CN113249382B

CN113249382B - 下调TRIM56基因表达的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN113249382B
Application number: CN202110388965.2A
Authority: CN
Inventors: 高洁; 李日著; 王居平
Original assignee: Youjiang Medical University for Nationalities
Current assignee: Youjiang Medical University for Nationalities
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113249382A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及下调TRIM56基因表达的siRNA及其应用，本发明通过研究分析发现TRIM56基因与细胞自噬蛋白呈负相关，具体为，上调TRIM56基因，则LC3BII基因下调，p62基因上调食管癌细胞Eca‑109自噬功能减弱；而下调TRIM56基因，则LC3BII基因上调，p62基因下调食管癌细胞Eca‑109自噬功能增强；同时在设计下调的siRNA中，发现当使用siRNA干扰TRIM56基因表达、下调时，食管癌细胞Eca‑109自噬功能增强时，其细胞生长受到抑制，有一定的食管癌治疗作用，同时，siRNA也用于制备相应的药物，来对食管癌进行治疗。

Description

下调TRIM56基因表达的siRNA及其应用

【技术领域】

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及下调TRIM56基因表达的siRNA及其应用。

【背景技术】

食管癌(esophageal carcinoma)又叫食道癌，是临床上最常见的消化道恶性肿瘤疾病之一。是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有30万人死于食管癌，其分布呈现地域性特征，我国是世界上食管癌高发地区之一，食管癌的发生原因与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤以及遗传因素等有关。典型的症状为进行性吞咽困难，先是难咽下干的食物，继而是半流质食物最后水和唾液也不能咽下。

目前，临床上的治疗方法有手术治疗、放疗、化疗、中医抗瘤治疗等治疗手段，来自世界卫生组织国际癌症研究机构的报告显示，食管癌发病率位于世界恶性肿瘤排行榜的第八位，其死亡率位于第六位。中国食管癌的新发病例和死亡率均位居世界第一位。因此，研究食管癌治疗的相关药物是我们目前肿瘤研究中亟需解决的技术问题。

自噬(autophagy)是细胞维持自身生理稳态的一种机制，是细胞中不被使用的组分和受损细胞器被降解与再利用的一种基本过程。细胞自噬活性异常或失控，会导致人体免疫、病原微生物感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性疾病等的发生，而自噬活性调节剂(激活或诱导剂，以及抑制剂)有望成为治疗肿瘤、病原微生物感染、免疫性疾病、Ⅱ型糖尿病和神经退行性疾病(例如帕金森症)等的药物；促进癌细胞自噬能有效的起到对癌症进行治疗的作用。

然而，细胞自噬是一个多阶段过程，涉及数十种自噬相关蛋白(ATG)的参与。在细胞启动自噬机制时，自噬体和自噬溶酶体的形成均是非常重要的环节。在研究细胞自噬过程中通常将LC3B-II作为自噬体形成的标志蛋白，LC3B-II是检测细胞自噬活性增高或降低的重要指标。p62作为自噬底物的受体，其水平变化再结合LC3B-II水平变化，可以作为自噬流是否正常的判断标准；通常LC3B-II水平升高、p62水平降低则说明自噬过程增强，反之则说明自噬过程降低；而通过研究癌细胞自噬而得出治疗癌症的药物是目前基因药物研究的新型途径。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要针对癌细胞的自噬功能研究与癌细胞自噬相关的基因，并设计出可干扰其下调表达的siRNA，实现对癌细胞自噬功能的调控，研发相应的肿瘤治疗基因药物。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

下调TRIM56基因表达的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3中的任意一个。

进一步的，所述TRIM56基因与癌细胞自噬呈负相关。

本发明还包括一种下调TRIM56基因表达的siRNA在促进癌细胞自噬、凋亡中的应用。

本发明还包括一种下调TRIM56基因表达的siRNA促进癌细胞自噬、凋亡中的方法，所述方法为，在癌细胞中转染所述siRNA，下调TRIM56基因表达，实现自噬信号通路相关基因LC3BII的上调表达、p62基因下调表达，促进癌细胞自噬。

进一步的，所述癌细胞为食管癌细胞。

本发明还包括一种下调TRIM56基因表达的siRNA在制备促进癌细胞自噬、凋亡药物中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过研究分析发现TRIM56基因与细胞自噬蛋白呈负相关，具体为，上调TRIM56基因，则LC3BII基因下调，p62基因上调食管癌细胞Eca-109自噬功能减弱；而下调TRIM56基因，则LC3BII基因上调，p62基因下调食管癌细胞Eca-109自噬功能增强；同时在设计下调的siRNA中，发现当使用siRNA干扰TRIM56基因表达、下调时，食管癌细胞Eca-109自噬功能增强时，其细胞生长受到抑制，有一定的食管癌治疗作用，同时，siRNA也用于制备相应的药物，来对食管癌进行治疗。

