JP4945440B2 - ５−フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、固形腫瘍治療剤として有用な、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼ（EC3.5.4.1；以下ＣＤ）を発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル（以下５−FU）耐性能を有すＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の作製方法に関する。また、本発明は、５−ＦＵ耐性菌、該耐性菌を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する固形腫瘍治療剤に関する。
ＣＤは、シトシンをウラシルに脱アミノ化する酵素である（例えば、非特許文献１参照）。ＣＤは微生物の代謝に於いて重要な役割を果たす酵素であり、複数の異なる微生物より分離されているが、哺乳動物細胞はこのＣＤを通常は産生しない（例えば、非特許文献２参照）。ＣＤを産生する多くの細菌及び真菌は、５−フルオロシトシン（以下５−ＦＣ）を細胞に対して致死的な極めて毒性の強い代謝物、５−ＦＵに変換する。５−ＦＵは異常ＲＮＡの生成とＤＮＡ合成を阻害するが、５−ＦＣの抗真菌作用はこの５−ＦＵの異常ＲＮＡ生成とＤＮＡ合成阻害作用による。
すなわち、５−ＦＣはシトシンパーミアーゼによって真菌細胞内へ取り込まれ、細胞内で５−ＦＣはＣＤによって直ちに５−ＦＵに変換される。細胞内の５−ＦＵは５−ＦＵＭＰを経て、ＵＭＰ−ピロホスホリラーゼによって５−ＦＵＤＰへ変換される。さらにその先のリン酸化経路は２つに分岐し、一方では５−ＦＵＴＰが、他方では５−ＦｄＵＭＰが生成される。ここで５−ＦＵＴＰは、ＵＴＰの代りにＲＮＡに取り込まれて異常なＲＮＡを生成することによって、正常なタンパク合成を阻害し、結果的に真菌の発育を阻止することになる。また、５−ＦｄＵＭＰは、チミジン酸合成酵素に対する強力な阻害剤として働き、ＤＮＡ合成・核分裂を阻害して殺菌的効果を現わす。
しかし、正常な哺乳動物細胞は有意な量のＣＤを発現しないため、５−ＦＣを有毒な代謝物５−ＦＵに脱アミノすることができず、従って５−ＦＣは強い抗菌活性を示す濃度においても哺乳動物細胞に対しては無毒である。一方、５−ＦＵは哺乳動物細胞に対しても強い細胞毒性作用を有しており、抗ガン剤として広く使用されている。
ＣＤ遺伝子は、大腸菌(Escherichia coli)及び酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)より分離され、クローン化されている。（例えば、非特許文献３，４参照）そして、多くの研究者がこのＣＤ遺伝子の哺乳動物細胞への導入により、イン・ビトロにおけるこれら細胞の５−ＦＣに対する選択的感受性が低下することを示している（例えば、非特許文献３，５参照）。また、レトロウイルスベクターを使った、ＣＤ遺伝子を導入された腫瘍細胞は、イン・ビボにおいて５−ＦＣによる動物の全身治療により排除できることも示されている（例えば、非特許文献６〜８参照）。さらに、複製欠損アデノウイルスベクター（例えば、非特許文献９参照）及びカチオン性リポゾーム（例えば、非特許文献１０参照）もまた、それぞれ、ヒト大腸癌細胞及びマウスの巨大細胞肺癌へのＣＤ遺伝子の導入に利用されている。これら腫瘍細胞内での遺伝子発現は、５−ＦＣに対する感受性を付与する。
カンジダ（Candida）等の真菌の感染症に用いられる５−ＦＣは耐性を得やすいことが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。５−ＦＣに対する耐性は、５−ＦＵへの変換、ＲＮＡへの取り込み等に関与するいずれかの酵素の喪失又は変異によって起こりうるために、理論的には多様な耐性化機序が考えられるが、臨床的に最も頻度が高いのは、カンジダ・アルビカンスにおけるＵＭＰ−ピロホスホリラーゼの喪失、又は活性低下に伴う耐性獲得であり、５−ＦＣ感受性とＵＭＰ−ピロホスホリラーゼ酵素活性が明らかに相関することも知られている。核相が一倍体であるカンジダ・グラブラータでは、シトシンパーミアーゼやＣＤの欠損による耐性株も報告されている。
他方、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)は、グラム陽性の嫌気性細菌で、そのゲノムはＧＣ含量が高い（例えば、非特許文献１２参照）。このビフィドバクテリウム・ロンガムは非病原性であり、ヒトや他の動物の大腸における、正常なミクロフローラの大部分を構成している（例えば、非特許文献１３参照）。免疫反応を高め（例えば、非特許文献１４参照）、癌の発生に対して抑制効果を有し（例えば、非特許文献１５参照）、ウイルス感染から宿主を保護し（例えば、非特許文献１６，１７参照）、抗菌物質を生産する可能性がある（例えば、非特許文献１８参照）等、宿主の健康を促進する特性を有するとされている。ビフィドバクテリウム種には、世界中で広く発酵乳製品の調製に使用されているものもある。
さらに、ビフィドバクテリウムのプラスミドは、プロバイオティクスのベクターや、感染性疾患の経口ワクチンのベクターへの応用を期待されている。例えば、ビフィドバクテリウム由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを利用してビフィドバクテリウムと大腸菌で相互複製されるシャトルベクターを製造する段階と、前記シャトルベクターに目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を結合させて組換えベクターを製造する段階とを有し、前記製造された組換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として前記シャトルベクターの製造に利用されたビフィドバクテリウムを利用することを特徴とする形質転換方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、最近の報告によって、全身投与後、低酸素の固形腫瘍にビフィドバクテリウム・ロンガムが蓄積し（例えば、非特許文献１９，２０参照）、ビフィドバクテリウム・ロンガムｈｕｐプロモーターと融合した大腸菌ｃｏｄＡを保有する組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤが、微生物においてＣＤを発現することが明らかとなった（例えば、特許文献２及び非特許文献２１，２２参照）。これによって、組換えビフィドバクテリウム・ロンガムが、酵素−プロドラッグ療法に有効であることが裏付けられた。前記組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの構築に用いられたｐＢＬＥＳ１００は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＫ５１のｐＴＢ６と大腸菌のｐＢＲ３２２とから構築されたシャトルベクターである。かかるシャトルベクターｐＢＬＥＳ１００は、２．２×１０４形質転換体／μｇＤＮＡの有効率でビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換し、その細胞中で構造的及び形質分離の点で安定していた（例えば、非特許文献２３参照）。ところが、トランスフェクションの際に、未修飾ＤＮＡを有するプラスミドが制限酵素によって微生物中で切断される可能性があることから、外来遺伝子のクローンニングには、更に高い形質転換率が必要とされ、本発明者らは、ｐＢＬＥＳ１００と比較して１００倍を超える高効率で、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換しうるプラスミドｐＡＶ００１及びｐＢＲＡＳＴＡ１０１を提案している（例えば、非特許文献２４参照）。
上述したように、５−ＦＵは哺乳動物細胞に対しても強い細胞毒性作用を有しており、抗ガン剤として広く使用されている。しかし、５−ＦＵをそのまま患者に投与する際には、患者への副作用を避けるために、例えば血中濃度で１μｇ／ｍｌ程度以下となるように投与するか、又は血中濃度が１μｇ／ｍｌを超えるように投与する場合であっても、血中濃度が１μｇ／ｍｌを超えている時間はせいぜい１時間程度とする必要があった。このような事情から、従来の方法では、５−ＦＵの抗ガン作用が十分に発揮されているとは言い難かった。このような状況下において、高濃度の５−ＦＵで腫瘍を処理しつつ、５−ＦＵの副作用の問題を克服する手段が強く求められていた。
ＣＤ／５−ＦＣを用いたＥｎｚｙｍｅ／ｐｒｏ−ｄｒｕｇ療法は動物実験、臨床試験等に広く用いられている治療法である。かかるＥｎｚｙｍｅ／ｐｒｏ−ｄｒｕｇ療法におけるＣＤ遺伝子導入細胞（菌）の５−ＦＵ耐性が向上すると、５−ＦＵにより死滅することがないため、ＣＤ遺伝子導入細胞（菌）の生存が向上し、ＣＤ／５−ＦＣを用いたＥｎｚｙｍｅ／ｐｒｏ−ｄｒｕｇ療法の治療効果が有意に向上することが期待できる。本発明の課題は、このような、Ｅｎｚｙｍｅ／ｐｒｏ−ｄｒｕｇ療法の治療剤として有用な、ＣＤを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−FU耐性能を有するＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌を作製する方法を提供することにある。また、本発明の課題は、高濃度の５−ＦＵで腫瘍を処理しつつ、５−ＦＵの副作用の問題を克服することを可能とする５−ＦＵ耐性菌、該耐性菌を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する固形腫瘍治療剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討し、ＣＤを発現していない菌にＣＤ遺伝子を導入して形質転換したＣＤ発現菌を、５−ＦＣの存在下で継代・馴化培養することにより、ＣＤ活性を保持したまま５−ＦＵ耐性菌を作製しうることを見い出した。すなわち、ＣＤ発現菌を、培養培地中に所定量の５−ＦＣを加えて培養すると、ＣＤ発現菌の増殖と共に発現したＣＤの酵素活性により徐々に５−ＦＣが５−ＦＵへと変換され、所定量の５−ＦＣを加えたにもかかわらず、初めは低濃度５−ＦＵで作用することで、ＣＤ発現菌の死滅を防ぎ、徐々に濃度が上がることで、耐性能を獲得したＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌のみを選択的に培養することができることを見い出した。また、本発明者らは、ＣＤを発現していない細菌を５−ＦＵの存在下で継代・馴化培養することにより５−ＦＵ耐性菌を作製した後、この５−ＦＵ耐性菌に、ＣＤ遺伝子を導入して形質転換することによっても、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌を作製できることを見出した。さらに、本発明者らは、このような方法で得られる５−ＦＵ耐性菌を用いることによって、高濃度の５−ＦＵで腫瘍を処理しつつ、５−ＦＵの副作用の問題を克服することを可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、［１］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌の作製方法であって、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌を、５−フルオロシトシンの存在下で継代・馴化培養することを特徴とする耐性菌の作製方法や、［２］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現しない菌に、シトシン・デミナーゼ遺伝子を導入して形質転換したシトシン・デアミナーゼ発現菌であることを特徴とする［１］に記載の耐性菌の作製方法や、［３］２〜５０
００μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを添加した培地で継代・馴化培養することを特徴とする［１］又は［２］に記載の耐性菌の作製方法や、［４］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現するバクテリアであることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の耐性菌の作製方法や、［５］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現するバクテリアが、シトシン・デアミナーゼを発現する腸内細菌であることを特徴とする［４］に記載の耐性菌の作製方法や、［６］シトシン・デアミナーゼを発現する腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする、［５］に記載の耐性菌の作製方法や、［７］シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする［６］に記載の耐性菌の作製方法や、［８］シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする［７］に記載の耐性菌の作製方法や、［９］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有することを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌の作製方法であって、（１）嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現しない菌を５−フルオロウラシルの存在下で継代・馴化培養して、５−フルオロウラシル耐性菌を作製する工程と、（２）該５−フルオロウラシル耐性菌に、シトシン・デアミナーゼ遺伝子を導入して形質転換する工程を有することを特徴とする耐性菌の作製方法や、［１０］１〜１００μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを添加した培地で継代・馴化培養することを特徴とする［９］に記載の耐性菌の作製方法や、［１１］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していない菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していないバクテリアであることを特徴とする［９］又は［１０］に記載の耐性菌の作製方法や、［１２］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していないバクテリアが、シトシン・デアミナーゼを発現していない腸内細菌であることを特徴とする［１１］に記載の耐性菌の作製方法や、［１３］シトシン・デアミナーゼを発現していない腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする［１２］に記載の耐性菌の作製方法や、［１４］シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする［１３］に記載の耐性菌の作製方法や、［１５］シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする［１４］に記載の耐性菌の作製方法や、［１６］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌であって、［１］〜［１５］のいずれかに記載の作製方法で作製されることを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［１７］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも２μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシン又は１μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを添加した培地で生育できることを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［１８］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性バクテリアであることを特徴とする［１６］又は［１７］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［１９］ シトシン・デアミナーゼ発現・
５−フルオロウラシル耐性バクテリアが、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウ
ラシル耐性腸内細菌であることを特徴とする［１８］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２０］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする［１９］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２１］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする［２０］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２２］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムである［２０］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２３］ シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・
ロンガムが、プラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株であることを特徴とする［２２］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２４］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株であることを特徴とする［２２］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２５］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２６］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２７］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２８］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２９］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［３０］［１６］〜［２９］のいずれかに記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌を含有することを特徴とする医薬組成物や、［３１］５−フルオロシトシンと組み合わせてなることを特徴とする［３０］に記載の医薬組成物や、［３２］さらに、ラクツロースと組み合わせてなることを特徴とする［３０］又は［３１］に記載の医薬組成物や、［３３］５−フルオロシトシンから有効治療量の５−フルオロウラシルに変換できる量のシトシン・デアミナーゼを発現するのに十分な量のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌と、有効治療量の５−フルオロウラシルに変換できる量の５−フルオロシトシンとを組み合わせてなる固形腫瘍治療剤であって、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が［１６
］〜［２９］のいずれかに記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌であることを特徴とする固形腫瘍治療剤や、［３４］さらに、ラクツロースを組み合わせてなることを特徴とする［３３］に記載の固形腫瘍治療剤に関する。
００μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを添加した培地で継代・馴化培養することを特徴とする［１］又は［２］に記載の耐性菌の作製方法や、［４］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現するバクテリアであることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の耐性菌の作製方法や、［５］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現するバクテリアが、シトシン・デアミナーゼを発現する腸内細菌であることを特徴とする［４］に記載の耐性菌の作製方法や、［６］シトシン・デアミナーゼを発現する腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする、［５］に記載の耐性菌の作製方法や、［７］シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする［６］に記載の耐性菌の作製方法や、［８］シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする［７］に記載の耐性菌の作製方法や、［９］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有することを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌の作製方法であって、（１）嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現しない菌を５−フルオロウラシルの存在下で継代・馴化培養して、５−フルオロウラシル耐性菌を作製する工程と、（２）該５−フルオロウラシル耐性菌に、シトシン・デアミナーゼ遺伝子を導入して形質転換する工程を有することを特徴とする耐性菌の作製方法や、［１０］１〜１００μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを添加した培地で継代・馴化培養することを特徴とする［９］に記載の耐性菌の作製方法や、［１１］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していない菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していないバクテリアであることを特徴とする［９］又は［１０］に記載の耐性菌の作製方法や、［１２］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していないバクテリアが、シトシン・デアミナーゼを発現していない腸内細菌であることを特徴とする［１１］に記載の耐性菌の作製方法や、［１３］シトシン・デアミナーゼを発現していない腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする［１２］に記載の耐性菌の作製方法や、［１４］シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする［１３］に記載の耐性菌の作製方法や、［１５］シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする［１４］に記載の耐性菌の作製方法や、［１６］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌であって、［１］〜［１５］のいずれかに記載の作製方法で作製されることを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［１７］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも２μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシン又は１μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを添加した培地で生育できることを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［１８］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性バクテリアであることを特徴とする［１６］又は［１７］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［１９］ シトシン・デアミナーゼ発現・
