CN101155911B - 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法 - Google Patents

5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101155911B
CN101155911B CN200680011344.6A CN200680011344A CN101155911B CN 101155911 B CN101155911 B CN 101155911B CN 200680011344 A CN200680011344 A CN 200680011344A CN 101155911 B CN101155911 B CN 101155911B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tolerance
bacterium
fluorouracil
isocytosine deaminase
bifidobacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200680011344.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101155911A (zh
Inventor
浜地芳典
藤森实
天野纯
谷口俊一郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asusa Medical Sciences Ltd
Original Assignee
Anaeropharma Science Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anaeropharma Science Inc filed Critical Anaeropharma Science Inc
Publication of CN101155911A publication Critical patent/CN101155911A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101155911B publication Critical patent/CN101155911B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供下述耐受菌的制备方法，所述耐受菌为在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶(CD)且对至少抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)具有耐受能力的表达CD的5-FU耐受菌。具体而言，包括将在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的表达CD的菌在5-氟胞嘧啶(5-FC)的存在下传代、驯化培养的方法A，或者包括将(1)在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达CD的菌在5-FU的存在下传代、驯化培养，制备5-FU耐受菌的步骤，和(2)向该5-FU耐受菌中导入CD基因进行转化的步骤的方法B。此外，本发明还提供这种表达CD的5-FU耐受菌以及含有该耐受菌的药物组合物。

