggtgaaata ttatcagctt ctaagatgct gtcaaagttt 840
aggaaaatca ttaaggaaga aattaacgac attaaagata cagatgtcat catgaagagg 900
aaaagaggag ggagccctgc tgtaacactt cttattagtg aaaaaatatc tgtggatata 960
accctggctt tggaatcaaa aagtagctgg cctgctagca cccaagaagg cctgcgcatt 1020
caaaactggc tttcagcaaa agttaggaag caactacgac taaagccatt ttaccttgta 1080
cccaagcatg caaaggaagg aaatggtttc caagaagaaa catggcggct atccttctct 1140
cacatcgaaa aggaaatttt gaacaatcat ggaaaatcta aaacgtgctg tgaaaacaaa 1200
gaagagaaat gttgcaggaa agattgttta aaactaatga aatacctttt agaacagctg 1260
aaagaaaggt ttaaagacaa aaaacatctg gataaattct cttcttatca tgtgaaaact 1320
gccttctttc acgtatgtac ccagaaccct caagacagtc agtgggaccg caaagacctg 1380
ggcctctgct ttgataactg cgtgacatac tttcttcagt gcctcaggac agaaaaactt 1440
gagaattatt ttattcctga attcaatcta ttctctagca acttaattga caaaagaagt 1500
aaagaatttc tgacaaagca aattgaatat gaaagaaaca atgagtttcc agtttttgat 1560
gaattt 1566
<210> 89
<211> 1137
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 干扰素基因刺激因子(STING)(H232等位基因)
<400> 89
atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60
gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccatgctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900
gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960
agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020
gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctct 1137
<210> 90
<211> 972
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> 脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶(msbB)
<400> 90
ttatttgatg ggataaagat ctttacgctt atacggctga atctcgcctg gcttgcgggt 60
tttgagcagc ttcaggatcc aggtgtactg ttccggatgc gggccgacaa aaatttcgac 120
ctcttcgttc atccgtctgg cgatagtgtg gtcgtcagcc gtgagcagat cgtccattgg 180
cgggcgaatc tggatagtca ggcgatgcgt tttaccatta tacaccggga aaagcggtat 240
cacgcgtgcg cggcacactt tcatcagccg accaattgca ggcagcgtcg ctttgtatgt 300
cgcaaagaaa tcaacgaatt cactatgctc cgggccgtga tcctggtccg gcaggtagta 360
accccagtag ccctgacgaa cagactgaat aaagggttta atcccgtcat tacgcgcatg 420
caaacgtccg ccgaaacgcc gacgcactgt gttccagata tagtcaaaaa ccggattacc 480
ctgattatga aacatcgccg ccattttttg cccctgagag gccatcagca tggctggaat 540
gtcgacgccc cagccatgcg gtacgagaaa aatgactttt tcgtcgttac gacgcatctc 600
ctcgataatc tccagacctt cccagtcaac acgctgttga atttttttcg gaccgcgcat 660
cgccaactca gccatcatcg ccattgcctg tggcgcggtg gcgaacatct catcgacaat 720
cgcttcgcgc tcagcttcgc tacgctgcgg aaagcacaac gacagattaa ttagcgcccg 780
gcgacgagaa ctcttcccca gccgtccggc aaaacgcccc agcgtcgcca gcaaagggtc 840
gcggaatgat gccggtgtta atgcgatccc cgccattgcc gccgcgccca accaggcgcc 900
ccaatactgt ggatagcgaa aggatttttc gaattcaggg atatactcac tattattttt 960
tttggtttcc at 972
<210> 91
<211> 1038
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> 磷酸核糖氨基咪唑合成酶 (purI)
<400> 91
ttattcaata accacacgct gttcggaatc agaggctttg atgataccga ttttccatgc 60
gttttcacct ttctcgttta gcagagcaag cgctttgtcc gcttccggag cggagagcgc 120
aatcaccatg ccgacgccgc agttaaaggt acggtacatt tcatgtcggc tgacattacc 180
ggcggtttgc agccaggtaa agatggcggg ccactgccag gacgactcat taattaccgc 240
ctgggtattc tccggcagaa cgcgcggaat attttcccaa aagcccccgc cggtgaggtg 300
ggcgatagcg tgtacatcga cgttttcaat cagttccaga accgatttta cgtagatacg 360
ggtcggttca agcagatgat cggccagcgg cttcccttcc agcagagtgg tttgtgggtc 420
gcagccgcta acgtcaataa ttttccgcac cagcgaatat ccattcgagt gcgggccgct 480
ggagccgagt gcaatcagca cgtcgccttc ggcaacccgg gagccgtcga tgatttctga 540
tttttcgact acgccgacgc agaaacccgc cacatcgtaa tcttcgccgt gatacatgcc 600
cggcatttcc gccgtctcgc cgccgaccag cgcgcagccg gattgcaggc agccttcggc 660
aataccgttg atcacgctgg cggcggtatc gacatccagt ttacccgtgg catagtaatc 720
gaggaaaaac agcggttccg cgccctgaac gaccagatcg tttacgcaca ttgccaccag 780
atcaataccg atagcgtcgt gacgctttaa gtccatcgcc aggcgaagtt tggtacctac 840
gccgtcagtg ccggaaacca gtaccggttc acgatatttt tgcggcaacg cgcacagcgc 900
accgaaaccg cccagaccgc ccataacctc cgggcggcga gttttcttca ctacgccttt 960
gattcgatca accagagcgt tacccgcatc aatatcgacg ccggcatctt tatagctaag 1020
agaggtctta tcggtcac 1038
<210> 92
<211> 426
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 存活素 (SVN)/BIRC5, 同种型1
<400> 92
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420
atggat 426
<210> 93
<211> 285
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> araBAD 启动子 (pBAD)
<400> 93
aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60
tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120
aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180
attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240
atcttacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccat 285
<210> 94
<211> 459
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 白介素2 (IL-2)
<400> 94
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 459
<210> 95
<211> 567
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 干扰素 (IFN) alpha
<400> 95
atggcctcgc cctttgcttt actgatggtc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60
tctctgggct gtgatctccc tgagacccac agcctggata acaggaggac cttgatgctc 120
ctggcacaaa tgagcagaat ctctccttcc tcctgtctga tggacagaca tgactttgga 180
tttccccagg aggagtttga tggcaaccag ttccagaagg ctccagccat ctctgtcctc 240
catgagctga tccagcagat cttcaacctc tttaccacaa aagattcatc tgctgcttgg 300
gatgaggacc tcctagacaa attctgcacc gaactctacc agcagctgaa tgacttggaa 360
gcctgtgtga tgcaggagga gagggtggga gaaactcccc tgatgaatgc ggactccatc 420
ttggctgtga agaaatactt ccgaagaatc actctctatc tgacagagaa gaaatacagc 480
ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ccctctcttt atcaacaaac 540
ttgcaagaaa gattaaggag gaaggaa 567
<210> 96
<211> 729
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD48, 同种型1
<400> 96
atgtgctcca gaggttggga ttcgtgtctg gctctggaat tgctactgct gcctctgtca 60
ctcctggtga ccagcattca aggtcacttg gtacatatga ccgtggtctc cggcagcaac 120
gtgactctga acatctctga gagcctgcct gagaactaca aacaactaac ctggttttat 180
actttcgacc agaagattgt agaatgggat tccagaaaat ctaagtactt tgaatccaaa 240
tttaaaggca gggtcagact tgatcctcag agtggcgcac tgtacatctc taaggtccag 300
aaagaggaca acagcaccta catcatgagg gtgttgaaaa agactgggaa tgagcaagaa 360
tggaagatca agctgcaagt gcttgaccct gtacccaagc ctgtcatcaa aattgagaag 420
atagaagaca tggatgacaa ctgttatctg aaactgtcat gtgtgatacc tggcgagtct 480
gtaaactaca cctggtatgg ggacaaaagg cccttcccaa aggagctcca gaacagtgtg 540
cttgaaacca cccttatgcc acataattac tccaggtgtt atacttgcca agtcagcaat 600
tctgtgagca gcaagaatgg cacggtctgc ctcagtccac cctgtaccct ggcccggtcc 660
tttggagtag aatggattgc aagttggcta gtggtcacgg tgcccaccat tcttggcctg 720
ttacttacc 729
<210> 97
<211> 1602
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD276/B7-H3, 同种型1
<400> 97
atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca 60
ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca 120
ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg 180
gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct 240
gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg 300
gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc 360
acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct 420
ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg 480
gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat 540
gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc 600
ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc 660
ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag 720
agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg 780
ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag 840
ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc 900
cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa 960
ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc 1020
ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac 1080
tcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc 1140
atcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcag 1200
ggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt 1260
gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg 1320
cgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg 1380
acattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactg 1440
ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat 1500
gcaggagctg aggaccagga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg 1560
aaacactctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cc 1602
<210> 98
<211> 846
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> B7-H4/VTCN1
<400> 98
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct 60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact 120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct 180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc 240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg 300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg 360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat 420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat 480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc 540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag 600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac 660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg 720
acagaatcgg agatcaaaag gcggagtcac ctacagctgc taaactcaaa ggcttctctg 780
tgtgtctctt ctttctttgc catcagctgg gcacttctgc ctctcagccc ttacctgatg 840
ctaaaa 846
<210> 99
<211> 867
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> BTLA/CD272, 同种型1
<400> 99
atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60
ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120
aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180
aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240
aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300
cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360
tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420
gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct 480
ttggggggat tgcctctact catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg 540
caccaaggaa agcaaaatga actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat 600
gctcacctta agagtgagca aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtactgcta 660
tcagaaactg gaatttatga taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct 720
gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg 780
aaccattctg tcattggacc gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca 840
gaatatgcat ccatatgtgt gaggagt 867
<210> 100
<211> 276
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 趋化因子 (C-C 基序) 配体 4 (CCL4)
<400> 100
atgaagctct gcgtgactgt cctgtctctc ctcatgctag tagctgcctt ctgctctcca 60
gcgctctcag caccaatggg ctcagaccct cccaccgcct gctgcttttc ttacaccgcg 120
aggaagcttc ctcgcaactt tgtggtagat tactatgaga ccagcagcct ctgctcccag 180
ccagctgtgg tattccaaac caaaagaagc aagcaagtct gtgctgatcc cagtgaatcc 240
tgggtccagg agtacgtgta tgacctggaa ctgaac 276
<210> 101
<211> 3537
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD103/ITGAE
<400> 101
atgtggctct tccacactct gctctgcata gccagcctgg ccctgctggc cgctttcaat 60
gtggatgtgg cccggccctg gctcacgccc aagggaggtg cccctttcgt gctcagctcc 120
cttctgcacc aagaccccag caccaaccag acctggctcc tggtcaccag ccccagaacc 180
aagaggacac cagggcccct ccatcgatgt tcccttgtcc aggatgaaat cctttgccat 240
cctgtagagc atgtccccat ccccaagggg aggcaccggg gagtgaccgt tgtccggagc 300
caccacggtg ttttgatatg cattcaagtg ctggtccggc ggcctcacag cctcagctca 360
gaactcacag gcacctgtag cctcctgggc cctgacctcc gtccccaggc tcaggccaac 420
ttcttcgacc ttgaaaatct cctggatcca gatgcacgtg tggacactgg agactgctac 480
agcaacaaag aaggcggtgg agaagacgat gtgaacacag ccaggcagcg ccgggctctg 540
gagaaggagg aggaggaaga caaggaggag gaggaagacg aggaggagga ggaagctggc 600
accgagattg ccatcatcct ggatggctca ggaagcattg atcccccaga ctttcagaga 660
gccaaagact tcatctccaa catgatgagg aacttctatg aaaagtgttt tgagtgcaac 720
tttgccttgg tgcagtatgg aggagtgatc cagactgagt ttgaccttcg ggacagccag 780
gatgtgatgg cctccctcgc cagagtccag aacatcactc aagtggggag tgtcaccaag 840
actgcctcag ccatgcaaca cgtcttagac agcatcttca cctcaagcca cggctccagg 900
agaaaggcat ccaaggtcat ggtggtgctc accgatggtg gcatattcga ggaccccctc 960
aaccttacga cagtcatcaa ctcccccaaa atgcagggtg ttgagcgctt tgccattggg 1020
gtgggagaag aatttaagag tgctaggact gcgagggaac tgaacctgat cgcctcagac 1080
ccggatgaga cccatgcttt caaggtgacc aactacatgg cgctggatgg gctgctgagc 1140
aaactgcggt acaacatcat cagcatggaa ggcacggttg gagacgccct tcactaccag 1200
ctggcacaga ttggcttcag tgctcagatc ctggatgagc ggcaggtgct gctcggcgcc 1260
gtcggggcct ttgactggtc cggaggggcg ttgctctacg acacacgcag ccgccggggc 1320
cgcttcctga accagacagc ggcggcggcg gcagacgcgg aggctgcgca gtacagctac 1380
ctgggttacg ctgtggccgt gctgcacaag acctgcagcc tctcctacat cgcgggggct 1440
ccacggtaca aacatcatgg ggccgtgttt gagctccaga aggagggcag agaggccagc 1500
ttcctgccag tgctggaggg agagcagatg gggtcctatt ttggctctga gctgtgccct 1560
gtggacattg acatggatgg aagcacggac ttcttgctgg tggctgctcc attttaccac 1620
gttcatggag aagaaggcag agtctacgtg taccgtctca gcgagcagga tggttctttc 1680
tccttggcac gcatactgag tgggcacccc gggttcacca atgcccgctt tggctttgcc 1740
atggcggcta tgggggatct cagtcaggat aagctcacag atgtggccat cggggccccc 1800
ctggaaggtt ttggggcaga tgatggtgcc agcttcggca gtgtgtatat ctacaatgga 1860
cactgggacg gcctctccgc cagcccctcg cagcggatca gagcctccac ggtggcccca 1920
ggactccagt acttcggcat gtccatggct ggtggctttg atattagtgg cgacggcctt 1980
gccgacatca ccgtgggcac tctgggccag gcggttgtgt tccgctcccg gcctgtggtt 2040
cgcctgaagg tctccatggc cttcaccccc agcgcactgc ccatcggctt caacggcgtc 2100
gtgaatgtcc gtttatgttt tgaaatcagc tctgtaacca cagcctctga gtcaggcctc 2160
cgcgaggcac ttctcaactt cacgctggat gtggatgtgg ggaagcagag gagacggctg 2220
cagtgttcag acgtaagaag ctgtctgggc tgcctgaggg agtggagcag cggatcccag 2280
ctttgtgagg acctcctgct catgcccaca gagggagagc tctgtgagga ggactgcttc 2340
tccaatgcca gtgtcaaagt cagctaccag ctccagaccc ctgagggaca gacggaccat 2400
ccccagccca tcctggaccg ctacactgag ccctttgcca tcttccagct gccctatgag 2460
aaggcctgca agaataagct gttttgtgtc gcagaattac agttggccac caccgtctct 2520
cagcaggagt tggtggtggg tctcacaaag gagctgaccc tgaacattaa cctaactaac 2580
tccggggaag attcctacat gacaagcatg gccttgaatt accccagaaa cctgcagttg 2640
aagaggatgc aaaagcctcc ctctccaaac attcagtgtg atgaccctca gccggttgct 2700
tctgtcctga tcatgaactg caggattggt caccccgtcc tcaagaggtc atctgctcat 2760
gtttcagtcg tttggcagct agaggagaat gcctttccaa acaggacagc agacatcact 2820
gtgactgtca ccaattccaa tgaaagacgg tctttggcca acgagaccca cacccttcaa 2880
ttcaggcatg gcttcgttgc agttctgtcc aaaccatcca taatgtacgt gaacacaggc 2940
caggggcttt ctcaccacaa agaattcctc ttccatgtac atggggagaa cctctttgga 3000
gcagaatacc agttgcaaat ttgcgtccca accaaattac gaggtctcca ggttgtagca 3060
gtgaagaagc tgacgaggac tcaggcctcc acggtgtgca cctggagtca ggagcgcgct 3120
tgtgcgtaca gttcggttca gcatgtggaa gaatggcatt cagtgagctg tgtcatcgct 3180
tcagataaag aaaatgtcac cgtggctgca gagatctcct gggatcactc tgaggagtta 3240
ctaaaagatg taactgaact gcagatcctt ggtgaaatat ctttcaacaa atctctatat 3300
gagggactga atgcagagaa ccacagaact aagatcactg tcgtcttcct gaaagatgag 3360
aagtaccatt ctttgcctat catcattaaa ggcagcgttg gtggacttct ggtgttgatc 3420
gtgattctgg tcatcctgtt caagtgtggc ttttttaaaa gaaaatatca acaactgaac 3480
ttggagagca tcaggaaggc ccagctgaaa tcagagaatc tgctcgaaga agagaat 3537
<210> 102
<211> 1671
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD19, 同种型1
<400> 102
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020
ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080
ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140
ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200
ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260
tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320
aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380
tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440
cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggcagg gtcccagtcc 1500
tatgaggata tgagaggaat cctgtatgca gccccccagc tccgctccat tcggggccag 1560
cctggaccca atcatgagga agatgcagac tcttatgaga acatggataa tcccgatggg 1620
ccagacccag cctggggagg agggggccgc atgggcacct ggagcaccag g 1671
<210> 103
<211> 579
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 白介素 18 (IL-18), 同种型1
<400> 103
atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60
aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120
cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180
ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240
accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300
tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360
gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420
agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480
ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540
ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagac 579
<210> 104
<211> 1005
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Fas 配体
<400> 104
atgctgggca tctggaccct cctacctctg gttcttacgt ctgttgctag attatcgtcc 60
aaaagtgtta atgcccaagt gactgacatc aactccaagg gattggaatt gaggaagact 120
gttactacag ttgagactca gaacttggaa ggcctgcatc atgatggcca attctgccat 180
aagccctgtc ctccaggtga aaggaaagct agggactgca cagtcaatgg ggatgaacca 240
gactgcgtgc cctgccaaga agggaaggag tacacagaca aagcccattt ttcttccaaa 300
tgcagaagat gtagattgtg tgatgaagga catggcttag aagtggaaat aaactgcacc 360
cggacccaga ataccaagtg cagatgtaaa ccaaactttt tttgtaactc tactgtatgt 420
gaacactgtg acccttgcac caaatgtgaa catggaatca tcaaggaatg cacactcacc 480
agcaacacca agtgcaaaga ggaaggatcc agatctaact tggggtggct ttgtcttctt 540
cttttgccaa ttccactaat tgtttgggtg aagagaaagg aagtacagaa aacatgcaga 600
aagcacagaa aggaaaacca aggttctcat gaatctccaa ctttaaatcc tgaaacagtg 660
gcaataaatt tatctgatgt tgacttgagt aaatatatca ccactattgc tggagtcatg 720
acactaagtc aagttaaagg ctttgttcga aagaatggtg tcaatgaagc caaaatagat 780
gagatcaaga atgacaatgt ccaagacaca gcagaacaga aagttcaact gcttcgtaat 840
tggcatcaac ttcatggaaa gaaagaagcg tatgacacat tgattaaaga tctcaaaaaa 900
gccaatcttt gtactcttgc agagaaaatt cagactatca tcctcaagga cattactagt 960
gactcagaaa attcaaactt cagaaatgaa atccaaagct tggtc 1005
<210> 105
<211> 1023
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> firA/SSC
<400> 105
atgccttcaa ttcgactggc tgacttagca gaacagttgg atgcagaatt acacggtgat 60
ggcgatatcg tcatcaccgg cgttgcgtcc atgcaatctg caacaacagg ccacattacg 120
tttatggtga atcctaagta ccgtgaacac ttaggtttat gccaggcttc tgcggttgtc 180
atgacgcagg acgatcttcc ttttgctaag agtgcggcgc tggtagttaa aaatccctac 240
ctgacctacg cgcgcatggc gcaaatttta gatactacgc cgcagcccgc gcagaatatc 300
gcgccaagcg ccgtgattga tgcgacggca acgctgggta gcaatgtttc agtcggcgcg 360
aatgcggtga ttgaatctgg cgtacaactg ggcgataacg tggttatcgg cgcaggctgt 420
ttcgtcggaa aaaatagcaa aatcggggcg ggttcacgct tgtgggcgaa cgtaacgatt 480
taccacgaca ttcagatcgg tgagaattgc ctgatccagt ccagtacggt gatcggcgcg 540
gacggttttg gctacgctaa cgatcgtggc aactgggtga agatcccaca actgggccgg 600
gtcattattg gcgatcgtgt cgagatcggc gcttgtacca ccattgaccg tggcgcgttg 660
gatgatactg ttattggcaa tggcgtgatt attgataatc agtgccagat tgcacataac 720
gtcgtgattg gcgacaatac ggcagttgcc ggtggcgtca ttatggcggg tagcctgaag 780
attggccgtt actgcatgat tggcggcgcc agcgtgatca atgggcatat ggaaatatgc 840
gacaaagtca cggtaactgg catgggtatg gtgatgcgtc ccatcacgga accgggcgtc 900
tactcctcag gcattccgct gcaacccaac aaagtatggc gtaaaactgc tgcactggtg 960
atgaacattg atgatatgag caagcgtctc aaagcgattg agcgcaaggt taatcaacaa 1020
gac 1023
<210> 106
<211> 918
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> htrB
<400> 106
atgacgaatc tacccaagtt ctccaccgca ctgcttcatc cgcgttattg gttaacctgg 60
ttgggtattg gcgtactttg gttagtcgtg caattgccct acccggttat ctaccgcctc 120
ggttgtggat taggaaaact ggcgttacgt tttatgaaac gacgcgcaaa aattgtgcat 180
cgcaacctgg aactgtgctt cccggaaatg agcgaacaag aacgccgtaa aatggtggtg 240
aagaatttcg aatccgttgg catgggcctg atggaaaccg gcatggcgtg gttctggccg 300
gaccgccgaa tcgcccgctg gacggaagtg atcggcatgg aacacattcg tgacgtgcag 360
gcgcaaaaac gcggcatcct gttagttggc atccattttc tgacactgga gctgggtgcg 420
cggcagtttg gtatgcagga accgggtatt ggcgtttatc gcccgaacga taatccactg 480
attgactggc tacaaacctg gggccgtttg cgctcaaata aatcgatgct cgaccgcaaa 540
gatttaaaag gcatgattaa agccctgaaa aaaggcgaag tggtctggta cgcaccggat 600
catgattacg gcccgcgctc aagcgttttc gtcccgttgt ttgccgttga gcaggctgcg 660
accacgaccg gaacctggat gctggcacgg atgtccggcg catgtctggt gcccttcgtt 720
ccacgccgta agccagatgg caaagggtat caattgatta tgctgccgcc agagtgttct 780
ccgccactgg atgatgccga aactaccgcc gcgtggatga acaaagtggt cgaaaaatgc 840
atcatgatgg caccagagca gtatatgtgg ttacaccgtc gctttaaaac acgcccggaa 900
ggcgttcctt cacgctat 918
<210> 107
<211> 717
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> ompR
<400> 107
atgcaagaga attataagat tctggtggtt gatgacgata tgcgtctgcg ggcgctactg 60
gaacgttatc tgaccgagca gggcttccag gttcgaagcg tcgctaacgc tgagcagatg 120
gatcgtctgc tgacccgtga atctttccat ctcatggtac tggatttaat gctgccaggt 180
gaagatggtc tgtcgatttg tcgtcgcctg cgtagtcaaa gtaatccaat gccgatcatt 240
atggtcacgg cgaagggtga agaggttgac cgtatcgtcg ggctggaaat cggcgccgat 300
gactacattc ctaaaccgtt taacccgcgc gagctgttgg cgcgtattcg gcccgtgtta 360
cgtcgtcagg caaacgaact gcccggcgcg ccgtcgcagg aagaggccgt tatcgcgttc 420
ggtaagttta aactgaacct cggtacgcgc gagatgttcc gtgaagatga accgatgccg 480
ctgaccagcg gggagtttgc ggtactgaaa gcgttagtca gccatccgcg cgagccgctc 540
tctcgcgata agctgatgaa tctggcccgt ggccgcgagt attccgcgat ggaacgctcc 600
atcgacgtcc agatctcccg cctgcgccgt atggtggaag aagatccggc acatccgcgt 660
tatattcaga ccgtctgggg cctgggctac gtctttgtac cggacggttc taaagca 717
<210> 108
<211> 498
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 干扰素 (IFN) gamma
<400> 108
atgaaatata caagttatat cttggctttt cagctctgca tcgttttggg ttctcttggc 60
tgttactgcc aggacccata tgtaaaagaa gcagaaaacc ttaagaaata ttttaatgca 120
ggtcattcag atgtagcgga taatggaact cttttcttag gcattttgaa gaattggaaa 180
gaggagagtg acagaaaaat aatgcagagc caaattgtct ccttttactt caaacttttt 240
aaaaacttta aagatgacca gagcatccaa aagagtgtgg agaccatcaa ggaagacatg 300
aatgtcaagt ttttcaatag caacaaaaag aaacgagatg acttcgaaaa gctgactaat 360
tattcggtaa ctgacttgaa tgtccaacgc aaagcaatac atgaactcat ccaagtgatg 420
gctgaactgt cgccagcagc taaaacaggg aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 480
ggtcgaagag catcccag 498
<210> 109
<211> 699
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 肿瘤坏死因子(TNF) alpha
<400> 109
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240
tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360
gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420
aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699
<210> 110
<211> 825
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Atg5 长同种型
<400> 110
atgacagatg acaaagatgt gcttcgagat gtgtggtttg gacgaattcc aacttgtttc 60
acgctatatc aggatgagat aactgaaagg gaagcagaac catactattt gcttttgcca 120
agagtaagtt atttgacgtt ggtaactgac aaagtgaaaa agcactttca gaaggttatg 180
agacaagaag acattagtga gatatggttt gaatatgaag gcacaccact gaaatggcat 240
tatccaattg gtttgctatt tgatcttctt gcatcaagtt cagctcttcc ttggaacatc 300
acagtacatt ttaagagttt tccagaaaaa gaccttctgc actgtccatc taaggatgca 360
attgaagctc attttatgtc atgtatgaaa gaagctgatg ctttaaaaca taaaagtcaa 420
gtaatcaatg aaatgcagaa aaaagatcac aagcaactct ggatgggatt gcaaaatgac 480
agatttgacc agttttgggc catcaatcgg aaactcatgg aatatcctgc agaagaaaat 540
ggatttcgtt atatcccctt tagaatatat cagacaacga ctgaaagacc tttcattcag 600
aagctgtttc gtcctgtggc tgcagatgga cagttgcaca cactaggaga tctcctcaaa 660
gaagtttgtc cttctgctat tgatcctgaa gatggggaaa aaaagaatca agtgatgatt 720
catggaattg agccaatgtt ggaaacacct ctgcagtggc tgagtgaaca tctgagctac 780
ccggataatt ttcttcatat tagtatcatc ccacagccaa cagat 825
<210> 111
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Beclin1
<400> 111
atggaagggt ctaagacgtc caacaacagc accatgcagg tgagcttcgt gtgccagcgc 60
tgcagccagc ccctgaaact ggacacgagt ttcaagatcc tggaccgtgt caccatccag 120
gaactcacag ctccattact taccacagcc caggcgaaac caggagagac ccaggaggaa 180
gagactaact caggagagga gccatttatt gaaactcctc gccaggatgg tgtctctcgc 240
agattcatcc ccccagccag gatgatgtcc acagaaagtg ccaacagctt cactctgatt 300
ggggaggcat ctgatggcgg caccatggag aacctcagcc gaagactgaa ggtcactggg 360
gacctttttg acatcatgtc gggccagaca gatgtggatc acccactctg tgaggaatgc 420
acagatactc ttttagacca gctggacact cagctcaacg tcactgaaaa tgagtgtcag 480
aactacaaac gctgtttgga gatcttagag caaatgaatg aggatgacag tgaacagtta 540
cagatggagc taaaggagct ggcactagag gaggagaggc tgatccagga gctggaagac 600
gtggaaaaga accgcaagat agtggcagaa aatctcgaga aggtccaggc tgaggctgag 660
agactggatc aggaggaagc tcagtatcag agagaataca gtgaatttaa acgacagcag 720
ctggagctgg atgatgagct gaagagtgtt gaaaaccaga tgcgttatgc ccagacgcag 780
ctggataagc tgaagaaaac caacgtcttt aatgcaacct tccacatctg gcacagtgga 840
cagtttggca caatcaataa cttcaggctg ggtcgcctgc ccagtgttcc cgtggaatgg 900
aatgagatta atgctgcttg gggccagact gtgttgctgc tccatgctct ggccaataag 960
atgggtctga aatttcagag ataccgactt gttccttacg gaaaccattc atatctggag 1020
tctctgacag acaaatctaa ggagctgccg ttatactgtt ctggggggtt gcggtttttc 1080
tgggacaaca agtttgacca tgcaatggtg gctttcctgg actgtgtgca gcagttcaaa 1140
gaagaggttg agaaaggcga gacacgtttt tgtcttccct acaggatgga tgtggagaaa 1200
ggcaagattg aagacacagg aggcagtggc ggctcctatt ccatcaaaac ccagtttaac 1260
tctgaggagc agtggacaaa agctctcaag ttcatgctga cgaatcttaa gtggggtctt 1320
gcttgggtgt cctcacaatt ttataacaaa 1350
<210> 112
<211> 2352
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Toll-样受体2 (TLR2)
<400> 112
atgccacata ctttgtggat ggtgtgggtc ttgggggtca tcatcagcct ctccaaggaa 60
gaatcctcca atcaggcttc tctgtcttgt gaccgcaatg gtatctgcaa gggcagctca 120
ggatctttaa actccattcc ctcagggctc acagaagctg taaaaagcct tgacctgtcc 180
aacaacagga tcacctacat tagcaacagt gacctacaga ggtgtgtgaa cctccaggct 240
ctggtgctga catccaatgg aattaacaca atagaggaag attctttttc ttccctgggc 300
agtcttgaac atttagactt atcctataat tacttatcta atttatcgtc ttcctggttc 360
aagccccttt cttctttaac attcttaaac ttactgggaa atccttacaa aaccctaggg 420
gaaacatctc ttttttctca tctcacaaaa ttgcaaatcc tgagagtggg aaatatggac 480
accttcacta agattcaaag aaaagatttt gctggactta ccttccttga ggaacttgag 540
attgatgctt cagatctaca gagctatgag ccaaaaagtt tgaagtcaat tcagaatgta 600
agtcatctga tccttcatat gaagcagcat attttactgc tggagatttt tgtagatgtt 660
acaagttccg tggaatgttt ggaactgcga gatactgatt tggacacttt ccatttttca 720
gaactatcca ctggtgaaac aaattcattg attaaaaagt ttacatttag aaatgtgaaa 780
atcaccgatg aaagtttgtt tcaggttatg aaacttttga atcagatttc tggattgtta 840
gaattagagt ttgatgactg tacccttaat ggagttggta attttagagc atctgataat 900
gacagagtta tagatccagg taaagtggaa acgttaacaa tccggaggct gcatattcca 960
aggttttact tattttatga tctgagcact ttatattcac ttacagaaag agttaaaaga 1020
atcacagtag aaaacagtaa agtttttctg gttccttgtt tactttcaca acatttaaaa 1080
tcattagaat acttggatct cagtgaaaat ttgatggttg aagaatactt gaaaaattca 1140
gcctgtgagg atgcctggcc ctctctacaa actttaattt taaggcaaaa tcatttggca 1200
tcattggaaa aaaccggaga gactttgctc actctgaaaa acttgactaa cattgatatc 1260
agtaagaata gttttcattc tatgcctgaa acttgtcagt ggccagaaaa gatgaaatat 1320
ttgaacttat ccagcacacg aatacacagt gtaacaggct gcattcccaa gacactggaa 1380
attttagatg ttagcaacaa caatctcaat ttattttctt tgaatttgcc gcaactcaaa 1440
gaactttata tttccagaaa taagttgatg actctaccag atgcctccct cttacccatg 1500
ttactagtat tgaaaatcag taggaatgca ataactacgt tttctaagga gcaacttgac 1560
tcatttcaca cactgaagac tttggaagct ggtggcaata acttcatttg ctcctgtgaa 1620
ttcctctcct tcactcagga gcagcaagca ctggccaaag tcttgattga ttggccagca 1680
aattacctgt gtgactctcc atcccatgtg cgtggccagc aggttcagga tgtccgcctc 1740
tcggtgtcgg aatgtcacag gacagcactg gtgtctggca tgtgctgtgc tctgttcctg 1800
ctgatcctgc tcacgggggt cctgtgccac cgtttccatg gcctgtggta tatgaaaatg 1860
atgtgggcct ggctccaggc caaaaggaag cccaggaaag ctcccagcag gaacatctgc 1920
tatgatgcat ttgtttctta cagtgagcgg gatgcctact gggtggagaa ccttatggtc 1980
caggagctgg agaacttcaa tccccccttc aagttgtgtc ttcataagcg ggacttcatt 2040
cctggcaagt ggatcattga caatatcatt gactccattg aaaagagcca caaaactgtc 2100
tttgtgcttt ctgaaaactt tgtgaagagt gagtggtgca agtatgaact ggacttctcc 2160
catttccgtc tttttgatga gaacaatgat gctgccattc tcattcttct ggagcccatt 2220
gagaaaaaag ccattcccca gcgcttctgc aagctgcgga agataatgaa caccaagacc 2280
tacctggagt ggcccatgga cgaggctcag cgggaaggat tttgggtaaa tctgagagct 2340
gcgataaagt cc 2352
<210> 113
<211> 2517
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TLR4, 同种型1
<400> 113
atgatgtctg cctcgcgcct ggctgggact ctgatcccag ccatggcctt cctctcctgc 60
gtgagaccag aaagctggga gccctgcgtg gaggtggttc ctaatattac ttatcaatgc 120
atggagctga atttctacaa aatccccgac aacctcccct tctcaaccaa gaacctggac 180
ctgagcttta atcccctgag gcatttaggc agctatagct tcttcagttt cccagaactg 240
caggtgctgg atttatccag gtgtgaaatc cagacaattg aagatggggc atatcagagc 300
ctaagccacc tctctacctt aatattgaca ggaaacccca tccagagttt agccctggga 360
gccttttctg gactatcaag tttacagaag ctggtggctg tggagacaaa tctagcatct 420
ctagagaact tccccattgg acatctcaaa actttgaaag aacttaatgt ggctcacaat 480
cttatccaat ctttcaaatt acctgagtat ttttctaatc tgaccaatct agagcacttg 540
gacctttcca gcaacaagat tcaaagtatt tattgcacag acttgcgggt tctacatcaa 600
atgcccctac tcaatctctc tttagacctg tccctgaacc ctatgaactt tatccaacca 660
ggtgcattta aagaaattag gcttcataag ctgactttaa gaaataattt tgatagttta 720
aatgtaatga aaacttgtat tcaaggtctg gctggtttag aagtccatcg tttggttctg 780
ggagaattta gaaatgaagg aaacttggaa aagtttgaca aatctgctct agagggcctg 840
tgcaatttga ccattgaaga attccgatta gcatacttag actactacct cgatgatatt 900
attgacttat ttaattgttt gacaaatgtt tcttcatttt ccctggtgag tgtgactatt 960
gaaagggtaa aagacttttc ttataatttc ggatggcaac atttagaatt agttaactgt 1020
aaatttggac agtttcccac attgaaactc aaatctctca aaaggcttac tttcacttcc 1080
aacaaaggtg ggaatgcttt ttcagaagtt gatctaccaa gccttgagtt tctagatctc 1140
agtagaaatg gcttgagttt caaaggttgc tgttctcaaa gtgattttgg gacaaccagc 1200
ctaaagtatt tagatctgag cttcaatggt gttattacca tgagttcaaa cttcttgggc 1260
ttagaacaac tagaacatct ggatttccag cattccaatt tgaaacaaat gagtgagttt 1320
tcagtattcc tatcactcag aaacctcatt taccttgaca tttctcatac tcacaccaga 1380
gttgctttca atggcatctt caatggcttg tccagtctcg aagtcttgaa aatggctggc 1440
aattctttcc aggaaaactt ccttccagat atcttcacag agctgagaaa cttgaccttc 1500
ctggacctct ctcagtgtca actggagcag ttgtctccaa cagcatttaa ctcactctcc 1560
agtcttcagg tactaaatat gagccacaac aacttctttt cattggatac gtttccttat 1620
aagtgtctga actccctcca ggttcttgat tacagtctca atcacataat gacttccaaa 1680
aaacaggaac tacagcattt tccaagtagt ctagctttct taaatcttac tcagaatgac 1740
tttgcttgta cttgtgaaca ccagagtttc ctgcaatgga tcaaggacca gaggcagctc 1800
ttggtggaag ttgaacgaat ggaatgtgca acaccttcag ataagcaggg catgcctgtg 1860
ctgagtttga atatcacctg tcagatgaat aagaccatca ttggtgtgtc ggtcctcagt 1920
gtgcttgtag tatctgttgt agcagttctg gtctataagt tctattttca cctgatgctt 1980
cttgctggct gcataaagta tggtagaggt gaaaacatct atgatgcctt tgttatctac 2040
tcaagccagg atgaggactg ggtaaggaat gagctagtaa agaatttaga agaaggggtg 2100
cctccatttc agctctgcct tcactacaga gactttattc ccggtgtggc cattgctgcc 2160
aacatcatcc atgaaggttt ccataaaagc cgaaaggtga ttgttgtggt gtcccagcac 2220
ttcatccaga gccgctggtg tatctttgaa tatgagattg ctcagacctg gcagtttctg 2280
agcagtcgtg ctggtatcat cttcattgtc ctgcagaagg tggagaagac cctgctcagg 2340
cagcaggtgg agctgtaccg ccttctcagc aggaacactt acctggagtg ggaggacagt 2400
gtcctggggc ggcacatctt ctggagacga ctcagaaaag ccctgctgga tggtaaatca 2460
tggaatccag aaggaacagt gggtacagga tgcaattggc aggaagcaac atctatc 2517
<210> 114
<211> 2574
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TLR5
<400> 114
atgggagacc acctggacct tctcctagga gtggtgctca tggccggtcc tgtgtttgga 60
attccttcct gctcctttga tggccgaata gccttttatc gtttctgcaa cctcacccag 120
gtcccccagg tcctcaacac cactgagagg ctcctgctga gcttcaacta tatcaggaca 180
gtcactgctt catccttccc ctttctggaa cagctgcagc tgctggagct cgggagccag 240
tataccccct tgactattga caaggaggcc ttcagaaacc tgcccaacct tagaatcttg 300
gacctgggaa gtagtaagat atacttcttg catccagatg cttttcaggg actgttccat 360
ctgtttgaac ttagactgta tttctgtggt ctctctgatg ctgtattgaa agatggttat 420
ttcagaaatt taaaggcttt aactcgcttg gatctatcca aaaatcagat tcgtagcctt 480
taccttcatc cttcatttgg gaagttgaat tccttaaagt ccatagattt ttcctccaac 540
caaatattcc ttgtatgtga acatgagctc gagcccctac aagggaaaac gctctccttt 600
tttagcctcg cagctaatag cttgtatagc agagtctcag tggactgggg aaaatgtatg 660
aacccattca gaaacatggt gctggagata ctagatgttt ctggaaatgg ctggacagtg 720
gacatcacag gaaactttag caatgccatc agcaaaagcc aggccttctc tttgattctt 780
gcccaccaca tcatgggtgc cgggtttggc ttccataaca tcaaagatcc tgaccagaac 840
acatttgctg gcctggccag aagttcagtg agacacctgg atctttcaca tgggtttgtc 900
ttctccctga actcacgagt ctttgagaca ctcaaggatt tgaaggttct gaaccttgcc 960
tacaacaaga taaataagat tgcagatgaa gcattttacg gacttgacaa cctccaagtt 1020
ctcaatttgt catataacct tctgggggaa ctttacagtt cgaatttcta tggactacct 1080
aaggtagcct acattgattt gcaaaagaat cacattgcaa taattcaaga ccaaacattc 1140
aaattcctgg aaaaattaca gaccttggat ctccgagaca atgctcttac aaccattcat 1200
tttattccaa gcatacccga tatcttcttg agtggcaata aactagtgac tttgccaaag 1260
atcaacctta cagcgaacct catccactta tcagaaaaca ggctagaaaa tctagatatt 1320
ctctactttc tcctacgggt acctcatctc cagattctca ttttaaatca aaatcgcttc 1380
tcctcctgta gtggagatca aaccccttca gagaatccca gcttagaaca gcttttcctt 1440
ggagaaaata tgttgcaact tgcctgggaa actgagctct gttgggatgt ttttgaggga 1500
ctttctcatc ttcaagttct gtatttgaat cataactatc ttaattccct tccaccagga 1560
gtatttagcc atctgactgc attaagggga ctaagcctca actccaacag gctgacagtt 1620
ctttctcaca atgatttacc tgctaattta gagatcctgg acatatccag gaaccagctc 1680
ctagctccta atcctgatgt atttgtatca cttagtgtct tggatataac tcataacaag 1740
ttcatttgtg aatgtgaact tagcactttt atcaattggc ttaatcacac caatgtcact 1800
atagctgggc ctcctgcaga catatattgt gtgtaccctg actcgttctc tggggtttcc 1860
ctcttctctc tttccacgga aggttgtgat gaagaggaag tcttaaagtc cctaaagttc 1920
tcccttttca ttgtatgcac tgtcactctg actctgttcc tcatgaccat cctcacagtc 1980
acaaagttcc ggggcttctg ttttatctgt tataagacag cccagagact ggtgttcaag 2040
gaccatcccc agggcacaga acctgatatg tacaaatatg atgcctattt gtgcttcagc 2100
agcaaagact tcacatgggt gcagaatgct ttgctcaaac acctggacac tcaatacagt 2160
gaccaaaaca gattcaacct gtgctttgaa gaaagagact ttgtcccagg agaaaaccgc 2220
attgccaata tccaggatgc catctggaac agtagaaaga tcgtttgtct tgtgagcaga 2280
cacttcctta gagatggctg gtgccttgaa gccttcagtt atgcccaggg caggtgctta 2340
tctgacctta acagtgctct catcatggtg gtggttgggt ccttgtccca gtaccagttg 2400
atgaaacatc aatccatcag aggctttgta cagaaacagc agtatttgag gtggcctgag 2460
gatctccagg atgttggctg gtttcttcat aaactctctc aacagatact aaagaaagaa 2520
aaagaaaaga agaaagacaa taacattccg ttgcaaactg tagcaaccat ctcc 2574
<210> 115
<211> 2712
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TLR3, 同种型1
<400> 115
atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60
tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120
aagttgactc aggtacccga tgatctaccc acaaacataa cagtgttgaa ccttacccat 180
aatcaactca gaagattacc agccgccaac ttcacaaggt atagccagct aactagcttg 240
gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300
ttaaaagttt tgaacctcca gcacaatgag ctatctcaac tttctgataa aacctttgcc 360
ttctgcacga atttgactga actccatctc atgtccaact caatccagaa aattaaaaat 420
aatccctttg tcaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480
tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540
aataaaattc aagcgctaaa aagtgaagaa ctggatatct ttgccaattc atctttaaaa 600
aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660
ggaagattat ttggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720
ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780
tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840
ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900
gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960
cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020
gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080
aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140
ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200
tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260
aaaatagaga gtgatgcttt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cctgggcctt 1320
aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagag gtctagaaaa tattttcgaa 1380
atctatcttt cctacaacaa gtacctgcag ctgactagga actcctttgc cttggtccca 1440
agccttcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttaaaa atgtggatag ctctccttca 1500
ccattccagc ctcttcgtaa cttgaccatt ctggatctaa gcaacaacaa catagccaac 1560
ataaatgatg acatgttgga gggtcttgag aaactagaaa ttctcgattt gcagcataac 1620
aacttagcac ggctctggaa acacgcaaac cctggtggtc ccatttattt cctaaagggt 1680
ctgtctcacc tccacatcct taacttggag tccaacggct ttgacgagat cccagttgag 1740
gtcttcaagg atttatttga actaaagatc atcgatttag gattgaataa tttaaacaca 1800
cttccagcat ctgtctttaa taatcaggtg tctctaaagt cattgaacct tcagaagaat 1860
ctcataacat ccgttgagaa gaaggttttc gggccagctt tcaggaacct gactgagtta 1920
gatatgcgct ttaatccctt tgattgcacg tgtgaaagta ttgcctggtt tgttaattgg 1980
attaacgaga cccataccaa catccctgag ctgtcaagcc actacctttg caacactcca 2040
cctcactatc atgggttccc agtgagactt tttgatacat catcttgcaa agacagtgcc 2100
ccctttgaac tctttttcat gatcaatacc agtatcctgt tgatttttat ctttattgta 2160
cttctcatcc actttgaggg ctggaggata tctttttatt ggaatgtttc agtacatcga 2220
gttcttggtt tcaaagaaat agacagacag acagaacagt ttgaatatgc agcatatata 2280
attcatgcct ataaagataa ggattgggtc tgggaacatt tctcttcaat ggaaaaggaa 2340
gaccaatctc tcaaattttg tctggaagaa agggactttg aggcgggtgt ttttgaacta 2400
gaagcaattg ttaacagcat caaaagaagc agaaaaatta tttttgttat aacacaccat 2460
ctattaaaag acccattatg caaaagattc aaggtacatc atgcagttca acaagctatt 2520
gaacaaaatc tggattccat tatattggtt ttccttgagg agattccaga ttataaactg 2580
aaccatgcac tctgtttgcg aagaggaatg tttaaatctc actgcatctt gaactggcca 2640
gttcagaaag aacggatagg tgcctttcgt cataaattgc aagtagcact tggatccaaa 2700
aactctgtac at 2712
<210> 116
<211> 3096
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TLR9
<400> 116
atgggtttct gccgcagcgc cctgcacccg ctgtctctcc tggtgcaggc catcatgctg 60
gccatgaccc tggccctggg taccttgcct gccttcctac cctgtgagct ccagccccac 120
ggcctggtga actgcaactg gctgttcctg aagtctgtgc cccacttctc catggcagca 180
ccccgtggca atgtcaccag cctttccttg tcctccaacc gcatccacca cctccatgat 240
tctgactttg cccacctgcc cagcctgcgg catctcaacc tcaagtggaa ctgcccgccg 300
gttggcctca gccccatgca cttcccctgc cacatgacca tcgagcccag caccttcttg 360
gctgtgccca ccctggaaga gctaaacctg agctacaaca acatcatgac tgtgcctgcg 420
ctgcccaaat ccctcatatc cctgtccctc agccatacca acatcctgat gctagactct 480
gccagcctcg ccggcctgca tgccctgcgc ttcctattca tggacggcaa ctgttattac 540
aagaacccct gcaggcaggc actggaggtg gccccgggtg ccctccttgg cctgggcaac 600
ctcacccacc tgtcactcaa gtacaacaac ctcactgtgg tgccccgcaa cctgccttcc 660
agcctggagt atctgctgtt gtcctacaac cgcatcgtca aactggcgcc tgaggacctg 720
gccaatctga ccgccctgcg tgtgctcgat gtgggcggaa attgccgccg ctgcgaccac 780
gctcccaacc cctgcatgga gtgccctcgt cacttccccc agctacatcc cgataccttc 840
agccacctga gccgtcttga aggcctggtg ttgaaggaca gttctctctc ctggctgaat 900
gccagttggt tccgtgggct gggaaacctc cgagtgctgg acctgagtga gaacttcctc 960
tacaaatgca tcactaaaac caaggccttc cagggcctaa cacagctgcg caagcttaac 1020
ctgtccttca attaccaaaa gagggtgtcc tttgcccacc tgtctctggc cccttccttc 1080
gggagcctgg tcgccctgaa ggagctggac atgcacggca tcttcttccg ctcactcgat 1140
gagaccacgc tccggccact ggcccgcctg cccatgctcc agactctgcg tctgcagatg 1200
aacttcatca accaggccca gctcggcatc ttcagggcct tccctggcct gcgctacgtg 1260
gacctgtcgg acaaccgcat cagcggagct tcggagctga cagccaccat gggggaggca 1320
gatggagggg agaaggtctg gctgcagcct ggggaccttg ctccggcccc agtggacact 1380
cccagctctg aagacttcag gcccaactgc agcaccctca acttcacctt ggatctgtca 1440
cggaacaacc tggtgaccgt gcagccggag atgtttgccc agctctcgca cctgcagtgc 1500
ctgcgcctga gccacaactg catctcgcag gcagtcaatg gctcccagtt cctgccgctg 1560
accggtctgc aggtgctaga cctgtcccac aataagctgg acctctacca cgagcactca 1620
ttcacggagc taccgcgact ggaggccctg gacctcagct acaacagcca gccctttggc 1680
atgcagggcg tgggccacaa cttcagcttc gtggctcacc tgcgcaccct gcgccacctc 1740
agcctggccc acaacaacat ccacagccaa gtgtcccagc agctctgcag tacgtcgctg 1800
cgggccctgg acttcagcgg caatgcactg ggccatatgt gggccgaggg agacctctat 1860
ctgcacttct tccaaggcct gagcggtttg atctggctgg acttgtccca gaaccgcctg 1920
cacaccctcc tgccccaaac cctgcgcaac ctccccaaga gcctacaggt gctgcgtctc 1980
cgtgacaatt acctggcctt ctttaagtgg tggagcctcc acttcctgcc caaactggaa 2040
gtcctcgacc tggcaggaaa ccagctgaag gccctgacca atggcagcct gcctgctggc 2100
acccggctcc ggaggctgga tgtcagctgc aacagcatca gcttcgtggc ccccggcttc 2160
ttttccaagg ccaaggagct gcgagagctc aaccttagcg ccaacgccct caagacagtg 2220
gaccactcct ggtttgggcc cctggcgagt gccctgcaaa tactagatgt aagcgccaac 2280
cctctgcact gcgcctgtgg ggcggccttt atggacttcc tgctggaggt gcaggctgcc 2340
gtgcccggtc tgcccagccg ggtgaagtgt ggcagtccgg gccagctcca gggcctcagc 2400
atctttgcac aggacctgcg cctctgcctg gatgaggccc tctcctggga ctgtttcgcc 2460
ctctcgctgc tggctgtggc tctgggcctg ggtgtgccca tgctgcatca cctctgtggc 2520
tgggacctct ggtactgctt ccacctgtgc ctggcctggc ttccctggcg ggggcggcaa 2580
agtgggcgag atgaggatgc cctgccctac gatgccttcg tggtcttcga caaaacgcag 2640
agcgcagtgg cagactgggt gtacaacgag cttcgggggc agctggagga gtgccgtggg 2700
cgctgggcac tccgcctgtg cctggaggaa cgcgactggc tgcctggcaa aaccctcttt 2760
gagaacctgt gggcctcggt ctatggcagc cgcaagacgc tgtttgtgct ggcccacacg 2820
gaccgggtca gtggtctctt gcgcgccagc ttcctgctgg cccagcagcg cctgctggag 2880
gaccgcaagg acgtcgtggt gctggtgatc ctgagccctg acggccgccg ctcccgctac 2940
gtgcggctgc gccagcgcct ctgccgccag agtgtcctcc tctggcccca ccagcccagt 3000
ggtcagcgca gcttctgggc ccagctgggc atggccctga ccagggacaa ccaccacttc 3060
tataaccgga acttctgcca gggacccacg gccgaa 3096
<210> 117
<211> 3147
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TLR7
<400> 117
atggtgtttc caatgtggac actgaagaga caaattctta tcctttttaa cataatccta 60
atttccaaac tccttggggc tagatggttt cctaaaactc tgccctgtga tgtcactctg 120
gatgttccaa agaaccatgt gatcgtggac tgcacagaca agcatttgac agaaattcct 180
ggaggtattc ccacgaacac cacgaacctc accctcacca ttaaccacat accagacatc 240
tccccagcgt cctttcacag actggaccat ctggtagaga tcgatttcag atgcaactgt 300
gtacctattc cactggggtc aaaaaacaac atgtgcatca agaggctgca gattaaaccc 360
agaagcttta gtggactcac ttatttaaaa tccctttacc tggatggaaa ccagctacta 420
gagataccgc agggcctccc gcctagctta cagcttctca gccttgaggc caacaacatc 480
ttttccatca gaaaagagaa tctaacagaa ctggccaaca tagaaatact ctacctgggc 540
caaaactgtt attatcgaaa tccttgttat gtttcatatt caatagagaa agatgccttc 600
ctaaacttga caaagttaaa agtgctctcc ctgaaagata acaatgtcac agccgtccct 660
actgttttgc catctacttt aacagaacta tatctctaca acaacatgat tgcaaaaatc 720
caagaagatg attttaataa cctcaaccaa ttacaaattc ttgacctaag tggaaattgc 780
cctcgttgtt ataatgcccc atttccttgt gcgccgtgta aaaataattc tcccctacag 840
atccctgtaa atgcttttga tgcgctgaca gaattaaaag ttttacgtct acacagtaac 900
tctcttcagc atgtgccccc aagatggttt aagaacatca acaaactcca ggaactggat 960
ctgtcccaaa acttcttggc caaagaaatt ggggatgcta aatttctgca ttttctcccc 1020
agcctcatcc aattggatct gtctttcaat tttgaacttc aggtctatcg tgcatctatg 1080
aatctatcac aagcattttc ttcactgaaa agcctgaaaa ttctgcggat cagaggatat 1140
gtctttaaag agttgaaaag ctttaacctc tcgccattac ataatcttca aaatcttgaa 1200
gttcttgatc ttggcactaa ctttataaaa attgctaacc tcagcatgtt taaacaattt 1260
aaaagactga aagtcataga tctttcagtg aataaaatat caccttcagg agattcaagt 1320
gaagttggct tctgctcaaa tgccagaact tctgtagaaa gttatgaacc ccaggtcctg 1380
gaacaattac attatttcag atatgataag tatgcaagga gttgcagatt caaaaacaaa 1440
gaggcttctt tcatgtctgt taatgaaagc tgctacaagt atgggcagac cttggatcta 1500
agtaaaaata gtatattttt tgtcaagtcc tctgattttc agcatctttc tttcctcaaa 1560
tgcctgaatc tgtcaggaaa tctcattagc caaactctta atggcagtga attccaacct 1620
ttagcagagc tgagatattt ggacttctcc aacaaccggc ttgatttact ccattcaaca 1680
gcatttgaag agcttcacaa actggaagtt ctggatataa gcagtaatag ccattatttt 1740
caatcagaag gaattactca tatgctaaac tttaccaaga acctaaaggt tctgcagaaa 1800
ctgatgatga acgacaatga catctcttcc tccaccagca ggaccatgga gagtgagtct 1860
cttagaactc tggaattcag aggaaatcac ttagatgttt tatggagaga aggtgataac 1920
agatacttac aattattcaa gaatctgcta aaattagagg aattagacat ctctaaaaat 1980
tccctaagtt tcttgccttc tggagttttt gatggtatgc ctccaaatct aaagaatctc 2040
tctttggcca aaaatgggct caaatctttc agttggaaga aactccagtg tctaaagaac 2100
ctggaaactt tggacctcag ccacaaccaa ctgaccactg tccctgagag attatccaac 2160
tgttccagaa gcctcaagaa tctgattctt aagaataatc aaatcaggag tctgacgaag 2220
tattttctac aagatgcctt ccagttgcga tatctggatc tcagctcaaa taaaatccag 2280
atgatccaaa agaccagctt cccagaaaat gtcctcaaca atctgaagat gttgcttttg 2340
catcataatc ggtttctgtg cacctgtgat gctgtgtggt ttgtctggtg ggttaaccat 2400
acggaggtga ctattcctta cctggccaca gatgtgactt gtgtggggcc aggagcacac 2460
aagggccaaa gtgtgatctc cctggatctg tacacctgtg agttagatct gactaacctg 2520
attctgttct cactttccat atctgtatct ctctttctca tggtgatgat gacagcaagt 2580
cacctctatt tctgggatgt gtggtatatt taccatttct gtaaggccaa gataaagggg 2640
tatcagcgtc taatatcacc agactgttgc tatgatgctt ttattgtgta tgacactaaa 2700
gacccagctg tgaccgagtg ggttttggct gagctggtgg ccaaactgga agacccaaga 2760
gagaaacatt ttaatttatg tctcgaggaa agggactggt taccagggca gccagttctg 2820
gaaaaccttt cccagagcat acagcttagc aaaaagacag tgtttgtgat gacagacaag 2880
tatgcaaaga ctgaaaattt taagatagca ttttacttgt cccatcagag gctcatggat 2940
gaaaaagttg atgtgattat cttgatattt cttgagaagc cctttcagaa gtccaagttc 3000
ctccagctcc ggaaaaggct ctgtgggagt tctgtccttg agtggccaac aaacccgcaa 3060
gctcacccat acttctggca gtgtctaaag aacgccctgg ccacagacaa tcatgtggcc 3120
tatagtcagg tgttcaagga aacggtc 3147
<210> 118
<211> 3177
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TLR8, 同种型1
<400> 118
atgaaggagt catctttgca aaatagctcc tgcagcctgg gaaaggagac taaaaaggaa 60
aacatgttcc ttcagtcgtc aatgctgacc tgcattttcc tgctaatatc tggttcctgt 120
gagttatgcg ccgaagaaaa tttttctaga agctatcctt gtgatgagaa aaagcaaaat 180
gactcagtta ttgcagagtg cagcaatcgt cgactacagg aagttcccca aacggtgggc 240
aaatatgtga cagaactaga cctgtctgat aatttcatca cacacataac gaatgaatca 300
tttcaagggc tgcaaaatct cactaaaata aatctaaacc acaaccccaa tgtacagcac 360
cagaacggaa atcccggtat acaatcaaat ggcttgaata tcacagacgg ggcattcctc 420
aacctaaaaa acctaaggga gttactgctt gaagacaacc agttacccca aataccctct 480
ggtttgccag agtctttgac agaacttagt ctaattcaaa acaatatata caacataact 540
aaagagggca tttcaagact tataaacttg aaaaatctct atttggcctg gaactgctat 600
tttaacaaag tttgcgagaa aactaacata gaagatggag tatttgaaac gctgacaaat 660
ttggagttgc tatcactatc tttcaattct ctttcacacg tgccacccaa actgccaagc 720
tccctacgca aactttttct gagcaacacc cagatcaaat acattagtga agaagatttc 780
aagggattga taaatttaac attactagat ttaagcggga actgtccgag gtgcttcaat 840
gccccatttc catgcgtgcc ttgtgatggt ggtgcttcaa ttaatataga tcgttttgct 900
tttcaaaact tgacccaact tcgataccta aacctctcta gcacttccct caggaagatt 960
aatgctgcct ggtttaaaaa tatgcctcat ctgaaggtgc tggatcttga attcaactat 1020
ttagtgggag aaatagcctc tggggcattt ttaacgatgc tgccccgctt agaaatactt 1080
gacttgtctt ttaactatat aaaggggagt tatccacagc atattaatat ttccagaaac 1140
ttctctaaac ttttgtctct acgggcattg catttaagag gttatgtgtt ccaggaactc 1200
agagaagatg atttccagcc cctgatgcag cttccaaact tatcgactat caacttgggt 1260
attaatttta ttaagcaaat cgatttcaaa cttttccaaa atttctccaa tctggaaatt 1320
atttacttgt cagaaaacag aatatcaccg ttggtaaaag atacccggca gagttatgca 1380
aatagttcct cttttcaacg tcatatccgg aaacgacgct caacagattt tgagtttgac 1440
ccacattcga acttttatca tttcacccgt cctttaataa agccacaatg tgctgcttat 1500
ggaaaagcct tagatttaag cctcaacagt attttcttca ttgggccaaa ccaatttgaa 1560
aatcttcctg acattgcctg tttaaatctg tctgcaaata gcaatgctca agtgttaagt 1620
ggaactgaat tttcagccat tcctcatgtc aaatatttgg atttgacaaa caatagacta 1680
gactttgata atgctagtgc tcttactgaa ttgtccgact tggaagttct agatctcagc 1740
tataattcac actatttcag aatagcaggc gtaacacatc atctagaatt tattcaaaat 1800
ttcacaaatc taaaagtttt aaacttgagc cacaacaaca tttatacttt aacagataag 1860
tataacctgg aaagcaagtc cctggtagaa ttagttttca gtggcaatcg ccttgacatt 1920
ttgtggaatg atgatgacaa caggtatatc tccattttca aaggtctcaa gaatctgaca 1980
cgtctggatt tatcccttaa taggctgaag cacatcccaa atgaagcatt ccttaatttg 2040
ccagcgagtc tcactgaact acatataaat gataatatgt taaagttttt taactggaca 2100
ttactccagc agtttcctcg tctcgagttg cttgacttac gtggaaacaa actactcttt 2160
ttaactgata gcctatctga ctttacatct tcccttcgga cactgctgct gagtcataac 2220
aggatttccc acctaccctc tggctttctt tctgaagtca gtagtctgaa gcacctcgat 2280
ttaagttcca atctgctaaa aacaatcaac aaatccgcac ttgaaactaa gaccaccacc 2340
aaattatcta tgttggaact acacggaaac ccctttgaat gcacctgtga cattggagat 2400
ttccgaagat ggatggatga acatctgaat gtcaaaattc ccagactggt agatgtcatt 2460
tgtgccagtc ctggggatca aagagggaag agtattgtga gtctggagct aacaacttgt 2520
gtttcagatg tcactgcagt gatattattt ttcttcacgt tctttatcac caccatggtt 2580
atgttggctg ccctggctca ccatttgttt tactgggatg tttggtttat atataatgtg 2640
tgtttagcta aggtaaaagg ctacaggtct ctttccacat cccaaacttt ctatgatgct 2700
tacatttctt atgacaccaa agatgcctct gttactgact gggtgataaa tgagctgcgc 2760
taccaccttg aagagagccg agacaaaaac gttctccttt gtctagagga gagggattgg 2820
gacccgggat tggccatcat cgacaacctc atgcagagca tcaaccaaag caagaaaaca 2880
gtatttgttt taaccaaaaa atatgcaaaa agctggaact ttaaaacagc tttttacttg 2940
gctttgcaga ggctaatgga tgagaacatg gatgtgatta tatttatcct gctggagcca 3000
gtgttacagc attctcagta tttgaggcta cggcagcgga tctgtaagag ctccatcctc 3060
cagtggcctg acaacccgaa ggcagaaggc ttgttttggc aaactctgag aaatgtggtc 3120
ttgactgaaa atgattcacg gtataacaat atgtatgtcg attccattaa gcaatac 3177
<210> 119
<211> 636
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 白介素6 (IL-6)
<400> 119
atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60
gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagta cccccaggag aagattccaa agatgtagcc 120
gccccacaca gacagccact cacctcttca gaacgaattg acaaacaaat tcggtacatc 180
ctcgacggca tctcagccct gagaaaggag acatgtaaca agagtaacat gtgtgaaagc 240
agcaaagagg cactggcaga aaacaacctg aaccttccaa agatggctga aaaagatgga 300
tgcttccaat ctggattcaa tgaggagact tgcctggtga aaatcatcac tggtcttttg 360
gagtttgagg tatacctaga gtacctccag aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc 420