【附图说明】

图1是TRIM56基因在食管癌组织的表达情况图；其中A是试管鳞状癌细胞、B是食管腺癌细胞、C为正常的食管粘膜组织；

图2是下调TRIM56基因的siRNA WB分析表达图；

图3是基因芯片分析散点图；

图4是TRIM56参与多种细胞生物过程图(TRIM56参与多种细胞生物过程)；

图5是TRIM56参与多条细胞信号通路图；

图6是TRIM56参与PI3K/AKT/FOXO信号通路图(TRIM56参与PI3K/AKT/FOXO信号通路)；

图7是TRIM56下调后差异基因表达情况图；

图8是过表达TRIM56后自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4的RT-qPCR表达情况图；

图9是下调TRIM56后自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4的RT-qPCR表达情况图；

图10是过表达TRIM56后自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4的WB检测图；

图11是下调TRIM56后自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4的WB检测图；

图12是下调TRIM56基因后LC3BII蛋白在细胞浆的表达情况图；

图13是MTT法绘制细胞Eca109的生长曲线图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

下调TRIM56基因表达的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列为：TRIM56 siRNA1：5’-GCACGGCTCTATCTCATCA-3’；(SEQ ID NO.1)、TRIM56 siRNA2：5’-CCAGAAGGATGGTGGGAAA-3’；(SEQ ID NO.2)、TRIM56 siRNA3：5’-TGACCCTTCGAGAAGTCAA-3’(SEQ ID NO.3)中的任意一个。

实施例2：

siRNA片段的获得：

用TRIM56单克隆抗体进行免疫组化检测；染色结果参见图1，图1中，左列为DAB显色切片，右列为HE复染切片；从上到下依次为：A、食管鳞状癌细胞染色情况、B、食管腺癌细胞染色情况和C、正常食管粘膜组织染色情况；

从图1中可见，TRIM56在食管癌组织中呈高表达。

因此，根据TRIM56基因设计siRNA分子，siRNA分子可以通过本领域常用的方法制备，可以体外制备siRNA之后将其转染到细胞中，也可通过化学合成、体外转录或由siRNA表达质粒或病毒载体在细胞中表达来制备；根据抑制效果，挑选出了具有较好抑制效果的siRNA，其序列如下：TRIM56 siRNA1：5’-GCACGGCTCTATCTCATCA-3’；(SEQ ID NO.1)、TRIM56siRNA2：5’-CCAGAAGGATGGTGGGAAA-3’；(SEQ ID NO.2)、TRIM56 siRNA3：5’-TGACCCTTCGAGAAGTCAA-3’(SEQ ID NO.3)。并设计一组阴性对照：Control siRNA。

实施例3：

运用siRNA干扰技术下调食管癌细胞Eca-109检测TRIM56的表达：

将上述的Control siRNA、TRIM56 siRNA1、TRIM56 siRNA2、TRIM56 siRNA3片段对食管癌细胞Eca-109细胞进行转染，72h后收集细胞，并做WB分析，结果如图2所示：TRIM56siRNA2片段的下调效果最显著。

实施例4：

基因芯片和生物信息学分析结果：

将Control siRNA和TRIM56 siRNA2瞬时转染到食管癌细胞Eca-109后，收集细胞送上海伯豪生物技术有限公司做基因芯片分析，结果如图3-图7所示：表明TRIM56参与以下细胞内多种生物过程，其中包括消化系统、特定类型的癌症、细胞生长和死亡、免疫疾病、内分泌和代谢疾病等，TRIM56参与30条重要的细胞信号通路，其中包括有FOXO信号通路，TNF信号通路，雌激素信号通路，RAS信号通路，Notch信号通路等，同时，TRIM56参与调控PI3K/AKT/FOXO信号通路，由此说明基因TRIM56参与体内多条重要细胞通路，且与消化系统、特定类型的癌症、细胞生长和死亡、免疫疾病、内分泌和代谢疾病密切相关。具有很高的研究的价值和意义。

实施例5：

研究TRIM56基因与自噬信号通路相关基因的调控关系，具体如下：

本实验选择干扰片段：TRIM56 siRNA2：5’-CCAGAAGGATGGTGGGAAA-3’；来完成实验，通过干扰技术下调TRIM56表达：在食管癌细胞Eca-109中转染Control siRNA和TRIM56siRNA1片段；通过转入TRIM56基因的过表达载体来实现上调TRIM56基因的表达；在上述过程中用RT-qPCR或WB检测自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4的表达。结果显示：TRIM56负性调控自噬相关基因表达，具体如图8-11所示：