Description

5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及下述菌的制备方法，所述菌可以用作实体肿瘤治疗药物，能够在厌氧环境下在肿瘤组织内生长，能够表达胞嘧啶脱氨酶(EC3.5.4.1；以下称CD)，并且至少具有对抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶(以下称为5-FU)的耐受能力的表达CD的5-FU耐受菌。此外，本发明涉及5-FU耐受菌、含有该耐受菌的药物组合物、以及含有该耐受菌的实体肿瘤治疗药物。
背景技术
CD是使胞嘧啶脱氨化成为尿嘧啶的酶(例如，参见非专利文献1)。CD是在微生物的代谢中起着重要作用的酶，能够从多种不同的微生物中分离得到，不过在哺乳动物细胞中通常不产生这种CD(例如，参见非专利文献2)。产生CD的多种细菌以及真菌将5-氟胞嘧啶(以下称为5-FC)转换成对细胞有致死性的具有极强毒性的的代谢物5-FU。5-FU导致生成异常的RNA以及抑制DNA合成，5-FC的抗真菌作用正是通过这种5-FU的导致异常RNA生成和抑制DNA合成的作用。
即，5-FC通过胞嘧啶透性酶而被摄取到真菌细胞内，在细胞内5-FC经由CD直接转换成5-FU。细胞内的5-FU由5-FUMP在UMP-焦磷酸化酶的作用下转换成5-FUDP。此外，其在先的磷酸化途径分成两条，一条生成5-FUTP，另一条生成5-FdUMP。此处，5-FUTP代替UTP，通过被掺入到RNA中，生成异常的RNA，抑制正常的蛋白质合成，结果抑制真菌的生长。另外，5-FdUMP作为胸腺嘧啶酸合成酶的有力的抑制剂而发挥作用，抑制DNA合成、核分裂，展示出杀菌效果。
不过，因为正常的哺乳动物细胞不表达有意义量的CD，所以不能将5-FC脱氨为有毒的代谢物5-FU，所以5-FC即使达到表现出强的抗菌活性浓度也对哺乳动物细胞无毒。另一方面，5-FU对哺乳动物细胞具有强的细胞毒性作用，作为抗癌制剂而广泛使用。
从大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母菌(Saccharomycescerevisiae)分离、克隆出CD基因(例如参见非专利文献3、4)。并且，多个研究人员通过将该CD基因导入到哺乳动物细胞，在体外试验中，这些细胞表示出对5-FC的选择性敏感度降低(例如参见非专利文献3、5)。此外，使用了逆转录病毒载体而将CD基因导入其中的肿瘤细胞在体内表现出能够通过5-FC的动物的全身治疗而被排除(例如参见非专利文献6～8)。此外，复制缺陷的腺病毒载体(例如参见非专利文献9)以及阳离子性脂质体(例如参见非专利文献10)或者分别向人大肠癌细胞以及小鼠的巨大细胞肺癌中导入CD基因而加以利用。通过在这些肿瘤细胞内进行基因表达而赋与对5-FC的敏感度。
已知在念珠菌(Candida)等真菌感染症中使用的5-FC容易获得耐受性(例如参见非专利文献11)。因为对5-FC的耐受性是由于与向5-FU转换、向RNA掺入等相关的任何的酶的丧失或者突变引起的，因此认为理论上有多种耐受性机制。在临床上频率最高的是白色念珠菌中的伴随UMP-焦磷酸化酶的丧失、或者活性降低而获得的耐受性，已经明确5-FC敏感度与UMP-焦磷酸化酶酶活性相关。据报道在细胞核相为一倍体的Candida glabrata中，有由于胞嘧啶透性酶或CD的缺陷而导致产生的耐受菌株。
另一方面，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是革兰氏阳性厌氧性细菌，其基因组中的GC含量高(例如，参见非专利文献12)。该长双歧杆菌是非病原性的，在人或者其他动物的大肠中构成正常的微生物群体的的大部分(例如非专利文献13)。具有提高免疫反应(例如参见非专利文献14参见)，抑制癌症的发生的效果(例如参见非专利文献15)、保护宿主免受病毒感染(例如，参见非专利文献16、17)、可以产生抗菌物质(例如参见非专利文献18)等，具有促进宿主健康的特性。双歧杆菌种在世界范围内广泛的的发酵乳制品的制备中被使用。
进而，希望双歧杆菌的质粒应用于益生菌(probiotics)载体、感染性患者的经口疫苗的载体。例如，已知包含下述步骤的转化体制备方法，其特征在于，该方法包括：利用来自双歧杆菌的质粒和来自大肠杆菌的质粒制备能够在双歧杆菌和大肠杆菌中互相复制的穿梭载体的步骤、和将上述穿梭载体与编码目的蛋白质的目的基因连接来制备重组载体的步骤、作为用于转化上述制备的重组载体的宿主细胞使用在制备上述的穿梭载体中使用的双歧杆菌(例如、参见专利文献1)。根据最近的报告已明确在全身给药后，长双歧杆菌积累于低氧的实体肿瘤中(例如，参见非专利文献19、20)，带有与长双歧杆菌hup启动子相融合的大肠杆菌codA的重组质粒pBLES100-S-eCD在微生物中表达CD(例如，参见专利文献2以及非专利文献21、22)。由此证明了重组长双歧杆菌对于酶-药物前体疗法有效。在上述重组质粒pBLES100-S-eCD的构建中使用的pBLES100是由长双歧杆菌BK51的pTB6和大肠杆菌的pBR322构建而成的穿梭载体。所涉及的穿梭载体pBLES100以2.2×104个转化子/μgDNA有效地转化长双歧杆菌，在该细胞中于结构和胞质分离方面趋于稳定(例如，参见非专利文献23)。可是，由于在转染时，存在着带有未修饰DNA的质粒在微生物中被限制性酶切断的可能性，因此在外源基因的克隆中需要更高的转化率。本发明者等人提供了与pBLES100相比较，能够以超过100倍的高效率转化长双歧杆菌的质粒pAV001以及pBRASTA101(例如参见非专利文献24)。
如上所述，5-FU对哺乳动物细胞具有强的细胞毒性作用，作为抗癌药物而广泛使用。不过，将5-FU直接施用给患者时，为了避免给患者带来副作用，例如使之在血液中的浓度为1μg/ml左右以下进行施用，或者即使是在使血中的浓度超过1μg/ml进行施用的情况下，有必要使在血中的浓度超过1μg/ml的时间仅仅为1小时左右。这样的情况在以往的方法中，很难使5-FU的抗癌作用充分发挥。在这样的情况下，努力寻求用高浓度的5-FU持续处理肿瘤，从而克服5-FU的副作用问题。
专利文献1：特表2004-519236号公报
专利文献2：特开2002-97144号公报
非专利文献1：O’Donovan et al.，Bact.Rev.34：278(1970)
非专利文献2：Nishiyama et al.，Cancer Res.45：1753(1985)
非专利文献3：Austin et al.，Pharmacol.43：380(1992)
非专利文献4：Anderson et al.，Arch.Microbiol.152：115(1989)
非专利文献5：Mullen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：33(1992)
非专利文献6：Huber et al.，Cancer Res.53：4619(1993)
非专利文献7：Mullen et al.，Cancer Res.54：1503(1994)
非专利文献8：Huber et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8302(1994)
非专利文献9：Hirschowitz et al.，Human Gene Ther.6：1055(1995)
非专利文献10：Davis et al.，Proc.AACR Abstract No.2355，p345(1996)
非专利文献11：Clin.Microbiol.Rev.11：382-402.1998
非专利文献12：Scardovi，Bergey’s Manual of Systematic Bacteriologyvol 2，eds.Sneath et al.，pp.1418-1434(1986)
非专利文献13：Mitsuoka，Elsevier Applied Science，pp 69-114(1992)
非专利文献14：Yasui et al.J.Dairy Sci.，74，1187-1195(1991)
非专利文献15：Reddy et al.，Cancer Res.，53，3914-3918(1993)
非专利文献16：Duffy et al.，Pediatr.Res.，35，690-695(1994)
非专利文献17：Saaverdra et al.，Lancet.，344，1046-1049(1994)
非专利文献18：Ibrahim et al.，J.Food Prot.，56，713-715(1993)
非专利文献19：Yazawa et al.Cancer Gene Ther.，7，269-274(2 000)
非专利文献20：Yazawa et al.Breast Cancer Res.Treat.，66，165-170(2001)
非专利文献21：Nakamura et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，66，2362-2366(2002)
非专利文献22：Fujimori et al.，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.，5，200-203(2002)
非专利文献23：Matsumura et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997)
非专利文献24：Tanaka et al.，Biosci BiotechnolBiochem.；69(2)：422-425(2005，Feb)
发明内容
发明所要解决的问题
使用了CD/5-FC的酶-前药疗法是在动物试验、临床实验中广泛使用的治疗方法。如果所涉及的酶-前药疗法中的导入了CD基因的细胞(菌)的5-FU耐受性提高的话，因为不存在因为5-FU导致的死亡，所以期待提高导入CD基因的细胞(菌)的存活，显著地提高使用了CD/5-FC的酶-前药疗法的治疗效果。本发明的课题是提供制备可用作这样的酶-前药疗法的治疗药物的、能够表达CD且至少对抗肿瘤活性有效浓度的5-FU具有耐受能力的表达CD的5-FU耐受菌的方法。此外，本发明的课题是提供用高浓度的5-FU持续处理肿瘤，可以克服5-FU的副作用问题的5-FU耐受菌、含有该耐受菌的药物组合物以及含有该耐受菌的实体肿瘤治疗药物。
用于解决问题的方法