５−フルオロウラシル耐性バクテリアが、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウ
ラシル耐性腸内細菌であることを特徴とする［１８］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２０］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする［１９］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２１］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする［２０］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２２］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムである［２０］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２３］ シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・
ロンガムが、プラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株であることを特徴とする［２２］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２４］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株であることを特徴とする［２２］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２５］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２６］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２７］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２８］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［２９］シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株であることを特徴とする［２１］に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌や、［３０］［１６］〜［２９］のいずれかに記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌を含有することを特徴とする医薬組成物や、［３１］５−フルオロシトシンと組み合わせてなることを特徴とする［３０］に記載の医薬組成物や、［３２］さらに、ラクツロースと組み合わせてなることを特徴とする［３０］又は［３１］に記載の医薬組成物や、［３３］５−フルオロシトシンから有効治療量の５−フルオロウラシルに変換できる量のシトシン・デアミナーゼを発現するのに十分な量のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌と、有効治療量の５−フルオロウラシルに変換できる量の５−フルオロシトシンとを組み合わせてなる固形腫瘍治療剤であって、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が［１６
］〜［２９］のいずれかに記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌であることを特徴とする固形腫瘍治療剤や、［３４］さらに、ラクツロースを組み合わせてなることを特徴とする［３３］に記載の固形腫瘍治療剤に関する。
本発明における５−ＦＵ耐性菌の作製方法としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるＣＤ発現菌を、５−ＦＣの存在下で継代・馴化培養する方法Ａ、又は、（１）嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、ＣＤを発現しない菌を５−ＦＵの存在下で継代・馴化培養して、５−ＦＵ耐性菌を作製する工程と、（２）該５−ＦＵ耐性菌に、ＣＤ遺伝子を導入して形質転換する工程とを有する方法Ｂであれば特に制限されない。
上記方法Ａにおける嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるＣＤ発現菌としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、ＣＤを発現している菌である限り特に制限はされず、自然界から単離した菌であってもよいし、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、ＣＤを発現していない菌にＣＤ遺伝子を導入して形質転換した組み換え菌であってもよい。
また、上記方法Ｂで用いられる、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、ＣＤを発現していない菌としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、ＣＤを発現していない菌であれば特に制限されない。
本発明の作製方法で用いられる、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できる菌としては、バクテリア（細菌）や真菌を例示することができ、該バクテリアとして、ビフィドバクテリウム属細菌、クロストリディウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ペプトコッカス属細菌、エンテロコッカス属細菌、バクテロイデス属細菌、ユーバクテリウム属細菌等の腸内細菌を具体的に例示することができるが、中でも、ビフィドバクテリウム属細菌が好ましい。
上記ビフィドバクテリウム属細菌として、具体的にはビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス（B. lactentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B．pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（B. thermophirum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B．infantis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）などを挙げることができる。中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知られているビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティスを宿主菌として用いることが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムを用いることがより好ましい。これらの菌は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７を用いることができる。
ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株を例示することができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株を好ましく例示することができる。
また、ビフィドバクテリウム・ブレーベの株についても特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（JCM1192）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を例示することができる。
また、ビフィドバクテリウム・インファンティスの株についても特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（JCM1222）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を例示することができる。
また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株についても特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（JCM1220）を例示することができる。
方法Ａにおける５−ＦＣの存在下での継代・馴化培養は、細菌、真菌のそれぞれ生育や増殖に適した培養培地（培養液あるいは寒天プレート）上に、例えば、２〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜２０００μｇ／ｍｌの範囲内の５−ＦＣを加え、３７℃で嫌気培養することにより行うことができる。
５−ＦＣを加えた培養培地で培養することにより、菌の増殖と共に発現したＣＤの酵素で５−ＦＣが徐々に５−ＦＵへと変換され、始めは低濃度で作用することで、培養菌の死滅を防ぎ、徐々に濃度が上がることで、耐性能を獲得した培養菌のみを選択的に培養することができる。このようにして、本発明の５−ＦＵ耐性菌を再現性よく採取することができる。
上記方法Ｂにおける５−ＦＵの存在下での継代・馴化培養としては、細菌、真菌のそれぞれ生育や増殖に適した培養培地（培養液あるいは寒天プレート）上に、例えば、１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜１００μｇ／ｍｌの範囲内の５−ＦＵを加えた３７℃で嫌気培養することができる。このようにして、５−ＦＵ耐性菌を再現性よく採取することができる。