图8中为采用RT-qPCR检测上调了TRIM56表达后，自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4在Eca-109食管癌细胞中的表现情况，可见：LC3BII基因、ATG12基因、PIK3CB基因和FOXO4基因都变现出了表达上调，而p62基因表现出了表达下调；

图9为采用RT-qPCR检测下调了TRIM56表达后，自噬信号通路相关基因LC3BII、p62、ATG12、PIK3CB、FOXO4在Eca-109食管癌细胞中的表现情况，可见：LC3BII基因、ATG12基因、PIK3CB基因和FOXO4基因都变现出了表达下调，而p62基因表现出了表达上调；

同时，出了采用RT-qPCR检测外，申请人还通过WB检测，检测结果如下：

图10是上调TRIM56基因的表达的结果图，从图中可看到，上调TRIM56后，LC3BI基因、LC3BII基因表达下调，p62基因表达上调，与RT-qPCR检测结果一致；

图11是下调TRIM56基因的表达的结果图，从图中可看到，下调TRIM56后，LC3BI基因、LC3BII基因表达上调，p62基因表达下调，与RT-qPCR检测结果一致。

实施例6：

通过荧光免疫技术检测下调TRIM56后LC3BII的定位，具体方法如下：

1.在培养板中将已爬好细胞(细胞密度为30％)的玻片用PBS浸洗3次，每次5min；

2.用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次5min；

3. 0.2％Triton X-100室温通透20min；

4.PBS浸洗玻片3次，每次5min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min，PBS浸洗玻片3次，每次5min；

5.每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

6.加荧光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次5min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育2h，PBS浸洗切片3次，每次5min(从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行)；

7.复染核：滴加DAPI避光孵育10min，对标本进行染核；

8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

结果如图12所示：明显可见，下调TRIM56后LC3BII表达增多，LC3BII蛋白在细胞浆中聚集。

因此，说明利用siRNA干扰片段下调TRIM56基因后，使得食管癌细胞自噬标志物LC3BII增加，能加快癌细胞自噬，使癌细胞凋亡。

实施例7：

通过MTT实验检测细胞增殖能力实验分为4组：对照组1为：阴性质粒对照组(含有转染试剂和Control siRNA)；对照组2为：转染试剂对照组(仅含转染试剂不含有任何siRNA片段)；实验组：TRIM56 siRNA实验组(含TRIM56 siRNA2和转染试剂)；空白组：食管癌Eca-109细胞。

将上述各组实验材料转染食管癌细胞Eca-109，完成细胞接种，然后放入培养板中持续培养5d，并不定期用酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A值)，以时间为X轴，吸光度为Y轴，绘制生长曲线，计算第5d的细胞生长抑制率：抑制率(％)＝(1-实验组A均值/空白组A均值)×100％。得到的生长细胞生长曲线图如图13所示，从图中可以看出，实验组即含TRIM56 siRNA2和转染试剂转染的细胞其生长明显受到抑制。

抑制率如表1所示：

表1第5d的Eca-109细胞生长抑制率

组别	对照组1	对照组2	实验组
				细胞抑制率(％)	6.21	6.44	59.82

从表1可见，实验组对Eca-109细胞具有显著的抑制作用，其第5d抑制率可高达59.82％；而对照组1和对照组2对Eca-109细胞不具备明显的抑制作用，由此说明TRIM56siRNA2可抑制食管癌细胞的生长。

实施例8：

从实施例7可以看出，本申请的siRNA干扰片段可以对Eca-109细胞生长起到抑制作用，由此可以将其制备成自噬活性调节剂或药品用于治疗食管癌。

综上，说明TRIM56基因与食管癌细胞的自噬功能呈负相关的作用，本申请的siRNA具有抑制食管癌的TRIM56基因表达的作用，且申请人通过研究发现TRIM56基因与食管癌细胞自噬通路的相关基因具有负相关的作用，即，上调TRIM56基因表达就会抑制LC3BII基因表达，下调TRIM56基因表达就会促进LC3BII基因表达；通过此特性，通过siRNA的干扰TRIM56基因的表达，达到促进食管癌细胞自噬，促进食管癌细胞凋亡抑制癌细胞生长的作用为食管癌治疗提供一种新的治疗依据。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 右江民族医学院

<120> 下调TRIM56基因表达的siRNA及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcacggctct atctcatca 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagaaggat ggtgggaaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacccttcg agaagtcaa 19

Claims

1.下调TRIM56基因表达的siRNA在制备促进癌细胞自噬、凋亡药物中的应用，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述癌细胞为食管癌细胞。