PT1867714E - Bactérias resistentes a 5-fluoruracilo e processo para a sua produção - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

"BACTÉRIAS RESISTENTES A 5-FLUORURACILO E PROCESSO PARA A SUA PRODUÇÃO"

Dominio Técnico A presente invenção refere-se a um processo para a produção de bactérias entéricas resistentes a 5-fluoruracilo (de ora em diante designado por 5-FU), que exprimem citosina-desaminase (EC3.5.4.1; de ora em diante designada por CD), que são úteis como agentes terapêuticos para tumores sólidos, podem crescer em tecidos de tumores anaeróbicos, podem exprimir CD e têm resistência a 5-FU presentes numa concentração que é pelo menos eficaz para a atividade antitumoral. A presente invenção também se refere a uma bactéria entérica resistente a 5-FU, a uma composição farmacêutica que contém a bactéria entérica resistente, e a um agente terapêutico que contém a bactéria entérica resistente, para o tratamento de tumores sólidos.

Antecedentes Técnicos A CD é um enzima que promove a desaminação de citosina a uracilo (ver por exemplo, o documento não patente 1). A CD desempenha um papel importante no metabolismo de microrganismos. A CD tem sido isolada de diversos microrganismos diferentes, embora não seja habitualmente produzida em células de mamíferos (ver por exemplo, documento não patente 2). Muitas das bactérias e fungos que produzem a CD convertem a 5-fluorcitosina (de ora em diante designada por 5-FC) a 5-FU, que é um metabolito altamente tóxico e é letal para as células. 0 5-FU induz a produção de ARN anormal e a inibição da síntese de ADN. A ação 2 antifúngica da 5-FC é devida a esta produção de ARN anormal e à inibição da sintese de ADN por ação do 5-FU.

Concretamente, a 5-FC é absorvida pelas células de fungos através da citosina-permease e é imediatamente convertida em 5-FU na célula, pela CD. 0 5-FU intercelular é então convertido em 5-FUDP, através de 5-FUMP, pela UMP-pirofosforilase. A seguir à fosforilação, a via bifurca-se em dois ramos, produzindo-se 5-FUTP por uma das vias e 5-FdUMP pela outra via. A incorporação de 5-FUTP, em vez de UTP, no ARN, produz ARN anormal e, deste modo, inibe a sintese de proteínas normais, tendo como resultado a inibição do crescimento do fungo. Além disso, o 5-FdUMP atua como um potente inibidor de timidilato-sintase e inibe a sintese do ADN e a divisão nuclear, conduzindo a um efeito antimicrobiano.

No entanto, uma vez que as células normais dos mamiferos não exprimem quantidades significativas de CD e, deste modo, a 5-FC não será sujeita a desaminação, originando o metabolito tóxico 5-FU, a 5-FC não é tóxica para as células de mamiferos, mesmo para uma concentração que exiba uma potente atividade antifúngica. Por outro lado, o 5-FU é também altamente tóxico para as células dos mamiferos e é largamente usado como agente anticancerigeno

Os genes de CD foram isolados e clonados a partir de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae (ver por exemplo, os documentos não patente 3 e 4) . Muitos investigadores relataram que a introdução de um gene de CD numa célula de um mamífero conduz à diminuição da sensibilidade seletiva da célula à 5-FC in vitro (ver, por exemplo, os documentos não patente 3 e 5) . Foi também referido que as células de tumores introduzidas com um gene de CD, utilizando-se um vetor retroviral, podem ser 3 eliminadas in vivo por um tratamento sistémico do animal com 5-FC (ver por exemplo, os documentos não patentes 6-8). São também empregues um vetor retroviral deficiente em replicação (ver por exemplo, o documento não patente 9) e um lipossoma catiónico (ver por exemplo, o documento não patente 10), para a introdução de um gene de CD, respetivamente, numa linha de células do carcinoma do cólon humano e no cancro pulmonar de células grandes do rato. Esta expressão de genes em células de tumores garante às células uma sensibilidade à 5-FC.

Sabe-se que emerge facilmente uma resistência à 5-FC, que é usada contra infeções por fungos, por exemplo, por Candida (ver por exemplo, o documento não patente 11). Uma vez que a resistência à 5-FC poderá surgir através da perda ou mutação de um enzima, relativamente ou à conversão da 5-FC em 5-FU, ou à incorporação do 5-FU no ARN, etc., há teoricamente uma grande diversidade de mecanismos para se obter a resistência. Clinicamente, no entanto, a aquisição de resistência é acompanhada mais frequentemente pela perda ou diminuição da atividade da UMP-pirofosforilase em Candida albicans. Sabe-se também que existe uma correlação óbvia entre a sensibilidade à 5-FC e a atividade enzimática da UMP-pirofosforilase. As estirpes resistentes que são deficientes em citosina-permease ou CD também são reportadas em Candida glabrata, cuja fase nuclear é monoplóide.

Por outro lado, a Bifidobacterium longum é uma bactéria anaeróbica Gram-positiva e tem um genoma com um elevado teor de GC (ver por exemplo, o documento não patente 12) . Esta Bifidobacterium longum é não patogénica e constitui uma parte principal da microflora do intestino grosso de humanos e de outros animais (ver por exemplo, o documento não patente 13) . É referido que o Bifidobacterium longum 4 tem propriedades de melhoria da saúde para o seu hospedeiro, envolvendo o fortalecimento da resposta imune (ver por exemplo, o documento não patente 14), um efeito inibitório sobre a carcinogénese (ver por exemplo, o documento não patente 15), a proteção do hospedeiro contra infeções virais (ver por exemplo, os documentos não patentes 16 e 17) e a possibilidade de produção de uma substância antibacteriana (ver por exemplo, o documento não patente 18). Algumas espécies de Bifidobacterium são largamente usadas em todo o mundo para a preparação de laticínios fermentados.

Além disso, os plasmideos para Bifidobacterium em principio são aplicados a vetores probióticos e a vetores para vacinas orais contra doenças infecciosas. Por exemplo, é conhecido um método de transformação que compreende os passos de: (a) se construir um vetor transportador que é replicado tanto em Bif idobacterium sp., como em E. coli, usando-se um plasmideo originado de Bifidobacterium sp., e o originado de E. coli; (b) se construir um vetor recombinante por inserção de um gene alvo que codifica uma proteína alvo no vetor transportador; e (c) se transformar o Bif idobacterium sp. usado no passo (a) com o vetor recombinante construído no passo (b) (ver por exemplo, o documento de patente 1). Além disso, foi revelado em relatos recentes que o Bifidobacterium longum se acumula em tumores sólidos hipóxicos após aplicação sistémica (ver por exemplo, os documentos não patentes 19 e 20) e que o plasmideo recombinante pBLESlOO- S- eCD, portador de E. coli codA, fundido com o promotor hup de Bifidobacterium longum, exprime CD em microrganismos (ver por exemplo, o documento de patente 2, e os documentos não patente 21 e 22). Estas descobertas suportam a eficácia de

Bifidobacterium longum para a terapia enzimática pró-droga. O pBLESlOO, que foi usado para a construção do plasmideo 5 recombinante pBLESlOO- S- eCD, é um vetor transportador construído a partir de pTB6 derivado de Bifidobacterium longum BK51 e de pBR322 derivado de E. coli. 0 vetor transportador pBLESlOO transformou Bifidobacterium longum com uma eficácia de 2,2 χ 104 transformantes/pg de ADN, e era estável nas células em estrutura e em segregação (ver por exemplo, o documento não patente 23). No entanto, para a clonagem de um gene estranho, é necessária mesmo uma eficiência superior, visto que um plasmídeo que possui um ADN não modificado tem que ser clivado por um enzima de restrição num microrganismo, durante a transfecção. Deste modo, os presentes inventores propõem os plasmídeos pAVOOl e pBRASTAlOl, que podem transformar o Bifidobacterium longum com uma eficiência 100 vezes ou superior à do pBLESlOO (ver por exemplo, o documento não patente 24).

