JP2021524230A - アッカーマンシア種の遺伝子操作のためのシステムおよび方法 - Google Patents
アッカーマンシア種の遺伝子操作のためのシステムおよび方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021524230A JP2021524230A JP2020564372A JP2020564372A JP2021524230A JP 2021524230 A JP2021524230 A JP 2021524230A JP 2020564372 A JP2020564372 A JP 2020564372A JP 2020564372 A JP2020564372 A JP 2020564372A JP 2021524230 A JP2021524230 A JP 2021524230A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- akkermansia
- modified
- transposon
- bacterium
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000702460 Akkermansia Species 0.000 title claims abstract description 223
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 19
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 18
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 13
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 12
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims 1
- 241000702462 Akkermansia muciniphila Species 0.000 abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 8
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 abstract description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 35
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 35
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 12
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 8
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 8
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 8
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 8
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 6
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004921 distal colon Anatomy 0.000 description 5
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 4
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 4
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 4
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 101150038013 PIR gene Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical class COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 2
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- NEWKHUASLBMWRE-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C#CC=2C=CC=CC=2)=N1 NEWKHUASLBMWRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 101000971127 Bartonella henselae Autotransporter adhesin BadA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000078280 Escherichia coli S17 Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100445525 Lysinibacillus sphaericus ermG gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 cell lines Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000020931 dietary conditions Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009643 growth defect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 235000021231 nutrient uptake Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000012066 statistical methodology Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
Abstract
Description
本出願は、2018年5月15日に出願された米国仮出願第62/671,614号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。
本発明は、NIHによって授与された連邦助成金番号5R21DK110496−02の下で政府の支援を受けて行われた。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本開示は、部分的に、腸内微生物、アッカーマンシアムシニフィラおよび関連種(臨床株を含む)の変異および特徴付けのための材料、システムおよび方法、ならびに改変されたアッカーマンシアのそれらの使用を提供する。
遺伝子および改変された表現型を有する改変された細菌の遺伝子スクリーニングを行うことを可能にするには、細菌を変異させるためのツールが必要であった。アッカーマンシアにおいて使用するために、前述のベクターの修飾バージョンが生成された。元のベクター、pSAM_Bt1は、バクテロイデス属テタイオタオミクロンにおける使用のために設計された。このベクターは、エリスロマイシン耐性遺伝子を有する修飾マリナートランスポゾンhimar1C9と、転位を触媒するために必要とされるトランスポザーゼ酵素の両方をコードしている。このプラスミドは、lamba pirに依存する複製起点を使用しており、pir遺伝子を欠くアッカーマンシアなどの株では複製できない。
