CN116555036A - 一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法 - Google Patents

一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法。本发明提供的阿克曼氏菌分离培养基以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素。采用本发明提供的培养基对粪便样品中阿克曼氏菌的分离具有极大的促进作用，能够更有效地排除杂菌对阿克曼氏菌株分离的影响，相较于原始分离方法，分离效率明显更高，分离获得阿克曼氏菌的成功率显著提高。本发明的培养基还具有组成简单、成本低的优势，分离方法简单易行，适于推广应用。

Description

一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏 菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法。
背景技术
阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）作为一种常见的肠道厌氧菌，距离2004年首次成功分离至今已有十余年。然而，目前只有非常有限的阿克曼氏菌菌株被成功分离和培养，可能原因是阿克曼氏菌对氧气的敏感性和易受杂菌生长影响的微小菌落形态。近年来宏基因组学和高通量等新型测序技术极大地丰富了微生物的检测手段。虽然组学有望帮助人们深入了解肠道菌群的菌落结构，但为了更好地利用有益微生物，有必要对更多的阿克曼氏菌菌株进行分离纯化，因此，需要开发高效的阿克曼氏菌分离培养基和分离方法。
发明内容
本发明提供一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法。
粪便样品中的微生物菌群复杂多样，阿克曼氏菌因其对营养要求较为严格，生长较慢，菌落微小，导致粪便中很多微生物均会对其分离筛选造成干扰，进而造成阿克曼氏菌的分离失败或分离效率降低。本发明在针对粪便样品分离阿克曼氏菌的研究中意外地发现，通过在分离筛选过程中添加万古霉素和红霉素，两种抗生素联用既能够有效抑制粪便样品中其他微生物的生长，同时还不会对阿克曼氏菌的生长产生抑制作用，进而显著提高了阿克曼氏菌的分离效率。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供万古霉素和红霉素在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。
具体地，所述应用为：以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素用于粪便样品的富集培养和/或阿克曼氏菌的分离培养；
其中，万古霉素的添加浓度为4-6μg/mL，红霉素的添加浓度为0.3-0.5μg/mL。
本发明发现，在上述浓度下将红霉素与万古霉素联用，即可显著抑制杂菌的生长，同时又不会对阿克曼氏菌的生长产生抑制。
优选地，上述应用包括：以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素用于粪便样品的富集培养和阿克曼氏菌的分离培养，在富集培养和分离培养使用的培养基中，万古霉素的添加浓度为4-6μg/mL，红霉素的添加浓度为0.3-0.5μg/mL。
进一步优选地，上述应用包括：将粪便样品置于含有万古霉素4-6μg/mL、红霉素0.3-0.5μg/mL的富集培养用培养基中进行富集培养，得到样品富集液；对样品富集液进行初步筛选鉴定，将鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液在含有万古霉素4-6μg/mL、红霉素0.3-0.5μg/mL的分离培养用培养基中进行分离培养，对分离得到的菌株进行阿克曼氏菌的鉴定。
第二方面，本发明提供一种阿克曼氏菌分离培养基，所述培养基以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素。
优选地，所述培养基中，万古霉素的浓度为4-6μg/mL，红霉素的浓度为0.3-0.5μg/mL。
具体地，所述阿克曼氏菌分离培养基包含：
第一培养基，为液体培养基，用于粪便样品的富集培养，包含：碳源和氮源、无机盐、氨基酸、益生元和筛选抗生素；其中，所述碳源和氮源包含脑心浸粉15-20g/L，黏蛋白2-4g/L，蛋白胨5-15 g/L，葡萄糖1-3 g/L；
第二培养基，为固体培养基，用于阿克曼氏菌的分离培养，包含：碳源和氮源、无机盐、氨基酸和筛选抗生素；其中，所述碳源和氮源包含黏蛋白2-4 g/L。
优选地，所述第一培养基中的碳源和氮源由脑心浸粉15-20g/L，黏蛋白2-4g/L，蛋白胨5-15 g/L，葡萄糖1-3 g/L组成。