Como foi mencionado acima, o 5-FU é altamente tóxico para as células de mamíferos, assim como é largamente usado como um agente anticancerígeno. No entanto, para a administração do próprio 5-FU a um paciente, tem que ser ministrado, por exemplo, de tal forma que a sua concentração no sangue seja de cerca de 1 pg/mL ou inferior, ou mesmo quando é ministrado para exceder a concentração no sangue de 1 pg/mL, o tempo durante o qual a concentração no sangue excede 1 pg/mL deverá ser, no máximo, de cerca de 1 hora, para evitar efeitos adversos. Nestas situações, não se pode dizer que o 5-FU exerça plenamente o seu efeito anticancerígeno com os métodos convencionais. Nestas circunstâncias, seriam altamente desejáveis medidas para se tratarem tumores com uma alta concentração de 5-FU, ultrapassando-se ao mesmo tempo os efeitos adversos do 5-FU.

[Documento de patente 1] Tradução japonesa publicada do Pedido de Patente Internacional PCT n° 2004-519236 6 [Documento de patente 2] Pedido de patente japonesa aberto n° 2002-97144 [Documento não patente 1] 0'Donovan et al., Bact. Rev. 34:278 (1970) [Documento não patente 2] Nishiyama et al., Câncer Res. 45:1753 (1985) [Documento não patente 3] Austin et al., Pharmacol. 443: 380 (1992) [Documento não patente 4] Anderson et al., Arch. Microbiol. 152: 115 (1989) [Documento não patente 5] Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:33 (1992) [Documento não patente 6] Huber et al., Câncer Res. 53: 4619 (1993) [Documento não patente 7] Mullen et al., Câncer Res. 54: 1503 (1994) [Documento não patente 8] Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:8302 (1994) [Documento não patente 9] Hirschowitz et al., Human Gene

Ther. 6:1055 (1995)

[Documento não patente 10] Davis et al., Proc. AACR abstract n° 2355, p. 345 (1996) [Documento não patente 11] Clin. Microbiol. Rev. 11:382- 402. 1998 [Documento não patente 12] Scardovi, Bergey' s Manual of

Systematic Bacteriology vol. 2, eds. Sneath et al., pp. 1418-1434 (1986) [Documento não patente 13] Mitsuoka, Elsevier Applied

Science, pp. 69-114 (1992) [Documento não patente 14] Yasui et al., Dairy Sei., 1187-1195 (1991) [Documento não patente 15] Reddy et al., Câncer Res. 53, 3914-3918 (1993) [Documento não patente 16] Duffy et al., Pediatr. Res., 35, 690-695 (1994) 7 [Documento não patente 17] Saarvedra et al., Lancet., 344, 1046-1049 (1994) [Documento não patente 18] Ibrahim et al., J. Food Prot., 56, 713-715 (1993) [Documento não patente 19] Yazawa et al., Câncer Gene Ther., 7, 269-274 (2000) [Documento não patente 20] Yazawa et al., Breast Câncer Res. Treat., 66, 165-170 (2001) [Documento não patente 21] Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002) [Documento não patente 22] Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devei., 5, 200-203 (2002) [Documento não patente 23] Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61,1211-1212 (1997) [Documento não patente 24] Tanaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425 (2005, Fev.).

Descrição da Invenção

Objetivos a serem Solucionados pela Invenção

Uma terapia enzima/pró-droga, utilizando CD/5-FC, é uma terapia amplamente usada em experiências com animais, ensaios clínicos, etc. Numa terapia enzima-pró-droga deste tipo, se a resistência ao 5-Fu das células com o gene CD introduzido (microrganismos) for melhorada, é de esperar que o efeito terapêutico da terapia enzima/pró-droga, utilizando CD/5-FC, seja melhorado significativamente, visto que estas células (microrganismos) não serão erradicadas pelo 5-FU e, por conseguinte, têm uma boa taxa de sobrevivência. Um objetivo da presente invenção é fornecer um processo para a produção de um tal microrganismo resistente a 5-FU, que exprima CD, útil como agente terapêutico para a terapia enzima-pró-droga, que seja capaz de exprimir CD, e que tenha uma resistência ao 5-FU a uma concentração que é pelo menos eficaz para a atividade antitumoral. Um outro objeto da invenção é fornecer um microrganismo resistente a 5-FU que possibilite o tratamento de tumores com uma alta concentração de 5-FU, ao mesmo tempo que ultrapassa os efeitos adversos do 5-FU, para fornecer uma composição farmacêutica contendo o microrganismo resistente, e um agente terapêutico de tumores sólidos, contendo os microrganismos resistentes.

Meios para Solucionar o Objetivo

Os presentes inventores estudaram profundamente para solucionar os objetivos descritos acima e descobriram que pode ser produzido um microrganismo resistente a 5-FU, mantendo a atividade CD, por subcultura ou cultura de aclimatação de um microrganismo que exprime CD, que é transformado com um gene CD, na presença de 5-FC. Concretamente, quando microrganismos que exprimem CD são cultivados num meio de cultura complementado com uma quantidade especifica de 5-FC, a 5-FC é convertida gradualmente em 5-FU por atividade enzimática da CD que foi expressa conjuntamente com a proliferação do microrganismo que exprime a CD. Por conseguinte, embora seja adicionada a quantidade especificada de 5-FC, esta atua inicialmente como uma baixa concentração de 5-FU, evitando a erradicação de microrganismos que exprimem CD. Devido a este aumento gradual de 5-FU, podem ser cultivados seletivamente microrganismos resistentes ao 5-FU, que exprimem a CD, que adquiriram resistência. Em alternativa, os presentes inventores descobriram que pode ser também produzido um microrganismo resistente a 5-FU, que exprime CD, por subcultura ou cultura de aclimatação de microrganismos que não exprimem CD, na presença de 5-FU, para se produzir um microrganismo resistente a 5-FU, e transformando os microrganismos resistentes a 5-FU resultantes por 9 introdução de um gene CD. Além disso, os presentes inventores descobriram que se pode conseguir o tratamento de um tumor com uma alta concentração de 5-FU, ultrapassando-se ao mesmo tempo os efeitos adversos do 5-FU, com a utilização do microrganismo resistente a 5-FU obtido por estes métodos, e assim completaram a presente invenção. A presente invenção refere-se nomeadamente a [1] um processo para a produção de uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que tem uma resistência a 5-fluoruracilo a uma concentração pelo menos eficaz para a atividade antitumoral, em que é introduzido um gene de citosina-desaminase numa bactéria entérica que pode crescer em tecidos de tumores anaeróbicos e que não tem um gene de citosina-desaminase, para se obter uma bactéria transformada que exprime citosina-desaminase, e é realizada uma subcultura ou cultura de aclimatação da bactéria transformada que exprime citosina-desaminase através da repetição de pelo menos três ciclos de cultura com um meio complementado com 2 a 5000 yg/mL de 5-fluorcitosina, durante pelo menos 24 horas; [2] o método para a produção de uma bactéria resistente de acordo com [1], em que a bactéria entérica que não tem um gene de citosina-desaminase é uma bactéria pertencente ao género Bifidobacterium; [3] o processo para a produção de uma bactéria resistente de acordo com [2], em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve ou Bifidobacterium infantis; [4] o processo para a produção de uma bactéria resistente de acordo com [3] , em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum; [5] um processo para a produção de uma bactéria entérica anaeróbica 10 resistente a 5-fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que tem uma resistência ao 5-fluoruracilo a uma concentração pelo menos eficaz para a atividade antitumoral, em que o processo compreende os passos de (1) se realizar uma subcultura ou cultura de aclimatação de uma bactéria entérica que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos e que não tem um gene citosina-desaminase, por repetição de pelo menos três ciclos de cultura com um meio complementado com 1 a 100 pg/mL de 5-fluoruracilo, durante pelo menos 24 horas, para se produzir uma bactéria resistente a 5-fluoruracilo, e (2) a transformação da bactéria resistente a 5-fluoruracilo produzida em (1) acima por introdução de um gene de citosina-desaminase; [6] o processo para a produção de uma bactéria resistente de acordo com [5], em que a bactéria entérica que não tem um gene citosina-desaminase é uma bactéria pertencente ao género Bifidobacterium; [7] o processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com [6], em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve ou Bifidobacterium infantis; [8] o processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com [7], em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum; [9] uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado pelo menos com 2 pg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos com 1 pg/mL de 5-fluoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe Bifidobacterium longum 105-A que é portadora do plasmídeo pAVOOl- HU- eCD; [10] uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que pode 11 crescer num meio complementado pelo menos com 2 pg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos com 1 pg/mL de 5-fluoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe de tipo Bifidobacterium breve que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD; [11] uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado pelo menos com 2 pg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos com 1 pg/mL de 5-fluoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe Bifidobacterium breve aS-1, que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD; [12] uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado pelo menos com 2 pg/mL de 5-f luorcitosina ou pelo menos com 1 pg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe Bifidobacterium breve 1-53- 8W, que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD; [13] uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado pelo menos com 2 pg/mL de 5-f luorcitosina ou pelo menos com 1 pg/mL de 5-fluoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe de tipo Bifidobacterium infantis, que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD; [14] uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado pelo menos com 2 pg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos com 1 pg/mL de 5-fluoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe de tipo Bif idobacterium infantis I- 10- 5, que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- 12 eCD; [15] um agente terapêutico para o tratamento de tumores sólidos, compreendendo a bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo com um gene citosina-desaminase introduzido, de acordo com um dos pontos [9] a [14]; [16] o agente terapêutico para o tratamento de tumores sólidos, de acordo com [15], combinado com 5-fluorcitosina; [17] o agente terapêutico para o tratamento de tumores sólidos, de acordo com [15] ou [16], combinado adicionalmente com lactulose.