ＣＤ遺伝子を導入して形質転換したＣＤ発現菌や、嫌気的環境下での生育能を付与する遺伝子を導入して形質転換した菌を調製するために用いられるＣＤ発現ベクターや形質転換菌の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル（講談社）、高木康敬編遺伝子操作実験法（講談社）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular C1oning，2nd ed．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1989）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol．），194（1991）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法（羊土社、1994）等に記載された方法に従って行うことができる。また、発現ベクターは、宿主菌に適したものを用いることが好ましい。
ＣＤをコードするＤＮＡは、例えば、大腸菌由来のＣＤをコードするDNAを含有するプラスミドpAdexｌCSCD（理化学研究所 ジーンバンク RDB No．1591）、または同じく大腸菌由来のＣＤをコードするDNAを含有するプラスミドpMK116から単離されるものを用いることができる（D．A．Mead et al.，Protein Engineering 1：67−74（1986））。
特に、ビフィドバクテリウム属細菌用のＣＤ発現ベクターとしては、ビフィドバクテリウム・ロンガムｈｕｐプロモーターの下流に挿入した大腸菌ｃｏｄＡを保有する組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献１及び非特許文献２１参照）や、このｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを改良した、ビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・ブレーベを形質転換しうるｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ、又はこれらのプラスミドの変異体を特に好適に例示することができる。
プラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの変異体とは、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤに由来するプラスミド核酸配列の変異体であって、本発明においてｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤと同様に用いることのできるプラスミドを意味する。また、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの変異体とは、同様に、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤに由来するプラスミド核酸配列の変異体であって、本発明においてｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと同様に用いることのできるプラスミドを意味する。
本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌は、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、ＣＤを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−ＦＵ耐性能を有している限り特に制限はされない。５−ＦＵの抗腫瘍活性の有効濃度は、対象となる腫瘍や患者等によって左右されるため一概にはいえないが、例えば少なくとも０．０５〜０．１μｇ／ｍｌという濃度を例示することができる。
なお、市販されている５−ＦＵ製剤（注射投与）の説明書には、５−ＦＵ製剤を進行胃がん患者に５−ＦＵの血中濃度が約０．６μｇ／ｍｌとなるように持続静注したことが記載されている。
本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌のより具体的な５−ＦＵ耐性能としては、少なくとも１〜２０００μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜２０００μｇ／ｍｌの範囲内の５−ＦＵを含む培養培地（培養液あるいは寒天プレート）で、３７℃で嫌気培養した場合に生育できることをいう。
また、本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の５−ＦＵ耐性能を、５−ＦＣの濃度で具体的に表すと、２〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは３〜５０００μｇ／ｍｌの範囲内の５−ＦＣを含む培養培地（培養液あるいは寒天プレート）で、３７℃で嫌気培養した場合に生育できることをいう。
本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の５−ＦＵ耐性能は、前述の５−ＦＵの数値範囲の範囲内のいずれかの数値の５−ＦＵを含む培養培地（培養液あるいは寒天プレート）で、３７℃で嫌気培養した場合に生育できるか、又は、前述の５−ＦＣの数値範囲の範囲内のいずれかの数値の５−ＦＣを含む培養培地（培養液あるいは寒天プレート）で、３７℃で嫌気培養した場合に生育できればよいが、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の耐性能としては、少なくとも１μｇ／ｍｌ以上の５−フルオロウラシルを添加した培地で生育できる耐性能、あるいは、少なくとも２μｇ／ｍｌ以上の５−フルオロシトシンを添加した培地で生育できる耐性能であることが望ましい。
本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の製造方法は特に制限されず、自然界から単離してもよいし、前述の本発明の耐性菌の作製方法等を用いてもよい。すなわち、本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌は、自然界から単離した菌であってもよいし、前述の本発明の耐性菌の作製方法等を用いた組み換え菌であってもよい。
本発明におけるＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、ＣＤを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−ＦＵ耐性能を有しているというこれらの性質を有しているバクテリア又は真菌である限り特に制限はされないが、該性質を有しているバクテリアであることが好ましく、該性質を有している腸内細菌であることがより好ましい。腸内細菌としては、ビフィドバクテリウム属細菌、クロストリディウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ペプトコッカス属細菌、エンテロコッカス属細菌、バクテロイデス属細菌、ユーバクテリウム属細菌等を好ましく例示することができ、中でもビフィドバクテリウム属細菌をより好ましく例示することができる。
上記ビフィドバクテリウム属細菌として、具体的にはビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス（B. lactentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B．pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（B. thermophirum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B．infantis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）などを挙げることができる。中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知られているビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティスを宿主菌として用いることが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムを用いることがより好ましい。これらの菌は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７を用いることができる。
ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株を例示することができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株を好ましく例示することができる。
また、ビフィドバクテリウム・ブレーベの株についても特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（JCM1192）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を例示することができる。
また、ビフィドバクテリウム・インファンティスの株についても特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（JCM1222）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を例示することができる。
また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株についても特に制限されないが、例えばビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（JCM1220）を例示することができる。
該性質を有しているビフィドバクテリウム属細菌としてより具体的には、プラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株（プラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体で形質転換されたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株）、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ又はそのプラスミド変異体を保持する、ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスI−１０−５株等を好ましく例示することができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌を含有している限り特に制限はされない。また、本発明の医薬組成物は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の１種又は２種以上を含有していてもよい。
また、本発明の医薬組成物のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の投与量は、５−ＦＣから有効治療量の５−ＦＵに変換できる量のＣＤを発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、できる限り少ない方が好ましい。
本発明の医薬組成物は、本発明の効果を妨げない限り、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌によって有効量の５−ＦＵに変換できる量の５−ＦＣと組み合わせて使用され、該５−ＦＣは本発明の医薬組成物に含有させてもよいが、５−ＦＣを含有する医薬組成物と組み合わせて用いることが好ましい。さらに本発明の医薬組成物は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の増殖を促進することができる糖類と組み合わせてもよく、このような糖類として例えばラクツロースを例示することができる。
