CN111377544B

CN111377544B - 一种利用嗜盐菌yl5-2的高盐废水处理工艺

Info

Publication number: CN111377544B
Application number: CN201811640182.3A
Authority: CN
Inventors: 徐军; 王开春; 李坤; 王强; 田凤蓉; 洪磊; 张璐璐; 孙文妮
Original assignee: Bluestar Lehigh Engineering Institute
Current assignee: Bluestar Lehigh Engineering Institute
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN111377544A

Abstract

本发明公开了一种利用嗜盐菌YL5‑2的高盐废水处理工艺。本发明一种利用嗜盐菌YL5‑2的高盐废水处理工艺，该工艺中使用保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐菌YL5‑2。该工艺使用的菌株YL5‑2作为嗜盐弧菌属Halovibrio的新物种，不仅能够降解有机污染物，而且还能够以有机物为电子供体进行反硝化。该工艺适用于3％～32％盐浓度范围内的高盐废水生化处理，尤其适用于盐浓度10～25％的高盐废水处理。

Description

一种利用嗜盐菌YL5-2的高盐废水处理工艺

技术领域

本发明属于废水处理领域，涉及一种利用嗜盐菌YL5-2的高盐废水处理工艺。

背景技术

高盐废水处理工艺主要包括物化方法、生化方法及其组合工艺。物化方法包括蒸发、膜分离、离子交换、高级氧化、电解等，这些技术无论多先进，其处理思路主要都是先分离废水中的无机盐，然后再使脱盐或稀释后的废水处理达标；因此，其投资成本和运行成本均很高，而且除盐产生的蒸发母液、固体盐、反渗透浓缩液等属于固废或危险固废。

目前高盐废水生化处理方法主要包括：盐度驯化、稀释生化、选择耐盐度高的生化工艺、接种嗜盐菌强化生物处理。接种嗜盐菌，可以强化普通生化系统对高盐废水处理的效果，甚至可以处理盐浓度超过5％的高盐废水。

中国专利申请号CN 201110003844.8提供了一种复合菌剂，由四种耐盐菌普罗威登斯菌(CGMCC NO.4327)、表皮短杆菌(CGMCC NO.4329)、盐单胞菌(CGMCC NO.4330)、Oceanobacillus sp.CJ-10(CGMCC NO.4328)，组成。

中国专利申请号CN 200910266193.4提供的复合耐盐菌剂由三株极端嗜盐菌盐单胞菌(CGMCC No.3081)、假单胞菌(CGMCC No.3082)和芽孢杆菌(CGMCC No.3083)组成。这些复合耐盐微生物菌剂进行规模化工程应用，须通过每种耐盐菌的发酵扩大培养后再进行复配得到，导致复合耐盐微生物菌剂的生产成本较高、生产周期较长，限制了其应用范围。

中国专利申请号201310540099.X提供了一种制备耐盐微生物菌剂的方法，该方法是在敞开装置中，直接在1％～30％的盐浓度条件下对耐盐微生物菌群进行混合培养，添加有机碳源、营养元素和微量元素进行制备。该方法虽然对微生物混合菌群进行混合培养，使复合微生物菌剂可以一次培养进行制备，但其生产条件仍然较为复杂，且用于实际高盐废水仍然需要较长时间的驯化。

中国专利申请号201510576214.8提供了一种利用耐盐微生物处理高盐废水的方法，包括以下步骤：(1)向生化系统中加入适盐微生物菌群；(2)所述生化系统在1％～25％盐浓度范围内对适盐微生物菌群进行混合培养，直至系统中出现泥水分离性能良好的微生物聚集体；(3)所述生化系统加入高盐废水，并且在进水盐浓度1％～25％且稳定的情况下，对适盐微生物菌群的污染物降解能力进行驯化；(4)稳定生化系统进水水质，对生化工艺参数进行优化调整，直至生化出水水质达标或达到设计要求。但是该专利未提供处理高盐废水所需的嗜盐菌或耐盐菌的种类。

高盐废水中的污染物包括有机污染物，氨氮、硝氮等营养盐类污染物、无机污染物等。利用嗜盐菌的高盐废水处理工艺，其关键是获取耐盐能力、污染物降解能力、抗盐度冲击能力等综合性能较好的嗜盐菌及适用工艺。