Breve Descrição dos Desenhos A [Fig. 1] é um diagrama que mostra um processo para a produção de um vetor transportador de Bifidobacterium-E. coli pAVOOl e um vetor transportador de expressão de CD pAVOOl- HU- eCD. A [Fig. 2] é uma figura que mostra o resultado da comparação do nivel de expressão da proteína CD entre uma Bifidobacterium longum de tipo selvagem e Bifidobacterium/-pAVOOl-HU-eCD. A [Fig. 3] é um gráfico que mostra o perfil da contagem de células em relação ao tempo, obtido a partir da comparação da atividade enzimática de CD (comparação da atividade para a conversão de 5-FC em 5-FU) entre uma Bifidobacterium longum de tipo selvagem e Bifidobacterium/pAVOOl-HU-eCD. A [Fig. 4] é um gráfico que mostra as concentrações de 4-FU obtidas a partir da comparação da atividade enzimática de CD (comparação da atividade para a conversão de 5-FC em 5-FU) entre uma Bifidobacterium longum de tipo selvagem e Bifidobacterium/pAVOOl-HU-eCD. 13

Melhor Modo de Realização da Invenção

Os microrganismos usados nos processos de produção da presente invenção, que podem crescer em tecidos de tumores anaeróbicos, são bactérias entéricas pertencentes a géneros tais como Bifidobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus, Peptococcus, Enterococcus, Bacteroides e Eubacterium. Entre estas, são preferidas as bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium.

Os exemplos concretos de bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium incluem Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium lactentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophirum, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium animalis. Entre estas são preferidas como bactérias hospedeiras as Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum e Bifidobacterium infantis, conhecidas por habitarem no intestino humano, independentemente da idade, sendo a mais preferida a Bifidobacterium longum. Todas estas bactérias estão disponíveis comercialmente ou podem ser facilmente obtidas a partir de instituições depositárias. Podem ser usadas, por exemplo, as Bifidobacterium longum ATCC-15707, Bifidobacterium bifidum ATCC-11863 ou Bifidobacterium infantis ATCC-15697.

Os exemplos de estirpes de Bifidobacterium longum incluem, sem limitações, Bifidobacterium longum 105-A, Bifidobacterium longum aE-194b, Bifidobacterium longum bs-601 e Bifidobacterium longum M101-2. Entre estas, pode ser citada como exemplo preferido a Bifidobacterium longum 105-A. 14

Além destas, as estirpes de Bifidobacterium breve citadas como exemplos incluem, sem limitações, estirpe de tipo Bifidobacterium breve (JCM1192), Bifidobacterium breve aS-1 e Bifidobacterium breve I- 53- 8W. de estirpes de Bifidobacterium limitações, estirpe de tipo (JCM1222) e Bifidobacterium

Além destas, os exemplos infantis incluem, sem Bifidobacterium infantis infantis I- 10- 5.

Além destes, os exemplos de estirpes de Bifidobacterium lactentis incluem, sem limitações, a estirpe de tipo Bifidobacterium lactentis (JCM1220). A subcultura ou cultura der aclimatação na presença de 5-FC pode ser realizada procedendo-se a uma cultura anaeróbica a 37°C num meio de cultura (meio liquido ou placa de agar) apropriado para o crescimento e a proliferação de bactérias ou fungos, sendo o referido meio complementado com 5-FC a uma concentração na gama de, por exemplo, de 2 a 5000 yg/mL, de preferência de 2 a 2000 yg/mL.

Quando os microrganismos são cultivados num meio de cultura complementado com 5-FC, a 5-FC é gradualmente convertida em 5-FU por CD, expressa em conjunto com a proliferação do microrganismo. Deste modo, o 5-FU atua primeiro a baixa concentração, evitando a erradicação do microrganismo da cultura, com o aumento gradual da concentração do 5-FU. Por conseguinte, apenas os microrganismos que tenham adquirido uma resistência podem ser cultivados seletivamente. Desta forma, pode ser recolhido de forma reprodutível o microrganismo resistente ao 5-FU da presente invenção. A subcultura ou cultura de aclimatação na presença de 5-FU pode ser realizada procedendo-se a uma cultura anaeróbica a 15 37°C num meio de cultura (meio liquido ou placa de agar) apropriado para o crescimento e a proliferação de bactérias ou fungos, sendo o referido meio complementado com 5-FC a uma concentração na gama de, por exemplo, de 1 a 100 yg/mL, de preferência de 2 a 100 yg/mL. Desta forma, pode ser recolhido de forma reprodutível o microrganismo resistente ao 5-FU.

Podem ser preparados um microrganismo que exprime CD, transformado pela introdução de um gene CD, e um vetor de expressão de CD e um transformante usado para a preparação de um microrganismo transformado pela introdução de um gene que garante ao microrganismo uma capacidade para crescer em estado anaeróbico, de acordo com os processos descritos em manuais de experiências que podem ser obtidos comercialmente, tais como Idenshi Manyuaru (Gene Manual (Kodansha)); Idenshi Sosa Jikkenhou (Methods for Experiments in Gene Manipulation (ed., Yasutaka Takagi, Kodansha)); Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory (1982)); Molecular Cloning, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory (1989)); Methods in Enzymology, 194 (1991) ; e Jikken Igaku bessatsu, Kobo niyoru Idenshi Jikkenhou (Gene Experiments Using Teasts, Experimental Medicine Suppl (Yodosha (1994))). Deverá ser de preferência usado um vetor de expressão apropriado para um microrganismo hospedeiro.