本発明における「ＸとＹと組み合わせてなる」には、ＸとＹを別の形態としたもの、ＸとＹを同一の形態（例えばＸとＹを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。また、ＸとＹを別の形態としたものの場合、Ｘ、Ｙのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。
本発明の医薬組成物を患者に投与すると、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌は腫瘍内で増殖する。該耐性菌が腫瘍内に存在している間に、患者に５−ＦＣを投与すると、腫瘍内におけるＣＤの働きで５−ＦＣが５−ＦＵに変換されて、腫瘍細胞を死滅させることができる。本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌は、腫瘍細胞を死滅させることができる５−ＦＵ濃度においても生存し、ＣＤによる酵素作用を持続することができるので、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌を有効成分とする優れた抗腫瘍剤を得ることができる。また、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌が増殖できる、嫌気的環境下にある腫瘍以外の部分では、該ＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌が生育できないため、５−ＦＣは５−ＦＵに変換されず、５−ＦＵをそのまま投与した場合に比べて、５−ＦＵによる全身性の副作用を格段に低く抑制することができる。さらに、本発明の固形腫瘍治療剤の抗腫瘍効果が腫瘍への高い特異性を有していることから、５−ＦＵをそのまま投与する場合に比べて、格段に高い５−ＦＵ濃度を腫瘍内において実現することが可能となり、その結果、極めて優れた抗腫瘍効果が得られる。
本発明の医薬組成物の剤型としては、例えば、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液若しくは補液または医薬添加物を加えてアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプルまたはバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥またはＬ乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥またはＬ乾燥した後これをアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。本発明の医薬組成物の投与方法としては、非経口投与が好ましく、例えば皮下注射、静脈注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができるが、静脈注射が最も好ましい。
なお、本発明の医薬組成物は、５−ＦＣ組み合わせて用いられる。本発明の医薬組成物の投与方法と、５−ＦＣの投与方法は同じであっても異なっていてもよく、また、投与も同時であってもよく隔時であってもよいが、５−ＦＣの投与は、本発明の医薬組成物の投与後、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌が腫瘍細胞で十分生育できる時間をおいた後に投与する方が好ましい。
本発明の医薬組成物と組み合わせて用いられる５−ＦＣの投与量は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌によって、５−ＦＣから有効治療量の５−ＦＵに変換できるのに十分な量である限り特に制限はされないが、できる限り少ない方が好ましく、例えば、５〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲内から適宜選択することができる。
また、本発明の医薬組成物は、本発明のＣＤ発現・５−ＦＵ耐性菌の増殖を促進する糖類を組み合わせて用いることができ、このような糖類として、例えばラクツロースを挙げることができる。このような糖類は、本発明の医薬組成物に、含有させて投与してもよく、別の医薬組成物として、同時にあるいは隔時に投与してもよい。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［ＣＤ発現ビフィドバクテリウム・ロンガムの作製］
特願２００４−３３９６７７に記載されている方法により、ＣＤ発現ビフィドバクテリウム・ロンガムを作製した。
１．シャトルベクターｐＡＶ００１の構築
（プラスミドの構築）
ビフィドバクテリウム・ロンガムと大腸菌のシャトルベクターｐＢＬＥＳ１００（特許文献２及び非特許文献２３参照）よりエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼ（ＡＡＤカセット）を含む配列をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ｐＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを作製した。なお、フォワードプライマーにＳｃａＩ、リバースプライマーにＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。
特願２００４−３３９６７７に記載されている方法により、ＣＤ発現ビフィドバクテリウム・ロンガムを作製した。
１．シャトルベクターｐＡＶ００１の構築
（プラスミドの構築）
ビフィドバクテリウム・ロンガムと大腸菌のシャトルベクターｐＢＬＥＳ１００（特許文献２及び非特許文献２３参照）よりエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼ（ＡＡＤカセット）を含む配列をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ｐＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを作製した。なお、フォワードプライマーにＳｃａＩ、リバースプライマーにＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。
図１に示すように、Invitrogen社より購入したクローニングベクターｐＧＦＰｕｖ（DEFINITION：Cloning vector pGFPuv. ACCESSION：U62636 VERSION：U62636.1 GI：1490528） はＧＦＰｕｖ遺伝子とその両端のマルチクローニングサイト（Multi-Cloning Site、MCS）、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌プラスミド複製起点より構成されている。
このｐＧＦＰｕｖのアンピシリン耐性遺伝子部位を制限酵素Ｅａｍ１１０５ＩとＳｃａＩを用いて切断し、取り除いた長断片を作製した。同様に制限酵素Ｅａｍ１１０５ＩとＳｃａＩを用いて、ｐＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを切断したＡＡＤカセット含む断片（約１１００ｂｐ）を作製した。上記２つの断片をＴ４ＤＮＡ リガーゼを用いて結合したｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲを作製した。なお、作製したプラスミドｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲのスペクチノマイシン耐性形質付与を、また同時にアンピシリン耐性形質の欠失をそれぞれ大腸菌にて確認した。
ｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲを制限酵素ＳａｌＩ（ＧＦＰｕｖ遺伝子上流のマルチクローニングサイト内に存在）とＳｐｅＩ（ＧＦＰｕｖ遺伝子下流のマルチクローニングサイト内に存在）で消化し、ＧＦＰｕｖ遺伝子を削除したプラスミドｐＡＶＮを作製した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来プラスミドｐＴＢ６の全塩基配列情報より、ＲｅｐＢ，ＳＤＯ，ＤＤＯ，ＡＴ−rich repeats，DnaA-binding motifsを含む約１９００ｂｐの配列をビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド複製ユニットとして同定した。ｐＴＢ６よりビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド複製ユニットを含む約１９００ｂｐをＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクターへサブクローニングしたｐＣＲＴＯＰＯ−ＡｐａＩ−１９００−ＳｃａＩを作製した。なお、フォアードプライマーにＡｐａＩ、リバースプライマーにＳｃａＩ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。
ｐＡＶＮを制限酵素ＡｐａＩとＳｃａＩで消化した長断片（約２４００ｂｐ）と同様にｐＣＲＴＯＰＯ−ＡｐａＩ−１９００−ＳｃａＩを制限酵素ＡｐａＩとＳｃａＩで消化した短断片（約１９００ｂｐ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した、ビフィドバクテリウム・ロンガム−大腸菌シャトルベクターｐＡＶ００１（約４３００ｂｐ）を作製した。
２．ＣＤ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ
（発現ベクターの構築）
次に、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断し、ＨＵ遺伝子プロモーター、大腸菌由来のＣＤ遺伝子とＨＵ遺伝子ターミネーター含む約２９００ｂｐを抜き出した。同様にシャトルベクターｐＡＶ００１をマルチクローニングサイト内にある制限酵素切断部位でＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断した長断片に、上記の約２９００ｂｐ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（約７１００ｂｐ）を作製した。
（発現ベクターの構築）
次に、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断し、ＨＵ遺伝子プロモーター、大腸菌由来のＣＤ遺伝子とＨＵ遺伝子ターミネーター含む約２９００ｂｐを抜き出した。同様にシャトルベクターｐＡＶ００１をマルチクローニングサイト内にある制限酵素切断部位でＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断した長断片に、上記の約２９００ｂｐ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（約７１００ｂｐ）を作製した。
３．ＣＤ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのビフィドバクテリウム属への導入