所述第二培养基中的碳源和氮源由黏蛋白2-4 g/L组成。
现有技术中，用于阿克曼氏菌筛选的富集培养基通常以黏蛋白为唯一碳氮源，以更好地抑制杂菌生长，本发明意外地发现，在添加上述筛选抗生素的基础上，采用脑心浸粉、黏蛋白、蛋白胨、葡萄糖为碳源和氮源，不仅能够有效抑制杂菌生长，而且还可以更好地促进阿克曼氏菌的生长和富集，配合有利于增加阿克曼氏菌丰度的益生元，在富集培养阶段，能够筛除大量杂菌，显著增加阿克曼氏菌的丰度，有利于后续阿克曼氏菌的分离，进而提高分离成功率和分离效率。
优选地，所述第一培养基中，无机盐包含氯化钠、磷酸氢二钠和微量元素；氨基酸包含L-半胱氨酸或其盐；益生元包含菊粉。
所述第二培养基中，无机盐包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化铵、氯化镁、氯化钙、碳酸氢钠和微量元素；氨基酸包含L-半胱氨酸或其盐。
上述L-半胱氨酸的盐优选为L-半胱氨酸盐酸盐。
上述微量元素优选为Coolaber 1000×B6微量元素溶液。
优选地，所述第一培养基包含以下组分：蛋白胨 8-12g/L，牛脑浸粉 10-15g/L，牛心浸粉 4-8g/L，氯化钠 3-7g/L，葡萄糖 1-3g/L，磷酸氢二钠 2-3g/L，黏蛋白2-4g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.8 g/L，菊粉15-25g/L，Coolaber 1000×B6微量元素溶液 0.8-1.2mL/L，万古霉素4-6μg/mL，红霉素0.3-0.5μg/mL。采用上述第一培养基进行粪便样品的富集培养能够显著促进粪便样品中阿克曼氏菌的富集，抑制其中杂菌的生长繁殖。
在本发明的一些实施方式中，所述第一培养基包含以下组分：蛋白胨 9-11g/L，脱水小牛脑浸粉 12-13g/L，脱水牛心浸粉 4-6g/L，氯化钠 4-6g/L，葡萄糖 1-3g/L，磷酸氢二钠 2-3g/L，黏蛋白 2-4g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.4-0.6 g/L，菊粉 18-22 g/L，Coolaber 1000×B6微量元素溶液 0.9-1.1mL/L，万古霉素4-5μg/mL，红霉素0.3-0.4μg/mL，以水为溶剂。作为示例本发明在实施例中提供了上述第一培养基中的一种，经验证，上述第一培养基均能够取得与实施例中所示培养基相当的富集和分离效果。
优选地，所述第二培养基包含以下组分：磷酸二氢钾 0.3-0.5 g/L，磷酸氢二钠0.5-0.6g/L，氯化钠 0.2-0.4 g/L，氯化铵 0.2-0.4 g/L，氯化镁 0.05-0.2g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，碳酸氢钠3-5 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.4-0.6g/L，黏蛋白2-4g/L，Coolaber1000×B6微量元素溶液 0.8-1.2mL/L，万古霉素4-6μg/mL，红霉素0.3-0.5μg/mL。采用上述第二培养基进行粪便样品的富集培养能够有效抑制样品富集液中杂菌的生长繁殖，并为阿克曼氏菌的生长提供必要的营养元素，提高阿克曼氏菌的分离成功率和效率。
优选地，所述第二培养基还包含琼脂15-25g/L。
在本发明的一些实施方式中，所述第二培养基包含以下组分：磷酸二氢钾 0.35-0.45g/L，磷酸氢二钠 0.5-0.55 g/L，氯化钠 0.25-0.35 g/L，氯化铵 0.25-0.35 g/L，氯化镁 0.08-0.12 g/L，氯化钙 0.1-0.15 g/L，碳酸氢钠 3.5-4.5 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.45-0.55 g/L，黏蛋白 2-4 g/L，Coolaber 1000×B6微量元素溶液 0.9-1.1mL/L，万古霉素4-5μg/mL，红霉素0.3-0.4μg/mL，琼脂 15-25 g/L，以水为溶剂。作为示例本发明在实施例中提供了上述第二培养基中的一种，经验证，上述第二培养基均能够取得与实施例中所示培养基相当的富集和分离效果。
上述第一培养基、第二培养基的pH优选为6.5-8.0，更优选为7.0-8.0。
本发明中，上述第一培养基能够显著增加样品富集液中阿克曼氏菌的丰度，减少其他杂菌的丰度影响；第二培养基能够有效减少其他杂菌生长，排除杂菌影响，增加阿克曼氏菌分离成功率。
第三方面，本发明提供以上所述的阿克曼氏菌分离培养基在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。
优选地，上述粪便样品为来源于人的粪便样品。