本发明人等人为了解决上述课题，努力研究，发现通过将向不表达CD的菌中导入CD基因而转化了的CD表达菌在5-FC的存在下传代、驯化培养，能够制备保持有CD活性的5-FU耐受菌。即、将CD表达菌在加入了确定量的5-FC的培养用培养基中进行培养的话，通过与CD表达菌的增殖一起表达的CD酶活性而缓慢地将5-FC转换成5-FU，即使加入确定量的5-FC，在最初的低浓度的5-FU作用下能够防止CD表达菌的死亡，缓慢地提高浓度，能够选择性地培养仅获得了耐受能力的表达CD的5-FU耐受菌。此外，本发明人等人发现通过将不表达CD的细菌在5-FU的存在下传代、驯化培养，制备5-FU耐受菌后，向该5-FU耐受菌中导入CD基因，进行转化也能够制备表达CD的5-FU耐受菌。此外，本发明人等人发现通过使用通过这样的方法得到的5-FU耐受菌，以高浓度的5-FU对肿瘤进行持续的处理，能够克服5-FU的副作用问题，由此完成了本发明。
即，本发明涉及：
.在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶、并且对至少抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌的制备方法，其特征在于，该方法包括将在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的胞嘧啶脱氨酶表达菌在5-氟胞嘧啶的存在下进行传代、驯化培养；和
.[1]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，其中在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的胞嘧啶脱氨酶表达菌是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达胞嘧啶脱氨酶的菌中导入胞嘧啶脱氨酶基因而转化的胞嘧啶脱氨酶表达菌，和
.[1]或者[2]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，在添加了2～5000μg/ml的5-氟胞嘧啶的培养基中进行传代、驯化培养，和
.[1]～[3]中任一项所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的胞嘧啶脱氨酶表达菌是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且表达胞嘧啶脱氨酶的细菌，和
.[4]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且表达胞嘧啶脱氨酶的细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的肠道内细菌，和
.其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的肠道内细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌，和
.[6]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，其中表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的长双歧杆菌、短双歧杆菌或者婴儿双歧杆菌，和
.[7]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的长双歧杆菌，和
.耐受菌的制备方法，其特征在于，所述耐受菌为在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶、且对至少抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，所述方法包括：(1)在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达胞嘧啶脱氨酶的菌在5-氟尿嘧啶的存在下进行传代、驯化培养，制备5-氟尿嘧啶耐受菌的步骤，和(2)向该5-氟尿嘧啶耐受菌中导入胞嘧啶脱氨酶基因进行转化的步骤，和
.[9]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，在添加了1～100μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中进行传代、驯化培养，和
.[9]或者[10]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达胞嘧啶脱氨酶的菌是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达胞嘧啶脱氨酶的细菌，知
.[11]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、并且不表达胞嘧啶脱氨酶的细菌是不表达胞嘧啶脱氨酶的肠道内细菌，和
.[12]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，不表达胞嘧啶脱氨酶的肠道内细菌是不表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌，和
.[13]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，不表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌是不表达胞嘧啶脱氨酶的长双歧杆菌、短双歧杆菌或者婴儿双歧杆菌，和
.[14]中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，不表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌是不表达胞嘧啶脱氨酶的长双歧杆菌，和
.表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，其是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶、并对至少抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，且通过[1]～[15]中任一项所述的制备方法制备，和
.表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，该菌在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶且能够在添加了至少2μg/ml的5-氟胞嘧啶或者1μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中生长，和
.[16]或者[17]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌是表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性细菌，和
.[18]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性肠道内细菌，和
.[19]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性肠道内细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性双歧杆菌属细菌，和
.[20]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性双歧杆菌属细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌、短双歧杆菌或者婴儿双歧杆菌，和
.[20]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其中表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性双歧杆菌属细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌，和
.[22]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌是含有质粒pBLES100-S-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌105-A株，和
.[23]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌是含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌105-A株，和
.[21]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌是含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌标准株，和
.[21]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌是含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌aS-1株，和
.[21]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌是含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌I-53-8W株，和
.[21]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌是含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌标准株，和
.[21]中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌是含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌I-10-5株，和