野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをＭＲＳ培地37℃嫌気条件下で培養した培養液から遠心分離により菌体を分離し、適当な緩衝液に懸濁した菌懸濁液を調製した。次に、非特許文献２３に記されているエレクトロポレーション法を用いて、シトシン・デアミナーゼ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを上記の菌懸濁液に導入した。導入された組換えビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ）は抗生剤スペクチノマイシン含有寒天培地上でのコロニー形成を元に選別した。
野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをＭＲＳ培地37℃嫌気条件下で培養した培養液から遠心分離により菌体を分離し、適当な緩衝液に懸濁した菌懸濁液を調製した。次に、非特許文献２３に記されているエレクトロポレーション法を用いて、シトシン・デアミナーゼ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを上記の菌懸濁液に導入した。導入された組換えビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ）は抗生剤スペクチノマイシン含有寒天培地上でのコロニー形成を元に選別した。
（組換えビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるシトシン・デアミナーゼの発現）
ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤまたは野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれ抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（１×１０９ＣＦＵ）を分離し、超音波破砕後、それぞれ菌体内タンパクを抽出した。上記抽出したタンパクをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ウエスタン分析法にてシトシン・デアミナーゼタンパクの発現を確認した。なお、一次抗体としてウサギ抗シトシン・デアミナーゼモノクローナル抗体（Sawaday Technology）、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗ウサギイムノグロブリンＧ複合体（Santa Cruz Biotechnology, Inc）をそれぞれ用いた。シグナルの感光法としてＥＣＬ法により発光させたシグナルを、冷却CCDカメラFluo-S-MAX（BIO-RAD）を用いて検出した。その結果、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいてはシグナルが検出されずシトシン・デアミナーゼが発現していなかったが、ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおいてはシグナルが検出され、シトシン・デアミナーゼタンパクが発現していることを確認した（図２参照）。
ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤまたは野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれ抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（１×１０９ＣＦＵ）を分離し、超音波破砕後、それぞれ菌体内タンパクを抽出した。上記抽出したタンパクをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ウエスタン分析法にてシトシン・デアミナーゼタンパクの発現を確認した。なお、一次抗体としてウサギ抗シトシン・デアミナーゼモノクローナル抗体（Sawaday Technology）、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗ウサギイムノグロブリンＧ複合体（Santa Cruz Biotechnology, Inc）をそれぞれ用いた。シグナルの感光法としてＥＣＬ法により発光させたシグナルを、冷却CCDカメラFluo-S-MAX（BIO-RAD）を用いて検出した。その結果、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいてはシグナルが検出されずシトシン・デアミナーゼが発現していなかったが、ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおいてはシグナルが検出され、シトシン・デアミナーゼタンパクが発現していることを確認した（図２参照）。
（ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおけるシトシン・デアミナーゼ酵素活性；５−ＦＣ→５−ＦＵの変換活性の測定）
ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤまたは野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれ抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（２×１０９ＣＦＵ）を分離し、４．５ｍＬのＭＲＳ培地に再度懸濁した。次に最終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるよう０．５ｍＬの５−ＦＣ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し３７℃嫌気条件下で培養した。０、４、８、１８、２４時間ごとの培養液から、遠心分離により菌体を取り除いた上清をそれぞれ回収し、ガスクロ分析（５−ＦＵ GC-MS methods, BＭＬ）により変換された５−ＦＵ濃度を測定した。経時菌数変化を図３に、５−ＦＵ濃度を図４にそれぞれ示す。分析の結果、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいては極少量の５−ＦＵしか検出されなかったが、ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおいては４時間後において３９．２ μg ／ ｍＬ、２４時間後においては１０２．１ μg ／ ｍＬの５−ＦＵが検出された。
ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤまたは野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれ抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（２×１０９ＣＦＵ）を分離し、４．５ｍＬのＭＲＳ培地に再度懸濁した。次に最終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるよう０．５ｍＬの５−ＦＣ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し３７℃嫌気条件下で培養した。０、４、８、１８、２４時間ごとの培養液から、遠心分離により菌体を取り除いた上清をそれぞれ回収し、ガスクロ分析（５−ＦＵ GC-MS methods, BＭＬ）により変換された５−ＦＵ濃度を測定した。経時菌数変化を図３に、５−ＦＵ濃度を図４にそれぞれ示す。分析の結果、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいては極少量の５−ＦＵしか検出されなかったが、ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおいては４時間後において３９．２ μg ／ ｍＬ、２４時間後においては１０２．１ μg ／ ｍＬの５−ＦＵが検出された。
［ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの５−ＦＵ耐性菌］
参考例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを、５−ＦＣを５０μｇ／ｍＬ含む５ｍＬの抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し、３７℃嫌気培養で７２時間培養した。次に、培養後の培地を１ｍＬ取り出し、同じく５−ＦＣを５０μｇ／ｍＬ含む９ｍＬの抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し、同様の培養条件で２４時間培養した。この植菌作業を３回繰り返し行うことにより、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを作製した。次に、５−ＦＵを２０μｇ／ｍＬ含む抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し、同様の培養条件で２４時間培養し、作製した５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの５−ＦＵ耐性生育を確認した。その後、菌はグリセロールと懸濁してグリセロールストックとして−８０℃で保存した。この保存した菌体サンプルと野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、５−ＦＵを２５０μｇ／ｍＬ含む抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し生育を比較したところ、野生型は生育しなかったが、保存したサンプルは翌日に菌が増殖し、５−ＦＵに対する耐性を保持していた。培養後の菌液を平板測定法により生育菌数を測定したところ、野生型は検出限界以下（１０３ＣＦＵ／ｍＬ以下）であったが、保存したサンプルの菌液は２〜３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ菌が生育していた。
参考例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを、５−ＦＣを５０μｇ／ｍＬ含む５ｍＬの抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し、３７℃嫌気培養で７２時間培養した。次に、培養後の培地を１ｍＬ取り出し、同じく５−ＦＣを５０μｇ／ｍＬ含む９ｍＬの抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し、同様の培養条件で２４時間培養した。この植菌作業を３回繰り返し行うことにより、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを作製した。次に、５−ＦＵを２０μｇ／ｍＬ含む抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し、同様の培養条件で２４時間培養し、作製した５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの５−ＦＵ耐性生育を確認した。その後、菌はグリセロールと懸濁してグリセロールストックとして−８０℃で保存した。この保存した菌体サンプルと野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、５−ＦＵを２５０μｇ／ｍＬ含む抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地に植菌し生育を比較したところ、野生型は生育しなかったが、保存したサンプルは翌日に菌が増殖し、５−ＦＵに対する耐性を保持していた。培養後の菌液を平板測定法により生育菌数を測定したところ、野生型は検出限界以下（１０３ＣＦＵ／ｍＬ以下）であったが、保存したサンプルの菌液は２〜３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ菌が生育していた。