Para um ADN que codifica CD, pode ser usado por exemplo, ADN isolado de um plasmídeo pAdexl CSCD (Riken Gene Bank, RDB n° 1591), que contém um ADN que codifica uma CD derivada de E. coli, ou um plasmídeo pMKH6, que também contém um ADN que codifica a CD derivada de E. coli (D. A. Mead et al., Protein Engineering 1: 67-74 (1986)). 16

Em particular, os exemplos de vetores de expressão de CD para as bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium incluem de preferência um plasmideo recombinante pBLESlOO-S-eCD portador de um E. coli codA inserido a jusante de um promotor hup de Bifidobacterium longum (ver o documento de patente 1 e o documento não patente 21), pAVOOl- HU- eCD, que foi construído por melhoria do pBLESlOO- S- eCD e é capaz de transformar Bifidobacterium longum e Bifidobacterium breve, e mutantes destes plasmideos.

Um mutante de um plasmideo pBLESlOO- S- eCD refere-se a um mutante de uma sequência de ácido nucleico do plasmideo derivado de pBLESlOO- S- eCD, que pode ser usado do mesmo modo que o pBLESlOO- S- eCD na presente invenção. Analogamente, os mutantes do plasmideo pAVOOl- HU- eCD referem-se a mutantes da sequência de ácido nucleico derivada do plasmideo derivado de pAVOOl- HU- eCD, em que os mutantes podem ser usados da mesma que o pAVOOl- HU- eCD na presente invenção.

Um microrganismo resistente a 5-FU, que exprima CD, de acordo com a presente invenção, pode crescer num tecido de tumor anaeróbico, pode exprimir CD, e tem uma resistência ao 5-FU a uma concentração que é pelo menos eficaz para a atividade antitumoral. Embora a concentração efetiva do 5-FU para a atividade antitumoral varie consoante os tecidos sujeitos, os pacientes e similares, pode dar-se como exemplo uma concentração de pelo menos 0,05 a 0,1 pg/mL.

Adicionalmente, uma instrução de uma formulação de 5-FU (para injeção) existente no comércio descreve que foi realizada uma injeção intravenosa continua da formulação de 5-FU num paciente com cancro do estomago avançado, de modo que a concentração do 5-FU no sangue fosse aproximadamente de 0,6 pg/mL. 17

Para uma resistência mais especifica ao 5-FU de um microrganismo resistente a 5-FU e que exprima CD, da presente invenção, é uma capacidade para crescer quando é cultivado anaerobicamente a 37°C num meio de cultura (meio liquido ou placa de agar) que contém pelo menos 1 a 2000 yg/mL, de preferência 2 a 2000 yg/mL de 5-FU.

Além disso, quando a resistência ao 5-FU de um microrganismo resistente a 5-FU e que exprima CD, da presente invenção, é expressa concretamente em relação à concentração de 5-FC, é uma capacidade para crescer quando é cultivada anaerobicamente a 37°C num meio de cultura (meio liquido ou placa de agar) que contém pelo menos 1 a 5000 yg/mL, de preferência 3 a 5000 yg/mL de 5-FC.

Embora a resistência ao 5-FU de um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime CD, da presente invenção, possa ser uma capacidade para crescer quando é cultivado anaerobicamente a 37°C num meio de cultura (meio líquido ou placa de agar) que contém 5-FU a uma concentração dentro da gama descrita acima, a resistência ao 5-FU de um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime CD, da presente invenção é uma capacidade para crescer num meio que contém pelo menos 1 yg/mL ou mais de 5-fluoruracilo ou uma capacidade para crescer num meio que contém pelo menos 2 yg/mL ou mais de 5-fluorcitosina.

Um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime CD, da presente invenção, pode ser um microrganismo recombinante produzido pelos processos descritos acima.

Um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime CD, da presente invenção, pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, pode exprimir CD, e tem uma resistência ao 5-FU a uma concentração que é pelo menos eficaz para a 18 atividade antitumoral e é uma bactéria entérica pertencente aos géneros Bifidobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus, Peptococcus, Enterococcus, Bacteroides ou Eubacterium. Entre estas, podem ser citadas como exemplos das mais preferidas as bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium.

Os exemplos concretos de bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium incluem Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium lactentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophirum, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium animalis. Entre estas são preferidas como bactérias hospedeiras as Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum e Bifidobacterium infantis, que são conhecidas por habitarem no intestino humano, independentemente da idade, sendo a mais preferida a Bifidobacterium longum. Todas estas bactérias estão disponíveis comercialmente ou podem ser facilmente obtidas a partir de instituições depositárias. Podem ser usadas, por exemplo, as Bifidobacterium longum ATCC-15707, Bifidobacterium bifidum ATCC-11863 ou Bifidobacterium infantis ATCC-15697.

Os exemplos de estirpes de Bifidobacterium longum incluem, sem limitações, Bifidobacterium longum 105-A, Bifidobacterium longum aE-194b, Bifidobacterium longum bs-601 e Bifidobacterium longum M101-2. Entre estas, pode ser citada como exemplo preferido a Bifidobacterium longum 105-A.

Além destas, as estirpes de Bifidobacterium breve citadas como exemplos incluem, sem limitações, estirpe de tipo 19

Bifidobacterium breve (JCM1192), Bifidobacterium breve aS-1 e Bifidobacterium breve I- 53- 8W. de estirpes de Bifidobacterium limitações, estirpe de tipo (JCM1222) e Bifidobacterium

Além destes, os exemplos infantis incluem, sem Bifidobacterium infantis infantis I- 10- 5.

Além destes, os exemplos de estirpes de Bifidobacterium lactentis incluem, sem limitações, a estirpe de tipo Bifidobacterium lactentis (JCM1220).

Mais concretamente, os exemplos de bactérias preferidas que têm as propriedades anteriores e que pertencem ao género Bifidobacterium incluem uma estirpe de Bifidobacterium longum 105-A resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que é portadora do plasmideo pBLESlOO- S- eCD ou um plasmideo mutante da mesma (uma estirpe Bifidobacterium longum 105-A transformada com o plasmideo pBLESlOO- S- eCD ou um plasmideo mutante da mesma); uma estirpe de Bifidobacterium longum 105-A resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD ou um plasmideo mutante do mesmo; uma estirpe tipo Bifidobacterium breve resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD ou um plasmideo mutante do mesmo; uma estirpe de Bifidobacterium breve aS-1 resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU- eCD ou um plasmideo mutante do mesmo; uma estirpe de Bifidobacterium breve I-53-8W resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU-eCD ou um plasmideo mutante do mesmo; uma estirpe tipo Bifidobacterium infantis resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que é portadora do plasmideo pAVOOl- HU- eCD ou um plasmideo mutante do mesmo; e uma estirpe Bifidobacterium infantis 1-10-5 resistente a 5-FU e que exprime a CD, e que 20 é portadora do plasmídeo pAVOOl- HU- eCD ou um plasmídeo mutante do mesmo.

Um agente terapêutico da presente invenção contém o microrganismo resistente a 5-FU e que exprime a CD da presente invenção. Além disso, o agente terapêutico da presente invenção pode conter uma ou mais espécies de um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime a CD da presente invenção. A dosagem de um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime a CD da presente invenção, contido num agente terapêutico da presente invenção, é uma quantidade suficiente para a expressão de CD numa quantidade que pode converter 5-FC numa quantidade terapeuticamente eficaz de 5-FU. No entanto, a dosagem deverá ser, de preferência, tão baixa quanto possível.

