CN109182211B - 宽温环境下防治srb的复合生物菌剂及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于微生物防治硫酸盐还原菌技术领域的一种宽温环境下防治SRB的复合生物菌剂及使用方法。本发明宽温复合生物菌剂包括中低温反硝化细菌CPB‑015、中高温反硝化细菌JSHD‑3、硝酸钠及磷酸二氢钠。本发明可以有效的刺激油井等宽温环境中反硝化细菌的生长，从而抑制不同温度环境下SRB的快速生长，控制硫化物的含量，改善水质。这种适用性强、抑制范围广的反硝化复合菌剂，不仅可以有效提高反硝化细菌脱硫防腐的能力和适用范围，而且对推进反硝化细菌的工业化应用具有重要的现实意义。

Description

宽温环境下防治SRB的复合生物菌剂及使用方法

技术领域

本发明涉及微生物防治硫酸盐还原菌技术领域，特别涉及一种宽温环境下 防治SRB的复合生物菌剂及使用方法。

背景技术

油藏注水开发导致油藏、石油管道及采油装置中的硫酸盐还原菌(SRB)的 生长，造成油藏酸化及管道的腐蚀，给全球石油工业带来了严重的损失。随着 反硝化菌(DNB)抑制硫酸盐还原菌(SRB)技术在国外油田成功应用，国内油 田开展利用微生物来抑制或消除微生物腐蚀的生物控制技术研究越来越受到重 视。但是该技术主要研究对象为油田水处理系统或回注系统的SRB治理，如专 利“控制油田硫酸盐还原菌危害的微生物制剂及其应用”(专利号 CN200610047730.2)解决了水处理系统或回注系统的生物防腐问题，但微生物只能适应较小温度范围。目前对于油井这种温度变化大的极端环境的研究较少， 现有的油井防治主要解决的是油井泵口处的防腐问题，如专利“防治高温水体 中SRB的生物菌剂及其抑制SRB的方法”(专利号CN201410569095.9)已经很 好的解决了泵口腐蚀问题。但现场大量研究及现场实践表明中低温段，特别是 35～50℃的油井段腐蚀依然非常严重，目前没有在纵向上实现0～2400m的油 井全温度段生物防腐。

发明内容

本发明的目的在于解决目前大部分生物防治SRB方法只能解决治理对象 局部腐蚀的问题，比如污水站30～50℃的防腐问题，油井井底高温腐蚀问题， 无法全流程、全温度段一次性实现系统防腐，本发明提出一种宽温环境下防治SRB的复合生物菌剂及使用方法。

本复合生物菌剂由一种最佳生长温度为35℃，耐受温度为25～50℃的反硝 化细菌CPB-015、另一种最佳生长温度为65℃，耐受温度为40～95℃的反硝化 细菌JSHD-3、硝酸钠和磷酸二氢钠组成。本发明中的复合生物菌剂可以在25～ 95℃、矿化度小于15万的油井宽温环境下有效地协同生长，特别在40～50℃ 时两种菌具有协同抑制硫酸盐还原菌的作用，比单一的菌效果都要好，通过温 度作为复合菌剂的调节因子，可以有效的分配CPB-015和JSHD-3的生态位点， 保证不同菌株在自身适宜温度条件下生长繁殖，形成优势菌体群落，竞争性抑 制SRB的繁殖。

这两种菌都是兼性厌氧菌，能够在油井微氧(氧气含量＜0.1mg/L)环境中 生长，并且均是芽孢菌，在不适应环境中变成芽孢，不会完全死亡，在遇到合 适条件时又会生长。其中中低温反硝化细菌CPB-015名称为Bacillus megaterium，于2014年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.9524。其中中高温反硝化细菌JSHD-3名称为Geobacillusthermoleovorans， 于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7272。

该宽温复合生物菌剂的使用方法，按照如下步骤进行：

(1)所述中低温反硝化细菌CPB-015和中高温反硝化细菌JSHD-3的浓度为 1.0×10⁸～1.8×10¹¹cfu/mL的工业发酵液按1：1～1：1.5混合，在油井套管气 压放至套压回零后，采用冲击式投加加入油井套管内，投加量为油井采出液体 积的0.5～1％；