.药物组合物，其特征在于，其中含有[16]～[29]中任一项所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，和
.[30]中所述的药物组合物，其特征在于，组合了5-氟胞嘧啶，知
.[30]或者[31]中所述的药物组合物，其特征在于，进一步组合了乳果糖，和；
.实体肿瘤治疗药物，其特征在于，该药物是用于能够表达足够量的由5-氟胞嘧啶转换成有效治疗量的5-氟尿嘧啶的量的胞嘧啶脱氨酶的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌和、能够转换成有效治疗量的5-氟尿嘧啶的量的5-氟胞嘧啶组合而成的实体肿瘤治疗药物，其中表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌是[16]～[29]中任一项所述的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，和
.[33]中所述的实体肿瘤治疗药物，其特征在于，进一步组合了乳果糖。
附图说明
图1是双歧杆菌属与大肠杆菌的穿梭载体pAV001的制备过程与表达CD的穿梭载体pAV001-HU-eCD的制备过程的示意图。
图2是比较在野生型长双歧杆菌和双歧杆菌/pAV001-HU-eCD中CD蛋白的表达量的结果的示意图。
图3是比较野生型长双歧杆菌和双歧杆菌/pAV001-HU-eCD中CD蛋白酶活性的(5-FC→5-FU的转换活性比较)的结果得到的经时菌数变化的示意图。
图4是比较野生型长双歧杆菌和双歧杆菌/pAV001-HU-eCD中CD蛋白酶活性的(5-FC→5-FU的转换活性比较)的结果得到的5-FU浓度的示意图。
具体实施方式
作为本发明中5-FU耐受菌的制备方法，只要是将在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的CD表达菌在5-FC的存在下传代、驯化培养的方法A；或者包括(1)将在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、并且不表达CD的菌在5-FU的存在下传代、驯化培养，制备5-FU耐受菌的步骤和、(2)向该5-FU耐受菌中导入CD基因进行转化的步骤的方法B，就没有特别的限制。
作为上述方法A中在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长CD表达菌，只要是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且表达CD的菌就没有特别的限制，可以是从自然界分离出的菌，也可以是向在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达CD菌中导入CD基因转化得到的重组菌。
此外，在上述方法B中使用的在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、并且不表达CD的菌只要是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、并且不表达CD的菌就没有特别的限制。
本发明的制备方法中使用的在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的菌，可以例如为菌(细菌)或真菌，作为该菌具体而言可以列举双歧杆菌属细菌、梭菌属细菌、乳酸菌属细菌、链球菌属细菌、消化球菌属细菌、肠球菌属细菌、拟杆菌属细菌、优杆菌属细菌等的肠道内细菌，其中优选双歧杆菌属细菌。
作为属于上述双歧杆菌属的细菌，具体而言，可以例举：长双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、乳酸双歧杆菌(B.lactentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophirum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、动物双歧杆菌(B.animalis)等。其中，与年龄无关的人的肠道内常在性的已知有优选使用长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌作为宿主菌，更优选使用长双歧杆菌。这些菌可以是任一市售的，或者可以容易地从保藏机构获得，例如，可以使用长双歧杆菌ATCC-15707、两歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697。
对长双歧杆菌株没有特别的限制，例如可以列举：长双歧杆菌105-A株、长双歧杆菌aE-194b株、长双歧杆菌bs-601株、长双歧杆菌M101-2株，其中，例如优选长双歧杆菌105-A株。
此外，对短双歧杆菌株也没有特别的限制，可以例举例如短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-1株、短双歧杆菌I-53-8W株。
此外，对婴儿双歧杆菌株没有特别的限制，可以例举例如婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌I-10-5株。
此外，对乳酸双歧杆菌株没有特别的限制，可以例举例如乳酸双歧杆菌标准株(JCM1220)。
方法A中，在5-FC的存在下的传代、驯化培养可以通过将细菌、真菌分别接种到适合生长或者增殖的培养用培养基(培养液或者琼脂平板)中，加入例如在2～5000μg/ml、优选2～2000μg/ml的范围内的5-FC，于37℃下，通过厌氧培养来进行。
通过在添加了5-FC的培养用培养基上进行培养，用与细菌的增殖一起表达的CD酶缓缓地将5-FC转换成5-FU，开始时以低浓度进行作用，防止所培养的菌的死亡，缓缓地使浓度上升，可以选择性地只培养获得了耐受能力的培养菌。这样，能够再现性良好地回收本发明的5-FU耐受菌。
上述方法B中，作为在5-FU的存在下的传代、驯化培养，将细菌、真菌分别接种到适合生长或者增殖的培养用培养基(培养液或者琼脂板)上，加入例如1～100μg/ml、优选2～100μg/ml的范围内的5-FU，在37℃下进行厌氧培养。这样，能够再现性良好地回收5-FU耐受菌。
为了制备导入了CD基因而被转化了的CD的表达菌或者、在导入在厌氧环境下赋与生长能力的基因而被转化了的菌而使用的CD表达载体或者转化菌的制备，可以按照市售的实验书，例如、基因操作手册(讲谈社)、高木康敬编基因操作试验法(讲谈社)、分子克隆(Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)、分子克隆第2版(Molecular Cloning，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory，1989，Methods in Enzymol.，194，1991、试验医学分册.酵母通过基因试验法(羊土社，1994)等所述的方法进行。此外，表达载体优选使用适合宿主菌的载体。
编码CD的DNA可以使用从例如、含有编码来自大肠杆菌的CD的DNA的质粒pAdexlCSCD(理化学研究所Gene Bank RDB No.1591)、或者含有编码来自相同的大肠杆菌的CD的DNA的质粒pMK116分离得到DNA(D.A.Mead et al.，Protein Engineering 1：67-74(1986))。
特别是、作为用于双歧杆菌属的细菌的CD表达载体，特别优选使用例如含有插入到长双歧杆菌hup启动子的下游的大肠杆菌codA的重组质粒pBLES100-S-eCD(参见专利文献1以及非专利文献21)或者、将该pBLES100-S-eCD改良了的、能转化长双歧杆菌或短双歧杆菌的pAV001-HU-eCD、或者这些质粒的突变体。
所谓的质粒pBLES100-S-eCD的突变体是指具有来自pBLES100-S-eCD的质粒核酸序列的突变体，在本发明中可以与pBLES100-S-eCD同样地使用的质粒。此外，所谓的质粒pAV001-HU-eCD的突变体是指同样地具有来自pAV001-HU-eCD的质粒核酸序列的突变体，在本发明中可以与pAV001-HU-eCD同样地使用的质粒。
本发明中表达CD的5-FU耐受菌只要能够在厌氧环境下的肿瘤组织内生长、能够表达CD的并且对至少抗肿瘤活性有效浓度的5-FU具有耐受能力，就没有特别的限制。5-FU的抗肿瘤活性的有效浓度取决于作为对象的肿瘤或者患者等，不能一概而论。可以列举例如至少0.05～0.1μg/ml的浓度。
并且，在市售的5-FU制剂(注射给药)的说明书中所述有使5-FU制剂在进行性胃癌患者中的5-FU的血中浓度为约0.6μg/ml而持续地进行静脉注射。
作为本发明中的表达CD的5-FU耐受菌的具体的5-FU耐受能力指的是在含有至少1～2000μg/ml、优选2～2000μg/ml的范围内的5-FU的培养用培养基(培养液或者琼脂板)，在37℃下厌氧培养的情况下能够进行生长。
此外，本发明中的表达CD的5-FU耐受菌的5-FU耐受能力是指：如果具体地表示为5-FC的浓度的话，为在含有2～5000μg/ml、优选3～5000μg/ml的范围内的5-FC的培养用培养基(培养液或者琼脂板)，于37℃下，在厌氧培养的情况下能够生长。
本发明中的表达CD的5-FU耐受菌的5-FU耐受能力是指：在含有前述的5-FU的数值范围的范围内的任一数值的5-FU的培养用培养基(培养液或者琼脂板)，在37℃，于厌氧培养的情况下能够生长，或者在含有前述的5-FC的数值范围的范围内任一数值的5-FC的培养用培养基(培养液或者琼脂板)上，在37℃下在厌氧培养的情况下能生长即可。作为本发明的表达CD的5-FU耐受菌的耐受能力，希望为能在添加了至少1μg/ml以上的5-氟尿嘧啶的培养基上能够生长的耐受能力，或者能够在添加了至少2μg/ml以上的5-氟胞嘧啶的培养基上生长的耐受能力。
本发明中的表达CD的5-FU耐受菌的制备方法没有特别的限制，可以使用从自然界分离的方法，也可以使用前述的本发明的耐受菌的制备方法等。即，本发明中的表达CD的5-FU耐受菌可以是从自然界分离的菌，也可以是使用了前述的本发明的耐受菌的制备方法等的重组菌。