Um agente terapêutico da presente invenção pode conter qualquer componente opcional que não seja o microrganismo resistente a 5-FU e que exprime a CD da presente invenção, desde que não prejudique o efeito da presente invenção. Estes componentes opcionais incluem, por exemplo, veículos, excipientes e diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Os agentes terapêuticos da presente invenção são usados em combinação com 5-FC numa quantidade que pode ser convertida numa quantidade eficaz de 5-FU por um microrganismo resistente a 5-FU e que exprime a CD, da presente invenção. Embora a 5-FC possa estar contida no agente terapêutico da presente invenção, é preferível utilizar-se uma outra composição farmacêutica contendo a 5-FC em combinação com o agente terapêutico da presente invenção. Além disso, o agente terapêutico da presente invenção pode ser combinado com açúcares que podem promover a proliferação dos microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem a CD, da 21 presente invenção. Os exemplos destes açúcares incluem a lactulose. 0 termo "combinação de X e Y (X combinado com Y) " aqui usado inclui ambos os casos em que X e Y estão em diferentes formas e em que X e Y estão na mesma forma (por exemplo, uma forma que contenha X e Y). Nos casos em que X e Y estão em formas diferentes, tanto X como Y podem conter ainda outros componentes.

Quando um agente terapêutico da presente invenção é administrado a um paciente, o microrganismo resistente a 5-FU e que exprime a CD da presente invenção cresce em tecidos de tumores. Se a 5-FC for administrada enquanto o microrganismo resistente existe no tumor, a 5-FC será convertida em 5-FU por ação da CD no tumor. 0 5-FU resultante pode matar as células do tumor. Em virtude da expressão da CD, os o microrganismos resistentes a 5-FU da presente invenção podem sobreviver na presença do 5-FU a uma concentração que pode matar as células do tumor e a atividade enzimática da CD pode ser mantida. Deste modo, podem ser obtidos excelentes medicamentos antitumorais contendo como ingrediente ativo os microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem CD, da presente invenção. Além disso, os microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem CD, da presente invenção não podem sobreviver em partes, além dos tecidos de tumor anaeróbicos, em que os microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem CD, da presente invenção podem crescer. Deste modo, a 5-FC não será ali convertida em 5-FU e os efeitos colaterais sistémicos do 5-FU podem ser restringidos a um nível drasticamente mais baixo, em comparação com a administração do 5-FU em si mesma. Além disso, os efeitos antitumorais dos agentes terapêuticos da presente invenção para o tratamento de tumores sólidos têm uma elevada 22 especificidade aos tumores. Podem ser alcançados desta forma niveis de 5-FU substancialmente mais elevados em tumores, quando comparados com os niveis de administração do 5-FU em si mesmo, conduzindo por consequência a efeitos antitumorais excecionalmente excelentes.

Para uma forma de dosagem de um agente terapêutico da presente invenção podem dar-se como exemplos uma formulação liquida e uma formulação sólida, contendo o microrganismo resistente a 5-FU e que exprime CD, da presente invenção. A formulação liquida pode ser preparada purificando-se a solução de cultura do microrganismo resistente a 5-FU e que exprime CD, da presente invenção, adicionando-se opcionalmente soro fisiológico ou liquido de substituição, adequados, ou aditivos farmacêuticos, e embalando a solução numa ampola ou frasco, etc. Para a preparação de uma formulação sólida, a formulação liquida pode ser adicionada de um agente de proteção apropriado, embalada numa ampola ou frasco, e liofilizada ou seca por pulverização. Em alternativa, a formulação liquida pode ser adicionada de um agente de proteção adequado, liofilizada ou seca por pulverização, e embalada numa ampola ou frasco. Como método de administração de um agente terapêutico da presente invenção, é preferida a administração parentérica e podem citar-se como exemplos a injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção localizada e a administração intraventricular. Entre estas, a mais preferível é a administração intraventricular.

Um agente terapêutico da presente invenção é usado em combinação com 5-FC. 0 agente terapêutico da presente invenção e a 5-FC podem ser administrados ou num mesmo método de administração, ou em métodos diferentes, e podem ser administrados ou simultaneamente, ou em separado. A administração da 5-FC deverá de preferência ser realizada 23 depois de um agente terapêutico da presente invenção, para permitir que os microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem CD, da presente invenção, cresçam suficientemente nos tecidos dos tumores. A dosagem da 5-FC usada em combinação com os agentes terapêuticos da presente invenção não está particularmente limitada, desde que seja uma quantidade suficiente de 5-FC a ser convertida na quantidade terapeuticamente efetiva do 5-FU pelos microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem CD, da presente invenção. No entanto, deverá de preferência ser tão baixa quanto possível. A dosagem pode ser selecionada apropriadamente, por exemplo, de uma gama de 5 a 200 mg/kg.

Além disso, pode ser usado um agente terapêutico da presente invenção em combinação com açúcares que promovam a proliferação dos microrganismos resistentes a 5-FU e que exprimem CD, da presente invenção. Os exemplos destes açúcares incluem a lactulose. Os referidos açúcares podem ser administrados como um componente de um agente terapêutico da presente invenção, ou como uma composição farmacêutica diferente, quer simultaneamente, quer em separado, com um agente terapêutico da presente invenção. A presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos exemplos adiante, mas o âmbito tecnológico da presente invenção não está limitado a estas exemplificações.

[Exemplo de Referência 1] [Produção de Bifidobacterium longum que exprime CD] 24 0 Bifidobacterium longum que exprime CD foi produzido como é descrito no Pedido de Patente Japonesa n° 2004-33967. 1. Construção do vetor transportador pAVOOl (Construção do plasmídeo)

Uma sequência que inclui genes que codificam espectinomicina-adeniltransferase (cassete AAD) de

Enterococcus faecalis foi amplificada por PCR a partir de pBLESlOO, que é um vetor transportador de Bifidobacterium longum e E. coli (ver o documento de patente 2 e o documento não patente 23), e foi subclonada no vetor pCR-BluntII-ΤΟΡΟ (Invitrogen) para se preparar pCRTOPO-Scal-AAD-Eamll051. Os sitios de restrição Seal e Eamll051 foram adicionados a iniciadores dianteiros e opostos, respetivamente.

Tal como se mostra na fig. 1, um vetor de clonagem pGFPuv (DEFINIÇÃO: vetor de clonagem pGFPuv. ADESÃO: U62636; VERSÃO: U62636.1 G1: 1490528) adquirido de Invitrogen, é composto pelo gene GFPuv com sítios multi-clonagem (MCS) em ambas as extremidades do gene, um gene de resistência à ampicilina, e uma origem de replicação de plasmídeo em E. Coli. O gene de resistência à ampicilina no pGFPuv foi excisado por clivagem com enzimas de restrição Eamll051 e Seal, para se produzir um fragmento longo. Analogamente, o pCRTOPO-Scal- AAD- Eamll051 foi clivado com Eamll051 e Seal, para se produzir um fragmento (aproximadamente 1100 bp) contendo uma cassete AAD. Estes dois fragmentos foram ligados a T4 ADN-ligase para produzir pGFPuv- SpR. A adição da propriedade de resistência à espectinomicina e perda da 25 resistência à ampicilina no pGFPuv- SpR são respetivamente confirmadas em E. coli. 0 pGFPuv- SpR foi digerido com os enzimas de restrição Sall (localizado no sitio de multiclonagem a montante do gene GFPuv) e Spel (localizado no sitio de multiclonagem a jusante do gene GFPuv) para se produzir o plasmídeo pAVN, que é desprovido do gene GFPuv.