agagctgtgc agatgagtac aaaagtcctg atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat 480
ctagatgcaa taaccacccc tgacccaacc acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag 540
gcacagaacc agtggctgca ggacatgaca actcatctca ttctgcgcag ctttaaggag 600
ttcctgcagt ccagcctgag ggctcttcgg caaatg 636
<210> 120
<211> 951
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> MyD88, 同种型1
<400> 120
atgcgacccg accgcgctga ggctccagga ccgcccgcca tggctgcagg aggtcccggc 60
gcggggtctg cggccccggt ctcctccaca tcctcccttc ccctggctgc tctcaacatg 120
cgagtgcggc gccgcctgtc tctgttcttg aacgtgcgga cacaggtggc ggccgactgg 180
accgcgctgg cggaggagat ggactttgag tacttggaga tccggcaact ggagacacaa 240
gcggacccca ctggcaggct gctggacgcc tggcagggac gccctggcgc ctctgtaggc 300
cgactgctcg agctgcttac caagctgggc cgcgacgacg tgctgctgga gctgggaccc 360
agcattgagg aggattgcca aaagtatatc ttgaagcagc agcaggagga ggctgagaag 420
cctttacagg tggccgctgt agacagcagt gtcccacgga cagcagagct ggcgggcatc 480
accacacttg atgaccccct ggggcatatg cctgagcgtt tcgatgcctt catctgctat 540
tgccccagcg acatccagtt tgtgcaggag atgatccggc aactggaaca gacaaactat 600
cgactgaagt tgtgtgtgtc tgaccgcgat gtcctgcctg gcacctgtgt ctggtctatt 660
gctagtgagc tcatcgaaaa gaggttggct agaaggccac ggggtgggtg ccgccggatg 720
gtggtggttg tctctgatga ttacctgcag agcaaggaat gtgacttcca gaccaaattt 780
gcactcagcc tctctccagg tgcccatcag aagcgactga tccccatcaa gtacaaggca 840
atgaagaaag agttccccag catcctgagg ttcatcactg tctgcgacta caccaacccc 900
tgcaccaaat cttggttctg gactcgcctt gccaaggcct tgtccctgcc c 951
<210> 121
<211> 807
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 白介素 1-beta (IL-1beta)
<400> 121
atggcagaag tacctgagct cgccagtgaa atgatggctt attacagtgg caatgaggat 60
gacttgttct ttgaagctga tggccctaaa cagatgaagt gctccttcca ggacctggac 120
ctctgccctc tggatggcgg catccagcta cgaatctccg accaccacta cagcaagggc 180
ttcaggcagg ccgcgtcagt tgttgtggcc atggacaagc tgaggaagat gctggttccc 240
tgcccacaga ccttccagga gaatgacctg agcaccttct ttcccttcat ctttgaagaa 300
gaacctatct tcttcgacac atgggataac gaggcttatg tgcacgatgc acctgtacga 360
tcactgaact gcacgctccg ggactcacag caaaaaagct tggtgatgtc tggtccatat 420
gaactgaaag ctctccacct ccagggacag gatatggagc aacaagtggt gttctccatg 480
tcctttgtac aaggagaaga aagtaatgac aaaatacctg tggccttggg cctcaaggaa 540
aagaatctgt acctgtcctg cgtgttgaaa gatgataagc ccactctaca gctggagagt 600
gtagatccca aaaattaccc aaagaagaag atggaaaagc gatttgtctt caacaagata 660
gaaatcaata acaagctgga atttgagtct gcccagttcc ccaactggta catcagcacc 720
tctcaagcag aaaacatgcc cgtcttcctg ggagggacca aaggcggcca ggatataact 780
gacttcacca tgcaatttgt gtcttcc 807
<210> 122
<211> 3075
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> MDA5/IFIH1, 同种型1
<400> 122
atgtcgaatg ggtattccac agacgagaat ttccgctatc tcatctcgtg cttcagggcc 60
agggtgaaaa tgtacatcca ggtggagcct gtgctggact acctgacctt tctgcctgca 120
gaggtgaagg agcagattca gaggacagtc gccacctccg ggaacatgca ggcagttgaa 180
ctgctgctga gcaccttgga gaagggagtc tggcaccttg gttggactcg ggaattcgtg 240
gaggccctcc ggagaaccgg cagccctctg gccgcccgct acatgaaccc tgagctcacg 300
gacttgccct ctccatcgtt tgagaacgct catgatgaat atctccaact gctgaacctc 360
cttcagccca ctctggtgga caagcttcta gttagagacg tcttggataa gtgcatggag 420
gaggaactgt tgacaattga agacagaaac cggattgctg ctgcagaaaa caatggaaat 480
gaatcaggtg taagagagct actaaaaagg attgtgcaga aagaaaactg gttctctgca 540
tttctgaatg ttcttcgtca aacaggaaac aatgaacttg tccaagagtt aacaggctct 600
gattgctcag aaagcaatgc agagattgag aatttatcac aagttgatgg tcctcaagtg 660
gaagagcaac ttctttcaac cacagttcag ccaaatctgg agaaggaggt ctggggcatg 720
gagaataact catcagaatc atcttttgca gattcttctg tagtttcaga atcagacaca 780
agtttggcag aaggaagtgt cagctgctta gatgaaagtc ttggacataa cagcaacatg 840
ggcagtgatt caggcaccat gggaagtgat tcagatgaag agaatgtggc agcaagagca 900
tccccggagc cagaactcca gctcaggcct taccaaatgg aagttgccca gccagccttg 960
gaagggaaga atatcatcat ctgcctccct acagggagtg gaaaaaccag agtggctgtt 1020
tacattgcca aggatcactt agacaagaag aaaaaagcat ctgagcctgg aaaagttata 1080
gttcttgtca ataaggtact gctagttgaa cagctcttcc gcaaggagtt ccaaccattt 1140
ttgaagaaat ggtatcgtgt tattggatta agtggtgata cccaactgaa aatatcattt 1200
ccagaagttg tcaagtcctg tgatattatt atcagtacag ctcaaatcct tgaaaactcc 1260
ctcttaaact tggaaaatgg agaagatgct ggtgttcaat tgtcagactt ttccctcatt 1320
atcattgatg aatgtcatca caccaacaaa gaagcagtgt ataataacat catgaggcat 1380
tatttgatgc agaagttgaa aaacaataga ctcaagaaag aaaacaaacc agtgattccc 1440
cttcctcaga tactgggact aacagcttca cctggtgttg gaggggccac gaagcaagcc 1500
aaagctgaag aacacatttt aaaactatgt gccaatcttg atgcatttac tattaaaact 1560
gttaaagaaa accttgatca actgaaaaac caaatacagg agccatgcaa gaagtttgcc 1620
attgcagatg caaccagaga agatccattt aaagagaaac ttctagaaat aatgacaagg 1680
attcaaactt attgtcaaat gagtccaatg tcagattttg gaactcaacc ctatgaacaa 1740
tgggccattc aaatggaaaa aaaagctgca aaagaaggaa atcgcaaaga acgtgtttgt 1800
gcagaacatt tgaggaagta caatgaggcc ctacaaatta atgacacaat tcgaatgata 1860
gatgcgtata ctcatcttga aactttctat aatgaagaga aagataagaa gtttgcagtc 1920
atagaagatg atagtgatga gggtggtgat gatgagtatt gtgatggtga tgaagatgag 1980
gatgatttaa agaaaccttt gaaactggat gaaacagata gatttctcat gactttattt 2040
tttgaaaaca ataaaatgtt gaaaaggctg gctgaaaacc cagaatatga aaatgaaaag 2100
ctgaccaaat taagaaatac cataatggag caatatacta ggactgagga atcagcacga 2160
ggaataatct ttacaaaaac acgacagagt gcatatgcgc tttcccagtg gattactgaa 2220
aatgaaaaat ttgctgaagt aggagtcaaa gcccaccatc tgattggagc tggacacagc 2280
agtgagttca aacccatgac acagaatgaa caaaaagaag tcattagtaa atttcgcact 2340
ggaaaaataa atctgcttat cgctaccaca gtggcagaag aaggtctgga tattaaagaa 2400
tgtaacattg ttatccgtta tggtctcgtc accaatgaaa tagccatggt ccaggcccgt 2460
ggtcgagcca gagctgatga gagcacctac gtcctggttg ctcacagtgg ttcaggagtt 2520
atcgaacatg agacagttaa tgatttccga gagaagatga tgtataaagc tatacattgt 2580
gttcaaaata tgaaaccaga ggagtatgct cataagattt tggaattaca gatgcaaagt 2640
ataatggaaa agaaaatgaa aaccaagaga aatattgcca agcattacaa gaataaccca 2700
tcactaataa ctttcctttg caaaaactgc agtgtgctag cctgttctgg ggaagatatc 2760
catgtaattg agaaaatgca tcacgtcaat atgaccccag aattcaagga actttacatt 2820
gtaagagaaa acaaagcact gcaaaagaag tgtgccgact atcaaataaa tggtgaaatc 2880
atctgcaaat gtggccaggc ttggggaaca atgatggtgc acaaaggctt agatttgcct 2940
tgtctcaaaa taaggaattt tgtagtggtt ttcaaaaata attcaacaaa gaaacaatac 3000
aaaaagtggg tagaattacc tatcacattt cccaatcttg actattcaga atgctgttta 3060
tttagtgatg aggat 3075
<210> 123
<211> 1620
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IPS-1/MAVS, 同种型1
<400> 123
atgccgtttg ctgaagacaa gacctataag tatatctgcc gcaatttcag caatttttgc 60
aatgtggatg ttgtagagat tctgccttac ctgccctgcc tcacagcaag agaccaggat 120
cgactgcggg ccacctgcac actctcaggg aaccgggaca ccctctggca tctcttcaat 180
acccttcagc ggcggcccgg ctgggtggag tacttcattg cggcactgag gggctgtgag 240
ctagttgatc tcgcggacga agtggcctct gtctaccaga gctaccagcc tcggacctcg 300
gaccgtcccc cagacccact ggagccaccg tcacttcctg ctgagaggcc agggcccccc 360
acacctgctg cggcccacag catcccctac aacagctgca gagagaagga gccaagttac 420
cccatgcctg tccaggagac ccaggcgcca gagtccccag gagagaattc agagcaagcc 480
ctgcagacgc tcagccccag agccatccca aggaatccag atggtggccc cctggagtcc 540
tcctctgacc tggcagccct cagccctctg acctccagcg ggcatcagga gcaggacaca 600
gaactgggca gtacccacac agcaggtgcg acctccagcc tcacaccatc ccgtgggcct 660
gtgtctccat ctgtctcctt ccagcccctg gcccgttcca cccccagggc aagccgcttg 720
cctggaccca cagggtcagt tgtatctact ggcacctcct tctcctcctc atcccctggc 780
ttggcctctg caggggctgc agagggtaaa cagggtgcag agagtgacca ggccgagcct 840
atcatctgct ccagtggggc agaggcacct gccaactctc tgccctccaa agtgcctacc 900
accttgatgc ctgtgaacac agtggccctg aaagtgcctg ccaacccagc atctgtcagc 960
acagtgccct ccaagttgcc aactagctca aagccccctg gtgcagtgcc ttctaatgcg 1020
ctcaccaatc cagcaccatc caaattgccc atcaactcaa cccgtgctgg catggtgcca 1080
tccaaagtgc ctactagcat ggtgctcacc aaggtgtctg ccagcacagt ccccactgac 1140
gggagcagca gaaatgagga gaccccagca gctccaacac ccgccggcgc cactggaggc 1200
agctcagcct ggctagacag cagctctgag aataggggcc ttgggtcgga gctgagtaag 1260
cctggcgtgc tggcatccca ggtagacagc ccgttctcgg gctgcttcga ggatcttgcc 1320
atcagtgcca gcacctcctt gggcatgggg ccctgccatg gcccagagga gaatgagtat 1380
aagtccgagg gcacctttgg gatccacgtg gctgagaacc ccagcatcca gctcctggag 1440
ggcaaccctg ggccacctgc ggacccggat ggcggcccca ggccacaagc cgaccggaag 1500
ttccaggaga gggaggtgcc atgccacagg ccctcacctg gggctctgtg gctccaggtg 1560
gctgtgacag gggtgctggt agtcacactc ctggtggtgc tgtaccggcg gcgtctgcac 1620
<210> 124
<211> 2775
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> RIG-1/DDX58, 同种型1
<400> 124
atgaccaccg agcagcgacg cagcctgcaa gccttccagg attatatccg gaagaccctg 60
gaccctacct acatcctgag ctacatggcc ccctggttta gggaggaaga ggtgcagtat 120
attcaggctg agaaaaacaa caagggccca atggaggctg ccacactttt tctcaagttc 180
ctgttggagc tccaggagga aggctggttc cgtggctttt tggatgccct agaccatgca 240
ggttattctg gactttatga agccattgaa agttgggatt tcaaaaaaat tgaaaagttg 300
gaggagtata gattactttt aaaacgttta caaccagaat ttaaaaccag aattatccca 360
accgatatca tttctgatct gtctgaatgt ttaattaatc aggaatgtga agaaattcta 420
cagatttgct ctactaaggg gatgatggca ggtgcagaga aattggtgga atgccttctc 480
agatcagaca aggaaaactg gcccaaaact ttgaaacttg ctttggagaa agaaaggaac 540
aagttcagtg aactgtggat tgtagagaaa ggtataaaag atgttgaaac agaagatctt 600
gaggataaga tggaaacttc tgacatacag attttctacc aagaagatcc agaatgccag 660
aatcttagtg agaattcatg tccaccttca gaagtgtctg atacaaactt gtacagccca 720
tttaaaccaa gaaattacca attagagctt gctttgcctg ctatgaaagg aaaaaacaca 780
ataatatgtg ctcctacagg ttgtggaaaa acctttgttt cactgcttat atgtgaacat 840
catcttaaaa aattcccaca aggacaaaag gggaaagttg tcttttttgc gaatcagatc 900
ccagtgtatg aacagcagaa atctgtattc tcaaaatact ttgaaagaca tgggtataga 960
gttacaggca tttctggagc aacagctgag aatgtcccag tggaacagat tgttgagaac 1020
aatgacatca tcattttaac tccacagatt cttgtgaaca accttaaaaa gggaacgatt 1080
ccatcactat ccatctttac tttgatgata tttgatgaat gccacaacac tagtaaacaa 1140
cacccgtaca atatgatcat gtttaattat ctagatcaga aacttggagg atcttcaggc 1200
ccactgcccc aggtcattgg gctgactgcc tcggttggtg ttggggatgc caaaaacaca 1260
gatgaagcct tggattatat ctgcaagctg tgtgcttctc ttgatgcgtc agtgatagca 1320
acagtcaaac acaatctgga ggaactggag caagttgttt ataagcccca gaagtttttc 1380
aggaaagtgg aatcacggat tagcgacaaa tttaaataca tcatagctca gctgatgagg 1440
gacacagaga gtctggcaaa gagaatctgc aaagacctcg aaaacttatc tcaaattcaa 1500
aatagggaat ttggaacaca gaaatatgaa caatggattg ttacagttca gaaagcatgc 1560
atggtgttcc agatgccaga caaagatgaa gagagcagga tttgtaaagc cctgttttta 1620
tacacttcac atttgcggaa atataatgat gccctcatta tcagtgagca tgcacgaatg 1680
aaagatgctc tggattactt gaaagacttc ttcagcaatg tccgagcagc aggattcgat 1740
gagattgagc aagatcttac tcagagattt gaagaaaagc tgcaggaact agaaagtgtt 1800
tccagggatc ccagcaatga gaatcctaaa cttgaagacc tctgcttcat cttacaagaa 1860
gagtaccact taaacccaga gacaataaca attctctttg tgaaaaccag agcacttgtg 1920
gacgctttaa aaaattggat tgaaggaaat cctaaactca gttttctaaa acctggcata 1980
ttgactggac gtggcaaaac aaatcagaac acaggaatga ccctcccggc acagaagtgt 2040
atattggatg cattcaaagc cagtggagat cacaatattc tgattgccac ctcagttgct 2100
gatgaaggca ttgacattgc acagtgcaat cttgtcatcc tttatgagta tgtgggcaat 2160
gtcatcaaaa tgatccaaac cagaggcaga ggaagagcaa gaggtagcaa gtgcttcctt 2220
ctgactagta atgctggtgt aattgaaaaa gaacaaataa acatgtacaa agaaaaaatg 2280
atgaatgact ctattttacg ccttcagaca tgggacgaag cagtatttag ggaaaagatt 2340
ctgcatatac agactcatga aaaattcatc agagatagtc aagaaaaacc aaaacctgta 2400
cctgataagg aaaataaaaa actgctctgc agaaagtgca aagccttggc atgttacaca 2460
gctgacgtaa gagtgataga ggaatgccat tacactgtgc ttggagatgc ttttaaggaa 2520
tgctttgtga gtagaccaca tcccaagcca aagcagtttt caagttttga aaaaagagca 2580
aagatattct gtgcccgaca gaactgcagc catgactggg gaatccatgt gaagtacaag 2640
acatttgaga ttccagttat aaaaattgaa agttttgtgg tggaggatat tgcaactgga 2700
gttcagacac tgtactcgaa gtggaaggac tttcattttg agaagatacc atttgatcca 2760
gcagaaatgt ccaaa 2775
<210> 125
<211> 1494
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IRF5, 转录物变体2
<400> 125
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360
tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420
ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480
gaggatgtca agtggccgcc cactctgcag ccgcccactc tgcggccgcc tactctgcag 540
ccgcccactc tgcagccgcc cgtggtgctg ggtccccctg ctccagaccc cagccccctg 600
gctcctcccc ctggcaaccc tgctggcttc agggagcttc tctctgaggt cctggagcct 660
gggcccctgc ctgccagcct gccccctgca ggcgaacagc tcctgccaga cctgctgatc 720
agcccccaca tgctgcctct gaccgacctg gagatcaagt ttcagtaccg ggggcggcca 780
ccccgggccc tcaccatcag caacccccat ggctgccggc tcttctacag ccagctggag 840
gccacccagg agcaggtgga actcttcggc cccataagcc tggagcaagt gcgcttcccc 900
agccctgagg acatccccag tgacaagcag cgcttctaca cgaaccagct gctggatgtc 960
ctggaccgcg ggctcatcct ccagctacag ggccaggacc tttatgccat ccgcctgtgt 1020
cagtgcaagg tgttctggag cgggccttgt gcctcagccc atgactcatg ccccaacccc 1080
atccagcggg aggtcaagac caagcttttc agcctggagc attttctcaa tgagctcatc 1140
ctgttccaaa agggccagac caacacccca ccacccttcg agatcttctt ctgctttggg 1200
gaagaatggc ctgaccgcaa accccgagag aagaagctca ttactgtaca ggtggtgcct 1260
gtagcagctc gactgctgct ggagatgttc tcaggggagc tatcttggtc agctgatagt 1320
atccggctac agatctcaaa cccagacctc aaagaccgca tggtggagca attcaaggag 1380
ctccatcaca tctggcagtc ccagcagcgg ttgcagcctg tggcccaggc ccctcctgga 1440
gcaggccttg gtgttggcca ggggccctgg cctatgcacc cagctggcat gcaa 1494
<210> 126
<211> 1284
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IRF3, 同种型1
<400> 126
accatgggaa ccccaaagcc acggatcctg ccctggctgg tgtcgcagct ggacctgggg 60
caactggagg gcgtggcctg ggtgaacaag agccgcacgc gcttccgcat cccttggaag 120
cacggcctac ggcaggatgc acagcaggag gatttcggaa tcttccaggc ctgggccgag 180
gccactggtg catatgttcc cgggagggat aagccagacc tgccaacctg gaagaggaat 240
ttccgctctg ccctcaaccg caaagaaggg ttgcgtttag cagaggaccg gagcaaggac 300
cctcacgacc cacataaaat ctacgagttt gtgaactcag gagttgggga cttttcccag 360
ccagacacct ctccggacac caatggtgga ggcagtactt ctgataccca ggaagacatt 420
ctggatgagt tactgggtaa catggtgttg gccccactcc cagatccggg acccccaagc 480
ctggctgtag cccctgagcc ctgccctcag cccctgcgga gccccagctt ggacaatccc 540
actcccttcc caaacctggg gccctctgag aacccactga agcggctgtt ggtgccgggg 600
gaagagtggg agttcgaggt gacagccttc taccggggcc gccaagtctt ccagcagacc 660
atctcctgcc cggagggcct gcggctggtg gggtccgaag tgggagacag gacgctgcct 720
ggatggccag tcacactgcc agaccctggc atgtccctga cagacagggg agtgatgagc 780
tacgtgaggc atgtgctgag ctgcctgggt gggggactgg ctctctggcg ggccgggcag 840
tggctctggg cccagcggct ggggcactgc cacacatact gggcagtgag cgaggagctg 900
ctccccaaca gcgggcatgg gcctgatggc gaggtcccca aggacaagga aggaggcgtg 960
tttgacctgg ggcccttcat tgtagatctg attaccttca cggaaggaag cggacgctca 1020
ccacgctatg ccctctggtt ctgtgtgggg gagtcatggc cccaggacca gccgtggacc 1080
aagaggctcg tgatggtcaa ggttgtgccc acgtgcctca gggccttggt agaaatggcc 1140
cgggtagggg gtgcctcctc cctggagaat actgtggacc tgcacatttc caacagccac 1200
ccactctccc tcacctccga ccagtacaag gcctacctgc aggacttggt ggagggcatg 1260
gatttccagg gccctgggga gagc 1284
<210> 127
<211> 1275
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TANK
<400> 127
atggataaaa acattggcga gcaactcaat aaagcgtatg aagccttccg gcaggcatgc 60
atggatagag attctgcagt aaaagaatta cagcaaaaga ctgagaacta tgagcagaga 120
atacgtgaac aacaggaaca gctgtcactt caacagacta ttattgacaa gctaaaatct 180
cagttacttc ttgtgaattc cactcaagat aacaattatg gctgtgttcc tctgcttgaa 240
gacagtgaaa caagaaagaa taatttgact cttgatcagc cacaagataa agtgatttca 300
ggaatagcaa gagaaaaact accaaaggta agaagacaag aggtttcttc tcctagaaaa 360
gaaacttcag caaggagtct tggcagtcct ttgctccatg aaaggggtaa tatagagaag 420
actttctggg atctgaaaga agaatttcat aaaatatgca tgctagcaaa agcacagaaa 480
gaccacttaa gcaaacttaa tataccagac actgcaactg aaacacagtg ctctgtgcct 540
atacagtgta cggataaaac agataaacaa gaagcgctgt ttaagcctca ggctaaagat 600
gatataaata gaggtgcacc atccatcaca tctgtcacac caagaggact gtgcagagat 660
gaggaagaca cctcttttga atcactttct aaattcaatg tcaagtttcc acctatggac 720
aatgactcaa ctttcttaca tagcactcca gagagacccg gcatccttag tcctgccacg 780
tctgaggcag tgtgccaaga gaaatttaat atggagttca gagacaaccc agggaacttt 840
gttaaaacag aagaaacttt atttgaaatt cagggaattg accccatagc ttcagctata 900
caaaacctta aaacaactga caaaacaaag ccctcaaatc tcgtaaacac ttgtatcagg 960
acaactctgg atagagctgc gtgtttgcca cctggagacc ataatgcatt atatgtaaat 1020
agcttcccac ttctggaccc atctgatgca ccttttccct cactcgattc cccgggaaaa 1080
gcaatccgag gaccacagca gcccatttgg aagccctttc ctaatcaaga cagtgactcg 1140
gtggtactaa gtggcacaga ctcagaactg catatacctc gagtatgtga attctgtcaa 1200
gcagttttcc caccatccat tacatccagg ggggatttcc ttcggcatct taattcacac 1260
ttcaatggag agact 1275
<210> 128
<211> 2136
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TRIF/TICAM1
<400> 128
atggcctgca caggcccatc acttcctagc gccttcgaca ttctaggtgc agcaggccag 60
gacaagctct tgtatctgaa gcacaaactg aagaccccac gcccaggctg ccaggggcag 120
gacctcctgc atgccatggt tctcctgaag ctgggccagg aaactgaggc caggatctct 180
ctagaggcat tgaaggccga tgcggtggcc cggctggtgg cccgccagtg ggctggcgtg 240
gacagcaccg aggacccaga ggagccccca gatgtgtcct gggctgtggc ccgcttgtac 300
cacctgctgg ctgaggagaa gctgtgcccc gcctcgctgc gggacgtggc ctaccaggaa 360
gccgtccgca ccctcagctc cagggacgac caccggctgg gggaacttca ggatgaggcc 420
cgaaaccggt gtgggtggga cattgctggg gatccaggga gcatccggac gctccagtcc 480
aatctgggct gcctcccacc atcctcggct ttgccctctg ggaccaggag cctcccacgc 540
cccattgacg gtgtttcgga ctggagccaa gggtgctccc tgcgatccac tggcagccct 600
gcctccctgg ccagcaactt ggaaatcagc cagtccccta ccatgccctt cctcagcctg 660
caccgcagcc cacatgggcc cagcaagctc tgtgacgacc cccaggccag cttggtgccc 720
gagcctgtcc ccggtggctg ccaggagcct gaggagatga gctggccgcc atcgggggag 780
attgccagcc caccagagct gccaagcagc ccacctcctg ggcttcccga agtggcccca 840
gatgcaacct ccactggcct ccctgatacc cccgcagctc cagaaaccag caccaactac 900
ccagtggagt gcaccgaggg gtctgcaggc ccccagtctc tccccttgcc tattctggag 960
ccggtcaaaa acccctgctc tgtcaaagac cagacgccac tccaactttc tgtagaagat 1020
accacctctc caaataccaa gccgtgccca cctactccca ccaccccaga aacatcccct 1080
cctcctcctc ctcctcctcc ttcatctact ccttgttcag ctcacctgac cccctcctcc 1140
ctgttccctt cctccctgga atcatcatcg gaacagaaat tctataactt tgtgatcctc 1200
cacgccaggg cagacgaaca catcgccctg cgggttcggg agaagctgga ggcccttggc 1260
gtgcccgacg gggccacctt ctgcgaggat ttccaggtgc cggggcgcgg ggagctgagc 1320
tgcctgcagg acgccataga ccactcagct ttcatcatcc tacttctcac ctccaacttc 1380
gactgtcgcc tgagcctgca ccaggtgaac caagccatga tgagcaacct cacgcgacag 1440
gggtcgccag actgtgtcat ccccttcctg cccctggaga gctccccggc ccagctcagc 1500
tccgacacgg ccagcctgct ctccgggctg gtgcggctgg acgaacactc ccagatcttc 1560
gccaggaagg tggccaacac cttcaagccc cacaggcttc aggcccgaaa ggccatgtgg 1620
aggaaggaac aggacacccg agccctgcgg gaacagagcc aacacctgga cggtgagcgg 1680
atgcaggcgg cggcactgaa cgcagcctac tcagcctacc tccagagcta cttgtcctac 1740
caggcacaga tggagcagct ccaggtggct tttgggagcc acatgtcatt tgggactggg 1800
gcgccctatg gggctcgaat gccctttggg ggccaggtgc ccctgggagc cccgccaccc 1860
tttcccactt ggccggggtg cccgcagccg ccacccctgc acgcatggca ggctggcacc 1920
cccccaccgc cctccccaca gccagcagcc tttccacagt cactgccctt cccgcagtcc 1980
ccagccttcc ctacggcctc acccgcaccc cctcagagcc cagggctgca acccctcatt 2040
atccaccacg cacagatggt acagctgggg ctgaacaacc acatgtggaa ccagagaggg 2100
tcccaggcgc ccgaggacaa gacgcaggag gcagaa 2136
<210> 129
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Batf3
<400> 129
atgtcgcaag ggctcccggc cgccggcagc gtcctgcaga ggagcgtcgc ggcgcccggg 60
aaccagccgc agccgcagcc gcagcagcag agccctgagg atgatgacag gaaggtccga 120
aggagagaaa aaaaccgagt tgctgctcag agaagtcgga agaagcagac ccagaaggct 180
gacaagctcc atgaggaata tgagagcctg gagcaagaaa acaccatgct gcggagagag 240
atcgggaagc tgacagagga gctgaagcac ctgacagagg cactgaagga gcacgagaag 300
atgtgcccgc tgctgctctg ccctatgaac tttgtgccag tgcctccccg gccggaccct 360
gtggccggct gcttgccccg a 381
<210> 130
<211> 459
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-4, 同种型1
<400> 130
atgggtctca cctcccaact gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg tgccggcaac 60
tttgtccacg gacacaagtg cgatatcacc ttacaggaga tcatcaaaac tttgaacagc 120
ctcacagagc agaagactct gtgcaccgag ttgaccgtaa cagacatctt tgctgcctcc 180
aagaacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 240
agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac 300
aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg 360
aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta 420
aagacgatca tgagagagaa atattcaaag tgttcgagc 459
<210> 131
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-10
<400> 131
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360
ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420
caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480
tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaac 534
<210> 132
<211> 759
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-12 alpha
<400> 132
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcc 759
<210> 133
<211> 986
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-12 beta
<400> 133
agatgtgtca ccagcagttg gtcatctctt ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc 60
tcgtggccat atgggaactg aagaaagatg tttatgtcgt agaattggat tggtatccgg 120
atgcccctgg agaaatggtg gtcctcacct gtgacacccc tgaagaagat ggtatcacct 180
ggaccttgga ccagagcagt gaggtcttag gctctggcaa aaccctgacc atccaagtca 240
aagagtttgg agatgctggc cagtacacct gtcacaaagg aggcgaggtt ctaagccatt 300
cgctcctgct gcttcacaaa aaggaagatg gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc 360
agaaagaacc caaaaataag acctttctaa gatgcgaggc caagaattat tctggacgtt 420
tcacctgctg gtggctgacg acaatcagta ctgatttgac attcagtgtc aaaagcagca 480
gaggctcttc tgacccccaa ggggtgacgt gcggagctgc tacactctct gcagagagag 540
tcagagggga caacaaggag tatgagtact cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc 600
cagctgctga ggagagtctg cccattgagg tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt 660
atgaaaacta caccagcagc ttcttcatca gggacatcat caaacctgac ccacccaaga 720
acttgcagct gaagccatta aagaattctc ggcaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg 780
acacctggag tactccacat tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca 840
agagcaagag agaaaagaaa gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct 900
gccgcaaaaa tgccagcatt agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga 960
gcgaatgggc atctgtgccc tgcagt 986
<210> 134
<211> 276
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> MIP-1 alpha/ CCL3
<400> 134
atgcaggtct ccactgctgc ccttgctgtc ctcctctgca ccatggctct ctgcaaccag 60
ttctctgcat cacttgctgc tgacacgccg accgcctgct gcttcagcta cacctcccgg 120
cagattccac agaatttcat agctgactac tttgagacga gcagccagtg ctccaagccc 180
ggtgtcatct tcctaaccaa gcgaagccgg caggtctgtg ctgaccccag tgaggagtgg 240
gtccagaaat atgtcagcga cctggagctg agtgcc 276
<210> 135
<211> 1530
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD39/ENTPD1, 同种型1
<400> 135
atggaagata caaaggagtc taacgtgaag acattttgct ccaagaatat cctagccatc 60
cttggcttct cctctatcat agctgtgata gctttgcttg ctgtggggtt gacccagaac 120
aaagcattgc cagaaaacgt taagtatggg attgtgctgg atgcgggttc ttctcacaca 180
agtttataca tctataagtg gccagcagaa aaggagaatg acacaggcgt ggtgcatcaa 240
gtagaagaat gcagggttaa aggtcctgga atctcaaaat ttgttcagaa agtaaatgaa 300
ataggcattt acctgactga ttgcatggaa agagctaggg aagtgattcc aaggtcccag 360
caccaagaga cacccgttta cctgggagcc acggcaggca tgcggttgct caggatggaa 420
agtgaagagt tggcagacag ggttctggat gtggtggaga ggagcctcag caactacccc 480
tttgacttcc agggtgccag gatcattact ggccaagagg aaggtgccta tggctggatt 540
actatcaact atctgctggg caaattcagt cagaaaacaa ggtggttcag catagtccca 600
tatgaaacca ataatcagga aacctttgga gctttggacc ttgggggagc ctctacacaa 660
gtcacttttg taccccaaaa ccagactatc gagtccccag ataatgctct gcaatttcgc 720
ctctatggca aggactacaa tgtctacaca catagcttct tgtgctatgg gaaggatcag 780
gcactctggc agaaactggc caaggacatt caggttgcaa gtaatgaaat tctcagggac 840
ccatgctttc atcctggata taagaaggta gtgaacgtaa gtgaccttta caagaccccc 900
tgcaccaaga gatttgagat gactcttcca ttccagcagt ttgaaatcca gggtattgga 960
aactatcaac aatgccatca aagcatcctg gagctcttca acaccagtta ctgcccttac 1020
tcccagtgtg ccttcaatgg gattttcttg ccaccactcc agggggattt tggggcattt 1080
tcagcttttt actttgtgat gaagttttta aacttgacat cagagaaagt ctctcaggaa 1140
aaggtgactg agatgatgaa aaagttctgt gctcagcctt gggaggagat aaaaacatct 1200
tacgctggag taaaggagaa gtacctgagt gaatactgct tttctggtac ctacattctc 1260
tccctccttc tgcaaggcta tcatttcaca gctgattcct gggagcacat ccatttcatt 1320
ggcaagatcc agggcagcga cgccggctgg actttgggct acatgctgaa cctgaccaac 1380
atgatcccag ctgagcaacc attgtccaca cctctctccc actccaccta tgtcttcctc 1440
atggttctat tctccctggt ccttttcaca gtggccatca taggcttgct tatctttcac 1500
aagccttcat atttctggaa agatatggta 1530
<210> 136
<211> 1722
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD73/NT5E, 同种型1
<400> 136
atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60
tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120
ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180
gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240
ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300
gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360
gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420
agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480
tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540
accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600
caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660
tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720
ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780
gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840
tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900
atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960
aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020
aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080
ggcaacctga tttgtgatgc aatgattaac aacaacctga gacacacgga tgaaatgttc 1140
tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200
cgcaacaatg gcacaattac ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca 1260
tttgacctag tccagttaaa aggttccacc ctgaagaagg cctttgagca tagcgtgcac 1320
cgctacggcc agtccactgg agagttcctg caggtgggcg gaatccatgt ggtgtatgat 1380
ctttcccgaa aacctggaga cagagtagtc aaattagatg ttctttgcac caagtgtcga 1440
gtgcccagtt atgaccctct caaaatggac gaggtatata aggtgatcct cccaaacttc 1500
ctggccaatg gtggagatgg gttccagatg ataaaagatg aattattaag acatgactct 1560
ggtgaccaag atatcaacgt ggtttctaca tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca 1620
gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca ggaagtcact gccatggaag cttttcttta 1680
atatttcttt cactttgggc agtgatcttt gttttatacc aa 1722
<210> 137
<211> 297
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-8 (CXCL8)
<400> 137
atgacttcca agctggccgt ggctctcttg gcagccttcc tgatttctgc agctctgtgt 60
gaaggtgcag ttttgccaag gagtgctaaa gaacttagat gtcagtgcat aaagacatac 120
tccaaacctt tccaccccaa atttatcaaa gaactgagag tgattgagag tggaccacac 180
tgcgccaaca cagaaattat tgtaaagctt tctgatggaa gagagctctg tctggacccc 240
aaggaaaact gggtgcagag ggttgtggag aagtttttga agagggctga gaattca 297
<210> 138
<211> 1596
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ICAM1
<400> 138
atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60
ttcccaggac ctggcaatgc ccagacatct gtgtccccct caaaagtcat cctgccccgg 120
ggaggctccg tgctggtgac atgcagcacc tcctgtgacc agcccaagtt gttgggcata 180
gagaccccgt tgcctaaaaa ggagttgctc ctgcctggga acaaccggaa ggtgtatgaa 240
ctgagcaatg tgcaagaaga tagccaacca atgtgctatt caaactgccc tgatgggcag 300
tcaacagcta aaaccttcct caccgtgtac tggactccag aacgggtgga actggcaccc 360
ctcccctctt ggcagccagt gggcaagaac cttaccctac gctgccaggt ggagggtggg 420
gcaccccggg ccaacctcac cgtggtgctg ctccgtgggg agaaggagct gaaacgggag 480
ccagctgtgg gggagcccgc tgaggtcacg accacggtgc tggtgaggag agatcaccat 540
ggagccaatt tctcgtgccg cactgaactg gacctgcggc cccaagggct ggagctgttt 600
gagaacacct cggcccccta ccagctccag acctttgtcc tgccagcgac tcccccacaa 660
cttgtcagcc cccgggtcct agaggtggac acgcagggga ccgtggtctg ttccctggac 720
gggctgttcc cagtctcgga ggcccaggtc cacctggcac tgggggacca gaggttgaac 780
cccacagtca cctatggcaa cgactccttc tcggccaagg cctcagtcag tgtgaccgca 840
gaggacgagg gcacccagcg gctgacgtgt gcagtaatac tggggaacca gagccaggag 900
acactgcaga cagtgaccat ctacagcttt ccggcgccca acgtgattct gacgaagcca 960
gaggtctcag aagggaccga ggtgacagtg aagtgtgagg cccaccctag agccaaggtg 1020
acgctgaatg gggttccagc ccagccactg ggcccgaggg cccagctcct gctgaaggcc 1080
accccagagg acaacgggcg cagcttctcc tgctctgcaa ccctggaggt ggccggccag 1140
cttatacaca agaaccagac ccgggagctt cgtgtcctgt atggcccccg actggacgag 1200
agggattgtc cgggaaactg gacgtggcca gaaaattccc agcagactcc aatgtgccag 1260
gcttggggga acccattgcc cgagctcaag tgtctaaagg atggcacttt cccactgccc 1320
atcggggaat cagtgactgt cactcgagat cttgagggca cctacctctg tcgggccagg 1380
agcactcaag gggaggtcac ccgcaaggtg accgtgaatg tgctctcccc ccggtatgag 1440
attgtcatca tcactgtggt agcagccgca gtcataatgg gcactgcagg cctcagcacg 1500
tacctctata accgccagcg gaagatcaag aaatacagac tacaacaggc ccaaaaaggg 1560
acccccatga aaccgaacac acaagccacg cctccc 1596
<210> 139
<211> 1488
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 血管生成素 2, 同种型1
<400> 139
atgtggcaga ttgttttctt tactctgagc tgtgatcttg tcttggccgc agcctataac 60
aactttcgga agagcatgga cagcatagga aagaagcaat atcaggtcca gcatgggtcc 120
tgcagctaca ctttcctcct gccagagatg gacaactgcc gctcttcctc cagcccctac 180
gtgtccaatg ctgtgcagag ggacgcgccg ctcgaatacg atgactcggt gcagaggctg 240
caagtgctgg agaacatcat ggaaaacaac actcagtggc taatgaagct tgagaattat 300
atccaggaca acatgaagaa agaaatggta gagatacagc agaatgcagt acagaaccag 360
acggctgtga tgatagaaat agggacaaac ctgttgaacc aaacagcgga gcaaacgcgg 420
aagttaactg atgtggaagc ccaagtatta aatcagacca cgagacttga acttcagctc 480
ttggaacact ccctctcgac aaacaaattg gaaaaacaga ttttggacca gaccagtgaa 540
ataaacaaat tgcaagataa gaacagtttc ctagaaaaga aggtgctagc tatggaagac 600
aagcacatca tccaactaca gtcaataaaa gaagagaaag atcagctaca ggtgttagta 660
tccaagcaaa attccatcat tgaagaacta gaaaaaaaaa tagtgactgc cacggtgaat 720
aattcagttc ttcagaagca gcaacatgat ctcatggaga cagttaataa cttactgact 780
atgatgtcca catcaaactc agctaaggac cccactgttg ctaaagaaga acaaatcagc 840
ttcagagact gtgctgaagt attcaaatca ggacacacca cgaatggcat ctacacgtta 900
acattcccta attctacaga agagatcaag gcctactgtg acatggaagc tggaggaggc 960
gggtggacaa ttattcagcg acgtgaggat ggcagcgttg attttcagag gacttggaaa 1020
gaatataaag tgggatttgg taacccttca ggagaatatt ggctgggaaa tgagtttgtt 1080
tcgcaactga ctaatcagca acgctatgtg cttaaaatac accttaaaga ctgggaaggg 1140
aatgaggctt actcattgta tgaacatttc tatctctcaa gtgaagaact caattatagg 1200
attcacctta aaggacttac agggacagcc ggcaaaataa gcagcatcag ccaaccagga 1260
aatgatttta gcacaaagga tggagacaac gacaaatgta tttgcaaatg ttcacaaatg 1320
ctaacaggag gctggtggtt tgatgcatgt ggtccttcca acttgaacgg aatgtactat 1380
ccacagaggc agaacacaaa taagttcaac ggcattaaat ggtactactg gaaaggctca 1440
ggctattcgc tcaaggccac aaccatgatg atccgaccag cagatttc 1488
<210> 140
<211> 2766
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> NLRP3, 同种型2
<400> 140
atgaagatgg caagcacccg ctgcaagctg gccaggtacc tggaggacct ggaggatgtg 60
gacttgaaga aatttaagat gcacttagag gactatcctc cccagaaggg ctgcatcccc 120
ctcccgaggg gtcagacaga gaaggcagac catgtggatc tagccacgct aatgatcgac 180
ttcaatgggg aggagaaggc gtgggccatg gccgtgtgga tcttcgctgc gatcaacagg 240
agagaccttt atgagaaagc aaaaagagat gagccgaagt ggggttcaga taatgcacgt 300
gtttcgaatc ccactgtgat atgccaggaa gacagcattg aagaggagtg gatgggttta 360
ctggagtacc tttcgagaat ctctatttgt aaaatgaaga aagattaccg taagaagtac 420
agaaagtacg tgagaagcag attccagtgc attgaagaca ggaatgcccg tctgggtgag 480
agtgtgagcc tcaacaaacg ctacacacga ctgcgtctca tcaaggagca ccggagccag 540
caggagaggg agcaggagct tctggccatc ggcaagacca agacgtgtga gagccccgtg 600
agtcccatta agatggagtt gctgtttgac cccgatgatg agcattctga gcctgtgcac 660
accgtggtgt tccagggggc ggcagggatt gggaaaacaa tcctggccag gaagatgatg 720
ttggactggg cgtcggggac actctaccaa gacaggtttg actatctgtt ctatatccac 780
tgtcgggagg tgagccttgt gacacagagg agcctggggg acctgatcat gagctgctgc 840
cccgacccaa acccacccat ccacaagatc gtgagaaaac cctccagaat cctcttcctc 900
atggacggct tcgatgagct gcaaggtgcc tttgacgagc acataggacc gctctgcact 960
gactggcaga aggccgagcg gggagacatt ctcctgagca gcctcatcag aaagaagctg 1020
cttcccgagg cctctctgct catcaccacg agacctgtgg ccctggagaa actgcagcac 1080
ttgctggacc atcctcggca tgtggagatc ctgggtttct ccgaggccaa aaggaaagag 1140
tacttcttca agtacttctc tgatgaggcc caagccaggg cagccttcag tctgattcag 1200
gagaacgagg tcctcttcac catgtgcttc atccccctgg tctgctggat cgtgtgcact 1260
ggactgaaac agcagatgga gagtggcaag agccttgccc agacatccaa gaccaccacc 1320
gcggtgtacg tcttcttcct ttccagtttg ctgcagcccc ggggagggag ccaggagcac 1380
ggcctctgcg cccacctctg ggggctctgc tctttggctg cagatggaat ctggaaccag 1440
aaaatcctgt ttgaggagtc cgacctcagg aatcatggac tgcagaaggc ggatgtgtct 1500
gctttcctga ggatgaacct gttccaaaag gaagtggact gcgagaagtt ctacagcttc 1560
atccacatga ctttccagga gttctttgcc gccatgtact acctgctgga agaggaaaag 1620
gaaggaagga cgaacgttcc agggagtcgt ttgaagcttc ccagccgaga cgtgacagtc 1680
cttctggaaa actatggcaa attcgaaaag gggtatttga tttttgttgt acgtttcctc 1740
tttggcctgg taaaccagga gaggacctcc tacttggaga agaaattaag ttgcaagatc 1800
tctcagcaaa tcaggctgga gctgctgaaa tggattgaag tgaaagccaa agctaaaaag 1860
ctgcagatcc agcccagcca gctggaattg ttctactgtt tgtacgagat gcaggaggag 1920
gacttcgtgc aaagggccat ggactatttc cccaagattg agatcaatct ctccaccaga 1980
atggaccaca tggtttcttc cttttgcatt gagaactgtc atcgggtgga gtcactgtcc 2040
ctggggtttc tccataacat gcccaaggag gaagaggagg aggaaaagga aggccgacac 2100
cttgatatgg tgcagtgtgt cctcccaagc tcctctcatg ctgcctgttc tcatgggttg 2160
gggcgctgtg gcctctcgca tgagtgctgc ttcgacatct ccttggtcct cagcagcaac 2220
cagaagctgg tggagctgga cctgagtgac aacgccctcg gtgacttcgg aatcagactt 2280
ctgtgtgtgg gactgaagca cctgttgtgc aatctgaaga agctctggtt ggtgaattct 2340
ggccttacgt cagtctgttg ttcagctttg tcctcggtac tcagcactaa tcagaatctc 2400
acgcaccttt acctgcgagg caacactctc ggagacaagg ggatcaaact actctgtgag 2460
ggactcttgc accccgactg caagcttcag gtgttggaat tagacaactg caacctcacg 2520
tcacactgct gctgggatct ttccacactt ctgacctcca gccagagcct gcgaaagctg 2580
agcctgggca acaatgacct gggcgacctg ggggtcatga tgttctgtga agtgctgaaa 2640
cagcagagct gcctcctgca gaacctgggg ttgtctgaaa tgtatttcaa ttatgagaca 2700
aaaagtgcgt tagaaacact tcaagaagaa aagcctgagc tgaccgtcgt ctttgagcct 2760
tcttgg 2766
<210> 141
<211> 831
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD40, 同种型1
<400> 141
atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 240
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
accatctgca cctgtgaaga aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc 360
ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 420
accatctgcg agccctgccc agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 480
tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagag ccctggtggt gatccccatc 600
atcttcggga tcctgtttgc catcctcttg gtgctggtct ttatcaaaaa ggtggccaag 660
aagccaacca ataaggcccc ccaccccaag caggaacccc aggagatcaa ttttcccgac 720
gatcttcctg gctccaacac tgctgctcca gtgcaggaga ctttacatgg atgccaaccg 780
gtcacccagg aggatggcaa agagagtcgc atctcagtgc aggagagaca g 831
<210> 142
<211> 783
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD40 配体 (CD40L)
<400> 142
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360
caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420
gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480
ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540
cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600
ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660
caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720
gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780
ctc 783
<210> 143
<211> 579
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD-70 抗原, 同种型1
<400> 143
atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg 60
gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc 120
ttcgcacagg ctcagcagca gctgccgctc gagtcacttg ggtgggacgt agctgagctg 180
cagctgaatc acacaggacc tcagcaggac cccaggctat actggcaggg gggcccagca 240
ctgggccgct ccttcctgca tggaccagag ctggacaagg ggcagctacg tatccatcgt 300
gatggcatct acatggtaca catccaggtg acgctggcca tctgctcctc cacgacggcc 360
tccaggcacc accccaccac cctggccgtg ggaatctgct ctcccgcctc ccgtagcatc 420
agcctgctgc gtctcagctt ccaccaaggt tgtaccattg cctcccagcg cctgacgccc 480
ctggcccgag gggacacact ctgcaccaac ctcactggga cacttttgcc ttcccgaaac 540
actgatgaga ccttctttgg agtgcagtgg gtgcgcccc 579
<210> 144
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD137 (4-1BB, TNFRSF9)
<400> 144
atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc tggtcctcaa ctttgagagg 60
acaagatcat tgcaggatcc ttgtagtaac tgcccagctg gtacattctg tgataataac 120
aggaatcaga tttgcagtcc ctgtcctcca aatagtttct ccagcgcagg tggacaaagg 180
acctgtgaca tatgcaggca gtgtaaaggt gttttcagga ccaggaagga gtgttcctcc 240
accagcaatg cagagtgtga ctgcactcca gggtttcact gcctgggggc aggatgcagc 300
atgtgtgaac aggattgtaa acaaggtcaa gaactgacaa aaaaaggttg taaagactgt 360
tgctttggga catttaacga tcagaaacgt ggcatctgtc gaccctggac aaactgttct 420
ttggatggaa agtctgtgct tgtgaatggg acgaaggaga gggacgtggt ctgtggacca 480
tctccagccg acctctctcc gggagcatcc tctgtgaccc cgcctgcccc tgcgagagag 540
ccaggacact ctccgcagat catctccttc tttcttgcgc tgacgtcgac tgcgttgctc 600
ttcctgctgt tcttcctcac gctccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc 660
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactg 765
<210> 145
<211> 807
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD200, 同种型1
<400> 145
atggagaggc tggtgatcag gatgcccttc tctcatctgt ctacctacag cctggtttgg 60
gtcatggcag cagtggtgct gtgcacagca caagtgcaag tggtgaccca ggatgaaaga 120
gagcagctgt acacacctgc ttccttaaaa tgctctctgc aaaatgccca ggaagccctc 180
attgtgacat ggcagaaaaa gaaagctgta agcccagaaa acatggtcac cttcagcgag 240
aaccatgggg tggtgatcca gcctgcctat aaggacaaga taaacattac ccagctggga 300
ctccaaaact caaccatcac cttctggaat atcaccctgg aggatgaagg gtgttacatg 360
tgtctcttca atacctttgg ttttgggaag atctcaggaa cggcctgcct caccgtctat 420
gtacagccca tagtatccct tcactacaaa ttctctgaag accacctaaa tatcacttgc 480
tctgccactg cccgcccagc ccccatggtc ttctggaagg tccctcggtc agggattgaa 540
aatagtacag tgactctgtc tcacccaaat gggaccacgt ctgttaccag catcctccat 600
atcaaagacc ctaagaatca ggtggggaag gaggtgatct gccaggtgct gcacctgggg 660
actgtgaccg actttaagca aaccgtcaac aaaggctatt ggttttcagt tccgctattg 720
ctaagcattg tttccctggt aattcttctc gtcctaatct caatcttact gtactggaaa 780
cgtcaccgga atcaggaccg agagccc 807
<210> 146
<211> 1236
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> A2aR (ADORA2A)
<400> 146
atgcccatca tgggctcctc ggtgtacatc acggtggagc tggccattgc tgtgctggcc 60
atcctgggca atgtgctggt gtgctgggcc gtgtggctca acagcaacct gcagaacgtc 120
accaactact ttgtggtgtc actggcggcg gccgacatcg cagtgggtgt gctcgccatc 180
ccctttgcca tcaccatcag caccgggttc tgcgctgcct gccacggctg cctcttcatt 240
gcctgcttcg tcctggtcct cacgcagagc tccatcttca gtctcctggc catcgccatt 300
gaccgctaca ttgccatccg catcccgctc cggtacaatg gcttggtgac cggcacgagg 360
gctaagggca tcattgccat ctgctgggtg ctgtcgtttg ccatcggcct gactcccatg 420
ctaggttgga acaactgcgg tcagccaaag gagggcaaga accactccca gggctgcggg 480
gagggccaag tggcctgtct ctttgaggat gtggtcccca tgaactacat ggtgtacttc 540
aacttctttg cctgtgtgct ggtgcccctg ctgctcatgc tgggtgtcta tttgcggatc 600
ttcctggcgg cgcgacgaca gctgaagcag atggagagcc agcctctgcc gggggagcgg 660
gcacggtcca cactgcagaa ggaggtccat gctgccaagt cactggccat cattgtgggg 720
ctctttgccc tctgctggct gcccctacac atcatcaact gcttcacttt cttctgcccc 780
gactgcagcc acgcccctct ctggctcatg tacctggcca tcgtcctctc ccacaccaat 840
tcggttgtga atcccttcat ctacgcctac cgtatccgcg agttccgcca gaccttccgc 900
aagatcattc gcagccacgt cctgaggcag caagaacctt tcaaggcagc tggcaccagt 960
gcccgggtct tggcagctca tggcagtgac ggagagcagg tcagcctccg tctcaacggc 1020
cacccgccag gagtgtgggc caacggcagt gctccccacc ctgagcggag gcccaatggc 1080
tatgccctgg ggctggtgag tggagggagt gcccaagagt cccaggggaa cacgggcctc 1140
ccagacgtgg agctccttag ccatgagctc aagggagtgt gcccagagcc ccctggccta 1200
gatgaccccc tggcccagga tggagcagga gtgtcc 1236
<210> 147
<211> 723
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> GITR/TNFRSF18, 同种型1
<400> 147
atggcacagc acggggcgat gggcgcgttt cgggccctgt gcggcctggc gctgctgtgc 60
gcgctcagcc tgggtcagcg ccccaccggg ggtcccgggt gcggccctgg gcgcctcctg 120
cttgggacgg gaacggacgc gcgctgctgc cgggttcaca cgacgcgctg ctgccgcgat 180
tacccgggcg aggagtgctg ttccgagtgg gactgcatgt gtgtccagcc tgaattccac 240
tgcggagacc cttgctgcac gacctgccgg caccaccctt gtcccccagg ccagggggta 300
cagtcccagg ggaaattcag ttttggcttc cagtgtatcg actgtgcctc ggggaccttc 360
tccgggggcc acgaaggcca ctgcaaacct tggacagact gcacccagtt cgggtttctc 420
actgtgttcc ctgggaacaa gacccacaac gctgtgtgcg tcccagggtc cccgccggca 480
gagccgcttg ggtggctgac cgtcgtcctc ctggccgtgg ccgcctgcgt cctcctcctg 540
acctcggccc agcttggact gcacatctgg cagctgagga gtcagtgcat gtggccccga 600
gagacccagc tgctgctgga ggtgccgccg tcgaccgaag acgccagaag ctgccagttc 660
cccgaggaag agcggggcga gcgatcggca gaggagaagg ggcggctggg agacctgtgg 720
gtg 723
<210> 148
<211> 1362
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> B7-H6 (NCR3LG1)
<400> 148
atgacgtgga gggctgccgc ctccacgtgc gcggcgctcc tgattctgct gtgggcgctg 60
acgaccgaag gtgatctgaa agtagagatg atggcagggg ggactcagat cacacccctg 120
aatgacaatg tcaccatatt ctgcaatatc ttttattccc aacccctcaa catcacgtct 180
atgggtatca cctggttttg gaagagtctg acgtttgaca aagaagtcaa agtctttgaa 240
ttttttggag atcaccaaga ggcattccga cctggagcca ttgtgtctcc atggaggctg 300
aagagtgggg acgcctcact gcggctgcct ggaatccagc tggaggaagc aggagagtac 360
cgatgtgagg tggtggtcac ccctctgaag gcacagggaa cagtccagct tgaagttgtg 420
gcttccccag ccagcagatt gttgctggat caagtgggca tgaaagagaa tgaagacaaa 480
tatatgtgtg agtcaagtgg gttctaccca gaggctatta atataacatg ggagaagcag 540
acccagaagt ttccccatcc catagagatt tctgaggatg tcatcactgg tcccaccatc 600
aagaatatgg atggcacatt taatgtcact agctgcttga agctgaactc ctctcaggaa 660
gaccctggga ctgtctacca gtgtgtggta cggcatgcgt ccttgcatac ccccttgagg 720
agcaacttta ccctgactgc tgctcggcac agtctttctg aaactgagaa gacagataat 780
ttttccattc attggtggcc tatttcattc attggtgttg gactggtttt attaattgtt 840
ttgattcctt ggaaaaagat atgtaacaaa tcatcttcag cctatactcc tctcaagtgc 900
attctgaaac actggaactc ctttgacact cagactctga agaaagagca cctcatattc 960
ttttgcactc gggcatggcc gtcttaccag ctgcaggatg gggaggcttg gcctcctgag 1020
ggaagtgtta atattaatac tattcaacaa ctagatgttt tctgcagaca ggagggcaaa 1080
tggtccgagg ttccttatgt gcaagccttc tttgccttgc gagacaaccc agatctttgt 1140
cagtgttgta gaattgaccc tgctctccta acagttacat caggcaagtc catagatgat 1200
aattccacaa agtctgagaa acaaacccct agggaacact cggatgcagt tccggatgcc 1260
ccaatccttc ctgtctcccc tatctgggaa cctcctccag ccacaacatc aacaactcca 1320
gttctatcct cccaaccccc aactttactg ttacccctac ag 1362
<210> 149
<211> 597
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ICOS, 同种型1
<400> 149
atgaagtcag gcctctggta tttctttctc ttctgcttgc gcattaaagt tttaacagga 60
gaaatcaatg gttctgccaa ttatgagatg tttatatttc acaacggagg tgtacaaatt 120
ttatgcaaat atcctgacat tgtccagcaa tttaaaatgc agttgctgaa aggggggcaa 180
atactctgcg atctcactaa gacaaaagga agtggaaaca cagtgtccat taagagtctg 240
aaattctgcc attctcagtt atccaacaac agtgtctctt tttttctata caacttggac 300
cattctcatg ccaactatta cttctgcaac ctatcaattt ttgatcctcc tccttttaaa 360
gtaactctta caggaggata tttgcatatt tatgaatcac aactttgttg ccagctgaag 420
ttctggttac ccataggatg tgcagccttt gttgtagtct gcattttggg atgcatactt 480
atttgttggc ttacaaaaaa gaagtattca tccagtgtgc acgaccctaa cggtgaatac 540
atgttcatga gagcagtgaa cacagccaaa aaatctagac tcacagatgt gacccta 597
<210> 150
<211> 906
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ICOS 配体, 同种型1
<400> 150
atgcggctgg gcagtcctgg actgctcttc ctgctcttca gcagccttcg agctgatact 60
caggagaagg aagtcagagc gatggtaggc agcgacgtgg agctcagctg cgcttgccct 120
gaaggaagcc gttttgattt aaatgatgtt tacgtatatt ggcaaaccag tgagtcgaaa 180
accgtggtga cctaccacat cccacagaac agctccttgg aaaacgtgga cagccgctac 240
cggaaccgag ccctgatgtc accggccggc atgctgcggg gcgacttctc cctgcgcttg 300
ttcaacgtca ccccccagga cgagcagaag tttcactgcc tggtgttgag ccaatccctg 360
ggattccagg aggttttgag cgttgaggtt acactgcatg tggcagcaaa cttcagcgtg 420
cccgtcgtca gcgcccccca cagcccctcc caggatgagc tcaccttcac gtgtacatcc 480
ataaacggct accccaggcc caacgtgtac tggatcaata agacggacaa cagcctgctg 540
gaccaggctc tgcagaatga caccgtcttc ttgaacatgc ggggcttgta tgacgtggtc 600
agcgtgctga ggatcgcacg gacccccagc gtgaacattg gctgctgcat agagaacgtg 660
cttctgcagc agaacctgac tgtcggcagc cagacaggaa atgacatcgg agagagagac 720
aagatcacag agaatccagt cagtaccggc gagaaaaacg cggccacgtg gagcatcctg 780
gctgtcctgt gcctgcttgt ggtcgtggcg gtggccatag gctgggtgtg cagggaccga 840
tgcctccaac acagctatgc aggtgcctgg gctgtgagtc cggagacaga gctcactggc 900
cacgtt 906
<210> 151
<211> 1344
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> gp49B/LILRB4, 同种型1
<400> 151
atgatcccca ccttcacggc tctgctctgc ctcgggctga gtctgggccc caggacccac 60
atgcaggcag ggcccctccc caaacccacc ctctgggctg agccaggctc tgtgatcagc 120
tgggggaact ctgtgaccat ctggtgtcag gggaccctgg aggctcggga gtaccgtctg 180
gataaagagg aaagcccagc accctgggac agacagaacc cactggagcc caagaacaag 240
gccagattct ccatcccatc catgacagag gactatgcag ggagataccg ctgttactat 300
cgcagccctg taggctggtc acagcccagt gaccccctgg agctggtgat gacaggagcc 360
tacagtaaac ccaccctttc agccctgccg agtcctcttg tgacctcagg aaagagcgtg 420
accctgctgt gtcagtcacg gagcccaatg gacacttttc ttctgatcaa ggagcgggca 480
gcccatcccc tactgcatct gagatcagag cacggagctc agcagcacca ggctgaattc 540
cccatgagtc ctgtgacctc agtgcacggg gggacctaca ggtgcttcag ctcacacggc 600
ttctcccact acctgctgtc acaccccagt gaccccctgg agctcatagt ctcaggatcc 660
ttggagggtc ccaggccctc acccacaagg tccgtctcaa cagctgcagg ccctgaggac 720
cagcccctca tgcctacagg gtcagtcccc cacagtggtc tgagaaggca ctgggaggta 780
ctgatcgggg tcttggtggt ctccatcctg cttctctccc tcctcctctt cctcctcctc 840
caacactggc gtcagggaaa acacaggaca ttggcccaga gacaggctga tttccaacgt 900
cctccagggg ctgccgagcc agagcccaag gacgggggcc tacagaggag gtccagccca 960
gctgctgacg tccagggaga aaacttctgt gctgccgtga agaacacaca gcctgaggac 1020
ggggtggaaa tggacactcg gcagagccca cacgatgaag acccccaggc agtgacgtat 1080
gccaaggtga aacactccag acctaggaga gaaatggcct ctcctccctc cccactgtct 1140
ggggaattcc tggacacaaa ggacagacag gcagaagagg acagacagat ggacactgag 1200
gctgctgcat ctgaagcccc ccaggatgtg acctacgccc ggctgcacag ctttaccctc 1260
agacagaagg caactgagcc tcctccatcc caggaagggg cctctccagc tgagcccagt 1320
gtctatgcca ctctggccat ccac 1344
<210> 152
<211> 1896
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> PIR-B/LILRB3, 同种型1
<400> 152
atgacgcccg ccctcacagc cctgctctgc cttgggctga gtctgggccc caggacccgc 60
atgcaggcag ggcccttccc caaacccacc ctctgggctg agccaggctc tgtgatcagc 120
tgggggagcc ccgtgaccat ctggtgtcag gggagcctgg aggcccagga gtaccaactg 180
gataaagagg gaagcccaga gccctgggac agaaataacc cactggaacc caagaacaag 240
gccagattct ccatcccatc catgacacag caccatgcag ggagataccg ctgccactat 300
tacagctctg caggctggtc agagcccagc gaccccctgg agctggtgat gacaggattc 360
tacaacaaac ccaccctctc agccctgccc agccctgtgg tggcctcagg ggggaatatg 420
accctccgat gtggctcaca gaagggatat caccattttg ttctgatgaa ggaaggagaa 480
caccagctcc cccggaccct ggactcacag cagctccaca gtggggggtt ccaggccctg 540
ttccctgtgg gccccgtgac ccccagccac aggtggaggt tcacatgcta ttactattat 600
acaaacaccc cctgggtgtg gtcccacccc agtgaccccc tggagattct gccctcaggc 660
gtgtctagga agccctccct cctgaccctg cagggccctg tcctggcccc tgggcagagc 720
ctgaccctcc agtgtggctc tgatgtcggc tacgacagat ttgttctgta taaggagggg 780
gaacgtgact tcctccagcg ccctggccag cagccccagg ctgggctctc ccaggccaac 840
ttcaccctgg gccctgtgag ccgctcctac gggggccagt acaggtgcta tggtgcacac 900
aacctctcct ccgagtggtc ggcccccagt gaccccctgg acatcctgat cacaggacag 960
atctatgaca ccgtctccct gtcagcacag ccgggcccca cagtggcctc aggagagaac 1020
atgaccctgc tgtgtcagtc acgggggtat tttgacactt tccttctgac caaagaaggg 1080
gcagcccatc ccccactgcg tctgagatca atgtacggag ctcataagta ccaggctgaa 1140
ttccccatga gtcctgtgac ctcagcccac gcggggacct acaggtgcta cggctcacgc 1200
agctccaacc cccacctgct gtctttcccc agtgagcccc tggaactcat ggtctcagga 1260
cactctggag gctccagcct cccacccaca gggccgccct ccacacctgg tctgggaaga 1320
tacctggagg ttttgattgg ggtctcggtg gccttcgtcc tgctgctctt cctcctcctc 1380
ttcctcctcc tcctccgtca gcgtcacagc aaacacagga catctgacca gagaaagact 1440
gatttccagc gtcctgcagg ggctgcggag acagagccca aggacagggg cctgctgagg 1500
aggtccagcc cagctgctga cgtccaggaa gaaaacctct atgctgctgt gaaggacaca 1560
cagtctgagg acagggtgga gctggacagt cagcagagcc cacacgatga agacccccag 1620
gcagtgacgt atgccccggt gaaacactcc agtcctagga gagaaatggc ctctcctccc 1680
tcctcactgt ctggggaatt cctggacaca aaggacagac aggtggaaga ggacaggcag 1740
atggacactg aggctgctgc atctgaagcc tcccaggatg tgacctacgc ccagctgcac 1800
agcttgaccc ttagacggaa ggcaactgag cctcctccat cccaggaagg ggaacctcca 1860
gctgagccca gcatctacgc cactctggcc atccac 1896
<210> 153
<211> 1014
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> HLA-G alpha 链
<400> 153
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360
tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420
gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480
gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600
gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660
tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840
tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900
tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960
gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagaa agaagagctc agat 1014
<210> 154
<211> 1092
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TIM1/HAVCR1
<400> 154
atgcatcctc aagtggtcat cttaagcctc atcctacatc tggcagattc tgtagctggt 60
tctgtaaagg ttggtggaga ggcaggtcca tctgtcacac taccctgcca ctacagtgga 120
gctgtcacat ccatgtgctg gaatagaggc tcatgttctc tattcacatg ccaaaatggc 180
attgtctgga ccaatggaac ccacgtcacc tatcggaagg acacacgcta taagctattg 240