作为本发明中的表达CD的5-FU耐受菌，只要是具有在厌氧环境下的肿瘤组织内能生长，能表达CD，并且具有至少抗肿瘤活性有效浓度的5-FU的耐受能力这些性质的菌或者真菌，就没有特别的限制，具有该性质的菌优选具有该性质的处于肠道内的细菌。作为肠道内的细菌，可以优选例如双歧杆菌属细菌、梭菌属细菌、乳酸菌属细菌、链球菌属细菌、消化球菌属细菌、肠球菌属细菌、拟杆菌属细菌、优杆菌属细菌等，其中更优选例如双歧杆菌属细菌。
作为上述的双歧杆菌属细菌，具体而言，可以例举例如：长双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、乳酸双歧杆菌(B.lactentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophirum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、动物双歧杆菌(B.animalis)等。其中，与年龄无关的人的肠道内内常在性的菌已知优选使用长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌作为宿主菌，更优选使用长双歧杆菌。这些菌任何一个可以市售的，或者可以从保藏机构容易地获得。可以使用例如、长双歧杆菌ATCC-15707、两歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697。
对于长双歧杆菌株没有特别的限制，可以举例例如长双歧杆菌105-A株、长双歧杆菌aE-194b株、长双歧杆菌bs-601株、长双歧杆菌M101-2株，其中，优选例如长双歧杆菌105-A株。
此外，对短双歧杆菌株没有特别的限制，可以举例例如短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-1株、短双歧杆菌I-53-8W株。
此外，对婴儿双歧杆菌株没有特别的限制，可以举例例如婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌I-10-5株。
此外，对乳酸双歧杆菌株没有特别的限制，可以举例例如乳酸双歧杆菌标准株(JCM1220)。
作为具有该性质的双歧杆菌属细菌，更具体而言，可以优选例举含有质粒pBLES100-S-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性长双歧杆菌105-A株(质粒pBLES100-S-eCD或该质粒突变体转化的长双歧杆菌105-A株)、含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性长双歧杆菌105-A株、含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性短双歧杆菌标准株、含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性短双歧杆菌aS-1株、含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性短双歧杆菌I-53-8W株、含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性婴儿双歧杆菌标准株、含有质粒pAV001-HU-eCD或该质粒突变体的表达CD的5-FU耐受性婴儿双歧杆菌I-10-5株等。
本发明的药物组合物只要含有本发明的表达CD的5-FU耐受菌就没有特别的限制。此外，本发明的药物组合物也可以含有一种或者2种以上的本发明的表达CD的5-FU耐受菌。
此外，本发明的药物组合物的表达CD的5-FU耐受菌的给药量只要是表达足够的用于从5-FC转换成有效治疗量的5-FU的量的CD的量就没有特别的限制，优选尽量少的量。
本发明的药物组合物只要不妨碍本发明的效果，可以除了本发明的表达CD的5-FU耐受菌之外，含有任意的成分。作为其任意成分，例如：药理学上允许的载体、赋形剂、稀释剂等。此外，本发明的药物组合物与通过本发明的表达CD的5-FU耐受菌而能够转换成5-FC的量的5-FU组合使用，该5-FC可以含有在本发明的药物组合物，优选将5-FC与药物组合物组合使用。此外，本发明的药物组合物也可以与促进本发明的表达CD的5-FU耐受菌的增殖的糖类相组合，作为这样的糖类，例如可以例举乳果糖。
本发明中的“X和Y的组合”中，X和Y可以各自为不同的形态、X和Y也可以是相同的形态(例如含有X和Y的形态)中的任何一种情况。此外，X和Y各自为不同的形态的情况下，也包括X、Y的任一一方还含有其他的成分的情况。
当将本发明的药物组合物向患者给药时，本发明的表达CD的5-FU耐受菌在肿瘤内增殖。该耐受菌在肿瘤内存在期间内，向患者给药5-FC，在肿瘤内中CD的作用下，5-FC转换成5-FU，能够使肿瘤细胞死亡。因为本发明的表达CD的5-FU耐受菌在能够使用肿瘤细胞死亡的5-FU浓度中也能生存，能够持续地通过CD酶发挥作用，所以能够得到以本发明的表达CD的5-FU耐受菌为有效成分的优良的抗肿瘤药物。此外，本发明的表达CD的5-FU耐受菌能够增殖，不过在厌氧环境下的肿瘤以外的部分该表达CD的5-FU耐受菌不能生长，所以，不能将5-FC转换成5-FU，与单独给药5-FU的情况相比，能够显著地降低由于5-FU产生的全身性的副作用。此外，因为本发明的实体肿瘤治疗药物的抗肿瘤效果对肿瘤具有高特异性，所以与单独给予5-FU的情况相比，能够在肿瘤内实现显著高的5-FU浓度，其结果取得了极其优良的抗肿瘤效果。
作为本发明的药物组合物的剂型，例如可以例举含有本发明的表达CD的5-FU耐受菌的液体制剂或者固体制剂。液体制剂是将本发明的表达CD的5-FU耐受菌的培养液进行纯化，向其中根据需要添加适当的生理盐水液或者补充液或者药物添加剂，通过填充到安剖或者西林瓶等进行制备。此外，固体制剂，可以向液体制剂中添加适当的保护剂，填充到安剖或者西林瓶等后，进行冻干或者L干燥，或者向向液体制剂中添加适当的保护剂，在冻干或者L干燥后将其填充到安剖或者西林瓶等中进行制备。作为本发明的药物组合物的给药方法，优选非经口给药，可以列举例如皮下注射、静脉注射、局部注入、脑室内给药等，不过最优选静脉注射。
并且，本发明的药物组合物是与5-FC组合使用的。本发明的药物组合物的给药方法和5-FC的给药方法可以相同也可以不同，此外，给药可以同时进行也可以间隔进行。优选5-FC的给药在本发明的药物组合物的给药后、本发明的表达CD的5-FU耐受菌能够在肿瘤细胞中充分生长的时间给药。
与本发明的药物组合物组合使用的5-FC的给药量只要是足够用于通过本发明的表达CD的5-FU耐受菌从5-FC转换成有效治疗量的5-FU的量，就没有特别的限制，优选少的量，例如可以在5～200mg/kg的范围内加以适当选择。
此外，本发明的药物组合物可以组合使用促进本发明的表达CD的5-FU耐受菌的增殖的糖类，作为这样的糖类，可以例举例如乳果糖。这样的糖类可以含在本发明的药物组合物中进行给药，也可以作为其他的药物组合物，同时或者间隔给药。
下面通过实施例更具体地说明本发明，不过本发明的技术范围不局限于这些例示。
参考例1
[表达CD的长双歧杆菌的制备]
按照特许2004-339677中所述的方法制备表达CD的长双歧杆菌。
穿梭载体pAV001的构建
(质粒的构建)
从长双歧杆菌和大肠杆菌的穿梭载体pBLES100(参见专利文献2以及非专利文献23)通过PCR扩增含有来自粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的大观霉素腺苷酸转移酶(AAD盒)的序列，亚克隆到pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen)中，制备pCRTOPO-ScaI-AAD-Eam1105I。并且，分别向正向引物中添加ScaI、反向引物中添加Eam1105I限制性酶切位点。
如图1所示，从Invitrogen公司购入的克隆载体pGFPuv(DEFINITION：Cloning vector pGFPuv.ACCESSION：U62636 VERSION：U62636.1 GI：1490528)由GFPuv基因和它两端的多克隆位点(Multi-Cloning Site、MCS)、氨苄抗性基因、大肠杆菌质粒复制起点所构成。
将该pGFPuv的氨苄抗性基因部位用限制性酶Eam1105I和ScaI切割，制备切取的长片段。同样地使用限制性酶Eam1105I和ScaI，制备含有切割了pCRTOPO-ScaI-AAD-Eam1105I的AAD盒的片段(约1100bp)。制备使用T4DNA连接酶连接了上述2个片段的pGFPuv-SpR。并且，在大肠杆菌中分别确认制备的质粒pGFPuv-SpR在赋与大观霉素耐受性性质的同时缺失了氨苄抗性性质。
将pGFPuv-SpR用限制性酶Sa1I(存在于GFPuv基因上游的多克隆位点内)和SpeI(存在于GFPuv基因下游的多克隆位点内)进行消化，制备去除了GFPuv基因的质粒pAVN。
根据来自长双歧杆菌的质粒pTB6的完整碱基序列信息确定含有RepB、SDO、DDO、AT-rich repeats、DnaA-binding motifs的约1900bp的序列和长双歧杆菌的质粒复制单位相同。通过PCR扩增含有来自pTB6的长双歧杆菌的质粒复制单位约1900bp的碱基，制备亚克隆到pCR-BluntII-TOPO载体的pCRTOPO-ApaI-1900-ScaI。并且，分别向正向引物中添加ApaI位点、向反向引物中添加ScaI限制性酶切位点。
将用限制性酶ApaI和ScaI消化后的pAVN的长片段(约2400bp)与同样地用限制性酶ApaI和ScaI消化后的pCRTOPO-ApaI-1900-ScaI短片段(约1900bp)使用T4DNA连接酶连接，制备长双歧杆菌-大肠杆菌穿梭载体pAV001(约4300bp)。
2.CD基因表达载体pAV001-HU-eCD
(表达载体的构建)
然后将pBLES100-S-eCD用限制性酶HindIII和SpeI切割，切取含有HU基因启动子、来自大肠杆菌的CD基因和HU基因终止子的约2900bp的序列。制备向同样地将穿梭载体pAV001的多克隆位点内的限制性酶切割部位以HindIII和SpeI切割得到的长片段上，使用T4DNA连接酶连接了上述的约2900bp片段的pAV001-HU-eCD(约7100bp)。
3.向双歧杆菌属导入CD基因表达载体pAV001-HU-eCD