发明内容

为解决高盐废水处理工艺的适用性问题，尤其是盐度大于10％条件下的高盐废水的生物工艺的适用性问题，本发明通过以下技术方案来实现：

本发明一种利用嗜盐菌YL5-2的高盐废水处理工艺，该工艺中使用保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐菌YL5-2。

嗜盐菌YL5-2能够在盐浓度3％～32％、pH6.5～11.0、温度15～45℃范围内生长。菌株YL5-2是一株异养菌，能够以乙酸为唯一碳源和能源进行生长，也能够在好氧或缺氧条件下进行反硝化。当以乙酸为碳源，NO₃-N或NO₂-N为电子受体时，YL5-2的最适生长盐环境为5％～25％，最适生长pH为7.5～8.0、最适生长温度为30～35℃。

本发明所述高盐废水处理工艺为活性污泥法工艺。

更进一步，本发明所述高盐废水处理工艺，该工艺中使用的嗜盐菌除菌株YL5-2以外，还包含其它功能型嗜盐菌。

本发明进一步优选的技术方案是：

本发明所述高盐废水生化处理工艺，其盐度适用范围是3％～32％。

本发明所述高盐废水生化处理工艺进行生物脱氮，其反硝化的耐盐范围是5％～25％。

本发明所述高盐废水生化处理工艺进行生物脱氮，其反硝化效果最好的耐盐范围是10％～25％。

本发明所述高盐废水处理工艺，当溶解氧＜0.5mg/L，可以进行反硝化脱氮；当溶解氧＜1.0mg/L(缺氧状态)，可以进行反硝化；当溶解氧≥1.0mg/L，进行好氧反硝化；当溶解氧≥2.0mg/L，其能够以乙酸或其它有机物为电子供体进行反硝化。

本发明一种利用嗜盐菌的高盐废水处理工艺，与现有技术相比具有以下优势：

(1)该工艺使用的菌株YL5-2是一种新确定的嗜盐菌新菌种，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心且保藏号为CGMCC NO.16315。

(2)该工艺使用的菌株YL5-2作为嗜盐弧菌属Halovibrio的新物种，不仅能够降解有机污染物，而且还能够以有机物为电子供体进行反硝化。

(3)该工艺适用于3％～32％盐浓度范围内的高盐废水生化处理，尤其适用于盐浓度10～25％的高盐废水处理。

附图说明

图1嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2在YL琼脂平板上于37℃条件下培养24h后的细胞透射电子显微镜(TEM)照片(比例尺为2μm)。

生物材料保藏信息

YL5-2，分类命名为Halovibrio salipaludis，保藏日期为2018年8月20日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.16315。

具体实施方式

实施例1该嗜盐菌YL5-2的分离及保藏

嗜盐菌YL5-2YL5-2是从中国青海省格尔木察尔汗盐湖(36°51′N,94°95′E)沉积土壤中分离得到。察尔汗盐湖湖水常年为饱和盐浓度或接近饱和盐浓度。

配置NaCl浓度为20％的LB液体培养基，并加入甘油250mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇50mg/L，在30～35℃条件下对察尔汗盐湖沉积土壤富集培养24～72h。利用YL固体培养基对富集培养液中的菌株进行分离。1L培养基中含有以下组分：葡萄糖：0.6g，柠檬酸三钠0.5g，甘油2mL，酵母提取物0.8g，蛋白胨1.6g，磷酸氢二钾0.35g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸铵0.25g，氯化铵0.25g，MgSO₄ 0.5g，CaCl₂ 0.1g，NaCl 180g；微量元素SL-4 10mL，pH 7.0-7.2；琼脂2.5％。

菌株YL5-2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16315，保藏日期为2018年8月20日。

实施例2嗜盐菌YL5-2 16S rRNA序列分析与全基因序列分析

菌株YL5-2基因组DNA提取采用TaKaRa试剂盒(TaKaRa MiniBEST BacteriaGenomic DNA Extraction 68Kit Ver.3.0)。