トランスポゾンベクター(配列番号1)は、大腸菌ドナー株とのコンジュゲーションによってアッカーマンシアに導入された。アッカーマンシアスターター培養は、30mlの合成培地2に1:5で継代培養し、OD600=0.6−1.0まで増殖させた。次に、細胞を、1.5mlチューブ内で10000xg、5分、4℃で遠心分離することにより回収した。並行して、大腸菌S17 pSAM_Akk培養物を、LB + 100ug/mlアンピシリン、35 ug/mlクロラムフェニコール中で、37°C 200rpmで光学密度(OD)OD600=0.4−0.7まで好気的に増殖させた。コンジュゲーション線毛の剪断を避けるために、大腸菌を2000xgで3分間遠心分離し、滅菌PBSで1回洗浄した。大腸菌およびアッカーマンシアのペレットを合成培地で総量0.5mlに混合し、懸濁液を使用して、事前に還元した合成培地プレート上に100μlの水たまりを作成した。プレートは、アッカーマンシア株に応じて、37℃で7〜14時間好気的にインキュベートされた。好気性インキュベーションは、コンジュゲーションを成功させるために重要である。
ムチンの利用に必要とされる遺伝子をスクリーニングするために、アレイ化されたTn変異体を使用して、ムチン培地3または合成培地のいずれかを含む複製96ウェルプレートに接種した。プレートを37℃で3日間嫌気的にインキュベートした。増殖後、プレートリーダーを使用してOD600を測定した。ムチンではなく合成培地で増殖した変異体を、追加の特性評価のために選択した。最初のスクリーニングを確認するために、プレートリーダーで増殖曲線アッセイを実行し、60分ごとに72時間測定することにより、目的の変異体のムチン増殖欠損をテストした(図3)。任意のPCRを使用して、トランスポゾン挿入部位を位置決めし、ムチンでの増殖に必要とされる遺伝子を同定した。このスクリーニングにより、単糖ではなくムチンでの増殖のために特に必要とされる遺伝子が同定された(表1)。
Tn変異体をスクリーニングするために使用される2番目のアプローチは、トランスポゾン挿入配列(Tn/IN−seq)1で使用するための大きなプールライブラリを作成することであった。この方法は、変異体の大きなプールをさまざまな条件で通過させ、続いて次世代シーケンシングを使用して入力プールと出力プールの各変異体の存在量をテストすることにより、条件付きで必須の遺伝子を特定する。特定の条件での生存に必要とされる遺伝子は、入力プールから枯渇する。Tn/IN−seqを使用して、マウス腸管のコロニー形成に必要とされる遺伝子を特定した。
1.Goodman et al.(2011)Nature Protocols.6(12):1969−1980
2.Plovier et al.(2017) Nature Medicine 23:107−113
3.Derrien et al.(2004) Int J Syst Evol Microbiol.54:1469−1476
これらの参考文献は、実施例に記載されている方法に関連する詳細について、その全体が組み込まれている。
実施例4に記載のマウスからの腸サンプルを採取し、切片化し、ムチンおよびアッカーマンシアに対する抗体で染色した。図5に示すように、アッカーマンシアは腸管内のムチン層と非常に密接に関連している。
テキスト形式の配列表は、本願と同時に提出され、出願時に本願の一部として完全に組み込まれる。
Claims (24)
- アッカーマンシア細菌を遺伝子改変する方法であって、前記方法が、
(a)配列番号1の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入して、複数の改変されたアッカーマンシア細菌を生成することと、
(b)前記複数の改変されたアッカーマンシアを培養して、前記ベクターの前記トランスポゾンをゲノムに組み込んだ細菌を選択して、複数の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を生成することと、を含む、方法。 - 前記外因性トランスポゾンベクターが、前記トランスポゾンベクターを含む大腸菌との前記アッカーマンシア細菌のコンジュゲーションによって導入される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)が、クロラムフェニコールを含む培地中で前記複数の改変されたアッカーマンシアを培養して、前記トランスポゾン内に含まれる抗生物質耐性遺伝子を含む前記複数の改変されたアッカーマンシアを選択することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 工程(b)が、アッカーマンシア細菌の増殖を可能にするが、大腸菌を含む他の細菌株の増殖を可能にしない培養条件下で、前記改変されたアッカーマンシアを培養することを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記細菌が嫌気性条件下で培養され、前記培地が、それらのゲノム内に組み込まれた前記トランスポゾンを有する改変されたアッカーマンシアを選択するためのクロラムフェニコールを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記方法が、
(c)形質を選択する条件下で前記複数の遺伝子改変されたアッカーマンシアを培養することと、
(d)前記アッカーマンシアのゲノム内の前記トランスポゾンに隣接する遺伝子のPCRまたは配列決定により、前記形質に関連する遺伝子を同定することと、をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記形質が、前記アッカーマンシアによるムチンの利用であり、工程(c)が、ムチンを含むかまたはムチンを含まない培地中で前記遺伝子改変されたアッカーマンシアを培養することを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記方法が、
(d)ムチンの存在下で増殖した前記改変されたアッカーマンシアの遺伝子およびムチンの非存在下で増殖した改変されたアッカーマンシアの遺伝子を遺伝子分析して、ムチン利用を調節する遺伝子を決定することをさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 表現型形質が腸の安定したコロニー形成に関連し、前記方法が、
(d)前記複数の遺伝子改変されたアッカーマンシアを対象に導入することと、
(e)前記改変された細菌の遺伝子を遺伝子分析することにより、前記対象の腸にコロニーを形成する増殖の利点を有する前記改変されたアッカーマンシアを検出することと、をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - 複数の改変されたアッカーマンシアバリアントの少なくとも一部のDNA配列によって遺伝子分析が行われる、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法によって生成される遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌であって、前記遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌のゲノムが前記トランスポゾンを含む、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
- 配列番号1のベクターからのトランスポゾンをアッカーマンシア細菌に組み込むことによって生成される、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
- 前記細菌は表1に列挙された遺伝子のいずれか1つが破壊されている、請求項12に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
- 前記細菌は表2に列挙された遺伝子のいずれか1つが破壊されている、請求項12に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
- 前記細菌は表3に列挙された遺伝子のいずれか1つが破壊されている、請求項12に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
- 改変されたアッカーマンシア細菌のライブラリであって、配列番号1のベクターからのトランスポゾンをアッカーマンシアの集団にランダムに導入することと、クロラムフェニコールを含む培地中、嫌気性条件下で前記細菌を培養することにより改変された前記アッカーマンシア細菌を選択して、前記トランスポゾンがゲノムに挿入されているアッカーマンシアを選択することによって生成される、ライブラリ。