ggggaccttt caagaaggga tgtctctttg accatagaaa atacagctgt gtctgacagt 300
ggcgtatatt gttgccgtgt tgagcaccgt gggtggttca atgacatgaa aatcaccgta 360
tcattggaga ttgtgccacc caaggtcacg actactccaa ttgtcacaac tgttccaacc 420
gtcacgactg ttcgaacgag caccactgtt ccaacgacaa cgactgttcc aatgacgact 480
gttccaacga caactgttcc aacaacaatg agcattccaa cgacaacgac tgttctgacg 540
acaatgactg tttcaacgac aacgagcgtt ccaacgacaa cgagcattcc aacaacaaca 600
agtgttccag tgacaacaac tgtctctacc tttgttcctc caatgccttt gcccaggcag 660
aaccatgaac cagtagccac ttcaccatct tcacctcagc cagcagaaac ccaccctacg 720
acactgcagg gagcaataag gagagaaccc accagctcac cattgtactc ttacacaaca 780
gatgggaatg acaccgtgac agagtcttca gatggccttt ggaataacaa tcaaactcaa 840
ctgttcctag aacatagtct actgacggcc aataccacta aaggaatcta tgctggagtc 900
tgtatttctg tcttggtgct tcttgctctt ttgggtgtca tcattgccaa aaagtatttc 960
ttcaaaaagg aggttcaaca actaagtgtt tcatttagca gccttcaaat taaagctttg 1020
caaaatgcag ttgaaaagga agtccaagca gaagacaata tctacattga gaatagtctt 1080
tatgccacgg ac 1092
<210> 155
<211> 1134
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TIM4/TIMD4, 同种型1
<400> 155
atgtccaaag aacctctcat tctctggctg atgattgagt tttggtggct ttacctgaca 60
ccagtcactt cagagactgt tgtgacggag gttttgggtc accgggtgac tttgccctgt 120
ctgtactcat cctggtctca caacagcaac agcatgtgct gggggaaaga ccagtgcccc 180
tactccggtt gcaaggaggc gctcatccgc actgatggaa tgagggtgac ctcaagaaag 240
tcagcaaaat atagacttca ggggactatc ccgagaggtg atgtctcctt gaccatctta 300
aaccccagtg aaagtgacag cggtgtgtac tgctgccgca tagaagtgcc tggctggttc 360
aacgatgtaa agataaacgt gcgcctgaat ctacagagag cctcaacaac cacgcacaga 420
acagcaacca ccaccacacg cagaacaaca acaacaagcc ccaccaccac ccgacaaatg 480
acaacaaccc cagctgcact tccaacaaca gtcgtgacca cacccgatct cacaaccgga 540
acaccactcc agatgacaac cattgccgtc ttcacaacag caaacacgtg cctttcacta 600
accccaagca cccttccgga ggaagccaca ggtcttctga ctcccgagcc ttctaaggaa 660
gggcccatcc tcactgcaga atcagaaact gtcctcccca gtgattcctg gagtagtgtt 720
gagtctactt ctgctgacac tgtcctgctg acatccaaag agtccaaagt ttgggatctc 780
ccatcaacat cccacgtgtc aatgtggaaa acgagtgatt ctgtgtcttc tcctcagcct 840
ggagcatctg atacagcagt tcctgagcag aacaaaacaa caaaaacagg acagatggat 900
ggaataccca tgtcaatgaa gaatgaaatg cccatctccc aactactgat gatcatcgcc 960
ccctccttgg gatttgtgct cttcgcattg tttgtggcgt ttctcctgag agggaaactc 1020
atggaaacct attgttcgca gaaacacaca aggctagact acattggaga tagtaaaaat 1080
gtcctcaatg acgtgcagca tggaagggaa gacgaagacg gcctttttac cctc 1134
<210> 156
<211> 831
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> OX-40/CD134/TNFRSF4
<400> 156
atgtgcgtgg gggctcggcg gctgggccgc gggccgtgtg cggctctgct cctcctgggc 60
ctggggctga gcaccgtgac ggggctccac tgtgtcgggg acacctaccc cagcaacgac 120
cggtgctgcc acgagtgcag gccaggcaac gggatggtga gccgctgcag ccgctcccag 180
aacacggtgt gccgtccgtg cgggccgggc ttctacaacg acgtggtcag ctccaagccg 240
tgcaagccct gcacgtggtg taacctcaga agtgggagtg agcggaagca gctgtgcacg 300
gccacacagg acacagtctg ccgctgccgg gcgggcaccc agcccctgga cagctacaag 360
cctggagttg actgtgcccc ctgccctcca gggcacttct ccccaggcga caaccaggcc 420
tgcaagccct ggaccaactg caccttggct gggaagcaca ccctgcagcc ggccagcaat 480
agctcggacg caatctgtga ggacagggac cccccagcca cgcagcccca ggagacccag 540
ggccccccgg ccaggcccat cactgtccag cccactgaag cctggcccag aacctcacag 600
ggaccctcca cccggcccgt ggaggtcccc gggggccgtg cggttgccgc catcctgggc 660
ctgggcctgg tgctggggct gctgggcccc ctggccatcc tgctggccct gtacctgctc 720
cggagggacc agaggctgcc ccccgatgcc cacaagcccc ctgggggagg cagtttccgg 780
acccccatcc aagaggagca ggccgacgcc cactccaccc tggccaagat c 831
<210> 157
<211> 549
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> OX-40L/CD252/TNFSF4, 同种型1
<400> 157
atggaaaggg tccaacccct ggaagagaat gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag 60
aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta attcagggac tggggctgct cctgtgcttc 120
acctacatct gcctgcactt ctctgctctt caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa 180
agtatcaaag tacaatttac cgaatataag aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa 240
aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc caggaagtca acattagcct tcattaccag 360
aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg 420
gcctctctga cttacaaaga caaagtctac ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg 480
gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc 540
tgtgtcctt 549
<210> 158
<211> 1950
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ILT-2/LILRB1, 同种型1
<400> 158
atgaccccca tcctcacggt cctgatctgt ctcgggctga gtctgggccc ccggacccac 60
gtgcaggcag ggcacctccc caagcccacc ctctgggctg aaccaggctc tgtgatcacc 120
caggggagtc ctgtgaccct caggtgtcag gggggccagg agacccagga gtaccgtcta 180
tatagagaaa agaaaacagc accctggatt acacggatcc cacaggagct tgtgaagaag 240
ggccagttcc ccatcccatc catcacctgg gaacacacag ggcggtatcg ctgttactat 300
ggtagcgaca ctgcaggccg ctcagagagc agtgaccccc tggagctggt ggtgacagga 360
gcctacatca aacccaccct ctcagcccag cccagccccg tggtgaactc aggagggaat 420
gtaaccctcc agtgtgactc acaggtggca tttgatggct tcattctgtg taaggaagga 480
gaagatgaac acccacaatg cctgaactcc cagccccatg cccgtgggtc gtcccgcgcc 540
atcttctccg tgggccccgt gagcccgagt cgcaggtggt ggtacaggtg ctatgcttat 600
gactcgaact ctccctatga gtggtctcta cccagtgatc tcctggagct cctggtccta 660
ggtgtttcta agaagccatc actctcagtg cagccaggtc ctatcgtggc ccctgaggag 720
accctgactc tgcagtgtgg ctctgatgct ggctacaaca gatttgttct gtataaggac 780
ggggaacgtg acttccttca gctcgctggc gcacagcccc aggctgggct ctcccaggcc 840
aacttcaccc tgggccctgt gagccgctcc tacgggggcc agtacagatg ctacggtgca 900
cacaacctct cctccgagtg gtcggccccc agcgaccccc tggacatcct gatcgcagga 960
cagttctatg acagagtctc cctctcggtg cagccgggcc ccacggtggc ctcaggagag 1020
aacgtgaccc tgctgtgtca gtcacaggga tggatgcaaa ctttccttct gaccaaggag 1080
ggggcagctg atgacccatg gcgtctaaga tcaacgtacc aatctcaaaa ataccaggct 1140
gaattcccca tgggtcctgt gacctcagcc catgcgggga cctacaggtg ctacggctca 1200
cagagctcca aaccctacct gctgactcac cccagtgacc ccctggagct cgtggtctca 1260
ggaccgtctg ggggccccag ctccccgaca acaggcccca cctccacatc tggccctgag 1320
gaccagcccc tcacccccac cgggtcggat ccccagagtg gtctgggaag gcacctgggg 1380
gttgtgatcg gcatcttggt ggccgtcatc ctactgctcc tcctcctcct cctcctcttc 1440
ctcatcctcc gacatcgacg tcagggcaaa cactggacat cgacccagag aaaggctgat 1500
ttccaacatc ctgcaggggc tgtggggcca gagcccacag acagaggcct gcagtggagg 1560
tccagcccag ctgccgatgc ccaggaagaa aacctctatg ctgccgtgaa gcacacacag 1620
cctgaggatg gggtggagat ggacactcgg agcccacacg atgaagaccc ccaggcagtg 1680
acgtatgccg aggtgaaaca ctccagacct aggagagaaa tggcctctcc tccttcccca 1740
ctgtctgggg aattcctgga cacaaaggac agacaggcgg aagaggacag gcagatggac 1800
actgaggctg ctgcatctga agccccccag gatgtgacct acgcccagct gcacagcttg 1860
accctcagac gggaggcaac tgagcctcct ccatcccagg aagggccctc tccagctgtg 1920
cccagcatct acgccactct ggccatccac 1950
<210> 159
<211> 1794
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ILT-4/LILRB2, 同种型1
<400> 159
atgaccccca tcgtcacagt cctgatctgt ctcgggctga gtctgggccc caggacccgc 60
gtgcagacag ggaccatccc caagcccacc ctgtgggctg agccagactc tgtgatcacc 120
caggggagtc ccgtcaccct cagttgtcag gggagccttg aagcccagga gtaccgtcta 180
tatagggaga aaaaatcagc atcttggatt acacggatac gaccagagct tgtgaagaac 240
ggccagttcc acatcccatc catcacctgg gaacacacag ggcgatatgg ctgtcagtat 300
tacagccgcg ctcggtggtc tgagctcagt gaccccctgg tgctggtgat gacaggagcc 360
tacccaaaac ccaccctctc agcccagccc agccctgtgg tgacctcagg aggaagggtg 420
accctccagt gtgagtcaca ggtggcattt ggcggcttca ttctgtgtaa ggaaggagaa 480
gatgaacacc cacaatgcct gaactcccag ccccatgccc gtgggtcgtc ccgcgccatc 540
ttctccgtgg gccccgtgag cccgaatcgc aggtggtcgc acaggtgcta tggttatgac 600
ttgaactctc cctatgtgtg gtcttcaccc agtgatctcc tggagctcct ggtcccaggt 660
gtttctaaga agccatcact ctcagtgcag ccgggtcctg tcatggcccc tggggaaagc 720
ctgaccctcc agtgtgtctc tgatgtcggc tatgacagat ttgttctgta caaggagggg 780
gaacgtgacc ttcgccagct ccctggccgg cagccccagg ctgggctctc ccaggccaac 840
ttcaccctgg gccctgtgag ccgctcctac gggggccagt acagatgcta cggtgcacac 900
aacctctcct ctgagtgctc ggcccccagc gaccccctgg acatcctgat cacaggacag 960
atccgtggca cacccttcat ctcagtgcag ccaggcccca cagtggcctc aggagagaac 1020
gtgaccctgc tgtgtcagtc atggcggcag ttccacactt tccttctgac caaggcggga 1080
gcagctgatg ccccactccg tctaagatca atacacgaat atcctaagta ccaggctgaa 1140
ttccccatga gtcctgtgac ctcagcccac gcggggacct acaggtgcta cggctcactc 1200
aactccgacc cctacctgct gtctcacccc agtgagcccc tggagctcgt ggtctcagga 1260
ccctccatgg gttccagccc cccacccacc ggtcccatct ccacacctgc aggccctgag 1320
gaccagcccc tcacccccac tgggtcggat ccccaaagtg gtctgggaag gcacctgggg 1380
gttgtgatcg gcatcttggt ggccgtcgtc ctactgctcc tcctcctcct cctcctcttc 1440
ctcatcctcc gacatcgacg tcagggcaaa cactggacat cgacccagag aaaggctgat 1500
ttccaacatc ctgcaggggc tgtggggcca gagcccacag acagaggcct gcagtggagg 1560
tccagcccag ctgccgacgc ccaggaagaa aacctctatg ctgccgtgaa ggacacacag 1620
cctgaagatg gggtggagat ggacactcgg gctgctgcat ctgaagcccc ccaggatgtg 1680
acctacgccc agctgcacag cttgaccctc agacggaagg caactgagcc tcctccatcc 1740
caggaaaggg aacctccagc tgagcccagc atctacgcca ccctggccat ccac 1794
<210> 160
<211> 717
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> BCL-2 同种型alpha
<400> 160
atggcgcacg ctgggagaac agggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60
tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120
ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180
gcatcccggg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240
gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300
ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360
ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480
agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540
ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600
ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660
ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctggg ccacaag 717
<210> 161
<211> 4050
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> MDR1/ABCB1, 同种型1
<400> 161
atgagtgtca acttgcaagg ggaccagaga ggtgcaacgg aagccagaac attcctcctg 60
gaaattcaac ctgtttcgca gtttctcgag gaatcagcat tcagtcaatc cgggccggga 120
gcagtcatct gtggtctttc cactaaagtc ggagtatctt cttccaaaat ttcacgtctt 180
ggtggccgtt ccaaggagcg cgaggtcgga atggatcttg aaggggaccg caatggagga 240
gcaaagaaga agaacttttt taaactgaac aataaaagtg aaaaagataa gaaggaaaag 300
aaaccaactg tcagtgtatt ttcaatgttt cgctattcaa attggcttga caagttgtat 360
atggtggtgg gaactttggc tgccatcatc catggggctg gacttcctct catgatgctg 420
gtgtttggag aaatgacaga tatctttgca aatgcaggaa atttagaaga tctgatgtca 480
aacatcacta atagaagtga tatcaatgat acagggttct tcatgaatct ggaggaagac 540
atgaccaggt atgcctatta ttacagtgga attggtgctg gggtgctggt tgctgcttac 600
attcaggttt cattttggtg cctggcagct ggaagacaaa tacacaaaat tagaaaacag 660
ttttttcatg ctataatgcg acaggagata ggctggtttg atgtgcacga tgttggggag 720
cttaacaccc gacttacaga tgatgtctcc aagattaatg aaggaattgg tgacaaaatt 780
ggaatgttct ttcagtcaat ggcaacattt ttcactgggt ttatagtagg atttacacgt 840
ggttggaagc taacccttgt gattttggcc atcagtcctg ttcttggact gtcagctgct 900
gtctgggcaa agatactatc ttcatttact gataaagaac tcttagcgta tgcaaaagct 960
ggagcagtag ctgaagaggt cttggcagca attagaactg tgattgcatt tggaggacaa 1020
aagaaagaac ttgaaaggta caacaaaaat ttagaagaag ctaaaagaat tgggataaag 1080
aaagctatta cagccaatat ttctataggt gctgctttcc tgctgatcta tgcatcttat 1140
gctctggcct tctggtatgg gaccaccttg gtcctctcag gggaatattc tattggacaa 1200
gtactcactg tattcttttc tgtattaatt ggggctttta gtgttggaca ggcatctcca 1260
agcattgaag catttgcaaa tgcaagagga gcagcttatg aaatcttcaa gataattgat 1320
aataagccaa gtattgacag ctattcgaag agtgggcaca aaccagataa tattaaggga 1380
aatttggaat tcagaaatgt tcacttcagt tacccatctc gaaaagaagt taagatcttg 1440
aagggtctga acctgaaggt gcagagtggg cagacggtgg ccctggttgg aaacagtggc 1500
tgtgggaaga gcacaacagt ccagctgatg cagaggctct atgaccccac agaggggatg 1560
gtcagtgttg atggacagga tattaggacc ataaatgtaa ggtttctacg ggaaatcatt 1620
ggtgtggtga gtcaggaacc tgtattgttt gccaccacga tagctgaaaa cattcgctat 1680
ggccgtgaaa atgtcaccat ggatgagatt gagaaagctg tcaaggaagc caatgcctat 1740
gactttatca tgaaactgcc tcataaattt gacaccctgg ttggagagag aggggcccag 1800
ttgagtggtg ggcagaagca gaggatcgcc attgcacgtg ccctggttcg caaccccaag 1860
atcctcctgc tggatgaggc cacgtcagcc ttggacacag aaagcgaagc agtggttcag 1920
gtggctctgg ataaggccag aaaaggtcgg accaccattg tgatagctca tcgtttgtct 1980
acagttcgta atgctgacgt catcgctggt ttcgatgatg gagtcattgt ggagaaagga 2040
aatcatgatg aactcatgaa agagaaaggc atttacttca aacttgtcac aatgcagaca 2100
gcaggaaatg aagttgaatt agaaaatgca gctgatgaat ccaaaagtga aattgatgcc 2160
ttggaaatgt cttcaaatga ttcaagatcc agtctaataa gaaaaagatc aactcgtagg 2220
agtgtccgtg gatcacaagc ccaagacaga aagcttagta ccaaagaggc tctggatgaa 2280
agtatacctc cagtttcctt ttggaggatt atgaagctaa atttaactga atggccttat 2340
tttgttgttg gtgtattttg tgccattata aatggaggcc tgcaaccagc atttgcaata 2400
atattttcaa agattatagg ggtttttaca agaattgatg atcctgaaac aaaacgacag 2460
aatagtaact tgttttcact attgtttcta gcccttggaa ttatttcttt tattacattt 2520
ttccttcagg gtttcacatt tggcaaagct ggagagatcc tcaccaagcg gctccgatac 2580
atggttttcc gatccatgct cagacaggat gtgagttggt ttgatgaccc taaaaacacc 2640
actggagcat tgactaccag gctcgccaat gatgctgctc aagttaaagg ggctataggt 2700
tccaggcttg ctgtaattac ccagaatata gcaaatcttg ggacaggaat aattatatcc 2760
ttcatctatg gttggcaact aacactgtta ctcttagcaa ttgtacccat cattgcaata 2820
gcaggagttg ttgaaatgaa aatgttgtct ggacaagcac tgaaagataa gaaagaacta 2880
gaaggttctg ggaagatcgc tactgaagca atagaaaact tccgaaccgt tgtttctttg 2940
actcaggagc agaagtttga acatatgtat gctcagagtt tgcaggtacc atacagaaac 3000
tctttgagga aagcacacat ctttggaatt acattttcct tcacccaggc aatgatgtat 3060
ttttcctatg ctggatgttt ccggtttgga gcctacttgg tggcacataa actcatgagc 3120
tttgaggatg ttctgttagt attttcagct gttgtctttg gtgccatggc cgtggggcaa 3180
gtcagttcat ttgctcctga ctatgccaaa gccaaaatat cagcagccca catcatcatg 3240
atcattgaaa aaaccccttt gattgacagc tacagcacgg aaggcctaat gccgaacaca 3300
ttggaaggaa atgtcacatt tggtgaagtt gtattcaact atcccacccg accggacatc 3360
ccagtgcttc agggactgag cctggaggtg aagaagggcc agacgctggc tctggtgggc 3420
agcagtggct gtgggaagag cacagtggtc cagctcctgg agcggttcta cgaccccttg 3480
gcagggaaag tgctgcttga tggcaaagaa ataaagcgac tgaatgttca gtggctccga 3540
gcacacctgg gcatcgtgtc ccaggagccc atcctgtttg actgcagcat tgctgagaac 3600
attgcctatg gagacaacag ccgggtggtg tcacaggaag agattgtgag ggcagcaaag 3660
gaggccaaca tacatgcctt catcgagtca ctgcctaata aatatagcac taaagtagga 3720
gacaaaggaa ctcagctctc tggtggccag aaacaacgca ttgccatagc tcgtgccctt 3780
gttagacagc ctcatatttt gcttttggat gaagccacgt cagctctgga tacagaaagt 3840
gaaaaggttg tccaagaagc cctggacaaa gccagagaag gccgcacctg cattgtgatt 3900
gctcaccgcc tgtccaccat ccagaatgca gacttaatag tggtgtttca gaatggcaga 3960
gtcaaggagc atggcacgca tcagcagctg ctggcacaga aaggcatcta tttttcaatg 4020
gtcagtgtcc aggctggaac aaagcgccag 4050
<210> 162
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 精氨酸酶1, 同种型1
<400> 162
atgagcgcca agtccagaac catagggatt attggagctc ctttctcaaa gggacagcca 60
cgaggagggg tggaagaagg ccctacagta ttgagaaagg ctggtctgct tgagaaactt 120
aaagaacaag taactcaaaa ctttttaatt ttagagtgtg atgtgaagga ttatggggac 180
ctgccctttg ctgacatccc taatgacagt ccctttcaaa ttgtgaagaa tccaaggtct 240
gtgggaaaag caagcgagca gctggctggc aaggtggcag aagtcaagaa gaacggaaga 300
atcagcctgg tgctgggcgg agaccacagt ttggcaattg gaagcatctc tggccatgcc 360
agggtccacc ctgatcttgg agtcatctgg gtggatgctc acactgatat caacactcca 420
ctgacaacca caagtggaaa cttgcatgga caacctgtat ctttcctcct gaaggaacta 480
aaaggaaaga ttcccgatgt gccaggattc tcctgggtga ctccctgtat atctgccaag 540
gatattgtgt atattggctt gagagacgtg gaccctgggg aacactacat tttgaaaact 600
ctaggcatta aatacttttc aatgactgaa gtggacagac taggaattgg caaggtgatg 660
gaagaaacac tcagctatct actaggaaga aagaaaaggc caattcatct aagttttgat 720
gttgacggac tggacccatc tttcacacca gctactggca caccagtcgt gggaggtctg 780
acatacagag aaggtctcta catcacagaa gaaatctaca aaacagggct actctcagga 840
ttagatataa tggaagtgaa cccatccctg gggaagacac cagaagaagt aactcgaaca 900
gtgaacacag cagttgcaat aaccttggct tgtttcggac ttgctcggga gggtaatcac 960
aagcctattg actaccttaa cccacctaag 990
<210> 163
<211> 3459
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 一氧化氮合酶, 可诱导的 (iNOS/NOS2),
同种型1
<400> 163
atggcctgtc cttggaaatt tctgttcaag accaaattcc accagtatgc aatgaatggg 60
gaaaaagaca tcaacaacaa tgtggagaaa gccccctgtg ccacctccag tccagtgaca 120
caggatgacc ttcagtatca caacctcagc aagcagcaga atgagtcccc gcagcccctc 180
gtggagacgg gaaagaagtc tccagaatct ctggtcaagc tggatgcaac cccattgtcc 240
tccccacggc atgtgaggat caaaaactgg ggcagcggga tgactttcca agacacactt 300
caccataagg ccaaagggat tttaacttgc aggtccaaat cttgcctggg gtccattatg 360
actcccaaaa gtttgaccag aggacccagg gacaagccta cccctccaga tgagcttcta 420
cctcaagcta tcgaatttgt caaccaatat tacggctcct tcaaagaggc aaaaatagag 480
gaacatctgg ccagggtgga agcggtaaca aaggagatag aaacaacagg aacctaccaa 540
ctgacgggag atgagctcat cttcgccacc aagcaggcct ggcgcaatgc cccacgctgc 600
attgggagga tccagtggtc caacctgcag gtcttcgatg cccgcagctg ttccactgcc 660
cgggaaatgt ttgaacacat ctgcagacac gtgcgttact ccaccaacaa tggcaacatc 720
aggtcggcca tcaccgtgtt cccccagcgg agtgatggca agcacgactt ccgggtgtgg 780
aatgctcagc tcatccgcta tgctggctac cagatgccag atggcagcat cagaggggac 840
cctgccaacg tggaattcac tcagctgtgc atcgacctgg gctggaagcc caagtacggc 900
cgcttcgatg tggtccccct ggtcctgcag gccaatggcc gtgaccctga gctcttcgaa 960
atcccacctg accttgtgct tgaggtggcc atggaacatc ccaaatacga gtggtttcgg 1020
gaactggagc taaagtggta cgccctgcct gcagtggcca acatgctgct tgaggtgggc 1080
ggcctggagt tcccagggtg ccccttcaat ggctggtaca tgggcacaga gatcggagtc 1140
cgggacttct gtgacgtcca gcgctacaac atcctggagg aagtgggcag gagaatgggc 1200
ctggaaacgc acaagctggc ctcgctctgg aaagaccagg ctgtcgttga gatcaacatt 1260
gctgtgctcc atagtttcca gaagcagaat gtgaccatca tggaccacca ctcggctgca 1320
gaatccttca tgaagtacat gcagaatgaa taccggtccc gtgggggctg cccggcagac 1380
tggatttggc tggtccctcc catgtctggg agcatcaccc ccgtgtttca ccaggagatg 1440
ctgaactacg tcctgtcccc tttctactac tatcaggtag aggcctggaa aacccatgtc 1500
tggcaggacg agaagcggag acccaagaga agagagattc cattgaaagt cttggtcaaa 1560
gctgtgctct ttgcctgtat gctgatgcgc aagacaatgg cgtcccgagt cagagtcacc 1620
atcctctttg cgacagagac aggaaaatca gaggcgctgg cctgggacct gggggcctta 1680
ttcagctgtg ccttcaaccc caaggttgtc tgcatggata agtacaggct gagctgcctg 1740
gaggaggaac ggctgctgtt ggtggtgacc agtacgtttg gcaatggaga ctgccctggc 1800
aatggagaga aactgaagaa atcgctcttc atgctgaaag agctcaacaa caaattcagg 1860
tacgctgtgt ttggcctcgg ctccagcatg taccctcggt tctgcgcctt tgctcatgac 1920
attgatcaga agctgtccca cctgggggcc tctcagctca ccccgatggg agaaggggat 1980
gagctcagtg ggcaggagga cgccttccgc agctgggccg tgcaaacctt caaggcagcc 2040
tgtgagacgt ttgatgtccg aggcaaacag cacattcaga tccccaagct ctacacctcc 2100
aatgtgacct gggacccgca ccactacagg ctcgtgcagg actcacagcc tttggacctc 2160
agcaaagccc tcagcagcat gcatgccaag aacgtgttca ccatgaggct caaatctcgg 2220
cagaatctac aaagtccgac atccagccgt gccaccatcc tggtggaact ctcctgtgag 2280
gatggccaag gcctgaacta cctgccgggg gagcaccttg gggtttgccc aggcaaccag 2340
ccggccctgg tccaaggtat cctggagcga gtggtggatg gccccacacc ccaccagaca 2400
gtgcgcctgg aggccctgga tgagagtggc agctactggg tcagtgacaa gaggctgccc 2460
ccctgctcac tcagccaggc cctcacctac ttcctggaca tcaccacacc cccaacccag 2520
ctgctgctcc aaaagctggc ccaggtggcc acagaagagc ctgagagaca gaggctggag 2580
gccctgtgcc agccctcaga gtacagcaag tggaagttca ccaacagccc cacattcctg 2640
gaggtgctag aggagttccc gtccctgcgg gtgtctgctg gcttcctgct ttcccagctc 2700
cccattctga agcccaggtt ctactccatc agctcctccc gggatcacac gcccacagag 2760
atccacctga ctgtggccgt ggtcacctac cacacccgag atggccaggg tcccctgcac 2820
cacggcgtct gcagcacatg gctcaacagc ctgaagcccc aagacccagt gccctgcttt 2880
gtgcggaatg ccagcggctt ccacctcccc gaggatccct cccatccttg catcctcatc 2940
gggcctggca caggcatcgc gcccttccgc agtttctggc agcaacggct ccatgactcc 3000
cagcacaagg gagtgcgggg aggccgcatg accttggtgt ttgggtgccg ccgcccagat 3060
gaggaccaca tctaccagga ggagatgctg gagatggccc agaagggggt gctgcatgcg 3120
gtgcacacag cctattcccg cctgcctggc aagcccaagg tctatgttca ggacatcctg 3180
cggcagcagc tggccagcga ggtgctccgt gtgctccaca aggagccagg ccacctctat 3240
gtttgcgggg atgtgcgcat ggcccgggac gtggcccaca ccctgaagca gctggtggct 3300
gccaagctga aattgaatga ggagcaggtc gaggactatt tctttcagct caagagccag 3360
aagcgctatc acgaagatat ctttggtgct gtatttcctt acgaggcgaa gaaggacagg 3420
gtggcggtgc agcccagcag cctggagatg tcagcgctc 3459
<210> 164
<211> 3765
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> Her2
<400> 164
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 1980
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag 2040
aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg 2100
acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg 2160
aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag tctacaaggg catctggatc 2220
cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc 2280
cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca 2340
tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg tgcagctggt gacacagctt 2400
atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag 2460
gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg 2520
ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa 2580
attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg agacagagta ccatgcagat 2640
gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc 2700
caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc 2760
aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg 2820
ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg 2880
attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc 2940
agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg 3000
gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct 3060
gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg 3120
ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca 3180
ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg 3240
gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc 3300
ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg aggaccccac agtacccctg 3360
ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg 3420
aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc 3480
cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc aagactctct ccccagggaa gaatggggtc 3540
gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag 3600
ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc 3660
tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac ccagcacctt caaagggaca 3720
cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc cagtg 3765
<210> 165
<211> 567
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> KRAS
<400> 165
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60
atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120
aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180
caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240
gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300
aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360
ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420
tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480
agggagatcc gacaatacag attgaaaaaa atcagcaaag aagaaaagac tcctggctgt 540
gtgaaaatta aaaaatgcat tataatg 567
<210> 166
<211> 1809
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> PLK1
<400> 166
atgagtgctg cagtgactgc agggaagctg gcacgggcac cggccgaccc tgggaaagcc 60
ggggtccccg gagttgcagc tcccggagct ccggcggcgg ctccaccggc gaaagagatc 120
ccggaggtcc tagtggaccc acgcagccgg cggcgctatg tgcggggccg ctttttgggc 180
aagggcggct ttgccaagtg cttcgagatc tcggacgcgg acaccaagga ggtgttcgcg 240
ggcaagattg tgcctaagtc tctgctgctc aagccgcacc agagggagaa gatgtccatg 300
gaaatatcca ttcaccgcag cctcgcccac cagcacgtcg taggattcca cggctttttc 360
gaggacaacg acttcgtgtt cgtggtgttg gagctctgcc gccggaggtc tctcctggag 420
ctgcacaaga ggaggaaagc cctgactgag cctgaggccc gatactacct acggcaaatt 480
gtgcttggct gccagtacct gcaccgaaac cgagttattc atcgagacct caagctgggc 540
aaccttttcc tgaatgaaga tctggaggtg aaaatagggg attttggact ggcaaccaaa 600
gtcgaatatg acggggagag gaagaagacc ctgtgtggga ctcctaatta catagctccc 660
gaggtgctga gcaagaaagg gcacagtttc gaggtggatg tgtggtccat tgggtgtatc 720
atgtatacct tgttagtggg caaaccacct tttgagactt cttgcctaaa agagacctac 780
ctccggatca agaagaatga atacagtatt cccaagcaca tcaaccccgt ggccgcctcc 840
ctcatccaga agatgcttca gacagatccc actgcccgcc caaccattaa cgagctgctt 900
aatgacgagt tctttacttc tggctatatc cctgcccgtc tccccatcac ctgcctgacc 960
attccaccaa ggttttcgat tgctcccagc agcctggacc ccagcaaccg gaagcccctc 1020
acagtcctca ataaaggctt ggagaacccc ctgcctgagc gtccccggga aaaagaagaa 1080
ccagtggttc gagagacagg tgaggtggtc gactgccacc tcagtgacat gctgcagcag 1140
ctgcacagtg tcaatgcctc caagccctcg gagcgtgggc tggtcaggca agaggaggct 1200
gaggatcctg cctgcatccc catcttctgg gtcagcaagt gggtggacta ttcggacaag 1260
tacggccttg ggtatcagct ctgtgataac agcgtggggg tgctcttcaa tgactcaaca 1320
cgcctcatcc tctacaatga tggtgacagc ctgcagtaca tagagcgtga cggcactgag 1380
tcctacctca ccgtgagttc ccatcccaac tccttgatga agaagatcac cctccttaaa 1440
tatttccgca attacatgag cgagcacttg ctgaaggcag gtgccaacat cacgccgcgc 1500
gaaggtgatg agctcgcccg gctgccctac ctacggacct ggttccgcac ccgcagcgcc 1560
atcatcctgc acctcagcaa cggcagcgtg cagatcaact tcttccagga tcacaccaag 1620
ctcatcttgt gcccactgat ggcagccgtg acctacatcg acgagaagcg ggacttccgc 1680
acataccgcc tgagtctcct ggaggagtac ggctgctgca aggagctggc cagccggctc 1740
cgctacgccc gcactatggt ggacaagctg ctgagctcac gctcggccag caaccgtctc 1800
aaggcctcc 1809
<210> 167
<211> 876
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> dapA, 菌株 LT2
<400> 167
atgttcacgg gaagtattgt cgcgcttgtt acgccgatgg atgagaaagg taacgtcagt 60
aggtcttgcc tgaaaaaact cattgattat catgtcgcca acggtacctc ggcgattgtt 120
tcggttggca ctaccggcga gtctgccacg ctaagccatg atgaacatgg cgatgtcgtg 180
atgatgacgc tggaactggc tgacggacgt attccggtta tcgccggcac gggcgcaaac 240
gcgaccgcgg aagcgattag cctgacgcag cgttttaacg atagcggtat tgtaggctgc 300
ctgacggtaa cgccgtacta caatcgcccc acgcaggaag gtttgttcca gcatttcaaa 360
gccatcgcgg aacacactga cttgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtaccggt 420
tgcgatatgt tgccggaaac cgtgggtcgt ctggcggaaa taaaaaatat tatcgctatc 480
aaagaggcga cagggaactt aacccgcgtt caccagatca aagagctggt ttcagacgat 540
tttattctgc ttagcggcga tgacgcgtct gcgctggact ttatgcaact gggtggtcat 600
ggcgtgattt ccgttacggc taacgtagcg gcgcgcgaga tggctgacat gtgcaaactg 660
gcggcggaag ggcaatttgc cgaggcgcgc gctatcaacc agcgtctgat gccgttacac 720
aacaaactat ttgtcgaacc caatcctatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggcattgggt 780
cttgtggcga ccgacacgct gcgcctgcca atgacgccta tcacggacca tggtcgtgac 840
atcgtcaaag cagcgcttca gcatgctggc ctgctg 876
<210> 168
<211> 819
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> dapB, 菌株 LT2
<400> 168
atgcatgaag cacaaatccg cgtcgccatt gccggcgccg gtggccgcat gggacggcag 60
ttaatccagg ccgccatggc gatggaaggt gttcagctgg gtgccgcgct ggagcgcgaa 120
ggctcttcct tgctgggcag cgatgctggc gaactggcag gggcgggaaa gtccggcgtg 180
atcgttcaaa gcagccttga ggcggtaaaa gatgattttg acgttttcat cgattttacc 240
cgtccggaag gcacgttgac gcatctggcg ttttgccgcc agcatggtaa agggatggtg 300
attggtacta ccggctttga cgacgccggt aaacaagcca ttcgcgaggc gtcacaagag 360
attgcgatcg ttttcgccgc aaactttagc gtcggcgtta acgtcatgct caagctgctg 420
gagaaagccg cgaaggtaat gggcgactat agcgatattg aaattattga agcgcaccac 480
cgccataaag tggatgcacc gtcgggtacg gcgctggcaa tgggcgaggc aatcgccggg 540
gcgctggata aaaatctgaa ggactgcgcg gtctactcgc gtgaaggtta taccggcgag 600
cgcgtagcgg gcacgattgg ctttgcgacc gttcgggcgg gcgacatcgt cggcgaacat 660
accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgc gtagagatta cgcataaagc ttccagccgc 720
atgacgtttg caaatggcgc gttgcgatcg gcgttatggc taaaaacgaa gaaaaatggg 780
ctatttgaca tgcgggatgt gctggggctg gatgtatta 819
<210> 169
<211> 876
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> dapA
<400> 169
atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt 60
cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt 120
tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg 180
atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac 240
gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc 300
ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa 360
gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc 420
tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc 480
aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat 540
tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat 600
ggggttattt ccgttacgac taacgtcgca gcgcgtgata tggcccagat gtgcaaactg 660
gcagcagaag aacattttgc cgaggcacgc gttattaatc agcgtctgat gccattacac 720
aacaaactat ttgtcgaacc caatccaatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggaactgggt 780
cttgtggcga ccgatacgct gcgcctgcca atgacaccaa tcaccgacag tggtcgtgag 840
acggtcagag cggcgcttaa gcatgccggt ttgctg 876
<210> 170
<211> 819
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> dapB
<400> 170
atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60
ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggagcgtgaa 120
ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180
accgtgcaaa gcagcctcga tgcggtaaaa gatgattttg atgtgtttat cgattttacc 240
cgtccggaag gtacgctgaa ccatctcgct ttttgtcgcc agcatggcaa agggatggtg 300
atcggcacta cggggtttga cgaagccggt aaacaagcaa ttcgtgacgc cgctgccgat 360
attgcgattg tctttgcggc caattttagc gttggcgtta acgtcatgct taagctgctg 420
gagaaagcag ccaaagtgat gggtgactac accgatatcg aaattattga agcacatcat 480
agacataaag ttgatgcgcc gtcaggcacc gcactggcaa tgggagaggc gatcgcccac 540
gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600
cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660
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atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780
ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttg 819
<210> 171
<211> 1218
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> dapC
<400> 171
atggcaattg aacaaacagc aattacacgc gcgactttcg atgaagtgat cctgccgatt 60
tatgctccgg cagagtttat tccggtaaaa ggtcagggca gccgaatctg ggatcagcaa 120
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cctgcgctgg tgaacgcgtt aaaaacccag ggcgaaactc tgtggcatat cagtaacgtt 240
ttcaccaatg aaccggcgct gcgtcttggg cgtaaactga ttgaggcaac gtttgccgaa 300
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<210> 172
<211> 822
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> dapD
<400> 172
atgcagcagt tacagaacat tattgaaacc gcttttgaac gccgtgccga gatcacgcca 60
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<210> 173
<211> 1125
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> dapE
<400> 173
atgtcgtgcc cggttattga gctgacacaa cagcttattc gccgcccttc cctgagtcct 60
gatgatgcag gatgccaggc tttgttgatt gaacgtttgc aggcgatcgg ttttaccgtt 120
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<210> 174
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> p53
<400> 174
atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60
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<210> 175
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ERBA
<400> 175
atggaacaga agccaagcaa ggtggagtgt gggtcagacc cagaggagaa cagtgccagg 60
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> myc
<400> 176
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> MYB
<400> 177
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<213> 智人
<220>
<223> JUN
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> ERBB
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catttgtatg aacatctgac tttggaaaaa tcttcaagca atttagcagt ttcaggacat 7140
ccattttatc aagtttctgc tacaagaaat gaaaaaatga gacacttgat tactacaggc 7200
agaccaacca aagtctttgt tccacctttt aaaactaaat cacattttca cagagttgaa 7260
cagtgtgtta ggaatattaa cttggaggaa aacagacaaa agcaaaacat tgatggacat 7320
ggctctgatg atagtaaaaa taagattaat gacaatgaga ttcatcagtt taacaaaaac 7380
aactccaatc aagcagcagc tgtaactttc acaaagtgtg aagaagaacc tttagattta 7440
attacaagtc ttcagaatgc cagagatata caggatatgc gaattaagaa gaaacaaagg 7500
caacgcgtct ttccacagcc aggcagtctg tatcttgcaa aaacatccac tctgcctcga 7560
atctctctga aagcagcagt aggaggccaa gttccctctg cgtgttctca taaacagctg 7620
tatacgtatg gcgtttctaa acattgcata aaaattaaca gcaaaaatgc agagtctttt 7680
cagtttcaca ctgaagatta ttttggtaag gaaagtttat ggactggaaa aggaatacag 7740
ttggctgatg gtggatggct cataccctcc aatgatggaa aggctggaaa agaagaattt 7800
tatagggctc tgtgtgacac tccaggtgtg gatccaaagc ttatttctag aatttgggtt 7860
tataatcact atagatggat catatggaaa ctggcagcta tggaatgtgc ctttcctaag 7920
gaatttgcta atagatgcct aagcccagaa agggtgcttc ttcaactaaa atacagatat 7980
gatacggaaa ttgatagaag cagaagatcg gctataaaaa agataatgga aagggatgac 8040
acagctgcaa aaacacttgt tctctgtgtt tctgacataa tttcattgag cgcaaatata 8100
tctgaaactt ctagcaataa aactagtagt gcagataccc aaaaagtggc cattattgaa 8160
cttacagatg ggtggtatgc tgttaaggcc cagttagatc ctcccctctt agctgtctta 8220
aagaatggca gactgacagt tggtcagaag attattcttc atggagcaga actggtgggc 8280
tctcctgatg cctgtacacc tcttgaagcc ccagaatctc ttatgttaaa gatttctgct 8340
aacagtactc ggcctgctcg ctggtatacc aaacttggat tctttcctga ccctagacct 8400
tttcctctgc ccttatcatc gcttttcagt gatggaggaa atgttggttg tgttgatgta 8460
attattcaaa gagcataccc tatacagtgg atggagaaga catcatctgg attatacata 8520
tttcgcaatg aaagagagga agaaaaggaa gcagcaaaat atgtggaggc ccaacaaaag 8580
agactagaag ccttattcac taaaattcag gaggaatttg aagaacatga agaaaacaca 8640
acaaaaccat atttaccatc acgtgcacta acaagacagc aagttcgtgc tttgcaagat 8700
ggtgcagagc tttatgaagc agtgaagaat gcagcagacc cagcttacct tgagggttat 8760
ttcagtgaag agcagttaag agccttgaat aatcacaggc aaatgttgaa tgataagaaa 8820
caagctcaga tccagttgga aattaggaag gccatggaat ctgctgaaca aaaggaacaa 8880
ggtttatcaa gggatgtcac aaccgtgtgg aagttgcgta ttgtaagcta ttcaaaaaaa 8940
gaaaaagatt cagttatact gagtatttgg cgtccatcat cagatttata ttctctgtta 9000
acagaaggaa agagatacag aatttatcat cttgcaactt caaaatctaa aagtaaatct 9060
gaaagagcta acatacagtt agcagcgaca aaaaaaactc agtatcaaca actaccggtt 9120
tcagatgaaa ttttatttca gatttaccag ccacgggagc cccttcactt cagcaaattt 9180
ttagatccag actttcagcc atcttgttct gaggtggacc taataggatt tgtcgtttct 9240
gttgtgaaaa aaacaggact tgcccctttc gtctatttgt cagacgaatg ttacaattta 9300
ctggcaataa agttttggat agaccttaat gaggacatta ttaagcctca tatgttaatt 9360
gctgcaagca acctccagtg gcgaccagaa tccaaatcag gccttcttac tttatttgct 9420
ggagattttt ctgtgttttc tgctagtcca aaagagggcc actttcaaga gacattcaac 9480
aaaatgaaaa atactgttga gaatattgac atactttgca atgaagcaga aaacaagctt 9540
atgcatatac tgcatgcaaa tgatcccaag tggtccaccc caactaaaga ctgtacttca 9600
gggccgtaca ctgctcaaat cattcctggt acaggaaaca agcttctgat gtcttctcct 9660
aattgtgaga tatattatca aagtccttta tcactttgta tggccaaaag gaagtctgtt 9720
tccacacctg tctcagccca gatgacttca aagtcttgta aaggggagaa agagattgat 9780
gaccaaaaga actgcaaaaa gagaagagcc ttggatttct tgagtagact gcctttacct 9840
ccacctgtta gtcccatttg tacatttgtt tctccggctg cacagaaggc atttcagcca 9900
ccaaggagtt gtggcaccaa atacgaaaca cccataaaga aaaaagaact gaattctcct 9960
cagatgactc catttaaaaa attcaatgaa atttctcttt tggaaagtaa ttcaatagct 10020
gacgaagaac ttgcattgat aaatacccaa gctcttttgt ctggttcaac aggagaaaaa 10080
caatttatat ctgtcagtga atccactagg actgctccca ccagttcaga agattatctc 10140
agactgaaac gacgttgtac tacatctctg atcaaagaac aggagagttc ccaggccagt 10200
acggaagaat gtgagaaaaa taagcaggac acaattacaa ctaaaaaata tatc 10254
<210> 182
<211> 2487
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> MCC
<400> 182
atgaattccg gagttgccat gaaatatgga aacgactcct cggccgagct gagtgagctc 60
cattcagcag ccctggcatc actaaaggga gatatagtgg aacttaataa acgtctccag 120
caaacagaga gggaacggga ccttctggaa aagaaattgg ccaaggcaca gtgcgagcag 180
tcccacctca tgagagagca tgaggatgtc caggagcgaa cgacgcttcg ctatgaggaa 240
cgcatcacag agctccacag cgtcattgcg gagctcaaca agaagataga ccgtctgcaa 300
ggcaccacca tcagggagga agatgagtac tcagaactgc gatcagaact cagccagagc 360
caacacgagg tcaacgagga ctctcgaagc atggaccaag accagacctc tgtctctatc 420
cccgaaaacc agtctaccat ggttactgct gacatggaca actgcagtga cctgaactca 480
gaactgcaga gggtgctgac agggctggag aatgttgtct gcggcaggaa gaagagcagc 540
tgcagcctct ccgtggccga ggtggacagg cacattgagc agctcaccac agccagcgag 600
cactgtgacc tggctattaa gacagtcgag gagattgagg gggtgcttgg ccgggacctg 660
tatcccaacc tggctgaaga gaggtctcgg tgggagaagg agctggctgg gctgagggaa 720
gagaatgaga gcctgactgc catgctgtgc agcaaagagg aagaactgaa ccggactaag 780
gccaccatga atgccatccg ggaagagcgg gaccggctcc ggaggcgggt cagagagctt 840
caaactcgac tacagagcgt gcaggccaca ggtccctcca gccctggccg cctcacttcc 900
accaaccgcc cgattaaccc cagcactggg gagctgagca caagcagcag cagcaatgac 960
attcccatcg ccaagattgc tgagagggtg aagctatcaa agacaaggtc cgaatcgtca 1020
tcatctgatc ggccagtcct gggctcagaa atcagtagca taggggtatc cagcagtgtg 1080
gctgaacacc tggcccactc acttcaggac tgctccaata tccaagagat tttccaaaca 1140
ctctactcac acggatctgc catctcagaa agcaagatta gagagtttga ggtggaaaca 1200
gaacggctga atagccggat tgagcacctc aaatcccaaa atgacctcct gaccataacc 1260
ttggaggaat gtaaaagcaa tgctgagagg atgagcatgc tggtgggaaa atacgaatcc 1320
aatgccacag cgctgaggct ggccttgcag tacagcgagc agtgcatcga agcctacgaa 1380
ctcctcctgg cgctggcaga gagtgagcag agcctcatcc tggggcagtt ccgagcggcg 1440
ggcgtggggt cctcccctgg agaccagtcg ggggatgaaa acatcactca gatgctcaag 1500
cgagctcatg actgccggaa gacagctgag aacgctgcca aggccctgct catgaagctg 1560
gacggcagct gtgggggagc ctttgccgtg gccggctgca gcgtgcagcc ctgggagagc 1620
ctttcctcca acagccacac cagcacaacc agctccacag ccagtagttg cgacaccgag 1680
ttcactaaag aagacgagca gaggctgaag gattatatcc agcagctcaa gaatgacagg 1740
gctgcggtca agctgaccat gctggagctg gaaagcatcc acatcgatcc tctcagctat 1800
gacgtcaagc ctcggggaga cagccagagg ctggatctgg aaaacgcagt gcttatgcag 1860
gagctcatgg ccatgaagga ggagatggcc gagttgaagg cccagctcta cctactggag 1920
aaagagaaga aggccctgga gctgaagctg agcacgcggg aggcccagga gcaggcctac 1980
ctggtgcaca ttgagcacct gaagtccgag gtggaggagc agaaggagca gcggatgcga 2040
tccctcagct ccaccagcag cggcagcaaa gataaacctg gcaaggagtg tgctgatgct 2100
gcctccccag ctctgtccct agctgaactc aggacaacgt gcagcgagaa tgagctggct 2160
gcggagttca ccaacgccat tcgtcgagaa aagaagttga aggccagagt tcaagagctg 2220
gtgagtgcct tggagagact caccaagagc agtgaaatcc gacatcagca atctgcagag 2280
ttcgtgaatg atctaaagcg ggccaacagc aacctggtgg ctgcctatga gaaagcaaag 2340
aaaaagcatc aaaacaaact gaagaagtta gagtcgcaga tgatggccat ggtggagaga 2400
catgagaccc aagtgaggat gctcaagcaa agaatagctc tgctagagga ggagaactcc 2460
aggccacaca ccaatgaaac ttcgctt 2487
<210> 183
<211> 2253
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> EZH2, 同种型1
<400> 183
atgggccaga ctgggaagaa atctgagaag ggaccagttt gttggcggaa gcgtgtaaaa 60
tcagagtaca tgcgactgag acagctcaag aggttcagac gagctgatga agtaaagagt 120
atgtttagtt ccaatcgtca gaaaattttg gaaagaacgg aaatcttaaa ccaagaatgg 180
aaacagcgaa ggatacagcc tgtgcacatc ctgacttctg tgagctcatt gcgcgggact 240
agggagtgtt cggtgaccag tgacttggat tttccaacac aagtcatccc attaaagact 300
ctgaatgcag ttgcttcagt acccataatg tattcttggt ctcccctaca gcagaatttt 360
atggtggaag atgaaactgt tttacataac attccttata tgggagatga agttttagat 420
caggatggta ctttcattga agaactaata aaaaattatg atgggaaagt acacggggat 480
agagaatgtg ggtttataaa tgatgaaatt tttgtggagt tggtgaatgc ccttggtcaa 540
tataatgatg atgacgatga tgatgatgga gacgatcctg aagaaagaga agaaaagcag 600
aaagatctgg aggatcaccg agatgataaa gaaagccgcc cacctcggaa atttccttct 660
gataaaattt ttgaagccat ttcctcaatg tttccagata agggcacagc agaagaacta 720
aaggaaaaat ataaagaact caccgaacag cagctcccag gcgcacttcc tcctgaatgt 780
acccccaaca tagatggacc aaatgctaaa tctgttcaga gagagcaaag cttacactcc 840
tttcatacgc ttttctgtag gcgatgtttt aaatatgact gcttcctaca tcgtaagtgc 900
aattattctt ttcatgcaac acccaacact tataagcgga agaacacaga aacagctcta 960
gacaacaaac cttgtggacc acagtgttac cagcatttgg agggagcaaa ggagtttgct 1020
gctgctctca ccgctgagcg gataaagacc ccaccaaaac gtccaggagg ccgcagaaga 1080
ggacggcttc ccaataacag tagcaggccc agcaccccca ccattaatgt gctggaatca 1140
aaggatacag acagtgatag ggaagcaggg actgaaacgg ggggagagaa caatgataaa 1200
gaagaagaag agaagaaaga tgaaacttcg agctcctctg aagcaaattc tcggtgtcaa 1260
acaccaataa agatgaagcc aaatattgaa cctcctgaga atgtggagtg gagtggtgct 1320
gaagcctcaa tgtttagagt cctcattggc acttactatg acaatttctg tgccattgct 1380
aggttaattg ggaccaaaac atgtagacag gtgtatgagt ttagagtcaa agaatctagc 1440
atcatagctc cagctcccgc tgaggatgtg gatactcctc caaggaaaaa gaagaggaaa 1500
caccggttgt gggctgcaca ctgcagaaag atacagctga aaaaggacgg ctcctctaac 1560
catgtttaca actatcaacc ctgtgatcat ccacggcagc cttgtgacag ttcgtgccct 1620
tgtgtgatag cacaaaattt ttgtgaaaag ttttgtcaat gtagttcaga gtgtcaaaac 1680
cgctttccgg gatgccgctg caaagcacag tgcaacacca agcagtgccc gtgctacctg 1740
gctgtccgag agtgtgaccc tgacctctgt cttacttgtg gagccgctga ccattgggac 1800
agtaaaaatg tgtcctgcaa gaactgcagt attcagcggg gctccaaaaa gcatctattg 1860
ctggcaccat ctgacgtggc aggctggggg atttttatca aagatcctgt gcagaaaaat 1920
gaattcatct cagaatactg tggagagatt atttctcaag atgaagctga cagaagaggg 1980
aaagtgtatg ataaatacat gtgcagcttt ctgttcaact tgaacaatga ttttgtggtg 2040
gatgcaaccc gcaagggtaa caaaattcgt tttgcaaatc attcggtaaa tccaaactgc 2100
tatgcaaaag ttatgatggt taacggtgat cacaggatag gtatttttgc caagagagcc 2160
atccagactg gcgaagagct gttttttgat tacagataca gccaggctga tgccctgaag 2220
tatgtcggca tcgaaagaga aatggaaatc cct 2253
<210> 184
<211> 1053
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> NIPP1/PPP1R8, 同种型alpha
<400> 184
atggcggcag ccgcgaactc cggctctagc ctcccgctgt tcgactgccc aacctgggca 60
ggtaagcccc ctcccggttt acatctggat gtagtcaaag gagacaaact aattgagaaa 120
ctgattattg atgagaagaa gtattactta tttgggagaa accctgattt gtgtgacttt 180
accattgacc accagtcttg ctctcgggtc catgctgcac ttgtctacca caagcatctg 240
aagagagttt tcctgataga tctcaacagt acacacggca ctttcttggg tcacattcgg 300
ttggaacctc acaagcctca gcaaattccc atcgattcca cggtctcatt tggcgcatcc 360
acaagggcat acactctgcg cgagaagcct cagacattgc catcggctgt gaaaggagat 420
gagaagatgg gtggagagga tgatgaactc aagggcttac tggggcttcc agaggaggaa 480
actgagcttg ataacctgac agagttcaac actgcccaca acaagcggat ttctaccctt 540
accattgagg agggaaatct ggacattcaa agaccaaaga ggaagaggaa gaactcacgg 600
gtgacattca gtgaggatga tgagatcatc aacccagagg atgtggatcc ctcagttggt 660
cgattcagga acatggtgca aactgcagtg gtcccagtca agaagaagcg tgtggagggc 720
cctggctccc tgggcctgga ggaatcaggg agcaggcgca tgcagaactt tgccttcagc 780
ggaggactct acgggggcct gccccccaca cacagtgaag caggctccca gccacatggc 840
atccatggga cagcactcat cggtggcttg cccatgccat acccaaacct tgcccctgat 900
gtggacttga ctcctgttgt gccgtcagca gtgaacatga accctgcacc aaaccctgca 960
gtctataacc ctgaagctgt aaatgaaccc aagaagaaga aatatgcaaa agaggcttgg 1020
ccaggcaaga agcccacacc ttccttgctg att 1053
<210> 185
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> PPP1CA, 同种型1
<400> 185
atgtccgaca gcgagaagct caacctggac tcgatcatcg ggcgcctgct ggaagtgcag 60
ggctcgcggc ctggcaagaa tgtacagctg acagagaacg agatccgcgg tctgtgcctg 120
aaatcccggg agatttttct gagccagccc attcttctgg agctggaggc acccctcaag 180
atctgcggtg acatacacgg ccagtactac gaccttctgc gactatttga gtatggcggt 240
ttccctcccg agagcaacta cctctttctg ggggactatg tggacagggg caagcagtcc 300
ttggagacca tctgcctgct gctggcctat aagatcaagt accccgagaa cttcttcctg 360
ctccgtggga accacgagtg tgccagcatc aaccgcatct atggtttcta cgatgagtgc 420
aagagacgct acaacatcaa actgtggaaa accttcactg actgcttcaa ctgcctgccc 480
atcgcggcca tagtggacga aaagatcttc tgctgccacg gaggcctgtc cccggacctg 540
cagtctatgg agcagattcg gcggatcatg cggcccacag atgtgcctga ccagggcctg 600
ctgtgtgacc tgctgtggtc tgaccctgac aaggacgtgc agggctgggg cgagaacgac 660
cgtggcgtct cttttacctt tggagccgag gtggtggcca agttcctcca caagcacgac 720
ttggacctca tctgccgagc acaccaggtg gtagaagacg gctacgagtt ctttgccaag 780
cggcagctgg tgacactttt ctcagctccc aactactgtg gcgagtttga caatgctggc 840
gccatgatga gtgtggacga gaccctcatg tgctctttcc agatcctcaa gcccgccgac 900
aagaacaagg ggaagtacgg gcagttcagt ggcctgaacc ctggaggccg acccatcacc 960
ccaccccgca attccgccaa agccaagaaa 990
<210> 186
<211> 1818
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TAK1/MAP3K7, 同种型1B
<400> 186
atgtctacag cctctgccgc ctcctcctcc tcctcgtctt cggccggtga gatgatcgaa 60
gccccttccc aggtcctcaa ctttgaagag atcgactaca aggagatcga ggtggaagag 120
gttgttggaa gaggagcctt tggagttgtt tgcaaagcta agtggagagc aaaagatgtt 180
gctattaaac aaatagaaag tgaatctgag aggaaagcgt ttattgtaga gcttcggcag 240
ttatcccgtg tgaaccatcc taatattgta aagctttatg gagcctgctt gaatccagtg 300
tgtcttgtga tggaatatgc tgaagggggc tctttatata atgtgctgca tggtgctgaa 360
ccattgccat attatactgc tgcccacgca atgagttggt gtttacagtg ttcccaagga 420
gtggcttatc ttcacagcat gcaacccaaa gcgctaattc acagggacct gaaaccacca 480
aacttactgc tggttgcagg ggggacagtt ctaaaaattt gtgattttgg tacagcctgt 540
gacattcaga cacacatgac caataacaag gggagtgctg cttggatggc acctgaagtt 600
tttgaaggta gtaattacag tgaaaaatgt gacgtcttca gctggggtat tattctttgg 660
gaagtgataa cgcgtcggaa accctttgat gagattggtg gcccagcttt ccgaatcatg 720
tgggctgttc ataatggtac tcgaccacca ctgataaaaa atttacctaa gcccattgag 780
agcctgatga ctcgttgttg gtctaaagat ccttcccagc gcccttcaat ggaggaaatt 840
gtgaaaataa tgactcactt gatgcggtac tttccaggag cagatgagcc attacagtat 900
ccttgtcagt attcagatga aggacagagc aactctgcca ccagtacagg ctcattcatg 960
gacattgctt ctacaaatac gagtaacaaa agtgacacta atatggagca agttcctgcc 1020
acaaatgata ctattaagcg cttagaatca aaattgttga aaaatcaggc aaagcaacag 1080
agtgaatctg gacgtttaag cttgggagcc tcccgtggga gcagtgtgga gagcttgccc 1140
ccaacctctg agggcaagag gatgagtgct gacatgtctg aaatagaagc taggatcgcc 1200
gcaaccacag cctattccaa gcctaaacgg ggccaccgta aaactgcttc atttggcaac 1260
attctggatg tccctgagat cgtcatatca ggcaacggac agccaagacg tagatccatc 1320
caagacttga ctgtaactgg aacagaacct ggtcaggtga gcagtaggtc atccagtccc 1380
agtgtcagaa tgattactac ctcaggacca acctcagaaa agccaactcg aagtcatcca 1440
tggacccctg atgattccac agataccaat ggatcagata actccatccc aatggcttat 1500
cttacactgg atcaccaact acagcctcta gcaccgtgcc caaactccaa agaatctatg 1560
gcagtgtttg aacagcattg taaaatggca caagaatata tgaaagttca aacagaaatt 1620
gcattgttat tacagagaaa gcaagaacta gttgcagaac tggaccagga tgaaaaggac 1680
cagcaaaata catctcgcct ggtacaggaa cataaaaagc ttttagatga aaacaaaagc 1740
ctttctactt actaccagca atgcaaaaaa caactagagg tcatcagaag tcagcagcag 1800
aaacgacaag gcacttca 1818
<210> 187
<211> 204
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> CMV 启动子
<400> 187
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 188
<211> 1212
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 胱天蛋白酶-1, 同种型alpha
<400> 188
atggccgaca aggtcctgaa ggagaagaga aagctgttta tccgttccat gggtgaaggt 60
acaataaatg gcttactgga tgaattatta cagacaaggg tgctgaacaa ggaagagatg 120
gagaaagtaa aacgtgaaaa tgctacagtt atggataaga cccgagcttt gattgactcc 180
gttattccga aaggggcaca ggcatgccaa atttgcatca catacatttg tgaagaagac 240
agttacctgg cagggacgct gggactctca gcagatcaaa catctggaaa ttaccttaat 300
atgcaagact ctcaaggagt actttcttcc tttccagctc ctcaggcagt gcaggacaac 360
ccagctatgc ccacatcctc aggctcagaa gggaatgtca agctttgctc cctagaagaa 420
gctcaaagga tatggaaaca aaagtcggca gagatttatc caataatgga caagtcaagc 480
cgcacacgtc ttgctctcat tatctgcaat gaagaatttg acagtattcc tagaagaact 540
ggagctgagg ttgacatcac aggcatgaca atgctgctac aaaatctggg gtacagcgta 600
gatgtgaaaa aaaatctcac tgcttcggac atgactacag agctggaggc atttgcacac 660
cgcccagagc acaagacctc tgacagcacg ttcctggtgt tcatgtctca tggtattcgg 720
gaaggcattt gtgggaagaa acactctgag caagtcccag atatactaca actcaatgca 780
atctttaaca tgttgaatac caagaactgc ccaagtttga aggacaaacc gaaggtgatc 840
atcatccagg cctgccgtgg tgacagccct ggtgtggtgt ggtttaaaga ttcagtagga 900
gtttctggaa acctatcttt accaactaca gaagagtttg aggatgatgc tattaagaaa 960
gcccacatag agaaggattt tatcgctttc tgctcttcca caccagataa tgtttcttgg 1020
agacatccca caatgggctc tgtttttatt ggaagactca ttgaacatat gcaagaatat 1080
gcctgttcct gtgatgtgga ggaaattttc cgcaaggttc gattttcatt tgagcagcca 1140
gatggtagag cgcagatgcc caccactgaa agagtgactt tgacaagatg tttctacctc 1200
ttcccaggac at 1212
<210> 189
<211> 885
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 细胞周期蛋白-D1/CCND1
<400> 189
atggaacacc agctcctgtg ctgcgaagtg gaaaccatcc gccgcgcgta ccccgatgcc 60
aacctcctca acgaccgggt gctgcgggcc atgctgaagg cggaggagac ctgcgcgccc 120
tcggtgtcct acttcaaatg tgtgcagaag gaggtcctgc cgtccatgcg gaagatcgtc 180
gccacctgga tgctggaggt ctgcgaggaa cagaagtgcg aggaggaggt cttcccgctg 240
gccatgaact acctggaccg cttcctgtcg ctggagcccg tgaaaaagag ccgcctgcag 300
ctgctggggg ccacttgcat gttcgtggcc tctaagatga aggagaccat ccccctgacg 360
gccgagaagc tgtgcatcta caccgacaac tccatccggc ccgaggagct gctgcaaatg 420
gagctgctcc tggtgaacaa gctcaagtgg aacctggccg caatgacccc gcacgatttc 480
attgaacact tcctctccaa aatgccagag gcggaggaga acaaacagat catccgcaaa 540
cacgcgcaga ccttcgttgc cctctgtgcc acagatgtga agttcatttc caatccgccc 600
tccatggtgg cagcggggag cgtggtggcc gcagtgcaag gcctgaacct gaggagcccc 660
aacaacttcc tgtcctacta ccgcctcaca cgcttcctct ccagagtgat caagtgtgac 720
ccggactgcc tccgggcctg ccaggagcag atcgaagccc tgctggagtc aagcctgcgc 780
caggcccagc agaacatgga ccccaaggcc gccgaggagg aggaagagga ggaggaggag 840
gtggacctgg cttgcacacc caccgacgtg cgggacgtgg acatc 885
<210> 190
<211> 996
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> A2b 受体 (ADORA2B)
<400> 190
atgctgctgg agacacagga cgcgctgtac gtggcgctgg agctggtcat cgccgcgctt 60
tcggtggcgg gcaacgtgct ggtgtgcgcc gcggtgggca cggcgaacac tctgcagacg 120
cccaccaact acttcctggt gtccctggct gcggccgacg tggccgtggg gctcttcgcc 180
atcccctttg ccatcaccat cagcctgggc ttctgcactg acttctacgg ctgcctcttc 240
ctcgcctgct tcgtgctggt gctcacgcag agctccatct tcagccttct ggccgtggca 300
gtcgacagat acctggccat ctgtgtcccg ctcaggtata aaagtttggt cacggggacc 360
cgagcaagag gggtcattgc tgtcctctgg gtccttgcct ttggcatcgg attgactcca 420
ttcctggggt ggaacagtaa agacagtgcc accaacaact gcacagaacc ctgggatgga 480
accacgaatg aaagctgctg ccttgtgaag tgtctctttg agaatgtggt ccccatgagc 540
tacatggtat atttcaattt ctttgggtgt gttctgcccc cactgcttat aatgctggtg 600
atctacatta agatcttcct ggtggcctgc aggcagcttc agcgcactga gctgatggac 660
cactcgagga ccaccctcca gcgggagatc catgcagcca agtcactggc catgattgtg 720