第四方面，本发明提供一种从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，所述方法包括：将粪便样品置于以上所述的阿克曼氏菌分离培养基中的第一培养基中进行富集培养得到样品富集液；对样品富集液进行初步筛选鉴定，将鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液在以上所述的阿克曼氏菌分离培养基中的第二培养基中进行分离培养，对分离得到的菌株进行阿克曼氏菌的鉴定。
上述方法中，所述初步筛选鉴定为以样品富集液的DNA为模板，以阿克曼氏菌特异性引物进行PCR扩增，根据扩增产物判断样品富集液中是否含有阿克曼氏菌；
所述阿克曼氏菌特异性引物为上游引物AKKF-1和下游引物AKKR-2，其中，上游引物AKKF-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物AKKR-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述引物的核苷酸序列具体如下：
上游引物AKKF-1：5’-CATGTGAAAGCATGCGACTC-3’；
下游引物AKKR-2：5’-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3’。
上述阿克曼氏菌特异性引物为本发明针对粪便样品的菌群特点以及阿克曼氏菌设计，可实现快速、简便地检测粪便样品中是否含有阿克曼氏菌，对于阿克曼氏菌的常见种具有普适性（包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）和Akkermansia glycaniphila），且具有属水平的高特异性，灵敏度高；当粪便样品中含有阿克曼氏菌属中的至少一种菌时，该特异性引物对可检测出样品中含有阿克曼氏菌，保证菌株富集和分离的准确性。
上述初步筛选鉴定能够初步筛选出具有阿克曼氏菌的样品富集液，排除无此菌的富集液，提高分离效率，对富集液进行针对性的分离。
在本发明的一些实施方式中，初步筛选鉴定包括：提取样品富集液的基因组DNA，作为模板DNA；将所述模板DNA与特异性引物对、10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水混合形成PCR反应体系；将所述PCR反应体系进行反应，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据条带分析结果。
在本发明的一些实施方式中，上述PCR扩增的PCR反应体系（20µL）包括：模板DNA 1µL，2×Taq PCR MasterMix 10µL，上游引物1µL，下游引物1µL，双蒸水补足至20µL。
在本发明的一些实施方式中，上述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，其中变性、退火、延伸共30个循环；最后72℃延伸5min。
上述方法中，所述分离培养采用为：将所述样品富集液稀释后涂布于第二培养基上。
在本发明的一些实施方式中，所述分离培养为：使用稀释涂布平板方法，并将较低稀释度的菌悬液涂布于第二培养基平板，避免因菌株丰度较低，而菌液稀释度较高而导致平板上无阿克曼氏菌生长；具体地，使用无菌水将样品富集液梯度稀释至10-1 ~ 10-5，吸取各梯度菌悬液100 μL，涂布到第二培养基（固体培养基）上，于 37℃厌氧培养 3-5d；待平板上长出菌落后，在每个平板上根据菌落形态选择单克隆，并将单克隆在固体培养基上进行平板划线，直至纯化。
上述方法中，对分离得到的菌株进行阿克曼氏菌的鉴定采用16S rRNA测序方法。
具体地，使用DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA，并采用通用引物（Lane,D. J., B. Pace, G. J. Olsen, D. A. Stahl, M. L. Sogin, and N. R. Pace. 1985.Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses.Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:6955-6959）对其进行PCR扩增得到16S rRNA基因，对16SrRNA基因进行测序，并通过与模式菌株的基因序列进行比对，确认是否为阿克曼氏菌。