Uma sequência de aproximadamente 1900 bp, contendo repetições ricas em RepB, SDO, DDO, AT, e motivos de ligação Dna-A, foi identificada como uma unidade de replicação de plasmideo de Bifidobacterium longum da informação de sequência de nucleótido completa do plasmideo pTB6 derivado de Bifidobacterium longum. A sequência de aproximadamente 1900 bp que contém a unidade de replicação de plasmideo de Bifidobacterium longum foi amplificada por PCR de pTB6 e foi subclonada no vetor pCR-BluntII-TOPO para produzir pCRTOPO-Apal-1900-Scal. Os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição de Apal e Seal foram adicionados aos iniciadores dianteiro e oposto, respetivamente.

Um fragmento longo, produzido por digestão de pAVN com os enzimas de restrição Apal e Seal (aproximadamente 2400 bp), e um fragmento curto produzido por digestão análoga de pCRTOPO-APAl-1900-Scal (aproximadamente 1900 bp) foram ligados entre si usando-se T4 ADN-ligase, para produzir um vetor transportador de Bifidobacterium longum-E.coli pAVOOl (aproximadamente 4300 bp). 2. Vetor de expressão do gene CD pAVOOl-HU-eCD (Construção do vetor de expressão) 26

Em seguida, o pBLESlOO- S- eCD foi clivado com enzimas de restrição Hind III e Spel para se extrair um fragmento de aproximadamente 2900 bp, contendo um promotor de gene HU, um gene CD derivado de E. coli, e um terminador de gene HU. Analogamente, o vetor transportador pAVOOl foi clivado com enzimas de restrição Hind III e Spel nos sítios de restrição no sítio de multiclonagem. O fragmento longo obtido e o fragmento acima de aproximadamente 2900 bp foram ligados usando-se T4 ADN-ligase, para se produzir pAVOOl-HU- eCD (aproximadamente 7100 bp). 3. Introdução do vetor de expressão do gene CD pAVOOl- HU-eCD no género Bifidobacterium

Bifidobacterium longum de tipo selvagem foi cultivado em meio MRS a 37°C, em condições anaeróbicas, e o meio de cultura resultante foi centrifugado para se isolarem as células bacterianas, que foram em seguida postas em suspensão num tampão apropriado, para se preparar uma suspensão de bactérias. Em seguida o vetor de expressão do gene citosina-desaminase pAVOOl- HU- eCD foi introduzido nas células, na suspensão de bactérias, pelo método de eletroporação, como é descrito no documento não patente 23. O Bifidobacterium longum recombinante transformado (Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD) foi selecionado com base na formação de colónias sobre um meio de agar contendo o antibiótico espectinomicina. (Expressão de citosina-desaminase em Bifidobacterium longum recombinante) O Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD e Bifidobacterium longum de tipo selvagem foram subcultivados respetivamente em meio MRS contendo o antibiótico espectinomicina, a 37°C, em condições anaeróbicas, durante dois ou mais dias. As 27 células das bactérias foram separadas (1 χ 109 CFU) do meio de cultura por centrifugação, que foi em seguida submetido a ultrassons e seguido pela extração das proteínas intracelulares respetivamente. As proteínas extraídas foram separadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. A expressão de uma proteína citosina-desaminase foi confirmada por "western blotting", usando-se o anticorpo monoclonal citosina-desaminase de coelho (Sawaday Technology) como anticorpo primário e imunoglobulina G anticoelho conjugada com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) como anticorpo secundário. Os sinais foram visualizados pelo sistema ECL e detetados como sinais luminescentes com uma câmara CCD arrefecida com Fluo-S-MAX (BIO-RAD). Foram detetados sinais de Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD, mostrando a expressão de proteínas citosina-desaminase, ao passo que não foram detetados sinais de Bifidobacterium longum de tipo selvagem, mostrando a não expressão da citosina-desaminase (ver a Fig. 2) . (Medição da atividade enzimática de citosina-desaminase (atividade de conversão 5-FC-5 5-FU) em Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD)

Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD e Bifidobacterium longum de tipo selvagem foram subcultivados respetivamente em meio MRS contendo o antibiótico espectinomicina, a 37°C, em condições anaeróbicas, durante dois ou mais dias. As células das bactérias foram separadas da solução de cultura por centrifugação (2 χ 109 CFU) , foram postas de novo em suspensão em 4,5 mL de meio MRS, e foram adicionados 0,5 mL de 5-FC (20 mg/mL) até à concentração final de 2 mg/mL, e em seguida foram cultivados a 37°C em condições anaeróbicas. Após 0, 4, 8, 18 e 24 horas as soluções de cultura foram centrifugadas e os sobrenadantes foram 28 recolhidos, dos quais foram removidas as células bacterianas. A concentração do 5-FU convertido nos sobrenadantes foi medida por análise por cromatografia em fase gasosa (métodos 5-FU GC-MS, BML). 0 perfil da contagem de células viáveis em relação ao tempo é apresentado na Fig. 3. As concentrações de 5-FU são mostradas na Fig. 4. Como resultado, foi detetado 5-FU em Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD, em 39,2 yg/mL após 4 horas e em 102,1 yg/mL após 24 horas, enquanto no Bifidobacterium longum de tipo selvagem foram detetadas quantidades extremamente baixas de 5-FU.

Exemplo 1 [microrganismos de Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistentes a 5-FU]

Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD obtido no Exemplo de Referência 1 foi inoculado em 5 mL de meio MRS que continha o antibiótico espectinomicina e 50 yg/mL de 5-FC, seguido pela cultura anaeróbica a 37°C durante 72 horas. Em seguida, 1 mL do meio de cultura foi inoculado de modo semelhante em 9 mL de meio MRS contendo o antibiótico espectinomicina e 50 yg/mL de 5-FC, e foi cultivado durante 24 horas nas mesmas condições de cultura. O passo de inoculação foi repetido em três ciclos para produzir Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistente a 5-FU. Em seguida foi confirmado o crescimento resistente a 5-FU do Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistente a 5-FU produzido, mediante a inoculação em meio MRS que continha 20 yg/mL de 5-FU e o antibiótico espectinomicina, e a cultura durante 24 horas nas mesmas condições de cultura que anteriormente. Em seguida as bactérias foram postas em suspensão com glicerina e guardadas a -80°C como reserva em glicerina. A amostra de bactérias guardada e o 29

Bifidobacterium longum tipo selvagem foram inoculados respetivamente em meios MRS que continham 250 pg/mL de 5-FU e o antibiótico espectinomicina, e foram comparados os seus crescimentos. 0 crescimento das bactérias da amostra conservada foi observado no dia seguinte, indicando a manutenção da resistência a 5-FU, ao passo que o tipo selvagem não cresceu. As contagens de células viáveis da cultura de bactérias após a cultura foram determinadas pelo método de contagem em placa. A contagem de células viáveis foi de 2 a 3 x 109 CFU/mL para a cultura de bactérias da amostra conservada, enquanto a do tipo selvagem era inferior ao limite de deteção (inferior a 103 CFU/mL).