gggatttttg ccctgtgctg gttacctgtg catgctgtta actgtgtcac tcttttccag 780
ccagctcagg gtaaaaataa gcccaagtgg gcaatgaata tggccattct tctgtcacat 840
gccaattcag ttgtcaatcc cattgtctat gcttaccgga accgagactt ccgctacact 900
tttcacaaaa ttatctccag gtatcttctc tgccaagcag atgtcaagag tgggaatggt 960
caggctgggg tacagcctgc tctcggtgtg ggccta 996
<210> 191
<211> 1242
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> HHLA2, 同种型1
<400> 191
atgaaggcac agacagcact gtctttcttc ctcattctca taacatctct gagtggatct 60
caaggcatat tccctttggc tttcttcatt tatgttccta tgaatgaaca aatcgtcatt 120
ggaagacttg atgaagatat aattctccct tcttcatttg agaggggatc cgaagtcgta 180
atacactgga agtatcaaga tagctataag gttcacagtt actacaaagg cagtgaccat 240
ttggaaagcc aagatcccag atatgcaaac aggacatccc ttttctataa tgagattcaa 300
aatgggaatg cgtcgctatt tttcagaaga gtaagccttc tggacgaagg aatttacacc 360
tgctatgtag gaacagcaat tcaagtgatt acaaacaaag tggtgctaaa ggtgggagtt 420
tttctcacac ccgtgatgaa gtatgaaaag aggaacacaa acagcttctt aatatgcagc 480
gtgttaagtg tttatcctcg tccaattatc acgtggaaaa tggacaacac acctatctct 540
gaaaacaaca tggaagaaac agggtctttg gattcttttt ctattaacag cccactgaat 600
attacaggat caaattcatc ttatgaatgt acaattgaaa attcactgct gaagcaaaca 660
tggacagggc gctggacgat gaaagatggc cttcataaaa tgcaaagtga acacgtttca 720
ctctcatgtc aacctgtaaa tgattatttt tcaccaaacc aagacttcaa agttacttgg 780
tccagaatga aaagtgggac tttctctgtc ctggcttact atctgagctc ctcacaaaat 840
acaattatca atgaatcccg attctcatgg aacaaagagc tgataaacca gagtgacttc 900
tctatgaatt tgatggatct taatctttca gacagtgggg aatatttatg caatatttct 960
tcggatgaat atactttact taccatccac acagtgcatg tagaaccgag ccaagaaaca 1020
gcttcccata acaaaggctt atggattttg gtgccctctg cgattttggc agcttttctg 1080
ctgatttgga gcgtaaaatg ttgcagagcc cagctagaag ccaggaggag cagacaccct 1140
gctgatggag cccaacaaga aagatgttgt gtccctcctg gtgagcgctg tcccagtgca 1200
cccgataatg gcgaagaaaa tgtgcctctt tcaggaaaag ta 1242
<210> 192
<211> 1128
<212> DNA
<213> 单纯疱疹
<220>
<223> 单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)
<400> 192
atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatgtcg ggggggaggc tgggagttca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggtggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128
<210> 193
<211> 1173
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1
<400> 193
atgccgccct ccgggctgcg gctgctgccg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60
ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120
gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180
agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240
tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300
gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360
tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420
cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480
aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540
tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600
accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660
gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720
accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780
atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840
gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900
gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960
ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020
gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080
ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140
aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173
<210> 194
<211> 699
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF
<400> 194
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480
aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc 540
ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag 600
acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 660
aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtga 699
<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 1
<400> 195
gaaacccaca acgaaatct 19
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 2
<400> 196
gtacacacag catatatat 19
<210> 197
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 3
<400> 197
ctgctgaggc tcaagttaa 19
<210> 198
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 4
<400> 198
gtggagctgt accagaaat 19
<210> 199
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 5
<400> 199
gactcgccag agtggttat 19
<210> 200
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 6
<400> 200
gagccgtgga ggggaaatt 19
<210> 201
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 7
<400> 201
cctgtgacag cagggataa 19
<210> 202
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 8
<400> 202
gccctggaca ccaactatt 19
<210> 203
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人TGF-beta 同种型1 shRNA 靶 9
<400> 203
ccctgtacaa ccagcataa 19
<210> 204
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF shRNA 靶 1
<400> 204
gagatcgagt acatcttca 19
<210> 205
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF shRNA 靶 2
<400> 205
gcagattatg cggatcaaa 19
<210> 206
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF shRNA 靶 3
<400> 206
gatagagcaa gacaagaaa 19
<210> 207
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF shRNA 靶 4
<400> 207
ggagaaagca tttgtttgt 19
<210> 208
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF shRNA 靶 5
<400> 208
gatccgcaga cgtgtaaat 19
<210> 209
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人VEGF shRNA 靶 6
<400> 209
gcgaggcagc ttgagttaa 19
<210> 210
<211> 3888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARI-134
<400> 210
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720
tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780
gtatgagacc actccctagg ccacactgta tggactattc tagagatagt ccatacagtg 840
tggctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc ggccgcaggt aagccagccc 900
aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac 960
aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt cctcaggtct gcccgggtgg 1020
catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 1080
accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 1140
aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc ccaagttaac ttgtttattg 1200
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 1260
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 1320
tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1380
tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1440
caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1500
tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 1560
tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggcc gactacaagc gaattatcta gagtaattcg 1620
cttgtagtcg gcttttttcg agtagctaga gaattcatgg taatagcgat gactaatacg 1680
tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg 1740
ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt 1800
actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct 1860
attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc 1920
ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta 1980
tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag acccagcttt cttgtacaaa 2040
gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt 2100
caaaataaaa tcattatttg ccatccagct gatatcccct atagtgagtc gtattacatg 2160
gtcatagctg tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2220
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2280
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 2340
gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 2400
atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 2460
agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 2520
cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 2580
gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 2640
attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 2700
ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt 2760
ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 2820
aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 2880
tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 2940
gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 3000
tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 3060
aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg 3120
taacactggc agagcattac gctgacttga cgggacggcg caagctcatg accaaaatcc 3180
cttaacgtga gttacgcgtc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3240
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3300
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3360
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3420
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3480
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3540
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3600
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 3660
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3720
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3780
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3840
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgct 3888
<210> 211
<211> 3888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARI-135
<400> 211
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720
tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780
gtatgagacc actccctagg agctggctcc tggtgaattc tagagattca ccaggagcca 840
gctctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc ggccgcaggt aagccagccc 900
aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac 960
aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt cctcaggtct gcccgggtgg 1020
catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 1080
accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 1140
aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc ccaagttaac ttgtttattg 1200
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 1260
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 1320
tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1380
tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1440
caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1500
tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 1560
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<220>
<221> misc_feature
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tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540
tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600
aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660
ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720
ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780
cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840
cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900
tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960
tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt 1020
aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca 1080
gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat 1140
ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1200
acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga 1260
aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc 1320
atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat 1380
tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga 1440
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gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt 1560
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catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga 2160
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gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg 2640
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gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg 2880
gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga 2940
cgcgaaaaaa tgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc 3000
attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg 3060
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ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt 3180
tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca 3240
gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt 3300
gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg 3360
ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg 3420
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agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa 4080
ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa 4140
cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc 4200
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tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc 4380
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attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt 5040
tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc 5100
tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa 5160
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ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5340
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 5400
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5460
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5520
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tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5700
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gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6240
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6300
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctg 6329
<210> 219
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> asd-1 引物
<400> 219
ccttcctaac gcaaattccc tg 22
<210> 220
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> asd-2 引物
<400> 220
ccaatgctct gcttaactcc tg 22
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> asd-3 引物
<400> 221
gcctcgccat gtttcagtac g 21
<210> 222
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> asd-4 引物
<400> 222
ggtctggtgc attccgagta c 21
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv-3 引物
<400> 223
cataatctgg gtccttggtc tgc 23
<210> 224
<211> 5728
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pJW168 质粒
<400> 224
ttactaatcg ccatcttcca gcaggcgcac cattgcccct gtttcactat ccaggttacg 60
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gctaaccagc gttttcgttc tgccaatatg gattaacatt ctcccaccgt cagtacgtga 480
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ccccagaaat gccagattac gtatatcctg gcagcgatcg ctattttcca tgagtgaacg 600
aacctggtcg aaatcagtgc gttcgaacgc tagagcctgt tttgcacgtt caccggcatc 660
aacgttttct tttcggatcc gccgcataac cagtgaaaca gcattgctgt cacttggtcg 720
tggcagcccg gaccgacgat gaagcatgtt tagctggccc aaatgttgct ggatagtttt 780
tactgccaga ccgcgcgcct gaagatatag aagataatcg cgaacatctt caggttctgc 840
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caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac 1740
gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg 1800
gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt 1860
ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt 1920
gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca 1980
cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg 2040
gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg 2100
cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg 2160
gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat 2220
gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg 2280
cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac 2340
gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc 2400
ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag 2460
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cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aatcaatgtg agttagctca ctcattaggc 2640
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ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 2880
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gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 3360
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ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 3480
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 3540
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 3600
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 3660
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 3720
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 3780
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caggaactgc tgaacagcaa aaagtcagat agcaccacat agcagacccg ccataaaacg 4020
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taaaaggcgc ctgtagtgcc atttaccccc attcactgcc agagccgtga gcgcagcgaa 4140
ctgaatgtca cgaaaaagac agcgactcag gtgcctgatg gtcggagaca aaaggaatat 4200
tcagcgattt gcccgattgc ggccgcaacc gagcttgcga gggtgctact taagccttta 4260
gggttttaag gtctgttttg tagaggagca aacagcgttt gcgacatcct tttgtaatac 4320
tgcggaactg actaaagtag tgagttatac acagggctgg gatctattct ttttatcttt 4380
ttttattctt tctttattct ataaattata accacttgaa tataaacaaa aaaaacacac 4440
aaaggtctag cggaatttac agagggtcta gcagaattta caagttttcc agcaaaggtc 4500
tagcagaatt tacagatacc cacaactcaa aggaaaagga ctagtaatta tcattgacta 4560
gcccatctca attggtatag tgattaaaat cacctagacc aattgagatg tatgtctgaa 4620
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aaagaacgga cggtatcgtt cacttataac caatacgttc agatgatgaa catcagtagg 4800
gaaaatgctt atggtgtatt agctaaagca accagagagc tgatgacgag aactgtggaa 4860
atcaggaatc ctttggttaa aggctttgag attttccagt ggacaaacta tgccaagttc 4920
tcaagcgaaa aattagaatt agtttttagt gaagagatat tgccttatct tttccagtta 4980
aaaaaattca taaaatataa tctggaacat gttaagtctt ttgaaaacaa atactctatg 5040
aggatttatg agtggttatt aaaagaacta acacaaaaga aaactcacaa ggcaaatata 5100
gagattagcc ttgatgaatt taagttcatg ttaatgcttg aaaataacta ccatgagttt 5160
aaaaggctta accaatgggt tttgaaacca ataagtaaag atttaaacac ttacagcaat 5220
atgaaattgg tggttgataa gcgaggccgc ccgactgata cgttgatttt ccaagttgaa 5280
ctagatagac aaatggatct cgtaaccgaa cttgagaaca accagataaa aatgaatggt 5340
gacaaaatac caacaaccat tacatcagat tcctacctac ataacggact aagaaaaaca 5400
ctacacgatg ctttaactgc aaaaattcag ctcaccagtt ttgaggcaaa atttttgagt 5460
gacatgcaaa gtaagyatga tctcaatggt tcgttctcat ggctcacgca aaaacaacga 5520
accacactag agaacatact ggctaaatac ggaaggatct gaggttctta tggctcttgt 5580
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atcaaaggga aaactgtcca tacccatggg ctagctgatc agccagtgcc aagcttgctc 5700
aatcaatcac cggatccccc gggaattc 5728
<210> 225
<211> 3736
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pATIU6 质粒
<400> 225
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaatggatc caaggtcggg 120
caggaagagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 180
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tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 360
aaaggacgaa actagttttt tctcgagtag ctagagaatt cttaagccag ccccgacacc 420
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 480
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 540
gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 600
tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gaagcttcgc ggaaccccta 660
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 720
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 780
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ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1020
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aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taaaagcttc 1620
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 1680
aaaggatcta ggtgaagatc ctttatggtg aaggatgcgc cacaggatac tggcgcgcat 1740
acacagcaca tctctttgca ggaaaaaaac gctatgaaaa atgttggttt tatcggctgg 1800
cgcggaatgg tcggctctgt tctcatgcaa cgcatggtag aggagcgcga tttcgacgct 1860
attcgccctg ttttcttttc tacctcccag tttggacagg cggcgcccac cttcggcgac 1920
acctccaccg gcacgctaca ggacgctttt gatctggatg cgctaaaagc gctcgatatc 1980
atcgtgacct gccagggcgg cgattatacc aacgaaattt atccaaagct gcgcgaaagc 2040
ggatggcagg gttactggat tgatgcggct tctacgctgc gcatgaaaga tgatgccatt 2100
attattctcg acccggtcaa ccaggacgtg attaccgacg gcctgaacaa tggcgtgaag 2160
acctttgtgg gcggtaactg taccgttagc ctgatgttga tgtcgctggg cggtctcttt 2220
gcccataatc tcgttgactg ggtatccgtc gcgacctatc aggccgcctc cggcggcggc 2280
gcgcgccata tgcgcgagct gttaacccag atgggtcagt tgtatggcca tgtcgccgat 2340
gaactggcga cgccgtcttc cgcaattctt gatattgaac gcaaagttac ggcattgacc 2400
cgcagcggcg agctgccggt tgataacttt ggcgtaccgc tggcgggaag cctgatcccc 2460
tggatcgaca aacagctcga taacggccag agccgcgaag agtggaaagg ccaggcggaa 2520
accaacaaga ttctcaatac tgcctctgtg attccggttg atggtttgtg tgtgcgcgtc 2580
ggcgcgctgc gctgtcacag ccaggcgttc accatcaagc tgaaaaaaga ggtatccatt 2640
ccgacggtgg aagaactgct ggcggcacat aatccgtggg cgaaagtggt gccgaacgat 2700
cgtgatatca ctatgcgcga attaaccccg gcggcggtga ccggcacgtt gactacgccg 2760
gttggtcgtc tgcgtaagct gaacatgggg ccagagttct tgtcggcgtt taccgtaggc 2820
gaccagttgt tatggggcgc cgccgagccg ctgcgtcgaa tgctgcgcca gttggcgtag 2880
ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 2940
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 3000
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 3060
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 3120
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 3180
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 3240
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 3300
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 3360
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 3420
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 3480
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 3540
ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 3600
cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 3660
cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 3720
gcgaggaagc ggaaga 3736
<210> 226
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APR-001 Kan 引物F
<400> 226
aaaaaagctt gcagctctgg cccgtg 26
<210> 227
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APR-002 Kan 引物R
<400> 227
aaaaaagctt ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatga 38
<210> 228
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APR-003 pATI ori T148CF
<400> 228
acactagaag gacagtattt ggtatctg 28
<210> 229
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APR-004 pATI ori T148CR
<400> 229
agccgtagtt aggccacc 18
<210> 230
<211> 3203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSL0147 质粒
<400> 230
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa cgcgttatcg gcaatctgga 2280
ggcaaagttt aatgataatt ttgcaaaaat aatgcgcgga ataatgatgc ataaagcggc 2340
tatttcgccg cctaagaaaa agatcggggg aagtgaaaaa ttttctaaag ttcgaaattc 2400
aggtgccgat acaagggtta cggtgagaaa ccgtgggcaa cagcccaata acatcaagtt 2460
gtaattgata aggaaaagat catgggctag cctcaataag cttcttgcct ttctgcagac 2520
caaggaccca gattatgttg cagcaggccg gtacctccgt tctggcgcag gcgaaccagg 2580
ttccgcaaaa cgtcctctct ttactgcgtt aatccggcga ttgattcacc gacacgtggt 2640
acacaatcaa ggcagcgaaa gctgcctttt ttaattccgg agcctgtgta atgaaagaaa 2700
tcaccgtcac tgaacctgcc tttgtcaccc gcttttcctg ttctggctcg gcctgtcgcg 2760
accactgttg taagggctgg aaagttccat cccaatacgc gtcaattcac tggccgtcgt 2820
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 2880
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 2940
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 3000
cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 3060
aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 3120
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 3180
accgtcatca ccgaaacgcg cga 3203
<210> 231
<211> 3196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSL0148 质粒
<400> 231
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa cttccagacg acaagagtat 2280
cgcctttatt tacatacttt aacgctcgtt tcaggccggg gcggtttgca atcttgccac 2340
tgatacggtc ctcaaaaatg cggtcacaat ttgcactagt aagcgcatta cgctgtaaat 2400
cgatattttg gtcaattgtt gacacccgaa tatacccaat agtagccatg attttctcct 2460
ttacatcaga taaggaagaa ttttagtcgc ttttctcatg gaggattgct gctagcctca 2520
ataagcttct tgcctttctg cagaccaagg acccagatta tgtatggaat gtatggctgt 2580
aaatgatatt tcctacgggc gagaagctga aatatggccg cgggattatt ctatgcttgc 2640
tcgtcgagtt caatttctac gttttaatga tatccctgtt cgattggtga gtaataatgc 2700
ccggataatc acaggctaca ttgcgaagtt taatccgaag gaaaatttga ttctggcttc 2760
ggataaacct aaaggagttc catcccaata cgcgtcaatt cactggccgt cgttttacaa 2820
cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 2880
ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 2940
agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 3000
tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 3060
ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 3120
gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 3180
tcaccgaaac gcgcga 3196
<210> 232
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flic-1 引物
<400> 232
cgttatcggc aatctggagg c 21
<210> 233
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flic-2 引物
<400> 233
ccagccctta caacagtggt c 21
<210> 234
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flic-3 引物
<400> 234
gtctgtcaac aactggtcta acgg 24
<210> 235
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flic-4 引物
<400> 235
agacggtcct catccagata agg 23
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fljb-1 引物序列
<400> 236
ttccagacga caagagtatc gc 22
<210> 237
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fljb-2 引物
<400> 237
cctttaggtt tatccgaagc cagaatc 27
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fljb-3 引物
<400> 238
caccaggttt ttcacgctgc 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fljb-4 引物
<400> 239
acacgcattt acgcctgtcg 20
<210> 240
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cytoLLO ORF
<400> 240
atgaaagacg cctccgcgtt taacaaggag aactccatca gctccatggc cccgcccgct 60
tccccgccgg cgagccctaa aaccccgatc gagaaaaagc acgccgacga gattgacaaa 120
tatattcaag gtttagacta caataagaac aacgtgctgg tgtatcacgg cgatgcggtg 180
accaatgttc cgccgcgcaa gggctacaaa gatggtaacg aatatatcgt ggttgagaaa 240
aagaaaaaaa gcatcaacca gaacaacgcc gatatccaag ttgtgaacgc catcagctct 300
ttaacctatc cgggcgcgct ggtgaaagcc aacagcgaac tggtggaaaa ccagcccgat 360
gtgctgccgg tgaaacgcga ttctttaacg ctgagcattg atttaccggg catgacgaac 420
caagataaca aaatcgtggt gaagaacgcg accaagtcca acgtgaacaa cgcggtgaac 480
acgctggtgg aacgctggaa cgaaaaatac gcccaagctt acccgaacgt gagcgcgaag 540
attgactacg acgacgaaat ggcctacagc gagagccagc tgatcgcgaa attcggcacc 600
gcgttcaaag cggtgaacaa ctctttaaac gtgaactttg gcgcgatcag cgaaggcaaa 660
atgcaagaag aggtgatcag ctttaaacaa atctattata acgtgaatgt taacgagccg 720
acgcgtccga gccgcttttt cggcaaagcg gtgacgaagg aacagctgca agcgcttggc 780
gtgaacgcgg aaaaccctcc ggcctatatt tccagcgtgg cgtatggccg ccaagtttat 840
ctgaagctga gcacgaacag ccacagcacc aaagttaagg cggcctttga tgcggcggtg 900
agcggcaaaa gcgttagcgg cgacgttgag ctgacgaaca tcatcaagaa cagctccttt 960
aaagcggtga tctatggcgg tagcgcgaaa gacgaagtgc agatcatcga cggcaattta 1020
ggtgatctgc gcgatatttt aaaaaagggc gccaccttca accgtgagac gcccggtgtg 1080
ccgatcgcct acaccaccaa ctttttaaag gataacgagc tggccgtgat caaaaacaat 1140
tccgaatata tcgaaaccac gagcaaggcg tataccgatg gcaagatcaa cattgaccac 1200
agcggtggct atgtggcgca gttcaacatc agctgggatg aagtgaacta tgatccggag 1260
ggcaacgaga tcgtgcagca caagaactgg tccgagaaca acaaatccaa gctggcgcat 1320
ttcaccagca gcatctatct gccgggcaac gcgcgcaaca ttaatgtgta cgcgaaagag 1380
tgcacgggtc ttgcgtggga atggtggcgc accgtgatcg atgatcgcaa tttaccgctg 1440
gtgaaaaacc gcaacatctc catctggggc accactttat acccgaaata ttccaacaaa 1500
gttgataacc ctattgag 1518
<210> 241
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO 启动子
<400> 241
attatgtctt gacatgtagt gagtgggctg gtataatgca gcaag 45
<210> 242
<211> 1176
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asd基因ORF
<400> 242
ctacgccaac tggcgcagca ttcgacgcag cggctcggcg gcgccccata acaactggtc 60
gcctacggta aacgccgaca agaactctgg ccccatgttc agcttacgca gacgaccaac 120
cggcgtagtc aacgtgccgg tcaccgccgc cggggttaat tcgcgcatag tgatatcacg 180
atcgttcggc accactttcg cccacggatt atgtgccgcc agcagttctt ccaccgtcgg 240
aatggatacc tcttttttca gcttgatggt gaacgcctgg ctgtgacagc gcagcgcgcc 300
gacgcgcaca cacaaaccat caaccggaat cacagaggca gtattgagaa tcttgttggt 360
ttccgcctgg cctttccact cttcgcggct ctggccgtta tcgagctgtt tgtcgatcca 420
ggggatcagg cttcccgcca gcggtacgcc aaagttatca accggcagct cgccgctgcg 480
ggtcaatgcc gtaactttgc gttcaatatc aagaattgcg gaagacggcg tcgccagttc 540
atcggcgaca tggccataca actgacccat ctgggttaac agctcgcgca tatggcgcgc 600
gccgccgccg gaggcggcct gataggtcgc gacggatacc cagtcaacga gattatgggc 660
aaagagaccg cccagcgaca tcaacatcag gctaacggta cagttaccgc ccacaaaggt 720
cttcacgcca ttgttcaggc cgtcggtaat cacgtcctgg ttgaccgggt cgagaataat 780
aatggcatca tctttcatgc gcagcgtaga agccgcatca atccagtaac cctgccatcc 840
gctttcgcgc agctttggat aaatttcgtt ggtataatcg ccgccctggc aggtcacgat 900
gatatcgagc gcttttagcg catccagatc aaaagcgtcc tgtagcgtgc cggtggaggt 960
gtcgccgaag gtgggcgccg cctgtccaaa ctgggaggta gaaaagaaaa cagggcgaat 1020
agcgtcgaaa tcgcgctcct ctaccatgcg ttgcatgaga acagagccga ccattccgcg 1080
ccagccgata aaaccaacat ttttcatagc gtttttttcc tgcaaagaga tgtgctgtgt 1140
atgcgcgcca gtatcctgtg gcgcatcctt caccat 1176
<210> 243
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBR322 Origin
<400> 243
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589
<210> 244
<211> 3269
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEQU6 shSCR
<400> 244
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taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120
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cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660
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gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 840
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ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga 1800
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attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag 1980
cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 2040
tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 2100
tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 2160
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accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 2400
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cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 2640
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tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 3240
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgct 3269
<210> 245
<211> 4642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pATI2.0 U6-H1 质粒
<400> 245
accggtctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 60
agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca accggtcttg cacctcagca 120
aaaggccatc cgtcaggatg gccttctgct tagtttgatg cctggcagtt tatggcgggc 180
gtcctgcccg ccaccctccg ggccgttgct tcacaacgtt caaatccgct cccggcggat 240
ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt 300
ccgactgagc ctttcgtttt atttgggccg gccatgcctg gcagttccct actctcgcgt 360
taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttctta agctcgggcc cttaaaggaa 420
ccaattcagt cgagaattac tagtggtacc atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa 480
atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt tgggaatctt ataagttctg tatgagacca 540
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ttcatctaga caggaagagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata 1080
caaggctgtt agagagataa ttagaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca 1140
aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt 1200
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tatcttgtgg aaaggacgaa acttgttttt tctcgagtag ctagagaatt cgtcgacgga 1320
actccatata tgggctatga actaatgacc ccgtaattga ttactattaa taactagcca 1380
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cgcatcaatc cagtaaccct gccatccgct ttcgcgcagc tttggataaa tttcgttggt 2280
ataatcgccg ccctggcagg tcacgatgat atcgagcgct tttagcgcat ccagatcaaa 2340
agcgtcctgt agcgtgccgg tggaggtgtc gccgaaggtg ggcgccgcct gtccaaactg 2400
ggaggtagaa aagaaaacag ggcgaatagc gtcgaaatcg cgctcctcta ccatgcgttg 2460
catgagaaca gagccgacca ttccgcgcca gccgataaaa ccaacatttt tcatagcgtt 2520
tttttcctgc aaagagatgt gctgtgtatg cgcgccagta tcctgtggcg catccttcac 2580
cataaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 2640
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtc tgcaggatat cccatgggca ttggcgcaga 2700
aaaaaatgcc tgatgcgacg ctgcgcgtct tatactccca catatgccag attcagcaac 2760
ggatacggct tccccaactt gcccacttcc atacgtgtcc tccttaccag aaatttatcc 2820
ttaaccatgg aagctttgca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2880
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2940
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 3000
gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 3060
atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 3120
agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 3180
cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 3240
gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 3300
attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 3360
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cccttaacgt gagttacgcg tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 3960
gatcttcatc gatttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 4020
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aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 4140
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taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 4260
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gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 4560
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ggccttttgc tggccttttg ct 4642
<210> 246
<211> 1261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASD基因orf + 85 bp 上游
<400> 246
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60
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g 1261
<210> 247
<211> 4112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pATI2.0 合成的 v26 scramble pBR322ori.dna
<400> 247
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ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa actagcaaca agatgaagag 720
caccaattct agagattggt gctcttcatc ttgttgtttt tctcgagtag ctagagaatt 780
cgtcgacgga actccatata tgggctatga actaatgacc ccgtaattga ttactattaa 840
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gcgtagaagc cgcatcaatc cagtaaccct gccatccgct ttcgcgcagc tttggataaa 1740
tttcgttggt ataatcgccg ccctggcagg tcacgatgat atcgagcgct tttagcgcat 1800
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ttggcgcaga aaaaaatgcc tgatgcgacg ctgcgcgtct tatactccca catatgccag 2220
attcagcaac ggatacggct tccccaactt gcccacttcc atacgtgtcc tccttaccag 2280
aaatttatcc ttaaccatgg aagctttgca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg 2340
ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa 2400
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ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc 2520
aggtgcgaca atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca 2580
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ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt 2700
actcaccact gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc 2760
aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt 2820
ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat 2880
gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga 2940
acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca 3000
tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga 3060
tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct 3120
cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc 3180
tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaaa gctttcagaa 3240
ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcgcaagc 3300
tcatggatcc caattggcgg ccgcttaatt aaacatgtga gctcgatgta cattcgaagg 3360
accccaaaat cccttaacgt gagttacgcg tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 3420
aagatcaaag gatcttcatc gatttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3480
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3540
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3600
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3660
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3720
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3780
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3840
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3900
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3960
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 4020
agcctatgga aaatcgattc cggaaacgcc aggctcttcc aacgcggcct ttttacggtt 4080
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<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-16-2
<400> 248
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacttgttcc actctagcag 60
cacgtaaata ttggcgtagt gaaatatata ttaaacacca atattactgt gctgctttag 120
tgtgacaggg atacagcaac tattttatca attgtttgcg tcgac 165
<210> 249
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)...(75)
<223> n可以是任何核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)...(117)
<223> n可以是任何核苷酸
<220>
<221> source
<222> (1)...(165)
<223> microRNA骨架，其中N表示插入的反义和有义microRNA
<400> 249
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnngtagt gaaatatata ttaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnntac 120
ggtaacgcgg aattcgcaac tattttatca attttttgcg tcgac 165
<210> 250
<211> 708
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> endA
<400> 250
atgtaccgta atttctcttt tgccgctgtg ttgctggccg cagcgttttc aggccaggcc 60
ctggccgatg gcattaacaa tttttctcag gccaaagcgg cgagcgtcaa agtcaatgct 120
gacgcgcccg gcagctttta ctgcgggtgc caaatccgct ggcagggtaa aaaaggcgtc 180
gtagacctgg agtcctgcgg ctataaggtg cgtaaaaacg agaatcgcgc cagacgcatt 240
gagtgggagc acgttgtccc cgcctggcaa ttcggtcatc agcgccagtg ctggcaggac 300
ggcgggcgaa aaaactgcgc taaagacccg gtctaccgca aaatggaaag cgatatgcat 360
aacctgcaac ccgcgattgg cgaagtgaat ggcgatcgcg gcaactttat gtatagccag 420
tggaacggcg gcgaaggtca gtacgggcag tgcgccatga aagtagattt caaagcgaag 480
ctcgccgagc cgcccgcccg cgcccgtggc gcaatcgccc gcacttattt ttatatgcgc 540
gaccaatacc aactgaaact ttcccgccaa caaacgcagc tttttaacgt ctgggataag 600
cagtaccccg ttaccgcctg ggagtgcgag cgcgatgcgc gtatcgcgaa ggtccagggt 660
aatcataatc cctatgtgca acgcgcttgc caggcgcgaa agagctaa 708
<210> 251
<211> 235
<212> PRT
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> 内切核酸酶I (endA编码)
<400> 251
Met Tyr Arg Asn Phe Ser Phe Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gly Gln Ala Leu Ala Asp Gly Ile Asn Asn Phe Ser Gln Ala Lys
20 25 30
Ala Ala Ser Val Lys Val Asn Ala Asp Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Cys
35 40 45
Gly Cys Gln Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Val Val Asp Leu Glu
50 55 60
Ser Cys Gly Tyr Lys Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Arg Arg Ile
65 70 75 80
Glu Trp Glu His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Arg Gln
85 90 95
Cys Trp Gln Asp Gly Gly Arg Lys Asn Cys Ala Lys Asp Pro Val Tyr
100 105 110
Arg Lys Met Glu Ser Asp Met His Asn Leu Gln Pro Ala Ile Gly Glu
115 120 125
Val Asn Gly Asp Arg Gly Asn Phe Met Tyr Ser Gln Trp Asn Gly Gly
130 135 140
Glu Gly Gln Tyr Gly Gln Cys Ala Met Lys Val Asp Phe Lys Ala Lys
145 150 155 160
Ile Ala Glu Pro Pro Ala Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Ile Tyr
165 170 175
Phe Tyr Met Arg Asp Gln Tyr Gln Leu Lys Leu Ser Arg Gln Gln Thr
180 185 190
Gln Leu Phe Asn Val Trp Asp Lys Gln Tyr Pro Val Thr Ala Trp Glu
195 200 205
Cys Glu Arg Asp Ala Arg Ile Ala Lys Val Gln Gly Asn His Asn Pro
210 215 220
Tyr Val Gln Arg Ala Cys Gln Ala Arg Lys Ser
225 230 235
<210> 252
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> microRNA-103a1 (miR-103a1)
<400> 252
tactgccctc ggcttcttta cagtgctgcc ttgttgcata tggatcaagc agcattgtac 60
agggctatga aggcattg 78
<210> 253
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> microRNA-30a (miR-30a)
<400> 253
gcgactgtaa acatcctcga ctggaagctg tgaagccaca gatgggcttt cagtcggatg 60
tttgcagctg c 71
<210> 254
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pMB1复制起点
<400> 254
aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 60
ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 120
gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta 180
ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 240
ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 300
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 360
gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 420
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 480
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 540
cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 600
aacgccagca acgcg 615
<210> 255
<211> 913
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> p15A 复制起点
<400> 255
gcgctagcgg agtgtatact ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg 60
cttcatgtgg caggagaaaa aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga 120
tatattccgc ttcctcgctc actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg 180
aaatggctta cgaacggggc ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg 240
aagtgagagg gccgcggcaa agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca 300
cgaaatctga cgctcaaatc agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 360
gtttccccct ggcggctccc tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt 420
cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg 480
cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct 540
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag 600
cagccactgg taattgattt agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa 660
actgaaagga caagttttgg tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag 720
ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag 780
caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa 840
tatttctaga tttcagtgca atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata 900
cgatataagt tgt 913
<210> 256
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSC101复制起点
<400> 256
gagttataca cagggctggg atctattctt tttatctttt tttattcttt ctttattcta 60
taaattataa ccacttgaat ataaacaaaa aaaacacaca aaggtctagc ggaatttaca 120
gagggtctag cagaatttac aagttttcca gcaaaggtct agcagaattt acagataccc 180
acaactcaaa ggaaaaggac tagtaattat cattgactag ccc 223
<210> 257
<211> 602
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ColE1复制起点
<400> 257
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 60
accgctacca acggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 120
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagtcggg 180
ccactacttc aagaactctg tagcaccgtt tgtgccatca tcgctctgct aatccggtta 240
ccagtggctg ctgccagtgg cgttaaggcg tgccttaccg ggttggactc aagacgatag 300
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 360
gagcgaacga cctacaccga actgagatac caacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 420
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 480
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 540
cacctctgac ttgagcgtct atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 600
aa 602
<210> 258
<211> 201
<212> DNA
<213> 丁香假单胞菌
<220>
<223> pPS10 复制起点
<400> 258
acctgaccgg cgcggaagcg ctcttgatct ttttttcttg tttttacttg ttgttccttg 60
ttttcgtaat tttaactata tgatttataa gaaaaaaaag ggtttaaagg ggacagattc 120
agggtttaaa ggggacagat tcagggttta aaggggacag attcagggtt taaaggggac 180
agattcaggc tgatatccac a 201
<210> 259
<211> 617
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> RK2 复制起点
<400> 259
ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60
aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga taccacgcgg 120
aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180
ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240
cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300
caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360
gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgatga cagatgaggg gcgcacctat 420
tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480
ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540
tttttaacca gggctgcgcc ctggcgcgtg accgcgcacg ccgaaggggg gtgccccccc 600
ttctcgaacc ctcccgg 617
<210> 260
<211> 639
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> R6K alpha 复制起点
<400> 260
tcttacttct ttgcgtagct gttaaataca gcgttgtttt gataaaatca tcattatcat 60
cgataatgct ttcttcaatt tttttatcct tactctttaa taaagcactt gctaataact 120
tcataccttt tgcaactgtc aaatttggtt catcagggta aatgctttta aggcatacta 180
acaaataatc atggtcttca tcttcaactc taaactgaat ttttttcatc ataactccca 240
acaagaaccg actgtaggtc accgggcaaa cgctgaaaaa taacgtcgaa tgacgtcatt 300
ttgcggcgtt tgccctatcc tgcatcgcag tagaaaatgc cacaactgaa attgtgcttc 360
agtatgtaca gaaatgcaaa atctgaggga tttcgtagct gaaagatcgc cagtcttcga 420
ccgtaaggat aggagttgct gtaagacctg tgcggggcgt tcgcttcgcg aacgggtctg 480
gcagggggca caagcgctgt gctgtgatat atgcaaaaga agccacccac gaacgggagg 540
gcttcggcga atcgactata gtgatctatt tacccggctg attgtcgcct tctagccctc 600
gcgggcatca tgcaaccagt gcctgaattt agttatatg 639
<210> 261
<211> 1027
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> R6K beta 复制起点
<400> 261
tgaagctttt tttatgaatt tatctgaagc tgatgcagct tttctcaagg tatttgatga 60
aaccgtacct cccaaaaaag ctaaggggtg atatatggct aaaatttacg atttccctca 120
aggagccgaa cgccgcagga tgcaccgcaa aatccagtgg aacaacgctg taaaattatc 180
taaaaatggc tggagtaagc cagaggttaa acgctggtct tttttagcat tcatctcaac 240
tggctggtat tactttcgcc tttcggtagc agtcattttc catatcatta ctatttgtgg 300
tttagctgtg ctcgcggcgt taagcaatac gatattctgg attggtggcg cgatatgtct 360
tgtaacctgg tatacaaatg accatcaaat ttggagtact aacaatctta ctatccctat 420
tgttttcgga ctttgggtgt taagtttagt agctgcacca ctcatagatt ttttcagtca 480
aaaattgccc ttttatcgtc ttcttgtgcc tgatgcgaag cgtgaggaag tgggcgaaga 540
tgattcttaa agccctgccc tgtacggctt taacgccttc tcgcggtaga tctatggatg 600
ttgagaatgt agtatggtta tactgcgatg caggataggg caaacgccgt aaaatgacgt 660
ctttgacgtt atttttcagc gcttgcccgg tgacctacag tcggtgcttg ttgggagatt 720
ttatgaagtt tactagtaaa ggattttatc agtgataaat atgcaaaggc tattaacatt 780
ttaaatgata accttaaaga aaactactat gttttttatg gtgtaaggtt aagtgaaatt 840
ctttttcctg caagtgatta tggtacagat gattttttta aggagtttga ggaaataaac 900
aacgttacct tgcctttagt tgtttttgaa ataaatgaac gtgaacctgt gattgtaatt 960
ggttttgatg aaataaatcc tgcgattctt atagagaaat ccggtataaa ggttttagta 1020
atcggac 1027
<210> 262
<211> 442
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> R6K gamma 复制起点
<400> 262
gatcgctagt ttgttttgac tccatccatt agggcttcta aaacgccttc taaggccatg 60
tcagccgtta agtgttcctg tgtcactgaa aattgctttg agaggctcta agggcttctc 120
agtgcgttac atccctggct tgttgtccac aaccgttaaa ccttaaaagc tttaaaagcc 180
ttatatattc ttttttttct tataaaactt aaaaccttag aggctattta agttgctgat 240
ttatattaat tttattgttc aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta 300
cgttagccat gagagcttag tacgttagcc atgagggttt agttcgttaa acatgagagc 360
ttagtacgtt aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta cgtactatca 420
acaggttgaa ctgctgatct tc 442
<210> 263
<211> 242
<212> DNA
<213> 肠杆菌噬菌体 P1
<220>
<223> P1 质粒复制起点 oriR
<400> 263
tttcccgtca acacacatcc tatatcccgc cagcacacat tagcaacccg tcagcacaca 60
tttttatccc tccagcacac atcgttttcc ctccagcaca catcgcgata cacttctaag 120
ccagacgtgg cgcggcctgc aacgatcagg gatctatatg gatctaattg ggatctgtat 180
ggacctgatt attggatcta tccagtggat aatgtggata agtgaaaaac cggccaacgt 240
ag 242
<210> 264
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R1 复制起点
<400> 264
ttatccacat ttaactgcaa gggacttccc cataaggtta caaccgttca tgtcataaag 60
cgccagccgc cagtcttaca gggtgcaatg tatcttttaa acacctgttt atatctcctt 120
taaactactt aattacattc atttaaaaag aaaacctatt cactgcctgt cctgtggaca 180
gacagatatg cacctcccac cgcaagcggc gggccccgac cggagccact ttagttacaa 240
cacacaaaaa caacctccag aaaaaccccg gtccagcgca gaaccgaaac cacaaagccc 300
ctccctcata actgaaaagc ggccccgccc cggcccaaag ggccggaaca gagtcgcttt 360
taattatgaa tgttgtaact acatcttcat cgctgtcagt cttctcgctg gaagttctca 420
gtacacgctc gtaagcggcc ctcacggccc gctaacgcgg agatacgccc cgacttcggg 480
taaaccctcg tcgggaccac tccgaccgcg cacagaagct ctctcatggc tgaaagcggg 540
tatggtctgg cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 600
ccgggcttcg gcggttttac tcctgtatca tatgaaacaa cagagtgccg ccttccatgc 660
cgctgatgcg gcatatcctg gtaacgatat ctgaattgtt atacatgtgt atatacgtgg 720
taatgacaaa aataggacaa gttaaaaatt tacaggcgat gcaatgattc aaacacgtaa 780
tcaatatctg ca 792
<210> 265
<211> 2920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pWSK 复制起点
<400> 265
ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 60
atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca gggtgccggc 120
agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct 180
gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc 240
caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccg acgcgctggg 300
ctacgtcttg ctggcgttcg cgacgcgagg ctggatggcc ttccccatta tgattcttct 360
cgcttccggc ggcatcggga tgcccgcgtt gcaggccatg ctgtccaggc aggtagatga 420
cgaccatcag ggacagcttc aaggatcgct cgcggctctt accagcctaa cttcgatcat 480
tggaccgctg atcgtcacgg cgatttatgc cgcctcggcg agcacatgga acgggttggc 540
atggattgta ggcgccgccc tataccttgt ctgcctcccc gcgttgcgtc gcggtgcatg 600
gagccgggcc acctcgacct gaatggaagc cggcggcacc tcgctaacgg attcaccact 660
ccgcagaccc gccataaaac gccctgagaa gcccgtgacg ggcttttctt gtattatggg 720
tagtttcctt gcatgaatcc ataaaaggcg cctgtagtgc catttacccc cattcactgc 780
cagagccgtg agcgcagcga actgaatgtc acgaaaaaga cagcgactca ggtgcctgat 840