16S rRNA扩增采用通用细菌引物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCA G-3)和1492R(5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3)。PCR测序委托上海生工生物科技有限公司进行。菌株YL5-2完整的16S rRNA序列为1518bp，GenBank登录号为MF782425。

菌株YL5-2的全基因组测序采用上海上海派森诺生物科技有限公司IlluminaMiSeq 2000高通量测序平台。原始测序数据采用PRINSEQ(版本号v 0.20.4)软件进行过滤和修正，然后采用带有默认参数的SOAP denovo软件(版本号v1.05)软件进行基因组的碱基配对，然后使用CheckM软件(版本1.03)评估基因组的完整性。蛋白质编码开放阅读框架采用Glimmer软件(版本号1.2)进行预测。RNA预测采用RNAmmer软件(版本1.2)。菌株YL5-2全基因组序列共3,495,096bp，GenBank登录号为NSKD00000000.1。

DNA-DNA杂交试验通过菌株YL5-2与其遗传发育最接近的弧菌属Halovibrio模式菌株进行。该方法由De Ley等于1970年提出，DNA杂交值(dDDH)采用GGDC软件第2种模式(版本号2.0)进行基因序列的一一比对得到。DNA试验和分析结果表明，菌株YL5-2和Halovibrio variabilis DSM 3050^T、Halovibrio denitrificans DSM15503^T的DNA-DNA杂交值分别为43.5％和38.2％，远低于70％的阈值(物种划分通常被接受的阈值)。

核苷酸平均一致性值采用全基因组序列的碱基组进行1000次重复拓扑检验得到。该方法由Goris等于2007提出，使用的软件为MUMmer(版本号3.23)和Jspecies(版本号1.2.1)。基于Kim等人和Richter等人提出的物种划分的ANI阈值范围(95-96％)，对菌株YL5-2的基因组和GenBank中与之密切相关的基因组进行ANI分析(表1)。结果表明，菌株YL5-2其与Tamilnaduibacter alinus Mi 7的平均核苷酸一致性(ANI)值最高，为88.5％(Supplementary Table S1)，这为菌株YL5-2^T属于Halovibrio属的一种新物种提供了论据。

表1嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与GenBank中密切相关的基因组之间的平均核苷酸一致性(ANI)和DDH值。

实施例3嗜盐菌YL5-2的表型特征和生理生化特征鉴定

革兰氏染色特性采用BD革兰氏染色试剂盒进行测试。

细胞运动性使用半MA培养基(0.5％琼脂，w/v)测定。

细胞形态采用透射电子显微镜(TEM)分析检测。即从指数生长的培养液中挑取细胞，用0.5％乙酸铀酰染色细胞，并在显微镜(Tecnai Spirit,FEI,Hillsboro,OR,USA)下对细胞进行拍照。

氧化酶活性使用氧化酶试剂盒(bioMérieux)，通过将3.0％H₂O₂溶液倒入细菌菌落并观察气泡产生来测定过氧化氢酶活性。

温度生长条件在YL液体琼脂培养基上进行，温度分别为4、10、15、20、25、30、33、37、40、45和50℃，pH恒定为7.5，比较不同温度下菌株YL5-2^T的生长速率确定其最佳生长温度。

耐盐能力在0.0-30.0％NaCl(w/v)的YL琼脂和YL液体培养基进行。用缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 5.0-7.0)，Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 8.0-12.0))将pH调至5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0(15.0％NaCl，35℃)以测定适合生长的pH范围。

碳源利用能力和酶活性测试采用API 20NE，API ZYM(bioMérieux)和BiologGENIII微孔板。所有测试接种YL培养基上预生长的细胞，并用相关的接种培养基稀释。

菌株YL5-2的表型特征和生理生化特征鉴定结果如表2所示：

表2嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2(a)与Halovibrio denitrificans DSM15503^T(b)，Halovibrio variabilis DSM 3050^T(c)在表型与生理生化等方面的区别特征比较