从野生型长双歧杆菌在MRS培养基中于37℃厌氧条件下培养得到的培养液通过离心分离分离菌体，制备悬浮在适当的缓冲液中的菌体悬浊液。然后，使用按照非专利文献23所所述的电转化法，将胞嘧啶脱氨酶基因表达载体pAV001-HU-eCD导入到上述的菌悬浊液中。将导入的重组长双歧杆菌(长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD在含有抗生素大观霉素的琼脂培养基上根据克隆形成进行筛选。
(重组长双歧杆菌中胞嘧啶脱氨酶的表达)
将长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD或者野生型长双歧杆菌分别在含有抗生素大观霉素的MRS培养基中于37℃厌氧条件下传代培养2天以上，通过从培养液离心分离将菌体(1×109CFU)分离，超声波破碎后分别提取菌体内蛋白。将上述提取的蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺电泳进行分离，通过Western法确认胞嘧啶脱氨酶蛋白的表达。并且，分别作为一次抗体使用兔抗胞嘧啶脱氨酶单克隆抗体(Sawaday Technology)、作为二次抗体使用西洋地黄辣根过氧化物酶-抗兔免疫球蛋白G复合体(Santa Cruz Biotechnology，Inc)。作为信号的感光法，使用冷却CCD成像Fluo-S-MAX(BIO-RAD)检测由ECL法发出的信号。其结果，野生型长双歧杆菌中检测不到信号，胞嘧啶脱氨酶无表达，而在长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD中检测到信号，确认胞嘧啶脱氨酶蛋白的表达(参见图2)。
(长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD中胞嘧啶脱氨酶酶活性；5-FC→5-FU的转换活性的测定)
将长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD或者野生型长双歧杆菌分别接种到含有抗生素大观霉素的MRS培养基中，在37℃厌氧条件下传代培养2天以上，通过从培养液离心分离分离菌体(2×109CFU)，在4.5mL的MRS培养基中再次悬浮。然后，使其最终浓度为2mg/mL添加0.5mL的5-FC(20mg/mL)，在37℃厌氧条件下培养。在第0、4、8、18、24小时时从培养液分别回收通过离心分离去除了菌体的上清，通过气相层析分析(5-FU GC-MS methods，BML)测定转换了的5-FU的浓度。经时菌数变化如图3、5-FU浓度如图4各自所示。分析结果在野生型长双歧杆菌中仅仅检测到极其少量的5-FU，而在长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD中，检测到在第4小时后为39.2μg/mL、在第24小时后为102.1μg/mL的5-FU。
实施例1
[长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD的5-FU耐受菌]
将参考例1得到的长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD接种到含有50μg/mL的5-FC的5mL的含有抗生素大观霉素的MRS培养基中，在37℃厌氧培养72小时。然后，取出1mL培养后的培养基，接种到相同地含有50μg/mL的5-FC的9mL的含有抗生素大观霉素的MRS培养基中，以相同的培养条件培养24小时。通过将该接种操作重复3次，制备5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD。然后，接种到含有5-FU为20μg/mL的含有抗生素大观霉素的MRS培养基中，以相同的培养条件培养24小时，确认制备的5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD的5-FU耐受性生长。之后，用甘油悬浮菌，将其作为甘油储液在-80℃保存。将该保存的菌体样品和野生型长双歧杆菌接种到含有5-FU250μg/mL的含有抗生素大观霉素的MRS培养基中，比较生长的时候，野生型没有生长，不过保存的样品在第二天出现菌的增殖，对5-FU保持了耐受性。对培养后的菌液通过平板测定法测定生长的菌数时，野生型在检测限以下(指的是103CFU/mL以下)，不过保存的样品的菌液生长了2～3×109CFU/mL的菌。
[5-FU耐受性长双歧杆菌的5-FU耐受性浓度测定]
将实施例1得到的5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD或者野生型长双歧杆菌分别在MRS培养基上于37℃厌氧条件下传代培养2天以上。将这些培养液用厌氧性稀释液稀释后，分别涂布在含有0、25、50、100、250、500、1000、2000μg/mL的5-FU的BL琼脂培养基上，测定在37℃经过2～3天的厌氧培养后的生长菌数。使用不含5-FU的BL琼脂培养基的实验进行5次，此外使用含有5-FU的BL琼脂培养基的进行3次。其结果示于表1(5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD)以及表2(野生型长双歧杆菌)。从表1的结果可知5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD的5-FU耐受性浓度为2000μg/mL以上。一方面野生型长双歧杆菌在至少含5-FU 25μg/mL以上时不生长(表2)。
表1
5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD
sd：标准偏差
CV：变动系数
表2
野生型长双歧杆菌
sd：标准偏差
CV：变动系数
[5-FU耐受性长双歧杆菌的5-FU耐受性特性的保持]
将实施例1中得到的5-FU耐受性长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD使用含有抗生素大观霉素的MRS培养基在37℃厌氧条件下传代培养2天以上。取该培养液5μL接种到不含抗生素大观霉素含的5mL的MRS培养基中，在37℃厌氧条件下进行24小时培养，将培养后的菌液同样地进行传代培养，连续地进行30天的传代培养。将连续传代培养30日后的菌液用厌氧性稀释液稀释后，分别涂布在含有5-FU 250μg/mL含的BL琼脂培养基和不含5-FU的BL琼脂培养基上，在37℃下厌氧培养2～3天后，测定生长的菌数。试验进行5次。其结果示于表3。从表3的结果可知，5-FU耐受性长双歧杆菌的5-FU耐受性性质至少在连续传代培养30天后也能保持。
表3
sd：标准偏差
CV：变动系数
[5-FU耐受性长双歧杆菌各5-FU非耐受性长双歧杆菌在添加5-FC的的体培养基中的培养]
将参考例1的长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD(5-FU非耐受性长双歧杆菌)和在实施例1中得到的长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD(5-FU耐受性长双歧杆菌)分别在含有抗生素大观霉素的MRS培养基于37℃厌氧条件下传代培养2天以上。之后分别接种到含有5、25、50、100、250、500μg/mL的5-FC的MRS培养基的50μL培养液中，在37℃厌氧条件下培养24小时，测定培养后的菌液的浊度(OD＝600nm)，调查各菌有无增殖(表4)。5-FU非耐受性长双歧杆菌在5-FC浓度为50μg/mL以上的浓度的培养基中的生长显著受到抑制，不过5-FU耐受性长双歧杆菌能够在全部浓度中生长。
表4
实施例2
[使用5-FU添加培养基制备的长双歧杆菌/pAV001-HU-eCD的5-FU耐受菌]
将长双歧杆菌接种到含有1、5、10、50、100、500μg/mL的5-FU的5mL的MRS培养基中、在37℃厌氧培养培养1～5天，测定各自的浊度(OD＝600nm)，调查有无生长(表5)。其结果，在含有500μg/mL的5-FU的培养基中在5日后一点都没有生长，不能制备耐受菌株。然后，从确认有增殖的培养后的培养基中取出1mL，分别接种到含有相同的浓度的5-FU的9mL的MRS培养基中，在相同的培养条件培养24小时。通过将该接种操作重复3次，制备针对各5-FU浓度的5-FU耐受性长双歧杆菌。然后，向MRS培养基中接种各5-FU耐受性长双歧杆菌，将培养后的菌液分别接种到含有250μg/mL的5-FU的MRS培养基中，使用浊度(OD＝600nm)测定24小时后有无增殖(表6)。其结果，用含有1～100μg/mL的5-FU的培养基制备的5-FU耐受性长双歧杆菌与实施例1得到的5-FU耐受菌株同样地对5-FU具有耐受性。
表5
表6
实施例3
将实施例2得到的5-FU耐受菌株以与参考例1相同的方法进行转化，确认表达胞嘧啶脱氨酶。制备的表达胞嘧啶脱氨酶的5-FU耐受菌株与实施例1得到的5-FU耐受菌株同样具有对5-FU的耐受性，而且，对5-FU的耐受能力至少保持在7天以上。
实施例4
与实施例1相同地制备短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌的5-FU耐受菌株。下述表7中所述了5-FU耐受性双歧杆菌的菌株的总结。
表7
用和实施例1相同的方法获得了耐受性的菌株的总结
工业实用性
通过本发明，能够容易地制备CD/5-FC的酶-前药疗法中极其有用的、保持CD活性并且表现出5-FU耐受性的双歧杆菌属细菌等的5-FU耐受菌。例如向癌症患者施用保持了CD活性且表现出5-FU耐受性的双歧杆菌属细菌的话，该双歧杆菌属细菌在肿瘤内增殖，在存在于肿瘤内的期间，如果将5-FC经口给药的话，其从肠道被吸收，在肿瘤内部的CD的作用下，5-FC转换成5-FU，能够使肿瘤细胞死亡，在能够使肿瘤细胞死亡的5-FU浓度下，5-FU耐受性双歧杆菌属细菌能够生存、且通过CD而持续发挥酶作用，由此能够得到以该双歧杆菌属微生物为有效成分的优良的抗肿瘤药物。
此外，在本发明的表达CD的5-氟尿嘧啶耐受菌增殖的肿瘤以外的部分，因为5-FC不转换成5-FU，所以与直接施用5-FU的情况相比，能够将5-FU的副作用抑制到极低的水平。而且，因为本发明的实体肿瘤治疗药物的抗肿瘤效果对肿瘤具有高度的特异性，所以与直接施用5-FU的情况相比，能够在肿瘤内实现很高的5-FU浓度，结果获得极其优良的抗肿瘤效果。