ggtcggagac aaaaggaata ttcagcgatt tgcccgagct tgcgagggtg ctacttaagc 900
ctttagggtt ttaaggtctg ttttgtagag gagcaaacag cgtttgcgac atccttttgt 960
aatactgcgg aactgactaa agtagtgagt tatacacagg gctgggatct attcttttta 1020
tcttttttta ttctttcttt attctataaa ttataaccac ttgaatataa acaaaaaaaa 1080
cacacaaagg tctagcggaa tttacagagg gtctagcaga atttacaagt tttccagcaa 1140
aggtctagca gaatttacag atacccacaa ctcaaaggaa aaggactagt aattatcatt 1200
gactagccca tctcaattgg tatagtgatt aaaatcacct agaccaattg agatgtatgt 1260
ctgaattagt tgttttcaaa gcaaatgaac tagcgattag tcgctatgac ttaacggagc 1320
atgaaaccaa gctaatttta tgctgtgtgg cactactcaa ccccacgatt gaaaacccta 1380
caaggaaaga acggacggta tcgttcactt ataaccaata cgctcagatg atgaacatca 1440
gtagggaaaa tgcttatggt gtattagcta aagcaaccag agagctgatg acgagaactg 1500
tggaaatcag gaatcctttg gttaaaggct ttgagatttt ccagtggaca aactatgcca 1560
agttctcaag cgaaaaatta gaattagttt ttagtgaaga gatattgcct tatcttttcc 1620
agttaaaaaa attcataaaa tataatctgg aacatgttaa gtcttttgaa aacaaatact 1680
ctatgaggat ttatgagtgg ttattaaaag aactaacaca aaagaaaact cacaaggcaa 1740
atatagagat tagccttgat gaatttaagt tcatgttaat gcttgaaaat aactaccatg 1800
agtttaaaag gcttaaccaa tgggttttga aaccaataag taaagattta aacacttaca 1860
gcaatatgaa attggtggtt gataagcgag gccgcccgac tgatacgttg attttccaag 1920
ttgaactaga tagacaaatg gatctcgtaa ccgaacttga gaacaaccag ataaaaatga 1980
atggtgacaa aataccaaca accattacat cagattccta cctacataac ggactaagaa 2040
aaacactaca cgatgcttta actgcaaaaa ttcagctcac cagttttgag gcaaaatttt 2100
tgagtgacat gcaaagtaag tatgatctca atggttcgtt ctcatggctc acgcaaaaac 2160
aacgaaccac actagagaac atactggcta aatacggaag gatctgaggt tcttatggct 2220
cttgtatcta tcagtgaagc atcaagacta acaaacaaaa gtagaacaac tgttcaccgt 2280
tacatatcaa agggaaaact gtccatatgc acagatgaaa acggtgtaaa aaagatagat 2340
acatcagagc ttttacgagt ttttggtgca ttcaaagctg ttcaccatga acagatcgac 2400
aatgtaacag atgaacagca tgtaacacct aatagaacag gtgaaaccag taaaacaaag 2460
caactagaac atgaaattga acacctgaga caacttgtta cagctcaaca gtcacacata 2520
gacagcctga aacaggcgat gctgcttatc gaatcaaagc tgccgacaac acgggagcca 2580
gtgacgcctc ccgtggggaa aaaatcatgg caattctgga agaaatagcg ctttcagccg 2640
gcaaaccggc tgaagccgga tctgcgattc tgataacaaa ctagcaacac cagaacagcc 2700
cgtttgcggg cagcaaaacc cgtacttttg gacgttccgg cggttttttg tggcgagtgg 2760
tgttcgggcg gtgcgcgcaa gatccattat gttaaacggg cgagtttaca tctcaaaacc 2820
gcccgcttaa caccatcaga aatcctcagc gcgattttaa gcaccaaccc ccccccgtaa 2880
cacccaaatc catactgaaa gtggctttgt tgaataaatc 2920
<210> 266
<211> 37
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ColE2 复制起点
<400> 266
aaaatgagac cagataagcc ttatcagata acagcgc 37
<210> 267
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pUC 复制起点
<400> 267
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 60
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 120
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 180
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 240
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 300
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 360
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 420
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 480
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 540
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 600
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 660
ttttctac 668
<210> 268
<211> 457
<212> DNA
<213> 噬菌体 F1
<220>
<223> F1 复制起点
<400> 268
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaattt 457
<210> 269
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-7
<400> 269
atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60
ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120
ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180
aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240
ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300
gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360
gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420
aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480
caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca ctga 534
<210> 270
<211> 987
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL12B
<400> 270
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987
<210> 271
<211> 762
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL12A
<400> 271
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762
<210> 272
<211> 489
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL-15
<400> 272
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60
ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120
gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180
gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240
cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300
gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360
agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420
gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480
acttcttga 489
<210> 273
<211> 804
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> IL15RA
<400> 273
atggccccgc ggcgggcgcg cggctgccgg accctcggtc tcccggcgct gctactgctg 60
ctgctgctcc ggccgccggc gacgcggggc atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa 120
cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc ttgtactcca gggagcggta catttgtaac 180
tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240
acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt 300
caccaaaggc cagcgccacc ctccacagta acgacggcag gggtgacccc acagccagag 360
agcctctccc cttctggaaa agagcccgca gcttcatctc ccagctcaaa caacacagcg 420
gccacaacag cagctattgt cccgggctcc cagctgatgc cttcaaaatc accttccaca 480
ggaaccacag agataagcag tcatgagtcc tcccacggca ccccctctca gacaacagcc 540
aagaactggg aactcacagc atccgcctcc caccagccgc caggtgtgta tccacagggc 600
cacagcgaca ccactgtggc tatctccacg tccactgtcc tgctgtgtgg gctgagcgct 660
gtgtctctcc tggcatgcta cctcaagtca aggcaaactc ccccgctggc cagcgttgaa 720
atggaagcca tggaggctct gccggtgact tgggggacca gcagcagaga tgaagacttg 780
gaaaactgct ctcaccacct atga 804
<210> 274
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CXCL9
<400> 274
atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60
caaggaaccc cagtagtgag aaagggtcgc tgttcctgca tcagcaccaa ccaagggact 120
atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc ctgcgagaaa 180
attgaaatca ttgctacact gaagaatgga gttcaaacat gtctaaaccc agattcagca 240
gatgtgaagg aactgattaa aaagtgggag aaacaggtca gccaaaagaa aaagcaaaag 300
aatgggaaaa aacatcaaaa aaagaaagtt ctgaaagttc gaaaatctca acgttctcgt 360
caaaagaaga ctacataa 378
<210> 275
<211> 297
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CXCL10
<400> 275
atgaatcaaa ctgccattct gatttgctgc cttatctttc tgactctaag tggcattcaa 60
ggagtacctc tctctagaac tgtacgctgt acctgcatca gcattagtaa tcaacctgtt 120
aatccaaggt ctttagaaaa acttgaaatt attcctgcaa gccaattttg tccacgtgtt 180
gagatcattg ctacaatgaa aaagaagggt gagaagagat gtctgaatcc agaatcgaag 240
gccatcaaga atttactgaa agcagttagc aaggaaaggt ctaaaagatc tccttaa 297
<210> 276
<211> 285
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CXCL11
<400> 276
atgagtgtga agggcatggc tatagccttg gctgtgatat tgtgtgctac agttgttcaa 60
ggcttcccca tgttcaaaag aggacgctgt ctttgcatag gccctggggt aaaagcagtg 120
aaagtggcag atattgagaa agcctccata atgtacccaa gtaacaactg tgacaaaata 180
gaagtgatta ttaccctgaa agaaaataaa ggacaacgat gcctaaatcc caaatcgaag 240
caagcaaggc ttataatcaa aaaagttgaa agaaagaatt tttaa 285
<210> 277
<211> 465
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CCL5
<400> 277
atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctactgccct ctgcgctcct 60
gcatctgcct ccccatattc ctcggacacc acaccctgct gctttgccta cattgcccgc 120
ccactgcccc gtgcccacat caaggagtat ttctacacca gtggcaagtg ctccaaccca 180
gcagtcgtcc acaggtcaag gatgccaaag agagagggac agcaagtctg gcaggatttc 240
ctgtatgact cccggctgaa caagggcaag ctttgtcacc cgaaagaacc gccaagtgtg 300
tgccaaccca gagaagaaat gggttcggga gtacatcaac tctttggaga tgagctagga 360
tggagagtcc ttgaacctga acttacacaa atttgcctgt ttctgcttgc tcttgtccta 420
gcttgggagg cttcccctca ctatcctacc ccacccgctc cttga 465
<210> 278
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BB 配体
<400> 278
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765
<210> 279
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF1A
<400> 279
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccactgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga 120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac 360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag 600
aatgttaagg gcactgagga ctcaggcacc acagtgctgt tgcccctggt cattttcttt 660
ggtctttgcc ttttatccct cctcttcatt ggtttaatgt atcgctacca acggtggaag 720
tccaagctct actccattgt ttgtgggaaa tcgacacctg aaaaagaggg ggagcttgaa 780
ggaactacta ctaagcccct ggccccaaac ccaagcttca gtcccactcc aggcttcacc 840
cccaccctgg gcttcagtcc cgtgcccagt tccaccttca cctccagctc cacctatacc 900
cccggtgact gtcccaactt tgcggctccc cgcagagagg tggcaccacc ctatcagggg 960
gctgacccca tccttgcgac agccctcgcc tccgacccca tccccaaccc ccttcagaag 1020
tgggaggaca gcgcccacaa gccacagagc ctagacactg atgaccccgc gacgctgtac 1080
gccgtggtgg agaacgtgcc cccgttgcgc tggaaggaat tcgtgcggcg cctagggctg 1140
agcgaccacg agatcgatcg gctggagctg cagaacgggc gctgcctgcg cgaggcgcaa 1200
tacagcatgc tggcgacctg gaggcggcgc acgccgcggc gcgaggccac gctggagctg 1260
ctgggacgcg tgctccgcga catggacctg ctgggctgcc tggaggacat cgaggaggcg 1320
ctttgcggcc ccgccgccct cccgcccgcg cccagtcttc tcagatga 1368
<210> 280
<211> 1386
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF1B
<400> 280
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60
cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc 120
cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc 180
caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240
agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300
agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360
aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420
cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480
tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540
ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc 600
acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660
tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720
ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cttcgctctt 780
ccagttggac tgattgtggg tgtgacagcc ttgggtctac taataatagg agtggtgaac 840
tgtgtcatca tgacccaggt gaaaaagaag cccttgtgcc tgcagagaga agccaaggtg 900
cctcacttgc ctgccgataa ggcccggggt acacagggcc ccgagcagca gcacctgctg 960
atcacagcgc cgagctccag cagcagctcc ctggagagct cggccagtgc gttggacaga 1020
agggcgccca ctcggaacca gccacaggca ccaggcgtgg aggccagtgg ggccggggag 1080
gcccgggcca gcaccgggag ctcagattct tcccctggtg gccatgggac ccaggtcaat 1140
gtcacctgca tcgtgaacgt ctgtagcagc tctgaccaca gctcacagtg ctcctcccaa 1200
gccagctcca caatgggaga cacagattcc agcccctcgg agtccccgaa ggacgagcag 1260
gtccccttct ccaaggagga atgtgccttt cggtcacagc tggagacgcc agagaccctg 1320
ctggggagca ccgaagagaa gcccctgccc cttggagtgc ctgatgctgg gatgaagccc 1380
agttaa 1386
<210> 281
<211> 1308
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> LTBR
<400> 281
atgctcctgc cttgggccac ctctgccccc ggcctggcct gggggcctct ggtgctgggc 60
ctcttcgggc tcctggcagc atcgcagccc caggcggtgc ctccatatgc gtcggagaac 120
cagacctgca gggaccagga aaaggaatac tatgagcccc agcaccgcat ctgctgctcc 180
cgctgcccgc caggcaccta tgtctcagct aaatgtagcc gcatccggga cacagtttgt 240
gccacatgtg ccgagaattc ctacaacgag cactggaact acctgaccat ctgccagctg 300
tgccgcccct gtgacccagt gatgggcctc gaggagattg ccccctgcac aagcaaacgg 360
aagacccagt gccgctgcca gccgggaatg ttctgtgctg cctgggccct cgagtgtaca 420
cactgcgagc tactttctga ctgcccgcct ggcactgaag ccgagctcaa agatgaagtt 480
gggaagggta acaaccactg cgtcccctgc aaggccgggc acttccagaa tacctcctcc 540
cccagcgccc gctgccagcc ccacaccagg tgtgagaacc aaggtctggt ggaggcagct 600
ccaggcactg cccagtccga cacaacctgc aaaaatccat tagagccact gcccccagag 660
atgtcaggaa ccatgctgat gctggccgtt ctgctgccac tggccttctt tctgctcctt 720
gccaccgtct tctcctgcat ctggaagagc cacccttctc tctgcaggaa actgggatcg 780
ctgctcaaga ggcgtccgca gggagaggga cccaatcctg tagctggaag ctgggagcct 840
ccgaaggccc atccatactt ccctgacttg gtacagccac tgctacccat ttctggagat 900
gtttccccag tatccactgg gctccccgca gccccagttt tggaggcagg ggtgccgcaa 960
cagcagagtc ctctggacct gaccagggag ccgcagttgg aacccgggga gcagagccag 1020
gtggcccacg gtaccaatgg cattcatgtc accggcgggt ctatgactat cactggcaac 1080
atctacatct acaatggacc agtactgggg ggaccaccgg gtcctggaga cctcccagct 1140
acccccgaac ctccataccc cattcccgaa gagggggacc ctggccctcc cgggctctct 1200
acaccccacc aggaagatgg caaggcttgg cacctagcgg agacagagca ctgtggtgcc 1260
acaccctcta acaggggccc aaggaaccaa tttatcaccc atgactga 1308
<210> 282
<211> 1008
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> FAS
<400> 282
atgctgggca tctggaccct cctacctctg gttcttacgt ctgttgctag attatcgtcc 60
aaaagtgtta atgcccaagt gactgacatc aactccaagg gattggaatt gaggaagact 120
gttactacag ttgagactca gaacttggaa ggcctgcatc atgatggcca attctgccat 180
aagccctgtc ctccaggtga aaggaaagct agggactgca cagtcaatgg ggatgaacca 240
gactgcgtgc cctgccaaga agggaaggag tacacagaca aagcccattt ttcttccaaa 300
tgcagaagat gtagattgtg tgatgaagga catggcttag aagtggaaat aaactgcacc 360
cggacccaga ataccaagtg cagatgtaaa ccaaactttt tttgtaactc tactgtatgt 420
gaacactgtg acccttgcac caaatgtgaa catggaatca tcaaggaatg cacactcacc 480
agcaacacca agtgcaaaga ggaaggatcc agatctaact tggggtggct ttgtcttctt 540
cttttgccaa ttccactaat tgtttgggtg aagagaaagg aagtacagaa aacatgcaga 600
aagcacagaa aggaaaacca aggttctcat gaatctccaa ctttaaatcc tgaaacagtg 660
gcaataaatt tatctgatgt tgacttgagt aaatatatca ccactattgc tggagtcatg 720
acactaagtc aagttaaagg ctttgttcga aagaatggtg tcaatgaagc caaaatagat 780
gagatcaaga atgacaatgt ccaagacaca gcagaacaga aagttcaact gcttcgtaat 840
tggcatcaac ttcatggaaa gaaagaagcg tatgacacat tgattaaaga tctcaaaaaa 900
gccaatcttt gtactcttgc agagaaaatt cagactatca tcctcaagga cattactagt 960
gactcagaaa attcaaactt cagaaatgaa atccaaagct tggtctag 1008
<210> 283
<211> 903
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF6B
<400> 283
atgagggcgc tggaggggcc aggcctgtcg ctgctgtgcc tggtgttggc gctgcctgcc 60
ctgctgccgg tgccggctgt acgcggagtg gcagaaacac ccacctaccc ctggcgggac 120
gcagagacag gggagcggct ggtgtgcgcc cagtgccccc caggcacctt tgtgcagcgg 180
ccgtgccgcc gagacagccc cacgacgtgt ggcccgtgtc caccgcgcca ctacacgcag 240
ttctggaact acctagagcg ctgccgctac tgcaacgtcc tctgcgggga gcgtgaggag 300
gaggcacggg cttgccacgc cacccacaac cgtgcctgcc gctgccgcac cggcttcttc 360
gcgcacgctg gtttctgctt ggagcacgca tcgtgtccac ctggtgccgg cgtgattgcc 420
ccgggcaccc ccagccagaa cacgcagtgc cagccgtgcc ccccaggcac cttctcagcc 480
agcagctcca gctcagagca gtgccagccc caccgcaact gcacggccct gggcctggcc 540
ctcaatgtgc caggctcttc ctcccatgac accctgtgca ccagctgcac tggcttcccc 600
ctcagcacca gggtaccagg agctgaggag tgtgagcgtg ccgtcatcga ctttgtggct 660
ttccaggaca tctccatcaa gaggctgcag cggctgctgc aggccctcga ggccccggag 720
ggctggggtc cgacaccaag ggcgggccgc gcggccttgc agctgaagct gcgtcggcgg 780
ctcacggagc tcctgggggc gcaggacggg gcgctgctgg tgcggctgct gcaggcgctg 840
cgcgtggcca ggatgcccgg gctggagcgg agcgtccgtg agcgcttcct ccctgtgcac 900
tga 903
<210> 284
<211> 783
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD27
<400> 284
atggcacggc cacatccctg gtggctgtgc gttctgggga ccctggtggg gctctcagct 60
actccagccc ccaagagctg cccagagagg cactactggg ctcagggaaa gctgtgctgc 120
cagatgtgtg agccaggaac attcctcgtg aaggactgtg accagcatag aaaggctgct 180
cagtgtgatc cttgcatacc gggggtctcc ttctctcctg accaccacac ccggccccac 240
tgtgagagct gtcggcactg taactctggt cttctcgttc gcaactgcac catcactgcc 300
aatgctgagt gtgcctgtcg caatggctgg cagtgcaggg acaaggagtg caccgagtgt 360
gatcctcttc caaacccttc gctgaccgct cggtcgtctc aggccctgag cccacaccct 420
cagcccaccc acttacctta tgtcagtgag atgctggagg ccaggacagc tgggcacatg 480
cagactctgg ctgacttcag gcagctgcct gcccggactc tctctaccca ctggccaccc 540
caaagatccc tgtgcagctc cgattttatt cgcatccttg tgatcttctc tggaatgttc 600
cttgttttca ccctggccgg ggccctgttc ctccatcaac gaaggaaata tagatcaaac 660
aaaggagaaa gtcctgtgga gcctgcagag ccttgtcgtt acagctgccc cagggaggag 720
gagggcagca ccatccccat ccaggaggat taccgaaaac cggagcctgc ctgctccccc 780
tga 783
<210> 285
<211> 1788
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF8
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atgcgcgtcc tcctcgccgc gctgggactg ctgttcctgg gggcgctacg agccttccca 60
caggatcgac ccttcgagga cacctgtcat ggaaacccca gccactacta tgacaaggct 120
gtcaggaggt gctgttaccg ctgccccatg gggctgttcc cgacacagca gtgcccacag 180
aggcctactg actgcaggaa gcagtgtgag cctgactact acctggatga ggccgaccgc 240
tgtacagcct gcgtgacttg ttctcgagac gacctcgtgg agaagacgcc gtgtgcatgg 300
aactcctccc gtgtctgcga atgtcgaccc ggcatgttct gttccacgtc tgccgtcaac 360
tcctgtgccc gctgcttctt ccattctgtc tgtccggcag ggatgattgt caagttccca 420
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aatggcgagg cgcctgccag caccagcccc actcagagct tgctggtgga ctcccaggcc 1080
agtaagacgc tgcccatccc aaccagcgct cccgtcgctc tctcctccac ggggaagccc 1140
gttctggatg cagggccagt gctcttctgg gtgatcctgg tgttggttgt ggtggtcggc 1200
tccagcgcct tcctcctgtg ccaccggagg gcctgcagga agcgaattcg gcagaagctc 1260
cacctgtgct acccggtcca gacctcccag cccaagctag agcttgtgga ttccagaccc 1320
aggaggagct caacgcagct gaggagtggt gcgtcggtga cagaacccgt cgcggaagag 1380
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gaggaaggga aagaagaccc cttgcccaca gctgcctctg gaaagtga 1788
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<212> DNA
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<220>
<223> TNFRSF10A
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atggcgccac caccagctag agtacatcta ggtgcgttcc tggcagtgac tccgaatccc 60
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<212> DNA
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<223> TNFRSF10B
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<212> DNA
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<223> TNFRSF10C
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<223> TNFRSF10D
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<212> DNA
<213> 智人
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<223> TNFRSF11A
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF14
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ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360
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<220>
<223> NGFR
<400> 296
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc 120
ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac 180
cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc 240
gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg 300
gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg 360
cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac 420
aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac 480
gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc 540
acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca 600
cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa 660
caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg cagctcccag 720
cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc catcctggct 780
gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga ggtggaacag ctgcaagcag 840
aacaagcaag gagccaacag ccggccagtg aaccagacgc ccccaccaga gggagaaaaa 900
ctccacagcg acagtggcat ctccgtggac agccagagcc tgcatgacca gcagccccac 960
acgcagacag cctcgggcca ggccctcaag ggtgacggag gcctctacag cagcctgccc 1020
ccagccaagc gggaggaggt ggagaagctt ctcaacggct ctgcggggga cacctggcgg 1080
cacctggcgg gcgagctggg ctaccagccc gagcacatag actcctttac ccatgaggcc 1140
tgccccgttc gcgccctgct tgcaagctgg gccacccagg acagcgccac actggacgcc 1200
ctcctggccg ccctgcgccg catccagcga gccgacctcg tggagagtct gtgcagtgag 1260
tccactgcca catccccggt gtga 1284
<210> 297
<211> 555
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF17
<400> 297
atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60
tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120
tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattctctg gacctgtttg 180
ggactgagct taataatttc tttggcagtt ttcgtgctaa tgtttttgct aaggaagata 240
aactctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct gggcatggct 300
aacattgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag 360
tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tgcatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct 420
gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgt caccacgaaa 480
acgaatgact attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca 540
atttctgcta ggtaa 555
<210> 298
<211> 1254
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF19
<400> 298
atggctttaa aagtgctact agaacaagag aaaacgtttt tcactctttt agtattacta 60
ggctatttgt catgtaaagt gacttgtgaa tcaggagact gtagacagca agaattcagg 120
gatcggtctg gaaactgtgt tccctgcaac cagtgtgggc caggcatgga gttgtctaag 180
gaatgtggct tcggctatgg ggaggatgca cagtgtgtga cgtgccggct gcacaggttc 240
aaggaggact ggggcttcca gaaatgcaag ccctgtctgg actgcgcagt ggtgaaccgc 300
tttcagaagg caaattgttc agccaccagt gatgccatct gcggggactg cttgccagga 360
ttttatagga agacgaaact tgtcggcttt caagacatgg agtgtgtgcc ttgtggagac 420
cctcctcctc cttacgaacc gcactgtgcc agcaaggtca acctcgtgaa gatcgcgtcc 480
acggcctcca gcccacggga cacggcgctg gctgccgtta tctgcagcgc tctggccacc 540
gtcctgctgg ccctgctcat cctctgtgtc atctattgta agagacagtt tatggagaag 600
aaacccagct ggtctctgcg gtcacaggac attcagtaca acggctctga gctgtcgtgt 660
tttgacagac ctcagctcca cgaatatgcc cacagagcct gctgccagtg ccgccgtgac 720
tcagtgcaga cctgcgggcc ggtgcgcttg ctcccatcca tgtgctgtga ggaggcctgc 780
agccccaacc cggcgactct tggttgtggg gtgcattctg cagccagtct tcaggcaaga 840
aacgcaggcc cagccgggga gatggtgccg actttcttcg gatccctcac gcagtccatc 900
tgtggcgagt tttcagatgc ctggcctctg atgcagaatc ccatgggtgg tgacaacatc 960
tctttttgtg actcttatcc tgaactcact ggagaagaca ttcattctct caatccagaa 1020
cttgaaagct caacgtcttt ggattcaaat agcagtcaag atttggttgg tggggctgtt 1080
ccagtccagt ctcattctga aaactttaca gcagctactg atttatctag atataacaac 1140
acactggtag aatcagcatc aactcaggat gcactaacta tgagaagcca gctagatcag 1200
gagagtggtg ctgtcatcca cccagccact cagacgtccc tccaggaagc ttaa 1254
<210> 299
<211> 1293
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> RELT
<400> 299
atgaagccaa gtctgctgtg ccggcccctg tcctgcttcc ttatgctgct gccctggcct 60
ctcgccaccc tgacatcaac aaccctttgg cagtgcccac ctggggagga gcccgacctg 120
gacccagggc agggcacatt atgcaggccc tgccccccag gcaccttctc agctgcatgg 180
ggctccagcc catgccagcc ccatgcccgt tgcagccttt ggaggaggct ggaggcccag 240
gtgggcatgg caactcgaga tacactctgt ggagactgct ggcctgggtg gtttgggcct 300
tggggggttc cccgcgttcc atgtcaacca tgttcctggg cacctctggg tactcatggc 360
tgtgatgagt gggggcggcg ggcccgacgt ggcgtggagg tggcagcagg ggccagcagc 420
ggtggtgaga cacggcagcc tgggaacggc acccgggcag gtggcccaga ggagacagcc 480
gcccagtacg cggtcatcgc catcgtccct gtcttctgcc tcatggggct gttgggcatc 540
ctggtgtgca acctcctcaa gcggaagggc taccactgca cggcgcacaa ggaggtcggg 600
cccggccctg gaggtggagg cagtggaatc aaccctgcct accggactga ggatgccaat 660
gaggacacca ttggggtcct ggtgcgcttg atcacagaga agaaagagaa tgctgcggcc 720
ctggaggagc tgctgaaaga gtaccacagc aaacagctgg tgcagacgag ccacaggcct 780
gtgtccaagc tgccgccagc gcccccgaac gtgccacaca tctgcccgca ccgccaccat 840
ctccacaccg tgcagggcct ggcctcgctc tctggcccct gctgctcccg ctgtagccag 900
aagaagtggc ccgaggtgct gctgtcccct gaggctgtag ccgccactac tcctgttccc 960
agccttctgc ctaacccgac cagggttccc aaggccgggg ccaaggcagg gcgtcagggc 1020
gagatcacca tcttgtctgt gggcaggttc cgcgtggctc gaattcctga gcagcggaca 1080
agttcaatgg tgtctgaggt gaagaccatc acggaggctg ggccctcgtg gggtgatctc 1140
cctgactccc cacagcctgg cctcccccct gagcagcagg ccctgctagg aagtggcgga 1200
agccgtacaa agtggctgaa gcccccagca gagaacaagg ccgaggagaa ccgctatgtg 1260
gtccggctaa gtgagagcaa cctggtcatc tga 1293
<210> 300
<211> 1968
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF21
<400> 300
atggggacct ctccgagcag cagcaccgcc ctcgcctcct gcagccgcat cgcccgccga 60
gccacagcca cgatgatcgc gggctccctt ctcctgcttg gattccttag caccaccaca 120
gctcagccag aacagaaggc ctcgaatctc attggcacat accgccatgt tgaccgtgcc 180
accggccagg tgctaacctg tgacaagtgt ccagcaggaa cctatgtctc tgagcattgt 240
accaacacaa gcctgcgcgt ctgcagcagt tgccctgtgg ggacctttac caggcatgag 300
aatggcatag agaaatgcca tgactgtagt cagccatgcc catggccaat gattgagaaa 360
ttaccttgtg ctgccttgac tgaccgagaa tgcacttgcc cacctggcat gttccagtct 420
aacgctacct gtgcccccca tacggtgtgt cctgtgggtt ggggtgtgcg gaagaaaggg 480
acagagactg aggatgtgcg gtgtaagcag tgtgctcggg gtaccttctc agatgtgcct 540
tctagtgtga tgaaatgcaa agcatacaca gactgtctga gtcagaacct ggtggtgatc 600
aagccgggga ccaaggagac agacaacgtc tgtggcacac tcccgtcctt ctccagctcc 660
acctcacctt cccctggcac agccatcttt ccacgccctg agcacatgga aacccatgaa 720
gtcccttcct ccacttatgt tcccaaaggc atgaactcaa cagaatccaa ctcttctgcc 780
tctgttagac caaaggtact gagtagcatc caggaaggga cagtccctga caacacaagc 840
tcagcaaggg ggaaggaaga cgtgaacaag accctcccaa accttcaggt agtcaaccac 900
cagcaaggcc cccaccacag acacatcctg aagctgctgc cgtccatgga ggccactggg 960
ggcgagaagt ccagcacgcc catcaagggc cccaagaggg gacatcctag acagaaccta 1020
cacaagcatt ttgacatcaa tgagcatttg ccctggatga ttgtgctttt cctgctgctg 1080
gtgcttgtgg tgattgtggt gtgcagtatc cggaaaagct cgaggactct gaaaaagggg 1140
ccccggcagg atcccagtgc cattgtggaa aaggcagggc tgaagaaatc catgactcca 1200
acccagaacc gggagaaatg gatctactac tgcaatggcc atggtatcga tatcctgaag 1260
cttgtagcag cccaagtggg aagccagtgg aaagatatct atcagtttct ttgcaatgcc 1320
agtgagaggg aggttgctgc tttctccaat gggtacacag ccgaccacga gcgggcctac 1380
gcagctctgc agcactggac catccggggc cccgaggcca gcctcgccca gctaattagc 1440
gccctgcgcc agcaccggag aaacgatgtt gtggagaaga ttcgtgggct gatggaagac 1500
accacccagc tggaaactga caaactagct ctcccgatga gccccagccc gcttagcccg 1560
agccccatcc ccagccccaa cgcgaaactt gagaattccg ctctcctgac ggtggagcct 1620
tccccacagg acaagaacaa gggcttcttc gtggatgagt cggagcccct tctccgctgt 1680
gactctacat ccagcggctc ctccgcgctg agcaggaacg gttcctttat taccaaagaa 1740
aagaaggaca cagtgttgcg gcaggtacgc ctggacccct gtgacttgca gcctatcttt 1800
gatgacatgc tccactttct aaatcctgag gagctgcggg tgattgaaga gattccccag 1860
gctgaggaca aactagaccg gctattcgaa attattggag tcaagagcca ggaagccagc 1920
cagaccctcc tggactctgt ttatagccat cttcctgacc tgctgtag 1968
<210> 301
<211> 1254
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> TNFRSF25
<400> 301
atggagcagc ggccgcgggg ctgcgcggcg gtggcggcgg cgctcctcct ggtgctgctg 60
ggggcccggg cccagggcgg cactcgtagc cccaggtgtg actgtgccgg tgacttccac 120
aagaagattg gtctgttttg ttgcagaggc tgcccagcgg ggcactacct gaaggcccct 180
tgcacggagc cctgcggcaa ctccacctgc cttgtgtgtc cccaagacac cttcttggcc 240
tgggagaacc accataattc tgaatgtgcc cgctgccagg cctgtgatga gcaggcctcc 300
caggtggcgc tggagaactg ttcagcagtg gccgacaccc gctgtggctg taagccaggc 360
tggtttgtgg agtgccaggt cagccaatgt gtcagcagtt cacccttcta ctgccaacca 420
tgcctagact gcggggccct gcaccgccac acacggctac tctgttcccg cagagatact 480
gactgtggga cctgcctgcc tggcttctat gaacatggcg atggctgcgt gtcctgcccc 540
acgagcaccc tggggagctg tccagagcgc tgtgccgctg tctgtggctg gaggcagatg 600
ttctgggtcc aggtgctcct ggctggcctt gtggtccccc tcctgcttgg ggccaccctg 660
acctacacat accgccactg ctggcctcac aagcccctgg ttactgcaga tgaagctggg 720
atggaggctc tgaccccacc accggccacc catctgtcac ccttggacag cgcccacacc 780
cttctagcac ctcctgacag cagtgagaag atctgcaccg tccagttggt gggtaacagc 840
tggacccctg gctaccccga gacccaggag gcgctctgcc cgcaggtgac atggtcctgg 900
gaccagttgc ccagcagagc tcttggcccc gctgctgcgc ccacactctc gccagagtcc 960
ccagccggct cgccagccat gatgctgcag ccgggcccgc agctctacga cgtgatggac 1020
gcggtcccag cgcggcgctg gaaggagttc gtgcgcacgc tggggctgcg cgaggcagag 1080
atcgaagccg tggaggtgga gatcggccgc ttccgagacc agcagtacga gatgctcaag 1140
cgctggcgcc agcagcagcc cgcgggcctc ggagccgttt acgcggccct ggagcgcatg 1200
gggctggacg gctgcgtgga agacttgcgc agccgcctgc agcgcggccc gtga 1254
<210> 302
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> EDAR
<400> 302
atggcccatg tgggggactg cacgcagacg ccctggctcc ccgtcctggt ggtgtctctg 60
atgtgctcag cccgagcgga atactcaaac tgcggtgaga acgagtacta caaccagact 120
acggggctgt gccaggagtg ccccccgtgt gggccgggag aggagcccta cctgtcctgt 180
ggctacggca ccaaagacga ggactacggc tgcgtcccct gcccggcgga gaagttttcc 240
aaaggaggct accagatatg caggcgtcac aaagactgtg agggcttctt ccgggccacc 300
gtgctgacac caggggacat ggagaatgac gctgagtgtg gcccttgcct ccctggctac 360
tacatgctgg agaacagacc gaggaacatc tatggcatgg tctgctactc ctgcctcctg 420
gcacccccca acaccaagga atgtgtggga gccacttcag gagcttctgc caacttccct 480
ggcacctcgg gcagcagcac cctgtctccc ttccagcacg cccacaaaga actctcaggc 540
caaggacacc tggccactgc cctgatcatt gcaatgtcca ccatcttcat catggccatc 600
gccatcgtcc tcatcatcat gttctacatc ctgaagacaa agccctctgc cccagcctgt 660
tgcaccagcc acccggggaa gagcgtggag gcccaagtga gcaaggacga ggagaagaaa 720
gaggccccag acaacgtggt gatgttctcc gagaaggatg aatttgagaa gctgacagca 780
actccagcaa agcccaccaa gagcgagaac gatgcctcat ccgagaatga gcagctgctg 840
agccggagcg tcgacagtga tgaggagccc gcccctgaca agcagggctc cccggagctg 900
tgcctgctgt cgctggttca cctggccagg gagaagtctg ccaccagcaa caagtcagcc 960
gggattcaaa gccggaggaa aaagatcctc gatgtgtatg ccaacgtgtg tggagtcgtg 1020
gaaggtctta gccccacgga gctgccattt gattgcctcg agaagactag ccgaatgctc 1080
agctccacgt acaactctga gaaggctgtt gtgaaaacgt ggcgccacct cgccgagagc 1140
ttcggcctga agagggatga gattgggggc atgacagacg gcatgcaact ctttgaccgc 1200
atcagcacgg caggctacag catccctgag ctactcacaa aactggtgca gattgagcgg 1260
ctggatgctg tggagtcctt gtgtgcagac atactggagt gggcgggggt tgtgccacct 1320
gcctcccagc cacatgctgc atcctga 1347
<210> 303
<211> 894
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> EDA2R
<400> 303
atggattgcc aagaaaatga gtactgggac caatggggac ggtgtgtcac ctgccaacgg 60
tgtggtcctg gacaggagct atccaaggat tgtggttatg gagagggtgg agatgcctac 120
tgcacagcct gccctcctcg caggtacaaa agcagctggg gccaccacag atgtcagagt 180
tgcatcacct gtgctgtcat caatcgtgtt cagaaggtca actgcacagc tacctctaat 240
gctgtctgtg gggactgttt gcccaggttc taccgaaaga cacgcattgg aggcctgcag 300
gaccaagagt gcatcccgtg cacgaagcag acccccacct ctgaggttca atgtgccttc 360
cagttgagct tagtggaggc agatacaccc acagtgcccc ctcaggaggc cacacttgtt 420
gcactggtga gcagcctgct agtggtgttt accctggcct tcctggggct cttcttcctc 480
tactgcaagc agttcttcaa cagacattgc cagcgtggag gtttgctgca gtttgaggct 540
gataaaacag caaaggagga atctctcttc cccgtgccac ccagcaagga gaccagtgct 600
gagtcccaag tgagtgagaa catctttcag acccagccac ttaaccctat cctcgaggac 660
gactgcagct cgactagtgg cttccccaca caggagtcct ttaccatggc ctcctgcacc 720
tcagagagcc actcccactg ggtccacagc cccatcgaat gcacagagct ggacctgcaa 780
aagttttcca gctctgcctc ctatactgga gctgagacct tggggggaaa cacagtcgaa 840
agcactggag acaggctgga gctcaatgtg ccctttgaag ttcccagccc ttaa 894
<210> 304
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STING (R232 等位基因)
<220>
<221> 等位基因
<222> (694)...(696)
<223> nnn = CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 或 AGG
<400> 304
atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60
gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gacnnngctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900
gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960
agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020
gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctct 1137
<210> 305
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人STING (R232等位基因)
<400> 305
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 306
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人STING (H232等位基因)
<400> 306
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 307
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人STING (Q293 等位基因)
<400> 307
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 308
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人STING (HAQ 等位基因; R71H/G230A/R293Q)
<400> 308
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu His His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Ala Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 309
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人STING (AQ 等位基因; G230A/R293Q)
<400> 309
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
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100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Ala Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
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305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 310
<211> 1025
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> MDA5/IFIH1
<400> 310
Met Ser Asn Gly Tyr Ser Thr Asp Glu Asn Phe Arg Tyr Leu Ile Ser
1 5 10 15
Cys Phe Arg Ala Arg Val Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu
20 25 30
Asp Tyr Leu Thr Phe Leu Pro Ala Glu Val Lys Glu Gln Ile Gln Arg
35 40 45
Thr Val Ala Thr Ser Gly Asn Met Gln Ala Val Glu Leu Leu Leu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Glu Tyr Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys
115 120 125
Leu Leu Val Arg Asp Val Leu Asp Lys Cys Met Glu Glu Glu Leu Leu
130 135 140
Thr Ile Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ala Glu Asn Asn Gly Asn
145 150 155 160
Glu Ser Gly Val Arg Glu Leu Leu Lys Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Asn Asn Ser Ser Glu Ser Ser Phe Ala Asp Ser Ser Val Val Ser
245 250 255
Glu Ser Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Leu Asp Glu
260 265 270
Ser Leu Gly His Asn Ser Asn Met Gly Ser Asp Ser Gly Thr Met Gly
275 280 285
Ser Asp Ser Asp Glu Glu Asn Val Ala Ala Arg Ala Ser Pro Glu Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Glu Gly Lys Asn Ile Ile Ile Cys Leu Pro Thr Gly Ser Gly Lys Thr
325 330 335
Arg Val Ala Val Tyr Ile Ala Lys Asp His Leu Asp Lys Lys Lys Lys
340 345 350
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355 360 365
Val Glu Gln Leu Phe Arg Lys Glu Phe Gln Pro Phe Leu Lys Lys Trp
370 375 380
Tyr Arg Val Ile Gly Leu Ser Gly Asp Thr Gln Leu Lys Ile Ser Phe
385 390 395 400
Pro Glu Val Val Lys Ser Cys Asp Ile Ile Ile Ser Thr Ala Gln Ile
405 410 415
Leu Glu Asn Ser Leu Leu Asn Leu Glu Asn Gly Glu Asp Ala Gly Val
420 425 430
Gln Leu Ser Asp Phe Ser Leu Ile Ile Ile Asp Glu Cys His His Thr
435 440 445
Asn Lys Glu Ala Val Tyr Asn Asn Ile Met Arg His Tyr Leu Met Gln
450 455 460
Lys Leu Lys Asn Asn Arg Leu Lys Lys Glu Asn Lys Pro Val Ile Pro
465 470 475 480
Leu Pro Gln Ile Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Val Gly Gly Ala
485 490 495
Thr Lys Gln Ala Lys Ala Glu Glu His Ile Leu Lys Leu Cys Ala Asn
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
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610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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770 775 780
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805 810 815
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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930 935 940
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965 970 975
Leu Asp Leu Pro Cys Leu Lys Ile Arg Asn Phe Val Val Val Phe Lys
980 985 990
Asn Asn Ser Thr Lys Lys Gln Tyr Lys Lys Trp Val Glu Leu Pro Ile
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Asp
1025
<210> 311
<211> 925
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> RIG-I/DDX58
<400> 311
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1 5 10 15
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35 40 45
Gly Pro Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Tyr Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys
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Ile Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro
100 105 110
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115 120 125
Glu Cys Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu
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Asn Ser Cys Pro Pro Ser Glu Val Ser Asp Thr Asn Leu Tyr Ser Pro
225 230 235 240
Phe Lys Pro Arg Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Ala Leu Pro Ala Met Lys
245 250 255
Gly Lys Asn Thr Ile Ile Cys Ala Pro Thr Gly Cys Gly Lys Thr Phe
260 265 270
Val Ser Leu Leu Ile Cys Glu His His Leu Lys Lys Phe Pro Gln Gly
275 280 285
Gln Lys Gly Lys Val Val Phe Phe Ala Asn Gln Ile Pro Val Tyr Glu
290 295 300
Gln Gln Lys Ser Val Phe Ser Lys Tyr Phe Glu Arg His Gly Tyr Arg
305 310 315 320
Val Thr Gly Ile Ser Gly Ala Thr Ala Glu Asn Val Pro Val Glu Gln
325 330 335
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340 345 350
Asn Asn Leu Lys Lys Gly Thr Ile Pro Ser Leu Ser Ile Phe Thr Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Ser Leu Asp Ala Ser Val Ile Ala Thr Val Lys His Asn Leu Glu Glu
435 440 445
Leu Glu Gln Val Val Tyr Lys Pro Gln Lys Phe Phe Arg Lys Val Glu
450 455 460
Ser Arg Ile Ser Asp Lys Phe Lys Tyr Ile Ile Ala Gln Leu Met Arg
465 470 475 480
Asp Thr Glu Ser Leu Ala Lys Arg Ile Cys Lys Asp Leu Glu Asn Leu
485 490 495
Ser Gln Ile Gln Asn Arg Glu Phe Gly Thr Gln Lys Tyr Glu Gln Trp
500 505 510
Ile Val Thr Val Gln Lys Ala Cys Met Val Phe Gln Met Pro Asp Lys
515 520 525
Asp Glu Glu Ser Arg Ile Cys Lys Ala Leu Phe Leu Tyr Thr Ser His
530 535 540
Leu Arg Lys Tyr Asn Asp Ala Leu Ile Ile Ser Glu His Ala Arg Met
545 550 555 560
Lys Asp Ala Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Phe Phe Ser Asn Val Arg Ala
565 570 575
Ala Gly Phe Asp Glu Ile Glu Gln Asp Leu Thr Gln Arg Phe Glu Glu
580 585 590
Lys Leu Gln Glu Leu Glu Ser Val Ser Arg Asp Pro Ser Asn Glu Asn
595 600 605
Pro Lys Leu Glu Asp Leu Cys Phe Ile Leu Gln Glu Glu Tyr His Leu
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Asn Pro Glu Thr Ile Thr Ile Leu Phe Val Lys Thr Arg Ala Leu Val
625 630 635 640
Asp Ala Leu Lys Asn Trp Ile Glu Gly Asn Pro Lys Leu Ser Phe Leu
645 650 655
Lys Pro Gly Ile Leu Thr Gly Arg Gly Lys Thr Asn Gln Asn Thr Gly
660 665 670
Met Thr Leu Pro Ala Gln Lys Cys Ile Leu Asp Ala Phe Lys Ala Ser
675 680 685
Gly Asp His Asn Ile Leu Ile Ala Thr Ser Val Ala Asp Glu Gly Ile
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Asp Ile Ala Gln Cys Asn Leu Val Ile Leu Tyr Glu Tyr Val Gly Asn
705 710 715 720
Val Ile Lys Met Ile Gln Thr Arg Gly Arg Gly Arg Ala Arg Gly Ser
725 730 735
Lys Cys Phe Leu Leu Thr Ser Asn Ala Gly Val Ile Glu Lys Glu Gln
740 745 750
Ile Asn Met Tyr Lys Glu Lys Met Met Asn Asp Ser Ile Leu Arg Leu
755 760 765
Gln Thr Trp Asp Glu Ala Val Phe Arg Glu Lys Ile Leu His Ile Gln
770 775 780
Thr His Glu Lys Phe Ile Arg Asp Ser Gln Glu Lys Pro Lys Pro Val
785 790 795 800
Pro Asp Lys Glu Asn Lys Lys Leu Leu Cys Arg Lys Cys Lys Ala Leu
805 810 815
Ala Cys Tyr Thr Ala Asp Val Arg Val Ile Glu Glu Cys His Tyr Thr
820 825 830
Val Leu Gly Asp Ala Phe Lys Glu Cys Phe Val Ser Arg Pro His Pro
835 840 845
Lys Pro Lys Gln Phe Ser Ser Phe Glu Lys Arg Ala Lys Ile Phe Cys
850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
Ile Ala Thr Gly Val Gln Thr Leu Tyr Ser Lys Trp Lys Asp Phe His
900 905 910
Phe Glu Lys Ile Pro Phe Asp Pro Ala Glu Met Ser Lys
915 920 925
<210> 312
<211> 427
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IRF-3, 同种型1
<400> 312
Met Gly Thr Pro Lys Pro Arg Ile Leu Pro Trp Leu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
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Glu Asp Phe Gly Ile Phe Gln Ala Trp Ala Glu Ala Thr Gly Ala Tyr
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65 70 75 80
Arg Ser Ala Leu Asn Arg Lys Glu Gly Leu Arg Leu Ala Glu Asp Arg
85 90 95
Ser Lys Asp Pro His Asp Pro His Lys Ile Tyr Glu Phe Val Asn Ser
100 105 110
Gly Val Gly Asp Phe Ser Gln Pro Asp Thr Ser Pro Asp Thr Asn Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Thr Ser Asp Thr Gln Glu Asp Ile Leu Asp Glu Leu Leu
130 135 140
Gly Asn Met Val Leu Ala Pro Leu Pro Asp Pro Gly Pro Pro Ser Leu
145 150 155 160
Ala Val Ala Pro Glu Pro Cys Pro Gln Pro Leu Arg Ser Pro Ser Leu
165 170 175
Asp Asn Pro Thr Pro Phe Pro Asn Leu Gly Pro Ser Glu Asn Pro Leu
180 185 190
Lys Arg Leu Leu Val Pro Gly Glu Glu Trp Glu Phe Glu Val Thr Ala
195 200 205
Phe Tyr Arg Gly Arg Gln Val Phe Gln Gln Thr Ile Ser Cys Pro Glu
210 215 220
Gly Leu Arg Leu Val Gly Ser Glu Val Gly Asp Arg Thr Leu Pro Gly
225 230 235 240
Trp Pro Val Thr Leu Pro Asp Pro Gly Met Ser Leu Thr Asp Arg Gly
245 250 255
Val Met Ser Tyr Val Arg His Val Leu Ser Cys Leu Gly Gly Gly Leu
260 265 270
Ala Leu Trp Arg Ala Gly Gln Trp Leu Trp Ala Gln Arg Leu Gly His
275 280 285
Cys His Thr Tyr Trp Ala Val Ser Glu Glu Leu Leu Pro Asn Ser Gly
290 295 300
His Gly Pro Asp Gly Glu Val Pro Lys Asp Lys Glu Gly Gly Val Phe
305 310 315 320
Asp Leu Gly Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Thr Phe Thr Glu Gly Ser
325 330 335
Gly Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Leu Trp Phe Cys Val Gly Glu Ser Trp
340 345 350
Pro Gln Asp Gln Pro Trp Thr Lys Arg Leu Val Met Val Lys Val Val
355 360 365
Pro Thr Cys Leu Arg Ala Leu Val Glu Met Ala Arg Val Gly Gly Ala
370 375 380
Ser Ser Leu Glu Asn Thr Val Asp Leu His Ile Ser Asn Ser His Pro
385 390 395 400
Leu Ser Leu Thr Ser Asp Gln Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln Asp Leu Val
405 410 415
Glu Gly Met Asp Phe Gln Gly Pro Gly Glu Ser
420 425
<210> 313
<211> 503
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IRF-7, 同种型A
<400> 313
Met Ala Leu Ala Pro Glu Arg Ala Ala Pro Arg Val Leu Phe Gly Glu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Gly Glu Ile Ser Ser Gly Cys Tyr Glu Gly Leu Gln Trp
20 25 30
Leu Asp Glu Ala Arg Thr Cys Phe Arg Val Pro Trp Lys His Phe Ala
35 40 45
Arg Lys Asp Leu Ser Glu Ala Asp Ala Arg Ile Phe Lys Ala Trp Ala
50 55 60
Val Ala Arg Gly Arg Trp Pro Pro Ser Ser Arg Gly Gly Gly Pro Pro
65 70 75 80
Pro Glu Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Gly Trp Lys Thr Asn Phe Arg
85 90 95
Cys Ala Leu Arg Ser Thr Arg Arg Phe Val Met Leu Arg Asp Asn Ser
100 105 110
Gly Asp Pro Ala Asp Pro His Lys Val Tyr Ala Leu Ser Arg Glu Leu
115 120 125
Cys Trp Arg Glu Gly Pro Gly Thr Asp Gln Thr Glu Ala Glu Ala Pro
130 135 140
Ala Ala Val Pro Pro Pro Gln Gly Gly Pro Pro Gly Pro Phe Leu Ala
145 150 155 160
His Thr His Ala Gly Leu Gln Ala Pro Gly Pro Leu Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Gly Asp Lys Gly Asp Leu Leu Leu Gln Ala Val Gln Gln Ser Cys Leu
180 185 190
Ala Asp His Leu Leu Thr Ala Ser Trp Gly Ala Asp Pro Val Pro Thr
195 200 205
Lys Ala Pro Gly Glu Gly Gln Glu Gly Leu Pro Leu Thr Gly Ala Cys
210 215 220
Ala Gly Gly Pro Gly Leu Pro Ala Gly Glu Leu Tyr Gly Trp Ala Val
225 230 235 240
Glu Thr Thr Pro Ser Pro Gly Pro Gln Pro Ala Ala Leu Thr Thr Gly
245 250 255
Glu Ala Ala Ala Pro Glu Ser Pro His Gln Ala Glu Pro Tyr Leu Ser
260 265 270
Pro Ser Pro Ser Ala Cys Thr Ala Val Gln Glu Pro Ser Pro Gly Ala
275 280 285
Leu Asp Val Thr Ile Met Tyr Lys Gly Arg Thr Val Leu Gln Lys Val
290 295 300
Val Gly His Pro Ser Cys Thr Phe Leu Tyr Gly Pro Pro Asp Pro Ala
305 310 315 320
Val Arg Ala Thr Asp Pro Gln Gln Val Ala Phe Pro Ser Pro Ala Glu
325 330 335
Leu Pro Asp Gln Lys Gln Leu Arg Tyr Thr Glu Glu Leu Leu Arg His
340 345 350
Val Ala Pro Gly Leu His Leu Glu Leu Arg Gly Pro Gln Leu Trp Ala
355 360 365
Arg Arg Met Gly Lys Cys Lys Val Tyr Trp Glu Val Gly Gly Pro Pro
370 375 380
Gly Ser Ala Ser Pro Ser Thr Pro Ala Cys Leu Leu Pro Arg Asn Cys
385 390 395 400
Asp Thr Pro Ile Phe Asp Phe Arg Val Phe Phe Gln Glu Leu Val Glu
405 410 415
Phe Arg Ala Arg Gln Arg Arg Gly Ser Pro Arg Tyr Thr Ile Tyr Leu
420 425 430
Gly Phe Gly Gln Asp Leu Ser Ala Gly Arg Pro Lys Glu Lys Ser Leu
435 440 445
Val Leu Val Lys Leu Glu Pro Trp Leu Cys Arg Val His Leu Glu Gly
450 455 460
Thr Gln Arg Glu Gly Val Ser Ser Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Cys Leu Ser Ser Ala Asn Ser Leu Tyr Asp Asp Ile Glu Cys Phe Leu
485 490 495
Met Glu Leu Glu Gln Pro Ala
500
<210> 314
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸因子 1 (EF1) alpha 启动子
<400> 314
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pagp-1 引物
<400> 315
gcgtgacggt tctgagtgct 20
<210> 316
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pagp-2 引物
<400> 316
cgtctttgct gccatcttcc g 21
<210> 317
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pagp-3 引物
<400> 317
acaataacga cgactccgat aagg 24
<210> 318
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pagp-4 引物
<400> 318
ctgctgaatg tgctgattaa cctg 24
<210> 319
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ansb-1 引物
<400> 319
accttagaag atagccgcaa agc 23
<210> 320
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ansb-2 引物
<400> 320
cagagacatg acacccacga ttatc 25
<210> 321
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ansb-3 引物
<400> 321
gcaaaccgct atccagaacg a 21
<210> 322
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ansb-4 引物
<400> 322
agtttaagta tgccgtggta ctgc 24
<210> 323
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> csgd-1 引物
<400> 323
cacttgcttt aagatttgta atggctag 28
<210> 324
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> csgd-2 引物
<400> 324
ggtgtattcg ctttcccatt tgtc 24
<210> 325
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> csgd-3 引物
<400> 325
tgtgctgtcc aggttaatgc c 21
<210> 326
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> csgd-4 引物
<400> 326
gacgacggtt ttctcgaagt ctc 23
<210> 327
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 327
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 328
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A 肽
<400> 328
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 329
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A 肽
<400> 329
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 330
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A 肽
<400> 330
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 331
<211> 3199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒 pSL0191
<400> 331
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa ccgcgtgacg gttctgagtg 2280
ctaaatcaaa cgccgttaac ccgatactct ctcagattat tctctgttta tagtttgtta 2340
agattttatt caggttaatg ttgttattat cacagtcgaa tttttgaacg gtatgtatgt 2400
tgcgatgatc atcagaaagt attttcttat tattgctctc cttttgatgc catggctggc 2460
tattcgctag cctcaataag cttcttgcct ttctgcaggt tttgatgggg aagggtatgc 2520
ttcagttgtg aattaaaaag tcttaaaaaa caataagtag atagagttag ctaaaaatta 2580
acgcgatatt tatcactttt tcgcaaagtt cgactggaca aaatgcatca caattgttgt 2640
actggtatcc gacacagcat ttgtgtctat ttttcatgta aaggtaattt tgatgtctaa 2700
gattaaaggt aacgttaagt ggtttaatga atccaaagga ttcggtttca ttactccgga 2760
agatggcagc aaagacgtgg ttccatccca atacgcgtca attcactggc cgtcgtttta 2820
caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 2880
cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 2940
cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 3000
atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 3060
cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 3120
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 3180
tcatcaccga aacgcgcga 3199
<210> 332
<211> 3214
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒 pSL0230
<400> 332
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggattgacc 420
ttagaagata gccgcaaagc gctggttggc agcctgaagt aatctttcct ttttaaacaa 480
tggcgcagat cgtatctgcg cctttttatt ctgttttttc ctgcattttg ttatccatct 540
ctaaaaaata ctctctgtcg gatatatatc gctggttaat cgtatggcgt cacattattc 600
gtctgcaata tagagataat gcgaccagtt gacataactg gagatataac atggctagcc 660
tcaataagct tcttgccttt ctgcagacca aggacccaga ttatgtgaag ttgacgatgc 720
aaaatacggc tttgtcgctt ccggcacgct gaacccgcaa aaagcgcgtg tcttactgca 780
actggcgtta acccagacta aagatccaaa acagatccag acgatgttca atcagtatta 840
aagataatgc cccggtcgga aggccggggc tatctttgga agacctctcg cacaaccaac 900
actattatct tgctaattat catcctggtt atgataatcg tgggtgtcat gtctctggat 960
cccaatggcg cgccgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 1020
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 1080
gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 1140
ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 1200
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 1260
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 1320
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1380
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1440
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1500
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1560
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1620
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1680
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1740
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1800
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1860
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1920
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1980
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 2040
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 2100
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 2160
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 2220
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 2280
gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 2340
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 2400
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 2460
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 2520
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 2580
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 2640
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2700
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2760
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2820
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2880
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2940
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 3000
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 3060