- 前記ライブラリが、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によって生成される、請求項13に記載のライブラリ。
- 形質の改変された遺伝的調節因子を有する改変されたアッカーマンシア細菌を選択する方法であって、前記方法が、
(a)配列番号1の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に導入して、前記トランスポゾンを前記アッカーマンシアのゲノムにランダムに組み込むことと、
(b)前記集団アッカーマンシアを培養して、前記トランスポゾンがそれらのゲノムに組み込まれているアッカーマンシアを選択して、アッカーマンシアの複数の改変されたバリアントを生成することと、
(c)前記改変された遺伝形質が選択される条件下で前記アッカーマンシアを培養することにより、前記改変された遺伝的調節因子を有するアッカーマンシアを選択することと、を含む、方法。 - 工程(a)が、配列番号1の前記トランスポゾンベクターを含む大腸菌との前記アッカーマンシアのコンジュゲーションを含む、請求項18に記載の方法。
- 工程(b)が、クロラムフェニコールの存在下でアッカーマンシアの前記改変されたバリアントを選択するために嫌気性条件下で前記細菌を継代培養することを含む、請求項18または19に記載の方法。
- (d)前記トランスポゾンに隣接するゲノム領域を配列決定またはPCR増幅することによって、前記改変された遺伝子調節因子を決定することをさらに含む、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- アッカーマンシアの形質の新規な遺伝的調節因子を同定する方法であって、前記方法が、
(a)配列番号1の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に組み込んで、前記トランスポゾンをそれらのゲノムに組み込んだ改変されたアッカーマンシアの集団を作製することと、
(b)クロラムフェニコールを含む培地で前記アッカーマンシアを培養して、前記外因性トランスポゾンを組み込んだアッカーマンシアを選択することと、
(c)前記改変されたアッカーマンシアを2つの異なる条件にさらすことと、
(d)前記形質に関連する遺伝子を同定するために、前記2つの異なる条件下で増殖させた、前記改変されたアッカーマンシアの前記トランスポゾンによって破壊された遺伝子を配列決定またはPCR増幅することによって分析することと、を含む、方法。 - 前記アッカーマンシアが、アッカーマンシアムニシプリラ(municiplila)またはアッカーマンシアの臨床株である、請求項1〜10または18〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッカーマンシアが、アッカーマンシアムニシプリラ(municiplila)またはアッカーマンシアの臨床株である、請求項11〜15のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア、または請求項16もしくは17に記載のライブラリ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862671614P | 2018-05-15 | 2018-05-15 | |
US62/671,614 | 2018-05-15 | ||
PCT/US2019/032431 WO2019222359A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-05-15 | Systems and methods for genetic manipulation of akkermansia species |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021524230A true JP2021524230A (ja) | 2021-09-13 |
JPWO2019222359A5 JPWO2019222359A5 (ja) | 2022-05-23 |
Family
ID=68540836
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020564372A Pending JP2021524230A (ja) | 2018-05-15 | 2019-05-15 | アッカーマンシア種の遺伝子操作のためのシステムおよび方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210222180A1 (ja) |
EP (1) | EP3802788A4 (ja) |
JP (1) | JP2021524230A (ja) |
CN (1) | CN112384624A (ja) |
CA (1) | CA3100376A1 (ja) |
WO (1) | WO2019222359A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116555036A (zh) * | 2023-07-04 | 2023-08-08 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR9812540A (pt) * | 1997-09-26 | 2001-12-26 | Athersys Inc | Expressão de genes endógenos por recombinaçãonão homóloga de uma construção de vetor comdna celular |
US6221349B1 (en) * | 1998-10-20 | 2001-04-24 | Avigen, Inc. | Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells |
US6686159B2 (en) * | 2000-08-24 | 2004-02-03 | Sierra Sciences, Inc. | Methods and compositions for modulating telomerase reverse transcriptase (TERT) expression |
EP3287144A1 (en) | 2002-07-03 | 2018-02-28 | ONO Pharmaceutical Co., Ltd. | Immunopotentiating compositions |
PL2439273T3 (pl) | 2005-05-09 | 2019-08-30 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku programowanej śmierci komórki 1(pd-1) oraz metody leczenia nowotworów z wykorzystaniem przeciwciał anty-pd-1 samodzielnie lub w połączeniu z innymi immunoterapeutykami |
EP2170959B1 (en) | 2007-06-18 | 2013-10-02 | Merck Sharp & Dohme B.V. | Antibodies to human programmed death receptor pd-1 |
WO2014075745A1 (en) * | 2012-11-19 | 2014-05-22 | Université Catholique de Louvain | Use of akkermansia for treating metabolic disorders |
ES2947938T3 (es) * | 2016-03-02 | 2023-08-24 | Ptt Global Chemical Public Co Ltd | Producción de ácido mucónico mejorada a partir de microorganismos genéticamente modificados |