在本发明的一些实施方式中，上述PCR扩增采用20μL反应体系为，其中：模板DNA 1μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1μL，双蒸水补足至20 μL，每个样本3个重复。PCR 扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃稳定延伸5 min，最后4℃保存。扩增完成后，采用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行测定，测定合格后进行测序。测序完成后，将测序结果提交EzBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）进行同源序列比对确定其属种。
上述方法中，所述培养为在36-37℃厌氧培养。
优选地，富集培养的时间优选为3-5d。分离培养的时间优选为3-5d。
上述方法中，在采集粪便样品时，优选将粪便样品置于样品保护液中，所述样品保护液保护以下组分：28-32%甘油、L-半胱氨酸盐酸盐 0.4-0.6g/L。
在本发明的一些实施方式中，使用无菌粪便样品取样器按粪便取样方法（五点取样法）对粪便进行取样，取样后立刻保存在液氮或者冰盒中，长期保存放入-80℃冰箱中进行保存，为保证样品中微生物的活性，尽快对样品进行后续培养处理。
在本发明的一些实施方式中提供一种从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）粪便样品的收集及保藏：使用无菌粪便样品取样器按粪便取样方法对粪便进行取样，并保存在-80℃冰箱中直至样品处理；
（2）将粪便样品进行处理并使用第一培养基对粪便样品进行富集培养，得到样品富集液；
（3）提取样品富集液的DNA，以该DNA为模板，利用阿克曼氏菌特异性引物进行PCR扩增，进行初步筛选鉴定；
（4）对步骤（3）中鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液进行梯度稀释后，涂布于第二培养基上进行分离培养；
（5）对步骤（4）的分离菌株进行纯化和16S rRNA 鉴定。
上述步骤（2）中，将粪便样品与PBS缓冲液混合后，于8000-12000r/min离心2-5min，将上清液置于富集培养基中，在37℃条件下厌氧培养3-5 d，得到样品富集液。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种针对粪便样品中阿克曼氏菌分离的培养基和方法。采用本发明提供的培养基对粪便样品中阿克曼氏菌的分离具有极大的促进作用，能够更有效地排除杂菌对阿克曼氏菌株分离的影响，相较于原始分离方法，分离效率明显更高，分离获得阿克曼氏菌的成功率显著提高。本发明的培养基还具有组成简单、成本低的优势，分离方法简单易行，适于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1中阿克曼氏菌特异性引物的检测特异性结果，其中，a为通用引物27F/1492R的PCR扩增结果；b为特异性引物AKKF-1/AKKR-2的PCR扩增结果；M为分子量标准DNAMarker DM2000；1：无菌水；2：Akkermansia muciniphila；3：Akkermansia glycaniphila；4：Lactiplantibacillus argentoratensis；5：Limosilactobacillus fermentum；6：Limosilactobacillus oris；7：Enterococcus hirae；8：Citrobacter pasteurii；9：Enterococcus durans；10：Gordonia terrae；11：Streptococcus mutans；12：Streptococcus salivarius；13：Shigella flexneri；14：Enterococcus hulanensis；15：Klebsiella pneumoniaesubsp. Pneumoniae；16：Klebsiella variicolasubsp.Variicola；17：Escherichia fergusonii；18：Streptococcus gallolyticus subsp.Pasteurianus；19：Streptococcus anginosussubsp. Whileyi；20：Streptococcus lutetiensis。
图2为本发明实验例1中阿克曼氏菌特异性引物对不同阿克曼氏菌进行PCR扩增的结果，其中，a为通用引物27F/1492R的PCR扩增结果；b为特异性引物AKKF-1/AKKR-2的PCR扩增结果；M为分子量标准DNAMarker DM2000；1：Akkermansia muciniphila；2：Akkermansia glycaniphila；3和4为两株从粪便样品中分离得到的阿克曼氏菌E41\B31。
图3为本发明实验例1中阿克曼氏菌特异性引物对粪便样品富集后的初步筛选鉴定结果，其中，a为通用引物27F/1492R的PCR扩增结果；b为特异性引物AKKF-1/AKKR-2的PCR扩增结果；M为分子量标准DNAMarker DM2000，1，Akkermansia muciniphila阳性对照；2，Akkemansia glycaniphia阳性对照；3~5，3个粪便样品。