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 3120
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 3180
tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 3214
<210> 333
<211> 3141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒 pSL0196
<400> 333
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatacact 420
tgctttaaga tttgtaatgg ctagattgaa aacagttaaa agtattttcg taaatatttt 480
tctctttctg gataatgggc tatttcaacc cacagcagtg caacatctgt cagtacttct 540
ggtgccttta ttttatgggg gcagctgtca gatgtgcgat taaaaaaagt ggagtttcat 600
catgtttaat gaagtccata gtagctagcc tcaataagct tcttgccttt ctgcagacca 660
aggacccaga ttatgtttca tgggcaaacg ataatctcag gcggtaaggc catgaaacgc 720
tatctgacct ggattgtagc agcagagtta ctgttcgcta ccggaaacct gcatgccaat 780
gaagttgaag tcgaggttcc cggattgtta accgaccaga ccgtctcttc gataggacat 840
gaattctatc gtgcattcag cgacaaatgg gaaagcgaat acaccatccc aatggcgcgc 900
cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 960
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 1020
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 1080
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 1140
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 1200
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1260
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1320
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1380
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1440
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1500
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1560
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1620
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1680
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1740
ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1800
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1860
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1920
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1980
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 2040
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 2100
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 2160
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 2220
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 2280
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2340
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2400
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2460
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2520
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2580
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2640
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2700
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2760
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2820
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2880
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2940
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 3000
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 3060
aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 3120
gtatcacgag gccctttcgt c 3141
<210> 334
<211> 1217
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> ansB (L-天冬酰胺酶II)
<400> 334
tggcgcagat cgtatctgcg cctttttatt ctgttttttc ctgcattttg ttatccatct 60
ctaaaaaata ctctctgtcg gatatatatc gctggttaat cgtatggcgt cacattattc 120
gtctgcaata tagagataat gcgaccagtt gacataactg gagatataac atggagtttt 180
tcaggaaaac ggcattagct gctctggtaa tgggtttcag cggcgcagcg ttcgctttac 240
cgaatatcac catcttagcg accggcggaa cgatcgctgg cggtggtgat tcagcaacaa 300
aatcaaatta tacggcaggt aaagtcggcg tcgaaaatct ggtggatgcc gttcctcaat 360
tgaaggacat tgcggtagtg aaaggcgagc aggtcgttaa cattggctcg caggatatga 420
acgatgaagt ctggctcacg ctggcgaaaa aaatcaatac cgagtgcgac agcaccgacg 480
gtttcgtgat cacccacggt actgatacga tggaagagac cgcttatttc ctcgatctga 540
ccgtgaaatg caataaaccg gtggtactgg tcggcgcgat gcgtccttcc acgtcaatga 600
gcgcagatgg cccgttcaac ctctataatg cggtagtaac agcggctgat aaacagtctg 660
ccaaccgcgg cgtgctggtg gtaatgaatg ataccgtcat ggacggacgc gacgtcacta 720
agaccaatac gactgacgtg gcgacgttta aagcggttaa ctacggcccg ctgggttata 780
tccacaacgg taaaattgac taccagcgta cgccagagcg taaacatacc acctccaccc 840
cgttcgacgt gtcgaagctg accgcgttgc cgaaagtcgg tatcgtttat aactatgcga 900
atgcgtccga tctgccggca aaagcgctgg tagacgcggg ttatgacggg atcgtgagcg 960
caggagtggg taacggcaac ctgtataaaa cggtctttga taccctggcg accgccgcgc 1020
acaacggtac ggtagtggtg cgttcttcac gagtgccgac tggcgcaacc acgcaggatg 1080
cggaagttga cgatgcaaaa tacggctttg tcgcttccgg cacgctgaac ccgcaaaaag 1140
cgcgtgtctt actgcaactg gcgttaaccc agactaaaga tccaaaacag atccagacga 1200
tgttcaatca gtattaa 1217
<210> 335
<211> 664
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> csgD
<400> 335
gtggagtttc atcatgttta atgaagtcca tagtagtcat ggtcacacac tattgttgat 60
cacaaagcca tctctgcaag ctacggcatt attgcaacat ttaaagcaat cgctggccat 120
aaccggaaaa ctgcataata ttcaacgttc tctggaagat atctcggccg gttgcattgt 180
tttaatggat atgatggaag cggataagaa gcttatccac tattggcagg ataatttaag 240
ccgcaaaaac aataatataa aaacattatt gttaaatacc cctgacgatt atccctaccg 300
tgaaattgaa aactggcctc atattaacgg cgtgttttac gctactgaag accaggaaca 360
cgtggtcagc ggattacagg gtattctgcg tggcgaatgc tatttttcac aaaaattagc 420
cagttacctg attacgcact caggaaatta ccgctacaac agcaccgagt ccgcattact 480
cactcatcgc gaaaaagaga tcctcaataa gttacgtatt ggtgcctcta ataatgaaat 540
cgcgaggtcg ctatttatca gcgagaatac ggttaagaca catctttata atcttttcaa 600
aaagatagct gtcaaaaatc gcacccaggc agtttcatgg gcaaacgata atctcaggcg 660
gtaa 664
<210> 336
<211> 558
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> rck (补体杀伤抗性)
<400> 336
atgaaaaaaa tcgttctgtc ctcactgctg ctgtccgcag ccgggctggc tgccgtaccg 60
gtggcacagg ctgacaccca ttccgtgtcg gtgggatatg cccagagccg gatagagcat 120
tttaaggata tccgtggggt gaacctgaaa taccgctatg aggctcagac gccgctggga 180
ctgatggcgt cgttcagttg gcagtcaggt aagcgcggag agtccggtgg cattcctggc 240
ggaatgagct ggcgtgatga tgtgaaggcg acgtactggt cgctgatggc gggtccggct 300
gtccgtgtga acgagctggt atctctgtat gcactggccg gtgccggtac cggcagggct 360
gaagtgaaag agcgtatcag catgccggga tacaacgggc ggttcacggg ttcggagcgc 420
agaacggggt ttgcctgggg agccggcgta cagtttaatc cggtggaaaa tgtggtcatc 480
gatctgggct atgagggaag taaagttggc gcagcgaaac tgaacggcgt taacgttggt 540
gtcggttacc ggttctga 558
<210> 337
<211> 4369
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> pagP
<400> 337
gaattccagc acggcggcca gcagcataca gatcaccaga atggtaataa tgtgcaactg 60
cggcccccat ttaccgtcaa aaatcagtac gccgataatg ggcgtgaacg gcaaaagggc 120
ataaaacgcc ggggccgtgg tggtaatctc cgccacgtcc agcatctcat gtgaaatgtt 180
ctctttttta tccagatagc gttgccagaa aaagtgcgca atcgccatac cgataatggc 240
ggcgatggaa attggcagcg tagttttgaa cgcgaaatcg attaacggca tctccgccgc 300
ttttgcggct aaaaccacat cgccagacgt tggcgagagg atgatggcgg ccggagaggc 360
gcaaatagcc gccgccgcgc cgcggctaat gccgacgttg accatcaccg ggaagagagt 420
agccatgagc agtacgccaa gccccgtcgc ggaagagacg gccagcgaca tcaggcaggc 480
gacaaaatag gcggcaatca tcaacaggta gggcgagttt atgtactgta aaggtttcga 540
cgccagcttc acgaccatat cattcgcgcc gatatgcgtc atataggcgg caaagccgca 600
cagcatcatg atcatcatgc caagatcgcc gccgcgactc ataagcaaaa ttttgatgta 660
ttcaacaata tctgttgcgg tatagccggt actggtttcg ctggcaggta ataccttatg 720
ccccatcagc gcgctgataa taagcagagc cagaccgccg acaaataaaa cgccagtggc 780
ggaatatccc ttaatgatgt agcgcgctac acccacaata acgacgattc cgataaggac 840
ctctataact gttagcattg tttcccctgt cttatcgaca cccagagtaa aaataagaac 900
cacaaaagtg gtataaaaat gtaccgaata aaggatggcg ccttactgat taaaatcacg 960
gcgcggttat tttttcatgt cattgctaaa gatgaaatat acttatacga attttctgta 1020
gcactataag tattaattta ttgttatttt attgttttat ttgttgtgct ttgttttgtg 1080
ttttttgtga aagcttatta aggagcgcgt gacggttctg agtgctaaat caaacgccgt 1140
taacccgata ctctctcaga ttattctctg tttatagttt gttaagattt tattcaggtt 1200
aatgttgtta ttatcacagt cgaatttttg aacggtatgt atgttgcgat gatcatcaga 1260
aagtattttc ttattattgc tctccttttg atgccatggc tggctattcc ttcagtctct 1320
gcggcggata aaggggggtt taacacgttt accgataacg tcgcagaaac gtggcgacag 1380
cctgagcatt atgatttgta tgtccccgcc attacctggc atgcgcgctt tgcctacgat 1440
aaagagaaaa cggatcgcta taacgagcgg ccgtggggcg ttggttttgg tcagtcccgc 1500
tgggacgaca aaggcaactg gcatggcctc tatatgatgg cctttaaaga ttcatttaac 1560
aaatgggaac ccataggcgg ttatggctgg gaaaaaacct ggcgaccgct ggaagacgat 1620
aattttcgcc ttggactggg ctttaccgca ggcgttaccg cgcgcgacaa ctggaattat 1680
attcccatcc ctgtgctgtt gcctttagcg tcgataggct atggtcccgc tacctttcag 1740
atgacctaca ttccgggttc gtataacaac ggaaacgtct atttcgcctg gatgcgtttc 1800
cagttttgat ggggaagggt atgcttcagt tgtgaattaa aaagtcttaa aaaacaataa 1860
gtagatagag ttagctaaaa attaacgcga tatttatcac tttttcgcaa agttcgactg 1920
gacaaaatgc atcacaattg ttgtactggt atccgacaca gcatttgtgt ctatttttca 1980
tgtaaaggta attttgatgt ctaagattaa aggtaacgtt aagtggttta atgaatccaa 2040
aggattcggt ttcattactc cggaagatgg cagcaaagac gtgtttgtac acttctctgc 2100
aatccagacc aatggtttta aaactctggc tgaaggtcag cgcgtagagt tcgaaatcac 2160
taacggtgcc aaaggccctt ccgctgcaaa cgtaactgct ctgtaagcat acgtccgaca 2220
gcaagatttc aaaacccgcc ctttcggcgg gttttttttg cgcttaacgc gccgctgcgg 2280
cggaaaatag ccagaatgcc agcgccgtca tggcaaacga acctaacagg ttaatcagca 2340
cattcagcag cgcccagcca aagcgcccct cttgcagcaa gaataccact tcggcagaaa 2400
aagtagaaaa ggtcgtcagg ccgccgcaaa agccggttgt gatgagcact ttccacatcg 2460
gatcgatatg tgtcatgcgg ttaaaccagg cgaaccccat gccgataata aacgcgccaa 2520
gcaaatttgc tgttagcgta ccgatgggaa tcgcctgatg aagcggatta aaacgcatac 2580
tgagcatcca ccgggctacg ctccccgttc caccgccgat aaaaactgct aaaagaagct 2640
gtaacactgc cgaatccttt atttaattgc tatacaagag gagtgtaacg ccgaacacgc 2700
ataattggcg agtcctgaca gaggtgtggg aggggatatg ttcgttgcag ccgggcagtt 2760
tgtggtgagt tctgtatggg aagagaatgc gcaagtttgc gtttcgttaa tggctcaggc 2820
ggcgggccgc ggcgtatcgc ttctggtgtt gcctgagggg atattagcgc gagatgacat 2880
cgaccttgac ctgccgattc gcgccgcgca gccgctggat ggcgcgttta tgacgcggct 2940
tctggaagaa agcgctcata ataatatgac gacgatattc actatccttg tcccgtcaac 3000
gcctggacgg gcggttaata tgctggtggc gctacgggcg ggtcacattg tcgcgcgtta 3060
cgcgaagctg catctctatg atgcgttttc gatgcaagaa tcccaaagta ttgatgccgg 3120
aaccgttatc gcgcctgtgc tggacgtgga gggggttaag gtggggctta tgacctgtta 3180
tgacctgcgc tttccggaca tggcgctagc gctggcttta cagggggctg acgtattggc 3240
gctgccgacg ggctgggttc gcggcccgtt gaaagagcag cagtggtcga cgctgctggc 3300
ggcgagagcg ctggatacca ccagctatat gattgcggcc ggggagtgtg gtaatcgtaa 3360
tattggtcaa agtcgtatta tcgatccgtt gggggtaacg atagccgcgg cagccgatcg 3420
tccggcgctg atcgtcgcgg aaatattcag agaacgaata gaccaggtgc gggagcaact 3480
tcctcttttg cagcaacgac gatttgcgcc accgcaatta ttatgatgtt tttttacgca 3540
aagcttgatt caccttgtta cagattgcta ttgtgtgcgc gcgtcgaaag accgttaata 3600
ttctcaggtt aatccggcgc gttacgcagc ctgtttttag tgaagaaggt atctatgggt 3660
gagattagta ttaccaaact gctggtggtt gccgcactgg ttgttctgct gtttggtacc 3720
aagaagttac gtacgctggg cggagacctg ggcacggcga ttaaaggatt caagaaagca 3780
atgaacgatg aagacgcggg cgttaagaaa gacgtcgacg gtagcgttca ggctgaaaaa 3840
ctctcgcaca aagagtaatt gcgcgatgcg cttgctccgc agagtaaaaa aaccggcgag 3900
ttgccggttt tttttgcctg aaatgtaagc gtctattaca cgatcatttc acttccatgc 3960
ctttggcctg gagatcagca tggtacgaag aacgtacaaa ggggccacag gcggcatggg 4020
taaagcccat cgccagggct tccgctttca tctcgtcaaa ctcttccggg ctgacataac 4080
gctgtaccgg caggtgatgg cggcttggct gtagatactg accaagcgtc agcatggtaa 4140
cgccgtgacg gcgtaagtcg cgcataacct caatgatttc cgcattggtt tcgcctaagc 4200
ccaccatcag acccgatttt gtcggaattt ccgggtgcgc ttctttgaag cgttccagta 4260
atttcagcga ccagttgtaa tcggcgcccg gacgaacctg gcggtaaata cgcggcacgt 4320
tttccaggtt gtggttaaac acatccggcg gcgtcgcgtt aaggatatc 4369
<210> 338
<211> 1500
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> fliC
<400> 338
aaggaaaaga tcatggcaca agtcattaat acaaacagcc tgtcgctgtt gacccagaat 60
aacctgaaca aatcccagtc cgctctgggc accgctatcg agcgtctgtc ttccggtctg 120
cgtatcaaca gcgcgaaaga cgatgcggca ggtcaggcga ttgctaaccg ttttaccgcg 180
aacatcaaag gtctgactca ggcttcccgt aacgctaacg acggtatctc cattgcgcag 240
accactgaag gcgcgctgaa cgaaatcaac aacaacctgc agcgtgtgcg tgaactggcg 300
gttcagtctg ctaacagcac caactcccag tctgacctcg actccatcca ggctgaaatc 360
acccagcgcc tgaacgaaat cgaccgtgta tccggccaga ctcagttcaa cggcgtgaaa 420
gtcctggcgc aggacaacac cctgaccatc caggttggtg ccaacgacgg tgaaactatc 480
gatatcgatc tgaagcagat caactctcag accctgggtc tggatacgct gaatgtgcaa 540
caaaaatata aggtcagcga tacggctgca actgttacag gatatgccga tactacgatt 600
gctttagaca atagtacttt taaagcctcg gctactggtc ttggtggtac tgaccagaaa 660
attgatggcg atttaaaatt tgatgatacg actggaaaat attacgccaa agttaccgtt 720
acggggggaa ctggtaaaga tggctattat gaagtttccg ttgataagac gaacggtgag 780
gtgactcttg ctggcggtgc gacttccccg cttacaggtg gactacctgc gacagcaact 840
gaggatgtga aaaatgtaca agttgcaaat gctgatttga cagaggctaa agccgcattg 900
acagcagcag gtgttaccgg cacagcatct gttgttaaga tgtcttatac tgataataac 960
ggtaaaacta ttgatggtgg tttagcagtt aaggtaggcg atgattacta ttctgcaact 1020
caaaataaag atggttccat aagtattaat actacgaaat acactgcaga tgacggtaca 1080
tccaaaactg cactaaacaa actgggtggc gcagacggca aaaccgaagt tgtttctatt 1140
ggtggtaaaa cttacgctgc aagtaaagcc gaaggtcaca actttaaagc acagcctgat 1200
ctggcggaag cggctgctac aaccaccgaa aacccgctgc agaaaattga tgctgctttg 1260
gcacaggttg acacgttacg ttctgacctg ggtgcggtac agaaccgttt caactccgct 1320
attaccaacc tgggcaacac cgtaaacaac ctgacttctg cccgtagccg tatcgaagat 1380
tccgactacg cgaccgaagt ttccaacatg tctcgcgcgc agattctgca gcaggccggt 1440
acctccgttc tggcgcaggc gaaccaggtt ccgcaaaacg tcctctcttt actgcgttaa 1500
<210> 339
<211> 1528
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> fljB
<400> 339
aaattttatg gcacaagtaa tcaacactaa cagtctgtcg ctgctgaccc agaataacct 60
gaacaaatcc cagtccgcac tgggcaccgc tatcgagcgt ctgtcttctg gtctgcgtat 120
caacagcgcg aaagacgatg cggcaggtca ggcgattgct aaccgtttca ccgcgaacat 180
caaaggtctg actcaggctt cccgtaacgc taacgacggt atctccattg cgcagaccac 240
tgaaggcgcg ctgaacgaaa tcaacaacaa cctgcagcgt gtgcgtgaac tggcggttca 300
gtctgctaac agcaccaact cccagtctga cctcgactcc atccaggctg aaatcaccca 360
gcgcctgaac gaaatcgacc gtgtatccgg ccagactcag ttcaacggcg tgaaagtcct 420
ggcgcaggac aacaccctga ccatccaggt tggcgccaac gacggtgaaa ctatcgatat 480
cgatctgaag cagatcaact ctcagaccct gggtctggac tcactgaacg tgcagaaagc 540
gtatgatgtg aaagatacag cagtaacaac gaaagcttat gccaataatg gtactacact 600
ggatgtatcg ggtcttgatg atgcagctat taaagcggct acgggtggta cgaatggtac 660
ggcttctgta accggtggtg cggttaaatt tgacgcagat aataacaagt actttgttac 720
tattggtggc tttactggtg ctgatgccgc caaaaatggc gattatgaag ttaacgttgc 780
tactgacggt acagtaaccc ttgcggctgg cgcaactaaa accacaatgc ctgctggtgc 840
gacaactaaa acagaagtac aggagttaaa agatacaccg gcagttgttt cagcagatgc 900
taaaaatgcc ttaattgctg gcggcgttga cgctaccgat gctaatggcg ctgagttggt 960
caaaatgtct tataccgata aaaatggtaa gacaattgaa ggcggttatg cgcttaaagc 1020
tggcgataag tattacgccg cagattacga tgaagcgaca ggagcaatta aagctaaaac 1080
tacaagttat actgctgctg acggcactac caaaacagcg gctaaccaac tgggtggcgt 1140
agacggtaaa accgaagtcg ttactatcga cggtaaaacc tacaatgcca gcaaagccgc 1200
tggtcatgat ttcaaagcac aaccagagct ggcggaagca gccgctaaaa ccaccgaaaa 1260
cccgctgcag aaaattgatg ccgcgctggc gcaggtggat gcgctgcgct ctgatctggg 1320
tgcggtacaa aaccgtttca actctgctat caccaacctg ggcaataccg taaacaatct 1380
gtctgaagcg cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg accgaagttt ccaacatgtc 1440
tcgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ttccgttctg gcgcaggcta accaggtccc 1500
gcagaacgtg ctgtctctgt tacgttaa 1528
<210> 340
<211> 537
<212> DNA
<213> 小肠结肠炎耶尔森氏菌
<220>
<223> ail (附着侵入基因座)
<400> 340
atgaaaaaga cattactagc tagttctcta atagcctgtt tatcaattgc gtctgttaat 60
gtgtacgctg cgagtgaaag tagtatttct attggttatg cgcaaagcca tgtaaaagaa 120
aatggggata cattggataa tgaccctaaa ggttttaacc tgaagtaccg ttatgaactc 180
gatgataact ggggagtaat aggttcgttt gcttatactc atcagggata tgatttcttc 240
tatggcagta ataagtttgg tcatggtgat gttgattact attcagtaac aatggggcca 300
tctttccgca tcaacgaata tgttagcctt tatggattac tgggggccgc tcatggaaag 360
gttaaggcat ctgtatttga tgaatcaatc agtgcaagta agacgtcaat ggcatacggg 420
gcaggggtgc aattcaaccc acttccaaat tttgtcattg acgcttcata tgaatactcc 480
aaactcgata gcacaaaagt tggcacctgg atgcttggtg cagggtatcg attctaa 537
<210> 341
<211> 1286
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> pgtE (外膜丝氨酸蛋白酶)
<400> 341
tgattataga ttgcttatta ttcacctgag catcaaattc tatttcttaa cttcaatata 60
aggtaaaaat gcgtcaagtt ctctggcgta ataaatgtac tcttgtccga cgatttgaca 120
agatgaaaac ttcatcacct ctccagatta catctgaata tgaggacaag agaaatgaaa 180
aaacatgcta ttgcagtaat gatgatcgcc gtattttctg agtcggttta tgcggagtct 240
gccttattta ttccggacgt ctctcctgat agcgtcacga catccctttc cgtgggtgtg 300
ttaaatggta aatccaggga gctggtttat gataccgaca ccgggcggaa gctgagtcaa 360
ctggattgga aaataaaaaa tgtcgccacg ttgcaggggg atttatcatg ggaaccctat 420
tcgttcatga cgctggacgc ccgcggctgg acgtctttgg cgtcgggatc gggtcatatg 480
gttgaccatg actggatgag cagtgagcag ccaggctgga ccgatcgttc aattcatccg 540
gacaccagcg tcaactatgc taatgaatac gatttgaacg tgaaaggttg gttattgcag 600
ggcgataact acaaggcggg cgtaacagcg ggctatcagg aaacccgttt tagctggacg 660
gcaagaggcg ggtcttatat ttatgataat ggtcgatata ttggtaattt tcctcatggc 720
gtgcgcggca taggttatag ccagcgtttc gaaatgccct atatcgggct ggcgggtgat 780
tatcgtatta atgactttga gtgtaatgta ctgtttaaat acagcgactg ggtaaatgcg 840
catgataatg acgaacacta catgcgcaaa cttaccttcc gtgaaaaaac ggaaaattca 900
cgatattatg gcgcttctat tgacgccgga tattatatta ccagtaatgc aaaaatcttt 960
gctgagtttg cttacagtaa atatgaagaa ggtaagggcg gtacgcaaat catagataaa 1020
accagcggtg atacggcgta ttttggtggc gatgccgcag gtatagctaa taataactat 1080
acggttaccg cggggttgca gtatcgcttc tagaccacat cgggatgtca tcggtcataa 1140
ccggccgatg acgacttttt gctgaacgta tggcatgtcc ggtgatattg cataggggca 1200
ataaaagcaa catgaaaggg aaaccgctcg aaaggttatg cagcaagaag agaatgtcct 1260
gggtatcaat ggtgtcccct gcagta 1286
<210> 342
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 342
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 343
<211> 4899
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 343
agtctctcgt catggaatac gcctctgacg cttcactgga ccccgaagcc ccgtggcctc 60
ccgcgccccg cgctcgcgcc tgccgcgtac tgccttgggc cctggtcgcg gggctgctgc 120
tgctgctgct gctcgctgcc gcctgcgccg tcttcctcgc ctgcccctgg gccgtgtccg 180
gggctcgcgc ctcgcccggc tccgcggcca gcccgagact ccgcgagggt cccgagcttt 240
cgcccgacga tcccgccggc ctcttggacc tgcggcaggt gagacgtgcc ccgaccctcg 300
gtagctggtc tcgcgggaga cccctaccgc ccctctggga ctcccttctc cctcccgcac 360
ccccagggac acctgttcta cactcccggc cggggagagg agacccaccg gggctcccat 420
tctccatcta gcaccgaggc cgggggggca cacctttcat cccgcacccc tacgacacct 480
catctgtacc ccaggccggg ggcggggagg agaccgccca acagttcttt ttggaccccc 540
caagggtctc cttcttctag tccggggggc acccctttca tcctgcgccc gctacgagac 600
cctatctgta tcccgggagg gggagaggag acccccacaa gttctttttg gacctccaag 660
ggctctcctt ctccgtcttg cacgggaggg cacccctttc attccgcatc ccgagacccc 720
atcagcaccc caggccagga ggaggagacc cccacagtcc tcaacccctc agggatacgt 780
cttctgcacc ccgggtcgga gaaaggctgg cttccctcca tgtggcagtg ggtgggggca 840
cccctcttca ttccgcattc ccaaggcacc ccatctgcac cctggacggg ggaccctccg 900
cggttctcca accctcgacg gcttcctttc tctatgtagg acttaggaca ttgagggcac 960
ctctttttac cccgcacccc cacaagctct gcatctctgg ggggaacctt ttttccatcc 1020
ccgatccgag gggggcactt cctctttatc tgggaccgcc aaggagaccc ccagttcctt 1080
tgctaactcc caaagagcct tatccccaac atctgaggta cccctctccc tttcaagacc 1140
cccaggggaa tacccccaag ggggctggaa agaagaggga tcgcttttcc ctcctgaatt 1200
cttggagatc tgtccttggg gcaggttgag ccaccagctt cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1260
tgtgtgtgtg tgttcgtgtt tgtgtgggtg tttgtgttcg tgtgtgtgtg ttcgtgtggg 1320
ggtgcgtatg tgtgtgtgtt cgtgggtgtg tttgtgttcg tgtgggtgtg tgttcgtgtg 1380
ggtgtttgtg tttgttcgtt cgtgtgggtg tttgtgttca tgtgggtgtg tttggatatt 1440
tgtgttcgtg tgtgtctgtg tgtgttcgtg tgggtgtttg tgtgtgtttg tgtttgcgtt 1500
cgtgtgtgtg ttcgtgtttg ttcgtgtgtc tgtgtgttaa tgtgggtgtt cgtgtgtgtg 1560
ttcgtttgtg tttgtgttcg tgtgtttgtg tgtttgtgtg tgtgtgtgtg cggtctctgt 1620
tctttagttg ggagggaagg gaagcgtagg cttcaggtcg gcacagactc tggggaccct 1680
gacagctgaa gtgagtgggg acagaacctc cattttctag gggaaccccc atccactttc 1740
ctcctttcta cttttaacag ggcatgtttg cgcagctggt ggcccaaaat ggtaagtatc 1800
ctccgccact tccggtccct ggccccccac catccccacc ccgggatacg aagaaggggg 1860
aacctggaga gtgaggctct gccgcacact ggctttgacc cttgaccgct gctgtctctg 1920
aaagctgcta cttcccctct ttgaacgcca ccgatccctc tttctgactt gctctgactc 1980
tctggatgcc atggcctccc catcagaccc ccatctgggc ccacctggga cccctgccct 2040
ctcagagctg gggcttgaca cccccaaccc ccagcctggt tttgtgtctc tggcctcctt 2100
cttttcgaaa ccctcttccc cgctgctttt cttccctctt tcctgcccct tccccactct 2160
cccagcctct cttccctacc tcttcccctc gcccagagcc tcctccttac tcccattctc 2220
ttccccatcc ccaggccctc ctcctgtccc cttccctccc cctagaccct cctccctgcc 2280
ccttccccaa accctcccca gccccatgct ctcccagttt ccaagacact cctcccagca 2340
ccttccctcc ccgtccagag acttcttccc cgctcgagac ctcttccccc ttcccctccc 2400
agagaccccc ttcccccttc ccctctccat ctagagatca cttccccctt tcccctcccc 2460
ctccagaaac cccttccccc ttccctctcc cctccagaga ccccttcccc ctccaaagac 2520
cccttccccc ttccttcccc ctccagagac ccctttcccc ttccctcccc ttccagagac 2580
cccttccccc tccccctcca aagacccctt cctccttccc ctccctctcc agagacccct 2640
tcccccttcc ctctccctcc agagacccct tcccccttcc ctgccccctc cagagtcccc 2700
ttcccctcca gaggcccctt cccccttccc cctccccctc cagagacacc ttctcccttc 2760
tccccctcca gagacccctt cccccttccc tccccctgcc taagactccc ctccctgcca 2820
tcttctctcc ttggtgcttc cttctcccta acccctcccc caccccttcc tgctcccttt 2880
gcctttcttc gaagtcctct cttaccaggt cccctgtcca cccctcttaa agttcccttg 2940
attccctgat ggatccttcc tctagaactt cctcctttcc taacagtctt ccctctccct 3000
cctagctccc tgtccacctc tcctctcccc tttccttcct tctctccctt ctcctccccc 3060
catctccatc ctgtccgaga tctgctgctc cctccaaccc cctcaccgcc ctctccagga 3120
gtccccttac ccctccccga ggcctcttcc agccagactc gcctggcctt ttgcttttca 3180
ccccctcttc ctcttcctgc atgtctttcc ccgcacccgc atcactcctt ccccacccaa 3240
cctcttggag ttttgccctg tcccgactct tgtccttctc cctggattcc cttcctctgt 3300
tctatccccg tctttccctc ccctagctct acccctgctc agagtcccgc ccccaacaac 3360
ctcagttctc ttcaatcagc acccccccaa cgcccccccc acccaggctc cccgctctgc 3420
tcccctgtcc cgctccctgc cccgccattc cccgcccccc ggcccctgac ccgttctttt 3480
ctcccagggc tgcgctgaca tgttcggtgc tcagccacgc tcagctgtgc tgggacatgc 3540
tcagctaagc taagtgcatg ctttcctccc acagttctgc tgatcgatgg gcccctgagc 3600
tggtacagtg acccaggcct ggcaggcgtg tccctgacgg ggggcctgag ctacaaagag 3660
gacacgaagg agctggtggt ggccaaggct ggagtctact atgtcttctt tcaactagag 3720
ctgcggcgcg tggtggccgg cgagggctca ggctccgttt cacttgcgct gcacctgcag 3780
ccactgcgct ctgctgctgg ggccgccgcc ctggctttga ccgtggacct gccacccgcc 3840
tcctccgagg ctcggaactc ggccttcggt ttccagggcc gcttgctgca cctgagtgcc 3900
ggccagcgcc tgggcgtcca tcttcacact gaggccaggg cacgccatgc ctggcagctt 3960
acccagggcg ccacagtctt gggactcttc cgggtgaccc ccgaaatccc agccggactc 4020
ccttcaccga ggtcggaata acgtccagcc tgggtgcagc ccacctggac agagtccgaa 4080
tcctactcca tccttcatgg agacccctgg tgctgggtcc ctgctgcttt ctctacctca 4140
aggggcttgg caggggtccc tgctgctgac ctccccttga ggaccctcct cacccactcc 4200
ttccccaagt tggaccttga tatttattct gagcctgagc tcagataata tattatatat 4260
attatatata tatatatatt tctatttaaa gaggatcctg agtttgtgaa tggacttttt 4320
tagaggagtt gttttggggg ggggggggtc ttcgacattg ccgaggctgg tcttgaactc 4380
ctggacttag acgatcctcc tgcctcagcc tcccaagcaa ctgggattca tcctttctat 4440
taattcattg tacttatttg cttatttgtg tgtattgagc atctgtaatg tgccagcatt 4500
gtgcccaggc tagggggcta tagaaacatc tagaaataga ctgaaagaaa atctgagtta 4560
tggtaatacg tgaggaattt aaagactcat ccccagcctc cacctcctgt gtgatacttg 4620
ggggctagct tttttctttc tttctttttt ttgagatggt cttgttctgt caaccaggct 4680
agaatgcagc ggtgcaatca tgagtcaatg cagcctccag cctcgacctc ccgaggctca 4740
ggtgatcctc ccatctcagc ctctcgagta gctgggacca cagttgtgtg ccaccacact 4800
tggctaactt tttaattttt ttgcggagac ggtattgcta tgttgccaag gttgtttaca 4860
tgccagtaca atttataata aacactcatt tttcctccc 4899
<210> 344
<211> 309
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 344
Met Asp Gln His Thr Leu Asp Val Glu Asp Thr Ala Asp Ala Arg His
1 5 10 15
Pro Ala Gly Thr Ser Cys Pro Ser Asp Ala Ala Leu Leu Arg Asp Thr
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Arg Pro Thr
35 40 45
Asn Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Val Asn Val Arg
50 55 60
Asp Arg Glu Ala Ala Trp Pro Pro Ala Leu Asn Phe Cys Ser Arg His
65 70 75 80
Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala
85 90 95
Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr
100 105 110
Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln
115 120 125
Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys
145 150 155 160
Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val
180 185 190
Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro
195 200 205
Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val
210 215 220
Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr
225 230 235 240
Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly
260 265 270
Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu
275 280 285
Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro
290 295 300
Asp Asn Pro Trp Glu
305
<210> 345
<211> 2472
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 345
gagaaagttc cgggagtcga ggggcggagc gcggagcccg ggaaccccgc ggctgccctc 60
cctcccttcc ctccccggaa aaggcgcctc ggtagcctat aaagcacggg cactggcggg 120
agacgtgcac tgaccgaccg tggtaatgga ccagcacaca cttgatgtgg aggataccgc 180
ggatgccaga catccagcag gtacttcgtg cccctcggat gcggcgctcc tcagagatac 240
cgggctcctc gcggacgctg cgctcctctc agatactgtg cgccccacaa atgccgcgct 300
ccccacggat gctgcctacc ctgcggttaa tgttcgggat cgcgaggccg cgtggccgcc 360
tgcactgaac ttctgttccc gccacccaaa gctctatggc ctagtcgctt tggttttgct 420
gcttctgatc gccgcctgtg ttcctatctt cacccgcacc gagcctcggc cagcgctcac 480
aatcaccacc tcgcccaacc tgggtacccg agagaataat gcagaccagg tcacccctgt 540
ttcccacatt ggctgcccca acactacaca acaggtgagg ctcatctcat ccctagggga 600
ctctttctta ccttctggaa gcatcgctgc accgacaggg agagaacagc acttcctccc 660
cacccccgcc ccgccccgcc ccgccccgcc tcgctctgct cctgctactc cgcttgaagc 720
accccctctc catctcgcac tcagaggaaa tccctttgcg tcttgacccc ttgaatgaac 780
ctatgaaacc tgggggagaa ctcccgaggg tgcaccgcag ttcccttcag tcccacttag 840
gccttcaggg ctctccttct ccatccaaag ttggacgccc caatgtgtgc tgggccgtat 900
gagttcctat ctgcttcttt aggatgtaag gtaccatcta cctttatttt tctttcttcc 960
cagggctctc ctgtgttcgc caagctactg gctaaaaacc gtgagtgccc cctgatttat 1020
ttccagcggg tcccgcaggg aggttgaaca aggggacctg ttcaaccttc tagtcatgtc 1080
cctctccctc acttactcag cctttctcac ttgctgtcac agctccaact gtcatccttg 1140
ggaccccatc caggttttca gagaattgag aattctcacc cccagctgac tctgggagat 1200
ctccttttct cttttccttc ctctatccct cccatgtagc ccaggcttcc tccaaattca 1260
ttatgtagct gaggctggcc gccctgctgc caacacctcc aatgggctgg gataaatgaa 1320
tgcctttggg cttcaggcac cctattgagc ccgagcccta gtctctccct gtcaagtctt 1380
agttgtcaaa ttatttgccc tcagagatga ctctcttcct gcactctcca tatcccacct 1440
ctctcccagt tttgttcatc cctctcttac tcctctgatt tctctctctt cttttctcct 1500
ctcccccttc ccctcttgtg gcccctttac tcagctcctt ccaggagtcc atgtgcatct 1560
ccgctcttaa cactctagac cctcgcccct ttgcctcgtt cttattccac aaccactttc 1620
ttaaattgta tcccttctgg gtggcccctc cctccttttc ttctgttttg tctcctctct 1680
ttcctcccca ttcccatggt ttcccccctc ccccacaccc cgcaaccctc agcaactcag 1740
tgttcttttt ctagaagcat cgttgtgcaa tacaactctg aactggcaca gccaagatgg 1800
agctgggagc tcatacctat ctcaaggtct gaggtacgaa gaagacaaaa aggagttggt 1860
ggtagacagt cccgggctct actacgtatt tttggaactg aagctcagtc caacattcac 1920
aaacacaggc cacaaggtgc agggctgggt ctctcttgtt ttgcaagcaa agcctcaggt 1980
agatgacttt gacaacttgg ccctgacagt ggaactgttc ccttgctcca tggagaacaa 2040
gttagtggac cgttcctgga gtcaactgtt gctcctgaag gctggccacc gcctcagtgt 2100
gggtctgagg gcttatctgc atggagccca ggatgcatac agagactggg agctgtctta 2160
tcccaacacc accagctttg gactctttct tgtgaaaccc gacaacccat gggaatgaga 2220
actatccttc ttgtgactcc tagttgctaa gtcctcaagc tgctatgttt tatggggtct 2280
gagcaggggt cccttccatg actttctctt gtctttaact ggacttggta tttattctga 2340
gcatagctca gacaagactt tatataattc actagatagc attagtaaac tgctgggcag 2400
ctgctagata aaaaaaaatt tctaaatcaa agtttatatt tatattaata tataaaaata 2460
aatgtgtttg ta 2472
<210> 346
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)
<400> 346
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 347
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 乙型肝炎病毒转录后调节元件 (HPRE)
<400> 347
ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg 60
gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg ccgatccata 120
ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggggcaaag ctcatcggaa 180
ctgacaattc tgtcgtcctc tcgcggaaat atacatcgtt tccatggctg ctaggttgta 240
ctgccaactg catccttcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg ctgaatcccg 300
cggacgaccc ctctcggggc cgcttgggac tctctcgtcc ccttctccgt ctgccgttcc 360
agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct tctcatctgc 420
cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gagaccaccg tgaacgccca 480
tcagatcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctcccagcaa tgtc 534
<210> 348
<211> 398
<212> PRT
<213> 斑马鱼
<220>
<223> WT 斑马鱼 STING (zfSTING)
<400> 348
Met Ser Val Met Gly Glu Asp Ala Leu Val Pro Arg Ala Arg Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Val Met Cys Ala Ala Gly Leu Gly Phe Leu Thr Leu Ala Val
20 25 30
Ala Trp Leu Leu Asp Ser Asp Lys Phe Ser Glu Arg Ala Gly Ile Ile
35 40 45
Ala Phe Gly Leu Met Leu Glu Arg Phe Ile Tyr Cys Ile Cys Leu Leu
50 55 60
Ala Glu Glu Leu Leu Phe His Ser Arg Gln Arg Tyr His Gly Arg Met
65 70 75 80
Ser Glu Ile Phe Arg Ala Cys Phe Arg Gly Ser Gly Ile Leu Gly Met
85 90 95
Cys Ala Ile Phe Leu Met Leu Met Leu Gly Gly Val Ser Phe Ser Val
100 105 110
Lys Gln Trp Ser His Phe Asn Leu Met Cys Ala Gly Tyr Met Leu Leu
115 120 125
Asn Ser Leu Gly Val Leu Gly Pro Ala Pro Val Glu Ile Ser Glu Ile
130 135 140
Cys Glu Ala Lys Lys Met Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Ile Gly Tyr Leu Lys Phe Leu Leu Pro Ala Leu Glu Val Asn Val
165 170 175
Arg Glu Tyr Ser Arg Arg Glu Arg Leu Ser Ser Pro Arg Leu His Ile
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Asn Ala Arg Val Pro Ser Lys Pro Glu Glu Glu Asp
195 200 205
Thr Asn Val Val Phe His Glu Asn Leu Pro Asp Leu Lys Leu Asp Arg
210 215 220
Ala Gly Val Arg Lys Arg Ser Tyr Thr Asn Ser Val Tyr Lys Ile Thr
225 230 235 240
His Asn Asn Glu Thr Phe Ser Cys Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu
245 250 255
Leu Thr Leu Tyr Gln Met Ser Gln Glu Ser Ser Ala Gly Phe Gly Glu
260 265 270
Arg Glu Arg Lys Gln Gln Val Leu Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Gln
275 280 285
Ile Leu Asp Asn Ser Leu Glu Cys Arg Asn Arg Tyr Arg Leu Ile Leu
290 295 300
Leu Asn Asp Glu His Thr Gly Asp Pro His Tyr Leu Ser Arg Glu Leu
305 310 315 320
Phe Gln Asn Leu Lys Gln Gln Asp Gly Glu Ile Phe Met Asp Pro Thr
325 330 335
Asn Glu Val His Pro Val Pro Glu Glu Gly Pro Val Gly Asn Cys Asn
340 345 350
Gly Ala Leu Gln Ala Thr Phe His Glu Glu Pro Met Ser Asp Glu Pro
355 360 365
Thr Leu Met Phe Ser Arg Pro Gln Ser Leu Arg Ser Glu Pro Val Glu
370 375 380
Thr Thr Asp Tyr Phe Asn Pro Ser Ser Ala Met Lys Gln Asn
385 390 395
<210> 349
<211> 381
<212> PRT
<213> 袋獾
<220>
<223> WT 袋獾 STING (tazSTING)
<400> 349
Met Pro Arg Ser His Leu His Pro Ser Ile Pro Gln Pro Arg Gly Trp
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Cys Val Leu Leu Ser Leu Cys Met Ala Ala
20 25 30
Val Tyr Ile Leu Gly Glu Ser Ala Ala Phe Thr Leu Gln Trp Leu Leu
35 40 45
Phe Tyr Phe Thr Thr Val Gln Val Gly Leu Leu Leu Lys Gly Ala Tyr
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Tyr His Ile Gln Ser Arg His Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Gln Ala Ile Gln Ala Cys Ile His Tyr Pro Phe Gln Arg Ile
85 90 95
Ser Leu Leu Leu Leu Ser Gly Tyr Phe Tyr Val Thr Leu Ser Asn Lys
100 105 110
Pro Asn Pro Ser Leu Thr Trp Thr Phe Ala Leu Leu Gly Leu Ser His
115 120 125
Ala Leu Ser Phe Ile Leu Gly Leu Gln Asn Leu Thr Ser Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Glu Val Cys Glu Lys Arg His Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Lys Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln
165 170 175
Thr Arg Ile Gln Ile Tyr Asn Gln Phe Asn Lys Asp Val Leu Arg Ser
180 185 190
Pro Glu Gly His Arg Leu His Ile Leu Ile Pro Leu Asp Cys Ser Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Gln Ala Asp Pro Asn Ile Gln Phe Leu Gln Glu
210 215 220
Leu Pro Gln His Lys Leu Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Ile Tyr
225 230 235 240
Thr Asn Ser Ile Tyr Lys Ile Ser Glu Asp Gly Gln Pro Ala Glu Val
245 250 255
Cys Val Leu Glu Phe Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Asp Ala Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ala Arg Asp Cys Cys Arg Leu Val Val Tyr Gln Glu Pro Glu Asp Lys
305 310 315 320
Ala Val Ser Asn Phe Ser Leu Ser Lys Glu Ile Leu Arg His Leu Arg
325 330 335
Gln Glu Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr
340 345 350
Val Thr Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser
355 360 365
Gly Met Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375 380
<210> 350
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 袋獾 STING (tazSTING) C206Y
<400> 350
Met Pro Arg Ser His Leu His Pro Ser Ile Pro Gln Pro Arg Gly Trp
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Cys Val Leu Leu Ser Leu Cys Met Ala Ala
20 25 30
Val Tyr Ile Leu Gly Glu Ser Ala Ala Phe Thr Leu Gln Trp Leu Leu
35 40 45
Phe Tyr Phe Thr Thr Val Gln Val Gly Leu Leu Leu Lys Gly Ala Tyr
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Tyr His Ile Gln Ser Arg His Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Gln Ala Ile Gln Ala Cys Ile His Tyr Pro Phe Gln Arg Ile
85 90 95
Ser Leu Leu Leu Leu Ser Gly Tyr Phe Tyr Val Thr Leu Ser Asn Lys
100 105 110
Pro Asn Pro Ser Leu Thr Trp Thr Phe Ala Leu Leu Gly Leu Ser His
115 120 125
Ala Leu Ser Phe Ile Leu Gly Leu Gln Asn Leu Thr Ser Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Glu Val Cys Glu Lys Arg His Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Lys Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln
165 170 175
Thr Arg Ile Gln Ile Tyr Asn Gln Phe Asn Lys Asp Val Leu Arg Ser
180 185 190
Pro Glu Gly His Arg Leu His Ile Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Ser Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Gln Ala Asp Pro Asn Ile Gln Phe Leu Gln Glu
210 215 220
Leu Pro Gln His Lys Leu Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Ile Tyr
225 230 235 240
Thr Asn Ser Ile Tyr Lys Ile Ser Glu Asp Gly Gln Pro Ala Glu Val
245 250 255
Cys Val Leu Glu Phe Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Asp Ala Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ala Arg Asp Cys Cys Arg Leu Val Val Tyr Gln Glu Pro Glu Asp Lys
305 310 315 320
Ala Val Ser Asn Phe Ser Leu Ser Lys Glu Ile Leu Arg His Leu Arg
325 330 335
Gln Glu Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr
340 345 350
Val Thr Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser
355 360 365
Gly Met Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375 380
<210> 351
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 袋獾 STING (tazSTING) R284G
<400> 351
Met Pro Arg Ser His Leu His Pro Ser Ile Pro Gln Pro Arg Gly Trp
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Cys Val Leu Leu Ser Leu Cys Met Ala Ala
20 25 30
Val Tyr Ile Leu Gly Glu Ser Ala Ala Phe Thr Leu Gln Trp Leu Leu
35 40 45
Phe Tyr Phe Thr Thr Val Gln Val Gly Leu Leu Leu Lys Gly Ala Tyr
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Tyr His Ile Gln Ser Arg His Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Gln Ala Ile Gln Ala Cys Ile His Tyr Pro Phe Gln Arg Ile
85 90 95
Ser Leu Leu Leu Leu Ser Gly Tyr Phe Tyr Val Thr Leu Ser Asn Lys
100 105 110
Pro Asn Pro Ser Leu Thr Trp Thr Phe Ala Leu Leu Gly Leu Ser His
115 120 125
Ala Leu Ser Phe Ile Leu Gly Leu Gln Asn Leu Thr Ser Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Glu Val Cys Glu Lys Arg His Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Lys Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln
165 170 175
Thr Arg Ile Gln Ile Tyr Asn Gln Phe Asn Lys Asp Val Leu Arg Ser
180 185 190
Pro Glu Gly His Arg Leu His Ile Leu Ile Pro Leu Asp Cys Ser Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Gln Ala Asp Pro Asn Ile Gln Phe Leu Gln Glu
210 215 220
Leu Pro Gln His Lys Leu Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Ile Tyr
225 230 235 240
Thr Asn Ser Ile Tyr Lys Ile Ser Glu Asp Gly Gln Pro Ala Glu Val
245 250 255
Cys Val Leu Glu Phe Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Asp Ala Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Gly Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ala Arg Asp Cys Cys Arg Leu Val Val Tyr Gln Glu Pro Glu Asp Lys
305 310 315 320
Ala Val Ser Asn Phe Ser Leu Ser Lys Glu Ile Leu Arg His Leu Arg
325 330 335
Gln Glu Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr
340 345 350
Val Thr Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser
355 360 365
Gly Met Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375 380
<210> 352
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT 人STING-袋獾 CTT
<400> 352
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr Val Thr
340 345 350
Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375
<210> 353
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人STING C206Y-袋獾 CTT
<400> 353
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr Val Thr
340 345 350
Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375
<210> 354
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人STING R284G-袋獾 CTT
<400> 354
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Gly Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr Val Thr
340 345 350
Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375
<210> 355
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT 人STING delTRAF6结合基序
(移除C-端Asp-Phe-Ser)
<400> 355
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr
370 375
<210> 356
<211> 377
<212> PRT
<213> 家猫
<220>
<223> WT 猫 STING (catSTING)
<400> 356
Met Pro Arg Thr Gly Leu His Pro Ser Ile Pro Arg Pro Arg Gly Met
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ala Val Cys Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Trp Arg Leu Gly Glu Ser Pro Asp His Thr Leu Arg Trp Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Phe Thr Gly Val Cys
50 55 60
His Leu Thr Glu Glu Leu Cys His Leu His Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Ala Met Lys Ala Cys Leu Gly Ser Pro Val Arg Ser Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Cys Tyr Phe Tyr Ser Thr Leu Pro Ser Thr
100 105 110
Asp Leu Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Leu Leu Asp Leu Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Lys Lys Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Pro Ala
165 170 175
Arg Val Leu Thr Cys Asn Gln Leu His Asn Asn Ile Leu Arg Gly Thr
180 185 190
Gly Ser His Arg Leu His Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asp Met Ser Val Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Tyr Glu Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Ser Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Val Tyr Thr
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Ala Leu Leu Glu Asn Gly Gln Gln Ala Gly Ile Cys
245 250 255
Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Ile Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Thr Pro Glu Cys
290 295 300
Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Glu Glu Gly Ser
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Ser Gln Glu Ile Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Arg Glu Val Thr Val Gly Ser Val Gly Thr Ser Met Val Arg Asn Pro
340 345 350
Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Asn Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu Gln
355 360 365
Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Val Phe
370 375
<210> 357
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猫 STING C205Y
<400> 357
Met Pro Arg Thr Gly Leu His Pro Ser Ile Pro Arg Pro Arg Gly Met
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ala Val Cys Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Trp Arg Leu Gly Glu Ser Pro Asp His Thr Leu Arg Trp Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Phe Thr Gly Val Cys
50 55 60
His Leu Thr Glu Glu Leu Cys His Leu His Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Ala Met Lys Ala Cys Leu Gly Ser Pro Val Arg Ser Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Cys Tyr Phe Tyr Ser Thr Leu Pro Ser Thr
100 105 110
Asp Leu Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Leu Leu Asp Leu Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Lys Lys Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Pro Ala
165 170 175
Arg Val Leu Thr Cys Asn Gln Leu His Asn Asn Ile Leu Arg Gly Thr
180 185 190
Gly Ser His Arg Leu His Ile Leu Phe Pro Leu Asp Tyr Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asp Met Ser Val Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Tyr Glu Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Ser Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Val Tyr Thr
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Ala Leu Leu Glu Asn Gly Gln Gln Ala Gly Ile Cys
245 250 255
Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Ile Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Thr Pro Glu Cys
290 295 300
Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Glu Glu Gly Ser
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Ser Gln Glu Ile Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Arg Glu Val Thr Val Gly Ser Val Gly Thr Ser Met Val Arg Asn Pro
340 345 350
Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Asn Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu Gln
355 360 365
Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Val Phe
370 375
<210> 358
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猫 STING R283G
<400> 358
Met Pro Arg Thr Gly Leu His Pro Ser Ile Pro Arg Pro Arg Gly Met
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ala Val Cys Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Trp Arg Leu Gly Glu Ser Pro Asp His Thr Leu Arg Trp Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Phe Thr Gly Val Cys
50 55 60
His Leu Thr Glu Glu Leu Cys His Leu His Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Ala Met Lys Ala Cys Leu Gly Ser Pro Val Arg Ser Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Cys Tyr Phe Tyr Ser Thr Leu Pro Ser Thr
100 105 110
Asp Leu Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Leu Leu Asp Leu Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Lys Lys Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Pro Ala
165 170 175
Arg Val Leu Thr Cys Asn Gln Leu His Asn Asn Ile Leu Arg Gly Thr
180 185 190
Gly Ser His Arg Leu His Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asp Met Ser Val Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Tyr Glu Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Ser Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Val Tyr Thr
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Ala Leu Leu Glu Asn Gly Gln Gln Ala Gly Ile Cys
245 250 255
Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Gly Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Ile Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Thr Pro Glu Cys
290 295 300
Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Glu Glu Gly Ser
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Ser Gln Glu Ile Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Arg Glu Val Thr Val Gly Ser Val Gly Thr Ser Met Val Arg Asn Pro
340 345 350
Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Asn Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu Gln
355 360 365
Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Val Phe
370 375
<210> 359
<211> 377
<212> PRT
<213> 普通狨
<220>
<223> WT 狨猴 STING
<400> 359
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro His Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Glu Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Val Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Trp Leu Arg Glu Ala Pro Glu Asp Ile Leu Arg Phe Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Arg Leu Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Val His Thr Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile Arg Leu Gly
85 90 95
Ala Gln Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Cys Phe Leu Pro Asn Gly
100 105 110
Arg Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Phe Ser Gln Ala Leu
115 120 125
Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ser Ala
130 135 140
Val Cys Glu Lys Arg Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser
145 150 155 160
Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Phe Gln Ala Arg
165 170 175
Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Asn Asn Asn Val Leu Arg Gly Pro Ala
180 185 190
Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp
195 200 205
Asn Leu Ser Thr Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro
210 215 220
Gln Glu Thr Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Val Tyr Thr Asn
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Ala Cys Val
245 250 255
Leu Glu Tyr Ala Ser Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr
260 265 270
Gly Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu
275 280 285
Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln
290 295 300
Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Glu Glu Pro Ala Asp Gly Ser Ser
305 310 315 320
Phe Leu Leu Ser Gln Glu Val Leu Gln His Leu Arg Gln Glu Glu Glu
325 330 335
Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Glu Val Pro Ser Thr
340 345 350
Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu Lys
355 360 365
Pro Leu Pro Leu Arg Ser Asp Leu Phe
370 375
<210> 360
<211> 378
<212> PRT
<213> 普通牛
<220>
<223> WT 牛 STING
<400> 360
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Gln Pro Arg Gly Leu
1 5 10 15
Arg Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Ala
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Asp Tyr Thr Leu Lys Trp Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Gln Gln Met Gly Leu Leu Ile Lys Gly Ile Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val His Ser Arg Tyr His Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Ala Val Arg Ala Cys Leu Cys Ser Ser Met Arg Cys Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Cys Tyr Phe Tyr Cys Ser Leu Pro Asn Met
100 105 110
Ala Asp Leu Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Val
130 135 140
Ser Ala Ile Cys Glu Lys Arg Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Pro
165 170 175
Ala Arg Ile Gln Ile Tyr Asn Gln Phe His Asn Asn Thr Leu Gln Gly
180 185 190
Ala Gly Ser His Arg Leu His Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asp Leu Asn Val Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu His Glu
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Ser Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Val Tyr
225 230 235 240
Thr Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Val
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asn Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Ala Glu Gly
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Ile Leu Gln His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Arg Glu Val Thr Met Gly Ser Thr Glu Thr Ser Val Met Pro Gly
340 345 350
Ser Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Leu Glu
355 360 365
Lys Pro Leu Pro Leu Arg Ser Asp Val Phe
370 375
<210> 361
<211> 375
<212> PRT
<213> 非洲鸵鸟南非亚种
<220>
<223> WT 鸵鸟 STING
<400> 361
Met Ala His Glu Ser Gly Thr Pro Ser Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ile
1 5 10 15
Pro Lys Ala Arg Glu Gly Arg Ala Gln His Ala Ala Tyr Val Leu Leu
20 25 30
Ala Leu Cys Ala Ala Ala Leu Tyr Leu Ala Gly Glu Pro Val Val His
35 40 45
Ile Ala Arg Ser Phe Thr Ser His Phe Val Ala Leu Gln Ile Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Lys Gly Ile Cys Tyr Leu Val Glu Glu Ile Phe His Leu Glu
65 70 75 80
Thr Arg His Arg Gly Ser Phe Arg Arg Ala Leu Ser Ala Cys Leu His
85 90 95
Leu Arg Trp His Val Thr Leu Leu Leu Val Cys Gly Ser Ala Tyr Val
100 105 110
Ala Leu Leu Asp Gly Asp Glu Gln Pro Leu Gly Leu His Leu Gly Leu
115 120 125
Ala Cys Leu Cys Gln Leu Leu Ile Leu Ala Leu Gly Leu His Lys Pro
130 135 140
Ser Ala Val Glu Ile Ser Glu Met Ser Glu Arg Ser Lys Gln Asn Val
145 150 155 160
Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Lys Ile Val
165 170 175
Leu Pro Arg Leu Lys Glu Ser Met Glu Asn Ile Gly Arg Thr Asn Pro
180 185 190
Asn Met Leu Ala His Lys Glu Thr Trp Lys Leu His Ile Leu Val Pro
195 200 205
Leu Ser Cys Asn Ile Cys Asp Asp Leu Glu Lys Ala Asp Ser Asn Ile
210 215 220
Gln Tyr Ala Met Asp Leu Pro Glu Thr Thr Leu Thr Arg Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Lys Arg Val Tyr Arg Asn Thr Leu Tyr Lys Ile Lys Asp Glu Asp
245 250 255
Lys Phe Arg Phe Cys Val Val Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Ser Leu
260 265 270
Tyr Ala Met Ser Gln Asp Glu Cys Ala Ala Phe Ser Arg Glu Asp Arg
275 280 285
Ile Glu Gln Ala Lys Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Gln
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Cys Ala Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Val Tyr Glu Glu
305 310 315 320
Ser Gly Glu Ala Glu Thr His Phe Leu Ser Arg Glu Ile Leu Arg His
325 330 335
Leu Gln Gln Gln Arg Gln Glu Glu Tyr Thr Val Cys Asp Gly Thr Leu
340 345 350
Cys Ser Thr Asp Leu Ser Leu Gln Ile Ser Glu Ser Asp Leu Pro Gln
355 360 365
Pro Leu Arg Ser Asp Cys Leu
370 375