Claims (14)

1.在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶且能够在至少添加了2μg/ml的5-氟胞嘧啶或者1μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中生长的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌的制备方法，其特征在于，
将在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长的、
属于长双歧杆菌、短双歧杆菌或者婴儿双歧杆菌属的、
表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌在添加了2～5000μg/ml的5-氟胞嘧啶的培养基中进行将培养24小时的操作重复3次的传代、驯化培养。
2.权利要求1中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的长双歧杆菌。
3.5-氟尿嘧啶耐受菌的制备方法，所述的耐受菌的特征在于是在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶、且能够在至少添加了2μg/ml的5-氟胞嘧啶或者1μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中生长的表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶的耐受菌，所述制备方法的特征在于，包括：
(1)将在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、且不表达胞嘧啶脱氨酶的、属于长双歧杆菌、短双歧杆菌或者婴儿双歧杆菌的双岐杆菌属细菌在添加了1～100μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中进行将培养24小时的操作重复3次的传代、驯化培养，制备5-氟尿嘧啶耐受菌的步骤，和、
(2)向该5-氟尿嘧啶耐受菌中导入胞嘧啶脱氨酶基因进行转化的步骤。
4.权利要求3中所述的耐受菌的制备方法，其特征在于，不表达胞嘧啶脱氨酶的双歧杆菌属细菌是不表达胞嘧啶脱氨酶的长双歧杆菌。
5.表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，所述菌为在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶、且能够在至少添加了2μg/ml的5-氟胞嘧啶或者1μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中生长的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，且是由权利要求1或3中任一项所述的制备方法制备的。
6.表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，其为在厌氧环境下的肿瘤组织内能够生长、能够表达胞嘧啶脱氨酶、且能够在至少添加了2μg/ml的5-氟胞嘧啶或者1μg/ml的5-氟尿嘧啶的培养基中生长的、属于长双歧杆菌、短双歧杆菌或者婴儿双歧杆菌的细菌。
7.权利要求6中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其中表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受性双歧杆菌属细菌是表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌。
8.权利要求7中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌是具有质粒pBLES100-S-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌105-A株。
9.权利要求7中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌是具有质粒pAV001-HU-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性长双歧杆菌105-A株。
10.权利要求6中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌是具有质粒pAV001-HU-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌标准株。
11.权利要求6中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌是具有质粒pAV001-HU-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌aS-1株。
12.权利要求6中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌是具有质粒pAV001-HU-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短双歧杆菌I-53-8W株。
13.权利要求6中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌是具有质粒pAV001-HU-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌标准株。
14.权利要求6中所述的表达胞嘧啶脱氨酶的、5-氟尿嘧啶耐受的双岐杆菌属细菌，其特征在于，表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌是具有质粒pAV001-HU-eCD的、表达胞嘧啶脱氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性婴儿双歧杆菌I-10-5株。
CN200680011344.6A 2005-04-08 2006-04-04 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法 Expired - Fee Related CN101155911B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005112557 2005-04-08
JP112557/2005 2005-04-08
PCT/JP2006/307102 WO2006109619A1 (ja) 2005-04-08 2006-04-04 ５－フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101155911A CN101155911A (zh) 2008-04-02
CN101155911B true CN101155911B (zh) 2015-08-26