图4为本发明实验例2中从粪便样品中分离得到的菌株的PCR鉴定电泳图，其中，M为分子量标准DNA Marker DM2000，1，Akkermansia muciniphila；2，Akkemansiaglycaniphia；3~5，三个志愿者的粪便样品（3：A，4：B， 5：C）。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种阿克曼氏菌分离培养基，包含第一培养基（BHI黏蛋白抗生素筛选液体培养基）和第二培养基（AKK基础筛选固体培养基）；
其中，BHI黏蛋白抗生素筛选液体培养基包括以下组分：蛋白胨 10g/L、脱水小牛脑浸粉 12.5 g/L、脱水牛心浸粉 5.0 g/L、氯化钠 5.0 g/L、葡萄糖 2.0 g/L、磷酸氢二钠2.5 g/L、黏蛋白 3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L、菊粉 20 g/L、Coolaber 1000×B6微量元素溶液 1mL/L、万古霉素5μg/mL、红霉素0.4μg/mL以水为溶剂，pH 7.0。
BHI黏蛋白抗生素筛选液体培养基的制备方法如下：称取蛋白胨 10g、脱水小牛脑浸粉 12.5g、脱水牛心浸粉 5.0g、氯化钠 5.0g、葡萄糖 2.0g、磷酸氢二钠 2.5g、黏蛋白3g、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5g、菊粉 20g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；将液体培养基分装至厌氧瓶中，进行抽换气（N2）后，在121℃条件下灭菌15min；待液体培养基冷却至50-60℃时，补加过滤除菌后的Coolaber 1000×B6微量元素溶液1mL/L，并按使用终浓度加入抗生素（万古霉素5μg/mL、红霉素0.4μg/mL），混匀备用。
AKK基础筛选固体培养基包括以下组分：磷酸二氢钾 0.4 g/L、磷酸氢二钠 0.53g/L、氯化钠 0.3 g/L、氯化铵 0.3 g/L、氯化镁 0.1 g/L、氯化钙 0.11 g/L、碳酸氢钠 4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L、黏蛋白 3 g/L、Coolaber 1000×B6微量元素溶液 1mL/L、万古霉素5μg/mL、红霉素0.4μg/mL、琼脂 20 g/L，以水为溶剂，pH 7.0。
AKK基础筛选固体培养基的制备方法如下：称取磷酸二氢钾 0.4g、磷酸氢二钠0.53g、氯化钠 0.3g、氯化铵 0.3g、氯化镁 0.1g、氯化钙 0.11g、碳酸氢钠 4g、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5g、黏蛋白 3g、琼脂 20g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0，在121℃条件下灭菌20min；待培养基冷却至50-60℃时，补加过滤除菌后的Coolaber 1000×B6微量元素溶液1mL/L，并按使用终浓度加入抗生素（万古霉素5μg/mL、红霉素0.4μg/mL），混匀后倒入无菌平板，放在超净台待冷却凝固后使用。
实施例2
本实施例提供一种从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，采用实施例1的培养基进行，包括以下步骤：
（1）粪便样品的收集及保藏：在无菌粪便样品取样器中加入可淹没样品取样勺的样品保护液（1L样品保护液组成：30%甘油、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5g），使用无菌粪便样品取样器按粪便取样方法（五点取样法）对粪便进行取样，收集完成后使用液氮进行冷冻保存运输，取得样品后对样品进行处理。
（2）样品富集培养：使用BHI黏蛋白抗生素筛选液体培养基对样品进行富集培养，37℃，厌氧条件下培养3-5d，得到样品富集液。
（3）初步筛选鉴定：提取步骤（2）得到的样品富集液的基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的阿克曼氏菌特异性引物配制PCR反应体系，对基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，分析PCR扩增结果；
其中，PCR反应体系组成为20µL，其中包括模板DNA 1µL，2×Taq PCR MasterMix10µL，上游引物AKKF-1 1µL，下游引物AKKR-2 1µL，双蒸水补足至20µL。
PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，其中变性、退火、延伸共30个循环；最后72℃延伸5min。
（4）菌株分离培养、纯化及鉴定：将步骤（3）中鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液进行梯度稀释，各梯度依次吸取上一梯度稀释菌液，直至稀释到 10-1，10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度的菌悬液，吸取各梯度菌悬液100 μL，涂布AKK基础筛选固体培养基平板进行菌株分离培养，在37℃条件下厌氧培养3-5d；观察平板，待平板上长出菌落后，对单克隆进行挑取扩培，在每个平板上根据菌落形态选择10个单克隆，并将单克隆在固体培养基上进行平板划线，直至纯化，同时对挑取的菌株进行16S rRNA测序并进行序列比对，鉴定是否为阿克曼氏菌。
对比例1
本对比例提供一种从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，其与实施例2的方法的区别仅在于，使用的BHI黏蛋白抗生素筛选液体培养基和AKK基础筛选固体培养基中的筛选抗生素仅为万古霉素5μg/mL，去除红霉素。
实验例1 阿克曼氏菌特异性引物的性能检测
1、对核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的阿克曼氏菌特异性引物（AKKF-1/AKKR-2）的特异性进行检测，具体方法和结果如下：
用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取Akkermansia muciniphila 和Akkermansia glycaniphila两种阿克曼氏菌的基因组DNA。
设置无菌水、Lactiplantibacillus argentoratensis、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus oris、Enterococcus hirae、Citrobacter pasteurii、Enterococcus durans、Gordonia terrae、Streptococcus mutans、Streptococcus salivarius、Shigella flexneri、Enterococcus hulanensis、Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae、Klebsiella variicolasubsp. Variicola、Escherichia fergusonii、Streptococcus gallolyticussubsp. Pasteurianus、Streptococcus anginosussubsp.Whileyi、Streptococcus lutetiensis作为非阿克曼氏菌属外源物种阴性对照模板。同时以细菌16S rRNA 基因通用引物(SEQ ID NO.3: 27F: 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ; SEQ ID NO.4: 1492R: 5’ -TACGACTTAACCCCAATCGC-3’ )作为阳性对照。
PCR扩增的反应体系（20µL）包括模板DNA 1µL，2×Taq PCR MasterMix 10µL，上游引物1µL，下游引物1µL，双蒸水补足至20µL。
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，其中变性、退火、延伸共30个循环；最后72℃延伸5min。
电泳分析：按照1%的比例配制琼脂糖凝胶，将制好的琼脂糖凝胶板放置于电泳槽中，加入1×TAE缓冲液，使其覆盖住胶板。开始点样，加入2µL 2000DNAMarker，加入2µL待检样品扩增产物。加样完成后进行电泳，按照一定恒定的电压进行核酸电泳( I=120，V=200 )，电泳时间一般为30min~ 40min即可停止。通过凝胶成像系统，观察各待样品扩增条带，并分析鉴定结果。