说明：+，阳性；-，阴性。

嗜盐菌YL5-2是革兰氏染色阴性、碱性好氧，直杆状或0.5-0.8x1.0-3.5μm的小弧菌形状，并且通过单极性鞭毛运动(图1)。

菌株YL5-2在好氧条件下利用乙酸生长，在缺氧条件下则利用硝酸盐生长(API20NE)。实施例4嗜盐菌YL5-2的发酵培养试验

(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。

(2)1L的三角瓶中接种后在35℃条件下培养48h，培养过程中补充水分的散失影响盐浓度的变化。48h后测得10％、15％、20％、25％盐浓度条件下OD600分别为1.72、1.65、1.62、1.60、1.63。进行两次转接培养，每次转接后均培养48h，驯化培养完成后OD600分别为2.56、2.68、2.72、2.68、2.52。

(3)1L培养液接种到20L的好氧发酵罐中进行培养，培养基成分保持不变。仍然培养48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L。48h后发酵罐中菌液的OD600可达到2.6～3.0之间。

(4)检验：培养过程中使用显微镜每日取样观察，检查是否有杂菌混入生长；同时观察YL5-2的生长及形态变化情况。

(5)结果：试验结果表明，菌株YL5-2可以快速的进行发酵培养和放大，这表明YL5-2具有大规模工程应用的潜力。

实施例5嗜盐菌YL5-2的耐盐能力试验

(1)培养基成分为甘油50mg/L、葡萄糖25mg/L、甲醇50mg/L、甲胺20mg/L、氯化钠250g/L，乙酸钠25mg/L，柠檬酸三钠25mg/L、酵母粉10mg/L、蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，琼脂20g/L。

(2)使用新鲜的上述培养基活化菌种，培养3天至菌苔生长丰富备用

(3)盐度梯度设置：根据YL5-2菌种的富集筛选条件，设置培养基的盐度梯度和范围为0％、0.5％、1％、2％、3％、24％、26％、28％、30％、32％、34％，摸索YL5-2菌种的耐盐范围。

(4)制备培养基：根据设置的培养基配方制备培养基，盐度较高的培养基热水融化后灭菌，每瓶多加5ml的蒸发水，易挥发的培养基成分待灭菌后加入摇匀，待冷却至60℃左右，倒制平皿，盐度高极易凝固，因此，倒制平皿快速要快(32％盐度培养基倒制平皿时，冷却凝固后有少量盐析出，34％盐度有大量盐晶体析出)。

(5)接种：无菌条件下挑取一环新鲜菌苔接入各盐度培养基，由低盐度往高盐度梯度转接，34％盐度培养基划线后随着划线轨迹有大量盐晶体析出，接种完毕培养皿用封口膜封口，35-37℃培养3-7天，观察菌种生长情况。

(6)试验结果：YL5-2菌种耐盐范围为3-32％。YL5-2菌株在3-30％盐度培养基中三天内可以明显观察到新长出的菌苔，但是在32％饱和盐度培养基中生长7天以上才能长出肉眼可见菌苔。表明YL5-2在3％～30％的盐浓度范围内生长速度均较快。

实施例6嗜盐菌YL5-2的耐盐反硝化能力试验

(1)培养基成分为乙酸2000mg/L，蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，NO₃-N为50～100mg/L，盐浓度3％～30％，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。

(2)盐度梯度设置：根据YL5-2菌种的富集筛选条件，设置培养基的盐度梯度和范围为3～5％、6～10％、11～20％、20～30％，研究YL5-2菌种在不同盐度范围内耐盐能力和反硝化能力。

(4)反硝化试验：反硝化试验10个500mL的三角瓶中进行，其中空白组2个，各个盐浓度各2个平行样；培养温度为30～35℃；震荡速度分别为10rpm和150rpm(模拟缺氧和好氧条件)；24h、48h和72h后取样测定NO₃-N的浓度

(6)试验结果：

①当废水盐浓度为3％～5％，NO₃-N在24h、48h、72h的去除率分别为5～20％、40～60％、85～90％。

②当废水盐浓度为5％～10％，NO₃-N在24h、48h、72h的去除率分别为20～30％、80～84％、90～95％。

③当废水盐浓度为10％～20％，NO₃-N在24h、48h、72h的去除率分别为30％～40％、85～90％、95～98％。

④当废水盐浓度为20％～30％，NO₃-N在24h、48h、72h的去除率分别为20％～30％、80～85％、89～91％。

实施例7嗜盐菌YL5-2的耐盐反硝化能力试验

(1)培养基成分为乙酸2000mg/L，蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，NO₂-N为50～100mg/L，盐浓度3％～30％，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。