[Medição da concentração de 5-FU até à qual o Bifidobacterium longum resistente a 5-FU é resistente] O Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistente a 5-FU, obtido acima, e Bifidobacterium longum de tipo selvagem foram subcultivados respetivamente em meio MRS a 37°C, em condições anaeróbicas, durante mais dois dias. As soluções de cultura foram diluidas com diluente anaeróbico, foram espalhadas sobre meios de BL agar que continham 0, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ou 2000 pg/mL de 5-FU, e foram cultivadas anaerobicamente a 37°C durante 2 a 3 dias. Em seguida foram determinadas as contagens de células viáveis. As experiências usando meio de BL agar isento de 5-FU foram realizadas em quintuplicado e as outras experiências usando meio BL agar contendo 5-FU foram realizadas em triplicado. Os resultados são apresentados nas Tabelas 1 (Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistente a 5-FU) e 2 (Bifidobacterium longum de tipo selvagem). Como se mostra na Tabela 1, o Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU-eCD resistente a 5-FU tem uma resistência ao 5-FU, cuja concentração é pelo menos de 2000 pg/mL. Pelo contrário, o Bifidobacterium longum de tipo selvagem não cresceu na 30 presença de 5-FU a uma concentração de pelo menos 25 yg/mL ou superior (Tabela 2). 31

[Tabela 1] Bifidobacterium longum/pAVOOl- HD- eCD resistentes a 5-FU

Teor de 5-FU (pg/mL) 1 2 3 1 5 Média DP Cv (¾) Taxa de Crescimento (1) 0 1« 120 175 138 105 119,0 20,0 13,4 25 110 118 121 129,3 10,7 12,9 86¾ 50 129 129 128 128,7 0,6 0,1 86¾ 100 118 139 107 121,3 10,3 12,4 81¾ 250 100 107 111 107,0 7,0 0,5 72¾ 500 115 110 153 148,0 oo 0\l 20,1 98¾ 1000 108 123 117 146,0 22,5 15,4 98¾ 2000 127 128 121 120,3 2,1 1,0 84¾ DP: desvio padrão CV: coeficiente de variação 32 [Tabela 2] Bifidobacterium longum de tipo selvagem

Teor de 5-FU (pg/mL) 1 2 3 4 5 Média DP Cv (¾) Taxa de Crescimento (1) 0 108 117 104 120 137 118,4 13,43 11,24 25 0 0 0 0,0 0,0 - 0¾ 50 0 0 0 0,0 0,0 - 01 100 0 0 0 0,0 0,0 - 0¾ 250 0 0 0 0,0 0,0 - 0¾ 500 0 0 0 0,0 0,0 - 01 1000 0 0 0 0,0 0,0 - 0¾ 2000 0 0 0 0,0 0,0 - 0¾ DP: desvio padrão CV: coeficiente de variação 33 [Manutenção do traço resistente a 5-FU em Bifidobacterium longum resistente a 5-FU] 0 Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistente a 5-FU, obtido acima, foi subcultivado anaerobicamente em meio MRS que continha o antibiótico espectinomicina a 37°C durante dois ou mais dias. 5 yL da solução cultivada foram inoculados em 5 mL de meio MRS que estava isento do antibiótico espectinomicina, e foram cultivados anaerobicamente a 37°C durante 24 horas. A solução de cultura foi subcultivada analogamente durante 30 dias, continuamente. Depois de 30 dias de subcultura continua a solução de cultura foi diluída com um diluente anaeróbico, foi espalhada sobre um meio de BL agar que continha 250 yg/mL de 5-FU ou de um meio de BL-Agar isento de 5-FU, e foi subcultivado anaerobicamente a 37°C durante 2 a 3 dias. Foi então determinada a contagem das células viáveis. As experiências foram realizadas em quintuplicado. Os resultados são apresentados na Tabela 3. Como é patente da Tabela 3, o traço resistente a 5-FU do Bifidobacterium longum resistente a 5-FU foi mantido pelo menos depois do 30° dia de subcultura contínua.

[Tabela 3]

Teor de 5-FU (yg/mL) 1 2 3 4 5 Média DP Cv (%) Taxa de Crescimento <%) 0 146 197 134 153 149 155, 8 24,10 15, 47 250 166 152 124 137 194 154,6 27,09 17,52 99% DP: desvio padrão CV: coeficiente de variação [Cultura de Bifidobacterium longum resistente a 5-FU e de Bifidobacterium longum não resistente a 5-FU em meios líquidos que contêm 5-FC] 34 0 Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD obtido no exemplo de referência 1 (Bifidobacterium longum não resistente a 5-FU) e o Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD obtido acima (Bifidobacterium longum resistente a 5-FU) foram subcultivados respetivamente em condições anaeróbicas a 37°C, em meio MRS contendo o antibiótico espectinomicina, durante dois ou mais dias. Em seguida, 50 pL de cada uma das soluções de cultura foram inoculados em meio MRS contendo 5-FC nas concentrações de 5, 25, 50, 100, 250 ou 500 pg/mL, e foram cultivados a 37°C em condições anaeróbicas durante 24 horas. Depois da cultura, o crescimento de cada bactéria foi determinado por medição da turbidez da solução pós-cultura (OD = 600 nm) (Tabela 4). O crescimento do Bifidobacterium longum não resistente a 5-FU foi inibido acentuadamente em meios que continham 50 pg/mL ou mais de 5-FC. Em contraste, o Bifidobacterium longum resistente a 5-FU cresceu em todas as concentrações de δυο.

[Tabela 4]

Medição da turbidez (OD = 600 nm) Teor de 5-FC (pg/mL) 5 25 50 100 250 500 Exemplo de referência 1 Bifidobacterium longum não resistente a 5-FU 6,43 4,29 1,92 0,68 0,19 0,09 Exemplo 1 Bifidobacterium longum resistente a 5-FU 5,73 5,38 4,11 5,41 5, 15 4,29

Exemplo 2 [Bactérias de Bifidobacterium longum/pAVOOl- HU- eCD resistentes a 5-FU, produzidas por utilização de meios que contêm 5-FU] 35

Foi inoculado Bifidobacterium longum em 5 mL de meio MRS que continha 1, 5, 10, 50, 100 ou 500 yg/mL de 5-FU e foi cultivado anaerobicamente a 37°C durante um a cinco dias. Foram medidas as turbidezes (OD = 600 nm) para cada cultura para se examinar o crescimento (Tabela 5). Para o meio que continha 500 yg/mL de 5-FU não foi observado crescimento, mesmo depois de 5 dias, e não foi possível obter-se a estirpe de bactéria resistente. Para os outros meios, em que foi observado crescimento, foi inoculado 1 mL de cada um dos meios pós-cultura em 9 mL de meio MRS que continha a mesma concentração de 5-FU, e foi cultivado durante 24 horas nas mesmas condições de cultura. Este passo de inoculação foi repetido por três ciclos, para se produzir Bif idobacterium longum resistente a 5-FU em cada uma das concentrações de 5-FU. Em seguida, cada Bifidobacterium longum resistente a 5-FU foi inoculado em meio MRS. Cada uma das soluções pós-cultura foi inoculada em meio MRS que continha 250 yg/mL de 5-FU. Após 24 horas de incubação foram medidas as turbidezes (OD = 600 nm), para se determinar o crescimento [Tabela 6] . Como resultado, o

Bifidobacterium longum resistente a 5-FU produzido a partir dos meios que continham 1 a 100 yg/mL de 5-FU têm o mesmo nivel de resistência ao 5-FU que a estirpe resistente a 5-FU obtida no exemplo 1.

[Tabela 5] OD = 600 nm Concentração de 5-FU usada para garantir a resistência (pg/mL) 1 5 10 50 100 500 1000 Dias de cultura 1 4, 94 0,22 0,09 0,00 -0,05 -0,05 -0,06 2 4, 94 4,39 5,51 0,44 0,01 -0,07 -0,08 3 4, 94 4,39 5,51 4,99 0,12 co o o 1 -0,06 4 4,94 4,39 5,51 4,99 5, 88 0,07 0,01 5 4,94 4,39 5,51 4,99 5, 88 0,08 0,02 36 [Tabela 6]

Concentração de 5-FU usada para garantir a resistência (pg/mL) 1 5 10 50 100 500 1000 Taxa de crescimento de estirpes resistentes a 5-FU 20% 55% 62% 90% 95% 0% 0%

As estirpes resistentes a 5-FU obtidas no exemplo 2 foram transformadas pelo mesmo método que no Exemplo de Referência 1 e foi confirmada a expressão de citosina-desaminase. As estirpes resistentes a 5-FU, que exprimiam citosina-desaminase, têm uma resistência a 5-DU semelhante à das estirpes resistentes a 5-FU obtidas no exemplo 1. Além disso, a resistência ao 5-FU foi mantida durante pelo menos 7 dias ou mais.