［５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムの５−ＦＵ耐性濃度測定］
実施例１で得られた５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤまたは野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。これらの培養液を嫌気性希釈液で希釈した後、それぞれ５−ＦＵが０，２５，５０，１００，２５０，５００，１０００，２０００μｇ／ｍＬ含まれるＢＬ寒天培地上に塗布し、３７℃で２〜３日間嫌気培養した後の生育菌数を測定した。５−ＦＵが含まれていないＢＬ寒天培地を用いたものは５連で、それ以外の５−ＦＵ含有ＢＬ寒天培地を用いたものは３連で試験を行った。その結果を表１（５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ）及び表２（野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム）に示す。表１の結果から分かるように、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの５−ＦＵ耐性濃度は２０００μｇ／ｍＬ以上であった。一方で野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムは少なくとも５−ＦＵ含量２５μｇ／ｍＬ以上では生育しなかった（表２）。
実施例１で得られた５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤまたは野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。これらの培養液を嫌気性希釈液で希釈した後、それぞれ５−ＦＵが０，２５，５０，１００，２５０，５００，１０００，２０００μｇ／ｍＬ含まれるＢＬ寒天培地上に塗布し、３７℃で２〜３日間嫌気培養した後の生育菌数を測定した。５−ＦＵが含まれていないＢＬ寒天培地を用いたものは５連で、それ以外の５−ＦＵ含有ＢＬ寒天培地を用いたものは３連で試験を行った。その結果を表１（５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ）及び表２（野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム）に示す。表１の結果から分かるように、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの５−ＦＵ耐性濃度は２０００μｇ／ｍＬ以上であった。一方で野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムは少なくとも５−ＦＵ含量２５μｇ／ｍＬ以上では生育しなかった（表２）。
［５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムの５−ＦＵ耐性形質の維持］
実施例１で得られた５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを、抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地を用いて３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。該培養液５μＬを抗生剤スペクチノマイシン含まない５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌して３７℃嫌気条件下で２４時間培養を行い、培養後の菌液を同様にして継代培養し、連続的に３０日間継代培養を行った。連続継代培養３０日後の菌液を嫌気性希釈液で希釈した後、５−ＦＵが２５０μｇ／ｍＬ含まれるＢＬ寒天培地と５−ＦＵを含まないＢＬ寒天培地上にそれぞれ塗布し、３７℃で２〜３嫌気日間培養後の生育菌数を測定した。実験は５連で行った。その結果を表３に示す。表３の結果から分かるように、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムの５−ＦＵ耐性形質は、少なくとも連続継代培養３０日間行った後も維持されていた。
実施例１で得られた５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを、抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地を用いて３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。該培養液５μＬを抗生剤スペクチノマイシン含まない５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌して３７℃嫌気条件下で２４時間培養を行い、培養後の菌液を同様にして継代培養し、連続的に３０日間継代培養を行った。連続継代培養３０日後の菌液を嫌気性希釈液で希釈した後、５−ＦＵが２５０μｇ／ｍＬ含まれるＢＬ寒天培地と５−ＦＵを含まないＢＬ寒天培地上にそれぞれ塗布し、３７℃で２〜３嫌気日間培養後の生育菌数を測定した。実験は５連で行った。その結果を表３に示す。表３の結果から分かるように、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムの５−ＦＵ耐性形質は、少なくとも連続継代培養３０日間行った後も維持されていた。
［５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムと５−ＦＵ非耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムの５―ＦＣ添加液体培地での培養］
参考例１のビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（５−ＦＵ非耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム）と実施例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム）をそれぞれ抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。その後、それぞれの培養液５０μＬを５，２５，５０，１００，２５０，５００μｇ／ｍＬの５-ＦＣを含むＭＲＳ培地に植菌し３７℃嫌気条件下で２４時間培養し、培養後の菌液の濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を測定し、各菌の増殖の有無を調べた（表４）。５−ＦＵ非耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムは５−ＦＣ濃度５０μｇ／ｍＬ以上の濃度の培地では著しく生育が阻害されたが、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムは全ての濃度で生育した。
参考例１のビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（５−ＦＵ非耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム）と実施例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム）をそれぞれ抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。その後、それぞれの培養液５０μＬを５，２５，５０，１００，２５０，５００μｇ／ｍＬの５-ＦＣを含むＭＲＳ培地に植菌し３７℃嫌気条件下で２４時間培養し、培養後の菌液の濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を測定し、各菌の増殖の有無を調べた（表４）。５−ＦＵ非耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムは５−ＦＣ濃度５０μｇ／ｍＬ以上の濃度の培地では著しく生育が阻害されたが、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムは全ての濃度で生育した。
［５−ＦＵ添加培地を用いて作製したビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの５−ＦＵ耐性菌］
ビフィドバクテリウム・ロンガムを、５−ＦＵを１，５，１０，５０，１００，５００μｇ／ｍＬ含む５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌し、３７℃嫌気培養で１〜５日間培養し、それぞれの濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を測定し、生育の有無を調べた（表５）。その結果、５−ＦＵを５００μｇ／ｍＬ含む培地では５日後も全く生育せず、耐性株が作製できなかった。次に、増殖が確認された培養後の培地を１ｍＬ取り出し、同じ濃度の５−ＦＵを含む９ｍＬのＭＲＳ培地にそれぞれ植菌し、同様の培養条件で２４時間培養した。この植菌作業を３回繰り返し行うことにより、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれの５−ＦＵ濃度で作製した。次に、ＭＲＳ培地にそれぞれの５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムを植菌し、培養後の菌液をそれぞれ２５０μｇ／ｍＬの５−ＦＵを含むＭＲＳ培地に植菌し、２４時間後の増殖の有無を濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を用いて測定した（表６）。その結果、５−ＦＵを１〜１００μｇ／ｍＬ含む培地で作製した５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムは、実施例１で得られた５−ＦＵ耐性株と同様に５−ＦＵに耐性であった。
ビフィドバクテリウム・ロンガムを、５−ＦＵを１，５，１０，５０，１００，５００μｇ／ｍＬ含む５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌し、３７℃嫌気培養で１〜５日間培養し、それぞれの濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を測定し、生育の有無を調べた（表５）。その結果、５−ＦＵを５００μｇ／ｍＬ含む培地では５日後も全く生育せず、耐性株が作製できなかった。次に、増殖が確認された培養後の培地を１ｍＬ取り出し、同じ濃度の５−ＦＵを含む９ｍＬのＭＲＳ培地にそれぞれ植菌し、同様の培養条件で２４時間培養した。この植菌作業を３回繰り返し行うことにより、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムをそれぞれの５−ＦＵ濃度で作製した。次に、ＭＲＳ培地にそれぞれの５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムを植菌し、培養後の菌液をそれぞれ２５０μｇ／ｍＬの５−ＦＵを含むＭＲＳ培地に植菌し、２４時間後の増殖の有無を濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を用いて測定した（表６）。その結果、５−ＦＵを１〜１００μｇ／ｍＬ含む培地で作製した５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムは、実施例１で得られた５−ＦＵ耐性株と同様に５−ＦＵに耐性であった。