结果如图1所示，特异性引物对AKKF-1/AKKR-2在两种阿克曼氏菌的PCR扩增条带为450pb左右，而在以Lactiplantibacillus argentoratensis、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus oris、Enterococcus hirae、Citrobacter pasteurii、Enterococcus durans、Gordonia terrae、Streptococcus mutans、Streptococcus salivarius、Shigella flexneri、Enterococcus hulanensis、Klebsiella pneumoniaesubsp. Pneumoniae、Klebsiella variicolasubsp. Variicola、Escherichia fergusonii、Streptococcus gallolyticussubsp. Pasteurianus、Streptococcus anginosussubsp. Whileyi、Streptococcus lutetiensis为模板的PCR扩增中无条带；通用引物对27F/1492R在两种阿克曼氏菌以及Lactiplantibacillus argentoratensis、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus oris、Enterococcus hirae、Citrobacter pasteurii、Enterococcus durans、Gordonia terrae、Streptococcus mutans、Streptococcus salivarius、Shigella flexneri、Enterococcus hulanensis、Klebsiella pneumoniaesubsp. Pneumoniae、Klebsiella variicolasubsp. Variicola、Escherichia fergusonii、Streptococcus gallolyticussubsp. Pasteurianus、Streptococcus anginosussubsp. Whileyi、Streptococcus lutetiensis的PCR扩增条带为1500pb左右；特异性引物对AKKF-1/AKKR-2和通用引物27F/1492R在以无菌水作为模板的PCR扩增中均无条带产生。
结果表明，与通用引物27F/1492R相比，本发明提供的阿克曼氏菌特异性引物（AKKF-1/AKKR-2）具有明显更高的特异性。
2、阿克曼氏菌特异性引物对阿克曼氏菌的检测
利用本发明提供的阿克曼氏菌特异性引物（AKKF-1/AKKR-2）对四株阿克曼氏菌（1、Akkermansia muciniphila、2、Akkemansia glycaniphia、3、4为两株从粪便样品中分离得到的阿克曼氏菌E41\B31）进行检测。PCR扩增的反应体系和反应程序同上述1。
结果如图2所示，四株阿克曼氏菌均可产生450pb左右的PCR扩增条带，表明本发明提供的阿克曼氏菌特异性引物（AKKF-1/AKKR-2）能够对阿克曼氏菌进行有效检测。
3、阿克曼氏菌特异性引物对能够提高粪便样品中阿克曼氏菌的分离效率
以3份人体粪便样品作为样品，采用实施例2的从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，在步骤（3）的初步筛选鉴定中分别使用特异性引物AKKF-1/AKKR-2和通用引物27F/1492R进行PCR扩增。
结果如图3所示，通用引物27F/1492R和特异性引物AKKF-1/AKKR-2的阳性对照均有扩增条带，且片段长度正确。且通用引物27F/1492R对于3份样品均有扩增条带产生。而特异性引物AKKF-1/AKKR-2则仅有2份样品有扩增条带产生。
为了进一步确认扩增条带准确性，将上述PCR扩增产物送至公司进行16S rRNA测序，得到的结果为通用引物27F/1492R对3份样品的扩增产物的测序结果均为重叠峰。而特异性引物AKKF-1/AKKR-2对2份样品的扩增产物的测序结果正常，且序列比对结果为Akkermansia muciniphila。
实验例2 粪便样品中阿克曼氏菌的分离
利用实施例2提供的从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法对三组粪便试验样品（编号A、B、C）进行阿克曼氏菌的分离。初步筛选鉴定结果如图4所示。从图4可知，1、2两个阳性对照均有条带产生，且片段长度正确，而3-5号的样品中三个样品中有两个样品中有条带产生，表明A样品中无阿克曼氏菌。接下来将针对B、C样品进行分离培养，分离结果见表1，结果表明，使用本发明的方法成功从样品中分离得到了阿克曼氏菌菌株。在一次分离试验中，B、C粪便样品的分离培养基平板上共挑取了12个单克隆，分离得到6株阿克曼氏菌菌株，分离频率为50%。
表1
此外，利用对比例1的方法从上述B、C粪便样品中分离阿克曼氏菌，结果显示，分离得到的菌株经鉴定均为乳杆菌，未分离得到阿克曼氏菌。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.万古霉素和红霉素在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为：以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素用于粪便样品的富集培养和/或阿克曼氏菌的分离培养；