(2)称量硝酸钠和磷酸二氢钠，溶解到20～25L的水中，使硝酸钠浓度为 30～150mg/L，磷酸二氢钠浓度为2～10mg/L，然后采用冲击式投加加入油井 套管内，最后再向油井套管内投加30～100L水。

有益效果：本发明中的复合生物菌剂可以在25～95℃的油井宽温环境下有 效地协同生长，通过温度作为复合菌剂的调节因子，可以有效的分配CPB-015 和JSHD-3的生态位点，保证不同菌株在自身适宜温度条件下生长繁殖，形成优 势菌体群落，竞争性抑制SRB的繁殖，控制硫化物的含量，改善水质。这种适 用性强、抑制范围广的反硝化复合菌剂，不仅可以有效提高反硝化细菌脱硫防 腐的能力和适用范围，而且对推进反硝化细菌的工业应用具有重要的现实意义。

附图说明

图1为CPB-015和JSHD-3混合菌液在营养体系中的繁殖24h菌体浓度图。

图2为CPB-015和JSHD-3混合菌液在营养体系中的繁殖16h菌体浓度图。

图3为复合菌、JSHD-3和CPB-015在25℃～95℃条件下，30d时硫化物抑制率 变化图。

图4为W76井硫化物变化曲线图。

图5为W76井SRB变化曲线图。

图6为H88-21井硫化物变化曲线图。

图7为H88-21井SRB变化曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1

本发明的JSHD-3菌通过如下过程筛选：

(1)样品采集

在江苏油田采集6口油井的产出液，样品名称分别为：CH2-9、CH2-48、T83-8、 H88-7、H88-39、真1-1。

(2)反硝化细菌选择性培养基

硝酸钾0.2％，葡萄糖0.1％，氯化镁0.01％，氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.005％，加水补充至100％，调节pH至7.0-7.2。

固体培养基：液体培养基中加入质量比为2％的琼脂。

(3)富集培养

将步骤(1)中6口油井产出液样品等比例混合，在江苏油田产出液中加入 硝酸盐还原菌富集分离培养基成分，然后置于65℃下培养，培养7d得到富集 培养样品。以上述富集样品为初始接种物，用硝酸盐还原菌富集分离培养基转 接培养3次，培养周期2d，以筛选确定优势硝酸盐还原菌种。

(4)菌株分离纯化

将65℃三次转接的样品涂布到硝酸盐还原菌固体培养基平板培养，从所得 培养平板上挑取单菌落于三角烧瓶中进行培养，培养3d后置于4℃冰箱保存。

(5)硝酸盐还原菌DNA提取与鉴定

I DNA提取

将分离纯化后的硝酸盐还原菌富集培养3天，用2mL离心管在12000×g条件 下离心收集细胞，采用Axygen DNA提取试剂盒提取硝酸盐还原菌DNA，具体操作 步骤如下：

1)在装有细胞的离心管中加入450μL裂解液，旋涡振荡15s，65℃水浴10 min；

2)继续加入400μL蛋白质变性剂和1mL相分离液(4℃预冷)，用力混合， 12000×g离心2min；

3)弃上相，保留相间沉淀和下相，加入1mL 4℃预冷的相分离液，混合， 12000×g离心2min；

4)弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2mL离心管中)，12000×g离心1 min；

5)弃滤器，在滤液中加入400μL DNA结合液，混合均匀；

6)将制备管置于2mL离心管中，将步骤(5)中的混合液移入制备管中，12000 ×g离心1min；

7)弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入500μL冲洗液W1，12000 ×g离心1min；

8)弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入700μL冲洗液W2，12000 ×g离心1min；

9)以同样的方法再用700μL冲洗液W2洗涤一次；

10)弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，12000×g离心1min；

11)将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加100-200 μLEluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA，保存在 -20℃下以备用。