<210> 362
<211> 382
<212> PRT
<213> 朱鹮
<220>
<223> WT 朱鹮 STING
<400> 362
Met Ser Gln Glu Pro Gln Trp Leu Ser His Pro Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Pro Lys Ala Arg Gly Gly Arg Ala Gln His Ala Val Tyr Leu Leu Leu
20 25 30
Ala Leu Cys Ala Ala Val Leu Tyr Leu Ala Gly Glu Pro Leu Val Pro
35 40 45
Ser Ala Arg Ser Leu Ile Ser His Phe Met Ala Leu Gln Ile Gly Val
50 55 60
Leu Leu Lys Gly Thr Cys Tyr Leu Ala Glu Glu Ile Phe His Leu Gln
65 70 75 80
Ser Arg His His Gly Ser Phe Trp Arg Ala Leu Ser Ala Cys Phe Pro
85 90 95
Leu Arg Trp His Gly Leu Met Leu Leu Val Cys Gly Ser Ala Tyr Val
100 105 110
Ala Leu Leu Glu Asp Gly Gln Pro Leu Gly Leu His Leu Gly Leu Ala
115 120 125
Ser Leu Cys Gln Leu Leu Ile Leu Ala Leu Gly Leu His Lys Pro Ser
130 135 140
Ala Val Glu Met Ser Glu Met Ser Glu Arg Ser Lys Gln Asn Val Ala
145 150 155 160
His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Lys Ile Val Leu
165 170 175
Pro Arg Val Lys Lys Ser Met Glu Glu Phe Ser Arg Ala Asn Pro Asn
180 185 190
Val Leu Ala Arg Arg Glu Thr Trp Lys Leu His Ile Leu Val Pro Leu
195 200 205
Ser Cys Asp Val Tyr Asp Asp Leu Glu Lys Ala Asp Ser Asn Ile Gln
210 215 220
Tyr Leu Met Asp Leu Pro Glu Thr Thr Leu Thr Arg Ala Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Arg Val Tyr Lys His Ser Leu Tyr Thr Ile Arg Asp Glu Gly Asn
245 250 255
Lys Leu Trp His Cys Ala Val Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Ser Leu
260 265 270
Tyr Ala Met Ser Gln Asp Glu Tyr Ala Ala Phe Ser Arg Glu Asp Arg
275 280 285
Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Lys
290 295 300
Gly Ser Lys Glu Cys Ala Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Val Tyr Glu Glu
305 310 315 320
Ser Gly Glu Ala Glu Thr His Ser Leu Ser Arg Asp Ile Leu Trp His
325 330 335
Leu Arg Gln Gln Cys His Glu Glu Tyr Thr Val Tyr Glu Gly Asn Gln
340 345 350
Pro His Asn Pro Ser Thr Thr Leu His Ser Thr Glu Leu Asn Leu Gln
355 360 365
Ile Ser Glu Ser Asp Leu Pro Gln Pro Leu Arg Ser Asp Cys
370 375 380
<210> 363
<211> 380
<212> PRT
<213> 腔棘鱼
<220>
<223> WT 腔棘鱼 STING
(UniProtKB 条目 H3A3G4)
<400> 363
Phe Gly Leu Gln Asn Met Ser Ala Ile Ile Pro Gln Pro Arg Gly Asn
1 5 10 15
Arg Ala Asn Gln Met Ala Tyr Phe Ile Ile Thr Val Ile Leu Met Leu
20 25 30
Leu Trp Ile Phe Arg Asn Ile Met Asp Asn Val Leu Glu Val Ile Ala
35 40 45
Leu His Ile Leu Leu Leu Gln Gly Ala Ala Ile Met Lys Gly Ile Cys
50 55 60
Asn Phe Ala Glu Glu Val Asn His Val Gln Pro Arg Tyr Gly Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Lys Ala Leu Glu Ala Cys Leu Asn Leu Ser Lys Tyr Asp Val
85 90 95
Met Lys Ile Val Phe Ala Gly Val Leu Trp Trp His Phe Ser Ser Ser
100 105 110
Leu Phe Val Val Trp Phe Leu His Leu Leu Val Ser Cys Leu Cys His
115 120 125
Leu Leu Asn Asn Val Leu Gly Val Leu Lys Pro Ser Pro Val Glu Val
130 135 140
Ser Glu Ile Tyr Glu Arg Asn Arg Ile Gly Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Leu Gly Tyr Leu Lys Leu Val Leu Pro Glu Leu Glu
165 170 175
Asp Arg Ile Lys Ser Tyr Asn Val Ser His Gly Asn Leu Leu Lys His
180 185 190
Lys Glu Thr Trp Arg Leu His Ile Leu Leu Pro Leu Ser Cys Ser Ile
195 200 205
Phe Asp Asn Leu Ala Asp Val Asp Ser Asn Ile Glu Phe Leu Asp Asn
210 215 220
Leu Ser Glu Leu Gln Ile Asn Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Ser Tyr
225 230 235 240
Lys His Ser Leu Tyr Gln Val Leu Asp Glu Asp Lys Arg Pro His Tyr
245 250 255
Cys Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Lys Ser Leu Leu Glu Met Ser
260 265 270
Lys Glu Ala Ser Ala Glu Phe Thr Lys Glu Asp Arg Leu Glu Gln Thr
275 280 285
Lys Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asp Asn Ser Gln Glu
290 295 300
Cys Arg Gly Arg Phe Arg Leu Val Ile Tyr Asp Gly Arg Glu Asp Ser
305 310 315 320
Gly Lys Ser His Phe Leu Ser Lys Glu Leu Leu Arg His Leu Asn Gln
325 330 335
Gln Gln Lys Glu Glu Tyr Phe Met Ser Glu Gln Thr Gln Pro Asn Ser
340 345 350
Ser Ser Thr Ser Cys Leu Ser Thr Glu Pro Gln Leu Met Ile Ser Asp
355 360 365
Thr Asp Ala Pro His Thr Leu Lys Arg Gln Val Cys
370 375 380
<210> 364
<211> 405
<212> PRT
<213> 腔棘鱼
<220>
<223> WT 腔棘鱼 STING
(同种型X1; NCBI 登录号 XP_005989369.1)
<400> 364
Met Cys Phe Ile Gln Val Leu Asp Ile Thr Ile Ile Thr Gln Met Leu
1 5 10 15
Gln Gly Glu Tyr Phe Gly Leu Gln Asn Met Ser Ala Ile Ile Pro Gln
20 25 30
Pro Arg Gly Asn Arg Ala Asn Gln Met Ala Tyr Phe Ile Ile Thr Val
35 40 45
Ile Leu Met Leu Leu Trp Ile Phe Arg Asn Ile Met Asp Asn Val Leu
50 55 60
Glu Val Ile Ala Leu His Ile Leu Leu Leu Gln Gly Ala Ala Ile Met
65 70 75 80
Lys Gly Ile Cys Asn Phe Ala Glu Glu Val Asn His Val Gln Pro Arg
85 90 95
Tyr Gly Gly Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Glu Ala Cys Leu Asn Leu Ser
100 105 110
Lys Tyr Asp Val Met Lys Ile Val Phe Ala Gly Val Leu Trp Trp His
115 120 125
Phe Ser Ser Ser Leu Phe Val Val Trp Phe Leu His Leu Leu Val Ser
130 135 140
Cys Leu Cys His Leu Leu Asn Asn Val Leu Gly Val Leu Lys Pro Ser
145 150 155 160
Pro Val Glu Val Ser Glu Ile Tyr Glu Arg Asn Arg Ile Gly Val Ala
165 170 175
His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Leu Gly Tyr Leu Lys Leu Val Leu
180 185 190
Pro Glu Leu Glu Asp Arg Ile Lys Ser Tyr Asn Val Ser His Gly Asn
195 200 205
Leu Leu Lys His Lys Glu Thr Trp Arg Leu His Ile Leu Leu Pro Leu
210 215 220
Ser Cys Ser Ile Phe Asp Asn Leu Ala Asp Val Asp Ser Asn Ile Glu
225 230 235 240
Phe Leu Asp Asn Leu Ser Glu Leu Gln Ile Asn Arg Ala Gly Ile Lys
245 250 255
Gly Arg Ser Tyr Lys His Ser Leu Tyr Gln Val Leu Asp Glu Asp Lys
260 265 270
Arg Pro His Tyr Cys Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Lys Ser Leu
275 280 285
Leu Glu Met Ser Lys Glu Ala Ser Ala Glu Phe Thr Lys Glu Asp Arg
290 295 300
Leu Glu Gln Thr Lys Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asp
305 310 315 320
Asn Ser Gln Glu Cys Arg Gly Arg Phe Arg Leu Val Ile Tyr Asp Asp
325 330 335
Cys Gln Asp Val Leu Asp Gly Glu Asp Ser Gly Lys Ser His Phe Leu
340 345 350
Ser Lys Glu Leu Leu Arg His Leu Asn Gln Gln Gln Lys Glu Glu Tyr
355 360 365
Phe Met Ser Glu Gln Thr Gln Pro Asn Ser Ser Ser Thr Ser Cys Leu
370 375 380
Ser Thr Glu Pro Gln Leu Met Ile Ser Asp Thr Asp Ala Pro His Thr
385 390 395 400
Leu Lys Ser Gly Phe
405
<210> 365
<211> 378
<212> PRT
<213> 野猪
<220>
<223> WT 野猪 STING
<400> 365
Met Pro Tyr Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Gln Pro Arg Gly Leu
1 5 10 15
Arg Ala Gln Val Ala Ala Leu Val Leu Leu Gly Ala Cys Leu Val Ala
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Leu Pro Glu Tyr Thr Leu Arg Trp Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Gln Gln Ile Gly Leu Leu Val Lys Gly Leu Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val His Ser Arg Tyr Gln Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Ala Ala Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile Arg Cys Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Cys Tyr Phe Tyr Phe Ser Ile Arg Asp Lys
100 105 110
Ala Gly Leu Pro Leu Pro Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Gln His Leu Ala Pro Ala Glu Val
130 135 140
Ser Ala Ile Cys Glu Lys Arg Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Arg
165 170 175
Ala Arg Ile Gln Ala Tyr Asn Gln Arg His Lys Asn Val Leu Gly Gly
180 185 190
Ile Gly Asn His Arg Leu His Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asp Leu Ser Val Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu His Glu
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Ser Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Gly Arg Val Tyr
225 230 235 240
Thr Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val
245 250 255
Cys Val Leu Gly Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ala Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Glu Gly
305 310 315 320
Gly Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Ile Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Arg Glu Val Thr Met Gly Ser Ala Glu Thr Ser Val Val Pro Thr
340 345 350
Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu
355 360 365
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Ser Asp Ile Phe
370 375
<210> 366
<211> 380
<212> PRT
<213> 北非果蝠
<220>
<223> WT 蝙蝠 STING
<400> 366
Met Ser His Ser Ser Leu His Pro Ser Val Pro Arg Pro Arg Gly Arg
1 5 10 15
Arg Ala Arg Asn Ile Ala Ala Phe Val Leu Leu Ile Val Cys Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Trp Leu Ser Gly Lys Pro Ser Glu Tyr Thr Leu Arg Cys Leu
35 40 45
Val Leu His Leu Ala Ser Gln Gln Leu Gly Leu Leu Ser Asn Arg Val
50 55 60
Cys Tyr Leu Ala Glu Glu Leu Ser His Ile His Ser Arg Tyr Gln Gly
65 70 75 80
Asn Tyr Trp Arg Ala Val Arg Ala Cys Leu Ser Cys Pro Ile Arg Phe
85 90 95
Gly Val Val Leu Leu Val Ser Phe Phe Phe Tyr Thr Ser Leu Pro Asn
100 105 110
Ile Asp Asp Leu Pro Leu Thr Trp Met Leu Ala His Leu Gly Leu Ser
115 120 125
Glu Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Arg Gly Leu Thr Pro Ala Glu
130 135 140
Val Ser Thr Val Cys Glu Gln Arg His Phe Asn Val Ala His Gly Leu
145 150 155 160
Ala Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu
165 170 175
Arg Ala Arg Ile His Thr Tyr Asn Gln Leu His Gly Asn Thr Leu Gln
180 185 190
Gly Val Gly Ser His Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly
195 200 205
Val Leu Asp Asp Leu Ser Ala Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Arg
210 215 220
Glu Leu Pro Arg Gln Ser Ser Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val
225 230 235 240
Tyr Thr Asn Ser Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Gly Lys Pro Val Gly
245 250 255
Thr Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met
260 265 270
Ser Gln Asp Ala Arg Ala Gly Phe Ser Gln Glu Asp Arg Leu Glu Gln
275 280 285
Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Ala Asp Ile Leu Ala Asp Asp Pro
290 295 300
Glu Ser Gln Lys Ser Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Glu
305 310 315 320
Glu Ser Asp Phe Ser Leu Ser Gln Ala Ile Leu Lys His Leu Arg Gln
325 330 335
Glu Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Thr Val Gly Thr Tyr Glu Ala
340 345 350
Pro Gly Ser Ser Thr Leu His Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly
355 360 365
Met Asp Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Ile Phe
370 375 380
<210> 367
<211> 387
<212> PRT
<213> 佛罗里达海牛
<220>
<223> WT 海牛 STING
<400> 367
Met Val Glu Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Arg His
1 5 10 15
Arg Gly His Gly Ile Gln Lys Ala Ala Phe Val Leu Leu Val Ala Cys
20 25 30
Leu Val Ala Leu Trp Glu Leu Gly Glu Pro Pro Gly His Thr Leu Gln
35 40 45
Trp Leu Val Cys Gln Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Lys
50 55 60
Val Ile Cys Ser Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val His Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Gln Ser Ser Tyr Trp Arg Ala Val Arg Ala Cys Met Gly Cys Pro Ile
85 90 95
Arg Arg Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Cys Tyr Phe Tyr Phe Cys Phe
100 105 110
Pro Asn Met Ala Asp Leu Pro Leu Thr Trp Thr Leu Ala Leu Leu Gly
115 120 125
Leu Leu Gln Ala Met Asn Ile Leu Leu Ser Leu Gln Gly Leu Thr Pro
130 135 140
Ala Glu Ile Ser Ala Ile Cys Glu Lys Arg Asn Leu Asn Val Ala His
145 150 155 160
Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro
165 170 175
Gly Leu Gln Asp Arg Ile Arg Ile Tyr Asn Leu Gln His Asn Asn Met
180 185 190
Leu Arg Gly Thr Gly Ser Gln Arg Leu His Ile Leu Phe Pro Leu Asp
195 200 205
Cys Gly Val Pro Asn Asp Leu Ser Val Ala Asp Ala Asn Ile Arg Phe
210 215 220
Leu Gln Lys Leu Pro Gln Gln Ser Ala Asp Cys Ala Gly Ile Lys Gly
225 230 235 240
Arg Val Tyr Thr Asn Ser Val Tyr Gln Leu Leu Glu His Gly Gln Pro
245 250 255
Ala Gly Ile Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe
260 265 270
Ala Met Ser Gln Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu
275 280 285
Glu Gln Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp
290 295 300
Ala Pro Glu Tyr Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Ser
305 310 315 320
Ala Glu Gly Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Ile Leu Arg His Leu
325 330 335
Arg Gln Glu Glu Arg Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Val Gly Thr Ser
340 345 350
Val Val Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ser Thr Ser Ser Leu Ser Gln Glu
355 360 365
Pro Lys Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr
370 375 380
Asp Val Phe
385
<210> 368
<211> 378
<212> PRT
<213> 米氏叶吻银鲛
<220>
<223> WT 鬼鲨 STING
<400> 368
Met Ser Asp Ser Ile Pro Arg Pro Arg Gly Lys Val Ala Thr Tyr Val
1 5 10 15
Gly Leu Ile Leu Met Ser Gly Leu Ala Cys Leu Tyr Phe Met Leu Thr
20 25 30
Pro Asp Tyr His Ile Lys Phe Ile Val Gln Gln Val Ala Gln Gln Leu
35 40 45
Ile Val Ser Phe Phe Ala Leu Cys Leu Leu Arg Leu Cys Glu Phe Val
50 55 60
Glu Glu Leu Gly His Lys Gln Thr Arg Tyr Gln Asn Ser Trp Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Asn Ala Ser Leu Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Leu Leu
85 90 95
Ile Ser Leu Leu Phe Asn Trp Val Leu Pro Tyr Glu Lys His Met Ser
100 105 110
Tyr Ala Val Pro Thr Val Gly Gln Thr Ile Ser Leu Thr Cys Phe Cys
115 120 125
Val Leu Phe Leu Lys Val Phe Gln Leu Asp Val Leu Ser Pro Ala Gln
130 135 140
Ile Ser Glu Ile Ser Glu Thr Asn Lys Cys Asn Val Ala His Gly Leu
145 150 155 160
Ala Trp Ser Tyr Tyr Leu Gly Tyr Leu Lys Ile Val Leu Pro Lys Leu
165 170 175
Glu Glu Lys Ile Asn Gln Tyr His Arg Glu Tyr Gly Asn Val Leu Gln
180 185 190
Gln Lys Gly Lys Lys Leu Tyr Ile Leu Ile Pro Phe Ser Cys Lys Val
195 200 205
Leu Asp Lys Leu Glu Lys Val Asp Thr Asn Ile Val Phe Tyr Gln Asn
210 215 220
Leu Pro Glu Leu Leu Val Asp Arg Ala Gly Ile Lys Ser Arg Ser Tyr
225 230 235 240
Lys His Ser Ile Tyr Leu Ile Tyr Asp Gln Lys Lys Gln Gln Pro His
245 250 255
His Cys Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Arg Ser Leu Phe Glu Met
260 265 270
Thr Asn Asp Ser Ala Ala Ala Phe Ser Lys Glu Gln Arg Leu Asp Gln
275 280 285
Ala Lys Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Lys Ser Ile Leu Asn Asn Val Pro
290 295 300
Glu Val Thr Gly Ser Tyr Arg Leu Ile Pro Tyr Asp Asp Asp Leu Glu
305 310 315 320
Gly Ala Glu Leu Gly Pro His Phe Val Ser Glu Glu Ile Leu Lys His
325 330 335
Met Arg Gln Glu Leu Thr Glu Tyr Pro Val Ala Glu Pro Ser Asn Ala
340 345 350
Asn Glu Thr Asp Cys Met Ser Ser Glu Pro His Leu Met Ile Ser Asp
355 360 365
Asp Pro Lys Pro Leu Arg Ser Tyr Cys Pro
370 375
<210> 369
<211> 378
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> WT 小鼠 STING
<400> 369
Met Pro Tyr Ser Asn Leu His Pro Ala Ile Pro Arg Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Arg Ser Lys Tyr Val Ala Leu Ile Phe Leu Val Ala Ser Leu Met Ile
20 25 30
Leu Trp Val Ala Lys Asp Pro Pro Asn His Thr Leu Lys Tyr Leu Ala
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser His Glu Leu Gly Leu Leu Leu Lys Asn Leu Cys
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Lys Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile His Cys Met
85 90 95
Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Phe Leu Gln Asn Thr Ala
100 105 110
Asp Ile Tyr Leu Ser Trp Met Phe Gly Leu Leu Val Leu Tyr Lys Ser
115 120 125
Leu Ser Met Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala
165 170 175
Arg Ile Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala
180 185 190
Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asn Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys
245 250 255
Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Ala Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser
290 295 300
Arg Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn
305 310 315 320
Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro Pro
340 345 350
Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met Asp
355 360 365
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile
370 375
<210> 370
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人STING C-端尾区 (CTT)
<400> 370
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
20 25 30
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
35 40
<210> 371
<211> 43
<212> PRT
<213> 袋獾
<220>
<223> 袋獾 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 371
Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr Val Thr
1 5 10 15
Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gly Met
20 25 30
Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
35 40
<210> 372
<211> 43
<212> PRT
<213> 普通狨
<220>
<223> 狨猴 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 372
Glu Glu Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Glu Val Pro
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
20 25 30
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Ser Asp Leu Phe
35 40
<210> 373
<211> 42
<212> PRT
<213> 普通牛
<220>
<223> 牛 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 373
Glu Arg Glu Val Thr Met Gly Ser Thr Glu Thr Ser Val Met Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Leu Glu
20 25 30
Lys Pro Leu Pro Leu Arg Ser Asp Val Phe
35 40
<210> 374
<211> 42
<212> PRT
<213> 家猫
<220>
<223> 猫 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 374
Glu Arg Glu Val Thr Val Gly Ser Val Gly Thr Ser Met Val Arg Asn
1 5 10 15
Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Asn Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu
20 25 30
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Val Phe
35 40
<210> 375
<211> 35
<212> PRT
<213> 非洲鸵鸟南非亚种
<220>
<223> 鸵鸟 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 375
Arg Gln Glu Glu Tyr Thr Val Cys Asp Gly Thr Leu Cys Ser Thr Asp
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gln Ile Ser Glu Ser Asp Leu Pro Gln Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Asp Cys Leu
35
<210> 376
<211> 42
<212> PRT
<213> 野猪
<220>
<223> 野猪 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 376
Glu Arg Glu Val Thr Met Gly Ser Ala Glu Thr Ser Val Val Pro Thr
1 5 10 15
Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met Glu
20 25 30
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Ser Asp Ile Phe
35 40
<210> 377
<211> 43
<212> PRT
<213> 北非果蝠
<220>
<223> 蝙蝠 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 377
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Thr Val Gly Thr Tyr Glu Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Thr Leu His Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
20 25 30
Asp Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Ile Phe
35 40
<210> 378
<211> 48
<212> PRT
<213> 佛罗里达海牛
<220>
<223> 海牛 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 378
Glu Arg Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Val Gly Thr Ser Val Val Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser Pro Ser Thr Ser Ser Leu Ser Gln Glu Pro Lys Leu
20 25 30
Leu Ile Ser Gly Met Glu Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Val Phe
35 40 45
<210> 379
<211> 43
<212> PRT
<213> 朱鹮
<220>
<223> 朱鹮 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 379
Cys His Glu Glu Tyr Thr Val Tyr Glu Gly Asn Gln Pro His Asn Pro
1 5 10 15
Ser Thr Thr Leu His Ser Thr Glu Leu Asn Leu Gln Ile Ser Glu Ser
20 25 30
Asp Leu Pro Gln Pro Leu Arg Ser Asp Cys Phe
35 40
<210> 380
<211> 43
<212> PRT
<213> 腔棘鱼
<220>
<223> 腔棘鱼 STING (SEQ ID NO:345) C-端尾区(CTT)
<400> 380
Gln Lys Glu Glu Tyr Phe Met Ser Glu Gln Thr Gln Pro Asn Ser Ser
1 5 10 15
Ser Thr Ser Cys Leu Ser Thr Glu Pro Gln Leu Met Ile Ser Asp Thr
20 25 30
Asp Ala Pro His Thr Leu Lys Arg Gln Val Cys
35 40
<210> 381
<211> 42
<212> PRT
<213> 腔棘鱼
<220>
<223> 腔棘鱼 STING (SEQ ID NO:346) C-端尾区(CTT)
<400> 381
Gln Lys Glu Glu Tyr Phe Met Ser Glu Gln Thr Gln Pro Asn Ser Ser
1 5 10 15
Ser Thr Ser Cys Leu Ser Thr Glu Pro Gln Leu Met Ile Ser Asp Thr
20 25 30
Asp Ala Pro His Thr Leu Lys Ser Gly Phe
35 40
<210> 382
<211> 71
<212> PRT
<213> 斑马鱼
<220>
<223> 斑马鱼 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 382
Asp Gly Glu Ile Phe Met Asp Pro Thr Asn Glu Val His Pro Val Pro
1 5 10 15
Glu Glu Gly Pro Val Gly Asn Cys Asn Gly Ala Leu Gln Ala Thr Phe
20 25 30
His Glu Glu Pro Met Ser Asp Glu Pro Thr Leu Met Phe Ser Arg Pro
35 40 45
Gln Ser Leu Arg Ser Glu Pro Val Glu Thr Thr Asp Tyr Phe Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Ala Met Lys Gln Asn
65 70
<210> 383
<211> 38
<212> PRT
<213> 米氏叶吻银鲛
<220>
<223> 鬼鲨 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 383
Leu Thr Glu Tyr Pro Val Ala Glu Pro Ser Asn Ala Asn Glu Thr Asp
1 5 10 15
Cys Met Ser Ser Glu Pro His Leu Met Ile Ser Asp Asp Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Arg Ser Tyr Cys Pro
35
<210> 384
<211> 43
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小鼠 STING C-端尾区 (CTT)
<400> 384
Glu Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met
20 25 30
Asp Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile
35 40
<210> 385
<211> 78
<212> PRT
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> LppA (菌株 LT2/ ATCC 700720)
<400> 385
Met Asn Arg Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser Ser
20 25 30
Asp Val Gln Thr Leu Asn Ala Lys Val Asp Gln Leu Ser Asn Asp Val
35 40 45
Asn Ala Met Arg Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala Arg
50 55 60
Ala Asn Gln Arg Leu Asp Asn Gln Ala Thr Lys Tyr Arg Lys
65 70 75
<210> 386
<211> 79
<212> PRT
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> LppB (菌株 LT2/ ATCC 700720)
<400> 386
Met Asn Arg Thr Asn Gln Leu Ile Leu Gly Ala Val Val Leu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser
20 25 30
Ser Asp Val Gln Thr Leu Ser Ala Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Asp
35 40 45
Val Asn Ala Met Arg Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala
50 55 60
Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asp Asn Lys Val Phe Arg Ile Cys Lys
65 70 75
<210> 387
<211> 237
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> lppA
<400> 387
ttacttacgg tatttagtag cctggttgtc cagacgctgg ttagcgcgag ctgcgtcgtc 60
tttagcagcc tgaacgtcgg aacgcattgc gttcacgtcg ttgctcagct ggtcaacttt 120
agcgttcaga gtctgaacgt cagaagacag ctgatcgatt ttagcgttgc tggagcaacc 180
agccagcaga gtagaaccca ggattaccgc gcccagtacc agtttagtac gattcat 237
<210> 388
<211> 240
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
<223> lppB
<400> 388
ttatttacag atgcggaata ctttgttgtc cagacgttgg ttcgcgcgag cagcatcgtc 60
tttagcagcc tgaacgtcgg aacgcattgc atttacgtca ttactcagtt gctcaacttt 120
agcgctcagc gtctgtacat cggaagacaa ctgatcgatt ttagcgttgc ttgaacaacc 180
tgccagtaac gtggaaccca gaactactgc acctaagatc agctggttag tacggttcat 240
<210> 389
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人4-1BBL, 全长
<220>
<221> 结构域
<222> (1)...(28)
<223> 胞质结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (29)...(49)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (50)...(254)
<223> 胞外结构域
<400> 389
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 390
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BBL，缺失胞质结构域
<400> 390
Met Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg
20 25 30
Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu
35 40 45
Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu
65 70 75 80
Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly
85 90 95
Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly
115 120 125
Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg
130 135 140
Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu
165 170 175
Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu
180 185 190
Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu
195 200 205
Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro
210 215 220
Arg Ser Glu
225
<210> 391
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BBL，胞质结构域截短
<400> 391
Met Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg
35 40 45
Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
50 55 60
Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
100 105 110
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
115 120 125
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
130 135 140
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
145 150 155 160
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
165 170 175
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
180 185 190
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
195 200 205
Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly
210 215 220
Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
225 230
<210> 392
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BBL，胞质结构域截短和具有Myc标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)...(11)
<223> Myc 标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)...(15)
<223> 截短的胞质结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (16)...(36)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (37)...(241)
<223> 胞外结构域
<400> 392
Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Val Leu Pro Trp
1 5 10 15
Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys
20 25 30
Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser
35 40 45
Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
50 55 60
Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala
65 70 75 80
Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp
85 90 95
Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser
100 105 110
Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr
115 120 125
Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
145 150 155 160
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
165 170 175
Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
180 185 190
Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
195 200 205
Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
210 215 220
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
225 230 235 240
Glu
<210> 393
<211> 309
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小鼠 4-1BBL, 全长
<220>
<221> 结构域
<222> (1)...(82)
<223> 胞质结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (83)...(103)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (104)...(309)
<223> 胞外结构域
<400> 393
Met Asp Gln His Thr Leu Asp Val Glu Asp Thr Ala Asp Ala Arg His
1 5 10 15
Pro Ala Gly Thr Ser Cys Pro Ser Asp Ala Ala Leu Leu Arg Asp Thr
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Arg Pro Thr
35 40 45
Asn Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Val Asn Val Arg
50 55 60
Asp Arg Glu Ala Ala Trp Pro Pro Ala Leu Asn Phe Cys Ser Arg His
65 70 75 80
Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala
85 90 95
Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr
100 105 110
Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln
115 120 125
Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys
145 150 155 160
Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val
180 185 190
Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro
195 200 205
Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val
210 215 220
Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr
225 230 235 240
Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly
260 265 270
Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu
275 280 285
Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro
290 295 300
Asp Asn Pro Trp Glu
305
<210> 394
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 4-1BBL，缺失胞质结构域
<400> 394
Met Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala Ala
1 5 10 15
Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile
20 25 30
Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val
35 40 45
Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser
50 55 60
Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn
65 70 75 80
Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu
85 90 95
Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp
100 105 110
Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr
115 120 125
Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu
130 135 140
Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val
145 150 155 160
Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp
165 170 175
Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu
180 185 190
Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu
195 200 205
Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp
210 215 220
Asn Pro Trp Glu
225
<210> 395
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 4-1BBL，胞质结构域截短
<400> 395
Met Ser Arg His Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ile Ala Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg
20 25 30
Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr
50 55 60
Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln
65 70 75 80
Ala Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala
85 90 95
Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu
115 120 125
Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp
130 135 140
Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn
145 150 155 160
Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu
165 170 175
Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg
180 185 190
Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr
195 200 205
Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe
210 215 220
Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu
225 230
<210> 396
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 4-1BBL，胞质结构域截短并具有Myc标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)...(11)
<223> Myc 标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)...(16)
<223> 截短的胞质结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (17)...(37)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> 结构域
<222> (38)...(243)
<223> 胞外结构域
<400> 396
Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Arg His Pro Lys
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala Ala Cys
20 25 30
Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr
35 40 45
Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr
50 55 60
Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro
65 70 75 80
Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Thr
85 90 95
Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser
115 120 125
Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe
130 135 140
Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln
145 150 155 160
Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu
165 170 175
Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser
180 185 190
Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg
195 200 205
Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser
210 215 220
Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn
225 230 235 240
Pro Trp Glu
<210> 397
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huSTING N154S/R284G tazCTT
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(336)
<223> huSTING (R232 等位基因)，具有N154S/R284G修饰，无人STING CTT
<220>
<221> misc_feature
<222> (337)...(379)
<223> 袋獾 STING CTT
<400> 397
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Ser Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Gly Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Arg Gln Glu Glu Phe Ala Ile Gly Pro Lys Arg Ala Met Thr Val Thr
340 345 350
Thr Ser Ser Thr Leu Ser Gln Glu Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Thr Asp Gly Phe
370 375
<210> 398
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huSTING N154S/R284G
<400> 398
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Ser Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Gly Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 399
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muSTING C205Y
<400> 399
Met Pro Tyr Ser Asn Leu His Pro Ala Ile Pro Arg Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Arg Ser Lys Tyr Val Ala Leu Ile Phe Leu Val Ala Ser Leu Met Ile
20 25 30
Leu Trp Val Ala Lys Asp Pro Pro Asn His Thr Leu Lys Tyr Leu Ala
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser His Glu Leu Gly Leu Leu Leu Lys Asn Leu Cys
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Lys Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile His Cys Met
85 90 95
Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Phe Leu Gln Asn Thr Ala
100 105 110
Asp Ile Tyr Leu Ser Trp Met Phe Gly Leu Leu Val Leu Tyr Lys Ser
115 120 125
Leu Ser Met Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala
165 170 175
Arg Ile Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala
180 185 190
Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Tyr Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asn Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys
245 250 255
Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Ala Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser
290 295 300
Arg Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn
305 310 315 320
Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro Pro
340 345 350
Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met Asp
355 360 365
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile
370 375
<210> 400
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muSTING R283G
<400> 400
Met Pro Tyr Ser Asn Leu His Pro Ala Ile Pro Arg Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Arg Ser Lys Tyr Val Ala Leu Ile Phe Leu Val Ala Ser Leu Met Ile
20 25 30
Leu Trp Val Ala Lys Asp Pro Pro Asn His Thr Leu Lys Tyr Leu Ala
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser His Glu Leu Gly Leu Leu Leu Lys Asn Leu Cys
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Lys Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile His Cys Met
85 90 95
Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Phe Leu Gln Asn Thr Ala
100 105 110
Asp Ile Tyr Leu Ser Trp Met Phe Gly Leu Leu Val Leu Tyr Lys Ser
115 120 125
Leu Ser Met Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala
165 170 175
Arg Ile Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala
180 185 190
Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asn Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys
245 250 255
Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Ala Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Gly Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser
290 295 300
Arg Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn
305 310 315 320
Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro Pro
340 345 350
Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met Asp
355 360 365
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile
370 375
<210> 401
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CTLA-4 scFv-Fc
<400> 401
atggagacac ctgcccagct gctgttcctg ctgctgctgt ggctgcccga caccaccggc 60
gagatcgtgc tgacccagtc tcctggcacc ctgagcctga gccccggcga gagagccaca 120
ctgagctgca gagcttctca gagcgtcgga tcttcttatc tggcctggta tcagcaaaag 180
cccggacaag ctcctcggct gctgatctac ggcgccttca gccgggctac aggcatccct 240
gatagattca gcggcagcgg ctctggcact gatttcaccc tgaccattag cagactggaa 300
cctgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacggga gcagcccttg gacctttgga 360
caaggcacca aggtggaaat caagcgtgga ggaggcggct caggcggcgg aggaagcggc 420
ggcggcggct ccggcggcgg aggcagccag gttcagctgg ttgaaagcgg aggcggcgtg 480
gtccagcctg gtagaagcct gcggctgtct tgcgccgcca gcggctttac atttagcagc 540
tacaccatgc actgggtgcg gcaggcccct ggcaagggcc tggaatgggt caccttcatc 600
agctacgacg gcaacaacaa gtactacgcc gacagcgtga aaggcagatt caccatcagc 660
agagataatt ctaaaaacac cctgtacctg caaatgaaca gcctcagagc cgaggatacc 720
gctatctact actgtgccag aacaggctgg ctgggcccct tcgactactg gggccagggc 780
acactggtga ccgtgtctag cgagcctaag tcttccgata agacacacac ctgccctccg 840
tgccccgccc ctgaactgct cggcggacct agcgtgttcc tgttccctcc aaagcctaag 900
gacaccctga tgatctctcg aacacctgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac 960
gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 1020
acaaaaccta gagaggagca gtacaacagc acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1080
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg 1140
cctgccccta tcgagaagac catcagcaag gctaaaggcc agcccagaga gccccaggtg 1200
tacacactgc ctccaagcag ggacgagctg accaagaacc aggtcagcct gacatgtctg 1260
gtgaagggct tctacccttc tgacatcgcc gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag 1320
aacaactaca agacgacccc tcctgtgctg gacagcgacg gatccttctt cctgtacagc 1380
aagctgacag ttgataagtc ccggtggcag cagggcaatg tgtttagctg tagcgtgatg 1440
cacgaggccc tgcataatca ctacacccag aaaagcctta gcctgtcccc aggcaaatga 1500
<210> 402
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CTLA-4 scFv-Fc
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> IGKV3-20 前导序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)...(129)
<223> 易普利姆玛 VL 结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)...(149)
<223> Gly-Ser 接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (150)...(267)
<223> 易普利姆玛 VH 结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (268)...(499)
<223> 人IgG1 FC w/ C5S铰链区突变
<400> 402
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser
260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
290 295 300
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
370 375 380
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485 490 495
Pro Gly Lys
<210> 403
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CTLA-4 scFv
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> IGKV3-20 前导序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)...(129)
<223> 易普利姆玛 VL 结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)...(149)
<223> Gly-ser 接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (150)...(267)
<223> 易普利姆玛 VH 结构域
<400> 403
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 404
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗小鼠CTLA-4 scFv
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> IgK 小鼠前导序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)...(132)
<223> 克隆9D9的VL
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)...(147)
<223> Gly-Ser 接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)...(264)
<223> 克隆9D9的VH
<400> 404
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro
20 25 30
Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys
145 150 155 160
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
165 170 175
Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
180 185 190
Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
195 200 205
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
210 215 220
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 405
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗小鼠 CTLA-4 scFv-Fc
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> IgK 小鼠前导序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)...(132)
<223> 克隆9D9的VL
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)...(147)
<223> Gly-Ser 接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)...(264)
<223> 克隆9D9的VH
<220>
<221> misc_feature
<222> (265)...(497)
<223> 小鼠 IgG2a Fc
<400> 405
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro
20 25 30
Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys
145 150 155 160
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
165 170 175
Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
180 185 190
Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
195 200 205
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
210 215 220
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
260 265 270
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
290 295 300
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
305 310 315 320
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
325 330 335
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
340 345 350
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
355 360 365
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
385 390 395 400
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
405 410 415
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
420 425 430
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
450 455 460
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
465 470 475 480
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
485 490 495
Lys
<210> 406
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠可溶TGF-beta受体II-Fc融合(mu sTGFbRII-Fc)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(184)
<223> 小鼠可溶TGFbeta受体II
<220>
<221> misc_feature
<222> (185)...(417)
<223> 小鼠 IgG2a Fc
<400> 406
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Asp
20 25 30
Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Ala Ser Ile His Leu Ser Cys Asn
35 40 45
Arg Thr Ile His Pro Leu Lys His Phe Asn Ser Asp Val Met Ala Ser
50 55 60
Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
65 70 75 80
Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
85 90 95
Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val
100 105 110
Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
115 120 125
Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met
145 150 155 160
Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu
165 170 175
Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
180 185 190
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
195 200 205
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
225 230 235 240
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
245 250 255
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
260 265 270
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
275 280 285
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
290 295 300
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
305 310 315 320
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
325 330 335
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
340 345 350
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
355 360 365
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
370 375 380
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
385 390 395 400
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
405 410 415
Lys
<210> 407
<211> 391
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人可溶TGF-beta受体II-Fc融合 (hu sTGFbRII-Fc)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(159)
<223> 人可溶TGF-beta受体II
<220>
<221> misc_feature
<222> (160)...(391)
<223> 人IgG1 Fc
<400> 407
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Glu
145 150 155 160
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
180 185 190
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
195 200 205
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
210 215 220
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
225 230 235 240
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
245 250 255
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
260 265 270
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
275 280 285
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
290 295 300
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
305 310 315 320
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
325 330 335
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
340 345 350
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
355 360 365
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
370 375 380
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385 390
<210> 408
<211> 3222
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒 pSL0209
<400> 408
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa cggtcagatc gtcgtgaata 2280
cctggcacag gtgaaagagg ttctgccgca actgcgcttc gattaacaaa tgcgctgaca 2340
gagccggtac gcgatgtgtg ccggcttttt tgttttgtgt gagacgcaga cgtcgctaca 2400
ctattcacaa ttccttttcg cgtcagcaga ccctggaaaa gcatggaaac caaaaaaaat 2460
agctagcctc aataagcttc ttgcctttct gcagaccaag gacccagatt atgtataaat 2520
aaagcctctc gtaagagagg ctttatgctg acaaaccctg tactacctga tgaacaggcg 2580
tgggggagtt ttactcaacg gtcaaaatac gcgtggtatt ggttgaaccg acggtgctca 2640
tgacatcgcc ctgggtcacg ataaccaggt cgccggaaac cagataccct ttatcgcgca 2700
gcagattaac agcttcatgt gccgcgacaa cgccatcagc cgcgctatca aaatgcaccg 2760
gcgttactcc gcgatagagc gcggtcaggt tcagcgtgcg ttcatggatc ccaatacgcg 2820
tcaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 2880
ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 2940
ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt 3000
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct 3060
gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 3120
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 3180
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc ga 3222
<210> 409
<211> 4235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒 pSL0211
<400> 409
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctc ggcgcgccat tgggatggaa cggtcagatc gtcgtgaata 2280
cctggcacag gtgaaagagg ttctgccgca actgcgcttc gattaacaaa tgcgctgaca 2340
gagccggtac gcgatgtgtg ccggcttttt tgttttgtgt gagacgcaga cgtcgctaca 2400
ctattcacaa ttccttttcg cgtcagcaga ccctggaaaa gcatggaaac caaaaaaaat 2460
agctagcctc aataagctta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgagcctg 2520
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 2580
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 2640
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 2700
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 2760
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 2820
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 2880
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aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 3000
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 3060
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 3120
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 3180
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ctcgtaagag aggctttatg ctgacaaacc ctgtactacc tgatgaacag gcgtggggga 3600
gttttactca acggtcaaaa tacgcgtggt attggttgaa ccgacggtgc tcatgacatc 3660
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actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 3900
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 3960
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct 4020
tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 4080
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 4140
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 4200
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcga 4235
<210> 410
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> purm-1 引物
<400> 410
ccagatgtgg cttgtttata cttcgc 26
<210> 411
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> purm-2 引物
<400> 411
ccttattgct gaatactgcc ctgag 25
<210> 412
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> purm-3 引物
<400> 412
cgtgtcgcaa ttcttaatgc catag 25
<210> 413
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> purm-4 引物
<400> 413
caaacatcgg actcagaata cgc 23
<210> 414
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> purm-5 引物
<400> 414
caggcgataa aggctaacaa ccg 23
<210> 415
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> purm-6 引物
<400> 415
ttgacctgga tcaaccaaaa gcg 23
<210> 416
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> acrd-1 引物
<400> 416
cctgcgaccg atactgatga c 21
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> acrd-3 引物
<400> 417
gctactcgct acctggatgc 20
<210> 418
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> msbB-1 引物
<400> 418
ggtcagatcg tcgtgaatac ctg 23
<210> 419
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> msbB-2 引物
<400> 419
atgaacgcac gctgaacctg 20
<210> 420
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> msbB-3 引物
<400> 420
acaccacacg ttacatgcac ttg 23
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> msbB-4 引物
<400> 421
aagccattgc catgtctgcg 20

Claims (379)

1.一种核酸构建体，其包含作为在单个启动子控制下的多顺反子序列的编码多种抗癌产物的核酸。
2.权利要求1的构建体，其中所述多顺反子序列包含在编码每种产物的每个开放阅读框(ORF)之间的2A肽。
3.权利要求1或2的构建体，其中所述抗癌产物是蛋白质。
4.权利要求2或3的构建体，其中所述2A肽是T2A、P2A、E2A或F2A中的一种或多种。
5.权利要求1至4任一项的构建体，其中所编码的产物是在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的一种或多种免疫刺激蛋白。
6.权利要求5的构建体，其中在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白选自以下的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、具有弱化的IL-2Ra结合的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、经修饰为不结合IL-2Ra的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞的募集和/或持续的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、CD28、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、具有胞质结构域缺失或截短以消除免疫抑制反向信号传导的4-1BBL、B7-CD28家族的成员、CD47拮抗剂、抗-IL6抗体或IL-6结合诱饵受体、TGF-β多肽拮抗剂以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。
7.权利要求5的构建体，其中在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白选自以下的一种或多种：IFN-α、IFN-β、GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-36γ、具有弱化的IL-2Ra结合的IL-2、经修饰为不与IL-2Ra结合的IL-2、CXCL9、CXCL10(IP-10)、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5、参与T细胞潜在的募集和/或持续的分子、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、具有缺失的胞质结构域(4-1BBLΔcyt)或具有部分缺失的胞质结构域的4-1BBL所述胞质结构域被缺失或截短以消除免疫抑制反向信号传导、B7-CD28家族的成员及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。
8.权利要求1至7任一项的构建体，其包含编码具有缺失或部分缺失的胞质结构域或部分缺失的胞质结构域和任选包括氨基酸修饰的4-1BBL的核酸，由此所得4-1BBL在细胞中表达时呈现正确方向。
9.权利要求1至8任一项的构建体，其包含编码具有缺失或部分缺失的胞质结构域的4-1BBL变体或具有截短的和经修饰的胞质结构域的经修饰的4-1BBL的核酸，其中所述4-1BBL的序列如SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:392所示。
10.权利要求1至9任一项的构建体，其包含编码任何以下产物和产物组合的核酸：
IL-12、或IL-15、或IL12p70、或IL-15/IL-15Rα链复合物中的一种或多种；
细胞因子和干扰素基因刺激因子(STING)通路激动剂；
细胞因子、STING通路激动剂及共刺激受体配体或免疫检查点抑制剂；
细胞因子、STING通路激动剂及TGF-β多肽拮抗剂；
细胞因子、STING通路激动剂、TGF-β多肽拮抗剂及共刺激受体配体或免疫检查点抑制剂，
其中STING通路激动剂是通过激活STING通路增加I型干扰素表达的任何产物。
11.权利要求1至10任一项的构建体，其包含编码干扰素基因刺激因子(STING)多肽的核酸。
12.权利要求1至11任一项的构建体，其包含编码选自以下组合的治疗产物组合的核酸：
抗CTLA-4抗体和STING多肽，
IL-15和STING多肽，
4-1BBL和STING多肽，
TGF-β受体诱饵或拮抗多肽，和STING多肽，
IL-12和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-15和STING多肽，
4-1BBL、IL-15和STING多肽，