US10689644B2 (en) | 2016-03-17 | 2020-06-23 | Duke University | Systems and methods for genetic analysis of intractable microbes |
-
2019
- 2019-05-15 CN CN201980045273.9A patent/CN112384624A/zh active Pending
- 2019-05-15 WO PCT/US2019/032431 patent/WO2019222359A1/en unknown
- 2019-05-15 JP JP2020564372A patent/JP2021524230A/ja active Pending
- 2019-05-15 CA CA3100376A patent/CA3100376A1/en active Pending
- 2019-05-15 US US17/055,478 patent/US20210222180A1/en active Pending
- 2019-05-15 EP EP19803499.3A patent/EP3802788A4/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3802788A1 (en) | 2021-04-14 |
CN112384624A (zh) | 2021-02-19 |
US20210222180A1 (en) | 2021-07-22 |
WO2019222359A1 (en) | 2019-11-21 |
EP3802788A4 (en) | 2022-02-16 |
CA3100376A1 (en) | 2019-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2021000092A (ja) | 細胞工学のための方法および遺伝システム | |
Baharoglu et al. | Conjugative DNA transfer induces the bacterial SOS response and promotes antibiotic resistance development through integron activation | |
Giraud et al. | Dissecting the genetic components of adaptation of Escherichia coli to the mouse gut | |
Lohße et al. | Overproduction of magnetosomes by genomic amplification of biosynthesis-related gene clusters in a magnetotactic bacterium | |
KR20170121291A (ko) | 감소된 창자 염증 및/또는 강화된 창자 점막 장벽으로부터 이익을 얻는 질병을 치료하기 위해 공학처리된 박테리아 | |
Brennan et al. | Genetic determinants of swimming motility in the squid light‐organ symbiont V ibrio fischeri | |
Shields et al. | Genomewide identification of essential genes and fitness determinants of Streptococcus mutans UA159 | |
WO2018112194A1 (en) | Compositions and methods for modulating growth of a genetically modified gut bacterial cell | |
US20220403367A1 (en) | Microbiome engineering through engineered mobile genetic elements | |
Navarro et al. | NanI sialidase is an important contributor to Clostridium perfringens type F strain F4969 intestinal colonization in mice | |
Ruhe et al. | CDI systems are stably maintained by a cell-contact mediated surveillance mechanism | |
US20210095273A1 (en) | Modulation of microbiota compositions using targeted nucleases | |
Zwiener et al. | Towards a'chassis' for bacterial magnetosome biosynthesis: genome streamlining of Magnetospirillum gryphiswaldense by multiple deletions | |
Santana et al. | HrrF is the Fur-regulated small RNA in nontypeable Haemophilus influenzae | |
JP2023530967A (ja) | 細菌分泌装置を含むadas | |
US10908151B2 (en) | Compositions and methods for cancer diagnosis | |
US11549115B2 (en) | Compositions and methods for regulated gene expression | |
van Bokhorst‐van de Veen et al. | Genotypic adaptations associated with prolonged persistence of Lactobacillus plantarum in the murine digestive tract | |
JP2021524230A (ja) | アッカーマンシア種の遺伝子操作のためのシステムおよび方法 | |
JP2021531039A (ja) | 細菌接合システム及びその治療的使用 | |
Lee et al. | Development of a gene delivery system in Streptococcus gordonii using thymidylate synthase as a selection marker | |
EP2057266B2 (en) | Genetic remodeling in bifidobacterium | |
JP2011015664A (ja) | 難培養性細菌の培養方法 | |
Zhu et al. | Vaginal Lactobacillus fatty acid response mechanisms reveal a novel strategy for bacterial vaginosis treatment | |
Koomen et al. | Ribosomal mutations enable a switch between high fitness and high stress resistance in Listeria monocytogenes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220513 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220513 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230518 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230818 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231013 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240104 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240404 |