(4)反硝化试验：反硝化试验10个500mL的三角瓶中进行，其中空白组2个，各个盐浓度各2个平行样；培养温度为30～35℃；震荡速度分别为10rpm和150rpm(分别模拟缺氧和好氧条件)；24h、48h和72h后取样测定NO₂-N的浓度

(6)试验结果：

①当废水盐浓度为3％～5％，NO₂-N在24h、48h、72h的去除率分别为10～20％、40～50％、80～90％。

②当废水盐浓度为5％～10％，NO₂-N在24h、48h、72h的去除率分别为20～30％、80～84％、90～95％。

③当废水盐浓度为10％～20％，NO₂-N在24h、48h、72h的去除率分别为30％～40％、85～90％、95～98％。

④当废水盐浓度为20％～30％，NO₂-N在24h、48h、72h的去除率分别为20％～30％、80～85％、89～91％。

实施例8利用嗜盐菌YL5-2处理高盐废水

(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠50～250g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。

(2)1L的三角瓶中接种嗜盐菌YL5-2后在35℃条件下培养48h，培养过程中补充水分的散失影响盐浓度的变化。48h后测得10％、15％、20％、25％盐浓度条件下OD600分别为1.72、1.65、1.62、1.60、1.63。进行两次转接培养，每次转接后均培养48h，驯化培养完成后OD600分别为2.56、2.68、2.72、2.68、2.52。

(3)1L培养液接种到20L的好氧发酵罐中进行培养，培养基成分保持不变。仍然培养48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为0.5～1.0mg/L(缺氧条件)。48h后发酵罐中菌液的OD600可达到2.6～3.0之间。

(4)20L培养液接种到1000L的好氧发酵罐中继续培养，培养条件与前述相同。随后可根据需要将培养规模进行放大或批量培养。

(5)培养得到的菌液即为嗜盐菌YL5-2微生物菌剂。

(6)将该菌剂用于TDS为5％～10％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，控制溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到64.5％，72h后NO₃-N的降解效率为92.3％。

(7)将该菌剂用于TDS为10～15％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，控制溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到82.2％，72h后NO₃-N的降解效率为96.5％。

(8)将该菌剂用于TDS为12～13％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，控制溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到84.3％，72h后NO₃-N的降解效率为98.5％。

(9)将该菌剂用于TDS为14～16％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，控制溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到83.8％，72h后NO₃-N的降解效率为98.4％。

(10)将该菌剂用于TDS为16～20％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，控制溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到80.5％，72h后NO₃-N的降解效率为97.7％。

(11)将该菌剂用于TDS为21～23％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到74.6％，72h后NO₃-N的降解效率为93.8％。

(12)将该菌剂用于TDS为24～25％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到71.4％，72h后NO₃-N的降解效率为90.6％。

(13)将该菌剂用于TDS为26～30％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到62.2％，72h后NO₃-N的降解效率为87.5％。

(14)将该菌剂用于TDS为31～32％、NO₃-N为100mg/L、乙酸为1000mg/L的高盐废水处理，处理工艺为活性污泥法，溶解氧为≤1.0mg/L(缺氧条件)，48h后NO₃-N降解率可达到30.3％，72h后NO₃-N的降解效率为60.4％。

Claims

1.一种利用嗜盐菌YL5-2的高盐废水处理工艺，其特征是：该工艺为活性污泥法，其中使用保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐菌Halovibrio salipaludis YL5-2；所述工艺的耐盐范围是3%~32%。

2.根据权利要求1所述的高盐废水处理工艺,其特征在于所述的工艺中除使用嗜盐菌除菌株YL5-2以外，还包含其它功能型嗜盐菌。

3.根据权利要求1所述的高盐废水处理工艺,其特征在于所述的活性污泥法在缺氧或好氧条件下进行。

4.根据权利要求1所述的高盐废水处理工艺，其特征在于：所述工艺进行反硝化的耐盐范围是5%~25%。

5.根据权利要求4所述的高盐废水处理工艺，其特征在于：所述工艺进行反硝化的耐盐范围是10%~25%。