Exemplo 3

Bactérias resistentes a 5-FU, de Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium lactentis

Foram produzidas estirpes de Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium lactentis, resistentes a 5-FU, pelo mesmo método do Exemplo 1. É Apresentada na Tabela 7, abaixo, uma lista de cinco estirpes de Bifidobacterium resistentes a 5-FU.

[Tabela 7]

Lista de estirpes com resistência requerida produzidas pelo mesmo método que no Exemplo 1 Espécie Estirpe Plasmideo introduzido B. Longum 105-A pBLESlOO-S-eCD B. Longum 105-A pAVOOl-HU-eCD 37

B. Longum aE-194b pAVOOl-HU-eCD B. Longum bs-601 pAVOOl-HU-eCD B. Longum M101-2 pAVOOl-HU-eCD B. lactentis Estirpe tipo JCM1220 pAVOOl-HU-eCD B. infantis Estirpe tipo JCM1222 pAVOOl-HU-eCD B. infantis 1-10-5 pAVOOl-HU-eCD B. breve Estirpe tipo JCM1192 pAVOOl-HU-eCD B. breve aS-1 pAVOOl-HU-eCD B. breve I-53-8W pAVOOl-HU-eCD

Aplicabilidade industrial A presente invenção permite produzir facilmente microrganismos resistentes a 5-FU, tais como bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium, mantendo atividade de CD e exibindo resistência a 5-FU, que são muito úteis para uma terapia enzima/pró-droga que empegue CD/5-FC. Por exemplo, após a administração, a um paciente com cancro, das bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium, que mantêm a atividade de CD e apresentam resistência ao 5-FU, as bactérias pertencentes ao género Bifidobacterium proliferam nos tumores. Se for administrada oralmente 5-FC enquanto as bactérias estão presentes no tumor, a 5-Fc será absorvida através do tracto intestinal e convertida em 5-FU pela atividade de CD nos tumores, e o 5-FU resultante pode matar as células dos tumores. No entanto, a bactéria resistente ao 5-FU pertencente ao género Bifidobacterium pode sobreviver na presença do 5-FU a uma concentração que é suficientemente alta para matar as células do tumor, e pode manter a atividade enzimática da CD. Pode ser obtido, por conseguinte, um excelente medicamento contra tumores que contém a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium como um ingrediente ativo. 38 A 5-FC não será convertida em 5-FU em outros locais senão os tumores em que prolifere um microrganismo resistente ao 5-fluoruracilo, que exprima a CD, da presente invenção. Deste modo, os efeitos adversos do 5-FU podem ser reduzidos consideravelmente em baixos niveis, em comparação com a administração do próprio 5-FU. Além disso, um agente terapêutico para o tratamento de tumores sólidos de acordo com a presente invenção tem efeitos antitumorais de alta especificidade para os tumores. Em conformidade, o agente pode alcançar uma concentração de 5-FU nos tumores notavelmente alta, tendo como resultado excelentes efeitos antitumorais.

Lisboa, 28 de Novembro de 2013

Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de uma bactéria entérica anaeróbica resistente a 5-fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que tem resistência ao 5-fluoruracilo a uma concentração pelo menos eficaz para a atividade antitumoral, em que o gene de citosina-desaminase é introduzido numa bactéria entérica que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos e que não tem um gene de citosina-desaminase para se obter uma bactéria transformada que exprime citosina desaminase, e é realizada uma subcultura ou cultura de aclimatação da bactéria transformada que exprime citosina desaminase, por repetição em pelo menos três ciclos de cultura com um meio complementado com 2 a 5000 pg/mL de 5-fluorcitosina durante pelo menos 24 horas.

2. Processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com a reivindicação 1, em que a bactéria entérica que não tem um gene de citosina-desaminase é uma bactéria pertencente ao género Bifidobacterium.

3. Processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com a reivindicação 2, em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve ou Bifidobacterium infantis.

4. Processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com a reivindicação 3, em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum. 2

5. Processo para a produção de uma bactéria entérica anaeróbica resistente ao 5-fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, que exprime citosina-desaminase e que tem resistência ao 5-fluoruracilo a uma concentração pelo menos eficaz para a atividade antitumoral, em que o processo compreende: (1) a realização de uma subcultura ou cultura de aclimatação de uma bactéria entérica que pode crescer em tecidos de tumores anaeróbicos e que não tem um gene de citosina-desaminase, por repetição de pelo menos três ciclos de cultura, com um meio complementado com 1 a 100 pg/mL de 5-fluoruracilo, durante pelo menos 24 horas, para se produzir uma bactéria resistente ao 5-fluoruracilo; e (2) a transformação da bactéria resistente ao 5-fluoruracilo, produzida no passo (1) acima, por introdução de um gene de citosina-desaminase.

6. Processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com a reivindicação 5, em que a bactéria entérica que não tem um gene de citosina-desaminase é uma bactéria pertencente ao género Bifidobacterium.

7. Processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com a reivindicação 6, em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve ou Bifidobacterium infantis.

8. Processo para a produção de uma bactéria resistente, de acordo com a reivindicação 7, em que a bactéria pertencente ao género Bifidobacterium é Bifidobacterium longum. 3

9. Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5- f luoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, em que foi introduzido um gene que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado com pelo menos 2 yg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos 1 yg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é a estirpe 105-A de Bifidobacterium longum que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU-eCD, como se mostra na Fig. 1.

10. Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5- fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, em que foi introduzido um gene que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado com pelo menos 2 yg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos 1 yg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe de tipo Bif idobacterium breve que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU-eCD, como se mostra na Fig. 1.

11. Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5- fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, em que foi introduzido um gene que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado com pelo menos 2 yg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos 1 yg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe aS-1 de Bifidobacterium breve que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU-eCD, como se mostra na Fig. 1.

12. Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5- f luoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, em que foi introduzido um gene que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio 4 complementado com pelo menos 2 yg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos 1 yg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe I-53-8W de Bifidobacterium breve que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU-eCD, como se mostra na Fig. 1.

13. Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5- fluoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, em que foi introduzido um gene que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado com pelo menos 2 yg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos 1 yg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe de tipo Bifidobacterium infantis que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU-eCD, como se mostra na Fig. 1.

14. Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5- f luoruracilo, que pode crescer em tecidos de tumor anaeróbicos, em que foi introduzido um gene que exprime citosina-desaminase e que pode crescer num meio complementado com pelo menos 2 yg/mL de 5-fluorcitosina ou pelo menos 1 yg/mL de 5-f luoruracilo, em que a bactéria é uma estirpe 1-10-5 de Bifidobacterium infantis que é portadora do plasmideo pAVOOl-HU-eCD, como se mostra na Fig. 1.

15. Agente terapêutico para utilização no tratamento de tumores sólidos, compreendendo a Bactéria entérica anaeróbica, resistente a 5-fluoruracilo, de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 14.

16. Agente terapêutico para utilização no tratamento de tumores sólidos, de acordo com a reivindicação 15, combinado com 5-fluorcitosina. 5

17. Agente terapêutico para utilização no tratamento de um tumor sólido, de acordo com as reivindicações 15 ou 16, combinado adicionalmente com lactulose. Lisboa, 28 de Novembro de 2013