TGF-β受体诱饵或拮抗多肽、IL-15和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12和STING多肽，
4-1BBL、IL-12和STING多肽，
TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂、IL-12和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-15、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂和STING多肽，
4-1BBL、IL-15、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、IL-15和STING多肽，
TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂、IL-12、IL-15和STING多肽，
TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂、IL-12、IL-15和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、IL-21、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
4-1BBL、IL-12、IL-21和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
IL-12、IL-15和STING多肽，
IL-15、IL-21和STING多肽，
IL-12、IL-21和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-15、IL-21和STING多肽，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-21和STING多肽，
4-1BBL、IL-15、IL-21和STING多肽，
4-1BBL、IL-12、IL-21和STING多肽，
抗CTLA-4抗体和IL-15，
抗CTLA-4抗体、IL-15和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
4-1BBL和IL-15，
4-1BBL、IL-15和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
抗CTLA-4抗体和IL-12，
抗CTLA-4抗体、IL-12和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
4-1BBL和IL-12，
4-1BBL、IL-12和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
抗CTLA-4抗体和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
4-1BBL和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
IL-15和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
IL-12和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，
IL-12、IL-15和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，和
IL-15、IL-21和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，其中：
4-1BBL是具有缺失的胞质结构域的4-1BBL、具有经修饰的胞质结构域的4-1BBL、具有截短的胞质结构域的4-1BBL或具有截短的和经修饰的胞质结构域的4-1BBL；
抗-CTLA-4抗体是scFv或scFv-Fc；和
STING多肽是野生型STING或变体STING多肽或嵌合STING多肽或具有氨基酸置换的嵌合STING多肽。
13.权利要求1至11任一项的构建体，其编码选自以下的治疗产物的组合：
IL-2和IL-12p70；
IL-2和IL-21；
IL-2、IL-12p70和STING功能获得(GOF)变体；
IL-2、IL-21和STING GOF变体；
IL-2、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；
IL-2、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
IL-15/IL-15Rα和IL-21；
IL-15/IL-15Rα、IL-12p70和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα、IL-21和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；
IL-12p70、IL-21和STING GOF变体；
IL-12p70、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和STING GOF变体；
IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-18；
IL-12p70、IL-18和STING GOF变体；
IL-12p70、IL-18、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-2和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-2和IL-21；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-2、IL-12p70和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-2、IL-21和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-2、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-2、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα和IL-21；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα、IL-21和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70和IL-21；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70、IL-21和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70和IL-18；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70、IL-18和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂、IL-12p70、IL-18、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或TGF-β多肽拮抗剂，和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-2和IL-12p70；
抗CTLA-4抗体、IL-2和IL-21；
抗CTLA-4抗体、IL-2、IL-12p70和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-2、IL-21和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-2、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体、IL-2、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα和IL-21；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-21和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70和IL-21；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-21和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体和IL-12p70；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70和IL-18；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-18和STING GOF变体；
抗CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-18、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-2和IL-12p70；
CD40激动剂、IL-2和IL-21；
CD40激动剂、IL-2、IL-12p70和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-2、IL-21和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-2、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂、IL-2、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα和IL-21；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-21和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂、IL-12p70和IL-21；
CD40激动剂、IL-12p70、IL-21和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-12p70、IL-21、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和IL-12p70；
CD40激动剂、IL-12p70和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-12p70、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂、IL-12p70和IL-18；
CD40激动剂、IL-12p70、IL-18和STING GOF变体；
CD40激动剂、IL-12p70、IL-18、STING GOF变体和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和
CD40激动剂和STING GOF变体，其中：
4-1BBL是具有缺失的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)、具有经修饰的胞质结构域的4-1BBL、具有截短的胞质结构域的4-1BBL或具有截短的和经修饰的胞质结构域的4-1BBL；及
抗-CTLA-4抗体是scFv或scFv-Fc。
14.权利要求1至13任一项的构建体，其中：
所述STING多肽经过修饰以导致I型干扰素(IFN)的表达增加或组成型表达，或者是一种嵌合多肽，包含来自不同物种的具有C末端尾区(CTT)的人STING多肽，其具有的NF-κB信号传导活性低于人STING的NF-κB信号传导活性，及其中：
所述CTT中的TRAF6结合位点任选被缺失；和
所述人STING蛋白具有SEQ ID NO:305-309任一所示的序列。
15.权利要求1至14任一项的构建体，其中所编码的治疗性蛋白质包含IL-12p70和嵌合人STING多肽，所述嵌合人STING多肽具有来自袋獾的CTT和导致I型干扰素表达增加或组成型表达的氨基酸置换，或者是具有导致I型干扰素表达增加或组成型表达的氨基酸置换的STING多肽，其中导致I型干扰素表达增加或组成型表达的突变是功能获得(GOF)突变。
16.权利要求15的构建体，其中参照与SEQ ID NO:305-309任一的比对，所述STING多肽中的氨基置换对应于R284G。
17.权利要求11至16任一项的构建体，其中所述STING多肽进一步包含置换N154S。
18.权利要求1至17任一项的构建体，其包含编码IL-36γ的核酸。
19.权利要求1至18任一项的构建体，其编码免疫检查点抑制剂抗体或其抗原结合部分。
20.权利要求19的构建体，其中所述免疫检查点是CTLA-4，或PD-1，或PD-L1。
21.权利要求1至20任一项的构建体，其中所编码的产物是抗体，其是scFv，或者是scFv-Fc双链多肽。
22.质粒，其包含权利要求1至21任一项的构建体。
23.权利要求22的质粒，其是细菌质粒，其中所述构建体与真核转录调节序列可操作地连接。
24.权利要求23的质粒，其中所述转录调节序列包含真核启动子。
25.组合物，其包含由权利要求1至24任一项的构建体或质粒编码的抗癌蛋白产物的混合物。
26.一种免疫刺激细菌，其包含权利要求1至24任一项的构建体或质粒。
27.权利要求26的免疫刺激细菌，其中所述细菌的基因组被修饰，使得所得细菌是msbB-/purI-。
28.权利要求26或27的免疫刺激细菌，其中所述细菌是msbB-和purI-，由此所述msbB-和purI-基因的至少编码部分的全长被缺失。
29.权利要求26至28任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌的基因组被修饰，由此所述细菌缺乏鞭毛。
30.权利要求26至29任一项的免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌是msbB-/pagP-。
31.权利要求26至30任一项的免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌不表达L-天冬酰胺酶II，因此所述细菌是ansB-。
32.一种免疫刺激细菌，其包含编码多种治疗产物的质粒，其中所述细菌的基因组被修饰，使得细菌是msbB-和purI-，由此msbB和purI基因的至少编码部分的全长被缺失。
33.一种免疫刺激细菌，其包含在真核启动子控制下的编码治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成。
34.权利要求33的免疫刺激细菌，其中所述天冬酰胺酶是由基因asnB编码的L-天冬酰胺酶II。
35.权利要求34的免疫刺激细菌，其具有基因组修饰，由此所述细菌缺乏鞭毛并且是pagP-、ansB-和csgD-。
36.权利要求35的免疫刺激细菌，其是Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD。
37.权利要求33至36任一项的免疫刺激细菌，其具有基因组修饰，由此所述细菌是msbB-。
38.权利要求33至37任一项的免疫刺激细菌，其具有基因组修饰，由此所述细菌是腺苷营养缺陷型，或者是腺苷和腺嘌呤营养缺陷型。
39.权利要求33至38任一项的免疫刺激细菌，其具有基因组修饰，由此所述细菌是purI-。
40.权利要求33至39任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。
41.权利要求33至40任一项的免疫刺激细菌，其是purI-。
42.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的多种治疗产物的质粒，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖(LPS)；
与野生型细菌相比，六酰化脂多糖显著减少至少10倍，或不存在；和
所述质粒编码在单个启动子控制下的多种互补抗癌治疗产物，其中互补治疗产物的每一种治疗癌症的不同方面，或通过不同机制起作用，使得组合效应至少是单独每种产物效应的累加。
43.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌具有减弱的TLR2、TLR4和TLR5的识别；和
所述质粒编码在单个启动子控制下的多种互补治疗产物。
44.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此细菌不激活卷曲菌毛和/或纤维素的合成；和
所述质粒编码在单个启动子控制下的多种互补治疗产物。
45.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌对嘌呤、腺苷或ATP是营养缺陷型的，并且通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分被修饰，由此所述细菌缺乏鞭毛；和
所述质粒编码在单个真核启动子控制下的多种治疗产物。
46.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌缺乏鞭毛；和
所述质粒编码在单个启动子控制下的多种治疗产物。
47.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞；和
所述质粒编码在单个启动子控制下的多种治疗产物。
48.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞，并且无法在肿瘤驻留骨髓细胞中复制。
49.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组包含选自以下的两种或更多种修饰：
a)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖；和
与野生型细菌相比，六酰化脂多糖显著减少至少10倍，或不存在；
b)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌具有减弱的对TLR2、TLR4和TLR5中一种或多种的识别；
c)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活卷曲菌毛和/或纤维素的合成；
d)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成；
e)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌对嘌呤、腺苷或ATP是营养缺陷型的；
f)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌缺乏鞭毛；
g)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞；
h)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞，并且不能在肿瘤驻留骨髓细胞中复制；及
i)缺失或破坏lppA和lppB之一或二者以降低或消除脂蛋白在膜中的表达，从而在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中增加被编码的治疗性蛋白质的表达。
50.权利要求49的免疫刺激细菌，其包含修饰a)、d)和f)，或包含修饰c)和d)。
51.权利要求49的免疫刺激细菌，其包含修饰a)、c)、d)、e)和f)。
52.权利要求49的免疫刺激细菌，其包含修饰a)、c)、d)、e)、f)和i)，或包含修饰a)、d)、f)和i)，或包含修饰c)、d)和i)，或包含修改f)和i)，或包含修饰a)至i)。
53.权利要求49的免疫刺激细菌，其包含修饰a)、b)、d)和f)，或包含修饰a)、b)、c)和d)。
54.权利要求26至53任一项的免疫刺激细菌，其中缺失lppA和lppB。
55.权利要求26至54任一项的免疫刺激细菌，其缺乏鞭毛并且是msbB-/pagP-，其中所述质粒编码选自共刺激分子、细胞因子、STING通路激动剂和免疫检查点抑制剂抗体中的两种或更多种治疗性蛋白质的组合。
56.一种免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中所述细菌感染巨噬细胞将人M2巨噬细胞转化为M1表型巨噬细胞。
57.一种免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中：
所述免疫刺激细菌在其基因组中包含修饰，由此所述细菌感染肿瘤驻留巨噬细胞，而不感染上皮细胞；和
所述治疗产物在巨噬细胞中的表达将人M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型。
58.权利要求26至57任一项的免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中所述治疗产物在巨噬细胞中的表达将人M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型。
59.权利要求26至58任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分。
60.权利要求59的免疫刺激细菌，其中I型IFN的表达是组成型的。
61.权利要求59或60的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是所述治疗产物的功能获得(GOF)变体，其是胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，其中所述GOF变体产物不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸以导致I型IFN表达。
62.权利要求26至61任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是变体STING蛋白。
63.权利要求26至62任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌的感染将人M2巨噬细胞转化为M1样I型IFN产生细胞。
64.权利要求26至63任一项的免疫刺激细菌，其缺乏鞭毛，其中所述野生型细菌具有鞭毛，及所述免疫刺激细菌是pagP-/msbB-。
65.权利要求26至64任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌含有基因组修饰，由此所述细菌缺乏鞭毛并且不产生L-天冬酰胺酶II(ansB)。
66.权利要求65的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌还具有基因组修饰，由此所述细菌是msbB-和pagP-。
67.权利要求26至66任一项的免疫刺激细菌，其中免疫刺激细菌具有基因组的修饰，由此基因组赋予的细菌表型是Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD或Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔmsbB/ΔpurI，其中所述质粒任选编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。
68.权利要求26至67任一项的免疫刺激细菌，其包含编码STING多肽的质粒。
69.权利要求68的免疫刺激细菌，其中所述STING多肽是导致I型干扰素的表达增加或组成型表达的变体STING多肽。
70.权利要求69的免疫刺激细菌，其中所述STING多肽是人嵌合STING多肽，其包含来自袋獾STING的C末端尾区(CTT)。
71.权利要求69或70的免疫刺激细菌，其中参考与SEQ ID NO:305-309任一的比对，所述STING多肽包含对应于R284的置换。
72.权利要求71的免疫刺激细菌，参考SEQ ID NO:305-309任一，其进一步包含对应于N154S的置换。
73.权利要求26至72任一项的免疫刺激细菌，其包含编码IL-12、IL-15和IL-21中的一种或多种的质粒。
74.权利要求26至73任一项的免疫刺激细菌，其是沙门氏菌(Salmonella)菌株。
75.权利要求26至74任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是抗癌治疗剂。
76.权利要求26至75任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌编码是免疫刺激蛋白的治疗产物。
77.权利要求76的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激蛋白是干扰素基因刺激因子(STING)蛋白、经修饰的STING蛋白、细胞因子、趋化因子或共刺激受体或配体。
78.权利要求26至77任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含基因组修饰，由此其缺乏鞭毛。
79.权利要求26至78任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含基因组修饰，由此其是pagP-或msbB-/pagP-。
80.权利要求26至79任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述细菌包含基因组修饰，由此其不表达天冬酰胺酶或激活分泌的天冬酰胺酶的合成；和/或
通过缺失或破坏编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌是ansB-且不表达活性L-天冬酰胺酶II。
81.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏全部或足够部分的csgD而被修饰，由此所述细菌是csgD-且不激活卷曲菌毛的合成。
82.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌是ansB-且不表达活性L-天冬酰胺酶II。
83.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或足够部分以及通过缺失或破坏基因csgD的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌是ansB-且不表达活性L-天冬酰胺酶II，并且是csgD-且不激活卷曲菌毛的合成。
84.权利要求26至83任一项的免疫刺激细菌，进一步包含缺失或破坏编码鞭毛的基因的全部或足够部分，由此所述细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)并且不产生鞭毛，其中野生型细菌具有鞭毛。
85.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏编码细菌脂蛋白的基因lppA和lppB的全部或足够部分而被修饰，由此不产生脂蛋白，并且其中所述质粒上编码的治疗产物是抗癌治疗剂。
86.权利要求85的免疫刺激细菌，其中通过缺失或破坏基因csgD的全部或足够部分来进一步修饰所述细菌的基因组，由此所述细菌是csgD-，或在基因组中具有另一种或额外的修饰，从而损害生物膜形成。
87.权利要求82至86任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌的基因组通过缺失或破坏基因的全部或足够部分而被进一步修饰，由此所述细菌是csgD-/msbB-/pagP-。
88.权利要求82、83和85至87任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含基因组的修饰，由此所述细菌缺乏鞭毛。
89.一种免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌缺乏鞭毛，并且是lppA-/lppB-，并且任选是csgD-，或缺乏鞭毛，是ansB-，以及任选是csgD-。
90.权利要求26至89任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是嘌呤营养缺陷型的。
91.权利要求26至89任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是腺苷营养缺陷型的。
92.权利要求26至89任一项的免疫刺激细菌，其是腺苷、腺嘌呤和ATP营养缺陷型的。
93.权利要求26至92任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是purI-。
94.权利要求26至93任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是pagP-。
95.权利要求26至94任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是asd-。
96.权利要求26至95任一项的免疫刺激细菌，其是天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)，其中由于破坏或缺失编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的全部或部分，由此内源性asd不表达，因此所述细菌是asd-。
97.权利要求26至96任一项的免疫刺激细菌，其在质粒上编码细菌启动子控制下的天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。
98.权利要求26至97任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是msbB-。
99.权利要求26至98任一项的免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌是asd-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-，其中野生型细菌具有鞭毛。
100.权利要求26至98任一项的免疫刺激细菌，其是asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-，其中野生型细菌具有鞭毛。
101.权利要求26至98任一项的免疫刺激细菌，其是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-，其中野生型细菌具有鞭毛。
102.权利要求96至100任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，其中野生型细菌具有鞭毛。
103.权利要求26至102任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌的基因组通过缺失或破坏基因lppA和/或lppB的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌是lppA-和/或lppB-，与除了具有完整lppA和/或lppB之外相同的免疫刺激细菌相比，所述在质粒上编码的治疗性蛋白质在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留巨噬细胞中的表达增加。
104.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-，其中野生型细菌具有鞭毛。
105.一种免疫刺激细菌，其包含编码在真核启动子控制下的治疗产物的质粒，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过一个或多个基因的全部或足够部分的缺失或破坏而被修饰，由此所述细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-，其中野生型细菌具有鞭毛和pagP-。
106.权利要求104或105的免疫刺激细菌，其中所述细菌是鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)。
107.权利要求105或106的免疫刺激细菌，其中所述细菌基因组包含进一步的修饰，由此所述细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、lppA-和lppB-。
108.权利要求26至107任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是抗癌治疗剂。
109.权利要求26至108任一项的免疫刺激细菌，其中编码所述治疗产物的核酸与编码分泌信号的核酸可操作地连接，由此当其表达时分泌所述治疗产物。
110.权利要求26至109任一项的免疫刺激细菌，其中涉及SPI-1侵入的一个或多个基因或操纵子被缺失或失活，由此所述免疫刺激细菌不侵入或感染上皮细胞。
111.权利要求110的免疫刺激细菌，其中缺失或失活以下一个或多个基因：avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP。
112.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以低拷贝数或中等拷贝数存在。
113.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含中等至低拷贝数的复制起点。
114.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含低拷贝数复制起点。
115.权利要求26至111和114任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以低拷贝数存在。
116.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以150或更少的拷贝数存在。
117.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以大于150的拷贝数存在。
118.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以高拷贝数存在。
119.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以中等拷贝数存在，所述中等拷贝数介于20和150之间，包括端值，小于150或小于约150且大于20或约20，或在20至150个拷贝之间。
120.权利要求26至111任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒的拷贝数大于150。
121.权利要求116的免疫刺激细菌，其中所述质粒的拷贝数为150个拷贝或更少，或者小于或等于150。
122.权利要求26至115任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以低拷贝数存在，所述低拷贝数小于25，或小于20，或小于约25，或小于约20个拷贝。
123.权利要求26至122任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是核酸或蛋白质。
124.权利要求123的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是蛋白质。
125.权利要求26至124任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码两种或更多种治疗产物。
126.权利要求26至125任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒上编码的治疗产物是抗癌治疗剂。
127.权利要求26至126任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌编码选自细胞因子、组成型诱导I型IFN的蛋白质和共刺激受体或分子的两种或更多种产物。
128.权利要求127的免疫刺激细菌，其中所述共刺激分子缺乏胞质结构域，或具有经修饰的截短的胞质结构域以确保被编码的共刺激分子在细胞中以正确方向表达，或具有截短的胞质结构域，从而消除或减少免疫抑制反向信号传导。
129.权利要求26至128任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码一种或多种治疗产物的核酸包含编码用于从包含所述细菌或质粒的细胞中分泌所述一或多种治疗产物的信号的核酸。
130.权利要求26至129任一项的免疫刺激细菌，其中质粒上编码所述产物的核酸与被真核宿主识别的调节序列可操作地连接。
131.权利要求26至130任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌编码两种或更多种产物，并且每种产物的表达在单独的启动子的控制下，或所有产物的表达在单个启动子的控制下，以及每种产物被编码2A肽的核酸分开以实现每种被编码的治疗产物的单独翻译。
132.权利要求131的免疫刺激细菌，其中所述核酸编码T2A、F2A、E2A或P2A肽以实现在单个启动子控制下被表达的治疗产物的单独表达。
133.权利要求26至132任一项的免疫刺激细菌，其中所述真核启动子是RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子。
134.权利要求133的免疫刺激细菌，其中所述启动子是RNA聚合酶II启动子，其是病毒启动子或哺乳动物RNA聚合酶II启动子。
135.权利要求134的免疫刺激细菌，其中所述启动子是选自巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子和腺病毒启动子的病毒启动子。
136.权利要求26至134任一项的免疫刺激细菌，其中控制质粒上一种或多种被编码的治疗产物或异源蛋白的表达的启动子是延伸因子-1(EF-1)α启动子，或MND启动子，或UBC启动子，或PGK启动子，或CAG启动子。
137.权利要求26至134任一项的免疫刺激细菌，其中控制质粒上一种或多种被编码的治疗产物或异源蛋白质的表达的启动子是EF-1α启动子、腺病毒2或5晚期启动子、CMV启动子、SV40启动子、MND启动子、PGK启动子、EIF4A1启动子、CAG启动子或CD68启动子。
138.权利要求26至134任一项的免疫刺激细菌，其中控制质粒上一种或多种被编码的治疗产物或异源蛋白质的表达的启动子是病毒启动子，其是晚期启动子。
139.权利要求26至138任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含调节序列，所述调节序列包含选自SV40、hGH、BGH、MND、鸡β-球蛋白和rbGlob(兔球蛋白)基因的终止子和/或启动子，以控制所述一或多种治疗产物的表达。
140.权利要求26至139任一项的免疫刺激细菌，其中所述被编码的一或多种治疗产物与用于从含有所述质粒的细胞中分泌的信号序列可操作地连接。
141.权利要求26至140任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码治疗产物的质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、编码所述治疗产物或异源蛋白质的开放读框和polyA尾区。
142.权利要求26至141任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、IRES、编码所述治疗产物或异源蛋白质的开放读框和polyA尾区。
143.权利要求26至142任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、IRES、定位序列、编码所述治疗产物的开放读框和polyA尾区。
144.权利要求26至143任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含包括细菌终止子的构建体，所述细菌终止子被定位以减少质粒上细菌启动子的通读。
145.权利要求26至144任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒上的真核启动子与质粒上的细菌启动子的方向相反。
146.权利要求145的免疫刺激细菌，其中所述细菌启动子控制asd基因的表达。
147.权利要求26至146任一项的免疫刺激细菌，其中编码治疗产物或异源蛋白质的质粒上的构建体包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)或乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
148.权利要求26至147任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒含有编码治疗产物的核酸，所述治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或者是其变体。
149.权利要求148的免疫刺激细菌，其中未修饰形式的治疗产物直接或间接感应胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸或与胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸相互作用，以诱导I型IFN的表达，并且变体蛋白在不存在感应胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸或与胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸相互作用的情况下诱导I型IFN的表达。
150.权利要求148的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是变体，当其在受试者中表达时导致I型IFN的组成型表达。
151.权利要求148的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是功能获得(GOF)变体，其不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸以导致I型IFN的表达。
152.权利要求26至151任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自STING、RIG-1、MDA-5、IRF-3、IRF-7、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60、和SNRNP200及其变体，其增加活性或增加活性以使I型干扰素活性增加或是组成型活性。
153.权利要求26至152任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200及其变体，其增加活性或增加活性以使I型干扰素活性增加或是组成型活性。
154.权利要求26至153任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是变体蛋白，其具有增加的活性，导致I型干扰素(IFN)表达增加或导致I型IFN组成型表达。
155.权利要求26至154任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码蛋白质的功能获得性、组成型活性变体，其在人体中促进或引起干扰素病。
156.权利要求62至80和148至155任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是包含突变的变体，所述突变消除了STING蛋白中的磷酸化位点从而减少活化的B细胞(NF-κB)信号传导的核因子κ-轻链增强子。
157.权利要求148至156任一项的免疫刺激细菌，其中所述诱导I型IFN的治疗产物是STING、RIG-I、IRF-3或MDA5，或其变体。
158.权利要求148至157任一项的免疫刺激细菌，其中：
诱导I型IFN表达的治疗产物是其具有增加的活性或组成型活性的变体；和
所述治疗产物是STING、RIG-I、IRF-3或MDA5，或其变体。
159.权利要求148至158任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是STING、RIG-1、IRF-3或MDA5的变体，其包含导致I型IFN表达增加的功能获得性突变。
160.权利要求148至159任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是STING、RIG-1、IRF-3或MDA5的变体，其中一个或多个由于病毒感染而被磷酸化的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基被天冬氨酸(D)置换，由此产生的变体是组成型诱导I型IFN的磷酸模拟物。
161.权利要求148至160任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述治疗产物是IRF-3，参考与SEQ ID NO:312的比对，其在位置396、398、402、404和405的残基具有一个或多个置换；和
所述残基被天冬氨酸残基置换。
162.权利要求161的免疫刺激细菌，其中参考与SEQ ID NO:312的比对，IRF-3包含置换S396D。
163.权利要求161的免疫刺激细菌，其中参考与SEQ ID NO:312的比对，IRF-3包含置换S396D/S398D/S402D/T404D/S405D。
164.权利要求148至163任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-7、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200及其变体，其增加活性或增加活性使得I型干扰素活性增加或是组成型活性。
165.权利要求148至164任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述感应胞质DNA/RNA的治疗产物是变体STING、MDA5、RIG-I或IRF-3；和
未修饰的STING具有SEQ ID NO:305-309任一所示序列，未修饰的MDA5具有SEQ ID NO:310所示的序列，未修饰的RIG-I具有SEQ ID NO:311所示序列，以及未修饰IRF-3具有SEQID NO:312所示的序列。
166.权利要求148至165任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自STING、MDA5、IRF-3和RIG-I，并且包含使STING、MDA5、IRF-3或RIG-I是组成型活性的功能获得性突变，由此I型IFN的表达是组成型表达。
167.权利要求165或166的免疫刺激细菌，其中所述突变选自以下：
a)参考与SEQ ID NO:305-309的比对，在STING中的选自如下的一个或多个突变：S102P、V147L、V147M、N154S、V155M、G166E、C206Y、G207E、S102P/F279L、F279L、R281Q、R284G、R284S、R284M、R284K、R284T、R197A、D205A、R310A、R293A、T294A、E296A、R197A/D205A、S272A/Q273A、R310A/E316A、E316A、E316N、E316Q、S272A、R293A/T294A/E296A、D231A、R232A、K236A、Q273A、S358A/E360A/S366A、D231A/R232A/K236A/R238A、S358A、E360A、S366A、R238A、R375A、N154S/R284G和S324A/S326A；
b)参考与SEQ ID NO:310的比对，在MDA5中的选自如下的一个或多个突变：T331I、T331R、A489T、R822Q、G821S、A946T、R337G、D393V、G495R、R720Q、R779H、R779C、L372F和A452T；
c)参考与SEQ ID NO:311的比对，在RIG-I中的选自E373A和C268F的一个或两个突变；及
d)参考与SEQ ID NO:312的比对，在IRF-3中的突变S396D。
168.权利要求148至167任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是变体STING，参考与SEQ ID NO:305-309任一的比对，其含有选自如下的一个或多个氨基酸置换：S102P、V147L、V147M、N154S、V155M、G166E、C206Y、G207E、S102P/F279L、F279L、R281Q、R284G、R284S、R284M、R284K、R284T、R197A、D205A、R310A、R293A、T294A、E296A、R197A/D205A、S272A/Q273A、R310A/E316A、E316A、E316N、E316Q、S272A、R293A/T294A/E296A、D231A、R232A、K236A、Q273A、S358A/E360A/S366A、D231A/R232A/K236A/R238A、S358A、E360A、S366A、R238A、R375A、S324A/S326A和N154S/R284G，及其保守置换。
169.权利要求26至168任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述治疗性蛋白质增加或诱导I型IFN的表达；和
所述I型IFN是干扰素-α或干扰素-β。
170.权利要求26至169任一项的免疫刺激细菌，其中涉及SPI-1侵入或SPI-1独立侵入的一个或多个基因或操纵子被缺失、破坏或失活，由此所述免疫刺激细菌不侵入或感染上皮细胞，或具有降低的侵入或感染上皮细胞的能力。
171.权利要求170的免疫刺激细菌，其中以下一种或多种基因被缺失、破坏或失活：avrA、hilA、hilD、invA、invB、invC、invE、invF、invG、invH、invI、invJ、iacP、iagB、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、orgA、orgB、orgC、prgH、prgI、prgJ、prgK、sicA、sicP、sipA、sipB、sipC、sipD、sirC、sopB、sopD、sopE、sopE2、sprB和sptP。
172.权利要求171的免疫刺激细菌，其中所述一种或多种基因选自pagN、hlyE、pefI、srgD、srgA、srgB和srgC。
173.权利要求26至172任一项的免疫刺激细菌，其具有编码SPI-2复合物中蛋白质的基因的缺失或破坏。
174.权利要求26至173任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白。
175.权利要求174的免疫刺激细菌，其中所述在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白选自以下一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、与IL-2Ra结合减弱的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、经修饰使其不与IL-2Ra结合的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞的募集和/或持续的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、CD28、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、具有缺失或截短或以其它方式修饰的胞质结构域以消除免疫抑制反向信号传导的4-1BBl、B7-CD28家族的成员、CD47拮抗剂、抗IL6抗体或IL-6结合诱饵受体、TGF-β多肽拮抗剂和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。
176.权利要求174或175的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码经修饰的4-1BBL，其序列在SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391或SEQ ID NO:392中示出。
177.权利要求175或176的免疫刺激细菌，进一步包含与所述共刺激蛋白连接以促进其纯化或表达的标签。
178.权利要求177的免疫刺激细菌，其中所述标签是包含序列MEQKLISEEDL的c-myc标签，如SEQ ID NO:392的残基1至11所示。
179.权利要求174至178任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码4-1BBL多肽和至少一种另外的治疗性蛋白质。
180.权利要求179的免疫刺激细菌，其中所述另外的治疗性蛋白质是IL-15Rα-IL-15sc，或IL-12，或IL-15Rα-IL-15sc和IL-12。
181.权利要求174至180任一项的免疫刺激细菌，其包含在单个启动子控制下在多顺反子核酸中编码的1-4BBL多肽和一种或多种另外的治疗性多肽，其中所述1-4BBL多肽是所述多顺反子中第一个多肽。
182.权利要求174至181任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述免疫刺激蛋白是选自CD40、CD40配体(CD40L)、CD28、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB和4-1BB配体(4-1BBL)的共刺激分子，其任选在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域截短或缺乏胞质结构域，以消除免疫抑制反向信号传导；和
截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于胞质结构域的截短或缺失而不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
183.权利要求26至182任一项的免疫刺激细菌，其中被编码的产物包含STING蛋白、经修饰的STING蛋白、嵌合STING蛋白、抗CTLA-4抗体、IL-15、4-1BBL及其修饰或截短形式、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂、IL-12和IL-21中的一种或多种，和/或以下任一：
IL-12、或IL-15、或IL12p70、或IL-15/IL-15Rα链复合物中的一种或多种；
细胞因子和STING通路激动剂；
细胞因子、STING通路激动剂和共刺激分子或免疫检查点抑制剂；
细胞因子、STING通路激动剂和TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂；和/或
细胞因子、STING通路激动剂、TGF-β受体诱饵或多肽拮抗剂，以及共刺激分子或免疫检查点抑制剂。
184.权利要求26至183任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包括编码诱导肿瘤细胞凋亡或对肿瘤细胞具有细胞毒性的产物的核酸。
185.权利要求184的免疫刺激细菌，其中：
所述产物是核酸；和
编码所述产物的核酸包括编码分泌信号的核酸，由此所述产物被分泌。
186.权利要求183或184的免疫刺激细菌，其中所述产物诱导凋亡。
187.权利要求186的免疫刺激细菌，其中所述诱导凋亡的产物是天青蛋白。
188.权利要求174至187任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白，并且所述免疫刺激蛋白是细胞因子或趋化因子。
189.权利要求174至188任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白，其是共刺激分子或其胞质结构域缺失的或截短的或其它经修饰的形式。
190.权利要求189的免疫刺激细菌，其中所述在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白选自4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L，以及其胞质结构域缺失的或截短的或截短的和经修饰的形式，其中当蛋白质在细胞中表达时所述修饰促进正确定向，以及所述胞质缺失、截短和/或修饰消除或减少免疫抑制反向信号传导。
191.权利要求26至190任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码作为TGF-β多肽拮抗剂的治疗产物。
192.权利要求191的免疫刺激细菌，其中所述TGF-β多肽拮抗剂选自抗TGF-β抗体或其片段、抗TGF-β受体抗体或其片段、可溶性TGF-β拮抗剂多肽及TGF-β结合诱饵受体。
193.权利要求191或192的免疫刺激细菌，其中编码TGF-β多肽拮抗剂的核酸包含编码用于分泌所编码的多肽的信号序列的核酸。
194.权利要求26至193任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是抗体或其抗原结合片段。
195.权利要求194的免疫刺激细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、纳米抗体、双特异抗体片段、单链抗体和scFv-Fc双链抗体的抗原结合片段。
196.权利要求195的免疫刺激细菌，其中所述抗体是scFV。
197.权利要求195或196的免疫刺激细菌，其中所述抗体包含Fc，由此所得抗体包含两条链。
198.权利要求195至197任一项的免疫刺激细菌，其中所述抗体由包含编码可变轻链、接头、可变重链和IgG Fc的核酸的核酸编码，其中所述被编码的抗体是scFv-Fc。
199.权利要求195至198任一项的免疫刺激细菌，其中所述抗体是抗CTLA-4抗体。
200.权利要求194至199任一项的免疫刺激细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段或者是人抗体或其抗原结合片段。
201.权利要求194至200任一项的免疫刺激细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是PD-1、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2或IL-6的拮抗剂。
202.权利要求26至201任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码选自以下的两种或更多种治疗产物：
a)在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白；
b)一种或多种蛋白质，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或其具有增加的活性以增加I型IFN表达的变体，或其导致I型IFN的组成型表达的变体；和
c)抗癌抗体或其抗原结合部分。
203.权利要求202的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激蛋白是缺乏在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其足够部分的共刺激分子，由此截短的共刺激分子能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
204.一种免疫刺激细菌，其包含编码在单个启动子控制下的两种或更多种治疗产物的质粒，其中：
所述治疗产物选自：
a)在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白；
b)一种或多种蛋白质，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或其具有增加的活性以增加I型IFN表达的变体，或其导致I型IFN组成型表达的变体；和
c)抗癌抗体或其抗原结合部分；及
所述编码核酸由IRES序列或2A肽分开，并且编码每种产物的每种核酸任选与编码信号序列的核酸可操作地连接，由此在编码的mRNA翻译时，每种产物从包含所述细菌和/或质粒的细胞中单独表达和分泌。
205.权利要求204的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激蛋白是缺乏在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其足够部分的共刺激分子，由此截短的共刺激分子能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
206.权利要求26至205任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码至少两种选自以下的治疗产物：细胞因子，组成型诱导I型IFN的蛋白质，共刺激分子和抗癌抗体或其抗原结合部分。
207.权利要求26至206任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述质粒编码在单个启动子控制下的两种或更多种治疗产物；和
编码至少两种或所有产物的核酸的表达在单个启动子的控制下，并且编码每种产物的核酸被编码2A肽的核酸分开，由此在翻译时，每种产物单独表达。
208.权利要求202至207任一项的免疫刺激细菌，其中编码一种或多种所述治疗产物的核酸与编码指导表达产物分泌的序列的核酸可操作地连接。
209.权利要求26至208任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述治疗产物是具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域缺失或截短或其它修饰的共刺激分子；和
所述截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于胞质结构域缺失、截短或其它修饰而不能向APC发出反调节信号。
210.权利要求209的免疫刺激细菌，其中所述具有缺失、截短或以其它方式修饰的胞质结构域的共刺激分子是4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1或OX40L，以及在细胞中表达时增加蛋白质正确方向的变体。
211.权利要求26至210任一项的免疫刺激细菌，其编码两种或更多种治疗产物，其中至少一种产物选自a)及至少一种选自b)，其中：
a)是IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-23、IL-36γ、与IL-2Ra结合减弱的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物、IL-18、经过修饰使其不与IL-2Ra结合的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集/持续的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族的成员、TGF-β多肽拮抗剂或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员；及
b)是STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-5、IRF-7、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60或SNRNP200。
212.权利要求26至211任一项的免疫刺激细菌，其编码或进一步编码TGF-β抑制性抗体或其抗原结合片段、TGF-β结合诱饵受体、抗IL6抗体或其抗原结合片段和IL-6结合诱饵受体中的一种或多种。
213.权利要求26至212任一项的免疫刺激细菌，其编码以下治疗产物组合中的一种或多种：
IL-2和IL-12p70；
IL-2和IL-21；
IL-2，IL-12p70，和STING功能获得(GOF)变体；
IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；
IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
IL-15/IL-15Rα和IL-21；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；
IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和STING GOF变体；
IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-18；
IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-2，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-2，和IL-21；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，和IL-21；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，和IL-18；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-2，和IL-21；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和IL-12p70；CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及
CD40激动剂和STING GOF变体，其中：
4-1BBL是具有缺失的胞质结构域的4-1BBL、具有经修饰的胞质结构域的4-1BBL、具有截短的胞质结构域的4-1BBL或具有截短的和经修饰的胞质结构域的4-1BBL；及
抗-CTLA-4抗体是scFv或scFv-Fc。
214.权利要求26至213任一项的免疫刺激细菌，其包含编码选自以下组合的治疗产物组合的核酸：
抗CTLA-4抗体和STING，
IL-15和STING，
4-1BBL和STING，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和STING，
IL-12和STING，
抗CTLA-4抗体、IL-15和STING，
4-1BBL、IL-15和STING，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-15和STING，
抗CTLA-4抗体、IL-12和STING，
4-1BBL、IL-12和STING，
TGF-β诱饵受体或拮抗剂多肽、IL-12和STING，
抗CTLA-4抗体、IL-15、TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂和STING，4-1BBL和IL-15，TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及STING，抗CTLA-4抗体和IL-12，和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及STING，4-1BBL和IL-12，TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及STING，抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15和STING，
4-1BBL、IL-12、IL-15和STING，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-12、IL-15和STING，
TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂、IL-12、IL-15和STING，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15、TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂和STING，4-1BBL、IL-12、IL-21，TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及STING，抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，4-1BBL、IL-12、IL-21和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-12、IL-15和STING，
IL-15、IL-21和STING，
IL-12、IL-21和STING，
抗CTLA-4抗体、IL-15、IL-21和STING，
抗CTLA-4抗体、IL-12、IL-21和STING，
4-1BBL、IL-15、IL-21和STING，
4-1BBL、IL-12、IL-21和STING，
抗CTLA-4抗体和IL-15，
抗CTLA-4抗体、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL和IL-15，
4-1BBL、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
抗CTLA-4抗体和IL-12，
抗CTLA-4抗体和IL-12，及TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL和IL-12，
4-1BBL、IL-12和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
抗CTLA-4抗体和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
4-1BBL和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-12和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，
IL-12、IL-15和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及
IL-15、IL-21和TGF-β诱饵受体或多肽拮抗剂，其中：
IL-15是IL-15或IL-15/IL-15Rα链复合物；
STING是STING多肽，或变体STING多肽，或嵌合STING多肽，或具有氨基酸置换的嵌合STING；
TGF-β是可溶性TGF-β诱饵或TGF-β拮抗剂；
4-1BBL是具有缺失的胞质结构域的4-1BBL、具有经修饰的胞质结构域的4-1BBL、具有截短的胞质结构域的4-1BBL或具有截短的和经修饰的胞质结构域的4-1BBL；及
抗-CTLA-4抗体是scFv或scFv-Fc。
215.权利要求214的免疫刺激细菌，其中所述TGF-β诱饵包含Fc融合物或者是抗TGF抗体或其抗原结合片段。
216.权利要求214或权利要求215的免疫刺激细菌，其中所述4-1BBL是全长的，或者是全长及具有在Ser5和/或Ser8的氨基酸置换，由此免疫抑制反向信号传导被减少或消除，或者是具有缺失的胞质结构域或截短的胞质结构域的1-4BBL，由此消除或减少免疫抑制反向信号传导，或者是在截短的胞质结构域中具有氨基酸置换的4-1BBL，由此所述4-1BBL当在细胞中表达时处于正确方向。
217.权利要求214至215任一项的免疫刺激细菌，其中所述STING多肽包含置换R284G，或包含置换N154S/R284，或者是嵌合STING多肽，其是具有来自袋獾的CTT的嵌合人STING多肽，或者是具有来自袋獾的CTT以及对应于R284G的置换或对应于N154S/R284G的置换的嵌合人STING多肽，所有置换均是参考与SEQ ID NO:305-309的比对。
218.权利要求213至215任一项的免疫刺激细菌，其中所述STING功能获得(GOF)变体选自权利要求167或权利要求168中所示任一项。
219.一种免疫刺激细菌或一种细胞，其编码以下治疗产物组合中的一种或多种：
IL-2和IL-12p70；
IL-2和IL-21；
IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；
IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
IL-15/IL-15Rα和IL-21；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；
IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和STING GOF变体；
IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-18；
IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-18；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-2，和IL-21；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及
CD40激动剂和STING GOF变体。
220.权利要求219的免疫刺激细菌或细胞，其中所述STING GOF变体选自权利要求167或权利要求168中所示任一项。
221.权利要求26至220任一项的免疫刺激细菌，其中被编码的治疗产物包含Fc结构域。
222.权利要求26至221任一项的免疫刺激细菌，其中被编码的治疗产物包含B7蛋白质跨膜结构域。
223.权利要求26至222任一项的免疫刺激细菌，其中被编码的治疗产物是GPI锚定的。
224.权利要求26至223任一项的免疫刺激细菌，其中被编码的治疗产物包含增加所述被编码的产物的血清半衰期的人血清白蛋白或其衍生物。
225.权利要求26至224任一项的免疫刺激细菌，其中被编码的治疗产物包含与胶原蛋白的融合物。
226.权利要求26至225任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是革兰氏阴性细菌。
227.权利要求26至226任一项的免疫刺激细菌，
其中所述细菌是沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、双歧杆菌属(Bifidobacteriae)、立克次体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、李斯特菌属(Listeria)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、博德特氏菌属(Bordetella)、奈瑟菌属(Neisseria)、气单胞菌属(Aeromonas)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、霍乱弧菌属(Cholera)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、布鲁氏菌属(Brucella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、军团菌属(Legionella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)或丹毒丝菌属(Erysipelothrix)的菌株，或前述细菌菌株列表中任一的其经减毒的菌株或其经修饰的菌株。
228.权利要求26至226任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是立克次氏体立克次体(Rickettsia rickettsiae)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、恙虫立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)、莫塞氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、嗜泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、马红球菌(Rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)、五日热罗卡利马氏体菌(Rochalimaea quintana)或根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)。
229.权利要求26至228任一项的免疫刺激细菌，其是减毒细菌或革兰氏阴性细菌。
230.权利要求26至229任一项的免疫刺激细菌，其是沙门氏菌属的菌株。
231.权利要求230的免疫刺激细菌，其是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株。
232.权利要求230或231的免疫刺激细菌，其中未修饰的沙门氏菌是野生型菌株。
233.权利要求230或231的免疫刺激细菌，其中未修饰的沙门氏菌菌株是减毒菌株。
234.权利要求26至233任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌源自菌株AST-100(VNP20009或YS1646)，或菌株ATCC 14028，或具有菌株ATCC 14028的所有鉴定特征的菌株。
235.权利要求227至233任一项的免疫刺激细菌，其是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。
236.权利要求26至235任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌编码并表达补体杀伤抗性基因(rck)。
237.权利要求236的免疫刺激细菌，其中所述rck基因是沙门氏菌rck基因。
238.权利要求26至237任一项的免疫刺激细菌，当以治疗剂量静脉内施用时，当在治疗后7天测量时，诱导血清IL-6、血清TNF-α和血清IL-10均低于150pg/ml。
239.一种免疫刺激细菌，当以治疗剂量静脉内施用时，当在治疗后7天测量时，诱导血清IL-6、血清TNF-α和血清IL-10均低于150pg/ml。
240.权利要求238或239的免疫刺激细菌，其中所述剂量是1×108CFU(菌落形成单位)。
241.权利要求238或权利要求239的免疫刺激细菌，其中所述剂量是1×108CFU至1×109CFU。
242.一种免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，并且被修饰以编码和表达补体杀伤抗性(rck)基因，其中野生型细菌不编码rck。
243.权利要求242的免疫刺激细菌，其是大肠杆菌菌株。
244.一种编码具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的全部或部分胞质结构域缺失的截短的共刺激分子的递送载体，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于胞质结构域缺失而不能向APC发出反调节信号。
245.权利要求244的递送载体，其中所述共刺激分子是4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1或OX40L，或其具有缺失的或截短的胞质结构域和/或当在细胞中表达时赋予正确方向的突变的变体。
246.权利要求244或245的递送载体，其是免疫刺激细菌、外来体、纳米颗粒、溶瘤病毒或细胞。
247.权利要求244至246任一项的递送载体，其是细胞。
248.权利要求247的递送载体，其中所述细胞是干细胞。
249.权利要求248的递送载体，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。
250.权利要求249的递送载体，其中所述MSC被遗传修饰以表达免疫调节细胞因子的组合。
251.权利要求250的递送载体，其中所述细胞因子是白细胞介素12(IL-12)和白细胞介素21(IL-21)。
252.一种分离的细胞，其包含权利要求244至251任一项的递送载体。
253.一种分离的细胞，其包含权利要求26至243任一项的免疫刺激细菌。
254.权利要求252或253的细胞，其是免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞或原代细胞系。
255.权利要求254的细胞，其是造血细胞。
256.权利要求255的细胞，其是T细胞。
257.权利要求252至256任一项的细胞，其通过用所述递送载体或免疫刺激细菌感染所述细胞离体产生。
258.权利要求252至254任一项的细胞，其是非胚胎来源的干细胞。
259.权利要求252至254任一项的细胞，其中所述细胞是干细胞。
260.权利要求259的细胞，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。
261.权利要求260的细胞，其中所述MSC被遗传修饰以表达免疫调节细胞因子的组合。
262.权利要求261的细胞，其中所述细胞因子是白细胞介素12(IL-12)和白细胞介素21(IL-21)。
263.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求25至243任一项的免疫刺激细菌，或权利要求244至251任一项的递送载体，或权利要求252至262任一项的细胞。
264.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求84的免疫刺激细菌。
265.权利要求263或264的药物组合物，其被配制用于不经稀释而施用。
266.权利要求263至265任一项的药物组合物，其被配制用于全身施用。
267.权利要求263至266任一项的药物组合物，其被配制用于肠胃外施用。
268.权利要求267的药物组合物，其被配制用于静脉内施用。
269.权利要求267的药物组合物，其被配制用于肿瘤内施用。
270.权利要求267的药物组合物，其被配制用于腹膜内施用。
271.权利要求266的药物组合物，其被配制用于口服施用。
272.一种治疗受试者中包含实体瘤或血液恶性肿瘤的癌症的方法，包括施用权利要求26至243任一项的免疫刺激细菌、或权利要求244至251任一项的递送载体、或权利要求252至262任一项的细胞、或权利要求263至271任一项的药物组合物。
273.权利要求26至244任一项的免疫刺激细菌、或权利要求244至251任一项的递送载体、或权利要求252至262任一项的细胞、或权利要求263至271任一项的药物组合物在治疗受试者中包含实体瘤或血液恶性肿瘤的癌症中的用途。
274.权利要求26至244任一项的免疫刺激细菌、或权利要求244至251任一项的递送载体、或权利要求252至262任一项的细胞、或权利要求263至271任一项的药物组合物，用于治疗受试者中包含实体瘤或血液恶性肿瘤的癌症。
275.权利要求272至274任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述受试者是人。
276.权利要求272至275任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述癌症包含实体瘤。
277.权利要求272至275任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述癌症包含血液恶性肿瘤。
278.权利要求272至277任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述治疗包含其中施用第二抗癌剂或治疗的联合治疗。
279.权利要求278的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述第二抗癌剂或治疗在施用所述免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物之前、同时、之后或间歇施用。
280.权利要求278或279的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述第二抗癌剂或治疗是免疫疗法。
281.权利要求272至280任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物的施用是肠胃外施用。
282.权利要求272至280任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物的施用是经口服或直肠，或通过气雾剂吸入肺或肿瘤内施用。
283.权利要求272至280任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物的施用是经静脉内、肌内或皮下施用。
284.权利要求272至283任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述癌症选自白血病；淋巴瘤；胃癌；以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、结肠直肠、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
285.权利要求280的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫疗法包括施用抗PD-1或抗PD-L1或抗CTLA-4抗体，或其抗原结合部分或形式。
286.权利要求272至285任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属或大肠杆菌物种。
287.权利要求272至286任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是沙门氏菌属物种。
288.权利要求272至287任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是鼠伤寒沙门氏菌菌株。
289.权利要求272至288任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌的施用是通过腹膜内或肿瘤内施用。
290.权利要求272至289任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述受试者患有转移性癌症。
291.权利要求272至290任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，包含施用第二抗癌治疗，其中所述第二治疗选自抗PD-1、抗-CTLA-4、抗PD-L1、抗IL-6、抗Siglec-15、抗VEGF、抗CD73和抗CD38抗体，或其抗原结合部分或形式。
292.权利要求272至291任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，包括施用第二或进一步的抗癌治疗，其中所述第二或进一步的治疗选自聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、化疗剂、抗EGFR抗体、CAR-T细胞、抗Her2抗体、抗间皮素抗体和抗-B细胞成熟抗原(BCMA)抗体。
293.权利要求272至292任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、递送载体、细胞或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。
294.一种选择用权利要求26至244任一项的免疫刺激细菌、或权利要求244至251任一项的递送载体、或权利要求252至262任一项的细胞、或权利要求263至271任一项的药物组合物治疗的对象的方法，包括：
从受试者获取生物样品；和
检测指示免疫豁免型或免疫沙漠型肿瘤表型的一种或多种生物标志物。
295.权利要求294的方法，其中所述生物标志物选自：
一种检验，其指示T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)浸润到肿瘤微环境中；
一种生物标志物，其测量T细胞或TIL对肿瘤和肿瘤核心的侵袭边缘的限制；
TIL的水平；
腺苷特征(Nanostring)，其指示CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、THBS1、IL-6、CSF-3、IL-1β、CCL2、CCL3或CCL7；
骨髓特征(Nanostring)，其指示CXXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、IL-6或PTGS2；和
CD3、CD8、CD73、CD39、TNAP(组织非特异性碱性磷酸酶)、CD38、CD45、CD68、PD-L1和FoxP3中一种或多种的水平。
296.一种使用权利要求26至244任一项的免疫刺激细菌或权利要求244至251任一项的递送载体或权利要求252至262任一项的细胞或权利要求263至271任一项的药物组合物监测治疗的方法，包括：
从受试者获得生物样品，并检测生物标志物水平的变化，其中：
指示抗癌表型的生物标志物的增加表示治疗是有效的；和
所述生物标志物是指示细胞因子应答、I型干扰素激活或II型干扰素激活的任何生物标志物。
297.权利要求296的方法，其中：
所述生物标志物选自CXCL10/IP-10、CXCL9、干扰素-α、干扰素-β、促炎血清细胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1、或CCL2和IL-18结合蛋白中一种或多种的水平；和
一种或多种所述生物标志物的水平的增加表示治疗是有效的。
298.权利要求294至297任一项的方法，其中所述生物样品是肿瘤活组织检查样品或体液样品。
299.权利要求294至298任一项的方法，进一步包括施用权利要求26至244任一项的免疫刺激细菌，或权利要求244至251任一项的递送载体，或权利要求252至262任一项的细胞，或权利要求263至271任一项的药物组合物。
300.来自非人物种的经修饰的干扰素基因刺激因子(STING)蛋白，其中非人STING与人STING相比具有较低的NF-κB信号传导活性，并且任选与人STING相比具有较高的I型干扰素(IFN)通路信号传导活性，其中：
对所述非人STING蛋白进行修饰以包括一个或多个突变，由此其具有增加的活性或在不存在胞质核酸的情况下组成型起作用；
所述突变是氨基酸的插入、缺失和/或置换；和
所述STING蛋白任选具有TRAF6结合位点的缺失或破坏。
301.来自非人物种的经修饰的干扰素基因刺激因子(STING)蛋白，或嵌合人STING蛋白及其修饰，其包含与功能获得(GOF)相关的一个或多个突变，所述突变导致编码的STING蛋白的组成型激活和/或增强的敏感性，或与内源配体增加的亲和性或结合，由此所述STING蛋白通过一个或多个氨基酸的插入、缺失和置换中的一种或多种进行修饰；
所述STING蛋白与人STING相比具有IFN-β信号传导活性，及减弱的活化B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导活性；和
所述一个或多个突变在诱导IFN-β产生中导致增加的STING活性或组成型活性。
302.权利要求300或权利要求301的经修饰的STING蛋白，其中所述人STING蛋白包含SEQ ID NO:305-309任一所示序列，或者是其与SEQ ID NO:305-309任一所示氨基酸序列具有至少98％序列相同性的人等位基因变体。
303.权利要求300至302任一项的经修饰的STING蛋白，其中：
所述STING蛋白是嵌合体，其包含将来自第一物种的STING蛋白中的C末端尾区(CTT)用来自第二物种的STING蛋白的CTT置换；
所述第二种STING蛋白的NF-κB信号传导活性低于人STING的NF-κB信号传导活性；和
任选缺失CTT中的TRAF6结合位点。
304.权利要求300至303任一项的经修饰的STING蛋白，其中所述一个或多个突变是对应于与自身炎症性疾病STING相关血管病(SAVI)相关的那些突变的任何突变。
305.一种经修饰的干扰素基因刺激因子(STING)蛋白，其是嵌合体，包含将来自第一物种的STING蛋白中的CTT(C-末端尾)区用来自第二物种的STING蛋白的CTT置换，其中：
所述第二物种的STING蛋白的NF-κB信号传导活性低于人STING的NF-κB信号传导活性；和
任选缺失CTT中的TRAF6结合位点。
306.权利要求303至305任一项的经修饰的STING蛋白，其中所述人STING蛋白包含SEQID NO:305-309任一所示序列，或者是其与SEQ ID NO:305-309任一所示氨基酸序列具有至少98％序列相同性的人等位基因变体。
307.权利要求303至306任一项的经修饰的STING蛋白，其中所述第一物种是人类，并且所述第二物种选自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠和鬼鲨。
308.权利要求300至307任一项的经修饰的STING蛋白，其中I型IFN信号传导活性是野生型人STING蛋白的至少或至少约30％。
309.权利要求300至308任一项的经修饰的STING蛋白，其中所述NF-κB信号传导活性低于野生型人STING NF-κB信号传导活性的30％、低于野生型人STING NF-κB信号传导活性的20％、低于野生型人STING NF-κB信号传导活性的15％、低于野生型人STING NF-κB信号传导活性的10％或低于野生型人STING NF-κB信号传导活性的5％。
310.权利要求300至309任一项的经修饰的STING蛋白，其中所述非人物种或第二物种选自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠和鬼鲨。
311.权利要求300至310任一项的经修饰的STING蛋白，其中通过参考和与人STING比对，所述STING的修饰是对应于在干扰素病中发生的突变的一个或多个突变，其中进行比对的人STING序列在SEQ ID NO:305-309任一所示。
312.权利要求300至311任一项的经修饰的STING蛋白，其包含C-末端尾区(CTT)用来自与人STING的NF-κB信号传导活性相比具有降低的NF-κB信号传导活性的STING蛋白的CTT置换。
313.权利要求312的经修饰的STING蛋白，其中所述置换CTT来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨STING蛋白。
314.权利要求312的经修饰的STING蛋白，其中所述置换CTT来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨STING蛋白，并且其置换人STING CTT。
315.权利要求313或314的经修饰的STING蛋白，其中所述置换CTT选自以下物种，并且具有以下序列：
袋獾RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF SEQ ID NO:371，狨猴EEEEVTVGSLKTSEVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRSDLF SEQ ID NO:372，牛EREVTMGSTETSVMPGSSVLSQEPELLISGLEKPLPLRSDVF SEQ ID NO:373，猫EREVTVGSVGTSMVRNPSVLSQEPNLLISGMEQPLPLRTDVF SEQ ID NO:374，鸵鸟RQEEYTVCDGTLCSTDLSLQISESDLPQPLRSDCL SEQ ID NO:375，野猪EREVTMGSAETSVVPTSSTLSQEPELLISGMEQPLPLRSDIF SEQ ID NO:376，蝙蝠EKEEVTVGTVGTYEAPGSSTLHQEPELLISGMDQPLPLRTDIF SEQ ID NO:377，海牛EREEVTVGSVGTSVVPSPSSPSTSSLSQEPKLLISGMEQPLPLRTDVF SEQ ID NO:378，
朱鹮CHEEYTVYEGNQPHNPSTTLHSTELNLQISESDLPQPLRSDCF SEQ ID NO:379，腔棘鱼
(变体1)QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKRQVC SEQ IDNO:380，
腔棘鱼
(变体2)QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKSGF SEQ ID NO:381，鬼鲨LTEYPVAEPSNANETDCMSSEPHLMISDDPKPLRSYCP SEQ ID NO:383，及小鼠EKEEVTMNAPMTSVAPPPSVLSQEPRLLISGMDQPLPLRTDLI SEQ ID NO:384，或这些序列中每一个的与其具有至少98％序列相同性的等位基因变体。
316.权利要求314或315的经修饰的STING蛋白，其中所述人CTT包含序列EKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(SEQ ID NO:370)，或者是与其具有至少98％序列相同性的等位基因变体。
317.权利要求305至316任一项的经修饰的STING蛋白，其中所述经修饰的STING蛋白是其中人STING CTT被来自袋獾STING的CTT置换的嵌合体。
318.权利要求317的经修饰的STING蛋白，其中所述来自袋獾STING的C末端尾区(CTT)包含序列：RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQELISGMEQPLSLRTDGF(SEQ ID NO:371)，或者是与其具有至少98％序列相同性的等位基因变体。
319.权利要求300至318任一项的经修饰的STING蛋白，其包含TRAF6结合位点的缺失或破坏。
320.权利要求319的经修饰的STING蛋白，其中所述STING蛋白是人STING蛋白，并且TRAF6结合位点包含在C端的氨基酸残基DFS。
321.权利要求300至320任一项的经修饰的STING蛋白，其包含增加I型干扰素信号传导活性或在不存在胞质核酸的情况下使所述活性是组成型活性的修饰。
322.权利要求321的经修饰的STING蛋白，其中通过参考和与人STING比对，所述修饰对应于在干扰素病中发生的突变，其中所述人STING蛋白具有SEQ IDNO:305-309任一所示序列。
323.权利要求300至322任一项的经修饰的STING蛋白，其中通过参考和与SEQ ID NO:305-309任一所示的人STING的序列比对，所述修饰是对应于以下一个或多个置换的一个或多个氨基酸置换：S102P、V147L、V147M、N154S、V155M、G166E、C206Y、G207E、S102P/F279L、F279L、R281Q、R284G、R284S、R284M、R284K、R284T、R197A、D205A、R310A、R293A、T294A、E296A、R197A/D205A、S272A/Q273A、R310A/E316A、E316A、E316N、E316Q、S272A、R293A/T294A/E296A、D231A、R232A、K236A、Q273A、S358A/E360A/S366A、D231A/R232A/K236A/R238A、S358A、E360A、S366A、R238A、R375A和S324A/S326A。
324.权利要求323的经修饰的STING蛋白，参考与SEQ ID NO:305-309任一所示的人STING的序列比对，其包含对应于C206Y或R284G的置换。
325.权利要求324的经修饰的STING蛋白，其包含对应于N154S/R284G的置换。
326.权利要求300的经修饰的STING蛋白，其是袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨STING蛋白。
327.一种递送载体，其包含编码权利要求300至326任一项的经修饰的STING蛋白的核酸。
328.一种递送载体，其包含编码来自非人物种的STING蛋白的核酸，其中所述STING蛋白具有I型IFN信号传导活性，及与人STING的NF-κB信号传导活性相比减弱的NF-κB信号传导活性。
329.权利要求328的递送载体，其中所述人STING蛋白包含SEQ ID NO:305-309任一所示序列，或者是其与SEQ ID NO:305-309任一所示氨基酸序列具有至少98％序列相同性的人等位基因变体。
330.权利要求328或329的递送载体，其中所述I型IFN信号传导活性是野生型人STING的I型IFN信号传导活性的至少或至少约30％。
331.权利要求327至330任一项的递送载体，其中所述非人STING蛋白的NF-κB信号传导活性小于人STING的NF-κB信号传导活性的30％、小于人STING的NF-κB信号传导活性的20％、小于人STING的NF-κB信号传导活性的15％、小于人STING的NF-κB信号传导活性的10％或小于人STING的NF-κB信号传导活性的5％。
332.权利要求327至331任一项的递送载体，其中所述非人物种是袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨。
333.权利要求327至332任一项的递送载体，其是细胞、外来体、溶瘤病毒或病毒载体、脂质体或其它基于脂质的载体，或免疫刺激细菌。
334.权利要求333的递送载体，其中所述递送载体是干细胞或免疫细胞的细胞。
335.权利要求333的递送载体，其中所述递送载体是权利要求26至243任一项的免疫刺激细菌。
336.权利要求335的递送载体，其中所述免疫刺激细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。
337.权利要求335的递送载体，其中所述免疫刺激细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、pagP-、lppA-和lppB-。
338.一种免疫刺激细菌，其包含编码权利要求300至326任一项的经修饰的STING蛋白的质粒，或编码来自非人物种的STING蛋白的质粒，其中被编码的STING蛋白具有I型IFN信号传导活性，及具有与人STING的NF-κB信号传导活性相比减弱的NF-κB信号传导活性。
339.权利要求338的免疫刺激细菌，其是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-，其中野生型细菌具有鞭毛和pagP-。
340.权利要求338的免疫刺激细菌，其是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)，其中野生型细菌具有鞭毛、pagP-、lppA-和lppB-。
341.权利要求338至340任一项的免疫刺激细菌，其中所述非人物种选自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠和鬼鲨。
342.权利要求338至341任一项的免疫刺激细菌，或权利要求295至297任一项的递送载体，其中所述免疫刺激细菌是革兰氏阴性细菌。
343.权利要求338至342任一项的免疫刺激细菌，或权利要求295至297任一项的递送载体，其中所述免疫刺激细菌是沙门氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、双歧杆菌属、立克次体属、弧菌属、李斯特菌属、克雷伯氏菌属、博德特氏菌属、奈瑟菌属、气单胞菌属、弗朗西斯氏菌属、霍乱弧菌属、棒状杆菌属、柠檬酸杆菌属、衣原体属、嗜血杆菌属、布鲁氏菌属、分枝杆菌属、支原体属、军团菌属、红球菌属、假单胞菌属、螺杆菌属、芽孢杆菌属或丹毒丝菌属的菌株，或前述细菌菌株列表中任一的其经减毒的菌株或其经修饰的菌株。
344.权利要求338至342任一项的免疫刺激细菌，或权利要求327至337任一项的递送载体，其中所述免疫刺激细菌是立克次氏体立克次体、普氏立克次氏体、恙虫立克次体、莫塞氏立克次氏体、西伯利亚立克次体、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、嗜泉气单胞菌、杀鲑气单胞菌、土拉弗朗西斯氏菌、假结核棒杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎衣原体、睡眠嗜血杆菌、流产布鲁氏菌、胞内分枝杆菌、嗜肺军团菌、马红球菌、铜绿假单胞菌、鼬鼠螺杆菌、霍乱弧菌、枯草芽孢杆菌、红斑丹毒丝菌、小肠结肠炎耶尔森杆菌、五日热罗卡利马氏体菌或根癌农杆菌，或前述细菌菌株列表中任一的其经减毒的菌株或其经修饰的菌株。
345.权利要求338至342任一项的免疫刺激细菌，或权利要求327至337任一项的递送载体，其中所述免疫刺激细菌是经减毒的细菌。
346.权利要求338至342任一项的免疫刺激细菌，或权利要求327至337任一项的递送载体，其中所述细菌是沙门氏菌属菌株。
347.权利要求346的免疫刺激细菌或递送载体，其中所述细菌是鼠伤寒沙门氏菌菌株。
348.权利要求346或347的免疫刺激细菌或递送载体，其中未修饰的沙门氏菌是野生型菌株。
349.权利要求346或347的免疫刺激细菌或递送载体，其中未修饰的沙门氏菌菌株是经减毒的菌株。
350.权利要求327至349任一项的免疫刺激细菌或递送载体，其中所述免疫刺激细菌源自菌株AST-100(VNP20009或YS1646)，或源自菌株ATCC 14028，或是具有菌株ATCC 14028的所有鉴定特征的菌株。
351.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求300至326任一项的经修饰的STING蛋白、或权利要求327至337任一项的递送载体、或权利要求338至350任一项的免疫刺激细菌。
352.一种分离的细胞，其包含权利要求300至326任一项的经修饰的STING蛋白、或权利要求327至337任一项的递送载体、或权利要求338至350任一项的免疫刺激细菌，其中所述细胞不是人受精卵的合子。
353.权利要求352的细胞，其是免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞或原代细胞系。
354.一种分离的细胞或培养的细胞，其包含权利要求338至350任一项的免疫刺激细菌。
355.权利要求353或354的细胞，其是造血细胞。
356.权利要求355的细胞，其是T细胞。
357.权利要求352至356任一项的细胞，其通过用所述免疫刺激细菌或递送载体感染所述细胞而离体产生。
358.权利要求357的细胞，其是T细胞或造血细胞。
359.一种治疗癌症的方法，包括为患有癌症的受试者施用权利要求300至326任一项的经修饰的STING蛋白、或权利要求327至337任一项的递送载体、或权利要求348至350任一项的免疫刺激细菌、或权利要求351的药物组合物、或权利要求352至358任一项的细胞，所述癌症包含实体瘤或是血液恶性肿瘤。
360.权利要求359的方法，其中所述癌症包含实体瘤。
361.权利要求359或360的方法，其中所述癌症是转移的癌症。
362.权利要求359至361任一项的方法，其中所述癌症选自淋巴瘤；白血病；胃癌；以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、结肠直肠、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
363.权利要求300至326任一项的经修饰的STING蛋白、或权利要求327至337任一项的递送载体、或权利要求338至350任一项的免疫刺激细菌、或权利要求351的药物组合物、或权利要求352至358任一项的细胞用于治疗癌症的用途。
364.权利要求363的用途，其中所述癌症包含实体瘤或血液恶性肿瘤。
365.权利要求363或364的用途，其中所述癌症是转移的癌症。
366.权利要求363至365任一项的用途，其中所述癌症选自淋巴瘤；白血病；胃癌；及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、结肠直肠、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
367.权利要求300至366任一项的经修饰的STING蛋白、递送载体、免疫刺激细菌、药物组合物、细胞、方法或用途，其中所述非人STING蛋白具有SEQ ID NO:349、356或359-369任一所示氨基酸序列，或者是每个物种的STING蛋白的等位基因变体，所述变体与SEQ ID NO:349、356或359-369任一所示氨基酸序列具有至少98％的序列相同性。
368.权利要求300至366任一项的经修饰的STING蛋白、递送载体、免疫刺激细菌、药物组合物、细胞、方法或用途，其中所述非人STING蛋白或嵌合体具有SEQ IDNO:350-355、357或358任一所示氨基酸序列。
369.一种将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型的方法，包括将权利要求26至343和338至350任一项的免疫刺激细菌施用于患有通过增强抗肿瘤免疫反应以治疗的病况、疾病或病症的受试者。
370.权利要求25至343和338至350任一项的免疫刺激细菌用于在患有癌症的受试者中将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型巨噬细胞的用途，或权利要求25至343和338至350任一项的免疫刺激细菌，其用于在患有癌症的受试者中将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型巨噬细胞的用途，由此所述抗肿瘤免疫反应被诱导或增强。
371.权利要求369的方法或权利要求370的用途或细菌，其中所述疾病、病症或病况是包括实体瘤的癌症。
372.一种分离的细胞，其包含权利要求26至243和338至350任一项的免疫刺激细菌。
373.权利要求372的细胞，其是免疫细胞或干细胞。
374.权利要求373的细胞，其中所述细胞是干细胞，所述干细胞不是胚胎干细胞。
375.权利要求373的细胞，其是T细胞。
376.权利要求375的细胞，其是CAR-T细胞。
377.一种治疗癌症的方法，包括施用权利要求372至376任一项的细胞。
378.权利要求372至376任一项的细胞，用于治疗癌症。
379.权利要求372至376任一项的细胞用于治疗癌症的用途。
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