其中，万古霉素的添加浓度为4-6μg/mL，红霉素的添加浓度为0.3-0.5μg/mL。
3.一种阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述培养基以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素。
4.根据权利要求3所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述培养基中，万古霉素的浓度为4-6μg/mL，红霉素的浓度为0.3-0.5μg/mL。
5.根据权利要求4所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述培养基包含：
第一培养基，为液体培养基，用于粪便样品的富集培养，包含：碳源和氮源、无机盐、氨基酸、益生元和筛选抗生素；其中，所述碳源和氮源包含脑心浸粉15-20g/L，黏蛋白2-4g/L，蛋白胨5-15 g/L，葡萄糖1-3 g/L；
第二培养基，为固体培养基，用于阿克曼氏菌的分离培养，包含：碳源和氮源、无机盐、氨基酸和筛选抗生素；其中，所述碳源和氮源包含黏蛋白2-4 g/L。
6.根据权利要求5所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述第一培养基中，无机盐包含氯化钠、磷酸氢二钠和微量元素，氨基酸包含L-半胱氨酸或其盐，益生元包含菊粉；
和/或，所述第二培养基中，无机盐包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化铵、氯化镁、氯化钙、碳酸氢钠和微量元素，氨基酸包含L-半胱氨酸或其盐。
7.根据权利要求5或6所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述第一培养基包含以下组分：蛋白胨8-12g/L，牛脑浸粉 10-15g/L，牛心浸粉4-8g/L，氯化钠 3-7g/L，葡萄糖1-3g/L，磷酸氢二钠 2-3g/L，黏蛋白2-4g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.8 g/L，菊粉15-25g/L，Coolaber 1000×B6微量元素溶液 0.8-1.2mL/L，万古霉素4-6μg/mL，红霉素0.3-0.5μg/mL；
和/或，所述第二培养基包含以下组分：磷酸二氢钾 0.3-0.5 g/L，磷酸氢二钠 0.5-0.6g/L，氯化钠 0.2-0.4 g/L，氯化铵 0.2-0.4 g/L，氯化镁 0.05-0.2g/L，氯化钙 0.1-0.2g/L，碳酸氢钠3-5 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.4-0.6g/L，黏蛋白2-4g/L，Coolaber 1000×B6微量元素溶液 0.8-1.2mL/L，万古霉素4-6μg/mL，红霉素0.3-0.5μg/mL。
8.权利要求3~7任一项所述的阿克曼氏菌分离培养基在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。
9.一种从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括：将粪便样品置于权利要求3~7任一项所述的阿克曼氏菌分离培养基中的第一培养基中进行富集培养得到样品富集液；对样品富集液进行初步筛选鉴定，将鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液在权利要求3~7任一项所述的阿克曼氏菌分离培养基中的第二培养基中进行分离培养，对分离得到的菌株进行阿克曼氏菌的鉴定。
10.根据权利要求9所述的从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，其特征在于，所述初步筛选鉴定为以样品富集液的DNA为模板，以阿克曼氏菌特异性引物进行PCR扩增，根据扩增产物判断样品富集液中是否含有阿克曼氏菌；
所述阿克曼氏菌特异性引物为上游引物AKKF-1和下游引物AKKR-2，其中，上游引物AKKF-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物AKKR-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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