実施例２で得られた５−ＦＵ耐性株を、参考例１と同様の方法で形質転換し、シトシン・デアミナーゼの発現を確認した。作製されたシトシン・デアミナーゼ発現する５−ＦＵ耐性株は、実施例１で得られた５−ＦＵ耐性株と同様に５−ＦＵに耐性があり、また、その５−ＦＵ耐性能は少なくとも７日間以上維持された。
実施例１と同様にして、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの５−ＦＵ耐性株を作製した。以下の表７に５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウムの菌株一覧を記載する。
本発明によると、ＣＤ／５−ＦＣを用いたＥｎｚｙｍｅ／ｐｒｏ−ｄｒｕｇ療法に極めて有用な、ＣＤ活性を保持しかつ５−ＦＵに耐性を示すビフィドバクテリウム属細菌等の５−ＦＵ耐性菌を容易に作製することができる。例えば、癌患者に、ＣＤ活性を保持しかつ５−ＦＵに耐性を示すビフィドバクテリウム属細菌を投与すると、該ビフィドバクテリウム属細菌は腫瘍内で増殖し、腫瘍内に存在している間に、５−ＦＣを経口投与すると腸管から吸収され、腫瘍内におけるＣＤの働きで５−ＦＣが５−ＦＵに変換されて、腫瘍細胞を死滅させることができるが、腫瘍細胞を死滅させることができる５−ＦＵ濃度においても、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム属細菌は生存し、ＣＤによる酵素作用を持続することができるので、該ビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とする優れた抗腫瘍剤を得ることができる。
また、本発明のＣＤ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が増殖している腫瘍以外の部分では、５−ＦＣは５−ＦＵに変換されないため、５−ＦＵをそのまま投与した場合に比べて、５−ＦＵによる副作用を格段に低く抑制することができる。さらに、本発明の固形腫瘍治療剤の抗腫瘍効果が腫瘍への高い特異性を有していることから、５−ＦＵをそのまま投与する場合に比べて、格段に高い５−ＦＵ濃度を腫瘍内において実現することが可能となり、その結果、極めて優れた抗腫瘍効果が得られる。
Claims (34)
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌の作製方法であって、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌を、５−フルオロシトシンの存在下で継代・馴化培養することを特徴とする耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現しない菌に、シトシン・デミナーゼ遺伝子を導入して形質転換したシトシン・デアミナーゼ発現菌であることを特徴とする請求項１に記載の耐性菌の作製方法。
- ２〜５０００μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを添加した培地で継代・馴化培養することを特徴とする請求項１又は２に記載の耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン・デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現するバクテリアであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現するバクテリアが、シトシン・デアミナーゼを発現する腸内細菌であることを特徴とする請求項４に記載の耐性菌の作製方法。
- シトシン・デアミナーゼを発現する腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする、請求項５に記載の耐性菌の作製方法。
- シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする請求項６に記載の耐性菌の作製方法。
- シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現するビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする請求項７に記載の耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有することを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌の作製方法であって、
（１）嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現しない菌を５−フルオロウラシルの存在下で継代・馴化培養して、５−フルオロウラシル耐性菌を作製する工程と、
（２）該５−フルオロウラシル耐性菌に、シトシン・デアミナーゼ遺伝子を導入して形質転換する工程を有することを特徴とする耐性菌の作製方法。 - １〜１００μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを添加した培地で継代・馴化培養することを特徴とする請求項９に記載の耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していない菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していないバクテリアであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン・デアミナーゼを発現していないバクテリアが、シトシン・デアミナーゼを発現していない腸内細菌であることを特徴とする請求項１１に記載の耐性菌の作製方法。
- シトシン・デアミナーゼを発現していない腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする請求項１２に記載の耐性菌の作製方法。
- シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする請求項１３に記載の耐性菌の作製方法。
- シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼを発現していないビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする請求項１４に記載の耐性菌の作製方法。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌であって、請求項１〜１５のいずれかに記載の作製方法で作製されることを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも２μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシン又は１μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを添加した培地で生育できることを特徴とするシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性バクテリアであることを特徴とする請求項１６又は１７に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性バクテリアが、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性腸内細菌であることを特徴とする請求項１８に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性腸内細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌であることを特徴とする請求項１９に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、又はビフィドバクテリウム・インファンティスであることを特徴とする請求項２０に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム属細菌が、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項２０に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムが、プラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株であることを特徴とする請求項２２に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガムが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株であることを特徴とする請求項２２に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株であることを特徴とする請求項２１に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株であることを特徴とする請求項２１に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株であるこ
とを特徴とする請求項２１に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。 - シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株であることを特徴とする請求項２１に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを保持する、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株であることを特徴とする請求項２１に記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌。
- 請求項１６〜２９のいずれかに記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌を含有することを特徴とする医薬組成物。
- ５−フルオロシトシンと組み合わせてなることを特徴とする請求項３０に記載の医薬組成物。
- さらに、ラクツロースと組み合わせてなることを特徴とする請求項３０又は３１に記載の医薬組成物。
- ５−フルオロシトシンから有効治療量の５−フルオロウラシルに変換できる量のシトシン・デアミナーゼを発現するのに十分な量のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌と、有効治療量の５−フルオロウラシルに変換できる量の５−フルオロシトシンとを組み合わせてなる固形腫瘍治療剤であって、シトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が請求項１６〜２９のいずれかに記載のシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌であることを特徴とする固形腫瘍治療剤。
- さらに、ラクツロースを組み合わせてなることを特徴とする請求項３３に記載の固形腫瘍治療剤。
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