Family

ID=37086897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680011344.6A Expired - Fee Related CN101155911B (zh) 2005-04-08 2006-04-04 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8734779B2 (zh)
EP (1) EP1867714B1 (zh)
JP (1) JP4945440B2 (zh)
KR (1) KR101302088B1 (zh)
CN (1) CN101155911B (zh)
CA (1) CA2603453C (zh)
DK (1) DK1867714T3 (zh)
ES (1) ES2438565T3 (zh)
PT (1) PT1867714E (zh)
WO (1) WO2006109619A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101448940A (zh) 2006-05-24 2009-06-03 阿内罗药物科学株式会社 基因转运载体的制备方法
DK2274422T3 (en) * 2008-04-17 2017-07-03 Anaeropharma Science Inc expression
US8338162B2 (en) * 2009-04-17 2012-12-25 Anaeropharma Science, Inc. Obligately anaerobic mutant lactic acid bacterium and preparation method therefor, and expression vector functioning in obligately anaerobic lactic acid bacterium
KR20170002403A (ko) 2014-05-01 2017-01-06 가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스 이종 폴리펩티드 발현 카세트
CZ309218B6 (cs) * 2014-08-26 2022-06-01 Univerzita Palackého v Olomouci Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6110737A (en) 1988-02-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Human platelet-derived growth factor receptor, type A
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
CA2302866C (en) 1997-09-10 2012-02-21 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
AU7572900A (en) 1999-08-26 2001-03-19 Vion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivery of an agent using attenuated salmonella containing phage
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
JP3642755B2 (ja) 2000-09-21 2005-04-27 純 天野 嫌気性菌を用いた遺伝子治療用医薬
CA2342040C (en) 2000-09-21 2012-07-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anaerobic bacterium as a drug for cancer gene therapy
KR100457879B1 (ko) 2001-02-24 2004-11-18 주식회사 비피도 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
JP4356501B2 (ja) 2003-04-25 2009-11-04 チッソ株式会社 難燃性繊維及びそれを用いた繊維成形体

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080006583A (ko) 2008-01-16
CA2603453C (en) 2015-01-27
EP1867714A4 (en) 2008-12-31
EP1867714B1 (en) 2013-09-18
EP1867714A1 (en) 2007-12-19
DK1867714T3 (da) 2013-12-09
KR101302088B1 (ko) 2013-08-30
PT1867714E (pt) 2013-12-05
US8734779B2 (en) 2014-05-27
JPWO2006109619A1 (ja) 2008-11-06
WO2006109619A1 (ja) 2006-10-19
ES2438565T3 (es) 2014-01-17
CA2603453A1 (en) 2006-10-19
US20090280091A1 (en) 2009-11-12
CN101155911A (zh) 2008-04-02
JP4945440B2 (ja) 2012-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101155911B (zh) 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法
CN102834514B (zh) 转化用质粒
CN110049760A (zh) 用于治疗炎性疾病的组合物及其用途以及益生菌组合物
CN102046190B (zh) 用于缺氧疾病的治疗剂
CN102747074B (zh) 基因转运载体的制备方法
ES2357372T3 (es) Nuevo vector lanzadera.
CN103917639B (zh) 经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途
US8741622B2 (en) Stress tolerant Bifidobacteria
CN107002090A (zh) 异源多肽表达盒
King et al. Tumor-targeted Salmonella typhimurium overexpressing cytosine deaminase: a novel, tumor-selective therapy
Peterson et al. Linked transformation of bacterial and prophage markers in Bacillus subtilis 168 lysogenic for bacteriophage φ105
CN104321065A (zh) 减少息肉病和结肠直肠癌的方法
KR20020069324A (ko) 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
WO2021123391A1 (en) Genetically modified clostridium strains and uses thereof
EP2057266B1 (en) Genetic remodeling in bifidobacterium
CN114456992B (zh) “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
WO2022006748A1 (en) Genetically engineered live bacteria and methods of constructing the same
CN116478895A (zh) 重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌hcs1、菌剂及其应用
KR20040072545A (ko) 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를함유하는 셔틀벡터

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: Tokyo, Japan, Japan Millennium Dai Tian District, Shen Tian Shen Bao 1-103 Tokyo garden tower 201

Patentee after: Anaeropharma Science, Inc.

Address before: Tokyo, Japan

Patentee before: Anaeropharma Science, Inc.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210608

Address after: Washington, USA

Patentee after: Asusa Medical Sciences Ltd.

Address before: Tokyo, Japan, Japan Millennium Dai Tian District, Shen Tian Shen Bao 1-103 Tokyo garden tower 201

Patentee before: Anaeropharma Science, Inc.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150826