II样品PCR扩增

将提取的JSHD-3的DNA，采用16S rDNA基因通用引物1492R和27F进行PCR扩 增。

1)细菌16S rDNA PCR反应体系

PCR反应体系组成见表1。

表1细菌16S rDNA PCR反应体系

2)引物序列

1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

27F：

5′>CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAGAGTTTGATCTTGGCTCAG<3′

3)PCR反应程序

III测序结果

江苏油田产出液65℃富集样品分离出菌落(编号JSHD-3)，挑取单菌落富 集培养，培养细胞提取DNA，PCR扩增产物进行测序。经分析比对与G. thermoleovorans CCB_US3_UF5相似度为96％，为嗜热地芽孢杆菌。

实施例2

本发明的CPB-015菌通过如下过程筛选：

(1)样品采集

采集自江苏油田不同油井出水样和土样。其中出水样共计9份，编号分别为 韦2三分、营4三分、H88-1、H88-10、H88-31、韦2-87、韦15-17、韦2-53、韦 11-1。土样4份，编号为韦2-57，黄58-29，黄88-3，韦11-1。

(2)富集培养

不同样品中取水样100mL，采用高速离心(12000rpm，15min)对水样中微 生物进行浓缩。去除上清液，沉淀用2mL无菌水悬浮后，取1mL悬浮液70℃水浴 30min以定向筛选对高温具有耐受能力的反硝化细菌。将高温处理和未处理的悬 浮液分别加入预先灭菌的反硝化细菌选择性液体培养基中，置35℃恒温摇床 180r/min震荡培养48-96h，观察培养液是否浑浊，获得样品培养富集液。光学 显微镜染色观察分离微生物的形态。

(3)菌株分离纯化

用涂布法将高温处理的富集培养液均匀涂布于反硝化筛选培养基上，30℃ 恒温培养2～3d，挑取单菌落接种到分离纯化培养基上，采用划线法进行分离纯 化，培养12h后，挑取单菌落涂布于反硝化筛选培养基上，获得纯化的DNB分离 菌株

(4)硝酸盐还原菌DNA提取与鉴定

设计16S rDNA通用引物(Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’， Primer B：5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’)，以分离放线菌SR-1102DNA为模板， 采用菌落PCR方法进行16S rDNA序列扩增。

PCR反应体系(50μL)：ddH₂O 34μL，10×buffer 5μL，Mg²⁺5μL，dNTP 2.5μL，rTaq0.5μL，Primer各1μL，模板DNA 1μL。

PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火1min，72℃ 延伸90s，循环33次；72℃总延伸5min。PCR产物连接克隆载体pEASY-T3并转 化大肠杆菌Top-10中。

菌株OPB-15的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的16S rDNA序列同源性达100％，据此推测OPB-15菌株属于芽孢杆 菌属。

实施例3

25mL富集培养基中分别接入0.5mL CPB-015+0.5mL JSHD-3摇瓶孢子悬浮液 (孢子浓度：10⁸cfu/mL)，置于40℃和60℃不同温度下培养，观察在共同营养 体系下两种反硝化细菌的生长繁殖情况。

混合接种40℃条件下培养16h后，CPB-015菌株明显繁殖生长，而JSHD-3未 见生长。镜检观察到对数生长期的CPB-015菌体，菌体浓度OD值为0.459，与单 独接种CPB-015培养16h的OD值0.471无显著差异。培养至24h，菌体浓度达最大 值，OD值为0.539，而对照OD600为0.542(图2)。相反，60℃条件下培养16h后， CPB-015菌株未见生长繁殖，而JSHD-3明显繁殖生长，显微镜检观察到成对扩增 的菌体，OD值为0.05，略高于单独接种JSHD-3的对照处理。培养24h后菌体浓度 进一步增长，OD值为0.105，而对照为0.107,两种差异不显著(图1)。

结果表明，在低浓度N、C源存在的营养体系中，混合菌液中两种反硝化细 菌生长繁殖无明显竞争作用，适宜的温度条件是不同反硝化细菌增殖繁殖的关 键因子。

实施例4

将反硝化菌JSHD-3和CPB-015通过常规微生物好氧发酵制备获得芽胞浓度 为1.0×10⁸～1.8×10¹¹cfu/mL工业发酵液。取硫化物含量60mg/L的油田污水， 分别加入比例为1：1的JSHD-3和CPB-015复合菌、JSHD-3单菌和CPB-015单菌。 泵深小于2400米的油井从泵深到井口温度变化一般在25℃～95℃，因此选择在25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、95℃不同温度条件下培养，观 察30d时的硫化物抑制率，抑制效果如图3。

结果表明，复合菌在25℃～95℃条件下抑制率保持在65.2％～98.1％；JSHD-3 单菌在40～95℃条件下抑制率为55.7％～95.7％，25～30℃条件下抑制率为0， 说明JSHD-3在此温度范围内不能生长；CPB-015单菌在25～50℃条件下抑制率为 68.1％～94.4％，60～95℃条件下抑制率为0，说明CPB-015在此温度范围内不能 生长。40～50℃时2株单菌的抑制率均小于复合菌，这说明在40～50℃时两种菌 具有协同抑制硫酸盐还原菌的作用，比单一的菌效果都要好，使用复合菌能够 实现全井筒的除硫防腐。

实施例5

首先将反硝化菌JSHD-3和CPB-015通过常规微生物好氧发酵制备获得芽胞 浓度为1.0×10⁸cfu/mL工业发酵液，该工业发酵液可使用20L塑料桶储存，使用 时按比例混合均匀，加入目标油井采出液。

将本发明复合生物菌剂按如下比例投入江苏油田W76井，处理前该井产出 液的硫化物浓度为58mg/L，硫酸盐还原菌(SRB)含量为2500个/mL。JSHD-3 工业发酵液(1.0×10⁸cfu/mL)，CPB-015工业发酵液(1.0×10⁸cfu/mL)按1： 1混合，在油井套管气压放至套压回零后，采用冲击式投加加入油井套管内， 投加量为油井采出液体积的0.5％；称量硝酸钠和磷酸二氢钠，溶解到20L的水 中，使硝酸钠浓度为40mg/L，磷酸二氢钠浓度为3mg/L，然后采用冲击式投 加加入油井套管内，最后再向油井套管内投加30～100L水。同时不定期检测硫化物含量，并适时补充添加复合生物菌剂；以保持抑制效果。抑制效果如图 4和图5，35d硫化物抑制率达95.8％,35d SRB抑制率达99％。

实施例6

与实施例5不同之处在于，实施油井为江苏油田H88-21井，处理前该井产出 液的硫化物浓度为165mg/L，硫酸盐还原菌(SRB)含量为7000个/mL。JSHD-3 工业发酵液(1.0×10⁹cfu/mL)，CPB-015工业发酵液(1.0×10⁹cfu/mL)按1： 1.5混合，投加量为油井采出液体积的0.8％；硝酸钠浓度为40mg/L，磷酸二氢 钠浓度为3mg/L。抑制效果如图6和图7，35d硫化物抑制率达97.8％,35d SRB抑 制率达99.6％。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于 所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做 出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求 所限定的范围内。

Claims (4)

1.一种中低温反硝化细菌CPB-015，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），保藏编号为CGMCC NO.9524，保藏日期为 2014年7月21日，耐受温度为25～50℃，最佳生长温度为35℃。

2.一种中高温反硝化细菌JSHD-3，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，分类命名为嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans），保藏编号为CGMCC NO. 7272，保藏日期为 2013年3月5日，耐受温度为40～95℃，最佳生长温度为60～70℃。

3.一种宽温复合生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的中低温反硝化细菌CPB-015、权利要求2所述的中高温反硝化细菌JSHD-3、硝酸钠及磷酸二氢钠。

4.一种权利要求3所述的宽温复合生物菌剂的使用方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）所述中低温反硝化细菌CPB-015和中高温反硝化细菌JSHD-3的芽胞浓度为1.0×10⁸～1.8×10¹¹cfu/mL的工业发酵液按1：1混合，在油井套管气压放至套压回零后，采用冲击式投加加入油井套管内，投加量为油井采出液体积的0.5～1%；

（2）称量硝酸钠和磷酸二氢钠，溶解到20～25L的水中，使硝酸钠浓度为30～150 mg/L，磷酸二氢钠浓度为2～10 mg/L，然后采用冲击式投加加入油井套管内，最后再向油井套管内投加30～100L水。

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